На что влияет впр: «Всероссийские проверочные работы» – в вопросах и ответах

CAS PubMed Google ученый

CAS PubMed Google ученый

CAS PubMed Google ученый

Впр — обзор | ScienceDirect Topics

Лентивирусный белок R (Vpr)

Vpr представляет собой связанный с вирионом нуклеоцитоплазматический регуляторный белок, который кодируется (и сохраняется среди) лентивирусов приматов, ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV. Хотя он незаменим для роста ВИЧ-1 в активированных и делящихся Т-клетках, Vpr, по-видимому, играет важную роль в репликации вируса in vivo , поскольку делеция vpr и связанных генов vpx в SIV серьезно ухудшает патогенные свойства у экспериментально зараженных макак-резусов.Кроме того, ВИЧ-2 и SIV также кодируют дополнительный связанный с Vpr белок, Vpx, который, как полагают, действует синергетически с Vpr. Сообщается, что Vpr ВИЧ-1 проявляет многочисленные биологические активности, включая ядерную локализацию (на основе присутствия по крайней мере двух NLS), образование ионных каналов, активацию транскрипции ВИЧ-1 и гетерологичных промоторов, совместную активацию рецептора глюкокортикоидов. , регуляция дифференцировки клеток, индукция апоптоза, остановка клеточного цикла и трансдукция через клеточные мембраны.Хотя значительные количества Vpr (примерно 0,15-кратное молярное отношение к вирусным коровым белкам) упаковываются в зарождающиеся частицы ВИЧ-1 в процессе, зависящем от взаимодействия Vpr с С-концевым доменом p6 Gag, биологическая роль (и) Связанный с вирионом Vpr еще предстоит полностью выяснить.

Высококонсервативный 96-аминокислотный Vpr привлек значительное внимание, и ряд биологических функций был приписан его присутствию в различных клеточных и внеклеточных компартментах.Наиболее интенсивно изучаемые биологические функции Vpr — это те, которые влияют на транслокацию PIC поступающего вируса из цитоплазмы в ядро ​​и остановку в фазе G ₂ клеточного цикла. Функция ядерного нацеливания Vpr была связана с продуктивной инфекцией терминально дифференцированных макрофагов, опосредуя интеграцию провирусной ДНК в геном хозяина. Предполагается, что Vpr вызывает динамические нарушения в архитектуре ядерной оболочки, что позволяет транспортировать PIC через ядерную мембрану.Что касается второй функции Vpr, которая приводит к остановке клеточного цикла G ₂ в ВИЧ-1-инфицированных Т-клетках, было высказано предположение, что эта активность обеспечивает внутриклеточную среду, благоприятную для экспрессии вирусных генов. Было идентифицировано множество клеточных партнеров по связыванию Vpr, и для некоторых из них была предложена специфическая роль в аресте G ₂ . Тем не менее точный молекулярный механизм, лежащий в основе Vpr-индуцированного ареста G ₂ , остается неясным. Возможное объяснение очевидной парадигмы, согласно которой Vpr предотвращает пролиферацию инфицированных Т-клеток, задерживая их в фазе G ₂ , было предоставлено наблюдением, что экспрессия вирусного гена оптимальна в фазе G ₂ и что Vpr может увеличивать продукцию вируса. задерживая клетки на этой стадии клеточного цикла.Интересно, что во входящих вирусных частицах имеется достаточное количество Vpr, чтобы вызвать остановку клеточного цикла G ₂ даже до инициации синтеза вирусных белков de novo . Вторичные структуры в Vpr, полученные в результате нескольких анализов, указывают на присутствие мотива α-спираль-поворот-α-спираль на N-конце и протяженной амфипатической спиральной области на C-конце, которая может играть ключевую роль в самоассоциации. и взаимодействие Vpr с гетерологичными белками, такими как p6, NC, Tat вируса и транслокатором адениновых нуклеотидов митохондриальной поры.

Другие исследования предполагают, что пролонгированная задержка G ₂ , индуцированная Vpr, в конечном итоге приводит к апоптозу инфицированной клетки. Напротив, были описаны ранние антиапоптотические эффекты Vpr, которые заменяются его проапоптотическими эффектами. Эти проапоптотические эффекты Vpr могут быть результатом либо эффектов на целостность ядерной оболочки, либо прямой проницаемости митохондриальной мембраны, возможно, включая Vpr-опосредованное образование ионных каналов в биологических мембранах.

Влияние на экспрессию гена ВИЧ-1, взаимодействие Tat-Vpr и клеточный апоптоз естественными вариантами HIV-1 Tat Exon 1 и Vpr из Северной Индии

Аннотация

Фон

Поскольку гены Tat и Vpr ВИЧ-1 участвуют в трансактивации промоторов, апоптозе и т. Д., Мы провели исследования, чтобы выяснить природу и степень естественной изменчивости двух генов у серопозитивных пациентов из Северной Индии и определили их функциональное значение.

Методы

HIV-1 tat экзон 1 и vpr были амплифицированы из геномной ДНК, выделенной из крови ВИЧ-1 инфицированных людей, с использованием специфических праймеров методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и подвергнуты обширному генетическому анализу (CLUSTAL W, Simplot так далее). Их экспрессию контролировали путем создания клонов слияния myc. Варианты экзона 1 Tat и Vpr котрансфицировали конструкцией репортерного гена (LTR-luc), и их потенциал трансактивации контролировали путем измерения активности люциферазы.Анализ апоптоза и клеточного цикла проводили окрашиванием пропидиум йодидом (PI) с последующим FACS.

Результаты

Экзон 1 tat амплифицировали из 21 образца, а vpr амплифицировали из 16 образцов. Один из вариантов экзона 1 Tat показал филогенетическое родство с подтипами B и C и оказался уникальным рекомбинантом. Два варианта Vpr были рекомбинантами B / C / D. Было обнаружено, что эти естественные вариации не влияют на стабильность Tat и Vpr.Эти варианты различались по способности трансактивировать промоторы B LTR и C LTR. Рекомбинантный Tat B / C показал лучшее кооперативное взаимодействие с Vpr. Было обнаружено, что рекомбинация B / C / D в Vpr не влияет на его кооперативность с Tat. Рекомбинантный Tat (B / C) индуцировал больше апоптоза, чем Tat дикого типа B и C. Рекомбинация B / C / D в Vpr не влияла на его потенциал индукции остановки G2, но снижала его способность индуцировать апоптоз.

Выводы

Обширные последовательности и регион-специфические вариации наблюдались в генах Tat и Vpr от ВИЧ-1 инфицированных людей из Северной Индии.Эти вариации имеют функциональное значение и поэтому важны для патогенности вируса.

Образец цитирования: Lata S, Ronsard L, Sood V, Dar SA, Ramachandran VG, Das S, et al. (2013) Влияние на экспрессию гена ВИЧ-1, взаимодействие Tat-Vpr и клеточный апоптоз с помощью естественных вариантов HIV-1 Tat Exon 1 и Vpr из Северной Индии. PLoS ONE 8 (12): e82128. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128

Редактор: Шилпа Дж.Бух, Медицинский центр Университета Небраски, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 29 мая 2013 г .; Принята к печати: 18 октября 2013 г .; Опубликован: 19 декабря 2013 г.

Авторские права: © 2013 Lata et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было поддержано Советом по научным и промышленным исследованиям, Нью-Дели, Индия, и Индийским советом медицинских исследований (HIV / 50/142/9/2011-ECD), Правительство Индии, автору-корреспонденту , Национальный институт иммунологии, Нью-Дели, Индия, сроком на 3 года. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) был открыт в 1983 году. Несмотря на широкое использование АРВ (антиретровирусных препаратов), он стал одной из самых серьезных проблем со здоровьем во всем мире. В отчете ЮНЭЙДС о глобальной эпидемии СПИДа за 2012 год зафиксировано 50-процентное снижение числа новых случаев инфицирования ВИЧ; тем не менее, на конец 2011 года во всем мире насчитывалось 34,2 миллиона ВИЧ-инфицированных. Незначительное увеличение с 33,5 миллиона в 2010 году объясняется совокупным эффектом продолжающихся новых инфекций, увеличением (на 63%) числа инфицированных получателей АРВ-препаратов и меньшим смертность (на 24% меньше по сравнению с 2005 годом) от СПИДа во всем мире.ВИЧ-1 принадлежит к семейству Retroviridae . Изоляты ВИЧ-1 со всего мира были разделены на четыре группы, а именно M, N, O и P. Группа «M» на сегодняшний день является наиболее распространенным типом ВИЧ. Более 90 процентов случаев ВИЧ / СПИДа происходят из-за этой группы. Группа вирусов M состоит как минимум из девяти чистых подтипов и множества циркулирующих рекомбинантных форм [1], [2], [3] и уникальных рекомбинантных форм [4], [5], [6]. По крайней мере 10 процентов циркулирующих штаммов ВИЧ-1 состоят из рекомбинантов межподтипа [7], [8], [9].Недавние исследования показывают, что подтип C (ответственный за большинство инфекций во всем мире (более 56%) составляет более 98 процентов инфекций на Индийском субконтиненте [10]. Группа P была недавно обнаружена у диких горилл. Вирус был изолирован от камерунской женщины [11]

Трансактиватор белка транскрипции (Tat) ВИЧ-1 был ключевым направлением исследований ВИЧ с момента его открытия в 1985 году [12] из-за его решающей роли в активации транскрипции вирусных генов и некоторых других функций, имеющих важное значение для патогенеза.Tat — небольшой белок (9–11 кДа), состоящий из 86–101 аминокислоты в зависимости от подтипа [13]. Tat имеет два экзона; первого экзона, кодирующего 72 аминокислоты, достаточно для трансактивации LTR ВИЧ-1 [14], [15], [16]. Последовательность Tat подразделяется на несколько отдельных областей на основе ее аминокислотного состава: N-концевой кислотный участок (аминокислотные остатки 1-22), богатый цистеином домен (аминокислотные остатки 22-37), центральная область (аминокислотные остатки 38– 47), основной области (а.о. 48–57) и богатой глутамином области (а.о. 60–76) [17]. Известно, что кислая область функционирует как домен активации [18].Считается, что богатый цистеином домен участвует в образовании димеров, опосредованном ионами цинка [19]. Основные, основные и богатые глутамином области участвуют в связывании РНК, и основная область также действует как сигнал ядерной локализации [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26] ]. С-концевой домен Tat участвует в стимуляции котранскрипционного кэпирования мРНК ВИЧ-1 посредством прямого взаимодействия с кэппирующим ферментом MceI [27]. Сообщалось также, что Tat ВИЧ-1 играет двойную роль в регуляции апоптоза клеток-хозяев.Экзогенный Tat индуцирует апоптоз в нормальных клетках, в то время как он защищает инфицированные ВИЧ-1 клетки от апоптоза, что может быть полезно для выживания инфицированных ВИЧ-1 клеток in vivo [28]. Tat ВИЧ-1 также увеличивает опосредованную NFκB секрецию IL-8 в линиях Т-клеток [29]. Сообщалось также, что Tat приводит к усилению регуляции CCR5 и понижению регуляции CXCR4 [30].

ВИЧ-1 Vpr представляет собой 96-аминокислотный белок массой 14 кДа. Vpr имеет три альфа-спирали. Эти спирали соединены петлями и свернуты вокруг гидрофобного ядра [31], окруженного гибким N-концевым доменом и C-концевым участком, богатым аргинином, которые имеют отрицательный и положительный заряд, соответственно.Vpr упакован в значительных количествах в вирусные частицы [32]. Vpr помогает в активной ядерной транслокации преинтеграционного комплекса ВИЧ-1 (PIC) в неделящиеся клетки, взаимодействуя с ядерным транспортным путем [33], [34], [35], [36]. Vpr вызывает остановку в фазе G ₂ / M клеточного цикла [37], [38]. Vpr активирует репликацию ВИЧ в результате его модулирующей клеточный цикл активности [39], [40]. Vpr также вызывает апоптоз инфицированных клеток [41].

Несколько вакцин с использованием дополнительных белков ВИЧ-1, таких как токсоид Tat, были разработаны разными исследователями [42], [43], [44], но они не были успешными из-за высокой генетической изменчивости ВИЧ, высокого уровня ошибок обратной транскриптазы [45 ], [46], [47], быстрый оборот вирионов у ВИЧ-инфицированных людей [48] и гомологичная рекомбинация [7], [8].Таким образом, иммунной системе становится невозможно угнаться за антигенной мозаикой возбудителя. Таким образом, изучение естественных вариаций белков ВИЧ-1, встречающихся в популяции, будет полезным при разработке вакцин. О генетических вариациях в экзоне 1 Tat ВИЧ-1 сообщалось из разных регионов Индии [49], [50], но их функциональное значение не исследовалось. Было обнаружено, что белки Tat и Vpr синергетически усиливают транскрипционную активность LTR ВИЧ-1 за счет структурного и функционального взаимодействия друг с другом [51].Целью настоящего исследования было выяснить природу генетических вариаций в Tat экзоне 1 и Vpr, обнаруженных у ВИЧ-1 инфицированных людей из Северной Индии, и определить их функциональное значение. Мы сообщаем о некоторых интересных и уникальных генетических вариантах Tat экзона 1 и Vpr, включая межподтипные рекомбинанты из Северной Индии.

Материалы и методы

ВИЧ-1 инфицированных

Двадцать четыре ВИЧ-1-инфицированных человека, некоторые из которых получали антиретровирусное лечение (АРТ), а некоторые были наивны, были случайным образом выбраны для этого исследования из региона Дели / Уттар-Прадеш на севере Индии.Они были зарегистрированы в клинике АРТ больницы Гуру Тег Бахадур в Дели. Клинический профиль этих людей приведен в таблице 1. Образцы периферической крови (2 мл) были собраны в ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), содержащей флаконы от выбранных лиц.

Образцы крови были взяты у пациентов, инфицированных ВИЧ-1, после получения письменного согласия. Это исследование было одобрено Консультативным комитетом исследовательского проекта, Институциональным комитетом по биобезопасности и Институциональным этическим комитетом — Исследования на людях Университетского колледжа медицинских наук и больницы Гуру Тег Бахадур, Дели, Индия.Этим наставником занимается Национальная организация по контролю над СПИДом, которая является подразделением Министерства здравоохранения и семейного благополучия правительства Индии, которое предоставляет бесплатные АРТ ВИЧ-серопозитивным пациентам в рамках структурированной программы борьбы с ВИЧ / СПИДом.

Выделение геномной ДНК и полимеразная цепная реакция

Геномную ДНК выделяли из периферической крови, собранной у отобранных ВИЧ-1 инфицированных людей, с использованием набора HiPurA ™ Blood Genomic DNA Miniprep Spin Kit (HiMedia). Экзон 1 и Vpr ВИЧ-1 tat амплифицировали из этих образцов ДНК с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) с ДНК-полимеразой Taq (Takara) с использованием специфических праймеров.Праймерами, использованными для амплификации экзона 1 tat , были FP, SalI, 5′-GAGGTCGACCATGGAGCCAAGTAGATC-3 ‘и RP, NotI, 5′-GAGGCGGCCGCCTATTGCTTTGATATAAGA-3’. Праймерами, использованными для амплификации vpr , были FP, BglII, 5′-GGCAGATCTCTATGGAACAAGCCCCAGAAGAC-3 ‘и RP, NotI, 5′-GGCGCGGCCGCCTAGGATCTACTGGCTCCATTTCTT — 3’. Условия цикла, использованные для реакций ПЦР, были следующими: начальная денатурация при 95 ° C в течение 5 минут, циклическая денатурация при 95 ° C в течение 30 секунд, отжиг праймеров при 68 ° C для tat экзона 1 и 63 ° C для vpr в течение 30 секунд, циклическое удлинение при 72 ° C в течение 30 секунд, окончательное удлинение при 72 ° C в течение 7 минут и 30 циклов.ПЦР-ампликоны tat экзона 1 и vpr обрабатывали на 1,5% агарозном геле, и полосы очищали с помощью набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen).

Клонирование и векторы экспрессии

Очищенные ампликоны ПЦР первоначально клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega) путем клонирования ТА. Для экспрессии у млекопитающих уникальных вариантов tat экзона 1 и vpr их клонировали в векторе pCMV-Myc (Clontech). Их клоны pGEM-T easy, а также пустой вектор pCMV-Myc переваривали соответствующими рестрикционными ферментами, запуск на 1.5-процентный агарозный гель, очищенный и лигированный вместе с использованием набора для лигирования Т4 (New England Biolabs). Штамм E.Coli DH5α использовали для экспериментов по клонированию. Плазмидные конструкции pCMV-Myc-B Tat, pCMV-Myc-C Tat, pCMV-Myc-B Vpr, pCMV-Myc-C Vpr, pBlue3’LTR-luc, pBlue3’LTR-luc-C (NIH AIDS Reagent Program) были использовались в разных экспериментах.

Генетический анализ вариантов экзона 1 Tat и Vpr

Клоны pGEM-T Easy вариантов tat экзона 1 и vpr подвергали секвенированию в обоих направлениях с использованием праймеров, специфичных для Т7 и SP6.Затем эти последовательности сравнивали с эталонными последовательностями ВИЧ-1, загруженными из базы данных ВИЧ (http://www.hiv.lanl.gov), используя Clustal W 2.1 [52]. Последовательности также анализировали с помощью Sim Plot версии 3.5.1 для анализа рекомбинации.

Классификация ВИЧ-1 по филогенетическому анализу и соотношению dN / dS

Нуклеотидные последовательности были собраны и проверены на ошибки с помощью программы BLAST (NCBI, США), чтобы исключить потенциальные лабораторные ошибки. Эти последовательности были сопоставлены с консенсусными последовательностями штаммов ВИЧ-1 всех подтипов с использованием ClustalW 2.1. Филогенетические деревья были построены с использованием метода объединения соседей с двухпараметрической матрицей расстояний кимура в программе MEGA5. Надежность узла проверяли с использованием метода начальной загрузки с 500 повторами для обоих вариантов Tat exon-1 и Vpr. Инструмент SNAP v1.1.0 [53] использовался для определения давления эволюционного отбора в наших вариантах.

Культура клеток и трансфекция

HEK-293T (клетки эмбриональной почки человека 293) и Hela (линия клеток рака шейки матки) (NIH AIDS Reagent Program) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Himedia) с инактивированной нагреванием 10-процентной фетальной телячьей сывороткой (Biological Industries) и 100 единиц пенициллина, 0.1 мг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерицина B на мл при 37 ° C в присутствии 5% CO ₂ . Все трансфекции выполняли с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Иммуноблот-анализ

Т-клетки НЕК-293 выращивали до 80% конфлюэнтности в шестилуночном планшете и трансфицировали векторами экспрессии плазмиды, кодирующими желаемые белки. После 24 часов трансфекции клетки собирали и лизировали буфером для лизиса клеток (1% NP-40, 50 мМ TrisCl, pH 8, 300 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 15 мМ MgCl ₂ , 2 мМ DTT).Концентрацию белка определяли количественно с использованием набора BCA Protein Assay kit (Pierce, Thermo Scientific). Равные количества белка разделяли с помощью 12% SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (mdi). Мембраны блокировали 1% BSA (альбумин бычьей сыворотки) (Sigma) и 5% обезжиренного сухого молока (Himedia) в PBS (фосфатный буферный раствор) и трижды промывали PBS, содержащим 1% Tween 20 (MERCK). В качестве первичных используемых антител были антитела против myc (Clontech) и против GAPDH (Cell Signaling).Использовали конъюгированные с пероксидом хрена (HRP) антимышиные и антикроличьи вторичные антитела. Блоты проявляли с использованием реагента ECL (Enhanced Chemiluminiscent).

Анализ Циклогексимида Чейза

Для сравнения стабильности природных вариантов Tat exon 1 и Vpr со стабильностью дикого типа была проведена погоня за циклогексимидом (CHX). Клетки HEK-293T трансфицировали 2 мкг каждой соответствующей плазмиды. После 24 часов трансфекции клетки обрабатывали циклогексимидом (100 мкг / мл) и получали лизаты клеток через 0 часов, 2 часа, 4 часа, 6 часов и 8 часов обработки CHX.Лизаты клеток разделяли с помощью 12% SDS PAGE с последующим иммуноблоттингом, как описано выше.

Репортерный анализ люциферазы

ВИЧ-1 измеряли с помощью набора для анализа Dual Luciferase Reporter (DLR) (Promega). 293 Т-клетки котрансфицировали репортерной конструкцией люциферазы LTR ВИЧ-1, плазмидами, кодирующими белки Tat и Vpr дикого типа, и конструкциями вариантного экзона 1 Tat и Vpr. Для измерения совместной активации LTR ВИЧ-1 вариантами экзона 1 Tat и вариантами B Vpr или Vpr и B Tat, клетки 293T трансфицировали репортерной конструкцией люциферазы LTR ВИЧ-1 вместе с B Tat, B Vpr и вариантом Tat экзона 1. и конструкции Vpr отдельно или с Vpr и B Tat дикого типа соответственно.Конструкцию люциферазы Renilla использовали в качестве контроля для нормализации эффективности трансфекции. Добавляли пустой вектор pcDNA3.1 для выравнивания количества трансфицированной ДНК в каждой лунке. Через 24 часа после трансфекции клетки лизировали в буфере для пассивного лизиса (Promega). Люциферазную активность измеряли люминометром с использованием двух субстратов (Promega), одного для люциферазы светлячков и второго для люциферазы renilla (смешанной со стоп-буфером и гло-буфером) с помощью люминометра (Tecan). Активность люциферазы светлячков делили на активность люциферазы ренилла, чтобы получить истинную репортерную активность люциферазы.

Проточная цитометрия

Для анализа апоптоза клетки Hela трансфицировали плазмидами экспрессии, кодирующими желаемые белки, в течение 24 часов. Для анализа клеточного цикла клетки также обрабатывали 40 мкМ Z VAD-FMK [54] (ингибитор панкаспаз). Клетки собирали с использованием трипсина EDTA и дважды промывали холодным PBS. Клетки фиксировали и пропускали через холодный 70-процентный этанол на льду в течение 30 минут. Затем клетки обрабатывали РНКазой A в течение 1 часа при комнатной температуре. Через 1 час клетки окрашивали йодидом пропидия, PI (50 мкг / мл) и анализировали проточной цитометрией.Данные FACS были проанализированы с использованием WINMDI версии 2.9.

Статистический анализ

Статистические расчеты и анализы были выполнены в Graph Pad Prism (версия 5.00). Значения P менее 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Описание отдельных лиц, инфицированных ВИЧ-1

Для этого исследования было отобрано в общей сложности двадцать четыре ВИЧ-1 инфицированных пациента из регионов Дели / Уттар-Прадеш на севере Индии. Их клиническая история кратко представлена ​​в таблице 1.Тринадцать пациентов получали АРТ, остальные — нет. Большинство из них заразились ВИЧ-инфекцией гетеросексуальным путем. Их количество CD4 было ниже 400 во время сбора образца. Пять пациентов, получавших АРТ, были инфицированы Mycobacterium tuberculosis .

Анализ множественных последовательностей

Аминокислотные последовательности экзона 1 Tat из образцов, инфицированных ВИЧ-1, сравнивали с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B и C [фиг. 1 (а)]. Некоторые мутации (N24T, K29Y, L35P, G44S и P68L) были консервативными в большинстве последовательностей.Пять последовательностей (Tat 31, 33, 34, 35 и 37) имели мутацию F38L в коровой области. Одна последовательность (Tat 71) напоминала B Tat в аминоконцевой области с тремя точечными мутациями (K29R в богатой цистеином области и I39M и Y47H в области ядра) и C Tat в карбоксиконцевой области. Две последовательности (Tat 80 и Tat 93) имели мутации L43V и S46F. Мутация C30R обнаружена только в одной последовательности (Tat 93). Аминокислотные последовательности Vpr из образцов, инфицированных ВИЧ-1, сравнивали с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B, C и D [фиг.1 (б)]. Было обнаружено, что три последовательности Vpr 45, Vpr 46 и Vpr 50 представляют собой мозаику подтипов B, C и D с одной точечной мутацией, M59T. Последовательность Vpr 45 и Vpr 50 была одинаковой. В С-концевой области последовательности Vpr 46 наблюдалась мутация сдвига рамки считывания, приводящая к изменению аминокислотной последовательности и образованию преждевременного стоп-кодона на С-концевом конце белка. Vpr 79 показывал преждевременное усечение. Это произошло из-за вставки четырех нуклеотидов в N-концевую область, что привело к образованию преждевременного стоп-кодона и полностью другой аминокислотной последовательности.

Рисунок 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей экзона 1 Tat и последовательностей Vpr ВИЧ-1 инфицированных пациентов.

( a ) Последовательности экзона 1 Tat были сопоставлены с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B и C с помощью Clustal W. При выравнивании последовательностей аминокислоты, идентичные консенсусу C, обозначены звездочками (*), аминокислоты идентичны Консенсус B, мутации, консервативные во всех тестовых последовательностях, и уникальные мутации показаны в алфавитном порядке. Положения мутировавших аминокислот указаны над выравниванием.( b ) Аминокислотные последовательности вариантов Vpr от ВИЧ-1 инфицированных пациентов были сопоставлены с эталонными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B, C и D с помощью Clustal W. При выравнивании последовательностей аминокислоты, идентичные Консенсусу C, обозначены звездочками. (*). Аминокислоты, идентичные Consensus B & D, мутации, общие в тестовых последовательностях, и уникальные мутации показаны в алфавитном порядке.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g001

Филогенетический анализ

Нуклеотидные последовательности Tat exon-1 и Vpr были выровнены с помощью ClustalW 2.1 [52] и проанализированы на подтипы филогенетическим анализом с использованием метода объединения соседей [55] с двухпараметрической матрицей расстояний Кимуры в программе MEGA5 [56] с подтипами группы M (AK) и подтипами (A1, A2, F1 и F2), которые показали большинство наших вариантов Tat exon-1 сгруппированы с подтипом C, а некоторые варианты сгруппированы между подтипами B и C, что указывает на присутствие B / C-рекомбинации [Рисунок 2 (a)]. Аналогичный анализ вариантов Vpr показал, что большинство наших вариантов разветвлено с подтипом B, а некоторые варианты сгруппированы с подтипом C [Рисунок 2 (b)].

Рис. 2. Подтипы ВИЧ-1 на основе глобальных ссылок на подтипы.

Филогенетический анализ был проведен для вариантов Tat экзон-1 и Vpr с группой M (от A до K, включая A1, A2, F1 и F2). Каждая контрольная последовательность была помечена подтипом с указанием страны выделения и регистрационного номера. Вероятность начальной загрузки (> 65%, 1000 повторов) была обозначена звездочкой (*) в соответствующих узлах дерева, а масштабная линейка представляет собой эволюционное расстояние 0.02 нуклеотида на позицию в последовательности. ( a ) Он представляет собой филогенетическое дерево вариантов экзона-1 Tat с M-группой. Заштрихованные кружки представляют варианты C, а закрашенные треугольники представляют рекомбинанты. ( b ) Он представляет собой филогенетическое древо вариантов Vpr с группой М. Заштрихованные треугольники представляют варианты B, а закрашенные кружки представляют рекомбинанты.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g002

Эволюционный отбор на основе отношения dN / dS

Режим давления отбора, который имел место в вариантах экзона-1 Tat и Vpr, был рассчитан путем взятия средних значений dN / dS в пределах предсказанного подтипа с использованием SNAP v1.1.0 (Программа синонимичного несинонимичного анализа). SNAP рассчитывает скорости несинонимичных (dN) и синонимичных (dS) замен на основе набора выровненных по кодонам нуклеотидных последовательностей (соотношение dN / dS) [57]. Значение dN / dS для вариантов Tat экзон-1 и Vpr составляло от 0,4 до 0,9 (таблица 2) и от 0,1 до 0,7 (таблица 3), соответственно, значение ei dN / dS меньше единицы означает очищающий отбор, а значение больше единицы. обозначают положительный выбор. Оба наших варианта Tat exon-1 и Vpr, включая рекомбинанты B / C и B / C / D, показали менее одного значения, указывающего на очищающий отбор среди населения Северной Индии.Кроме того, был рассчитан тип отбора, который произошел между вариантами B и C, который показал, что среднее расхождение у изолятов B и C было меньше одного значения, подразумевающего очищающий отбор (таблицы 2 и 3).

Sim Анализ графика

Для проверки наличия рекомбинации последовательности экзона 1 Tat и вариантов Vpr анализировали с помощью Sim Plot. Последовательности нуклеиновых кислот вариантов были выровнены с эталонными последовательностями и подверглись анализу загрузочного сканирования с использованием Sim Plot версии 3.5.1. Анализ загрузочного сканирования Tat 71 показал присутствие B / C-рекомбинации, где N-концевой участок был получен из подтипа B, но он был идентичен подтипу C в направлении C-концевой половины [фиг. 3 (а)]. Другие варианты экзона 1 Tat показали полное сходство с подтипом C при проведении аналогичного анализа [Рис. S1]. Анализ загрузочного сканирования Vpr 45 или Vpr 50 (поскольку обе последовательности одинаковы) [Рис. 3 (б)] и Vpr 46 [рис. 3 (c)] показали рекомбинацию B / C / D в своих последовательностях.

Рисунок 3. Анализ рекомбинации вариантов Tat exon 1 и Vpr.

Последовательности Tat 71, Vpr 45 и Vpr 46 анализировали с помощью Sim Plot. Их сравнивали с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B, C и D и подвергали анализу загрузочного сканирования. Tat 71 оказался рекомбинантным подтипа B и C. Vpr 45 и Vpr 46 оказались рекомбинантными подтипа B, C и D. ( a ) Анализ загрузочного сканирования Tat 71 ( b ) Загрузочный анализ сканирования Vpr 45 ( c ) Анализ сканирования загрузки Vpr 46.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0082128.g003

Сравнение экспрессии и стабильности вариантов Tat экзона 1 и Vpr

Из найденных природных вариантов были отобраны интересные и уникальные варианты экзона 1 Tat, то есть Tat 31, Tat 71, Tat 80 и Tat 93 и варианты Vpr, то есть Vpr 45 и Vpr 46, были отобраны для функциональной характеристики. Последовательность Vpr 79 показывала преждевременное образование стоп-кодона, поэтому никаких функциональных исследований с этим образцом не проводилось. Влияние мутаций, обнаруженных в природе в экзоне 1 Tat и Vpr, на их стабильность, если таковые имеются, исследовали с помощью анализа циклогексимида с использованием их гибридных клонов myc с последующим иммуноблоттингом.Мутантные клоны трансфицировали в клетки 293Т, используя белки дикого типа в качестве контроля. Через 24 часа клетки обрабатывали циклогексимидом, и клеточные лизаты получали через каждые 2 часа. Хотя было обнаружено, что экспрессия всех вариантов экзона 1 Tat ниже, чем у B Tat, и больше, чем у C Tat [рис. 4 (а)], их период полураспада был почти таким же, как у B Tat [Рис. 4 (б, в)]. Было обнаружено, что экспрессия и стабильность вариантов Vpr аналогичны таковой для дикого типа [фиг. 5].

Рисунок 4.Экспрессия и стабильность вариантов экзона 1 Tat.

( a ) 293 Т-клетки трансфицировали слитыми myc конструкциями вариантов Tat, C Tat и Tat дикого типа 1 (2 мкг каждый) с использованием липофектамина 2000; лизаты клеток получали через 24 часа после трансфекции и обрабатывали с помощью 12-процентного SDS-PAGE. Вестерн-блоттинг проводили с использованием моноклонального мышиного антитела c-myc в качестве первичного антитела и меченного HRP антимышиного антитела в качестве вторичного антитела. GAPDH был исследован как контроль загрузки. ( b ) Клетки 293T трансфицировали 2 мкг каждого из гибридных клонов myc подтипа B Tat, C Tat и вариантов экзона 1 Tat и после 24 часов трансфекции клетки обрабатывали циклогексимидом, CHX (100 мкг / мл. ) и собирают с интервалом от 2 до 8 часов.Клеточные лизаты обрабатывали с помощью 12-процентного SDS-PAGE и блоты зондировали моноклональным антителом c-myc и антителом GAPDH (контроль нагрузки) ( c ). Относительную концентрацию белка в различные моменты времени измеряли путем измерения плотности полосы в для каждого случая и были нанесены линейные графики в зависимости от продолжительности лечения CHX.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g004

Рисунок 5. Экспрессия и стабильность природных вариантов Vpr.

( a ) Т-клетки 293 трансфицировали конструкциями слияния myc вариантов Vpr, C Vpr и Vpr дикого типа (2 мкг каждого) с использованием липофектамина 2000; лизаты клеток получали через 24 часа после трансфекции и обрабатывали с помощью 12-процентного SDS-PAGE.Вестерн-блоттинг проводили с использованием моноклонального мышиного антитела c-myc в качестве первичного антитела и меченного HRP антимышиного антитела в качестве вторичного антитела. GAPDH был исследован как контроль загрузки. ( b ) Клетки 293T трансфицировали 2 мкг каждого из гибридных клонов myc вариантов Vpr, C Vpr и Vpr дикого типа, и через 24 часа трансфекции клетки обрабатывали циклогексимидом, CHX (100 мкг / мл) и собирают с интервалом от 2 до 6 часов. Лизаты клеток разделяли с помощью 12-процентного SDS-PAGE и блоты зондировали моноклональным антителом c-myc и антителом GAPDH (контроль нагрузки) ( c ). Относительную концентрацию белка в различные моменты времени измеряли путем измерения плотности полосы в для каждого случая и были нанесены линейные графики в зависимости от продолжительности лечения CHX.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g005

Потенциал трансактивации LTR ВИЧ-1 экзона 1 Tat и вариантов Vpr

ВИЧ-1 Tat играет ключевую роль в трансактивации LTR и, следовательно, в репликации вируса, в то время как Vpr является слабым трансактиватором. Таким образом, влияние встречающихся в природе мутаций в экзоне 1 Tat и Vpr было исследовано путем сравнения их способности трансактивировать репортер люциферазы LTR с таковой дикого типа. Было обнаружено, что рекомбинация B / C в Tat 71 отрицательно влияет на его активационную способность B LTR, в то время как трансактивация B LTR с помощью Tat 80 была сопоставима с B Tat.Потенциал активации B LTR двух других вариантов был аналогичен потенциалу C Tat, как и ожидалось [Рис. 6 (а)]. Было обнаружено, что активация C LTR с помощью Tat 71 больше, чем для C Tat, в то время как она почти аналогична C Tat в присутствии других вариантов [фиг. 6 (б)]. Tat также может взаимодействовать с Vpr и синергетически усиливать активацию LTR [51]. Также было исследовано влияние встречающихся в природе мутаций в Tat и Vpr на их кооперативность. Было обнаружено, что синергическая трансактивация B LTR рекомбинантным Tat 71 B / C с помощью B Vpr выше, чем у Tat B дикого типа, в то время как другие варианты экзона 1 Tat не проявляют кооперативности с B Vpr [фиг. .6 (с)]. Потенциал активации B LTR и C LTR вариантов Vpr был почти сопоставим с потенциалом активации дикого типа [Рис. 7 (а, б)]. Было обнаружено, что естественные вариации Vpr не влияют на кооперативную активацию B LTR, опосредованную Tat-Vpr [фиг. 7 (с)].

Рисунок 6. Потенциал активации LTR ВИЧ-1 природных вариантов экзона 1 Tat.

Т-клетки 293 трансфицировали репортерной плазмидой люциферазы ВИЧ-1 подтипа B LTR или C LTR (50 нг), люциферазой renilla в качестве контроля для нормализации и B. Tat, C Tat и вариант плазмиды экспрессии экзона 1 Tat (100 нг) отдельно или в комбинации с B Vpr с использованием липофектамина 2000.pcDNA 3.1 трансфицировали для выравнивания количества трансфицированной ДНК в каждой лунке. Через 24 часа клетки собирали и лизировали в буфере для пассивного лизиса. Люциферазную активность измеряли люминометром. ( a ) Активация B LTR ВИЧ-1 с помощью Tat 80 была сравнима с активацией B Tat, а активация с помощью Tat 71 была меньше, чем активация B Tat. Активация B LTR другими вариантами была сопоставима с C Tat. ( b ) Активация C LTR ВИЧ-1 с помощью Tat 71 была больше, чем для C Tat, и сравнима с B Tat. Активация C LTR другими вариантами была почти аналогична C Tat.( c ) Кооперативная трансактивация B LTR с помощью Tat 71 с B Vpr была больше, чем B Tat, в то время как другие варианты не показали кооперативного взаимодействия с B Vpr, как ожидалось. Представленные здесь данные представляют собой среднее значение по меньшей мере трех отдельных экспериментов по трансфекции. Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g006

Рисунок 7. Потенциал активации LTR ВИЧ-1 природных вариантов Vpr.

Т-клетки HEK-293 трансфицировали репортерной плазмидой люциферазы ВИЧ-1 подтипа B LTR или C LTR (50 нг), люциферазой renilla в качестве контроля нормализации и плазмидами экспрессии B Vpr, C Vpr и варианта Vpr (100 нг) отдельно или в комбинация с B Tat с использованием Lipofectamine 2000.pcDNA 3.1 трансфицировали для выравнивания количества трансфицированной ДНК в каждой лунке. Через 24 часа клетки собирали и лизировали в буфере для пассивного лизиса. Люциферазную активность измеряли люминометром. ( a ) Активация B LTR ВИЧ-1 вариантами Vpr была сопоставима с активацией Vpr дикого типа ( b ). Активация C LTR ВИЧ-1 вариантами Vpr была почти аналогична активации дикого типа. ( c ) Совместная трансактивация B LTR вариантами Vpr с B Tat также была сопоставима с B Vpr. Представленные здесь данные представляют собой среднее значение по меньшей мере трех отдельных экспериментов по трансфекции.Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g007

Анализ апоптоза экзона 1 Tat и вариантов Vpr

Vpr ВИЧ-1 и экзогенно экспрессируемый Tat индуцируют апоптоз клеток-хозяев. Эффективность индукции апоптоза вариантов Tat экзона 1 и Vpr измеряли с помощью проточной цитометрии. Их трансфицировали в клетки Hela белками дикого типа в качестве контроля и через 24 часа; клетки фиксировали и окрашивали PI.Затем клетки анализировали проточным цитометром. Перед фазой G1 наблюдали отдельный пик, представляющий клетки в фазе апоптоза. Апоптоз, индуцированный рекомбинантным Tat 71 (22,39%) и Tat 80 (31,78%), был намного сильнее, чем у дикого типа, в то время как другие варианты индуцировали апоптоз (4,66% Tat 31 и 7,21% Tat 93) почти в той же степени, что и у Tat дикого типа [рис. 8]. Способность к индукции апоптоза вариантов Vpr (7,91% для Vpr 45 и 9,40% для Vpr 46) оказалась ниже, чем у вариантов дикого типа (41.32% по B Vpr и 24,69% по C Vpr) [Рис. 9].

Рисунок 8. Анализ апоптоза вариантов экзона 1 Tat.

( a ) Клетки Hela трансфицировали 2 мкг каждой плазмиды, кодирующей варианты B Tat, C Tat и Tat экзона 1, и клетки собирали через 24 часа с использованием трипсина EDTA. Затем клетки промывали PBS, фиксировали в 70% этаноле, обрабатывали РНКазой A и окрашивали PI. После окрашивания клетки анализировали в растворе PI / РНКазы с помощью проточной цитометрии. Апоптотические клетки наблюдались в виде отдельного пика перед фазой G1.Процент апоптоза, зарегистрированный для каждого варианта, показан в верхнем правом углу. Рекомбинантный Tat 71 B / C и вариант Tat 80 подтипа C вызывают больший апоптоз, чем Tat дикого типа. Показанные здесь результаты являются представителями трех независимых экспериментов. ( b ) Процент апоптотических клеток для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с Tat B дикого типа. Значение p было меньше 0,05 для каждого образца. ( c ) Процент апоптотических клеток для каждого образца наносили в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с Tat C дикого типа.Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g008

Рисунок 9. Апоптоз, индуцированный вариантами Vpr.

( a ) Клетки Hela трансфицировали 2 мкг каждой плазмиды, кодирующей варианты B Vpr, C Vpr и Vpr, и клетки собирали через 24 часа с использованием трипсина EDTA. Затем клетки промывали PBS, фиксировали в 70% этаноле, обрабатывали РНКазой A и окрашивали PI. После окрашивания клетки анализировали в растворе PI / РНКазы с помощью проточной цитометрии.Апоптотические клетки наблюдались в виде отдельного пика перед фазой G1. Процент апоптоза, зарегистрированный для каждого варианта, показан в верхнем правом углу. Рекомбинанты B / C / D Vpr 45 и Vpr 46 вызывают меньший апоптоз, чем Vpr дикого типа. Показанные здесь результаты являются представителями трех независимых экспериментов. b ) Процент апоптотических клеток для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с Vpr дикого типа B. Значение p было меньше 0,05 для каждого образца. ( c ) Процент апоптотических клеток для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с C Vpr дикого типа.Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g009

Анализ клеточного цикла вариантов Vpr

Vpr вызывает остановку клеточного цикла G2 / M в инфицированных клетках. Варианты Vpr были проанализированы на их способность вызывать остановку G2 с помощью проточной цитометрии. Их трансфицировали в клетки Hela белками дикого типа в качестве контроля, и клетки обрабатывали 40 мкМ Z VAD-FMK [54], ингибитором апоптоза. Через 24 часа клетки фиксировали, окрашивали PI и анализировали проточным цитометром.Было обнаружено, что потенциал индукции остановки G2 вариантов Vpr является промежуточным по сравнению с потенциалом Vpr и C Vpr дикого типа [фиг. 10].

Рис. 10. Остановка G2 / M, вызванная вариантами Vpr.

( a ) Клетки Hela трансфицировали 2 мкг каждой плазмиды, кодирующей варианты B Vpr, C Vpr и Vpr, и обрабатывали 40 мкМ Z-VAD-FMK (ингибитор панкаспаз). Клетки собирали через 24 часа с использованием трипсина EDTA. Затем клетки промывали PBS, фиксировали в 70% этаноле, обрабатывали РНКазой A и окрашивали PI.После окрашивания клетки анализировали в растворе PI / РНКазы с помощью проточной цитометрии. Были получены пики G1 — фазы, S — фазы и G2 — фазы. Процент ячеек в фазе G2 / M указан в правом верхнем углу. Показанные здесь результаты являются представителями трех независимых экспериментов. ( b ) Процент клеток в фазе G2 / M для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с Vpr дикого типа B. Значение p было меньше 0,05 для каждого образца. ( c ) Процент клеток в фазе G2 / M для каждого образца был нанесен в виде столбчатой ​​диаграммы по сравнению с C Vpr дикого типа.Значение p было меньше 0,05 для каждого образца.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.g010

Обсуждение

ВИЧ-1 быстро эволюционирует из-за его высокой генетической изменчивости. Генетический анализ природных вариантов tat экзона 1 и vpr выявил интересные особенности. Большинство аминокислотных вариаций в Tat было обнаружено в богатых цистеином и ядерных областях, в то время как N-концевые области, области связывания TAR и богатые глутамином области (за исключением одной мутации) были почти консервативными во всех последовательностях.Один вариант, Tat 71, оказался рекомбинантным подтипа B и C с тремя точечными мутациями (K29R, I39M и Y47H), в то время как другие напоминали подтип C с некоторыми точечными мутациями (F38L, L43V, S46F, K29R, C30R, Y47H и I39M). Последовательность Tat 71 также была проанализирована с помощью анализа Sim Plot, который показал, что это рекомбинант B / C с одной точкой рекомбинации между подтипом B и C. Три варианта Vpr представляли собой мозаику подтипа B, C и D с одной точечной мутацией (M59T). и отличается от уже описанного рекомбинантного B / C / D вируса Vpr ВИЧ-1 [58].Vpr 79 показал преждевременное образование стоп-кодонов. Хотя последовательность вариантов экзона 1 Tat была подобна последовательности C Tat с некоторыми точечными мутациями (кроме Tat 71), их стабильность и экспрессия были аналогичны таковой у Tat B дикого типа. Это может быть связано с мутациями, естественно присутствующими в их последовательности. Нет предыдущих отчетов, показывающих влияние этих естественных мутаций на экспрессию и стабильность.

Было обнаружено, что функционально варианты экзона 1 Tat обладают различным потенциалом активации LTR.Практически не наблюдалось влияния сообщенной рекомбинации B / C / D на способность LTR-активации вариантов Vpr, в то время как ранее описанный рекомбинант B / C / D Vpr [58] был более активен, чем дикий тип. Активация LTR подтипа B ВИЧ-1 с помощью Tat 80, который напоминал подтип C, за исключением двух точечных мутаций (L43V и S46F), была больше, чем Tat C дикого типа. Однако сообщается, что Tat фосфорилируется по S16 и S46, что требуется для LTR-направленной транскрипции генов ВИЧ-1, и мутации остатков S16 и S46 приводят к снижению фосфорилирования Tat и, следовательно, к ингибированию репликации ВИЧ-1 [59], но эта мутация ( S46F) гидрофильной аминокислоты (S) к гидрофобной аминокислоте (F) в положении 46 может усиливать гидрофобные свойства области ядра Tat [60], что важно для связывания с циклином T1 [61], необходимого для функции Tat [ 18], [62].Также замена ароматических аминокислот на неароматические приводит к снижению активности Tat в 2 раза [63]. Таким образом, замена неароматической аминокислоты (S) ароматической аминокислотой (F) в положении 46 может увеличить активность Tat. Активация B LTR Tat 31 и Tat 93 была почти аналогична активации C Tat. И Tat 80, и Tat 93 имеют две одинаковые точечные мутации (L43V и S46F), но транскрипционная активность B LTR Tat 93 относительно ниже, чем у Tat 80. Это может быть связано с мутацией C30.Было обнаружено, что эта мутация снижает потенциал трансактивации Tat [64], [17], [65]. Рекомбинация B / C с тремя точечными мутациями (K29R, I39M и Y47H) в Tat 71 снижала его способность к трансактивации B LTR. Сообщается, что аминокислотные остатки в положениях 35 и 39 в Tat тесно связаны между собой, и мутация любого остатка этой пары аминокислот приводит к появлению мутанта Tat, который не может активировать вирусный LTR. Однако одновременное введение обеих мутаций восстанавливает функцию гена до дикого типа [66].Но Tat 71, имеющий мутацию I39M, все еще способен активировать транскрипцию B LTR. Это может быть связано с другой мутацией Y47H, которая, как сообщается, восстанавливает потерю активности мутанта Y26A Tat, несмотря на тот факт, что оба этих тирозина важны для репликации ВИЧ-1 [63] и мутации Y47H, когда вводятся в виде отдельной мутации. в Tat дикого типа увеличивает активность мутантного Tat в два раза в временных анализах [67]. Мутация K29R также наблюдалась у ревертантов второго сайта Tat, но не было обнаружено, что она улучшает активность Tat в анализах транскрипции LTR [67].

Активация LTR подтипа C ВИЧ-1 с помощью Tat 71 была больше, чем активация C Tat, и сравнима с активацией B Tat, что может быть связано с рекомбинацией B / C. Было обнаружено, что транскрипционная активность C-LTR Tat 80 выше, чем для C Tat. Это может быть связано с наличием в его последовательности мутации S46F [60]. Транскрипция C LTR была сравнима с C Tat в случае Tat 31 и Tat 93. Транскрипционная активность C LTR Tat 93 относительно меньше, чем у Tat 80, несмотря на одинаковые точечные мутации в двух сайтах (L43V и S46F) по описанной причине. выше для активации B LTR.

Хотя Tat 71 обладал пониженной трансктивацией B LTR, он показал большую кооперативность с B Vpr в активации B LTR, чем Tat B дикого типа. Таким образом, можно сделать вывод, что последовательность Tat 71 приведет к усиленной репликации в вирусном контексте и, таким образом, будет положительно выбрана в процессе эволюции. Другие три варианта не показали какой-либо совместной активации B LTR с B Vpr, как ожидалось, потому что их последовательность напоминала последовательность C Tat, за исключением нескольких точечных мутаций. Также не наблюдалось влияния естественных вариаций Vpr на его взаимодействие с Tat.Это предполагает, что Vpr играет лишь вторую скрипку по отношению к функции LTR трансактивации Tat.

Можно утверждать, что функциональные различия в выборках могут быть из-за изменений в их соответствующих последовательностях LTR. Поэтому мы амплифицировали последовательности LTR из двух репрезентативных образцов (Tat 71 и Tat 80), используя протокол, описанный нами ранее [68]. При сравнении с консенсусными последовательностями LTR образцы последовательностей LTR показали сохранение всех основных сайтов связывания факторов транскрипции (TATA-бокс, Sp1, NF-kB, NFAT-III, AP-1, AP-2) (данные не показаны).Таким образом, мы пришли к выводу, что наблюдаемые функциональные различия связаны с изменениями самой последовательности Tat.

Было обнаружено, что вариации, обнаруженные в природе в экзоне 1 Tat и Vpr, также влияют на их способность индуцировать апоптоз. Апоптоз, индуцированный Tat 31 и Tat 93, был почти аналогичен Tat дикого типа, в то время как он был намного больше, чем Tat 71 (B / C рекомбинантный) и Tat 80, чем Tat для B и C, и Tat 80. Таким образом, мутации, которые усиливали транскрипцию активность Tat также увеличивала потенциал индукции апоптоза Tat.Оба варианта Vpr индуцировали меньший апоптоз, чем дикий тип, но нормальную остановку G2. Таким образом, рекомбинация B / C / D, обнаруженная в вариантах Vpr, оказала негативное влияние на их апоптоз, но не на потенциал индукции остановки G2.

В целом, четыре точечные мутации, встречающиеся в природе в экзоне 1 Tat, оказались функционально значимыми. Мутации S46F и Y47H увеличивали активность Tat, в то время как C30R и I39M отрицательно влияли на активность Tat. Было обнаружено, что другие мутации (K29R, L43V и F38L), встречающиеся в природе в экзоне 1 Tat, являются функционально неактивными.Было обнаружено, что рекомбинация B / C / D в вариантах Vpr отрицательно влияет на их способность к индукции апоптоза, характерную функцию Vpr, но не влияет на другие функции. Таким образом, эти вариации, включая межподтипную рекомбинацию, встречающуюся в природе в белках ВИЧ-1, оказывают сильное влияние на патогенез вируса. Несколько исследований показали, что рекомбинация может происходить под избирательным давлением, оказываемым антиретровирусными препаратами, или из-за коинфекции различными штаммами, что приводит к появлению новых вариантов ВИЧ-1 с двойной лекарственной устойчивостью, измененным тропизмом тканей, патогенностью и диапазоном хозяев, или с изменениями антигенных эпитопов [69], [70], [71].На сегодняшний день эффективной вакцины против ВИЧ не существует, несмотря на несколько попыток использования белков ВИЧ-1. Возможно, тип и распространение разновидностей белков инфекционных штаммов повлияют на усилия по созданию целенаправленной вакцины. Генетический и функциональный анализ вариантов гена ВИЧ-1, циркулирующих в популяции, предоставит знания для понимания биогенеза ВИЧ-1 и его эволюционного процесса. Это будет полезно для разработки новых методов лечения ВИЧ и стратегий вакцинации в будущем.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Анализ загрузочного сканирования нерекомбинантных вариантов экзона 1 Tat. Последовательности Tat 31, Tat 80 и Tat 93 анализировали с помощью Sim Plot. Их сравнивали с консенсусными последовательностями ВИЧ-1 подтипа B, C и D и подвергали анализу загрузочного сканирования. Все они были похожи на C Tat. ( a ) Анализ загрузочного сканирования Tat 31 ( b ) Анализ загрузочного сканирования Tat 80 ( c ) Анализ загрузочного сканирования Tat 93.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082128.s001

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Программу исследований СПИДа и эталонных реагентов, Отделение СПИДа, NIAID, NIH за их реагенты.Мы благодарим ART, больницу GTB, Дели, Индия, за предоставленные образцы крови, инфицированной ВИЧ-1. Мы также благодарим Индийский совет медицинских исследований, Нью-Дели, Индия, и Совет научных и промышленных исследований, Нью-Дели, Индия за их поддержку.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SL VS ACB VGR. Проведены эксперименты: SL. Проанализированы данные: SL LR S. Dar. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: ACB VGR S. Das. Написал статью: SL.

Ссылки

Vpr вызывает деградацию IRF3 (Okumura et al., 2008), но мы не обнаружили деградацию IRF3 в клетках THP-1 в условиях, когда экспрессия генов и ядерный транспорт IRF3 были сильно подавлены (Рисунок 5). Кроме того, помимо подавления ядерного транспорта IRF3, мы обнаружили, что Vpr снижает фосфорилирование IRF3 по S396, но не по S386 (Рисунок 5). Предыдущие исследования показали, что фосфорилирование IRF3 по S386 необходимо и достаточно для активации IRF3 (Lin et al., 1999; Мори и др., 2004; Ширмахер, 2015; Слуга и др., 2003; Сухара и др., 2000; Йонеяма и др., 1998). Таким образом, наши данные согласуются с более сложной картиной активации IRF3 путем фосфорилирования. Возможно, что фосфорилирование по S396 происходит кариоферин или NPC-зависимым путем, который блокируется рекрутированием Vpr в кариоферин. Фосфорилирование IRF3 по S396 было связано с усиленной ассоциацией и мультимеризацией с транскрипционным коактиватором CREB-связывающим белком (CBP / p300), что указывает на более позднюю роль, чем фосфорилирование по S386 (Chen et al., 2008). Возможно, что отсутствие фосфорилирования IRF3 S396 является следствием дефосфорилирования IRF3 по S396, поскольку предотвращается проникновение в ядро.

Ингибирование фосфорилирования IRF3 также согласуется с сообщениями об ингибировании TBK1 с помощью Vpr, хотя это исследование обнаружило ингибирование фосфорилирования TBK1, тогда как мы этого не сделали (Harman et al., 2015). В этом исследовании Vpr способствовал инфицированию макрофагов и дендритных клеток, несмотря на то, что ВИЧ-индуцированное образование сигнальных комплексов врожденного иммунитета, содержащих TBK1, IRF3 и TRAF3, визуализировалось с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.Таким образом, ингибирование TBK1 с помощью Vpr может происходить в дополнение к активности Vpr в отношении ядерного транспорта, потому что TBK1 наблюдается в цитоплазме, а не в ядерной оболочке этих ВИЧ-инфицированных клеток (Harman et al., 2015). В этом исследовании не было обнаружено деградации IRF3, и ВИЧ-1 не индуцировал фосфорилирование IRF3, хотя влияние инфекции на IRF3 с помощью ВИЧ-1 дикого типа и ВИЧ-1, удаленных для Vpr, не сравнивали.

Ожидается, что регуляция ядерного импорта NF-B и IRF3 множественными кариоферинами будет сложной (Fagerlund et al., 2005; Fagerlund et al., 2008; Кумар и др., 2000; Лян и др., 2013). Нацеливание на кариоферины является типичной вирусной стратегией для манипулирования клеточными ответами, но различные способы, которыми вирусы выполняют эту функцию, намекают на сложность, необходимую для подавления врожденных ответов, избегая при этом остановки вирусной транскрипции. Мы предполагаем, что различные механизмы манипулирования NF-κB / IRF3 разными вирусами отражают их зависимость от активации транскрипции, одновременно зависящую от ингибирования одних и тех же факторов транскрипции, активируемых защитными процессами.Мы предполагаем, что каждый вирус специально адаптировался для облегчения репликации, подавляя активацию ингибирующих эффекторов. Неспособность расщепить белки кариоферина предполагает, что некоторая функция ядерного импорта KPNA1 может быть оставлена ​​нетронутой ВИЧ для облегчения более тонких манипуляций с биологией клетки-хозяина (рис. 7). Подобная модель ингибирования связывания мишени KPNA для манипулирования ядерным импортом была предложена кристаллической структурой белка VP24 вируса Эбола в комплексе с KPNA5. В этом исследовании предполагается, что VP24 нацелен на сайт связывания KPNA5 NLS, чтобы специфически ингибировать ядерный импорт фосфорилированного STAT1 (Xu et al., 2014).

Очевидно, что тип клеток также играет роль в функции Vpr. Например, в миелоидных клетках (Kogan et al., 2013; Miller et al., 2017) и Т-клетках (Ayyavoo et al., 1997) сообщалось, что Vpr ингибирует NF-B. Другие исследования Т-клеток предполагают активацию NF-B с помощью Vpr для управления вирусной транскрипцией (Liu et al., 2014; Vermeire et al., 2016). В более позднем исследовании Хоттер и его коллеги показали, что экспрессия различных Vprs вируса иммунодефицита приматов в клетках HEK293T может активировать или ингибировать активность NF-B в зависимости от анализа (Hotter et al., 2017). Например, экспрессия Vpr в клетках HEK293T активировала исходный уровень, а TNFα стимулировала экспрессию трансфицированного NF-ĸB-чувствительного репортера, но ингибировала активацию репортера трансфецированным IKKβ. Авторы предположили, что Vpr-опосредованное ингибирование NF-B имеет значение, поскольку Vpr ингибирует репортер IFNβ, активированный инфекцией вируса Сендай, что согласуется с результатами, представленными в данном документе. Мы предполагаем, что тип клетки и стадия жизненного цикла вируса влияют на эффект Vpr на активацию фактора транскрипции.Одна возможность состоит в том, что входящая частица, связанная с Vpr, активна против NF-B, чтобы уменьшить врожденное восприятие, но Vpr, экспрессируемый провирусом в инфицированной клетке, связывается с помощью Gag, который секвестрирует Vpr, снижая дальнейшее ингибирование активированного NF-B, т.е. необходим для текущей вирусной транскрипции (Belzile et al., 2010).

Наши данные также объясняют предыдущие сообщения о подавлении экспрессии котрансфицированных плазмид CMV, управляемых MIEP, с помощью Vpr (Liu et al., 2015b). Ингибирование Vpr транспорта NF-B в ядро ​​для активации MIEP, вероятно, объясняет эти данные, но другая возможность состоит в том, что фактор транскрипции, связанный с цитоплазматической плазмидной ДНК, играет роль в импорте плазмиды в ядро, и именно транспорт плазмиды ингибируется ( Mesika et al., 2001). Нечувствительность к Vpr NF-ĸB-независимого убиквитина и промоторов EF1α (рис. 6) согласуется с этой моделью, обобщенной на рис. 7 — приложение к рисунку 1А. Это важно, потому что ингибирование экспрессии трансфицированного плазмидного белка может объяснить эффект котрансфицированного Vpr SIV на передачу сигналов STING и cGAS, о котором недавно сообщалось (Su et al., 2019). Обратите внимание, что на экспрессию STING не влияла коэкспрессия Vpr, но STING экспрессировался с Vpr и NF-ĸB-нечувствительного промотора EF1α (фиг.6), тогда как cGAS, который не был измерен с помощью вестерн-блоттинга, экспрессировался с Vpr и NF. -B-чувствительная (фиг.6) CMV-управляемая плазмида VR1012 (Hartikka et al., 1996). Некоторые эксперименты в Hotter et al., 2017 также могли быть подвержены влиянию этого явления.

Важно отметить, что наши данные согласуются с сообщениями о том, что манипулирование клеточным циклом с помощью Vpr не зависит от взаимодействия с белками кариоферина. Мутант Vpr R80A, который не останавливает клеточный цикл и не манипулирует комплексом SLX4 (Gaynor and Chen, 2001; Laguette et al., 2014), действует в отношении ингибирования врожденного восприятия (Рисунки 3, 5 и 6). Таким образом, мы предполагаем, что взаимодействие SLX4 не играет роли в показанном здесь антагонизме врожденного иммунитета.Картирование остатков Vpr, которые важны для ингибирования врожденного иммунитета, на структуры, разрешенные с помощью ЯМР и рентгеновской кристаллографии, выявляет потенциально отличный интерфейс от того, нацеленный на UNG2, потому что остатки Vpr 34/35 удалены от сайта связывания UNG2 (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1Б, В). Кроме того, UNG2 не был связан с восприятием врожденного иммунитета. Учитывая, что Vpr, как было показано, связывает мотив FxFG в p6 Gag во время включения вириона (Zhu et al., 2004), и мотивы FG в NPC (Fouchier et al., 1998) возможно, что взаимодействие Vpr с белками ядерных пор посредством мотивов FG способствует Vpr-опосредованному ингибированию ядерного импорта IRF3 и NF-B.

In vitro первичные миелоидные клетки ведут себя в соответствии с полученными стимулами. Таким образом, противоречивые результаты между исследованиями, например, требование здесь для cGAMP, но не в других исследованиях, чтобы вызвать Vpr-зависимую репликацию в макрофагах (рисунок 1), можно объяснить различиями в стимуляции миелоидных клеток из-за различий в очистке клеток и используемые методы дифференциации или реагенты.Способы приготовления вирусов, здесь вирусы очищали центрифугированием через сахарозу, также могут быть источником активации клеток-мишеней и экспериментальных вариаций. Мы предполагаем, что цГАМФ индуцировал зависимость Vpr в MDM (рис. 1), потому что клетки не были активированы до добавления цГАМФ, тогда как в других исследованиях базальная активация вызывала Vpr-зависимую репликацию. Репликация в активированных первичных CD4 + Т-клетках, по нашему мнению, не зависела от Vpr в присутствии и в отсутствие cGAMP, который был ингибирующим, что позволяет предположить, что Vpr не может преодолеть передачу сигналов ниже cGAMP в этих клетках.Это означает, что активированные Т-клетки по-разному реагируют на цГАМФ, чем макрофаги, что согласуется с наблюдениями, что в смешанных культурах Т-клеток / макрофагов негативные эффекты цГАМФ на репликацию ВИЧ-1 в основном опосредованы макрофагами (Xu et al., 2016). Сообщалось о Vpr-чувствительной, cGAS-зависимой продукции IFN из Т-клеток, что свидетельствует о том, что при определенных обстоятельствах Т-клетки могут воспринимать ДНК ВИЧ-1 через cGAS в Т-клетках (Vermeire et al., 2016). Важно отметить, что в этом исследовании использовалось ингибирование интеграции, чтобы продемонстрировать провирус-зависимое обнаружение ВИЧ-1, что позволяет предположить, что поступающая ДНК ВИЧ-1 не является мишенью cGAS в этом исследовании.Природа PAMP в этих экспериментах остается неясной. Безусловно, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять различные требования к функции Vpr в Т-клетках и макрофагах.

Чувствительность к ВИЧ-1 явно зависит от дозы вируса и, следовательно, от дозы PAMP. Например, Cingoz и др. Сообщили, что ВИЧ-1 с псевдотипом VSV-G (∆Env, ∆Nef, ∆Vpr) не активирует сенсорное восприятие в различных клеточных линиях (Cingöz and Goff, 2019). Однако другие исследования продемонстрировали восприятие ДНК ВИЧ-1 дикого типа с помощью cGAS (Gao et al., 2013; Lahaye et al., 2013), и здесь мы наблюдали cGAS-зависимую, Vpr-чувствительную индукцию репортера CXCL10 или NF-ĸB высокой дозой (MOI 1-3) VSV-G, псевдотипированного одинарного круглого вектора GFP ВИЧ-1 в THP. -1 ячейка (рисунки 1 и 6). Эффект дозы проиллюстрирован на рисунке 1, на котором MOI (0,1–0,3) мало влияет на экспрессию CXCL10 в клетках THP-1. Однако более высокие дозы активировали экспрессию CXCL10, если только вирионы не несли Vpr, и в этом случае индукция CXCL10 подавлялась. Cingoz использовала люциферазу для измерения инфекции, и поэтому MOI неясны, что затрудняет сравнение доз.Обратите внимание, что здесь MOI, рассчитанный по экспрессии GFP, включен в дополнительные данные для большинства экспериментов. Учитывая, что инфекция обычно зависит от воздействия на клетки более чем одной вирусной частицы, что требует десятков частиц даже по самым консервативным оценкам, вполне вероятно, что Vpr, доставляемый частицами, которые в конечном итоге не образуют провирус, способствует подавлению восприятия. Конечно, более низкий MOI требуется для активности Vpr, когда стимуляция исходит от самих вирусных частиц, несущих Vpr (требуется MOI три, рисунок 1C), по сравнению с внешним стимулом (требуется MOI 20, рисунок 1B).Трудно понять, какие MOI действительно имеют отношение к репликации in vivo , но важно отметить, что в наших экспериментах высокие MOI выше одного требуются для активации врожденного иммунитета и Vpr-зависимого антагонизма. Это говорит о том, что инфекция с низким MOI зависит от уклонения сенсора от секвестрации вирусного PAMP внутри интактных капсидов (Jacques et al., 2016), но инфекции с более высоким MOI могут зависеть от Vpr, связанного с частицами, для подавления активации любых экспонированных вирусных PAMP и любых эндогенных PAMP, которые являются индуцированный.

Таким образом, наши открытия связывают Vpr-манипуляции с ядерным транспортом с ингибированием врожденного иммунного восприятия, а не с вирусным ядерным импортом. Они подчеркивают решающую роль связанного с частицами Vpr в ингибировании активации врожденного иммунитета на ранних стадиях жизненного цикла вируса и объединяют серию исследований, объясняющих ранее очевидно несвязанные наблюдения. Учитывая сложность активации NF-kB и различные способы, которыми каждый вирус манипулирует защитными транскрипционными ответами, мы предполагаем, что дальнейшее изучение вирусного ингибирования воспалительных реакций, вызванных PAMP, приведет к лучшему пониманию биологии задействованных факторов транскрипции и выделить новые, поддающиеся лечению цели для терапевтических противовоспалительных разработок.

Активация транскрипции ВИЧ дополнительным белком VPR опосредуется коактиватором p300

Аннотация

Дополнительный белок, Vpr, представляет собой связанный с вирионом белок, который необходим для репликации ВИЧ-1 в макрофагах и регулирует экспрессию вирусных генов в Т-клетках. Vpr вызывает остановку развития клеточного цикла при G ₂ / M, предположительно за счет своего воздействия на активность циклина B1⋅Cdc2. Здесь мы показываем, что способность Vpr активировать транскрипцию ВИЧ коррелирует с его способностью вызывать остановку роста G ₂ / M, и этот эффект опосредуется коактиватором транскрипции p300, который способствует кооперативным взаимодействиям между субъединицей Rel A. NF-κB и циклина B1⋅Cdc2.Vpr взаимодействует с p300, который регулирует NF-κB и базальный аппарат транскрипции, чтобы увеличить экспрессию гена ВИЧ. Подобные эффекты наблюдаются в отсутствие Vpr с киназо-дефицитным Cdc2, а сверхэкспрессия p300 увеличивает уровни репликации ВИЧ Vpr ⁺ . Взятые вместе, эти данные предполагают, что p300 посредством его взаимодействий с NF-κB, базальными транскрипционными компонентами и Cdks модулируется с помощью Vpr и регулирует репликацию ВИЧ. Регулирование p300 с помощью Vpr обеспечивает механизм усиления вирусной репликации в пролиферирующих клетках после остановки роста за счет увеличения вирусной транскрипции.

ВИЧ очень чувствительна к изменениям клеточной стимуляции, таким как активация клеток цитокинами или прогрессирование клеточного цикла факторами роста. Регуляция клеточного цикла ВИЧ недавно стала очевидной. В частности, Vpr представляет собой кодируемый ВИЧ белок, который влияет на развитие клеточного цикла, либо индуцируя дифференцировку (1), либо вызывая остановку клеточного цикла в контрольной точке G ₂ / M (2–5). Vpr является дополнительным белком ВИЧ массой 14 кДа, который локализуется в ядре и связывается с вирионом, связываясь с карбоксильным концом вирусного белка Gag (6–9).В неделящихся клетках, таких как макрофаги, Vpr играет роль в транслокации ВИЧ в ядро ​​по механизму, отличному от кариоферинового пути, который используется белком вирусного матрикса для ядерной локализации ВИЧ (10, 11). Vpr важен для заметной стимуляции репликации вируса в макрофагах и вызывает умеренное увеличение транскрипции ВИЧ и продукции вируса в Т-лимфоцитах (12–14).

Транскрипция ВИЧ регулируется двумя сайтами κB в вирусном энхансере в длинном концевом повторе (LTR) (15).Эти сайты распознаются семейством факторов транскрипции NF-κB, которые обычно индуцируются в ответ на стресс и инфекцию (см. Ссылку 16). Транскрипционная активность NF-κB в значительной степени контролируется секвестрацией в цитоплазме семейством ингибирующих белков, IκB, и ингибирование снимается, когда IκB фосфорилируются и деградируют в ответ на различные цитокины, включая фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), рост факторы, а также бактериальные и вирусные продукты (см.17). Функция NF-κB также регулируется в ядре другими факторами транскрипции, членами основного транскрипционного аппарата (18) и коактиваторами транскрипции, такими как коактиваторы p300 и CREB-связывающего белка (CBP) (19). Недавно было показано, что активация транскрипции NF-κB регулируется модуляторами прогрессии клеточного цикла. В частности, остановка роста за счет экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы p21 усиливала функцию NF-κB (19). Этот эффект опосредован коактиватором транскрипции p300, который связывается с комплексами циклина E⋅Cdk2, ингибируемыми p21.Таким образом, казалось, что G ₁ / S-специфические регуляторные белки клеточного цикла могут модулировать активность NF-κB и тем самым увеличивать транскрипцию вирусных генов, когда прогрессирование клеточного цикла останавливается.

Механизм активации транскрипции ВИЧ с помощью Vpr не совсем понятен. Vpr ингибирует развитие клеточного цикла в контрольной точке G ₂ / M. Наш предыдущий вывод о том, что задержка роста G ₁ / S влияет на транскрипцию ВИЧ, повысил вероятность того, что остановка роста, вызванная Vpr, также может влиять на его трансактивацию.Поэтому мы исследовали, может ли Vpr влиять на транскрипцию ВИЧ с помощью p300 / CBP за счет его способности вызывать остановку клеточного цикла G ₂ / M. Мы демонстрируем, что Vpr влияет на экспрессию гена ВИЧ посредством своего действия на p300, и что этот эффект коррелирует со способностью Vpr останавливать развитие клеточного цикла. Мы предполагаем, что комплексы циклина B1⋅Cdc2, связанные с p300, являются медиатором этого эффекта. Репликация HIV Vpr ⁺ увеличивается, когда p300 сверхэкспрессируется в инфицированных клетках, что подразумевает коактивацию транскрипции, регулируемую Cdks, в контроле репликации ВИЧ.

МЕТОДЫ

Плазмиды, культуры клеток и ядерные экстракты.

ВИЧ-CAT, RSV-Rel A, CMV-Vpr, CMV-Vpr (ΔATG), CMV-Cdc2 (ΔK), CMV-p300, pBS-3′p300, WT 12S E1A, Δp300 12S E1A и CMV- Все плазмиды экспрессии мутанта Vpr описаны (15, 19, 20, 21, 22). Мутант Vpr, R80A, который был охарактеризован (23), был сконструирован в контексте Hx _bru Vpr (20). Β-галактозидаза вируса саркомы Рауса (RSV) или β-глобин RSV и щелочная фосфатаза цитомегаловируса (CMV) (VCL-1012 CMV (Vical, Inc.)) векторы использовали в качестве контрольных плазмид-наполнителей для трансфекций RSV-Rel A, CMV-p300 и CMV-Cdc2 (ΔK). Ранее также сообщалось о конструкциях p300 и Rel A pBluescript, используемых для трансляции in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7 (15, 22). Плазмиду CMV-CD2 получали путем лигирования фрагмента Sal I– Hin dIII, содержащего кодирующую область для человеческого CD2, с сайтами Sal I– Eco RV в области множественного клонирования VCL-1012 CMV.Вектор CMV-CD4 получали путем лигирования фрагмента Eco RI– Bam HI, содержащего кодирующую последовательность CD4, с сайтами Pst I– Bam HI в области множественного клонирования VCL-1012 CMV.

Jurkat, UM-316, 293 почечного эпителия и NIH 3T3 (24), а ядерные экстракты получали, как описано ранее (25). Для индукции NF-κB для анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) клетки стимулировали в течение 1 часа 200 ед. / Мл рекомбинантного TNF-α (Genzyme).

Трансфекции и анализы хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT).

клеток Jurkat трансфицировали с использованием DEAE-декстрана, и анализы CAT выполняли через 48 часов после трансфекции, как описано ранее (15). Клетки 293 трансфицировали осаждением фосфатом кальция, и через 72 ч получали ядерные экстракты (25).

клеток NIH 3T3 трансфицировали gAP / DLRIE / DOPE 50/50 (Vical). В частности, клетки высевали до 40% конфлюэнтности за 1 день до трансфекции, дважды промывали Opti-MEM и трансфицировали раствором липид-ДНК, полученным путем объединения 1.5 мл Opti-MEM, содержащего 15 мкг ДНК, плюс 1,5 мл Opti-MEM, содержащего 30 мкл раствора липидов с концентрацией 2 мг / мл. Клетки инкубировали в течение 4 часов, липидный раствор удаляли, добавляли свежую среду и клетки лизировали и анализировали через 48 часов. Из-за различий в эффективности трансфекции, наблюдаемой с этими клетками, 4 мкг RSV-β-галактозидазы было котрансфицировано во всех образцах, и экстракты были нормализованы перед анализом активности CAT на основе активности β-галактозидазы (26).

UM-316 высевали до 20% конфлюэнтности в 6-луночные планшеты за 1 день до трансфекции.Клетки трансфицировали 5 мкг CMV-p300 или пустого контрольного вектора CMV и 0,5 мкг CMV-CD4 с использованием липофектамина (GIBCO / BRL) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ клеточного цикла.

клеток 293 трансфицировали 2,5 мкг CMV-CD2 плюс 7,5 мкг векторов CMV-Vpr. Через 48 часов клетки инкубировали в течение 30 минут с антителом к ​​маркеру клеточной поверхности CD2 (супернатант гибридомы ATCC HB 222), трижды промывали PBS + 2% фетальной телячьей сывороткой, инкубировали в течение 30 минут с изотиоцианатом флуоресцеина мыши. -конъюгированное антитело и промывали еще три раза.Клетки ресуспендировали в 875 мкл ледяного PBS и фиксировали в течение 1 ч на льду, добавляя 125 мкл холодного PBS, содержащего 2% параформальдегида. Клетки промывали один раз PBS + 2% фетальной телячьей сыворотки, повышали проницаемость в течение 15 минут при 37 ° C с помощью 1 мл 2% Tween 20 в PBS и еще раз промывали. Окрашивание йодидом пропидия проводили путем инкубации клеток в течение 1 ч при 37 ° C в 960 мкл PBS, 2 единицах РНКазы и 40 мкл йодида пропидия (Boehringer Mannheim). Содержание ДНК в CD2-положительных клетках измеряли с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности.

EMSA были выполнены с 1,5 мкг ядерного экстракта из клеток 293 и двухцепочечного олигомера с концевой меткой, содержащего один сайт связывания NF-κB, как описано ранее (25). Комплексы анализировали на 5% полиакриламидных гелях в буфере 0,25 × TBE.

Анализ связывания белков и вестерн-блоттинг.

Для связывания с транслированными белками in vitro проводили иммунопреципитацию с антителом против циклина B (SC-245AC, Santa Cruz) или контрольным мышиным IgG1 (M-9269, Sigma) на 50 мкг ядерного экстракта в течение 2 часов.Иммунопреципитированные белки трижды промывали буфером для иммунопреципитации (19), инкубировали с in vitro транслированным карбокси-концевым p300 (система транскрипции / трансляции кроличьих ретикулоцитов Т7 TNT, Promega) и еще трижды промывали буфером для иммунопреципитации. Комплексы анализировали с помощью 8% SDS / PAGE.

Для обнаружения связанных p300, Rel A, циклина B1 и Cdc2 с помощью вестерн-блоттинга иммунопреципитацию проводили на 420 мкг ядерного экстракта, подвергали 8% SDS / PAGE и затем Вестерн-анализу с антителами к p300 (SC-584 и SC-585, Санта-Крус), Rel A (SC-109 и SC-372, Санта-Крус), циклин B1 (SC-245, Санта-Крус) и Cdc2 (SC-54, Санта-Крус).Антитела использовали в концентрации 0,5 мкг / мл, а соответствующее вторичное антитело против кролика или антитело против мыши, связанное с пероксидазой хрена, использовали в разведениях 1: 8000 и 1: 3000 соответственно. Белки визуализировали с помощью системы усиленной хемилюминесценции (Amersham).

ВИЧ-инфекции и анализ обратной транскриптазы.

Трансфицированные CD4-положительные клетки 293 или клетки UM-316 в 6-луночных планшетах для тканевых культур были инфицированы ВИЧ _bru Vpr ⁺ или ВИЧ _bru Vpr ^— путем инкубации клеток с вирусом в течение 4 часов при 37 ° C. при кратности заражения 0.05–0.1. После инкубации с вирусом клетки дважды промывали D-PBS и добавляли свежую DMEM до конечного объема 4 мл.

Супернатанты культур анализировали на активность обратной транскриптазы (RT), как описано ранее (27). Поли (A) / олиго (dt) использовали в качестве праймера-матрицы, и включение [ ³² P] dTTP измеряли после нанесения 3 мл реакционной смеси RT на бумагу DE81, сушки и четырехкратной промывки в 2 × SSC. раствор при 22 ° C. Радиоактивность анализировали на бетаскопе Betagene (Waltham, MA), и активность выражали в имп / мл супернатантов культуры.Были выполнены тройные анализы RT, и значения выражены как среднее ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Чтобы изучить механизм активации транскрипции ВИЧ с помощью Vpr, мы сначала определили, коррелирует ли способность Vpr вызывать остановку роста с активацией транскрипции ВИЧ. Клетки лейкемии Jurkat T трансфицировали вектором, кодирующим ген хлорамфениколацетилтрансферазы, контролируемым энхансером ВИЧ (HIV-CAT), и векторами экспрессии, кодирующими либо дикого типа, либо мутантные формы Vpr.Мутант R80A, который не может арестовывать клетки, но сохраняет способность перемещаться в ядро ​​(23), и два дополнительных мутанта, R73S и S79I / R80D, которые аналогичны ранее охарактеризованным мутантам клеточного цикла (23), были протестированы в этих условиях. эксперименты. Также была исследована мутация E25K, которая нарушает ядерную локализацию и включение вириона Vpr, но обеспечивает эффективную репликацию вируса (20). В клетках 293 E25K ингибировал развитие клеточного цикла через 48 часов, тогда как способность R80A, R73S и S79I / R80D задерживать клетки были нарушены (рис.1 А ). Клетки 293 использовали для документирования остановки роста из-за достигнутой высокой эффективности трансфекции, и было труднее оценить эти эффекты в клетках Jurkat, которые плохо трансфицированы; однако предыдущие исследования показали сходные фенотипы остановки клеточного цикла с помощью Vpr и нескольких мутантов в клетках Jurkat (3, 28). Заражение клеток Jurkat ВИЧ, содержащим мутацию R80A или E25K, также использовалось для подтверждения того, что Vpr R80A не вызывает остановки клеточного цикла и что Vpr E25K действительно задерживает клетки (R.В КАЧЕСТВЕ. и E.A.C., неопубликованные данные), что аналогично результатам для 293 клеток, представленных здесь.

Vpr транскрипции ВИЧ с помощью Rel A коррелирует с его способностью регулировать развитие клеточного цикла. ( A ) Мутанты Vpr, дефектные по остановке роста G ₂ / M, обладают нарушенной способностью активировать транскрипцию ВИЧ.Для анализа распределения клеточного цикла клетки 293 котрансфицировали pCMV-CD2, вектором экспрессии, кодирующим антиген CD2, CMV-Vpr дикого типа и указанными мутантными формами Vpr. CD2-положительные клетки анализировали с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией. Обозначены отношения популяций клеток G ₂ / M к G ₁ . Для анализа трансактивации Vpr клетки Jurkat трансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT, 0,2 мкг RSV Rel A и 1 мкг CMV-Vpr (WT), CMV-Vpr (R80A), CMV-Vpr (R73S), CMV-Vpr (S79I / R80D) или CMV-Vpr (E25K).Использовали контрольные плазмиды, так что каждая трансфекция получала 0,2 мкг RSV и 1 мкг плазмид CMV. Значения представлены как кратность активации по сравнению с базальной активностью ВИЧ-CAT, а столбики ошибок представляют собой SEM. ( B ) Vpr не может активировать энхансер ВИЧ в клетках NIH 3T3, которые не могут быть арестованы с помощью Vpr. Клетки NIH 3T3 котрансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT, 0,5 мкг RSV-Rel A и 1 мкг CMV-Vpr, где указано. Контрольные плазмиды использовали так, чтобы каждый образец содержал 0,2 мкг RSV и 1 мкг плазмид CMV.

Для анализа усиления транскрипции клетки Jurkat котрансфицировали каждым вектором экспрессии Vpr и Rel A, чтобы обеспечить постоянную экспрессию NF-κB и активацию транскрипции ВИЧ (рис. 1). А ). И Vpr дикого типа, и мутант E25K стимулировали активность ВИЧ-CAT (рис. 1). А ; p = 0,001 для Vpr и p = 0,044 для E25K по сравнению с нетранслированным отрицательным контролем, Vpr (ΔATG), парным тестом t ), что позволяет предположить, что ядерная локализация и включение вириона Vpr не требовались для активации Транскрипция ВИЧ с помощью Vpr; однако способность R80A, R73S и S79I / R80D к трансактивации нарушена, что свидетельствует о корреляции между трансактивацией и функциями остановки клеточного цикла Vpr.Экспрессию Vpr подтверждали вестерн-блоттингом (данные не показаны).

Чтобы дополнительно изучить, коррелирует ли остановка клеточного цикла с помощью Vpr с трансактивацией энхансера ВИЧ, мы проанализировали влияние Vpr на активность ВИЧ-CAT в клетках NIH 3T3, рост которых не задерживается с помощью Vpr (3). Клетки NIH 3T3 трансфицировали HIV-CAT и CMV-Vpr в присутствии или в отсутствие Rel A. В отличие от эффектов Vpr в клетках Jurkat, не наблюдали активации HIV-LTR в клетках NIH 3T3 в присутствии Впр (рис.1 Б ). Кроме того, когда Rel A котрансфицировали для обеспечения постоянных количеств ядерной активности NF-κB, в этих клетках не наблюдали трансактивации с помощью Vpr. Таким образом, неспособность Vpr блокировать клетки NIH 3T3 в G ₂ / M коррелировала с отсутствием активации транскрипции ВИЧ, что дополнительно предполагает, что активность Vpr по остановке роста G ₂ / M необходима для его функции трансактивации.

Для анализа специфических цис -действующих элементов промотора ВИЧ, участвующих в трансактивации Vpr, мы затем исследовали, может ли Vpr влиять на базальную и TNF-индуцированную транскрипцию ВИЧ.Клетки Jurkat трансфицировали ВИЧ-CAT и увеличивающимися количествами вектора экспрессии Vpr. Затем клетки либо оставляли нестимулированными, либо стимулировали TNF-α. Vpr индуцировал дозозависимое увеличение активности CAT в присутствии или в отсутствие TNF-α (рис. 2). А ). Чтобы определить влияние Vpr на специфические области энхансера, клетки Jurkat котрансфицировали Vpr и HIV-CAT, содержащими различные мутантные cis -действующие регуляторные элементы. Несмотря на уменьшение в отсутствие сайтов κB, мутантный энхансер κB оставался чувствительным к Vpr (рис.2 B ), предполагая, что NF-κB способствует трансактивации с помощью Vpr, но не несет полной ответственности за этот эффект. Напротив, индукция не наблюдалась при использовании мутантного репортера ΔκB / ΔTATA, предполагая, что базальный транскрипционный аппарат также необходим для трансактивации с помощью Vpr. Поскольку мутантный репортер ΔκB / ΔTATA реагирует на другие вирусные трансактиваторы (29), было очевидно, что и сайты κB, и TATA-бокс необходимы для ответа на Vpr.Влияние Vpr на индукцию NF-κB было проанализировано биохимически. Ядерные экстракты из клеток 293, трансфицированных контрольными плазмидами или плазмидами, экспрессирующими либо Vpr, либо Tax, анализировали с использованием EMSA. Экспрессия Vpr не вызвала значительного изменения активности связывания ДНК κB, в отличие от известного активатора HTLV-1 Tax (21, 30, 31), который увеличивал комплексы NF-κB (рис. 3). А ). Вестерн-блоттинг подтвердил, что Vpr существенно не изменяет уровни ядерного Rel A (1.В 3 раза выше контроля) (рис. B ), и при иммунопреципитации не было обнаружено прямого взаимодействия с Rel A (данные не показаны).

Определение цис--действующих сайтов, которые опосредуют стимуляцию Vpr транскрипции ВИЧ. ( A ) Vpr стимулирует активность усилителя ВИЧ.Клетки Jurkat котрансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT и указанными количествами CMV-Vpr. Контрольный вектор, Vpr (ΔATG), использовали так, чтобы каждый образец получал эквивалентное количество плазмиды экспрессии CMV. Через сорок два часа после трансфекции клетки стимулировали в течение 6 часов TNF-α (+ TNF-α) или оставляли нестимулированными. ( B ) Последовательности κB и TATA необходимы для трансактивации Vpr. Клетки Jurkat котрансфицировали 5 мкг HIV-CAT, (ΔκB) HIV-CAT или (ΔκB / ΔTATA) HIV-CAT и 1 мкг CMV-Vpr, где указано.Использовали контрольные плазмиды, так что каждый образец содержал 1 мкг векторов CMV. Значения представлены как кратная активация Vpr над базальным уровнем каждого репортера в отсутствие Vpr.

Vpr не влияет на связывание ДНК или ядерную транслокацию NF-κB. ( A ) Vpr не индуцирует связывание ДНК NF-κB.Ядерные экстракты из клеток 293, трансфицированных 7,5 мкг отрицательного контроля, CMV-Vpr с удаленным ATG (контроль) (дорожки 1–3), CMV-Vpr (дорожки 4–6), LTR-Tax (дорожки 7–9), или стимулированные TNF-α, анализировали с помощью EMSA с использованием меченного на конце ³² P двухцепочечного олигонуклеотидного κB-зонда. Немеченые мутантные ДНК и ДНК-конкуренты κB дикого типа (100 нг) были включены, как указано. ( B ) Vpr не индуцирует ядерную транслокацию Rel A. Ядерные экстракты из клеток 293, трансфицированных 7,5 мкг мутанта CMV-ATG отрицательного контроля Vpr (контроль) (дорожка 1) или CMV-Vpr (дорожка 2), анализировали на ядерную локализацию Rel A с помощью вестерн-блоттинга.Денситометрический анализ показал, что RelA было в 1,3 раза выше в клетках, трансфицированных Vpr.

Обнаружение того, что трансактивация Vpr происходит как через сайты κB, так и через TATA-бокс, позволяет предположить, что Vpr может регулировать функцию транскрипционного коактиватора, такого как p300, который связывается как с NF-κB, так и с компонентами TFIIB и TBP базальный транскрипционный аппарат (19). Чтобы исследовать роль p300 в активации энхансера ВИЧ с помощью Vpr, продукт гена аденовируса E1A был использован для ингибирования p300-зависимой активации гена.Форма 12S белка E1A аденовируса связывается и инактивирует p300 (32–36), ингибируя базальный и TNF-α-индуцированный NF-κB (37). 12S E1A дикого типа и мутант, связывающий p300 12S E1A, котрансфицировали ВИЧ-CAT и Vpr в Т-клетках Jurkat. 12S E1A дикого типа подавляла активацию с помощью Vpr; однако мутант 12S E1A, который не может связывать p300, не смог проявить этот репрессивный эффект (рис. 4). A ), предполагая, что p300 необходим для активации транскрипции ВИЧ с помощью Vpr. Чтобы определить, необходим ли p300 для активации базального транскрипционного аппарата с помощью Vpr, котрансфицировали (ΔκB) HIV-CAT, Vpr и 12S E1A дикого типа или связывающий мутант p300 12S E1A.Как наблюдалось ранее, активация (ΔκB) ВИЧ-CAT с помощью Vpr была ниже, чем наблюдаемая с ВИЧ-CAT; однако эффекты E1A на (ΔκB) HIV-CAT были аналогичны эффектам, наблюдаемым в случае HIV-CAT. Дикий тип, но не связывающий мутант p300 12S E1A, ингибировал Vpr-опосредованную (ΔκB) активацию HIV-CAT (рис. 4). B ), предполагая, что p300 необходим для активации транскрипции ВИЧ через базальные компоненты транскрипции.

p300 стимулирует транскрипцию ВИЧ.( A ) 12S E1A дикого типа, но не мутант, связывающий p300 12S E1A, ингибирует активацию энхансера ВИЧ с помощью Vpr. Клетки Jurkat котрансфицировали 2 мкг ВИЧ-CAT, 0,5 мкг CMV-Vpr и 2 мкг 12S E1A дикого типа или мутанта, связывающего p300 12S E1A, как указано. При необходимости использовали соответствующие контрольные плазмиды. Значения представлены как кратная активация по сравнению с базальным уровнем ВИЧ-CAT. ( B ) 12S E1A дикого типа, но не 12S E1A, связывающий мутант p300 ингибирует (ΔκB) активность HIV-CAT.Клетки Jurkat котрансфицировали 2 мкг (ΔκB) HIV-CAT, 0,5 мкг CMV-Vpr и либо 2 мкг 12S E1A дикого типа, либо мутантом, связывающим p300 12S E1A, как указано. При необходимости добавляли контрольные плазмиды. Значения представлены как активация, кратная базовому уровню активности HIV-CAT. ( C ) p300 и Vpr действуют вместе, активируя энхансер ВИЧ. Клетки Jurkat котрансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT, 0,2 мкг RSV-RelA, если указано, 1 мкг CMV-Vpr, если указано, и возрастающими количествами CMV-p300.При необходимости трансфицировали соответствующие контрольные векторы. Значения представляют собой процент превращения хлорамфеникола в анализе CAT.

Для дальнейшего изучения роли p300 в трансактивации Vpr клетки Jurkat котрансфицировали Vpr, Rel A (для обеспечения постоянного ядерного NF-κB) и увеличивающимися количествами вектора экспрессии p300. p300 оказывал дозозависимую стимуляцию в комбинации с Vpr, Rel A и Vpr плюс Rel A, а комбинация Vpr / Rel A / p300 была больше, чем аддитивная (в 100 раз) по сравнению с эффектом p300 плюс Vpr (в 36 раз) или p300 plus RelA (16-кратный) (рис.4 С ). Эти данные свидетельствуют о том, что Vpr, Rel A и p300 действуют согласованно, чтобы активировать транскрипцию ВИЧ.

Затем был исследован механизм регуляции p300 с помощью Vpr. Было показано, что соактиватор p300 стимулирует транскрипцию ВИЧ в присутствии ингибитора циклинзависимой киназы p21. Rel A связывается с концом NH ₂ p300, тогда как комплексы циклин E / Cdk2 связываются с концом COOH p300. Было показано, что Vpr вызывает остановку роста благодаря своей способности ингибировать активность киназы Cdc2.Циклин B1 также был обнаружен на низких уровнях в иммунопреципитации Rel A (19), что повышает вероятность того, что циклин B1⋅Cdc2 также может взаимодействовать с p300. Поэтому мы исследовали, может ли p300 взаимодействовать с комплексами циклин B1⋅Cdc2.

Иммунопреципитации проводили с контрольными антителами или антителами к циклину B1 на ядерных экстрактах из клеток Jurkat, а in vitro транслировали COOH-терминальный р300, были связаны с циклином B1⋅Cdc2, но не для контроля иммунопреципитации (рис.5 А ). Это взаимодействие было подтверждено in vivo в стимулированных TNF ядерных экстрактах Jurkat путем иммунопреципитации циклина B1 и вестерн-блоттинга для p300 (фиг. Б ). Хотя p300 не был обнаружен с помощью контрольных антител, он легко обнаруживался в иммунопреципитатах циклина B1. Вестерн-блот-анализ для Rel A тех же иммунопреципитированных комплексов показал, что Rel A также присутствует в комплексах циклин B1⋅Cdc2⋅p300, но не в контрольных иммунопреципитациях (рис.5 Б ). Присутствие как циклина B1, так и Cdc2 в этих комплексах было подтверждено аналогичной иммунопреципитацией циклина B1 с последующим вестерн-блот-анализом с использованием антител к циклину B1 и Cdc2 (рис. С ). Таким образом, казалось, что комплексы циклина B1⋅Cdc2⋅p300⋅Rel A существуют in vivo . Vpr также, по-видимому, не влиял на общий уровень связывания циклина B1⋅Cdc2 с p300 (рис. 5). D ).

Cyclin B1⋅Cdc2, p300 и Rel A связаны в один и тот же комплекс, на который не влияет сверхэкспрессия Vpr и влияние киназо-дефицитного Cdc2 на p300-зависимую транскрипцию ВИЧ.( A ) Комплексы циклин B1⋅Cdc2 связывают p300 in vitro . Иммунопреципитации из ядерных экстрактов Jurkat с использованием контрольных антител (дорожка 2) или антител к циклину B1 (дорожка 3) инкубировали с in vitro транслированным карбоксиконцевым p300, промывали и анализировали с помощью SDS / PAGE. Дорожки 1 и 4 показывают 10% введенного in vitro , транслированного p300. ( B ) Комплексы циклин B1⋅Cdc2 связывают p300 in vivo . Иммунопреципитацию проводили на ядерных экстрактах из клеток Jurkat, которые были обработаны TNF-α в течение 1 часа контрольным антителом (дорожка 5) или антициклином B1 (дорожка 6).Комплексы промывали и подвергали вестерн-анализу с использованием антител против р300 ( верхний ) или анти-Rel A ( нижний ). Дорожка 4 содержит 10 мкг ядерного экстракта Jurkat. ( C ) И циклин B1, и Cdc2 обнаруживаются в иммунопреципитации циклина B1 из ядерных экстрактов. Иммунопреципитацию контрольным антителом (дорожка 8) или антителом к ​​циклину B1 (дорожка 9) проводили на ядерных экстрактах Jurkat и подвергали вестерн-блоттингу с использованием антител к циклину B1 ( верхний ) или Cdc2 ( нижний ).Дорожка 7 содержит 10 мкг ядерного экстракта Jurkat. ( D ) Экспрессия Vpr не влияет на связывание циклина B1-p300. Клетки 293 трансфицировали отрицательным контролем, CMV-Vpr с удаленным ATG (контроль) (дорожки 10–12) или CMV-Vpr (дорожки 13–15), и иммунопреципитацию проводили с контрольными (C) антителами (дорожки 10 и 13). антитела p300 (дорожки 11 и 14) и антитела к циклину B1 (дорожки 12 и 15). Иммунопреципитированные комплексы подвергали Вестерн-блоттингу на р300. ( E ) Экспрессия Cdc2 с дефицитом киназы активирует транскрипцию ВИЧ через клетки Jurkat p300, котрансфицированные 5 мкг HIV-CAT, 1 мкг CMV-Cdc 2 (ΔK), где указано, или 2 мкг E1A 12S дикого типа или мутант, связывающий 12S E1A p300, как показано.Значения представлены как процент ацетилированного хлорамфеникола в анализе CAT.

Поскольку считается, что Vpr оказывает свое влияние на задержку роста за счет ингибирования активности киназы Cdc2, а циклин B1⋅Cdc2 был обнаружен в ассоциации с p300, мы затем определили, может ли мутант Cdc2, дефицитный по киназе, Cdc2 (ΔK) влиять на ВИЧ. активация транскрипции p300. Клетки Jurkat котрансфицировали HIV-CAT, плазмидой экспрессии, кодирующей Cdc2 (ΔK), которая, как было показано ранее, задерживает клетки в фазе G ₂ / M клеточного цикла (38) и 12S E1A дикого типа или 12S E1A p300. связывающий мутант.Сверхэкспрессия Cdc2 (ΔK) стимулировала активность ВИЧ-CAT, предполагая, что прямое ингибирование Cdc2 имеет такой же эффект на транскрипцию ВИЧ, что и непрямое ингибирование Cdc2 с помощью Vpr. Котрансфекция оптимальных количеств Vpr и Cdc2 (ΔK) не обеспечивала синергетической активации, и этот эффект снижался в отсутствие сайтов κB, как видно с Vpr (данные не показаны), что свидетельствует о насыщении пути активации, общего для Vpr и Cdc2. . Кроме того, активация транскрипции ВИЧ с помощью Cdc2 (ΔK) ингибировалась 12S E1A дикого типа, но не мутантом, связывающим p300 (рис.5 E ), предполагая, что трансактивация HIV-LTR посредством ингибирования Cdc2 происходит через p300. Таким образом, ингибирование связанной с p300 активности Cdc2 усиливает активацию транскрипции с помощью Rel A и p300, и вполне вероятно, что Vpr действует посредством этого механизма.

Ингибирование Vpr-опосредованной активности энхансера ВИЧ путем секвестрации p300 с помощью E1A и участие Vpr в репликации ВИЧ предполагают, что p300 также может участвовать в репликации ВИЧ.Чтобы определить, может ли p300 регулировать репликацию ВИЧ, клетки CD4–293, высокотрансфицируемая клеточная линия, которая является высоко пермиссивной для ВИЧ, трансфицировали CMV-p300 или контрольной плазмидой CMV. Эти клетки затем инфицировали ВИЧ _bru Vpr ⁺ , и репликацию вируса измеряли в дни 0, 2 и 4 путем количественной оценки активности обратной транскриптазы (RT). В присутствии CMV-p300 наблюдалось постепенное увеличение p300 по сравнению с контрольными трансфицированными клетками с 6-7-кратным увеличением через 4 дня после заражения (рис.6 A , p = 0,041, парный тест t ), существенная разница, учитывая высокую репликацию вируса в этих клетках (39). Хотя клетки CD4–293 содержат E1A, который ингибирует функцию p300, уровни сверхэкспрессии p300 смогли преодолеть до уровней эндогенного E1A, что было исследовано с помощью окрашивания серебром и вестерн-блоттинга (данные не показаны). Чтобы подтвердить этот эффект в отсутствие E1A, использовали высокотрансфицируемую E1A-отрицательную клеточную линию меланомы, UM-316.Клетки UM-316 котрансфицировали CD4 и p300 или контрольными векторами экспрессии, а затем инфицировали ВИЧ _bru Vpr ⁺ или ВИЧ _bru Vpr ^—. Активность обратной транскриптазы была определена количественно через 4 дня после заражения и продемонстрировала, что репликация ВИЧ _bru Vpr ⁺ была в 4,3 раза выше в присутствии p300, тогда как репликация ВИЧ _bru Vpr ^— практически не изменилась в присутствии p300. (Рис. 6 Б ).Эти результаты демонстрируют, что Vpr и p300 взаимодействуют для увеличения репликации ВИЧ во время острой инфекции в пролиферирующих клетках.

p300 активирует репликацию ВИЧ _bru Vpr ⁺ . ( A ) Динамика активации p300 репликации ВИЧ, стимулированной p300. Клетки 293, экспрессирующие молекулу CD4, трансфицировали 6 мкг CMV-p300 или контрольной плазмидой CMV без вставки.Клетки заражали ВИЧ через 24 часа и репликацию измеряли с помощью анализов RT через 0, 2 и 4 дня после заражения. Активность RT выражается в виде средних значений ± стандартное отклонение трех анализов. ( B ) p300 дифференциально регулирует репликацию HIV _bru Vpr ^— и HIV _bru Vpr ⁺ . Клетки UM-316 трансфицировали 0,5 мкг CMV-CD4 и либо 5 мкг контрольного вектора CMV, либо CMV-p300, как указано. Клетки инфицировали ВИЧ _bru Vpr ^— или ВИЧ _bru Vpr ⁺ через 24 часа, и репликацию вируса измеряли на 4 день с помощью анализов RT.Активность RT выражается в виде средних значений ± стандартное отклонение трех анализов.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы показываем, что активация транскрипции ВИЧ с помощью Vpr коррелирует с его способностью арестовывать клетки в G ₂ / M и опосредуется модуляцией функции транскрипционного коактиватора, которая реагирует на Cdks. Предыдущие исследования показали, что уровни РНК ВИЧ увеличиваются во время фазы G ₂ / M клеточного цикла (40), подтверждая идею о том, что Vpr связывает вирусную транскрипцию с пролиферацией клеток.Таким образом, основная роль Vpr в Т-клетках может заключаться в координации изменений в развитии клеточного цикла с увеличением экспрессии вирусных генов через p300 / CBP.

Мы обнаружили, что Vpr оказывает свое влияние на энхансер ВИЧ через p300, поскольку ингибирование функции p300 с помощью 12S E1A, но не мутант 12S E1A, неспособный связывать p300, устраняет способность Vpr активировать NF-κB. Кроме того, сверхэкспрессия p300 увеличивает способность Vpr активировать NF-κB и энхансер ВИЧ. Vpr, который ингибирует активность циклина B1⋅Cdc2 (3-5, 28), не связан напрямую с p300, но вместо этого регулирует активность циклина B1⋅Cdc2, которая, как мы показали, взаимодействует с COOH-концом этого соактиватора.В соответствии с этими наблюдениями, Cdc2 с дефицитом киназы стимулирует аналогичное увеличение активации транскрипции ВИЧ и ингибируется 12S E1A дикого типа, но не мутантом связывания p300 12S E1A, обеспечивая связь между Cdc2 и NF-κB посредством p300 в регуляции. транскрипции ВИЧ. Механизм, с помощью которого Vpr ингибирует активность Cdc2, полностью не изучен; однако белок Cdc25, который активирует Cdc2, неактивен в клетках, экспрессирующих Vpr (5), что позволяет предположить, что белки, которые обычно контролируют Cdc2, модулируются Vpr, что, в свою очередь, влияет на транскрипцию ВИЧ.Наши эксперименты с мутантом Vpr E25K, у которого нарушена ядерная локализация, но сохраняется способность арестовывать клетки, предполагают, что Vpr регулирует Cdc2-регуляторные белки, которые находятся в цитоплазме клетки и дополнительно подтверждают косвенную роль Vpr в модуляции Cdk. который взаимодействует с p300 в ядре, влияя на транскрипцию NF-κB.

В прикрепленных макрофагах, которые не пролиферируют, основная роль Vpr, по-видимому, заключается в локализации преинтеграционного комплекса в ядре (10, 11).Способность Vpr влиять на транскрипцию ВИЧ в макрофагах не проверялась; однако наши результаты предполагают, что Vpr не может в дальнейшем индуцировать функцию усилителя ВИЧ в макрофагах, поскольку его способность останавливать клеточный цикл была бы ненужной в непролиферирующих клетках, а NF-κB уже максимально индуцируется в этих клетках (41). В этих клетках, следовательно, вероятно, что NF-κB уже регулируется клеточными факторами, которые контролируют клеточный цикл и присутствуют в покоящихся клетках с помощью механизмов, независимых от Vpr.Однако, если макрофаги пролиферируют, вполне вероятно, что Vpr может влиять на транскрипцию ВИЧ посредством остановки клеточного цикла. Также недавно сообщалось, что Vpr репрессирует некоторые промоторы цитокинов, регулируемые NF-κB (42). Обобщение этих результатов, выполненных на клетках рабдомиосаркомы, неизвестно и, вероятно, будет отличаться от представленных здесь. В частности, эти эффекты затрагивали различные гены-мишени в клеточной линии, обычно не инфицированной ВИЧ.

Контроль активности NF-κB с помощью E1A хорошо изучен, а E1A стимулирует развитие клеточного цикла путем связывания и инактивации клеточных белков, таких как pRb, p107 и p300.Напротив, Vpr, по-видимому, ингибирует развитие клеточного цикла и увеличивает активность белков (p300 / CBP), которые ингибируются E1A. В отличие от E1A, Vpr, по-видимому, не связывается с p300, но активирует белок посредством непрямого механизма. Интересно, что p300, по-видимому, является молекулой, которая является точкой преобразования для этих вирусных белков, а также для путей передачи клеточного сигнала (43). Кроме того, p300 регулирует множество факторов транскрипции, не связанных с NF-κB, включая CREB (44), YY1 (45), Myb (46, 47), Jun (48), Fos (49), Sap1a (50), Stat2. (51), миогенные факторы транскрипции (52, 53), ядерные рецепторы (54) и p53 (55, 56), предположительно благодаря его способности регулировать структуру хроматина путем ацетилирования гистонов (57, 58).Также остается вероятным, что p300 может взаимодействовать с другими белками, кодируемыми ВИЧ, которые действуют на разных стадиях жизненного цикла вируса. Например, Tat также участвует в транскрипции ВИЧ и взаимодействует с основными компонентами транскрипционного комплекса. p300, благодаря своей способности реагировать на изменения клеточной пролиферации и клеточной активации, таким образом, может играть важную роль в репликации ВИЧ, координируя изменения в развитии клеточного цикла с транскрипцией специфических вирусных и клеточных генов.

Благодарности

Мы благодарим г-жу Донну Гшвенд и г-жу Нэнси Барретт за их помощь в подготовке рукописи и рисунков. Грегори Эндерс, Джим Кох и Эд Харлоу за плазмиду экспрессии Cdc2 с дефицитом киназы, д-р Ксавье Дантинн за помощь в анализе клеточного цикла и д-р. Нилу Перкинсу, Джонатану Беттсу, Марии Атанассиу и другим членам лаборатории Набель за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантами Совета по медицинским исследованиям и Fonds pour la Formation de Chercheurs et l’Aide à la Recerche (E.A.C.), Комиссии по продвижению молодых ученых и ученых Цюрихского университета, Швейцария (M.O.H.), а также стипендии для докторантов из Программы обучения иммунопатологии Мичиганского университета и Института исследований рака (L.K.F.).

Сноски

• ↵ ‡ Кому следует обращаться с запросами на перепечатку: Отделения внутренней медицины и биологической химии, Медицинский институт Говарда Хьюза, Медицинский центр Мичиганского университета, 1150 W.Медицинский центр Драйв, 4520 MSRB I, Анн-Арбор, MI 48109-0650. электронная почта: gnabel {at} umich.edu.

• Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в Proceedings Office.

• Сокращения: TNF — фактор некроза опухоли; CBP, связывающий белок CREB; LTR, длинный концевой повтор; EMSA, анализ сдвига электрофоретической подвижности; CAT, хлорамфениколацетилтрансфераза; ЦМВ, цитомегаловирус; RSV, вирус саркомы Рауса.

• Авторские права © 1998, Национальная академия наук

Белок ВИЧ-1 Vpr подавляет выработку IL-12 из человеческих моноцитов за счет усиления действия глюкокортикоидов: потенциальные последствия активности коактиватора Vpr для врожденного и клеточного дефицита иммунитета, наблюдаемого при ВИЧ-1 Инфекция

Аннотация

Белок Vpr ВИЧ-1 обладает коактиваторной активностью рецепторов глюкокортикоидов, сильно повышая чувствительность тканей-мишеней глюкокортикоидов к кортизолу.У пациентов со СПИДом и нормальной секрецией кортизола наблюдаются проявления, совместимые с гиперчувствительностью иммунной системы к глюкокортикоидам, такие как подавление врожденного и клеточного иммунитета. Последнее можно объяснить индуцированным глюкокортикоидами ингибированием цитокиновых сетей, регулирующих врожденный и управляемый Th2 клеточный иммунитет. Мы продемонстрировали, что внеклеточно вводимый белок Vpr дозозависимо потенцировал индуцированное глюкокортикоидом подавление как экспрессии мРНК, так и секреции субъединицы p35 IL-12 и голопротеина IL-12, но не субъединицы IL-12 p40 или IL-10 моноцитами человека. / макрофаги, стимулированные LPS или убитыми нагреванием, фиксированными формалином Staphylococcus aureus (штамм Cowan 1).Этот эффект подавлялся антагонистом рецепторов глюкокортикоидов RU 486. Кроме того, Vpr изменял экспрессию дополнительных пяти генов, чувствительных к глюкокортикоидам, в том же направлении, что и дексаметазон, и был активен в потенциале активации trans , но не trans . -репрессия, свойства глюкокортикоидного рецептора на ядерном факторе κB- или активация простых промоторов, регулируемых белком 1. Таким образом, внеклеточный Vpr усиливает подавляющее действие активируемого лигандом глюкокортикоидного рецептора на секрецию IL-12 моноцитами / макрофагами человека.Благодаря этому эффекту Vpr может способствовать подавлению врожденного и клеточного иммунитета у ВИЧ-1-инфицированных людей и пациентов со СПИДом.

Инфекция ВИЧ-1 приводит к снижению числа CD4 Т-клеток и нарушению клеточного иммунного ответа, что делает возможным развитие СПИДа, за счет уничтожения этих клеток вирусной инфекцией (1, 2, 3). Параллельно, дефицит врожденного и клеточного иммунитета, наблюдаемый у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, также характеризуется подавлением цитолитической активности NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов, а также ингибированием пролиферации Т-клеток и реакций гиперчувствительности замедленного типа (3). ).Одним из важных механизмов этой иммунной дисрегуляции является избирательное повреждение моноцитов / макрофагов, дендритных клеток и лимфоцитов Th2 и их цитокиновых сетей (4, 5). Таким образом, продукция IL-12 и IFN-γ NK и T-клетками, двумя цитокинами, которые регулируют и способствуют врожденному, клеточному и противовирусному иммунитету, снижается во время инфекции ВИЧ-1 (6).

Цитокины, ответственные за поляризацию ответов Th-типа, представляют особый интерес при СПИДе (7). IL-12 является центральным индуктором Th2-ответа и клеточного иммунитета, стимулируя продукцию IFN-γ NK- и T-клетками и индуцируя дифференцировку и пролиферацию клеток Th2-типа (8).Таким образом, этот цитокин, который продуцируется APC врожденной иммунной системы, такой как моноциты / макрофаги и дендритные клетки, по-видимому, имеет решающее значение для развития клеточного и, следовательно, противовирусного иммунитета (9, 10, 11). IL-12 представляет собой гетеродимерную молекулу массой 75 кДа, состоящую из субъединиц p35 и p40, кодируемых двумя отдельными генами (12, 13, 14). Как p35, так и p40 активируются в ответ на различные стимулы, включая внутриклеточные бактерии или вирусы, некоторые эндотоксины, такие как LPS, и внутриклеточные белки, выделяемые некротическими клетками (14, 15, 16, 17, 18, 19).IFN-γ, с другой стороны, не стимулирует выработку IL-12, но действует как костимулирующий сигнал, заставляя клетки производить большее количество IL-12 после соответствующих стимулов (20).

PBMC или культуры цельной крови от ВИЧ-инфицированных людей выражают заметную недостаточность продукции как IL-12 p40, так и p70 по сравнению с клетками от здоровых людей (6). Этот дефицит наблюдается по широкому спектру стимулов, исходящих от инфекционных патогенов (21). Нарушение продукции IL-12 у ВИЧ-1-инфицированных лиц, по-видимому, является избирательным, поскольку не было обнаружено изменений в секреции TNF-α, IL-1β или IL-10 (22).Низкая продукция IL-12 может быть одним из критических факторов нарушения врожденного и клеточного иммунитета у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, поскольку экзогенный IL-12 способен частично восстанавливать подавленную пролиферацию T-клеток, продукцию T- и NK-клеток. IL-2 и IFN-γ, а также литической активности NK в клетках ВИЧ-1-инфицированных людей (23). Однако механизм (ы), лежащий в основе снижения выработки IL-12 у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, остается плохо изученным.

ВИЧ-1 кодирует 96-аминокислотный вспомогательный белок, связанный с вирионом, Vpr, который выполняет множество разнообразных функций (2, 24, 25).Vpr усиливает репликацию вируса в клеточных линиях, происходящих из моноцитов и лимфоцитов (26, 27, 28), и действует как активатор транскрипции нескольких вирусных промоторов, включая промотор длинных концевых повторов ВИЧ-1 (29, 30, 31, 32) , и вызывает остановку клеточного цикла в фазе G ₂ / M (33, 34, 35). Vpr также может способствовать ядерной транслокации прединтеграционного комплекса ВИЧ-1, возможно, помогая ВИЧ-1 эффективно инфицировать неделящиеся клетки, такие как моноциты / макрофаги и лимфоциты в состоянии покоя (36, 37, 38).Поскольку Vpr связан с вирионом, он доставляется к инфицированным клеткам вместе с вирусной частицей на ранней стадии ВИЧ-1-инфекции, поражая локальные инфицированные лимфоциты, моноциты / макрофаги и дендритные клетки (39). Однако тот же вирусный полипептид также экспрессируется и секретируется инфицированными клетками хозяина после успешной интеграции провируса ВИЧ-1 в геном хозяина (40). Действительно, этот белок обнаруживается во внеклеточных жидкостях ВИЧ-1-инфицированных пациентов, таких как плазма и спинномозговая жидкость.Поскольку внеклеточно вводимый синтетический Vpr является биоактивным, вызывая остановку клеточного цикла за счет проникновения через клеточную мембрану, Vpr, секретируемый во внеклеточное пространство, может оказывать свое влияние на проксимальные и дистальные клетки и ткани, которые не инфицированы вирусом (41).

Ранее мы сообщали, что Vpr резко усиливает активность глюкокортикоидных рецепторов (GR). ² в нескольких различных клеточных линиях, функционируя как мощный коактиватор GR, через классический мотив сигнатуры коактиватора LXXLL (30).Мы также продемонстрировали, что Vpr ведет себя как адаптерная молекула между связанными с промотором факторами транскрипции и коактиваторами p300 / CBP в промоторе, чувствительном к глюкокортикоидам (42). Мы также сообщили, что промоторы, чувствительные к ядерным рецепторам, использовали тот же набор коактиваторов и комплексов транскрипции-элонгации, что и длинный концевой повтор ВИЧ-1, и что Vpr усиливал оба типа активности промотора через один и тот же механизм, взаимодействуя с коактиваторами хозяина (43). .

Глюкокортикоиды сильно ингибируют продукцию ИЛ-12 периферическими моноцитами / макрофагами, и было высказано предположение, что это основной механизм, ответственный за их избирательное подавление функций Th2 и клеточного иммунитета (44, 45, 46).Поскольку Vpr действует как усилитель активности глюкокортикоидов, мы предположили, что этот вирусный белок может способствовать нарушению выработки IL-12, наблюдаемому у пациентов со СПИДом. Мы обнаружили, что внеклеточно введенный Vpr подавляет продукцию как мРНК, так и белка IL-12, но не IL-10, из периферических моноцитов человека. Этот вирусный пептид усиливал действие дексаметазона на продукцию IL-12, и этот эффект подавлялся антагонистом глюкокортикоидов RU 486. Действие Vpr и дексаметазона на экспрессию других мРНК, регулируемых глюкокортикоидами, было сходным.Эти результаты показывают, что Vpr может ингибировать выработку IL-12 за счет усиления эндогенного действия глюкокортикоидов, потенциально способствуя дефициту врожденного и клеточного иммунитета у ВИЧ-1-позитивных людей и пациентов со СПИДом.

Материалы и методы

Очистка рекомбинантного Vpr

Рекомбинантный белок Vpr был получен с использованием системы экспрессии бакуловируса. КДНК Vpr амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров 5′-ATGATAGGATCCATGGAACAAGCCCCAGAAGACC-3 ‘и 5′-ACATGTAAGCTTCTAGGATCTACTGGCTC-3’ из pCDNA3-Vpr, который содержит последовательность Vpr дикого типа штамма NLA1 ВИЧ-1 (30).PFastBacHTb-Vpr был сконструирован путем субклонирования кДНК Vpr в сайты Bam HI и Hin dIII pFastBacHTb (Life Technologies, Gaithersburg, MD) и экспрессировал меченный шестью гистидином белок Vpr в клетках насекомых. Вирусы, содержащие последовательность His-Vpr, выделяли из клеток Dh20bac (Life Technologies), трансформированных pFastBacHTb-Vpr. Затем клетки Sf9 инфицировали такими вирусами, и лизаты клеток и культуральную среду собирали для тестирования экспрессии Vpr. В лизатах клеток было обнаружено значительное количество His-Vpr, и последующую очистку проводили с использованием осадка клеток.

Метод очистки рекомбинантного His-Vpr заключается в следующем. Осадки замороженных клеток ресуспендировали в буфере для лизиса (20 мМ фосфат калия (pH 7,4), 0,5 М NaCl, 5 мМ имидазол, 1% Твин 20, 1 мкг / мл апротинина, 1 мкг / мл лейпептина и 1 мМ PMSF) и обрабатывали ультразвуком. нарушить работу клеточных мембран. Гомогенаты центрифугировали при 14000 об / мин в течение 15 минут, супернатанты собирали и наносили на аффинную колонку с His-tag (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).His-Vpr элюировали с использованием буфера для элюции (20 мМ фосфат калия (pH 7,4), 0,5 М NaCl, 1 мкг / мл апротинина, 1 мкг / мл лейпептина, 1 мМ PMSF и 200 или 400 мМ имидазол) и затем концентрировали. с использованием Centriprep YM-10 (номинальный предел молекулярной массы, 10000) и YM-30 (номинальный предел молекулярной массы, 30 000; Millipore, Bedford, MA). Фракцию, профильтрованную с помощью YM-10, использовали для растворения обратной транскриптазы ВИЧ-1 (Pol; AIDS Research and Reagent Program, National Institutes of Health, Bethesda, MD), которую использовали в качестве контроля для очищенного His-Vpr.Во всех описанных выше процедурах мы не использовали стероиды, в том числе глюкокортикоиды. Набор для окрашивания серебром SilverXpress (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) использовали для визуализации протеинов на геле SDS-PAGE в соответствии с инструкциями производителя, а гели сушили на бумажных фильтрах. His-Vpr, выделенный на геле SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и подвергали блоттингу анти-Vpr Ab (подарок д-ра Дж. Б. Коппа, Национальные институты здравоохранения) или анти-His Ab (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния).

ELISA для измерения цитокинов

IL-12 p70, IL-12 p40 и IL-10 измеряли с помощью специальных наборов ELISA, приобретенных в R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Оптическую плотность каждого образца измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов (модель 550; Bio-Rad, Ричмонд, Калифорния), и результаты преобразовывали в концентрацию цитокинов (в пикограммах на миллилитр) с использованием стандартной кривой, рассчитанной с помощью программного обеспечения для анализа данных Microplate Manager III Macintosh. (Био-Рад).

Отмывание и культивирование моноцитов от человека-донора

Человеческие моноциты были получены от ВИЧ-1-отрицательных здоровых доноров. Мононуклеарные клетки выделяли в среде для разделения лимфоцитов, и моноциты очищали с помощью центрифугирования в противотоке, как сообщалось ранее (47). Моноциты культивировали при 5 × 10 ⁵ клеток / мл в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 1% глутамина и 50 мкг / мл гентамицина с получением конечного объема 1 мл в 24-луночных планшетах.В отдельном эксперименте FBS, обработанный декстраном / древесным углем, использовали вместо обычного FBS. Клетки праймировали 100 нг / мл IFN-γ (R&D Systems) и культивировали в присутствии возрастающих концентраций Vpr в отсутствие или в присутствии нескольких концентраций дексаметазона и / или RU 486 с последующей стимуляцией 1 мкг / мл ЛПС или 0,1% убитого нагреванием, фиксированного формалином Staphylococcus aureus (штамм Cowan 1; SAC) в 5% CO ₂ при 37 ° C в течение 18 часов. После инкубации планшеты центрифугировали, бесклеточную среду собирали и хранили при -70 ° C для определения компонентов p70 и p40 IL-12 и IL-10.Чтобы свести к минимуму разброс результатов от разных доноров, эксперименты повторяли не менее четырех раз с использованием периферических моноцитов от разных людей. Среднее значение ± стандартная ошибка LPS-индуцированных уровней p70, p40 и IL-10 составило 403 ± 16,9, 8956 ± 255 и 125,2 ± 5 пг / мл соответственно.

Определение количества мРНК, регулируемых глюкокортикоидами, с помощью ПЦР в реальном времени

Человеческие моноциты культивировали при 1,5 × 10 ⁷ клеток в присутствии 10 нг / мл Vpr и / или 10 ^-8 M дексаметазона с последующей стимуляцией 1 мкг / мл LPS.Тотальную РНК выделяли с использованием TRIzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD) в соответствии с инструкциями производителя. КДНК подвергали обратной транскрипции с помощью реагентов обратной транскрипции TaqMan (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Уровни мРНК p35 и p40 и IL-10 определяли с использованием планшета для экспрессии генов цитокинов TaqMan I (PE Applied Biosystems) в системе определения последовательности ABI PRISM 7700, как сообщалось ранее. уровни мРНК человеческого CD44, человеческого Toll-подобного рецептора 4 и индоламин-2,3-диоксигеназы; рецептор макрофагов человека со структурой коллагеназы и тромбоспондин 1, которые отрицательно или положительно регулируются глюкокортикоидами, соответственно, были определены с использованием наборов праймеров, как описано ранее (48).

Транзиторная трансфекция и репортерный анализ

Клетки HeLa карциномы шейки матки человека хранили в среде DMEM, содержащей 10% FBS, 50 мкг / мл стрептомицина и 50 Ед / мл пенициллина. Их трансфицировали 1,0 мкг / лунку pCDNA3-Vpr вместе с 1,5 мкг / лунку (IκB) ₃ -люциферазы (Luc) или AP-1-tk81-Luc и 0,5 мкг / лунку pSV40-β-Gal с помощью липофектин (Life Technologies), как описано ранее (30). pRSV-RelA (0,5 мкг / лунку) или тетрадеканоил форболацетат (10 ^-9 M) котрансфицировали или добавляли для исследования активности NF-κB или AP-1 соответственно.Чтобы сохранить такое же количество ДНК, были добавлены Bluescript SK ⁺ и / или pCDNA3. После трансфекции среду заменяли обычной средой, и клетки культивировали еще 24 часа. Затем клетки стимулировали 1 × 10 ^-6 M дексаметазоном или носителем, и лизаты клеток собирали для анализов люциферазы и β-галактозидазы еще через 24 часа. Эти ферментативные активности определяли, как описано ранее (49). pRSV-RelA, который экспрессирует компонент p65 NF-κB, был получен от Национального института здравоохранения по исследованию СПИДа и программе эталонных реагентов.pCDNA3-Vpr, которая экспрессирует Vpr дикого типа, была описана ранее. (IκB) ₃ -Luc, который содержит три κB-чувствительных элемента от промотора IκB, был подарком доктора Т. Фудзиты (Токийский столичный институт медицинских наук, Токио, Япония). AP-1-tk81-Luc, который имеет четыре AP-1-чувствительных элемента перед проксимальной частью промотора тимидинкиназы простого герпеса, был подарком д-ра К. Бамбергера (IHF, Институт исследований гормонов и фертильности, Гамбург. , Германия). Промотор-люцифераза вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV) (pMMTV-Luc), который имеет полноразмерный промотор MMTV, который содержит четыре глюкокортикоид-чувствительных элемента (GRE), был предоставлен доктором.Г. Л. Хагер (Национальный институт рака, Бетесда, Мэриленд). Bluescript SK ⁺ , pCDNA3 и pSV40-β-галактозидаза были приобретены у компаний Stratagene (Ла-Хойя, Калифорния), Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) и Promega (Мэдисон, Висконсин), соответственно.

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. Статистический анализ был выполнен с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Стьюдента t после соответствующей поправки Бонферрони.

Результаты

Vpr подавляет продукцию LPS-индуцированного IL-12 p70, но не IL-12 p40 или IL-10, в моноцитах человека

Очищенный белок Vpr, полученный из клеток насекомых, показал единственную полосу с M _r 17 кДа, обнаруженную методом окрашивания серебром на геле SDS-PAGE (рис.1⇓ А ). Полоса белка с тем же M _r была обнаружена с помощью анти-Vpr (i) или анти-His (ii) Ab в Вестерн-блоттинге (фиг. 1⇓ B ). Добавление увеличивающихся концентраций His-Vpr приводило к дозозависимому ингибированию продукции IL-12 p70 из LPS-стимулированных моноцитов человека (фиг. 2⇓ A ). Очень низкие концентрации Vpr, такие как 0,1 нг / мл, уже подавляли продукцию IL-12 до 84% от исходного уровня. Эффект Vpr становился более значительным при концентрациях 1 и 10 нг / мл с выработкой цитокинов 73 и 65% от исходного уровня соответственно.Та же самая концентрация контрольного белка, Pol HIV-1, растворенного в жидкости пустот от концентрации YM-10 во время очистки Vpr, не влияла на продукцию p70. Чтобы определить, ограничиваются ли эффекты Vpr на продукцию IL-12 стимулированным LPS IL-12, моноциты обрабатывали SAC вместо LPS и демонстрировали такой же эффект (фиг. 2⇓ B ).