Впр по химии 10 класс 2018 2018: Демоверсия 2018 КДР по Химии 10 класс с ответами Демонстрационный

( A ) mus и SAMHD1, идентифицированные с помощью CLMS. Белки имеют цветовую кодировку, как на рис. 3, 4, и черный/белый SAMHD1. SAMHD1-CtD выделен желтым цветом. Сшивки с N-концевыми глобулярными доменами SAM и HD SAMHD1 окрашены в светло-коричневый цвет, в то время как сшивки с N-концевой половиной SAMHD1-CtD выделены розовым цветом, а сшивки с С-концом SAMHD1-CtD отмечены окрашены в фиолетовый цвет.( B ) Поперечные связи Sulfo-SDA из A , в той же цветовой схеме, картированные на молекулярной модели CRL4-NEDD8 ^DCAF1-CtD /Vpr _mus /SAMHD1 (состояние-2), получено из крио-ЭМ анализа (рис. 3). Плотность SAMHD1-CtD из крио-ЭМ-анализа CRL4-NEDD8 ^DCAF1-CtD /Vpr _mus /SAMHD1 (основной) (рис. 4) показана желтой сеткой. ( C ) Доступное пространство взаимодействия SAMHD1-CtD, рассчитанное сервером DisVis [61], согласующееся как минимум с 14 из 26 наблюдаемых перекрестных связей, визуализируется серой сеткой.DCAF1-CtD и Vpr _mus ориентированы и окрашены, как на рис. 4А.

Для более количественной оценки информации о расстоянии, присущей перекрестным ссылкам SAMHD1-CtD, объем, доступный для SAMHD1-CtD для взаимодействия с CRL4 ^DCAF1-CtD /Vpr _mus , в соответствии с расстоянием CLMS ограничений моделировали с помощью программного инструмента DisVis [60, 61]. Для этого анализа SAMHD1-CtD моделировали как пептид в расширенной конформации. Во время моделирования модель молекулярного состояния CRL4 ^DCAF1-CtD /Vpr _mus сохранялась фиксированной, а шестимерный поиск всех возможных степеней свободы вращения и трансляции для модели SAMHD1-CtD в молекулярном контакте с CRL4 ^DCAF1-CtD /Vpr _mus был рассчитан и ранжирован в соответствии с ограничениями расстояния CLMS.Чтобы визуализировать выходные данные, все возможные пространственные положения центра масс SAMHD1-CtD, которые удовлетворяют> 50% ограничений CLMS, были нанесены в виде карты плотности на структуру DCAF1-CtD/Vpr _mus (рис. 5C). . В соответствии с крио-ЭМ-реконструкцией этот независимый вычислительный анализ также определяет местонахождение SAMHD1-CtD на вершине пучка спирали Vpr _mus .

Взятые вместе, структурные, биохимические данные и данные CLMS согласуются с моделью, в которой сам С-конец SAMHD1 рекрутируется Vpr _mus , чтобы разместить оставшиеся домены SAMHD1 надлежащим образом для доступа к каталитическому механизму на дистальном конце стебля CRL4.

Эти данные позволяют провести структурное сравнение со способами связывания субстрата neo белков Vpx и Vpr из разных линий ретровирусов (рис. 6A-D). Vpx _HIV-2 и Vpx _sm позиционируют SAMHD1-CtD сбоку от домена DCAF1 BP посредством взаимодействия с N-концами Vpx Helices-1 и -3 (рис. 6B) [50]. Vpx _mnd2 и Vpx _rcm связывают SAMHD1-NtD, используя двусторонний интерфейс, включающий сторону DCAF1 BP и верхнюю поверхность пучка спирали Vpx (рис. 6C) [51, 52].Vpr _HIV-1 взаимодействует со своим субстратом убиквитилирования UNG2, используя как верхнюю часть, так и верхний край пучка спирали Vpr _HIV-1 (Fig. 6D) [54]. Следует отметить, что эти интерфейсы взаимодействия верхней поверхности лишь частично перекрываются с интерфейсом связывания Vpr _mus /SAMHD1-CtD, идентифицированным здесь, и используют принципиально разные наборы взаимодействующих аминокислотных остатков. Таким образом, оказывается, что интерфейсы молекулярного взаимодействия, управляющие Vpx/Vpr-опосредованным распознаванием и деградацией субстрата neo , не сохраняются между родственными вспомогательными белками SIV и Vpx/Vpr ВИЧ, даже в тех случаях, когда идентичные области SAMHD1-CtD нацелены на рекрутирование. .

Сравнение Neo Моды распознавания Neo VPR _MUS ( A ), VPX _SM ( B ), VPX _MND2 ( C ) и VPR _ВИЧ-1 ( D ). DCAF1-CtD показан серым мультяшным цветом и полупрозрачной поверхностью, Vpr _mus – зеленым, Vpx _sm – оранжевым, Vpx _mnd2 – синим и Vpr _HIV-1 – светло-коричневым показаны мультяшными. Модели рекрутированных субстратов убиквитилирования показаны в виде сильно отфильтрованных, полупрозрачных расчетных карт электронной плотности со следующей схемой окраски: SAMHD1-CtD, связанный с Vpr _mus – желтый, SAMHD1-CtD (связанный с Vpx _sm , PDB 4cc9 ) [50] – мятно-зеленый, SAMHD1-NtD (Vpx _mnd2 , PDB 5aja) [51] – пурпурный, UNG2 (Vpr _HIV-1 , PDB 5jk7) [54] – светло-фиолетовый.

Обсуждение

Наши рентгеноструктурные исследования сборки DDB1/DCAF1-CtD/Vpr _mus обеспечивают первое понимание структуры класса «гибридных» белков Vpr SIV.Они присутствуют в линиях лентивирусов SIV _agm и SIV _mus/deb/syk и сочетают характеристики родственных вспомогательных белков Vpr _HIV-1 и SIV Vpx.

Как и Vpx SIV, «гибридные» белки Vpr подавляют рестрикционный фактор хозяина SAMHD1, привлекая его к CRL4 ^DCAF1 для убиквитинирования и последующей протеасомной деградации. Однако, используя комбинацию рентгеновского, крио-ЭМ и CLMS анализов, мы показываем, что молекулярная стратегия, которую Vpr _mus развила для нацеливания на SAMHD1, разительно отличается от Vpx-содержащих штаммов SIV.В двух кладах белков Vpx расходящаяся аминокислотная последовательность простирается непосредственно перед Helix-1 (вариабельная область (VR)1, S6A Fig) вместе с полиморфизмами в SAMHD1-N-конце соответствующего вида-хозяина определяют, является ли ВИЧ -2-тип или SIV _mnd -тип Vpx распознают SAMHD1-CtD или SAMHD1-NtD соответственно. Эти механизмы распознавания приводят к позиционированию SAMHD1-CtD или -NtD на стороне домена DCAF1 BP таким образом, что обеспечиваются дополнительные контакты между SAMHD1 и DCAF1, образуя тройные сборки Vpx/SAMHD1/DCAF1 с очень низкой скоростью диссоциации [50]. –52, 62].В Vpr _mus разные принципы определяют специфичность SAMHD1-CtD. Здесь VR1 вообще не участвует в связывании SAMHD1-CtD, но формирует дополнительные взаимодействия с DCAF1, которые не наблюдаются в белковых комплексах Vpx/DCAF1 (S6A Fig). Молекулярные контакты между Vpr _mus и SAMHD1 рассредоточены по спиралям-1 и -3, обращены в сторону от места взаимодействия DCAF1 и иммобилизуют SAMHD1-CtD на верхней стороне пучка спирали Vpr _mus (рис. S6A). Помещение SAMHD1-CtD в такое положение препятствует стабилизации тройного взаимодействия с DCAF1-CtD, но все же приводит к надежному убиквитилированию SAMHD1 in vitro и деградации SAMHD1 в клеточных анализах [24].

Каталитическая дНТФазная активность SAMHD1 зависит от нуклеотид-зависимой олигомеризации, опосредованной двумя аллостерическими сайтами связывания нуклеотидов, где нуклеотиды на основе гуанина в первом сайте индуцируют образование димера, а связывание дНТФ со вторым сайтом приводит к сборке каталитически активный тетрамер. SAMHD1-CtD необходим для образования тетрамера, обеспечивая критические молекулярные контакты с соседними протомерами. Более того, дестабилизация тетрамера посредством CDK1/2-циклинА-зависимого фосфорилирования T592 в SAMHD1-CtD эндогенно ослабляет активность SAMHD1 в циклирующих клетках [46, 63-65]. Соответственно, возможно, что, изолируя SAMHD1-CtD, Vpr _mus дестабилизирует тетрамер SAMHD1 и, таким образом, аннулирует активность SAMHD1, прежде чем вызвать его протеасомную деградацию, в соответствии с предыдущим наблюдением Vpx _{, опосредованного ВИЧ-2} . Разборка тетрамера SAMHD1 и ингибирование активности дНТФазы [62].

Предсказания относительно молекулярного механизма связывания SAMHD1 другими «гибридными» ортологами Vpr затруднены из-за расхождения последовательностей.Даже в Vpr _deb , наиболее близком по отношению к Vpr _mus , сохраняется только приблизительно 50% боковых цепей аминокислот, выстилающих предполагаемый карман связывания SAMHD1-CtD (S6A Fig). Предыдущие эксперименты по убиквитинированию in vitro и клеточной деградации не показали явного предпочтения Vpr _deb для рекрутирования либо SAMHD1-NtD, либо –CtD [24, 49]. Кроме того, спорным является вопрос о том, действительно ли Vpr _deb связывает DCAF1 [66], что, возможно, можно объяснить аминокислотными вариациями на самом N-конце и/или в Helix-3 (S6A Fig). Vpr _syk специфичен для SAMHD1-CtD [49], но большинство остатков, образующих платформу связывания SAMHD1-CtD, наблюдаемых в настоящем исследовании, не являются консервативными. Линия белков Vpr SIV _agm еще более дивергентна, со значительными различиями не только в возможных остатках, контактирующих с SAMHD1, но и в участках последовательности, предшествующих Helix-1 и соединяющих спирали-2 и -3, а также в N-концевая половина Helix-3 (фиг. S6A). Кроме того, есть указания на то, что рекрутирование SAMHD1 с помощью Vpr _{agm.Подтип GRI} включает молекулярное распознавание как SAMHD1-NtD, так и –CtD [49, 53]. В заключение, повторяющиеся раунды эволюционной адаптации лентивирусов к фактору рестрикции SAMHD1 хозяина с последующей повторной адаптацией хозяина привели к высоковидоспецифическим, разнообразным молекулярным способам взаимодействия Vpr-SAMHD1. Аналогичная гонка молекулярных вооружений между внутренними клеточными противовирусными факторами-хозяевами и вирусными антагонистами сформировала видоспецифический лентивирусный антагонизм, например. факторы рестрикции хозяина семейства APOBEC3 и тетерин путем индукции их деградации соответствующими вирусными антагонистами Vif или Nef/Vpu [67–69].Кроме того, реадаптация вируса к определенным обезьяньим и человеческим вариантам этих рестрикционных факторов после межвидовой передачи принимала участие в появлении пандемических штаммов ВИЧ, что подчеркивает важность структурного понимания этих процессов [9]. В дополнение к представленному здесь случаю, необходима дальнейшая структурная характеристика комплексов SAMHD1-Vpr, чтобы полностью определить результаты этой конкретной гонки молекулярных вооружений вирус-хозяин.

Предыдущее исследование структуры DDB1/DCAF1/Vpr _HIV-1 в комплексе с neo -субстратом UNG2 показало, что Vpr _HIV-1 взаимодействует с UNG2, имитируя фосфатный остов ДНК.Точнее, остатки UNG2, выступающие в большую бороздку его эндогенного ДНК-субстрата, встраиваются в гидрофобную щель, образованную Vpr _HIV-1 Helices-1, -2 и N-концевой половиной Helix-3 [54]. . Этот механизм может объяснить необычайную неразборчивость связывания Vpr _HIV-1 , поскольку список потенциальных субстратов деградации Vpr _HIV-1 значительно обогащен ДНК- и РНК-связывающими белками [27]. Более того, было высказано предположение, что неразборчивая Vpr _{, индуцированная ВИЧ-1} , деградация факторов хозяина с ДНК- или РНК-связывающей активностью вызывает остановку клеточного цикла на границе фазы G2/M, что является наиболее подробно описанным фенотипом белков Vpr. далеко [26, 27, 70].В Vpr _mus N-концевая половина Helix-1, а также объемный аминокислотный остаток W48, который также сохраняется в Vpr _agm и Vpx, сужают гидрофобную щель (S6A, B Fig). Кроме того, удлиненный N-конец Vpr _mus Helix-3 несовместим со связыванием UNG2 из-за стерического исключения (рис. S6C). В соответствии с этими наблюдениями, Vpr _mus не подавляет UNG2 в линии Т-клеток человека [27]. Однако Vpr _mus , Vpr _syk и Vpr _agm также вызывают остановку клеточного цикла G2/M в соответствующих клетках-хозяевах [66, 71, 72]. Это убедительно указывает на существование дополнительных структурных детерминант у Vpr _mus , Vpr _syk , Vpr _agm и потенциально Vpr _HIV-1 , которые регулируют рекрутирование и убиквитилирование ДНК/РНК-связывающих факторов хозяина, кроме того к гидрофобной, имитирующей ДНК щели на вершине пучка из трех спиралей. Будущие усилия по структурной характеристике этих детерминант еще больше расширят наше понимание того, как спиральный каркас Vpx/Vpr связывается и, таким образом, адаптируется к множеству neo -субстратных эпитопов.

Наши крио-ЭМ реконструкции CRL4 ^DCAF1-CtD /Vpr _mus /SAMHD1, дополненные CLMS, также дают представление о структурной динамике сборок CRL4 до переноса убиквитина. Данные подтверждают ранее описанное вращательное движение ножки CRL4 в отсутствие ограничений, налагаемых кристаллической решеткой, создавая зону убиквитилирования вокруг субстратного рецептора, модифицированного Vpr _mus (рис. 3 и 7А) [13, 15, 16, 19, 57]. Отсутствие плотности для недилированного домена CUL4 WHB и для каталитического домена ROC1 RING указывает на то, что эти дистальные элементы стебля очень подвижны и, вероятно, имеют множество ориентаций относительно каркаса CUL4 (рис. 7B).Эти наблюдения согласуются со структурным анализом CRL1 и CRL5, где недилирование CUL1/5 приводит к переориентации домена WHB кулина и высвобождению домена ROC1 RING из каркаса куллина одновременно со стимуляцией активности убиквитилирования [56]. ]. Более того, недавний крио-ЭМ анализ структуры CRL1 ^β-TRCP /IκBα продемонстрировал значительную подвижность прекаталитических доменов CUL1-NEDD8 WHB и ROC1 RING [73]. Такая гибкость, по-видимому, необходима для структурной организации множественных CRL1-зависимых процессов, в частности, зародышеобразования каталитической сборки, включающей сложные белок-белковые взаимодействия между NEDD8, CUL1, заряженным убиквитином E2 и субстратным рецептором.Эта синергетическая сборка затем направляет С-конец убиквитина к субстрату лизина для праймирования убиквитином [73]. Соответственно, наши крио-ЭМ исследования могут указывать на то, что аналогичные принципы применимы к катализируемому CRL4 убиквитилированию. Однако, чтобы разгадать каталитическую архитектуру CRL4, должны быть проведены сложные процедуры перекрестного связывания, как в ссылке (73).

Sf9 осаждали центрифугированием при 1000 об/мин, 4°С в течение 30 мин с использованием центрифужного ротора JLA 9.1000 (Beckman). Клетки E. coli осаждали центрифугированием при 4000 об/мин, 4°С в течение 15 мин с использованием того же ротора.Осадок клеток ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, 0,5 мМ трис-(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP), мини-полные ингибиторы протеазы (1 таблетка на 50 мл) и 20 мМ имидазол (только для His-меченых белков). 100 мл лизирующего буфера использовали для ресуспендирования осадка из 1 л культуры Sf9 и 35 мл лизирующего буфера на осадок из 1 л культуры E. coli . Перед ресуспендированием осадков коэкспрессии CUL4/ROC1 рН буфера доводили до 8,5. Добавляли 5 мкл бензоназы (Merck) и клетки лизировали, пропуская суспензию не менее двух раз через Microfluidizer (Microfluidics).Лизаты осветляли центрифугированием при 48000 g в течение 45 мин при 4°С. Очистку белков проводили при 4°C на Äkta pure FPLC (GE) с использованием хроматографических колонок XK 16/20 (GE), содержащих 10 мл соответствующей аффинной смолы. GST-меченые белки были захвачены на глутатион-сефарозе (GSH-Sepharose FF, GE), промыты 250 мл промывочного буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 7,8, 500 мМ NaCl, 4 мМ MgCl ₂ , 0,5 мМ TCEP). и элюировали тем же буфером с добавлением 20 мМ восстановленного глутатиона.Белки, меченные His, иммобилизовали на Ni-Sepharose HP (GE), промывали 250 мл промывочного буфера с добавлением 20 мМ имидазола и элюировали промывочным буфером, содержащим 0,3 М имидазол. Фракции элюента анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и доводили до 5 мл с помощью центрифужных фильтрующих устройств (Vivaspin). Если применимо, добавляли 100 мкг протеазы GST-3C или 50 мкг тромбина на мг общего белка, и образец инкубировали в течение 12 часов на льду для отщепления аффинных меток. В качестве второго этапа очистки выполняли гель-фильтрационную хроматографию (ГФ) на Äkta prime plus FPLC (GE) с колонками Superdex 200 16/600 (GE), уравновешенными в 10 мМ Tris-HCl, pH 7.8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl ₂ , 0,5 мМ буфер TCEP, скорость потока 1 мл/мин. Для очистки комплекса CUL4/ROC1 рН всех буферов для очистки доводили до 8,5. Пиковые фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до прибл. 20 мг/мл, мгновенно замороженные в жидком азоте небольшими аликвотами и хранящиеся при температуре -80°C. Концентрации белков определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop (ND 1000, Peqlab) с использованием теоретических коэффициентов поглощения, рассчитанных на основе аминокислотной последовательности с помощью ProtParam на веб-сервере ExPASy [85].

Аналитический гель-фильтрационный анализ

Перед гель-фильтрационным анализом аффинные метки удаляли путем инкубации 30 мкг протеазы GST-3C с 6 мкМ каждого белкового компонента в объеме 150 мкл промывочного буфера с последующей инкубацией на льду в течение 12 ч. . Чтобы удалить расщепленную GST-метку и протеазу GST-3C, добавляли 20 мкл гранул GSH-Sepharose FF (GE) и образец вращали при 4 °C в течение одного часа. Гранулы GSH-сефарозы удаляли центрифугированием при 4°C, 3500 об/мин в течение 5 мин и 120 мкл супернатанта загружали на аналитическую колонку GF (Superdex 200 10/300 GL, GE), уравновешенную в 10 мМ Tris-HCl. рН 7.8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl ₂ , 0,5 мМ TCEP, скорость потока 0,5 мл/мин. Фракции объемом 1 мл собирали и анализировали с помощью SDS-PAGE. Для следующих контрольных образцов 120 мкл очищенного белка наносили непосредственно на колонку GF, потому что не нужно было удалять метку очистки путем расщепления: SAMHD1, T4L-SAMHD1-CtD, SAMHD1-ΔCtD. Для этих образцов концентрация была доведена до 18 мкМ, 37 мкМ и 30 мкМ, соответственно, для учета более низкого коэффициента экстинкции этих выделенных белковых компонентов, чтобы обеспечить лучшую визуализацию пика элюции. Колонку GF калибровали с использованием калибровочного набора для гель-фильтрации (GE) с высоким молекулярным весом (HMW) в соответствии с инструкциями производителя.

160 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкМ субстрата (указанные конструкции SAMHD1, S2 рис.), 0,125 мкМ DDB1/DCAF1-CtD, 0,125 мкМ pr-TUL4/SUV-SUV-ROC1, 0,12MOC1, 0,12MOC1 _мус (остатки 1-92), 0,25 мкМ UBCH5C, 15 мкМ убиквитина в 20 мМ трис-HCl, рН 7,8, 150 мМ NaCl, 2.5 мМ MgCl ₂ , 2,5 мМ АТФ. В контрольных реакциях некоторые компоненты были исключены, как показано на рис. S2. Был взят образец объемом 30 мкл для анализа SDS-PAGE (t=0). Реакции инициировали добавлением 0,05 мкМ UBA1, инкубировали при 37°C и через 1 мин, 2 мин, 5 мин и 15 мин отбирали 30 мкл образцов SDS-PAGE, сразу смешивали с 10 мкл буфера для образцов 4x SDS и кипятили при 95°С в течение 5 мин. Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE.

Для начальных испытаний неддилирования была подготовлена ​​200 мкл реакционная смесь, содержащая 8 мкМ CUL4/ROC1, 1. 8 мкМ UBC12, 30 мкМ NEDD8 в 50 мМ Tris-HCl pH 7,8, 150 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl ₂ , 2,5 мМ АТФ. Для SDS-PAGE отбирали 2 образца по 30 мкл, один немедленно смешивали с 10 мкл 4x буфера для образцов SDS, другой инкубировали в течение 60 мин при 25°C. Реакцию инициировали добавлением 0,7 мкМ APPBP1/UBA3, инкубировали при 25°C, и через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 30 мин и 60 мин отбирали 30 мкл образцов SDS-PAGE, сразу же смешивали с 10 мкл 4x буфер для образца SDS и кипятят при 95°C в течение 5 мин. Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE.На основании этого теста объем реакции увеличили до 1 мл и инкубировали в течение 5 мин при 25°C. Реакцию гасили добавлением 5 мМ TCEP и немедленно загружали в колонку Superdex 200 16/600 GF (GE), уравновешенную 10 мМ Tris-HCl, pH 7,8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl ₂ , 0,5 мМ TCEP при скорость потока 1 мл/мин. Пиковые фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до ~20 мг/мл, мгновенно замораживали в жидком азоте небольшими аликвотами и хранили при -80°C.

Подготовка образцов для рентгеновской кристаллографии, кристаллизация, сбор данных и структурное решение

Комплекс DDB1/DCAF1-CtD

Кристаллы DDB1/DCAF1-CtD выращивали методом диффузии паров висячей капли путем смешивания равных объемов (1 мкл) раствора DDB1/DCAF1-CtD в концентрации 10 мг/мл с резервуарным раствором, содержащим 100 мМ цитрата Tri-Na, рН 5.5, 18% ПЭГ 1000 и суспендируют над резервуаром объемом 500 мкл. Кристаллы росли в течение ночи при 18°С. Кристаллы подвергали криозащите в резервуарном растворе с добавлением 20% глицерина и криоохлаждению в жидком азоте. Набор данных с монокристалла был собран в Diamond Light Source (Didcot, Великобритания) при длине волны 0,

Комплекс DDB1/DCAF1-CtD/T4L-Vprmus (1-92)

Комплекс DDB1/DCAF1-CtD/Vpr _мус был собран путем инкубации очищенных DDB1/DCAF1-CtD и HisSUMO-T4L-Vpr _мус (остатки 1-92), в молярном соотношении 1:1, в буфере, содержащем 50 мМ бис-трис-пропана, рН 8,5, 0,5 М NaCl, 4 мМ MgCl ₂ , 0,5 мМ TCEP, содержащий 1 мг HRV- Протеаза 3C для удаления HisSUMO-tag. После инкубации на льду в течение 12 часов образец загружали в колонку Superdex 200 16/600 GF (GE) с колонкой 1 мл GSH-Sepharose FF (GE), подключенной в линию.Колонку уравновешивали 10 мМ бис-трис-пропана, рН 8,5, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2 и 0,5 мМ TCEP. Скорость потока через колонку составляла 1 мл/мин. Фракции GF анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 4,5 мг/мл.

Кристаллы были приготовлены методом диффузии пара сидячей каплей путем смешивания равных объемов (200 нл) белкового комплекса с концентрацией 4,5 мг/мл и резервуарного раствора, содержащего 8-10% ПЭГ 4000 (масса/объем), 200 мМ MgCl ₂ , 100 мМ HEPES-NaOH, pH 7.0-8,2. Объем резервуара составлял 75 мкл. Кристаллы вырастали после по меньшей мере 4 недель инкубации при 4°С. Кристаллы подвергали криозащите в резервуарном растворе с добавлением 20% глицерина и криоохлаждению в жидком азоте. Были собраны наборы данных с двух монокристаллов, сначала в BESSY II (Helmholtz-Zentrum Berlin, HZB) при длине волны 0,

Å, а затем в ESRF (Гренобль) при длине волны 1 Å. Наборы данных обрабатывались отдельно с использованием XDS [86] и XDSAPP [90]. Структура расшифрована путем молекулярной замены с использованием исходного набора данных BESSY с помощью программы PHASER [91] и следующих структур в качестве поисковых моделей: DDB1/DCAF1-CtD (настоящая работа) и вариант T4L E11H (PDB 1qt6) [92]. ].После оптимизации исходной модели и уточнения по сравнению с набором данных ESRF с более высоким разрешением, Vpr _mus был помещен вручную в плотность, используя ЯМР-модель Vpr _HIV-1 (PDB 1m8l) [93] в качестве ориентира. Итерационные циклы настройки модели с помощью программы Coot [88] с последующим уточнением с помощью программы PHENIX [89] дали окончательное соотношение R/R _без факторов 21,61%/26,05%. В модели 95,1 % остатков имеют двугранные углы остова в предпочтительной области графика Рамачандрана, остальные попадают в разрешенные области, и ни один из них не является выбросом.Детали сбора данных и уточнения статистики представлены в таблице S1. Координаты и структурные факторы депонированы в PDB под инвентарным номером 6zx9.

Крио-ЭМ подготовка проб и сбор данных

Сборка комплекса

Очищенные CUL4-NEDD8/ROC1, DDB1/DCAF1-CtD, GST-Vpr _mus и SAMHD1 макака-резуса, 1 мкМ каждый, инкубировали в конечном объеме 1 мл 10 мМ Tris-HCl pH 7,8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl ₂ , 0,5 мМ TCEP, дополненный 1 мг протеазы GST-3C. После инкубации на льду в течение 12 часов образец загружали на колонку Superdex 200 16/600 GF (GE), уравновешенную тем же буфером со скоростью 1 мл/мин, с колонкой GSH-Sepharose FF (GE) объемом 1 мл, соединенной в линия. Фракции GF анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 2,8 мг/мл.

Подготовка сетки

3,5 мкл белкового раствора, содержащего 0,05 мкМ CUL4-NEDD8/ROC1/DDB1/DCAF1-CtD/Vpr _мус /SAMHD1 и 0,25 мкМ конъюгата UBCH5C-убиквитин (S4 A, B рис.), наносили на Перфорированная углеродная сетка Quantifoil R2/4 Cu/Rh 300 меш (Quantifoil Micro Tools GmbH), покрытая дополнительной тонкой углеродной пленкой в ​​качестве подложки для образца и окрашенная 2% уранилацетатом для начальной характеристики.Для крио-ЭМ свежую углеродную сетку Quantifoil R1.2/1.3 Cu с отверстиями 400 меш (Quantifoil Micro Tools GmbH) подвергали тлеющему разряду в течение 30 с с использованием плазменной очистки Harrick с техническим воздухом при 0,3 мбар и 7 Вт. Белок 3,5 мкл. раствор, содержащий 0,4 мкМ комплекса CUL4-NEDD8/ROC1/DDB1/DCAF1-CtD/Vpr _mus /SAMHD1 и 2 мкМ конъюгата UBCH5C-убиквитин, наносили на сетку, инкубировали в течение 45 с, блотировали с помощью устройства Vitrobot Mark II (FEI , Thermo Fisher Scientific) в течение 1-2 с при температуре 8°C и влажности 80% и погружали в жидкий этан.Сетки хранились в жидком азоте до визуализации.

Сбор данных крио-ЭМ

Исходные наборы данных отрицательного окрашивания и крио-ЭМ были собраны автоматически для контроля качества образцов и реконструкции с низким разрешением на крио-ЭМ Tecnai Spirit 120 кВ (FEI, Thermo Fisher Scientific), оснащенном F416 CMOS камеры (TVIPS) с использованием Leginon [94, 95]. Затем изображения частиц были проанализированы с помощью 2D-классификации и первоначальной реконструкции модели с использованием SPHIRE [96], cisTEM [97] и Relion 3.07 [98]. Эти данные выявили наличие комплексов, содержащих как DDB1/DCAF1-CtD/Vpr _mus (ядро), так и CUL4/ROC1 (стебель). Данные высокого разрешения были собраны на крио-ЭМ Tecnai Polara 300 кВ (FEI, Thermo Fisher Scientific), оснащенном детектором прямых электронов K2summit (Gatan) при номинальном увеличении 31000x с размером пикселя 0,625 Å/пиксель на масштаб объекта. Всего было собрано 3644 видеостека в режиме суперразрешения с использованием Leginon [94, 95] со следующими параметрами: диапазон расфокусировки 0.5-3,0 мкм, 40 кадров на фильм, время экспозиции 10 с, доза электронов 1,25 е/Å ² /с и кумулятивная доза 50 е/Å ² на фильм.

Крио-ЭМ вычислительный анализ

Видеоролики были совмещены и взвешены по дозе с использованием MotionCor2 [99], а начальная оценка функции передачи контраста (CTF) была выполнена с помощью пакета CTTFind4 [100]. Полученные микрофотографии были проверены вручную, чтобы исключить изображения со значительными загрязнениями (как правило, большими агрегатами белка или загрязнениями льда) или артефактами сетки.Спектры мощности проверялись вручную, чтобы исключить изображения с астигматическими, слабыми или плохо определенными спектрами. После этих этапов контроля качества набор данных включал 2322 микрофотографии (63% от общего числа). На этом этапе набор данных был выбран дважды и обработан отдельно, чтобы получить реконструкции состояний-1, -2 и -3 (анализ 1) и ядра (анализ 2).

Для анализа 1 положения частиц были определены с использованием программы гауссовского пикинга cisTEMs, в результате чего было получено в общей сложности 959 155 изображений частиц.После двух раундов 2D-классификации для дальнейшей обработки было отобрано 227 529 изображений частиц (S4C, D Fig). Используя эти данные, была создана исходная модель с использованием Relion 3.07. Полученная карта дала сильный сигнал для ядра, но только для фрагментированной плотности стебля, что указывает на большую неоднородность области стебля в наборе данных. Эта большая степень композиционной (+/- ножка) и конформационной неоднородности (движение ножки относительно ядра) усложняла классификацию.Соответственно, выравнивание и классификация проводились одновременно. Первая цель состояла в том, чтобы разделить набор данных на три категории: «мусор», «ядро» и «ядро+стебель».

Поэтому ножка была удалена из исходной модели с помощью инструмента «Ластик» в Chimera [101]. Эта основная карта использовалась в качестве исходной модели для 3D-классификации уровня 1 с Relion 3.07 с уменьшенным размером пикселя 2,5 Å/пиксель. Использовались следующие параметры: количество классов K=6, T=10, глобальный шаг поиска=7.5°, количество итераций = 25. Классификация дала два класса, содержащих стебель (классы 3 и 5, содержащие 23% и 22% изображений частиц соответственно) (рис. S4D). Эти частицы были объединены и направлены на 3D-классификацию уровня 2 с использованием следующих параметров: количество классов K=6, T=10, глобальный шаг поиска=7,5°, количество итераций=25. Три из этих классов дали карты среднего разрешения с интерпретируемыми функциями (состояния-1, -2 и -3, рис. S4D). Эти три класса были уточнены по отдельности с помощью 3D-автоматического уточнения в Relion 3. 07, в результате чего были получены карты с разрешением от 7,8 Å до 8,9 Å (рис. S4E-G).

Для анализа 2 положения частиц определяли с помощью сопоставления шаблона с отфильтрованной картой, включающей ядро ​​и основу, с использованием программного обеспечения Gautomatch (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/research/locally-developed- программное обеспечение/чжан-программное обеспечение/). Было найдено 712 485 изображений частиц, извлеченных с помощью Relion 3.07 и впоследствии 2D-классифицированных с помощью cryoSPARC [102], в результате чего после отбора было получено 505 342 изображения частиц (S5A, B Fig).Эти изображения частиц были разделены на два подмножества одинакового размера, и для уменьшения вычислительной нагрузки была выполнена трехмерная классификация уровня 1 с использованием Relion 3.07 для обоих из них (рис. S5B). Были использованы следующие параметры: начальная модель = «ядро», количество классов K = 4, T = 10, глобальный шаг поиска = 7,5 °, количество итераций = 25, размер пикселя 3,75 Å/px. Из них были отобраны те, у которых есть и сердцевина, и стебель. Классы, изображающие одинаковую ориентацию стебля относительно ядра, были объединены и направлены на уровень 2 в виде трех разных субпопуляций, содержащих 143 172, 193 059 и 167 666 изображений частиц соответственно (рис. S5B).

Для уровня 2 каждая субпопуляция была классифицирована отдельно по 4 классам. Из этих 12 классов все изображения частиц, демонстрирующие четко определенные плотности ядра и стебля, были объединены и помечены как «ядро + стебель», в результате чего в общей сложности было получено 310 801 изображение частиц. 193 096 изображений частиц, представляющих классы, содержащие только ядро, были объединены и помечены как «ядро» (рис. S5B).Подмножество «ядро + стебель» было разделено на 6 классов, 5 из которых содержали как стебель, так и сердцевину (рис. S5B), а один класс состоял только из ядра со связанным Vpr _mus . 5 классов со стеблем показали ориентацию стебля, аналогичную той, что была получена в результате анализа 1 (см. выше, S4 рис.), но были уточнены по отдельности до более низкого разрешения, как в анализе 1, и были отброшены. Однако индивидуальное уточнение класса уровня 3 только для ядра дало реконструкцию 7,3 Å (S5C, рис. D).

Молекулярная визуализация, подгонка твердого тела, трехмерное структурное выравнивание, анализ вращения и интерфейса

Карты плотности и атомные модели были визуализированы с помощью Coot [88], PyMOL (Schrödinger) и UCSF Chimera [101].Подгонка жесткого тела и структурное выравнивание выполнялись с использованием программы UCSF Chimera [101]. Углы поворота между крайними положениями домена DDB1 BPB измеряли с помощью сервера DynDom [103] (http://dyndom.cmp.uea.ac.uk/dyndom/runDyndom.jsp). Молекулярные интерфейсы анализировали с помощью сервера EBI PDBePISA [104] (https://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver).

Масс-спектрометрия сшивки (CLMS)

Сборка комплекса

Очищенные CUL4/ROC1, DDB1/DCAF1-CtD, GST-Vpr _mus и SAMHD1 макака-резуса, по 1 мкМ каждого, инкубировали в объеме 3 мл буфер, содержащий 10 мМ HEPES pH 7. 8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl ₂ , 0,5 мМ TCEP, дополненный 1 мг протеазы GST-3C. После инкубации на льду в течение 12 ч образец загружали на колонку Superdex 200 16/600 GF (GE), уравновешенную тем же буфером, со скоростью потока 1 мл/мин с колонкой 1 мл GSH-Sepharose FF ( GE) подключены в линию. Фракции GF анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 6 мг/мл.

Photo-Crosslinking

Сшивающий агент сульфо-SDA (сульфосукцинимидил-4,4′-азипентаноат) (Thermo Scientific) растворяли в сшивающем буфере (10 мМ HEPES pH 7.8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, 0,5 мМ TCEP) до 100 мМ перед использованием. Стадию мечения проводили путем инкубации аликвот по 18 мкг комплекса в концентрации 1 мг/мл с добавлением 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 мМ сульфо-SDA, соответственно, в течение часа. Затем образцы облучали УФ-светом с длиной волны 365 нм для образования поперечных связей в течение 20 мин и гасили 50 мМ Nh5HCO3 в течение 20 мин. Все шаги выполнялись на льду. Продукты реакции разделяли на геле Novex Bis-Tris 4–12% SDS-PAGE (Life Technologies). Полосу геля, соответствующую сшитому комплексу, вырезали и расщепляли трипсином (Thermo Scientific Pierce) [107], а полученные триптические пептиды экстрагировали и обессоливали с помощью C18 StageTips [108].Элюированные пептиды фракционировали на колонке Superdex Peptide 3,2/300 (GE Healthcare) при скорости потока 10 мкл/мин с использованием 30% (об./об.) ацетонитрила и 0,1% (об./об.) трифторуксусной кислоты в качестве подвижной фазы. Фракции по 50 мкл собирали и сушили в вакууме.

Получение методом CLMS

Образцы для анализа ресуспендировали в 0,1% (об./об.) муравьиной кислоте, 3,2% (об./об.) ацетонитриле. Анализ ЖХ-МС/МС выполняли на масс-спектрометре Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Fisher), соединенном в режиме реального времени с системой ВЭЖХ Ultimate 3000 RSLCnano (Dionex, Thermo Fisher).Образцы разделяли на колонке EASY-Spray длиной 50 см (Thermo Fisher). Подвижная фаза А состояла из 0,1% (об. /об.) муравьиной кислоты, а подвижная фаза В состояла из 80% (об./об.) ацетонитрила с 0,1% (об./об.) муравьиной кислоты. Скорость потока составляла 0,3 мкл/мин с использованием градиентов, оптимизированных для каждой хроматографической фракции автономного фракционирования, в диапазоне от 2% подвижной фазы B до 55% подвижной фазы B в течение 90 минут. Данные МС были получены в режиме зависимости от данных с использованием настройки максимальной скорости с временем цикла 3 с. Для каждого цикла с помощью Orbitrap записывали полный сканирующий масс-спектр с разрешением 120 000 в диапазоне от 400 до 1 500 м/з.Ионы с исходным зарядовым состоянием от 3+ до 7+ были выделены и фрагментированы. Фрагментация аналита была достигнута с помощью высокоэнергетической столкновительной диссоциации (HCD) [109], после чего спектры фрагментации были записаны в Orbitrap с разрешением 50 000. Динамическое исключение было включено с подсчетом одиночных повторов и длительностью исключения 60 с.

Обработка CLMS

Повторная калибровка предшественника m/z была проведена на основе высокодостоверных (<1% доля ложных открытий (FDR)) линейных идентификаций пептидов. Повторно откалиброванные списки пиков сравнивали с последовательностями и обратными последовательностями (в качестве ловушек) перекрестно-сшитых пептидов с использованием пакета программного обеспечения Xi (v.1.7.5.1) для идентификации [110]. Окончательные списки перекрестных связей были составлены с использованием идентифицированных кандидатов, отфильтрованных до <1% FDR на уровне связи с xiFDR v.2.0 [111], обеспечивающим минимальное покрытие последовательностей 20% и 4 наблюдаемых фрагмента на пептид.

Анализ CLMS

Для того чтобы выбрать доступный объем взаимодействия SAMHD1-CtD в соответствии с данными CLMS, модель SAMHD1 была создана с использованием I-TASSER [112].Из модели был извлечен SAMHD1-CtD со случайной конфигурацией катушки. Чтобы отобразить все перекрестные связи, недостающие петли в сложной структуре были сгенерированы с помощью MODELLER [113]. Затем поиск объема взаимодействия был отправлен на веб-сервер DisVis [61] с допустимым расстоянием от 1,5 Å до 22 Å для каждого ограничения с использованием опции «полное сканирование». Интервал выборки вращения был установлен на 9,72 °, а шаг вокселя сетки — на 1 Å. Доступный объем взаимодействия визуализировали с помощью UCSF Chimera [101].

Спектроскопия кругового дихроизма (CD)

Для оценки содержания вторичной структуры Vpr _mus , меченного GST, и двойных мутантов R15E/R75E и W29A/A66W была проведена спектроскопия CD. Образцы белка подвергали диализу в течение ночи при 4°C против буфера CD (смесь 100 мМ NaF, 10 мМ K ₂ HPO ₄ /KH ₂ PO ₄ , pH 8,5) и концентрацию белка доводили до 0,2 мг. /мл. Для каждого образца регистрировали три повторных спектра КД в 1.Шаг 0 нм в диапазоне 190-260 нм. Измерения проводились в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 0,05 см (Hellma, Мюльхайм, Германия) при 20°C на спектрополяриметре Chirascan (Applied Photophysics, Лондон, Великобритания). Эталонный спектр буфера CD вычитали из усредненного спектра образца белка. Измеренная эллиптичность в миллиградусах (m°) была преобразована в молярную эллиптичность [Θ] в соответствии с уравнением Θ=m°*M/(10xLxC), где M — средняя молекулярная масса белка, L — длина пути измерительной ячейки, а C — молярная концентрация белка. Молярную эллиптичность строили в зависимости от длины волны с использованием SigmaPlot версии 14.0 (Systat Software Inc., Сан-Хосе, Калифорния, США).

Доступность данных

Координаты и структурные факторы для кристаллических структур были депонированы в Банке белковых данных (PDB) с кодами доступа 6ZUE (DDB1/DCAF1-CtD) и 6ZX9 (DDB1/DCAF1-CtD/T4L-Vpr _муз 1-92). Крио-ЭМ-реконструкции были депонированы в банке данных электронной микроскопии (EMDB) под кодами доступа EMD-10611 (основной), EMD-10612 (конформационное состояние-1), EMD-10613 (состояние-2) и EMD-10614 ( состояние-3).Данные CLMS депонированы в базе данных PRIDE [114] под кодом доступа PXD020453, пароль рецензента fCrQG2u8.

Благодарности

Мы благодарим MPI-MG за предоставление доступа к инструментам TEM группы обслуживания микроскопии и крио-ЭМ. Мы благодарим доктора Манфреда Вайса и научный персонал BESSY-MX (Макромолекулярная рентгеновская кристаллография)/Helmholtz Zentrum Berlin für Materialien und Energie на каналах BL14. 1, BL14.2 и BL14.3, эксплуатируемых Joint Berlin MX. — Лаборатория на кольце хранения электронов BESSY II (Берлин-Адлерсхоф, Германия), а также научный персонал ESRF (Гренобль, Франция) на каналах ID30A-3, ID30B, ID23-1, ID23-2 и ID29 для непрерывного служба поддержки.Мы благодарим компанию Diamond Light Source (Didcot, Великобритания) за доступ и поддержку синхротронного луча I04 и крио-ЭМ-оборудования в Национальном центре электронной биовизуализации Великобритании (eBIC). Кроме того, авторы признательны Северогерманскому альянсу суперкомпьютеров (HLRN) и кластеру высокопроизводительных вычислений для исследований Берлинского института здравоохранения за предоставление ресурсов для высокопроизводительных вычислений. Мы благодарны профессору Удо Хайнеманну и Цзяньхуэй Вану (Max-Delbrück-Centrum, Берлин, Германия) за доступ и помощь во время спектроскопии КД.Плазмида pHisSUMO была щедрым подарком доктора Евангелоса Христодулу (Институт Фрэнсиса Крика, Лондон, Великобритания). Матрица кДНК SAMHD1 макаки-резуса была щедрым подарком профессора Майкла Эмермана (Центр исследования рака им. Фреда Хатчинсона, Сиэтл, США). Рекомбинантная бакмида BAC10:1629KO была щедрым подарком профессора Яна Джонса (Университет Рединга, Великобритания). pAcGHLT-B-DDB1 был подарен профессором Нин Чжэн (плазмида Addgene 48638). pET28-mE1 был подарен профессором Хорхе Эдуардо Азеведо (плазмида Addgene 32534).

Принципы дизайна регуляторов транскрипции на основе CRISPR с дефицитом нуклеаз | Исследование дрожжей FEMS

Аннотация

Разработка кластеризованных регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR) — CRISPR-ассоциированных белков продолжает расширять набор инструментов, доступных для редактирования генома, перепрограммирования регуляции генов, визуализации генома и эпигенетических исследований живых организмов. В этом обзоре будут представлены новые принципы дизайна с использованием перепрограммирования экспрессии генов на основе CRISPR с дефицитом нуклеаз.В обзоре основное внимание будет уделено конструкциям, реализованным в дрожжах как на уровне белков CRISPR, так и на направляющей РНК (гРНК), но, где это уместно, будут отданы должное исходным исследованиям, проведенным на других видах. В дополнение к принципам дизайна в этом обзоре также освещаются приложения, извлекающие выгоду из использования регуляции транскрипции, опосредованной CRISPR, и обсуждаются будущие направления дальнейшего расширения набора инструментов для перепрограммирования геномов с дефицитом нуклеаз. Таким образом, этот обзор должен представлять общий интерес для экспериментаторов, чтобы ознакомиться с параметрами, лежащими в основе возможностей перепрограммирования геномных функций с использованием технологий CRISPR с дефицитом нуклеаз.

ВВЕДЕНИЕ

Живые клетки регулируют экспрессию генов за счет координированных действий ДНК-связывающих регуляторов транскрипции, РНК-полимераз и арсенала вспомогательных коактиваторов (Hahn 2004). Сложная сеть механизмов транскрипции контролирует основные функции, такие как клеточная дифференцировка, клеточное деление, реакции на условия окружающей среды и метаболизм. Наше механистическое понимание генов и путей, подтверждающих своевременное и адекватное выполнение этих важных функций, в значительной степени опиралось на исследования функциональной геномики, часто сопровождаемые эффективными методологиями для точного контроля нарушений экспрессии генов (Khalil et al. 2012; Si и др. 2015).

РНК-интерференция, посттранскрипционный механизм молчания генов, запускаемый малыми интерферирующими РНК или короткими шпилечными РНК, образованными в результате эндонуклеазно-опосредованной РНКазы III деградации двухцепочечных РНК, является одной из таких методологий (Drinnenberg et al. 2009). С помощью итеративной РНКи у микробов был оптимизирован нокдаун нескольких генов, связанных с химической устойчивостью и производством гетерологичных метаболитов (Crook, Schmitz and Alper, 2013; Si et al. 2015). Другой метод, используемый для изменения экспрессии сотен генов, называемый глобальная инженерия транскрипционных механизмов (gTME), основан на введении мутантных библиотек общих факторов транскрипции, регулирующих специфичность промотора, а затем на скрининге определенных фенотипов с последующей характеристикой и подтверждением мутантного контекста гена. фактор транскрипции и анализ транскриптома (Alper et al. 2006). Кроме того, для целенаправленной регуляции генов восходящая инженерия синтетических факторов транскрипции на основе белков гибридных цинковых пальцев (ZF) и промоторов для ортогонального контроля экспрессии генов выявила важные параметры для скоординированной, настроенной и пространственной регуляции экспрессии генов (Khalil и др. 2012). В совокупности разработка методов исследования условной потери функции путем нарушений экспрессии нескольких генов оказалась важной для нашего понимания функции генов, особенно при изучении функции основных генов и полигенных признаков (например, химической устойчивости). . Однако, хотя вышеупомянутые методы поддерживают простое нацеливание на множественные гены для нокдауна и сверхэкспрессии, недостатки очевидны. Это включает в себя отсутствие специфичности и ограниченный регуляторный потенциал (RNAi), необходимость введения синтетического геномного материала (ZF) или потребность в системе скрининга для отбора глобальных транскрипционных изменений, которые не предполагались a priori (gTME).

С 2013 г. система бактериальных коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами (CRISPR)–Cas вдохновила на рациональную разработку ортогональных синтетических стратегий перепрограммирования транскрипции, основанных на РНК-опосредованном нацеливании белков Cas с дефицитом нуклеаз на заранее определенные геномные локусы (Larson et и др. , 2013 г.; Qi и др., , 2013 г.). Вкратце, системы CRISPR-Cas основаны на древней бактериальной адаптивной иммунной системе, в которой CRISPR-ассоциированный белок (Cas) направляется в геномные локусы с помощью направляющей РНК (гРНК) с последовательностью 20 нуклеотидов, комплементарной геномному сайту-мишени (Jinek и др. 2012; Конг и др. 2013). На этой платформе появились две основные системы для (i) редактирования генома с использованием гРНК-опосредованных эндонуклеазно-опосредованных разрывов ДНК (DSB) для облегчения как нокаута, так и нокаута гена (Jinek et al. 2012; Cong et al. 2013), и (ii) dCas-опосредованная транскрипционная и посттранскрипционная регуляция с дефицитом нуклеаз, выяснение эпигенетических ландшафтов и редактирование оснований с дефицитом DSB, и это лишь некоторые из них (Qi et al. 2013; Lenstra и другие. 2015; Фу и др. 2016; Нисида и др. 2016; Кокс и др. 2017). С точки зрения регуляции транскрипции, нуклеазо-дефицитные формы CRISPR-ассоциированного белка Cas9 типа II, называемого dCas9, из Streptococcus pyogenes , были признаны мощной платформой для перепрограммирования экспрессии генов и геномной функции. По сути, dCas9 представляет собой мутант Cas9, нуклеазная активность которого снижена за счет мутаций в нуклеазных доменах RuvC и HNH, но при этом сохраняется способность связывания ДНК, запрограммированная гРНК (Qi et al. 2013). Первоначально было продемонстрировано, что dCas9 и гРНК могут опосредовать эффективную репрессию генов в бактериях, когда dCas9 направляется в проксимальные положения промотора ниже сайта начала транскрипции (TSS), механизм, созданный интерференцией CRISPR (CRISPRi) (Larson et al. 2013 г. ; Qi и др. , 2013 г.).

В последние годы стало очевидным, что по сравнению с упомянутыми выше традиционными подходами к перепрограммированию функции генома с помощью ненативных регуляторов транскрипции нуклеазо-дефицитные варианты Cas9 и бактерии Lachnospiraceae ND2006 Cpf1 являются мощными РНК-управляемыми технологии регуляции генома дрожжей.В частности, широкое распространение получили удобство, специфичность, надежность и масштабируемость активации и репрессии эндогенных генов (Фарзадфард, Перли и Лу, 2013; Гилберт, и др., , 2013; Залатан, и др., , 2015; Лиан, и др., ). 2017). Кроме того, CRISPR-опосредованная регуляция транскрипции представляет собой мощный подход к целевому, комбинаторному и настраиваемому интерфейсу перепрограммирования транскрипции, особенно с учетом простоты синтеза и экспрессии гРНК без длительной генетической модификации геномов хозяина видов, сопротивляющихся трансформации и целенаправленному редактированию генома.

В этом обзоре будет рассмотрен огромный прогресс CRISPR-опосредованных систем, применяемых для репрограммирования регуляции транскрипции у дрожжей, включая обширный список факторов, влияющих на эффективность гРНК, и принципы дизайна для оптимальной реконфигурации dCas9 и dCpf1. В конце обзора будут освещены будущие перспективы использования белков Cas с дефицитом нуклеаз в сочетании с другими дополнительными появляющимися технологиями для перепрограммирования функций генома без необходимости экзогенной нуклеазной активности.Хотя этот обзор будет посвящен в основном опосредованному dCas9 перепрограммированию экспрессии генов в дрожжах, недавно был опубликован более независимый от хозяина обзор технологий CRISPR-dCas с дефицитом нуклеаз (Mitsunobu et al. 2017).

РЕГЛАМЕНТ ТРАНСКРИПЦИИ НА ОСНОВЕ CRISPR

Модуляция активности dCas9

Регуляция активности белка CRISPR слиянием белков

Регуляторы транскрипции имеют глобулярную форму. Чаще всего регуляторы включают два модульных домена, обеспечивающих (i) связывание ДНК и (ii) регуляторный домен, поддерживающий активацию или репрессию транскрипции (Jensen et al. 2010; Khalil et al. 2012). Благодаря этой модульности эксперименты по замене доменов оказались успешными для создания синтетических регуляторов транскрипции с определенной специфичностью связывания ДНК, слитых с различными регуляторными доменами, чтобы усилить транскрипционную активацию или репрессию как нативных, так и синтетических промоторов (Khalil et al. 2012; Фолчер и др. 2013). Модульность регуляторных доменов позволила разработать регуляторы транскрипции, которые могут регулировать экспрессию генов до гораздо более высоких уровней по сравнению с регуляторами, основанными только на нативной конструкции (Folcher et al. 2013).

Когда дефицитный по нуклеазе dCas9 первоначально использовался в бактериях, сообщалось о репрессии генов до 99,9% (Qi et al. 2013). Однако при использовании только dCas9 и одной гРНК в дрожжах для регуляции экспрессии целевого гена сообщалось лишь об умеренных репрессиях, варьирующихся от отсутствия эффекта до 2-3-кратной репрессии (Farzadfard, Perli and Lu 2013; Deaner, Mejia and Alper 2017; Vanegas, Lehka and Mortensen 2017), хотя в одном исследовании сообщалось о 18-кратном снижении активности репортерного гена (Gilbert et al. 2013). Этот уровень регуляции сравним с исследованиями на других эукариотах и ​​позволяет предположить, что одного комплекса гРНК с dCas9 недостаточно для стерического затруднения прогрессии РНК и/или блокировки инициации транскрипции (Gilbert et al. 2013; Lawhorn, Ferreira and Wang). 2014). Вдохновленные модульной конструкцией других синтетических регуляторов транскрипции и признавая, что белки CRISPR, связанные с гРНК, аналогичны простым молекулам, связывающимся с ДНК, исследования с использованием нарушений экспрессии, опосредованных dCas9 или dCpf1, в настоящее время включают дополнительные регуляторные домены, слитые с dCas9 и/или dCpf1 для улучшения потенциалов репрессии и активации (рис. 1а и б).

Рисунок 1.

Модуляция активности Cas9 и Cpf1 с дефицитом нуклеаз в дрожжах путем слияния доменов, регулирующих транскрипцию. ( a) Схематическая иллюстрация доменов репрессии транскрипции, которые были успешно слиты с активацией dCas9 CRISPR с дефицитом нуклеаз в дрожжах. ( b ) Схематическая иллюстрация доменов активации транскрипции, которые были успешно слиты с дефицитными по нуклеазе dCas9 и dCpf1 для активации CRISPR в дрожжах.

Рисунок 1.

Модуляция активности Cas9 и Cpf1 с дефицитом нуклеаз в дрожжах путем слияния доменов, регулирующих транскрипцию. ( a) Схематическая иллюстрация доменов репрессии транскрипции, которые были успешно слиты с активацией dCas9 CRISPR с дефицитом нуклеаз в дрожжах. ( b ) Схематическая иллюстрация доменов активации транскрипции, которые были успешно слиты с дефицитными по нуклеазе dCas9 и dCpf1 для активации CRISPR в дрожжах.

В своем основополагающем исследовании dCas9-опосредованной регуляции транскрипции у эукариот Gilbert et al. сравнили эффект слияния домена репрессора транскрипции млекопитающих, Mxi1, который, как сообщается, взаимодействует с модифицирующим хроматин гомологом гистоновой деацетилазы Sin3 в дрожжах, с dCas9 (Schreiber-Agus et al. 1995; Gilbert et al. 2013) ( Рис. 1а). Нацелившись на промотор TEF1 , dCas9-Mxi1 репрессировал активность репортерного гена в 53 раза по сравнению с упомянутым выше 18-кратным использованием только dCas9.Этот результат сравним с эффектом, о котором недавно сообщалось в исследовании Yarrowia lipolytica (Schwartz et al. 2017) . Здесь Schwartz et al. сообщили о 10-кратной репрессии уровней транскриптов MIh2 при использовании dCas9, но при прямом сравнении эффектов использования dCas9 по сравнению с dCas9-Mxi1 на гены Ku70 и Ku80 , связанные с негомологичным соединением концов, Шварц и др. наблюдали самый высокий уровень репрессии (87%) для Ku80 , когда гибрид dCas9-Mxi1 сравнивали с dCas9 (38%) (Schwartz et al. 2017). Для дальнейшего изучения дизайна слияния dCas9 для оптимальной репрессии Schwartz et al. и Гандер и др. (Gander et al. 2017) также тестировали слияния между dCas9 и Krüppel-ассоциированным блоком (или доменом KRAB) из геномов четвероногих позвоночных (Witzgall et al. 1994). Здесь Schwartz et al. обнаружили сопоставимые уровни обилия транскриптов в порядке 2–3-кратной репрессии для dCas9-KRAB, что также наблюдается для dCas9, в то время как Gander et al. наблюдали примерно 2,5-кратную репрессию для dCas9-KRAB по сравнению с примерно 12-кратной репрессией при использовании dCas9-Mxi1 для контроля экспрессии синтетического промотора на основе CYC1 (Gander et al. 2017). Эти результаты также подтверждаются математическими моделями, предсказывающими, что репрессия только через dCas9 пропускает больше, чем репрессия через dCas9-Mxi1 (Gander et al. 2017). Помимо Mxi1 и KRAB, Gander et al. также тестировали домены репрессии GAL80, LUG, TPLRD1, TUP1 и XTC1 (Flick and Johnston 1990; Edmondson, Smith and Roth 1996; Wu et al. 2001; Травен и др. 2002; Пьер-Жером и др. 2014), при этом LUG и TPLRD1 демонстрируют такой же потенциал репрессии, как и KRAB, в то время как ни слияния GAL80, TUP1 и XTC1 не показали никакой репрессии (Fig. 1a). Точно так же Lian et al. (2017) тестировали варианты репрессорных доменов TUP1, MIG1, CRT1, XTC1 и UME6 (Edmondson, Smith and Roth 1996; Ostling, Carlberg and Ronne 1996; Kadosh and Struhl 1997; Zhang and Reese 2005; Traven et al. 2002). ), и сообщили, что трехкомпонентный домен репрессии, сконструированный из UME6, MIG1 и TUP1, является наиболее успешной конструкцией для dCas9-опосредованной репрессии (до 5 раз более сильной репрессии по сравнению с dCas9-Mxi1), тогда как слияние с dCpf1 не было эффективным. для CRISPRi (Lian et al. 2017).

Помимо слияния репрессорных доменов, в нескольких исследованиях проводилось слияние белков CRISPR с одиночными и множественными доменами активации транскрипции, чтобы обеспечить CRISPR-опосредованную активацию экспрессии генов, называемую CRISPRa (Gilbert et al. 2014). У дрожжей Farzadfard et al. были первыми, кто показал, что dCas9 можно использовать в качестве активатора транскрипции при слиянии с активационным доменом (Farzadfard, Perli and Lu 2013). Здесь они первоначально протестировали dCas9-VP64, направленный либо на смысловую, либо на антисмысловую цепь минимального промотора CYC1 , и обнаружили несколько положений гРНК, обеспечивающих статистически значимое повышение репортерной флуоресценции порядка 1.в 5–3,0 раза (Фарзадфард, Перли и Лу, 2013). Аналогичные кратные изменения наблюдались для dCas9-VP64, нацеленного на промоторы GAL1 и ADE2 (Farzadfard, Perli and Lu 2013; Vanegas, Lehka and Mortensen 2017), в то время как Naranjo et al. сообщили о >100- и >250-кратном увеличении уровней транскриптов при использовании dCas9-VP64 и GAL4-dCas9-VP64, соответственно, для мишени FRM2 (Naranjo et al. 2015). активность под управлением любой из протестированных гРНК. Помимо тестирования dCas9-VP64 на CRISPRa, Farzadfard et al. также протестировали возможность управления несколькими копиями dCas9-VP64 и, таким образом, настройки активности репортерного промотора. Исходя из этого, авторы наблюдали, что активность репортерного гена увеличивалась до 70 раз при нацеливании dCas9-VP64 максимум на 12 идентичных позиций оператора с использованием одной гРНК (Farzadfard, Perli and Lu 2013). Одно интересное наблюдение, признанное уже на этой ранней стадии CRISPR-опосредованного репрограммирования транскрипции, заключалось в сильном влиянии, оказываемом положением гРНК по отношению к влиянию регуляции, основанной на dCas9.В частности, Farzadfard et al. обнаружили, что, хотя dCas9-VP64 мог служить активатором транскрипции, когда гРНК располагались выше ТАТА-бокса, наблюдалась значительная репрессия активности репортерного гена порядка 2–3 раз, когда слитый белок направлялся в положения, перекрывающиеся или ниже по течению от коробки ТАТА (Фарзадфард, Перли и Лу, 2013). Эффекты, специфичные для позиций гРНК, будут более подробно описаны в разделе «Модуляция активности гРНК».

В дополнение к однодоменному VP64 белки CRISPR также недавно были успешно слиты с комбинациями активаторов транскрипции, включая VPR, который сконструирован из четырехкратных копий вирусного белка простого герпеса (VP16), трансактивационного домена NF. субъединица p65 -kB (p65AD) и трансактиватор R вируса Эпштейна-Барр (Rta) (Chavez et al. 2016; Динер и Альпер, 2017 г.; Дженсен и др. 2017). Как свидетельствует Chavez et al. , сравнивая уровни экспрессии репортерного гена с использованием гРНК, нацеленных на промоторы дрожжей GAL7 и HED1 , dCas9-VPR опосредовал примерно 100- и 40-кратную активацию соответственно по сравнению со скромным 14- и 8-кратным увеличением, наблюдаемым при использовании dCas9. -VP64 (рис. 1b) (Чавес и др. , 2015 г.). Помимо использования дефицитного по нуклеазе Cas9 из S. pyogenes , Lian et al. систематически тестировали новые CRISPR-опосредованные активаторы транскрипции путем слияния нескольких белков CRISPR с дефицитом нуклеаз с активационными доменами (Lian et al. 2017). Здесь авторы обнаружили, что оптимальный домен активации зависел от белка Cas, протестированного с наиболее эффективным вариантом S. pyogenes dCas9, демонстрирующим до 12-кратной активации активности репортерного гена при слиянии с VPR, в то время как наиболее эффективный Вариант dCpf1 индуцировал до 8-кратной активации активности гена при слиянии с VP64-p65AD (Lian et al. 2017).

Признавая результаты исследований слияния dCas9, несколько групп с тех пор успешно применили dCas9-VPR для CRISPRa у дрожжей (Deaner and Alper 2017; Deaner, Mejia and Alper 2017; Jensen et al. 2017). Несмотря на то, что большинство наблюдаемых активаций находятся в диапазоне от 2 до 10 раз, Deaner et al. наблюдали более чем 160-кратные изменения экспрессии гена NDE2 при сравнении наилучшего положения гРНК для опосредования CRISPRi с использованием dCas9-Mxi1 и наиболее сильного положения гРНК для опосредования CRISPRa с использованием dCas9-VPR (Deaner and Alper 2017). В соответствии с выводами Farzadfard et al. , Deaner и Alper также сообщили о позиционно-специфическом потенциале dCas9-VPR для умеренной репрессии экспрессии генов (Farzadfard, Perli and Lu 2013; Deaner and Alper 2017).

В совокупности несколько исследований показали, что CRISPRi/a у дрожжей приводит к изменениям экспрессии и активности генов в порядке >50-кратного подавления и >100-кратного повышения, при этом dCas9-Mxi1 и dCas9-VPR в настоящее время являются наиболее частыми. принятые регуляторы.В общем, dCas9 является универсальным партнером по слиянию как для доменов активации, так и для доменов репрессии, однако оптимальный выбор регуляторных доменов, которые будут использоваться для репрограммирования транскрипции, может зависеть от белка CRISPR. Это открывает возможности для многофункционального перепрограммирования, опосредованного CRISPR, с использованием ортогональных последовательностей PAM различных белков CRISPR в качестве аналогов для вышестоящих активирующих (UAS) или репрессирующих последовательностей (Lian et al. 2017).

Регуляция экспрессии генов, кодирующих белки CRISPR

При использовании дефицитных по нуклеазе синтетических регуляторов на основе CRISPR важно понимать, что регуляторный потенциал регуляторов транскрипции неотъемлемо зависит от уровня экспрессии самого регулятора транскрипции, при этом более высокая экспрессия чаще всего обеспечивает наивысший уровень репрессии и/или активации рассматриваемого гена(ов)-мишени (Skjoedt et al. 2016). В соответствии с этим в большинстве исследований на дрожжах используются сильные конститутивные или гликолитические промоторы для управления экспрессией гена, кодирующего dCas9 и его варианты (Gilbert et al. 2013; Lian et al. 2017). Из S. Cerevisiae , это включает в себя TDH4 (или GDP1), TEF1 и PDC1 промоутами для использования в S. Cerevisiae и Kluyveromyces Marxianus (Gilbert et al. 2013; Chavez и другие. 2015; Смит и др. 2016; Намбу-Нишида и др. 2017), тогда как в Y. lipolytica Schwartz et al. использовали ранее сконструированный сильный конститутивный промотор, основанный на укороченном промоторе TEF1 , слитом с восемью копиями 105-п. Blanchin-Roland, Cordero Otero and Gaillardin 1994; Blazeck и др. 2011; Schwartz et al. 2016; Шварц и др. 2017).

В дополнение к конститутивной экспрессии dCas9 способность программировать начало регуляции гена-мишени побудила использовать индуцибельную экспрессию dCas9 для условного перепрограммирования транскрипции у дрожжей. При использовании синтетического промотора, первоначально разработанного Ellis et al. , была достигнута индуцируемая галактозой и ангидротетрациклином (aTc) экспрессия dCas9-VP64 (Ellis, Wang and Collins 2009; Farzadfard, Perli and Lu 2013), что позволило добиться 70-кратной индуцируемой экспрессии минимального промотора CYC1 с выходами сравним с активационным потенциалом других обычно используемых эндогенных промоторов GAL1 и CUP1 (Farzadfard, Perli and Lu 2013). Вместе с дополнительным набором свето- и аллостерически регулируемых систем CRISPR/Cas9, описанных в клетках млекопитающих (Gao et al. 2016; Oakes et al. 2016), такая галактозо- и aTc-индуцируемая экспрессия dCas9 и его вариантов позволяет контролировать начало экспрессии целевого гена.

Модуляция активности гРНК

Рекрутирование эффекторов слитыми с аптамерами гРНК

Неотъемлемая взаимосвязь между dCas9 и гРНК ограничивает dCas9-опосредованное программирование мультигенных генных цепей, основанных на транскрипции, только одним направлением регуляции (т.е. репрессия или активация) на уровне одной клетки. Это не выравнивает сложность и изощренность, лежащие в основе нативных транскрипционных сетей. Однако, по аналогии со слиянием регуляторных доменов с dCas9, инженерия самой гРНК оказалась модульной и настраиваемой платформой для диверсификации не только геномных сайтов-мишеней (исходной последовательности), но и функции CRISPR-опосредованной регуляции транскрипции.

Используя преимущество 3 ^΄ -конца гРНК, Zalatan et al. и Киани и др. были первыми, кто сконструировал гРНК с помощью РНК-аптамеров, взаимодействующих с белком (Kiani et al. 2015; Zalatan et al. 2015). У дрожжей это включало gRNAs, которые действительно могли контролировать не только локализацию dCas9 (и Cas9), но также и функцию. В своих основополагающих исследованиях они показали, что слияние РНК-аптамеров с tracr-частью гРНК позволяет связывать РНК-связывающие белки и тем самым контролировать регуляторный потенциал в зависимости от партнера по взаимодействию с белком, прикрепленного к РНК-связывающему белку (рис.2а) (Киани и др. 2015 г.; Залатан и др. 2015 г.). В частности, чтобы преобразовать как специфичность целевой последовательности, так и функцию в эти каркасные РНК (scRNAs), Zalatan et al. тестировали (i) разные аптамеры, (ii) 5 ^΄ — по сравнению с 3 ^΄ -концевыми слияниями, (iii) различное количество аптамеров, (iv) длину линкера между гРНК 5 ^΄ -концом и аптамером, и (v) ортогональность между аптамером и родственными ему партнерами по связыванию РНК. Систематическая характеристика выявила три мощных РНК-связывающих модуля, каждый из которых состоит из аптамера и его партнера по РНК-связывающему белку, слитых либо с доменом активации VP64, либо с доменом репрессии Mxi1 (Fig. 2a). Более того, авторы показали, что несколько аптамеров могут быть введены в одиночные scRNAs, и не наблюдалось перекрестных помех между компонентами РНК-связывающих модулей, что в конечном итоге делает возможной как dCas9-опосредованную активацию, так и регуляцию в отдельных клетках только в зависимости от последовательности семян и кодируемого аптамера. в scRNA(s) (Zalatan et al. 2015). Что наиболее важно, при использовании стратегии scRNA вместе с РНК-связывающими модулями на основе VP64 у дрожжей наблюдалась более чем 50-кратная активация синтетического репортерного промотора по сравнению со скромной 2-3-кратной активацией, наблюдаемой для dCas9-VP64. Используя две разные scRNA для целевой активации генов вместе с репрессией, опосредованной dCas9, Zalatan et al. обеспечил синтетический контроль над потоками в точках ветвления пути биосинтеза виолацеина (рис. 2b), в то время как Jensen et al. продемонстрировали комбинаторное перепрограммирование генов мевалонатного и каротиноидного путей с использованием модулей активации MCP:VPR и репрессии PCP:Mxi1, что в конечном итоге привело к значительным изменениям уровней каротиноидов (рис. 2c) (Zalatan et al. 2015; Jensen et al. ). 2017).

Рисунок 2.

Дизайн и применение каркасных РНК, контролирующих как геномную целевую последовательность, так и регуляторную функцию. ( a ) Пять примеров каркасных РНК (scRNAs), используемых в дрожжах.ScRNAs представляют собой сконструированные gRNA с РНК-аптамерами, взаимодействующими с белками. Белок и аптамер вместе относятся к РНК-связывающим модулям. Связывающие аптамеры белки MCP, PCP и COM ортогонально взаимодействуют с аптамерами MS2, PP7 и com соответственно. MCP, PCP и COM могут быть слиты с доменами активации или репрессии, что позволяет scRNAs определять целевой локус генома и регуляторную функцию. ( b ) Пример, иллюстрирующий репрограммирование одной клетки экспрессии трех генов, кодирующих часть пути биосинтеза виолацеина.( c ) Пример, иллюстрирующий перепрограммирование одной клетки экспрессии трех генов, кодирующих белки, регулирующие метаболический поток через мевалонатный и каротиноидный пути.

Рисунок 2.

Дизайн и применение каркасных РНК, контролирующих как геномную целевую последовательность, так и регуляторную функцию. ( a ) Пять примеров каркасных РНК (scRNAs), используемых в дрожжах. ScRNAs представляют собой сконструированные gRNA с РНК-аптамерами, взаимодействующими с белками. Белок и аптамер вместе относятся к РНК-связывающим модулям.Связывающие аптамеры белки MCP, PCP и COM ортогонально взаимодействуют с аптамерами MS2, PP7 и com соответственно. MCP, PCP и COM могут быть слиты с доменами активации или репрессии, что позволяет scRNAs определять целевой локус генома и регуляторную функцию. ( b ) Пример, иллюстрирующий репрограммирование одной клетки экспрессии трех генов, кодирующих часть пути биосинтеза виолацеина. ( c ) Пример, иллюстрирующий перепрограммирование одной клетки экспрессии трех генов, кодирующих белки, регулирующие метаболический поток через мевалонатный и каротиноидный пути.

Таким образом, инженерия гРНК в scРНК предлагает многонаправленное перепрограммирование экспрессии генов на основе CRISPR и имеет особое значение для изучения и улучшения нашего понимания полигенных признаков и комбинированных эффектов ключевых точек ветвления метаболического пути.

Регуляция экспрессии гРНК

Было показано, что уровни экспрессии гРНК коррелируют с эффективностью CRISPR/Cas9-опосредованной инженерии генома в клетках млекопитающих (Hsu et al. 2013). Чтобы соответствовать стехиометрии dCas9 или dCpf1, экспрессируемых из сильных конститутивных промоторов полимеразы II (см. раздел «Регулирование экспрессии генов, кодирующих белки CRISPR»), были тщательно исследованы способы оптимизации экспрессии гРНК и scРНК. Как правило, промоторы полимеразы III используются для управления экспрессией гРНК, поскольку промоторы РНК-полимеразы II добавляют дополнительные нуклеотиды к 5΄- и 3΄-концам гРНК и, таким образом, считается, что они прерывают функцию гРНК (Yoshioka et al. 2015). Первоначально промоторы полимеразы III SNR52 и RPR1 были адаптированы для конститутивной доставки гРНК в дрожжи (рис. 3) (DiCarlo et al. 2013; Farzadfard, Perli and Lu 2013; Gilbert et al. 2013). ). В частности, использование промотора SNR52 широко используется из-за его нативных сайтов расщепления транскриптов, что приводит к вырезанию гРНК из первичных транскриптов (DiCarlo et al. 2013). Затем, чтобы обеспечить большую гибкость в дизайне и силе экспрессии гРНК, в двух исследованиях сразу после вышеупомянутых исследований по конститутивной доставке гРНК было протестировано слияние саморасщепляющегося дельта-вируса гепатита (HDV) и рибозимов типа «голова-молот» с гРНК, таким образом возможность редактирования генома, полученного из промоторов полимеразы II (Gao and Zhao 2014; Ryan et al. 2014). Гао и Чжао были первыми, кто обратил внимание на использование фланкированных рибозимами гРНК, позволяющих использовать промоторы pol II для управления экспрессией пре-гРНК, предназначенных для самокатализируемого процессинга (рис. 3) (Gao and Zhao 2014; Zhang et al. 2017). В дополнение к этому исследованию с использованием промотора ADh2 pol II для управления экспрессией гРНК, фланкированных минимальной головкой молотка 5 ^΄ и рибозимами 3 ^΄ HDV на концах 5 ^΄ и 3 ^΄ соответственно. , Райан и др. тестировали в общей сложности одиннадцать промоторов pol III для доставки функциональных гРНК (Ryan et al. 2014). Исследование пришло к выводу, что, хотя промоторы тРНК были совместимы со слиянием рибозима HDV, обеспечивая почти 100% инженерную эффективность, промотор snoRNA SNR52 был единственным промотором, не относящимся к тРНК, который выравнивал такую ​​эффективность при слиянии с рибозимом HDV (Ryan et al. ). 2014). Эти результаты добавляются к более позднему эталону синтетических промоторов слияния pol III, промоторов pol II (управляющих экспрессией фланкированных рибозимом гРНК (RGR)) и промоторов pol III, не являющихся тРНК, управляющих экспрессией гРНК в S.cerevisiae и Y. lipolytica (рис. 3) (Schwartz et al. 2016; Deaner, Mejia and Alper 2017). Здесь было обнаружено, что уровни экспрессии в значительной степени коррелируют с инженерной эффективностью различных конструкций, при этом синтетические промоторы слияния между укороченными промоторами pol III и промоторами тРНК давали самые высокие оценки (> 90%) в Y. lipolytica , в то время как сильные Подход pol II TEF1-RGR продуцировал почти в 4 раза больше гРНК по сравнению с SNR52, что также коррелирует с более сильным регуляторным потенциалом (Schwartz et al. 2016; Динер, Мехиа и Альпер, 2017 г.). Также Гандер и др. использовали минимальный промотор CYC1 для создания набора промоторов гРНК-чувствительной полимеразы II (pGRR), управляющих экспрессией RGR (Gander et al. 2017). В их исследовании была сконструирована библиотека из 400 pGRR с двумя целевыми сайтами вместе с 20 RGR, в общей сложности 8000 NOR (либо один, либо оба) логических вентилей, включая как конститутивные, так и индуцируемые эстрадиолом промоторы pol II, чтобы управлять экспрессией RGR, в конечном итоге уступая до 12-кратной регуляции с помощью одиночных репортерных промоторов, контролируемых гРНК (McIsaac et al. 2013; Гандер и др. 2017).

Рисунок 3.

Экспрессия направляющих РНК (гРНК), каркасных РНК (scRNA) и фланкированных рибозимами гРНК. Сообщается о примерах нативных, гибридных и сконструированных промоторов, которые управляют экспрессией гРНК, scРНК и фланкированных рибозимами гРНК у дрожжей.

Рисунок 3.

Экспрессия направляющих РНК (гРНК), каркасных РНК (скРНК) и фланкированных рибозимом гРНК. Сообщается о примерах нативных, гибридных и сконструированных промоторов, которые управляют экспрессией гРНК, scРНК и фланкированных рибозимами гРНК у дрожжей.

Помимо нативных промоторов pol III и индуцируемых pol II, контролирующих экспрессию гРНК и RGR, другие группы использовали сконструированный нативный промотор RPR1 pol III, чтобы включить сайт связывания TetO для aTc-индуцируемой депрессии экспрессии гРНК, когда коэкспрессируя конститутивно экспрессируемый репрессор TetR, тем самым обеспечивая нарушения экспрессии в 2–20 раз (рис. 3) (Farzadfard et al. 2013; Smith et al. 2016; Jensen et al. 2017; Феррейра и др. 2018). Интересно, что в исследовании Ferreira et al. , три кассеты гРНК были экспрессированы из одного сконструированного промотора RPR1 pol III, а затем эндорибонуклеаза Csy4 была использована для расщепления транскрипта на субэлементы и усиления опосредованной dCas9-VPR экспрессии HMG1 , OLE1 и ACS1. промоторов примерно в 2 раза (Ferreira et al. 2018). Этот элегантный подход позволяет легко обойти необходимость повторного использования одного и того же промотора или необходимости использования нескольких разных промоторов при попытке перепрограммировать транскрипцию нескольких генов (рис. 3).

Таким образом, несмотря на то, что нативные промоторы pol III изначально были предпочтительной конструкцией, простая разработка промоторов pol II, управляющих экспрессией саморасщепляющихся RGR, позволяет контролировать перепрограммирование генома, основанное практически на любом промоторе pol II (Zhang и др. , 2017 г.). Кроме того, стерические препятствия, предлагаемые индуцируемыми репрессорами, могут быть использованы для создания промоторов pol III для функциональной, своевременной и эффективной доставки гРНК.

Множественные гРНК для перепрограммирования геномных функций

Регулирование нативных и синтетических промоторов с помощью эндогенных или сконструированных факторов транскрипции зависит от их способности связывать родственные ТФ-связывающие сайты в таких промоторах (Khalil et al. 2012). По аналогии с этим и как упоминалось ранее (раздел «Регулирование экспрессии генов, кодирующих белки CRISPR»), Farzadfard et al. показали, что синергетические эффекты на регуляцию транскрипции могут наблюдаться при использовании нескольких гРНК, направляющих dCas9-опосредованный контроль промоторов-мишеней. Например, каждая из двух отдельных гРНК вызывала 2-кратную репрессию, тогда как их комбинация показала 7-кратную репрессию. Более того, Farzadfard et al. также тестировали управление несколькими копиями dCas9-VP64 и тем самым регулировали активность репортерного промотора, и таким образом наблюдали, что активность репортерного гена увеличивалась до 70 раз при нацеливании dCas9-VP64 максимум на 12 позиций (Farzadfard, Perli and Lu 2013).Точно так же Gilbert et al. протестировали 7× гРНК на промоторе TetO , продемонстрировав самую высокую из когда-либо зарегистрированных репрессий активности репортерного гена при использовании dCas9-Mxi1 (153×, рис. 1), в то время как Deaner et al. использовали двойные гРНК, экспрессированные из промоторов SNR52- и TEF1 , чтобы усилить регуляторный потенциал dCas9-VPR (Gilbert et al. 2013; Deaner, Mejia and Alper 2017). Напротив, Schwartz et al. также использовали две гРНК в области TSS –120 п.н., чтобы проверить, усиливает ли это репрессию Ku70 и Ku80 , однако они обнаружили лишь незначительные эффекты от использования двух гРНК по сравнению с возмущениями, наблюдаемыми при использовании только одной гРНК (Schwartz ). и другие. 2017).

В совокупности, как и в нативных и других синтетических сетях регуляции транскрипции, количество регуляторов, привязанных к целевому регулону, представляет собой модульный клапан для настройки воздействия перепрограммирования, опосредованного CRISPR-dCas9. Тем не менее, использование нескольких гРНК должно быть тщательно разработано с особым вниманием к положению существующих регуляторных элементов и нуклеосом, чтобы настроить регуляторный потенциал путем простого увеличения количества гРНК, нацеленных на такие области (см. позиционирование и доступность хроматина»).

Смещение цепи в сравнении с нормативным потенциалом

Большое внимание привлекло механистическое понимание CRISPRi в отношении позиционирования гРНК. Первоначально основной механизм dCas9-опосредованной репрессии транскрипции был выяснен с использованием NET-seq в Escherichia coli (Churchman and Weissman 2011; Qi et al. 2013). В E. coli , Qi et al. определили, что гРНК вызывают сильную паузу транскрипции выше локуса-мишени гРНК на нематричной цепи, что привело к гипотезе о том, что физическое столкновение между удлиняющейся РНК-полимеразой и комплексом dCas9:гРНК приводит к блокированию транскрипции (Qi et al. 2013). Однако у дрожжей Farzadfard et al. были первыми, кто показал, что размещение гРНК в сходных положениях ниже TSS, но на разных цепях промотора, оказывает сходное негативное влияние на экспрессию генов. Более того, размещение gRNAs на любой из цепей выше TATA-бокса и TSS приводит к аналогичной dCas9-VP64-опосредованной активации генов (Farzadfard, Perli and Lu 2013). Точно так же Gilbert et al. позже сообщили, что целевая цепь ДНК и содержание гуанин-цитозина в гРНК не были определяющими факторами для успешного CRISPRi в их исследовании (Gilbert et al. 2014). Наконец, в более позднем исследовании, приняв подход с гораздо большей библиотекой гРНК для определения химико-генетического взаимодействия, Smith et al. сконструировал 383 гРНК в диапазоне от +500 п.н. до –500 п.н. области TSS пяти генов (Smith et al. 2016). Здесь авторы не обнаружили смещения цепи в отношении эффективности гРНК в тестируемом окне размером 1 т.п.н.

В соответствии с этими выводами недавно было дополнительно выяснено, что, в отличие от результатов CRISPRi в E.coli (Qi et al. 2013), dCas9 в дрожжах может действовать не как простой механизм блокирования транскрипции для РНК-полимеразы специфичным для цепи образом, а, скорее, комплекс гРНК:dCas9 поддерживает образование пермиссивные образования транскриптов, включая преждевременную терминацию и образование нового транскрипта как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации (Howe et al. 2017). В совокупности это подчеркивает, что дрожжи не только сопротивляются потенциальному смещению цепей CRISPRi, но и что выводы, сделанные в исследованиях CRISPRi, должны учитывать целостность целевых транскриптов.

Позиционные эффекты гРНК

В отличие от исследований потенциальных эффектов, специфичных для цепей, существуют гораздо более убедительные доказательства из больших наборов данных о позиционно-специфических эффектах гРНК в промоторах.

В целом, гРНК, нацеленные на область выше ТАТА-бокса и TSS, в значительной степени коррелируют с активацией генов, опосредованной как dCas9-VP64, так и dCas9-VPR, в то время как расположение вариантов dCas9 ниже или в непосредственной близости от ТАТА-боксов отрицательно влияет на экспрессию генов (Farzadfard, Perli and Lu 2013; Deaner and Alper 2017).Например, нацеливание dCas9-VP64 на положение выше TATA-бокса обеспечивало почти 5-кратную активацию минимального промотора GAL1 , в то время как нацеливание гРНК на TATA-бокс или элемент kozak ниже него приводило к CRISPRi, вероятно, из-за интерференции. с комплексом инициации транскрипции, как также наблюдал Deaner et al. при использовании dCas9-VPR для CRISPRi (рис. 1) (Farzadfard, Perli and Lu, 2013; Deaner, Mejia and Alper, 2017). Кроме того, Deaner и Alper представили подробное исследование систематического тестирования чувствительности к возмущению ферментов (STEPS) путем размещения гРНК в окне ~0–750 п.н. выше TATA-бокса различных промоторов нативных дрожжей.Наблюдая за изменениями в экспрессии генов, поскольку dCas9-Mxi1 расположен дальше от блока TATA, а dCas9-VPR расположен ближе к блоку TATA, авторы смогли вывести карты чувствительности к потоку, нанеся изменения в образовании глицерина в зависимости от Градуированная экспрессия 5 генов (Динер и Альпер, 2017). С точки зрения применения авторы использовали STEPS, чтобы показать, что уровни экспрессии генов GPD1 и TPI1 положительно и отрицательно коррелируют с титрами глицерина соответственно.В конечном итоге эти опросы привели к простой стратегии сверхэкспрессии GPD1 / GPP1 , дающей более чем 5-кратное увеличение титров глицерина (4,89–28,0 г/л). Аналогичным образом, использование STEPS на пяти ключевых генах пентозофосфатного пути для увеличения потока через путь ароматических аминокислот привело к примерно 8-кратному увеличению титров 3-DHS (до 126,4 г/л) на фоне делеции zwf1 (Deaner and Alper 2017). ).

Вышеупомянутые исследования эффектов положения гРНК в значительной степени подтверждаются другим недавним исследованием.Здесь Smith et al. использовали CRISPRi на основе dCas9-Mxi1 для тестирования примерно 1000 гРНК, направленных против 20 генов, уровни экспрессии которых, по прогнозам, влияют на чувствительность к специфическим ингибиторам роста (Smith et al. 2016). Здесь авторы обнаружили, что медианный направляющий эффект для dCas9-Mxi1 был максимальным в окне от –200 п.н. до TSS, в то время как гРНК, расположенные вне окна –200 п.н. до TSS, только в некоторых случаях могли эффективно репрессировать транскрипцию, но менее эффективно ( Смит и др. 2016). Эти результаты отличаются от исследований, проведенных на клетках млекопитающих, в которых область от –50 до +300 по отношению к TSS оказалась наиболее эффективной для CRISPRi (Gilbert et al. 2014). Тем не менее, для дрожжей Smith et al. разработал инструмент для дизайна гРНК (http://lp2.github.io/yeast-crispri/), принимая во внимание как положение в геноме, доступность хроматина (раздел «Положение нуклеосом и доступность хроматина»), нуклеосомы (раздел «Положение нуклеосом и доступность хроматина»), длина и последовательность гРНК (раздел «специфичность и длина гРНК»), а также занятость транскрипционным фактором сайта-мишени (раздел «Другие релевантные признаки — активность базального промотора, интерференция связывания ТФ и вторичная структура РНК» .) (Смит и др. 2016 г.). Основываясь на этих и других выводах, Schwartz et al. идентифицировали гРНК для эффективной репрессии экспрессии генов у Y. lipolytica (Schwartz et al. 2017). В крупнейшем на сегодняшний день исследовании Smith et al. нацелен на опосредованную dCas9-Mxi1 репрессию более 1500 генов, необходимых для роста (Smith et al. 2017). Проанализировав > 9000 штаммов, содержащих уникальную гРНК с проверенной последовательностью, авторы усовершенствовали свои более ранние результаты (Smith et al. 2016), теперь выделяя положения гРНК в области между TSS и примерно 125 п.н. выше TSS, которые особенно эффективны для опосредованной CRISPR репрессии (Smith et al. 2017).

При этом, несмотря на то, что Jensen et al. нацелены на 88 гРНК в окне от –200 п.н. до TSS 12 нативных промоторов дрожжей, авторы обнаружили, что несколько гРНК не функционируют при использовании dCas9-VPR и dCas9-Mxi1 для перепрограммирования транскрипции (Jensen et al. 2017).

Обобщение позиционирования гРНК относительно TATA и TSS предлагает простую настраиваемую и портативную стратегию для нарушения активности экспрессии генов как для CRISPRi, так и для CRISPRa, хотя конкретное позиционирование должно также учитывать другие локальные стерические и регуляторные особенности эукариотических промоторов (см. разделы «Положение нуклеосом и доступность хроматина» и «специфичность и длина гРНК»).

Позиционирование нуклеосом и доступность хроматина

нуклеосомы эффективно мешают действию ДНК-связывающих регуляторов транскрипции (Griesenbeck et al. 2003; Mao et al. 2011). Системы CRISPR, основанные на связывании ДНК, широко использовались в царстве эукариот, но, в отличие от бактерий, ДНК у эукариот в значительной степени закручена вокруг гистонов с образованием нуклеосом, что делает эукариотическую ДНК более плотно упакованной и менее доступной для других ДНК-связывающих белков. Рандо и Чанг, 2009 г.; Рандо и Уинстон, 2012 г.).Как было рассмотрено выше, гРНК, нацеленные на один и тот же промотор, могут по-разному влиять на транскрипцию (Smith et al. 2016), даже близко расположенные гРНК могут иметь разную эффективность, не строго коррелирующую с их расстоянием от TSS (Farzadfard, Perli and Lu 2013; Jensen et al. 2017; Vanegas, Lehka and Mortensen 2017). Это привело Smith et al. , чтобы выяснить, может ли доступность хроматина и расположение нуклеосом также влиять на эффективность направляющей для dCas9-опосредованной регуляции транскрипции.По аналогии с факторами транскрипции, канонически связывающими свободную от нуклеосом ДНК в промоторах, имеющих решающее значение для регуляции экспрессии генов, Smith et al. воспользовались результатами исследования Schep et al. , в котором они идентифицировали высокоструктурированный образец длин фрагментов ДНК и положения вокруг нуклеосом у дрожжей с использованием анализа доступного для транспозазы хроматина (ATAC-seq). Используя данные ATAC-seq вместе с другими наборами данных о положении нуклеосом по всему геному (Lee et al. 2007), Smith и др. обнаружили положительную корреляцию между эффективностью направляющей и показателями доступности хроматина в окне TSS от -400 п.н. до TSS +400 п.н. Несмотря на то, что исследования показали, что расположение гРНК ниже TSS может быть эффективным для перепрограммирования транскрипции (Farzadfard, Perli and Lu 2013; Deaner and Alper 2017), Smith et al. при тестировании сотен гРНК наблюдали, что взаимосвязь между эффективностью направляющей и плотностью чтения ATAC-seq распространяется на область, обычно занятую нуклеосомами, ниже по течению от TSS (Yuan et al. 2005 г.; Ли и др. 2007; Zaugg and Luscombe 2012), подтверждая мнение о том, что эффективность гРНК не определяется в строгом смысле ее близостью к TSS. Эти наблюдения согласуются с биохимическими исследованиями, показывающими, что Cas9 и dCas9 не могут стабильно взаимодействовать с PAM, когда они расположены в ядре нуклеосомы, что указывает на то, что доступность PAM является критическим фактором, определяющим активность белка CRISPR с дефицитом нуклеазы (Hinz, Laughery and Wyrick 2015; Исаак и др. 2016), что еще раз подтверждает наблюдение, что определение того, какие области-мишени с низкой занятостью нуклеосом и высокой доступностью хроматина, вероятно, будут более эффективными (Smith et al. 2016, 2017). Кроме того, в нескольких сообщениях о клетках человека подчеркивается, что расположение эффективных гРНК для dCas9-опосредованной репрессии транскрипции коррелирует с хроматиновыми метками, связанными с активной транскрипцией и открытым хроматином (h4K27ac, h4K9ac, h4K4me3, h4K4me2 и h4K79me2) (Horlbeck et al. 2016; Радзишевская и др. 2016).

Взятые вместе, биохимические данные и данные in vivo позволяют предположить, что стратегии дизайна гРНК должны избегать нацеливания на гРНК вблизи ядра нуклеосомы. Более того, поскольку существует несколько наборов данных о крупномасштабных картах позиционирования нуклеосом и доступности ДНК (Jiang and Pugh 2009; Schep et al. 2015), разработка будущих инструментов компьютерного проектирования для создания специфических и высокоэффективных гРНК должна оцениваться. включение таких наборов данных при выводе выбора гРНК.

Специфичность и длина гРНК

Длина гРНК является решающим фактором для специфичности мишени для нуклеазного Cas9, при этом минимальная длина нуклеазной активности составляет 17 нуклеотидов (Fu et al. 2014b). Для CRISPRi и CRISPRa в нескольких исследованиях оценивалось влияние укороченных гРНК по сравнению с полноразмерными 20-нуклеотидными спейсерными областями гРНК. Первоначально Ци и соавт. обнаружили, что для CRISPRi самая сильная репрессия наблюдалась при использовании полноразмерных гРНК, что подтверждается Kiani et al., которые обнаружили, что активация, опосредованная dCas-VPR, увеличивается с 2- до 100-кратной активации, когда длина семени сдвигается с 8 до 20 нуклеотидов (Kiani et al. 2015). Аналогично, у дрожжей Smith et al. обнаружили, что несовпадения, расположенные в семенной области, расположенной 1–10 относительно PAM, плохо переносятся как полноразмерными, так и укороченными гРНК (Smith et al. 2016), что также согласуется с результатами, полученными при нацеливании на Cas9. in vitro и в клетках млекопитающих (Hsu et al. 2013; Ву и др. 2014; Фу и др. 2014a), а также наблюдение, что всего лишь одного несовпадения пар оснований достаточно для перенаправления нацеливания dCas9 в дрожжах (Farzadfard, Perli and Lu 2013).

В целом, выводы, сделанные на основе этих исследований, показывают, что усечение гРНК снижает эффективность опосредованной CRISPR-dCas9 регуляции транскрипции как в отношении идеально совпадающих, так и не полностью совпадающих последовательностей-мишеней по сравнению с полноразмерными гРНК из 20 нуклеотидов (Kiani et al. 2015; Смит и др. 2016), хотя существует некоторая степень гибкости в конструировании дистальных положений гРНК, которые можно учитывать при конструировании гРНК, нацеленных на промоторные области, плотные в нуклеосомах и вышестоящих активирующих последовательностях.

Другие важные признаки — активность базального промотора, интерференция связывания TF и ​​вторичная структура РНК

В предыдущих разделах некоторые принципы проектирования выделяются как имеющие особое значение для эффективного перепрограммирования транскрипции, опосредованного CRISPR.Для гРНК это включает (i) положительную корреляцию между уровнем экспрессии гРНК и инженерной эффективностью (Schwartz et al. 2016; Deaner et al. 2017), (ii) нацеливание гРНК на окно между –125 п.н. выше по течению TSS и TSS для CRISPRi и (iii) расположение гРНК в бедных нуклеосомами областях промоторов-мишеней (Smith et al. 2016, 2017). В дополнение к этим критериям проектирования следует упомянуть несколько дополнительных исследований для разработки оптимального CRISPR-опосредованного зондирования функции генома.

Во-первых, при выборе интересующих генов стоит учитывать наблюдаемую обратную зависимость между базовыми уровнями экспрессии интересующих генов и относительными нарушениями экспрессии, которые могут быть достигнуты с помощью dCas9-опосредованного перепрограммирования (т.е. высокая базальная экспрессия часто может быть лишь незначительной). активируется и наоборот) (Чавес и др. 2015 г.; Дженсен и др. 2017 г.). В соответствии с этим, другой интересующий фактор связан с регулирующей организацией целевого промотора(ов).Об использовании dCas9 для блокирования связывания ДНК синтетического регулятора транскрипции rTA на синтетическом репортерном промоторе TetON-Venus Gilbert et al. обнаружили, что 115-кратное подавление rtTA-индуцированной активации может быть достигнуто при совместной экспрессии dCas9 и гРНК, что позволяет предположить, что dCas9 может стерически конкурировать с факторами транскрипции, в противном случае контролирующими регуляцию целевого промотора, что указывает на возможность использования CRISPRi и CRISPRa. для определения регуляторных функций вышестоящих активирующих и вышестоящих репрессивных последовательностей (Gilbert et al. 2013). Однако, исходя из своего крупномасштабного библиотечного подхода, Smith et al. (2016) обнаружили лишь небольшое количество случаев, когда перекрытие с сайтом связывания активатора транскрипции коррелировало с повышенной эффективностью CRISPRi, что указывает на то, что этот параметр конструкции может зависеть от нативного регуляторного контекста целевых промоторов. В связи с этим Jensen et al. продемонстрировал опосредованное CRISPR повышение и понижение активности гена OLE1 в течение 48 часов, что коррелирует с количественным анализом с временным разрешением, демонстрирующим, что OLE1 сильно экспрессируется в течение ранней фазы до средней экспоненциальной фазы и подавляется от поздняя экспоненциальная фаза (Jensen et al. 2017). Наконец, еще один важный принцип проектирования гРНК, который следует упомянуть, исходит из ранее упомянутого крупномасштабного исследования CRISPRi, проведенного Smith et al. (2017). Здесь авторы выявили значительную корреляцию между энергией фолдинга в ккал/моль для предсказанной структуры РНК (лидер, целевая последовательность гРНК из 20 нуклеотидов и структурная часть) гРНК и эффективностью гРНК (т. е. больше фолдинга, меньшая эффективность) (Smith и др. , 2017 г.).

В совокупности были выяснены многочисленные параметры дизайна для оптимальной CRISPR-опосредованной регуляции транскрипции.Некоторые из параметров определены в ходе крупномасштабных исследований и считаются не зависящими от генов. Аналогичным образом, как видно из нескольких исследований, CRISPR-опосредованный регуляторный потенциал промоторов-мишеней может поддерживаться в течение длительного времени (Deaner and Alper, 2017; Jensen et al. , 2017), что подчеркивает надежность и ортогональность технологии.

ПРОГНОЗ

Как видно из предыдущих разделов, при использовании CRISPR для исследования функций генома с помощью CRISPRi и CRISPRa необходимо учитывать множество соображений.Тем не менее, для нарушений транскрипции, по сравнению с другими методами, такими как РНКи, gTEM и направленная сверхэкспрессия, CRISPRi/a предлагает простой дизайн, программируемое РНК-опосредованное нацеливание и регуляторное направление как отдельных, так и нескольких генов на уровне одной клетки. Это мощно и использует природу многофакторной нативной регуляции транскрипции для нарушений транскрипции. Действительно, для перепрограммирования транскрипции подходы на основе dCas9 использовались для быстрого анализа динамики метаболических путей и выяснения ограничивающих скорость ферментативных стадий без необходимости редактирования генома (Zalatan et al. 2015; Динер и Альпер, 2017 г.; Дженсен и др. 2017). Кроме того, отдельные наборы экспериментов по трансформации (мультиплексы) могут быть легко реализованы, а однократный синтез наборов гРНК позволяет быстро проходить через повторяющиеся инженерные циклы, а именно путем быстрой оценки комбинаторных эффектов возмущений экспрессии для определения первичных и вторичных мишеней. которые не могли быть известны априори из нарушений экспрессии одного гена.

Однако, несмотря на то, что несколько белков CRISPR и версий гРНК были протестированы в крупномасштабных исследованиях на дрожжах, относительные изменения экспрессии, наблюдаемые при использовании dCas9-опосредованной регуляции транскрипции, по-прежнему часто наблюдаются как минимум на порядок меньше наблюдаемых для усилий по перепрограммированию бактерий и млекопитающих, часто в 100–20 000 раз (Qi et al. 2013; Чавес и др. 2015), тогда как самые высокие изменения транскриптов, зарегистрированные у дрожжей, примерно в 100–250 раз (Gilbert et al. 2013; Chavez et al. 2015; Naranjo et al. 2015). Для улучшения регуляторного потенциала CRISPR-dCas9 у дрожжей и дальнейшего усиления набора инструментов, доступных для исследования функций генома, по-прежнему существует потребность в дальнейшей разработке технологий перепрограммирования.

Недавно сообщалось об одной новой в своем классе технологии CRISPR, имеющей отношение к функциональным геномным исследованиям, с использованием ортологов РНКазы Cas13 с дефицитом нуклеаз из систем CRISPR-Cas типа VI, которые могут управляться одноэффекторными гРНК для нацеливания на большее количество более 70% посттранскрипционного нокдауна экспрессии генов в клетках млекопитающих и растений с высокой специфичностью к мишени (Abudayyeh et al. 2017; Кокс и др. 2017). Кроме того, лаборатория Чжана показала, что dCas13 может быть слит с ферментами семейства аденозиндезаминаз, действующих на РНК (ADAR), и тем самым позволяет редактировать РНК (Cox et al. 2017). Таким образом, считается, что dCas13, нацеленный на РНК, продвигает функциональную геномику на посттранскрипционном уровне, поддерживая функциональные исследования, например. Варианты сплайсинга мРНК, редактирование оснований на уровне РНК и выяснение процессинга мРНК с помощью вариантов dCas13, слитых с регуляторными доменами, аналогично принципам конструирования вариантов dCas9.

Кроме того, хотя это и отличается от CRISPR, следует отметить, что Barbieri et al. недавно сообщили, что подавление механизмов репарации ДНК дрожжей и замедление репликации усиливает множественное редактирование генома с помощью 90-нуклеотидных одноцепочечных олигодезоксинуклеотидов (ssODN) в дрожжах, что позволяет одновременно интегрировать более 10 ssODN с 60 мутациями на трансформацию (Barbieri). и др. , 2017 г.). Что наиболее важно, эта стратегия не зависит как от DSB ДНК, так и от гомологичной рекомбинации, и в ближайшем будущем станет возможным объединить мультилокусное разрешение и разрешение одной пары оснований этого подхода с опосредованным CRISPR-dCas9 перепрограммированием транскрипции для быстрой идентификации. отпечатков генома и экспрессии, связанных с желаемыми признаками.

Наконец, нативная регуляция транскрипции зависит от интегрирования многогенных пространственно-временных нарушений экспрессии. Для дальнейшего обеспечения синтетического контроля над транскрипцией полигенных признаков, особенно тех, которые зависят от основных генов, исследования в рамках контролируемых систем CRISPR должны использовать преимущества и дальнейшее развитие стратегий перепрограммирования, совместимых с оптогенетикой, тем самым обходя ограниченную обратимость химических реакций. индуцированные (например, aTc) системы (Xiaofeng et al. 2017). Точно так же следует учитывать аллостерическую регуляцию активности белка CRISPR для условного переключения клеточного принятия решений, например. состояния роста и метаболизма (Oakes et al. 2016). В конечном счете, предполагается, что такие методы значительно поддержат наше понимание и ортогональный контроль транскрипционных и посттранскрипционных регуляций для желаемых клеточных и метаболических результатов.

Благодарности

Авторы благодарят Эмиля Дамгаарда Йенсена за плодотворные обсуждения и комментарии к рукописи во время подготовки.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена при поддержке фонда Ново Нордиск.

Конфликт интересов . Не объявлено.

ССЫЛКИ

Абудайе

ОО