Особенности строения цитоплазматической мембраны таблица: Особенности строения цитоплазматической мембраны таблица. Цитоплазматическая мембрана. функции. структура

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Спротт, Г. Д., Колвин, Дж. Р., и Маккеллар, Р. К. (1979). Сферобласты Methanospirillum hungatai образовывались при обработке дитиотреитолом. Банка. J. Microbiol. 25, 730–738. DOI: 10,1139 / m79-106

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Спротт, Г.Д., и МакКеллар, Р. С. (1980). Состав и свойства клеточной стенки Methanospirillum hungatei . Банка. J. Microbiol. 26, 115–120. DOI: 10.1139 / m80-017

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Stetter, K.O., Thomm, M., Winter, J., Wildgruber, G., Huber, H., Zillig, W., et al. (1981). Methanothermus fervidus , sp. nov., новый чрезвычайно теплолюбивый метаноген, выделенный из исландских горячих источников. Zbl. Бакт. Hyg. Я.Abt. Ориг. C2, 166–178.

Google Scholar

Стиглмайер, М., Клингл, А., Риттманн, С., Алвес, Р. Э., Мельчер, М., Лейш, Н. и др. (2014). Nitrososphaera viennensis sp. nov., аэробная и мезофильная архея, окисляющая аммиак, из почвы и член нового архейного типа Thaumarchaeota. Внутр. J. Syst. Evol. Microbiol. 64, 2738–2752. DOI: 10.1099 / ijs.0.063172-0

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шумпер, М.и Виланд Ф. Т. (1995). «Бактериальные гликопротеины» в Glycoproteins , ред. J. Montreuil, J. F. G. Vliegenthart и H. Schachter (Амстердам: Elsevier), 455–473.

Google Scholar

Veith, A., Klingl, A., Zolghadr, B., Lauber, K., Mentele, R., Lottspeich, F., et al. (2009). Acidianus , Sulfolobus и Metallosphaera Поверхностные слои: структура, состав и экспрессия генов. Мол. Microbiol. 73, 58–72. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2009.06746.x

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вильдхабер И. и Баумейстер В. (1987). Оболочка клеток Thermoproteus tenax : трехмерная структура поверхностного слоя и его роль в поддержании формы. EMBO J. 6, 1475–1480.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | Google Scholar

Юрист-Дауч, С., Чабан, Б., Ван Дайк, Д. Дж., Джаррелл, К. Ф., и Эйхлер, Дж.(2008). Сладкое до крайности: гликозилирование белков в архее. Мол. Microbiol. 68, 1079–1084. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2008.06224.x

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3.1 Клеточная мембрана — анатомия и физиология

Несмотря на различия в структуре и функциях, все живые клетки в многоклеточных организмах имеют окружающую клеточную мембрану. Поскольку внешний слой вашей кожи отделяет ваше тело от окружающей среды, клеточная мембрана (также известная как плазматическая мембрана) отделяет внутреннее содержимое клетки от внешней среды.Эта клеточная мембрана обеспечивает защитный барьер вокруг клетки и регулирует, какие материалы могут проходить внутрь или наружу.

Структура и состав клеточной мембраны

Клеточная мембрана представляет собой чрезвычайно гибкую структуру, состоящую в основном из взаимно расположенных фосфолипидов («бислой»). Также присутствует холестерин, который способствует текучести мембраны, и есть различные белки, встроенные в мембрану, которые выполняют множество функций.

Одиночная молекула фосфолипида имеет фосфатную группу на одном конце, называемую «головкой», и две расположенные рядом друг с другом цепи жирных кислот, которые составляют липидные «хвосты» (рис.2). Фосфатная группа заряжена отрицательно, что делает голову полярной и гидрофильной — или «водолюбивой». Гидрофильная молекула (или область молекулы) притягивается к воде. Таким образом, фосфатные головки притягиваются к молекулам воды как внеклеточной, так и внутриклеточной среды. С другой стороны, липидные хвосты не заряжены или неполярны и являются гидрофобными или «водобоязненными». Гидрофобная молекула (или участок молекулы) отталкивается и отталкивается водой. Некоторые липидные хвосты состоят из насыщенных жирных кислот, а некоторые содержат ненасыщенные жирные кислоты.Эта комбинация добавляет плавности постоянно находящимся в движении хвостам. Таким образом, фосфолипиды представляют собой амфипатические молекулы. Амфипатическая молекула — это молекула, которая содержит как гидрофильную, так и гидрофобную области. Фактически, мыло удаляет масляные и жирные пятна, потому что оно обладает амфипатическими свойствами. Гидрофильная часть может растворяться в воде, в то время как гидрофобная часть может улавливать жир в мицеллах, которые затем можно смыть.

Рис. 3.2 Структура фосфолипида Молекула фосфолипида состоит из полярной фосфатной «головы», которая является гидрофильной, и неполярного липидного «хвоста», которая является гидрофобной.Ненасыщенные жирные кислоты приводят к изгибам гидрофобных хвостов.

Клеточная мембрана состоит из двух смежных слоев фосфолипидов. Липидные хвосты одного слоя обращены к липидным хвостам другого слоя, встречаясь на границе двух слоев. Головки фосфолипидов обращены наружу, причем один слой находится внутри клетки, а другой — снаружи (рис. 3.3). Поскольку фосфатные группы полярны и гидрофильны, они притягиваются к воде во внутриклеточной жидкости.Внутриклеточная жидкость (ICF) — это жидкость внутри клетки. Фосфатные группы также притягиваются к внеклеточной жидкости. Внеклеточная жидкость (ECF) — это жидкая среда за пределами клеточной мембраны. Интерстициальная жидкость (IF) — это термин, обозначающий внеклеточную жидкость, не содержащуюся в кровеносных сосудах. Поскольку липидные хвосты гидрофобны, они встречаются во внутренней области мембраны, исключая водянистую внутриклеточную и внеклеточную жидкость из этого пространства. Клеточная мембрана содержит множество белков, а также другие липиды (например, холестерин), которые связаны с бислоем фосфолипидов.Важной особенностью мембраны является то, что она остается текучей; липиды и белки в клеточной мембране не закреплены жестко на месте.

Рис. 3.3. Фосфолипидный бислой. Фосфолипидный бислой состоит из двух соседних листов фосфолипидов, расположенных хвостом к хвосту. Гидрофобные хвосты соединяются друг с другом, образуя внутреннюю часть мембраны. Полярные головки контактируют с жидкостью внутри и снаружи ячейки.

Мембранные белки

Липидный бислой составляет основу клеточной мембраны, но он полностью усеян различными белками.Два разных типа белков, которые обычно связаны с клеточной мембраной, — это интегральные белки и периферический белок (рис. 3.4). Как следует из названия, интегральный белок — это белок, встроенный в мембрану. Канальный белок является примером интегрального белка, который избирательно позволяет определенным материалам, таким как определенные ионы, проходить внутрь или из клетки.

Рис. 3.4 Клеточная мембрана Клеточная мембрана клетки представляет собой бислой фосфолипидов, содержащий множество различных молекулярных компонентов, включая белки и холестерин, некоторые с присоединенными углеводными группами.

Другой важной группой интегральных белков являются белки распознавания клеток, которые служат для обозначения идентичности клетки, чтобы ее могли распознать другие клетки. Рецептор — это тип белка распознавания, который может избирательно связывать определенную молекулу вне клетки, и это связывание вызывает химическую реакцию внутри клетки. Лиганд — это специфическая молекула, которая связывается с рецептором и активирует его. Некоторые интегральные белки выполняют двойную роль как рецептор, так и ионный канал. Одним из примеров взаимодействия рецептор-лиганд являются рецепторы нервных клеток, которые связывают нейротрансмиттеры, такие как дофамин.Когда молекула дофамина связывается с белком рецептора дофамина, канал в трансмембранном белке открывается, позволяя определенным ионам проникать в клетку.

Некоторые интегральные мембранные белки являются гликопротеинами. Гликопротеин — это белок, к которому прикреплены молекулы углеводов, которые проникают во внеклеточный матрикс. Прикрепленные углеводные метки на гликопротеинах помогают в распознавании клеток. Углеводы, которые происходят из мембранных белков и даже из некоторых мембранных липидов, вместе образуют гликокаликс.Гликокаликс представляет собой нечеткое покрытие вокруг клетки, образованное гликопротеинами и другими углеводами, прикрепленными к клеточной мембране. Гликокаликс может выполнять различные роли. Например, он может иметь молекулы, которые позволяют клетке связываться с другой клеткой, он может содержать рецепторы гормонов или может содержать ферменты, расщепляющие питательные вещества. Гликокализы, обнаруженные в организме человека, являются продуктами его генетической структуры. Они придают каждой из триллионов клеток человека «идентичность» принадлежности к его телу.Эта идентичность — основной способ, которым клетки иммунной защиты человека «знают» не атаковать клетки собственного тела человека, но это также причина, по которой органы, пожертвованные другим человеком, могут быть отвергнуты.

Периферические белки обычно находятся на внутренней или внешней поверхности липидного бислоя, но также могут быть прикреплены к внутренней или внешней поверхности интегрального белка. Эти белки обычно выполняют определенную функцию для клетки. Например, некоторые периферические белки на поверхности клеток кишечника действуют как пищеварительные ферменты, расщепляя питательные вещества до размеров, которые могут проходить через клетки в кровоток.

Транспорт через клеточную мембрану

Одно из величайших чудес клеточной мембраны — это ее способность регулировать концентрацию веществ внутри клетки. Эти вещества включают ионы, такие как Ca ⁺⁺ , Na ⁺ , K ⁺ и Cl ^— ; питательные вещества, включая сахара, жирные кислоты и аминокислоты; и продукты жизнедеятельности, особенно диоксид углерода (CO ₂ ), которые должны покинуть ячейку.

Двухслойная липидная структура мембраны обеспечивает первый уровень контроля.Фосфолипиды плотно упакованы вместе, и мембрана имеет гидрофобную внутреннюю часть. Эта структура делает мембрану избирательно проницаемой. Мембрана, обладающая избирательной проницаемостью, позволяет без посторонней помощи проходить через нее только веществам, отвечающим определенным критериям. В случае клеточной мембраны только относительно небольшие неполярные материалы могут перемещаться через липидный бислой (помните, липидные хвосты мембраны неполярны). Некоторыми примерами этого являются другие липиды, кислород и углекислый газ, а также спирт.Однако водорастворимые материалы, такие как глюкоза, аминокислоты и электролиты, нуждаются в некоторой помощи для прохождения через мембрану, потому что они отталкиваются гидрофобными хвостами фосфолипидного бислоя. Все вещества, которые проходят через мембрану, делают это одним из двух общих методов, которые классифицируются в зависимости от того, требуется ли энергия. Пассивный транспорт — это движение веществ через мембрану без затрат клеточной энергии. Напротив, активный транспорт — это движение веществ через мембрану с использованием энергии аденозинтрифосфата (АТФ).

Пассивный транспорт

Чтобы понять , как веществ пассивно перемещаются через клеточную мембрану, необходимо понимать градиенты концентрации и диффузию. Градиент концентрации — это разница в концентрации вещества в пространстве. Молекулы (или ионы) будут распространяться / диффундировать от того места, где они более сконцентрированы, к месту, где они менее концентрированы, до тех пор, пока они не будут равномерно распределены в этом пространстве. (Когда молекулы движутся таким образом, они, как говорят, перемещаются на вниз на своего градиента концентрации.) Диффузия — это перемещение частиц из области с более высокой концентрацией в область с более низкой концентрацией. Несколько общих примеров помогут проиллюстрировать эту концепцию. Представьте, что вы находитесь в закрытой ванной. Если распылить флакон духов, молекулы аромата естественным образом распространятся из места, где они оставили флакон, во все углы ванной комнаты, и это распространение будет продолжаться до тех пор, пока не исчезнет градиент концентрации. Другой пример — ложка сахара, помещенная в чашку чая.В конце концов сахар будет распространяться по всему чаю, пока не исчезнет градиент концентрации. В обоих случаях, если в комнате теплее или чай горячее, диффузия происходит еще быстрее, поскольку молекулы сталкиваются друг с другом и распространяются быстрее, чем при более низких температурах. Таким образом, внутренняя температура тела около 98,6 ^° F также способствует диффузии частиц внутри тела.

Интерактивная ссылка

Перейдите по этой ссылке, чтобы увидеть диффузию и то, как она приводится в движение кинетической энергией молекул в растворе.Как температура влияет на скорость диффузии и почему?

Когда какое-либо вещество существует в большей концентрации на одной стороне полупроницаемой мембраны, такой как клеточные мембраны, любое вещество, которое может двигаться вниз по градиенту своей концентрации через мембрану, будет делать это. Рассмотрим вещества, которые могут легко диффундировать через липидный бислой клеточной мембраны, такие как газы кислород (O ₂ ) и CO ₂ . O ₂ обычно диффундирует в клетки, потому что он более сконцентрирован вне них, а CO ₂ обычно диффундирует из клеток, потому что он более сконцентрирован внутри них.Ни один из этих примеров не требует энергии со стороны клетки, и поэтому они используют пассивный транспорт для перемещения через мембрану.

Прежде чем двигаться дальше, вам нужно рассмотреть газы, которые могут диффундировать через клеточную мембрану. Поскольку клетки быстро потребляют кислород во время метаболизма, обычно внутри клетки концентрация O ₂ ниже, чем снаружи. В результате кислород будет диффундировать из межклеточной жидкости непосредственно через липидный бислой мембраны в цитоплазму внутри клетки.С другой стороны, поскольку клетки продуцируют CO ₂ в качестве побочного продукта метаболизма, концентрации CO ₂ повышаются в цитоплазме; следовательно, CO ₂ будет перемещаться из клетки через липидный бислой в интерстициальную жидкость, где его концентрация ниже. Этот механизм движения молекул через клеточную мембрану со стороны, где они более сконцентрированы, к стороне, где они менее сконцентрированы, представляет собой форму пассивного транспорта, называемого простой диффузией (Рисунок 3.5).

Рис. 3.5 Простая диффузия через клеточную (плазменную) мембрану Структура липидного бислоя позволяет небольшим незаряженным веществам, таким как кислород и углекислый газ, и гидрофобным молекулам, таким как липиды, проходить через клеточную мембрану вниз по градиенту их концентрации. простая диффузия.

Большие полярные или ионные молекулы, которые являются гидрофильными, не могут легко пересечь фосфолипидный бислой. Очень маленькие полярные молекулы, такие как вода, могут пересекаться посредством простой диффузии из-за своего небольшого размера.Заряженные атомы или молекулы любого размера не могут пересечь клеточную мембрану посредством простой диффузии, поскольку заряды отталкиваются гидрофобными хвостами внутри бислоя фосфолипидов. Растворенные вещества, растворенные в воде по обе стороны от клеточной мембраны, будут стремиться диффундировать вниз по градиенту их концентрации, но поскольку большинство веществ не могут свободно проходить через липидный бислой клеточной мембраны, их движение ограничивается белковыми каналами и специализированными транспортными механизмами в мембране. .Облегченная диффузия — это процесс диффузии, используемый для тех веществ, которые не могут пересекать липидный бислой из-за своего размера, заряда и / или полярности (рис. 3.6). Типичным примером облегченной диффузии является перемещение глюкозы в клетку, где она используется для производства АТФ. Хотя глюкоза может быть более концентрированной вне клетки, она не может пересекать липидный бислой посредством простой диффузии, потому что он является одновременно большим и полярным. Чтобы решить эту проблему, специальный белок-носитель, называемый переносчиком глюкозы, будет переносить молекулы глюкозы в клетку, чтобы облегчить ее внутреннюю диффузию.

Рис. 3.6. Облегченная диффузия (a) Облегченная диффузия веществ, пересекающих клеточную (плазматическую) мембрану, происходит с помощью белков, таких как канальные белки и белки-носители. Канальные белки менее избирательны, чем белки-носители, и обычно легко различают свой груз в зависимости от размера и заряда. (б) Белки-носители более селективны, часто позволяя пересекаться только одному конкретному типу молекул.

В качестве примера, хотя ионы натрия (Na ⁺ ) сильно сконцентрированы вне клеток, эти электролиты заряжены и не могут проходить через неполярный липидный бислой мембраны.Их диффузии способствуют мембранные белки, которые образуют натриевые каналы (или «поры»), так что ионы Na ⁺ могут перемещаться вниз по градиенту их концентрации из-за пределов клеток внутрь клеток. Есть много других растворенных веществ, которые должны пройти через облегченную диффузию, чтобы попасть в клетку, например, аминокислоты, или выйти из клетки, например, отходы. Поскольку облегченная диффузия — это пассивный процесс, он не требует затрат энергии клеткой.

Вода также может свободно перемещаться через клеточную мембрану всех клеток либо через белковые каналы, либо скользя между липидными хвостами самой мембраны.Осмос — это диффузия воды через полупроницаемую мембрану (рис. 3.7).

Рисунок 3.7 Осмос Осмос — это диффузия воды через полупроницаемую мембрану вниз по градиенту ее концентрации. Если мембрана проницаема для воды, но не для растворенного вещества, вода выровняет свою концентрацию, диффундируя в сторону более низкой концентрации воды (и, следовательно, в сторону более высокой концентрации растворенного вещества). В стакане слева раствор с правой стороны мембраны гипертонический.

Движение молекул воды само по себе не регулируется некоторыми клетками, поэтому важно, чтобы эти клетки подвергались воздействию среды, в которой концентрация растворенных веществ вне клеток (во внеклеточной жидкости) равна концентрации растворенных веществ. внутри клеток (в цитоплазме). Два раствора с одинаковой концентрацией растворенных веществ называются изотоническими (равное натяжение). Когда клетки и их внеклеточная среда изотоничны, концентрация молекул воды одинакова снаружи и внутри клеток, и клетки сохраняют свою нормальную форму (и функцию).

Осмос возникает, когда существует дисбаланс растворенных веществ вне клетки по сравнению с внутри клетки. Раствор, который имеет более высокую концентрацию растворенных веществ, чем другой раствор, называется гипертоническим, а молекулы воды имеют тенденцию диффундировать в гипертонический раствор (рис. 3.8). Клетки в гипертоническом растворе будут сморщиваться, когда вода покидает клетку посредством осмоса. Напротив, раствор, который имеет более низкую концентрацию растворенных веществ, чем другой раствор, считается гипотоническим, а молекулы воды имеют тенденцию диффундировать из гипотонического раствора.Клетки в гипотоническом растворе будут поглощать слишком много воды и набухать, что в конечном итоге может привести к разрыву. Важнейшим аспектом гомеостаза живых существ является создание внутренней среды, в которой все клетки тела находятся в изотоническом растворе. Различные системы органов, особенно почки, работают над поддержанием этого гомеостаза.

Рис. 3.8 Концентрация растворов Гипертонический раствор имеет более высокую концентрацию растворенного вещества, чем другой раствор. Изотонический раствор имеет концентрацию растворенного вещества, равную другому раствору.Гипотонический раствор имеет меньшую концентрацию растворенного вещества, чем другой раствор.

Другой механизм помимо диффузии для пассивной транспортировки материалов между отсеками — фильтрация. В отличие от диффузии вещества от более концентрированного до менее концентрированного, фильтрация использует градиент гидростатического давления, который выталкивает жидкость — и растворенные в ней вещества — из области с более высоким давлением в область с более низким давлением. Фильтрация — чрезвычайно важный процесс в организме. Например, кровеносная система использует фильтрацию для перемещения плазмы и веществ через эндотелиальную выстилку капилляров в окружающие ткани, снабжая клетки питательными веществами.Давление фильтрации в почках обеспечивает механизм удаления отходов из кровотока.

Активный транспорт

Для всех методов транспортировки, описанных выше, ячейка не расходует энергию. Мембранные белки, которые помогают в пассивном переносе веществ, делают это без использования АТФ. Во время активного транспорта АТФ требуется для перемещения вещества через мембрану, часто с помощью белков-носителей, и обычно против его градиента концентрации.

Один из наиболее распространенных типов активного транспорта включает белки, которые служат насосами.Слово «насос», вероятно, вызывает в воображении мысли об использовании энергии для накачки шины велосипеда или баскетбольного мяча. Точно так же энергия АТФ требуется этим мембранным белкам для переноса веществ — молекул или ионов — через мембрану, обычно против градиентов их концентрации (из области с низкой концентрацией в область с высокой концентрацией).

Натрий-калиевый насос, который также называется Na ⁺ / K ⁺ АТФаза, транспортирует натрий из клетки, одновременно перемещая калий в клетку.Насос Na ⁺ / K ⁺ — важный ионный насос, обнаруженный в мембранах многих типов клеток. Эти насосы особенно распространены в нервных клетках, которые постоянно выкачивают ионы натрия и притягивают ионы калия для поддержания электрического градиента через клеточные мембраны. Электрический градиент — это разница в электрическом заряде в пространстве. В случае нервных клеток, например, существует электрический градиент между внутренней и внешней частью клетки, при этом внутренняя часть заряжена отрицательно (около -70 мВ) относительно внешней стороны.Отрицательный электрический градиент сохраняется, потому что каждый насос Na ⁺ / K ⁺ перемещает три иона Na ⁺ из клетки и два иона K ⁺ в клетку для каждой используемой молекулы АТФ (рис. 3.9) . Этот процесс настолько важен для нервных клеток, что на него приходится большая часть использования ими АТФ.

Рис. 3.9. Натрий-калиевый насос. Натрий-калиевый насос находится во многих клеточных (плазматических) мембранах. Насос, работающий от АТФ, перемещает ионы натрия и калия в противоположных направлениях, каждый против своего градиента концентрации.За один цикл насоса три иона натрия вытесняются из ячейки, а два иона калия импортируются в ячейку.

Активные транспортные насосы могут также работать вместе с другими активными или пассивными транспортными системами для перемещения веществ через мембрану. Например, натрий-калиевый насос поддерживает высокую концентрацию ионов натрия вне клетки. Следовательно, если клетке нужны ионы натрия, все, что ей нужно сделать, это открыть пассивный натриевый канал, поскольку градиент концентрации ионов натрия заставит их диффундировать в клетку.Таким образом, действие активного транспортного насоса (натрий-калиевый насос) обеспечивает пассивный транспорт ионов натрия, создавая градиент концентрации. Когда активный транспорт обеспечивает перенос другого вещества таким образом, это называется вторичным активным транспортом.

Симпортеры — это вторичные активные переносчики, которые перемещают два вещества в одном направлении. Например, симпортер натрий-глюкоза использует ионы натрия, чтобы «втягивать» молекулы глюкозы в клетку. Поскольку клетки хранят глюкозу для получения энергии, глюкоза обычно находится в более высокой концентрации внутри клетки, чем снаружи.Однако из-за действия натрий-калиевого насоса ионы натрия легко диффундируют в клетку при открытии симпортера. Поток ионов натрия через симпортер обеспечивает энергию, которая позволяет глюкозе перемещаться через симпортер в клетку против градиента ее концентрации.

И наоборот, антипортеры — это вторичные активные транспортные системы, которые транспортируют вещества в противоположных направлениях. Например, антипортер ионов натрия-водорода использует энергию поступающего внутрь потока ионов натрия для перемещения ионов водорода (H +) из клетки.Натрий-водородный антипортер используется для поддержания pH внутри клетки.

Другие формы активного транспорта не связаны с мембранными переносчиками. Эндоцитоз (попадание «в клетку») — это процесс поглощения клеткой материала путем охвата его частью своей клеточной мембраны с последующим отщипыванием этой части мембраны (рис. 3.10). После защемления часть мембраны и ее содержимое становятся независимыми внутриклеточными пузырьками. Везикула — это перепончатый мешок — сферическая полая органелла, ограниченная двухслойной липидной мембраной.Эндоцитоз часто приносит в клетку материалы, которые необходимо расщепить или переварить. Фагоцитоз («поедание клеток») — это эндоцитоз крупных частиц. Многие иммунные клетки участвуют в фагоцитозе вторгающихся патогенов. Как и маленькие пакмены, их работа — патрулировать ткани тела на предмет нежелательных веществ, таких как вторжение в бактериальные клетки, фагоцитировать и переваривать их. В отличие от фагоцитоза, пиноцитоз («питье клетки») переносит жидкость, содержащую растворенные вещества, в клетку через мембранные везикулы.

Рисунок 3.10 Три формы эндоцитоза Эндоцитоз — это форма активного транспорта, при котором клетка окружает внеклеточные материалы, используя свою клеточную мембрану. (а) При фагоцитозе, который является относительно неселективным, клетка поглощает крупную частицу. (б) При пиноцитозе клетка поглощает мелкие частицы жидкости. (c) Напротив, рецепторно-опосредованный эндоцитоз довольно селективен. Когда внешние рецепторы связывают определенный лиганд, клетка отвечает эндоцитозом лиганда.

Фагоцитоз и пиноцитоз захватывают большие части внеклеточного материала, и они, как правило, не обладают высокой избирательностью в отношении веществ, которые они приносят.Клетки регулируют эндоцитоз определенных веществ через рецептор-опосредованный эндоцитоз. Рецептор-опосредованный эндоцитоз — это эндоцитоз части клеточной мембраны, содержащей множество рецепторов, специфичных для определенного вещества. Как только поверхностные рецепторы свяжут достаточное количество специфического вещества (лиганда рецептора), клетка будет эндоцитозировать часть клеточной мембраны, содержащую комплексы рецептор-лиганд. Таким образом эритроциты эндоцитируют железо, необходимый компонент гемоглобина.Железо связано с белком, который называется трансферрином в крови. Специфические рецепторы трансферрина на поверхности эритроцитов связывают молекулы железо-трансферрин, и клетка эндоцитирует комплексы рецептор-лиганд.

В отличие от эндоцитоза, экзоцитоз («извлечение из клетки») — это процесс экспорта клетками материала с использованием везикулярного транспорта (рис. 3.11). Многие клетки производят вещества, которые необходимо секретировать, как фабрика, производящая продукт на экспорт. Эти вещества обычно упакованы в мембраносвязанные везикулы внутри клетки.Когда мембрана везикулы сливается с клеточной мембраной, везикула выпускает свое содержимое в интерстициальную жидкость. Затем мембрана везикул становится частью клеточной мембраны. Клетки желудка и поджелудочной железы производят и секретируют пищеварительные ферменты посредством экзоцитоза (рис. 3.12). Эндокринные клетки производят и секретируют гормоны, которые разносятся по всему телу, а определенные иммунные клетки производят и секретируют большое количество гистамина, химического вещества, важного для иммунных реакций.

Рисунок 3.11 Экзоцитоз Экзоцитоз во многом похож на эндоцитоз в обратном направлении. Материал, предназначенный для экспорта, упаковывается в пузырьки внутри клетки. Мембрана везикулы сливается с клеточной мембраной, и содержимое выходит во внеклеточное пространство.

Рисунок 3.12 Ферментные продукты клеток поджелудочной железы Ацинарные клетки поджелудочной железы производят и секретируют множество ферментов, которые переваривают пищу. Крошечные черные гранулы на этой электронной микрофотографии представляют собой секреторные везикулы, заполненные ферментами, которые будут выводиться из клеток посредством экзоцитоза.LM × 2900. (Микрофотография предоставлена ​​Медицинской школой Риджентс Мичиганского университета © 2012)

Болезни …

Клетка: Муковисцидоз

Муковисцидоз (CF) поражает примерно 30 000 человек в Соединенных Штатах, при этом ежегодно регистрируется около 1000 новых случаев. Это генетическое заболевание наиболее известно своим поражением легких, вызывающим затруднения дыхания и хронические легочные инфекции, но оно также поражает печень, поджелудочную железу и кишечник. Всего около 50 лет назад прогноз для детей, рожденных с МВ, был очень мрачным — ожидаемая продолжительность жизни редко превышала 10 лет.Сегодня, с развитием медицины, многие пациенты с МВ доживают до 30 лет.

Симптомы МВ являются результатом неисправности мембранного ионного канала, называемого регулятором трансмембранной проводимости при муковисцидозе, или CFTR. У здоровых людей белок CFTR является интегральным мембранным белком, который переносит ионы Cl ^— из клетки. У человека, у которого есть CF, ген CFTR мутирован, таким образом, клетка производит дефектный белок канала, который обычно не включается в мембрану, а вместо этого разрушается клеткой.

CFTR требует АТФ для работы, что делает его Cl ^— транспортной формой активного транспорта. Эта характеристика долгое время озадачивала исследователей, потому что ионы Cl ^— на самом деле текут на вниз по градиенту их концентрации при транспортировке из клеток. Активный транспорт обычно перекачивает ионы против их градиента концентрации, но CFTR представляет собой исключение из этого правила.

В нормальной ткани легких перемещение Cl ^— из клетки поддерживает обогащенную Cl ^— отрицательно заряженную среду непосредственно за пределами клетки.Это особенно важно в эпителиальной выстилке дыхательной системы. Клетки респираторного эпителия выделяют слизь, которая улавливает пыль, бактерии и другой мусор. Реснички (множественное число = реснички) — это один из волосковидных придатков, обнаруженных на определенных клетках. Реснички на эпителиальных клетках перемещают слизь и ее захваченные частицы по дыхательным путям от легких к внешней стороне. Для эффективного продвижения вверх слизь не может быть слишком вязкой; скорее он должен иметь жидкую водянистую консистенцию.Транспорт Cl ^— и поддержание электроотрицательной среды вне клетки привлекают положительные ионы, такие как Na ⁺ , во внеклеточное пространство. Накопление ионов Cl ^— и Na ⁺ во внеклеточном пространстве создает богатую растворенными веществами слизь с низкой концентрацией молекул воды. В результате через осмос вода перемещается из клеток и внеклеточного матрикса в слизь, «разжижая» ее. Таким образом, в нормальной дыхательной системе слизь остается достаточно разбавленной, чтобы ее можно было вытолкнуть из дыхательной системы.

Если канал CFTR отсутствует, ионы Cl ^— не выводятся из клетки в достаточном количестве, что не позволяет им вытягивать положительные ионы. Отсутствие ионов в секретируемой слизи приводит к отсутствию нормального градиента концентрации воды. Таким образом, отсутствует осмотическое давление, втягивающее воду в слизь. Образующаяся слизь густая и липкая, и мерцательный эпителий не может эффективно удалить ее из дыхательной системы. Проходы в легких блокируются слизью вместе с мусором, который она переносит.Бактериальные инфекции возникают легче, потому что бактериальные клетки не выводятся из легких.

Грамотрицательная бактериальная периплазма: размер имеет значение

Цитирование: Миллер С.И., Салама Н.Р. (2018) Грамотрицательная бактериальная периплазма: размер имеет значение. PLoS Biol 16 (1): e2004935. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004935

Опубликовано: 17 января 2018 г.

Авторские права: © Миллер, Салама, 2018.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Национальные институты здравоохранения https://www.nih.gov (номер гранта R01AI054423). Получено NRS. Спонсор не имел никакого отношения к дизайну исследования, сбору и анализу данных, принятию решения о публикации или подготовке рукописи. Национальные институты здоровья https: // www.nih.gov (номер гранта 5U19AI107775). Получено по SIM-карте. Спонсор не имел никакого отношения к дизайну исследования, сбору и анализу данных, принятию решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения: ABC, АТФ-связывающая кассета; Я, внутренняя мембрана; Lpp, Липопротеин Брауна; LPS, липополисахарид; ОМ, внешняя мембрана; PG, пептидогликан; RcsF, Регулятор капсульного синтеза F

Происхождение: Введен в эксплуатацию; внешняя экспертная оценка.

Грамотрицательные бактерии, как и энергетические органеллы растений и животных (хлоропласты и митохондрии), имеют два мембранных бислоя, называемых внешней и внутренней мембранами. Пространство между этими двумя мембранами называется периплазмой. Задолго до одноклеточных эукариот периплазма превратилась в первый экстрацитоплазматический компартмент, обеспечивающий важную конкурентную адаптацию к грамотрицательным бактериям. Ранние знания и открытие периплазмы возникли еще до ее морфологической визуализации.В 1960-х годах ученые пытались понять, насколько токсичные ферменты, участвующие в деградации важных биологических молекул, таких как рибонуклеазы и фосфатазы, продуцируемые грамотрицательными бактериями Escherichia coli , не токсичны для клетки. Методы биохимической экстракции предлагали отдельный отсек, поскольку такая экстракция сохраняла внутреннюю мембранно-связанную цитоплазму, и эти сферопласты могли снова расти и синтезировать больше ферментов [1]. Развитие электронной микроскопии привело к визуализации двух мембранных бислоев, разделенных периплазмой [2].

Дополнительная мембрана позволяет создавать периплазму как отдельный клеточный компартмент, новые функции которого, вероятно, обеспечивают значительное и, возможно, даже более важное селективное преимущество, чем исключение токсинов (Таблица 1). Эти новые функции включают транспорт, фолдинг, окисление и контроль качества белка, аналогичные эндоплазматическому ретикулуму эукариотических клеток. Периплазма также обеспечивает секвестрацию ферментов, которые могут быть токсичными в цитоплазме, важных сигнальных функциях и регуляции деления клеток.Кроме того, он способствует способности клетки противостоять тургорному давлению, обеспечивая структурные системы, которые работают согласованно с внешней мембраной, такие как пептидогликан и липопротеины, системы оттока нескольких лекарственных препаратов и специфические растворенные вещества, которые вносят вклад в доннановский или ионный потенциал через внешняя мембрана. Периплазма также содержит платформы сборки, участвующие в секреции уникально структурированных бета-стволовых белков, липопротеинов и глицеринфосфолипидов на внешнюю мембрану (Рис. 1).

Рис. 1. Архитектура оболочки грамотрицательных бактериальных клеток.

Показан асимметричный бислой липополисахарида и глицеролфосфолипидов, который составляет внешнюю мембрану. Внутренняя мембрана представляет собой симметричный бислой глицеринфосфолипидов. Периплазматическое пространство — это область между этими мембранами, которая включает в себя множество ферментов и функций, включая окисление и контроль качества белков. Также в периплазматическом пространстве находится слой сшитых сахаров и аминокислот, называемый пептидогликаном, который окружает клетку.Пептидогликан связан с внешней мембраной кишечных бактерий посредством ковалентных транспептидазных связей между обильным липопротеином Lpp наружной мембраны. Разнообразные сенсоры располагаются на внутренней мембране с периплазматическими доменами, воспринимающими изменение окружающей среды и, в случае системы Rcs, изменение местоположения липопротеина внешней мембраны RcsF. Многокомпонентные белковые комплексы, такие как жгутиковый аппарат, охватывают две мембраны. IM, внутренняя мембрана; Lpp, липопротеин Брауна; ЛПС, липополисахарид; RcsF, Регулятор синтеза капсул F.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004935.g001

Наружная мембрана — это уникальная органелла, соединенная с другими частями клеточной оболочки через периплазму. У грамположительных бактерий отсутствует внешняя мембрана, но они имеют более обширный пептидогликановый полимер, защищающий их поверхность. В отличие от внутренней бактериальной мембраны, которая представляет собой бислой из глицеролфосфолипидов, подобный таковому у большинства мембран млекопитающих, и который имеет специфический поток, характеризующийся боковой диффузией, внешняя мембрана имеет ограниченный поток [3].Это уникальный бислой, внутренний лист которого имеет типичное глицеринфосфолипидное содержание фосфотидилэтаноламина, фосфатидилглицерина и кардиолипина, а внешний листок в основном состоит из уникального гликолипида, липополисахарида (ЛПС) [4]. Фосфаты ЛПС наделяют поверхность отрицательным зарядом, и через внешнюю мембрану в периплазму создается специфический потенциал Доннана [5]. Наружная мембрана действует как селективный барьер, который позволяет транспортировать ценные питательные вещества, одновременно обеспечивая барьер против токсичных соединений, таких как катионные противомикробные соединения, продуцируемые всеми организмами, включая многие грамположительные бактерии [6].Другим компонентом этого барьера являются белки внешней мембраны с уникальной бета-цилиндрической структурой, которые вставляются во внешнюю мембрану через специфическую периплазматическую систему шаперонов [7]. Эти белки собираются во внешнюю мембрану как специфические точки, указывая на то, что внешняя мембрана, вероятно, собирается в специфические дискретные участки, содержащие белок и уникальный асимметричный липидный бислой [8]. В число этих белков внешней мембраны входят порины, которые могут действовать как селективные каналы, позволяющие гидрофильным субстратам определенного размера проникать в периплазму.К счастью для людей, эти порины транспортируют гидрофильные бета-лактамные антибиотики, что позволяет им проникать в периплазму, где они нацелены на синтез важного структурного элемента клеточной стенки — полимерного пептидогликана. Наружная мембрана у некоторых бактерий прикреплена к пептидогликановому полимеру через обильные липопротеины, которые вставляются во внутренний листок внешней мембраны через специфические системы секреции [9]. Множество важных белковых комплексов функционируют как наномашины и используют гидролиз АТФ для секреции макромолекул или поворота органеллы подвижности, называемой жгутиками [10,11,12].Следовательно, внешняя мембрана и внутренняя мембрана также связаны через периплазму с помощью трансмембранных белковых комплексов. Следовательно, внешняя мембрана состоит из четко собранных участков, которые содержат сложную органеллу, которая может быть прикреплена к слою пептидогликана и внутренней мембране посредством ковалентных и нековалентных белковых связей. Сборка внешней мембраны и ее связь с пептидогликаном и цитоплазмой создают пространство между внутренней мембраной и внешней мембраной, которое является периплазмой.

Несмотря на важные функции, содержащиеся в периплазматическом пространстве, в течение многих лет ведутся споры о межмембранном расстоянии или размере этого компартмента и о единообразии расстояния между внутренней и внешней мембранами по всей клетке. Высказывались опасения, что многие визуализации этого пространства как определенного размера были артефактами фиксации для получения изображений с помощью электронной микроскопии, и что на самом деле это пространство было лишь потенциальным пространством.Ранние электронно-микроскопические исследования Байера продемонстрировали спайки между внешней и внутренней мембранами, которые уничтожили часть этих пространств; он предположил, что точки адгезии — это области, где главный липид наружной створки, LPS, доставляется к внешней мембране из места его синтеза на внутренней мембране [13]. Однако его работа впоследствии была дискредитирована как результат наблюдения потенциальных артефактов фиксации, хотя сегодня многие эксперты считают, что между мембранами могут существовать настоящие белковые адгезии, поскольку некоторые системы оттока и транспорта не содержат компонентов достаточных размеров, чтобы охватить весь мир. визуализированное пространство.Наличие специфических областей, в которых мембраны расположены близко друг к другу, объясняет, как могут работать некоторые из этих насосов для транспортировки и оттока АТФ-связывающей кассеты (ABC); эти системы имеют периплазматические белковые компоненты, которые необходимы для оттока, LPS или другого транспорта гликолипидов, но не имеют собственного размера или полимерной природы, достаточно большой, чтобы достичь внешней мембраны и, таким образом, обеспечить механизм, способствующий транспорту. Кроме того, периплазма содержит множество других компонентов, которые требуют, по крайней мере, некоторого объема периплазматического пространства, в первую очередь полимерного слоя пептидогликана, окружающего клетку.В настоящее время неясно, как эти переносчики перемещаются вокруг этого полимера и ширина периплазмы для контакта с мембраной, хотя недавняя работа, демонстрирующая, что липопротеины внешней мембраны могут координировать синтез пептидогликана посредством прямого контакта, указывает на то, что по крайней мере некоторые белки могут проходить через поры в пептидогликан для выполнения важных функций [14]

Напротив, множество органелл, включая жгутик и связанный с вирулентностью игольчатый комплекс системы секреции типа III, требуют сборки полимеров внутри периплазмы, которая охватывает две мембраны.В случае жгутика его стержень или приводной вал охватывает периплазму, а его длина определяется полимером, контактирующим с внешней мембраной. Элегантная недавняя работа группы Келли Хьюз показала, что размер периплазмы или расстояние между двумя мембранами у кишечных бактерий в значительной степени контролируется специфическим липопротеином, называемым липопротеином Брауна (или Lpp), который ковалентно связывает внешнюю мембрану. в слой пептидогликана [15]. Это весьма примечательно, потому что Lpp — это самый распространенный белок, присутствующий в кишечных бактериях, описанный Брауном 48 лет назад, и до этого момента ему не приписывали никакой специфической функции.Этот альфа-спиральный белок вставляется через свой липидный якорь во внутренний листок внешней мембраны и ковалентно связан с пептидогликановым полимером семейством транспептидаз [16]. Удлинение этих липопротеинов, что способствует расширению периплазмы, приводит к более длинному жгутиковому стержню и более эффективному поведению при плавании. Эти авторы интерпретировали этот результат как указание на то, что должны быть другие эволюционно избранные функции, которые ограничивают периплазматический размер, вызывая снижение эффективности плавания.В этом выпуске PLOS Biology раскрывается одна из этих важных функций: сигнальная функция повреждения оболочки, контролируемая другим липопротеином внешней мембраны, регулятором синтеза капсулы F (RcsF), который распознает нарушение или повреждение оболочки.

Грамотрицательные бактерии выполняют множество важных функций, которые определяют повреждение мембраны и токсичные соединения, такие как антимикробные пептиды, которые повреждают внешнюю мембрану [17,18]. Эти сенсорные системы включают те, которые позволяют реконструировать бактериальную поверхность, чтобы сделать ее более устойчивой к токсичным соединениям — аналогично космическим кораблям, активирующим свои щиты в научно-фантастических рассказах [19].Некоторые из этих сенсорных систем представляют собой рецепторы, которые функционируют как сенсорные киназы с доменами в периплазме, чтобы ощущать определенные молекулы или повреждения. Однако одна из наиболее уникальных сенсорных киназных систем, называемая системой Rcs, которая при повреждении мембраны активирует синтез внеклеточного полисахарида для обеспечения клеточной защиты и образования биопленок, имеет липопротеин внешней мембраны RcsF, который взаимодействует с сигнальными белками со специфическими периплазматическими доменами на повреждение оболочки и пептидогликановый стресс для активации синтеза внеклеточной продукции полисахаридов и других связанных со стрессом путей совладания [20].Таким образом, повреждение оболочки каким-то образом приближает липопротеин RcsF к внутренней мембранно-чувствительной системе, и, таким образом, он эволюционировал, чтобы почувствовать нарушение во внешней мембране и / или пептидогликане (Рис. 2). В этом выпуске PLOS Biology авторы убедительно демонстрируют, что для этого зондирования требуется периплазма определенного размера, поскольку мутации, которые удлиняют очень распространенный липопротеиновый якорь Lpp от внешней мембраны до пептидогликана (что приводит к увеличению размера периплазмы). ) отменяет передачу сигналов, если чувствительный липопротеин (который при повреждении мембраны должен достигать сенсора внутренней мембраны) также не удлиняется [21].Эта работа также ясно показывает очень специфический порядок и размер периплазмы; размер периплазмы четко виден, поскольку он существует в связи с изменениями в прикреплении липопротеинов или длине при криоэлектронной микроскопии. Эта технология и электронная томография, использованные в работе группы Хьюза в отношении жгутикового ротора [15], революционизируют наш взгляд на оболочку бактериальной клетки и белковые комплексы, которые покрывают периплазму для выполнения важных функций [22].

Рис 2.Передача сигналов RcsF изменяется из-за изменения размера периплазматического пространства.

Датчик липопротеинов внешней мембраны RcsF должен контактировать со своими внутренними мембранными сигнальными партнерами, чтобы активировать зондирование. Это восприятие требует определенного периплазматического расстояния, потому что удлинение связей Lpp с пептидогликаном увеличивает расстояние периплазмы, и если RcsF не удлиняется, передача сигналов больше не может происходить. На панели A: состояние, в котором RcsF не активирует сигнализацию, потому что не происходит нарушения оболочки.На панели B: нарушение оболочки приводит к физическим взаимодействиям RcsF с внутренней мембранно-чувствительной системой, и активируется регулон Rcs. На панели C, на которой Lpp был удлинен и периплазматическое межмембранное расстояние увеличено, Rcs регулон не может быть активирован, несмотря на нарушение оболочки. На панели D: дефект длинного Lpp исправлен удлинением RcsF. IM, внутренняя мембрана; Lpp, липопротеин Брауна; ОМ, наружная мембрана; PG, пептидогликан; RcsF, Регулятор синтеза капсул F.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004935.g002

Хотя эти недавние исследования определили Lpp как особый молекулярный правитель между внешней мембраной и пептидогликаном, неизвестно, что регулирует расстояние между внутренней мембраной и пептидогликан и то, что контролирует полимеризацию или деградацию пептидогликанового полимера, так что он не полностью блокирует белки, покрывающие периплазму. Определение этих и других загадок клеточной оболочки может привести к важным практическим достижениям в дополнение к удовлетворению нашего научного стремления разгадать загадки оболочки грамотрицательных бактерий.Эта оболочка представляет собой чрезвычайно эффективное и эволюционно продвинутое молекулярное сито, которое значительно затрудняет разработку антибиотиков против этих организмов, чем для грамположительных бактерий, у которых отсутствует дополнительная мембрана и периплазма.

Расширенные знания о грамотрицательной клеточной оболочке также имеют решающее значение для понимания механизмов устойчивости к антибиотикам, потому что многие из наших наиболее успешных антибиотиков, включая бета-лактамные антибиотики (которые нацелены на пептидогликан и проникают через порины), нацелены на клеточную оболочку.Грамотрицательные бактерии и организмы с множественной лекарственной устойчивостью продолжают развиваться за счет мутаций оболочки и приобретения новых периплазматических ферментов. В разработке не хватает новых антибиотиков для грамотрицательных бактерий из-за сложности преодоления уникального барьера, обеспечиваемого внешней мембраной и периплазмой. В этом отношении антибиотики с периплазматическими мишенями имеют преимущество перед антибиотиками, которые сталкиваются с трудностями проникновения через внутреннюю мембрану и предотвращения значительного оттока.Интересно предположить, что нацеливание на важные периплазматические функции, которые требуют периплазмы определенного размера и способности выполнять различные функции, может предложить новые важные цели для разработки антибиотиков. Недавние исследования выявили новые основные функции грамотрицательной оболочки с помощью бактериальной генетики, структурной биологии и передовых морфологических методов. Несмотря на десятилетия исследований, еще многое предстоит узнать о оболочке грамотрицательных бактериальных клеток.Раскрытие других загадок в этой области должно привести к новому поколению целей для разработки антибиотиков, чтобы держать нас на шаг впереди в гонке вооружений с устойчивыми к антибиотикам грамотрицательными бактериями.

Бактериальная клеточная стенка — обзор

тРНК для синтеза клеточной стенки

В стенке бактериальной клетки аминокислотная модификация пептидогликана способствует перекрестному связыванию с плазматической мембраной, что приводит к снижению проницаемости мембраны, что часто является предпосылкой для применения антибиотика высокого уровня сопротивление.Многие клинически значимые бактерии, в том числе Streptococcus pneumoniae , Staphylococcus aureus , Enterococcus faecalis и Pseudomonas aeruginosa , рекрутируют специфические аминоацилированные тРНК в пептидогликаны, биосинтез и мембрану фосфолигликанов (2012). ; Banerjee и др. , 2010). Поперечное сшивание коротких внутрицепочечных пептидов придает клетке дополнительную жесткость, обеспечивающую устойчивость S.aureus к β-лактамным антибиотикам, включая метициллин (Biarrotte-Sorin et al. , 2004). Эти аминокислоты, обычно Gly и Ala, переносятся из аминоацил-тРНК (AA-тРНК) в гексапептидный липидный интермедиат с помощью ряда ферментов, таких как FemA / B / X. Каждый из белков Fem присоединяет несколько аминокислот для последовательного построения межпептидного мостика (Biarrotte-Sorin et al. , 2004; Benson et al. , 2002).

Чтобы участвовать в биосинтезе пептидогликана, AA-тРНК должны выходить из цепи трансляции цитоплазматического белка.Некоторые тРНК специально оптимизированы для избежания трансляции из-за отсутствия определенных последовательностей GTψC и GG в петле акцепторного ствола и, таким образом, неспособны связываться с EF-Tu • GTP и рибосомой. Кроме того, белки FemX специфически распознают аминокислотную составляющую (Gly и Ala), дискриминаторное основание тРНК ^Gly и акцепторный стержень тРНК ^Ala , чтобы рекрутировать эти тРНК для биосинтеза пептидогликана. Другие аминокислоты, включая Ser, Thr, Lys и Arg и их тРНК, также используются для сшивания пептидогликанов или модификации липидов клеточной мембраны (Dare and Ibba, 2012).

У стрептомицетов аминоацилированные тРНК также используются для синтеза антибиотиков, а также для устойчивости к антибиотикам. Антибиотик валанимицин, продуцируемый Streptomcyes viridifaciens , является производным Val (l-валин) и Ser (l-серин). Вал сначала превращается в изобутилгидроксиламин, который должен реагировать с Ser во время биосинтеза валанимицина (Garg et al. , 2008). Ген серил-тРНК синтетазы, неожиданно идентифицированный в кластере генов биосинтеза валанимицина (vlm), указывает на то, что сериловый остаток может переноситься с серил-тРНК на гидроксильную группу изобутилгидроксиламина (Garg et al., 2006). Другой пример тРНК-зависимого синтеза антибиотиков — это биосинтез альбонурсина (alb) в Streptomyces noursei (Gondry et al. , 2009). Альбонурсин представляет собой циклодипептидный антибиотик, полученный из Phe и Leu ферментом AlbC, и было обнаружено, что заряженные тРНК E.coli тРНК ^Phe и тРНК ^Leu были необходимыми субстратами. В следующих исследованиях было обнаружено множество других циклодипептидов, содержащих Ala, Val и Met из клеточного экстракта, что указывает на то, что AlbC и его гомологи могут использовать другие тРНК в качестве субстратов, помимо тРНК ^Phe и тРНК ^Leu .Эти примеры предполагают, что у тРНК есть много других ролей, которые еще предстоит раскрыть.

Разделение фаз в биологии; функциональная организация высшего порядка | Клеточная коммуникация и передача сигналов

Подобно разделению труда в человеческих обществах, клеточная «рабочая сила», макромолекулы, такие как белки, ДНК и РНК, пространственно организована в клетке на основе функциональной специализации. Субклеточная организация макромолекул лежит в основе жизненно важных клеточных процессов, таких как развитие, деление и гомеостаз, в то время как нарушение этой организации часто связано с болезнью.

Большая часть ферментативных и сигнальных реакций в биологии происходит в водном растворе. Липидные бислои, не смешивающиеся с водной фазой, включают водорастворимые компоненты клетки. Плазматическая мембрана охватывает все внутренние компоненты клетки. Органеллы, связанные с мембраной, обеспечивают физическое разделение, необходимое для протекания специализированных процессов в функционально оптимизированных компартментах внутри клетки. Таким образом, ядро ​​содержит механизмы, предназначенные для синтеза ДНК и РНК, а в цитоплазме находятся компоненты, контролирующие синтез и распад белка.Эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи и липидные везикулы представляют собой мембранные компартменты, специализирующиеся на сортировке и транспортировке белков через клетку. Митохондрии обеспечивают энергетические потребности клетки в АТФ и заключены в двухслойную мембрану, в отличие от одинарного липидного бислоя, окружающего другие мембраносвязанные органеллы.

С появлением электронной микроскопии, которая позволила визуализировать структуры в нанометровом масштабе [1], а также достижением флуоресцентных красителей и световой микроскопии стало очевидно, что в ядре и цитозоле происходит дальнейшее подразделение и локальная организация в форме не -мембранные макромолекулярные сборки.

В настоящее время охарактеризованные безмембранные тела или органеллы имеют размер от десятков нм до десятков мкм и были определены как высокодинамичные макромолекулярные ансамбли, компоненты которых быстро меняются между органеллами и окружающей средой [2-7]. Ядрышки (обзор в [8]), ядерные спеклы (обзор в [3, 9]), параспеклы (обзор в [2, 10]) и PML (обзор в [11, 12]) и тельца Кахаля (обзор в [ 4]) заключены в ядерную оболочку и специализируются на различных аспектах регуляции генов и метаболизма РНК.Гранулы цитоплазматического рибонуклеопротеина (мРНП), такие как Р-тельца, зародышевые гранулы и стрессовые гранулы (рассмотренные в [13]), выполняют специфические роли в метаболизме и гомеостазе мРНК. Аналогичные формы гранул РНК недавно были идентифицированы в митохондриях, играющих роль в биогенезе митохондриальных рибосом и процессинге РНК [14].

В этом обзоре мы представим обзор современных знаний о структурной биологии безмембранных органелл и молекулярных механизмах, участвующих в регуляции их структуры и функции.

Обзор безмембранных органелл

Безмембранные органеллы были описаны как динамические структуры, которые часто проявляют подобные жидкости физические свойства [5, 6]. Хотя точно установлено, что они участвуют в важных биологических процессах, их точные роли остаются неуловимыми, часто связанными более чем с одним функциональным путем. Как будет описано более подробно в следующих разделах, белковый состав безмембранных органелл и их морфология изменяются в ответ на изменения в клеточной среде.Эта способность реагировать на сигналы окружающей среды может представлять собой механистическую основу участия безмембранных органелл, обсуждаемых здесь, в чувствительности к стрессу [2, 4, 9, 11, 13, 15]. Отсутствие богатого липидами барьера для включения компонентов безмембранных органелл дает преимущество, заключающееся в том, что изменения в окружающей среде могут легко изменить их внутреннее равновесие. Высвобождение или секвестрация составляющих белков или РНК из безмембранных органелл или внутри них изменяет их концентрации в окружающем свободно диффундирующем пуле макромолекул, тем самым посылая сигналы, которые нарушают пути реакции на стресс.Одним из примеров является накопление в ядрышке с последующим высвобождением в нуклеоплазму опухолевого супрессора p14 ^ARF в ответ на повреждение ДНК, которое активирует путь опухолевого супрессора p53 [16]. Ядерный объем разделен на несколько безмембранных органелл, также называемых ядерными тельцами. Цитоплазматические тельца дополнительно разделяют цитозольные компоненты. Ядерные и цитоплазматические тельца представляют собой динамические структуры с четко определенным составом, которые обладают способностью обмениваться компонентами в ответ на изменения в окружающей их среде.В следующем разделе мы обсудим функциональную роль безмембранных органелл и уникальные особенности, которые их определяют.

Ядерные безмембранные тельца

Ядрышко

Крупнейшая и наиболее изученная безмембранная органелла, ядрышко, функционирует как центр биогенеза рибосом в эукариотических клетках. Ядрышко демонстрирует сложную, раздельную организацию в интерфазе и распадается в митозе. С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) в интактных ядрышках можно наблюдать три различных участка: центры фибриллы (FC), плотный фибриллярный компонент (DFC) и гранулярный компонент (GC).Во время митоза GC растворяется, нарушая организацию ядрышка, но компоненты FC и DFC поддерживают взаимодействия как диффундирующие субструктуры.

Сборка ядра (обзор в [8]) инициируется РНК-полимеразой I (РНК-Pol I), транскрипция кластерных генов рибосомной РНК (рРНК) (рДНК), связанных с фактором транскрипции UBF. Биогенез рибосом происходит векторно, начиная с FC, где рДНК транскрибируется в рРНК. Молекулы пре-рРНК проходят через DFC, где они сплайсируются и собирается малая рибосомная субъединица, затем перемещаются в GC, где собирается большая рибосомная субъединица.Затем прерибосомные частицы высвобождаются в нуклеоплазму и затем экспортируются в цитоплазму, где собираются функциональные рибосомы.

p53-зависимые механизмы чувствительности к стрессу интегрированы в ядрышко, тем самым позволяя клетке останавливать энергетически затратный процесс биогенеза рибосом в условиях, неблагоприятных для роста и пролиферации. Например, в ответ на онкогенный стресс (например, активацию Myc), Mdm2, убиквитинлигаза E3, отвечающая за быстрый оборот p53, иммобилизуется в ядрышке посредством взаимодействия с p14 ^ARF , чтобы активировать p53 и его нижележащие клетки. эффекторы остановки цикла [17].

Paraspeckles

Paraspeckles — это ядерные тельца, расположенные в межхроматиновом пространстве, играющие роль в контроле экспрессии генов посредством удерживания в ядре специфических молекул РНК, отмеченных аденозино-инозиновым редактированием [2]. Белки, из которых состоят параспеклы, связаны с транскрипцией РНК-полимеразы II (РНК-Pol II) и процессингом РНК. Семейство DBHS белков сплайсинга, P54NRB / NONO, PSPC1, PSF / SFPQ [2, 10, 18, 19], и длинные некодирующие РНК (lcnRNA) NEAT1 / Men ε / β и Ctn являются составными частями. компоненты параспеклов [2].Параспеклы реагируют на стресс и обмениваются компонентами с ядрышком в ответ на сигналы окружающей среды. Например, белок 1 параспекла (PSPC1) был впервые идентифицирован как белок ядрышка; однако позже было показано, что в условиях активной РНК-Pol II-зависимой транскрипции он разделяется на другое ядерное тельце, параспеклы, и становится повторно локализованным в ядрышке только тогда, когда активность РНК Pol II подавляется [10, 18 ]. Интересно, что эта повторная локализация происходит в пери-ядрышковых крышках, которые представляют собой структуры, которые, по-видимому, физически связаны с ядрышками, но не интегрированы в ядрышковый матрикс [10].Это указывает на то, что либо физические свойства PSPC1-содержащих тел и ядрышка различны, что исключает слияние, либо их динамическое поведение ограничено в ответ на сигналы, которые ингибируют активность РНК Pol II.

Ядерные спеклы

По внешнему виду похожие на параспеклы и локализованные рядом с нуклеоплазматическими межхроматиновыми областями [3], ядерные спеклы, также называемые снарпосомами, представляют собой отдельный класс динамических органелл [1]. Состав ядерных спеклов, обогащенных факторами сплайсинга пре-мРНК, такими как малые ядерные рибонуклеопротеины (snRNP) и белки, богатые серином / аргинином (SR) [20], и поли (A) ⁺ РНК [21], как а также их пространственная близость к сайтам активной транскрипции, предполагает, что они могут играть роль в регуляции экспрессии генов, поставляя или сохраняя факторы, связанные со сплайсингом пре-мРНК [22].

Тельца Кахаля

Хотя не полностью выяснена, роль телец Кахаля связана с регуляцией snRNPs и малых ядрышковых рибонуклеопротеиновых частиц (snoRNPs) [4]. Промежуточные эксперименты по мониторингу флуоресцентно меченых коилинов и выживания белков мотонейронов (SMN), двух хорошо описанных маркеров тельцов Кахаля, показали, что они являются динамическими структурами внутри ядра, которые подвергаются событиям слияния и деления [23]. Подобно другим ядерным органеллам без мембран, тельца Кахаля чувствительны к стрессовым условиям.Супрессор опухолей p53 ассоциируется с тельцами Кахаля в условиях УФ-облучения и хемотоксического стресса [24], в то время как коилин повторно локализуется в ядрышковых крышках вместе с фибрилларином и компонентами аппарата РНК Pol I [25]. Более того, подобно ядрышку, структурная целостность тельцов Кахаля зависит от клеточного цикла; они интактны во время интерфазы и растворяются во время митоза [26].

Тельца PML

Локализованные в основном в ядре тельца PML характеризуются наличием белка промиелоцитарного лейкоза (PML).Член семейства белков TRIM, PML содержит домен RING, два B-боксовых домена и предсказанный домен coiled-coil, все из которых, как было показано, необходимы для правильной сборки тел PML. Точная роль этих органелл еще предстоит полностью выяснить. Доказательства того, что регуляторы транскрипции, такие как p53, CBP и Daxx, временно нацелены и удерживаются в тельцах PML, предполагают, что они функционируют как хранилище и, таким образом, регулируют пути, участвующие в подавлении опухоли, вирусной защите и апоптозе [12].Как и в случае с другими безмембранными органеллами, на количество и структурную целостность телец PML влияют фазы клеточного цикла и стрессовые стимулы [27]. В стареющих клетках тела ПМЛ увеличиваются и ассоциируются с крышечками ядрышек [28]. Недавно синтезированная РНК накапливается на периферии тел PML, поддерживая роль в метаболизме РНК. Однако, в отличие от других безмембранных органелл, описанных здесь, РНК не обязательна в отношении образования телец PML [29].

Цитозольные безмембранные тельца

В цитоплазме также описаны динамические безмембранные органеллы.Их обычно называют гранулами мРНП, они участвуют в метаболизме и гомеостазе мРНК и включают такие структуры, как Р-тельца, стрессовые гранулы и зародышевые гранулы (см. Обзор [13, 30]). Несколько разных типов гранул мРНП имеют общие белковые и мРНК компоненты, и было продемонстрировано, что они обладают способностью физически взаимодействовать друг с другом in vivo , претерпевая события стыковки и слияния [13]. Эти наблюдения предполагают, что эти безмембранные органеллы не только функционально связаны, но при определенных условиях они проявляют сходные физико-химические свойства, которые позволяют их структурную смешиваемость.Основные типы гранул мРНП обсуждаются ниже.

P-тельца

Процессинг или P-тельца распространены повсеместно для всех типов клеток и содержат белки, участвующие в транспорте, модификации и трансляции мРНК (обзор в [31]). Исследования на дрожжах продемонстрировали, что делеции любого отдельного белкового компонента недостаточно для полного прекращения сборки Р-телец [32], но подчеркнули важность партнерских взаимодействий для накопления ряда белков в органелле [33, 34].Напр., Рекрутирование Dcp1-декапирующего фермента в органеллу опосредуется взаимодействиями с его кофактором, Dcp2 [34], тогда как Dcp2 напрямую взаимодействует с каркасным белком Edc3 [33, 34]. Как и в случае с другими безмембранными органеллами, РНК играет центральную роль в сборке Р-телец. Повышенные уровни нетранслирующей мРНК, достигаемые за счет ингибирования инициации трансляции или стресса, коррелируют с увеличением размера и количества Р-телец [35]. Напротив, захват мРНК в полисомы путем ингибирования стадии элонгации или ферментативной деградации мРНК коррелирует с растворением Р-телец [31, 35].

Стрессовые гранулы

Стрессовые гранулы, как следует из названия, собираются в ответ на стрессовые сигналы, секвестируя транскрипционно молчащие молекулы мРНК и факторы транскрипции (обзор в [30]). Факторы инициации трансляции и компоненты малой рибосомной субъединицы входят в число белков, обогащенных стрессовыми гранулами [13]. Удаление стрессовых сигналов и повторная инициация трансляции мРНК вызывали разрушение стрессовых гранул [36]. Подобно Р-тельцам, секвестрация нетранслирующих молекул мРНК в полисомах ингибирует образование стрессовых гранул [36], таким образом предполагая, что мРНК необходима для их сборки.Р-тельца и стресс-гранулы у дрожжей демонстрируют обширное перекрытие по составу, но различные физические свойства [37]. Кроме того, штаммы дрожжей, дефицитные по образованию Р-телец, также не могли эффективно образовывать стрессовые гранулы. На образование Р-телец у дрожжей не влияли мутантные штаммы, у которых отсутствовала сборка стрессовых гранул. Вместе эти наблюдения подтвердили, что предварительная сборка комплексов мРНК / белок в Р-тельцах является предпосылкой для образования стрессовых гранул [32], подчеркивая функциональную связь между двумя типами безмембранных органелл.

Зародышевые гранулы

Термин «зародышевые гранулы» охватывает класс немембранно-связанных органелл, обнаруженных в специализированных половых клетках, которые генерируют половые клетки при мейозе в развивающемся эмбрионе, и называются Р-гранулами, зародышевыми тельцами или Nuage. органов в зависимости от организма-происхождения (см. обзор [38]). Значительные успехи были достигнуты в понимании как биологии, так и биофизики Р-гранул нематоды C. elegans. P-гранулы обогащены мРНК, РНК-геликазами и ферментами, модифицирующими РНК, и участвуют в посттранскрипционной регуляции мРНК в первичных половых клетках [38].Напр., Nos-2 РНК асимметрично сегрегирована во время личиночного развития C. elegans [39]. P-тельца физически состыковываются, но не сливаются с зародышевыми гранулами C. elegans эмбрионов. Эта физическая ассоциация между двумя типами органелл позволяет Р-тельцам сегрегировать внутри бластомера зародышевой линии — свойство, заимствованное у зародышевых гранул. Более того, эти Р-тела, которые связаны с зародышевыми гранулами, неспособны подвергнуться созреванию в органеллы, которые разрушают мРНК [40].В совокупности эти наблюдения иллюстрируют, как различные физико-химические свойства сохраняют целостность органелл и подтверждают межорганические взаимодействия как новый механизм регуляции функции.

гранулы мРНП при нейродегенеративном заболевании

Ослабляющие нейродегенеративные заболевания, такие как боковой амиотрофический склероз (БАС), мультисистемная протеинопатия (MSP) и лобно-височная долевая дегенерация (FTLD), характеризуются образованием патологических мРНП (включений мРНК в нормальном состоянии и нарушение метаболизма) [41]).Эти патологические включения образуются в результате агрегации белков, обнаруженных в гранулах эндогенных мРНП. Интересно, что многие белки, связанные с патологическими включениями, содержат прионоподобный домен в своей аминокислотной последовательности, который способствует их сборке в амилоидоподобные фибриллы. Некоторые белки, о которых известно, что они локализуются в стрессовых гранулах, включая FUS [42], hnRNPA1 [43–45] и hnRNPA2 [43], были обнаружены в патологических включениях, связанных с БАС. Интересно, что образование фибрилл этими белками стимулируется в микроокружении стрессовых гранул, где достигаются высокие локальные концентрации белка [37, 42, 44, 45].Более того, генетические мутации в прионоподобных доменах этих белков, которые, как известно, связаны с БАС, ускоряют образование амилоидоподобных фибрилл и ингибируют клиренс стрессовых гранул in vivo , тем самым нарушая гомеостаз мРНК [41–44]. Эти данные свидетельствуют о том, что высокоплотное окружение гранул мРНП способствует образованию фибрилл белками, указанными выше, особенно когда их склонность к агрегации усиливается мутацией. Кроме того, эти исследования устанавливают корреляцию между связанными с БАС мутациями в белках гранул мРНП и повышенным образованием фибрилл и измененным метаболизмом мРНК.Однако необходимы дополнительные исследования, чтобы понять, как эти изменения в структуре и функции гранул мРНП связаны с нейропатогенезом.

В следующем разделе мы обсудим общие физико-химические особенности безмембранных органелл и объединим механистические идеи, которые описывают их сборку в многокомпонентные плотные фазы.

Общие черты безмембранных органелл

Отличительной чертой описанных выше безмембранных органелл является то, что их состав и физические свойства меняются в зависимости от клеточных факторов, таких как стадия клеточного цикла, стимулы роста и стрессовые условия.Кроме того, они обладают динамическими структурными особенностями. Brangwynne и его коллеги продемонстрировали, что ядрышко [5] и Р-гранулы [6] демонстрируют жидкоподобное поведение in vivo и что эта жидкостная организация возникает в результате фазового разделения их молекулярных компонентов. Эта концепция подтверждается растущим объемом данных, идентифицирующих белки, иногда смешанные с нуклеиновыми кислотами, которые разделяют in vitro на на плотные жидкости, подобные [46–49] или гидрогелевые [50, 51] (см. Обзор [ 52]).Белки и нуклеиновые кислоты сконцентрированы в ~ 10-100 раз в плотной фазе [46, 48], где они могут достигать концентраций в миллимолярном диапазоне [53]; разбавленная фаза поддерживается на уровне критической концентрации разделения фаз. Экспериментально два физических состояния, жидкость и гидрогель, отличаются своей способностью течь, когда их поверхности подвергаются напряжению сдвига. Жидкоподобные свойства безмембранных органелл и in vitro с фазовым разделением и капель белка и белка / РНК были продемонстрированы на основе измерений их вязкоупругих свойств [5, 6, 44, 47, 54, 55].Например, жидкообразные Р-тела [37] и Р-гранулы [6] приняли сферическую форму в цитоплазме, которая определялась поверхностным натяжением, и слились и слились в более крупные капли, которые вернулись к сферической форме. Кроме того, P-гранулы обратимо деформировались, когда сталкивались с физическим барьером (, т.е. «капали» на поверхность ядра) [6]. Напротив, гидрогели не проявляют текучести в стационарных условиях [50, 51, 56]. Микрореологический анализ показал, что жидкие безмембранные органеллы [5, 6] и капли белка и белка / РНК, приготовленные in vitro , характеризуются высокой вязкостью.Поразительно, что измеренные значения вязкости широко варьируются в диапазоне трех порядков: от ~ 1 Па · с для P-гранул до ~ 10 ³ Па · с для ядрышек [5, 6, 47, 54, 55 ]. Хотя это не обязательно является прямым индикатором жидкоподобного поведения, макромолекулы в безмембранных органеллах ([7, 37, 44, 46]) и жидкоподобные капли [42, 44, 46, 53, 55] восстанавливаются после фотообесцвечивания на шкала времени от секунд до десятков секунд. Это указывает на быстрый обмен молекулами внутри жидкообразной фазы или с окружающей средой, когда объект подвергается фотообесцвечиванию частично или полностью, соответственно.

Безмембранные органеллы имеют разный сложный состав. Например, P-гранулы состоят примерно из 40 белков [57], в то время как масс-спектрометрия показала, что ядрышки человека содержат ошеломляющие ~ 4500 белков [58]. Кроме того, белковый состав безмембранных органелл может варьироваться в зависимости от клеточных условий. Примечательно, что протеом ядрышка значительно изменяется в стрессовых условиях, и эти изменения специфичны для определенных форм стресса [59, 60].Эти наблюдения поднимают два важных вопроса: (1) как достигается специфический молекулярный состав безмембранных органелл и (2) как регулируется их состав в ответ на сигналы стресса ? В следующем разделе мы обращаемся к молекулярным принципам, лежащим в основе фазового разделения и структурной организации безмембранных органелл. Мы также обсуждаем текущие данные, свидетельствующие о том, как регулируются их динамическая структура и состав.

Структурные и композиционные особенности белков, находящихся в безмембранных органеллах

Результаты исследований методом нокдауна и нокаута [32, 39, 61–63] показали, что структурная целостность некоторых безмембранных органелл зависит от гетерогенных взаимодействий. среди множества компонентов.Нокдаун или генетическая делеция отдельных белков, таких как NPM1 [61] или нуклеолин [62] в ядрышке или PGL-1 и PGL-3 [63] в зародышевых гранулах, изменяет морфологию органелл, но не предотвращает другие, неизмененные органеллы. компоненты от сборки в точечные структуры. Эти наблюдения согласуются с избыточностью характеристик последовательности белков, обнаруженных в различных безмембранных органеллах (Table 1).

Основные принципы фазового разделения полимерами; от химических полимеров к белкам

Фазовое разделение органических полимеров в растворах широко изучено и может быть описано с помощью упрощенных математических термодинамических моделей.Теория Флори-Хаггинса описывает свободную энергию смешения полимера с растворителем, при этом полимеры рассматриваются как упрощенные массивы модулей, которые представляют их повторяющиеся сегменты. Разделение жидко-жидкой фазы на фазу с высоким содержанием полимера и фазу с низким содержанием полимера происходит, когда критическая концентрация или температурный порог пересекаются, после чего полимер становится лучшим растворителем для себя, чем буфер, в котором он растворен (см. [64 ]; Рисунок 1).

Макромолекулярная конденсация опосредует образование безмембранных органелл.Безмембранные органеллы представляют собой динамические структуры, образованные с помощью механизма разделения фаз, подобного конденсации полимера и зависящему от концентрации. Порог критической концентрации (серая линия , ) для разделения фаз может быть настроен в пределах диапазона концентраций ( заштрихованный зеленый прямоугольник ) посредством физико-химических изменений в системе ( т. Е. посттрансляционных модификаций доменов и / или мотивов, которые изменяют сродство их взаимодействий, изменения температуры, измененную ионную силу и т. д.). Эти изменения могут управлять фазовым разделением и сборкой безмембранных органелл или их разборкой

Розен и его коллеги сообщили, что поливалентные повторяющиеся домены двух сигнальных белков, которые регулируют полимеризацию актина, NCK и N-WASP, разделяют фазы in vitro и что порог разделения фаз зависит от концентрации белка и валентности каждого отдельного партнера по взаимодействию [ 46]. Используя упрощенное представление белка, подобное тому, которое используется для органических полимеров, авторы использовали адаптацию формализма Флори-Хаггинса для описания поведения фазового перехода бинарной системы NCK / N-WASP.Модель включала четыре параметра: параметры ассоциации / диссоциации, а также коэффициенты диффузии и краудинга. Качественно этот формализм, который предполагал структурное разобщение между отдельными связывающими доменами, предсказал влияние различной валентности на порог концентрации для разделения фаз [46]. Подобная адаптация этой модели была использована для описания поведения фазового разделения мономолекулярной РНК-геликазы, Ddx4 [48]. Хотя общую феноменологию можно описать с помощью этой упрощенной модели, недавний отчет с участием бинарной системы NCK / N-WASP продемонстрировал, что заряженные остатки в неупорядоченном линкере, соединяющем модули связывания домена Sh4, вызывают слабую самоассоциацию NCK и снижение критической концентрации. для разделения фаз [65] (рис.1). Таким образом, теория Флори-Хаггинса описывает основное поведение фазового разделения бимолекулярных и мономолекулярных белковых систем. Однако сложность последовательности белковых полимеров, в отличие от более простых по составу химических полимеров, обеспечивает возможность дополнительных межмолекулярных взаимодействий, которые могут «настроить» явление разделения фаз. Эти результаты обеспечивают основу для понимания поведения фазового разделения более сложных систем in vitro в будущем.Более того, они обеспечивают основу для глубокого изучения поведения безмембранных органелл в клетках.

Белковые элементы, связанные с разделением фаз; Последовательности низкой сложности и свернутые домены

Белки, ассоциированные с безмембранными органеллами, часто обладают многовалентными свойствами, которые структурно проявляются по-разному. Складчатые домены представляют собой белковые сегменты, которые принимают дискретные и стабильные вторичные и третичные структуры. Неупорядоченные области, также называемые внутренне неупорядоченными областями белка (IDR), представляют собой сегменты белка, которые не принимают стабильную вторичную и третичную структуру и являются конформационно гетерогенными и динамичными.Некоторые белки в безмембранных органеллах содержат свернутые домены, но могут также содержать IDR, тогда как другие полностью неупорядочены (называемые внутренне неупорядоченными белками или IDP). Подмножество неупорядоченных областей белка, называемых областями низкой сложности, демонстрируют смещение состава в сторону небольшого набора аминокислот. Интересно, что последовательности и нарушения низкой сложности [47, 48, 50, 56] чрезмерно представлены в белках, которые, как показано, разделяют in vitro на по фазе. Эти особенности обеспечивают высокую степень конформационной гибкости, которая требуется для событий связывания, чтобы оставаться несвязанными [46].ЯМР-анализ белков в жидкообразной фазе после разделения фаз не предоставил доказательств сворачивания при связывании, тем самым предполагая, что неупорядоченные области низкой сложности сохраняют свою конформационную гибкость в жидкообразной фазе [48, 53]. Однако детальная интерпретация этих данных осложняется возможностью организационной гетерогенности белковых молекул снаружи и, возможно, внутри жидко-подобных капель, а также влиянием межмолекулярных взаимодействий и видимого размера молекул на ширину и интенсивность резонансных линий.

Многовалентные взаимодействия, вероятно, вносят вклад в динамические, похожие на жидкость свойства мономолекулярных сборок с разделением фаз [47, 48], а также более сложных сборок [46, 49]. Среди белков, связанных с разделением фаз в безмембранных органеллах, поливалентность достигается за счет повторяющегося отображения двух типов белковых модулей: i) свернутых доменов и ii) неупорядоченных сегментов низкой сложности (суммированных в таблицах 1 и 2; рис. 2). Исследования in vitro показали, что один из двух типов поливалентности необходим и достаточен для разделения фаз белка.Концентрации белка, связанные с разделением фаз, для разных систем варьировались на несколько порядков, от субмикромолярных [44, 47] до сотен микромолярных [44, 46, 48, 53]. Безмембранные органеллы представляют собой многокомпонентные системы, и их сборка, как показано для ядрышка, зависит от общей концентрации их составляющих [66]. Принимая во внимание отмеченные выше наблюдения, что накопление компонентов с ядрышками определяется во времени (рассмотрено в [8]) и происходит в предварительно сформированных ядрышковых организующих областях (NORs), возникает важный вопрос.Являются ли одни компоненты более важными, чем другие, для инициации процесса разделения фаз с образованием безмембранных органелл? Учитывая большие различия в критических концентрациях, измеренных для различных систем, один из возможных ответов состоит в том, что компоненты с самой низкой критической концентрацией фазы разделяются первыми, таким образом увеличивая локальную концентрацию выше критической концентрации для разделения фаз других компонентов, которые впоследствии включаются в плотную фазу. фаза. Сообщалось, что как складчатые домены, так и неупорядоченные / неупорядоченные области инициируют разделение фаз in vitro, и в целлюлозе. Складчатые домены часто участвуют в специфических взаимодействиях белок-нуклеиновая кислота [67–69] и белок-белок [19, 70] и могут обеспечивать организационную основу для сборки безмембранных органелл. Домены низкой сложности, с другой стороны, предоставляют средства для более динамических взаимодействий с потенциально более широким диапазоном партнеров по связыванию (Fig. 2). Убедительный пример такого синергетического сотрудничества между поливалентными свернутыми доменами и их соответствующими соединяющими гибкими линкерами был описан Bajade et al.на систему Nck / N-WASP / нефрин [65]. Конструкции Nck, которые являются двухвалентными в мотивах Sh4, связываются с мотивами PRM в N-WASP с микромолярным или миллимолярным сродством и подвергаются фазовому разделению. Посредством слабых, в основном электростатических взаимодействий неупорядоченный линкер, соединяющий домены Sh4 в Nck, способствует самосборке, эффективно снижая критическую концентрацию для разделения фаз. Кроме того, добавление неупорядоченной области нефрина, содержащей несколько остатков фосфотирозина, которые связываются со свернутым доменом Sh3 внутри Nck, усиливает поливалентные взаимодействия и дополнительно снижает критическую концентрацию для разделения фаз.Таким образом, мультивалентное отображение свернутых доменов и последовательностей низкой сложности с неупорядоченными областями внутри белков обеспечивает синергию между различными компонентами сложных жидкоподобных капель. Подобный синергизм между поливалентными компонентами, вероятно, будет способствовать образованию безмембранных органелл в клетках.

Молекулярная основа сборки безмембранных органелл.Белки, обогащенные матриксом безмембранных органелл, обычно имеют несколько модулей, которые создают поливалентность, включая свернутые связывающие домены ( красный, ) и области низкой сложности (, фиолетовый, ). Валентность часто усиливается доменами, которые делают возможной гомо- или гетероолигомеризацию ( оранжевый ). Взаимодействия между белками, содержащими различные комбинации этих модулей взаимодействия, обеспечивают основу для построения гетерогенной, бесконечно расширяемой сети внутри безмембранных органелл.Формирование такого типа сети приводит к разделению фаз при достижении критического порога концентрации. Для многих обсуждаемых здесь примеров активная транскрипция РНК необходима для безмембранной сборки органелл. Мы предполагаем, что экспрессия РНК, превышающая порог критической концентрации, необходима для зарождения взаимодействий со специфическими, многомодульными белками и для зарождения образования безмембранных органелл. Сигналы стресса могут изменить многовалентные взаимодействия, которые приводят к разделению фаз и привести к частичной или полной разборке органеллы

Инициирующие события в сборке безмембранных органелл

Многие белки, которые участвуют в образовании безмембранных органелл, имеют сегменты с низкой сложностью последовательностей, часто содержащие множественные мотивы, обогащенные аминокислотами аргинин, серин, глицин, глутамин, аспарагин и / или ароматические остатки (таблицы 1 и 2).Однако, несмотря на низкую сложность их последовательностей, эти белки часто связаны со специфическими безмембранными органеллами. Что лежит в основе включения определенных белков и молекул нуклеиновых кислот в определенные безмембранные органеллы? Возникающее решение этой загадки, по крайней мере в некоторых случаях, заключается в том, что специфические взаимодействия белок-нуклеиновая кислота или белок-белок инициируют сборку безмембранных органелл, которые затем создают микросреду, которая способствует фазовому разделению дополнительных компонентов (рис. .2). Эта концепция была описана для ядрышка, которое собирается вокруг ЯОР, стабильных ядрышковых предшественников, состоящих из кластерных массивов ( т. Е. Мультивалентность ) генов рРНК, связанных с фактором транскрипции UBF [71]. Примечательно, что UBF содержит массив из шести боксов HMG-доменов, которые проявляют широкий диапазон аффинности связывания с ДНК [69]. РНК Pol I рекрутируется в ЯОР для транскрипции пре-рРНК, которая инициирует сборку ядрышка. В случае зародышевых гранул [63] и телец PML [12] их образование инициируется самоассоциацией доменов coiled-coil белков PGL-1/3 и PML, соответственно.В этих примерах структурированные домены обеспечивают специфические взаимодействия с образованием сборок, которые служат каркасом для дальнейшей сборки компонентов безмембранных органелл. Некоторые из белков, которые способствуют сборке, содержат как структурированные домены, так и сегменты низкой сложности, которые обеспечивают поливалентные взаимодействия. Таким образом, образование безмембранных органелл может включать иерархическую сборку специфических комплексов белок-нуклеиновая кислота с более высоким сродством с последующим привлечением дополнительных компонентов посредством более слабых, поливалентных взаимодействий.

Сборка белков, ассоциированных с параспеклами, представляет собой другой пример того, как события инициации могут опосредовать рекрутирование компонентов внутри безмембранной органеллы. Бонд и его сотрудники использовали рентгеновскую кристаллографию и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) для изучения полимеризации факторов сплайсинга DBHS, локализованных в параспеклах и обогащенных ими [19, 70]. Расширенные мотивы взаимодействия спиральной спирали в пределах домена полимеризации этих белков обеспечивают структурный каркас для образования протяженных полимеров неопределенной длины.Слабые полярные контакты стабилизируют взаимодействия спиральных катушек и считаются полезными для поддержания растворимости неспаренных протяженных спиральных структур [70]. Валентность молекулярной сборки усиливается дополнительным доменом димеризации, который опосредует гомо- и гетеродимеризацию между белками семейства DBHS, такими как PSPC1 и NONO [19] или SFPQ и NONO [70]. Более того, поливалентные взаимодействия с РНК опосредуются тандемными доменами RRM, присутствующими в NONO, PSPC1 и SFPQ [19, 70].Эти исследования демонстрируют, как модульные, поливалентные белки могут опосредовать образование гетерогенных, динамических молекулярных ансамблей, тем самым обеспечивая структурную основу для образования безмембранных органелл (Fig. 2).

Силы, которые опосредуют взаимодействия, связанные с разделением фаз белка

Как обсуждалось выше, белки, которые претерпевают фазовое разделение, обычно содержат сегменты с низкой сложностью последовательности. Кроме того, эти области часто обогащены заряженными и ароматическими аминокислотами, что подчеркивает важность электростатических и гидрофобных взаимодействий в процессе разделения фаз.Напр., Неупорядоченные сегменты DEAD-box геликаз Ddx4 [48] и LAF-1 [47], а также hnRNPA1 [44], которые обеспечивают разделение фаз, обогащены остатками аргинина в пределах их RGG-бокса и RRM-доменов низкой сложности. Из-за их общего положительного заряда образование жидких капель этими белками очень чувствительно к ионной силе окружающего раствора. Многие другие белки, связанные с ядерными тельцами и гранулами мРНП, обогащены остатками аргинина ( e.грамм. доменов RGG и SR; см. Таблицу 1). Напр., SR повторы низкой сложности, общие для семейства SR факторов сплайсинга, были идентифицированы как сигналы нацеливания для локализации ядерных спеклов [72, 73]. Эти наблюдения убедительно подтверждают, что электростатические взаимодействия играют ключевую роль в фазовом разделении субнабора белков (Рис. 1).

Электростатика, однако, не единственные взаимодействия, которые способствуют формированию богатого белком состояния с разделением фаз. Области низкой сложности, богатые ароматическими остатками ( i.е. фенилаланин, тирозин) чрезмерно представлены в белках, которые находятся в безмембранных органеллах [48, 74] и других разделенных фазами матрицах, как в случае белка FUS в гранулах мРНП [50, 53] и FG-Nups в ядерно-поровый комплекс [51]. Интересно, что мутации F в Y, но не F в S, в домене повтора FG сохранили образование in vitro гидрогеля дрожжевым нуклеопорином Nsp1p [51], демонстрируя важность ароматических остатков в явлениях сборки, связанных с комплексом ядерных пор. .Кроме того, критическая концентрация для образования in vitro жидких капель FUS была снижена за счет увеличения ионной силы раствора, что согласуется с интерпретацией, согласно которой высаливание гидрофобных взаимодействий снижает порог растворимости белка в буфере [53]. Nott et al. Отметили, что эволюционно консервативная кластеризация одинаково заряженных аминокислотных остатков и регулярное расстояние между мотивами RG и FG необходимы для фазового разделения конструкции Ddx4 [48].Эти исследования подчеркивают роль взаимодействий катион-π [48] и π-π [50, 51] в явлениях разделения фаз.

В отсутствие липидного мембранного барьера движение молекул внутрь и из безмембранных органелл ограничено диффузией [1], и их накопление в основном зависит от удерживания, основанного на взаимодействиях с матрицей органелл. Интересно, что диффузионный барьер для экзогенных макромолекул, таких как декстраны, продиктован физическими свойствами безмембранного матрикса органелл [1].DFC ядрышка менее благоприятен для накопления декстранов по сравнению с окружающими GC, что согласуется с наблюдениями, что DFC более плотный, чем GC [1]. Более того, динамические характеристики компонентов, специфически удерживаемых внутри безмембранных органелл, варьируются в зависимости от природы их взаимодействий с другими составляющими матрикса [7, 23]. Вместе эти результаты предполагают, что переменные вклады различных типов межмолекулярных взаимодействий, которые способствуют разделению фаз, определяют избирательное накопление определенных белков в определенных типах безмембранных органелл.

Механизмы, участвующие в достижении локальной организации и композиционной сложности в безмембранных органеллах

Локализация определенных макромолекул в определенных безмембранных органеллах достигается за счет специфических взаимодействий с молекулярной сетью, которая простирается от области зародышеобразования. Как обсуждалось выше, большая часть белков, о которых известно, что они ассоциируются с безмембранными органеллами, проявляют поливалентность за счет отображения повторяющихся мотивов низкой сложности (например,g., SR, RGG или мотивы FG) и / или множества копий свернутых доменов, таких как домены RRM. Таким образом, за счет комбинаторного использования конечного числа модулей межмолекулярного взаимодействия сложные смеси белков и нуклеиновых кислот могут быть задействованы в конденсированной фазе. Например, образование Р-гранул инициируется самоассоциацией спиральных доменов белков PGL-1 и PGL-3, которые в дальнейшем связывают мРНК через свои RGG-домены низкой сложности. Связанные с Vasa геликазы GLH-1, 2, 3 и 4, которые содержат повторы FG, затем включаются для облегчения ассоциации P-гранул с ядрами посредством взаимодействий с матриксом гидрогеля комплекса ядерных пор и его расширения [74].Присутствие доменов гомо- и гетеро-олигомеризации дополнительно увеличивает степень поливалентности и способствует интеграции в безмембранные органеллы (Рис. 2). Белок PML образует гомо- и гетеро-олигомеры через свой домен спиральной спирали, но валентность может быть увеличена путем гомодимеризации через домен RING. Мутации либо в coiled-coil, либо в RING доменах приводят к разрушению тел PML [12]. Компоненты аппарата обезглавливания мРНК, обнаруженные в P-тельцах, включая Pdc1, Dcp2 и Edc3, собираются в жидко-подобные капли in vitro. Два домена LSm в димерном Edc3 взаимодействуют с Dcp2 и Pdc1, которые оба содержат поливалентные мотивы HLM. Edc3 связывается с различными мотивами HLM с аффинностью от низкого микромолярного до миллимолярного диапазона [49]. Валентность мотивов HLM в Pdc1 увеличивается за счет олигомеризации через центральный домен coiled-coil [49, 75]. Эти примеры иллюстрируют, как модули многовалентного взаимодействия и домены олигомеризации могут взаимодействовать, чтобы инициировать разделение фаз в контексте различных типов безмембранных органелл.Дополнительные домены в этих белках, которые не участвуют напрямую в механизме разделения фаз, могут опосредовать привлечение дополнительных компонентов в жидкую фазу. Напр., Геликаза Ddx6 / Dhh2 и мРНК могут рекрутироваться в Р-тельца через домен FDF Edc3 и домен связывания РНК геликазы, соответственно [49]. Таким образом, мы различаем два основных типа компонентов безмембранных органелл: (i) многовалентные макромолекулы, которые непосредственно участвуют во взаимодействиях, участвующих в процессе разделения фаз и лежащие в основе структурных особенностей жидкой фазы, и (ii) другие макромолекулы, которые рекрутируются. через специфические взаимодействия со сборкой, разделенной на фазы, в которой отсутствуют элементы многовалентного взаимодействия, но которые выполняют специализированные функции в жидкой фазе ( i.е., ферментов, катализирующих определенные биохимические реакции). Однако способность к сборке / разделению фаз и биохимическая функциональность могут быть воплощены в одном белке, как видно с Ddx4, который несет в себе домен геликазы и поливалентный домен RGG низкой сложности, который обеспечивает разделение фаз [48].

РНК в безмембранных органеллах

Хотя много внимания было уделено пониманию роли поливалентных белков в формировании безмембранных органелл, основные функции многих из этих органелл — это разные аспекты метаболизма РНК и, следовательно, РНК также участвует в их сборке и структурной целостности.Сборка ядрышка на выходе из митоза инициируется транскрипционной активацией РНК Pol I [8, 76], а структурная целостность парашютов зависит от транскрипционной активности РНК Pol II [2]. Белки, способные к фазовому разделению, часто содержат аналогичные наборы свернутых и мультивалентных доменов с низкой сложностью, что приводит к структурной избыточности и возможности при определенных условиях беспорядочно локализоваться в более чем одном типе безмембранных органелл.Напротив, разные типы органелл обычно содержат специфические типы РНК (суммированные в Таблице 1), предполагая, что компоненты РНК являются основными детерминантами идентичности органелл. В подтверждение этой гипотезы нарушение транскрипции РНК вызывает повторную локализацию белковых компонентов различных ядерных и цитоплазматических тел [25, 59]. Напр., Mao et al. Продемонстрировали, что lncRNA Mem ε / β необходима для рекрутирования специфических молекул белка и РНК в параспеклы [77].Кроме того, иммобилизация PSP1, модульного белка парапекл, который, как было показано, гомо- и гетеро-олигомеризоваться [18], была способна рекрутировать некоторые компоненты белка парапекл, но была неспособна воспроизвести полную сборку органеллы [77]. Рекрутирование полного набора белков и компонентов РНК параспеклов в сочетании с исключением макромолекул, связанных с ядерными спеклами, достигалось только в условиях активной транскрипции днРНК Mem ε / β. Хотя обобщенные выше наблюдения ясно указывают на доминирующую роль РНК в молекулярном составе определенных безмембранных органелл, другие факторы также могут влиять на их структурную целостность.Например, стрессовые сигналы, индуцированные DRB, небольшой молекулой, которая избирательно ингибирует Pol II РНК, вызвали растворение параспеков до того, как можно было измерить значительное снижение общих уровней Mem ε / β днРНК [77]. Это открытие предполагает, что неизвестный в настоящее время регуляторный механизм контролирует структурную целостность парапекл и что существует острый и чувствительный порог для восприятия клеточного стресса и реакции на него. Это поднимает важный общий вопрос: как изменения в условиях окружающей среды, например, в ответ на различные типы стресса, передаются на безмембранный матрикс органелл и проявляются как изменения в структуре и функции ? Эта тема обсуждается в следующем разделе.

Структурная и динамическая регуляция структур с разделенными фазами

Отсутствие липидного двухслойного барьера между безмембранными органеллами и их окружением устраняет необходимость активного транспорта макромолекул через мембраны и обеспечивает быструю передачу сигнала. Стрессовые сигналы влияют на структурную целостность безмембранных органелл, обеспечивая механизм стрессовых реакций, опосредованных органеллами. Далее мы обсудим различные факторы, которые влияют на структуру и функцию безмембранных органелл.

Химические и другие факторы окружающей среды

Изменения температуры [27, 48], ионной силы [47, 48], хемотоксические повреждения и повреждения ДНК [27, 59, 60, 78, 79] — это изменения окружающей среды, которые, как известно, нарушают разделение фаз клеточные тела и in vitro жидких капель. Жесткость ядрышек, выделенных из клеток HeLa, снижалась или увеличивалась при ингибировании РНК-полимеразы или протеасомы, соответственно, на основании измерений атомно-силовой микроскопии [79]. Таким образом, сигналы напряжения влияют на вязкоупругие свойства ядрышек и, следовательно, модулируют их функции.

Безмембранные органеллы образуются, разбираются и функционируют во внутриклеточной среде, заполненной макромолекулами. Высокая кумулятивная концентрация макромолекул в клетке, которая коррелирует с высоким процентом исключенного объема (~ 20–30% от общего объема клетки), влияет на кинетику и термодинамику большинства биохимических процессов [80]. In vitro, агенты молекулярного краудинга способствуют сборке рекомбинантной hnRNPA1 в плотные жидкие капельки белка при более низких критических концентрациях, чем наблюдаемые в одном только буфере [44, 45].Таким образом, увеличение исключенного объема, вызванное макромолекулярным краудингом, увеличивает локальную концентрацию отдельных видов белка, тем самым снижая порог эффективной концентрации для разделения фаз (рис. 1).

Изменения морфологии и вязкоупругих свойств гранул мРНП из-за мутаций в резидентных белках ( например, hnRNPA1, FUS) связаны с изнурительными нейродегенеративными заболеваниями [13, 42, 44, 45]. In vitro , фазы FUS и hnRNPA1 разделяются на жидкие капельки [42, 44, 45, 53] или гидрогели [42, 44, 50], в зависимости от концентрации белка и условий эксперимента.Области низкой сложности в двух белках, наряду с доменами RRM [44, 45, 53], вносят вклад в разделение фаз. Мутации внутри Q / N-богатых областей низкой сложности, называемых прионоподобными доменами, связаны с дефектами гранул мРНП и нейропатогенезом [42, 44]. Эти дефекты объясняются кинетически медленным шагом (от десятков минут до часов в масштабе времени), который происходит в плотной жидкообразной фазе, называемом «капельным старением» [42], когда жидкообразная фаза превращается в твердую фазу. нравится состояние.Феноменологические наблюдения предполагают, что это физическое преобразование является результатом медленной структурной реорганизации плотной жидкообразной фазы. Реорганизация приводит к снижению динамики внутри состояния с разделенными фазами и достигает кульминации в переходе от жидкого состояния к гидрогелевому или твердому состоянию. Переход между двумя физическими состояниями сопровождается морфологическими изменениями: от почти сферических капель, сформированных за счет поверхностного натяжения, до удлиненных фибриллообразных структур [42, 44, 45].Аналогичный переход наблюдали для in vitro, и in vivo, для капель, содержащих Whi3, белок, кодирующий тракт polyQ [55]. Потенциальный механизм, лежащий в основе, заключается в том, что в условиях высокой локальной концентрации белка в плотной жидко-подобной фазе возникают новые, менее динамичные взаимодействия, возможно, между прионоподобными доменами низкой сложности. Со временем эти взаимодействия могут стать преобладающими над более динамичными, многовалентными электростатическими взаимодействиями, которые приводят к жидкоподобному состоянию.Мы предполагаем, что баланс термодинамической благоприятности этих двух типов взаимодействий может влиять на физическую природу состояния с разделенными фазами (, т.е. жидкость, гидрогель / твердое тело) и определять различные склонности белков дикого типа и мутантных белков к переход от жидкого структурного состояния к твердому.

Энергозависимый контроль динамики безмембранных органелл

Мы подчеркнули, что физические свойства безмембранных органелл зависят от их белков и состава РНК.В дополнение, однако, ядрышку требуется АТФ, чтобы поддерживать свое жидкое поведение, физическое состояние, называемое «активной жидкостью» [5]. В настоящее время неясно, какие специфические АТФ-зависимые процессы участвуют в поддержании этого активного жидкого состояния. Более того, активность АТФ-зависимых шаперонов, таких как Hsp70 / Hsp40, которые накапливаются в стрессовых гранулах, необходима для их разборки после восстановления после стресса [81]. Эти наблюдения предполагают, что ферменты, гидролизующие АТФ, регулируют динамику макромолекул внутри безмембранных органелл.Сходным образом несколько других типов АТФ-зависимых ферментов, включая киназы и DEAD-box геликазы [47–49, 78], которые включены в эти органеллы, могут участвовать в поддержании их жидких физических свойств. Геликазы могут модулировать структуру РНК, а также взаимодействия белок-РНК и, таким образом, активно контролировать вязкоупругие свойства безмембранных органелл.

Роль посттрансляционных модификаций в регулировании структуры и динамики безмембранных органелл

Сборка компонентов во многих из рассмотренных нами систем с разделенными фазами управляется электростатически.Следовательно, посттрансляционные модификации, которые изменяют характеристики заряда аминокислот внутри доменов и сегментов низкой сложности белков, предоставляют средства для модуляции их поливалентных взаимодействий и поведения фазового разделения (Fig. 1).

Важность электростатических взаимодействий иллюстрируется поведением фазового разделения LAF-1 [47], hnRNPA1 [44, 45] и Ddx4 [48], на способность которых образовывать жидкие капли сильно влияет концентрация соли в окружающий буфер.Пороговое значение концентрации фазового разделения для обоих линейно масштабировалось с ионной силой по мере увеличения концентрации NaCl. Кроме того, метилирование остатков аргинина в RGG домене Ddx4 увеличивает порог разделения фаз in vitro [48].

Фосфорилирование играет решающую роль во многих путях передачи сигналов, а также модулирует структурную целостность и динамику безмембранных органелл. Например, фосфорилирование нефрина тирозином стимулирует фазовое разделение тройной системы нефрин / NCK / N-WASP [46].Интересно, что общей чертой некоторых хорошо охарактеризованных безмембранных органелл является то, что они включают киназы и фосфатазы в свой матрикс [39, 78, 82]. Циклы активного фосфорилирования / дефосфорилирования связаны с регуляцией структурной целостности органелл. Активность ядрышковой киназы CK2 контролирует структурную связь между GC и DFC областями внутри ядрышка [78] и увеличивает динамику обмена NPM1 между ядрышковым и нуклеоплазматическим компартментами [83].Кроме того, фосфорилирование белков MEG-3 и MEG-4 киназой MBK-2 / DYRK и дефосфорилирование фосфатазой PP2A ^{PPTR-1 / PPTR2} регулируют разборку и сборку P-гранул, соответственно, во время митоза у C. elegans в ассоциация с эмбриогенезом [39].

Сборка и разборка безмембранных органелл обеспечивает механизм для управления концентрацией и ассоциированным сигнальным поведением свободно диффундирующих молекул в ограниченных мембранами компартментах клетки.Напр., Динамические свойства стрессовых гранул связаны с передачей сигналов mTORC1 за счет иммобилизации mTORC1 внутри гранул, тогда как опосредованное фосфорилированием растворение этих органелл высвобождает mTORC1, активируя передачу сигналов ниже по течению [82]. В качестве другого примера Wippich et al. [82], продемонстрировали, что киназа DYRK3 конденсируется в цитоплазматических гранулах через свой N-концевой домен низкой сложности в зависимости от концентрации и локализуется в стрессовых гранулах при осмотическом и окислительном стрессе.Неактивный DYRK3 конденсируется в стрессовые гранулы вместе с компонентами пути mTORC1. Активация DYRK3 и последующее фосфорилирование PRAS40, ингибитора mTORC1, приводит к растворению стрессовых гранул и нарушению ингибирующего взаимодействия PRAS40 / mTORC1.

Дальнейшее доказательство роли посттрансляционных модификаций в регуляции свойств безмембранных органелл обеспечивается наблюдением, что аминокислоты аргинин, серин и тирозин чрезмерно представлены в последовательностях белков низкой сложности внутри них.Эти аминокислоты могут быть модифицированы посттрансляционно, аргинины — метилированием, а серины и тирозины — фосфорилированием, обеспечивая общие механизмы для модуляции пороговых значений конденсации белков и, следовательно, сигнальные пути ниже компонентов, секвестрированных в разделенной фазе фракции.

Концентрация компонентов как фактор сборки / разборки безмембранных органелл

Другим важным фактором в формировании безмембранных органелл в зависимости от фазового разделения является локальная концентрация компонентов (рис.1). Например, регуляция Р-гранул во время перехода от ооцита к эмбриону, когда они переходят из перинуклеарной области в цитоплазму, регулируется градиентом концентрации, который вызывает растворение перинуклеарных капель и повторную конденсацию в цитоплазме. Похожий механизм используется во время асимметричной сегрегации Р-гранул в основную клетку зародышевой линии [6]. Недавно Brangwynne и его коллеги продемонстрировали, что уровни РНК в каплях LAF-1, минималистичной модели P-гранул in vitro , регулируют вязкость и молекулярную динамику внутри жидкообразной фазы [47].Вязкоупругие свойства жидкоподобных капель, содержащих Whi3, также модулируются концентрацией РНК. В то время как Whi3 способен к фазовому разделению мономолекулярным образом при определенных условиях, присутствие РНК необходимо для того, чтобы процесс происходил при физиологических концентрациях соли. Более того, увеличение концентрации РНК коррелирует с увеличением вязкости капель и снижением динамики восстановления Whi3 после фотообесцвечивания [55]. Кроме того, сборка ядрышек и парашютов зависит от концентраций составляющих их РНК, которые контролируются транскрипционной активностью РНК-полимераз [2, 8], предполагая, что транскрипционный контроль концентрации РНК может быть общим механизмом для настройки физических свойств. безмембранных органелл (рис.1).

Многие безмембранные органеллы участвуют в клеточных ответах на различные типы стресса, и чувствительность их структурной целостности к концентрациям белка и РНК обеспечивает механизм быстрого реагирования на стрессовые сигналы, влияющие на эти уровни. Например, ингибирование Pol I-, II- и III-зависимой транскрипции РНК актиномицином D было связано с реорганизацией компонентов как ядерных, так и цитоплазматических безмембранных органелл [59]. После обработки актиномицином D, NPM1, основной компонент GC ядрышка, становится делокализованным в нуклеоплазму и цитоплазму из-за ингибирования РНК-Pol I-зависимой транскрипции рРНК.В этих условиях было обнаружено, что цитоплазматический NPM1 взаимодействует с компонентами стрессовых гранул, такими как мРНК, и белками hnRNPU и hnRNPA1 [84].

Также в условиях лечения актиномицином D компоненты белка и РНК, связанные с параспеклами, а также с тельцами PML и Кахаля, перемещаются в крышки ядрышек. Интересно, что в то время как белки из GC выбрасываются из ядрышка, белки из DFC, такие как фибрилларин, повторно локализуются в крышках ядрышка [25]. Эти наблюдения предполагают, что изменения окружающей среды могут изменять равновесие, которое поддерживает целостность безмембранных органелл, тем самым изменяя концентрации их компонентов в свободно диффундирующих пулах макромолекул внутри нуклеоплазмы и цитоплазмы и позволяя их перераспределение в различных других органеллах.

Новые методы исследования структур с разделенными фазами

Детальный анализ структурных особенностей безмембранных органелл и лежащих в их основе макромолекулярных ансамблей представляет проблемы, не встречающиеся в других областях структурной биологии. Взаимодействия, относящиеся к явлению разделения фаз, происходят в различных масштабах длины, от субнанометров до десятков микрометров, что делает какой-либо один аналитический метод недостаточным для исследования макромолекулярных сборок с разделением фаз.Например, хотя жидкообразные капли превышают ограничения по размеру, связанные с анализом с помощью ЯМР-спектроскопии, структурные и динамические характеристики гибких компонентов внутри них были охарактеризованы [53]. Однако динамические характеристики этих систем несовместимы с рентгеновской кристаллографией. Хотя сформированные макромолекулярные сборки легко наблюдаются с помощью обычных методов микроскопии, взаимодействия, ответственные за сборку, происходят на масштабах длины, которые ниже предела разрешения обнаружения.Кроме того, эти системы очень разнородны, и поэтому необходимы интеграционные решения, сочетающие в себе дополнительные методы, чтобы понять их структурные особенности.

Методы определения структуры с атомным разрешением

Несколько исследований с использованием классических структурных методов, включая ЯМР в растворе [46, 48, 49, 67–69] и рентгеновскую кристаллографию [19, 70], предоставили детальное понимание молекулярных взаимодействий. которые опосредуют сетевую структуру, которая управляет фазовым разделением модульных белков внутри безмембранных органелл.Однако из-за технологических ограничений эти исследования проводились с усеченными формами белков и нуклеиновых кислот, соответствующими индивидуальным модулям взаимодействия. Эти традиционные методы будут полезны в будущем для определения структурной основы взаимодействий между свернутыми доменами внутри многодоменных белков, склонных к фазовому разделению, и их партнеров по взаимодействию, включая пептиды, соответствующие коротким линейным мотивам и сегментам РНК. Однако, поскольку многие белки, склонные к фазовому разделению, демонстрируют низкую сложность и особенности неупорядоченной последовательности, эти методы определения дискретной структуры белка, вероятно, найдут ограниченное применение в этой развивающейся области.

ЯМР-спектроскопия; универсальный инструмент в исследованиях белков, склонных к фазовому разделению.

ЯМР-спектроскопия предлагает уникальные возможности в исследованиях неупорядоченных белков, обеспечивая понимание конформаций и динамики отдельных аминокислот по всей полипептидной цепи. Измерения значений химического сдвига для ядер атомов основной цепи сообщают о склонностях и динамике вторичной структуры, которые можно исследовать в масштабах времени от пс до нс и от мкс до мс с использованием различных методов релаксации [85].Более того, дальнодействующая структура в неупорядоченных белках может быть изучена с использованием методов усиления парамагнитной релаксации (PRE) и путем измерения остаточных диполярных связей [86]. Первый метод, однако, требует, чтобы белки были сконструированы так, чтобы включать отдельные остатки цистеина для мечения парамагнитным зондом. Ограничением этих подходов ЯМР является то, что быстрые конформационные флуктуации неупорядоченных полипептидов вызывают ансамблевое усреднение параметров ЯМР. Второе ограничение заключается в том, что полученная структурная и динамическая информация сообщает об особенностях отдельных сайтов в белке в очень ограниченной шкале длины (Å или десятки Å в случае измерений PRE).Исключением является использование методов градиента импульсного поля для изучения диффузии белков [87], но они еще не использовались в исследованиях белков в жидких каплях. Обширная динамика, характеризующая IDP, часто является преимуществом для исследований ЯМР, поскольку они вызывают сужение резонанса и улучшают обнаружение. Однако некоторые ВПЛ испытывают колебания во временных масштабах, которые вызывают расширение резонанса и могут затруднять ЯМР-исследования. Несмотря на эти ограничения, уже было продемонстрировано, что ЯМР обеспечивает уникальное понимание конформационных и динамических характеристик IDP, склонных к разделению фаз, как до, так и после разделения фаз; несколько примерных исследований обсуждаются ниже в разделе «Интегративные подходы к пониманию молекулярных основ разделения фаз».

Методы исследования молекулярных взаимодействий, связанных с разделением фаз

Классические методы характеристики биомолекулярных взаимодействий, такие как ITC [49] и SPR [68, 69], использовались для характеристики широкого диапазона аффинностей связывания, связанных с различными типы взаимодействий, которые происходят в жидкообразных каплях и / или безмембранных органеллах. ЯМР также можно использовать для характеристики макромолекулярных взаимодействий и особенно хорошо подходит для исследований слабых взаимодействий, которые создают проблемы для других методов.Например, возмущения химического сдвига, наблюдаемые во время титрования немеченого связывающего партнера в изотопно-меченый белок, могут быть количественно проанализированы для определения специфичных для остатков и общих значений K _d для взаимодействий, связанных с разделением фаз [NPM1 интегрируется в ядрышко через несколько -модальные взаимодействия с белками, демонстрирующими R-богатые линейные мотивы и рРНК: Mitrea DM, et al., в обзоре]. Однако поливалентность белков, склонных к фазовому разделению, может привести к возникновению сложных многоступенчатых механизмов взаимодействия, которые усложняют анализ данных, полученных с помощью описанных выше методов.Поэтому эксперименты часто проводят с усеченными макромолекулами пониженной поливалентности и, следовательно, не рассматривают взаимодействия в условиях разделения фаз. Несмотря на эти ограничения, эти биофизические методы обеспечивают важное понимание свойств связывания отдельных элементов в поливалентных макромолекулах, которые претерпевают фазовое разделение.

Методы рассеяния для исследования структурных особенностей до и после разделения фаз

Динамическое рассеяние света и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) [19, 46] были использованы для понимания общего размера и формы макромолекулярных ансамблей.В частности, SAXS использовался для характеристики формы (например, радиуса вращения) ансамблей неупорядоченных белков [88]. Однако методы рассеяния могут также обнаруживать дальний порядок в так называемых мягких материалах и однозначно давать представление о структурном составе этих материалов. Малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН) ранее использовалось в структурном анализе смесей полимеров [89–91] и полимерных мягких наноматериалов [92] и имеет большой потенциал в исследованиях безмембранных органелл для получения информации о пространственной организации макромолекулы в конденсированном состоянии.Одно недавнее исследование использовало SANS для характеристики регулярного расположения молекул в каплях, состоящих из ядрышкового белка, нуклеофозмина (NPM1) и пептида, полученного из рибосомного белка, rpL5, на масштабах длины от 5,5 до 11,9 нм [NPM1 интегрируется в ядрышко посредством мультимодальных взаимодействий с белками, демонстрирующими R-богатые линейные мотивы и рРНК: Mitrea DM, et al., в обзоре]. SANS имеет то преимущество, что позволяет обнаруживать рассеяние от конкретных компонентов в гетерогенных, разделенных фазами состояниях посредством селективного протонирования и / или дейтерирования и согласования контрастности растворителя [93].Более того, SANS с временным разрешением использовались в прошлом в исследованиях фазового разделения мутантного хантингтина экзона 1 на амилоидные волокна для определения механизма сборки макромолекул и геометрии упаковки мономеров внутри фибрилл [94]. Мы предполагаем, что SAXS и SANS могут быть в состоянии выявить расстояние между частично упорядоченными макромолекулами в жидкообразной структуре капель, приготовленных in vitro и, возможно, в безмембранных органеллах, если могут быть решены технические проблемы, связанные с подготовкой образцов.Мы предполагаем, что эти методы рассеяния станут мощным инструментом для характеристики биологических структур, возникающих в результате разделения фаз в будущем.

Световая микроскопия

Методы световой микроскопии (обзор в [95]) широко используются для визуализации субклеточной локализации флуоресцентно меченых молекул. Визуализация в реальном времени в сочетании с восстановлением флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) или потери флуоресценции при фотообесцвечивании (FLIP) позволяет исследовать динамику макромолекул в безмембранных органеллах внутри живых клеток [7, 46, 48, 77] и фазово-разделенные состояния, восстановленные in vitro [46–48, 50].

Информация, полученная с помощью методов структурной биологии, находится на шкале длин от 10 ⁻¹⁰ до 10 ⁻⁹ м, в то время как классические методы световой микроскопии предоставляют информацию на гораздо более крупных масштабах, от 10 ⁻⁷ до 10 ⁻³ м. Эта ситуация создает разрыв, соответствующий двум порядкам величины по шкале длины в нашем понимании структурных и динамических особенностей безмембранных органелл микронного размера. Макромолекулярные взаимодействия, которые происходят в масштабе длины этого промежутка, ответственны за структурную организацию, которая приводит к разделению фаз и жидкоподобным и / или гелеобразным свойствам безмембранных органелл и родственных структур.Далее мы обсудим структурные методы, которые могут заглянуть в этот разрыв в масштабе длины.

Высокое разрешение и микроскопия одиночных молекул

Электронная микроскопия может расширить промежуток между двумя наборами методов, описанных выше, и широко используется для изучения ультраструктуры клеток [1]. Существенным ограничением этого метода является низкая уверенность в том, что конкретные молекулы могут быть идентифицированы на основе контраста изображений в оттенках серого [96]. Возникающая область коррелированной световой и электронной микроскопии (CLEM; обзор [96]) предоставляет возможность напрямую связать динамическую информацию, полученную с помощью методов живой флуоресцентной микроскопии, с ультраструктурными деталями, полученными с помощью электронной микроскопии.

Значительный прогресс был достигнут за последнее десятилетие в методах микроскопии сверхвысокого разрешения (обзор приведен в [97]) и был успешно применен для расшифровки архитектуры хромосом [98]. Для изучения ультраструктурной организации зародышевых гранул у C. elegans была применена микроскопия решетчатых листов в сочетании с микроскопией со структурированным освещением, метод, который возвращает трехмерные изображения с разрешением ~ 200 нм x 200 нм в плоскости x / z, которое превышает дифракционный предел. [39]. Внутренняя структура, наблюдаемая в нескольких безмембранных органеллах, предполагает, что сконденсированные макромолекулы не распределены однородно, а далее разделяются на фракции с разделенными фазами с различными физическими свойствами.Эти методы дают возможность выявить гетерогенную ультраструктуру безмембранных органелл в будущем.

Флуоресцентная микроскопия одиночных молекул имеет большой потенциал для анализа белков в жидких каплях in vitro и безмембранных органеллах в клетках. Например, флуоресцентная корреляционная спектроскопия одиночных молекул (FCS) [99] и резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) [100] были использованы для изучения структурных и динамических характеристик склонных к агрегации внутренне неупорядоченных белков in vitro (обзор в [101]).Кроме того, одномолекулярный FRET и другие методы были применены к широкому диапазону неупорядоченных белков с различным составом и распределением заряженных остатков (обзор в [102]). Мы предполагаем, что в будущем эти методы будут применяться к неупорядоченным белкам внутри жидких капелек, чтобы выявить их структурные и динамические особенности. Более того, smFRET и визуализация времени жизни флуоресценции выявили конформационные особенности неупорядоченного белка в клетках HeLa [103], открывая возможности в будущем для изучения склонных к фазовому разделению белков в безмембранных органеллах в их естественной клеточной среде.

Дополнительные методы определения физических характеристик

Плотность [1], вязкость [5, 6, 47] и жесткость [79] — это некоторые из физических свойств, которые были измерены для bona fide безмембранных органелл или in vitro. капель восстановленной жидкости. Интерферометрическая микроскопия была использована для измерения плотности ядерных безмембранных органелл в изолированных зародышевых пузырьках Xenopus laevis , ядрах ооцитов [1]. Этот метод позволил получить важную информацию о физических свойствах тугоплавких субклеточных тел в квази-естественной среде.Однако несколько соображений при интерпретации этих данных заключаются в том, что результаты основаны на упрощенном предположении, что органеллы имеют сферическую форму и состоят исключительно из гомогенно смешанной воды, белков и низкомолекулярных растворенных веществ [1].

Атомно-силовая микроскопия обеспечивает преимущество выполнения сканирования поверхности безмембранных органелл, которые создают топологические карты с разрешением в нанометровом диапазоне. Кроме того, этот метод предоставляет средства для измерения других ключевых биофизических свойств, таких как структурная жесткость, как это делается для ядрышек [79].

Методы микрореологии, традиционно используемые для характеристики вязкоупругих свойств полимеров и сложных жидкостей [104], были применены для характеристики безмембранных органелл [5, 6, 42, 105] и in vitro. сформированных белков и белков. -РНК жидкие капли [47, 55]. В частности, технология индикаторных шариков предоставила важную информацию о влиянии РНК на вязкоупругие свойства in vitro жидких капель [47, 55].

Вычислительные и теоретические подходы

По мере того, как мы получаем больше знаний о типах макромолекул, которые подвергаются фазовому разделению с образованием жидких структур как in vitro, , так и в клетках, необходимы вычислительные модели для анализа структурных и динамических характеристик, закодированных по их аминокислотным последовательностям, чтобы понять их поведение при разделении фаз.Большая часть белков или участков белка, которые, как было показано, подвергаются фазовому разделению, по своей природе неупорядочены, что создает множество вычислительных проблем, особенно конформационный отбор образцов и физическую точность. Для удовлетворения потребности в выборке обширного конформационного пространства, исследуемого IDP / IDR, используется широкий спектр методов, включая методы молекулярной динамики, часто улучшенные такими подходами, как обмен репликами и родственными методами [106, 107], а также методами выборки Монте-Карло. [108, 109].Доступно множество различных силовых полей и их вариантов [110–112], а некоторые из них были недавно протестированы и сравнены [113]. Расчеты часто выполняются без экспериментальных ограничений, и поэтому они полагаются на лежащие в основе силовые поля для создания физически точных молекулярных ансамблей. В прошлом проблема заключалась в том, что вычислительные модели IDP были слишком компактными [114], но эта проблема решается путем уточнения метода [112, 115–117] и рассмотрения данных ЯМР, SAXS и smFRET [110, 113, 118] .Другая группа подходов использует экспериментальные ограничения (например, данные ЯМР и / или SAXS) для выбора конформеров для включения в ансамбли IDP — так называемые методы «выборки и выбора» [88, 119–121]. Дополнительные вычислительные методы были разработаны для создания ансамблей IDP на основе данных SAXS [122]. Разработка физически точных молекулярных ансамблей с атомистическими деталями для IDP важна, потому что, за исключением методов флуоресценции одиночных молекул, экспериментальные методы, используемые для характеристики IDP, подлежат усреднению по ансамблю.Таким образом, созданные с помощью вычислений ансамблевые модели IDP позволяют исследовать особенности большого числа отдельных молекул. Однако эти подходы только начинают применяться к белкам, которые претерпевают фазовое разделение.

Ключевой задачей компьютерных исследований белков, склонных к фазовому разделению, является понимание межмолекулярных взаимодействий, которые являются основой самоассоциации и фазового разделения. Что касается этой цели, область находится в зачаточном состоянии. Однако методологии, применяемые для понимания агрегации белков и образования фибрилл, можно использовать для понимания типов взаимодействий, которые управляют фазовым разделением белков и, возможно, в будущем, фазовым разделением белок-нуклеиновая кислота.В области агрегации белков были применены методы разностных вычислений, чтобы понять агрегацию полиглутаминовых трактов, связанных с болезнью Хантингтона [123], и атомистические методы, чтобы понять агрегацию амилоида β [124]. Очевидно, что для понимания молекулярной основы разделения фаз необходимы дополнительные усилия в этой области.

В то время как вычислительные подходы сталкиваются с проблемами в решении проблемы разделения фаз белков, в последние годы был достигнут значительный прогресс в понимании взаимосвязей между особенностями последовательностей IDPs и IDRs и общими конформационными особенностями ансамблей IDP [125–127].Результаты ЯМР, флуоресценции одиночных молекул и вычислительных подходов показали, что характеристики заряда IDP влияют на форму их динамических ансамблей. Паппу и его сотрудники расширили эти результаты, используя как вычислительные, так и экспериментальные методы, чтобы показать, что не только доля заряженных остатков и чистый заряд на остаток в IDP и IDR влияют на их общие конформационные характеристики, но также и на распределение противоположно заряженных остатков в последовательностях. существенно влияет на уплотнение ансамблей ИДП [128].Эти достижения привели к разработке новой фазовой диаграммы, основанной на значениях чистого положительного и отрицательного заряда на остаток для классификации последовательностей IDP и IDR [129]. Эти разработки обеспечивают концептуальную основу для установления взаимосвязей между характеристиками начисления IDP и IDR, их конформационными характеристиками и их склонностью к разделению фаз. Характеристики заряда, безусловно, являются важными факторами, определяющими поведение фазового разделения белков; например, остатки аргинина преобладают в областях низкой сложности, которые, как известно, образуют жидкие капельки in vitro и в белковых компонентах безмембранных органелл [44, 47].Однако эти последовательности часто обогащены ароматическими и другими нейтральными аминокислотами, что указывает на то, что, хотя электростатические взаимодействия могут играть важную роль в некоторых случаях, другие типы молекулярных взаимодействий играют роль в других случаях [48, 50, 53]. Это было подтверждено в недавнем исследовании Гарсиа Кироса и Чилкоти [130], в котором они определили особенности последовательностей сконструированных белков, которые могут подвергаться фазовому разделению из-за повышения температуры (названные последовательностями LCST) или уменьшения (названные последовательностями UCST).Последовательности LCST были обогащены гидрофобными остатками, тогда как последовательности UCST были обогащены остатками зарядов [131]. Это исследование, которое включало теоретические соображения, а также экспериментальные измерения in vitro и , служит моделью для будущих исследований физической основы для фазового разделения растущего списка белков и молекул РНК, которые, как было показано, разделяются на жидкие или гелевые. -подобная фаза безмембранных органелл и других клеточных тел.

Интегративные подходы к пониманию молекулярной основы фазового разделения

Ни один из отдельных методов или подходов, обсуждаемых выше, сам по себе не раскрывает молекулярную основу для фазового разделения с помощью белков и смесей белок-нуклеиновые кислоты; следовательно, существует необходимость в применении нескольких взаимодополняющих методов и интеграции результатов для улучшения понимания механизмов.Интеграция необходима для охвата широких масштабов длины, относящихся к безмембранным органеллам, начиная от атомной шкалы (единиц Å), относящейся к конформациям аминокислот и их межмолекулярным взаимодействиям, до общего размера in vitro жидких капель. и клеточные органеллы без мембран (единицы микрометры). Интеграция также необходима в широком диапазоне соответствующих временных масштабов, включая движения аминокислот и их полипептидных цепей, которые опосредуют их конформационную гетерогенность и межмолекулярные взаимодействия в масштабе времени от нс до мкс, для диффузии макромолекул внутрь и наружу. и внутри жидкообразных структур в масштабе времени от секунд до десятков секунд.Ключевой задачей является понимание взаимосвязи между конформационными особенностями и движениями аминокислот в атомном масштабе и макроскопическими свойствами этих структур (например, вязкостью, поверхностным натяжением, скоростью макромолекулярной диффузии и т. Д.).

Было начато несколько исследований, направленных на решение проблем, связанных с охватом этих широких масштабов длины и времени. Например, в недавнем отчете рассматриваются конформационные особенности белка FG-Nup, Nup153, и то, как эти особенности опосредуют сверхбыстрые взаимодействия с ядерным транспортным рецептором, Importin β [132].Хотя это исследование не связано с разделением фаз per se , это исследование дает объяснение того, как груз, связанный с импортином β, может быстро диффундировать через конденсированную фазу в ядре комплекса ядерных пор, который состоит из нескольких белков FG-Nup, включая Nup153. ЯМР-спектроскопию использовали для понимания усредненных по ансамблю конформационных и динамических характеристик амидных групп основной цепи в неупорядоченном Nup153 в отсутствие и в присутствии импортина-β и для создания конформационного ансамбля с использованием подхода «образец и выбор».Этот ансамбль был подтвержден обратным расчетом профиля рассеяния рентгеновских лучей и сравнением с экспериментальными данными SAXS, иллюстрацией масштабов охвата от аминокислот до целого неупорядоченного белка. Чтобы дополнить эту информацию, данные smFRET и измерения времени жизни флуоресценции были использованы для понимания конформационных особенностей многих отдельных молекул в одних и тех же условиях, в то время как флуоресцентная корреляционная спектроскопия использовалась для сравнения молекулярных диффузионных свойств Nup153 без и с импортином β.Кроме того, молекулярная динамика и вычислительные методы броуновской динамики использовались, чтобы связать выводы из вышеупомянутых биофизических методов с механизмом взаимодействия Nup153 / Importin β при атомистическом разрешении. Наконец, эти различные части молекулярных данных были связаны с импортином-β-зависимым транспортом через NPC в живых клетках с использованием объемного и одночастичного отслеживания флуоресценции.

Другой пример — недавнее исследование связанного с БАС белка, FUS, от Fawzi и его сотрудников, в котором использовались методы ЯМР и различные методы флуоресцентной микроскопии для изучения молекулярных свойств FUS в in vitro, жидкоподобных каплях и его взаимодействия с РНК и С-концевым доменом РНК Pol II.Последним примером является недавнее исследование очень распространенного ядрышкового белка, NPM1, который, как было показано, разделяется на жидкие капельки с другими ядрышковыми белками и рибосомной РНК [NPM1 интегрируется в ядрышко посредством мультимодальных взаимодействий с белками, демонстрирующими R-богатые линейные мотивы и рРНК: Mitrea DM, et al., В обзоре]. ЯМР, smFRET и SANS были использованы для понимания конформационных и динамических характеристик NPM1 до и после разделения фаз с пептидом, полученным из рибосомного белка, rpL5, и выявили молекулярную организацию, простирающуюся до ~ 10 нм в жидкообразных каплях.Кроме того, делеционный анализ идентифицировал домены NPM1, необходимые для разделения фаз in vitro, и для локализации внутри ядрышек в клетках.

Три исследования, обсужденные выше, иллюстрируют подходы, позволяющие связать молекулярные особенности склонных к фазовому разделению белков, изученных с атомным разрешением, с макроскопическими особенностями жидкоподобных структур, которые они образуют. Важно отметить, что в двух исследованиях также были интегрированы результаты клеточных анализов, что позволило связать молекулярные особенности с биологической функцией.Мы только начинаем понимать физические свойства белков, склонных к фазовому разделению, которые связаны с их локализацией в безмембранных органеллах, и с нетерпением ждем результатов аналогичных авантюрных интегративных исследований, чтобы расширить наши знания об этих свойствах и, что важно, о том, как они вносят свой вклад.

Author: alexxlab