На что влияет впр: «Всероссийские проверочные работы» – в вопросах и ответах

Содержание

«Всероссийские проверочные работы» – в вопросах и ответах

— Николай Михайлович, ВПР – это только срез знаний, и по идее к ним не нужно готовиться, потому что результаты получатся необъективными. Почему же тогда в школе часто вместо уроков проводят подготовку к ВПР, выпускаются специальные тетради для подготовки и т.д. Надо ли вообще готовиться к ВПР?

– Как и к любой проверочной работе, к ВПР нужно готовиться. В заданиях всероссийских проверочных работ содержится большой блок учебного материала, освоенный учеником в течение учебного года. Конечно, что-то уже подзабыто и требует актуализации и элементарного повторения.

Также некоторые формулировки в заданиях ВПР могут быть не совсем аналогичными к тем, которые используются в учебнике, что тоже требует предварительной тренировки. Чтобы не столкнуться на мониторинге с новыми форматами заданий, лучше заранее посмотреть образцы проверочных работ на сайте ФИОКО и подготовиться к разным вариантам.

Любые форматные задания требуют специальной подготовки. Для того чтобы справиться с такими заданиями, недостаточно хорошо знать материал – нужно иметь навык работы с ними и хотя бы минимальный опыт их решения.

Все это нужно обучающемуся, чтобы он чувствовал себя во время выполнения ВПР уверенно и спокойно.

– Влияет ли оценка за ВПР на четвертную оценку? Часто учителя говорят, что влияет и ставят эти оценки в дневник. Правомерно ли они поступают?

– Выполнение всероссийских проверочных работ полезно для всех: школьников, учителей, заместителей руководителей образовательных учреждений, отвечающих за организацию учебного процесса. Школьники знакомятся со стандартизированным форматом проверочных работ и могут увидеть, какие темы «западают», а какие даются лучше. Учителя, проанализировав результаты ВПР, могут скорректировать программу дополнительных занятий с учеником. Проверочные работы помогают школам провести диагностику качества получаемых учениками знаний.

Это значит, что высокая или невысокая оценка на ВПР не повлияет на годовую оценку, тем более оценку в аттестате или на переход в следующий класс. Именно школа принимает решение о выставлении отметок в журналы, но и родители, и сами школьники должны быть ознакомлены с этим решением.

– ВПР проводятся в урочные часы, получается, что у детей пропадают какие-то уроки, они недополучают знания и потом надо навёрстывать упущенное. Как правильно проводить ВПР? И зачем в отдельных параллелях их проводят так много (6 — 8 предметов за год)?

– Однако ВПР проводятся в течение достаточно продолжительного периода времени: так для обучающихся 4 – 8 классов в 2021 году — это период с 15 марта по 21 мая. И школа может самостоятельно (принимая во внимания все особенности) решить, когда именно провести работу, чтобы не возникло физической перегрузки школьников.

А у педагогов также есть достаточно длительный период, чтобы скорректировать учебную программу по предмету и освоить весь учебный материал в полном объеме. Как правило, итоговые уроки в 4-й четверти по многим предметам как раз и отводятся на повторение.

Количество ВПР определяется федеральным координатором в лице Федерального института оценки качества образования и в 2021 году составляет: для 4 класса – 3, для 5 класса – 4, для 6 класса – 4, для 7 класса – 8, для 8 класса – 4. При этом школа может учесть эту работу как итоговую по предмету и не проводить дополнительную внутреннюю контрольную работу, что снизит нагрузку на обучающегося.

Во время подготовки и проведения ВПР я бы посоветовала ребятам помнить о следующем: все задания соответствуют стандарту школьной программы.

– Ученики 11 классов, которые не выбрали предметы (историю, биологию, географию, физику, химию, иностранные языки) для прохождения государственной итоговой аттестации в форме ЕГЭ теперь обязаны выполнить ВПР по всем этим предметам? За что такая «обязанность»? Когда же школьнику готовиться к ЕГЭ?

– Общее количество проводимых (предлагаемых) ВПР определяется федеральным координатором. В 2021 году их шесть для 11 класса. При этом одиннадцатиклассник, выбравший предмет для прохождения государственной итоговой аттестации в форме ЕГЭ, по решению департамента образования Белгородской области (с целью недопущения перегрузки) имеет право не принимать участие в ВПР по данному предмету. То есть, если выпускник сдает ЕГЭ по химии и биологии, то по этим предметам ВПР он не выполняет. Также школа может засчитать ВПР в качестве итоговой работы по предмету и не проводить дополнительную внутреннюю контрольную работу, что, в конечном итоге, снизит нагрузку на обучающегося.

Стоит отметить, что подготовка к ВПР (по итогам учебного года) и подготовка к ЕГЭ (за уровень образования) принципиально разнятся. Действительно, успешная сдача единого государственного экзамена требует и определенных усилий, и длительного времени. Однако вызывает сомнение результативность такой подготовки, если выпускник планирует начать ее только в марте. 

что нам с ними делать?

Сотрудники РЦИОКО и родители школьников обсудили вопросы проведения всероссийских проверочных работ за круглым столом.

Сегодня в Департаменте образования и науки города Севастополя состоялся круглый стол по вопросам проведения всероссийских проверочных работ. Региональный центр информатизации и оценки качества образования (РЦИОКО) пригласил к обсуждению родителей школьников, участвующих в написании всероссийских проверочных работ, педагогов и независимых наблюдателей, которые следят за соблюдением порядка проведения процедуры. Речь шла о том, для чего предназначены ВПР и как родителям использовать результаты этой процедуры с максимальной пользой для развития ребенка.

Всероссийские проверочные работы (ВПР) – это итоговые контрольные работы для оценки уровня подготовки школьников с учетом требований федеральных государственных образовательных стандартов.

– Засчитывать или нет результаты ВПР в качестве промежуточной аттестации каждая школа решает сама и закрепляет свое решение внутренним локальным актом, – рассказала собравшимся директор РЦИОКО Дарья Крузе, – ВПР – это прежде всего инструмент, позволяющий осуществлять мониторинг соответствия образовательной программы ФГОС, диагностику качества преподавания и определение образовательных достижений школьника с целью последующей их коррекции.

ВПР не являются экзаменом или формой аттестации. Это контрольная работа, единая для всей страны, основанная на Федеральном государственном образовательном стандарте (ФГОС), которая предназначена для того, чтобы выявлять проблемы в школьном образовании и работать над их устранением на всех уровнях. Результаты ВПР могут использоваться для формирования программ развития образования на уровне муниципалитетов, регионов и в целом по стране, для совершенствования методики преподавания предметов в конкретных школах, а также для индивидуальной работы с учащимися.

Единство подходов к составлению вариантов, проведению самих работ и их оцениванию, а также использование современных технологий, позволяющих обеспечить практически одновременное выполнение работ обучающимися всех образовательных организаций Российской Федерации делают ВПР инструментом формирования единого образовательного пространства страны. У каждой школы и каждого учителя есть возможность сверить результаты своей деятельности со стандартами, откорректировать при необходимости свою работу и помочь каждому ребенку вовремя устранить пробелы в знаниях и навыках.

– Не нужно проводить специальной подготовки к ВПР, лучше потратить это время на освоение знаний и умений, требуемых ФГОС. Не нужно пугать детей и создавать психологическое напряжение. Не должно быть угрозы наказания за недостаточно высокий результат. Это не аттестация, а диагностика, значит в ней главное не результат. И цель у нее соответствующая: понять кому и какая необходима помощь, – подчеркнула Дарья Николаевна, – ВПР должны проводиться объективно, только тогда они будут инструментом, позволяющим определить текущее состояние, чтобы предпринять конкретные шаги для повышения качества образования. А в этом заинтересованы все участники образовательного процесса.

Дарья Крузе посоветовала родителям не нагнетать напряженность, не требовать от школьников отличного написания ВПР, а терпеливо с раннего возраста объяснять каждому ребенку, что учеба – это ежедневный труд и важно готовиться к каждому уроку. А ВПР помогут определить, что упущено или не качественно усвоено и вовремя восполнить недостаток.

За круглым столом обсуждались самые волнующие родителей вопросы. Почему сотрудники РЦИОКО утверждают, что не требуется покупать специальных пособий, чтобы «натаскивать» детей на решение заданий ВПР, а в школе говорят обратное. Почему, если оценка за ВПР ни на что не влияет, в школе детей пугают тем, что если результат работы будет ниже текущей успеваемости, то итоговая оценка будет снижена. Сетовали на то, что в процессе подготовки к ВПР выясняется, что у ребенка совершенный провал в освоении какой-то темы, и решать этот вопрос приходится собственными силами.

– Нам нужно развернуть ситуацию в сторону сотрудничества. Перестать натаскивать детей на сдачу ВПР, и снять напряжение у учителей по поводу оценки их преподавательской деятельности. Не очень высокие результаты – это повод оказать необходимую помощь. Но для этого надо понять, какая помощь необходима. Поэтому говорить с учителями вы теперь можете с позиции известной вам информации, и вместе мы достигнем нужных результатов – уверена начальник отдела оценки качества образования РЦИОКО София Нафикова.

– Спасибо за этот круглый стол, очень полезный и конструктивный получился разговор. Важно, чтобы была возможность задавать волнующие родителей вопросы и получать на них компетентные ответы. Информированность родителей – это очень важная составляющая на пути к успеху ребенка. Только так мы можем детям действительно помогать, – поблагодарила организаторов председатель Севастопольского отделения Национальной родительской ассоциации Марина Лебедева.

– Спасибо за этот диалог. Мы хотим в лице родителей иметь заинтересованных союзников, сторонников объективной оценки, не имеющей никакого отношения к поощрению или наказанию кого либо, а существующей, как ориентир в выборе верных траекторий развития как школьников, так и педагогов, школ и системы образования региона в целом, – подытожила встречу Дарья Николаевна.

Почему «тройки» и «двойки» за ВПР не идут в журнал?

Русский и английский языки, математика, история, биология, география, обществознание, физика — знания по этим предметам предстоит показать семиклассникам Заречного. У этой параллели самый большой перечень дисциплин, входящих в программу Всероссийских проверочных работ. Выполнять их школьники начнут с марта. Расписание работ каждая школа составит индивидуально.

«У них есть разброс по времени, то есть они сами выбирают свой день и пишут контрольные работы. График, утвержденный приказом школы, будет опубликован на сайтах каждой образовательной организации», — рассказала заместитель начальника Департамента образования Заречного Светлана Чернышева.

Всероссийские проверочные работы пишут ученики начиная с 4 класса. У каждой параллели свой набор предметов. Подготовка к ВПР идёт во время уроков и каких-то дополнительных занятий не требует. В задания входят упражнения, примеры и задачи из общеобразовательной программы. Цель Всероссийских проверочных работ — не оценка деятельности учащихся, педагогов или конкретных школ, а выявление реальной ситуации в образовании.

«ВПР — это не экзамен. Они не являются контрольной работой, входящей во внутришкольный контроль, потому что у нас есть промежуточная аттестация, входные контрольные работы, полугодовые контрольные работы и итоговые контрольные работы. А всероссийские проверочные работы нацелены на то, чтобы выявить общий уровень усвоения материала», — объяснила заместитель директора по учебно-воспитательной работе школы №225 Татьяна Жилякова.

Баллы, полученные за ВПР, не влияют на оценку за четверть. Кроме того, выставить оценку за проверочную работу в журнал учитель может только при желании ребенка. В 225-ой школе, как правило, к текущим отметкам добавляют только полученные на ВПР четвёрки и пятерки. Таким образом учителя хотят поддержать школьников, которые успешно справились с заданиями.

отвечаем на 8 самых важных вопросов

В 2021 году итоговые проверочные работы пройдут во всех классах параллели, писать их будут все ученики с 4 по 11 класс, за некоторым исключением. Рассказываем, что нужно знать о ВПР и как сделать так, чтобы подготовка не вызвала лишних сложностей.

Что такое ВПР и в чём его смысл?

ВПР – всероссийские проверочные работы. Это итоговые контрольные работы, проводимые по отдельным учебным предметам для оценки уровня подготовки школьников с учетом требований федерального государственного стандарта. В этом году ВПР пройдут с 1 марта по 26 мая. Задания для проведения ВПР составляются в Рособрнадзоре – организации, которая следит за качеством образования. 

ВПР нужна для проверки, насколько знания учеников данной школы соответствуют федеральным образовательным стандартам (ФГОС). Для школьников это хорошая возможность еще раз проверить себя и выявить пробелы в знании предметов, если они есть. Родители по результатам ВПР могут лучше оценить уровень оценить уровень преподавания. Учителям проверочная работа помогает скорректировать учебные планы и понять, какие ученики или классы нуждаются в дополнительном внимании.

Кто пишет ВПР в 2021 году

В 2021 году ВПР проводится для учеников 4-8 и 10-11 классов. Старшеклассники сдают ВПР в режиме апробации, раньше ВПР были для них не обязательны.

В 6 и 8 классах предметы по выбору случайным образом определяет Рособрнадзор.

Расписание ВПР утверждено приказом Рособрнадзора №119 от 11.02.2021.

СрокиКлассыПредметы
15 – 21 маяРусский язык, окружающий мир, математика
15 – 21 мая5Русский, математика, история, биология
15 – 21 мая6Русский, математика + на выбор история, биология, обществознание, география
15 – 21 мая7Иностранный язык, обществознание, русский язык, биология, география, математика, физика, история
15 – 21 мая8Русский, математика + на выбор история, биология, обществознание, география, физика, химия
1 – 26 марта10География
1 – 26 марта11Иностранный язык, биология, география, история, физика, химия

Как проходит ВПР?

Точную дату проведения контрольной работы назначает школа. Работа проходит одновременно во всех классах параллели во время уроков, то есть для ВПР, например, нельзя поставить дополнительный урок в расписании. 

Время на написание контрольной работы – от 45 до 90 минут. Точное время зависит от класса и предмета. Одиннадцатиклассникам даётся 90 минут на все предметы, кроме иностранного языка – эта ВПР длится 75 минут и проходит в компьютерной форме в специально оборудованном классе.

Проверяют работу учителя школы с опытом преподавания предмета не менее 3 лет. 

На что влияют результаты ВПР?

Оценка за ВПР не учитывается при выставлении годовой отметки по соответствующему предмету и при получении аттестата о среднем общем образовании. Если школьник напишет ВПР на двойку, ему не нужно переписывать работу и его не могут оставить на второй год. Но если всё-таки хотите улучшить успеваемость и оценки за контрольные, воспользуйтесь нашими советами.

Что будет, если не сдать ВПР в 11 классе? Что важнее — результаты ВПР или ЕГЭ?

Информация из предыдущего абзаца относится и к проверочным работам в 11 классе. Их результаты не влияют на оценку и на допуск к ЕГЭ. И конечно, результаты ВПР не учитываются при поступлении в вуз, так что успешно сдать ЕГЭ намного важнее. 

Можно ли отказаться от ВПР?

Обязанность школьников писать ВПР никаким федеральным законом не установлена. Методические указания Рособрнадзора, где сказано, что работу должны писать все учащиеся, касается образовательных организаций, а не граждан. То есть школа обязана такую работу провести, а вот участвовать в ней или нет – решать школьнику и его родителю. Но это на бумаге, а на практике отказ от написания ВПР может быть чреват определёнными сложностями.

Если вы готовы потратить время на отстаивание своих прав, вооружитесь Законом об образовании, где никаких ВПР не упомянуто. В крайнем случае, можно просто не прийти в школу в этот день и принести справку об отсутствии по болезни или другой уважительной причине.

Пишут ли ВПР дети на домашнем обучении?

Если ребенок на семейном обучении, писать ВПР ему не нужно, поскольку он не числится в контингенте школы. 

Заочники пишут ВПР наравне с обычными школьниками. Форму и сроки проведения контрольной работы определяет образовательная организация. Исключение — негосударственные образовательные учреждения. На них методические указания Рособрнадзора не распространяются, и они могут отказаться от проведения ВПР .  

Как готовиться к ВПР?

ВПР — первое серьёзное испытание для выпускников начальной школы. О том, как поддержать ребёнка и помочь ему подготовиться к проверочной работе, рассказываем в нашей статье.

В отличие от ОГЭ и ЕГЭ, ВПР проводится в традиционной, а не в тестовой форме. Ответы на задания нужно записывать самостоятельно в развернутом виде. Чтобы формат ВПР не стал неожиданностью, полезно ознакомиться с заданиями проверочных работ разных лет и потренироваться в их решении.

Наша школа проводит бесплатное занятие по подготовке к ВПР, которое поможет школьникам разобраться, с чего начать самостоятельную подготовку и на что обратить внимание, занимаясь предметом.

Влияют ли результаты ВПР на годовые оценки? | Бегом в школу — клуб родителей

Всероссийские проверочные работы уже пишут российские школьники. Повлияют ли их результаты на годовые оценки?

Что такое ВПР?

ВПР — эта аббревиатура пугает родителей и школьников, начиная с начальных классов. ВПР боятся все и даже педагоги, которые, была б их воля, оградили бы своих подопечных от таких умственных, психологических и эмоциональных нагрузок. Однако стоит ли так бояться?

Всероссийская проверочная работа (ВПР) по своей сути представляет собой итоговую контрольную работу, которая проводится по отдельным школьным предметам с учетом требований федеральных государственных образовательных стандартов. Она не является формой экзамена или даже ЕГЭ и, как правило, не предусматривает никакой дополнительной нагрузки для детей. Она проводится, прежде всего, для правильной объективной оценки знаний учеников на промежуточном этапе школьного образования для того, чтобы педагоги увидели реальный уровень усвоения знаний, выявили пробелы в работе и предприняли необходимые меры для их устранения. Говоря простым языком, по результатам ВПР учитель увидит, какие темы по той или иной дисциплине школьник усвоил на допустимом уровне, а какие, по возможности, необходимо будет повторить и закрепить.

Как и когда проводится ВПР в 2019 году

Впервые ВПР запустили в 2015 году, а затем решили проводить регулярно. На сегодняшний день сдача Всероссийских проверочных работ обязательна для учеников 4, 5 и 6 классов. Для 11-классников процедура добровольная, а вот, начиная с 2019 года, к числу участников в режиме апробации присоединились учащиеся 7-ых классов, для которых ВПР также не являются обязательными. Для каждого предмета либо строго на федеральном уровне определяется день проведения контрольной работы, либо указываются четкие сроки. Приказом Рособрнадзора №84 от 29.01.2019 г. «О проведении Федеральной службой по надзору в сфере образования и науки мониторинга качества обучающихся общеобразовательных организаций в 2019 году» утвержден график проведения Всероссийских проверочных работ в этом году. Каким стал этот график, мы уже писали.

В установленное время педагоги раздают детям бланки с заданиями, подразумевающими как краткий, так и развернутый ответ. На написание дается от 45 до 90 минут, то есть максимум 2 урока. При этом пользоваться дополнительными материалами: учебниками, рабочими тетрадями,справочниками, калькуляторами и тем более шпаргалками категорически запрещено.

Влияют ли результаты ВПР на годовые оценки?

Ну и самый главный вопрос, волнующий школьников и их родителей: влияют ли результаты написания ВПР на годовые оценки? Согласно рекомендациям Федеральной надзорной службы в сфере образования, результаты ВПР не влияют на годовые и четвертные оценки по предметам. Они не идут в журнал, и конечно же не учитываются при поступлении в высшие учебные заведения. Поэтому больше бояться родителям и школьникам нужно итоговых контрольных работ, которые традиционно пройдут в мае перед концом учебного года.

Рособрнадзор: не надо ажиотажа, проверочные работы не повлияют на аттестат

В интернете продолжается сбор подписей за отмену пяти Всероссийских проверочных работ (ВПР) для 11-классников. Петиций несколько, одну из них подписали уже десятки тысяч человек.

На школьных подростковых форумах бурно обсуждают очередные нововведения, родители и учителя волнуются — считают, что теперь много времени придется потратить на подготовку к ВПР — чтобы вспомнить за пару месяцев до госэкзаменов те предметы, которые в будущем не пригодятся по выбранной специальности (и по которым не нужно сдавать ЕГЭ).

В Рособрнадзоре пока рекомендуют не учитывать результаты Всероссийских проверочных работ при выставлении оценок в аттестат и уверяют, что поводов для опасений нет. Обо всем этом подробнее — в интервью заместителя руководителя Федеральной службы по надзору в сфере образования и науки Анзора Музаева обозревателю МИА «Россия сегодня» Анастасии Мельниковой.

— Зачем в школах вводятся Всероссийские проверочные работы (ВПР) по пяти неосновным предметам?

— Зачем мы вводим ВПР? Зачем хотим, чтобы работу по химии или биологии написали все выпускники школы, в том числе считающие себя гуманитариями? Отнюдь не для того, чтоб усложнить им жизнь. Сделано это для того, чтобы увидеть реальную картину с состоянием образования в школе. ЕГЭ здесь не показателен, ведь ребята, избравшие для себя определенные предметы на ЕГЭ, мотивированы, они будут дополнительно заниматься. Их результат — это не только результат работы школы, учителя. ВПР тут будет более точным индикатором и «тревожным звоночком», если в школе, регионе, муниципалитете есть проблемы с преподаванием отдельных предметов.

Сейчас школы сами проверяют, как учащиеся освоили предметы, не входящие в ЕГЭ или ГИА-9, сами проводят контрольные работы. Проводят они их по собственным заданиям. Никто не контролирует, как эти задания составлены, каков их уровень сложности, как оценивается их выполнение.

Вводя ВПР, мы предложили школам единый стандарт оценки. А федеральные и региональные органы образования, да и сами директора школ, и, что немаловажно, родители могут увидеть реальную картину — чему смогли или не смогли в их школе научить.

— Сообщалось, что для выпускников это станет «неким механизмом, направленным против «натаскивания к ЕГЭ», но ведь ЕГЭ-то остается, только теперь прибавляются еще и контрольные. Ученики, будущие выпускники, их родители и учителя — в переживаниях…

— Не надо страхов и ажиотажа, переживать незачем. Речь идет всего лишь о контрольных работах по итогам изучения соответствующего предмета. Такие контрольные работы проводились и проводятся школами по всем предметам, это совершенно естественная часть образовательного процесса.

ВПР не влияют на аттестат, по их результатам не принимаются никакие жизненно важные для выпускника решения, к ним (ВПР) не нужно как-то специально готовиться — просто нужно учиться. Мы не рекомендуем школам учитывать результаты ВПР при выставлении оценок в аттестат.

— Вот это очень важно — что результаты ВПР не влияют на итоговые оценки. Ну и раз это апробация, а участие школ — добровольное, то кто в результате принимает решение о том, что та или иная школа участвует в этом эксперименте? Директора школ? Ученики и их родители?

— Решение об участии принимает школа. Если такое решение принято, то дальше директор должен выпустить распоряжение, на основании которого определяется, кто и как участвует в контрольной работе.

— А если школа пишет контрольные, но кто-то из 11-классников отказывается (раз это дело добровольное). Например, хочет сосредоточиться только на подготовке к тем предметам, по которым будет сдавать ЕГЭ — такой вариант возможен?

— Права и обязанности всех участников образовательного процесса определены законом «Об образовании в Российской Федерации».

В законе есть описание полномочий школы по организации различных форм аттестации. Если учитель в классе объявляет, что в такой-то день состоится контрольная работа, то ученики ведь не принимаются оспаривать это решение?

Если ученик собирается поступать в технический вуз, разве это означает, что он должен вообще отказаться от изучения основ истории своей страны? Или основ функционирования своего собственного организма, или элементарных законов природы? Давайте не будем превращать выпускников в «специалистов, подобных флюсу» (Козьма Прутков — ред.).

— Кто говорит об отказе от изучения? Все школьники и так изучают остальные предметы — годами. Если вы ссылаетесь на Козьму Пруткова, приведу еще одно его высказывание: «Ничего не доводи до крайности». Ну а вопрос о добровольном участии учеников в ВПР задан в связи с вашим же недавним интервью, в котором вы, цитирую, сказали буквально следующее: «Участие школ [в проведении ВПР] — добровольное. Более того, добровольно участвуют и сами ученики».

— И вам я могу повторить то же самое. В общем, ВПР — это совсем не ЕГЭ. Но там действительно проверяются наиболее значимые аспекты каждого предмета — то, что важно для дальнейшей жизни и общего развития.

— Будут ли ВПР в будущем обязательными?

— На данный момент мы говорим о ВПР 2017 года, которые проводятся по решению школы. Остальные решения могут быть приняты только после всестороннего обсуждения со всеми заинтересованными сообществами.

— Как будут выбираться предметы для контрольных — ведь у всех выпускников, помимо обязательных ЕГЭ, — совершенно разные госэкзамены?

— Сейчас мы говорим о режиме апробации. Будущее покажет, какая организационная форма проведения ВПР окажется наиболее эффективной.

— Какие еще проверочные работы планируется в этом учебном году проводить в других классах?

— В этом году учащиеся 4-х классов всех школ напишут Всероссийские проверочные работы по русскому языку, математике и окружающему миру. Для 5-х классов ВПР по русскому языку, математике, истории и биологии пройдут в режиме апробации, то есть на добровольной основе. В ноябре мы также провели ВПР по русскому языку для 2-х и 5-х классов, в которых приняли участие примерно четверть школ страны.

— Как участие школ в проведении ВПР отразится на их рейтингах?

— Уровень результатов никак не будет учитываться ни в каких рейтингах. Может быть в дальнейшем, при проведении школой самооценки своей работы, имеет смысл учитывать массовость участия в ВПР, поскольку результаты ВПР позволяют сделать школу прозрачной, дать больше информации о ее работе для родителей и общественности.

— Сколько школ в этом учебном году решились на проведение ВПР?

— В мае, когда мы проводили ВПР в 4-х классах, в них участвовали 37 тысяч школ, около 1,3 миллиона детей. Это подавляющее большинство школ России (примерно 9/10). С учетом того, что участие было добровольным, это впечатляющий показатель. У нас пока нет данных, сколько школ проведут ВПР в 5 и 11 классах весной, но мы надеемся, что участие будет не менее активным.

— И всё-таки — в апреле 2017 года некоторые школы проведут ВПР: где-то плохо напишут контрольные по химии, где-то по физике, и что дальше? Учителей уволят? Где-то будут отличные результаты — а в этом случае что последует? Премии-поощрения?

— Никто никого не уволит. Но если директор решится провести работу объективно, то он, а также все учителя и все родители получат весьма ценную информацию, с которой дальше смогут работать.

Это совершенно естественный путь, известный школе с незапамятных времен. Ничего нового тут нет, контрольные работы проводились всегда. Особенность ВПР только в том, что школа и родители получают возможность увидеть свои показатели в сравнении со всей страной. И если ребенка чему-то не смогли научить — нужно работать с этой школой, с учителем, заниматься его переподготовкой и повышением квалификации, чтобы ученик любой школы мог получить полноценное образование.

— Зачем какие-то дополнительные экзамены или новые требования вводятся именно в 11 классе? Будущим выпускникам и так тяжело, это очень ответственный, напряженный год, который фактически оказывает влияние на всю жизнь. Зачем ещё больше загружать одиннадцатиклассников? Уж чему научили — то и получится на выходе. Может, стоит всё же начинать реформы в младших и средних классах, чтобы постепенно подготавливать будущих выпускников к новым реалиям?

— ВПР задают тот приемлемый уровень требований, в рамках которого дети и учителя могут, наконец, найти компромисс и не отказываться вообще от изучения «ненужного» предмета, а взять из него все самое значимое, важное с точки зрения дальнейшей жизни и общего развития. Это путь к большей честности в образовании, возможность для выпускников с полным правом говорить о получении общего среднего образования, а не специализированной подготовки по трем предметам ЕГЭ.

ВПР: что это такое, на что влияет всероссийская проверочная работа в школах, критерии оценки и подготовка

Из-за пандемии в 2020/21 учебном году дети много времени провели на дистанционном обучении, а выпускные экзамены отменили. Однако на проведение всероссийских проверочных работ это не повлияло.

Что такое ВПР дети узнают в 4 классе и пишут их до самого выпуска из школы практически ежегодно. Хотя это не экзамен, пугают детей и родителей проведением ВПР и оценками за неё не меньше: результаты этой контрольной имеют значение для школы, т.к влияют на её рейтинг.

При этом сами педагоги тоже не в восторге от обязательств по организации и проведению ещё одной проверочной работы.

Разбираемся, в чём смысл такой централизованной проверки знаний школьников по всей стране, как к ней готовиться и на что влияют полученные оценки.

Содержание:

Что такое ВПР и для чего существует?

Это комплексная контрольная работа, которая должна показать уровень успеваемости школьников по различным предметам и соответствие их знаний требованиям Федеральных государственных образовательных стандартов (ФГОС), нацеленная на выявление и решение проблем в школьном образовании всех уровней.

Впервые ВПР провели в 2015 году. Сначала в 4 классах, затем их ввели в 5, 6, 7, 8 классах. В 2021 и 2022 годах решение об участии в ВПР учащихся 10 и 11 принимают школы. Обычно проверочные работы проходят в конце учебного года, весной.

Цели введения ВПР:

  1. Комплексная проверка предметных знаний учеников всех школ страны на основе заданий, равнозначных по типам и уровню сложности.
  2. Общая оценка качества школьного образования по основным предметам. Особенно это важно в начальных и средних классах, когда детей ещё не ждут выпускные экзамены.
  3. Совершенствование преподавания учебных предметов и повышение качества образования.
  4. Борьба с «натаскиванием», когда дети делают упор на изучение предметов, по которым предстоит сдавать экзамены, и преимущественно разбирают типовые задания из ЕГЭ в ущерб остальной учебной программе.

Как проводят ВПР?

Варианты проверочных работ формируются для каждой школы индивидуально

на основе контрольно-измерительных материалов, разработанных Рособрнадзором — главным регулятором качества образования в стране.

Все включённые в ВПР задания стандартизированы, то есть имеют одинаковую структуру и уровень сложности. Они составлены с учётом основных образовательных программ и содержания учебников, используемых в СОШ. Задания могут повторяться, но существование двух полностью одинаковых контрольных работ по какому-либо предмету исключено, утверждают в Рособрнадзоре.

В ходе написания контрольной ученикам запрещено пользоваться учебниками, рабочими тетрадями, какими-либо справочниками.

Проверяют ВПР учителя школы в день написания. Критерии оценки выполнения заданий также расписаны и стандартизированы, чтобы снизить риски «человеческого фактора» и необъективного оценивания. Результаты вносят в единую информационную систему, с данными которой могут работать эксперты.

Выполняются всероссийские проверочные работы на специальных обезличенных бланках, где вместо имени и фамилии ученика указывают специальный четырёхзначный код. Узнать результат можно у учителя или на сайте общеобразовательного учреждения при помощи кода, выданного перед выполнением контрольной.

По каким предметам проводят ВПР и какие там задания?

ВПР пишут учащиеся 4-8 классов и 10-11 классов.

Исключение составляют 9 и 10 классы. Девятиклассники не пишут ВПР совсем, а для десятиклассников предусмотрена проверочная работа по одному предмету.

4 класс 3 обязательных предмета русский язык, математика, окружающий мир
5 класс 4 обязательных предмета русский язык, математика, биология, история
6 класс 2 обязательных предмета, 2 предмета по случайному выбору русский язык, математика, биология, история, обществознание, география
7 класс 2 обязательных предмета, 2 предмета по случайному выбору русский язык, математика, биология, история, обществознание, география, физика, иностранный язык (английский, немецкий, французский)
8 класс 2 обязательных предмета, 2 предмета по случайному выбору русский язык, математика, биология, история, обществознание, география, физика, химия
10 класс 1 обязательный предмет география
11 класс предметы, по которым не сдаётся ЕГЭ биология, история, география, физика, химия, иностранный язык (английский, немецкий, французский)

4 класс

Учащиеся пишут ВПР по трём обязательным предметам:

Предмет Объём ВПР Что проверяют?
Русский язык Две части, всего 15 заданий.

Задания 1 и 2 частей выполняются в разные дни, на каждую часть отведено по 45 минут.
Первая часть — диктант на 80 слов и несколько упражнений к нему на знание синтаксиса, членов предложения, частей речи.

Вторая часть — задания на проверку орфоэпических навыков, понимание смысла текста и его структуры, определение значения слов, умение распознавать однородные члены предложения, разбирать слова по составу на морфемы и т.д.
Математика 12 заданий, общее время на выполнение — 45 минут. 1. Умение складывать, вычитать, умножать, делить числа в пределах 100.
2. Знание геометрических фигур, единиц измерения величин.
3. Навык решения арифметическими способами задач, связанных с учёбой и повседневной жизнью.4. Навык чтения и анализа несложных таблиц, развитие логического и алгоритмического мышления.
Окружающий мир 2 части, 10 заданий. Время на выполнение — 45 минут. 1 часть: анализ и распознавание знакомых объектов, умение понимать информацию. Оценка уровня начальных знаний из биологии и географии.

2 часть: демонстрация знаний об элементарных нормах нравственного и здоровьесберегающего поведения в природной и социальной среде, о массовых профессиях и социальной значимости труда, понимание значимости семьи, образования, государства.

5 класс

Дети пишут ВПР по четырём обязательным предметам.

Предмет Объём ВПР Что проверяют?
Русский язык 12 заданий. Время выполнения — 60 минут. Навыки правописания, умение производить фонетический, морфемный, морфологический и синтаксический разбор, понимать структуру текста.

1. Необходимо списать текст, в котором пропущены буквы и знаки препинания, верно их расставив.
2. Распознать прямую речь и слова автора, обращение, сложное предложение, разобрать предложение по составу, выделив самостоятельные и служебные части речи.
3.Сформулировать основную мысль текста в письменной форме, определить значение слов.
Математика 14 заданий. На решение даётся 60 минут. 1. Понимание делимости чисел, знание десятичных и обыкновенных дробей.
2. Умение найти неизвестный компонент арифметического действия, решать текстовые задачи на движение, работу, проценты и задачи практического содержания с применением геометрических представлений, извлечением данных из таблиц и диаграмм, построением алгоритмов действий и т.д.
История 8 заданий, 2 части, общее время на решение — 45 минут. 1 часть посвящена истории Древнего мира.

Ученик должен продемонстрировать умение работать с иллюстративным материалом, исторической картой, текстовыми историческими источниками, показать знание терминологии.

Вторая часть — по истории родного края.
Биология 10 заданий. На решение отведено 45 минут. 1. Умение определять на рисунке вирусы, растения, животных, сравнивать объекты, выявлять отсутствующий признак, систематизировать.
2. Умение работать с графической информацией и географической картой.
3. Анализ биологического текста.

6-8 классы

В 6, 7 и 8 классах предусмотрено проведение ВПР по двум обязательным предметам — русскому языку и математике, и двум выбранным случайным образом для каждого класса в параллели. Это может быть история, обществознание, биология, география, физика, химия (последние два предмета последовательно добавляются в 7 и 8 классах).

Информацию о распределении предметов по классам в параллели школа получает через личный кабинет в Федеральной информационной системе оценки качества образования (ФИСОКО).

Ранее дети писали контрольные по каждому предмету.

Также семиклассников ждёт ВПР по иностранному языку (английскому, немецкому или французскому).

Обязательный предмет Объём ВПР Что проверяют?
Русский язык 6 класс: 14 заданий, время выполнения 90 минут.

7 класс: 14 заданий, время выполнения 90 минут.

8 класс: 17 заданий, время выполнения 90 минут.
6 класс:

Правописание, умение проводить морфемный, морфологический, синтаксический разборы, анализировать различные виды предложений, понимание словообразования.

7 класс: база 6 класса + распознавание производных предлогов и союзов, а также причастных и деепричастных оборотов.

8 класс: база 6-7 классов + оценка умения правильно писать слова разных частей речи с НЕ, Н и НН, а также обосновывать выбор такого написания.
Математика 6 класс: 13 заданий, общее время на выполнение — 60 минут.

7 класс: 16 заданий, которые нужно сделать за 90 минут.

8 класс: 19 заданий, которые нужно сделать за 90 минут.
6 класс: усвоение понятий обыкновенной и десятичной дроби, отрицательных чисел, умение решать несложные логические задачи, находить пересечение, объединение, подмножество в простейших ситуациях, оперирование понятием модуль числа.

7 класс: база 6 класса + способность использовать формулы сокращённого умножения, решать задачи на проценты, линейные уравнения. Владение основными понятиями и единицами измерения длины, площади, объёма и т.д.

8 класс: база 7 класса + умение решать линейные и квадратные уравнения, а также системы уравнений, решение задач на части, на проценты, способность оценивать вероятность события, оперирование свойствами геометрических фигур.
Иностранный язык 6 заданий, две части. Время на решение 45 минут. Проходит только в 7 классе! Первая часть письменная, включает задания по аудированию, чтению, грамматике и лексике. Вторая часть устная, состоит из заданий по чтению текста вслух и говорению.


В ВПР по математике за 5 и 6 класс два последних задания проверяют развитие у ребёнка пространственных представлений, уровень логического мышления и умение проводить математические рассуждения. Детям, которые решили их, а также в целом успешно справились с ВПР, рекомендовано индивидуально развивать математические способности.

Содержание «случайных» ВПР по остальным предметам смотрите в конце статьи.

11 класс

Одиннадцатиклассники пишут ВПР по предметам, по которым не будут сдавать ЕГЭ, поэтому контрольные по русскому и математике для них не предусмотрены.

Выпускников ждут ВПР по иностранному языку (английскому, немецкому или французскому), биологии, химии, географии, истории, обществознанию, физике или химии — что останется после исключения сдаваемых для аттестации предметов.

Предмет  Объём ВПР  Темы
История 12 заданий, в том числе 1 по истории края. На выполнение 90 минут. От Древней Руси до истории СССР в 1914–1991 годах и новейшей истории России (с 1992–2012 годы). Требуется знание основных фактов, процессов, явлений, терминов, персоналий, а также причинно-следственных связей между событиями.
Биология 14 заданий. Время на выполнение — 90 минут. Методы научного познания, общие биологические процессы и системы, экосистемы, вид, клетка, организм, организм человека и его здоровье, генетика, эволюционная теория.
География  17 заданий. Время на выполнение — 90 минут. Темы за 8–11 классы, такие как источники географической информации, мировое хозяйство, природопользование и геоэкология, регионы и страны мира, специфика отдельных стран и регионов, их различия по уровню социально-экономического развития, география России.
Физика 18 заданий, 14 базовой сложности, 4 повышенной.

Время на выполнение — 90 минут.
Механика, молекулярная физика, электродинамика и квантовая физика, устройство и принцип действия технических объектов, практическое использование физических знаний, отличие теории от гипотез, самостоятельная оценка информации в СМИ, Интернете, научно-популярных статьях на основе полученных знаний.
Химия 15 заданий, 11 базового уровня и 4 повышенного. Время на выполнение — 90 минут. Теоретические и экспериментальные основы химии, методы познания в химии, важнейшие химические понятия, основные законы и теории химии, неорганическая и органическая химия, классификация и номенклатура органических и неорганических соединений и т.д.
Иностранные языки (английский, немецкий, французский). 6 заданий: 5 базового уровня и 1 повышенного.

На их выполнение отводится 65 минут.

ВПР пройдут в компьютерной форме, при выполнении заданий запрещено пользоваться черновиком.
Аудирование, чтение, грамматика, проверка лексико-грамматических навыков, осмысленное чтение текста вслух, устное описание выбранной фотографии.

Также в 2022 году в режиме апробации будут писать ВПР по географии десятиклассники, но описания проекта и демо-версии контрольной ещё нет.

Как подготовиться к ВПР?

В Рособрнадзоре заявляют, что задания ВПР подобраны таким образом, что при проведении контрольных всё необходимое учащимися уже было изучено, поэтому «натаскивать» их на контрольную не нужно, а покупка дополнительных учебных пособий для подготовки не требуется, хотя они и существуют.

Чтобы оценить уровень готовности к проверочной работе и понять, что от неё ждать, можно ознакомиться с демоверсиями работ. Они опубликованы на сайте ВПР и включают в себя не только примеры задач, но и ответы, а также объяснения решений с критериями оценивания, на которые будут опираться проверяющие учителя.

Поскольку оценка важнее для школы, чем для ученика, дополнительные занятия могут быть организованы по инициативе образовательной организации. Однако в целом какой-то сверхподготовки ВПР не требует и третировать этим ребёнка не нужно.

На что влияют результаты и что делать, если ребёнок завалил ВПР? Ответы на часто задаваемые вопросы

На что могут влиять результаты ВПР?

Поскольку ВПР – это не экзамен, а мониторинг уровня подготовки школьников во всех регионах России, их результаты, по своей сути, не имеют значения для детей.

Школа для снижения нагрузки на учеников и педагогической состав может выбрать проведение всероссийских проверочных работ в качестве формы текущего контроля предметной успеваемости и промежуточной аттестации с последующим выставлением отметок в классном журнале. Однако Рособрнадзор не рекомендует школам опираться на результаты ВПР для выставления годовых отметок обучающимся. Не предусматривает такой меры и закон «Об образовании РФ».

При этом результаты ВПР могут привлечь внимание к школе со стороны проверяющих Рособрнадзора и спровоцировать перепроверку сделанных контрольных. Это происходит, если при анализе результатов ВПР чиновники заметят признаки необъективного оценивания работ, например, завышение среднего балла, несоответствие результатов ВПР успеваемости детей, резкие колебания результатов в разных классах одной параллели.

Например, в 2019 году было выявлено порядка 2500 таких школ, из которых почти 200 показывали необъективные результаты ВПР несколько лет подряд. Рособрнадзор рекомендовал уволить их директоров.

Поэтому образовательные учреждения заинтересованы в подготовке детей к написанию ВПР и в результатах, которые в целом будут соответствовать уровню успеваемости учеников школы.

ВПР в 4 классе – это аналог выпускного экзамена?

Нет. Результаты ВПР учеников 4 классов не влияют на переход в другой класс или школу, не определяют дальнейший образовательный вектор ребёнка. Они имеют рекомендательный характер и могут быть использованы для восполнения недостающих знаний или, наоборот, для определения сильных сторон школьника в разных предметных областях.

Что будет, если ребёнок написал ВПР на «2»?

На самом деле – ничего. По закону выставляются такие оценки в журнал опционально, влияют они на четвертные отметки лишь косвенно и никак не влияют на итоговые годовые. Соответственно, на второй год ребёнка не оставят и в следующий класс переведут.

Нужно ли писать ВПР, если ребёнок на семейном или домашнем обучении?

По закону — нет. Всероссийская проверочная работа — это не экзамен, не промежуточная и тем более не итоговая аттестация, а мониторинг, нацеленный на выявление несовершенств образовательного процесса в школах, и оценивает он работу школы, а не успеваемость ребёнка.

Все аспекты семейного обучения определяет родитель школьника, он же отвечает за качество образования. Уровень полученных знаний ребёнка подтверждается на аттестации. Школа в данном случае отвечает только за её проведение, но не за результаты. Соответственно, участие в ВПР детей, находящихся на домашнем или семейном обучении, не предусмотрено.

Однако по опыту родителей хоумскулеров, государственные школы, к которым дети прикреплены для прохождения аттестации, всё равно настаивают на участии в ВПР. В таком случае можно подчиниться и написать, а можно просто не приходить на контрольную работу.

Читайте подробнее про альтернативные способы обучения детей: Всё, что нужно знать родителям про семейное обучение и Что такое анскулинг и возможно ли обучать ребёнка без школы?

ВПР — это аналог ЕГЭ или допуск к нему? Что важнее для выпускника?

В соответствии с приказом Минпросвещения и Рособрнадзора о порядке проведения государственной итоговой аттестации по программам среднего общего образования причинами для недопуска к ЕГЭ могут сдать:

  • академическая задолженность – отсутствие годовой отметки по какой-либо дисциплине, изучавшейся в выпускном классе;
  • неудовлетворительная итоговая оценка по любому из предметов программы 10 и 11 классов;
  • незачёт за итоговое сочинение/изложение.

ВПР — это не итоговая аттестация, соответственно, участие в ней и полученная оценка никак не влияют на допуск к ЕГЭ.

Единый госэкзамен для школьника, безусловно, важнее, чем ВПР, поскольку является одновременно итоговой аттестацией и вступительным экзаменом в вуз/колледж. Его результаты действуют целых 4 года, и в случае провала придётся потратить больше времени для перепоступления в нужное место. Результаты ВПР нужны только школьному методисту и чиновникам.

Можно ли не писать ВПР?

Да, можно. Согласно методическим рекомендациям Рособрнадзора, участниками ВПР «являются все обучающиеся соответствующих классов всех образовательных организаций Российской Федерации, реализующих программы начального общего, основного общего и/или среднего общего образования».

Однако такие письма – не нормативные правовые акты и, соответственно, не могут устанавливать какие-либо обязательства. С точки зрения законодательства, санкции за отказ от участия в ВПР ни ученику, ни его родителям не грозят. Единственное вполне вероятное последствие – личная неприязнь к ребёнку со стороны школьной администрации.

Как отказаться от участия в ВПР?

Родителю/законному представителю ребёнка необходимо написать соответствующее заявление в свободной форме на имя директора школы. В нём необходимо указать, что вы не даёте согласие на участие ребёнка в ВПР, поскольку это

мониторинговое мероприятие, не входящее в учебный план, не являющееся итоговой или промежуточной аттестацией, а также формой текущего контроля успеваемости.

Пример такого заявления можно найти в интернете.

Кстати, в случае болезни ученик, пропустивший ВПР, не обязан писать её позже.

Критика ВПР: почему эти проверки не нравятся ни детям, ни учителям?

Изначально цель введения Всероссийских проверочных работ – выявить и устранить пробелы и недочёты в школьном образовании всех уровней. Однако внедрённую в жизнь инициативу не оценили ни школьники, которые пугаются одного названия этой контрольной, ни учителя, на плечи которых, по сути, легли все организационные моменты.

Почему педагоги против ВПР?

По данным опроса, половина учителей отменили бы ВПР совсем, ещё 39% модернизировали бы их. Лишь 7% респондентов оставили бы проверочные в текущем виде. При этом 59% учителей вносят корректировки в учебный процесс по результатам ВПР, а 37% никак не используют.

Весной 2021 года профсоюз «Учитель» создал петицию с требованием отменить ВПР, которую подписали более 32 тысяч человек.

«Мы, педагоги и родители школьников, требуем отменить проведение ВПР в российских школах! Учителя имеют достаточно возможностей и инструментов для оценивания знаний своих учеников. ВПР отнимают бесценное время очных уроков, которые так нужны, чтобы наверстать упущенное за время пандемии!», – сказано в тексте требования.

Причины, по которым учителя не любят ВПР:

Это бесплатная сверхурочная работа

В разъяснениях Рособрнадзора сказано, что проведение контрольных работ учителями является их неотъемлемой рабочей задачей, а ВПР по своей сути такая же контрольная, поэтому дополнительная оплата при организации и проведении всероссийской проверочной работы учителю не предусмотрена.

Это мешает освоению учебной программы

ВПР проводятся вместо уроков, поэтому неизученные темы нужно куда-то перенести и изучить потом. Помимо этого учитель должен выделить дополнительные часы на подготовку к всероссийской проверочной. Официально такие «консультации» также не предусмотрены и, соответственно, учителю приходится проводить их в нерабочее время, либо в ущерб внеклассным занятиям. Опять же, бесплатно.

Школа должна сама найти ресурсы для проведения ВПР

На печать бланков для контрольной, а также контрольно-измерительных материалов для подготовки детей школы не получают никаких дополнительных средств. В итоге расходы нередко ложатся на учителей или родителей.

Это необъективный метод оценки знаний

Задания ВПР не учитывают отличия школьных программ и учебников. В итоге ребёнку могут попасться задания, которых не было в его учебнике, по теме, которую он ещё не проходил.

Не понятно, как использовать результаты ВПР

Анализируют результаты и корректируют учебные программы по итогам контрольных региональные институты развития образования, предлагающие курсы повышения квалификации педагогам, методисты школ и сами учителя, а федерального применения результатам всероссийской проверочной работы, за исключением создания перечня школ с необъективными результатами ВПР, нет.

За что не любят ВПР родители?

В первую очередь, за то, что это — ещё одна контрольная, к тому же, имеющая всероссийский статус — лишний стресс для школьников, особенно в конце года, когда все усилия сосредоточены на получение хороших итоговых отметок.

Если говорить о выпускниках, то проведение ВПР совпадает с подготовкой к ЕГЭ и не только создает дополнительную нагрузку, но и отвлекает. При этом приоритет выпускного экзамена для ученика 11 класса значительно выше, чем ВПР, но от детей требуют хорошей подготовки к проверочной работе, оценка за которую для них не особо важна.

«Моя дочь учится сейчас в 4 классе, и вся наша жизнь теперь идёт под лозунгом «Готовимся к ВПР». В прошлом учебном году мой сын закончил 11 класс в этой же самой школе, сдавал ЕГЭ. Так вот, подготовки к ЕГЭ в школе не было никакой вообще. Потому что всем давно известно, что в хорошей сдаче ЕГЭ заинтересован лишь сам выпускник. А вот ВПР – совсем другое дело! Школе очень интересны результаты ВПР: чем они лучше, тем лучше для школы.

Мне, как маме школьника, хочется всё-таки понять, почему интересы школы и интересы учеников вдруг перестали совпадать совсем? Школе важны результаты ВПР, неинтересные детям. Детям важны результаты ОГЭ и ЕГЭ, неинтересные школе. О каком качестве образования может идти речь, если образовательные цели у школы и учащихся не совпадают?» – пишет в канале Яндекс-дзен мама двоих детей.

Смущает родителей и неопределённый статус результатов ВПР:

«ВПР – для чего и кого они нужны? Детям? Им дополнительная нагрузка, стресс. А если не напишут, что будет? Ничего. Тогда зачем писать?

Родителям? Они тоже смысла не видят, это же не итоговая контрольная работа за год, тогда зачем она?

Преподавателям? Они и без ВПР знают уровень своих учеников. Тогда зачем они?» – подобные комментарии, полные недоумения, часто встречаются в интернете и соцсетях, когда речь заходит про всероссийские проверочные работы.

Расписание ВПР 2021/22

В 2021 году, несмотря на пандемию и дистанционное обучение, ВПР для обучающихся 4-8 классов прошли в штатном режиме, весной. Ученики 11 классов писали контрольный срез по решению школы. Всего, по данным Рособрнадзора, в текущем году прошли через ВПР более 7 миллионов школьников.

Недавно Рособрнадзор утвердил график проведения ВПР в 2022 году:

Класс Период проведения ВПР 2022
4-6, 8 С 15 марта по 20 мая
7 С 15 марта по 20 мая (с 1 апреля по 20 мая – ВПР по иностранному языку)
10, 11 С 1 по 25 марта

Итоговые даты проведения ВПР для каждого класса и по конкретным предметам школы определяют самостоятельно в рамках установленного расписанием периода.

Стоит ли бояться ВПР?

Ходят легенды, что дети, понявшие суть ВПР, сдают в конце контрольной пустые бланки, доводя педагогов до истерики. Правда это или нет – неважно. В любом случае, делать так не стоит, как и не стоит чрезмерно переживать и готовиться к всероссийской проверочной. Её результаты вполне можно применить для оценки количества пробелов в знаниях, а также умения решать нетипичные для школы задачи.

ВПР 6-8 классов по неосновным предметам

Предмет Объём ВПР Темы
История 6 класс: 10 заданий, 2 части, время на выполнение 60 минут.

7 класс: 12 заданий, 2 части, время на выполнение 60 минут.

8 класс: 12 заданий, 2 части, время на выполнение 60 минут.
6 класс: История России и зарубежных стран в Средние века + история родного края.

7-8 классы: История России и зарубежных стран в Новое время + история родного края.
Обществознание 6 класс: 8 заданий, которые нужно решить за 45 минут.

7 класс: 9 заданий, которые нужно решить за 45 минут.

8 класс: 10 заданий, которые нужно решить за 45 минут.
6 класс: проверка знаний основ социологических и статистических наук, базовых социальных ролей, межличностных отношений.

7 класс: проверка умения определять общественное мнение, анализировать социальную ситуацию.

8 класс: умение применять обществоведческие знания в процессе решения типичных задач в области социальных отношений, анализировать деятельность в духовной и экономической сферах жизни с опорой на личный социальный опыт.
География  6 класс: 10 заданий, время на решение — 60 минут.

7 и 8 класс: 8 комплексных заданий, включающих от 2 до 4 пунктов. Время на решение 90 минут.
6 класс: исследования и основные открытия великих путешественников, материки и океаны, планетарные явления, наиболее известные природные и культурно-исторические достопримечательности стран.

7 класс: этапы географического освоения Земли, знания о климатических и природных особенностях материков и частей света.

8 класс: база 7 класса + знание столиц государств, умение узнавать страны по фото.
Биология  6 класс: 10 заданий, на которые отводится 45 минут.

7 класс: 13 заданий, на которые отводится 60 минут.

8 класс: 13 заданий, на которые отводится 60 минут.
6 класс: проверка умений описывать биологический процесс, понимать биологические тексты, работать с микроскопическими объектами, а также знания из ботаники.

7 класс: методы изучения живых организмов, их классификация, клеточные и неклеточные формы жизни, растения, бактерии, грибы. Бережное отношение к природе.

8 класс: зоология, общие свойства организмов, классификация животных, позвоночные и беспозвоночные, значение животных в мире и жизни человека, бережное отношение к природе.
Физика 7 класс: 11 заданий, которые нужно решить за 45 минут.

8 класс: 11 заданий, которые нужно решить за 45 минут.
7 класс: роль эксперимента в физике, базовые представления о физической сущности явлений в природе и в быту, физические величины и т.п.

8 класс: использование законов физики в различных условиях, сопоставление экспериментов и теорий, решения задач с графиком или схемой электрической цепи, понимание темы «Магнитные явления».
Химия  8 класс: 9 заданий, 3 из которых относятся к повышенному уровню сложности.

На решение отведено 90 минут.
Понимание состава и строения атома, разницы между химическими веществами и их смесями, химическими реакциями и физическими явлениями, областей применения химических веществ, расчёт молярой массы газообразного вещества, массовой доли вещества в растворе.

различных ролей на протяжении жизненного цикла вируса

Реферат

Геномы вирусов иммунодефицита человека и обезьян (ВИЧ и SIV) кодируют гены gag, pol и env и содержат не менее шести дополнительных открытых рамок считывания, обозначенных tat , rev. , nef , vif , vpr , vpx и vpu . В то время как гены tat и rev кодируют регуляторные белки, абсолютно необходимые для репликации вируса, nef , vif , vpr, vpx и vpu кодируют небольшие белки, называемые «вспомогательными» (или «вспомогательными»). ), поскольку их экспрессия обычно необходима для роста вируса во многих системах in vitro .Однако эти вспомогательные белки необходимы для репликации вируса и патогенеза in vivo . Два гена, родственные vpr и vpx , обнаружены только у представителей группы HIV-2 / SIVsm / SIVmac, тогда как лентивирусы приматов из других линий (HIV-1, SIVcpz, SIVagm, SIVmnd и SIVsyk) содержат single vpr ген. В этом обзоре мы в основном сосредоточимся на vpr из ВИЧ-1 и обсудим самые последние достижения в нашем понимании функций Vpr и его роли во время цикла репликации вируса.

Введение

Вирусный белок R (Vpr) ВИЧ-1 представляет собой небольшой основной белок (14 кДа) из 96 аминокислот, хорошо консервативный в ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV [1]. Роль Vpr в патогенезе СПИДа неоспорима, но его реальные функции при естественном течении инфекции все еще остаются предметом дискуссий. Роль Vpr в патофизиологии СПИДа была исследована на макаках-резусах, экспериментально инфицированных SIVmac, и первоначально было показано, что обезьяны, инфицированные нулевым мутантом SIV vpr , снижали репликацию вируса и замедляли прогрессирование заболевания [2,3].Более того, обезьяны, инфицированные SIV, который не экспрессировал гены vpr и vpx , показали очень низкую вирусную нагрузку и не заболели иммунодефицитом [4,5]. Что касается этих фенотипических эффектов in vivo , многочисленные лаборатории проанализировали роль Vpr в различных системах in vitro, , in vivo, и ex vivo, , чтобы изучить вклад этого белка на различных этапах жизненного цикла вируса. . Несмотря на свой небольшой размер, Vpr, как было показано, выполняет множество функций во время репликации вируса, включая влияние на точность процесса обратной транскрипции, ядерный импорт вирусной ДНК как компонента преинтеграционного комплекса (PIC), прогрессирование клеточного цикла, регуляция апоптоза и трансактивация ВИЧ-LTR, а также генов клетки-хозяина (рис.). Кроме того, Vpr обнаружен в вирионах, в клетках и существует в виде свободных молекул, обнаруженных в сыворотке и спинномозговой жидкости больных СПИДом, что указывает на то, что он может осуществлять свои биологические функции различными способами.

Схематическое изображение ранних стадий инфицирования ВИЧ-1 клетки-мишени. Выделены функциональные события, в которых участвует белок Vpr. Было показано, что Vpr играет несколько функций в течение жизненного цикла вируса, включая влияние на точность процесса обратной транскрипции, ядерный импорт вирусной ДНК как компонента преинтеграционного комплекса, прогрессию клеточного цикла, регуляцию апоптоз и трансактивация HIV-LTR, а также генов клетки-хозяина.

Структура белка Vpr ВИЧ-1

Поскольку полноразмерный белок агрегирован в водном растворе, общая структура Vpr была труднодоступна [6], и в предварительных стратегиях использовались два различных синтетических пептида, соответствующие Vpr (1– 51) и (52–96) для исследования ЯМР и кругового дихроизма [6–9]. Как предсказывалось ранее [10], структура фрагмента Vpr (1–51) имеет длинный мотив типа α спиральный виток-α спираль, охватывающий область Asp17-Ile46, и заканчивается γ витком [8].Фрагмент Vpr (52–96) содержит α-спираль, охватывающую область 53–78, богатую остатками лейцина [7]. Одна сторона спирали предлагает участок гидрофобных остатков, которые могут образовывать мотив, подобный лейциновой молнии [11]. Эта структура может объяснять образование димеров Vpr [7,12,13] и / или взаимодействие с клеточными партнерами [14]. Наконец, недавно был проведен ЯМР-анализ растворимого полноразмерного полипептида Vpr (1–96), который дал доступ к третичной структуре белка (рис.), что подтверждает амфипатическую природу трех α-спиралей Vpr ВИЧ-1. Спирали соединены петлями и свернуты вокруг гидрофобного ядра [15], окруженного гибким N-концевым доменом и C-концевым участком, богатым аргинином, которые имеют отрицательный и положительный заряд, соответственно. В N-концевом домене обнаружены четыре консервативных пролина (положения 5, 10, 14 и 35), которые представляют изомеризацию цис / транс [16]. Сообщалось, что клеточная пептидил-пропилизомераза циклофилин A способна взаимодействовать с Vpr через пролины в положениях 14 и 35, что обеспечивает правильную укладку вирусного белка [17].Карбокси-конец Vpr содержит шесть аргининов между остатками 73 и 96. Этот домен демонстрирует сходство с доменами богатых аргинином белков трансдукции (PTD) и может объяснять трансдукционные свойства Vpr, включая его способность пересекать липид клеточной мембраны. двухслойный [6,18-20].

Трехмерная структура белка Vpr ВИЧ-1 (из [15]). Три α-спирали (17–33, 38–50, 55–77) окрашены в розовый, синий и оранжевый цвета соответственно; петли и гибкие домены — зеленым.Мы можем локализовать остаток Trp54 между второй и третьей а-спиралью, и это, вероятно, доступно для белок-белкового взаимодействия с UNG2 [54].

Vpr упакован в вирусные частицы

Vpr экспрессируется на поздней стадии жизненного цикла вируса, но присутствует на ранних этапах инфицирования клеток-мишеней, поскольку он упакован в вирионы, высвобождаемые из продуцирующих клеток. Включение Vpr происходит посредством прямого взаимодействия с карбокси-концевой областью p6 Gag предшественника Pr55 Gag , кодируемого gag [21-24].В то время как целостность α-спиралей Vpr требуется для эффективной упаковки в вирионы [25], богатый лейцином мотив, обнаруженный в области p6 Gag предшественника Pr55 Gag , непосредственно участвует во взаимодействии с Vpr [25]. 23,26]. После сборки и протеолитического расщепления Pr55 Gag в матриксе, капсиде, нуклеокапсиде (NCp7) и зрелых белках p6, Vpr рекрутируется в коническое ядро ​​вирусной частицы [27,28], где он тесно связан с вирусной РНК. [29,30].Интересно, что Vpr проявляет более высокую авидность к NCp7, чем к зрелому белку p6 [23,24,31]. Поскольку p6 исключен из ядра вириона [27,28], Vpr может переключаться с области предшественника p6 Gag на зрелый белок NCp7, чтобы получить доступ к ядру инфекционной вирусной частицы, отрастающей на поверхности клетки. Похоже, что Vpr менее активен для полностью процессированного белка p6, чем для области p6 Gag в контексте предшественника p55 Gag . Из-за этой дифференциальной авидности Vpr рекрутируется в ядро ​​частицы, где он может взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами, NCp7 [24,31] и / или матриксным белком [32].Поскольку было подсчитано, что Vpr эффективно включается при соотношении Vpr / Gag ~ 1: 7 [33], это может составлять 275 молекул Vpr на вирион.

Включение Vpr также использовалось как уникальный инструмент для нацеливания грузов (например, клеточных и вирусных белков, лекарств) на вирусные частицы [34,35]. Это свойство широко использовалось для изучения соответствующих функций интегразы (IN) и обратной транскриптазы (RT) во время репликации вируса путем экспрессии слияния Vpr-IN и Vpr-RT в транс- в вирус-продуцирующих клетках [36-38].Эта стратегия дополнения trans также позволила анализировать мутант IN без изменения сборки, созревания и других последующих вирусных событий [37,39].

Кроме того, Vpr, слитый с зеленым флуоресцентным белком (GFP), недавно был использован для маркировки частиц ВИЧ, чтобы проследить внутриклеточное поведение вируса на ранних этапах инфицирования клеток-мишеней [40,41].

Vpr влияет на точность процесса обратной транскрипции

После проникновения вируса ядро ​​вируса высвобождается в цитоплазму клетки-мишени, и обратная транскрипция вирусной РНК происходит в цитоплазме внутри большого нуклеопротеинового комплекса, называемого обратным транскрипционный комплекс (RTC), содержащий две копии вирусной РНК и вирусные белки: RT, IN, NCp7, Vpr и несколько молекул матричного белка [42–46].Обычно считается, что процесс обратной транскрипции инициируется в вирусных частицах и затем завершается после проникновения вируса в цистозоле клетки-мишени. Этот процесс, скорее всего, сопровождает как снятие оболочки вируса, так и его транспортировку через цитозоль (обзоры см. [47,48]). Недавние исследования подтвердили, что Vpr совместно локализуется с вирусными нуклеиновыми кислотами и IN в очищенных RTC ВИЧ-1 [41,45,49] и остается связанным с вирусной ДНК в течение 4–16 часов после острой инфекции [43].

Помимо потенциальной роли в стадии инициации процесса обратной транскрипции [50], было показано, что Vpr модулирует частоту мутации in vivo ВИЧ-1, влияя на точность обратной транскрипции. ОТ ВИЧ-1 представляет собой подверженную ошибкам РНК-зависимую ДНК-полимеразу, и количественная оценка уровня in vivo прямой вирусной мутации за цикл репликации показала, что скорость мутаций была в четыре раза выше в отсутствие экспрессии Vpr при измерении. в активно делящихся клетках с использованием генно-инженерной системы [51,52].Более того, недавний анализ неделящихся клеток показывает, что этот фенотип усугубляется в первичных макрофагах, происходящих из моноцитов (MDM), что приводит к 18-кратному увеличению частоты мутаций ВИЧ-1 [53]. Эта активность четко коррелирует с взаимодействием Vpr с ядерной формой урацил-ДНК-гликозилазы (UNG2) [54], фермента, участвующего в пути эксцизионной репарации оснований, который специфически удаляет урацил-основание РНК из ДНК. Урацил может попадать в ДНК либо из-за неправильного включения dUTP, либо из-за дезаминирования цитозина.Первоначально идентифицированный из дрожжевого двухгибридного скрининга с использованием Vpr в качестве приманки, взаимодействие с UNG было подтверждено как in vitro , так и ex vivo в клетках, экспрессирующих Vpr. Хотя было показано, что остаток Trp в положении 54, расположенный в открытой петле, соединяющей вторую и третью α-спирали Vpr ВИЧ-1, имеет решающее значение для поддержания взаимодействия с UNG, сайт связывания Vpr был картирован в С-концевой части. UNG2 и происходит через мотив TrpXXPhe. В настоящее время три различных клеточных партнера Vpr содержат мотив WXXF, включая фактор транскрипции TFIIB, аденозин-нуклеотидный транслокатор (ANT) и UNG2 [55,56].

Ассоциация Vpr с UNG2 в вирусопродуцирующих клетках позволяет включать каталитически активный фермент в частицы ВИЧ-1, где UNG2 может напрямую влиять на точность обратной транскрипции [54], и это играет особую роль в модуляции скорость мутации вируса. Модель, поддерживающая прямой вклад включенного UNG2 в процесс обратной транскрипции, была недавно продемонстрирована с помощью экспериментальной системы, в которой UNG2 рекрутируется в вирионы независимо от Vpr.UNG2 был экспрессирован как химерный белок, слитый с C-концом мутанта VprW54R, варианта Vpr, который не может рекрутировать UNG2 в вирионы и влиять на скорость мутации вируса, даже несмотря на то, что он включен так же эффективно, как и белок дикого типа (wt ) Vpr белок. Слияние VprW54R-UNG также эффективно упаковывается в вирионы ВИЧ-1 и восстанавливает скорость мутаций, эквивалентную наблюдаемой с Vpr дикого типа, как в активно делящихся клетках, так и в MDM. В соответствии с этим фенотипом частоты вирусных мутаций, наконец, было задокументировано, что Vpr-опосредованное включение UNG2 в вирусные частицы способствует способности ВИЧ-1 реплицироваться в первичных макрофагах.Когда вариант VprW54R был введен в инфекционный молекулярный клон ВИЧ-1, репликация вируса в MDM снижалась и задерживалась, тогда как репликация в PBMC не изменялась из-за отсутствия включения UNG2 в вирусные частицы. Хотя было высказано предположение, что вирусная интеграза также способна опосредовать взаимодействие с UNG2, Vpr кажется основной вирусной детерминантой, которая делает возможным включение клеточного UNG2 в вирусные частицы. Однако предварительные результаты, полученные из анализов связывания in vitro , предполагают, что и Vpr, и IN связываются с UNG с образованием тримерного комплекса (ELR и SB, неопубликованные результаты), но требуются дальнейшие анализы для документирования характера взаимодействий между UNG2, Vpr, IN, а также RT как в вирус-продуцирующих клетках, так и в клетках-мишенях.

ВИЧ-1 и другие лентивирусы необычны среди ретровирусов по своей способности инфицировать покоящиеся или окончательно дифференцированные клетки. Хотя было показано, что Vpr облегчает ядерный импорт вирусной ДНК в неделящиеся клетки, включение вириона UNG2 через Vpr также способствует способности ВИЧ-1 реплицироваться в первичных макрофагах. Это означает, что UNG2 является клеточным фактором, который играет важную роль на ранних стадиях цикла репликации ВИЧ-1 (т.е. синтез вирусной ДНК).Это наблюдение хорошо согласуется с недавним сообщением, показывающим, что неправильное включение урацила в минус-цепь вирусной ДНК влияет на инициацию синтеза плюс-цепи ДНК in vitro [57]. Это наблюдение предполагает, что UNG, вероятно, рекрутируется в частицы ВИЧ-1, чтобы впоследствии минимизировать вредное накопление урацила во вновь синтезированной провирусной ДНК. Хотя необходимы дальнейшие исследования для объяснения точного механизма того, как каталитическая активность UNG может специфически влиять на репликацию ВИЧ-1 в макрофагах, стоит отметить, что неделящиеся клетки экспрессируют низкие уровни UNG и содержат относительно высокие уровни dUTP [58].Точно так же большинство лентивирусов неприматов, таких как вирус иммунодефицита кошек (FIV), вирус артрита-энцефалита коз (CAEV) и инфекционная анемия лошадей (EIAV), также разработали эффективную стратегию уменьшения накопления урацила в вирусной ДНК. Эти лентивирусы кодируют и упаковывают dUTP-пироптофатазу (dUTPase) в вирусные частицы, фермент, который гидролизует dUTP до dUMP и, таким образом, поддерживает низкий уровень dUTP. Интересно, что репликация FIV, CAEV или EIAV, которые лишены функциональной активности dUTPase, серьезно нарушается в неделящихся клетках-хозяевах (например,g., первичные макрофаги). Взятые вместе, эти результаты показывают, что неправильное включение урацила в цепи вирусной ДНК во время обратной транскрипции вредно для текущих этапов жизненного цикла вируса. Присутствие вирусной dUTPase или клеточного UNG предотвратит эти пагубные эффекты для репликации лентивирусов неприматов и приматов в макрофагах, соответственно.

Кроме того, интересно отметить, что два вспомогательных вирусных белка из ВИЧ-1, Vpr и Vif, могут влиять на точность синтеза вирусной ДНК.Белок Vif образует комплекс с клеточной дезаминазой APOBEC-3G (CEM15), предотвращая его инкапсидацию в вирионы [59-63], в то время как Vpr связывает фермент репарации ДНК, UNG, чтобы привлечь его к частицам. Возникает соблазн предположить, что действие обоих вирусных белков может влиять на скорость мутаций во время инфекции ВИЧ-1, и их баланс может играть ключевую роль во время прогрессирования заболевания у инфицированных людей.

Vpr и ядерный импорт вирусного преинтеграционного комплекса

Неделящиеся клетки, такие как покоящиеся Т-клетки и терминально дифференцированные макрофаги, являются важными мишенями для репликации вируса на начальных стадиях инфекции, поскольку первичное инфицирование этих популяций клеток способствует созданию резервуаров вируса, критически важных для последующего распространения вируса в лимфоидные органы и Т-хелперные лимфоциты [64].Заражение лимфоидной гистокультуры с использованием ткани миндалин или селезенки человека показало, что Vpr значительно усиливает репликацию ВИЧ в макрофагах, но не влияет на продуктивную инфекцию пролиферирующих или покоящихся Т-клеток [65]. После проникновения вируса в клетку вирусный капсид быстро снимается с оболочки, и завершается обратная транскрипция геномной РНК ВИЧ-1, приводящая к полноразмерной двухцепочечной ДНК. Эта вирусная ДНК связывается с вирусными белками и белками клетки-хозяина в так называемый преинтеграционный комплекс (PIC).В отличие от онкоретровирусов, которым требуется распад ядерной оболочки во время митоза для интеграции своего вирусного генома в хромосомы хозяина, лентивирусы, такие как ВИЧ и SIV, разработали стратегию импорта собственного генома через оболочку межфазного ядра посредством активного механизма 4–6 ч после заражения (см. обзор [66]). Сообщалось, что Vpr усиливает транспорт вирусной ДНК в ядро ​​неделящихся клеток [67-69], способствуя прямым или косвенным взаимодействиям с клеточными механизмами, регулирующими ядерно-цитоплазматическое перемещение [70-74].

PIC на пути к NE

Точный состав PIC все еще является предметом споров, но он содержит вирусную ДНК, по крайней мере, связанную с интегразой, и многие недавние исследования подтвердили, что Vpr также является неотъемлемым компонентом этого комплекса. (обзоры см. в [75–77]). Конечно, PIC, вероятно, содержит клеточные факторы, которые участвуют как во внутрицитоплазматической маршрутизации, так и в ядерной транслокации вирусной ДНК. В то время как микрофиламенты актина, по-видимому, играют роль в ранних событиях инфекции, действуя как каркас для соответствующей локализации и активации RTC [78], PIC тесно связан с микротрубочковыми структурами в цитоплазме.Изящная система, использующая Vpr, слитый с GFP, в качестве зонда была разработана для отслеживания движения PIC вскоре после проникновения вируса в живые клетки [40]. Было показано, что PIC, меченный GFP-Vpr, продвигается по цитоплазме вдоль цитоскелетных филаментов, а затем накапливается в перинуклеарной области рядом с центросомами. Точнее, было замечено, что вирусный комплекс использует цитоплазматический динеиновый мотор для перемещения по сети микротрубочек для миграции к ядру. Пока не известно, играет ли Vpr активную роль во время этого движения PIC вдоль микротрубочек или он только связан с комплексом, а затем активно участвует в последующих этапах, включая прикрепление PIC к ядерной оболочке (NE). и ядерная транслокация вирусной ДНК.

Vpr стыкуется с NE

Действительно, Vpr проявляет очевидные кариофильные свойства и локализуется в ядре, но значительная часть закрепляется в NE и может быть визуализирована как окрашивание обода ядра в экспериментах по флуоресцентной микроскопии [73,79-81 ]. NE состоит из двух концентрических внутренней и внешней мембран, усеянных комплексами ядерных пор (NPC), которые образуют канал с центральным водным каналом, который позволяет селективно перемещаться между ядром и цитоплазмой и создает барьер проницаемости для свободной диффузии макромолекул или комплексов.NPC соответствует структуре 125-MDa, состоящей из 30 различных белков ядерных пор, названных нуклеопоринами (Nups) [82]. Специфическая субпопуляция Nups содержит FG- или FxFG пептидные повторы, которые составляют большую часть нитевидных структур, исходящих с обеих сторон NPC и которые обеспечивают сайты стыковки для различных транспортных факторов [83]. Первоначальные исследования показали, что Vpr ВИЧ-1 связывается с FG-богатой областью нескольких нуклеопоринов, включая Nups p54 и p58 человека, POM121 грызунов и NUP1P дрожжей [71,73,74], но напрямую взаимодействует с CG1 человека. о нуклеопорине сообщалось совсем недавно [70].Это взаимодействие не опосредуется участком FG-повтора этого Nup, а скорее через участок без консенсусного мотива, расположенный на N-конце белка. Используя анализ ядерного импорта in vitro , было продемонстрировано, что ассоциация с N-концевой областью hCG1 необходима для стыковки Vpr с NE, тогда как область FG-повтора не участвует в этом процессе [70 ]. Роль Vpr в NE не ясна, но можно предложить два объяснения. Во-первых, эта локализация может объяснить нацеливание PIC на NPC до его транслокации в ядерный компартмент.В этой модели связанный с вирионом Vpr будет в первую очередь участвовать, после проникновения вируса и его снятия оболочки, на начальном этапе стыковки вирусной ДНК с NPC, в то время как другие кариофильные детерминанты PIC, такие как IN, затем позволят второй этап ядерной транслокации для продолжения [81,84-86]. Альтернативно, другое объяснение может исходить из наблюдения, что Vpr был способен спровоцировать грыжи и преходящие разрывы NE [87]. Молекулярный механизм, поддерживающий локальный взрыв, индуцированный Vpr, неизвестен, но взаимодействие Vpr с нуклеопоринами может вызывать начальную неправильную сборку NPC, ведущую к изменениям архитектуры NE.Следовательно, эти временные разрывы могут обеспечить нетрадиционный путь проникновения вирусного ПОС в ядро ​​[87,88].

Транслокация Vpr в ядро ​​

Несмотря на отсутствие какого-либо идентифицируемого сигнала канонической ядерной локализации (NLS), Vpr проявляет очевидные кариофильные свойства и быстро нацеливается на ядро ​​клетки-хозяина после заражения [89]. Несмотря на то, что небольшой размер Vpr не требует строго NLS-зависимого процесса, эксперименты, проведенные как in vitro , так и на трансфицированных клетках, показали, что Vpr способен активно стимулировать ядерный импорт репортерного белка, такого как BSA, β- галастозидаза или GFP [10,13,90-94].Подобно белкам, содержащим NLS основного типа, первоначально было предположено, что Vpr использует importin α-зависимый путь для доступа к ядерному компартменту [72,73]. Кроме того, Vpr может усиливать изначально низкое сродство вирусной МА к импортину α, что позволяет импортировать МА в ядро ​​[95,96], но существуют противоречивые данные о ядерной локализации этого вирусного белка [81,85]. Наконец, сообщалось, что ядерный импорт Vpr опосредуется неидентифицированным путем, отличным от классических NLS- и M9-зависимых путей [92].Два независимых сигнала ядерного нацеливания были охарактеризованы в последовательности Vpr ВИЧ-1, один охватывает α-спиральные домены в N-концевой части белка, а другой — в богатой аргинином С-концевой области [92,94]. Эти результаты согласуются с данными, показывающими, что структура α-спиральных доменов Vpr должна поддерживаться как для его ядерной локализации, так и для связывания Vpr с нуклеопоринами [25,70,80].

В заключение, нуклеофильное свойство Vpr и его высокое сродство к NPC, связанное с его присутствием в вирусном PIC, по крайней мере, подтверждают его роль на этапе стыковки PIC в NE, что является предварительным условием перед транслокацией вирусного PIC. ДНК в ядро.Несмотря на то, что нет доказательств того, что Vpr непосредственно участвует в процессе транслокации, стоит отметить, что очищенные PICs также стыковываются с NE перед ядерной транслокацией, используя путь, также отличный от путей ядерного импорта NLS и M9 [49]. Можно предположить, что среди избыточности сигналов ядерной локализации, характерных для PIC, как в ассоциированных вирусных белках (т.е. IN, MA, Vpr), так и в вирусной ДНК [97], Vpr в первую очередь служит для стыковки PIC с NE, в то время как IN и MA действуют совместно с центральным лоскутом ДНК, чтобы нацелить вирусную ДНК на ядро ​​(см. обзор [98]).

Vpr, нуклеоцитоплазматический белок

В дополнение к нетрадиционному NLS для нацеливания в ядро, Vpr представляет собой динамический мобильный белок, способный перемещаться между ядром и цитоплазматическими компартментами [23,99,100]. Эксперименты по фотообесцвечиванию живых клеток, экспрессирующих слияние Vpr-GFP, подтвердили, что Vpr проявляет свойства ядерно-цитоплазматического челночного перемещения [70]. Эта челночная активность связана с дистальной, богатой лейцином спиралью, которая может формировать классический CRM1-зависимый сигнал экспорта из ядра (NES) [99].Точная роль этого NES в функции Vpr неизвестна, но поскольку Vpr быстро импортируется в ядро ​​после биосинтеза, NES может перенаправить его в цитоплазму для последующего включения в вирионы посредством прямого связывания с вирусным предшественником p55 Gag . во время поздней стадии бутонизации жизненного цикла вируса [23,100].

Vpr и клеточный цикл

Другая важная биологическая активность белков Vpr SIV и ВИЧ связана с их способностью вызывать остановку в фазе G2 клеточного цикла инфицированных пролиферирующих Т-клеток человека и обезьяны [91,101-105] .Остановка клеточного цикла не требует синтеза Vpr de novo, но индуцируется молекулами Vpr, упакованными в инфицирующие вирионы [87,106]. Это указывает на то, что индукция остановки клеточного цикла G2 может произойти до стадии интеграции вирусного ДНК-генома. Примечательно, что делящиеся дрожжи S. pombe , а также S. cerevisiae , сверхэкспрессирующие Vpr ВИЧ-1, также блокируются в фазе G2 клеточного цикла [107-109], подтверждая идею о том, что клеточный путь изменен. by Vpr хорошо сохраняется во всех эукариотических клетках.Более того, заражение козьих клеток вирусом козьего артрита энцефалита (CAEV), экспрессирующим ген vpr из SIV, аналогичным образом спровоцировало арест G2 [110]. Биологическое значение этого ареста во время естественной инфекции не совсем понятно, но LTR ВИЧ-1, по-видимому, более активен в фазе G2, подразумевая, что арест G2 может создавать благоприятную клеточную среду для эффективной транскрипции ВИЧ-1 [ 111]. В соответствии с этим, Vpr-индуцированная остановка G2 коррелирует с высоким уровнем вирусной репликации в первичных Т-клетках человека.

Детерминанты блокирующей активности G2 в основном расположены в С-концевой неструктурированной основной области Vpr ВИЧ-1, и требуется фосфорилирование белка [112,113]. Регуляторы клеточного цикла, такие как циклин-зависимые киназы (CDK), контролируют прохождение клеточного цикла посредством обратимого фосфорилирования [114]. CDK p34 / cdc2 ассоциируется с циклином B1 в фазе G2 (см. Обзор [115]), чтобы регулировать переход G2 в M. Накопление клеток, экспрессирующих Vpr в фазе G2, коррелирует с инактивацией киназы p34 / cdc2-cyclinB [102,103].Активность cdc2 контролируется противоположными эффектами киназ Wee-1 и Myt1 и фосфатазы cdc25. Wee1 ингибирует активность cdc2 посредством фосфорилирования тирозина, в то время как дефосфорилирование cdc2 фосфатазой cdc25 способствует активации cdc2-cyclinB, которая приводит клетки к митозу. Активность как cdc25, так и Wee-1 также регулируется фосфорилированием / дефосфорилированием. Первоначально было описано, что клетки, экспрессирующие Vpr, содержат как гиперфосфорилированный cdc2, так и гипофосфорилированный cdc25, их неактивный статус [101-103].Следовательно, эти два регулятора переключателя G2 / M блокируются, предотвращая развитие любого клеточного цикла. Молекулярный механизм, приводящий к этому ингибированию, еще не ясен, но различные клеточные партнеры, взаимодействующие с Vpr, которые могут играть роль в регуляции клеточного цикла, были предложены в качестве потенциальных медиаторов Vpr-индуцированной остановки G2. hVIP / MOV34, член комплекса eIF3, был идентифицирован как Vpr-партнер в дрожжевом двугибридном анализе [116], и был связан с активностью Vpr по остановке клеточного цикла [117].eIF3 — это большой мультимерный комплекс, который регулирует транскрипционные события и важен для прогрессирования как G1 / S, так и G2 / M. Исследования внутриклеточной локализации показали, что экспрессия Vpr индуцирует релокализацию MOV34, которая переходит от цитоплазматического к ядерному паттерну локализации [116,117]. Два других клеточных партнера Vpr, UNG и HHR23A (т.е. человеческий гомолог дрожжевого белка rad23), участвуют в процессах репарации клеточной ДНК. Поскольку существует четкая взаимосвязь между путем ответа на повреждение ДНК и развитием клеточного цикла, первоначально предполагалось, что связывание Vpr с этими белками репарации ДНК может объяснять наблюдаемую остановку G2 [118-120], но последующий анализ показал, что существует не было никакой корреляции между ассоциацией Vpr с HHR23A и ​​/ или UNG и блокадой в G2 [121, 122].Эти анализы согласуются с предыдущим сообщением, показывающим, что задержка, опосредованная Vpr, отличается от остановки клеточного цикла в G2, связанной с повреждением ДНК. Однако также сообщалось, что Vpr индуцирует остановку клеточного цикла посредством пути, чувствительного к повреждению ДНК [123]. Контрольная точка повреждения ДНК G2 находится под контролем фосфатидилинозитол-3-киназоподобных белков, ATR и ATM [124], которые приводят к инактивации комплекса cdc2-cyclinB. Белок ATR недавно был связан с задержкой G2, индуцированной Vpr [125].Ингибирование ATR лекарствами, доминантно-отрицательной формой ATR или siRNA восстанавливает Vpr-индуцированную остановку клеточного цикла, в то время как активация ATR с помощью Vpr приводит к фосфорилированию Chk1, киназы, регулирующей активность cdc25c. Эти авторы предположили, что остановка G2, индуцированная Vpr, параллельна пути повреждения ATR-ДНК, но необходимы дополнительные исследования, чтобы продемонстрировать, что Vpr вызывает повреждение ДНК или имитирует сигнал, активирующий один из датчиков повреждения ДНК.

Было показано, что протеинфосфатаза 2A (PP2A) напрямую связана с Vpr через его субъединицу B55α [126].PP2A представляет собой серин / треонинфосфатазу, участвующую в широком спектре клеточных процессов, включая прогрессирование клеточного цикла. PP2A инактивирует cdc2 опосредованно как путем инактивации киназы Wee1, так и путем активации cdc25 (см. Обзор [127]). Генетические исследования, проведенные на S. pombe , предполагают участие PP2A и Wee1 в Vpr-индуцированной остановке клеточного цикла [128]. Интересно, что экспрессия Vpr и B55α приводит к ядерной локализации субъединицы B55α, в то время как она остается цитоплазматической в ​​нормальном состоянии.Вместе эти исследования подчеркнули тот факт, что Vpr может играть роль в субклеточном перераспределении нескольких регуляторных белковых комплексов, участвующих в прогрессировании клеточного цикла. В самом деле, митотическая функция комплекса cdc2-cyclinB запускается не только поворотом фосфорилирования / десфорилирования обеих субъединиц по конкретным остаткам, но также пространственно-временным контролем их внутриклеточного распределения. Напр., CyclinB является преимущественно цитоплазматическим на протяжении фазы G2, пока он быстро не перемещается в ядро ​​за 10 мин до разрушения ядерной оболочки [129].Как упоминалось ранее, Vpr вызывает грыжи и локальный разрыв ядерной оболочки, ведущие к перераспределению ключевых регуляторов клеточного цикла, включая Wee1, cdc25 и циклин B, в цитоплазму клетки-хозяина [87]. Кажется очевидным, что изменения субклеточной локализации сегрегированных регуляторов клеточного цикла могут объяснить арест G2, индуцированный Vpr; это также может объяснить общее разнообразие клеточных факторов, вовлеченных в этот процесс. Альтернативно, ядерные грыжи, индуцированные Vpr, также могут влиять на структуру хроматина, приводя к активации ATR.Однако неизвестно, может ли индуцированное Vpr изменение архитектуры NE вызывать повреждение ДНК, такое как двухцепочечные разрывы, но разрушения структуры ядерного ламина достаточно, чтобы блокировать репликацию ДНК, еще одну аномалию, распознаваемую белком ATR (для обзоров см. [130,131]).

Vpr и апоптоз

ВИЧ-инфекция вызывает истощение CD4 + Т-лимфоцитов у больных СПИДом, что приводит к ослаблению иммунной системы, ухудшающей ее способность бороться с инфекциями.Основным механизмом истощения CD4 + Т-клеток является запрограммированная гибель клеток или апоптоз, который может быть вызван ВИЧ через несколько путей как инфицированных клеток, так и неинфицированных клеток-свидетелей (см. Обзор [132]). Несмотря на то, что точный вклад Vpr как проапоптотического фактора, ответственного за истощение Т-клеток, наблюдаемое при естественном течении ВИЧ-инфекции, все еще неизвестен, неоднократно подтверждалось, что Vpr обладает цитотоксическим потенциалом и способен вызывать апоптоз у многих животных. Системы vitro .Кроме того, у трансгенных мышей, экспрессирующих Vpr под контролем промотора CD4, наблюдается истощение как CD4, так и CD8 Т-клеток, связанное с атрофией тимуса [133]. Однако были получены противоречивые результаты, указывающие на то, что Vpr также может действовать как негативный регулятор апоптоза Т-клеток [134, 135].

Первоначально предложенный как следствие длительной остановки клеточного цикла [136-140], другие исследования затем показали, что Vpr-опосредованная остановка G2 не была предпосылкой для индукции апоптоза, предполагая, что обе функции разделены [79,87,141,142 ].Однако недавнее наблюдение, что активность регуляторной киназы Wee-1 клеточного цикла снижается в Vpr-индуцированных апоптотических клетках, привело к гипотезе о прямой корреляции между задержкой G2 и апоптотическими свойствами Vpr [143]. Следовательно, снижение активности Wee-1, вероятно, связанное с его делокализацией, спровоцированной Vpr [87], приводит к несоответствующей активации cdc2, ведущей к гибели клеток с фенотипическими аберрантными митотическими особенностями, процессу, известному как митотическая катастрофа [144,145].Используя установленную клеточную линию, экспрессирующую Vpr, было обнаружено, что после длительной фазы G2 клетки округляются с аберрантным веретеном M-фазы с множественными полюсами, возникающими в результате аномальной дупликации центросом [138, 146]. Клетки преждевременно остановились в прометафазе и погибли в результате последующего апоптоза.

Однако в работах группы Г. Кремера было установлено, что синтетический Vpr, а также укороченные полипептиды способны вызывать апоптоз, напрямую воздействуя на митохондрии, что приводит к проницаемости митохондриальной мембраны и последующему разрушению митохондриальной трансмембраны. потенциал (ΔΨm) [56].Этот прямой эффект Vpr был связан с его способностью физически взаимодействовать с транслокатором адениновых нуклеотидов (ANT), компонентом переходной поры митохондрий, локализованной во внутренней митохондриальной мембране. Поскольку ANT является трансмембранным белком и представляет мотив WxxF на поверхности внутренней мембраны, который распознается Vpr [56,147], это взаимодействие подразумевает, что Vpr должен сначала пересечь внешнюю мембрану митохондрий для доступа к ANT. Взаимодействие между Vpr и ANT запускает пермеабилизацию внутренней мембраны с последующей пермеабилизацией внешней митохондриальной мембраны с последующим высвобождением растворимых межмембранных белков, таких как цитохром c и факторы, индуцирующие апоптоз, в цитозоле.Затем цитохром c связывается с Apaf-1 в комплексе с каспазой-9 для создания апоптосомы, позволяя активировать эффекторные каспазы, такие как каспаза-3, и впоследствии окончательно выполнить апоптотический процесс (см. Обзор [148]). ]). Хотя многочисленные сообщения показали, что апоптоз, опосредованный Vpr, был связан с активацией каспазы-9 и капазы-3 [56,79,137,140,147,149], интересно, что Vpr все еще способен вызывать гибель клеток в эмбриональных стволовых клетках, лишенных Apaf-1, каспазы. -9 и IAF [150].Эти результаты предлагают модель, в которой прямого действия Vpr на митохондрии может быть достаточно, чтобы вызвать гибель клеток в инфицированных ВИЧ-1 клетках [149].

Хотя причинная роль Vpr в индукции апоптоза очевидна как in vitro , так и ex vivo , его реальный вклад с другими вирусными детерминантами, такими как оболочка gp120, Tat, Nef и вирусная протеаза, в физиопатологию. СПИДа необходимо дополнительно документировать в ходе ВИЧ-инфекции [151].Однако недавно было обнаружено, что пациенты, длительно не прогрессирующие с ВИЧ-1, демонстрируют самую высокую частоту мутации в позиции Arg77 белка Vpr, чем пациенты с прогрессирующим заболеванием СПИДом. Интересно, что этот остаток кажется решающим для способности белка индуцировать апоптоз за счет проницаемости митохондриальной мембраны [152]. Напротив, сообщалось, что мутация остатка Leu64 усиливала проапоптопную активность Vpr [153], указывая на то, что мутации, затрагивающие C-концевую область белка, могут генерировать молекулы Vpr с различными проапоптотическими потенциалами в ходе естественного ВИЧ-1 инфекция.

Кроме того, растворимый белок Vpr обнаружен в сыворотке крови, а также в спинномозговой жидкости ВИЧ-инфицированных пациентов, и предполагается, что он играет роль, связанную с его проапоптотической активностью при деменции, связанной со СПИДом [154,155]. Было высказано предположение об участии Vpr в этих неврологических расстройствах, поскольку рекомбинантный Vpr оказывает нейроцитопатическое действие на нейрональные клетки крысы и человека [156–158]. Нейроны, убитые внеклеточным Vpr, демонстрируют типичные черты апоптоза, о чем свидетельствует прямая активация инициатора каспазы-8, которая приведет к последующей активации эффекторных каспаз.Эти эффекты были связаны со свойством первой амфипатической α-спирали Vpr формировать катион-селективные ионные каналы в плоских липидных бислоях, вызывая деполяризацию плазматической мембраны [6,157,159,160]. Эти наблюдения показывают, что Vpr может запускать апоптотические процессы разными альтернативными путями в зависимости от клеток-мишеней.

Ядерная роль (и) Vpr

Первой описанной функцией Vpr была умеренная транскрипционная активность на вирусном промоторе LTR, а также на гетерологичных клеточных промоторах [161, 162].Хотя связь между остановкой клеточного цикла и LTR-трансактивацией с помощью Vpr не совсем понятна, был сделан вывод, что активация Vpr-индуцированной вирусной транскрипции является вторичной по отношению к его функции остановки G2 / M [111, 163]. Действительно, наблюдается повышение транскрипционной активности вирусного LTR в заблокированных клетках, экспрессирующих Vpr [164-166]. Трансактивация ВИЧ-1, индуцированная Vpr, опосредуется через цис--действующих элементов, включая NF-κB, Sp1, C / EBP и энхансерные последовательности GRE, обнаруженные в промоторе LTR [167-170].Также связанный с этой активностью, Vpr регулирует экспрессию генов клетки-хозяина, таких как NF-κB, NF-IL-6, p21 Waf1 и сурвивин [171-173]. Наконец, Vpr, по-видимому, также может напрямую взаимодействовать с повсеместно распространенным клеточным фактором транскрипции Sp1 [168], рецептором глюкокортикоидов [174, 175], коактиватором p300 [163, 176] и с фактором транскрипции TFIIB, компонентом базального транскрипционного аппарата [177]. ]. Это последнее взаимодействие также опосредуется мотивом WxxF, обнаруженным в первичной последовательности TFIIB [55].

Vpr демонстрирует высокое сродство к нуклеиновым кислотам, но специфическая последовательность ДНК, нацеленная на Vpr, еще не идентифицирована [19,29]. Интересно, что Vpr не связывается только с фактором Sp1 или цис--действующими элементами, но он связывается с Sp1 в контексте массива G / C-боксов [168], а также в тройном комплексе с p53 [178], это указывает на то, что Vpr может связывать специфическую последовательность ДНК, однажды связанную с клеточными партнерами, чтобы впоследствии управлять экспрессией как клетки-хозяина, так и вирусных генов.Соответственно, сообщалось, что Vpr может напрямую связываться с p300 через мотив LXXLL, присутствующий в C-концевой α-спирали белка [179], что позволяет предположить, что Vpr может действовать, рекрутируя коактиваторы p300 / CBP в ВИЧ. -1 промотор LTR и, таким образом, усиливает вирусную экспрессию. Поскольку p300 является соактиватором NF-κB, Vpr может также опосредовать повышающую регуляцию промоторов, содержащих последовательности энхансеров NF-κB и NF-IL-6, в первичных Т-клетках и макрофагах. Кроме того, Vpr заметно усиливает действие глюкокортикоидного рецептора (GR) на его ответные промоторы [174, 175].Vpr-опосредованная транскрипция LTR ингибировалась добавлением антагониста GR, RU486, в культивируемых макрофагах [175]. Эта Vpr-опосредованная коактивация GR отличается от G2 ареста и требует мотивов LLEEL 26 и LQQLL 68 , содержащихся в первом и третьем α-спиральных доменах Vpr ВИЧ-1 [174,180].

Vpr может также функционировать как адаптерная молекула для эффективного рекрутирования коактиваторов транскрипции (GRE, p300 / CBP …) на промотор LTR ВИЧ-1 и, таким образом, усиливает репликацию вируса.Кроме того, он может участвовать в активации генов клетки-хозяина, индуцирующих клеточные пути, в связи с патогенезом СПИДа. Действительно, анализ микроматрицы кДНК с использованием изогенного ВИЧ-1 с экспрессией vpr или без нее показал, что Vpr индуцирует повышающую и понижающую регуляцию различных клеточных генов [181].

Дополнительный белок ВИЧ-1 Vpr: значение в патогенезе ВИЧ и потенциал для терапевтического вмешательства | Ретровирология

  • 1.

    Коэн Э.А., Тервиллигер Э. Ф., Джалинос Й., Пру Дж., Содроски Дж. Г., Хазелтин В. А.: Идентификация продукта и функции vpr ВИЧ-1.J Acquir Immune Defic Syndr. 1990, 3: 11-18.

    CAS PubMed Google ученый

  • 2.

    Юань X, Matsuda Z, Matsuda M, Essex M, Lee TH: Ген vpr вируса иммунодефицита человека кодирует связанный с вирионом белок. AIDS Res Hum Retroviruses. 1990, 6: 1265-1271.

    CAS PubMed Google ученый

  • 3.

    Emerman M: ВИЧ-1, Vpr и клеточный цикл. Curr Biol.1996, 6: 1096-1103. 10.1016 / S0960-9822 (02) 00676-0.

    CAS PubMed Google ученый

  • 4.

    Planelles V, Jowett JB, Li QX, Xie Y, Hahn B, Chen IS: Vpr-индуцированная остановка клеточного цикла сохраняется среди лентивирусов приматов. J Virol. 1996, 70: 2516-2524.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 5.

    Tristem M, Marshall C, Karpas A, Hill F: Эволюция лентивирусов приматов: данные vpx и vpr.Embo J. 1992, 11: 3405-3412.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 6.

    Feldherr CM, Feldherr AB: Ядерная мембрана как барьер для свободной диффузии белков. Природа. 1960, 185: 250-251. 10.1038 / 185250a0.

    CAS PubMed Google ученый

  • 7.

    Lewis PF, Emerman M: Прохождение через митоз требуется для онкоретровирусов, но не для вируса иммунодефицита человека.J Virol. 1994, 68: 510-516.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 8.

    Роу Т., Рейнольдс Т.С., Ю.Г., Браун П.О .: Интеграция ДНК вируса лейкемии мышей зависит от митоза. Эмбо Дж. 1993, 12: 2099-2108.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 9.

    Льюис П., Хенсель М., Эмерман М.: инфицирование вирусом иммунодефицита человека клеток, остановленных в клеточном цикле.Эмбо Дж. 1992, 11: 3053-3058.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 10.

    Букринский М.И., Шарова Н., Демпси М.П., ​​Стэнвик Т.Л., Букринская А.Г., Хаггерти С., Стивенсон М. Активный ядерный импорт преинтеграционных комплексов вируса иммунодефицита человека типа 1. Proc Natl Acad Sci USA. 1992, 89: 6580-6584. 10.1073 / pnas.89.14.6580.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 11.

    Ди Марцио П., Чоу С., Эбрайт М., Кноблаух Р., Ландау Н.Р.: Мутационный анализ остановки клеточного цикла, ядерной локализации и упаковки вирионов вируса иммунодефицита человека типа 1 Vpr. J Virol. 1995, 69: 7909-7916.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 12.

    Лу Ю.Л., Спирмен П., Ратнер Л.: Локализация вирусного белка R вируса иммунодефицита человека типа 1 в инфицированных клетках и вирионах. J Virol. 1993, 67: 6542-6550.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 13.

    Mahalingam S, Collman RG, Patel M, Monken CE, Srinivasan A: Функциональный анализ Vpr ВИЧ-1: идентификация детерминант, необходимых для субклеточной локализации. Вирусология. 1995, 212: 331-339. 10.1006 / viro.1995.1490.

    CAS PubMed Google ученый

  • 14.

    Галлай П., Хоуп Т., Чин Д., Троно D: ВИЧ-1 инфицирование неделящихся клеток посредством распознавания интегразы путем импорта / кариоферина.Proc Natl Acad Sci USA. 1997, 94: 9825-9830. 10.1073 / pnas.94.18.9825.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 15.

    Arhel NJ, Souquere-Besse S, Munier S, Souque P, Guadagnini S, Rutherford S, Prevost MC, Allen TD, Charneau P: образование лоскута ДНК ВИЧ-1 способствует отслаиванию преинтеграционного комплекса в ядерная пора. EMBO J. 2007, 26: 3025-3037. 10.1038 / sj.emboj.7601740.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 16.

    Dismuke DJ, Aiken C: Доказательства функциональной связи между непокрытием ядра вируса иммунодефицита человека типа 1 и ядерным импортом вирусного преинтеграционного комплекса. J Virol. 2006, 80: 3712-3720. 10.1128 / JVI.80.8.3712-3720.2006.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 17.

    Горлич Д. Импорт ядерных белков. Curr Opin Cell Biol. 1997, 9: 412-419. 10.1016 / S0955-0674 (97) 80015-4.

    CAS PubMed Google ученый

  • 18.

    Herold A, Truant R, Wiegand H, Cullen BR: Определение организации функционального домена импортина альфа-фактора ядерного импорта. J Cell Biol. 1998, 143: 309-318. 10.1083 / jcb.143.2.309.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 19.

    Кобе B: Автоингибирование сигналом внутренней ядерной локализации, выявленное кристаллической структурой импортина альфа млекопитающих. Nat Struct Biol. 1999, 6: 388-397.10.1038 / 7625.

    CAS PubMed Google ученый

  • 20.

    Moore MS, Blobel G: Очистка Ran-взаимодействующего белка, который необходим для импорта белка в ядро. Proc Natl Acad Sci USA. 1994, 91: 10212-10216. 10.1073 / pnas.91.21.10212.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 21.

    Moore MS, Blobel G: GTP-связывающий белок Ran / TC4 необходим для импорта белка в ядро.Природа. 1993, 365: 661-663. 10.1038 / 365661a0.

    CAS PubMed Google ученый

  • 22.

    Paschal BM, Gerace L: Идентификация NTF2, цитозольного фактора ядерного импорта, который взаимодействует с комплексным белком ядерной поры p62. J Cell Biol. 1995, 129: 925-937. 10.1083 / jcb.129.4.925.

    CAS PubMed Google ученый

  • 23.

    Melchior F, Paschal B, Evans J, Gerace L: Ингибирование импорта ядерного белка негидролизуемыми аналогами GTP и идентификация малой GTPase Ran / TC4 в качестве важного транспортного фактора.J Cell Biol. 1993, 123: 1649-1659. 10.1083 / jcb.123.6.1649.

    CAS PubMed Google ученый

  • 24.

    Melchior F, Guan T, Yokoyama N, Nishimoto T., Gerace L: Гидролиз GTP под действием Ran происходит в комплексе ядерных пор на ранней стадии импорта белка. J Cell Biol. 1995, 131: 571-581. 10.1083 / jcb.131.3.571.

    CAS PubMed Google ученый

  • 25.

    Котера I, Секимото Т., Миямото Y, Сайваки Т., Нагоши Э, Сакагами Х., Кондо Х., Йонеда Y: Импортин альфа переносит CaMKIV в ядро ​​без использования импортина бета.Эмбо Дж. 2005, 24: 942-951. 10.1038 / sj.emboj.7600587.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 26.

    Takizawa CG, Weis K, Morgan DO: Ran-независимый ядерный импорт циклина B1-Cdc2 с помощью importin beta. Proc Natl Acad Sci USA. 1999, 96: 7938-7943. 10.1073 / pnas.96.14.7938.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 27.

    Aitchison JD, Blobel G, Rout MP: Kap104p: кариоферин, участвующий в ядерном транспорте белков, связывающих информационную РНК.Наука. 1996, 274: 624-627. 10.1126 / science.274.5287.624.

    CAS PubMed Google ученый

  • 28.

    Fridell RA, Truant R, Thorne L, Benson RE, Cullen BR: Ядерный импорт hnRNP A1 опосредуется новым клеточным кофактором, связанным с кариоферином-бета. J Cell Sci. 1997, 110 (Pt 11): 1325-1331.

    CAS PubMed Google ученый

  • 29.

    Майкл В.М., Чой М., Дрейфус G: сигнал ядерного экспорта в hnRNP A1: опосредованный сигналом, зависимый от температуры путь экспорта ядерного белка.Клетка. 1995, 83: 415-422. 10.1016 / 0092-8674 (95)

    -1.

    CAS PubMed Google ученый

  • 30.

    Pollard VW, Michael WM, Nakielny S, Siomi MC, Wang F, Dreyfuss G: Новый рецептор-опосредованный путь импорта ядерного белка. Клетка. 1996, 86: 985-994. 10.1016 / S0092-8674 (00) 80173-7.

    CAS PubMed Google ученый

  • 31.

    Siomi H, Dreyfuss G: домен ядерной локализации в белке hnRNP A1.J Cell Biol. 1995, 129: 551-560. 10.1083 / jcb.129.3.551.

    CAS PubMed Google ученый

  • 32.

    Nakielny S, Siomi MC, Siomi H, Michael WM, Pollard V, Dreyfuss G: Transportin: ядерный транспортный рецептор нового пути импорта ядерного белка. Exp Cell Res. 1996, 229: 261-266. 10.1006 / excr.1996.0369.

    CAS PubMed Google ученый

  • 33.

    Palacios I, Weis K, Klebe C, Mattaj IW, Dingwall C: мутанты RAN / TC4 идентифицируют общую потребность в snRNP и импорте белка в ядро.J Cell Biol. 1996, 133: 485-494. 10.1083 / jcb.133.3.485.

    CAS PubMed Google ученый

  • 34.

    Jenkins Y, McEntee M, Weis K, Greene WC: Характеристика ядерного импорта vpr ВИЧ-1: анализ сигналов и путей. J Cell Biol. 1998, 143: 875-885. 10.1083 / jcb.143.4.875.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 35.

    Efthymiadis A, Shao H, Hubner S, Jans DA: кинетическая характеристика последовательности двудольной ядерной локализации (NLS) белка ретинобластомы человека in vivo и in vitro.Сравнение с NLS с большим Т-антигеном SV40. J Biol Chem. 1997, 272: 22134-22139. 10.1074 / jbc.272.35.22134.

    CAS PubMed Google ученый

  • 36.

    Gorlich D, Henklein P, Laskey RA, Hartmann E: 41-аминокислотный мотив в импортине-альфа обеспечивает связывание с импортином-бета и, следовательно, транзит в ядро. Эмбо Дж. 1996, 15: 1810-1817.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 37.

    Янс Д.А., Янс П., Джулих Т., Бриггс Л.Дж., Сяо С.Ю., Пиллер С.К.: Внутриядерное связывание регуляторным белком ВИЧ-1 VPR зависит от цитозольных факторов. Biochem Biophys Res Commun. 2000, 270: 1055-1062. 10.1006 / bbrc.2000.2559.

    CAS PubMed Google ученый

  • 38.

    Nitahara-Kasahara Y, Kamata M, Yamamoto T, Zhang X, Miyamoto Y, Muneta K, Iijima S, Yoneda Y, Tsunetsugu-Yokota Y, Aida Y: новый ядерный импорт Vpr, продвигаемый importin alpha. имеет решающее значение для репликации вируса иммунодефицита человека 1 типа в макрофагах.J Virol. 2007, 81: 5284-5293. 10.1128 / JVI.01928-06.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 39.

    Kamata M, Nitahara-Kasahara Y, Miyamoto Y, Yoneda Y, Aida Y: Импортин-альфа способствует прохождению через комплекс ядерных пор вируса иммунодефицита человека типа 1 Vpr. J Virol. 2005, 79: 3557-3564. 10.1128 / JVI.79.6.3557-3564.2005.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 40.

    Balliet JW, Kolson DL, Eiger G, Kim FM, McGann KA, Srinivasan A, Collman R: отчетливые эффекты в первичных макрофагах и лимфоцитах дополнительных генов вируса иммунодефицита человека типа 1 vpr, vpu и nef: мутационный анализ первичного Изолят ВИЧ-1. Вирусология. 1994, 200: 623-631. 10.1006 / viro.1994.1225.

    CAS PubMed Google ученый

  • 41.

    Коннор Р.И., Чен Б.К., Чоу С., Ландау Н.Р.: Vpr требуется для эффективной репликации вируса иммунодефицита человека типа 1 в мононуклеарных фагоцитах.Вирусология. 1995, 206: 935-944. 10.1006 / viro.1995.1016.

    CAS PubMed Google ученый

  • 42.

    Hattori N, Michaels F, Fargnoli K, Marcon L, Gallo RC, Franchini G: Ген vpr вируса иммунодефицита человека типа 2 необходим для продуктивного инфицирования макрофагов человека. Proc Natl Acad Sci USA. 1990, 87: 8080-8084. 10.1073 / pnas.87.20.8080.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 43.

    Огава К., Сибата Р., Киёмасу Т., Хигучи И., Кишида Ю., Ишимото А., Адачи А.: Мутационный анализ открытой рамки считывания vpr вируса иммунодефицита человека. J Virol. 1989, 63: 4110-4114.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 44.

    Blomer U, Naldini L, Kafri T, Trono D, Verma IM, Gage FH: высокоэффективный и устойчивый перенос генов во взрослых нейронах с помощью лентивирусного вектора. J Virol. 1997, 71: 6641-6649.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 45.

    Агостини И., Попов С., Хао Т., Ли Дж. Х., Дубровский Л., Чайка О., Чайка Н., Льюис Р., Букринский М. Фосфорилирование Vpr регулирует ядерный импорт 1 типа ВИЧ и макрофагальную инфекцию. AIDS Res Hum Retroviruses. 2002, 18: 283-288. 10.1089 / 088

    2753472856.

    CAS PubMed Google ученый

  • 46.

    Кэли Л., Саксена Н.К., Пиллер С.К., Янс Д.А.: Нарушение ядерного импорта и включения вируса Vpr, полученного в результате длительного отсутствия прогрессирования ВИЧ.Ретровирология. 2008, 5: 67-10.1186 / 1742-4690-5-67.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 47.

    Фушье Р.А., Мейер Б.Е., Саймон Дж. Х., Фишер Ю., Олбрайт А. В., Гонсалес-Скарано Ф., Малим М. Х .: Взаимодействие белка Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 с комплексом ядерных пор. J Virol. 1998, 72: 6004-6013.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 48.

    Gallay P, Stitt V, Mundy C, Oettinger M, Trono D: Роль кариоферинового пути в ядерном импорте вируса иммунодефицита человека 1 типа. J Virol. 1996, 70: 1027-1032.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 49.

    Jacquot G, Le Rouzic E, David A, Mazzolini J, Bouchet J, Bouaziz S, Niedergang F, Pancino G, Benichou S: Локализация Vpr ВИЧ-1 в ядерной оболочке: влияние на функции Vpr и репликация вируса в макрофагах.Ретровирология. 2007, 4: 84-10.1186 / 1742-4690-4-84.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 50.

    Vodicka MA, Koepp DM, Silver PA, Emerman M: ВИЧ-1 Vpr взаимодействует с путем ядерного транспорта, способствуя заражению макрофагами. Genes Dev. 1998, 12: 175-185. 10.1101 / gad.12.2.175.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 51.

    Попов С., Рексах М., Ратнер Л., Блобель Г., Букринский М.: Вирусный белок R регулирует стыковку прединтеграционного комплекса ВИЧ-1 с комплексом ядерной поры.J Biol Chem. 1998, 273: 13347-13352. 10.1074 / jbc.273.21.13347.

    CAS PubMed Google ученый

  • 52.

    Keele BF, Giorgi EE, Salazar-Gonzalez JF, Decker JM, Pham KT, Salazar MG, Sun C, Grayson T, Wang S, Li H и др.: Идентификация и характеристика переданного и раннего вируса-основателя конверты при первичной ВИЧ-1 инфекции. Proc Natl Acad Sci USA. 2008, 105: 7552-7557. 10.1073 / pnas.0802203105.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 53.

    Fischer W, Ganusov VV, Giorgi EE, Hraber PT, Keele BF, Leitner T., Han CS, Gleasner CD, Green L, Lo CC и др. -глубокое секвенирование. PLoS One. 2010, 5: e12303-10.1371 / journal.pone.0012303.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 54.

    Иидзима С., Нитахара-Касахара Ю., Кимата К., Чжун Чжуанг В., Камата М., Исогай М., Мива М., Цунецугу-Йокота Ю., Аида Ю.: Ядерная локализация Vpr имеет решающее значение для эффективной репликации ВИЧ. -1 в первичных CD4 + Т-клетках.Вирусология. 2004, 327: 249-261. 10.1016 / j.virol.2004.06.024.

    CAS PubMed Google ученый

  • 55.

    Букринский М.И., Хаффар ОК: Ядерный импорт ВИЧ-1: в поисках лидера. Передние биоски. 1997, 2: d578-587.

    CAS PubMed Google ученый

  • 56.

    Ямасита М., Перес О., Хоуп Т.Дж., Эмерман М.: Доказательства прямого участия капсидного белка в ВИЧ-инфекции неделящихся клеток.PLoS Pathog. 2007, 3: 1502-1510. 10.1371 / journal.ppat.0030156.

    CAS PubMed Google ученый

  • 57.

    Craigo JK, Montelaro RC: Lentivirus Tropism and Disease. Лентивирусы и макрофаги: молекулярные и клеточные взаимодействия. Отредактировано: Desport M. 2010, Норфолк: Caister Academic Press, 1-24.

    Google ученый

  • 58.

    Морелле Н., Буазиз С., Петитжан ​​П., Рокес Б.П.: ЯМР-структура регуляторного белка ВИЧ-1 VPR.J Mol Biol. 2003, 327: 215-227. 10.1016 / S0022-2836 (03) 00060-3.

    CAS PubMed Google ученый

  • 59.

    Mahalingam S, Ayyavoo V, Patel M, Kieber-Emmons T, Weiner DB: Ядерный импорт, включение вирионов и остановка / дифференцировка клеточного цикла опосредуются отдельными функциональными доменами Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа. J Virol. 1997, 71: 6339-6347.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 60.

    Nie Z, Bergeron D, Subbramanian RA, Yao XJ, Checroune F, Rougeau N, Cohen EA: Предполагаемая альфа-спираль 2 вируса иммунодефицита человека типа 1 Vpr содержит детерминанту, которая отвечает за ядерную транслокацию провирусной ДНК в процессе роста. арестованные камеры. J Virol. 1998, 72: 4104-4115.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 61.

    Singh SP, Tomkowicz B, Lai D, Cartas M, Mahalingam S, Kalyanaraman VS, Murali R, Srinivasan A: Функциональная роль остатков, соответствующих спиральному домену II (аминокислоты от 35 до 46) вируса иммунодефицита человека тип 1 Впр.J Virol. 2000, 74: 10650-10657. 10.1128 / JVI.74.22.10650-10657.2000.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 62.

    Яо XJ, Суббраманиан Р.А., Rougeau N, Boisvert F, Bergeron D, Cohen EA: Мутагенный анализ Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1: роль предсказанной N-концевой альфа-спиральной структуры в ядерной локализации Vpr и включение вириона. J Virol. 1995, 69: 7032-7044.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 63.

    Fritz JV, Didier P, Clamme JP, Schaub E, Muriaux D, Cabanne C, Morellet N, Bouaziz S, Darlix JL, Mely Y, de Rocquigny H: прямое взаимодействие Vpr-Vpr в клетках, отслеживаемое с помощью двухфотонной корреляционной спектроскопии флуоресценции и визуализация времени жизни флуоресценции. Ретровирология. 2008, 5: 87-10.1186 / 1742-4690-5-87.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 64.

    Агостини И., Попов С., Ли Дж., Дубровский Л., Хао Т., Букринский М.: Белок теплового шока 70 может заменять вирусный белок R ВИЧ-1 во время ядерного импорта вирусного прединтеграционного комплекса.Exp Cell Res. 2000, 259: 398-403. 10.1006 / excr.2000.4992.

    CAS PubMed Google ученый

  • 65.

    Popov S, Rexach M, Zybarth G, Reiling N, Lee MA, Ratner L, Lane CM, Moore MS, Blobel G, Bukrinsky M: вирусный белок R регулирует ядерный импорт пре-интеграции ВИЧ-1 сложный. Embo J. 1998, 17: 909-917. 10.1093 / emboj / 17.4.909.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 66.

    Kamata M, Aida Y: Два предполагаемых альфа-спиральных домена Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 опосредуют ядерную локализацию по крайней мере двумя механизмами. J Virol. 2000, 74: 7179-7186. 10.1128 / JVI.74.15.7179-7186.2000.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 67.

    Le Rouzic E, Mousnier A, Rustum C, Stutz F, Hallberg E, Dargemont C, Benichou S. Присоединение Vpr ВИЧ-1 к ядерной оболочке опосредуется взаимодействием с нуклеопорином hCG1.J Biol Chem. 2002, 277: 45091-45098. 10.1074 / jbc.M207439200.

    CAS PubMed Google ученый

  • 68.

    Radu A, Moore MS, Blobel G: домен пептидного повтора нуклеопорина Nup98 функционирует как стыковочный сайт при транспортировке через комплекс ядерных пор. Клетка. 1995, 81: 215-222. 10.1016 / 0092-8674 (95)

    -3.

    CAS PubMed Google ученый

  • 69.

    Rexach M, Blobel G: Импорт белка в ядра: реакции ассоциации и диссоциации с участием транспортного субстрата, транспортных факторов и нуклеопоринов.Клетка. 1995, 83: 683-692. 10.1016 / 0092-8674 (95)

    -7.

    CAS PubMed Google ученый

  • 70.

    Kutay U, Izaurralde E, Bischoff FR, Mattaj IW, Gorlich D: Доминантно-отрицательные мутанты импортина-бета блокируют множественные пути импорта и экспорта через комплекс ядерных пор. Эмбо Дж. 1997, 16: 1153-1163. 10.1093 / emboj / 16.6.1153.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 71.

    Карни О., Фридлер А., Закай Н., Гилон С., Лойтер А: пептид, полученный из N-концевой области Vpr ВИЧ-1, способствует ядерному импорту в проницаемые клетки: выяснение области NLS Vpr. FEBS Lett. 1998, 429: 421-425. 10.1016 / S0014-5793 (98) 00645-0.

    CAS PubMed Google ученый

  • 72.

    Zhou Y, Lu Y, Ratner L: Остатки аргинина на С-конце Vpr ВИЧ-1 важны для ядерной локализации и остановки клеточного цикла.Вирусология. 1998, 242: 414-424. 10.1006 / viro.1998.9028.

    CAS PubMed Google ученый

  • 73.

    Стюарт С.А., Пун Б., Джоветт Дж. Б., Чен И.С.: Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует апоптоз после остановки клеточного цикла. J Virol. 1997, 71: 5579-5592.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 74.

    Леви Д. Н., Рафаэли Ю., МакГрегор Р. Р., Вайнер Д. Б.: Сывороточный Vpr регулирует продуктивную инфекцию и латентный период вируса иммунодефицита человека типа 1.Proc Natl Acad Sci USA. 1994, 91: 10873-10877. 10.1073 / pnas.91.23.10873.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 75.

    Леви Д.Н., Рафаэли Ю., Вайнер ДБ: Внеклеточный белок Vpr увеличивает клеточную проницаемость для репликации вируса иммунодефицита человека и реактивирует вирус с латентного периода. J Virol. 1995, 69: 1243-1252.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 76.

    Agostini I, Navarro JM, Rey F, Bouhamdan M, Spire B, Vigne R, Sire J: трансактиватор Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1: взаимодействие с активаторными доменами, связанными с промотором, и связывание с TFIIB. J Mol Biol. 1996, 261: 599-606. 10.1006 / jmbi.1996.0485.

    CAS PubMed Google ученый

  • 77.

    Cohen EA, Dehni G, Sodroski JG, Haseltine WA: продукт vpr вируса иммунодефицита человека представляет собой связанный с вирионом регуляторный белок.J Virol. 1990, 64: 3097-3099.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 78.

    Ван Л., Мукерджи С., Цзя Ф., Нараян О., Чжао Л.Дж .: Взаимодействие вирионного белка Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 с клеточным фактором транскрипции Sp1 и трансактивация длинного концевого повтора вируса. J Biol Chem. 1995, 270: 25564-25569. 10.1074 / jbc.270.43.25564.

    CAS PubMed Google ученый

  • 79.

    Ghosh D: сайт связывания рецептора глюкокортикоидов в длинном концевом повторе вируса иммунодефицита человека. J Virol. 1992, 66: 586-590.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 80.

    Katsanakis CD, Sekeris CE, Spandidos DA: длинный концевой повтор вируса иммунодефицита человека содержит последовательности, демонстрирующие частичную гомологию с элементами, чувствительными к глюкокортикоидам. Anticancer Res. 1991, 11: 381-383.

    CAS PubMed Google ученый

  • 81.

    Макаллистер Дж. Дж., Филлипс Д., Миллхаус С., Коннер Дж., Хоган Т., Росс Х. Л., Вигдаль Б. Анализ LTR ВИЧ-1 NF-kappaB-проксимального участка Sp III: данные о регуляции генов, специфичных для клеточного типа, и репликации вирусов. Вирусология. 2000, 274: 262-277. 10.1006 / viro.2000.0476.

    CAS PubMed Google ученый

  • 82.

    Soudeyns H, Geleziunas R, Shyamala G, Hiscott J, Wainberg MA: Идентификация нового элемента ответа глюкокортикоидов в геноме вируса иммунодефицита человека 1 типа.Вирусология. 1993, 194: 758-768. 10.1006 / viro.1993.1317.

    CAS PubMed Google ученый

  • 83.

    Verhoef K, Sanders RW, Fontaine V, Kitajima S, Berkhout B: Эволюция промотора длинных концевых повторов вируса иммунодефицита человека типа 1 путем преобразования элемента энхансера NF-kappaB в сайт связывания GABP. J Virol. 1999, 73: 1331-1340.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 84.

    Vanitharani R, Mahalingam S, Rafaeli Y, Singh SP, Srinivasan A, Weiner DB, Ayyavoo V: Vpr ВИЧ-1 трансактивирует экспрессию, направленную на LTR, через последовательности, присутствующие в пределах от -278 до -176, и увеличивает репликацию вируса in vitro. Вирусология. 2001, 289: 334-342. 10.1006 / viro.2001.1153.

    CAS PubMed Google ученый

  • 85.

    Felzien LK, Woffendin C, Hottiger MO, Subbramanian RA, Cohen EA, Nabel GJ: активация транскрипции ВИЧ дополнительным белком, VPR, опосредуется коактиватором p300.Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95: 5281-5286. 10.1073 / pnas.95.9.5281.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 86.

    Kino T, Tsukamoto M, Chrousos G: Компоненты фактора транскрипции TFIIH усиливают коактиваторную активность GR, но не активность по остановке клеточного цикла белка Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1. Biochem Biophys Res Commun. 2002, 298: 17-23. 10.1016 / S0006-291X (02) 02442-7.

    CAS PubMed Google ученый

  • 87.

    Sawaya BE, Khalili K, Rappaport J, Serio D, Chen W., Srinivasan A, Amini S: подавление транскрипции и репликации ВИЧ-1 мутантом Vpr. Gene Ther. 1999, 6: 947-950. 10.1038 / sj.gt.3300907.

    CAS PubMed Google ученый

  • 88.

    Sawaya BE, Khalili K, Gordon J, Taube R, Amini S: Совместное взаимодействие между регуляторными белками ВИЧ-1 Tat и Vpr модулирует транскрипцию вирусного генома. J Biol Chem. 2000, 275: 35209-35214.10.1074 / jbc.M005197200.

    CAS PubMed Google ученый

  • 89.

    Рафаэли Ю., Леви Д. Н., Вайнер Д. Б. Комплекс глюкокортикоидных рецепторов типа II является мишенью для продукта гена vpr ВИЧ-1. Proc Natl Acad Sci USA. 1995, 92: 3621-3625. 10.1073 / pnas.92.8.3621.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 90.

    Кино Т., Грагеров А., Копп Дж. Б., Стаубер Р. Х., Павлакис Г. Н., Хрусос Г. П.: ВИЧ-1-ассоциированный с вирионом белок vpr является коактиватором рецептора глюкокортикоидов человека.J Exp Med. 1999, 189: 51-62. 10.1084 / jem.189.1.51.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 91.

    Sherman MP, de Noronha CM, Pearce D, Greene WC: Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 содержит две богатые лейцином спирали, которые опосредуют коактивацию рецептора глюкокортикоидов независимо от его эффектов на остановку клеточного цикла G (2). J Virol. 2000, 74: 8159-8165. 10.1128 / JVI.74.17.8159-8165.2000.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 92.

    Кино Т., Грагеров А., Слободская О., Цопаномичалу М., Хрусос Г. П., Павлакис Г. Н.: Дополнительный белок вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) Vpr индуцирует транскрипцию промоторов, чувствительных к ВИЧ-1 и глюкокортикоидам, путем связывания непосредственно с p300 / Коактиваторы CBP. J Virol. 2002, 76: 9724-9734. 10.1128 / JVI.76.19.9724-9734.2002.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 93.

    Thotala D, Schafer EA, Tungaturthi PK, Majumder B, Janket ML, Wagner M, Srinivasan A, Watkins S, Ayyavoo V: Структурно-функциональный анализ вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) Vpr: роль остатков лейцина в опосредованной Vpr трансактивации и репликации вируса.Вирусология. 2004, 328: 89-100. 10.1016 / j.virol.2004.07.013.

    CAS PubMed Google ученый

  • 94.

    Ramanathan MP, Curley E, Su M, Chambers JA, Weiner DB: Карбоксильный конец hVIP / mov34 имеет решающее значение для взаимодействия ВИЧ-1-Vpr и передачи сигналов, опосредованной глюкокортикоидами. J Biol Chem. 2002, 277: 47854-47860. 10.1074 / jbc.M203

  • 0.

    CAS PubMed Google ученый

  • 95.

    Muthumani K, Choo AY, Zong WX, Madesh M, Hwang DS, Premkumar A, Thieu KP, Emmanuel J, Kumar S, Thompson CB, Weiner DB: комплекс Vpr ВИЧ-1 и рецепторных рецепторов глюкокортикоидов — это усиление функции взаимодействие, которое предотвращает ядерную локализацию PARP-1. Nat Cell Biol. 2006, 8: 170-179. 10.1038 / ncb1352.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 96.

    Poli G, Kinter A, Justement JS, Kehrl JH, Bressler P, Stanley S, Fauci AS: Фактор некроза опухоли альфа действует аутокринным образом в индукции экспрессии вируса иммунодефицита человека.Proc Natl Acad Sci USA. 1990, 87: 782-785. 10.1073 / pnas.87.2.782.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 97.

    Ленардо MJ, Балтимор D: NF-каппа B: плейотропный медиатор индуцибельного и тканеспецифичного генного контроля. Клетка. 1989, 58: 227-229. 10.1016 / 0092-8674 (89)

    -7.

    CAS PubMed Google ученый

  • 98.

    Chang HK, Gallo RC, Ensoli B: Регулирование экспрессии и функции клеточных генов с помощью белка Tat вируса иммунодефицита человека 1 типа.J Biomed Sci. 1995, 2: 189-202. 10.1007 / BF02253380.

    CAS PubMed Google ученый

  • 99.

    Chatterton RT, Green D, Harris S, Grossman A, Hechter O: Продольное исследование стероидов надпочечников в когорте ВИЧ-инфицированных пациентов с гемофилией. J Lab Clin Med. 1996, 127: 545-552. 10.1016 / S0022-2143 (96)

    -6.

    PubMed Google ученый

  • 100.

    Кава С.К., Томпсон Э.Б.: Устойчивость лимфоидных клеток к глюкокортикоидам при ВИЧ-инфекции.J Стероид Biochem Mol Biol. 1996, 57: 259-263. 10.1016 / 0960-0760 (96) 00001-5.

    CAS PubMed Google ученый

  • 101.

    Lortholary O, Christeff N, Casassus P, Thobie N, Veyssier P, Trogoff B, Torri O, Brauner M, Nunez EA, Guillevin L: Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая функция у мужчин, инфицированных вирусом иммунодефицита человека. J Clin Endocrinol Metab. 1996, 81: 791-796. 10.1210 / jc.81.2.791.

    CAS PubMed Google ученый

  • 102.

    Laudat A, Blum L, Guechot J, Picard O, Cabane J, Imbert JC, Giboudeau J: Изменения в системных стероидах гонад и надпочечников у бессимптомных мужчин, инфицированных вирусом иммунодефицита человека: взаимосвязь с количеством клеток CD4. Eur J Endocrinol. 1995, 133: 418-424. 10.1530 / eje.0.1330418.

    CAS PubMed Google ученый

  • 103.

    Biglino A, Limone P, Forno B, Pollono A, Cariti G, Molinatti GM, Gioannini P: измененный ответ адренокортикотропина и кортизола на высвобождающий кортикотропин гормон при ВИЧ-1 инфекции.Eur J Endocrinol. 1995, 133: 173-179. 10.1530 / eje.0.1330173.

    CAS PubMed Google ученый

  • 104.

    Кумар М., Кумар А.М., Морган Р., Сапочник Дж., Эйсдорфер С.: Аномальный гипофизарно-адренокортикальный ответ на ранней стадии инфицирования ВИЧ-1. J Acquir Immune Defic Syndr. 1993, 6: 61-65.

    CAS PubMed Google ученый

  • 105.

    Кино Т., Копп Дж. Б., Хрусос Г. П.: Глюкокортикоиды подавляют активность длинных концевых повторов вируса иммунодефицита человека типа 1 специфическим для клеточного типа, опосредованным рецептором глюкокортикоидов способом: прямые защитные эффекты противоречат клинической феноменологии.J Стероид Biochem Mol Biol. 2000, 75: 283-290. 10.1016 / S0960-0760 (00) 00187-4.

    CAS PubMed Google ученый

  • 106.

    Лоуренс Дж., Селлерс М.Б., Сикдер С.К .: Влияние глюкокортикоидов на инфекцию хронического вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и транскрипцию, опосредованную промотором ВИЧ. Кровь. 1989, 74: 291-297.

    CAS PubMed Google ученый

  • 107.

    Mitra D, Sikder S, Laurence J: Ингибирование tat-активированной экспрессии гена, опосредованной длинным концевым повтором ВИЧ-1, глюкокортикоидами.AIDS Res Hum Retroviruses. 1993, 9: 1055-1056. 10.1089 / помощь.1993.9.1055.

    CAS PubMed Google ученый

  • 108.

    Mitra D, Sikder SK, Laurence J: Роль сайтов связывания глюкокортикоидных рецепторов в длинном концевом повторе вируса иммунодефицита человека типа 1 в стероид-опосредованном подавлении экспрессии гена ВИЧ. Вирусология. 1995, 214: 512-521. 10.1006 / viro.1995.0062.

    CAS PubMed Google ученый

  • 109.

    Russo FO, Patel PC, Ventura AM, Pereira CA: Модуляция длинных концевых повторов ВИЧ-1 глюкокортикоидами в линиях моноцитарных и лимфоцитарных клеток. Virus Res. 1999, 64: 87-94. 10.1016 / S0168-1702 (99) 00082-9.

    CAS PubMed Google ученый

  • 110.

    Furth PA, Westphal H, Hennighausen L: экспрессия ВИЧ-LTR стимулируется глюкокортикоидами и беременностью. AIDS Res Hum Retroviruses. 1990, 6: 553-560. 10.1089 / помощь.1990.6.553.

    CAS PubMed Google ученый

  • 111.

    Kinter AL, Biswas P, Alfano M, Justement JS, Mantelli B, Rizzi C, Gatti AR, Vicenzi E, Bressler P, Poli G: Интерлейкин-6 и глюкокортикоиды синергетически индуцируют экспрессию вируса иммунодефицита человека 1 типа. в хронически инфицированных клетках U1 с помощью посттранскрипционного механизма, независимого от длинных концевых повторов. Mol Med. 2001, 7: 668-678.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 112.

    Hoshino S, Konishi M, Mori M, Shimura M, Nishitani C, Kuroki Y, Koyanagi Y, Kano S, Itabe H, Ishizaka Y: Vpr ВИЧ-1 индуцирует TLR4 / MyD88-опосредованную продукцию IL-6 и реактивирует вирусную продукцию из задержка. J Leukoc Biol. 2010, 87: 1133-1143. 10.1189 / jlb.0809547.

    CAS PubMed Google ученый

  • 113.

    Bressler P, Poli G, Justement JS, Biswas P, Fauci AS: Глюкокортикоиды действуют синергично с фактором некроза опухоли альфа в индукции экспрессии ВИЧ из линии хронически инфицированных промоноцитарных клеток.AIDS Res Hum Retroviruses. 1993, 9: 547-551. 10.1089 / help.1993.9.547.

    CAS PubMed Google ученый

  • 114.

    Capitanio JP, Mendoza SP, Lerche NW, Mason WA: Социальный стресс приводит к изменению регуляции глюкокортикоидов и сокращению выживаемости при синдроме приобретенного иммунодефицита обезьян. Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95: 4714-4719. 10.1073 / pnas.95.8.4714.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 115.

    Corley PA: Индукция интерлейкина-1 и глюкокортикоидных гормонов ВИЧ способствует репликации вируса и связывает хромосому 2 человека с патогенезом СПИДа: генетические механизмы и терапевтическое значение. Мед-гипотезы. 1997, 48: 415-421. 10.1016 / S0306-9877 (97) -2.

    CAS PubMed Google ученый

  • 116.

    Наир М.П., ​​Сараволац Л.Д., Шварц С.А.: Селективные ингибирующие эффекты гормонов стресса на активность естественных киллеров (NK) лимфоцитов от пациентов со СПИДом.Иммунол Инвест. 1995, 24: 689-699. 10.3109 / 0882013950

    98.

    CAS PubMed Google ученый

  • 117.

    Schafer EA, Venkatachari NJ, Ayyavoo V: Противовирусные эффекты мифепристона на вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1): нацеливание на Vpr и его клеточного партнера, глюкокортикоидного рецептора (GR). Antiviral Res. 2006, 72: 224-232. 10.1016 / j.antiviral.2006.06.008.

    CAS PubMed Google ученый

  • 118.

    Wiegers K, Schwarck D, Reimer R, Bohn W. Активация рецептора глюкокортикоидов высвобождает нестимулированные PBMC из раннего блока репликации ВИЧ-1. Вирусология. 2008, 375: 73-84. 10.1016 / j.virol.2008.01.037.

    CAS PubMed Google ученый

  • 119.

    Fletcher TM, Brichacek B, Sharova N, Newman MA, Stivahtis G, Sharp PM, Emerman M, Hahn BH, Stevenson M: функции ядерного импорта и остановки клеточного цикла белка Vpr ВИЧ-1 кодируются два отдельных гена в ВИЧ-2 / SIV (SM).Embo J. 1996, 15: 6155-6165.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 120.

    Гиббс Дж.С., Лакнер А.А., Ланг С.М., Саймон М.А., Сегал П.К., Дэниел М.Д., Десрозье Р.С.: прогрессирование до СПИДа в отсутствие гена для vpr или vpx. J Virol. 1995, 69: 2378-2383.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 121.

    Subbramanian RA, Kessous-Elbaz A, Lodge R, Forget J, Yao XJ, Bergeron D, Cohen EA: Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 является положительным регулятором вирусной транскрипции и инфекционности в первичных макрофагах человека.J Exp Med. 1998, 187: 1103-1111. 10.1084 / jem.187.7.1103.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 122.

    Belzile JP, Duisit G, Rougeau N, Mercier J, Finzi A, Cohen EA: Опосредованная Vpr ВИЧ-1 остановка G2 включает в себя убиквитинлигазу DDB1-CUL4AVPRBP E3. PLoS Pathog. 2007, 3: e85-10.1371 / journal.ppat.0030085.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 123.

    ДеХарт JL, Циммерман ES, Ардон О., Монтейро-Филхо CM, Арганараз ER, Planelles V: ВИЧ-1 Vpr активирует контрольную точку G2 посредством манипулирования протеасомной системой убиквитина. Virol J. 2007, 4: 57-10.1186 / 1743-422X-4-57.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 124.

    Hrecka K, Gierszewska M, Srivastava S, Kozaczkiewicz L, Swanson SK, Florens L, Washburn MP, Skowronski J: Лентивирусный Vpr узурпирует Cul4-DDB1 [VprBPulate] E3 для лигазы убиквитина клеточного цикла.Proc Natl Acad Sci USA. 2007, 104: 11778-11783. 10.1073 / pnas.0702102104.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 125.

    Le Rouzic E, Belaïdouni N, Estrabaud E, Morel M, Rain J, Transy C, Margottin-Goguet F: Vpr ВИЧ1 останавливает клеточный цикл, рекрутируя DCAF1 / VprBP, рецептор убиквитина Cul4-DDB1 лигаза. Клеточный цикл. 2007, 6: 182-188. 10.4161 / cc.6.2.3732.

    CAS PubMed Google ученый

  • 126.

    Schrofelbauer B, Hakata Y, Landau NR: функция Vpr ВИЧ-1 опосредуется взаимодействием со специфическим для повреждений ДНК-связывающим белком DDB1. Proc Natl Acad Sci USA. 2007, 104: 4130-4135. 10.1073 / pnas.0610167104.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 127.

    Tan L, Ehrlich E, Yu XF: DDB1 и Cul4A необходимы для остановки G2, вызванной вирусом иммунодефицита человека типа 1, вызванной Vpr. J Virol. 2007, 81: 10822-10830. 10.1128 / JVI.01380-07.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 128.

    Wen X, Duus KM, Friedrich TD, de Noronha CM: Белок Vpr ВИЧ1 способствует остановке клеточного цикла G2 за счет взаимодействия с DDB1 и Cullin4A-содержащим комплексом убиквитин-лигазы с использованием VprBP / DCAF1 в качестве адаптера. J Biol Chem. 2007, 282: 27046-27057. 10.1074 / jbc.M703955200.

    CAS PubMed Google ученый

  • 129.

    Zhao LJ, Mukherjee S, Narayan O: Биохимический механизм функции Vpr ВИЧ-I. Специфическое взаимодействие с клеточным белком. J Biol Chem. 1994, 269: 15577-15582.

    CAS PubMed Google ученый

  • 130.

    Ayinde D, Maudet C, Transy C, Margottin-Goguet F: Обратите внимание на два дополнительных белка ВИЧ / SIV при макрофагальной инфекции: затмевает ли Vpx Vpr ?. Ретровирология. 2010, 7: 35-10.1186 / 1742-4690-7-35.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 131.

    Casey L, Wen X, de Noronha CM: функции белка Vpr ВИЧ1 и его действие через убиквитинлигазу DCAF1.DDB1.Cullin4. Цитокин. 2010, 51: 1-9. 10.1016 / j.cyto.2010.02.018.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 132.

    Zimmerman E, Sherman M, Blackett J, Neidleman J, Kreis C, Mundt P, Williams S, Warmerdam M, Kahn J, Hecht F, et al: Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 вызывает стресс репликации ДНК в vitro и in vivo.J Virol. 2006, 80: 10407-10418. 10.1128 / JVI.01212-06.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 133.

    Forget J, Yao XJ, Mercier J, Cohen EA: Функция трансактивации белка vpr вируса иммунодефицита человека типа 1: механизм и идентификация вовлеченных доменов. J Mol Biol. 1998, 284: 915-923. 10.1006 / jmbi.1998.2206.

    CAS PubMed Google ученый

  • 134.

    Goh WC, Rogel ME, Kinsey CM, Michael SF, Fultz PN, Nowak MA, Hahn BH, Emerman M: Vpr ВИЧ-1 увеличивает вирусную экспрессию путем манипулирования клеточным циклом: механизм отбора Vpr in vivo. Nat Med. 1998, 4: 65-71. 10.1038 / нм0198-065.

    CAS PubMed Google ученый

  • 135.

    Igarashi T, Brown CR, Endo Y, Buckler-White A, Plishka R, Bischofberger N, Hirsch V, Martin MA: Макрофаги являются основным резервуаром и поддерживают высокие вирусные нагрузки у макак-резусов после истощения CD4 + Т-клетки, вызываемые высокопатогенным вирусом обезьяньего иммунодефицита / химерой ВИЧ типа 1 (SHIV): последствия для инфицирования людей ВИЧ-1.Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98: 658-663. 10.1073 / pnas.021551798.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 136.

    Тристем М., Маршалл С., Карпас А., Петрик Дж., Хилл Ф: Происхождение vpx в лентивирусах. Природа. 1990, 347: 341-342. 10.1038 / 347341b0.

    CAS PubMed Google ученый

  • 137.

    Шарова Н., Ву И, Чжу X, Странска Р., Каушик Р., Шарки М., Стивенсон М.: Примат лентивирусный Vpx захватывает DDB1, чтобы противодействовать ограничению макрофагов.PLoS Pathog. 2008, 4: e1000057-10.1371 / journal.ppat.1000057.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 138.

    Srivastava S, Swanson SK, Manel N, Florens L, Washburn MP, Skowronski J: Лентивирусный вспомогательный фактор Vpx нацелен на адаптер субстрата VprBP / DCAF1 для убиквитин-лигазы cullin 4 E3 для включения макрофагальной инфекции. PLoS Pathog. 2008, 4: e1000059-10.1371 / journal.ppat.1000059.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 139.

    Bergamaschi A, Ayinde D, David A, Le Rouzic E, Morel M, Collin G, Descamps D, Damond F, Brun-Vezinet F, Nisole S и др .: Белок Vpx вируса иммунодефицита человека 2 типа захватывает CUL4A-DDB1 Убиквитинлигаза DCAF1 для преодоления постентрийного блока при макрофагальной инфекции. J Virol. 2009, 83: 4854-4860. 10.1128 / JVI.00187-09.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 140.

    Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D: многократно ослабленный лентивирусный вектор обеспечивает эффективную доставку гена in vivo.Nat Biotechnol. 1997, 15: 871-875. 10.1038 / nbt0997-871.

    CAS PubMed Google ученый

  • 141.

    Cosenza MA, Zhao ML, Lee SC: экспрессия ВИЧ-1 защищает макрофаги и микроглию от апоптотической гибели. Neuropathol Appl Neurobiol. 2004, 30: 478-490. 10.1111 / j.1365-2990.2004.00563.x.

    CAS PubMed Google ученый

  • 142.

    Fernandez Larrosa PN, Croci DO, Riva DA, Bibini M, Luzzi R, Saracco M, Mersich SE, Rabinovich GA, Peralta LM: Устойчивость к апоптозу в стойко инфицированных ВИЧ-1 клетках не зависит от активной репликации вируса и включает модуляцию митохондриального пути апоптоза.Ретровирология. 2008, 5: 19-10.1186 / 1742-4690-5-19.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 143.

    Фукумори Т., Акари Х., Йошида А., Фудзита М., Кояма А.Х., Кагава С., Адачи А.: Регулирование клеточного цикла и апоптоза вирусом иммунодефицита человека типа 1 Vpr. Микробы заражают. 2000, 2: 1011-1017. 10.1016 / S1286-4579 (00) 01255-7.

    CAS PubMed Google ученый

  • 144.

    Yao XJ, Mouland AJ, Subbramanian RA, Forget J, Rougeau N, Bergeron D, Cohen EA: Vpr стимулирует вирусную экспрессию и индуцирует гибель клеток в делящихся Т-клетках Jurkat, инфицированных вирусом иммунодефицита человека типа 1. J Virol. 1998, 72: 4686-4693.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 145.

    Conti L, Rainaldi G, Matarrese P, Varano B, Rivabene R, Columba S, Sato A, Belardelli F, Malorni W., Gessani S: белок vpr ВИЧ-1 действует как негативный регулятор апоптоза в линия лимфобластоидных Т-клеток человека: возможные последствия для патогенеза СПИДа.J Exp Med. 1998, 187: 403-413. 10.1084 / jem.187.3.403.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 146.

    Rostad SW, Sumi SM, Shaw CM, Olson K, McDougall JK: Инфекция вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в мозге с лейкоэнцефалопатией, связанной со СПИДом. AIDS Res Hum Retroviruses. 1987, 3: 363-373. 10.1089 / help.1987.3.363.

    CAS PubMed Google ученый

  • 147.

    McArthur JC: Деменция ВИЧ: развивающееся заболевание. J Neuroimmunol. 2004, 157: 3-10. 10.1016 / j.jneuroim.2004.08.042.

    CAS PubMed Google ученый

  • 148.

    Куре К., Ллена Дж. Ф., Лайман В. Д., Соейро Р., Вайденхайм К. М., Хирано А., Диксон Д. В. Инфекция нервной системы вирусом иммунодефицита человека-1: исследование аутопсии 268 взрослых, детей и плода. . Hum Pathol. 1991, 22: 700-710. 10.1016 / 0046-8177 (91)

    -Х.

    CAS PubMed Google ученый

  • 149.

    Порвит А., Парравичини С., Петрен А.Л., Баркхем Т., Костанци Г., Джозеф С., Биберфельд П.: Клеточная ассоциация ВИЧ при СПИД-связанной энцефалопатии и деменции. Apmis. 1989, 97: 79-90. 10.1111 / j.1699-0463.1989.tb00759.x.

    CAS PubMed Google ученый

  • 150.

    Pumarola-Sune T, Navia BA, Cordon-Cardo C, Cho ES, Price RW: антиген ВИЧ в мозге пациентов с комплексом деменции СПИДа. Энн Нейрол. 1987, 21: 490-496. 10.1002 / ana.410210513.

    CAS PubMed Google ученый

  • 151.

    Williams KC, Corey S, Westmoreland SV, Pauley D, Knight H, deBakker C, Alvarez X, Lackner AA: периваскулярные макрофаги — это первичный тип клеток, продуктивно инфицированный вирусом иммунодефицита обезьян в мозгу макак: последствия для нейропатогенеза СПИДа. J Exp Med. 2001, 193: 905-915. 10.1084 / jem.193.8.905.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 152.

    Glass JD, Fedor H, Wesselingh SL, McArthur JC: Иммуноцитохимическое количественное определение вируса иммунодефицита человека в головном мозге: корреляция с деменцией. Энн Нейрол. 1995, 38: 755-762. 10.1002 / ana.410380510.

    CAS PubMed Google ученый

  • 153.

    Фишер-Смит Т., Тедальди Е.М., Раппапорт Дж .: Коэкспрессия CD163 / CD16 циркулирующими моноцитами / макрофагами в ВИЧ: потенциальные биомаркеры ВИЧ-инфекции и прогрессирования СПИДа.AIDS Res Hum Retroviruses. 2008, 24: 417-421. 10.1089 / помощь.2007.0193.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 154.

    Pulliam L, Gascon R, Stubblebine M, McGuire D, McGrath MS: Уникальная подгруппа моноцитов у пациентов с деменцией СПИДа. Ланцет. 1997, 349: 692-695. 10.1016 / S0140-6736 (96) 10178-1.

    CAS PubMed Google ученый

  • 155.

    Fischer-Smith T, Croul S, Sverstiuk AE, Capini C, L’Heureux D, Regulier EG, Richardson MW, Amini S, Morgello S, Khalili K, Rappaport J: вторжение в ЦНС периферических CD14 + / CD16 + полученные из крови моноциты при ВИЧ-деменции: периваскулярное накопление и резервуар ВИЧ-инфекции.J Neurovirol. 2001, 7: 528-541. 10.1080 / 135502801753248114.

    CAS PubMed Google ученый

  • 156.

    Ахим CL, Heyes MP, Wiley CA: Количественное определение вируса иммунодефицита человека, факторов иммунной активации и хинолиновой кислоты в мозге при СПИДе. J Clin Invest. 1993, 91: 2769-2775. 10.1172 / JCI116518.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 157.

    Fischer-Smith T, Croul S, Adeniyi A, Rybicka K, Morgello S, Khalili K, Rappaport J: Накопление макрофагов / микроглии и экспрессия ядерных антигенов пролиферирующих клеток в центральной нервной системе при энцефалопатии вируса иммунодефицита человека. Am J Pathol. 2004, 164: 2089-2099. 10.1016 / S0002-9440 (10) 63767-4.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 158.

    Фишер-Смит Т., Раппапорт Дж .: Развивающиеся парадигмы в патогенезе деменции, связанной с ВИЧ-1.Эксперт Rev Mol Med. 2005, 7: 1-26. 10.1017 / S1462399405010239.

    PubMed Google ученый

  • 159.

    Уиллер ED, Ахим CL, Ayyavoo V: Иммунодетекция Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в ткани мозга пациентов с энцефалитом ВИЧ-1. J Neurovirol. 2006, 12: 200-210. 10.1080 / 13550280600827377.

    CAS PubMed Google ученый

  • 160.

    Пиллер С.К., Янс П., Гейдж П.В., Янс Д.А.: Внеклеточный вирусный белок R ВИЧ-1 вызывает большой внутренний ток и гибель клеток в культивируемых нейронах гиппокампа: последствия для патологии СПИДа.Proc Natl Acad Sci USA. 1998, 95: 4595-4600. 10.1073 / pnas.95.8.4595.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 161.

    Jones GJ, Barsby NL, Cohen EA, Holden J, Harris K, Dickie P, Jhamandas J, Power C: Vpr ВИЧ-1 вызывает апоптоз нейронов и нейродегенерацию in vivo. J Neurosci. 2007, 27: 3703-3711. 10.1523 / JNEUROSCI.5522-06.2007.

    CAS PubMed Google ученый

  • 162.

    Sabbah EN, Roques BP: Критическое значение (70-96) домена белка Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа в апоптозе первичных нейронов коры и полосатого тела крыс. J Neurovirol. 2005, 11: 489-502. 10.1080 / 13550280500384941.

    CAS PubMed Google ученый

  • 163.

    Патель С.А., Мухтар М., Померанц Р.Дж.: Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует апоптоз в нейрональных клетках человека. J Virol. 2000, 74: 9717-9726.10.1128 / JVI.74.20.9717-9726.2000.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 164.

    Бреннеман Д.Е., Вестбрук Г.Л., Фитцджеральд С.П., Эннист Д.Л., Элкинс К.Л., Рафф М.Р., Перт CB: Уничтожение нейрональных клеток белком оболочки ВИЧ и его предотвращение с помощью вазоактивного кишечного пептида. Природа. 1988, 335: 639-642. 10.1038 / 335639a0.

    CAS PubMed Google ученый

  • 165.

    Venkatesh LK, Arens MQ, Subramanian T., Chinnadurai G: Селективная индукция токсичности для человеческих клеток, экспрессирующих Tat вируса иммунодефицита человека типа 1, условно цитотоксическим аденовирусным вектором. Proc Natl Acad Sci USA. 1990, 87: 8746-8750. 10.1073 / pnas.87.22.8746.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 166.

    Патель К.А., Мухтар М., Харли С., Кулькоски Дж., Померанц Р.Дж .: Лентивирусная экспрессия Vpr ВИЧ-1 индуцирует апоптоз в нейронах человека.J Neurovirol. 2002, 8: 86-99. 10.1080 / 135502802552.

    CAS PubMed Google ученый

  • 167.

    Acheampong E, Mukhtar M, Parveen Z, Ngoubilly N, Ahmad N, Patel C., Pomerantz RJ: Этанол сильно усиливает апоптоз, индуцированный белками ВИЧ-1 в первичных эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга человека. Вирусология. 2002, 304: 222-234. 10.1006 / viro.2002.1666.

    CAS PubMed Google ученый

  • 168.

    Rom I, Deshmane SL, Mukerjee R, Khalili K, Amini S, Sawaya BE: ВИЧ-1 Vpr нарушает секрецию кальция в нервных клетках. Brain Res. 2009

    Google ученый

  • 169.

    D’Antoni S, Berretta A, Bonaccorso CM, Bruno V, Aronica E, Nicoletti F, Catania MV: метаботропные рецепторы глутамата в глиальных клетках. Neurochem Res. 2008, 33: 2436-2443.

    PubMed Google ученый

  • 170.

    Китайма Х, Миура Й, Андо Й, Хосино С., Ишизака Й, Коянаги Y: Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 ингибирует разрастание аксонов за счет индукции митохондриальной дисфункции. J Virol. 2008, 82: 2528-2542. 10.1128 / JVI.02094-07.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 171.

    Hogan TH, Nonnemacher MR, Krebs FC, Henderson A, Wigdahl B: Связывание Vpr ВИЧ-1 с цис-действующими элементами LTR C / EBP ВИЧ-1 и соседними областями является последовательноспецифичным.Biomed Pharmacother. 2003, 57: 41-48. 10.1016 / S0753-3322 (02) 00333-5.

    CAS PubMed Google ученый

  • 172.

    Burdo TH, Nonnemacher M, Irish BP, Choi CH, Krebs FC, Gartner S, Wigdahl B: высокоаффинное взаимодействие между Vpr ВИЧ-1 и специфическими последовательностями, которые охватывают C / EBP и соседний NF-kappaB сайты в LTR ВИЧ-1 коррелируют с деменцией, связанной с ВИЧ-1. ДНК Cell Biol. 2004, 23: 261-269. 10.1089 / 104454

  • 3819842.

    CAS PubMed Google ученый

  • 173.

    Киларески Е.М., Шах С., Ноннемахер М.Р., Вигдал Б. Регуляция транскрипции ВИЧ-1 в клетках линии моноцитарно-макрофагального происхождения. Ретровирология. 2009, 6: 118-10.1186 / 1742-4690-6-118.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 174.

    Si Q, Kim MO, Zhao ML, Landau NR, Goldstein H, Lee S: Vpr- и Nef-зависимая индукция RANTES / CCL5 в клетках микроглии.Вирусология. 2002, 301: 342-353. 10.1006 / viro.2002.1613.

    CAS PubMed Google ученый

  • 175.

    Wyatt CM, Rosenstiel PE, Klotman PE: ВИЧ-ассоциированная нефропатия. Contrib Nephrol. 2008, 159: 151-161. полный текст.

    CAS PubMed Google ученый

  • 176.

    Копп Дж., Смит М., Нельсон Дж., Джонсон Р., Фридман Б., Боуден Д., Олексик Т., Маккензи Л., Каджияма Н., Ахуджа Т. и др. гломерулосклероз.Нат Жене. 2008, 40: 1175-1184. 10,1038 / нг.226.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 177.

    Tang P, Jerebtsova M, Przygodzki R, Ray PE: Фактор роста фибробластов-2 увеличивает рекрутирование почек и прикрепление ВИЧ-инфицированных мононуклеарных клеток к эпителиальным клеткам почечных канальцев. Педиатр Нефрол. 2005, 20: 1708-1716. 10.1007 / s00467-005-2018-2.

    PubMed Google ученый

  • 178.

    Дики П., Робертс А., Ювьера Р., Уитмер Дж., Шарма К., Копп Дж. Б. Фокальный гломерулосклероз у провирусных и трансгенных мышей c-fms связывает экспрессию Vpr с ВИЧ-ассоциированной нефропатией. Вирусология. 2004, 322: 69-81. 10.1016 / j.virol.2004.01.026.

    CAS PubMed Google ученый

  • 179.

    Чжун Дж., Цзо Й., Ма Дж., Фого А.Б., Джоликер П., Итикава И., Мацусака Т.: Экспрессия генов ВИЧ-1 только в подоцитах может привести к полному спектру ВИЧ-1-ассоциированной нефропатии.Kidney Int. 2005, 68: 1048-1060. 10.1111 / j.1523-1755.2005.00497.x.

    CAS PubMed Google ученый

  • 180.

    Zuo Y, Matsusaka T, Zhong J, Ma J, Ma LJ, Hanna Z, Jolicoeur P, Fogo AB, Ichikawa I: гены vpr и nef ВИЧ-1 синергетически повреждают подоциты, что приводит к гломерулосклерозу. J Am Soc Nephrol. 2006, 17: 2832-2843. 10.1681 / ASN.2005080878.

    CAS PubMed Google ученый

  • 181.

    Rosenstiel PE, Gruosso T, Letourneau AM, Chan JJ, LeBlanc A, Husain M, Najfeld V, Planelles V, D’Agati VD, Klotman ME, Klotman PE: ВИЧ-1 Vpr ингибирует цитокинез в клетках проксимальных канальцев человека. Kidney Int. 2008, 74: 1049-1058. 10.1038 / ки.2008.303.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 182.

    Hiramatsu N, Hiromura K, Shigehara T, Kuroiwa T, Ideura H, Sakurai N, Takeuchi S, Tomioka M, Ikeuchi H, Kaneko Y, et al: Блокада рецепторов ангиотензина II типа 1 тормозит развитие и прогрессирование ВИЧ-ассоциированной нефропатии на мышиной модели.J Am Soc Nephrol. 2007, 18: 515-527. 10.1681 / ASN.2006030217.

    CAS PubMed Google ученый

  • 183.

    Ayyavoo V, Muthumani K, Kudchodkar S, Zhang D, Ramanathan P, Dayes NS, Kim JJ, Sin JI, Montaner LJ, Weiner DB: вирусный белок R ВИЧ-1 нарушает клеточную иммунную функцию in vivo. Int Immunol. 2002, 14: 13-22. 10.1093 / intimm / 14.1.13.

    CAS PubMed Google ученый

  • 184.

    Muthumani K, Bagarazzi M, Conway D, Hwang DS, Ayyavoo V, Zhang D, Manson K, Kim J, Boyer J, Weiner DB: включение дополнительного гена Vpr в коктейль плазмидной вакцины заметно снижает эффективность вакцины Nef in vivo, что приводит к Потеря клеток CD4 и увеличение вирусной нагрузки у макак-резусов. J Med Primatol. 2002, 31: 179-185. 10.1034 / j.1600-0684.2002.02004.x.

    CAS PubMed Google ученый

  • 185.

    Bouzar AB, Villet S, Morin T, Rea A, Genestier L, Guiguen F, Garnier C, Mornex JF, Narayan O, Chebloune Y: Белки Vpr / Vpx вируса иммунодефицита обезьяны убивают неинфицированные CD4 + Т-лимфоциты. путем индукции апоптоза.Вирусология. 2004, 326: 47-56. 10.1016 / j.virol.2004.05.016.

    CAS PubMed Google ученый

  • 186.

    Moon HS, Yang JS: Роль Vpr ВИЧ как регулятора апоптоза и эффектора на клетках-свидетелях. Mol Cells. 2006, 21: 7-20.

    CAS PubMed Google ученый

  • 187.

    Azad AA: Могут ли белки Nef и Vpr способствовать прогрессированию заболевания, способствуя истощению клеток-свидетелей и продлению выживания ВИЧ-инфицированных клеток ?.Biochem Biophys Res Commun. 2000, 267: 677-685. 10.1006 / bbrc.1999.1708.

    CAS PubMed Google ученый

  • 188.

    Groux H, Torpier G, Monte D, Mouton Y, Capron A, Ameisen JC: индуцированная активацией смерть в результате апоптоза CD4 + Т-клеток у бессимптомных людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека. J Exp Med. 1992, 175: 331-340. 10.1084 / jem.175.2.331.

    CAS PubMed Google ученый

  • 189.

    Meyaard L, Schuitemaker H, Miedema F: Дисфункция Т-клеток при ВИЧ-инфекции: анергия из-за дефектной функции антигенпрезентирующих клеток ?. Иммунол сегодня. 1993, 14: 161-164. 10.1016 / 0167-5699 (93)

  • -Т.

    CAS PubMed Google ученый

  • 190.

    Ясуда Дж., Мияо Т., Камата М., Аида Ю., Ивакура Ю.: апоптоз Т-клеток вызывает истощение периферических Т-клеток у мышей, трансгенных по гену vpr ВИЧ-1. Вирусология. 2001, 285: 181-192. 10.1006 / viro.2001.0964.

    CAS PubMed Google ученый

  • 191.

    Nishizawa M, Kamata M, Mojin T., Nakai Y, Aida Y: Индукция апоптоза белком Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 происходит независимо от G (2) остановки клеточного цикла. Вирусология. 2000, 276: 16-26. 10.1006 / viro.2000.0534.

    CAS PubMed Google ученый

  • 192.

    Li G, Park HU, Liang D, Zhao RY: остановка клеточного цикла G2 / M посредством S-фазозависимого механизма вирусным белком ВИЧ-1 R.Ретровирология. 2010, 7: 59-10.1186 / 1742-4690-7-59.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 193.

    Muthumani K, Zhang D, Hwang DS, Kudchodkar S, Dayes NS, Desai BM, Malik AS, Yang JS, Chattergoon MA, Maguire HC, Weiner DB: Аденовирус, кодирующий Vpr ВИЧ-1, активирует каспазу 9 и индуцирует апоптотическая гибель клеток как в р53-положительных, так и в отрицательных линиях опухолевых клеток человека. Онкоген. 2002, 21: 4613-4625. 10.1038 / sj.onc.1205549.

    CAS PubMed Google ученый

  • 194.

    Shostak LD, Ludlow J, Fisk J, Pursell S, Rimel BJ, Nguyen D, Rosenblatt JD, Planelles V: Роли p53 и каспаз в индукции остановки клеточного цикла и апоптоза ВИЧ-1 vpr. Exp Cell Res. 1999, 251: 156-165. 10.1006 / excr.1999.4568.

    CAS PubMed Google ученый

  • 195.

    Стюарт С.А., Пун Б., Сонг Дж.Й., Чен И.С.: vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует апоптоз через активацию каспазы.J Virol. 2000, 74: 3105-3111. 10.1128 / JVI.74.7.3105-3111.2000.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 196.

    Majumder B, Venkatachari NJ, Schafer EA, Janket ML, Ayyavoo V: Дендритные клетки, инфицированные vpr-положительным вирусом иммунодефицита человека типа 1, индуцируют апоптоз CD8 + Т-клеток посредством усиления фактора некроза опухоли альфа. J Virol. 2007, 81: 7388-7399. 10.1128 / JVI.00893-06.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 197.

    Ричард Дж., Синдху С., Фам Т.Н., Белзил Дж. П., Коэн Э.А.: Vpr ВИЧ-1 регулирует экспрессию лигандов для активирующего рецептора NKG2D и способствует опосредованному NK-клеткам уничтожению. Кровь. 2010, 115: 1354-1363. 10.1182 / кровь-2009-08-237370.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 198.

    Ward J, Davis Z, DeHart J, Zimmerman E, Bosque A, Brunetta E, Mavilio D, Planelles V, Barker E: Vpr ВИЧ-1 запускает опосредованный естественными клетками-киллерами лизис инфицированных клеток посредством активации ответ на повреждение ДНК, опосредованный ATR.PLoS Pathog. 2009, 5: e1000613-10.1371 / journal.ppat.1000613.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 199.

    Hong HS, Bhatnagar N, Ballmaier M, Schubert U, Henklein P, Volgmann T., Heiken H, Schmidt RE, Meyer-Olson D. Экзогенный Vpr ВИЧ-1 нарушает ответ IFN-альфа плазматическими дендритными клетками ( pDC) и последующее взаимодействие pDC / NK. Immunol Lett. 2009, 125: 100-104. 10.1016 / j.imlet.2009.06.008.

    CAS PubMed Google ученый

  • 200.

    Majumder B, Venkatachari NJ, O’Leary S, Ayyavoo V: Инфекция Vpr-положительным вирусом иммунодефицита человека типа 1 нарушает функцию NK-клеток косвенно через дисрегуляцию цитокинов инфицированных клеток-мишеней. J Virol. 2008, 82: 7189-7200. 10.1128 / JVI.01979-07.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 201.

    Majumder B, Janket ML, Schafer EA, Schaubert K, Huang XL, Kan-Mitchell J, Rinaldo CR, Ayyavoo V: Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа нарушает созревание дендритных клеток и активацию Т-клеток: последствия для вирусный иммунный побег.J Virol. 2005, 79: 7990-8003. 10.1128 / JVI.79.13.7990-8003.2005.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 202.

    Мариани Р., Расала Б.А., Раттер Г., Вигерс К., Брандт С.М., Краусслич Г.Г., Ландау Н.Р.: Гетерокарионы мыши и человека поддерживают эффективную сборку вируса иммунодефицита человека типа 1. J Virol. 2001, 75: 3141-3151. 10.1128 / JVI.75.7.3141-3151.2001.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 203.

    Muthumani K, Desai BM, Hwang DS, Choo AY, Laddy DJ, Thieu KP, Rao RG, Weiner DB: Vpr ВИЧ-1 и противовоспалительная активность. ДНК Cell Biol. 2004, 23: 239-247. 10.1089 / 104454

  • 3819824.

    CAS PubMed Google ученый

  • 204.

    Venkatachari NJ, Majumder B, Ayyavoo V: Vpr вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1 индуцирует дифференциальную регуляцию костимулирующих молекул Т-клеток: прямое влияние Vpr на активацию Т-клеток и иммунную функцию.Вирусология. 2007, 358: 347-356. 10.1016 / j.virol.2006.08.030.

    CAS PubMed Google ученый

  • 205.

    Muthumani K, Hwang DS, Choo AY, Mayilvahanan S, Dayes NS, Thieu KP, Weiner DB: ВИЧ-1 Vpr ингибирует созревание и активацию макрофагов и дендритных клеток in vitro. Int Immunol. 2005, 17: 103-116. 10.1093 / intimm / dxh290.

    CAS PubMed Google ученый

  • 206.

    Muthumani K, Choo AY, Hwang DS, Dayes NS, Chattergoon M, Mayilvahanan S, Thieu KP, Buckley PT, Emmanuel J, Premkumar A, Weiner DB: ВИЧ-1 Вирусный белок-r (Vpr) защищает от смертельного заражения суперантигеном, в то время как поддержание гомеостатических уровней Т-клеток in vivo. Mol Ther. 2005, 12: 910-921. 10.1016 / j.ymthe.2005.05.009.

    CAS PubMed Google ученый

  • 207.

    Auphan N, DiDonato JA, Rosette C, Helmberg A, Karin M: иммуносупрессия глюкокортикоидами: ингибирование активности NF-каппа B посредством индукции синтеза I каппа B.Наука. 1995, 270: 286-290. 10.1126 / science.270.5234.286.

    CAS PubMed Google ученый

  • 208.

    Scheinman RI, Cogswell PC, Lofquist AK, Baldwin AS, Jr: Роль транскрипционной активации I каппа B альфа в опосредовании иммуносупрессии глюкокортикоидами. Наука. 1995, 270: 283-286. 10.1126 / science.270.5234.283.

    CAS PubMed Google ученый

  • 209.

    Ayyavoo V, Mahboubi A, Mahalingam S, Ramalingam R, Kudchodkar S, Williams WV, Green DR, Weiner DB: Vpr ВИЧ-1 подавляет активацию иммунной системы и апоптоз посредством регуляции ядерного фактора каппа B. Nat Med. 1997, 3: 1117-1123. 10,1038 / нм1097-1117.

    CAS PubMed Google ученый

  • 210.

    Mirani M, Elenkov I, Volpi S, Hiroi N, Chrousos GP, Kino T: белок Vpr ВИЧ-1 подавляет выработку IL-12 из моноцитов человека, усиливая действие глюкокортикоидов: потенциальные последствия активности коактиватора Vpr для дефицит врожденного и клеточного иммунитета, наблюдаемый при ВИЧ-1-инфекции.J Immunol. 2002, 169: 6361-6368.

    CAS PubMed Google ученый

  • 211.

    Muthumani K, Kudchodkar S, Papasavvas E, Montaner LJ, Weiner DB, Ayyavoo V: Vpr ВИЧ-1 регулирует экспрессию бета-хемокинов в первичных лимфоцитах и ​​макрофагах человека. J Leukoc Biol. 2000, 68: 366-372.

    CAS PubMed Google ученый

  • 212.

    Varin A, Decrion A, Sabbah E, Quivy V, Sire J, Van Lint C, Roques B, Aggarwal B, Herbein G: синтетический белок Vpr активирует протеин-активатор-1, N-концевую киназу c-Jun. , и NF-kappaB и стимулирует транскрипцию ВИЧ-1 в промоноцитарных клетках и первичных макрофагах.J Biol Chem. 2005, 280: 42557-42567. 10.1074 / jbc.M502211200.

    CAS PubMed Google ученый

  • 213.

    Roux P, Alfieri C, Hrimech M, Cohen E, Tanner J: Активация факторов транскрипции NF-kappaB и NF-IL-6 белком R (Vpr) вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует экспрессию интерлейкина-8. . J Virol. 2000, 74: 4658-4665. 10.1128 / JVI.74.10.4658-4665.2000.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 214.

    Eckstein DA, Sherman MP, Penn ML, Chin PS, De Noronha CM, Greene WC, Goldsmith MA: ВИЧ-1 Vpr увеличивает вирусную нагрузку, облегчая инфицирование тканевых макрофагов, но не деля CD4 + Т-клетки. J Exp Med. 2001, 194: 1407-1419. 10.1084 / jem.194.10.1407.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 215.

    Lang SM, Weeger M, Stahl-Hennig C, Coulibaly C, Hunsmann G, Muller J, Muller-Hermelink H, Fuchs D, Wachter H, Daniel MM, et al: Важность vpr для инфицирования резуса обезьяны с вирусом обезьяньего иммунодефицита.J Virol. 1993, 67: 902-912.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 216.

    Tzitzivacos DB, Tiemessen CT, Stevens WS, Papathanasopoulos MA: Вирусные генетические детерминанты непрогрессирующей инфекции ВИЧ типа 1 подтипа C у детей, не получавших антиретровирусные препараты. AIDS Res Hum Retroviruses. 2009, 25: 1141-1148. 10.1089 / помощь.2009.0080.

    CAS PubMed Google ученый

  • 217.

    Jacquot G, Le Rouzic E, Maidou-Peindara P, Maizy M, Lefrere JJ, Daneluzzi V, Monteiro-Filho CM, Hong D, Planelles V, Morand-Joubert L, Benichou S: Характеристика молекулярных детерминант первичного ВИЧ- 1 Белки Vpr: влияние замен Q65R и R77Q на функции Vpr. PLoS One. 2009, 4: e7514-10.1371 / journal.pone.0007514.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 218.

    Aquaro S, Svicher V, Schols D, Pollicita M, Antinori A, Balzarini J, Perno CF: Механизмы, лежащие в основе активности антиретровирусных препаратов в ВИЧ-1-инфицированных макрофагах: новые терапевтические стратегии.J Leukoc Biol. 2006, 80: 1103-1110. 10.1189 / jlb.0606376.

    CAS PubMed Google ученый

  • 219.

    Датта Т., Агаше Х.Б., Гарг М., Балакришнан П., Кабра М., Джайн Н.К. Наноконтейнеры на основе поли (пропиленимин) дендримеров для нацеливания эфавиренца на человеческие моноциты / макрофаги in vitro. J Drug Target. 2007, 15: 89-98. 10.1080 / 10611860600965914.

    CAS PubMed Google ученый

  • 220.

    Вьяс Т.К., Шах Л., Амиджи М.М.: Носители лекарств в виде наночастиц для доставки терапии ВИЧ / СПИДа в места расположения вирусных резервуаров. Мнение эксперта Drug Deliv. 2006, 3: 613-628. 10.1517 / 17425247.3.5.613.

    CAS PubMed Google ученый

  • 221.

    Swingler S, Mann AM, Zhou J, Swingler C., Stevenson M: Апоптотическое уничтожение ВИЧ-1-инфицированных макрофагов нарушается гликопротеином вирусной оболочки. PLoS Pathog. 2007, 3: 1281-1290. 10.1371 / журнал.ppat.0030134.

    CAS PubMed Google ученый

  • 222.

    Huang Y, Erdmann N, Peng H, Herek S, Davis JS, Luo X, Ikezu T, Zheng J: TRAIL-опосредованный апоптоз в ВИЧ-1-инфицированных макрофагах зависит от ингибирования Akt-1 фосфорилирование. J Immunol. 2006, 177: 2304-2313.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 223.

    Chugh P, Bradel-Tretheway B, Monteiro-Filho CM, Planelles V, Maggirwar SB, Dewhurst S, Kim B: ингибиторы Akt в качестве ВИЧ-1-инфицированных макрофаг-специфических противовирусных препаратов.Ретровирология. 2008, 5: 11-10.1186 / 1742-4690-5-11.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 224.

    Капаси А.А., Coscia SA, Pandya MP, Singhal PC: Морфин по-разному модулирует индуцированный gp160 ВИЧ-1 апоптоз мышиных макрофагов и человеческих моноцитов. J Neuroimmunol. 2004, 148: 86-96. 10.1016 / j.jneuroim.2003.11.015.

    CAS PubMed Google ученый

  • 225.

    Li G, Bukrinsky M, Zhao RY: вирусный белок R (Vpr) ВИЧ-1 и его взаимодействия с клеткой-хозяином. Curr HIV Res. 2009, 7: 178-183. 10.2174 / 157016209787581436.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 226.

    Liang D, Benko Z, Agbottah E, Bukrinsky M, Zhao RY: Анти-vpr активность белка теплового шока 27. Mol Med. 2007, 13: 229-239. 10.2119 / 2007-00004.Liang.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 227.

    Иорданский С., Чжао Ю., Дубровский Л., Иорданская Т., Чен М., Лян Д., Букринский М.: Белок теплового шока 70 защищает клетки от остановки клеточного цикла и апоптоза, индуцированного вирусным белком вируса иммунодефицита человека 1 типа R. J Virol. 2004, 78: 9697-9704. 10.1128 / JVI.78.18.9697-9704.2004.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 228.

    Иорданский С., Чжао Ю., ДиМарцио П., Агостини И., Дубровский Л., Букринский М.: Белок теплового шока 70 оказывает противоположные эффекты на Vpr-зависимую и Vpr-независимую репликацию ВИЧ-1 в макрофагах.Кровь. 2004, 104: 1867-1872. 10.1182 / кровь-2004-01-0081.

    CAS PubMed Google ученый

  • 229.

    Yedavalli VS, Shih HM, Chiang YP, Lu CY, Chang LY, Chen MY, Chuang CY, Dayton AI, Jeang KT, Huang LM: Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 взаимодействует с антиапоптотическим митохондриальным белком HAX-1 . J Virol. 2005, 79: 13735-13746. 10.1128 / JVI.79.21.13735-13746.2005.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 230.

    Gibellini D, Re MC, Ponti C, Vitone F, Bon I, Fabbri G, Grazia Di Iasio M, Zauli G: белок Tat ВИЧ-1 одновременно подавляет апикальную каспазу-10 и повышает c-FLIP в лимфоидном T клетки: потенциальный молекулярный механизм, позволяющий избежать цитотоксичности TRAIL. J. Cell Physiol. 2005, 203: 547-556. 10.1002 / jcp.20252.

    CAS PubMed Google ученый

  • 231.

    Haffar OK, Smithgall MD, Popov S, Ulrich P, Bruce AG, Nadler SG, Cerami A, Bukrinsky MI: CNI-H0294, ингибитор ядерного импорта генома вируса иммунодефицита человека типа 1, отменяет репликацию вируса в инфицированных активированных мононуклеарных клетках периферической крови.Антимикробные агенты Chemother. 1998, 42: 1133-1138.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 232.

    Сузуки Т., Ямамото Н., Нонака М., Хашимото Ю., Мацуда Г., Такешима С. Н., Мацуяма М., Игараси Т., Миура Т., Танака Р. и др.: Подавление вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1 ) ядерный импорт через взаимодействия Vpr-Importin альфа в качестве новой терапии ВИЧ-1. Biochem Biophys Res Commun. 2009, 380: 838-843. 10.1016 / j.bbrc.2009.01.180.

    CAS PubMed Google ученый

  • 233.

    Пакстон В., Коннор Р. И., Ландау Н. Р.: Включение Vpr в вирионы вируса иммунодефицита человека типа 1: потребность в области p6 gag и мутационный анализ. J Virol. 1993, 67: 7229-7237.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 234.

    Yao XJ, Kobinger G, Dandache S, Rougeau N, Cohen E: гибридные белки Vpr-хлорамфениколацетилтрансфераза ВИЧ-1: требования к последовательности для включения вириона и анализ противовирусного эффекта.Gene Ther. 1999, 6: 1590-1599. 10.1038 / sj.gt.3300988.

    CAS PubMed Google ученый

  • 235.

    Ao Z, Yu Z, Wang L, Zheng Y, Yao X: слитый белок Vpr14-88-Apobec3G эффективно включается в Vif-положительные частицы ВИЧ-1 и ингибирует вирусную инфекцию. PLoS ONE. 2008, 3: e1995-10.1371 / journal.pone.0001995.

    PubMed Central PubMed Google ученый

  • 236.

    Мариани Р., Чен Д., Шрофельбауэр Б., Наварро Ф., Кониг Р., Боллман Б., Мунк С., Нимарк-МакМахон Н., Ландау Н. Р.: Специфичное для видов исключение APOBEC3G из вирионов ВИЧ-1 с помощью Vif. Клетка. 2003, 114: 21-31. 10.1016 / S0092-8674 (03) 00515-4.

    CAS PubMed Google ученый

  • 237.

    Sheehy AM, Gaddis NC, Choi JD, Malim MH: Выделение человеческого гена, который ингибирует инфекцию ВИЧ-1 и подавляется вирусным белком Vif. Природа. 2002, 418: 646-650.10.1038 / природа00939.

    CAS PubMed Google ученый

  • 238.

    Стюарт С.А., Пун Б., Джоветт Дж. Б., Се Ю., Чен И.С.: Лентивирусная доставка белка Vpr ВИЧ-1 индуцирует апоптоз в трансформированных клетках. Proc Natl Acad Sci USA. 1999, 96: 12039-12043. 10.1073 / pnas.96.21.12039.

    PubMed Central CAS PubMed Google ученый

  • 239.

    Шимура М., Танака Ю., Накамура С., Минемото Ю., Ямасита К., Хатаке К., Такаку Ф., Ишизака Ю. Формирование микроядер и анеуплоидия, индуцированные Vpr, дополнительным геном вируса иммунодефицита человека 1 типа.Faseb J. 1999, 13: 621-637.

    CAS PubMed Google ученый

  • Впр — обзор | ScienceDirect Topics

    Лентивирусный белок R (Vpr)

    Vpr представляет собой связанный с вирионом нуклеоцитоплазматический регуляторный белок, который кодируется (и сохраняется среди) лентивирусов приматов, ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV. Хотя он незаменим для роста ВИЧ-1 в активированных и делящихся Т-клетках, Vpr, по-видимому, играет важную роль в репликации вируса in vivo , поскольку делеция vpr и связанных генов vpx в SIV серьезно ухудшает патогенные свойства у экспериментально зараженных макак-резусов.Кроме того, ВИЧ-2 и SIV также кодируют дополнительный связанный с Vpr белок, Vpx, который, как полагают, действует синергетически с Vpr. Сообщается, что Vpr ВИЧ-1 проявляет многочисленные биологические активности, включая ядерную локализацию (на основе присутствия по крайней мере двух NLS), образование ионных каналов, активацию транскрипции ВИЧ-1 и гетерологичных промоторов, совместную активацию рецептора глюкокортикоидов. , регуляция дифференцировки клеток, индукция апоптоза, остановка клеточного цикла и трансдукция через клеточные мембраны.Хотя значительные количества Vpr (примерно 0,15-кратное молярное отношение к вирусным коровым белкам) упаковываются в зарождающиеся частицы ВИЧ-1 в процессе, зависящем от взаимодействия Vpr с С-концевым доменом p6 Gag, биологическая роль (и) Связанный с вирионом Vpr еще предстоит полностью выяснить.

    Высококонсервативный 96-аминокислотный Vpr привлек значительное внимание, и ряд биологических функций был приписан его присутствию в различных клеточных и внеклеточных компартментах.Наиболее интенсивно изучаемые биологические функции Vpr — это те, которые влияют на транслокацию PIC поступающего вируса из цитоплазмы в ядро ​​и остановку в фазе G 2 клеточного цикла. Функция ядерного нацеливания Vpr была связана с продуктивной инфекцией терминально дифференцированных макрофагов, опосредуя интеграцию провирусной ДНК в геном хозяина. Предполагается, что Vpr вызывает динамические нарушения в архитектуре ядерной оболочки, что позволяет транспортировать PIC через ядерную мембрану.Что касается второй функции Vpr, которая приводит к остановке клеточного цикла G 2 в ВИЧ-1-инфицированных Т-клетках, было высказано предположение, что эта активность обеспечивает внутриклеточную среду, благоприятную для экспрессии вирусных генов. Было идентифицировано множество клеточных партнеров по связыванию Vpr, и для некоторых из них была предложена специфическая роль в аресте G 2 . Тем не менее точный молекулярный механизм, лежащий в основе Vpr-индуцированного ареста G 2 , остается неясным. Возможное объяснение очевидной парадигмы, согласно которой Vpr предотвращает пролиферацию инфицированных Т-клеток, задерживая их в фазе G 2 , было предоставлено наблюдением, что экспрессия вирусного гена оптимальна в фазе G 2 и что Vpr может увеличивать продукцию вируса. задерживая клетки на этой стадии клеточного цикла.Интересно, что во входящих вирусных частицах имеется достаточное количество Vpr, чтобы вызвать остановку клеточного цикла G 2 даже до инициации синтеза вирусных белков de novo . Вторичные структуры в Vpr, полученные в результате нескольких анализов, указывают на присутствие мотива α-спираль-поворот-α-спираль на N-конце и протяженной амфипатической спиральной области на C-конце, которая может играть ключевую роль в самоассоциации. и взаимодействие Vpr с гетерологичными белками, такими как p6, NC, Tat вируса и транслокатором адениновых нуклеотидов митохондриальной поры.

    Другие исследования предполагают, что пролонгированная задержка G 2 , индуцированная Vpr, в конечном итоге приводит к апоптозу инфицированной клетки. Напротив, были описаны ранние антиапоптотические эффекты Vpr, которые заменяются его проапоптотическими эффектами. Эти проапоптотические эффекты Vpr могут быть результатом либо эффектов на целостность ядерной оболочки, либо прямой проницаемости митохондриальной мембраны, возможно, включая Vpr-опосредованное образование ионных каналов в биологических мембранах.

    Влияние на экспрессию гена ВИЧ-1, взаимодействие Tat-Vpr и клеточный апоптоз естественными вариантами HIV-1 Tat Exon 1 и Vpr из Северной Индии

    Аннотация

    Фон

    Поскольку гены Tat и Vpr ВИЧ-1 участвуют в трансактивации промоторов, апоптозе и т. Д., Мы провели исследования, чтобы выяснить природу и степень естественной изменчивости двух генов у серопозитивных пациентов из Северной Индии и определили их функциональное значение.

    Методы

    HIV-1 tat экзон 1 и vpr были амплифицированы из геномной ДНК, выделенной из крови ВИЧ-1 инфицированных людей, с использованием специфических праймеров методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и подвергнуты обширному генетическому анализу (CLUSTAL W, Simplot так далее). Их экспрессию контролировали путем создания клонов слияния myc. Варианты экзона 1 Tat и Vpr котрансфицировали конструкцией репортерного гена (LTR-luc), и их потенциал трансактивации контролировали путем измерения активности люциферазы.Анализ апоптоза и клеточного цикла проводили окрашиванием пропидиум йодидом (PI) с последующим FACS.

    Результаты

    Экзон 1 tat амплифицировали из 21 образца, а vpr амплифицировали из 16 образцов. Один из вариантов экзона 1 Tat показал филогенетическое родство с подтипами B и C и оказался уникальным рекомбинантом. Два варианта Vpr были рекомбинантами B / C / D. Было обнаружено, что эти естественные вариации не влияют на стабильность Tat и Vpr.Эти варианты различались по способности трансактивировать промоторы B LTR и C LTR. Рекомбинантный Tat B / C показал лучшее кооперативное взаимодействие с Vpr. Было обнаружено, что рекомбинация B / C / D в Vpr не влияет на его кооперативность с Tat. Рекомбинантный Tat (B / C) индуцировал больше апоптоза, чем Tat дикого типа B и C. Рекомбинация B / C / D в Vpr не влияла на его потенциал индукции остановки G2, но снижала его способность индуцировать апоптоз.

    Выводы

    Обширные последовательности и регион-специфические вариации наблюдались в генах Tat и Vpr от ВИЧ-1 инфицированных людей из Северной Индии.Эти вариации имеют функциональное значение и поэтому важны для патогенности вируса.

    Образец цитирования: Lata S, Ronsard L, Sood V, Dar SA, Ramachandran VG, Das S, et al. (2013) Влияние на экспрессию гена ВИЧ-1, взаимодействие Tat-Vpr и клеточный апоптоз с помощью естественных вариантов HIV-1 Tat Exon 1 и Vpr из Северной Индии. PLoS ONE 8 (12): e82128. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128

    Редактор: Шилпа Дж.Бух, Медицинский центр Университета Небраски, Соединенные Штаты Америки

    Поступила: 29 мая 2013 г .; Принята к печати: 18 октября 2013 г .; Опубликован: 19 декабря 2013 г.

    Авторские права: © 2013 Lata et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Финансирование: Это исследование было поддержано Советом по научным и промышленным исследованиям, Нью-Дели, Индия, и Индийским советом медицинских исследований (HIV / 50/142/9/2011-ECD), Правительство Индии, автору-корреспонденту , Национальный институт иммунологии, Нью-Дели, Индия, сроком на 3 года. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) был открыт в 1983 году. Несмотря на широкое использование АРВ (антиретровирусных препаратов), он стал одной из самых серьезных проблем со здоровьем во всем мире. В отчете ЮНЭЙДС о глобальной эпидемии СПИДа за 2012 год зафиксировано 50-процентное снижение числа новых случаев инфицирования ВИЧ; тем не менее, на конец 2011 года во всем мире насчитывалось 34,2 миллиона ВИЧ-инфицированных. Незначительное увеличение с 33,5 миллиона в 2010 году объясняется совокупным эффектом продолжающихся новых инфекций, увеличением (на 63%) числа инфицированных получателей АРВ-препаратов и меньшим смертность (на 24% меньше по сравнению с 2005 годом) от СПИДа во всем мире.ВИЧ-1 принадлежит к семейству Retroviridae . Изоляты ВИЧ-1 со всего мира были разделены на четыре группы, а именно M, N, O и P. Группа «M» на сегодняшний день является наиболее распространенным типом ВИЧ. Более 90 процентов случаев ВИЧ / СПИДа происходят из-за этой группы. Группа вирусов M состоит как минимум из девяти чистых подтипов и множества циркулирующих рекомбинантных форм [1], [2], [3] и уникальных рекомбинантных форм [4], [5], [6]. По крайней мере 10 процентов циркулирующих штаммов ВИЧ-1 состоят из рекомбинантов межподтипа [7], [8], [9].Недавние исследования показывают, что подтип C (ответственный за большинство инфекций во всем мире (более 56%) составляет более 98 процентов инфекций на Индийском субконтиненте [10]. Группа P была недавно обнаружена у диких горилл. Вирус был изолирован от камерунской женщины [11]

    Трансактиватор белка транскрипции (Tat) ВИЧ-1 был ключевым направлением исследований ВИЧ с момента его открытия в 1985 году [12] из-за его решающей роли в активации транскрипции вирусных генов и некоторых других функций, имеющих важное значение для патогенеза.Tat — небольшой белок (9–11 кДа), состоящий из 86–101 аминокислоты в зависимости от подтипа [13]. Tat имеет два экзона; первого экзона, кодирующего 72 аминокислоты, достаточно для трансактивации LTR ВИЧ-1 [14], [15], [16]. Последовательность Tat подразделяется на несколько отдельных областей на основе ее аминокислотного состава: N-концевой кислотный участок (аминокислотные остатки 1-22), богатый цистеином домен (аминокислотные остатки 22-37), центральная область (аминокислотные остатки 38– 47), основной области (а.о. 48–57) и богатой глутамином области (а.о. 60–76) [17]. Известно, что кислая область функционирует как домен активации [18].Считается, что богатый цистеином домен участвует в образовании димеров, опосредованном ионами цинка [19]. Основные, основные и богатые глутамином области участвуют в связывании РНК, и основная область также действует как сигнал ядерной локализации [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26] ]. С-концевой домен Tat участвует в стимуляции котранскрипционного кэпирования мРНК ВИЧ-1 посредством прямого взаимодействия с кэппирующим ферментом MceI [27]. Сообщалось также, что Tat ВИЧ-1 играет двойную роль в регуляции апоптоза клеток-хозяев.Экзогенный Tat индуцирует апоптоз в нормальных клетках, в то время как он защищает инфицированные ВИЧ-1 клетки от апоптоза, что может быть полезно для выживания инфицированных ВИЧ-1 клеток in vivo [28]. Tat ВИЧ-1 также увеличивает опосредованную NFκB секрецию IL-8 в линиях Т-клеток [29]. Сообщалось также, что Tat приводит к усилению регуляции CCR5 и понижению регуляции CXCR4 [30].

    ВИЧ-1 Vpr представляет собой 96-аминокислотный белок массой 14 кДа. Vpr имеет три альфа-спирали. Эти спирали соединены петлями и свернуты вокруг гидрофобного ядра [31], окруженного гибким N-концевым доменом и C-концевым участком, богатым аргинином, которые имеют отрицательный и положительный заряд, соответственно.Vpr упакован в значительных количествах в вирусные частицы [32]. Vpr помогает в активной ядерной транслокации преинтеграционного комплекса ВИЧ-1 (PIC) в неделящиеся клетки, взаимодействуя с ядерным транспортным путем [33], [34], [35], [36]. Vpr вызывает остановку в фазе G 2 / M клеточного цикла [37], [38]. Vpr активирует репликацию ВИЧ в результате его модулирующей клеточный цикл активности [39], [40]. Vpr также вызывает апоптоз инфицированных клеток [41].

    Несколько вакцин с использованием дополнительных белков ВИЧ-1, таких как токсоид Tat, были разработаны разными исследователями [42], [43], [44], но они не были успешными из-за высокой генетической изменчивости ВИЧ, высокого уровня ошибок обратной транскриптазы [45 ], [46], [47], быстрый оборот вирионов у ВИЧ-инфицированных людей [48] и гомологичная рекомбинация [7], [8].Таким образом, иммунной системе становится невозможно угнаться за антигенной мозаикой возбудителя. Таким образом, изучение естественных вариаций белков ВИЧ-1, встречающихся в популяции, будет полезным при разработке вакцин. О генетических вариациях в экзоне 1 Tat ВИЧ-1 сообщалось из разных регионов Индии [49], [50], но их функциональное значение не исследовалось. Было обнаружено, что белки Tat и Vpr синергетически усиливают транскрипционную активность LTR ВИЧ-1 за счет структурного и функционального взаимодействия друг с другом [51].Целью настоящего исследования было выяснить природу генетических вариаций в Tat экзоне 1 и Vpr, обнаруженных у ВИЧ-1 инфицированных людей из Северной Индии, и определить их функциональное значение. Мы сообщаем о некоторых интересных и уникальных генетических вариантах Tat экзона 1 и Vpr, включая межподтипные рекомбинанты из Северной Индии.

    Материалы и методы

    Обследовано

    ВИЧ-1 инфицированных

    Двадцать четыре ВИЧ-1-инфицированных человека, некоторые из которых получали антиретровирусное лечение (АРТ), а некоторые были наивны, были случайным образом выбраны для этого исследования из региона Дели / Уттар-Прадеш на севере Индии.Они были зарегистрированы в клинике АРТ больницы Гуру Тег Бахадур в Дели. Клинический профиль этих людей приведен в таблице 1. Образцы периферической крови (2 мл) были собраны в ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), содержащей флаконы от выбранных лиц.

    Заявление об этике

    Образцы крови были взяты у пациентов, инфицированных ВИЧ-1, после получения письменного согласия. Это исследование было одобрено Консультативным комитетом исследовательского проекта, Институциональным комитетом по биобезопасности и Институциональным этическим комитетом — Исследования на людях Университетского колледжа медицинских наук и больницы Гуру Тег Бахадур, Дели, Индия.Этим наставником занимается Национальная организация по контролю над СПИДом, которая является подразделением Министерства здравоохранения и семейного благополучия правительства Индии, которое предоставляет бесплатные АРТ ВИЧ-серопозитивным пациентам в рамках структурированной программы борьбы с ВИЧ / СПИДом.

    Выделение геномной ДНК и полимеразная цепная реакция

    Геномную ДНК выделяли из периферической крови, собранной у отобранных ВИЧ-1 инфицированных людей, с использованием набора HiPurA ™ Blood Genomic DNA Miniprep Spin Kit (HiMedia). Экзон 1 и Vpr ВИЧ-1 tat амплифицировали из этих образцов ДНК с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) с ДНК-полимеразой Taq (Takara) с использованием специфических праймеров.Праймерами, использованными для амплификации экзона 1 tat , были FP, SalI, 5′-GAGGTCGACCATGGAGCCAAGTAGATC-3 ‘и RP, NotI, 5′-GAGGCGGCCGCCTATTGCTTTGATATAAGA-3’. Праймерами, использованными для амплификации vpr , были FP, BglII, 5′-GGCAGATCTCTATGGAACAAGCCCCAGAAGAC-3 ‘и RP, NotI, 5′-GGCGCGGCCGCCTAGGATCTACTGGCTCCATTTCTT — 3’. Условия цикла, использованные для реакций ПЦР, были следующими: начальная денатурация при 95 ° C в течение 5 минут, циклическая денатурация при 95 ° C в течение 30 секунд, отжиг праймеров при 68 ° C для tat экзона 1 и 63 ° C для vpr в течение 30 секунд, циклическое удлинение при 72 ° C в течение 30 секунд, окончательное удлинение при 72 ° C в течение 7 минут и 30 циклов.ПЦР-ампликоны tat экзона 1 и vpr обрабатывали на 1,5% агарозном геле, и полосы очищали с помощью набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen).

    Клонирование и векторы экспрессии

    Очищенные ампликоны ПЦР первоначально клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega) путем клонирования ТА. Для экспрессии у млекопитающих уникальных вариантов tat экзона 1 и vpr их клонировали в векторе pCMV-Myc (Clontech). Их клоны pGEM-T easy, а также пустой вектор pCMV-Myc переваривали соответствующими рестрикционными ферментами, запуск на 1.5-процентный агарозный гель, очищенный и лигированный вместе с использованием набора для лигирования Т4 (New England Biolabs). Штамм E.Coli DH5α использовали для экспериментов по клонированию. Плазмидные конструкции pCMV-Myc-B Tat, pCMV-Myc-C Tat, pCMV-Myc-B Vpr, pCMV-Myc-C Vpr, pBlue3’LTR-luc, pBlue3’LTR-luc-C (NIH AIDS Reagent Program) были использовались в разных экспериментах.

    Генетический анализ вариантов экзона 1 Tat и Vpr

    Клоны pGEM-T Easy вариантов tat экзона 1 и vpr подвергали секвенированию в обоих направлениях с использованием праймеров, специфичных для Т7 и SP6.Затем эти последовательности сравнивали с эталонными последовательностями ВИЧ-1, загруженными из базы данных ВИЧ (http://www.hiv.lanl.gov), используя Clustal W 2.1 [52]. Последовательности также анализировали с помощью Sim Plot версии 3.5.1 для анализа рекомбинации.

    Классификация ВИЧ-1 по филогенетическому анализу и соотношению dN / dS

    Нуклеотидные последовательности были собраны и проверены на ошибки с помощью программы BLAST (NCBI, США), чтобы исключить потенциальные лабораторные ошибки. Эти последовательности были сопоставлены с консенсусными последовательностями штаммов ВИЧ-1 всех подтипов с использованием ClustalW 2.1. Филогенетические деревья были построены с использованием метода объединения соседей с двухпараметрической матрицей расстояний кимура в программе MEGA5. Надежность узла проверяли с использованием метода начальной загрузки с 500 повторами для обоих вариантов Tat exon-1 и Vpr. Инструмент SNAP v1.1.0 [53] использовался для определения давления эволюционного отбора в наших вариантах.

    Культура клеток и трансфекция

    Клетки

    HEK-293T (клетки эмбриональной почки человека 293) и Hela (линия клеток рака шейки матки) (NIH AIDS Reagent Program) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Himedia) с инактивированной нагреванием 10-процентной фетальной телячьей сывороткой (Biological Industries) и 100 единиц пенициллина, 0.1 мг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерицина B на мл при 37 ° C в присутствии 5% CO 2 . Все трансфекции выполняли с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

    Иммуноблот-анализ

    Т-клетки НЕК-293 выращивали до 80% конфлюэнтности в шестилуночном планшете и трансфицировали векторами экспрессии плазмиды, кодирующими желаемые белки. После 24 часов трансфекции клетки собирали и лизировали буфером для лизиса клеток (1% NP-40, 50 мМ TrisCl, pH 8, 300 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 15 мМ MgCl 2 , 2 мМ DTT).Концентрацию белка определяли количественно с использованием набора BCA Protein Assay kit (Pierce, Thermo Scientific). Равные количества белка разделяли с помощью 12% SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (mdi). Мембраны блокировали 1% BSA (альбумин бычьей сыворотки) (Sigma) и 5% обезжиренного сухого молока (Himedia) в PBS (фосфатный буферный раствор) и трижды промывали PBS, содержащим 1% Tween 20 (MERCK). В качестве первичных используемых антител были антитела против myc (Clontech) и против GAPDH (Cell Signaling).Использовали конъюгированные с пероксидом хрена (HRP) антимышиные и антикроличьи вторичные антитела. Блоты проявляли с использованием реагента ECL (Enhanced Chemiluminiscent).

    Анализ Циклогексимида Чейза

    Для сравнения стабильности природных вариантов Tat exon 1 и Vpr со стабильностью дикого типа была проведена погоня за циклогексимидом (CHX). Клетки HEK-293T трансфицировали 2 мкг каждой соответствующей плазмиды. После 24 часов трансфекции клетки обрабатывали циклогексимидом (100 мкг / мл) и получали лизаты клеток через 0 часов, 2 часа, 4 часа, 6 часов и 8 часов обработки CHX.Лизаты клеток разделяли с помощью 12% SDS PAGE с последующим иммуноблоттингом, как описано выше.

    Репортерный анализ люциферазы

    Трансактивацию LTR

    ВИЧ-1 измеряли с помощью набора для анализа Dual Luciferase Reporter (DLR) (Promega). 293 Т-клетки котрансфицировали репортерной конструкцией люциферазы LTR ВИЧ-1, плазмидами, кодирующими белки Tat и Vpr дикого типа, и конструкциями вариантного экзона 1 Tat и Vpr. Для измерения совместной активации LTR ВИЧ-1 вариантами экзона 1 Tat и вариантами B Vpr или Vpr и B Tat, клетки 293T трансфицировали репортерной конструкцией люциферазы LTR ВИЧ-1 вместе с B Tat, B Vpr и вариантом Tat экзона 1. и конструкции Vpr отдельно или с Vpr и B Tat дикого типа соответственно.Конструкцию люциферазы Renilla использовали в качестве контроля для нормализации эффективности трансфекции. Добавляли пустой вектор pcDNA3.1 для выравнивания количества трансфицированной ДНК в каждой лунке. Через 24 часа после трансфекции клетки лизировали в буфере для пассивного лизиса (Promega). Люциферазную активность измеряли люминометром с использованием двух субстратов (Promega), одного для люциферазы светлячков и второго для люциферазы renilla (смешанной со стоп-буфером и гло-буфером) с помощью люминометра (Tecan). Активность люциферазы светлячков делили на активность люциферазы ренилла, чтобы получить истинную репортерную активность люциферазы.

    Проточная цитометрия

    Для анализа апоптоза клетки Hela трансфицировали плазмидами экспрессии, кодирующими желаемые белки, в течение 24 часов. Для анализа клеточного цикла клетки также обрабатывали 40 мкМ Z VAD-FMK [54] (ингибитор панкаспаз). Клетки собирали с использованием трипсина EDTA и дважды промывали холодным PBS. Клетки фиксировали и пропускали через холодный 70-процентный этанол на льду в течение 30 минут. Затем клетки обрабатывали РНКазой A в течение 1 часа при комнатной температуре. Через 1 час клетки окрашивали йодидом пропидия, PI (50 мкг / мл) и анализировали проточной цитометрией.Данные FACS были проанализированы с использованием WINMDI версии 2.9.

    Статистический анализ

    Статистические расчеты и анализы были выполнены в Graph Pad Prism (версия 5.00). Значения P менее 0,05 считались статистически значимыми.

    Результаты

    Описание отдельных лиц, инфицированных ВИЧ-1

    Для этого исследования было отобрано в общей сложности двадцать четыре ВИЧ-1 инфицированных пациента из регионов Дели / Уттар-Прадеш на севере Индии. Их клиническая история кратко представлена ​​в таблице 1.Тринадцать пациентов получали АРТ, остальные — нет. Большинство из них заразились ВИЧ-инфекцией гетеросексуальным путем. Их количество CD4 было ниже 400 во время сбора образца. Пять пациентов, получавших АРТ, были инфицированы Mycobacterium tuberculosis .

    Анализ множественных последовательностей

    Аминокислотные последовательности экзона 1 Tat из образцов, инфицированных ВИЧ-1, сравнивали с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B и C [фиг. 1 (а)]. Некоторые мутации (N24T, K29Y, L35P, G44S и P68L) были консервативными в большинстве последовательностей.Пять последовательностей (Tat 31, 33, 34, 35 и 37) имели мутацию F38L в коровой области. Одна последовательность (Tat 71) напоминала B Tat в аминоконцевой области с тремя точечными мутациями (K29R в богатой цистеином области и I39M и Y47H в области ядра) и C Tat в карбоксиконцевой области. Две последовательности (Tat 80 и Tat 93) имели мутации L43V и S46F. Мутация C30R обнаружена только в одной последовательности (Tat 93). Аминокислотные последовательности Vpr из образцов, инфицированных ВИЧ-1, сравнивали с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B, C и D [фиг.1 (б)]. Было обнаружено, что три последовательности Vpr 45, Vpr 46 и Vpr 50 представляют собой мозаику подтипов B, C и D с одной точечной мутацией, M59T. Последовательность Vpr 45 и Vpr 50 была одинаковой. В С-концевой области последовательности Vpr 46 наблюдалась мутация сдвига рамки считывания, приводящая к изменению аминокислотной последовательности и образованию преждевременного стоп-кодона на С-концевом конце белка. Vpr 79 показывал преждевременное усечение. Это произошло из-за вставки четырех нуклеотидов в N-концевую область, что привело к образованию преждевременного стоп-кодона и полностью другой аминокислотной последовательности.

    Рисунок 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей экзона 1 Tat и последовательностей Vpr ВИЧ-1 инфицированных пациентов.

    ( a ) Последовательности экзона 1 Tat были сопоставлены с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B и C с помощью Clustal W. При выравнивании последовательностей аминокислоты, идентичные консенсусу C, обозначены звездочками (*), аминокислоты идентичны Консенсус B, мутации, консервативные во всех тестовых последовательностях, и уникальные мутации показаны в алфавитном порядке. Положения мутировавших аминокислот указаны над выравниванием.( b ) Аминокислотные последовательности вариантов Vpr от ВИЧ-1 инфицированных пациентов были сопоставлены с эталонными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B, C и D с помощью Clustal W. При выравнивании последовательностей аминокислоты, идентичные Консенсусу C, обозначены звездочками. (*). Аминокислоты, идентичные Consensus B & D, мутации, общие в тестовых последовательностях, и уникальные мутации показаны в алфавитном порядке.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g001

    Филогенетический анализ

    Нуклеотидные последовательности Tat exon-1 и Vpr были выровнены с помощью ClustalW 2.1 [52] и проанализированы на подтипы филогенетическим анализом с использованием метода объединения соседей [55] с двухпараметрической матрицей расстояний Кимуры в программе MEGA5 [56] с подтипами группы M (AK) и подтипами (A1, A2, F1 и F2), которые показали большинство наших вариантов Tat exon-1 сгруппированы с подтипом C, а некоторые варианты сгруппированы между подтипами B и C, что указывает на присутствие B / C-рекомбинации [Рисунок 2 (a)]. Аналогичный анализ вариантов Vpr показал, что большинство наших вариантов разветвлено с подтипом B, а некоторые варианты сгруппированы с подтипом C [Рисунок 2 (b)].

    Рис. 2. Подтипы ВИЧ-1 на основе глобальных ссылок на подтипы.

    Филогенетический анализ был проведен для вариантов Tat экзон-1 и Vpr с группой M (от A до K, включая A1, A2, F1 и F2). Каждая контрольная последовательность была помечена подтипом с указанием страны выделения и регистрационного номера. Вероятность начальной загрузки (> 65%, 1000 повторов) была обозначена звездочкой (*) в соответствующих узлах дерева, а масштабная линейка представляет собой эволюционное расстояние 0.02 нуклеотида на позицию в последовательности. ( a ) Он представляет собой филогенетическое дерево вариантов экзона-1 Tat с M-группой. Заштрихованные кружки представляют варианты C, а закрашенные треугольники представляют рекомбинанты. ( b ) Он представляет собой филогенетическое древо вариантов Vpr с группой М. Заштрихованные треугольники представляют варианты B, а закрашенные кружки представляют рекомбинанты.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g002

    Эволюционный отбор на основе отношения dN / dS

    Режим давления отбора, который имел место в вариантах экзона-1 Tat и Vpr, был рассчитан путем взятия средних значений dN / dS в пределах предсказанного подтипа с использованием SNAP v1.1.0 (Программа синонимичного несинонимичного анализа). SNAP рассчитывает скорости несинонимичных (dN) и синонимичных (dS) замен на основе набора выровненных по кодонам нуклеотидных последовательностей (соотношение dN / dS) [57]. Значение dN / dS для вариантов Tat экзон-1 и Vpr составляло от 0,4 до 0,9 (таблица 2) и от 0,1 до 0,7 (таблица 3), соответственно, значение ei dN / dS меньше единицы означает очищающий отбор, а значение больше единицы. обозначают положительный выбор. Оба наших варианта Tat exon-1 и Vpr, включая рекомбинанты B / C и B / C / D, показали менее одного значения, указывающего на очищающий отбор среди населения Северной Индии.Кроме того, был рассчитан тип отбора, который произошел между вариантами B и C, который показал, что среднее расхождение у изолятов B и C было меньше одного значения, подразумевающего очищающий отбор (таблицы 2 и 3).

    Sim Анализ графика

    Для проверки наличия рекомбинации последовательности экзона 1 Tat и вариантов Vpr анализировали с помощью Sim Plot. Последовательности нуклеиновых кислот вариантов были выровнены с эталонными последовательностями и подверглись анализу загрузочного сканирования с использованием Sim Plot версии 3.5.1. Анализ загрузочного сканирования Tat 71 показал присутствие B / C-рекомбинации, где N-концевой участок был получен из подтипа B, но он был идентичен подтипу C в направлении C-концевой половины [фиг. 3 (а)]. Другие варианты экзона 1 Tat показали полное сходство с подтипом C при проведении аналогичного анализа [Рис. S1]. Анализ загрузочного сканирования Vpr 45 или Vpr 50 (поскольку обе последовательности одинаковы) [Рис. 3 (б)] и Vpr 46 [рис. 3 (c)] показали рекомбинацию B / C / D в своих последовательностях.

    Рисунок 3. Анализ рекомбинации вариантов Tat exon 1 и Vpr.

    Последовательности Tat 71, Vpr 45 и Vpr 46 анализировали с помощью Sim Plot. Их сравнивали с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B, C и D и подвергали анализу загрузочного сканирования. Tat 71 оказался рекомбинантным подтипа B и C. Vpr 45 и Vpr 46 оказались рекомбинантными подтипа B, C и D. ( a ) Анализ загрузочного сканирования Tat 71 ( b ) Загрузочный анализ сканирования Vpr 45 ( c ) Анализ сканирования загрузки Vpr 46.

    https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0082128.g003

    Сравнение экспрессии и стабильности вариантов Tat экзона 1 и Vpr

    Из найденных природных вариантов были отобраны интересные и уникальные варианты экзона 1 Tat, то есть Tat 31, Tat 71, Tat 80 и Tat 93 и варианты Vpr, то есть Vpr 45 и Vpr 46, были отобраны для функциональной характеристики. Последовательность Vpr 79 показывала преждевременное образование стоп-кодона, поэтому никаких функциональных исследований с этим образцом не проводилось. Влияние мутаций, обнаруженных в природе в экзоне 1 Tat и Vpr, на их стабильность, если таковые имеются, исследовали с помощью анализа циклогексимида с использованием их гибридных клонов myc с последующим иммуноблоттингом.Мутантные клоны трансфицировали в клетки 293Т, используя белки дикого типа в качестве контроля. Через 24 часа клетки обрабатывали циклогексимидом, и клеточные лизаты получали через каждые 2 часа. Хотя было обнаружено, что экспрессия всех вариантов экзона 1 Tat ниже, чем у B Tat, и больше, чем у C Tat [рис. 4 (а)], их период полураспада был почти таким же, как у B Tat [Рис. 4 (б, в)]. Было обнаружено, что экспрессия и стабильность вариантов Vpr аналогичны таковой для дикого типа [фиг. 5].

    Рисунок 4.Экспрессия и стабильность вариантов экзона 1 Tat.

    ( a ) 293 Т-клетки трансфицировали слитыми myc конструкциями вариантов Tat, C Tat и Tat дикого типа 1 (2 мкг каждый) с использованием липофектамина 2000; лизаты клеток получали через 24 часа после трансфекции и обрабатывали с помощью 12-процентного SDS-PAGE. Вестерн-блоттинг проводили с использованием моноклонального мышиного антитела c-myc в качестве первичного антитела и меченного HRP антимышиного антитела в качестве вторичного антитела. GAPDH был исследован как контроль загрузки. ( b ) Клетки 293T трансфицировали 2 мкг каждого из гибридных клонов myc подтипа B Tat, C Tat и вариантов экзона 1 Tat и после 24 часов трансфекции клетки обрабатывали циклогексимидом, CHX (100 мкг / мл. ) и собирают с интервалом от 2 до 8 часов.Клеточные лизаты обрабатывали с помощью 12-процентного SDS-PAGE и блоты зондировали моноклональным антителом c-myc и антителом GAPDH (контроль нагрузки) ( c ). Относительную концентрацию белка в различные моменты времени измеряли путем измерения плотности полосы в для каждого случая и были нанесены линейные графики в зависимости от продолжительности лечения CHX.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g004

    Рисунок 5. Экспрессия и стабильность природных вариантов Vpr.

    ( a ) Т-клетки 293 трансфицировали конструкциями слияния myc вариантов Vpr, C Vpr и Vpr дикого типа (2 мкг каждого) с использованием липофектамина 2000; лизаты клеток получали через 24 часа после трансфекции и обрабатывали с помощью 12-процентного SDS-PAGE.Вестерн-блоттинг проводили с использованием моноклонального мышиного антитела c-myc в качестве первичного антитела и меченного HRP антимышиного антитела в качестве вторичного антитела. GAPDH был исследован как контроль загрузки. ( b ) Клетки 293T трансфицировали 2 мкг каждого из гибридных клонов myc вариантов Vpr, C Vpr и Vpr дикого типа, и через 24 часа трансфекции клетки обрабатывали циклогексимидом, CHX (100 мкг / мл) и собирают с интервалом от 2 до 6 часов. Лизаты клеток разделяли с помощью 12-процентного SDS-PAGE и блоты зондировали моноклональным антителом c-myc и антителом GAPDH (контроль нагрузки) ( c ). Относительную концентрацию белка в различные моменты времени измеряли путем измерения плотности полосы в для каждого случая и были нанесены линейные графики в зависимости от продолжительности лечения CHX.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g005

    Потенциал трансактивации LTR ВИЧ-1 экзона 1 Tat и вариантов Vpr

    ВИЧ-1 Tat играет ключевую роль в трансактивации LTR и, следовательно, в репликации вируса, в то время как Vpr является слабым трансактиватором. Таким образом, влияние встречающихся в природе мутаций в экзоне 1 Tat и Vpr было исследовано путем сравнения их способности трансактивировать репортер люциферазы LTR с таковой дикого типа. Было обнаружено, что рекомбинация B / C в Tat 71 отрицательно влияет на его активационную способность B LTR, в то время как трансактивация B LTR с помощью Tat 80 была сопоставима с B Tat.Потенциал активации B LTR двух других вариантов был аналогичен потенциалу C Tat, как и ожидалось [Рис. 6 (а)]. Было обнаружено, что активация C LTR с помощью Tat 71 больше, чем для C Tat, в то время как она почти аналогична C Tat в присутствии других вариантов [фиг. 6 (б)]. Tat также может взаимодействовать с Vpr и синергетически усиливать активацию LTR [51]. Также было исследовано влияние встречающихся в природе мутаций в Tat и Vpr на их кооперативность. Было обнаружено, что синергическая трансактивация B LTR рекомбинантным Tat 71 B / C с помощью B Vpr выше, чем у Tat B дикого типа, в то время как другие варианты экзона 1 Tat не проявляют кооперативности с B Vpr [фиг. .6 (с)]. Потенциал активации B LTR и C LTR вариантов Vpr был почти сопоставим с потенциалом активации дикого типа [Рис. 7 (а, б)]. Было обнаружено, что естественные вариации Vpr не влияют на кооперативную активацию B LTR, опосредованную Tat-Vpr [фиг. 7 (с)].

    Рисунок 6. Потенциал активации LTR ВИЧ-1 природных вариантов экзона 1 Tat.

    Т-клетки 293 трансфицировали репортерной плазмидой люциферазы ВИЧ-1 подтипа B LTR или C LTR (50 нг), люциферазой renilla в качестве контроля для нормализации и B. Tat, C Tat и вариант плазмиды экспрессии экзона 1 Tat (100 нг) отдельно или в комбинации с B Vpr с использованием липофектамина 2000.pcDNA 3.1 трансфицировали для выравнивания количества трансфицированной ДНК в каждой лунке. Через 24 часа клетки собирали и лизировали в буфере для пассивного лизиса. Люциферазную активность измеряли люминометром. ( a ) Активация B LTR ВИЧ-1 с помощью Tat 80 была сравнима с активацией B Tat, а активация с помощью Tat 71 была меньше, чем активация B Tat. Активация B LTR другими вариантами была сопоставима с C Tat. ( b ) Активация C LTR ВИЧ-1 с помощью Tat 71 была больше, чем для C Tat, и сравнима с B Tat. Активация C LTR другими вариантами была почти аналогична C Tat.( c ) Кооперативная трансактивация B LTR с помощью Tat 71 с B Vpr была больше, чем B Tat, в то время как другие варианты не показали кооперативного взаимодействия с B Vpr, как ожидалось. Представленные здесь данные представляют собой среднее значение по меньшей мере трех отдельных экспериментов по трансфекции. Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g006

    Рисунок 7. Потенциал активации LTR ВИЧ-1 природных вариантов Vpr.

    Т-клетки HEK-293 трансфицировали репортерной плазмидой люциферазы ВИЧ-1 подтипа B LTR или C LTR (50 нг), люциферазой renilla в качестве контроля нормализации и плазмидами экспрессии B Vpr, C Vpr и варианта Vpr (100 нг) отдельно или в комбинация с B Tat с использованием Lipofectamine 2000.pcDNA 3.1 трансфицировали для выравнивания количества трансфицированной ДНК в каждой лунке. Через 24 часа клетки собирали и лизировали в буфере для пассивного лизиса. Люциферазную активность измеряли люминометром. ( a ) Активация B LTR ВИЧ-1 вариантами Vpr была сопоставима с активацией Vpr дикого типа ( b ). Активация C LTR ВИЧ-1 вариантами Vpr была почти аналогична активации дикого типа. ( c ) Совместная трансактивация B LTR вариантами Vpr с B Tat также была сопоставима с B Vpr. Представленные здесь данные представляют собой среднее значение по меньшей мере трех отдельных экспериментов по трансфекции.Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g007

    Анализ апоптоза экзона 1 Tat и вариантов Vpr

    Vpr ВИЧ-1 и экзогенно экспрессируемый Tat индуцируют апоптоз клеток-хозяев. Эффективность индукции апоптоза вариантов Tat экзона 1 и Vpr измеряли с помощью проточной цитометрии. Их трансфицировали в клетки Hela белками дикого типа в качестве контроля и через 24 часа; клетки фиксировали и окрашивали PI.Затем клетки анализировали проточным цитометром. Перед фазой G1 наблюдали отдельный пик, представляющий клетки в фазе апоптоза. Апоптоз, индуцированный рекомбинантным Tat 71 (22,39%) и Tat 80 (31,78%), был намного сильнее, чем у дикого типа, в то время как другие варианты индуцировали апоптоз (4,66% Tat 31 и 7,21% Tat 93) почти в той же степени, что и у Tat дикого типа [рис. 8]. Способность к индукции апоптоза вариантов Vpr (7,91% для Vpr 45 и 9,40% для Vpr 46) оказалась ниже, чем у вариантов дикого типа (41.32% по B Vpr и 24,69% по C Vpr) [Рис. 9].

    Рисунок 8. Анализ апоптоза вариантов экзона 1 Tat.

    ( a ) Клетки Hela трансфицировали 2 мкг каждой плазмиды, кодирующей варианты B Tat, C Tat и Tat экзона 1, и клетки собирали через 24 часа с использованием трипсина EDTA. Затем клетки промывали PBS, фиксировали в 70% этаноле, обрабатывали РНКазой A и окрашивали PI. После окрашивания клетки анализировали в растворе PI / РНКазы с помощью проточной цитометрии. Апоптотические клетки наблюдались в виде отдельного пика перед фазой G1.Процент апоптоза, зарегистрированный для каждого варианта, показан в верхнем правом углу. Рекомбинантный Tat 71 B / C и вариант Tat 80 подтипа C вызывают больший апоптоз, чем Tat дикого типа. Показанные здесь результаты являются представителями трех независимых экспериментов. ( b ) Процент апоптотических клеток для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с Tat B дикого типа. Значение p было меньше 0,05 для каждого образца. ( c ) Процент апоптотических клеток для каждого образца наносили в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с Tat C дикого типа.Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g008

    Рисунок 9. Апоптоз, индуцированный вариантами Vpr.

    ( a ) Клетки Hela трансфицировали 2 мкг каждой плазмиды, кодирующей варианты B Vpr, C Vpr и Vpr, и клетки собирали через 24 часа с использованием трипсина EDTA. Затем клетки промывали PBS, фиксировали в 70% этаноле, обрабатывали РНКазой A и окрашивали PI. После окрашивания клетки анализировали в растворе PI / РНКазы с помощью проточной цитометрии.Апоптотические клетки наблюдались в виде отдельного пика перед фазой G1. Процент апоптоза, зарегистрированный для каждого варианта, показан в верхнем правом углу. Рекомбинанты B / C / D Vpr 45 и Vpr 46 вызывают меньший апоптоз, чем Vpr дикого типа. Показанные здесь результаты являются представителями трех независимых экспериментов. b ) Процент апоптотических клеток для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с Vpr дикого типа B. Значение p было меньше 0,05 для каждого образца. ( c ) Процент апоптотических клеток для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с C Vpr дикого типа.Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g009

    Анализ клеточного цикла вариантов Vpr

    Vpr вызывает остановку клеточного цикла G2 / M в инфицированных клетках. Варианты Vpr были проанализированы на их способность вызывать остановку G2 с помощью проточной цитометрии. Их трансфицировали в клетки Hela белками дикого типа в качестве контроля, и клетки обрабатывали 40 мкМ Z VAD-FMK [54], ингибитором апоптоза. Через 24 часа клетки фиксировали, окрашивали PI и анализировали проточным цитометром.Было обнаружено, что потенциал индукции остановки G2 вариантов Vpr является промежуточным по сравнению с потенциалом Vpr и C Vpr дикого типа [фиг. 10].

    Рис. 10. Остановка G2 / M, вызванная вариантами Vpr.

    ( a ) Клетки Hela трансфицировали 2 мкг каждой плазмиды, кодирующей варианты B Vpr, C Vpr и Vpr, и обрабатывали 40 мкМ Z-VAD-FMK (ингибитор панкаспаз). Клетки собирали через 24 часа с использованием трипсина EDTA. Затем клетки промывали PBS, фиксировали в 70% этаноле, обрабатывали РНКазой A и окрашивали PI.После окрашивания клетки анализировали в растворе PI / РНКазы с помощью проточной цитометрии. Были получены пики G1 — фазы, S — фазы и G2 — фазы. Процент ячеек в фазе G2 / M указан в правом верхнем углу. Показанные здесь результаты являются представителями трех независимых экспериментов. ( b ) Процент клеток в фазе G2 / M для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с Vpr дикого типа B. Значение p было меньше 0,05 для каждого образца. ( c ) Процент клеток в фазе G2 / M для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с C Vpr дикого типа.Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g010

    Обсуждение

    ВИЧ-1 быстро эволюционирует из-за его высокой генетической изменчивости. Генетический анализ природных вариантов tat экзона 1 и vpr выявил интересные особенности. Большинство аминокислотных вариаций в Tat было обнаружено в богатых цистеином и ядерных областях, в то время как N-концевые области, области связывания TAR и богатые глутамином области (за исключением одной мутации) были почти консервативными во всех последовательностях.Один вариант, Tat 71, оказался рекомбинантным подтипа B и C с тремя точечными мутациями (K29R, I39M и Y47H), в то время как другие напоминали подтип C с некоторыми точечными мутациями (F38L, L43V, S46F, K29R, C30R, Y47H и I39M). Последовательность Tat 71 также была проанализирована с помощью анализа Sim Plot, который показал, что это рекомбинант B / C с одной точкой рекомбинации между подтипом B и C. Три варианта Vpr представляли собой мозаику подтипа B, C и D с одной точечной мутацией (M59T). и отличается от уже описанного рекомбинантного B / C / D вируса Vpr ВИЧ-1 [58].Vpr 79 показал преждевременное образование стоп-кодонов. Хотя последовательность вариантов экзона 1 Tat была подобна последовательности C Tat с некоторыми точечными мутациями (кроме Tat 71), их стабильность и экспрессия были аналогичны таковой у Tat B дикого типа. Это может быть связано с мутациями, естественно присутствующими в их последовательности. Нет предыдущих отчетов, показывающих влияние этих естественных мутаций на экспрессию и стабильность.

    Было обнаружено, что функционально варианты экзона 1 Tat обладают различным потенциалом активации LTR.Практически не наблюдалось влияния сообщенной рекомбинации B / C / D на способность LTR-активации вариантов Vpr, в то время как ранее описанный рекомбинант B / C / D Vpr [58] был более активен, чем дикий тип. Активация LTR подтипа B ВИЧ-1 с помощью Tat 80, который напоминал подтип C, за исключением двух точечных мутаций (L43V и S46F), была больше, чем Tat C дикого типа. Однако сообщается, что Tat фосфорилируется по S16 и S46, что требуется для LTR-направленной транскрипции генов ВИЧ-1, и мутации остатков S16 и S46 приводят к снижению фосфорилирования Tat и, следовательно, к ингибированию репликации ВИЧ-1 [59], но эта мутация ( S46F) гидрофильной аминокислоты (S) к гидрофобной аминокислоте (F) в положении 46 может усиливать гидрофобные свойства области ядра Tat [60], что важно для связывания с циклином T1 [61], необходимого для функции Tat [ 18], [62].Также замена ароматических аминокислот на неароматические приводит к снижению активности Tat в 2 раза [63]. Таким образом, замена неароматической аминокислоты (S) ароматической аминокислотой (F) в положении 46 может увеличить активность Tat. Активация B LTR Tat 31 и Tat 93 была почти аналогична активации C Tat. И Tat 80, и Tat 93 имеют две одинаковые точечные мутации (L43V и S46F), но транскрипционная активность B LTR Tat 93 относительно ниже, чем у Tat 80. Это может быть связано с мутацией C30.Было обнаружено, что эта мутация снижает потенциал трансактивации Tat [64], [17], [65]. Рекомбинация B / C с тремя точечными мутациями (K29R, I39M и Y47H) в Tat 71 снижала его способность к трансактивации B LTR. Сообщается, что аминокислотные остатки в положениях 35 и 39 в Tat тесно связаны между собой, и мутация любого остатка этой пары аминокислот приводит к появлению мутанта Tat, который не может активировать вирусный LTR. Однако одновременное введение обеих мутаций восстанавливает функцию гена до дикого типа [66].Но Tat 71, имеющий мутацию I39M, все еще способен активировать транскрипцию B LTR. Это может быть связано с другой мутацией Y47H, которая, как сообщается, восстанавливает потерю активности мутанта Y26A Tat, несмотря на тот факт, что оба этих тирозина важны для репликации ВИЧ-1 [63] и мутации Y47H, когда вводятся в виде отдельной мутации. в Tat дикого типа увеличивает активность мутантного Tat в два раза в временных анализах [67]. Мутация K29R также наблюдалась у ревертантов второго сайта Tat, но не было обнаружено, что она улучшает активность Tat в анализах транскрипции LTR [67].

    Активация LTR подтипа C ВИЧ-1 с помощью Tat 71 была больше, чем активация C Tat, и сравнима с активацией B Tat, что может быть связано с рекомбинацией B / C. Было обнаружено, что транскрипционная активность C-LTR Tat 80 выше, чем для C Tat. Это может быть связано с наличием в его последовательности мутации S46F [60]. Транскрипция C LTR была сравнима с C Tat в случае Tat 31 и Tat 93. Транскрипционная активность C LTR Tat 93 относительно меньше, чем у Tat 80, несмотря на одинаковые точечные мутации в двух сайтах (L43V и S46F) по описанной причине. выше для активации B LTR.

    Хотя Tat 71 обладал пониженной трансктивацией B LTR, он показал большую кооперативность с B Vpr в активации B LTR, чем Tat B дикого типа. Таким образом, можно сделать вывод, что последовательность Tat 71 приведет к усиленной репликации в вирусном контексте и, таким образом, будет положительно выбрана в процессе эволюции. Другие три варианта не показали какой-либо совместной активации B LTR с B Vpr, как ожидалось, потому что их последовательность напоминала последовательность C Tat, за исключением нескольких точечных мутаций. Также не наблюдалось влияния естественных вариаций Vpr на его взаимодействие с Tat.Это предполагает, что Vpr играет лишь вторую скрипку по отношению к функции LTR трансактивации Tat.

    Можно утверждать, что функциональные различия в выборках могут быть из-за изменений в их соответствующих последовательностях LTR. Поэтому мы амплифицировали последовательности LTR из двух репрезентативных образцов (Tat 71 и Tat 80), используя протокол, описанный нами ранее [68]. При сравнении с консенсусными последовательностями LTR образцы последовательностей LTR показали сохранение всех основных сайтов связывания факторов транскрипции (TATA-бокс, Sp1, NF-kB, NFAT-III, AP-1, AP-2) (данные не показаны).Таким образом, мы пришли к выводу, что наблюдаемые функциональные различия связаны с изменениями самой последовательности Tat.

    Было обнаружено, что вариации, обнаруженные в природе в экзоне 1 Tat и Vpr, также влияют на их способность индуцировать апоптоз. Апоптоз, индуцированный Tat 31 и Tat 93, был почти аналогичен Tat дикого типа, в то время как он был намного больше, чем Tat 71 (B / C рекомбинантный) и Tat 80, чем Tat для B и C, и Tat 80. Таким образом, мутации, которые усиливали транскрипцию активность Tat также увеличивала потенциал индукции апоптоза Tat.Оба варианта Vpr индуцировали меньший апоптоз, чем дикий тип, но нормальную остановку G2. Таким образом, рекомбинация B / C / D, обнаруженная в вариантах Vpr, оказала негативное влияние на их апоптоз, но не на потенциал индукции остановки G2.

    В целом, четыре точечные мутации, встречающиеся в природе в экзоне 1 Tat, оказались функционально значимыми. Мутации S46F и Y47H увеличивали активность Tat, в то время как C30R и I39M отрицательно влияли на активность Tat. Было обнаружено, что другие мутации (K29R, L43V и F38L), встречающиеся в природе в экзоне 1 Tat, являются функционально неактивными.Было обнаружено, что рекомбинация B / C / D в вариантах Vpr отрицательно влияет на их способность к индукции апоптоза, характерную функцию Vpr, но не влияет на другие функции. Таким образом, эти вариации, включая межподтипную рекомбинацию, встречающуюся в природе в белках ВИЧ-1, оказывают сильное влияние на патогенез вируса. Несколько исследований показали, что рекомбинация может происходить под избирательным давлением, оказываемым антиретровирусными препаратами, или из-за коинфекции различными штаммами, что приводит к появлению новых вариантов ВИЧ-1 с двойной лекарственной устойчивостью, измененным тропизмом тканей, патогенностью и диапазоном хозяев, или с изменениями антигенных эпитопов [69], [70], [71].На сегодняшний день эффективной вакцины против ВИЧ не существует, несмотря на несколько попыток использования белков ВИЧ-1. Возможно, тип и распространение разновидностей белков инфекционных штаммов повлияют на усилия по созданию целенаправленной вакцины. Генетический и функциональный анализ вариантов гена ВИЧ-1, циркулирующих в популяции, предоставит знания для понимания биогенеза ВИЧ-1 и его эволюционного процесса. Это будет полезно для разработки новых методов лечения ВИЧ и стратегий вакцинации в будущем.

    Дополнительная информация

    Рисунок S1.

    Анализ загрузочного сканирования нерекомбинантных вариантов экзона 1 Tat. Последовательности Tat 31, Tat 80 и Tat 93 анализировали с помощью Sim Plot. Их сравнивали с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B, C и D и подвергали анализу загрузочного сканирования. Все они были похожи на C Tat. ( a ) Анализ загрузочного сканирования Tat 31 ( b ) Анализ загрузочного сканирования Tat 80 ( c ) Анализ загрузочного сканирования Tat 93.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.s001

    (TIF)

    Благодарности

    Мы благодарим Программу исследований СПИДа и эталонных реагентов, Отделение СПИДа, NIAID, NIH за их реагенты.Мы благодарим ART, больницу GTB, Дели, Индия, за предоставленные образцы крови, инфицированной ВИЧ-1. Мы также благодарим Индийский совет медицинских исследований, Нью-Дели, Индия, и Совет научных и промышленных исследований, Нью-Дели, Индия за их поддержку.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: SL VS ACB VGR. Проведены эксперименты: SL. Проанализированы данные: SL LR S. Dar. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: ACB VGR S. Das. Написал статью: SL.

    Ссылки

    1. 1.Сиддаппа Н.Б., Даш П.К., Махадеван А., Десаи А., Джаясурян Н. и др. (2005) Идентификация уникальных рекомбинантных штаммов B / C ВИЧ-1 в южном штате Карнатака, Индия. СПИД 19 (13) 1426–1429.
    2. 2. Неоги У, Суд В., Чоудхури А., Дас С., Рамачандран В. Г. и др. (2009) Генетический анализ циркулирующей рекомбинантной формы 02_AG ВИЧ-1, последовательностей оболочки, специфичных для подтипов B и C, из Северной Индии и их прогнозируемое использование корецепторов. AIDS Res Ther 6: 28.
    3. 3.Оуян Ю., Шао И., Ма Л. (2012) ВИЧ-1 CRF_BC Рекомбинантная инфекция в Китае: молекулярная эпидемия и характеристики. Текущие исследования ВИЧ 10: 151–161.
    4. 4. Робертсон Д.Л., Андерсон Дж. П., Брэдак Дж. А., Карр Дж. К., Фоли Б. и др .. (1999) Предложение по номенклатуре ВИЧ-1: справочное руководство по классификации ВИЧ-1. В: Kuiken CL, Foley B, Hahn BH, Korber B, McCutchan F и Marx PA, редакторы. Человеческие ретровирусы и СПИД: сборник и анализ последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот.NM: Группа теоретической биологии и биофизики, Национальная лаборатория Лос-Аламоса. С. 492–505.
    5. 5. Лоле К.С., Боллинджер Р.С., Паранджапе Р.С., Гадкари Д., Кулкарни С.С. и др. (1999) Полноразмерные геномы вируса иммунодефицита человека типа 1 из сероконвертеров, инфицированных подтипом С, в Индии, с доказательствами межподтипной рекомбинации. J Virol 73 (1) 152–160.
    6. 6. Tripathy SP, Kulkarni SS, Jadhav SD, Agnihotri KD, Jere AJ, et al. (2005) Рекомбинанты ВИЧ подтипа B и подтипа C типа 1 в северо-восточном штате Манипур, Индия.Ретровирусы AIDS Res Hum 21 (2) 152–157.
    7. 7. Робертсон Д.Л., Хан Б.Х., Шарп П.М. (1995a) Рекомбинация в вирусах СПИДа. J Mol Evol 40: 249–259.
    8. 8. Робертсон Д.Л., Шарп П.М., МакКатчан Ф.И., Хан Б.Х. (1995b) Рекомбинация при ВИЧ-1. Природа 374: 124–126.
    9. 9. Куикен С., Фоли Б., Хан Б., Маркс П., МакКатчан Ф. и др. (2000) Сборник последовательностей ВИЧ 2000. Группа теоретической биологии и биофизики, Национальная лаборатория Лос-Аламоса, Лос-Аламос, Нью-Мексико, США.
    10. 10. Робертсон Д.Л., Андерсон Дж. П., Брэдак Дж. А., Карр Дж. К., Фоли Б. и др. (2000) Предложение по номенклатуре ВИЧ-1. Наука 288: 55–56.
    11. 11. Plantier JC, Leoz M, Dickerson JE, De Oliveira F, Cordonnier F, et al. (2009) Новый вирус иммунодефицита человека, полученный от горилл. Природная медицина 15 (8) 871–872.
    12. 12. Sodroski JG, Rosen CA, Wong-Staal F, Salahuddin SZ, Popovic M, et al. (1985) Trans -действующая регуляция транскрипции длинного концевого повтора вируса Т-клеточной лейкемии человека III типа.Наука 227: 171–173.
    13. 13. Jeang KT (1996) Сборник и анализ последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот. В: Лос-Аламосская национальная лаборатория, под ред. Ретровирусы человека и СПИД. С. III-3 – III-18.
    14. 14. Зайгель Л.Дж., Ратнер Л., Джозефс С.Ф., Дерс Д., Фейнберг МБ и др. (1986) Трансактивация, индуцированная Т-лимфотропным вирусом человека типа III (HTLV-III), отображается на вирусную последовательность, кодирующую 58 аминокислот, и не имеет тканевой специфичности. Вирусология 148: 226–231.
    15. 15.Cullen BR (1986) Трансактивация вируса иммунодефицита человека происходит по бимодальному механизму. Cell 46: 973–982.
    16. 16. Джонс К.А., Петерлин Б.М. (1994) Контроль инициации и удлинения РНК на промоторе ВИЧ-1. Анну Рев Биохим 63: 717
    17. 17. Kuppuswamy M, Subramanian T, Srinivasan A, Chinnadurai G (1989) Множественные функциональные домены Tat, трансактиватора ВИЧ-1, определенные с помощью мутационного анализа. Nucleic Acids Res 17: 3551–3561.
    18. 18.Rappaport J, Lee SJ, Khalili K, Wong-Staal F (1989) Кислая аминоконцевая область белка Tat ВИЧ-1 представляет собой важный активирующий домен. Новая Биол 1: 101–110.
    19. 19. Франкель А.Д., Бредт Д., Пабо С. (1988). Белок Tat из вируса иммунодефицита образует связанный с металлом димер. Наука 240: 70–73.
    20. 20. Hauber J, Malim M, Cullen B (1989) Мутационный анализ консервативного основного домена белка Tat вируса иммунодефицита человека. J Virol 63: 1181–1187.
    21. 21. Рубен С., Перкинс А., Перселл Р., Джунг К., Сиа Р. и др. (1989) Структурная и функциональная характеристика белка Tat вируса иммунодефицита человека. J Virol 63: 1–8.
    22. 22. Roy S, Delling U, Chen C-H, Rosen CA, Sonenberg N (1990) Выпуклая структура в TAR-РНК ВИЧ-1 необходима для связывания Tat и опосредованной Tat трансактивации. Genes Dev 4: 1365–1373.
    23. 23. Байер П., Крафт М., Эйчарт А., Вестендроп М., Франк Р. и др. (1995) Структурные исследования белка Tat ВИЧ-1.J Mol Biol 247: 529–535.
    24. 24. Klostermeier D, Bayer P, Kraft M, Frank RW, Rösch P (1997) Spectroscopiuc исследования транс- -активатора ВИЧ-1 и родственных пептидов в водных растворах. Biophys Chem 63: 87–96.
    25. 25. Metzger AU, Bayer P, Willbold D, Hoffmann S, Frank RW и др. (1997) Взаимодействие Tat (32–72) ВИЧ-1 с его РНК-мишенью: исследование флуоресценции и ядерного магнитного резонанса. Biochem Biophys Res Comm 241: 31–36.
    26. 26.Rana TM, Jeang KT (1999) Биохимические и функциональные взаимодействия между белком Tat ВИЧ-1 и РНК TAR. Arch Biochem Biophys 365: 175–185.
    27. 27. Чиу Ю.Л., Хо С.К., Саха Н., Швер Б., Шуман С. и др. (2002) Tat стимулирует ко-транскрипционное кэппирование мРНК ВИЧ. Mol Cell 10: 585–597.
    28. 28. Макклоски Т.В., Отт М., Триббл Э., Хан С.А., Тейчберг С. и др. (1997) Двойная роль Tat ВИЧ в регуляции апоптоза в Т-клетках. J Immunol 158: 1014–1019.
    29. 29.Отт М., Ловетт Дж. Л., Мюллер Л., Вердин Э (1998) Супериндукция IL-8 в Т-клетках белком Tat ВИЧ-1 опосредуется факторами NF-kB. J Immunol 160: 2872–2880.
    30. 30. де ла Фуэнте С., Сантьяго Ф., Денд Л., Иди С., Зильберман И. и др. (2002) Профиль экспрессии генов клеток, экспрессирующих Tat ВИЧ-1: тесное взаимодействие между пролиферативными и дифференцированными сигналами. Биохимия BMC 3: 14.
    31. 31. Morellet N, Bouaziz S, Petitjean P, Roques BP (2003) Структура ЯМР регуляторного белка ВИЧ-1 VPR.J Mol Biol 327: 215–227.
    32. 32. Cohen EA, Dehni G, Sodroski JG, Haseltine WA (1990) Продукт вируса иммунодефицита человека vpr представляет собой связанный с вирионом регуляторный белок. J Virol 64: 3097–3099.
    33. 33. Хайнцингер Н.К., Букринский М.И., Хаггерти С.А., Рагланд А.М., Кевальрамани В. и др. (1994) Белок Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 влияет на ядерную локализацию вирусных нуклеиновых кислот в неделящихся клетках-хозяевах. Proc Natl Acad Sci USA 91: 7311–7315.
    34. 34. Фушье Р.А., Мейер Б.Е., Саймон Дж. Х., Фишер Ю., Олбрайт А. В. и др. (1998) Взаимодействие белка Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа с комплексом ядерных пор. J Virol 72: 6004–6013.
    35. 35. Nie Z, Bergeron D, Subbramanian R, Yao X-J, Checroune F, et al. (1998) Предполагаемая альфа-спираль 2 вируса иммунодефицита человека типа 1 Vpr содержит детерминанту, которая отвечает за ядерную транслокацию провирусной ДНК в клетках с задержкой роста.J Virol 72: 4104–4115.
    36. 36. Попов С., Рексач М., Зибарт Дж., Рейлинг Н., Ли М.-А и др. (1998) Вирусный белок R регулирует ядерный импорт преинтеграционного комплекса ВИЧ-1. EMBO J 17: 909–917.
    37. 37. Джоветт Дж. Б., Планеллес В., Пун Б., Шах Н. П., Чен М. Л. и др. (1995) Ген вируса иммунодефицита человека типа 1 vpr задерживает инфицированные Т-клетки в фазе G 2 + M клеточного цикла. J Virol 69: 6304–6313.
    38. 38. He J, Choe S, Walker R, Di Marzio P, Morgan DO и др.(1995) Вирусный белок R (Vpr) вируса иммунодефицита человека 1 типа задерживает клетки в фазе клеточного цикла G 2 , ингибируя активность p34 cdc2 . J Virol 69: 6705–6711.
    39. 39. Goh WC, Rogel ME, Kinsey CM, Michael SF, Fultz PN, et al. (1998) Vpr ВИЧ-1 увеличивает вирусную экспрессию путем манипулирования клеточным циклом: механизм отбора Vpr in vivo. Nat Med 4: 65–71.
    40. 40. Суббраманиан Р.А., Кессоус-Эльбаз А., Лодж Р., Забыть Дж., Яо Х-Дж и др.(1998) Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 является положительным регулятором вирусной транскрипции и инфекционности в первичных макрофагах человека. J Exp Med 187: 1103–1111.
    41. 41. Stewart SA, Poon B, Jowett JBM, Chen IS (1997) Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует апоптоз после остановки клеточного цикла. J Virol 71: 5579–5592.
    42. 42. Pauza CD, Tvedi P, Wallace M, Ruckwardt TJ, Buanec HL, et al. (2000) Вакцинация токсоидом Tat ослабляет заболевание у обезьяньих макак, зараженных ВИЧ.PNAS 97 (7) 3515–3519.
    43. 43. Аллен Т.М., Мортара Л., Моте Б.Р., Либл М., Джинг П. и др. (2002) Макаки, ​​вакцинированные Tat, не контролируют репликацию вируса иммунодефицита обезьян SIVmac239. J Virol 76 (8) 4108–4112.
    44. 44. Nkolola JP, Wee EG, Im EJ, Jewell CP, Chen N, et al. (2004) Engineering RENTA, буст-вакцина против ВИЧ с первичной ДНК-MVA, специально разработанная для Восточной и Центральной Африки Gene Ther. 11 (13) 1068–1080.
    45. 45. Dougherty JP, Temin HM (1988) Определение скорости мутаций замещения пар оснований и вставок при репликации ретровируса.J Virol 62: 2817–2822.
    46. 46. Preston BD, Poiesz BJ, Loeb LA (1988) Верность обратной транскриптазы ВИЧ-1. Наука 242: 1168–1171.
    47. 47. Робертс Дж. Д., Бебенек К., Кункель Т. А. (1988) Точность обратной транскриптазы ВИЧ-1. Наука 242: 1171–1173.
    48. 48. Хо Д.Д., Нойман А.Ю., Перельсон А.С., Чен В., Леонард Дж. М. и др. (1995) Быстрый оборот вирионов плазмы и лимфоцитов CD4 при ВИЧ-1-инфекции. Природа 373: 123–126.
    49. 49.Mullick R, Sengupta S, Sarkar K, Chakrabarti S (2010) Молекулярная характеристика гена tat и области длинного терминального повтора вируса иммунодефицита человека типа 1, обнаруженного среди потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) в Манипуре, Индия: Идентификация рекомбинантов BC. Virus Res 147: 195–201.
    50. 50. Неоги У, Гупта С., Саху П.Н., Шет А., Рао С.Д. и др. (2012) Генетическая характеристика экзона 1 Tat 1 ВИЧ из южноиндийской клинической когорты: идентификация уникальных остатков эпидемиологической сигнатуры.Ретровирусы Aids Res Hum 28 (9) 1152–1156.
    51. 51. Sawaya BE, Khalili K, Gordon J, Taube R, Amini S (2000) Совместное взаимодействие между регуляторными белками ВИЧ-1 Tat и Vpr модулирует транскрипцию вирусного генома. J. Biol Chem. 275 (45) 35209–35214.
    52. 52. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) CLUSTAL W: Повышение чувствительности прогрессивного множественного выравнивания последовательностей посредством взвешивания последовательностей, штрафов за пропуски для конкретных позиций и выбора матрицы весов.Nucleic Acids Res 22: 4673–4680.
    53. 53. Корбер Б. (2000) Анализ сигнатуры и последовательности ВИЧ-инфекции. В: Rodrigo AG, Learn GH, редакторы. Компьютерный анализ молекулярных последовательностей ВИЧ. Дордрехт, Нидерланды: Kluwer Academic Publishers. С. 55–72.
    54. 54. Sorgel S, Fraedrich K, Votteler J, Thomas M, Stamminger T. и др. (2012) Перинуклеарная локализация регуляторного белка ВИЧ-1 Vpr важна для индукции остановки G2. Вирусология 432: 444–451.
    55. 55. Saitou N, Nei M (1987) Метод объединения соседей: новый метод реконструкции филогенетических деревьев. Mol Biol Evol 4: 406–425.
    56. 56. Тамура К., Дадли Дж., Ней М., Кумар С. (2007) MEGA4: программа молекулярно-эволюционного генетического анализа (MEGA), версия 4.0. Mol Biol Evol 24: 1596–1599.
    57. 57. Kimura M (1980) Простой метод оценки скорости эволюции замен оснований посредством сравнительных исследований нуклеотидных последовательностей.J Mol Evol 16: 111–120.
    58. 58. Бано А.С., Суд В., Неоги Ю., Гоэль Н., Куттият В.С. и др. (2009) Генетическая и функциональная характеристика вариантов VprC вируса иммунодефицита человека типа 1 из северной Индии: наличие уникальных рекомбинантов с мозаичными геномами из подтипов B, C и D в открытой рамке считывания Vpr. J Gen Virol 90: 2768–2776.
    59. 59. Аммосова Т., Берро Р., Жеребцова М., Джексон А., Чарльз С. и др. (2006) Фосфорилирование Tat ВИЧ-1 с помощью CDK2 в транскрипции ВИЧ-1.Ретровирология 3: 78.
    60. 60. Fang Z, Xing H, Meng Z, Hong K, Liao L и др. (2010) Анализ генетических характеристик участка Tat Exon-1 штаммов CRF07_BC ВИЧ типа 1 в Китае. Ретровирусы СПИДа Res Hum 26 (3) 359–363.
    61. 61. Гарбер М.Э., Вей П., Кевал Рамани В.Н., Майалл Т.П., Херрманн С.Х. и др. (1998) Взаимодействие между Tat ВИЧ-1 и циклином T1 человека требует цинка и критического остатка цистеина, который не консервативен в белке CycT1 мыши.Genes Dev 12: 3512–3527.
    62. 62. Wei P, Garber ME, Fang SM, Fischer WH, Jones KA (1998) Новый связанный с CDK9 циклин C-типа напрямую взаимодействует с Tat ВИЧ-1 и опосредует его высокоаффинное петлеспецифическое связывание с TAR РНК. Ячейка 92: 451–462.
    63. 63. Verhoef K, Koper M, Berkhout B (1997) Определение минимального количества активности Tat, необходимой для репликации вируса иммунодефицита человека типа 1. Вирусология 237: 228–236.
    64. 64. Садаи М.Р., Раппапорт Дж., Бентер Т., Джозефс С.Ф., Уиллис Р. и др.(1988) Миссенс-мутации в геноме вируса инфекционного иммунодефицита человека: функциональное картирование tat и идентификация акцептора сплайсинга rev. Proc Natl Acad Sci USA 85 (23) 9224–9228.
    65. 65. Ранга У., Шанкараппа Р., Сиддаппа Н.Б., Рамакришна Л., Нагендран Р. и др. (2004) Белок Tat штаммов вируса иммунодефицита человека типа 1 подтипа C является дефектным хемокином. J Virol 78 (5) 2586–2590.
    66. 66. Dey SS, Xue Y, Joachimiak MP, Friedland GD, Burnett JC и др.(2012) Анализ взаимной информации показывает, что в Tat коэволюционируют остатки, которые компенсируют две различные функции в экспрессии гена ВИЧ-1. J Biol Chem 287 (11) 7945–7955.
    67. 67. Verhoef K, Berkhout B (1999) Мутация второго сайта, которая восстанавливает репликацию Tat-дефектного вируса иммунодефицита человека. J Virol 73 (4) 2781–2789.
    68. 68. Neogi U, Sood V, Goel N, Wanchu A, Banerjea AC (2008) Новые последовательности длинных концевых повторов (LTR) ВИЧ-1 подтипа B и мозаичные рекомбинанты межподтипа B / C в Северной Индии.Arch Virol 153 (10) 1961–66.
    69. 69. Tumas KM, Poszgay JM, Avidan N, Ksiazek SJ, Overmoyer B, et al. (1993) Потеря антигенных эпитопов в результате рекомбинации гена env при лейкемии, вызванной ретровирусом, у иммунокомпетентных мышей. Вирусология 192 (2) 587–595.
    70. 70. Головкина Т., Яффе А., Росс С. (1994) Коэкспрессия экзогенных и эндогенных вирусов опухоли молочной железы мыши РНК in vivo приводит к вирусной рекомбинации и расширяет круг хозяев вируса.J Virol 68: 5019–5026.
    71. 71. Moutouh L, Corbeil J, Richman D (1996) Рекомбинация приводит к быстрому появлению мутантов с двойной устойчивостью ВИЧ-1 под давлением селективных лекарств. Proc Natl Acad Sci USA 93: 6106–6111.

    Vpr ВИЧ-1 противодействует активации врожденного иммунитета, воздействуя на опосредованный кариоферином ядерный транспорт NF-κB / IRF3

    Несмотря на множество исследований, изучающих функцию Vpr, четкого механизма того, как HIV-1 Vpr способствует репликации, не появилось, отчасти потому, что фенотипы репликации Vpr не были четко механистически связаны с манипуляциями со специфическими белками-мишенями.Ранние работы связывали ассоциацию Vpr с ядерной мембраной с репликацией в макрофагах, но не в Т-клетках (Connor et al., 1995; Dedera et al., 1989; Fouchier et al., 1998; Hattori et al., 1990; Mashiba et al. , 2015; Водичка и др., 1998). Ранние работы также отделяли влияние Vpr на клеточный цикл от его ассоциации с ядерной оболочкой с использованием мутантов Vpr, в частности, Vpr F34I, которые, как подтверждено в данном документе, подавляли клеточный цикл, но не рекрутировались на ядерную мембрану (Jacquot et al., 2007; Водичка и др., 1998). Мутанты Vpr, которые не локализовались на ядерной мембране, не способствовали репликации макрофагов, что привело авторов к разумному заключению, что Vpr вносит вклад в ядерный транспорт самого вируса. Это наблюдение согласуется с мнением, что Vpr-опосредованная поддержка входа в ядро, как ожидается, будет более важной для неделящихся клеток (макрофагов), чем для быстро делящихся клеток (активированных Т-клеток). Vpr также обычно не требуется для инфицирования клеточных линий, даже если они не делятся (Yamashita and Emerman, 2005).

    В дополнительных исследованиях Vpr был связан с антагонизмом чувствительности врожденного иммунитета в макрофагах (Harman et al., 2015), Т-клетках (Vermeire et al., 2016), а также в клетках HeLa, восстановленных для восприятия ДНК с помощью экспрессии STING. (Тротард и др., 2016). Здесь мы предлагаем модель, которая объединяет роль Vpr в манипулировании проникновением в ядро ​​с его антагонизмом к передаче сигналов врожденного иммунитета. Мы предполагаем, что взаимодействие Vpr с кариоферином KPNA1 (Рисунок 7; Miyatake et al., 2016; Nitahara-Kasahara et al., 2007; Vodicka et al., 1998) ингибирует ядерный транспорт активированных IRF3 и NF-B (рис. 5-7) и последующие изменения экспрессии генов ниже по течению от восприятия врожденного иммунитета (рис. 1–3). Таким образом, Vpr ВИЧ-1 противодействует последствиям активации врожденного иммунитета как производными от ВИЧ, так и не полученными от ВИЧ PAMP. Это объясняет его важность для максимальной репликации в макрофагах, поскольку активированные Т-клетки и большинство клеточных линий плохо реагируют на агонисты врожденного иммунитета, особенно на PAMP на основе ДНК (рис.1; Cingöz and Goff, 2019; de Queiroz et al., 2019; Хейбер и Барбер, 2012; Xia et al., 2016a; Xia et al., 2016b).

    Мы предполагаем, что предыдущие демонстрации Vpr-зависимой репликации ВИЧ-1 в макрофагах, которая зависела от ассоциации Vpr с NPC или с факторами ядерного транспорта, объяснялись ингибированием Vpr врожденной иммунной чувствительности и последующими противовирусными ответами (Jacquot et al. ., 2007; Водичка и др., 1998). Действительно, теперь мы знаем, что индукция врожденного ответа ВИЧ-1, лишенного Vpr, как ожидается, подавит проникновение вируса в ядро, поскольку индукция IFN MxB в макрофагах вызывает ингибирование проникновения в ядро ​​ВИЧ-1 (Goujon et al., 2013; Kane et al., 2013). Таким образом, мы предполагаем, что Vpr напрямую не способствует проникновению в ядро ​​ВИЧ-1. Скорее, он предотвращает ингибирование проникновения в ядро ​​после активации врожденного иммунитета. Мы предполагаем, что Vpr обеспечивает преимущество репликации in vivo , поскольку активация IRF3 и NF-B индуцирует экспрессию воспалительных цитокинов, включая IFN типа 1, и, следовательно, факторов рестрикции, для которых ВИЧ-1 не кодирует антагонисты. Например, в дополнение к MxB IFN индуцирует IFITM1-3 (Foster et al., 2016) и TRIM5α (Jimenez-Guardeño et al., 2019), все из которых могут ингибировать ВИЧ-1. Соответственно, случайное заражение сотрудника лаборатории Vpr-дефектным изолятом ВИЧ-1 привело к отсроченной сероконверсии, подавлению вирусемии и нормальному количеству Т-клеток без необходимости в противовирусном лечении (Ali et al., 2018).

    В большинстве экспериментов, представленных здесь, и в предыдущих исследованиях функции Vpr в клеточных линиях (Yamashita and Emerman, 2005), Vpr не влиял на инфицирование однократных VSV-G псевдотипированных векторов ВИЧ-1, кодирующих GFP.Мы предполагаем, что это связано с тем, что если противовирусные воспалительные реакции, например IFN, запускаются примерно во время инфекции, либо экзогенными сигналами, либо самим ВИЧ-1, тогда активированные противовирусные эффекторы слишком медленны, чтобы ингибировать эту инфекцию, что есть экспрессия GFP из интегрированного провируса. Таким образом, потребность в Vpr выявляется только путем анализа распространения инфекции в врожденных компетентных клетках, таких как макрофаги, которые могут подавлять репликацию последующих раундов инфекции.

    Мы и другие утверждали, что инфекционный геном ВИЧ-1 дикого типа не эффективно воспринимается сенсорами нуклеиновых кислот или не разрушается клеточными нуклеазами, потому что капсид защищает и изолирует геном, регулируя процесс обратной транскрипции во время транспортировки. через враждебную цитоплазматическую среду до удаления оболочки на NPC или в ядре инфицированных клеток (Bejarano et al., 2019; Burdick et al., 2017; Francis et al., 2016; Jacques et al., 2016; Rasaiyaah и другие., 2013; Schaller et al., 2011; Самнер и др., 2020; Башни и Нурсадеги, 2014; Ян и др., 2010; Зила и др., 2019). В самом деле, мы обнаружили, что Vpr может способствовать репликации ВИЧ-1, даже если стимуляция врожденного иммунитета не происходит от производного от ВИЧ-1 PAMP, что здесь проиллюстрировано анализами репликации в первичных макрофагах человека, обработанных cGAMP (Рисунок 1). Мы также обнаружили, что Vpr противодействует эффектам воздействия LPS, РНК и ДНК-лигандов, а также другим вирусным инфекциям, примером которых является вирусная инфекция Сендай, которая сильно активирует чувствительность к РНК и продукцию IFN в макрофагах человека (Matikainen et al., 2000; Фигура 2). Таким образом, Vpr может подавлять сигналы активации, косвенно связанные с инфекцией. Серия недавних исследований продемонстрировала, что инфицированные клетки продуцируют широкий спектр эндогенных PAMP, происходящих из РНК и ДНК. Примеры включают индукцию ретроэлементов при инфекции гриппа (Schmidt et al., 2019), экспрессию псевдогена РНК после заражения вирусом простого герпеса (Chiang et al., 2018) и лиганды RIGI после заражения вирусом герпеса саркомы Капоши (Zhao et al., 2018). Эти исследования предполагают, что вирусы должны быть способны управлять врожденной активацией невирусных PAMP, даже если их собственные PAMP изолированы.Также было описано, что инфекция ВИЧ-1 индуцирует экспрессию ретроэлементов (Jones et al., 2013), что согласуется с потребностью в Vpr для подавления активации врожденного иммунитета ниже эндогенных PAMPs. Кроме того, сероконверсия ВИЧ связана с цитокиновым штормом (Stacey et al., 2009), противовирусный эффект которого может быть смягчен с помощью ассоциированного с частицами Vpr. Таким образом, ВИЧ-1 может использовать Vpr для репликации в среде, активированной врожденным иммунитетом, даже когда его собственные PAMP эффективно изолированы.Связь между бегством от врожденного восприятия и успешной передачей предполагает несколько линий доказательств. К ним относятся в целом низкая частота передачи ВИЧ (Shaw and Hunter, 2012), наблюдение, что передаваемые ВИЧ клоны-основатели особенно устойчивы к IFN (Iyer et al., 2017) и кодируют различные сигнатуры аминокислот Vpr по сравнению с хроническими вирусами. (Rossenkhan et al., 2016), а также сам цитокиновый шторм, связанный с передачей ВИЧ (Stacey et al., 2009). Соответственно, Vpu, Nef и Vif и Vpr противодействуют врожденному иммунитету, усиливая репликацию вируса, что описано в Sumner et al., 2020.

    Было высказано предположение, что

    Vpr вызывает деградацию IRF3 (Okumura et al., 2008), но мы не обнаружили деградацию IRF3 в клетках THP-1 в условиях, когда экспрессия генов и ядерный транспорт IRF3 были сильно подавлены (Рисунок 5). Кроме того, помимо подавления ядерного транспорта IRF3, мы обнаружили, что Vpr снижает фосфорилирование IRF3 по S396, но не по S386 (Рисунок 5). Предыдущие исследования показали, что фосфорилирование IRF3 по S386 необходимо и достаточно для активации IRF3 (Lin et al., 1999; Мори и др., 2004; Ширмахер, 2015; Слуга и др., 2003; Сухара и др., 2000; Йонеяма и др., 1998). Таким образом, наши данные согласуются с более сложной картиной активации IRF3 путем фосфорилирования. Возможно, что фосфорилирование по S396 происходит кариоферин или NPC-зависимым путем, который блокируется рекрутированием Vpr в кариоферин. Фосфорилирование IRF3 по S396 было связано с усиленной ассоциацией и мультимеризацией с транскрипционным коактиватором CREB-связывающим белком (CBP / p300), что указывает на более позднюю роль, чем фосфорилирование по S386 (Chen et al., 2008). Возможно, что отсутствие фосфорилирования IRF3 S396 является следствием дефосфорилирования IRF3 по S396, поскольку предотвращается проникновение в ядро.

    Ингибирование фосфорилирования IRF3 также согласуется с сообщениями об ингибировании TBK1 с помощью Vpr, хотя это исследование обнаружило ингибирование фосфорилирования TBK1, тогда как мы этого не сделали (Harman et al., 2015). В этом исследовании Vpr способствовал инфицированию макрофагов и дендритных клеток, несмотря на то, что ВИЧ-индуцированное образование сигнальных комплексов врожденного иммунитета, содержащих TBK1, IRF3 и TRAF3, визуализировалось с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.Таким образом, ингибирование TBK1 с помощью Vpr может происходить в дополнение к активности Vpr в отношении ядерного транспорта, потому что TBK1 наблюдается в цитоплазме, а не в ядерной оболочке этих ВИЧ-инфицированных клеток (Harman et al., 2015). В этом исследовании не было обнаружено деградации IRF3, и ВИЧ-1 не индуцировал фосфорилирование IRF3, хотя влияние инфекции на IRF3 с помощью ВИЧ-1 дикого типа и ВИЧ-1, удаленных для Vpr, не сравнивали.

    Ожидается, что регуляция ядерного импорта NF-B и IRF3 множественными кариоферинами будет сложной (Fagerlund et al., 2005; Fagerlund et al., 2008; Кумар и др., 2000; Лян и др., 2013). Нацеливание на кариоферины является типичной вирусной стратегией для манипулирования клеточными ответами, но различные способы, которыми вирусы выполняют эту функцию, намекают на сложность, необходимую для подавления врожденных ответов, избегая при этом остановки вирусной транскрипции. Мы предполагаем, что различные механизмы манипулирования NF-κB / IRF3 разными вирусами отражают их зависимость от активации транскрипции, одновременно зависящую от ингибирования одних и тех же факторов транскрипции, активируемых защитными процессами.Мы предполагаем, что каждый вирус специально адаптировался для облегчения репликации, подавляя активацию ингибирующих эффекторов. Неспособность расщепить белки кариоферина предполагает, что некоторая функция ядерного импорта KPNA1 может быть оставлена ​​нетронутой ВИЧ для облегчения более тонких манипуляций с биологией клетки-хозяина (рис. 7). Подобная модель ингибирования связывания мишени KPNA для манипулирования ядерным импортом была предложена кристаллической структурой белка VP24 вируса Эбола в комплексе с KPNA5. В этом исследовании предполагается, что VP24 нацелен на сайт связывания KPNA5 NLS, чтобы специфически ингибировать ядерный импорт фосфорилированного STAT1 (Xu et al., 2014).

    Очевидно, что тип клеток также играет роль в функции Vpr. Например, в миелоидных клетках (Kogan et al., 2013; Miller et al., 2017) и Т-клетках (Ayyavoo et al., 1997) сообщалось, что Vpr ингибирует NF-B. Другие исследования Т-клеток предполагают активацию NF-B с помощью Vpr для управления вирусной транскрипцией (Liu et al., 2014; Vermeire et al., 2016). В более позднем исследовании Хоттер и его коллеги показали, что экспрессия различных Vprs вируса иммунодефицита приматов в клетках HEK293T может активировать или ингибировать активность NF-B в зависимости от анализа (Hotter et al., 2017). Например, экспрессия Vpr в клетках HEK293T активировала исходный уровень, а TNFα стимулировала экспрессию трансфицированного NF-ĸB-чувствительного репортера, но ингибировала активацию репортера трансфецированным IKKβ. Авторы предположили, что Vpr-опосредованное ингибирование NF-B имеет значение, поскольку Vpr ингибирует репортер IFNβ, активированный инфекцией вируса Сендай, что согласуется с результатами, представленными в данном документе. Мы предполагаем, что тип клетки и стадия жизненного цикла вируса влияют на эффект Vpr на активацию фактора транскрипции.Одна возможность состоит в том, что входящая частица, связанная с Vpr, активна против NF-B, чтобы уменьшить врожденное восприятие, но Vpr, экспрессируемый провирусом в инфицированной клетке, связывается с помощью Gag, который секвестрирует Vpr, снижая дальнейшее ингибирование активированного NF-B, т.е. необходим для текущей вирусной транскрипции (Belzile et al., 2010).

    Наши данные также объясняют предыдущие сообщения о подавлении экспрессии котрансфицированных плазмид CMV, управляемых MIEP, с помощью Vpr (Liu et al., 2015b). Ингибирование Vpr транспорта NF-B в ядро ​​для активации MIEP, вероятно, объясняет эти данные, но другая возможность состоит в том, что фактор транскрипции, связанный с цитоплазматической плазмидной ДНК, играет роль в импорте плазмиды в ядро, и именно транспорт плазмиды ингибируется ( Mesika et al., 2001). Нечувствительность к Vpr NF-ĸB-независимого убиквитина и промоторов EF1α (рис. 6) согласуется с этой моделью, обобщенной на рис. 7 — приложение к рисунку 1А. Это важно, потому что ингибирование экспрессии трансфицированного плазмидного белка может объяснить эффект котрансфицированного Vpr SIV на передачу сигналов STING и cGAS, о котором недавно сообщалось (Su et al., 2019). Обратите внимание, что на экспрессию STING не влияла коэкспрессия Vpr, но STING экспрессировался с Vpr и NF-ĸB-нечувствительного промотора EF1α (фиг.6), тогда как cGAS, который не был измерен с помощью вестерн-блоттинга, экспрессировался с Vpr и NF. -B-чувствительная (фиг.6) CMV-управляемая плазмида VR1012 (Hartikka et al., 1996). Некоторые эксперименты в Hotter et al., 2017 также могли быть подвержены влиянию этого явления.

    Важно отметить, что наши данные согласуются с сообщениями о том, что манипулирование клеточным циклом с помощью Vpr не зависит от взаимодействия с белками кариоферина. Мутант Vpr R80A, который не останавливает клеточный цикл и не манипулирует комплексом SLX4 (Gaynor and Chen, 2001; Laguette et al., 2014), действует в отношении ингибирования врожденного восприятия (Рисунки 3, 5 и 6). Таким образом, мы предполагаем, что взаимодействие SLX4 не играет роли в показанном здесь антагонизме врожденного иммунитета.Картирование остатков Vpr, которые важны для ингибирования врожденного иммунитета, на структуры, разрешенные с помощью ЯМР и рентгеновской кристаллографии, выявляет потенциально отличный интерфейс от того, нацеленный на UNG2, потому что остатки Vpr 34/35 удалены от сайта связывания UNG2 (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1Б, В). Кроме того, UNG2 не был связан с восприятием врожденного иммунитета. Учитывая, что Vpr, как было показано, связывает мотив FxFG в p6 Gag во время включения вириона (Zhu et al., 2004), и мотивы FG в NPC (Fouchier et al., 1998) возможно, что взаимодействие Vpr с белками ядерных пор посредством мотивов FG способствует Vpr-опосредованному ингибированию ядерного импорта IRF3 и NF-B.

    In vitro первичные миелоидные клетки ведут себя в соответствии с полученными стимулами. Таким образом, противоречивые результаты между исследованиями, например, требование здесь для cGAMP, но не в других исследованиях, чтобы вызвать Vpr-зависимую репликацию в макрофагах (рисунок 1), можно объяснить различиями в стимуляции миелоидных клеток из-за различий в очистке клеток и используемые методы дифференциации или реагенты.Способы приготовления вирусов, здесь вирусы очищали центрифугированием через сахарозу, также могут быть источником активации клеток-мишеней и экспериментальных вариаций. Мы предполагаем, что цГАМФ индуцировал зависимость Vpr в MDM (рис. 1), потому что клетки не были активированы до добавления цГАМФ, тогда как в других исследованиях базальная активация вызывала Vpr-зависимую репликацию. Репликация в активированных первичных CD4 + Т-клетках, по нашему мнению, не зависела от Vpr в присутствии и в отсутствие cGAMP, который был ингибирующим, что позволяет предположить, что Vpr не может преодолеть передачу сигналов ниже cGAMP в этих клетках.Это означает, что активированные Т-клетки по-разному реагируют на цГАМФ, чем макрофаги, что согласуется с наблюдениями, что в смешанных культурах Т-клеток / макрофагов негативные эффекты цГАМФ на репликацию ВИЧ-1 в основном опосредованы макрофагами (Xu et al., 2016). Сообщалось о Vpr-чувствительной, cGAS-зависимой продукции IFN из Т-клеток, что свидетельствует о том, что при определенных обстоятельствах Т-клетки могут воспринимать ДНК ВИЧ-1 через cGAS в Т-клетках (Vermeire et al., 2016). Важно отметить, что в этом исследовании использовалось ингибирование интеграции, чтобы продемонстрировать провирус-зависимое обнаружение ВИЧ-1, что позволяет предположить, что поступающая ДНК ВИЧ-1 не является мишенью cGAS в этом исследовании.Природа PAMP в этих экспериментах остается неясной. Безусловно, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять различные требования к функции Vpr в Т-клетках и макрофагах.

    Чувствительность к ВИЧ-1 явно зависит от дозы вируса и, следовательно, от дозы PAMP. Например, Cingoz и др. Сообщили, что ВИЧ-1 с псевдотипом VSV-G (∆Env, ∆Nef, ∆Vpr) не активирует сенсорное восприятие в различных клеточных линиях (Cingöz and Goff, 2019). Однако другие исследования продемонстрировали восприятие ДНК ВИЧ-1 дикого типа с помощью cGAS (Gao et al., 2013; Lahaye et al., 2013), и здесь мы наблюдали cGAS-зависимую, Vpr-чувствительную индукцию репортера CXCL10 или NF-ĸB высокой дозой (MOI 1-3) VSV-G, псевдотипированного одинарного круглого вектора GFP ВИЧ-1 в THP. -1 ячейка (рисунки 1 и 6). Эффект дозы проиллюстрирован на рисунке 1, на котором MOI (0,1–0,3) мало влияет на экспрессию CXCL10 в клетках THP-1. Однако более высокие дозы активировали экспрессию CXCL10, если только вирионы не несли Vpr, и в этом случае индукция CXCL10 подавлялась. Cingoz использовала люциферазу для измерения инфекции, и поэтому MOI неясны, что затрудняет сравнение доз.Обратите внимание, что здесь MOI, рассчитанный по экспрессии GFP, включен в дополнительные данные для большинства экспериментов. Учитывая, что инфекция обычно зависит от воздействия на клетки более чем одной вирусной частицы, что требует десятков частиц даже по самым консервативным оценкам, вполне вероятно, что Vpr, доставляемый частицами, которые в конечном итоге не образуют провирус, способствует подавлению восприятия. Конечно, более низкий MOI требуется для активности Vpr, когда стимуляция исходит от самих вирусных частиц, несущих Vpr (требуется MOI три, рисунок 1C), по сравнению с внешним стимулом (требуется MOI 20, рисунок 1B).Трудно понять, какие MOI действительно имеют отношение к репликации in vivo , но важно отметить, что в наших экспериментах высокие MOI выше одного требуются для активации врожденного иммунитета и Vpr-зависимого антагонизма. Это говорит о том, что инфекция с низким MOI зависит от уклонения сенсора от секвестрации вирусного PAMP внутри интактных капсидов (Jacques et al., 2016), но инфекции с более высоким MOI могут зависеть от Vpr, связанного с частицами, для подавления активации любых экспонированных вирусных PAMP и любых эндогенных PAMP, которые являются индуцированный.

    Таким образом, наши открытия связывают Vpr-манипуляции с ядерным транспортом с ингибированием врожденного иммунного восприятия, а не с вирусным ядерным импортом. Они подчеркивают решающую роль связанного с частицами Vpr в ингибировании активации врожденного иммунитета на ранних стадиях жизненного цикла вируса и объединяют серию исследований, объясняющих ранее очевидно несвязанные наблюдения. Учитывая сложность активации NF-kB и различные способы, которыми каждый вирус манипулирует защитными транскрипционными ответами, мы предполагаем, что дальнейшее изучение вирусного ингибирования воспалительных реакций, вызванных PAMP, приведет к лучшему пониманию биологии задействованных факторов транскрипции и выделить новые, поддающиеся лечению цели для терапевтических противовоспалительных разработок.

    Активация транскрипции ВИЧ дополнительным белком VPR опосредуется коактиватором p300

    Аннотация

    Дополнительный белок, Vpr, представляет собой связанный с вирионом белок, который необходим для репликации ВИЧ-1 в макрофагах и регулирует экспрессию вирусных генов в Т-клетках. Vpr вызывает остановку развития клеточного цикла при G 2 / M, предположительно за счет своего воздействия на активность циклина B1⋅Cdc2. Здесь мы показываем, что способность Vpr активировать транскрипцию ВИЧ коррелирует с его способностью вызывать остановку роста G 2 / M, и этот эффект опосредуется коактиватором транскрипции p300, который способствует кооперативным взаимодействиям между субъединицей Rel A. NF-κB и циклина B1⋅Cdc2.Vpr взаимодействует с p300, который регулирует NF-κB и базальный аппарат транскрипции, чтобы увеличить экспрессию гена ВИЧ. Подобные эффекты наблюдаются в отсутствие Vpr с киназо-дефицитным Cdc2, а сверхэкспрессия p300 увеличивает уровни репликации ВИЧ Vpr + . Взятые вместе, эти данные предполагают, что p300 посредством его взаимодействий с NF-κB, базальными транскрипционными компонентами и Cdks модулируется с помощью Vpr и регулирует репликацию ВИЧ. Регулирование p300 с помощью Vpr обеспечивает механизм усиления вирусной репликации в пролиферирующих клетках после остановки роста за счет увеличения вирусной транскрипции.

    Репликация

    ВИЧ очень чувствительна к изменениям клеточной стимуляции, таким как активация клеток цитокинами или прогрессирование клеточного цикла факторами роста. Регуляция клеточного цикла ВИЧ недавно стала очевидной. В частности, Vpr представляет собой кодируемый ВИЧ белок, который влияет на развитие клеточного цикла, либо индуцируя дифференцировку (1), либо вызывая остановку клеточного цикла в контрольной точке G 2 / M (2–5). Vpr является дополнительным белком ВИЧ массой 14 кДа, который локализуется в ядре и связывается с вирионом, связываясь с карбоксильным концом вирусного белка Gag (6–9).В неделящихся клетках, таких как макрофаги, Vpr играет роль в транслокации ВИЧ в ядро ​​по механизму, отличному от кариоферинового пути, который используется белком вирусного матрикса для ядерной локализации ВИЧ (10, 11). Vpr важен для заметной стимуляции репликации вируса в макрофагах и вызывает умеренное увеличение транскрипции ВИЧ и продукции вируса в Т-лимфоцитах (12–14).

    Транскрипция ВИЧ регулируется двумя сайтами κB в вирусном энхансере в длинном концевом повторе (LTR) (15).Эти сайты распознаются семейством факторов транскрипции NF-κB, которые обычно индуцируются в ответ на стресс и инфекцию (см. Ссылку 16). Транскрипционная активность NF-κB в значительной степени контролируется секвестрацией в цитоплазме семейством ингибирующих белков, IκB, и ингибирование снимается, когда IκB фосфорилируются и деградируют в ответ на различные цитокины, включая фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), рост факторы, а также бактериальные и вирусные продукты (см.17). Функция NF-κB также регулируется в ядре другими факторами транскрипции, членами основного транскрипционного аппарата (18) и коактиваторами транскрипции, такими как коактиваторы p300 и CREB-связывающего белка (CBP) (19). Недавно было показано, что активация транскрипции NF-κB регулируется модуляторами прогрессии клеточного цикла. В частности, остановка роста за счет экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы p21 усиливала функцию NF-κB (19). Этот эффект опосредован коактиватором транскрипции p300, который связывается с комплексами циклина E⋅Cdk2, ингибируемыми p21.Таким образом, казалось, что G 1 / S-специфические регуляторные белки клеточного цикла могут модулировать активность NF-κB и тем самым увеличивать транскрипцию вирусных генов, когда прогрессирование клеточного цикла останавливается.

    Механизм активации транскрипции ВИЧ с помощью Vpr не совсем понятен. Vpr ингибирует развитие клеточного цикла в контрольной точке G 2 / M. Наш предыдущий вывод о том, что задержка роста G 1 / S влияет на транскрипцию ВИЧ, повысил вероятность того, что остановка роста, вызванная Vpr, также может влиять на его трансактивацию.Поэтому мы исследовали, может ли Vpr влиять на транскрипцию ВИЧ с помощью p300 / CBP за счет его способности вызывать остановку клеточного цикла G 2 / M. Мы демонстрируем, что Vpr влияет на экспрессию гена ВИЧ посредством своего действия на p300, и что этот эффект коррелирует со способностью Vpr останавливать развитие клеточного цикла. Мы предполагаем, что комплексы циклина B1⋅Cdc2, связанные с p300, являются медиатором этого эффекта. Репликация HIV Vpr + увеличивается, когда p300 сверхэкспрессируется в инфицированных клетках, что подразумевает коактивацию транскрипции, регулируемую Cdks, в контроле репликации ВИЧ.

    МЕТОДЫ

    Плазмиды, культуры клеток и ядерные экстракты.

    ВИЧ-CAT, RSV-Rel A, CMV-Vpr, CMV-Vpr (ΔATG), CMV-Cdc2 (ΔK), CMV-p300, pBS-3′p300, WT 12S E1A, Δp300 12S E1A и CMV- Все плазмиды экспрессии мутанта Vpr описаны (15, 19, 20, 21, 22). Мутант Vpr, R80A, который был охарактеризован (23), был сконструирован в контексте Hx bru Vpr (20). Β-галактозидаза вируса саркомы Рауса (RSV) или β-глобин RSV и щелочная фосфатаза цитомегаловируса (CMV) (VCL-1012 CMV (Vical, Inc.)) векторы использовали в качестве контрольных плазмид-наполнителей для трансфекций RSV-Rel A, CMV-p300 и CMV-Cdc2 (ΔK). Ранее также сообщалось о конструкциях p300 и Rel A pBluescript, используемых для трансляции in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7 (15, 22). Плазмиду CMV-CD2 получали путем лигирования фрагмента Sal I– Hin dIII, содержащего кодирующую область для человеческого CD2, с сайтами Sal I– Eco RV в области множественного клонирования VCL-1012 CMV.Вектор CMV-CD4 получали путем лигирования фрагмента Eco RI– Bam HI, содержащего кодирующую последовательность CD4, с сайтами Pst I– Bam HI в области множественного клонирования VCL-1012 CMV.

    Выращивали клетки

    Jurkat, UM-316, 293 почечного эпителия и NIH 3T3 (24), а ядерные экстракты получали, как описано ранее (25). Для индукции NF-κB для анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) клетки стимулировали в течение 1 часа 200 ед. / Мл рекомбинантного TNF-α (Genzyme).

    Трансфекции и анализы хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT).

    клеток Jurkat трансфицировали с использованием DEAE-декстрана, и анализы CAT выполняли через 48 часов после трансфекции, как описано ранее (15). Клетки 293 трансфицировали осаждением фосфатом кальция, и через 72 ч получали ядерные экстракты (25).

    клеток NIH 3T3 трансфицировали gAP / DLRIE / DOPE 50/50 (Vical). В частности, клетки высевали до 40% конфлюэнтности за 1 день до трансфекции, дважды промывали Opti-MEM и трансфицировали раствором липид-ДНК, полученным путем объединения 1.5 мл Opti-MEM, содержащего 15 мкг ДНК, плюс 1,5 мл Opti-MEM, содержащего 30 мкл раствора липидов с концентрацией 2 мг / мл. Клетки инкубировали в течение 4 часов, липидный раствор удаляли, добавляли свежую среду и клетки лизировали и анализировали через 48 часов. Из-за различий в эффективности трансфекции, наблюдаемой с этими клетками, 4 мкг RSV-β-галактозидазы было котрансфицировано во всех образцах, и экстракты были нормализованы перед анализом активности CAT на основе активности β-галактозидазы (26).

    Клетки

    UM-316 высевали до 20% конфлюэнтности в 6-луночные планшеты за 1 день до трансфекции.Клетки трансфицировали 5 мкг CMV-p300 или пустого контрольного вектора CMV и 0,5 мкг CMV-CD4 с использованием липофектамина (GIBCO / BRL) в соответствии с инструкциями производителя.

    Анализ клеточного цикла.

    клеток 293 трансфицировали 2,5 мкг CMV-CD2 плюс 7,5 мкг векторов CMV-Vpr. Через 48 часов клетки инкубировали в течение 30 минут с антителом к ​​маркеру клеточной поверхности CD2 (супернатант гибридомы ATCC HB 222), трижды промывали PBS + 2% фетальной телячьей сывороткой, инкубировали в течение 30 минут с изотиоцианатом флуоресцеина мыши. -конъюгированное антитело и промывали еще три раза.Клетки ресуспендировали в 875 мкл ледяного PBS и фиксировали в течение 1 ч на льду, добавляя 125 мкл холодного PBS, содержащего 2% параформальдегида. Клетки промывали один раз PBS + 2% фетальной телячьей сыворотки, повышали проницаемость в течение 15 минут при 37 ° C с помощью 1 мл 2% Tween 20 в PBS и еще раз промывали. Окрашивание йодидом пропидия проводили путем инкубации клеток в течение 1 ч при 37 ° C в 960 мкл PBS, 2 единицах РНКазы и 40 мкл йодида пропидия (Boehringer Mannheim). Содержание ДНК в CD2-положительных клетках измеряли с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией.

    Анализ сдвига электрофоретической подвижности.

    EMSA были выполнены с 1,5 мкг ядерного экстракта из клеток 293 и двухцепочечного олигомера с концевой меткой, содержащего один сайт связывания NF-κB, как описано ранее (25). Комплексы анализировали на 5% полиакриламидных гелях в буфере 0,25 × TBE.

    Анализ связывания белков и вестерн-блоттинг.

    Для связывания с транслированными белками in vitro проводили иммунопреципитацию с антителом против циклина B (SC-245AC, Santa Cruz) или контрольным мышиным IgG1 (M-9269, Sigma) на 50 мкг ядерного экстракта в течение 2 часов.Иммунопреципитированные белки трижды промывали буфером для иммунопреципитации (19), инкубировали с in vitro транслированным карбокси-концевым p300 (система транскрипции / трансляции кроличьих ретикулоцитов Т7 TNT, Promega) и еще трижды промывали буфером для иммунопреципитации. Комплексы анализировали с помощью 8% SDS / PAGE.

    Для обнаружения связанных p300, Rel A, циклина B1 и Cdc2 с помощью вестерн-блоттинга иммунопреципитацию проводили на 420 мкг ядерного экстракта, подвергали 8% SDS / PAGE и затем Вестерн-анализу с антителами к p300 (SC-584 и SC-585, Санта-Крус), Rel A (SC-109 и SC-372, Санта-Крус), циклин B1 (SC-245, Санта-Крус) и Cdc2 (SC-54, Санта-Крус).Антитела использовали в концентрации 0,5 мкг / мл, а соответствующее вторичное антитело против кролика или антитело против мыши, связанное с пероксидазой хрена, использовали в разведениях 1: 8000 и 1: 3000 соответственно. Белки визуализировали с помощью системы усиленной хемилюминесценции (Amersham).

    ВИЧ-инфекции и анализ обратной транскриптазы.

    Трансфицированные CD4-положительные клетки 293 или клетки UM-316 в 6-луночных планшетах для тканевых культур были инфицированы ВИЧ bru Vpr + или ВИЧ bru Vpr путем инкубации клеток с вирусом в течение 4 часов при 37 ° C. при кратности заражения 0.05–0.1. После инкубации с вирусом клетки дважды промывали D-PBS и добавляли свежую DMEM до конечного объема 4 мл.

    Супернатанты культур анализировали на активность обратной транскриптазы (RT), как описано ранее (27). Поли (A) / олиго (dt) использовали в качестве праймера-матрицы, и включение [ 32 P] dTTP измеряли после нанесения 3 мл реакционной смеси RT на бумагу DE81, сушки и четырехкратной промывки в 2 × SSC. раствор при 22 ° C. Радиоактивность анализировали на бетаскопе Betagene (Waltham, MA), и активность выражали в имп / мл супернатантов культуры.Были выполнены тройные анализы RT, и значения выражены как среднее ± стандартное отклонение.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Чтобы изучить механизм активации транскрипции ВИЧ с помощью Vpr, мы сначала определили, коррелирует ли способность Vpr вызывать остановку роста с активацией транскрипции ВИЧ. Клетки лейкемии Jurkat T трансфицировали вектором, кодирующим ген хлорамфениколацетилтрансферазы, контролируемым энхансером ВИЧ (HIV-CAT), и векторами экспрессии, кодирующими либо дикого типа, либо мутантные формы Vpr.Мутант R80A, который не может арестовывать клетки, но сохраняет способность перемещаться в ядро ​​(23), и два дополнительных мутанта, R73S и S79I / R80D, которые аналогичны ранее охарактеризованным мутантам клеточного цикла (23), были протестированы в этих условиях. эксперименты. Также была исследована мутация E25K, которая нарушает ядерную локализацию и включение вириона Vpr, но обеспечивает эффективную репликацию вируса (20). В клетках 293 E25K ингибировал развитие клеточного цикла через 48 часов, тогда как способность R80A, R73S и S79I / R80D задерживать клетки были нарушены (рис.1 А ). Клетки 293 использовали для документирования остановки роста из-за достигнутой высокой эффективности трансфекции, и было труднее оценить эти эффекты в клетках Jurkat, которые плохо трансфицированы; однако предыдущие исследования показали сходные фенотипы остановки клеточного цикла с помощью Vpr и нескольких мутантов в клетках Jurkat (3, 28). Заражение клеток Jurkat ВИЧ, содержащим мутацию R80A или E25K, также использовалось для подтверждения того, что Vpr R80A не вызывает остановки клеточного цикла и что Vpr E25K действительно задерживает клетки (R.В КАЧЕСТВЕ. и E.A.C., неопубликованные данные), что аналогично результатам для 293 клеток, представленных здесь.

    Рисунок 1 Активация

    Vpr транскрипции ВИЧ с помощью Rel A коррелирует с его способностью регулировать развитие клеточного цикла. ( A ) Мутанты Vpr, дефектные по остановке роста G 2 / M, обладают нарушенной способностью активировать транскрипцию ВИЧ.Для анализа распределения клеточного цикла клетки 293 котрансфицировали pCMV-CD2, вектором экспрессии, кодирующим антиген CD2, CMV-Vpr дикого типа и указанными мутантными формами Vpr. CD2-положительные клетки анализировали с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией. Обозначены отношения популяций клеток G 2 / M к G 1 . Для анализа трансактивации Vpr клетки Jurkat трансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT, 0,2 мкг RSV Rel A и 1 мкг CMV-Vpr (WT), CMV-Vpr (R80A), CMV-Vpr (R73S), CMV-Vpr (S79I / R80D) или CMV-Vpr (E25K).Использовали контрольные плазмиды, так что каждая трансфекция получала 0,2 мкг RSV и 1 мкг плазмид CMV. Значения представлены как кратность активации по сравнению с базальной активностью ВИЧ-CAT, а столбики ошибок представляют собой SEM. ( B ) Vpr не может активировать энхансер ВИЧ в клетках NIH 3T3, которые не могут быть арестованы с помощью Vpr. Клетки NIH 3T3 котрансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT, 0,5 мкг RSV-Rel A и 1 мкг CMV-Vpr, где указано. Контрольные плазмиды использовали так, чтобы каждый образец содержал 0,2 мкг RSV и 1 мкг плазмид CMV.

    Для анализа усиления транскрипции клетки Jurkat котрансфицировали каждым вектором экспрессии Vpr и Rel A, чтобы обеспечить постоянную экспрессию NF-κB и активацию транскрипции ВИЧ (рис. 1). А ). И Vpr дикого типа, и мутант E25K стимулировали активность ВИЧ-CAT (рис. 1). А ; p = 0,001 для Vpr и p = 0,044 для E25K по сравнению с нетранслированным отрицательным контролем, Vpr (ΔATG), парным тестом t ), что позволяет предположить, что ядерная локализация и включение вириона Vpr не требовались для активации Транскрипция ВИЧ с помощью Vpr; однако способность R80A, R73S и S79I / R80D к трансактивации нарушена, что свидетельствует о корреляции между трансактивацией и функциями остановки клеточного цикла Vpr.Экспрессию Vpr подтверждали вестерн-блоттингом (данные не показаны).

    Чтобы дополнительно изучить, коррелирует ли остановка клеточного цикла с помощью Vpr с трансактивацией энхансера ВИЧ, мы проанализировали влияние Vpr на активность ВИЧ-CAT в клетках NIH 3T3, рост которых не задерживается с помощью Vpr (3). Клетки NIH 3T3 трансфицировали HIV-CAT и CMV-Vpr в присутствии или в отсутствие Rel A. В отличие от эффектов Vpr в клетках Jurkat, не наблюдали активации HIV-LTR в клетках NIH 3T3 в присутствии Впр (рис.1 Б ). Кроме того, когда Rel A котрансфицировали для обеспечения постоянных количеств ядерной активности NF-κB, в этих клетках не наблюдали трансактивации с помощью Vpr. Таким образом, неспособность Vpr блокировать клетки NIH 3T3 в G 2 / M коррелировала с отсутствием активации транскрипции ВИЧ, что дополнительно предполагает, что активность Vpr по остановке роста G 2 / M необходима для его функции трансактивации.

    Для анализа специфических цис -действующих элементов промотора ВИЧ, участвующих в трансактивации Vpr, мы затем исследовали, может ли Vpr влиять на базальную и TNF-индуцированную транскрипцию ВИЧ.Клетки Jurkat трансфицировали ВИЧ-CAT и увеличивающимися количествами вектора экспрессии Vpr. Затем клетки либо оставляли нестимулированными, либо стимулировали TNF-α. Vpr индуцировал дозозависимое увеличение активности CAT в присутствии или в отсутствие TNF-α (рис. 2). А ). Чтобы определить влияние Vpr на специфические области энхансера, клетки Jurkat котрансфицировали Vpr и HIV-CAT, содержащими различные мутантные cis -действующие регуляторные элементы. Несмотря на уменьшение в отсутствие сайтов κB, мутантный энхансер κB оставался чувствительным к Vpr (рис.2 B ), предполагая, что NF-κB способствует трансактивации с помощью Vpr, но не несет полной ответственности за этот эффект. Напротив, индукция не наблюдалась при использовании мутантного репортера ΔκB / ΔTATA, предполагая, что базальный транскрипционный аппарат также необходим для трансактивации с помощью Vpr. Поскольку мутантный репортер ΔκB / ΔTATA реагирует на другие вирусные трансактиваторы (29), было очевидно, что и сайты κB, и TATA-бокс необходимы для ответа на Vpr.Влияние Vpr на индукцию NF-κB было проанализировано биохимически. Ядерные экстракты из клеток 293, трансфицированных контрольными плазмидами или плазмидами, экспрессирующими либо Vpr, либо Tax, анализировали с использованием EMSA. Экспрессия Vpr не вызвала значительного изменения активности связывания ДНК κB, в отличие от известного активатора HTLV-1 Tax (21, 30, 31), который увеличивал комплексы NF-κB (рис. 3). А ). Вестерн-блоттинг подтвердил, что Vpr существенно не изменяет уровни ядерного Rel A (1.В 3 раза выше контроля) (рис. B ), и при иммунопреципитации не было обнаружено прямого взаимодействия с Rel A (данные не показаны).

    фигура 2

    Определение цис--действующих сайтов, которые опосредуют стимуляцию Vpr транскрипции ВИЧ. ( A ) Vpr стимулирует активность усилителя ВИЧ.Клетки Jurkat котрансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT и указанными количествами CMV-Vpr. Контрольный вектор, Vpr (ΔATG), использовали так, чтобы каждый образец получал эквивалентное количество плазмиды экспрессии CMV. Через сорок два часа после трансфекции клетки стимулировали в течение 6 часов TNF-α (+ TNF-α) или оставляли нестимулированными. ( B ) Последовательности κB и TATA необходимы для трансактивации Vpr. Клетки Jurkat котрансфицировали 5 мкг HIV-CAT, (ΔκB) HIV-CAT или (ΔκB / ΔTATA) HIV-CAT и 1 мкг CMV-Vpr, где указано.Использовали контрольные плазмиды, так что каждый образец содержал 1 мкг векторов CMV. Значения представлены как кратная активация Vpr над базальным уровнем каждого репортера в отсутствие Vpr.

    Рисунок 3

    Vpr не влияет на связывание ДНК или ядерную транслокацию NF-κB. ( A ) Vpr не индуцирует связывание ДНК NF-κB.Ядерные экстракты из клеток 293, трансфицированных 7,5 мкг отрицательного контроля, CMV-Vpr с удаленным ATG (контроль) (дорожки 1–3), CMV-Vpr (дорожки 4–6), LTR-Tax (дорожки 7–9), или стимулированные TNF-α, анализировали с помощью EMSA с использованием меченного на конце 32 P двухцепочечного олигонуклеотидного κB-зонда. Немеченые мутантные ДНК и ДНК-конкуренты κB дикого типа (100 нг) были включены, как указано. ( B ) Vpr не индуцирует ядерную транслокацию Rel A. Ядерные экстракты из клеток 293, трансфицированных 7,5 мкг мутанта CMV-ATG отрицательного контроля Vpr (контроль) (дорожка 1) или CMV-Vpr (дорожка 2), анализировали на ядерную локализацию Rel A с помощью вестерн-блоттинга.Денситометрический анализ показал, что RelA было в 1,3 раза выше в клетках, трансфицированных Vpr.

    Обнаружение того, что трансактивация Vpr происходит как через сайты κB, так и через TATA-бокс, позволяет предположить, что Vpr может регулировать функцию транскрипционного коактиватора, такого как p300, который связывается как с NF-κB, так и с компонентами TFIIB и TBP базальный транскрипционный аппарат (19). Чтобы исследовать роль p300 в активации энхансера ВИЧ с помощью Vpr, продукт гена аденовируса E1A был использован для ингибирования p300-зависимой активации гена.Форма 12S белка E1A аденовируса связывается и инактивирует p300 (32–36), ингибируя базальный и TNF-α-индуцированный NF-κB (37). 12S E1A дикого типа и мутант, связывающий p300 12S E1A, котрансфицировали ВИЧ-CAT и Vpr в Т-клетках Jurkat. 12S E1A дикого типа подавляла активацию с помощью Vpr; однако мутант 12S E1A, который не может связывать p300, не смог проявить этот репрессивный эффект (рис. 4). A ), предполагая, что p300 необходим для активации транскрипции ВИЧ с помощью Vpr. Чтобы определить, необходим ли p300 для активации базального транскрипционного аппарата с помощью Vpr, котрансфицировали (ΔκB) HIV-CAT, Vpr и 12S E1A дикого типа или связывающий мутант p300 12S E1A.Как наблюдалось ранее, активация (ΔκB) ВИЧ-CAT с помощью Vpr была ниже, чем наблюдаемая с ВИЧ-CAT; однако эффекты E1A на (ΔκB) HIV-CAT были аналогичны эффектам, наблюдаемым в случае HIV-CAT. Дикий тип, но не связывающий мутант p300 12S E1A, ингибировал Vpr-опосредованную (ΔκB) активацию HIV-CAT (рис. 4). B ), предполагая, что p300 необходим для активации транскрипции ВИЧ через базальные компоненты транскрипции.

    Рисунок 4

    p300 стимулирует транскрипцию ВИЧ.( A ) 12S E1A дикого типа, но не мутант, связывающий p300 12S E1A, ингибирует активацию энхансера ВИЧ с помощью Vpr. Клетки Jurkat котрансфицировали 2 мкг ВИЧ-CAT, 0,5 мкг CMV-Vpr и 2 мкг 12S E1A дикого типа или мутанта, связывающего p300 12S E1A, как указано. При необходимости использовали соответствующие контрольные плазмиды. Значения представлены как кратная активация по сравнению с базальным уровнем ВИЧ-CAT. ( B ) 12S E1A дикого типа, но не 12S E1A, связывающий мутант p300 ингибирует (ΔκB) активность HIV-CAT.Клетки Jurkat котрансфицировали 2 мкг (ΔκB) HIV-CAT, 0,5 мкг CMV-Vpr и либо 2 мкг 12S E1A дикого типа, либо мутантом, связывающим p300 12S E1A, как указано. При необходимости добавляли контрольные плазмиды. Значения представлены как активация, кратная базовому уровню активности HIV-CAT. ( C ) p300 и Vpr действуют вместе, активируя энхансер ВИЧ. Клетки Jurkat котрансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT, 0,2 мкг RSV-RelA, если указано, 1 мкг CMV-Vpr, если указано, и возрастающими количествами CMV-p300.При необходимости трансфицировали соответствующие контрольные векторы. Значения представляют собой процент превращения хлорамфеникола в анализе CAT.

    Для дальнейшего изучения роли p300 в трансактивации Vpr клетки Jurkat котрансфицировали Vpr, Rel A (для обеспечения постоянного ядерного NF-κB) и увеличивающимися количествами вектора экспрессии p300. p300 оказывал дозозависимую стимуляцию в комбинации с Vpr, Rel A и Vpr плюс Rel A, а комбинация Vpr / Rel A / p300 была больше, чем аддитивная (в 100 раз) по сравнению с эффектом p300 плюс Vpr (в 36 раз) или p300 plus RelA (16-кратный) (рис.4 С ). Эти данные свидетельствуют о том, что Vpr, Rel A и p300 действуют согласованно, чтобы активировать транскрипцию ВИЧ.

    Затем был исследован механизм регуляции p300 с помощью Vpr. Было показано, что соактиватор p300 стимулирует транскрипцию ВИЧ в присутствии ингибитора циклинзависимой киназы p21. Rel A связывается с концом NH 2 p300, тогда как комплексы циклин E / Cdk2 связываются с концом COOH p300. Было показано, что Vpr вызывает остановку роста благодаря своей способности ингибировать активность киназы Cdc2.Циклин B1 также был обнаружен на низких уровнях в иммунопреципитации Rel A (19), что повышает вероятность того, что циклин B1⋅Cdc2 также может взаимодействовать с p300. Поэтому мы исследовали, может ли p300 взаимодействовать с комплексами циклин B1⋅Cdc2.

    Иммунопреципитации проводили с контрольными антителами или антителами к циклину B1 на ядерных экстрактах из клеток Jurkat, а in vitro транслировали COOH-терминальный р300, были связаны с циклином B1⋅Cdc2, но не для контроля иммунопреципитации (рис.5 А ). Это взаимодействие было подтверждено in vivo в стимулированных TNF ядерных экстрактах Jurkat путем иммунопреципитации циклина B1 и вестерн-блоттинга для p300 (фиг. Б ). Хотя p300 не был обнаружен с помощью контрольных антител, он легко обнаруживался в иммунопреципитатах циклина B1. Вестерн-блот-анализ для Rel A тех же иммунопреципитированных комплексов показал, что Rel A также присутствует в комплексах циклин B1⋅Cdc2⋅p300, но не в контрольных иммунопреципитациях (рис.5 Б ). Присутствие как циклина B1, так и Cdc2 в этих комплексах было подтверждено аналогичной иммунопреципитацией циклина B1 с последующим вестерн-блот-анализом с использованием антител к циклину B1 и Cdc2 (рис. С ). Таким образом, казалось, что комплексы циклина B1⋅Cdc2⋅p300⋅Rel A существуют in vivo . Vpr также, по-видимому, не влиял на общий уровень связывания циклина B1⋅Cdc2 с p300 (рис. 5). D ).

    Рисунок 5.

    Cyclin B1⋅Cdc2, p300 и Rel A связаны в один и тот же комплекс, на который не влияет сверхэкспрессия Vpr и влияние киназо-дефицитного Cdc2 на p300-зависимую транскрипцию ВИЧ.( A ) Комплексы циклин B1⋅Cdc2 связывают p300 in vitro . Иммунопреципитации из ядерных экстрактов Jurkat с использованием контрольных антител (дорожка 2) или антител к циклину B1 (дорожка 3) инкубировали с in vitro транслированным карбоксиконцевым p300, промывали и анализировали с помощью SDS / PAGE. Дорожки 1 и 4 показывают 10% введенного in vitro , транслированного p300. ( B ) Комплексы циклин B1⋅Cdc2 связывают p300 in vivo . Иммунопреципитацию проводили на ядерных экстрактах из клеток Jurkat, которые были обработаны TNF-α в течение 1 часа контрольным антителом (дорожка 5) или антициклином B1 (дорожка 6).Комплексы промывали и подвергали вестерн-анализу с использованием антител против р300 ( верхний ) или анти-Rel A ( нижний ). Дорожка 4 содержит 10 мкг ядерного экстракта Jurkat. ( C ) И циклин B1, и Cdc2 обнаруживаются в иммунопреципитации циклина B1 из ядерных экстрактов. Иммунопреципитацию контрольным антителом (дорожка 8) или антителом к ​​циклину B1 (дорожка 9) проводили на ядерных экстрактах Jurkat и подвергали вестерн-блоттингу с использованием антител к циклину B1 ( верхний ) или Cdc2 ( нижний ).Дорожка 7 содержит 10 мкг ядерного экстракта Jurkat. ( D ) Экспрессия Vpr не влияет на связывание циклина B1-p300. Клетки 293 трансфицировали отрицательным контролем, CMV-Vpr с удаленным ATG (контроль) (дорожки 10–12) или CMV-Vpr (дорожки 13–15), и иммунопреципитацию проводили с контрольными (C) антителами (дорожки 10 и 13). антитела p300 (дорожки 11 и 14) и антитела к циклину B1 (дорожки 12 и 15). Иммунопреципитированные комплексы подвергали Вестерн-блоттингу на р300. ( E ) Экспрессия Cdc2 с дефицитом киназы активирует транскрипцию ВИЧ через клетки Jurkat p300, котрансфицированные 5 мкг HIV-CAT, 1 мкг CMV-Cdc 2 (ΔK), где указано, или 2 мкг E1A 12S дикого типа или мутант, связывающий 12S E1A p300, как показано.Значения представлены как процент ацетилированного хлорамфеникола в анализе CAT.

    Поскольку считается, что Vpr оказывает свое влияние на задержку роста за счет ингибирования активности киназы Cdc2, а циклин B1⋅Cdc2 был обнаружен в ассоциации с p300, мы затем определили, может ли мутант Cdc2, дефицитный по киназе, Cdc2 (ΔK) влиять на ВИЧ. активация транскрипции p300. Клетки Jurkat котрансфицировали HIV-CAT, плазмидой экспрессии, кодирующей Cdc2 (ΔK), которая, как было показано ранее, задерживает клетки в фазе G 2 / M клеточного цикла (38) и 12S E1A дикого типа или 12S E1A p300. связывающий мутант.Сверхэкспрессия Cdc2 (ΔK) стимулировала активность ВИЧ-CAT, предполагая, что прямое ингибирование Cdc2 имеет такой же эффект на транскрипцию ВИЧ, что и непрямое ингибирование Cdc2 с помощью Vpr. Котрансфекция оптимальных количеств Vpr и Cdc2 (ΔK) не обеспечивала синергетической активации, и этот эффект снижался в отсутствие сайтов κB, как видно с Vpr (данные не показаны), что свидетельствует о насыщении пути активации, общего для Vpr и Cdc2. . Кроме того, активация транскрипции ВИЧ с помощью Cdc2 (ΔK) ингибировалась 12S E1A дикого типа, но не мутантом, связывающим p300 (рис.5 E ), предполагая, что трансактивация HIV-LTR посредством ингибирования Cdc2 происходит через p300. Таким образом, ингибирование связанной с p300 активности Cdc2 усиливает активацию транскрипции с помощью Rel A и p300, и вполне вероятно, что Vpr действует посредством этого механизма.

    Ингибирование Vpr-опосредованной активности энхансера ВИЧ путем секвестрации p300 с помощью E1A и участие Vpr в репликации ВИЧ предполагают, что p300 также может участвовать в репликации ВИЧ.Чтобы определить, может ли p300 регулировать репликацию ВИЧ, клетки CD4–293, высокотрансфицируемая клеточная линия, которая является высоко пермиссивной для ВИЧ, трансфицировали CMV-p300 или контрольной плазмидой CMV. Эти клетки затем инфицировали ВИЧ bru Vpr + , и репликацию вируса измеряли в дни 0, 2 и 4 путем количественной оценки активности обратной транскриптазы (RT). В присутствии CMV-p300 наблюдалось постепенное увеличение p300 по сравнению с контрольными трансфицированными клетками с 6-7-кратным увеличением через 4 дня после заражения (рис.6 A , p = 0,041, парный тест t ), существенная разница, учитывая высокую репликацию вируса в этих клетках (39). Хотя клетки CD4–293 содержат E1A, который ингибирует функцию p300, уровни сверхэкспрессии p300 смогли преодолеть до уровней эндогенного E1A, что было исследовано с помощью окрашивания серебром и вестерн-блоттинга (данные не показаны). Чтобы подтвердить этот эффект в отсутствие E1A, использовали высокотрансфицируемую E1A-отрицательную клеточную линию меланомы, UM-316.Клетки UM-316 котрансфицировали CD4 и p300 или контрольными векторами экспрессии, а затем инфицировали ВИЧ bru Vpr + или ВИЧ bru Vpr . Активность обратной транскриптазы была определена количественно через 4 дня после заражения и продемонстрировала, что репликация ВИЧ bru Vpr + была в 4,3 раза выше в присутствии p300, тогда как репликация ВИЧ bru Vpr практически не изменилась в присутствии p300. (Рис. 6 Б ).Эти результаты демонстрируют, что Vpr и p300 взаимодействуют для увеличения репликации ВИЧ во время острой инфекции в пролиферирующих клетках.

    Рисунок 6

    p300 активирует репликацию ВИЧ bru Vpr + . ( A ) Динамика активации p300 репликации ВИЧ, стимулированной p300. Клетки 293, экспрессирующие молекулу CD4, трансфицировали 6 мкг CMV-p300 или контрольной плазмидой CMV без вставки.Клетки заражали ВИЧ через 24 часа и репликацию измеряли с помощью анализов RT через 0, 2 и 4 дня после заражения. Активность RT выражается в виде средних значений ± стандартное отклонение трех анализов. ( B ) p300 дифференциально регулирует репликацию HIV bru Vpr и HIV bru Vpr + . Клетки UM-316 трансфицировали 0,5 мкг CMV-CD4 и либо 5 мкг контрольного вектора CMV, либо CMV-p300, как указано. Клетки инфицировали ВИЧ bru Vpr или ВИЧ bru Vpr + через 24 часа, и репликацию вируса измеряли на 4 день с помощью анализов RT.Активность RT выражается в виде средних значений ± стандартное отклонение трех анализов.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    В этом исследовании мы показываем, что активация транскрипции ВИЧ с помощью Vpr коррелирует с его способностью арестовывать клетки в G 2 / M и опосредуется модуляцией функции транскрипционного коактиватора, которая реагирует на Cdks. Предыдущие исследования показали, что уровни РНК ВИЧ увеличиваются во время фазы G 2 / M клеточного цикла (40), подтверждая идею о том, что Vpr связывает вирусную транскрипцию с пролиферацией клеток.Таким образом, основная роль Vpr в Т-клетках может заключаться в координации изменений в развитии клеточного цикла с увеличением экспрессии вирусных генов через p300 / CBP.

    Мы обнаружили, что Vpr оказывает свое влияние на энхансер ВИЧ через p300, поскольку ингибирование функции p300 с помощью 12S E1A, но не мутант 12S E1A, неспособный связывать p300, устраняет способность Vpr активировать NF-κB. Кроме того, сверхэкспрессия p300 увеличивает способность Vpr активировать NF-κB и энхансер ВИЧ. Vpr, который ингибирует активность циклина B1⋅Cdc2 (3-5, 28), не связан напрямую с p300, но вместо этого регулирует активность циклина B1⋅Cdc2, которая, как мы показали, взаимодействует с COOH-концом этого соактиватора.В соответствии с этими наблюдениями, Cdc2 с дефицитом киназы стимулирует аналогичное увеличение активации транскрипции ВИЧ и ингибируется 12S E1A дикого типа, но не мутантом связывания p300 12S E1A, обеспечивая связь между Cdc2 и NF-κB посредством p300 в регуляции. транскрипции ВИЧ. Механизм, с помощью которого Vpr ингибирует активность Cdc2, полностью не изучен; однако белок Cdc25, который активирует Cdc2, неактивен в клетках, экспрессирующих Vpr (5), что позволяет предположить, что белки, которые обычно контролируют Cdc2, модулируются Vpr, что, в свою очередь, влияет на транскрипцию ВИЧ.Наши эксперименты с мутантом Vpr E25K, у которого нарушена ядерная локализация, но сохраняется способность арестовывать клетки, предполагают, что Vpr регулирует Cdc2-регуляторные белки, которые находятся в цитоплазме клетки и дополнительно подтверждают косвенную роль Vpr в модуляции Cdk. который взаимодействует с p300 в ядре, влияя на транскрипцию NF-κB.

    В прикрепленных макрофагах, которые не пролиферируют, основная роль Vpr, по-видимому, заключается в локализации преинтеграционного комплекса в ядре (10, 11).Способность Vpr влиять на транскрипцию ВИЧ в макрофагах не проверялась; однако наши результаты предполагают, что Vpr не может в дальнейшем индуцировать функцию усилителя ВИЧ в макрофагах, поскольку его способность останавливать клеточный цикл была бы ненужной в непролиферирующих клетках, а NF-κB уже максимально индуцируется в этих клетках (41). В этих клетках, следовательно, вероятно, что NF-κB уже регулируется клеточными факторами, которые контролируют клеточный цикл и присутствуют в покоящихся клетках с помощью механизмов, независимых от Vpr.Однако, если макрофаги пролиферируют, вполне вероятно, что Vpr может влиять на транскрипцию ВИЧ посредством остановки клеточного цикла. Также недавно сообщалось, что Vpr репрессирует некоторые промоторы цитокинов, регулируемые NF-κB (42). Обобщение этих результатов, выполненных на клетках рабдомиосаркомы, неизвестно и, вероятно, будет отличаться от представленных здесь. В частности, эти эффекты затрагивали различные гены-мишени в клеточной линии, обычно не инфицированной ВИЧ.

    Контроль активности NF-κB с помощью E1A хорошо изучен, а E1A стимулирует развитие клеточного цикла путем связывания и инактивации клеточных белков, таких как pRb, p107 и p300.Напротив, Vpr, по-видимому, ингибирует развитие клеточного цикла и увеличивает активность белков (p300 / CBP), которые ингибируются E1A. В отличие от E1A, Vpr, по-видимому, не связывается с p300, но активирует белок посредством непрямого механизма. Интересно, что p300, по-видимому, является молекулой, которая является точкой преобразования для этих вирусных белков, а также для путей передачи клеточного сигнала (43). Кроме того, p300 регулирует множество факторов транскрипции, не связанных с NF-κB, включая CREB (44), YY1 (45), Myb (46, 47), Jun (48), Fos (49), Sap1a (50), Stat2. (51), миогенные факторы транскрипции (52, 53), ядерные рецепторы (54) и p53 (55, 56), предположительно благодаря его способности регулировать структуру хроматина путем ацетилирования гистонов (57, 58).Также остается вероятным, что p300 может взаимодействовать с другими белками, кодируемыми ВИЧ, которые действуют на разных стадиях жизненного цикла вируса. Например, Tat также участвует в транскрипции ВИЧ и взаимодействует с основными компонентами транскрипционного комплекса. p300, благодаря своей способности реагировать на изменения клеточной пролиферации и клеточной активации, таким образом, может играть важную роль в репликации ВИЧ, координируя изменения в развитии клеточного цикла с транскрипцией специфических вирусных и клеточных генов.

    Благодарности

    Мы благодарим г-жу Донну Гшвенд и г-жу Нэнси Барретт за их помощь в подготовке рукописи и рисунков. Грегори Эндерс, Джим Кох и Эд Харлоу за плазмиду экспрессии Cdc2 с дефицитом киназы, д-р Ксавье Дантинн за помощь в анализе клеточного цикла и д-р. Нилу Перкинсу, Джонатану Беттсу, Марии Атанассиу и другим членам лаборатории Набель за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантами Совета по медицинским исследованиям и Fonds pour la Formation de Chercheurs et l’Aide à la Recerche (E.A.C.), Комиссии по продвижению молодых ученых и ученых Цюрихского университета, Швейцария (M.O.H.), а также стипендии для докторантов из Программы обучения иммунопатологии Мичиганского университета и Института исследований рака (L.K.F.).

    Сноски

    • ↵ ‡ Кому следует обращаться с запросами на перепечатку: Отделения внутренней медицины и биологической химии, Медицинский институт Говарда Хьюза, Медицинский центр Мичиганского университета, 1150 W.Медицинский центр Драйв, 4520 MSRB I, Анн-Арбор, MI 48109-0650. электронная почта: gnabel {at} umich.edu.

    • Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в Proceedings Office.

    • Сокращения: TNF — фактор некроза опухоли; CBP, связывающий белок CREB; LTR, длинный концевой повтор; EMSA, анализ сдвига электрофоретической подвижности; CAT, хлорамфениколацетилтрансфераза; ЦМВ, цитомегаловирус; RSV, вирус саркомы Рауса.

    • Авторские права © 1998, Национальная академия наук

    Белок ВИЧ-1 Vpr подавляет выработку IL-12 из человеческих моноцитов за счет усиления действия глюкокортикоидов: потенциальные последствия активности коактиватора Vpr для врожденного и клеточного дефицита иммунитета, наблюдаемого при ВИЧ-1 Инфекция

    Аннотация

    Белок Vpr ВИЧ-1 обладает коактиваторной активностью рецепторов глюкокортикоидов, сильно повышая чувствительность тканей-мишеней глюкокортикоидов к кортизолу.У пациентов со СПИДом и нормальной секрецией кортизола наблюдаются проявления, совместимые с гиперчувствительностью иммунной системы к глюкокортикоидам, такие как подавление врожденного и клеточного иммунитета. Последнее можно объяснить индуцированным глюкокортикоидами ингибированием цитокиновых сетей, регулирующих врожденный и управляемый Th2 клеточный иммунитет. Мы продемонстрировали, что внеклеточно вводимый белок Vpr дозозависимо потенцировал индуцированное глюкокортикоидом подавление как экспрессии мРНК, так и секреции субъединицы p35 IL-12 и голопротеина IL-12, но не субъединицы IL-12 p40 или IL-10 моноцитами человека. / макрофаги, стимулированные LPS или убитыми нагреванием, фиксированными формалином Staphylococcus aureus (штамм Cowan 1).Этот эффект подавлялся антагонистом рецепторов глюкокортикоидов RU 486. Кроме того, Vpr изменял экспрессию дополнительных пяти генов, чувствительных к глюкокортикоидам, в том же направлении, что и дексаметазон, и был активен в потенциале активации trans , но не trans . -репрессия, свойства глюкокортикоидного рецептора на ядерном факторе κB- или активация простых промоторов, регулируемых белком 1. Таким образом, внеклеточный Vpr усиливает подавляющее действие активируемого лигандом глюкокортикоидного рецептора на секрецию IL-12 моноцитами / макрофагами человека.Благодаря этому эффекту Vpr может способствовать подавлению врожденного и клеточного иммунитета у ВИЧ-1-инфицированных людей и пациентов со СПИДом.

    Инфекция ВИЧ-1 приводит к снижению числа CD4 Т-клеток и нарушению клеточного иммунного ответа, что делает возможным развитие СПИДа, за счет уничтожения этих клеток вирусной инфекцией (1, 2, 3). Параллельно, дефицит врожденного и клеточного иммунитета, наблюдаемый у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, также характеризуется подавлением цитолитической активности NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также ингибированием пролиферации Т-клеток и реакций гиперчувствительности замедленного типа (3). ).Одним из важных механизмов этой иммунной дисрегуляции является избирательное повреждение моноцитов / макрофагов, дендритных клеток и лимфоцитов Th2 и их цитокиновых сетей (4, 5). Таким образом, продукция IL-12 и IFN-γ NK и T-клетками, двумя цитокинами, которые регулируют и способствуют врожденному, клеточному и противовирусному иммунитету, снижается во время инфекции ВИЧ-1 (6).

    Цитокины, ответственные за поляризацию ответов Th-типа, представляют особый интерес при СПИДе (7). IL-12 является центральным индуктором Th2-ответа и клеточного иммунитета, стимулируя продукцию IFN-γ NK- и T-клетками и индуцируя дифференцировку и пролиферацию клеток Th2-типа (8).Таким образом, этот цитокин, который продуцируется APC врожденной иммунной системы, такой как моноциты / макрофаги и дендритные клетки, по-видимому, имеет решающее значение для развития клеточного и, следовательно, противовирусного иммунитета (9, 10, 11). IL-12 представляет собой гетеродимерную молекулу массой 75 кДа, состоящую из субъединиц p35 и p40, кодируемых двумя отдельными генами (12, 13, 14). Как p35, так и p40 активируются в ответ на различные стимулы, включая внутриклеточные бактерии или вирусы, некоторые эндотоксины, такие как LPS, и внутриклеточные белки, выделяемые некротическими клетками (14, 15, 16, 17, 18, 19).IFN-γ, с другой стороны, не стимулирует выработку IL-12, но действует как костимулирующий сигнал, заставляя клетки производить большее количество IL-12 после соответствующих стимулов (20).

    PBMC или культуры цельной крови от ВИЧ-инфицированных людей выражают заметную недостаточность продукции как IL-12 p40, так и p70 по сравнению с клетками от здоровых людей (6). Этот дефицит наблюдается по широкому спектру стимулов, исходящих от инфекционных патогенов (21). Нарушение продукции IL-12 у ВИЧ-1-инфицированных лиц, по-видимому, является избирательным, поскольку не было обнаружено изменений в секреции TNF-α, IL-1β или IL-10 (22).Низкая продукция IL-12 может быть одним из критических факторов нарушения врожденного и клеточного иммунитета у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, поскольку экзогенный IL-12 способен частично восстанавливать подавленную пролиферацию T-клеток, продукцию T- и NK-клеток. IL-2 и IFN-γ, а также литической активности NK в клетках ВИЧ-1-инфицированных людей (23). Однако механизм (ы), лежащий в основе снижения выработки IL-12 у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, остается плохо изученным.

    ВИЧ-1 кодирует 96-аминокислотный вспомогательный белок, связанный с вирионом, Vpr, который выполняет множество разнообразных функций (2, 24, 25).Vpr усиливает репликацию вируса в клеточных линиях, происходящих из моноцитов и лимфоцитов (26, 27, 28), и действует как активатор транскрипции нескольких вирусных промоторов, включая промотор длинных концевых повторов ВИЧ-1 (29, 30, 31, 32) , и вызывает остановку клеточного цикла в фазе G 2 / M (33, 34, 35). Vpr также может способствовать ядерной транслокации прединтеграционного комплекса ВИЧ-1, возможно, помогая ВИЧ-1 эффективно инфицировать неделящиеся клетки, такие как моноциты / макрофаги и лимфоциты в состоянии покоя (36, 37, 38).Поскольку Vpr связан с вирионом, он доставляется к инфицированным клеткам вместе с вирусной частицей на ранней стадии ВИЧ-1-инфекции, поражая локальные инфицированные лимфоциты, моноциты / макрофаги и дендритные клетки (39). Однако тот же вирусный полипептид также экспрессируется и секретируется инфицированными клетками хозяина после успешной интеграции провируса ВИЧ-1 в геном хозяина (40). Действительно, этот белок обнаруживается во внеклеточных жидкостях ВИЧ-1-инфицированных пациентов, таких как плазма и спинномозговая жидкость.Поскольку внеклеточно вводимый синтетический Vpr является биоактивным, вызывая остановку клеточного цикла за счет проникновения через клеточную мембрану, Vpr, секретируемый во внеклеточное пространство, может оказывать свое влияние на проксимальные и дистальные клетки и ткани, которые не инфицированы вирусом (41).

    Ранее мы сообщали, что Vpr резко усиливает активность глюкокортикоидных рецепторов (GR). 2 в нескольких различных клеточных линиях, функционируя как мощный коактиватор GR, через классический мотив сигнатуры коактиватора LXXLL (30).Мы также продемонстрировали, что Vpr ведет себя как адаптерная молекула между связанными с промотором факторами транскрипции и коактиваторами p300 / CBP в промоторе, чувствительном к глюкокортикоидам (42). Мы также сообщили, что промоторы, чувствительные к ядерным рецепторам, использовали тот же набор коактиваторов и комплексов транскрипции-элонгации, что и длинный концевой повтор ВИЧ-1, и что Vpr усиливал оба типа активности промотора через один и тот же механизм, взаимодействуя с коактиваторами хозяина (43). .

    Глюкокортикоиды сильно ингибируют продукцию ИЛ-12 периферическими моноцитами / макрофагами, и было высказано предположение, что это основной механизм, ответственный за их избирательное подавление функций Th2 и клеточного иммунитета (44, 45, 46).Поскольку Vpr действует как усилитель активности глюкокортикоидов, мы предположили, что этот вирусный белок может способствовать нарушению выработки IL-12, наблюдаемому у пациентов со СПИДом. Мы обнаружили, что внеклеточно введенный Vpr подавляет продукцию как мРНК, так и белка IL-12, но не IL-10, из периферических моноцитов человека. Этот вирусный пептид усиливал действие дексаметазона на продукцию IL-12, и этот эффект подавлялся антагонистом глюкокортикоидов RU 486. Действие Vpr и дексаметазона на экспрессию других мРНК, регулируемых глюкокортикоидами, было сходным.Эти результаты показывают, что Vpr может ингибировать выработку IL-12 за счет усиления эндогенного действия глюкокортикоидов, потенциально способствуя дефициту врожденного и клеточного иммунитета у ВИЧ-1-позитивных людей и пациентов со СПИДом.

    Материалы и методы

    Очистка рекомбинантного Vpr

    Рекомбинантный белок Vpr был получен с использованием системы экспрессии бакуловируса. КДНК Vpr амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров 5′-ATGATAGGATCCATGGAACAAGCCCCAGAAGACC-3 ‘и 5′-ACATGTAAGCTTCTAGGATCTACTGGCTC-3’ из pCDNA3-Vpr, который содержит последовательность Vpr дикого типа штамма NLA1 ВИЧ-1 (30).PFastBacHTb-Vpr был сконструирован путем субклонирования кДНК Vpr в сайты Bam HI и Hin dIII pFastBacHTb (Life Technologies, Gaithersburg, MD) и экспрессировал меченный шестью гистидином белок Vpr в клетках насекомых. Вирусы, содержащие последовательность His-Vpr, выделяли из клеток Dh20bac (Life Technologies), трансформированных pFastBacHTb-Vpr. Затем клетки Sf9 инфицировали такими вирусами, и лизаты клеток и культуральную среду собирали для тестирования экспрессии Vpr. В лизатах клеток было обнаружено значительное количество His-Vpr, и последующую очистку проводили с использованием осадка клеток.

    Метод очистки рекомбинантного His-Vpr заключается в следующем. Осадки замороженных клеток ресуспендировали в буфере для лизиса (20 мМ фосфат калия (pH 7,4), 0,5 М NaCl, 5 мМ имидазол, 1% Твин 20, 1 мкг / мл апротинина, 1 мкг / мл лейпептина и 1 мМ PMSF) и обрабатывали ультразвуком. нарушить работу клеточных мембран. Гомогенаты центрифугировали при 14000 об / мин в течение 15 минут, супернатанты собирали и наносили на аффинную колонку с His-tag (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).His-Vpr элюировали с использованием буфера для элюции (20 мМ фосфат калия (pH 7,4), 0,5 М NaCl, 1 мкг / мл апротинина, 1 мкг / мл лейпептина, 1 мМ PMSF и 200 или 400 мМ имидазол) и затем концентрировали. с использованием Centriprep YM-10 (номинальный предел молекулярной массы, 10000) и YM-30 (номинальный предел молекулярной массы, 30 000; Millipore, Bedford, MA). Фракцию, профильтрованную с помощью YM-10, использовали для растворения обратной транскриптазы ВИЧ-1 (Pol; AIDS Research and Reagent Program, National Institutes of Health, Bethesda, MD), которую использовали в качестве контроля для очищенного His-Vpr.Во всех описанных выше процедурах мы не использовали стероиды, в том числе глюкокортикоиды. Набор для окрашивания серебром SilverXpress (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) использовали для визуализации протеинов на геле SDS-PAGE в соответствии с инструкциями производителя, а гели сушили на бумажных фильтрах. His-Vpr, выделенный на геле SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и подвергали блоттингу анти-Vpr Ab (подарок д-ра Дж. Б. Коппа, Национальные институты здравоохранения) или анти-His Ab (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния).

    ELISA для измерения цитокинов

    IL-12 p70, IL-12 p40 и IL-10 измеряли с помощью специальных наборов ELISA, приобретенных в R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Оптическую плотность каждого образца измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов (модель 550; Bio-Rad, Ричмонд, Калифорния), и результаты преобразовывали в концентрацию цитокинов (в пикограммах на миллилитр) с использованием стандартной кривой, рассчитанной с помощью программного обеспечения для анализа данных Microplate Manager III Macintosh. (Био-Рад).

    Отмывание и культивирование моноцитов от человека-донора

    Человеческие моноциты были получены от ВИЧ-1-отрицательных здоровых доноров. Мононуклеарные клетки выделяли в среде для разделения лимфоцитов, и моноциты очищали с помощью центрифугирования в противотоке, как сообщалось ранее (47). Моноциты культивировали при 5 × 10 5 клеток / мл в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 1% глутамина и 50 мкг / мл гентамицина с получением конечного объема 1 мл в 24-луночных планшетах.В отдельном эксперименте FBS, обработанный декстраном / древесным углем, использовали вместо обычного FBS. Клетки праймировали 100 нг / мл IFN-γ (R&D Systems) и культивировали в присутствии возрастающих концентраций Vpr в отсутствие или в присутствии нескольких концентраций дексаметазона и / или RU 486 с последующей стимуляцией 1 мкг / мл ЛПС или 0,1% убитого нагреванием, фиксированного формалином Staphylococcus aureus (штамм Cowan 1; SAC) в 5% CO 2 при 37 ° C в течение 18 часов. После инкубации планшеты центрифугировали, бесклеточную среду собирали и хранили при -70 ° C для определения компонентов p70 и p40 IL-12 и IL-10.Чтобы свести к минимуму разброс результатов от разных доноров, эксперименты повторяли не менее четырех раз с использованием периферических моноцитов от разных людей. Среднее значение ± стандартная ошибка LPS-индуцированных уровней p70, p40 и IL-10 составило 403 ± 16,9, 8956 ± 255 и 125,2 ± 5 пг / мл соответственно.

    Определение количества мРНК, регулируемых глюкокортикоидами, с помощью ПЦР в реальном времени

    Человеческие моноциты культивировали при 1,5 × 10 7 клеток в присутствии 10 нг / мл Vpr и / или 10 -8 M дексаметазона с последующей стимуляцией 1 мкг / мл LPS.Тотальную РНК выделяли с использованием TRIzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD) в соответствии с инструкциями производителя. КДНК подвергали обратной транскрипции с помощью реагентов обратной транскрипции TaqMan (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Уровни мРНК p35 и p40 и IL-10 определяли с использованием планшета для экспрессии генов цитокинов TaqMan I (PE Applied Biosystems) в системе определения последовательности ABI PRISM 7700, как сообщалось ранее. уровни мРНК человеческого CD44, человеческого Toll-подобного рецептора 4 и индоламин-2,3-диоксигеназы; рецептор макрофагов человека со структурой коллагеназы и тромбоспондин 1, которые отрицательно или положительно регулируются глюкокортикоидами, соответственно, были определены с использованием наборов праймеров, как описано ранее (48).

    Транзиторная трансфекция и репортерный анализ

    Клетки HeLa карциномы шейки матки человека хранили в среде DMEM, содержащей 10% FBS, 50 мкг / мл стрептомицина и 50 Ед / мл пенициллина. Их трансфицировали 1,0 мкг / лунку pCDNA3-Vpr вместе с 1,5 мкг / лунку (IκB) 3 -люциферазы (Luc) или AP-1-tk81-Luc и 0,5 мкг / лунку pSV40-β-Gal с помощью липофектин (Life Technologies), как описано ранее (30). pRSV-RelA (0,5 мкг / лунку) или тетрадеканоил форболацетат (10 -9 M) котрансфицировали или добавляли для исследования активности NF-κB или AP-1 соответственно.Чтобы сохранить такое же количество ДНК, были добавлены Bluescript SK + и / или pCDNA3. После трансфекции среду заменяли обычной средой, и клетки культивировали еще 24 часа. Затем клетки стимулировали 1 × 10 -6 M дексаметазоном или носителем, и лизаты клеток собирали для анализов люциферазы и β-галактозидазы еще через 24 часа. Эти ферментативные активности определяли, как описано ранее (49). pRSV-RelA, который экспрессирует компонент p65 NF-κB, был получен от Национального института здравоохранения по исследованию СПИДа и программе эталонных реагентов.pCDNA3-Vpr, которая экспрессирует Vpr дикого типа, была описана ранее. (IκB) 3 -Luc, который содержит три κB-чувствительных элемента от промотора IκB, был подарком доктора Т. Фудзиты (Токийский столичный институт медицинских наук, Токио, Япония). AP-1-tk81-Luc, который имеет четыре AP-1-чувствительных элемента перед проксимальной частью промотора тимидинкиназы простого герпеса, был подарком д-ра К. Бамбергера (IHF, Институт исследований гормонов и фертильности, Гамбург. , Германия). Промотор-люцифераза вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV) (pMMTV-Luc), который имеет полноразмерный промотор MMTV, который содержит четыре глюкокортикоид-чувствительных элемента (GRE), был предоставлен доктором.Г. Л. Хагер (Национальный институт рака, Бетесда, Мэриленд). Bluescript SK + , pCDNA3 и pSV40-β-галактозидаза были приобретены у компаний Stratagene (Ла-Хойя, Калифорния), Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) и Promega (Мэдисон, Висконсин), соответственно.

    Статистический анализ

    Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Стьюдента t после соответствующей поправки Бонферрони.

    Результаты

    Vpr подавляет продукцию LPS-индуцированного IL-12 p70, но не IL-12 p40 или IL-10, в моноцитах человека

    Очищенный белок Vpr, полученный из клеток насекомых, показал единственную полосу с M r 17 кДа, обнаруженную методом окрашивания серебром на геле SDS-PAGE (рис.1⇓ А ). Полоса белка с тем же M r была обнаружена с помощью анти-Vpr (i) или анти-His (ii) Ab в Вестерн-блоттинге (фиг. 1⇓ B ). Добавление увеличивающихся концентраций His-Vpr приводило к дозозависимому ингибированию продукции IL-12 p70 из LPS-стимулированных моноцитов человека (фиг. 2⇓ A ). Очень низкие концентрации Vpr, такие как 0,1 нг / мл, уже подавляли продукцию IL-12 до 84% от исходного уровня. Эффект Vpr становился более значительным при концентрациях 1 и 10 нг / мл с выработкой цитокинов 73 и 65% от исходного уровня соответственно.Та же самая концентрация контрольного белка, Pol HIV-1, растворенного в жидкости пустот от концентрации YM-10 во время очистки Vpr, не влияла на продукцию p70. Чтобы определить, ограничиваются ли эффекты Vpr на продукцию IL-12 стимулированным LPS IL-12, моноциты обрабатывали SAC вместо LPS и демонстрировали такой же эффект (фиг. 2⇓ B ).

    РИСУНОК 1.

    Очищенный белок Vpr, продуцируемый клетками насекомых, инфицированных бакуловирусом. , His-Vpr детектировали как одну полосу в геле SDS-PAGE.Один микрограмм очищенного His-Vpr загружали и прогоняли в 10-20% геле SDS-PAGE. Затем полосу белка визуализировали с помощью набора для окрашивания серебром SilverXpress, и гель сушили. B , белок Vpr был обнаружен с помощью анти-Vpr и анти-His-АБ в Вестерн-блот-анализе. Аликвоту 100 нг очищенного Vpr и контрольного белка Pol загружали и разделяли на 10-20% SDS-PAGE геле. Белки наносили на нитроцеллюлозную мембрану и определяли с помощью анти-Vpr (i) или анти-His (ii) Abs.

    ФИГУРА 2.

    A , Vpr подавлял секрецию IL-12 p70 LPS-стимулированными периферическими моноцитами человека. Периферические моноциты человека инкубировали с возрастающими концентрациями Vpr или 10 нг / мл Pol. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка для каждого результата по сравнению со значениями, полученными только при стимуляции LPS. ∗, p <0,05; ∗∗, p <0,01 (по сравнению с исходным уровнем). B , Vpr подавлял секрецию IL-12 p70 из периферических моноцитов человека, стимулированных SAC в дополнение к LPS.Периферические моноциты человека инкубировали с 10 нг / мл Vpr с LPS или SAC. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка каждого результата по сравнению со значениями, полученными при стимуляции LPS. ∗∗, p <0,01 (по сравнению с исходным уровнем). C и D , Vpr не изменяли секрецию IL-12 p40 ( C ) и IL-10 ( D ) периферическими моноцитами человека, стимулированными LPS. Периферические моноциты человека инкубировали с возрастающими концентрациями Vpr или 10 нг / мл Pol.Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка каждого результата по сравнению со значениями, полученными при стимуляции LPS.

    Мы также протестировали влияние Vpr на продукцию IL-12 p40 и IL-10 в той же системе анализа. Ни Vpr, ни пол ВИЧ-1 не влияли на продукцию этих молекул в LPS-стимулированных моноцитах (рис. 2, C и D ). Поскольку мы сообщили, что Vpr усиливает глюкокортикоидный эффект, действуя как коактиватор GR (30), мы исследовали влияние дексаметазона на продукцию IL-12 p70 и p40 и IL-10 для сравнения с активностью Vpr (рис.3⇓, A – C ). Дексаметазон в концентрации 10 -8 M подавлял p70 и p40 IL-12, но не продукцию IL-10 в моноцитах, обработанных LPS, как мы сообщали ранее. Это было эквивалентно 10 нг / мл Vpr для подавления продукции этих цитокинов. RU 486, конкурентный антагонист GR, в концентрации 10 -6 M не влиял на продукцию ни одного из исследованных цитокинов, в то время как он полностью отменял подавляющее действие дексаметазона на p70.

    РИСУНОК 3.

    Vpr изменял продукцию IL-12 p70, усиливая действие глюкокортикоидов. A – C , дексаметазон при 10 −8 M подавлял продукцию IL-12 p70 ( A ) и IL-12 p40 ( B ), но не IL-10 ( C ). , стимулированными LPS периферическими моноцитами человека, а RU 486 аннулировал его эффекты. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка каждого результата по сравнению со значениями, полученными при стимуляции LPS.∗∗, p <0,01 (по сравнению с исходным уровнем). D , RU 486 отменял Vpr-индуцированное подавление продукции IL-12 p70 периферическими моноцитами человека, стимулированными LPS. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка каждого результата по сравнению со значениями, полученными при стимуляции LPS. E , Vpr не смог подавить продукцию p70 IL-12 в среде с FBS, обработанным декстраном / древесным углем. LPS-стимулированные периферические моноциты человека культивировали в среде, содержащей обычный FBS или FBS, обработанный декстрановым углем, и инкубировали с 10 нг / мл Vpr.Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка каждого результата по сравнению со значениями, полученными при стимуляции LPS. F , Vpr сдвинул кривую титрования дексаметазоном продукции IL-12 p70 влево и вниз в LPS-стимулированных периферических моноцитах человека. LPS-стимулированные периферические моноциты человека инкубировали с возрастающими концентрациями дексаметазона в присутствии (▪) или в отсутствие (○) 1 нг / мл Vpr. Каждая точка представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка каждого результата по сравнению со значениями, полученными при стимуляции LPS.∗, p <0,05; ∗∗, p <0,01 (по сравнению со значениями, полученными с 10 −12 M дексаметазоном).

    Vpr усиливает действие эндогенных глюкокортикоидов и потенцирует действие дексаметазона на продукцию IL-12

    Для дальнейшего исследования гипотезы о том, что Vpr действует путем модуляции активности GR, мы протестировали RU 486 на действие Vpr в той же экспериментальной процедуре. RU 486 при 10 −6 M полностью устраняет подавление Vpr-индуцированной продукции p70, указывая на то, что Vpr усиливает путь (пути), регулируемый GR (рис.3⇑ D ). Поскольку вероятно, что Vpr усиливает глюкокортикоидный эффект, присутствующий в обычном FBS, мы протестировали влияние Vpr на продукцию IL-12 p70 в среде с добавлением FBS, обработанного декстраном / древесным углем. Как и ожидалось, Vpr не подавлял p70, в то время как он был полностью активен в среде, содержащей FBS (рис. 3⇑ E ).

    Мы также протестировали эффекты Vpr в присутствии возрастающих концентраций дексаметазона. Инкубация этих клеток с 1 нг / мл Vpr сдвигала кривую доза-ответ дексаметазона для продукции p70 влево и вниз, предполагая, что она усиливала эффект введенного дексаметазона на продукцию p70.Эффект Vpr был особенно значительным при концентрациях дексаметазона 10 −10 −10 −9 M, которые эквивалентны физиологическим концентрациям кортизола у людей (рис. 3⇑ F ).

    Vpr регулирует экспрессию мРНК генов, чувствительных к глюкокортикоидам, включая IL-12 p35, но не p40

    Затем мы исследовали влияние Vpr на экспрессию мРНК IL-12 p40 и p35 и IL-10 в периферических моноцитах человека с использованием планшета I.Экспрессия мРНК IL-12 p35 подавлялась Vpr, в то время как экспрессия IL-12 p40 и IL-10 не изменялась. В параллельном эксперименте 10 -8 M дексаметазон подавлял экспрессию мРНК IL-12 p35 и p40, но не изменял количество мРНК IL-10. Vpr и 10 -8 M дексаметазон кооперативно подавляли уровни мРНК IL-12 p35 (рис. 4⇓). Мы также измерили концентрации мРНК CD44, Toll-подобного рецептора 4 и индоламин-2,3-диоксигеназы, все из которых сильно подавляются глюкокортикоидами, а также рецептора макрофагов с коллагеновой структурой и тромбоспондина 1, которые сильно стимулируются этими гормонами.Концентрация 10 нг / мл Vpr или 10 -8 M дексаметазона изменяла экспрессию всех протестированных мРНК в том же направлении, предполагая, что Vpr также влияет на экспрессию других генов, регулируемых глюкокортикоидами (рис. 5⇓).

    РИСУНОК 4.

    Vpr подавлял продукцию мРНК IL-12 p35, но не IL-12 p40 и IL-10, в LPS-стимулированных периферических моноцитах человека. Периферические моноциты человека инкубировали с носителем (-), 10 -8 M дексаметазоном (Dex) или 10 нг / мл Vpr и стимулировали LPS.Собирали тотальную РНК и определяли количество мРНК указанных полипептидов с использованием процедуры TaqMan PCR. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка каждого результата по сравнению со значениями, полученными при стимуляции LPS. ∗∗, p <0,01 (по сравнению с исходным уровнем).

    РИСУНОК 5.

    Vpr и дексаметазон вызывали однонаправленные изменения экспрессии генов, регулируемых глюкокортикоидами. LPS-стимулированные периферические моноциты человека инкубировали с носителем (-), 10 нг / мл Vpr или 10 -8 M дексаметазоном (Dex).Собирали тотальную РНК и определяли количество мРНК указанных полипептидов с использованием процедуры TaqMan PCR. Столбики представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка каждого результата по сравнению со значениями, полученными при стимуляции LPS. ∗∗, p <0,01 (по сравнению с исходным уровнем).

    Vpr не влияет на

    trans -репрессию GR, которая опосредуется белок-белковыми взаимодействиями с NF-κB и AP-1

    Vpr подавлял продукцию мРНК IL-12 p35, но не продукцию IL-12 p40, и он был активен как в отношении положительно, так и отрицательно регулируемых генов дексаметазоном.Поскольку GR имеет две основные активности, GRE-опосредованную транс -активацию промоторов, чувствительных к глюкокортикоидам и транс -репрессию промоторов, регулируемую другими факторами транскрипции посредством белок-белковых взаимодействий (50), указанное несоответствие может быть результатом избирательное действие Vpr на эти активности GR. Ранее мы показали, что Vpr усиливает активацию trans с помощью GR за счет своей коактиваторной активности (30). Здесь мы протестировали Vpr на GR-индуцированной транс- -репрессии промоторов, чувствительных к NF-κB и AP-1, в системах анализа репортеров на основе временной трансфекции.Промотор p40 IL-12 содержит функциональные элементы, реагирующие на NF-κB и AP-1, и вмешательство глюкокортикоидов в транскрипционную активность этих факторов может объяснить их подавляющий эффект дексаметазона на экспрессию мРНК p40 (51, 52). Интересно, что Vpr не влияет на дексаметазон-супрессивные активности промотора NF-κB или AP-1, в то время как он усиливает активность GR на промоторе MMTV, как сообщалось ранее (30) (рис. 6). Эти результаты показывают, что Vpr эффективен в первую очередь в GRE-опосредованной активности активации trans , но, по-видимому, не влияет на его trans -репрессивные действия на другие факторы транскрипции, такие как NF-κB и AP-1.

    РИСУНОК 6.

    Vpr не изменял trans -репрессивную активность GR на промоторах, реагирующих на NF-κB и AP-1. Эффект Vpr исследовали на чувствительных промоторах MMTV- ( A ), NF-κB- ( B ) и AP-1- ( C ) в клетках HeLa. Столбики показывают среднее значение ± стандартная ошибка люциферазы, нормализованная для активности β-галактозидазы в отсутствие или в присутствии 10 -6 M дексаметазона. ∗∗, p <0,01; п.с., p > 0,05 (по сравнению с исходным уровнем).

    Обсуждение

    Мы продемонстрировали, что внеклеточно введенный Vpr умеренно подавлял продукцию IL-12, измеренную как димерная молекула p70 из IFN-γ-примированных, LPS-стимулированных периферических моноцитов человека, что предполагает последующее подавление врожденного клеточного иммунитета и клеточного иммунитета Th2-типа этим вирусным белком. Vpr, с другой стороны, не изменяет продукцию IL-10, который играет критическую роль в поддержании гуморального иммунитета Th3-типа.Эффект Vpr на продукцию IL-12 и IL-10 и экспрессию мРНК был подобен, но не идентичен эффекту дексаметазона (44, 46). Антагонист GR, RU 486, или использование FBS, обработанного декстраном / древесным углем, который удаляет стероидные гормоны из сыворотки, полностью устраняет влияние Vpr на секрецию IL-12, а 1 нг / мл Vpr сдвигает кривую доза-ответ дексаметазона. на продукцию IL-12 влево и вниз, предполагая, что этот вирусный белок сделал периферическую секрецию IL-12 моноцитами / макрофагами человека более чувствительными к подавляющему действию глюкокортикоидов.Кроме того, Vpr и дексаметазон индуцировали согласованные изменения мРНК в пяти различных генах, чувствительных к глюкокортикоидам. Эти результаты убедительно подтверждают гипотезу о том, что внеклеточный Vpr проникает в клетки человека и подавляет продукцию IL-12 за счет усиления связанной с лигандом активности GR.

    Vpr усиливает активность глюкокортикоидов, подавляя экспрессию p35 IL-12, но не p40. Поскольку субъединица p35 IL-12 продуцируется в гораздо меньших количествах, чем субъединица p40, ВИЧ-1 может эффективно подавлять продукцию p70 IL-12 путем подавления этого ограничивающего скорость компонента IL-12 (18).В то время как Vpr не изменял уровни мРНК или белка IL-12 p40, однако, дексаметазон менял. Промотор гена субъединицы p40 IL-12 содержит функциональные цис--действующих последовательностей, включая элементы, отвечающие за NF-κB и AP-1, которые являются ключевыми факторами транскрипции при воспалении (20, 51, 52, 53). Поскольку глюкокортикоиды вызывают сильное ингибирование NF-κB и AP-1 за счет белок-белковых взаимодействий между лиганд-активированным GR и каждым из этих факторов транскрипции, вероятно, что глюкокортикоиды подавляют продукцию p40, подавляя активность этих факторов (54).

    Механизм подавления промотора p35 глюкокортикоидами изучен недостаточно. У человека существует два типа транскриптов p35, которые регулируются вышестоящим промотором, характеризующимся островком CpG, и нижележащим промотором, содержащим ТАТА-бокс (55). Первый активен в линиях В-клеток, трансформированных EBV, тогда как последний играет главную роль в моноцитах / макрофагах. Последний промотор содержит IFN-чувствительные элементы, которые сильно влияют на экспрессию p35 (56).Тот же промотор также содержит несколько полу-GRE и чувствительных элементов для NF-κB, AP-1, Sp 1 и C / EBP; однако функциональное значение этих последовательностей еще не определено (56). Поскольку наши результаты показывают, что Vpr не влияет на супрессивный эффект GR на простые NF-κB- или AP-1-чувствительные промоторы (рис. 6⇑), мы пришли к выводу, что Vpr не может в целом нарушать правильную функцию транскриптосомы, образованной эти факторы транскрипции; однако функциональное значение полу-GRE и влияние на них Vpr неизвестны.Наши данные предполагают, что Vpr может усиливать trans -активационный эффект глюкокортикоидов на транскрипцию гена (ов), кодирующего белок (белки), который снижает активность промотора p35 и, следовательно, косвенно подавляет экспрессию p35 и продукцию IL-12.

    Vpr включается в вирион, и его активность может быть важной на ранних стадиях жизненного цикла вируса (39). Хотя мы не тестировали активность ассоциированного с вирионом Vpr, этот белок, высвобождаемый из вириона или продуцируемый de novo заражающим вирусом, может ингибировать секрецию IL-12 моноцитами / макрофагами или дендритными клетками в локальных участках инфекции.Таким образом, Vpr может способствовать неэффективной активации NK-клеток, блокаде распознавания Ag и недостаточной продукции сенсибилизированных цитотоксических Т-лимфоцитов с антивирусной специфичностью, которые характерны для ВИЧ-1-инфицированных пациентов со СПИДом. Благодаря этим эффектам он может сыграть важную роль в успешном инфицировании и распространении вируса ВИЧ-1. Мы также продемонстрировали, что внеклеточный Vpr изменяет экспрессию дополнительных пяти регулируемых глюкокортикоидами генов в том же направлении, что и дексаметазон.Этот результат указывает на то, что Vpr может регулировать многочисленные гены, чувствительные к глюкокортикоидам, независимо от фактического инфицирования клеток, посредством усиления активности GR trans по активации даже при нормальных или низких концентрациях циркулирующих глюкокортикоидов. Действительно, у больных СПИДом есть несколько проявлений, наблюдаемых при типичных состояниях избытка глюкокортикоидов, таких как миопатия, мышечное истощение, дислипидемия и инсулинорезистентность, связанная с висцеральным ожирением, в дополнение к иммуносупрессии, подобной той, которая вызывается фармакологическими уровнями глюкокортикоидов (57, 58, 59). , 60, 61, 62, 63, 64).Возможно, внеклеточный Vpr может способствовать развитию этих патологических состояний; таким образом, ингибирование активности коактиватора Vpr путем нейтрализации Ab до Vpr или введения RU 486 может помочь улучшить клинические проявления и течение болезни у пациентов со СПИДом.

    Благодарности

    Мы благодарим доктора Г. Н. Павлакиса за полезные обсуждения, доктора Дж. Б. Коппа за предоставление анти-Vpr Ab и докторов. Т. Фуджита, К. Бамбергер и Г. Л. Хагер за предоставленные плазмиды.Мы также благодарим доктора Дж. Сидикки и К. Захмана за превосходную техническую помощь.

    Сноски

    • №1 Направляйте корреспонденцию и запросы на перепечатку доктору Томосигэ Кино, отделение детской и репродуктивной эндокринологии, Национальный институт здоровья детей и развития человека, Национальные институты здравоохранения, здание 10, комната 9D42, 10 Center Drive, MSC 1583, Bethesda, MD 20892–1853. Электронный адрес: кинот {at} mail.nih.gov

    • ↵2 В статье использованы сокращения: GR, глюкокортикоидный рецептор; GRE, элемент, реагирующий на глюкокортикоиды; MMTV, вирус опухоли молочной железы мыши; SAC, Staphylococcus aureus (штамм Cowan 1).

    • Получено 18 июля 2002 г.
    • Принято 25 сентября 2002 г.
    • Авторское право © 2002 Американская ассоциация иммунологов

    Ссылки

    1. Fahey, J. L., J. M. Taylor, R. Detels, B. Hofmann, R. Melmed, P. Nishanian, J. V. Giorgi. 1990. Прогностическое значение клеточных и серологических маркеров при инфицировании вирусом иммунодефицита человека 1 типа. N. Engl.J. Med. 322: 166

    2. Павлакис, Г. Н. 1996. Молекулярная биология ВИЧ-1. В. Т. ДеВита, С. Хеллман и С. А. Розенберг, ред. СПИД: диагностика, лечение и профилактика 45 Липпинкотт Рэйвен, Филадельфия.

    3. Ганди, Р. Т., Б. Д. Уокер. 2002. Иммунологический контроль ВИЧ-1. Анну. Rev. Med. 53: 149

    4. Клеричи, М., М. Л. Фузи, С. Руццанте, С. Пикони, М. Биазин, Д. Ариенти, Д. Трабаттони, М. Л. Вилла. 1997. Цитокины типа 1 и типа 2 при ВИЧ-инфекции — возможная роль в апоптозе и прогрессировании заболевания. Анна. Med. 29: 185

    5. Коупленд, К. Ф., Дж. Л. Хини. 1996. Активация Т-хелперных клеток и ретровирусный патогенез человека. Microbiol. Ред. 60: 722

    6. Ma, X., L. J. Montaner.2000. Провоспалительный ответ и экспрессия IL-12 при ВИЧ-1 инфекции. J. Leukocyte Biol. 68: 383

    7. Романьани, С., Дж. Дель Прете, Р. Манетти, А. Равина, Ф. Аннунциато, М. Де Карли, М. Маццетти, М. П. Пиччинни, М. М. Д’Элиос, П. Парронки и др. 1994. Роль цитокинов Th2 / Th3 в ВИЧ-инфекции. Иммунол. Ред. 140: 73

    8. Trinchieri, G .. 1998. Провоспалительные и иммунорегуляторные функции интерлейкина-12.Int. Rev. Immunol. 16: 365

    9. D’Andrea, A., M. Rengaraju, NM Valiante, J. Chehimi, M. Kubin, M. Aste, SH Chan, M. Kobayashi, D. Young, E. Nickbarg, et al. 1992. Производство естественный фактор стимуляции клеток-киллеров (интерлейкин 12) мононуклеарными клетками периферической крови. J. Exp. Med. 176: 1387

    10. Heufler, C., F. Koch, U. Stanzl, G. Topar, M. Wysocka, G.Тринкьери, А. Энк, Р. М. Штейнман, Н. Романи, Г. Шулер. 1996. Интерлейкин-12 продуцируется дендритными клетками и опосредует развитие Т-хелперов 1, а также продукцию интерферона-γ клетками Т-хелперов 1. Евро. J. Immunol. 26: 659

    11. Chehimi, J., C. Paganin, I. Frank, S. Chouaib, S. Starr, G. Trinchieri. 1995. Интерлейкин-12 в патогенезе и терапии ВИЧ-инфекции. Res. Иммунол. 146: 605

    12. Кобаяши, М., Л. Фитц, М. Райан, Р. М. Хьюик, С. К. Кларк, С. Чан, Р. Лаудон, Ф. Шерман, Б. Перуссия, Г. Тринкьери. 1989. Идентификация и очистка естественного фактора стимуляции клеток-киллеров (NKSF), цитокина с множественными биологическими эффектами на лимфоциты человека. J. Exp. Med. 170: 827

    13. Гублер У., А. О. Чуа, Д. С. Шёнхаут, К. М. Дуайер, В. МакКомас, Р. Мотика, Н. Набави, А. Г. Волицки, П. М. Куинн, П. К. Фамиллетти и др. 1991.Совместная экспрессия двух различных генов необходима для выработки секретируемого биоактивного цитотоксического фактора созревания лимфоцитов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 88: 4143

    14. Ма, X., Х. Риман, Г. Гри, Г. Тринкьери. 1998. Положительная и отрицательная регуляция экспрессии гена интерлейкина-12. Евро. Сеть цитокинов 9: 54

    15. Бабик, Дж. М., Э. Адамс, Ю. Тон, П. Дж. Фэйрчайлд, М. Тон, Х.Вальдманн. 1999. Экспрессия мышиного IL-12 регулируется трансляционным контролем субъединицы p35. J. Immunol. 162: 4069

    16. Бетт, М., С. К. Джин, Т. Германн, М. К. Шафер, Э. Вейхе, Э. Руд, Б. Флейшер. 1994. Дифференциальная экспрессия мРНК, кодирующей субъединицы p35 и p40 интерлейкина-12 in situ. Евро. J. Immunol. 24: 2435

    17. Хайнцель, Ф. П., Р. М. Рерко, П.Линг, Дж. Хакими, Д. С. Шёнхаут. 1994. Интерлейкин 12 продуцируется in vivo при эндотоксемии и стимулирует синтез гамма-интерферона. Заразить. Иммун. 62: 4244

    18. А. Снайдерс, К. М. Хилкенс, Т. К. ван дер Поув Краан, М. Энгель, Л. А. Аарден, М. Л. Капсенберг. 1996. Регулирование производства биоактивного ИЛ-12 в человеческих моноцитах, стимулированных липополисахаридом, определяется экспрессией субъединицы р35. J. Immunol. 156: 1207

    19. Хейс, М.П., Дж. Ван, М. А. Норкросс. 1995. Регулирование экспрессии интерлейкина-12 в человеческих моноцитах: селективное праймирование интерфероном-γ липополисахарид-индуцибельных генов p35 и p40. Кровь 86: 646

    20. Мерфи, К. М., У. Оуян, Дж. Д. Фаррар, Дж. Ян, С. Ранганат, Х. Аснагли, М. Афкарян, Т. Л. Мерфи. 2000. Сигнализация и транскрипция в развитии Т-хелперов. Анну. Rev. Immunol. 18: 451

    21. Маршалл, Дж.Д., Дж. Чехими, Г. Гри, Дж. Р. Костман, Л. Дж. Монтанер, Г. Тринкьери. 1999. Опосредованный интерлейкином-12 путь иммунных событий является дисфункциональным у людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека. Кровь 94: 1003

    22. Чехими, Дж., С. Э. Старр, И. Франк, А. Д’Андреа, Х. Ма, Р. Р. МакГрегор, Дж. Сеннелье, Дж. Тринкьери. 1994. Нарушение продукции интерлейкина 12 у пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека. J. Exp. Med.179: 1361

    23. Клеричи М., Д. Р. Люси, Дж. А. Берзофски, Л. А. Пинто, Т. А. Винн, С. П. Блатт, М. Дж. Долан, К. В. Хендрикс, С. Ф. Вольф, Г. М. Ширер. 1993. Восстановление ВИЧ-специфических клеточно-опосредованных иммунных ответов интерлейкином-12 in vitro. Наука 262: 1721

    24. Эмерман, М. 1996. ВИЧ-1, Vpr и клеточный цикл. Curr. Биол. 6: 1096

    25. Коэн, Э.А., Р. А. Суббраманиан, Х. Г. Готтлингер. 1996. Роль вспомогательных белков в морфогенезе ретровирусов. Curr. Верхний. Microbiol. Иммунол. 214: 219

    26. Гох, В. К., М. Э. Рогель, К. М. Кинси, С. Ф. Майкл, П. Н. Фульц, М. А. Новак, Б. Х. Хан, М. Эмерман. 1998. Vpr ВИЧ-1 увеличивает вирусную экспрессию путем манипулирования клеточным циклом: механизм отбора Vpr in vivo. Nat. Med. 4: 65

    27. Айяву, В., А. Махбуби, С. Махалингам, Р. Рамалингам, С. Кудходкар, В. В. Уильямс, Д. Р. Грин, Д. Б. Вайнер. 1997. Vpr ВИЧ-1 подавляет активацию иммунной системы и апоптоз посредством регуляции ядерного фактора κB. Nat. Med. 3: 1117

    28. Суббраманиан, Р. А., А. Кессоус-Эльбаз, Р. Лодж, Дж. Форгет, Х. Дж. Яо, Д. Бержерон, Э. А. Коэн. 1998. Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 является положительным регулятором вирусной транскрипции и инфекционности в первичных макрофагах человека.J. Exp. Med. 187: 1103

    29. Коэн, Э. А., Э. Ф. Тервиллигер, Ю. Джалинус, Дж. Пру, Дж. Г. Содроски, В. А. Хазелтин. 1990. Идентификация продукта и функции vpr ВИЧ-1. J. Приобретенный иммунодефицит. Syndr. 3: 11

    30. Кино, Т., А. Грагеров, Дж. Б. Копп, Р. Х. Стаубер, Г. Н. Павлакис, Г. П. Хрусос. 1999. Связанный с вирионом ВИЧ-1 белок vpr является коактиватором рецептора глюкокортикоидов человека.J. Exp. Med. 189: 51

    31. Савая, Б. Э., К. Халили, Дж. Гордон, Р. Таубе, С. Амини. 2000. Кооперативное взаимодействие между регуляторными белками ВИЧ-1 Tat и Vpr модулирует транскрипцию вирусного генома. J. Biol. Chem. 275: 35209

    32. Шерман, М. П., К. М. де Норонья, Д. Пирс, В. К. Грин. 2000. Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 содержит две богатые лейцином спирали, которые опосредуют коактивацию рецептора глюкокортикоидов независимо от его воздействия на остановку клеточного цикла G 2 .J. Virol. 74: 8159

    33. Re, F., D. Braaten, E. K. Franke, J. Luban. 1995. Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 останавливает клеточный цикл в G 2 , ингибируя активацию p34cdc2-циклина B. J. Virol. 69: 6859

    34. Хе, Дж., С. Чоу, Р. Уокер, П. Ди Марцио, Д. О. Морган, Н. Р. Ландау. 1995. Вирусный белок R (Vpr) вируса иммунодефицита человека 1 типа задерживает клетки в фазе G 2 клеточного цикла, ингибируя активность p34cdc2.J. Virol. 69: 6705

    35. Ди Марцио, П., С. Чоу, М. Эбрайт, Р. Кноблаух, Н. Р. Ландау. 1995. Мутационный анализ остановки клеточного цикла, ядерной локализации и упаковки вирионов вируса иммунодефицита человека типа 1 Vpr. J. Virol. 69: 7909

    36. С. Попов, М. Рексач, Г. Зибарт, Н. Рейлинг, М. А. Ли, Л. Ратнер, К. М. Лейн, М. С. Мур, Г. Блобель, М. Букринский.1998. Вирусный белок R регулирует ядерный импорт преинтеграционного комплекса ВИЧ-1. EMBO J. 17: 909

    37. Хайнцингер, Н. К., М. И. Букински, С. А. Хаггерти, А. М. Рагланд, В. Кевальрамани, М. А. Ли, Х. Э. Гендельман, Л. Ратнер, М. Стивенсон, М. Эмерман. 1994. Белок Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа влияет на ядерную локализацию вирусных нуклеиновых кислот в неделящихся клетках-хозяевах. Proc. Natl. Акад. Sci. США 91: 7311

    38. Водичка, М.А., Кепп Д. М., Сильвер П. А., Эмерман М.. 1998. Vpr ВИЧ-1 взаимодействует с ядерным транспортным путем, способствуя заражению макрофагами. Genes Dev. 12: 175

    39. Пакстон У., Р. И. Коннор, Н. Р. Ландау. 1993. Включение Vpr в вирионы вируса иммунодефицита человека типа 1: потребность в области p6 gag и мутационный анализ. J. Virol. 67: 7229

    40. Леви, Д.Н., Я. Рафаэли, Р. Р. МакГрегор, Д. Б. Вайнер. 1994. Сыворотка Vpr регулирует продуктивную инфекцию и латентный период вируса иммунодефицита человека типа 1. Proc. Natl. Акад. Sci. США 91: 10873

    41. Хенкляйн, П., К. Брунс, М. П. Шерман, У. Тессмер, К. Лича, Дж. Копп, К. М. де Норонья, В. К. Грин, В. Рэй, У. Шуберт. 2000. Функциональная и структурная характеристика синтетического Vpr ВИЧ-1, который трансдуцирует клетки, локализуется в ядре и индуцирует остановку клеточного цикла G 2 .J. Biol. Chem. 275: 32016

    42. Кино Т., Грагеров А., Слободская О., Цопаномичалу-Нглотсу М., Хрусос Г. П., Павлакис Г. Н.. 2002. Дополнительный белок вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) Vpr индуцирует транскрипцию промоторов, чувствительных к ВИЧ-1 и глюкокортикоидам, путем непосредственного связывания с коактиваторами p300 / CBP. J. Virol. 76: 9724

    43. Кино, Т., Слободская О., Г.Н. Павлакис, Г. П. Хрусос. 2002. Белки-коактиваторы ядерного рецептора p160 усиливают промотор длинных концевых повторов ВИЧ-1 путем связывания факторов, связанных с промотором, и комплекса Tat-P-TEFb. J. Biol. Chem. 277: 2396

    44. Еленков И. Дж., Г. П. Хрусос. 1999. Гормоны стресса, паттерны Th2 / Th3, про / противовоспалительные цитокины и восприимчивость к болезням. Тенденции Эндокринол. Метаб. 10: 359

    45. Еленков, И.Дж., Э. Л. Вебстер, Д. Дж. Торпи, Г. П. Хрусос. 1999. Стресс, кортикотропин-рилизинг гормон, глюкокортикоиды и иммунная / воспалительная реакция: острые и хронические эффекты. Анна. NY Acad. Sci. 876: 1

    46. Еленков И. Дж., Р. Л. Уайлдер, Г. П. Хрусос, Э. С. Визи. 2000. Симпатический нерв, интегративный интерфейс между двумя суперсистемами: мозгом и иммунной системой. Pharmacol. Редакция 52: 595

    47. Ссылка, А.А., Т. Кино, Дж. А. Уорт, Дж. Л. Макгуайр, М. Л. Крейн, Г. П. Хрусос, Р. Л. Уайлдер, И. Дж. Еленков. 2000. Активация лигандом аденозиновых рецепторов A2a подавляет продукцию IL-12 моноцитами человека. J. Immunol. 164: 436

    48. Галон, Дж., Д. Франшимонт, Н. Хирои, Г. Фрей, А. Боттнер, М. Эрхарт-Борнштейн, Дж. Дж. О’Ши, Г. П. Хрусос, С. Р. Борнштейн. 2002. Анализ генов показывает неизвестное усиливающее и подавляющее действие глюкокортикоидов на иммунные клетки.FASEB J. 16: 61

    49. Кино Т., Дж. Б. Копп, Г. П. Хрусос. 2000. Глюкокортикоиды подавляют активность длинных концевых повторов вируса иммунодефицита человека типа 1 специфическим для клеточного типа, опосредованным рецептором глюкокортикоидов способом: прямые защитные эффекты, противоречащие клинической феноменологии. J. Steroid Biochem. Мол. Биол. 75: 283

    50. Бамбергер, К. М., Х. М. Шульте, Г.П. Хрусос. 1996. Молекулярные детерминанты функции рецепторов глюкокортикоидов и чувствительности тканей к глюкокортикоидам. Endocr. Ред. 17: 245

    51. Жу, К., К. Гагнидзе, Дж. Х. Гемберлинг, С. Е. Плевы. 2001. Характеристика сайта связывания с белком активации-1 в промоторе мышиного интерлейкина-12 p40: демонстрация новых функциональных элементов с помощью редукционистского подхода. J. Biol. Chem. 276: 18519

    52. Мерфи Т.Л., М. Г. Кливленд, П. Кулеша, Дж. Маграм, К. М. Мерфи. 1995. Регулирование экспрессии интерлейкина 12 p40 через полусайт NF-κB. Мол. Cell Biol. 15: 5258

    53. Plevy, S. E., J. H. Gemberling, S. Hsu, A. J. Dorner, S. T. Smale. 1997. Множественные контрольные элементы опосредуют активацию промоторов интерлейкина 12 p40 мыши и человека: свидетельство функционального синергизма между белками C / EBP и Rel. Мол. Cell Biol. 17: 4572

    54. Маккей, Л.И., Дж. А. Цидловски. 1999. Молекулярный контроль иммунных / воспалительных реакций: взаимодействия между ядерным фактором κB и путями передачи сигналов стероидным рецептором. Endocr. Ред.20: 435

    55. Hayes, M. P., F. J. Murphy, P. R. Burd. 1998. Интерферон-γ-зависимая индуцируемая экспрессия гена р35 человеческого интерлейкина-12 в моноцитах инициируется с ТАТА-содержащего промотора, отличного от промотора, богатого CpG, активного в лимфобластоидных клетках, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра.Кровь 91: 4645

    56. Коллет, Дж., К. Витек, Дж. Д. Джентри, Х. Лю, С. Д. Шварцбах, Т. М. Петро. 2001. Делеционный анализ промотора р35 мышиного IL-12, сравнивающий стимуляцию IFN-гамма и липополисахаридом. J. Immunol. 167: 5653

    57. Симпсон Д. М., Бендер А. Н.. 1988. Миопатия, ассоциированная с вирусом иммунодефицита человека: анализ 11 пациентов. Анна. Neurol. 24: 79

    58. Грюнфельд, К., К. Р. Фейнгольд. 1992. Нарушения обмена веществ и истощение при синдроме приобретенного иммунодефицита. N. Engl. J. Med. 327: 329

    59. Макаллан, Д. К., К. Ноубл, К. Болдуин, С. А. Джебб, А. М. Прентис, В. А. Кауард, М. Б. Сойер, Т. Дж. Макманус, Г. Е. Гриффин. 1995. Энергозатраты и растрата при инфицировании вирусом иммунодефицита человека. N. Engl. J. Med. 333: 83

    60. Хадиган, К., С. Джесте, Э. Дж. Андерсон, Р. Цай, Х. Сир, С. Гринспун. 2001. Изменяемые пищевые привычки и их связь с метаболическими нарушениями у мужчин и женщин с инфекцией вируса иммунодефицита человека и перераспределением жира. Clin. Заразить. Дис. 33: 710

    61. Dube, M. P .. 2000. Нарушения метаболизма глюкозы у пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека. Clin. Заразить. Дис. 31: 1467

    62. Кино, Т., Г. П. Хрусос. 2001. Инсулинорезистентность и липодистрофия, связанные с синдромом приобретенного иммунодефицита: многофакторное вирусное и ятрогенное состояние. Endocr. Практик. 7: 480

    63. Яновски, Дж. А., К. Д. Миллер, Т. Кино, Т. К. Фридман, Г. П. Хрусос, К. Цигос, Дж. Фаллон. 1999. Эндокринная и метаболическая оценка пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, с признаками липодистрофии, связанной с ингибиторами протеазы. Дж.Clin. Эндокринол. Метаб. 84: 1925

    64. Сарлис, Н. Дж., С. Дж. Чанок, Л. К. Ниман. 2000. Кортизолемические индексы позволяют прогнозировать тяжелые инфекции при синдроме Кушинга из-за эктопической продукции адренокортикотропина. J. Clin.

    Author: alexxlab

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *