2.3.4. Органические вещества клетки. Нуклеиновые кислоты
2.3.4. Органические вещества клетки. Нуклеиновые кислоты
Нуклеиновые кислоты были открыты в 1868 г. швейцарским ученым Ф. Мишером.
В организмах существует несколько видов нуклеиновых кислот, которые встречаются в различных органоидах клетки – ядре, митохондриях, пластидах.
К нуклеиновым кислотам относятся ДНК, и-РНК, т-РНК, р-РНК.
– линейный полимер, имеющий вид двойной спирали, образованной парой антипараллельных комплементарных (соответствующих друг другу по конфигурации) цепей. Пространственная структура молекулы ДНК была смоделирована американскими учеными Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком в 1953 г.
Мономерами ДНК являются нуклеотиды.
Каждый нуклеотид ДНК состоит из пуринового (А – аденин или Г – гуанин) или пиримидинового (Т – тимин или Ц – цитозин) азотистого основания, пятиуглеродного сахара – дезоксирибозы и фосфатной группы.
Нуклеотиды в молекуле ДНК обращены друг к другу азотистыми основаниями и объединены парами в соответствии с
Последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК определяет ее специфичность, а также специфичность белков организма, которые кодируются этой последовательностью. Эти последовательности индивидуальны и для каждого вида организмов, и для отдельных особей.
Пример:
дана последовательность нуклеотидов ДНК: ЦГА – ТТА – ЦАА.
На информационной РНК (и-РНК) будет синтезирована цепь ГЦУ – ААУ – ГУУ, в результате чего выстроится цепочка аминокислот: аланин – аспарагин – валин.
При замене нуклеотидов в одном из триплетов или их перестановке этот триплет будет кодировать другую аминокислоту, а, следовательно изменится и белок, кодируемый данным геном. Изменения в составе нуклеотидов или их последовательности называются мутацией.
– линейный полимер, состоящий из одной цепи нуклеотидов. В составе РНК тиминовый нуклеотид замещен на урациловый (У). Каждый нуклеотид РНК содержит пятиуглеродный сахар – рибозу, одно из четырех азотистых оснований и остаток фосфорной кислоты.
Синтезируются РНК в ядре. Процесс называется транскрипция — это биосинтез молекул РНК на соответствующих участках ДНК; первый этап реализации генетической информации в клетке, в процессе которого последовательность нуклеотидов ДНК «переписывается» в нуклеотидную последовательность РНК.
Молекулы РНК формируются на матрице, которой служит одна из цепей ДНК, последовательность нуклеотидов в которой определяет порядок включения рибонуклеотидов по принципу комплементарности. РНК-полимераза, продвигаясь вдоль одной из цепей ДНК, соединяет нуклеотиды в том порядке, который определен матрицей. Образовавшиеся молекулы РНК называют
Виды РНК.
Матричная или информационная РНК. Синтезируется в ядре при участии фермента РНК-полимеразы. Комплементарна участку ДНК, на котором происходит синтез. Ее функция – снятие информации с ДНК и передача ее к месту синтеза белка – на рибосомы. Составляет 5% РНК клетки.
Рибосомная РНК – синтезируется в ядрышке и входит в состав рибосом. Составляет 85% РНК клетки.
Транспортная РНК – транспортирует аминокислоты к месту синтеза белка. Имеет форму клеверного листа и состоит из 70—90 нуклеотидов.
– представляет собой нуклеотид, состоящий из азотистого основания аденина, углевода рибозы и трех остатков фосфорной кислоты, в двух из которых запасается большое количество энергии. При отщеплении одного остатка фосфорной кислоты освобождается 40 кДж/моль энергии. Способность запасать такое количество энергии делает АТФ ее универсальным источником. Синтез АТФ происходит в основном в митохондриях.
Таблица. Функции нуклеотидов в клетке.
Таблица. Сравнительная характеристика ДНК и РНК.
Тематические задания.
Часть А
А1. Мономерами ДНК и РНК являются
1) азотистые основания
2) фосфатные группы
3) аминокислоты
4) нуклеотиды
А2. Функция информационной РНК:
1) удвоение информации
2) снятие информации с ДНК
3) транспорт аминокислот на рибосомы
4) хранение информации
А3. Укажите вторую цепь ДНК, комплементарную первой: АТТ – ГЦЦ – ТТГ
1) УАА – ТГГ – ААЦ
3) УЦЦ – ГЦЦ – АЦГ
2) ТАА – ЦГГ – ААЦ
4) ТАА – УГГ – УУЦ
А4. Подтверждением гипотезы, предполагающей, что ДНК является генетическим материалом клетки, служит:
1) количество нуклеотидов в молекуле
2) индивидуальность ДНК
3) соотношение азотистых оснований (А = Т, Г= Ц)
4) соотношение ДНК в гаметах и соматических клетках (1:2)
А5. Молекула ДНК способна передавать информацию благодаря:
1) последовательности нуклеотидов
2) количеству нуклеотидов
3) способности к самоудвоению
4) спирализации молекулы
А6. В каком случае правильно указан состав одного из нуклеотидов РНК
1) тимин – рибоза – фосфат
2) урацил – дезоксирибоза – фосфат
3) урацил – рибоза – фосфат
4) аденин – дезоксирибоза – фосфат
Часть В
В1. Выберите признаки молекулы ДНК
1) Одноцепочная молекула
2) Нуклеотиды – АТУЦ
3) Нуклеотиды – АТГЦ
4) Углевод – рибоза
5) Углевод – дезоксирибоза
В2. Выберите функции, характерные для молекул РНК эукариотических клеток
1) распределение наследственной информации
2) передача наследственной информации к месту синтеза белков
3) транспорт аминокислот к месту синтеза белков
4) инициирование репликации ДНК
5) формирование структуры рибосом
6) хранение наследственной информации
Часть С
С1. Установление структуры ДНК позволило решить ряд проблем. Какие, по вашему мнению, это были проблемы и как они решились в результате этого открытия?
С2. Сравните нуклеиновые кислоты по составу и свойствам.
Содержание нуклеиновых кислот — Справочник химика 21
В основе модификации спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанной А. С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм. Автор предложил также формулу для расчета содержания нуклеиновых кислот.Высокое содержание нуклеиновых кислот, что может представлять опасность при некоторых патологических состояниях. [c.301]
СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.162]
Содержание нуклеиновой кислоты % [c.465]
Настоящая книга, издаваемая в серии научных трудов ВИР, освещает методы и методики по определению содержания нуклеиновых кислот в растительных тканях и препаратах. В ней также изложены — идентификация и количественный учет свободных нуклеотидов выделение нативных РНК и ДНК из растений фракционирование их на колонках определение нуклеотидного состава РНК и ДНК методами колоночной и бумажной хроматографии изучение свойств макромолекул нуклеиновых кислот, обнаружение их в клетке, цитофотометрия, определение состояния ДНК и РНК в клетке. [c.2]
Содержание нуклеиновых кислот в клетках колеблется от 0,1 о/о в дрожжах и 0,5—1% в мышцах и бактериальных клетках до 15—40% в тимусе (вилочковой железе) и в клетках спермы. Очевидно, в этих двух последних случаях из-за высокого содержания нуклеиновых кислот умножение содержания азота (в %) на 6,25 не дает правильной оценки содержания белка. [c.157]
Содержание лейкоцитов в 1 мкл крови составляет около 7 10 т.е. почти в 1000 раз меньше, чем эритроцитов. Лейкоциты в отличие от эритроцитов являются полноценными клетками с большим ядром и митохондриями и высоким содержанием нуклеиновых кислот. В них сосредоточен весь гликоген крови, который служит источником энергии при недостатке кислорода, например, в очагах воспаления. [c.585]
Содержание нуклеиновой кислоты относительно общей концентрации белка (белок -кислота). [c.465]
Определение содержания нуклеиновых кислот в растительных тканях [c.25]
Содержание нуклеиновых кислот в тканях [c.106]
Данные о содержании нуклеиновых кислот в различных тканях, полученные с помощью химических методов, в общем под- [c.106]
Содержание нуклеиновых кислот в нормальных тканях и злокачественных опухолях, найденное по методу Шнейдера [59] [c.107]
Содержание нуклеиновой кислоты в опухолевых тканях колеблется в столь широких пределах, что вывести какие-то общие закономерности по этому вопросу не представляется возможным [57, 58]. Результаты некоторых определений содержания нуклеиновых кислот в опухолях включены в табл. 9. Опухоли, богатые клетками (типа саркомы), отличаются высоким содержанием нуклеиновых кислот, тогда как для опухолей, в значительной мере состоящих из фиброзной ткани (типа скирра), характерно очень низкое содержание нуклеиновых кислот. В тех немногих случаях, когда удается непосредственно сопоставить опухолевую ткань с исходной нормальной, оказывается, что в опухоли содержание нуклеиновых кислот несколько выше. [c.108]
Особый интерес представляют данные, полученные при изучении печени, так как этот орган служит объектом большей части исследований, посвященных выяснению характера изменений в содержании нуклеиновых кислот под действием различных физиологических и патологических процессов. Кроме того, результаты цитологического изучения печени вполне соответствуют данным химических анализов. Голодание (фиг. 44) или выдерживание на бедном белком рационе [54] приводят к тому, что содержание РНК в печени падает, сопровождаясь исчезновением базофильных цитоплазматических гранул содержание ДНК при этом не меняется. Подобного рода явление наблюдается при ишемии, вызванной наложением лигатуры на сосудистый пучок одной из долей печени [60].
Содержание нуклеиновых кислот в бактериях [c.113]
Все нуклеопротеиды можно разделить по меньшей мере на два типа. К первому типу относятся нуклеопротеиды, в которых нуклеиновая кислота связана солевой связью с простыми белками основного характера и низкого молекулярного веса. Такими белками могут быть протамины (сальмин, клупеин, сту-рин), встречающиеся в сперме рыб. К этому же типу относятся нуклеопротеиды, в которых нуклеиновая кислота связана с основными белками более высокого молекулярного веса — гистолами. Примером могут служить нуклеопротеиды, встречающиеся в тканях зобной и поджелудочной желез. Ко второму типу мы относим более сложные структуры — вирусы растений (например, вирус табачной мозаики) и бактериофаги. Содержание нуклеиновых кислот в вирусах колеблется от 5 до 50%. Природа связи между белками и нуклеиновыми кислотами в вирусных нуклеопротеидах изучена слабее, чем в нуклеопро-теидах первого типа. Известно, что в вирусном нуклеопротеиде связи между белком и нуклеиновыми кислотами более лабильны и что для белков вирусов характерно высокое содержание основных аминокислот. Даже сравнительно простые вирусы имеют весьма сложное строение. Еще более сложное строение у таких вирз сов, как вирусы гриппа и пситтакоза. Последние могут даже быть отнесены к микроорганизмам. Подробное строение вирусов этой группы здесь не рассматривается. [c.246]
Особенно богаты нуклеиновыми кислотами бактерии, у которых содержание нуклеиновых кислот может в некоторых случаях [c.113]
К прекращению утилизации углеводородного сырья и остановке процесса синтеза в клетке, 2, К стабилизации содержания нуклеиновых кислот. 3, К вспениванию культуры хуглеводородон в биомассе, [c.290]
Нормальное развитие микроорганизмов, поглощение клетками парафина, активизирует действие многих ферментов н стабилизирует содержание нуклеиновых кислот. 2. Высокое содержание нуклеиновых кислот в биомассе, активизирует действие многих ферментов, стимулирует поглощение клетками парафина. 3. Нормальное развитие микроорганизмов, накопление белка, утилизация углеродного сырья, активизирует действие многих ферментов. 4. Высокое содержание нуклеииовы.ч кислот в биомассе, снижение нроизподственных потерь и себестоимости продукта. [c.290]
Рибосомы сами по себе являются рибонуклеопротеинами с содержанием нуклеиновых кислот -60%. Они находятся в свободном состоянии прежде всего в цитоплазме и в связанном — в эидоплазматическом ретикулуме. Все рибосомы состоят из двух субъединиц, на которые они диссоциируют в зависимости от концентрации. У наиболее хорошо изученных рибосом Е. oli большая (50 S) субъединица включает 5 S- и 23 S-рибосомные РНК, а также 34 различных белка малая (30 S) субъединица состоит из 16 S-рибосомной РНК и 21 белка. Рибосомы эукариот образованы 60 S- и 40 S-субъединицами. [c.393]
Автолиз останавливали охлаждением пробы до 0 С путем помещения их в ледяную баню. Клетки бактерий отделяли центрифугированием. В бесклеточном автолизате определяли содержание нуклеиновых кислот по методу A. . Спирина, аминного азота методом формольного титрования, общего азота микрометодом Къельдаля. [c.223]
Н. М. Карамзиной), семенииков — по весовому коэффициенту, с помощью количественного морфологического анализа (Е. М. Чирковой, 1970) и определения содержания нуклеиновых кислот и скорости включения в них радиоактивного фосфора (Е. Я. Голуйоаич, 1970). [c.30]
Колонку (2X15 см) заполняют густой суспензией гидроксилапатита так, как это описано на с. 102. Колонку промывают 100 мл 0,03 М фосфатного буфера. Затем в нее вносят препарат нуклеиновой кислоты из расчета 0,2 мг на 1 мл суспензии (сухие препараты растворяют в 0,03 М калий-фосфатном буфере, менее очищенные препараты предварительно освобождают от избытка ионов). Устанавливают скорость тока жидкости 0,2 мл/мин-см . Колонку промывают 50—100 мл исходного буфера и проводят элюцию в линейном градиенте концентрации фосфатного буфера 0,03—0,4 М. Общий объем элюента — 400 мл. Собирают фракции по 5—10 мл. Содержание нуклеиновых кислот определяют по поглощению при 260 нм. Порядок элюции нуклеиновых кислот с колонки гидроксилапатита при постепенном увеличении концентрации фосфатного буфера следующий РНК, однонитевая ДНК, двух-нитевая нативная ДНК. [c.172]
В качестве источников углерода дрожжевые клетки могут использовать и низшие спирты — метанол и этанол, получаемые в биотехнологии из природного газа или растительных отходов. Дрожжевая масса, полученная после культивирования дрожжей на спиртах, содержит больше белков (56 — 62 % от сухой массы) и меньше вредных примесей, чем кормовые дрожжи, выращенные на парафинах нефти, такие, как производные бензола, /)-аминокисло-ты, аномальные липиды, токсины и канцерогенные вещества. Кроме того, кормовые дрожжи имеют повышенное содержание нуклеиновых кислот — 3 — 6% от сухой массы, которые в этой концентрации вредно воздействуют на организм животных. В результате их гидролиза образуется много пуриновых оснований, превращающихся затем в мочевую кислоту и ее соли, которые могут быть причиной мочекаменной болезни, остеохондроза и других заболеваний. Тем не менее кормовые дрожжи хорошо усваиваются и перевариваются в организме животных, а по содержанию таких аминокислот, как лизин, треонин, валин и лейцин, значительно превышают многие растительные белки. Вместе с тем белки дрожжей частично не сбалансированы по метионину, в них мало цистеина и селенцистеина. Оптимальная норма добавления дрожжевой массы в корм сельскохозяйственных животных обычно составляет не более 5 —10 % от сухого вещества. [c.11]
В Советском Союзе молекулярная биология имела свою предысторию с серьезными научными заделами и традициями. Первые конкретные идеи о матричном механизме воспроизведения макромолекулярных хромосомных структур как носителей наследственности были высказаны еще в 1928 г. Н. К. Кольцовым. В 1934 г. в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова на кафедре биохимии растений под руководством А. Р. Кизеля были начаты исследования нуклеиновых кислот. Эти работы затем возглавил его ученик А. Н Белозерский, трудами которого была доказана универсальность распространения ДНК в живом мире и связь количественного содержания нуклеиновых кислот в клетках с интенсивностью роста и размножения. К моменту официального рождения молекулярной биологии в 1953 г., когда Дж. Уотсоном и Ф. Криком был сформулирован принцип структуры и воспроизведения ДНК, у нас в стране существовала собственная школа специалистов по нуклеиновым кислотам, готовая воспринять тенденции развития этой новой науки. Поэтому уже в ранний период становления молекулярной биологии, несмотря на определенные трудности и недостаток кадров, советскими учеными был сделан ряд принципиальных научных вкладов, среди которых обнаружение специальной фракции РНК. в последующем названной информационной РНК (мРНК), открытие временной регуляции синтеза информационных РНК на ДНК, тонерские исследования информационных РНК эукариотических клеток, расшифровка полной первичной структуры одной из тРНК, демонстрация возможности самосборки рибосом и т. д. [c.4]
Еще в ранних работах, связанных с изучением нуклеиновых кислот, было установлено, что эти кислоты содержатся в наибольшем количестве в органах и тканях, богатых ядерным веществом и характеризующихся интенсивным синтезом белков. Например, количество нуклеиновых кислот в молодых листьях или в точках роста побегов значительно больше, чем в старых листьях или в стеблях. Много нуклеиновых кислот в зародышах семян, глазках клубней картофеля, пыльце, кончиках корней и т. д. По данным А. Н. Белозерского, содержание нуклеиновых кислот в наиболее богатых ими органах растений следующее (в процентах веса сухой массы) споры Fuligo vavlans 7,9 семяпочки мака 4,9—6,2 зародыши кедрового ореха 6,8 зародыши пшеницы 7,9. В листьях и стеблях большинства растений содержание нуклеиновых кислот обычно составляет 0,1 — 1% веса сухой массы. [c.223]
При изучении содержания нуклеиновых кислот в клетке было установлено, что практически вся ДНК локализована в ядре, а РНК сосредоточена по преимуществу в рибосомах. РНК содержащаяся в рибосомах и составляющая структурную основу рибосом, называется рибосомальной РНК (рб-РНК) На долю рб-РНК приходится 80—90% всей РНК, содержащейся в клетке. Кроме рб-РНК, в клетках обнаружена также так называемая растворимая РНК (р-РНК), не связанная с клеточными структурами. Свое название растворимая РНК получила потому, что она находится в растворенном состоянии в-надосадочной жидкости при центрифугировании гомогенатои клеток в течение продолжительного времени при очень высоких значениях [c.230]
Еще в ранних работах, связанных с изучением обмена нуклеиновых кислот, было выяснено, что их содержание изменяется в зависимости от интенсивности и направленности обмена веществ в растениях. В опытах с яровой пшеницей Л. А. Зуев и В. И. Поручикова установили, что в первые фазы созревания зерна, когда в семенах наблюдается высокая интенсивность обмена веществ и прежде всего синтеза белков, содержание нуклеиновых кислот в зерне довольно высокое. При завершения созревания зерна интенсивность обмена веществ ослабляется, наблюдается уменьшение содержания нуклеиновых кислот и повышение количества фитина. В созревших семенах фитин— основное запасное фосфорсодержащее соединение. В других опытах с прорастающими семенами /пшеницы и риса было показано, что при прорастании семян содержание фитина в них резко снижается, а количество нуклеиновых кислот возрастает. За 12 дней прорастания содержание фосфора, входящего в состав нуклеиновых кислот (в процентах от общего фосфора), повышалось у пшеницы с 8,5 до 21,2%, а у риса—с 9,2 до 23,3%. Таким образом, в растениях постоянно идет синтез и распад нуклеиновых кислот. Эти процессы тесно связаны с обменом веществ растения, прежде всего с обменом белковых вешеств. [c.265]
По методу Огура и Розен [38], предназначенному первоначально для работы с растительными тканями, прежде всего удаляют кислоторастворимые вещества и липиды. Затем выделяют РНК, обрабатывая остаток ткани 1 н. хлорной кислотой в течение 18 час нри 4°. Для выделения ДНК полученный остаток обрабатывают 0,5 н. хлорной кислотой при 70° в течение 20 мин. При работе с животными тканями нагревание рекомендуется проводить до 80° в течение 30 мин в присутствии 1 н. хлорной кислоты. Содержание нуклеиновой кислоты в каждом из экстрактов определяют затем по содержанию фосфора, пентозы (или дезоксипентозы) или пуринов и ниримидинов. Недостаток этого метода заключается в том, что некоторое количество ДНК может экстрагироваться холодной хлорной кислотой и переходить во фракцию РНК [35]. [c.102]
Основное затруднение при использовании всех методов подобного рода состоит в том, чтобы по количеству найденных в экстрактах реакционноснособных пентозы и дезоксипентозы рассчитать содержание ДНК или РНК. В связи с этим важно иметь в виду, что в пуриннуклеотидах сахара значительно более реакционно-способны, чем в пиримпдиннуклеотидах. Для устранения указанной трудности обычно производят следующее. В очищенных препаратах РНК дрожжей или ДНК зобной железы с известным содержанием фосфора определяют содержание пентозы или дезоксирибозы. Это дает возможность при определении содержания нуклеиновых кислот в новой ткани выражать полученные результаты в величинах содержания фосфора нуклеиновых кислот. Точность результатов зависит, очевидно, от чистоты и состава использованных в качестве стандарта препаратов. [c.103]
Изучетгае любой какой-нибудь ткани у груцпы животных одного возраста, находящихся в одинаковых условиях, указывает, что содержание нуклеиновой кислоты может варьировать в довольно широких пределах. Обычно с возрастом содержание нуклеиновой кислоты уменьшается, однако эти изменения выражены недостаточно четко. Исключение составляют ткани зародыша, которые в общем богаче нуклеиновыми кислотами, чем соответствующие ткани взрослого животного. [c.108]
При оценке имеющихся в литературе данных о содержании нуклеиновых кислот в тканях следует иметь в виду, что прн определении фосфора РНК методом Шмидта — Таннгаузера неизбежно получаются завышенные результаты, обусловленные примесями других фосфорных соединений (стр. 101). [c.108]
Печень крысы представляет собой орган, в котором легко индуцировать опухоль, скармливая животным азокраситель масляный желтый ( -диметиламиноазобепзол). Тем самым становится возможным в известных пределах сопоставление полученной генатомы с исходной нормальной тканью. Это сопоставление показало, что, в то время как по содержанию РНК различия между тканями обоих типов невелики, содержание ДНК выше в опухоли [62, 78]. Шнейдер [58, 79] нашел, что концентрация РНК в печени и гепатоме крыс по существу одинакова, по в гепатоме содержание нуклеиновой кислоты (на 1 мг сухой ткани) во фракции, состоящей из больших гранул (стр. 130), и в нерасфрак-ционированном остатке, включающем микросомы (стр. 130), выше, чем в соответствующих фракциях нормальной нечени. Увеличение содержания ДНК в гепатоме обусловлено главным образом возрастанием числа клеток в опухолевой ткани. [c.112]
Содержание нуклеиновых кислот в нервной тпани определяли главным образом но методу Касперсона. Повышенная двигательная активность сопровождается снижением содержания РНК в цитоплазме клеток передних рогов спинного мозга [83]. После звукового раздражения в клетках ганглия улитки также наблюдается уменьшение содержания РНК [84]. Хиден и Хартелиус [85] [c.112]
Рекомбинантные гистоны как инструмент для доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки
Одной из важных проблем при использовании генно-терапевтических препаратов в медицине является эффективность их доставки в эукариотические клетки [1—3]. Широкое использование вирусных векторов, демонстрирующих высокую эффективность доставки генетических препаратов в клетки, ограничено из-за их сильной иммуногенности и высокой стоимости получения [4, 5]. В качестве альтернативных носителей в настоящее время все чаще используют синтетические поликатионные соединения, липиды и пептиды. Хотя их получение дешевле, чем вирусных векторов, недостатком является низкая эффективность и в ряде случаев высокая токсичность [6—9]. Наиболее безопасным может оказаться использование природных поликатионных белков, а также так называемых проникающих в клетки пептидов (CPP — cell penetration peptide). При образовании комплексов с нуклеиновыми кислотами такие белки/пептиды обеспечивают прямую трансдукцию в ядра клеток, благодаря наличию в своем составе белоктрансдуцирующих доменов (БТД), которые состоят из 10—30 основных аминокислотных остатков [10—13]. Примерами таких белков могут служить гистоны, естественными функциями которых являются связывание и образование прочного комплекса с молекулами ДНК в клетке. Ранее было показано, что все коровые гистоны (Н2А, Н2 В, Н3, Н4) и линкерный гистон Н1 способны образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами и доставлять их в клетки эукариот [14—17]. Условия, и по-видимому, механизм трансфекции клеток плазмидной ДНК с помощью гистона Н1 сильно отличаются от условий трансфекции с использованием коровых гистонов [15, 16]. Механизм проникновения гистоновых комплексов с ДНК в клетку до конца не изучен, ряд авторов показали, что перенос происходит без образования эндосом, тогда как другие эксперименты указывают на эндосомальный путь [16, 18]. Есть данные о прямом переносе химерных белков гистонов Н2А и Н2 В и зеленого флюоресцентного белка в клетки, который происходит за счет гистоновой составляющей [19]. В описанных ранее работах использовали в основном гистоны, полученные экстракцией и очисткой из тканей животных, в ряде случаев использовали суммарную фракцию гистонов [16, 20]. Однако более технологичным являются получение и использование рекомбинантных гистонов, молекулы которых при необходимости легко модифицировать, вводя те или иные дополнительные аминокислотные последовательности, например фрагмент ТАТ-пептида. Фрагмент регуляторного белка вируса иммунодефицита ВИЧ-1 — ТАТ является в настоящее время наиболее изученным представителем негистоновых СРР [21]. Фрагмент ТАТ-пептида, состоящий из 10—15 аминокислотных остатков, в настоящее время используют при создании комплексов ДНК с поликатионами (полиплексов) и вводят в состав липидных векторов [22, 23]. Показано, что в ряде случаев введение ТАТ-пептида значительно увеличивает эффективность трансфекции. Создание химерных белков гистонов с другими CPP и их использование для доставки генетического материала в клетки ранее не были описаны.
В литературе приводится много способов очистки гистонов, в том числе и рекомбинантных. Все они сводятся к использованию ионообменной хроматографии и ВЭЖХ, или, при наличии в структуре белка полигистидиновой последовательности, аффинной хроматографии на никелевой смоле, в ряде случаев дополнительно используют гель-фильтрацию [24—27]. При использовании гистонов для доставки терапевтических препаратов in vivo важно избавляться от бактериальных эндотоксинов как в препаратах гистонов, так и при очистке плазмидного вектора, что редко учитывается в описанных способах очистки рекомбинантных белков из культуры бактериальных клеток. Для получения препаратов плазмидной ДНК с низким содержанием эндотоксина обычно используют специальные наборы для их выделения, включающие стадию очистки от эндотоксина, например наборы фирмы «Qiagen», США. При очистке рекомбинантных гистонов из бактериальных субстанций следует учитывать сильный положительный заряд этих белков [28]. Гистоны прочно связываются с отрицательно заряженными бактериальными эндотоксинами и разделить такие комплексы весьма сложно. Например, при очистке препаратов гистона Н1 только использование сильных кислот при ВЭЖХ приводило к необходимому уровню чистоты [29].
В данной работе для очистки рекомбинантных гистонов человека Н2А, Н2 В и химерного белка, состоящего из гистона Н2А и ТАТ-пептида (Н2А-ТАТ) перед ионообменной хроматографией, мы использовали стадию обработки препаратов соляной кислотой. Кроме того, лизис клеток проводили в растворе 6 М мочевины, что позволило перевести весь белок в растворимую форму. Предложенная схема очистки (лизис клеток в растворе 6 М мочевины, инкубация лизата клеток в 0,25 М HCl, катионнообменная хроматография и ВЭЖХ) позволила снизить содержание эндотоксина более чем в 100 раз и значительно увеличить выход целевого белка. Было показано, что полученные белки способны образовывать комплексы с плазмидной ДНК, и такие комплексы можно эффективно использовать для трансфекции эукариотических клеток.
Материал и методы
Создание экспрессирующих векторов. Экспрессирующие векторы конструировали на основе плазмиды pET-32a (+) (Novagen, США). Фрагменты кДНК, соответствующие открытой рамке считывания гистонов Н2А и Н2 В, амплифицировали с помощью праймеров, содержащих сайты рестрикции Nde I и Hind III (для гистона Н2А — GTTAGCATATGTCGGGACGTGGCAAGC и ACTAAGCTTCTACTTGCCCTTGGCCTTGT, для гистона Н2 В — GTTAGCATATGCCTGATCCAGCTAAGT и CTAAGCTTTTATTTGGAGCTGGTGTACT). В качестве матрицы использовали кДНК из лимфоцитов человека и полимеразу Encyclo («Евроген», Россия). Полученные фрагменты обрабатывали рестриктазами Nde I и Hind III («Thermo Scientific», США), очищали методом электрофореза в агарозном геле и клонировали в экспрессионную плазмиду, гидролизованную теми же эндонуклеазами с помощью лигазы Т4 («Thermo Scientific», США). Для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего слитный химерный белок Н2А-ТАТ, использовали тот же Nde I-праймер, что и при клонировании гистона Н2А (см. выше) и Hind III-праймер, последовательность которого комплементарна последовательности ТАТ-фрагмента и 3’-области гистона Н2А (ACTAAGCTTCTAACGGCGACGCTGGCGACGTTTCTTACGACCGTACTTGCCCTTGGC CTTGTGG). В качестве матрицы использовали плазмиду Н2А-pET. Полученные конструкции Н2А-pET, Н2В-pET и Н2А-ТАТ-pET, несущие фрагменты генов гистонов Н2А и Н2 В человека и белка h3A-TAT (размерами 393, 390 и 435 пар нуклеотидов соответственно) под контролем раннего промотора фага Т7, секвенировали для исключения ошибок работы полимеразы.
Синтез и очистка белков. Полученными конструкциями трансформировали клетки E. coli BL21 (DE3) («Novagen», США). Синтез рекомбинантных гистонов проводили в среде LB с канамицином (30 мг/мл), для индукции синтеза добавляли изопропил-β, D-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ. Клетки собирали центрифугированием и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора («Cole-Parmer», США). Буфер для лизиса клеток: 50 мМ трис-HCl, pH 7,5; 6 M мочевина; 1 мМ ЭДТА; 0,2 М NaCl; 1 мM PMSF. Для очистки белков использовали хроматографическую систему Biologic LP («Bio-Rad», США). Очистку проводили на хроматографической колонке 200×15 мм («Whatman», Англия) с ионообменным сорбентом SP-Sepharose («GEHealthcare», Швеция), фракционирование белков проводили повышающимся линейным градиентом концентрации соли со скоростью потока 1 мл/мин. ВЭЖХ проводили с использованием колонки Supelco BIO Wide Pore C18, 5 мкм, 15×4,6 мм на HPLC-хроматографе («Pharmacia», Швеция) в градиенте концентрации водного раствора ацетонитрила в 0,1% TFA.
Анализ белков. Электрофорез проводили в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях. Белки окрашивали красителем Coomassie Brilliant Blue R-250 («Bio-Rad», США). Концентрацию белков определяли по методу Брэдфорда с реактивом Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate («Bio-Rad», США). Концентрацию белков также оценивали, измеряя оптическую плотность при 280 нм. Для расчета концентрации белков использовали коэффициенты экстинкции гистонов Н2А и Н2 В. Содержание бактериальных эндотоксинов определяли с помощью гель-тромб LAL-теста согласно протоколу производителя («Cape Cod Inc.», США).
Тест на задержку ДНК в геле. Для формирования комплексов белка с ДНК 0,2 мкг плазмиды смешивали с разным количеством гистонов в 20 мкл фосфатного буфера («DPBS, Gibco», CША). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, добавляли 6 мкл буфера для нанесения на гель (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 30% глицерина) и проводили электрофоретическое разделение в 0,7% агарозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии бромистого этидия.
Клетки. В работе использовали следующие клеточные линии человека — НТ1080 (фибросаркома), HeLa (аденокарцинома шейки матки), А431 (карцинома кожи), OSA (остеосаркома), A375 (злокачественная меланома кожи), NCI-h2299 (немелкоклеточный рак легких), NCI-h422 (бронхоальвеолярная карцинома), HepG2 (карцинома печени), Calu-1 (карцинома легкого), LUDLU-1 (плоскоклеточный рак легких), PANC-1 (карцинома поджелудочной железы), A549 (карцинома легкого), а также COS7 (клетки почек зеленой мартышки, трансформированные SV40) и линии клеток мыши C26 (химически индуцированная опухоль прямой кишки), LLC (карцинома легких Льюис), M3 (меланома Клаудмана), S37 (саркома), B16F1 (меланома). Клетки получены из коллекций ATCC или ECACC. Клетки человека и зеленой мартышки культивировали при 37 °С и 5% CO2 в среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина («Invitrogen», США). Клетки мыши культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 12,5% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина.
Трансфекцию клеток проводили в 24-луночных планшетах. За 24 ч до трансфекции рассевали по 100 000 клеток в лунку. В работе использовали плазмидный вектор pCMV-Luc («Promega», США), несущий ген люциферазы Photinus pyralis под контролем раннего промотора цитомегаловируса, концентрация 1 мкг/мл. Трансфекцию с Липофектамином 2000 («Invitrogen», США) проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Для получения комплексов гистон—ДНК смешивали 1 мкг плазмиды с разным количеством гистонов (исходная концентрация гистона2 мкг/мкл), доводили объем до 100 мкл буфером DPBS («Gibco», США), инкубировали 30 мин при комнатной температуре, добавляли 100 мкл среды OPTI-MEM («Invitrogen», США) и переносили смесь в лунки планшета. Инкубировали 3 ч при 37 °C и 5% СO2, затем трансфекционную смесь заменяли на 0,5 мл соответствующей ростовой среды без антибиотиков. Через 48 ч клетки собирали, лизировали и проводили анализ люциферазной активности с помощью набора Dual-Luciferase Reporter Assay System («Promega», США) согласно протоколу производителя. Для определения эффективности трансфекции использовали плазмидный вектор pEGFP-N1 («Clontech», США), несущий репортерный ген зеленого флюоресцентного белка под контролем раннего промотора цитомегаловируса. Трансфекцию проводили в 6-луночном планшете, аналогично описанному выше. Через 48 ч клетки собирали, промывали фосфатным буфером и анализировали на проточном цитофлуориметре.
Определение локализации плазмиды в клетке. Флюоресцентное мечение ДНК плазмиды pGFPN1 проводили с использованием набора реагентов Label IT Tracker™ Intracellular Nucleic Acid Localization Kit («Mirus», США) в соответствии с рекомендациями производителя. После трансфекции клеток линий А431 и НТ1080 с помощью Липофектамина 2000 и гистона Н2А (25:1) клетки промывали. Меченные родамином молекулы ДНК и появление зеленого флюоресцентного белка наблюдали с помощью флюоресцентного микроскопа.
Результаты и обсуждение
Получение и очистка рекомбинантных гистонов. В ходе работы были получены экспрессионные плазмидные конструкции, несущие последовательности, кодирующие полноразмерные рамки считывания генов гистонов Н2А и Н2 В, а также получена экспрессионная конструкция, кодирующая химерный белок, состоящий из гистона Н2А, слитого с ТАТ-пептидом на С-конце. При клонировании генов гистонов и химерного белка из полилинкера плазмиды pET-32a (+) удаляли фрагмент, кодирующий синтез гексагистидинового пептида, тромбина и энтерокиназы. В результате трансляции получали белки, соответствующие только аминокислотным последовательностям целевых гистонов или химерного белка. Аминокислотные последовательности полученных белков представлены на рис. 1. Рис. 1. Аминокислотная последовательность гистонов и оценка чистоты белковых препаратов. а — аминокислотная последовательность химерного белка Н2А-ТАТ. Прямым шрифтом показана последовательность гистона Н2А, жирным курсивом показана последовательность ТАТ-пептида; б — аминокислотная последовательность гистона Н2В; в — электрофореграмма гистонов после очистки ВЭЖХ. М — маркер молекулярных масс, Н2А-ТАТ — химерный белок, Н2А — гистон Н2А, Н2 В — гистон Н2 В.
Для очистки рекомбинантных гистонов и белка Н2А-ТАТ была разработана методика, позволяющая получить препараты, обедненные бактериальным эндотоксином. При используемых нами условиях индукции синтеза белка (1 мМ IPTG, 3 ч при 37 °С) было показано, что больше половины, но далеко не весь целевой белок оказывается в тельцах включения. Для того чтобы увеличить выход белкового продукта, было предложено разрушать клетки ультразвуком в присутствии 6 М мочевины, при этом практически весь белок переходил в растворимую фракцию. Подобный подход для увеличения выхода и быстрой очистки гистонов был описан ранее [30]. Разрушение комплекса положительно заряженных гистонов с бактериальным эндотоксином требует достаточно жестких условий. В работе по очистке рекомбинантного гистона Н1 от эндотоксина [29] хорошие результаты показало использование сильных кислот. Ранее для очистки коровых гистонов из тканей животных широко использовали метод экстракции гистонов из тканей раствором соляной кислоты [31]. В ходе выполнения данной работы мы использовали стадию обработки осветленного клеточного лизата соляной кислотой. Дальнейшую очистку гистоновых белков проводили с помощью ионообменной хроматографии на SP-сефарозе и ВЭЖХ. В результате была предложена следующая универсальная схема очистки белков h3A, h3B и химерного белка h3A-TAT.
1. После выращивания бактериальные клетки собирали центрифугированием и лизировали ультразвуком в присутствии 6 М мочевины, обломки клеток удаляли центрифугированием.
2. К осветленному лизату добавляли соляную кислоту до конечной концентрации 0,25 М, перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре, осадок удаляли.
3. Раствор нейтрализовали (2 М трис), разводили в 2 раза буфером для нанесения и наносили на ионообменную колонку с SP-сефарозой. Элюцию белка проводили градиентом концентрации хлористого натрия, наибольший выход гистонов наблюдался при концентрации соли 0,5 М.
4. Фракции, содержащие гистон, объединяли, добавляли 1/10 объема ацетонитрила и 1/100 объема TFA (рН образца 5,0—6,5) и наносили на колонку Supelco BIO Wide Pore C18, 5 мкм, 15×4,6 мм. Элюцию белков проводили градиентом водного раствора ацетонитрила от 10 до 80%. Выход целевых белков составлял 20—25 мг из 1 л культуральной среды.
4. Фракции, содержащие гистон, объединяли и высушивали на вакуумной центрифуге.
Сухой белок хранили при температуре –20 оС. Чистоту препаратов определяли при помощи денатурирующего гель-электpофоpеза в 15% полиакpиламидном геле c окраской гелей кумаccи R-250 (см. рис. 1). Основная полоса препаратов соответствовала по электрофоретической подвижности целевым белкам, доля примесей составляла не более 10%. Дополнительно был проведен масс-спектрометрический анализ мажорных компонент полученных белковых препаратов после трипсинолиза. Во всех случаях в гидролизатах присутствовали пептидные фрагменты, соответствующие последовательностям целевых белков.
Содержание бактериального эндотоксина в препаратах гистонов, полученных при использовании только ионообменной хроматографии и ВЭЖХ, составляло 80—200 эндотоксиновых единиц (ЭЕ) на 1 мг белка, что значительно превышало нормы для инъекции животным. Добавление к стадии обработки лизата клеток соляной кислоты позволило снизить концентрацию эндотоксинов в конечных препаратах до 1—2,5 ЭЕ/мг белка (допустимая норма содержания эндотоксина при использовании рекомбинантных лекарственных препаратов, установленная Всемирной организацией здравоохранения, ЕС и FDA до 5 ЭЕ/мг) [32, 33].
Таким образом, дополнительная стадия обработки гистоновых белков соляной кислотой позволила снизить содержание бактериального эндотоксина приблизительно в 100 раз. В результате предложенной схемы очистки получали препараты целевых белков, в которых остаточное содержание эндотоксинов позволяло использовать их для экспериментов как in vitro, так и in vivo.
Образование комплексов гистонов с плазмидной ДНК. Результаты экспериментов по торможению вхождения комплексов в агарозный гель показали, что полное связывание гистона h3A и белка h3A-ТАТ с плазмидной ДНК происходит при их весовом соотношении 2:1 (2 мкг белка на 1 мкг плазмиды). Соотношение N/P, где N — количество положительно заряженных групп в образце белка, а P — количество отрицательно заряженных фосфатных остатков ДНК, при этом составляло 1:1. Белки смешивали с ДНК в количествах, которые соответствовали соотношениям N/P 0,5, 1, 2, 3 и 4. В случае гистона h3B полное связывание плазмиды наблюдалось при весовом соотношении белок: плазмида 4:1. На рис. 2 приведены Рис. 2. Анализ связывания белков с плазмидной ДНК по задержке прохождения комплекса в агарозном геле. Пл — плазмида; БСА — смесь бычьего сывороточного альбумина и плазмиды в весовом соотношении 10:1, h3A, h3B, h3A-TAT—комплексы соответственно гистонов Н2А, Н2 В и белка Н2А-ТАТ с плазмидой в весовых соотношениях 0,5:1, 1:1, 2:1 и 4:1. результаты по образованию комплексов плазмидной ДНК с гистонами. Замена фосфатно-солевого буфера на воду увеличивала количество гистона, необходимое для образования комплекса приблизительно в 1,5—2 раза. Используемый в качестве контрольного белка бычий сывороточный альбумин (БСА), даже при большом весовом избытке белка (10:1), не образовывал комплексов с плазмидной ДНК. Было также установлено, что связывание гистоновых белков с плазмидной ДНК не зависит от типа плазмиды.
Использование гистонов для трансфекции (трансдукции) клеток плазмидной ДНК. Способность положительно заряженных белков обеспечивать доставку ДНК в клетки (трансфекцию) изучали в условиях in vitro. Плазмидную ДНК, несущую ген люциферазы светлячка (pCMV-Luc) или ген флюоресцентного белка GFP (pEGFP-N1), смешивали с исследуемыми белками в фосфатно-солевом буфере. Готовили комплексы с разным весовым соотношением белок/плазмида (w/w от 4 до 50, что соответствовало N/P от 5,0 до 25). При весовом соотношении белок: плазмида 4:1, когда по результатам торможения вхождения комплексов в агарозный гель ДНК полностью связывается белком, эффективность трансфекции была низкой. Наибольшая активность люциферазы после трансфекции наблюдалась при соотношении гистон: плазмида 25:1, что соответствовало соотношению N/P 12,5. Мы проводили трансфекцию клеток разного происхождения — 12 линий клеток человека, одной линии клеток зеленой мартышки и 5 линий клеток мыши. Активность люциферазы после трансфекции комплекса плазмиды с гистоном Н2 В в изученных клеточных линиях была низкой. Наибольший уровень активности люциферазы после трансфекции плазмиды pCMV-Luc в комплексе с гистоном Н2А наблюдался в клетках фибросаркомы человека линии НТ1080, однако даже в этом случае он составлял только 10—15% от активности люциферазы после трансфекции плазмиды с помощью липофектамина 2000. Активность люциферазы после трансфекции других линий клеток составляла 5—20% от активности люциферазы после трансфекции клеток линии HT1080. Люциферазная активность при трансфекции клеток линии HT1080 комплексом плазмиды pCMV-Luc с химерным белком Н2А-ТАТ была сравнима с получаемой при использовании гистона h3A (рис. 3). Рис. 3. Активность люциферазы после трансфекции клеток линии HT1080 комплексами плазмидой pCMV-Luc в комплексе с гистонами Н2А, h3B и белком h3A-TAT. Н2А — клетки трансфицировали комплексом плазмиды с гистоном Н2А, Н2В — клетки трансфицировали комплексом плазмиды с гистоном Н2 В, Н2А-ТАТ — клетки трансфицировали комплексом плазмиды с белком Н2А-ТАТ. Без белка — трансфекция «голой» плазмидой. Цифрами обозначены весовые соотношения конденсирующего белка и плазмидной ДНК, использованные для образования комплекса при трансфекции (10:1, 25:1, 50:1). Однако следует заметить, что если высокий уровень люциферазной активности после трансфекции комплекса гистона Н2А с плазмидой наблюдался только в клетках линии HT1080, то при использовании модифицированного гистона Н2А-ТАТ высокая люциферазная активность наблюдалась при использовании и других клеточных линий. На рис. 4 представлены Рис. 4. Активность люциферазы после трансфекции клеток линий HT1080 и С26 плазмидой pCMV-Luc в комплексе с гистоном Н2А и белком h3A-TAT. На оси абсцисс — весовые соотношения конденсирующего белка и плазмидной ДНК, использованные для образования комплекса при трансфекции (10:1, 25:1, 50:1). Для трансфекции использовали клетки линий HT1080 и C26. Н2А — клетки трансфицировали комплексом плазмиды и гистона Н2А, Н2А-ТАТ — клетки трансфицировали комплексом плазмиды и белка Н2А-ТАТ. результаты люциферазной активности после трансфекций клеток линий HT1080 и С26. Аналогичные результаты при использовании в качестве носителя белка Н2А-ТАТ были получены и при трансфекции клеток других линий, что свидетельствует об отсутствии клеточной специфичности при проникновении в клетки комплексов плазмидной ДНК и Н2А-ТАТ. При трансфекции клеток с использованием плазмидного вектора pEGFP-N1, несущего в своем составе репортерный ген зеленого флюоресцентного белка, результаты были аналогичны полученным с плазмидой pCMV-Luc. Лучший результат получили при трансфекции клеток линии НТ1080 комплексами гистона Н2А и Н2А-ТАТ с плазмидой в весовом соотношении 25:1 (N/P 12,5). Эффективность трансфекции, определяемая по числу светящихся за счет экспрессии зеленого флюоресцентного белка клеток, в обоих случаях составляла 7—15%.
Определение цитотоксичности с помощью МТТ-теста показало, что использованные белки не приводят к гибели клеток даже при добавлении в концентрациях, в 10 раз превышающих использованные при трансфекции. Длительное (в течение нескольких месяцев) хранение препаратов комплексов белок: плазмида при –20 °С и многократное их замораживание—оттаивание не приводило к снижению эффективности трансфекции.
В проведенных нами экспериментах с использованием меченных тетраметилродамином молекул ДНК было определено, что уровни проникновения плазмидной ДНК в клетки в комплексах с липофектомином 2000 и гистоном Н2А одинаковы в клетках линий А431 и HT1080. Однако наблюдаемый при этом уровень экспрессии белка GFP при трансфекции клеток с помощью липофектомина 2000 был в несколько раз выше, чем в случае использования гистона Н2А, причем уровень трансфекции с помощью гистона Н2А-клеток линии HT1080 был выше в несколько раз, чем клеток линии А431, что подтверждает полученные нами ранее результаты. Значительные различия в экспрессии репортерного белка, по-видимому, не связаны со способностью комплексов белок/ДНК проникать через клеточную мембрану, а вызваны другими причинами, требующими дальнейшего исследования. Возможно, эффективность трансфекции определяется сложностью преодоления ядерной мембраны или зависит от прочности комплекса ДНК с гистоном.
Таким образом, в ходе выполнения работы было продемонстрировано, что рекомбинантные гистоны человека Н2А, Н2 В и химерный белок Н2А-ТАТ обладают трансфицирующей активностью в комплексе с ДНК. В литературе приводятся данные о высокой эффективности разных коровых гистонов. Так, группа Балики [14, 34] показала наиболее высокую трансфекционную активность гистона Н2А, однако в работах группы Вагстаффа [19] приводятся данные о большей эффективности гистона Н2 В. В ряде работ продемонстрирована высокая эффективность использования и других коровых гистонов — Н3 и Н4 [16]. В нашей работе комплекс гистон Н2В—плазмида оказался малоэффективным при трансфекции всех исследованных линий клеток. В то же время высокая эффективность при использовании гистона Н2А наблюдалась только для клеток линии НТ1080 (фибросаркома человека). Уровень трансфекции клеток других линий человека и мыши был значительно ниже как по данным измерения свечения зеленого флюоресцентного белка, так и по результатам измерения уровня люциферазной активности. Пока неясно, с чем связана специфичность трансфекции линии клеток НТ1080. В ранее описанных экспериментах по трансфекции с гистонами эта линия клеток не использовалась и каких-либо указаний на клеточную специфичность ранее не описано. Существуют указания, что использование ТАТ-пептида в составе различных полиплексов и липосом повышает уровень трансфекции плазмидной ДНК в различные клетки [23, 35], но до настоящего времени не имелось данных об использовании химерных белков гистонов и ТАТ-пептида. Полученный нами химерный белок, состоящий из ТАТ-пептида и гистона Н2А, демонстрировал одинаково высокую трансфицирующую активность для ряда исследованных клеток, включая клетки НТ1080. Таким образом, химерный белок не проявляет специфичности в отношении клеток разного происхождения и может использоваться как универсальный трансфицирующий агент.
Хотя во всех изученных нами случаях эффективность трансфекции с использованием рекомбинантных гистонов и химерного белка Н2А-ТАТ была ниже, чем для липофектамина 2000, результаты работы свидетельствуют, что гистоны и их производные могут быть использованы для доставки препаратов в клетки млекопитающих. Использование рекомбинантных гистонов дает широкую возможность их модификаций, что может повысить их трансфицирующую активность, а предложенный способ очистки позволяет получить препараты, пригодные для экспериментов in vivo.
Работа поддержана грантом РФФИ 14−04−04589.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции: Зиновьева Марина Валерьевна (Zinovyeva Marina Valerievna); e-mail: [email protected]
Нуклеиновые странники
: 16 Авг 2012 , В поисках начала всех начал , том 45, №3Что представляют собой свободные, т. е. внеклеточные нуклеиновые кислоты? Для обитающих в почве и в морских отложениях бактерий это – источник азота и фосфора, а для инфицированной патогеном клетки – сигнал «опасность!»
Но, как было выяснено в последние десятилетия, функции и роль нуклеиновых «странников» на этом далеко не исчерпываются. И с каждым годом мы узнаем все больше об этих молекулах, которые во многом определяют функционирование биологических систем, от клетки до популяции
Нуклеиновые кислоты, ДНК и РНК, несут информацию о строении, развитии и размножении всех клеток живого организма, поэтому неудивительно, что клетки тщательно оберегают эти структуры от действия потенциально опасных внешних факторов. Так, у бактерий геномные ДНК компактно упакованы с помощью специальных белков и защищены от окружающей среды прочной клеточной стенкой; в клетках высших организмов ДНК хранится в клеточном ядре в составе сложных структур – хромосом.
Долгие годы считалось, что за пределы клетки нуклеиновые кислоты выходят лишь в случае смерти последней. Конечно, было известно, что у бактерий в ходе размножения ДНК переносится из одной клетки к другой, но и в этом случае она перемещается не свободно, а внутри специального белкового комплекса. Даже ДНК и РНК «условно живых» вирусов, представляющих собой автономные генетические программы, перемещаются во внеклеточном пространстве, упакованные в специальные транспортные структуры.
Однако исследования последних лет показали, что «свободные», т. е. внеклеточные нуклеиновые кислоты встречаются в больших количествах не только в таких природных системах, как почва, но и непосредственно в живых организмах. Какую же роль играют и какие специфические функции выполняют эти нуклеиновые кислоты, находящиеся «в свободном плавании»?
Генетическая «интервенция»?
Нуклеиновые кислоты – довольно стабильные полимерные молекулы, поэтому они могут сохраняться в естественной среде длительное время после гибели организма. Так, в костной ткани относительно длинные фрагменты ДНК остаются практически неизменными в течение десятков тысяч лет (!), что делает возможным проведение палеогенетических исследований, таких как расшифровка генома мамонта или неандертальца.
В верхнем 10-сантиметровом слое океанических донных отложений концентрация ДНК бактериального происхождения составляет около 0,5 г/м2, причем более 90 % ее является «свободной» (Dell’Anno, Danovaro, 2005). Общее же количество ДНК, ежегодно попадающее на дно океана, превышает 12 млрд т! Очевидно, что такие запасы в качестве потенциального источника азота и фосфора оказывают значительное влияние на жизнедеятельность морских микроорганизмов.
В почве, где ДНК растительного и бактериального происхождения может сохраняться месяцами и даже годами, ее концентрация достигает 2 мкг/г (Niemeyer, Gessler, 2002). Интерес к такой ДНК сегодня подогревается проблемой генетически модифицированных организмов, ведь после гибели таких растений в окружающую среду попадает рекомбинантная ДНК. Имелись опасения, что подобные «модифицированные» гены будут ассимилироваться почвенными бактериями и переноситься в другие организмы путем так называемого горизонтального переноса генов – своего рода «параллельной» эволюции, характерной для микроорганизмов. Однако прямых доказательств переноса генетической информации от генно-модифицированных растений к бактериям на сегодня нет, и вообще вероятность такого процесса в природных условиях крайне мала.
Но иногда горизонтальный перенос ДНК становится реальным источником проблем. Речь идет о бактериальных пленках (так называемых биофильмах), которые образуются на твердых поверхностях, в том числе на поверхности эндопротезов, зубов (вызывая кариес), а также на стенках бронхов при бронхитах и пневмониях.
Такие пленки состоят из размножающихся бактерий, связанных между собой и с поверхностью полимерным гидратированным веществом из смеси полисахаридов, белков, ДНК и РНК (Nishimura et al., 2003). Причем нуклеиновые кислоты появляются в межклеточном веществе биофильмов не только за счет гибели бактерий, но и в результате специального секреторного процесса, который стимулируется совместным «культивированием» различных видов бактерий (Hamilton et al., 2005). Эти ДНК могут достаточно легко переносится от одной бактерии к другой, поэтому биофильмы – настоящая головная боль терапевтов: входящие в состав пленок болезнетворные бактерии не только скрываются там от действия опасных факторов, но и успешно эволюционируют за счет генетического обмена в устойчивые (в том числе к антибиотикам) штаммы.
Что касается потребления ГМО человеком, то в наш организм ежедневно с пищей попадает значительное количество чужеродных ДНК различного происхождения. Известно, что у людей, потребляющих в пищу генно-модифицированную сою – самый распространенный трансгенный продукт, специфичный трансген успешно переваривается в желудочно-кишечном тракте (Netherwood et al., 2004).
Однако со «съеденными генами» так проиходит не всегда. Как показали исследования на лабораторных животных, фрагменты ДНК из переваренной пищи спустя двое суток после кормления могут попадать в кровь и задерживаться в клетках печени и селезенки (Hohlweg et al., 2001). Однако в клетках животных не происходит считывания соответствующей РНК и синтеза белков, кодируемых растительными генами. Это справедливо и в отношении трансгенной ДНК, что подтверждается результатами эксперимента по кормлению лабораторных мышей ГМО-продуктами в течение восьми поколений (там же).
Таким образом, непосредственной опасности, связанной с употреблением трансгенных продуктов, на сегодняшний день не выявлено. Безусловно, в процессе эволюции должны были появиться механизмы, защищающие клетки от вторжения чужеродной ДНК, столь широко распространенной в окружающей среде.
Тем не менее отношения между нами и тем, что мы едим, не так просты. Судя по результатам последних исследований, в организмах животных РНК растительного происхождения могут сохранять свою биологическую активность! Так, китайским исследователям удалось обнаружить в клетках желудочно-кишечного тракта и затем в крови лабораторной мыши и человека микроРНК из пищи (риса и растений семейства крестоцветных), причем в значительных концентрациях. Эта чужеродная микроРНК оказалась способна подавлять экспрессию одного из генов, кодирующего белок рецептора липопротеина низкой плотности (Zhang et al., 2012).
На пути агрессоров
Живые клетки не только заботливо охраняют свои генетические программы, но и активно борются с чужими. При заражении вирусами или бактериями первая реакция клетки-хозяина состоит в распознавании и уничтожении чужих нуклеиновых кислот; либо зараженная клетка включает механизмы самоликвидации, чтобы не допустить размножения инфекционных агентов в целом организме.
Система врожденного неспецифического иммунитета, которая реагирует на генетически чужеродные молекулярные субстанции, сформировалась еще на ранних этапах эволюции многоклеточных организмов. Она способна распознать «чужака» по наличию в его РНК или ДНК определенных консервативных последовательностей нуклеотидов. В ДНК бактерий такой узнаваемой последовательностью являются участки, содержащие шестизвенные кластеры цитозин–гуанин–динуклеотидов (CpG). В отличие от млекопитающих у бактерий такие последовательности не метилированы.
Когда фагоцитирующие иммунные клетки (макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы и т. д.) разрушают оболочку бактерии, неметилированные CpG становятся «видны» для толл-подобных (TLR) рецепторов фагоцитов, способных распознавать чужеродные нуклеиновые кислоты. Активация внутриклеточного рецептора TLR9 запускает цепочку молекулярных событий, определяющих дальнейшее развитие иммунной реакции. Происходит активация В- и Т-лимфоцитов, которые начинают усиленно вырабатывать специальные вещества – цитокины, координирующие развитие воспалительного процесса; усиливается продукция иммуноглобулинов (Hacker et al., 2002). И, наконец, на последнем этапе происходит выработка антител, специфичных к патогену.
При вирусной инфекции сигналом опасности для иммунной системы служит наличие характерной для вируса двуцепочечной РНК («обычная» для клетки РНК, в отличие от ДНК, состоит из одной цепочки нуклеотидов). Такая РНК либо присутствует в составе вирусных частиц, либо появляется в зараженной клетке в процессе размножения вируса.
Узнавание двуцепочечной РНК как сигнала опасности опосредуется поверхностным фагоцитарным рецептором TRL3, который и запускает сигнальный каскад, активирующий усиленный синтез противоспалительных белков-интерферонов (Yu et al., 2011). Последние, специфически связываясь с клеточными рецепторами, активируют работу определенных генов, ответственных за противовирусный ответ. Например, ген, кодирующий фермент РНК-зависимую протеинкиназу (PKR), который индуцирует апоптоз (клеточное самоубийство), либо белковый комплекс OAS/RNAseL, который угнетает процессы репликации и трансляции вирусной РНК и т. д.
В конечном итоге зараженная вирусом клетка обычно теряет способность к делению и синтезу белков, а зачастую и вовсе элиминируется из организма.
Другой типичной реакцией зараженной клетки, которая активируется проникновением вирусной двуцепочечной РНК, является РНК-интерференция – лавинообразный процесс, приводящий к расщеплению чужеродной РНК и выключению вирусных генов.
Своя рубашка ближе к телу
Все вышесказанное относилось к так называемым экзогенным нуклеиновым кислотам, чужеродным по отношению к организму. Однако достаточно давно было обнаружено присутствие в крови животных и человека, а также в тканях растений, эндогенных, т.е. собственных внеклеточных ДНК и РНК.
У высших растений внеклеточные РНК могут перемещаться между соседними клетками и транспортироваться до отдаленных органов и тканей через флоэму – проводящую сосудистую ткань, которая обеспечивает нисходящий транспорт органических веществ (продуктов фотосинтеза) из листьев к другим органам. Это было доказано в экспериментах по пересадке частей растений; был также обнаружен особый белок флоэмы, связывающий одноцепочечные РНК и способствующий их переносу как между соседними клетками, так и через фильтрующие структуры флоэмы.
В циркулирующем токе флоэмы были обнаружены матричные РНК собственных генов растения, микроРНК, малые интерферирующие РНК, а также несколько классов малых РНК с неизвестными функциями (кроме того, там присутствует большое количество экзогенной РНК — патогены, например вирусы растений, способны использовать этот путь для распространения своей генетической информации) (Lough, Lucas, 2012).
У млекопитающих внеклеточные ДНК представляют собой популяцию молекул размером от 180 до 3500 пар нуклеотидов. Один из источников их появления – клетки, разрушающиеся по механизму апоптоза или некроза (Jahr et al., 2001). Так погибают клетки опухолей, а также пострадавшие в результате травм, инфаркта миокарда, интенсивного воспалительного процесса и даже в результате интенсивной физической нагрузки.
Однако внеклеточные ДНК и РНК активно секретируются и вполне «живыми», функционирующими клетками. В том числе внеклеточная ДНК опухолевого происхождения появляется в крови на ранних этапах канцерогенеза, когда некроз и апоптоз в опухоли практически не наблюдаются. Известно, что при культивировании некоторые клетки человека (например, эндотелиоциты пупочной вены и периферические лимфоциты) секретируют ДНК в инкубационную среду (Morozkin et al., 2004). Кроме того, в процессе появления свободных нуклеиновых кислот участвуют фагоциты, которые поглощают продукты разрушения клеток, а затем повторно их секретируют уже в «переваренном» виде.
На концентрацию внеклеточных ДНК и РНК влияет работа специальных расщепляющих ферментов, которых в крови предостаточно, и ДНК спасает лишь то, что вне клеток она появляется в комплексах с белками (например, с гистонами в виде нуклеосом) либо заключенная в мембранные структуры (экзосомы, микрочастицы и апоптотические тельца) (Stroun, 2000).
МЕЖКЛЕТОЧНАЯ «ПОЧТА» Идея о том, что в пределах организма может происходить перенос наследственной информации от одних органов и тканей к другим, принадлежит великому Ч. Дарвину. Еще в 1868 г. в своем труде «Изменения домашних животных и культурных растений» он сформулировал гипотезу «пангенезиса», предположив, что все клетки «отделяют от себя крошечные геммулы, рассеянные по всему организму». Перемещаясь с током крови в половые органы, они обеспечивают появление у потомков признаков, сходных с родительскими, в том числе и благоприобретенных.Конечно же, эта гипотеза в том виде, в котором она предложена Дарвиным, была впоследствии опровергнута. Надо сказать, что и сам создатель эволюционной теории предложил теорию пангенезиса в качестве временной, требующей доработки и экспериментальной проверки. И уже через три года Ф. Гальтон, двоюродный брат Дарвина, провел серию опытов по переливанию крови от черных кроликов к светлоокрашенным, однако никакого влияния на окраску потомства не обнаружил. В конечном счете гипотеза о «пангенах» заняла свое место в бибилиотечных архивах – как тогда казалось, навсегда…
Примечательно, что в том же 1868 г. швейцарский химик Ф. Мишер выделил из клеточных ядер ранее неизвестную субстанцию, названную им «нуклеином». Труды Мишера положили начало исследованиям нуклеиновых кислот – ДНК и РНК.
Как это нередко случается в истории науки, и само представление о межклеточном переносе генетической информации, и механистическая модель геммулы, как ее носителя, оказались востребованными в современной биологии, однако эти представления легли на ставший классическим молекулярно-генетический «фундамент», который отводит роль хранителей и переносчиков генетической информации нуклеиновым кислотам.
Однако процесс «взаимопроникновения» идей пошел не сразу. С одной стороны, были открыты секретируемые клетками животных микро- и наночастицы, которые были способны «путешествовать» по организму. Однако эти исследования практически не пересекались с исследованиями внеклеточных нуклеиновых кислот, которые были обнаружены в крови и других биологических жидкостях. Например, гранулы, высвобождаемые тромбоцитами, интересовали исследователей в основном своими белками и липидами, которые непосредственно участвуют в процессе тромбообразования, а удивительно высокую стабильность РНК в плазме и сыворотке крови объясняли тем, что она циркулирует в составе фрагментов погибших клеток.
Все изменилось, когда было установлено, что мембранные частицы – микровезикулы и экзосомы, высвобождаемые одними и захватываемые другими клетками, – содержат РНК (Valadi et al., 2007). Это означало, что жизнеспособные клетки способны активно обмениваться нуклеиновыми кислотами.
Согласно современным представлениям, большинство клеток организма человека и высших животных способны секретировать мембранные частицы размером от 50 до 1000 нм. После отделения от клетки-донора они могут быть захвачены соседними клетками либо удаленными клетками-реципиентами. Клетка-донор будет распознавать направленное ей межклеточное «сообщение» по особенностям белкового и липидного состава внешней поверхности мембран частиц, которые являются своего рода «печатью отправителя» и «адресом получателя».
Исследование процессов секреции и циркуляции клеточных микро- и наночастиц сегодня одно из самых бурно развивающихся направлений биологии, причем наиболее интригующим является вопрос об информационном наполнении межклеточных сообщений и реализации его в клетках-реципиентах.
В первую очередь в содержимом экзосом/микровезикул следует отметить многообразные формы РНК: от матричной РНК, кодирующей белки, до некодирующих микроРНК. Хотя сегодня имеются данные, что на такой мРНК в клетках-реципиентах может синтезироваться белок (Valadi et al., 2007), многие детали этого процесса (в частности, эффективность синтеза белка по «чужеродной» для клетки и, скорее всего, фрагментированной РНК) вызывают у теоретиков и практиков оправданные сомнения.
С другой стороны, некодирующие РНК (в том числе и микроРНК) внутри клеток являются, прямо или косвенно, регуляторами едва ли не всех ключевых, жизненно важных клеточных процессов (при этом подобные свойства сохраняются даже у продуктов частичного гидролиза некодирующих РНК). Поэтому неудивительно, что именно с набором некодирующих РНК связывают в настоящее время основное информационное наполнение всех циркулирующих мембранных частиц.
Исследования циркулирующих в плазме крови человека РНК были начаты еще до открытия их циркуляции в составе экзосом и микровезикул (Kolodny and Culp, 1972; Stroun et al., 1978; Wieczorek et al., 1985).
В Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) исследования циркулирующих нуклеиновых кислот были инициированы в начале 2000-х гг. Вскоре удалось обнаружить свободные ДНК и РНК не только в плазме крови, но и на поверхности человеческих клеток, что дополнило представления о циркуляции нуклеиновых кислот в организме и подтвердило предположение об их взаимодействии с клетками. Было также показано, что ДНК и РНК крови представляют собой удобный материал для диагностики опухолей, а их анализ позволяет с высокой точностью не только диагностировать опухоли, но и дифференцировать злокачественные и доброкачественные новообразования (Rykova et al., 2004; Skvortsova et al., 2006; Рыкова и др., 2008).
В настоящее время для получения исчерпывающего описания всех форм РНК, которые присутствуют в плазме крови человека, в институте используются самые современные методы, включая массовое параллельное секвенирование. Это позволяет определять сотни миллионов нуклеотидных последовательностей в одном эксперименте, находить среди них десятки тысяч известных, а также открывать новые, не описанные ранее последовательности.
В лаборатории биотехнологии ИХБФМ занимаются как расшифровкой информационного контекста РНК, циркулирующих в составе экзосом и микровезикул, так и поиском новых форм регуляторных РНК, в том числе РНК-маркеров онкологических заболеваний.
С использованием технологии высокоэффективного параллельного секвенирования SOLiD удалось охарактеризовать набор форм РНК, циркулирующих в крови здоровых людей (Semenov et al., 2012). А совместно с врачами Новосибирского областного онкологического диспансера был проведен анализ циркулирующих РНК из плазмы крови пациентов с немелкоклеточным раком легкого. В результате был обнаружен ряд новых опухолевых РНК-маркеров онкологических заболеваний человека, среди которых фрагменты матричной РНК, фрагменты различных некодирующих РНК, а также новые, не описанные ранее транскрипты.
Были получены и уникальные данные, подтверждающие существенный вклад, который микровезикулы и экзосомы вносят в общий пул внеклеточных РНК, циркулирующих в крови человека.
Чтобы усовершенствовать и расширить методологию выделения и анализа внеклеточных микро- и наночастиц, в 2012 г. в ИХБФМ совместно с сотрудниками других институтов СО РАН – Института неорганической химии и Института физики полупроводников, был инициирован интеграционный проект междисциплинарных фундаментальных исследований, в рамках которого планируется решать как фундаментальные задачи, связанные с функциями экзосом и микровезикул, так и практические задачи по разработке новых подходов к диагностике и лечению заболеваний человека с использованием циркулирующих мембранных комплексов.
К. х. н. Д. В. Семенов
(Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск)
У некоторых примитивных животных, таких как паразитическая нематода C. elegans, интерферирующие РНК распространяются по всему организму за счет транспорта специальным белком sid-1 (Feinberg et al., 2003). У млекопитающих такие РНК переносятся в комплексах с белками, участвующими в РНК-интерференции, или с липопротеинами высокой плотности («хорошим холестерином») (Vickers et al., 2011). Попадая в кровь, содержащие нуклеиновые кислоты комплексы могут связываться с белками плазмы или клеток крови – эритроцитов и лейкоцитов.
Все эти структуры захватываются как близлежащими, так и сравнительно удаленными от секретирующей «родительницы» клетками. Механизмы проникновения нуклеиновых кислот в клетки до сих пор во многом остаются загадкой, так как фосфолипидные клеточные мембраны являются барьером для их пассивной диффузии внутрь клеток. Ключевую роль в этом процессе играет взаимодействие «транспортных средств» – везикул и белковых комплексов, с поверхностными белками самой клетки. (Хотя есть свидетельства, что в некоторых случаях возможно также узнавание и захват «голой» нуклеиновой кислоты).
На благо…
Внеклеточные нуклеиновые кислоты, синтезируемые в организме и участвующие в общей циркуляции (особенно это относится к РНК), играют важнейшую сигнальную роль в локальной и отдаленной регуляции развития органов и тканей, обеспечивая слаженную работу клеток в многоклеточных организмах.
Так, в экспериментах по выявлению факторов, регулирующих клеточную дифференцировку и тканевый морфогенез, были открыты РНК-белковые комплексы, названные ангиотропинами. РНК этих комплексов представляют собой высокомодифицированные короткие (длиной до 200 нуклеотидов) последовательности. Взаимодействие таких молекул с белками в присутствии ионов металлов (Cu, Ca, Na, K) приводит к образованию комплексов, которые выступают в роли противоспалительных факторов (цитокинов) и как регуляторы дифференцировки клеток, выстилающих капилляры, при формировании этих структур (Wissler, 2004).
В последние годы огромное внимание уделяется изучению микроРНК – коротких (19—24 нуклеотида) одноцепочечных или двуцепочечных («незрелая» форма) молекул, которые участвуют в подавлении экспрессии собственных генов клетки по механизму РНК-интерференции. Еще совсем недавно эту специфическую регуляцию синтеза белков было принято считать явлением локального, внутриклеточного масштаба. Однако в последние годы было показано, что активные интерферирующие микроРНК в значительных концентрациях присутствуют в общей циркуляции вопреки высокой активности внеклеточных ферментов, расщепляющих РНК.
Перенос микроРНК между клетками может способствовать формированию самых разных физиологических эффектов, от регуляции иммунного ответа до миграции клеток. У беременной женщины микроРНК, секретируемые тканями эмбриона (правда, это фактически чужеродная для организма РНК), могут участвовать в адаптации материнского организма к беременности (Mincheva-Nilsson et al., 2010), а микроРНК материнского молока, в свою очередь, – в развитии иммунной системы ребенка (Kosaka et al., 2010).
Транспортируемые в экзосомах матричные и микроРНК могут защищать клетки от апоптоза и стимулировать их деление. Как оказалось, именно этот факт объясняет благотворные эффекты инъекций стволовых клеток в поврежденные органы. Ранее считалось, что стволовые клетки дают в поврежденных органах начало новой ткани, а оказалось, что все дело в продуцируемых ими экзосомах, которые помогают выживать и размножаться собственным клеткам поврежденной ткани (Biancone et al., 2012).
Как показали эксперименты, «коктейль» из мРНК и/или микроРНК можно использовать для достижения и «обратного» эффекта: с их помощью можно получить индуцированные стволовые клетки из уже дифференцированных клеток (например, фибробластов) (Jayawardena et al., 2012).
…и во вред
Однако способ межклеточных взаимодействий путем обмена нуклеиновыми кислотами может быть использован и во вред организму. Так, клетки опухолей (например, глиобластом) активно секретируют экзосомы, содержащие микроРНК, которые влияют на клетки стенок кровеносных сосудов и способствуют успешному распространению метастазов (Skog et al., 2008). (Кстати сказать, аналогичным образом может действовать и экзогенная микроРНК: в геноме вируса Эпштейна-Барра закодированы микроРНК, которые, будучи секретируемыми в составе экзосом зараженной клеткой, проникают в окружающие клетки и нарушают экспрессию цитокина, ответственного за активацию клеточного иммунного ответа (Pegtel et al., 2010)).
И это далеко не единственный пример негативного воздействия внеклеточных нуклеиновых кислот. Так, в ряде случаев в развитии патологических процессов непосредственно участвует внеклеточная ДНК. Наиболее известная болезнь такого типа – системная красная волчанка. При этом аутоиммунном заболевании в организме появляются патогенные антитела против собственной ДНК (Rumore et al., 1990). Эти антитела образуют с внеклеточными ДНК комплексы, которые способствуют развитию воспалительных реакций. Считается, что толчком к развитию болезни могут быть нарушения механизмов, регулирующих уровень циркулирующих ДНК, поскольку у многих больных отмечено снижение активности фермента, разрушающего ДНК, и фагоцитов, ее утилизирующих (Napirei et al., 2006).
Поскольку клетки способны захватывать продукты клеточного распада, была выдвинута гипотеза о возможности ракового перерождения клеток вследствие переноса генов из опухолевых клеток, погибших в результате апоптоза. По такому механизму рак мог бы, как инфекционное заболевание, передаваться через кровь от клетки к клетке пораженного организма, формируя отдаленные и соседние метастазы.
В соответствии с этой гипотезой «генометастазов», рак распространяется в организме за счет циркуляции ДНК (или апоптотических телец), а не опухолевых клеток (Garca-Olmo et al., 2012). И хотя эта гипотеза пока не получила четкого экспериментального доказательства, полностью отвергать ее нет оснований.
Все имеющиеся на сегодня данные однозначно свидетельствуют об огромной биологической значимости внеклеточных нуклеиновых кислот. Согласно самым смелым представлениям они являются не просто сигнальными молекулами, а важным действующим звеном механизмов, работающих как на организменном, так и на популяционном и, в конечном итоге, эволюционном уровне.
Генометастазы, горизонтальный перенос генов, перепрограммирование соседних клеток, даже перенос внеклеточного «генома» в следующие поколения в обход неодарвинистских механизмов наследования – все эти на первый взгляд фантастические явления будут, безусловно, детально изучаться в ближайшее десятилетие наряду со ставшими уже традиционными исследованиями источников, причин и механизмов появления нуклеиновых кислот-«путешественников».
Литература
Черноловская Е. Л. РНК-интерференция: клин клином… // НАУКА из первых рук. 2008. № 1 (19). С. 54—59.
Rykova E. Y. et al. Cell-free and cell-bound circulating nucleic acid complexes: mechanisms of generation, concentration and content // Expert Opin Biol Ther. 2012 Suppl 1. P. 141—153.
Vlassov V. V., Pyshnyi D. V., Vorobjev P. E. Nucleic acids: structures, functions, and applications. In Handbook of nucleic acids purification, Ed. D. Liu, Boca Raton, CRC Press, 2009.
: 16 Авг 2012 , В поисках начала всех начал , том 45, №3#13 Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов
25.06.2020
Одной из базовых методик практически в любом эксперименте является выделение нуклеиновых кислот. Причем, зачастую, от качества выделенной нуклеиновой кислоты зависит успех всего дальнейшего эксперимента, поэтому к подбору реагентов для экстракции НК стоит подходить ответственно. Мы решили рассмотреть различные технологии выделения НК, их особенности, преимущества и недостатки, чтобы вы смогли подобрать идеальное решение для ваших индивидуальных задач.
Методы выделения НК, применяемые в современных коммерческих наборах
Впервые нуклеиновые кислоты были выделены швейцарским физиологом Фридрихом Мишером в 1869 году. Он изучал химический состав животных клеток и заметил, что из ядер лейкоцитов можно выделить некое неизвестное ранее вещество – «нуклеин». Позже, благодаря кислотным свойствам этого вещества, его стали называть «нуклеиновая кислота». Технология выделения НК Фридриха Мишера была очень трудоемкой, она включала много сложных этапов и занимала несколько дней.
Спустя 100 лет после открытия нуклеиновых кислот исследователи по всему миру стали широко использовать технологию фенол-хлороформного выделения.
Рис.1 Схема протокола выделения НК фенол-хлороформным методом.
В данной методике образец лизируют, а затем лизат смешивают с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом. После центрифугирования эта смесь разделяется на две фазы, причем в нижней органической фазе остаются все жиры и липиды, в интерфазе – белки, а в верхней водной фазе – нуклеиновые кислоты (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз и таким образом получают выделенные и очищенные НК.
Метод фенол-хлороформной экстракции широко распространен благодаря своей дешевизне, но он всё же уступает другим технологиям по качеству и выходу НК, а также требует сложных и длительных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать.
В 1979 году американские учёные продемонстрировали, что при определённых условиях НК способны связываться с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики, со связанными НК. Их открытие легло в основу двух технологий: выделения НК на спин-колонках и на магнитных частицах.
Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении лизированного образца на колонку и последующем центрифугировании НК остаются на кремниевой мембране колонки, а все остальные компоненты образца проходят сквозь неё (Рис.2). Затем НК можно промыть и элюировать в пробирку для сбора образца.
Рис.2 Схема протокола выделения НК на спин-колонках.
Основные преимущества метода — чистота и высокое качество выделенных нуклеиновых кислот, высокая воспроизводимость и простота по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.
Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках становится популярным более быстрый способ выделения на магнитных частицах. Технология этого способа экстракции основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы.
Рис.3 Схема протокола выделения НК на магнитных частицах.
К лизированному образцу добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания НК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).
Этот метод так же хорош, как и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не нужно сложное оборудование (например, центрифуга), а сам процесс легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой технологии.
Вы можете найти наборы для выделения НК от SkyGen у следующих брендов:
Наборы для выделения НК от компании New England Biolabs
Американская компания New England Biolabs представляет линейку наборов Monarch® для выделения и очистки нуклеиновых кислот:
|
T3010 L/S Набор Monarch® для выделения геномной ДНК |
|
|
T1030 L/S Набор Monarch® для очистки ДНК-продуктов ПЦР и ферментативных реакций |
|
|
T1020 L/S Набор Monarch® для выделения ДНК из агарозного геля |
|
|
T1010 L/S Набор Monarch® для выделения плазмидной ДНК, 20 мкг |
|
|
T2030, T2040, T2050 L/S Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов ферментативных реакций |
Все наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках и позволяют получить экстракт очень высокого качества.
Основываясь на собственном опыте и отзывах наших клиентов, мы рекомендуем использовать набор Monarch® (Т3010 L/S) для выделения геномной ДНК для дальнейшего секвенирования на платформах Oxford Nanopore Technology (MinION, GridION, PromethION).
Вы можете узнать подробнее об особенностях и преимуществах этого набора в нашем обзоре.
В каталог Продукция на сайте NEB Линейка Monarch
Видеобиблиотека Брошюра
Продукция для выделения НК от компании Analytik Jena
Все наборы для выделения НК от немецкой компании Analytik Jena основаны на технологии двойной химии (Dual Chemistry Technology, DC-Technology), которая была разработана и запатентована в 2005 году. Она основана на использовании буферов с содержанием хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой в определенной комбинации. Это позволяет НК прочнее связываться с твердой фазой, а также сокращать время выделения благодаря более эффективному лизису.
innuPREP и blackPREP — линейки наборов для выделения НК на спин-колонках из широкого спектра образцов. В линейке blackPREP представлены колонки чёрного цвета, других отличий от innuPREP у этой линейки нет.
В данных линейках представлены наборы для выделения НК из следующих типов биологических образцов:
- Кровь
- Ткани, клетки и мазки
- Бактерии
- Криминалистические образцы
- Вирусные НК из биологических жидкостей, тканей и мазков
- Растения
- Фекалии
- Образцы пищи
- Клещи
- Фрагменты хвостов грызунов
- Мазки буккального эпителия
- Парафиновые срезы = FFPE
- Гели и смеси
Для использования наборов innuPREP и blackPREP потребуется следующее оборудование:
- Дозаторы
- Вортекс
- Термошейкер
- Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)
innuSPEED – линейка наборов для выделения НК на спин-колонках из сложнолизируемых образцов. Данная панель адаптирована под этап механического лизиса на гомогенизаторе (можно заменить на вортекс) в специальных пробирках с шариками. Такие пробирки со стеклянными, керамическими или стальными шариками различного размера уже входят в состав наборов, а также их можно приобрести отдельно и комбинировать с любыми другими наборами.
Наборы innuSPEED позволяют выделять НК из следующих образцов:
- Бактерии и грибы
- Растения
- Ткани
- Почва
Для использования наборов innuSPEED потребуется следующее оборудование:
- Дозаторы
- Вортекс
- Гомогенизатор SpeedMill (или любой другой, а также можно заменить на вортекс)
- Термошейкер
- Центрифуга до 10.000 g (~ 12.000 rpm)
Наряду с DC-Technology компания Analytik Jena разработала технологию SmartExtraction, которая основана на связывании НК с частицами с особой смарт-поверхностью. Это обеспечивает более эффективное связывание высокомолекулярной ДНК, а также уменьшение стресс-факторов за счет отсутствия этапов вортексирования и центрифугирования. Методика основана на выделении НК при помощи систем дозирования жидкостей. Для экстракции используют специальные наконечники с «умными» частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе лизированного образца в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).
Рис.4 Схема протокола выделения НК при помощи технологии SmartExtraction.
Так выглядит схема автоматической экстракции, но в портфолио Analytik Jena также присутствуют два набора для ручного выделения ДНК на магнитных частицах с такой «умной» поверхностью из крови и клеток и тканей.
Каталог реагентов
При больших потоках образцов и для упрощения этапа экстракции НК можно использовать автоматические решения от Analytik Jena:
|
InnuPure C16 touch |
CyBio SELMA |
CyBio Felix |
| Предназначена для эффективной и воспроизводимой экстракции ДНК/РНК при помощи технологий выделения на магнитных частицах, а также SmartExtraction. |
Полуавтоматическая компактная дозирующая система для раскапки 96- и 384-луночных планшетов. Можно адаптировать для выделения НК. |
Автоматическая дозирующая станция с гибкой модульной системой, которую легко трансформировать под индивидуальные задачи. |
Продукция для выделения НК от компании QIAGEN
В нашем портфолио есть широкий спектр наборов для выделения НК от компании QIAGEN, причем особенность этих реагентов заключается в том, что можно подобрать набор под очень узкоспециализированную задачу в зависимости от типа выделяемой НК и биологического материала.
Такие реагенты лучше всего подойдут пользователям с нестандартными задачами, например в каталоге QIAGEN есть наборы для выделения сцДНК, митохондриальной и космидной ДНК или микроРНК.
Также есть наборы для элюции образца в очень малых объемах, для работы с архивными и сложнолизируемыми образцами, для выделения на спин-колонках, магнитных частицах или ферментативной экстракции в одной пробирке.
Подробнее изучить наборы QIAGEN вы можете в каталоге на официальном сайте.
В портфолио QIAGEN есть и автоматические станции для выделения НК:
|
|
||
|
QIAcube Connect |
QIAcube HT |
QIAsymphony |
|
|
|
Продукция для выделения НК от компании MicroGEM
Новозеландская компания MicroGEM представляет уникальную технологию ферментативного температурно-зависимого выделения НК в одной пробирке. Она начинается со смешивания буфера и особых ферментов с биологическим образцом. При последующей инкубации при 75°C протеиназы разрушают клетки и высвобождают нуклеиновые кислоты. Дальнейшее нагревание до 95°C дезактивирует протеиназы, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5).
Рис.5 Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения НК.
Эта технология очень простая и быстрая, и здесь отсутствуют потери НК, что позволяет работать даже с небольшим количеством образца. Однако, от этой технологии стоит отказаться, если для вас важна чистота выделяемой НК.
Узнать больше о данной технологии вы можете в нашем обзоре.
Наша команда научной поддержки может помочь с подбором идеального набора для ваших задач, для этого необходимо заполнить форму:
Подобрать набор
строение, функции — урок. Биология, Общие биологические закономерности (9–11 класс).
Все живые клетки содержат дезоксирибонуклеиновую и рибонуклеиновые кислоты (ДНК и РНК).
Нуклеиновые кислоты — это биополимеры, которые являются носителями генетической (наследственной) информации.
Эти вещества хранят в закодированном виде, воспроизводят и передают информацию о первичной структуре всех белков, необходимых данному организму.
Строение молекул нуклеиновых кислот
Нуклеиновые кислоты являются биологическими полимерами, состоящими из нуклеотидов.
Нуклеотид — это вещество, образованное из азотистого основания, моносахарида (пентозы) и остатка фосфорной кислоты.
В состав нуклеотидов может входить два вида пентоз — рибоза и дезоксирибоза. В РНК содержится рибоза, а в ДНК — дезоксирибоза.
Азотистых оснований обнаружено пять: аденин, тимин, цитозин, гуанин и урацил. В обеих нуклеиновых кислотах есть аденин, цитозин и гуанин. Четвёртое основание в молекулах ДНК — это тимин, а в РНК — урацил.
Рис. \(1\). Состав ДНК и РНК
Нуклеотиды соединены в цепи за счёт связей между углеводом одного нуклеотида и остатком фосфорной кислоты другого. Азотистые основания остаются сбоку от цепи.
Есть ешё одно отличие нуклеиновых кислот: молекулы РНК состоят из одной полинуклеотидной цепи, а молекулы ДНК — из двух.
Рис. \(2\). Строение ДНК
В ДНК две цепи удерживаются вместе за счёт водородных связей между нуклеотидами аденином и тимином, цитозином и гуанином. Молекулы этих оснований соответствуют друг другу по размерам и расположению атомов. Такое соответствие называют комплементарностью. Между аденином и тимином образуется две водородные связи, а между цитозином и гуанином — три.
Двойная молекула ДНК закручивается в виде спирали. Один виток спирали состоит из \(10\) нуклеотидов и имеет длину \(0,34\) нм.Обрати внимание!
Особое строение нуклеиновых кислот встречается у вирусов — у них бывают одноцепочечные ДНК и двухцепочечные РНК.
В клетках присутствует три вида молекул РНК: информационные, или матричные (иРНК, или мРНК), рибосомные (рРНК) и транспортные (тРНК). Каждый вид РНК выполняет свою функцию в процессе синтеза белка.
Нуклеиновые кислоты открыты в \(1868\) году Ф. Мишером, а пространственное строение молекулы ДНК смоделировано Дж. Уотсоном и Ф. Криком в \(1953\) г.
Источники:
Рис. 1. Состав ДНК и РНК © ЯКласс.
Рис. 2. Строение ДНК © ЯКласс.
Нуклеиновые кислоты, их строение и роль в клетке.
Нуклеиновые кислоты, их строение и роль в клетке.
Существует два вида нуклеиновых кислот: ДНК иРНК
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) — биологический полимер, состоящий из двух полинуклеотидных цепей соединенных друг с другом. Мономеры, составляющие цепи ДНК, состоят из азотистого основания (их может быть 4 вида: аденин (А), цитозин (Ц), тимин (Т), гуанин (Г)), пятиатомного углевода — дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты. В каждой цепи нуклеотиды соединяются путем об разования ковалентных связей между дезоксирибозой одного и остатком фосфорной кислоты последующего нуклеотида. Объединяются две цепи в одну молекулы при помощи водородных связей, возникающих между азотистыми основаниями, входящими в состав нуклеотидов, образующих разные цепи. Основания располагаются парами друг против друга. Спаривание происходит только между комплементарными (подходящими друг другу) основаниями: А — Т связаны двумя водородными связями, а Г — Ц — тремя. Молекула ДНК имеет форму двойной спирали, в которой полинуклетидные цепи закручены вокруг оси. ДНК обладает уникальными свойствами: способностью к самоудвоению (репликации) и способностью к самовосстановлению.
Молекула ДНК является носителем наследственной информации. Молекулы ДНК находятся в основном в ядрах клеток, также в небольшом количестве в митохондриях и хлоропластах.
РНК (рибонуклеиновая кислота’), так же как ДНК, представляет собой полимер, мономерами которого служат нуклеотиды. Нуклеотиды РНК содержат углевод — рибозу, одно из четырех азотистых оснований (аденин, гуанин, цитозин или урацил (У)) и остаток фосфорной кислоты. Таким образом, нуклеотиды ДНК и РНК различаются по составу содержащихся в них сахаров (ДНК — дезоксирибоза, РНК — рибоза) и азотистых оснований (ДНК — А, Г, Ц, Т; РНК — А, Г, Ц, У). Молекула РНК в отличие от молекулы ДНК представлена одной нитью. Различают три вида РНК.
- Рибосомная РНК (рРНК) синтезируется в ядрышке, содержится в больших и малых субчастицах рибосом. На долю рРНК приходится около 85% всей РНК клетки.
- Информационная РНК (иРНК) синтезируется в ядре при участии фермента РНК-полимеразы комплементарно одной из нитей ДНК, переносит эту информацию на рибосомы, где становится матрицей для синтеза белковой молекулы. В зависимости от объема копируемой информации молекула иРНК может иметь различную длину.
- Транспортная РНК (тРНК) содержится в основном в цитоплазме клетке. Функция состоит в переносе аминокислот в рибосомы к месту синтеза белка.
Молекулы тРНК короткие, состоят из 70—90 нуклеотидов и имеют структуру в виде «клеверного листа». В клетке имеется столько же разных тРНК, сколько кодонов шифрующих аминокислоты. На вершине «листа» каждой тРНК имеется последовательность трех нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам кодона в иРНК, их называют антикодоном. Специальный фермент опознает тРНК и присоединяет к черешку «лист» — ту аминокислоту, которая кодируется триплетом, комплементарным антикодону, затем тРНК доставляет аминокислоту к рибосомам.
Нуклеиновые кислоты, их строение и роль в клетке.
Оцените пожалуйста этот постНа этой странице искали :
- роль нуклеиновых кислот в клетке
- нуклеиновые кислоты и их роль в клетке
- нуклеиновые кислоты их строение и биологическая роль
- нуклеиновые кислоты их роль в клетке
Сохрани к себе на стену!
3.5: Нуклеиновые кислоты — Биология LibreTexts
ДНК и РНК
Двумя основными типами нуклеиновых кислот являются дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК). ДНК — это генетический материал, содержащийся во всех живых организмах, от одноклеточных бактерий до многоклеточных млекопитающих. Он обнаружен в ядре эукариот, органеллах, хлоропластах и митохондриях. У прокариот ДНК не заключена в мембранную оболочку.
Все генетическое содержимое клетки известно как ее геном, а изучение геномов — это геномика.В эукариотических клетках, но не в прокариотах, ДНК образует комплекс с гистоновыми белками с образованием хроматина, вещества эукариотических хромосом. Хромосома может содержать десятки тысяч генов. Многие гены содержат информацию для производства белковых продуктов; другие гены кодируют продукты РНК. ДНК контролирует всю клеточную активность, «включая» или «выключая» гены.
Другой тип нуклеиновой кислоты, РНК, в основном участвует в синтезе белка. Молекулы ДНК никогда не покидают ядро, а вместо этого используют посредника для связи с остальной частью клетки.Этим посредником является информационная РНК (мРНК). Другие типы РНК, такие как рРНК, тРНК и микроРНК, участвуют в синтезе белка и его регуляции.
ДНК и РНК состоят из мономеров, известных как нуклеотиды. Нуклеотиды объединяются друг с другом с образованием полинуклеотида, ДНК или РНК. Каждый нуклеотид состоит из трех компонентов: азотистого основания, пентозного (пятиуглеродного) сахара и фосфатной группы (рисунок \ (\ PageIndex {1} \)). Каждое азотистое основание в нуклеотиде присоединено к молекуле сахара, которая присоединена к одной или нескольким фосфатным группам.
Рисунок \ (\ PageIndex {1} \): Нуклеотид состоит из трех компонентов: азотистого основания, пентозного сахара и одной или нескольких фосфатных групп. Остатки углерода в пентозе пронумерованы от 1 ‘до 5’ (штрих отличает эти остатки от остатков в основании, которые пронумерованы без использования штрихового обозначения). Основание прикреплено к положению 1 ‘рибозы, а фосфат присоединено к положению 5’. Когда образуется полинуклеотид, 5′-фосфат входящего нуклеотида присоединяется к 3′-гидроксильной группе в конце растущей цепи.Два типа пентозы содержатся в нуклеотидах: дезоксирибоза (содержится в ДНК) и рибоза (содержится в РНК). Дезоксирибоза похожа по структуре на рибозу, но имеет H вместо OH в положении 2 ‘. Основания можно разделить на две категории: пурины и пиримидины. Пурины имеют двойную кольцевую структуру, а пиримидины — одинарное кольцо.Азотистые основания, важные компоненты нуклеотидов, представляют собой органические молекулы и названы так потому, что содержат углерод и азот. Они являются основаниями, потому что содержат аминогруппу, которая может связывать дополнительный водород, и, таким образом, снижает концентрацию ионов водорода в окружающей среде, делая его более основным.Каждый нуклеотид в ДНК содержит одно из четырех возможных азотистых оснований: аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) и тимин (T).
Аденин и гуанин относятся к пуринам. Первичная структура пурина — это два углеродно-азотных кольца. Цитозин, тимин и урацил классифицируются как пиримидины, которые имеют одно углеродно-азотное кольцо в качестве первичной структуры (рисунок \ (\ PageIndex {1} \)). К каждому из этих основных углеродно-азотных колец присоединены разные функциональные группы. В сокращении молекулярной биологии азотистые основания обозначаются просто символами A, T, G, C и U.ДНК содержит A, T, G и C, тогда как РНК содержит A, U, G и C.
Пентозный сахар в ДНК — это дезоксирибоза, а в РНК — это рибоза (рисунок \ (\ PageIndex {1} \)). Разница между сахарами заключается в наличии гидроксильной группы на втором углероде рибозы и водорода на втором углероде дезоксирибозы. Атомы углерода молекулы сахара пронумерованы как 1 ‘, 2’, 3 ‘, 4’ и 5 ‘(1′ читается как «один штрих»). Фосфатный остаток присоединен к гидроксильной группе 5′-углерода одного сахара и гидроксильной группе 3′-углерода сахара следующего нуклеотида, что образует 5′-3’-фосфодиэфирную связь.Фосфодиэфирная связь не образуется простой реакцией дегидратации, как другие связи, соединяющие мономеры в макромолекулах: ее образование включает удаление двух фосфатных групп. Полинуклеотид может иметь тысячи таких фосфодиэфирных связей.
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Обзор взаимодействий белок-нуклеиновая кислота | Thermo Fisher Scientific
В конце 19 века ученые под микроскопом наблюдали ассоциацию белков с цепями ДНК. С тех пор исследователи использовали множество анализов in vitro и in vivo, чтобы продемонстрировать, что белки взаимодействуют с ДНК и РНК, влияя на структуру и функцию соответствующей нуклеиновой кислоты.Выяснение роли, которую комплексы белок-нуклеиновая кислота играют в регуляции транскрипции, трансляции, репликации ДНК, репарации и рекомбинации, процессинга и транслокации РНК, продолжает революционизировать наше понимание клеточной биологии, нормального развития клеток и механизмов заболеваний. Эта статья представляет собой введение в некоторые из ключевых методов, используемых для изучения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота.
Просмотреть все продукты взаимодействия белок-нуклеиновая кислота
Просмотреть и выбрать продукты
Введение во взаимодействия белок-нуклеиновая кислота
Белки взаимодействуют с ДНК и РНК посредством сходных физических сил, которые включают электростатические взаимодействия (солевые мостики), диполярные взаимодействия (водородные связи, Н-связи), энтропийные эффекты (гидрофобные взаимодействия) и дисперсионные силы (укладка оснований).Эти силы в разной степени способствуют связыванию белков последовательным (плотным) или неспецифическим (свободным) образом. Например, специфические взаимодействия белок-ДНК обычно опосредуются мотивом α-спирали в белке, который вставляется в большую бороздку ДНК, узнавая и взаимодействуя с конкретной последовательностью оснований через Н-связи и солевые мостики. Кроме того, сродство и специфичность конкретного взаимодействия белок-нуклеиновая кислота могут быть увеличены за счет олигомеризации белков или образования мультибелковых комплексов (например,g., GCN4, рецептор глюкокортикоидов, комплексы инициации транскрипции, комплексы сплайсинга мРНК, RISC и т. д.). Вторичная и третичная структура, образованная последовательностями нуклеиновых кислот (особенно в РНК), обеспечивает важный дополнительный механизм, с помощью которого белки распознают и связывают определенные последовательности нуклеиновых кислот.
Примечание по применению: анализ андроген-зависимой и независимой регуляции транскрипционной активности
В этом примечании к применению описывается использование анализа иммунопреципитации хроматина (ChIP) для мониторинга взаимодействия между рецептором андрогенов (AR) и элементами андрогенного ответа (ARE) в ДНК.Клеточную линию рака предстательной железы LNcaP подвергали действию тестостерона и использовали набор Thermo Scientific Pierce Magnetic ChIP Kit с антителом против AR с последующей количественной ПЦР. На рисунке слева показаны изменения связывания AR с известными ARE (PSA, CDKN1A, FKBP5, TMPRSS2 и IGF-1) с 300-кратным изменением ARE FKBP5 через 30 минут после лечения. Этот набор позволяет эффективно изолировать связанную с хроматином ДНК с помощью иммунопреципитации примерно за 8 часов с использованием всего 10 000 клеток.
Перейти к примечанию по применению
Справочник по взаимодействию белков
В нашем 72-страничном техническом справочнике по взаимодействию с белками представлены протоколы, а также техническая информация и информация о продукте, чтобы помочь максимизировать результаты исследований взаимодействия с белками.В справочнике представлены общие сведения, полезные советы и рекомендации по поиску и устранению неисправностей для тестов иммунопреципитации и коиммунопреципитации, анализов с понижением, дальнего вестерн-блоттинга и кросслинкинга. В справочнике также есть расширенный раздел о методах изучения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота, включая ChIP, EMSA и РНК EMSA. Справочник является важным ресурсом для любой лаборатории, изучающей взаимодействия белков.
Содержание включает: Введение в белковые взаимодействия, анализы коиммунопреципитации, анализы Pull-down, дальневестерн-блоттинг, картирование взаимодействия белков, двухгибридные репортерные анализы дрожжей, анализы сдвига электрофоретической подвижности [EMSA], анализы иммунопреципитации хроматина (ChIP) , Конъюгаты белок-нуклеиновая кислота и др.
Справочник по взаимодействию с белками
Домены, связывающие нуклеиновые кислоты
ДНК- или РНК-связывающая функция белка локализована в дискретных консервативных доменах в его третичной структуре. Отдельный белок может иметь несколько повторов одного и того же связывающего домена нуклеиновой кислоты или может иметь несколько разных доменов, обнаруженных в его структуре. Идентичность отдельных доменов и их относительное расположение функционально важны внутри белка.Несколько общих ДНК-связывающих доменов включают цинковые пальцы, спираль-поворот-спираль, спираль-петлю-спираль, крылатую спираль и лейциновую молнию. Специфичность и функция связывания РНК представлены доменами «цинковый палец», KH, S1, PAZ, PUF, PIWI и RRM (мотив узнавания РНК). Множественные связывающие нуклеиновые кислоты домены с одним белком могут увеличивать специфичность и сродство белка к определенным последовательностям нуклеиновых кислот-мишеней, опосредовать изменение топологии целевой нуклеиновой кислоты, правильно позиционировать другие последовательности нуклеиновых кислот для распознавания или регулировать активность ферментативных домены в связывающем белке.
Сложные взаимодействия
Белки могут связываться с нуклеиновой кислотой напрямую или опосредованно через другие связанные белки, эффективно создавая иерархию взаимодействий. Сила этих взаимодействий влияет на то, какие анализы или подходы лучше всего подходят для изучения сборки комплекса. Некоторые из этих взаимодействий являются временными и требуют стабилизации путем химического сшивания перед выделением комплексов. Понимание того, как белки взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, определение того, какие белки присутствуют в этих комплексах белок-нуклеиновая кислота и идентификация последовательности / структуры нуклеиновой кислоты, необходимой для сборки этих комплексов, жизненно важно для понимания роли, которую эти комплексы играют в регуляции клеточных процессов.
Взаимодействие белок-ДНК
Общие ДНК-связывающие домены, спираль-поворот-спираль и домены с цинковыми пальцами включены в многочисленные ДНК-связывающие белки, экспрессируемые в клетке. Специфичность проистекает из взаимодействий более высокого порядка с участием комплексов нуклеопротеидов. Эти ДНК-связывающие белковые комплексы находят свою цель, «скользя» по геномной ДНК до тех пор, пока не будет обнаружен их специфический сайт стыковки с ДНК. Связывание белка с ДНК контролирует структуру геномной ДНК (хроматина), транскрипцию РНК и механизмы восстановления ДНК.В следующем примере показано, как магнитные шарики Invitrogen Dynabeads можно использовать для восстановления белков, которые связываются с нуклеиновыми кислотами.
Выделение ДНК- и РНК-связывающих белков. ДНК- и РНК-связывающие белки могут быть выделены с использованием стрептавидина Invitrogen Dynabeads M-280. Сначала меченную биотином последовательность ДНК / РНК-мишень иммобилизуют на стрептавидиновых гранулах. Затем их инкубируют с белковым экстрактом, и связанные белки выделяют с помощью магнитной сепарации.Затем белок может быть элюирован для характеристики. Эти шарики имеют низкое неспецифическое связывание белков и идеально подходят для выделения РНК- и ДНК-связывающих белков.Хромосомы
Основная функция взаимодействий белок-ДНК — управлять большой длиной генетического материала, содержащегося в каждой клетке. Хромосомы эволюционировали для упаковки, хранения и перемещения ДНК по клетке, но они также играют роль в регуляции транскрипции. Ремоделирование хромосомы позволяет раскрыть селективные части хромосомы, чтобы ДНК была доступна для транскрипции генов, или чтобы она оставалась плотно упакованной, так что транскрипция кодируемых генов полностью подавляется.
Транскрипционная регуляция
После раскрытия геномная ДНК может быть расшифрована; однако не все последовательности ДНК кодируют белки. Только гены транскрибируются для производства РНК, а последовательности между генами (и внутри) служат для регулирования транскрипции посредством связывания с белками. Эти последовательности важны для контроля транскрипции, и они содержат промоторы, энхансеры, инсуляторы и спейсеры. Последовательности энхансеров, которые могут находиться на расстоянии многих килобаз от места старта гена, связывают белки и действуют как маяки, привлекающие механизмы транскрипции.Транскрипция гена инициируется, когда белки факторов транскрипции связываются со специфическими последовательностями промотора ДНК, расположенными непосредственно рядом с сайтом начала транскрипции гена. Это взаимодействие облегчается за счет ДНК-связывающего домена (ов) фактора транскрипции. Посредством белковых взаимодействий домен трансактивации фактора транскрипции облегчает связывание и локализацию холофермента РНК-полимеразы II на промоторе гена, чтобы инициировать производство матричной РНК (мРНК)
Белок-РНК взаимодействия
Белки взаимодействуют с РНК, чтобы сращивать, защищать, транслировать или ухудшать сообщения.Первое взаимодействие происходит сразу после инициации транскрипции, когда комплемент к промоторной последовательности отщепляется от мРНК и механизм кэпирования включает кэп «GpppN» на 5′-конце мРНК. Это приводит к привлечению факторов элонгации, которые регулируют сброс транскрипции мРНК. За удлинением следует процессинг 3′-конца и сплайсинг, в результате чего получается зрелый транскрипт РНК, который экспортируется в цитоплазму для трансляции. Все эти процессы требуют значительных белок-РНК-взаимодействий, они строго регулируются и сложны.Многие из регуляторных элементов этого процесса находятся в некодирующих 3 ‘и 5’ нетранслируемых областях (UTR) мРНК. Однако регуляторные микроРНК (miRNA) также встречаются в кодирующих областях интронов, а также в экзонах, некодирующих генах и повторяющихся элементах. В последние годы повышенное внимание уделяется важности этих некодирующих последовательностей РНК и их роли в клеточной регуляции и болезненных состояниях. Однако инструменты для изучения критических взаимодействий белок-РНК ограничены.Данные, представленные в этом примере, были получены с помощью эксперимента по удалению РНК-белок с использованием набора Thermo Scientific Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down.
РНК-протеиновый эксперимент. Связывание 3’-UTR РНК дикого типа и мутантного рецептора андрогена с белками HuR и Poly (C) BP анализировали с использованием набора Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit. Образцы нормализовали по объему. L = загрузка лизата, FT = проточный, E = элюат. Этот набор обеспечивает надежный метод улучшения взаимодействия белок-РНК.
5 ‘и 3’ UTR
UTR-области мРНК содержат элементы последовательности, которые привлекают РНК-связывающие белки для посттранскрипционной регуляции и трансляции белков. Кроме того, эти элементы способствуют стабильности или деградации транскрипта и могут управлять субклеточной локализацией РНК. Эти регуляторные элементы РНК различаются по длине, но для связывания с белками они зависят как от первичной, так и от вторичной структуры. Например, регуляция железа в клетке — это строго регулируемый процесс, в котором взаимодействие белок-РНК является ключевым для поддержания гомеостаза железа.Гены-мишени, такие как ферритин запасного белка железа или рецептор трансферрина, содержат небольшой (~ 28 нуклеотидов) консенсусный железо-чувствительный элемент (IRE) в их соответствующих 5 ‘или 3’ UTR. Белок, реагирующий на железо (IRP), реагирует на состояние клеточного железа связыванием элемента IRE. В условиях недостатка железа IRP остается связанным с элементом IRE, подавляя трансляцию запасных белков железа. В условиях, богатых железом, IRE-связывающая активность IRP теряется, а запасные белки железа транслируются.Многие из этих элементов консенсуса РНК были идентифицированы и классифицированы в различные семейства на основе последовательности и функции. 3 ‘UTR также содержит элементы распознавания для miRNA, которые отвечают за репрессию трансляции белка кодирующей мРНК.
МикроРНК
MicroRNAs (miRNAs) представляют собой большой и повсеместный класс некодирующих РНК, которые регулируют посттранскрипционное молчание мРНК-мишени. В геноме человека идентифицировано более 700 miRNA. МикроРНК имеют последовательности узнавания связывания в 57.8% мРНК человека, при этом 72% мРНК содержат несколько сайтов узнавания миРНК. MiRNA начинается с 70–100-нуклеотидной транскрибируемой РНК (pre-miRNA), содержащей затравочную область из 6-8 нуклеотидов на 5′-конце для связывания мРНК. Затем миРНК расщепляется DROSHA, ядерной эндорибонуклеазой III. Затем пре-miRNA связывается с двухцепочечными РНК-связывающими белками и активно экспортируется в цитоплазму, в зависимости от Exportin 5 и Ran GTPase. Пре-миРНК затем подвергается дальнейшему процессингу в комплексе рибонуклеопротеидов (РНП), состоящем из белков Argonaute и Dicer (эндорибонуклеаза III), который расщепляет пре-миРНК до зрелой миРНК из 19–22 нуклеотидов.Комплекс miRNA-Argonaute затем связывается с генами-мишенями и привлекает дополнительные неидентифицированные белки для регуляции генов-мишеней.
регуляция мРНК
В большинстве случаев регуляция мРНК приводит к репрессии трансляции за счет деградации, деаденилирования или хранения мРНК в тельцах, обрабатывающих мРНК цитоплазмы (P-тельца), но трансляция мРНК также может повышаться. Было предложено несколько моделей репрессии и деградации мРНК, но единственная принятая модель еще не принята.Исследования микроРНК быстро расширяются, и ключевые взаимодействия белок-РНК изучаются для дальнейшего понимания роли miRNA в росте, дифференцировке и канцерогенезе клеток.
- Хендриксон В. (1985) BioTechniques 3: 346–354.
- Evertts AGet al. (2010) Современные подходы к исследованию эпигенетических сигнальных путей. J Appl Physiol 28 января ePub перед печатью.
- Жорж А.Б. и др. (2010) Общие сайты связывания, денерические ДНК-связывающие домены: откуда происходит распознавание специфического промотора? FASEB Journal 24: 346–356.
- Lunde B и др. (2007) РНК-связывающие белки: модульный дизайн для эффективного функционирования. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 479–490.
Доставка нуклеиновых кислот в клетки
1 января 2014 г. (том 34, № 1)
Кэти Лишевски
Независимо от того, выясняет ли кто биологические механизмы, исправляет дефектный ген или модулирует экспрессию гена, искусственное введение нуклеиновых кислот в клетки требует эффективного и нетоксичного метода доставки.
Трансфекция (помещение нуклеиновых кислот в клетки невирусными методами) и трансдукция (с использованием вирусных векторов) являются основными инструментами для доставки полезной нагрузки в интересующую клетку.
На недавнем заседании Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) исследователи описали передовые подходы к доставке товаров, таких как липид-опосредованное короткое интерферирование (siRNA) мРНК, специально созданные вирусные наноматериалы и инженерные решения. листы стволовых клеток для трансплантации роговицы.
По словам Альфреда Левина, доктора философии, профессора молекулярной генетики и микробиологии Медицинского колледжа Университета Флориды,некодирующих РНК (нкРНК) достигли своего рода статуса суперзвезды в области генетики и молекулярной биологии. Молекулы РНК не кодируют белки или стабильные РНК, такие как рибосомная РНК или транспортная РНК. Скорее, они влияют на транскрипцию и трансляцию информационной РНК.
«Наша лаборатория заинтересована в использовании нкРНК, таких как миРНК и рибозимы, для регулирования экспрессии генов в качестве лечения доминантно наследуемых заболеваний, таких как пигментный ретинит, и вирусных инфекций.”
Лаборатория доктора Левина провела исследования трансфекции миРНК с целью нокдауна матричной РНК для CNGB1, которая кодирует субъединицу циклического GMP-закрытого канала в палочковидных фоторецепторных клетках сетчатки. «Наша конечная цель — использовать модель пигментного ретинита на мышах и оценить, снизит ли нокдаун CNGB1 или другого белка, трансдуцина, их дегенерацию и сохранит функцию соседних фоторецепторов колбочек.
«Мы проверили, могут ли siRNA для CNGB1 подавить функцию in situ, используя легко трансфицируемые клетки линии клеток человека HEK293.Мы котрансфицировали две плазмиды, одну с мРНК для CNGB1, меченную люциферазой, и одну с соответствующей миРНК, предназначенной для подавления экспрессии CNGB1. Мы использовали различные соотношения обоих веществ вместе с липофектамином 2000 (Life Technologies), реагентом для трансфекции, опосредованным липидами. Показания были снижены активность люциферазы ».
По словам доктора Левина, трансфекция на основе липидов позволяет использовать простые, эффективные и малотоксичные средства для котрансфекции в различные клетки. Катионные липиды — это амфифильные молекулы с положительно заряженными полярными головными группами, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатами ДНК.
«Трансфекция в культивируемые клетки позволяет нам проводить скрининг различных siRNA, чтобы найти те, которые будут эффективно расщеплять мишень», — отметил д-р Левин. «Обладая этими данными, мы можем выбрать лучшую миРНК для последующей работы с животными. Затем мы будем использовать вирусные векторы в модели мышей на основе того, что мы обнаружили в системе культивирования клеток ».
Исследователи изучают возможность использования липид-опосредованной siRNA нокдауна мРНК и специально созданных вирусных наноматериалов в качестве двух многообещающих методов доставки нуклеиновых кислот в клетки.[Biogeek / iStock Photo]
Наночастицы, созданные на основе вирусов
Опираясь на 50-летние исследования вируса гриппа, исследователи в настоящее время оценивают его и используют для вирусной доставки терапевтических нагрузок. «Мы можем восстановить вирус гриппа с нуля», — заметил Бенджамин тенОвер, доктор философии, профессор микробиологии Медицинской школы Икана на горе Синай. «Мы рассматриваем вирусы как наноматериал, который можно создать для доставки груза в клетку, не вызывая болезни.
«Вирус гриппа A (IAV) состоит из восьми вирусных сегментов, кодирующих только десять основных белков. Устраняя два сегмента, мы делаем его неинфекционным и способным доставлять как кодирующие, так и некодирующие РНК, тем самым создавая индивидуальный терапевтический препарат, специально разработанный для удовлетворения медицинских потребностей ».
В недавнем исследовании векторная система доктора тенОВера на основе IAV была сконструирована для доставки микроРНК для лечения глаукомы. Это исследование, которое возглавил доктор философии Педро Гонсалес.D., доцент офтальмологии и патологии в Университете Дьюка, в конечном итоге оценил, насколько хорошо система обеспечивает доставку in vivo. «МикроРНК могут помочь в лечении глаукомы», — сказал д-р Гонсалес. «Тем не менее, безопасная и эффективная доставка в глазную сеть клеток является серьезной проблемой».
Разработанная система IAV, нагруженная микроРНК, была оценена на первичных культурах клеток трабекулярной сети человека и продемонстрировала надежную доставку с помощью кПЦР, гибридизации РНК in situ и нозерн-блоттинга.Система также показала успешную доставку in vivo после интравитреальной инъекции в глаз.
«В целом этот подход обеспечивает универсальное терапевтическое средство на основе вирусов, которое может временно доставлять малые РНК к желаемой ткани», — заметил д-р Гонсалес. «Это обеспечивает средство для неотложного лечения, поскольку генетический материал (РНК) не включен в геном хозяина. Мы можем представить себе множество других приложений для этой технологии, поскольку доставка может быть достигнута для широкого диапазона тканей, но она особенно хорошо подходит для разработки терапевтических средств против других вирусов, таких как Эбола, SARS или даже IAV.”
«Эта технология может быть нацелена на эндогенные пути, такие как путь апоптоза, для повышения эффективности лечения рака на основе вирусов», — добавил д-р Гонсалес. «Мы с энтузиазмом относимся к этой новой платформе доставки РНК и искренне надеемся увидеть ее применение в терапии будущего».
РНК гибридизация эпителия дыхательных путей in situ. На рисунке показано наложение ядер клеток (синий), цитоплазмы (красный) и доставки небольшой РНК, опосредованной РНК-вирусом (зеленый / желтый).[Mt. Синай]
Гибридные полимерные полиплексы
Хотя вирусные векторы можно успешно использовать для включения генов, они ограничены рядом ограничений. «Успешная глазная генная терапия требует эффективного переноса генов и стабильной экспрессии трансгена, но может быть ограничена размером гена», — сказал Дэниел Чанг, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Медицинской школы Перельмана при Университете Пенсильвании.
«Наша цель состояла в том, чтобы стабильно экспрессировать большой ген дегенерации сетчатки с помощью многообещающей технологии, которая использует сайт-специфическую рекомбиназу, интегразу фага phiC31 и наночастицы хитозана для переноса гена в культивируемые клетки.Хитозан — это модифицированный углеводный полимер хитина, природного биополимера, получаемого из панцирей ракообразных, таких как крабы и омары.
При выполнении этой работы д-р Чанг сотрудничал с доктором наук Габриэлой Сильвой и докторантом Анной В. Оливьера, оба из отдела биомедицинских наук Университета Алгарве, Фару. Группа разработала плазмидные конструкции, которые несли полноразмерную кДНК для гена центросомного белка 290 (CEP290), большого трансгена 8,2, ответственного за врожденный амавроз Лебера 10 типа, заболевание сетчатки.Исследователи также добавили сайт прикрепления интегразы и маркерный ген.
«Мы обнаружили устойчивую экспрессию гена с использованием вестерн-блоттинга и флуоресцентной микроскопии в течение до 14 недель с маркером и более 6 недель с геном большой дегенерации сетчатки CEP290», — сказал д-р Чанг. «Мы также определили, что на эффективность трансфекции и экспрессию трансгена влияет размер полимера и тип используемого полиплекса».
Принимая во внимание влияние этих результатов, д-р.Чанг отметил: «Этот метод трансфекции преодолевает несколько проблем, связанных с традиционной аденоассоциированной вирусопосредованной доставкой генов. Комбинированная стратегия использования полимеров и интегразы более эффективна, чем неинтегративные стратегии. Мы можем существенно преодолеть недостатки в размере, потому что даже большие гены можно легко упаковать ».
«Поскольку мы используем сайт-специфичную интегразу, мы можем избежать случайной интеграции в геном хозяина, что в прошлом вызывало значительную заболеваемость и смертность в испытаниях генной терапии», — добавил д-р.Чанг. «Еще одно преимущество заключается в том, что этот метод нетоксичен и неиммуногенен».
Следующим шагом группы будут исследования на модели in vivo. «Мы будем оценивать систему на трансгенных мышах, а также продолжим разработку и оценку различных комбинаций полиплексов хитозана».
Таблицы инженерных ячеек
За последние пять лет в трансплантации роговицы произошли значительные улучшения. Клетки или, скорее, листы стволовых клеток можно выращивать и размножать в культуре и трансплантировать в глаз человека.Но одним из осложнений трансплантации может стать рост новых кровеносных сосудов. «Роговица должна оставаться чистой и противостоять непреднамеренной васкуляризации», — отметил Марк И. Розенблатт, доктор медицинских наук, доцент офтальмологии Медицинского колледжа Вейля Корнелла.
Наличие или активация ангиогенных белков, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), иногда может приводить к пролиферации клеток крови и последующей потере зрения. Группа доктора Розенблатта изучила перенос гена ex vivo растворимой версии рецептора VEGF (sFlt1), интегрированной в лентивирусный вектор для реконструкции поверхности глаза.
«Мы клонировали sFlt1 мыши в лентивирус и подготовили вирусный исходный материал, который использовали для трансдукции первичных эпителиальных клеток роговицы кролика (RCEC)», — прокомментировал д-р Розенблатт. «SFlt1, по сути, служит приемником-ловушкой. Мы проанализировали экспрессию с помощью qRT-PCR и обнаружили высокий уровень экспрессии мРНК sFlt1 мыши в трансдуцированных RCEC. Кроме того, белок sFlt1 был обнаружен с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания в цитоплазме и с помощью ELISA на срок до одной недели ».
Лентивирусы — это ретровирусы, которые могут стабильно доставлять высокую нагрузку вирусной РНК в геном клеток-хозяев.Они обладают уникальной способностью инфицировать неделящиеся клетки, что делает их одним из самых эффективных методов доставки генов. Также они обладают низкой иммуногенностью.
«Мы узнали несколько вещей из наших предварительных исследований», — заключил д-р Розенблатт. «Во-первых, мы можем использовать лентивирусную систему для высокого уровня экспрессии антиангиогенного гена, который стабильно встраивается в геном сконструированных клеток. Во-вторых, эффективность очень высока — часто невозможно достичь этого уровня экспрессии без вирусных систем.В-третьих, эффективная стратегия заключается в использовании культуры ткани в качестве модельной системы, проверяющей наличие устойчивой экспрессии, перед воздействием на клетки различными способами для проверки антиангиогенного эффекта ».
По мере решения проблем доставки и решения других проблем генетически модифицированные, культивируемые трансплантаты эпителиальных стволовых клеток могут стать основой повседневной генной терапии роговицы ex vivo для лечения различных заболеваний роговицы.
Как справиться с трудно трансфектируемыми клетками
Обилие вариантов трансфекции должно быть обнадеживающим, особенно для исследователей, работающих с трудно трансфицируемыми клетками.Однако перспектива фактического скрининга любого значительного числа вариантов трансфекции может заставить любого исследователя задуматься. Даже исследователи, которые ограничивают свои возможности трансфекции химическими методами, то есть трансфекцией с помощью реагентов на основе липидов или полимеров, могут чувствовать себя подавленными или, по крайней мере, раздраженными из-за того, что им приходится выполнять относительно простую, но трудоемкую работу.
К сожалению, трансфекция — это не совсем наука. Обычно невозможно предсказать лучший набор условий трансфекции.Тщательный осмотр конструкций не помогает. И копаться в литературе тоже не поможет. Сообщений, сравнивающих различные условия трансфекции для определенных типов клеток, немного, и они очень редки.
Однако может быть полезно обратиться за помощью к специалисту или в таможенные службы. Например, Mirus Bio предоставляет специальные услуги. Еще в 2008 году терапевтическое подразделение Mirus Bio было приобретено Hoffmann-La Roche. Однако подразделение исследовательских инструментов компании остается независимым лицом и продолжает два десятилетия исследований невирусной генной терапии.
«В течение некоторого времени не хватало серьезных достижений в технологии доставки генов», — сказал Скотт Хейс, доктор философии, вице-президент Mirus Bio. «В результате исследователи все чаще прибегают к вирусным технологиям или технологиям физического разрушения, чтобы облегчить поглощение нуклеиновых кислот в клетках, которые трудно трансфицировать, несмотря на ограничения, присущие каждому из этих методов».
Одна из целей Mirus Bio — помочь исследователям избежать излишне жестких методов трансфекции. Еще в июне 2013 года, представляя динамическую систему доставки Trans IT-X2, полимерную систему для доставки нуклеиновых кислот, Dr.Хейс заявил: «Эта система обеспечивает превосходную доставку плазмидной ДНК и миРНК в широкий спектр типов клеток. Мы считаем, что эта технология обеспечивает явные преимущества по сравнению с другими средствами трансфекции и открывает новые возможности для экспериментального дизайна ».
Специальная услугаMirus Bio, помимо предложений по трансфекции пДНК, мРНК и миРНК / миРНК, сосредоточена на разработке реагентов для трансфекции и маркировке нуклеиновых кислот. Что касается разработки реагентов, Mirus Bio может производить скрининг, упорядочивая липиды / реагенты в соответствии с их люциферазной активностью после трансфекции.Что касается мечения, Mirus Bio использует метод неферментативного химического мечения, который облегчает прямое ковалентное присоединение флуоресцентных или нефлуоресцентных меток к нуклеиновым кислотам посредством одностадийной химической реакции. Mirus Bio поддерживает такие приложения, как FISH, микроматрицы и визуализация нуклеиновых кислот как in vitro, так и in vivo.
Клетки HEK 293, стабильно экспрессирующие eGFP, получали посредством временной трансфекции с использованием реагента для трансфекции Mirus Bio’s Trans IT-2020 с векторами плазмидной ДНК eGFP и неомицина.
3.7 нуклеиновых кислот — биология человека
Создал: CK-12 / Адаптировал Кристин Миллер
Рис. 3.7.1 Однояйцевые близнецы ясно показывают важность генов в создании нас такими, какие мы есть. Гены были бы невозможны без нуклеиновых кислот.
Нуклеиновые кислоты — это класс биохимических соединений, который включает ДНК и РНК. Эти молекулы состоят из небольших мономеров, называемых нуклеотидами . Многие нуклеотиды связываются вместе, образуя цепь, называемую полинуклеотидом.Нуклеиновая кислота , ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) состоит из двух полинуклеотидных цепей или нитей. Таким образом, ДНК иногда называют двухцепочечной. Нуклеиновая кислота РНК (рибонуклеиновая кислота) состоит только из одной полинуклеотидной цепи или цепи, поэтому РНК иногда называют одноцепочечной.
Каждый нуклеотид состоит из трех меньших молекул:
- Молекула сахара (дезоксирибоза сахара в ДНК и рибоза сахара в РНК)
- Фосфатная группа
- Азотная основа
Азотистые основания нуклеиновой кислоты выступают из остова.Существует четыре различных азотистых основания: цитозин, аденин, гуанин и тимин (в ДНК) или урацил (в РНК). В ДНК связи образуются между основаниями двух нуклеотидных цепей и удерживают цепи вместе. Каждый тип оснований связывается только с одним другим типом оснований: цитозин всегда связывается с гуанином, а аденин всегда связывается с тимином. Эти пары оснований называются дополнительными основаниями парами .
Рис. 3.7.2 Короткий участок ДНК, показывающий комплементарное спаривание оснований.Как вы можете видеть на рисунке 3.7.2, сахара и фосфатные группы составляют основу полинуклеотидной цепи. Водородные связи между комплементарными основаниями удерживают две полинуклеотидные цепи вместе.
Рис. 3.7.3 ДНК — это полимер, состоящий из множества мономеров, называемых нуклеотидами. ДНК несет все инструкции, необходимые клетке для метаболизма.Связывание комплементарных оснований заставляет молекулы ДНК автоматически принимать свою хорошо известную форму двойной спирали , которая показана на анимации на рисунке 3.7.3. Двойная спираль похожа на винтовую лестницу. Он образуется естественным путем и очень прочен, что затрудняет разрыв двух полинуклеотидных цепей.
молекула ДНК. Водородные связи между комплементарными основаниями помогают формировать двойную спираль молекулы ДНК. Буквы A, T, G и C обозначают основания аденин, тимин, гуанин и цитозин. Последовательность этих четырех оснований в ДНК представляет собой код, содержащий инструкции по созданию белков. Показано, как двойная спираль складывается в хромосому.
ДНКсоставляет гены, а последовательность оснований ДНК составляет генетический код. Между «запусками» и «остановками» код несет инструкции для правильной последовательности аминокислот в белке. РНК использует информацию ДНК для сборки правильных аминокислот и помощи в производстве белка. Информация в ДНК передается от родительских клеток к дочерним клеткам всякий раз, когда клетки делятся, а также передается от родителей к потомству при воспроизводстве организмов. Таким образом унаследованные характеристики передаются от одного поколения к другому.
Рис. 3.7.4 АТФ (аденозин-TRI-фосфат) может быть преобразован в ADP (аденозин-DI-фосфат) для высвобождения энергии, хранящейся в химических связях между второй и третьей фосфатной группой.Существует один тип специализированной нуклеиновой кислоты, который существует только в виде мономера. Он отличается от других нуклеиновых кислот, потому что не кодирует и не помогает создавать белки. Эта молекула представляет собой ATP , что означает аденозинтрифосфат. Он состоит из сахара, аденозина и трех фосфатных групп.Его основная роль — это основная энергетическая валюта в клетке. Принцип действия АТФ основан на фосфатах. Как показано на рисунке 3.7.4, большое количество энергии хранится в связи между второй и третьей фосфатной группой. Когда эта связь разрывается, она действует как экзотермическая реакция, и эта энергия может использоваться для питания других процессов, происходящих в клетке.
- Нуклеиновые кислоты — это класс биохимических соединений, который включает ДНК и РНК.Эти молекулы состоят из небольших мономеров, называемых нуклеотидами, которые соединяются в длинные цепи с образованием полинуклеотидов. ДНК состоит из двух полинуклеотидов, а РНК состоит из одного полинуклеотида.
- Каждый нуклеотид состоит из молекулы сахара, фосфатной группы и азотистого основания. Сахара и фосфатные группы соседних нуклеотидов связываются вместе, образуя «основу» полинуклеотида. Основания азота выступают в сторону сахарно-фосфатного остова. Связи между комплементарными основаниями удерживают вместе две полинуклеотидные цепи ДНК и заставляют ее принимать характерную форму двойной спирали. ДНК
- составляет гены, а последовательность азотистых оснований в ДНК составляет генетический код для синтеза белков. РНК помогает синтезировать белки в клетках. Генетический код в ДНК также передается от родителей к потомству во время воспроизводства, что объясняет, как унаследованные характеристики передаются от одного поколения к другому.
- Что такое нуклеиновые кислоты?
- Чем РНК структурно отличается от ДНК? Нарисуйте изображение каждого.
- Опишите нуклеотид.Объясните, как нуклеотиды связываются вместе с образованием полинуклеотида.
- Какую роль азотистые основания в нуклеотидах играют в структуре и функциях ДНК?
- Какова функция РНК?
- Используя то, что вы узнали из этой статьи о нуклеиновых кислотах, объясните, почему близнецы так похожи.
- Какие нуклеотиды находятся в комплементарной цепи ДНК ниже?
- Расположите следующие элементы в порядке от наименьшего до наибольшего уровня организации: ДНК, нуклеотид, полинуклеотид.
- Как часть процесса репликации ДНК, две полинуклеотидные цепи отделены друг от друга, но каждая отдельная цепь остается неповрежденной. Какие связи разрываются в этом процессе?
- Аденин, гуанин, цитозин и тимин _______________.
- Некоторые болезни и расстройства вызываются генами. Объясните, почему эти генетические нарушения могут передаваться от родителей к детям.
- Есть ли в вашей семье какие-либо генетические нарушения?
ДНК: Книга о вас — Джо Хэнсон, TED-Ed, 2012.
Атрибуции
Рисунок 3.7.1
Рисунок 3.7.2
ДНК-диаграммаКристин Миллер [Christinelmiller] на Wikimedia Commons используется по лицензии CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0).
Рисунок 3.7.3
Bdna_cropped [gif] от Spiffistan, производная работа: Jahobr, на Викискладе, выпущена в общественное достояние (https://en.wikipedia.org/wiki/Public_domain).
Рисунок 3.7,4
ATP для энергии Кристин Миллер используется по лицензии CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Номер ссылки
TED-Ed. (2012, 26 ноября). ДНК: Книга о вас — Джо Хэнсон. YouTube, 2012 г. https://www.youtube.com/watch?v=aeAL6xThfL8&feature=youtu.be
Синтез нуклеиновых кислот
Нуклеиновые кислоты, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК), хранят генетическую информацию для живых организмов.Производство и регулирование этих биологических макромолекул необходимы для выживания и размножения организмов. Следовательно, ферменты, участвующие в этих процессах, являются привлекательными терапевтическими мишенями для различных заболеваний.
Обзор
ДНК — это основная форма хранения генетической информации в живых организмах. Он состоит из двух цепей нуклеотидов, связанных между собой сахарной и фосфатной цепью. По мере деления клеток ДНК реплицируется с образованием новых идентичных копий ДНК, которые встраиваются в дочерние клетки.ДНК также транскрибируется в родственную нуклеиновую кислоту, информационную РНК, которая управляет синтезом белков. Существует множество ферментов, участвующих в синтезе нуклеиновых кислот, которые являются потенциальными терапевтическими мишенями, в том числе:
- Синтез или утилизация пуриновых и пиримидиновых оснований: Нуклеозиды, которые являются основными строительными блоками РНК, и родственные нуклеотиды, которые являются основными строительными блоками ДНК, содержат азотистые пуриновые основания, аденин и гуанин, а также пиримидиновые основания. цитозин, урацил (только РНК) и тимин (только ДНК).Эти основания могут быть получены путем синтеза de novo или путем переработки. Нуклеозиды необходимы для трансляции ДНК в РНК для экспрессии генов, а нуклеотиды необходимы для репликации ДНК во время деления клеток. Нехватка пуриновых или пиримидиновых оснований может предотвратить эти важные процессы, ведущие к гибели клеток.
- Обмотка / раскрутка ДНК: Чтобы получить доступ к ДНК для репликации, необходимо разделить две цепи ДНК. Это достигается прежде всего за счет действия геликасов.В сочетании с геликазами другая группа ферментов, называемых топоизомеразами, может разрывать одну (тип I) или обе цепи (тип II) ДНК, чтобы уменьшить скручивание ДНК, которое может накапливаться ниже по течению от сайта репликации. Ингибирование наматывания / раскручивания ДНК может предотвратить или остановить репликацию, что приведет к гибели клеток.
- ДНК / РНК-полимеразы: Полимеразы — это семейство ферментов, используемых для репликации ДНК, получения информационной РНК из ДНК или обратной транскрипции ДНК из РНК в вирусах. Полимеразы также участвуют в проверке ДНК, обеспечивая точность генетического кода при репликации ДНК.
В каждом из этих процессов задействованы многочисленные ферменты и другие белки. Конкретные ферменты различаются у разных организмов, особенно если сравнивать их у млекопитающих, простейших, бактерий и вирусов. Разнообразие ферментов в этих организмах способствует их привлекательности в качестве терапевтических мишеней, поскольку существует возможность избирательного воздействия на ферменты конкретных организмов.
Существующие продукты
Существует множество ингибиторов синтеза нуклеиновых кислот, одобренных для лечения различных заболеваний.
| Путь синтеза / регуляции нуклеиновых кислот | Имя цели | Нормативный статус |
| Синтез нуклеотидов | Дигидрофолатредуктаза (DHFR) | Метотрексат одобрен FDA для лечения рака и некоторых аутоиммунных заболеваний |
| Суфадоксин-пириметамин (SP), одобрен FDA для лечения малярии | ||
| Дигидрооротатдегидрогеназа (DHODH) | Лефлуномид и терифлуномид, одобренные FDA для лечения ревматоидного артрита | |
| Намотка / размотка ДНК | ДНК-гираза (топоизомераза II) | Ципрофлоксацин, одобренный FDA антибиотик широкого спектра действия |
| Эукариотическая топоизомераза II | Сурамин и пентамадин не одобрены FDA, но широко используются в развивающихся странах для лечения африканского трипаносомоза человека (HAT) стадии 1 | |
| Топоизомераза IA | Стибоглюконат натрия (SSG) не одобрен FDA, но широко используется в развивающихся странах для лечения лейшманиоза | |
| ДНК / РНК-полимеразы | Обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза) | Азидотимидин (AZT) и многие другие, одобренные FDA для лечения ВИЧ |
Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот как препараты для лечения тропических болезней, которым не пренебрегают
Есть несколько болезней, не связанных с забытыми тропическими болезнями, для которых был нацелен синтез нуклеиновых кислот, в том числе:
- Рак
- Аутоиммунные болезни (включая ревматоидный артрит)
Чтобы реплицировать ДНК в делящихся клетках, необходимы нуклеотиды для построения вновь синтезированной цепи ДНК.Следовательно, реплицирующиеся клетки особенно чувствительны к ингибированию биосинтетических путей, которые производят новые нуклеотиды. И рак, и аутоиммунное заболевание характеризуются повышенной клеточной репликацией. В случае рака трансформированные клетки быстро делятся, образуя опухоль. В случае аутоиммунного заболевания повышенная пролиферация иммунных клеток способствует сверхактивному иммунному ответу.
Дигидрофолатредуктаза (DHFR) и дигидрооротатдегидрогеназа (DHODH) являются хорошо известными терапевтическими мишенями для блокирования репликации ДНК в быстро делящихся клетках.DHFR является ферментом, участвующим в биосинтезе фолиевой кислоты, и играет ключевую роль в синтезе de novo пиримидинов, цитозина, тимина и урацила, важных строительных блоков нуклеотидов. Ингибирование DHFR такими соединениями, как метотрексат, приводит к нехватке доступных нуклеотидов, тем самым блокируя репликацию ДНК. Точно так же ДГОДГ — это фермент, который непосредственно участвует в синтезе пиримидина, поэтому его ингибирование также приводит к блокированию синтеза ДНК.
Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот как препараты для лечения тропических болезней, которым не уделяется должного внимания
Синтез и восстановление нуклеиновых кислот были нацелены на лечение бактериальных, простейших и вирусных забытых тропических болезней, включая:
- Малярия
- Энтеротоксигенный E.coli (ETEC)
- Лейшманиоз
- Африканский трипаносомоз человека (HAT)
- ВИЧ
Комбинированное лечение сульфадоксином и пириметамином (SP или Фансидар) обычно использовалось для лечения острой малярии до конца 1990-х годов. Пириметаминный компонент SP является мощным ингибитором фермента DHFR Plasmodium falciparum , простейшего паразита, вызывающего малярию. Как и в клетках человека, ингибирование DHFR в делящихся клетках приводит к гибели клеток за счет блокирования репликации ДНК.Фермент DHFR P. falciparum достаточно отличается от своего человеческого ортолога, поэтому возможно селективное ингибирование; SP достаточно безопасен для использования у маленьких детей и беременных женщин. Однако широкое использование SP в конечном итоге привело к развитию устойчивости к противомалярийным препаратам и замене SP и других противомалярийных средств первой линии на комбинированную терапию артемизинином (ACT) для лечения острой малярии в начале 2000-х годов. 1
Топоизомеразы типа II, включая ДНК-гиразу и топоизомеразу IV, необходимы для репликации ДНК в таких бактериях, как ETEC. 2 В отличие от клеток млекопитающих, где геном хранится на нескольких линейных хромосомах с двухцепочечной ДНК, бактерии имеют один кольцевой фрагмент двухцепочечной ДНК, кодирующий их геном. Чтобы воспроизвести этот кольцевой фрагмент ДНК, цепи ДНК должны быть разделены. В кольцевой ДНК, когда две цепи ДНК разделяются для репликации, это вызывает сверхспирализацию остальной части круга, ограничивая прогресс репликации. Чтобы компенсировать это, бактерии используют топоизомеразы типа II, чтобы разорвать круг ДНК, ослабить суперспирализацию и затем повторно соединить ДНК.Воспользовавшись этим механизмом, были разработаны многочисленные антибиотики широкого спектра действия, нацеленные на топоизомеразы типа II. Антибиотики на основе класса фторхинолонов, включая ципрофлоксацин и левофлоксацин, являются наиболее распространенными ингибиторами топоизомеразы II и широко используются для лечения диареи путешественников, включая диарею, вызванную ETEC.
Топоизомеразы также являются мишенью для трех продуктов, которые в настоящее время используются для лечения эукариотических простейших паразитарных болезней HAT и лейшманиоза:
- Сурамин, лечение HAT стадии 1, вызванной Trypanosoma brucei rhodesiense
- Пентамадин, лечение HAT стадии 1, вызванной Trypanosoma brucei gambiense
- Натрия стибоглюконат (SSG) для лечения лейшманиоза
Считается, что и сурамин, и пентамадин нацелены на эукариотические топоизомеразы паразита II типа. 3 Поскольку паразиты, вызывающие HAT, являются эукариотическими, их топоизомеразы типа II больше похожи на человеческую топоизомеразу II, чем на спирали ДНК бактерий. Интересно, что данные свидетельствуют о том, что сурамин и пентамадин преимущественно нацелены на топоизомеразу II кинетопласта HAT. Вероятно, что эти продукты были эффективны для лечения HAT, потому что: (1) паразиты HAT быстро делятся относительно большинства клеток-хозяев, что требует активности топоизомеразы для стимуляции репликации ДНК и (2) появляется топоизомераза кинетопластов II. быть более чувствительным к лекарствам, чем топоизомераза хозяина.Хотя сурамин и пентамадин эффективны для лечения HAT стадии 1, сурамин, в частности, связан с тяжелыми токсическими побочными эффектами.
Стибоглюконат натрия (SSG) — это пятивалентная сурьма, используемая для лечения лейшманиоза. Предыдущий анализ воздействия SSG на паразита, вызывающего лейшманиоз, показал, что SSG действует путем ингибирования топоизомеразы типа I. 3 После завершения последовательности генома паразитов, вызывающих лейшманиоз, HAT и родственное заболевание, называемое болезнью Шагаса, было обнаружено, что эта группа паразитов, известная под общим названием кинетопластиды, имеет две расходящиеся топоизомеразы типа I.Первый — это топоизомераза типа IB, которая обнаруживается как в ядре, так и в органеллах, связанных с митохондриями, и является уникальной для кинетопластид, известных как кинетопласт. В отличие от топоизомераз IB типа других эукариот, кинетопластидная топоизомераза IB представляет собой гетеромультимер. Вторая топоизомераза типа I представляет собой топоизомеразу типа IA. Снова отдельные копии топоизомеразы типа IA обнаруживаются в ядре и кинетопласте. Топоизомераза типа IA в кинетопласте значительно отличается от других топоизомераз типа IA и важна как для репликации кольцевой ДНК в кинетопласте, так и для выживания паразита. 4 Неизвестно, подавляет ли SSG формы топоизомеразы типа IA или B при лейшманизе. Однако вполне вероятно, что паразиты чувствительны к SSG, потому что они делятся быстрее, чем клетки-хозяева, и потому, что репликация кинетопластной ДНК более чувствительна к ингибированию топоизомераз.
Вирусы часто используют уникальные ферменты при репликации своих геномов. Например, ВИЧ имеет геном РНК, а не геном ДНК. В клетках млекопитающих ДНК-полимеразы представляют собой ферменты, которые реплицируют ДНК из матрицы ДНК.Чтобы вирус ВИЧ мог реплицироваться, он должен создать копию ДНК из матрицы РНК, используя фермент, называемый обратной транскриптазой или РНК-зависимой ДНК-полимеразой. Первым успешным препаратом, разработанным для лечения ВИЧ, был ингибитор обратной транскриптазы ВИЧ под названием азидотимидин, более известный как AZT. 5 С момента одобрения FDA в 1987 году зидовудина для лечения ВИЧ было одобрено более шестнадцати различных продуктов, содержащих ингибиторы обратной транскриптазы. 6
Наномедицина — Миркин
СНС как терапевтические агенты
СНС для регулирования генов
Синтетические олигонуклеотиды можно использовать для понимания внутриклеточных процессов и регулирования экспрессии генов, предлагая путь к жизнеспособным вариантам лечения многих заболеваний и нарушений на генетической основе, включая многие виды рака или неврологические нарушения.Однако все еще существует серьезная проблема, касающаяся того, как доставлять синтетические нуклеиновые кислоты к конкретным участкам заболевания и в клетки. В самом деле, существуют естественные защитные сети, которые не допускают попадания чужеродных нуклеиновых кислот в клетки. Кроме того, нуклеиновые кислоты часто быстро разрушаются нуклеазами и могут активировать врожденный иммунный ответ. Исторически положительно заряженные агенты трансфекции использовались для перемещения отрицательно заряженных нуклеиновых кислот через отрицательно заряженные клеточные мембраны и защиты нуклеиновых кислот от ферментативной деградации.К сожалению, агенты трансфекции не были идеальными для использования в системной доставке, потому что они не разлагаются естественным путем и могут вызывать серьезную токсичность. Конструкции SNA представляют собой альтернативу в этом отношении, поскольку, несмотря на их высокий отрицательный заряд (дзета-потенциал <-30 мВ), они проникают в клетки в очень больших количествах без необходимости во вспомогательных средствах трансфекции и эффективно регулируют экспрессию генов, сопротивляясь расщеплению нуклеазой. Кроме того, они нетоксичны и биосовместимы.В одном из ключевых примеров SNA были использованы при лечении мультиформной глиобластомы (агрессивный рак мозга) для нацеливания на онкопротеин Bcl2Like12 (Bcl2L12). Этот белок сверхэкспрессируется в GBM по сравнению с нормальным мозгом и астроцитомами низкой степени злокачественности. SNA проникают через гематоэнцефалический барьер (BBB) и гематоэнцефалический барьер (BTB) и доставляют siRNA, которая сбивает эндогенную мРНК и белок Bcl2L12 , что в конечном итоге позволяет клеткам глиомы стать более чувствительными и отзывчивыми на индуцированный терапией апоптоз.
SNA для иммунотерапииНуклеиновые кислоты, которые были разработаны для модуляции иммунной системы, имеют необычайные перспективы для лечения заболеваний, однако клинический прогресс ограничен отсутствием инструментов для безопасного увеличения (например, в случае рака) или уменьшения (например, в случае аутоиммунных заболеваний) иммунная активность у пациентов. Некоторые иммунотерапевтические нуклеиновые кислоты действуют путем агонирования или антагонизма эндосомных толл-подобных рецепторов (например, TLR3, TLR7 / 8 и TLR9), рецепторов, участвующих в передаче сигналов врожденного иммунитета.Группа Миркина разработала иммуномодулирующие SNA, которые стимулируют (иммуностимулирующий, IS-SNA) или регулируют (иммунорегуляторный, IR-SNA) иммунитет путем задействования TLR. По сравнению со свободными олигонуклеотидами, IS-SNA демонстрируют до 80-кратное увеличение активности, в 700 раз более высокие титры антител, в 400 раз более высокие клеточные ответы на модельный антиген и улучшенное лечение мышей с лимфомами, а также другими типами раки. IR-SNA демонстрируют восьмикратное увеличение активности и на 30% большее снижение показателя фиброза у мышей с неалкогольным стеатогепатитом (НАСГ).Совсем недавно СНС были использованы для создания области «рациональной вакцинологии», где было доказано, что химическая структура вакцины изменяет лечение от умеренно эффективного до лечебного (рис.
