Комплексная работа впр 4 класс: Итоговая комплексная работа 4 класс. 2018-2019 уч. год. | Учебно-методический материал (4 класс):

Содержание

Итоговая комплексная работа 4 класс. 2018-2019 уч. год. | Учебно-методический материал (4 класс):

Итоговая комплексная работа 4 класс. 2018-2019 уч. год.

ФИ _______________________________________________________________________

                                                                         Хлеб

        Земля кормит человека, но кормит недаром. Много должны потрудиться люди, чтобы поле вместо травы, годной только для скота, дало рожь для чёрного хлеба, пшеницу для булки, гречу и просо для каши.
       Сначала земледелец пашет поле сохой, если не нужно пахать глубоко. Или плугом, если пашет новину, или такое поле, что его пахать нужно глубже. Соха легче плуга. В неё запрягают одну лошадку. Плуг гораздо тяжелее сохи, берёт глубже. В него впрягают несколько пар лошадей или волов.
       Вспахано поле. Всё оно покрылось большими глыбами земли. Но этого ещё мало. Если поле новое или земля сама по себе очень жирна, то навоз не нужен. Но если на ниве что-нибудь уже было посеяно и она истощилась, то её необходимо удобрить навозом. Навоз вывозят крестьяне на поле осенью или весной и разбрасывают кучками. Но в кучках навоз мало принесёт пользы. Нужно его запахать сохой в землю.
        Вот навоз перегнил. Но сеять всё ещё нельзя. Земля лежит комьями, а для зёрнышка нужна мягкая постелька. Выезжают крестьяне на поле с зубчатыми боронами. Боронят, пока все комья разобьются. И тогда только начинают сеять.
         Сеют или весною, или осенью. Осенью сеют озимый хлеб: рожь и озимую пшеницу. Весною сеют яровой хлеб: ячмень, овёс, просо, гречиху и яровую пшеницу.
Озимь всходит ещё с осени. Когда на лугах трава уже давно пожелтела, тогда озимые поля покрываются всходами, словно зелёным бархатом. Жалко смотреть, как падает снег на такое бархатное поле. Молодые листочки озими под снегом скоро вянут. Но тем лучше растут корешки, кустятся и глубже идут в землю. Всю зиму просидит озимь под снегом. А весной, когда снег сойдёт и солнышко пригреет — пустит новые стебельки, новые листки,  крепче, здоровее прежних. Плохо, если начнутся морозы прежде, чем ляжет снег. Тогда озимь может вымерзнуть. Вот почему крестьяне боятся морозов без снега. И не жалеют, а радуются, когда озимь прикрывается на зиму толстым снежным одеялом.

                                                                                                                     По К. Д. Ушинскому

  1. Найдите в первом абзаце имена существительные в родительном падеже и выпишите их.

             ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

  1. Выпиши из 4 абзаца 4 предложение , выполни разбор по членам предложения, частям речи, дай характеристику предложению.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

       

3.  Выберите утверждение, которое соответствует содержанию прочитанного текста.
1) Хлеб всему голова.
2) Поля пашут плугом .
3) Человека кормит земля.
4) Крестьяне боятся морозов без снега.

    4. Подберите из теста слова с орфограммами, указанными в таблице, запиши (где возможно проверочные слова).

Слова, проверочные слова

Название орфограммы

Непроизносимый согласный звук в корне слова

Правописание сочетаний с шипящими согласными звуками

Написание существительных  нарицательных

Парный согласный звук на конце слова

Правописание частицы не с глаголом

Проверяемые безударные гласные в корне

Правописание ь  на конце сущ-ых после шипящих

5.    а)  Решите задачу.
  С колхозного поля собрано 64 000 000 кг пшеницы, это в 4 раза меньше , чем гречихи . Сколько всего гречихи  было собрано? Ответ запишите в тоннах.

Решение_____________________________________________________________________

Ответ_______________________________________________________________________

      б )    Измени  вопрос задачи так, чтобы она стала составной. Вопрос запиши .

Вопрос______________________________________________________________________

Решение_____________________________________________________________________

Ответ _______________________________________________________________________

6.  Найди значение выражения: (506 ∙ 123+29376: 72 – 61830) :4=

7. Выпишите из текста названия культурных растений. Дополните список 3 своими примерами.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8. К какому жанру относится прочитанный вами текст? 
1) Сказка.
2) Басня.
3) Повесть.
4) Рассказ.

9. Среди рисунков выберите орудие труда, о котором не говорится в тексте. Если нужно, перечитайте текст ещё раз.


10. Для защиты почвы на полях необходимо..
а) перепахивать, удобрять, уничтожать вредных насекомых и животных;
б) сажать деревья, поливать обильно, применять ядохимикаты;
в) проводить снегозадержание, сажать полезащитные полосы, правильно пахать, умеренно поливать и употреблять удобрения.

11. Птицы приносят большую пользу растениям, которые человек выращивает в полях, садах и огородах. Ответьте, в чём заключается их польза? Напишите 2 названия   этих птиц.

 ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

12. Определи тему и главную мысль текста.

Тема текста : _________________________________________________________________

 Главная мысль теста :_________________________________________________________

 

                                                                                      Ответы

№ задания

Верный ответ

Кол-во баллов

1

Человека, травы, скота, хлеба, булки, каши.

6 б.

2

      гл.             сущ.      пр. сущ.  пр.  прил.           сущ.

Выезжают крестьяне на поле   с  зубчатыми боронами.

 ( невосклицательное,повествовательное., распространенное.)

За разбор:

по чл. пр-я – 5б;

по ч. речи- 7б;

Харак-а пр-я – 1б.

Итого – 13 б.

3

3

4

  1. выезжают- езда;
  2. каши;
  3. крестьяне;
  4. плуг – плуги;
  5. не жалеют;
  6. земля-земли;
  7. рожь.

       

   7 б.+ 3б за верно подобранные проверочные слова

Итого -10 б.

5

а ) Масса собранной гречихи  — 256.000.000кг = 256.000 тонн.

б ) Вопрос  : Какова масса собранного урожая ?

  1. 64.000.000 ∙ 4 + 64.000.000= 320.000.000кг= 320.000 т.

 

  3б.

6

204

 5 б

7

Рожь, пшеница, гречиха, просо, ячмень, овёс …. (слива, яблоня, ранетка.)

6 б.+ 3 б

8

рассказ

1б.

9

   Ответ – б )

10

   Ответ —  в )

1 б

11

 Главная польза птиц — уничтожение насекомых-вредителей. Скворец, синица.

 

 3 б

12

Тема : Много  людям  нужно трудиться ,чтоб получить урожай.

Основ. мысль : Земля – кормилица.

  2 б

Итого — 55 баллов.

Анализ комплексной работы

Уровень сформированности умений

Для учителя

      Ф.И.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Кол.

баллов

Всего %

Уровень

Отметка

1

2

3

Итого:

Диапазон

Уровень

86%-100%

Высокий

66%-85%

Выше среднего

41% — 65%

Средний

0% — 40%

Низкий

Уровень

Количество человек

Доля (%)

Высокий

Выше среднего

Средний

Низкий

Общие данные по 4 классам для сдачи в РУО

Всего учащихся

Выполняли работу

Качество

знаний

Успеваемость

Средний

балл

   Текстовый анализ работы делается в свободной форме. Указываются  задания, с которыми учащиеся справились и задания, вызвавшие затруднения.

Мудрый гном — Урок ОБЖ в начальной школе «Как сохранить улыбку красивой?»

1. Орг. момент

1мин.

Если только рассмеяться, 
То начнутся чудеса – 
От улыбок прояснятся
И глаза, и небеса.
Ну-ка взрослые и дети,
Улыбнитесь поскорей, 
Чтобы стало на планете
И светлее, и теплей!

«Как сохранить улыбку красивой?”

2. Знакомство с темой занятия

3мин.

Ребята, а какую улыбку можно назвать красивой? (Добрая, открытая, радостная, нежная, с красивыми зубами,… — ответы детей)

После высказываний — варианты ответов на компьютере.

 

Подвести детей к мысли, что не на всякие зубы приятно смотреть.

3. Знакомство с новыми понятиями

7мин.

А знаете ли вы, ребята, что зуб – это живой орган!

Каждый зуб состоит из трёх основных частей:

Коронка – часть зуба, которая видна в полости рта;

Корень – часть зуба, которая располагается в челюсти;

Шейка – часть зуба, которая располагается между коронкой и корнем. Она прикрыта десной.

Рассматривание изображения зуба, пояснение непонятных моментов.

Знаете ли вы?

Зубы покрыты эмалью.

Она твёрдая, защищает зубы от повреждения.

Если за зубами неправильно ухаживать – появляется дырочка (кариес)

Дырка в зубе – всегда больно!

А ещё больные зубы вредят другим органам – сердцу, почкам…

4. Работа над темой занятия.

10мин.

Ребята, у кого из вас выпадали зубы?

А почему это происходило?

Обычно дети не слишком огорчаются оттого, что у них выпадают молочные зубы, даже когда во рту образуется пустое пространство между зубами. Вы ведь прекрасно понимаете: выпадают молочные зубы, значит, вы растёте!

Возьмите зеркало и рассмотрите свои зубы. Найдите молочный и постоянный.

Чем отличаются молочные зубы от постоянных?

В разных странах существуют разные обычаи, связанные с выпадением зубов:

В Америке – дети кладут на ночь выпавший зуб под подушку на ночь специально для Зубной Феи, которая может забрать зуб и положить вместо него несколько монеток!

У испанцев надо забросить зуб на крышу дома и рассказать смешной стишок, приглашая мышонка, взять старый зуб и принести новый.

Кстати, в России, тоже зовут мышку, но зуб принято класть на печку.

Когда японский ребёнок теряет зуб, он бросает его в воздух и кричит: «Превратись в зуб Они!” (Они – это японское чудовище, у которого очень крепкие зубы).

А что вы делаете, когда у вас выпадает зуб? Истории детей.

На доске появляются таблички:

«МОЛОЧНЫЕ ЗУБЫ”,

«ПОСТОЯННЫЕ ЗУБЫ”

на доске:

1. Постоянные больше по размеру.

2. Временные бело-голубоватого цвета.

5. Постановка проблемного вопроса

3мин.

Как у нашей Любы 
Разболелись зубы: 
Слабые, непрочные — 
Детские, молочные… 
Целый день бедняжка стонет, 
Прочь своих подружек гонит: 
— Мне сегодня не до вас! 
Мама девочку жалеет, 
Полосканье в чашке греет, 
Не спускает с дочки глаз. 
Папа Любочку жалеет, 
Из бумаги куклу клеит. 
Чем бы доченьку занять, 
Чтобы боль зубную снять?…
Как вы думаете, 
почему болели зубы у Любы?

 

6. Решение проблемного вопроса

10мин.

Что вредно для зубов? Обсуждение ответов детей. Вывод на компьютере:

НЕЛЬЗЯ:

Грызть орехи

Есть очень холодную или очень горячую пищу

Есть вредную для зубов пищу (особенно много сладкого)

Дети принесли на урок этикетки от продуктов, которые часто едят дома. Рассмотрим этикетки, найдём слова, которые обозначают сладкое. Разделим этикетки на 2 части: с высоким содержанием сахара и низким.

Как вы думаете, какие продукты питания позволяют поддерживать здоровье зубов?

Что нужно сделать, чтобы зубы не болели?

Ребята составляют правило – можно записать их да доске или предложить зарисовать в виде знаков-плакатов. Как вывод можно разучить стихотворение:

Как поел, почисти зубки.
Делай так два раза в сутки.
Предпочти конфетам фрукты, 
Очень важные продукты!

Сахар, сироп, мёд, мальтоза, фруктоза, цукроза.

Творог, молоко, кашу, особенно овсяную, так как в них содержатся кальций и фосфор, укрепляющий эмаль зубов.

7. Практикум

5мин.

ПРАВИЛА ЧИСТКИ ЗУБОВ

 

8. Работа над проблемой

7мин.

А что делать, если зубы всё же заболели? Дать возможность детям рассказать случаи из жизни

Зубные врачи – стоматологи – знают:

как помочь при зубной боли

как некрасивые зубы сделать красивыми!

Чтобы зуб не беспокоил,
Помни правило такое:
К стоматологу идём 
В год два раза на приём.
И тогда улыбки свет
Сохранишь на много лет!

9.Работа над формулировкой вывода

3мин.

Давайте сделаем вывод, как же сохранить улыбку красивой?!

Ешьте фрукты и овощи.

Не злоупотребляйте сахаром и сладостями!

Чистите зубы два раза в день: после завтрака и перед сном.

Меняйте зубную щётку каждые 3 месяца!

Дважды в год посещайте стоматолога.

И у вас будет ослепительная улыбка!

 

10. Итог урока

1мин.

В начале урока вы мне сказали, что красивая улыбка – это добрая, хорошая улыбка. Когда мы улыбаемся – мы делимся своим хорошим настроением! И чем чаще мы это делаем, тем больше человек будут радоваться жизни вместе с нами! Давайте чаще улыбаться!

Если только рассмеяться, 
То начнутся чудеса – 
От улыбок прояснятся
И глаза, и небеса.

Ну-ка взрослые и дети,
Улыбнитесь поскорей, 
Чтобы стало на планете
И светлее, и теплей!

 

Персональный сайт — 4 класс

Контрольные работы начальная школа

Нумерация многозначных чисел

Решение задач

Нахождение доли числа и числа по доле

Итоговая аттестация по математике 4 класс

ВКР по математике          ВПР 2016      ВПР 2015   Математика 2017      Вариант 22-31     Тренажер ВПР по математике     Тренажер  ВПР по математике 

ВКР по русскому языку      ВПР 2015    Тренажер ВПР по русскому языку    Тренажер  ВПР по русскому языку    Тренажер ВПР по русскому языку

ВКР по окружающему миру      ВПР 2016   В 21  В 24  В 26     В 27    В 33   В 34

Образцы проверочных работ 2016г.

Комплексная работа на метапредметной основе вариант 1

Комплексная работа на метапредметной основе вариант 2

Комплексная работа на метапредметной основе вариант 3

Комплексная работа на метапредметной основе вариант 4

Комплексная работа на метапредметной основе вариант 5

Комплексная работа на метапредметной основе вариант 6

Комплексная работа на метапредметной основе вариант 7

Метапредметная работа 2017  вариант 1       вариант 2

Олимпиада по физической культуре 4 класс    3 класс

  • Образец проверочной работы по русскому языку. 4 класс. 2019 г.
  • Описание проверочной работы по русскому языку. 4 класс. 2019 г.
  • Образец проверочной работы по математике. 4 класс. 2019 г.
  • Описание проверочной работы по математике. 4 класс. 2019 г.
  • Образец проверочной работы по окружающему миру. 4 класс. 2019 г.
  • Описание проверочной работы по окружающему миру. 4 класс. 2019 г.

РЕШУ ВПР 

ВПР Математика 4 класс 2021 год

ВПР Русский язык 4 класс 2021 год

 

Местоимения  Слова с удвоенной согласной  Слова с удвоенной согласной   Слова с удвоенной согласной

Суффиксы ОК ЕК ИК   О/Е в окончаниях имён существительных Т.п.после шипящих и Ц

О/Е в окончаниях имён существительных Т.п.после шипящих и Ц № 2   Суффиксы ОК, ЕК, ИК

Итоговые проверочные работы. Русский язык. Математика. Итоговая комплексная работа. 4 класс | 978-5-358-23543-4

Стоимость товара может отличаться от указанной на сайте!
Наличие товара уточняйте в магазине или по телефону, указанному ниже.

г.Поворино, ул.Советская, 87

8 (47376) 4-28-43

г. Воронеж, ул. Плехановская, д. 33

8 (473) 252-57-43

г. Воронеж, ул. Ленинский проспект д.153

8 (473) 223-17-02

г. Воронеж, ул. Хользунова, д. 35

8 (473) 246-21-08

г.Воронеж, ул. Жилой массив Олимпийский, д.1

8 (473) 207-10-96

г. Воронеж, ул.Челюскинцев, д 88А

8 (4732) 71-44-70

г. Воронеж, ул. Пушкинская, 2

8 (473) 300-41-49

комплексные контрольные работы 4 класс правильный ответ

Ссылка:

http://ihynizul.sabemo.ru/6/64/kompleksnye-kontrolnye-raboty-4-klass-pravilnyy-otvet


комплексные контрольные работы 4 класс правильный ответ Контрольные и практические работы по русскому языку для качественной проверки знаний . Комплексные контрольные работы . 4 класс. Прочитай текст. Заяц-русак относится к крупным зайцам. Литературное чтение. К какому разделу можно отнести данный текст? Выбери правильный ответ. А) Сказания и легенды о животных. Е.И. Самонова) и «Тетрадь для контрольных . Методическое пособие « Уроки русского языка в 4 классе» является составляющей . турный блок ( определение темы и основной мысли текста, ответы на вопросы по содерь . комплексной работы по расширению словарного запаса школьников, овладению . 12 ноя 2014 . . контрольная работа по рассказу И. Тургенева Воробей; 4 класс . Выбор правильного ответа из нескольких данных;; Заполнение . ку. Если нужно, перечитай сказку ещё раз. Задание 4. Выбери правильный ответ и отметь его значком . Столько же «ног», сколько у мыши … А) у совы. Контрольные работы для учителей начальных классов. . •со свободным развернутым ответом (требуется записать полный ответ, решение или объяснение к ответу). Комплексная итоговая контрольная работа проводится после изучения . Образец ВПР по математике для 4 класса содержит 11 заданий. Контрольные работы для учителей начальных классов. . •со свободным развернутым ответом (требуется записать полный ответ, решение или объяснение к ответу). Комплексная итоговая контрольная работа проводится после изучения . Образец ВПР по математике для 4 класса содержит 11 заданий. Диктант. 3. 3. Контрольная работа. 4. 4. Сочинение. 4. 4. Изложение. 4. 4 . При планировании контрольных работ в каждом классе необходимо предусмотреть .. Развернутый ответ ученика должен представлять собой связное, логически .. В комплексной контрольной работе, состоящей из диктанта и . Комплексная работа проверяется в строгом соответствии с критериями оценки и кодами правильных ответов (в. Комплексная контрольная работа 4 класс . 24 окт 2012 . Контрольные работы по окружающему миру в 4 классе по УМК Школа России А.А. Плешаков : За . В заданиях под синим номером только один правильный ответ. . Комплексные работы для младших школьников. Пробный региональный экзамен, 4 класс , 2 вариант. Инструкция по выполнению работы. Комплексная работа выполняется в два дня. Время на выполнение каждой части – 45 минут. Затем аккуратно перенесите правильные ответы в. комплексной промежуточной работы для учащихся 4 классов (для оценки индивидуальных достижений. Задания с выбором одного правильного ответа из нескольких. Контрольные работы для учителей начальных классов. . •со свободным развернутым ответом (требуется записать полный ответ, решение или объяснение к ответу). Комплексная итоговая контрольная работа проводится после изучения . Образец ВПР по математике для 4 класса содержит 11 заданий. Мониторинг подготовки обучающихся 4-х классов проводится по четырем . Контрольная работа представлена в тестовой форме. . ответа. Все задания примерно равнозначны по сложности. Необходимо . При выполнении тестовых заданий из предложенных ответов выберите правильный и поставьте . Входная контрольная по математике для 1 класса по математике, тест дошкольников Тесты по математике — 4 класс по учебнику Моро за 1, 2, 3 и 4 четверть. Проверочные тесты на темы . Комплексные контрольные работы в начальной школе (теория и локальный . типы заданий: с выбором правильного ответа из предложенных вариантов ; . Учащиеся 1-4 классов (в соответствии с требованиями ФГОС НОО) . Итоговые комплексные работы. 4 класс. ФГОС Логинова, Яковлева .. Есть дополнения, ответы, лист самооценки, методические рекомендации. Как мама . ФГОС Русский язык. 4 класс. Контрольные работы. Часть 1. ФГОС 3 рец.
2017/04/16(日) 07 53:24 | Unclassified | トラックバック 0

МАОУ «Экономическая гимназия» — Независимая оценка качества образования

Независимая система оценки качества образования 

2019-2020 учебный год

Контрольная работа по английскому языку 9 классы

2018-2019 учебный год

ВПР 5 классы — биология, история, математика, русский язык,

ВПР 6 классы — биология, география, история, математика, обществознание, русский язык,

ВПР 7 классы — английский язык, биология, география, история, обществознание, русский язык, физика,

ВПР 11 классы — английский язык, биология, география, история, физика, химия,

1 классы май 2019 г.

ВПР 4 классы апрель 2019 г.

Комплексная работа 4 классы

Стартовая диагностика 1 классы

Форма выражения мнений гражданами о качестве образовательной деятельности организаций, осуществляющих образовательную деятельность

2017-2018 учебный год

Мониторинг 1 классы май 2018

ВПР 11 классы англ.яз. 2018

ВПР 11 классы география 2018

ВПР 10 классы география 2018

ВПР 11 классы физика 2018

ВПР 11 классы химия 2018

ВПР 11 классы биология 2018

ВПР 11 классы история 2018

ВПР 5 классы биология апрель 2018

ВПР 6 классы биология апрель 2018

ВПР 6 классы география апрель 2018

ВПР история 5 классы апрель 2018

ВПР математика 5 класс апрель 2018

ВПР математика 6 класс апрель 2018

ВПР обществознание 6 класс апрель 2018

ВПР русский язык 5 класс апрель 2018

ВПР русский язык 6 класс апрель 2018

ВПР 4 класс апрель 2018

4 класс русский язык октябрь 2017

4 класс математика октябрь 2017

2 класс русский язык октябрь 2017

4 класс русский язык октябрь 2017

4 класс комплексная работа октябрь 2017

2016-2017 учебный год 

ВПР апрель-май 2017 года

ВПР 6 класс английский язык март 2017

ВПР 6 класс комплексная работа март 2017

ВПР 6 класс математика март 2017

ВПР 6 класс русский язык март 2017

ВПР 5 класс биология апрель 2017

ВПР 5 класс история апрель 2017

ВПР 5 класс математика апрель 2017

ВПР 5 класс русский язык апрель 2017

ВПР 4 класс окружающий мир апрель 2017

1 классы математика, литературное чтение апрель 2017 

Результаты всероссийской проверочной работы по русскому языку во 2-х классах

Стартовая диагностика обучающихся 1-х классов по материалам ФГАУ «ФИРО» по системе Занкова Л.В.:

1″А» класс, 1″Б» класс, 1″В» класс, 1″Г» класс, сводная таблица

2015-2016 учебный год 

ВПР апрель-май 2016

Математика 7-е классы

Математика 10-й класс

Математика 11-е классы

2014-2015 учебный год 

Русский язык 4- е классы

Математика 4-е классы

Окружающий мир 4-е классы

Комплексная работа 4-е классы

февраль 2015

Математика 11А, 11Б

Демоверсии для учащихся 2-4 классов

математика 4 класс 1,   2

Русский язык 4 класс 1,    2

математика 3 класс 

Русский язык 3 класс 

математика 2 класс 

Русский язык 2 класс 

Комплексная работа 2 класс

Стартовая диагностика 1 классы

октябрь 2014 г.

русский язык 10Б

физика 10Б

обществознание 10А, 10Б (гум), 10Б (физ-мат)

математика 10А документ 

математика 10 Б документ

сентябрь 2014 г.

Стартовая диагностика

1 В документ

1 Б документ

1 А документ

4 класс. Кузнецова. Комплексные проверочные работы (Вентана-Граф)

Переплет мягкий
ISBN 978-5-36-011184-9
Количество томов 1
Формат 84×108/16 (205×260мм)
Количество страниц 80
Год издания 2021
Серия Начальная школа XXI века
Издательство Вентана-Граф
Автор
Возрастная категория 4 кл.
Раздел Литература, Математика, Окружающий мир, Русский язык
Тип издания Контрольные задания и тесты, Рабочая тетрадь
Язык русский

Описание к товару: «Кузнецова. Работа с текстом и информацией 4 класс. Комплексные проверочные работы. Оценка планируемых результатов»

Предлагаемые проверочные работы позволят определить степень овладения осмысленным чтением и другими метапредметными умениями, охарактеризовать индивидуальный уровень их применения при работе с информацией, представленной в различном виде (текст, схемы, иллюстрации). Предлагаемые работы способствуют активизации знаний по всем основным предметам (русский язык, литературное чтение, математика, окружающий мир). Задания составлены на основе ситуаций, часто встречающихся в реальной жизни. Результаты работ могут служить основой для принятия обоснованных педагогических решений о дальнейшем ходе обучения.

Всего в тетради содержится 4 работы (каждая в двух вариантах), которые рекомендуется распределить по четырём четвертям.

Раздел: Математика

Издательство: ВЕНТАНА-ГРАФ
Серия: Начальная школа XXI века

Вы можете получить более полную информацию о товаре «4 класс. Кузнецова. Комплексные проверочные работы (Вентана-Граф)«, относящуюся к серии: Начальная школа XXI века, издательства Вентана-Граф, ISBN: 978-5-36-011184-9, автора/авторов: Рыдзе О.А., Кузнецова М.И., если напишите нам в форме обратной связи.

Роль Vpr ВИЧ-1 в содействии инфицированию неделящихся клеток и остановке клеточного цикла

Curr Opin HIV AIDS. Авторская рукопись; доступно в PMC 2013 21 октября.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC3802534

NIHMSID: NIHMS513426

Центр иммунологии и микробных заболеваний, Медицинский колледж Олбани, Олбани, Нью-Йорк 12208, корреспондент 9 Карлос MC де Норонья, доктор медицины, здание медицинских наук 216, MC-151, Медицинский колледж Олбани, Олбани, штат Нью-Йорк 12208, тел .: 518-262-1175, факс: 518-262-6161, [email protected] См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Purpose

Поиск роли (ей), которую Vpr ВИЧ-1 и его паралоги Vpr и Vpx HIV2 / SIV играют в вирусной инфекции и патогенезе, показал, что все три участвуют в комплексах убиквитин-лигазы CRL4. Эта ассоциация запускает убиквитинирование и деградацию клеточных субстратов. Идентичность субстратов убиквитинлигазы только сейчас начинает выясняться. Этот обзор посвящен недавней работе, в которой был идентифицирован один такой субстрат и выявлены новые клеточные ограничения для инфекции.

Недавние открытия

Три группы описали клеточные факторы, ограничивающие инфицирование ВИЧ-1 в клетках миелоидной линии. Было показано, что один из этих факторов, SAMHD1, истощается за счет комплекса убиквитин-лигазы CRL4 в присутствии HIV-2 / SIV Vpx. Другое ограничение может быть снято с помощью Vpx в отсутствие по крайней мере одной части убиквитинлигазного комплекса, который запускает истощение SAMHD1.

Другая группа показала, что ранее описанная повышающая регуляция лигандов NK-клеток на поверхности ВИЧ-1-инфицированных клеток требует действия как цитидиндезаминазы APOBEC3G, так и урацил-N-гликозилазы 2 в сочетании с ВИЧ-инфекцией. 1 Впр.

Резюме

По мере того, как все больше партнеров по клеточному взаимодействию идентифицируется для Vpr ВИЧ-1 и его паралогов из других вирусов, появляются подробности о функции Vpr. Недавние открытия подчеркнули существование двух новых белков человека, которые могут бороться с ВИЧ-инфекцией, и показали, как белки ВИЧ-1 действуют согласованно, модулируя взаимодействие между NK-клетками и ВИЧ-1-инфицированными клетками.

Ключевые слова: ВИЧ, SIV, Vpr, Vpx, SAMHD1

Введение

Взаимодействие между ВИЧ и клетками миелоидного клона играет жизненно важную роль в ВИЧ-инфекции и патогенезе.Дендритные клетки и макрофаги являются важными компонентами иммунной системы, соединяющими врожденный и адаптивный иммунитет, чтобы в конечном итоге организовать защиту, необходимую для блокирования вторгшихся микробов. Ключевые особенности биологии ВИЧ позволяют этому вирусу существовать, несмотря на защиту хозяина.

Дендритные клетки, как плазмацитоидные, так и миелоидные, отрицательно влияют на ВИЧ-инфекцию. У инфицированных людей снижается количество дендритных клеток в крови [1, 2]. Хотя точная причина этого снижения неизвестна, потеря этих критических иммунных компонентов ухудшает реакцию против ВИЧ.Действительно, снижение количества дендритных клеток указывает на плохой прогноз на моделях макак [3] и у людей [4]. Оставшиеся дендритные клетки обладают многочисленными чертами, которые только еще больше ослабляют иммунитет. Во-первых, эти клетки демонстрируют дисбаланс про- и антиапоптотических факторов, что способствует апоптозу [5]. Во-вторых, активация Т-клеток этими клетками сильно нарушена [6]. Наконец, взаимодействие этих клеток с вирионами ВИЧ-1 приводит к снижению способности связываться с NK-клетками, тем самым ограничивая активность NK-клеток [7].

Хотя ВИЧ-1 может инфицировать дендритные клетки, он делает это неэффективно. Это может, по крайней мере на самых ранних стадиях инфекции, принести пользу ВИЧ-1, поскольку отсутствие репликации в этих клетках может позволить вирусу избежать обнаружения системами, которые в противном случае запустили бы продукцию интерферона (IFN) [8]. Другая хорошо известная роль миелоидных дендритных клеток заключается в том, чтобы действовать как «троянские кони», облегчая перенос вируса к CD4 + Т-клеткам. ВИЧ-1 передается CD4 + Т-клеткам по иммунологическому синапсу, который формируется между двумя типами клеток [9].Это может как способствовать заражению Т-клеток, так и, по крайней мере, временно помочь вирусу избежать обнаружения.

Современные знания о взаимодействии дендеритных клеток с ВИЧ получены в основном из исследований in vitro . Технические препятствия, включая ограниченную доступность крови от ВИЧ-инфицированных пациентов, тот факт, что дендритные клетки составляют лишь небольшую часть клеток крови, потерю дендритных клеток на ранней стадии инфекции и отсутствие моделей животных, не относящихся к приматам, ограничивают анализы, которые мог быть выполнен.Несмотря на трудности, связанные с работой in vivo , начинает появляться новая информация. Zhang et al. смогли продемонстрировать, in vivo , что ВИЧ-1 может инфицировать плазмоцитоидные дендритные клетки, и это может приводить как к активации, так и к функциональному нарушению этих клеток, поскольку они проявляют пониженный ответ на стимуляцию TLR7 / 9 [10]. Это произошло как в костном мозге, так и в селезенке и коррелировало со снижением количества CD4 + Т-клеток [10]. Исследования с использованием образцов ткани ex vivo или моделей тканей для имитации среды in vivo также дали представление о том, что может происходить при реальной инфекции человека.Действительно, модели шейно-вагинальной ткани [11] и мужских половых путей [12] внесли свой вклад в наше понимание передачи и распространения ВИЧ. Примечательно, что подобные модели привели к участию клеток Лангерганса в поглощении и передаче ВИЧ-1 [12]. Эти исследования указывают на важность дендритных клеток в патогенезе ВИЧ.

Инфекция макрофагов ВИЧ-1 вносит вклад в патологию ВИЧ несколькими способами. Инфекция макрофагов ВИЧ-1 приводит к активации клеток и, в конечном итоге, к активации молекул, которые могут запускать апоптоз CD4 + и, возможно, CD8 + Т-клеток при контакте [13, 14].В то время как инфицированные Т-клетки умирают вскоре после заражения ВИЧ, инфицированные макрофаги могут сохраняться месяцами и, таким образом, выступать в качестве долгосрочных резервуаров вируса. Подобно дендритным клеткам, инфицированные макрофаги могут переносить ВИЧ-1 в CD4 + Т-клетки и могут активировать наивные инфицированные CD4 + Т-клетки, что приводит к усилению транскрипции провирусов [15].

В целом, ВИЧ разрушает опосредованную клетками защиты миелоидного клона защиту путем: прямого истощения этих клеток, ухудшения их способности связываться с другими типами клеток, использования их для получения доступа к CD4 + Т-клеткам и создания латентных резервуаров.

Геном ВИЧ-1 кодирует несколько специализированных белков, которые адаптируют среду клетки-хозяина для облегчения репликации вируса. Из них белок Vpr, связанный с вирионом 17 кДа, остается одним из наименее изученных с точки зрения его вклада в репликацию и патологию ВИЧ. Интересно, что ВИЧ2 и некоторые SIV кодируют два Vpr-подобных белка, Vpx и Vpr. В то время как многие функции приписываются Vpr ВИЧ-1, две из них наиболее широко признаны — это запускающая остановка на стадии G2 клеточного цикла делящихся клеток и усиление инфицирования терминально дифференцированных макрофагов.Они являются общими с HIV-2 / SIV Vpr и Vpx соответственно. Функция остановки была связана с ассоциацией Vpr с убиквитин-лигазным комплексом CRL4 через адаптерный белок DCAF1 [16-22] (). Эта ассоциация необходима для установления внутриклеточного состояния, которое имитирует ответ на повреждение ДНК [17, 23].

Структура комплекса убиквитин-лигазы CRL4 и сводка связанных с ним функций в присутствии Vpr или Vpx

Является ли запуск клеточного цикла G2 блокировкой функции, которую Vpr эволюционировал для выполнения, или побочным продуктом другой роли, которую играет Vpr? Goh et al. предположил, что фаза G2 клеточного цикла, когда клеточный хроматин реплицируется, но до того, как клеточные структуры разбираются при подготовке к делению клетки, обеспечивает оптимальную среду для производства вируса [24]. Однако более поздние исследования показали, что реакция на повреждение ДНК также запускает экспрессию лигандов NK-клеток на поверхности инфицированных клеток [25, 26]. Цель экспрессии лиганда NK на инфицированных клетках в настоящее время остается неоднозначной.

Роль ВИЧ-1Vpr в макрофагальной инфекции также еще предстоит определить.Ранние исследования связывали HIV-1 Vpr, который имеет по крайней мере два сигнала ядерного импорта и один сигнал ядерного экспорта [27], с транслокацией пре-интеграционного комплекса в ядро ​​клетки [28–32]. Хотя Vpr действительно обладает сигналами ядерного импорта, они также присутствуют на др. Компонентах преинтеграционного комплекса [33]. Таким образом, может существовать избыточность для обеспечения импорта при различных условиях. Однако другие данные свидетельствуют о том, что ядерный импорт может происходить без каких-либо ранее идентифицированных сигналов ядерного импорта, связанных с вирионом [34, 35].ВИЧ-1 заражает макрофаги менее эффективно, чем ВИЧ-2 / SIV, но в этом контексте Vpr может иметь важное значение в установлении инфекции. Повышенная эффективность инфекции ВИЧ-2 / SIV может быть связана с действием Vpx, который, как было показано, побеждает доминирующий ингибитор ретровирусной репликации, обнаруживаемый в клетках миелоидной линии [36–38].

Последние уроки, полученные от Vpr и его паралогов ВИЧ-2 / SIV Vpr и Vpx

ВИЧ-1 не инфицирует макрофаги так же эффективно, как CD4 + Т-клетки.Тем не менее макрофаги продуктивно инфицированы ВИЧ-1, и Vpr играет ключевую роль в этом процессе [39]. ВИЧ-2 и SIV, с другой стороны, демонстрируют значительно большую эффективность инфицирования макрофагами, чем ВИЧ-1, и это было приписано Vpx [40]. Филогенетический анализ предполагает, что ВИЧ-2 Vpr и ВИЧ-2 Vpx возникли в результате события дупликации гена Vpr-подобного предшественника ВИЧ-1 [41]. Способность ВИЧ-2 Vpx значительно усиливать инфекцию макрофагов приписывалась его способности препятствовать функции противовирусного фактора.Новая информация о взаимодействии между Vpr ВИЧ-1 и Vpr SIV / HIV-2 и антивирусными белками хозяина быстро появляется и дает важные ключи к разгадке роли Vpr ВИЧ-1 в инфекциях человека.

Две группы в новаторских смежных публикациях описали использование коиммунопреципитации для выделения SAMHD1 в качестве клеточного партнера для SIV / HIV-2 Vpx [42, 43]. Они также продемонстрировали, что этот белок собирается с комплексом убиквитин-лигазы CRL4 Vpx-зависимым образом и что клетки истощаются по SAMHD1 в присутствии Vpx.Важно отметить, что истощение SAMHD1 усиливает инфекцию как дендритных клеток, так и макрофагов [42, 43], помогая вирусу преодолеть блокировку обратной транскрипции [42]. Интересно, что в то время как работа Laguette и его коллег показывает, что экспрессия SAMHD1 коррелирует с ограничением вируса [43], Hrecka очищает SAMHD1 из линии эмбриональных клеток почек человека HEK 293T. Эта линия не является устойчивой к инфицированию ВИЧ-1, несущим белок VSV-G вместо гликопротеина env ВИЧ-1 [42]. Это наблюдение, конечно, предполагает, что SAMHD1 может быть необходим, но недостаточен для ограничения ретровирусов.Схема ограничения вирусов кратко изложена в.

Характер рестрикции ВИЧ-1 и ВИЧ-2 / SIV в моноцитарных дендритных клетках и макрофагах

SAMHD1, как следует из названия, характеризуется как стерильным альфа-мотивом (SAM), так и металл-зависимой фосфогидролазой (HD) домен. Мутации в SAMHD1 присутствуют почти у пятой части всех пациентов с синдромом Айкарди-Гутьера. У этих пациентов отсутствие функции SAMHD1 вызывает симптомы, напоминающие вирусную инфекцию. Это аналогично дефициту других ферментов, которые предотвращают накопление пулов нуклеиновых кислот, которые могут вызвать врожденный иммунный ответ.Пулы нуклеиновых кислот могут включать пулы, генерируемые вирусной инфекцией. Ферментативно SAMHD1 действует как dGTP-регулируемая дезоксинуклеотидфосфогидролаза [44, 45].

Другая недавняя публикация также была посвящена влиянию факторов клеточного ограничения на ретровирусную инфекцию. Pertel et al. исследовал влияние интерферона-бета (IFN-β) и липополисахарида (LPS) на инфекции в макрофагах и дендритных клетках, происходящих из моноцитов [46]. Они обнаружили, что лечение этими двумя агентами запускает мобилизацию того, что кажется еще одним барьером для ретровирусной инфекции.В то время как блок SAMHD1 нацелен на вирус во время обратной транскрипции, рестрикция, индуцированная LPS / IFN-β, по-видимому, находится на уровне или около ядерного импорта преинтеграционного комплекса и до интеграции провируса. Интересно, что только ВИЧ-1, но не ВИЧ-2 или инфекция SIV, выиграли от действия Vpx против индуцированного ограничения MDDC. Это говорит о том, что ВИЧ-1 может иметь уникальную особенность в своих нуклеиновых кислотах или белках, которая позволяет ему избегать противовирусного фактора в присутствии Vpx. Кроме того, хотя Vpx снимает блокировку, он не требует DCAF1, адаптера, который ВИЧ1 Vpr и Vpx используют для задействования функции убиквитинлигазы.Это оставляет открытой возможность того, что Vpx либо напрямую блокирует фактор, либо направляет его истощение через другие белки. Так, Pertel et al. определили еще один фактор рестрикции ВИЧ, который может быть побежден вирусным белком. Все ограничения дендритных клеток суммированы в.

Резюме текущих знаний об ограничениях миелоидных клеток и Vpx-опосредованных контрмерах

В совокупности эти недавние открытия предоставляют новую информацию о клеточных ингибиторах ретровирусов, но также поднимают ряд новых вопросов.ВИЧ-2 и SIV кодируют Vpx, чтобы препятствовать пока еще не охарактеризованному противовирусному действию SAMHD1, которое блокирует репликацию во время обратной транскрипции. Каталитический сайт SAMHD1 должен был поддерживаться для того, чтобы он обладал противовирусной активностью, но поскольку в этих анализах не измерялась ферментативная функция, неясно, нужно ли поддерживать сайт для сохранения конформации, внутримолекулярного взаимодействия или функция. Также неясно, влияет ли действие SAMHD1 на вирус прямо или косвенно.

Помечает ли HIV-1 Vpr SAMHD1 для уничтожения, хотя и менее эффективно? Vpr ВИЧ-1 не способствует взаимодействию между SAMHD1 и комплексом CRL4 DCAF1 , но, возможно, Vpr выполняет аналогичную функцию в другом типе клеток и / или вместе с разными кофакторами. Истощение SAMHD1 в дендритных клетках значительно улучшило ВИЧ-инфекцию, чем в макрофагах. Однако известно, что ни ВИЧ-1, ни ВИЧ-2 не могут эффективно инфицировать дендритные клетки. Здесь, конечно, второе ограничение, выделенное Pertel, может дать объяснение, потому что, хотя Vpx истощает SAMHD1, он также обходит второй блок.Второй блок действует как на ВИЧ-1, так и на ВИЧ-2 / SIV, но Vpx помогает только ВИЧ-1, который не кодирует Vpx. Взаимодействие между Vpx ВИЧ-1 и ВИЧ-2 наиболее вероятно у людей, инфицированных обоими вирусами. Интересно, что проспективное исследование сенегальских работников коммерческого секса показало, что инфицирование ВИЧ-2 может снизить риск последующего инфицирования ВИЧ-1, а не усилить его [47].

Что исследования функции Vpx показывают о Vpr ВИЧ-1? Они подчеркивают тот факт, что существует больше клеточных белков, блокирующих ВИЧ-инфекцию, чем было идентифицировано ранее.Они добавляют к списку противовирусных средств защиты, который на данный момент включает Trim5α, APOBEC3G и Tetherin. Эти защиты, конечно, могут быть конститутивно присутствующими или индуцируемыми при вирусной инфекции. Мы также узнали из этих исследований, что Vpr-подобные белки могут иметь несколько мишеней, которые могут быть побеждены по крайней мере двумя механизмами, один из которых требует адаптерного белка DCAF1, а другой нет. В самом деле, HIV-1 Vpr может направлять истощение, UNG2 и SMUG1 [48], а также еще не идентифицированного белка, который необходим для продолжения клеточного цикла за пределы G2.

Кроме того, если Vpr не может победить эти цели, они могут быть хорошими кандидатами для остановки ВИЧ-1. Однако, учитывая сходство между Vpr ВИЧ-1 и Vpx ВИЧ-2 / SIV, Vpr ВИЧ-1 может развиваться, чтобы противостоять противовирусному фактору. С другой стороны, его развитие может быть ограничено из-за совпадения с другой жизненно важной функцией. Хотя многие функции HIV-1 Vpr и HIV-2 / SIV Vpx были связаны с комплексом CRL4 DCAF1 , работа Pertel также служит напоминанием о том, что не все действия Vpr могут зависеть от комплекса CRL4 DCAF1 .

Vpr-опосредованная повышающая регуляция лигандов NK-клеток

Экспрессия Vpr ВИЧ-1 в CD4 + T-клетках, отдельно или в контексте инфекции, приводит к усилению регуляции лигандов NK-клеток и увеличению Опосредованное NK-клетками уничтожение экспрессирующих Vpr клеток [25, 26]. Pham et al. [49] расширил эту работу, продемонстрировав, что этот фенотип не ограничивается Vpr из обычных лабораторных штаммов, но также наблюдается с Vpr из первичных изолятов из различных типов и клад ВИЧ-1.Предыдущая работа связала способность Vpr запускать экспрессию лигандов NK-клеток с остановкой клеточного цикла, которую Vpr вызывает, вызывая внутриклеточное состояние, подобное тому, которое обнаруживается после повреждения ДНК [26]. Здесь авторы дополнительно усилили корреляцию индукции NK-лиганда с остановкой клеточного цикла G2. Два из протестированных аллелей Vpr не смогли активировать лиганд NK-клеток ULBP2 в CD4 + Т-клетках. Один изолят, названный Vpr P, не мог связываться с комплексом CRL4 DCAF1 , необходимым для облегчения ареста G2.Другой тип Vpr, обозначенный M / D-lo, обнаруживает нарушенную способность локализоваться в ядре, где, вероятно, запускаются сигналы повреждения ДНК. Интересно, что M / D-lo ассоциирован с убиквитинлигазным комплексом, но обладает удлиненным С-концом из 12 аминокислот, который, как было обнаружено, препятствует фенотипу остановки G2, поскольку укорочение этого удлинения восстанавливает способность останавливать клеточный цикл в G2. Авт. Предположили, что удлиненный С-конец аминокислоты нарушает способность Vpr взаимодействовать с еще не идентифицированным клеточным фактором, ответственным за прогрессирование клеточного цикла.Влияние Vpr-опосредованной активации лиганда NK-клеток на биологию вируса все еще остается неясным. Как указывают авторы, повышающая регуляция лигандов NK-клеток в присутствии Vpr может быть средством, с помощью которого ВИЧ-1 индуцирует толерантность к NK-клеткам за счет длительного воздействия на активируемые лиганды. Кроме того, растворимый Vpr [50] предположительно может проникать в неинфицированные клетки-свидетели, приводя к усилению опосредованного NK-клетками уничтожения, что дополнительно способствует истощению Т-клеток.

Лиганды Vif, Vpr и NK

Недавняя работа Norman et al. исследовал взаимосвязь между белками Vpr и Vif ВИЧ-1 и повышающую регуляцию лигандов NK [51] Vif, другой специализированный вирусный белок маркирует клеточную цитидиндезаминазу APOBEC3G для протеасомной деградации, связывая ее с cullin5-elonginB / C сложный. В отсутствие эффективного Vif-опосредованного истощения APOBEC3G этот фермент дезаминирует цитидины, оставляя уридины в провирусной ДНК. Vpr ВИЧ-1 давно ассоциирован с урацил-N-гликозилазой 2, которая выполняет первую стадию процесса эксцизионной репарации для удаления уридинов из ДНК.Авторы этой работы показывают, что Vif и Vpr работают вместе, чтобы уменьшить количество уридина в ДНК, предположительно потому, что Vif снижает уровни ABOBEC3G, а Vpr задействует UNG2, чтобы инициировать удаление уридинов. Авт. Обнаружили, что UNG2 и Vpr оба необходимы для усиления активации лигандов NKG2D NK-клеток. Это приписывается ответу на повреждение ДНК, запускаемому механизмом репарации, инициированным UNG2.

Эта работа вызывает ряд новых вопросов. Это показывает, что ВИЧ-1 кодирует три белка, каждый из которых влияет на способность инфицированных клеток избегать распознавания NK-клетками.Nef, как было показано ранее, снижает модуляцию белков клеточной поверхности, таких как CD4 и MHC-I, маскирует опосредованную Vpr повышающую регуляцию лигандов NK-клеток. Vif необходим для предотвращения действия APOBEC3G, которое может запускать опосредованную UNG2 репарацию и, следовательно, активировать сигналы повреждения ДНК. Интересно, что в то время как недавние публикации показывают, что Vpr вызывает истощение UNG2 [48, 52], эта работа показывает, что истощение UNG2 с помощью shRNA мешает экспрессии лиганда NKG2D, хотя и в меньшей степени, чем делеция Vpr. Кроме того, они показали, что мутант Vpr, который, как было показано, не взаимодействует с UNG2 или не вызывает его истощение, имеет нарушенную способность запускать экспрессию лиганда NK-клеток.Эти результаты больше согласуются с более ранними исследованиями, показавшими, что Vpr вместе с UNG2 снижает частоту вирусных мутаций. Наблюдения могут также указывать на то, что могут существовать разные популяции урацил-N-гликозилазы в клетках, которые могут иметь разные судьбы при экспрессии Vpr.

Заключение

ВИЧ-2 менее патогенен, чем ВИЧ-1, вероятно, потому, что эти два вируса используют разные стратегии репликации. HIV-1 Vpr, HIV-2 / SIV Vpr и Vpx, очевидно, имеют решающее значение для соответствующих вирусов in vivo , поскольку все они законсервированы, и их отсутствие или изменение вызывает более легкие заболевания как у людей, так и у обезьяньих моделей [53–56].Мы предполагаем, что ВИЧ-2 лучше или, по крайней мере, иначе адаптирован к своему хозяину, чем ВИЧ-1. ВИЧ-2 плохо инфицирует дендритные клетки и, таким образом, не запускает интерфероновую реакцию. ВИЧ-2 Vpx заметно усиливает инфекцию макрофагов, чтобы получить доступ к долгоживущим клеткам-хозяевам. В результате у SIV / HIV-2 может быть снижена потребность в репликации в более пермиссивных типах клеток-хозяев, таких как CD4 + Т-клетки. ВИЧ-1 менее хорошо адаптирован и, следовательно, требует лучшего доступа к CD4 + Т-клеткам для облегчения максимальной репликации.Наблюдение за тем, что HIV-2 Vpx может спасти репликацию ВИЧ-1, но не свою собственную, предполагает, что ВИЧ-2 мог быть выбран для ограниченной репликации в одних обстоятельствах и усиленной репликации в других. ВИЧ-2 мог изменить или изменить свой клеточный тропизм в пользу лучшего равновесия с хозяином. Возможно, поэтому ВИЧ-2 менее патогенен. Долгоживущий хозяин может способствовать размножению вируса, обеспечивая как усиленную репликацию вируса с течением времени, так и повышенную вероятность передачи новому хозяину.Другие данные также подтверждают эту стратегию. Инфекция SIV у естественных хозяев, таких как сажистые мангабеи, обычно не является патогенной и не прогрессирует до СПИДа, несмотря на высокую вирусную нагрузку [57, 58]. Напротив, инфекция SIV у неприродных хозяев, таких как макаки-резус, приводит к очевидной патологии, прогрессированию заболевания и возникновению СПИДа. Исследование этой интригующей дихотомии SIV показало, что, хотя как патогенные, так и непатогенные инфекции первоначально дают устойчивый ответ IFN типа I, ответ увеличивается во время хронической фазы инфекции в моделях патогенных макак, но ослабевает у непатогенных естественных хозяев [59, 60].Это может играть существенную роль в хронической иммунной активации, которая, как считается, способствует потере CD4 + Т-клеток и прогрессированию СПИДа [61, 62]. Nef ВИЧ-2 нарушает формирование иммунологических синапсов, тогда как ВИЧ-1 использует синапсы для проникновения в CD4 + Т-клетки [9, 63]. Возможно, что нарушение формирования иммунологических синапсов может привести к меньшей активации и, следовательно, к меньшей продукции IFN типа I. Это в сочетании с такими факторами, как Vpx, которые позволяют вирусу сохраняться в клетках, которые в противном случае не допускают пермиссию, может способствовать размножению вируса ВИЧ-2 с меньшим повреждением хозяина.

ВИЧ-1-опосредованная модуляция лигандов NK-клеток привлекает внимание к еще одному интересному аспекту биологии ВИЧ. Здесь оказывается, что ВИЧ-1 зависит от Vif для истощения APOBEC3G, чтобы гарантировать, что UNG, взаимодействуя с Vpr, не запускает экспрессию лиганда NK-клеток на поверхности инфицированных клеток. Это взаимодействие, конечно, может регулировать не только функцию ВИЧ-1 в инфицированной клетке, но также взаимодействия между инфицированной клеткой и NK-клетками.

Эти недавние открытия поднимают ряд стимулирующих вопросов, которые помогут направить дальнейшие исследования.К ним относятся следующие:

  1. Обрели ли Vpr ВИЧ-1 и его паралоги ВИЧ-2 / SIV совершенно отдельные функции? Все, по-видимому, развили способность взаимодействовать с убиквитин-лигазами CRL4, но имеют ли они общие цели убиквитинирования?

  2. Следует ли нам обращать внимание не только на инфекционность? Vpx, по-видимому, является мощным регулятором инфекционности, но исследования, показывающие, что ВИЧ-1Vpr запускает экспрессию лигандов NK-клеток на клеточной поверхности, являются мощным напоминанием о том, что Vpr может контролировать внутриклеточные взаимодействия.

  3. Смотрим ли мы на эффекты Vpr на инфекционность в правильных типах клеток?

  4. Имеет ли опосредованная Vpr деградация ВИЧ-1 конкретную мишень или она нацелена на класс белков? Две известные мишени Vpr ВИЧ-1: UNG2 и SMUG1 имеют общий мотив триптофан-X-X-фенилаланин, который, как было показано, жизненно важен для взаимодействия Vpr с UNG2. Все ли мишени Vpr ВИЧ-1 разделяют этот мотив?

  5. Работает ли Vpr совместно с дополнительными белками ВИЧ-1? Из работы Norman et al., мы видим, что баланс между Vif, Vpr и Nef определяет, экспрессируется ли и сколько лиганда NKG2D на поверхности инфицированных клеток. Есть ли дополнительные взаимодействия? Например, Vpx помогал ВИЧ-1-, но не ВИЧ-2 / SIV-инфекции в дендритных клетках в присутствии IFN-β. Что уникального в ВИЧ-1, что позволило его спасти?

  6. Как небольшие белки, такие как Vpr и Vpx, усиливают убиквитинирование мишени? Требуются ли они для того, чтобы убиквитинлигаза взаимодействовала с субстратом, или они делают взаимодействие более эффективным?

  7. Почему SAMHD1 проявляет противовирусные функции в некоторых типах клеток, но не в других? Этот белок присутствует в клетках, где инфекция не ограничена.Зависит ли ограничение от путей, которых нет в некоторых клетках?

Ответы на эти вопросы в дальнейшем будут способствовать раскрытию роли, которую загадочный белок Vpr играет в инфекции и патогенезе ВИЧ-1. Обнаружение функции Vpr, конечно, поможет в разработке дополнительных терапевтических стратегий против этого вируса.

Ключевые точки

  • ВИЧ-2 / SIV-кодируемый HIV-1 Vpr paralog Vpx нацелен на клеточный белок SAMHD1 для разрушения посредством комплекса убиквитин-лигазы CRL4.

  • Экспрессия SAMHD1 необходима для блокировки обратной транскрипции в клетках миелоидной линии.

  • Vpx может преодолеть еще один блок для ВИЧ-1 инфекции в дендритных клетках, полученных из моноцитов, обработанных LPS или IFN-β, что останавливает вирус после точки действия SAMHD1.

  • Vpr из различных первичных изолятов ВИЧ-1 запускает экспрессию лигандов NK-клеток на поверхности инфицированных клеток.

  • Экспрессия лиганда NK-клеток, запускаемая Vpr, зависит от взаимодействия между белками Vif и Vpr ВИЧ-1 и клеточными белками APOBEC3G и UNG2.

Благодарности

Эта работа поддержана грантом NIH 5R01AI073178.

Сноски

Конфликт интересов:

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки

2. Баррат-Бойс С.М., Браун К.Н., Мелхем Н., Солофф А.С., Глисон С.М. Понимание и использование дендритных клеток при инфицировании вирусом иммунодефицита человека с использованием нечеловеческой модели приматов. Immunol Res. 2006. 36 (1–3): 265–274. [PubMed] [Google Scholar] 3.Barratt-Boyes SM, Wijewardana V. Дивергентный ответ миелоидных дендритных клеток в установленной точке вируса предсказывает исход заболевания у SIV-инфицированных макак-резус. Журнал медицинской приматологии. 2011 август; 40 (4): 206–213. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 4. Гэн В., Фан Х, Диао Й, Цуй Х, Сун Х, Юн К. и др. Быстрое прогрессирование заболевания у ВИЧ-1-инфицированных мужчин, практикующих секс с мужчинами, отрицательно коррелирует с количеством периферических плазмацитоидных дендритных клеток на ранней стадии первичной инфекции. Журнал клинической иммунологии.2011, 14 июня; [PubMed] [Google Scholar] 5. Диллон С.М., Фридлендер Л.Дж., Роджерс Л.М., Медиц А.Л., Фолкворд Дж. М., Конник Э. и др. Миелоидные дендритные клетки крови ВИЧ-1-инфицированных индивидуумов демонстрируют проапоптотический профиль, характеризующийся пониженными уровнями Bcl-2 и частотами каспазы-3 +, которые связаны с уровнями виремии в плазме и активацией Т-клеток в исследовательском исследовании. J Virol. 2011 Янв; 85 (1): 397–409. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Йонкерс Н.Л., Родригес Б., Асаад Р., Ледерман М.М., Энтони Д.Д.Системная активация иммунитета при ВИЧ-инфекции связана со снижением чувствительности MDC к лиганду TLR и неспособностью активировать наивные CD4 Т-клетки. PLoS One. 2011; 6 (9): e23884. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Бенлахреч А., Готч Ф., Келлехер П., Паттерсон С. Потеря способности стимуляции NK плазматическими и моноцитарными ДК, но не миелоидными ДК у ВИЧ-1 инфицированных пациентов. PLoS One. 2011; 6 (3): e17525. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Харман А.Н., Уилкинсон Дж., Пока Ч. Р., Босняк Л., Стерн Дж. Л., Николл М. и др.ВИЧ вызывает созревание дендритных клеток, происходящих из моноцитов, и клеток Лангерганса. J Immunol. 2006 15 ноября; 177 (10): 7103–7113. [PubMed] [Google Scholar] 9. Макдональд Д., Ву Л., Бокс С. М., Кевал Рамани В. Н., Унутмаз Д., Надежда Т. Дж.. Рекрутирование ВИЧ и его рецепторов в соединениях дендритных клеток и Т-клеток. Наука. 23 мая 2003 г .; 300 (5623): 1295–1297. [PubMed] [Google Scholar] 10. Zhang L, Jiang Q, Li G, Jeffrey J, Kovalev GI, Su L. Эффективное инфицирование, активация и нарушение pDC в BM и периферических лимфоидных органах во время раннего инфицирования ВИЧ-1 у гуманизированных rag2 / gamma C / мышей in vivo .Кровь. 2011, 9 июня; 117 (23): 6184–6192. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Мербах М., Введение А., Фицджеральд В., Гривел Дж. С., Лиско А., Ванпуй С. и др. Шейно-вагинальная ткань ex vivo как модель для изучения ранних событий ВИЧ-1-инфекции. Am J Reprod Immunol. 2011 Март; 65 (3): 268–278. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Ганор Ю., Бомсель М. Передача ВИЧ-1 в мужских половых путях. Am J Reprod Immunol. 2011 Март; 65 (3): 284–291. [PubMed] [Google Scholar] 13. Ояйзу Н., Макклоски Т.В., Коронези М., Чирмуле Н., Кальянараман В.С., Пахва С.Ускоренный апоптоз в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) от пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека типа 1, и в CD4-сшитых PBMC от нормальных людей. Кровь. 1993. 82 (11): 3392–3400. [PubMed] [Google Scholar] 14. Чжэн Л., Фишер Дж., Миллер Р.Э., Пешон Дж., Линч Д.Х., Ленардо М.Дж. Индукция апоптоза зрелых Т-клеток фактором некроза опухоли. Природа. 1995, 28 сентября; 377 (6547): 348–351. [PubMed] [Google Scholar] 16. Вен X, Дуус К.М., Фридрих Т.Д., де Норонья СМ. Белок Vpr ВИЧ1 способствует остановке клеточного цикла G2 путем взаимодействия с DDB1 и Cullin4A-содержащим убиквитин-лигазным комплексом с использованием VprBP / DCAF1 в качестве адаптера.J Biol Chem. 2007, 14 сентября; 282 (37): 27046–27057. [PubMed] [Google Scholar] 17. Belzile JP, Duisit G, Rougeau N, Mercier J, Finzi A, Cohen EA. Опосредованная Vpr ВИЧ-1 остановка G2 включает убиквитинлигазу DDB1-CUL4A (VPRBP) E3. PLoS Pathog. 13 июля 2007 г .; 3 (7): e85. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Тан Л, Эрлих Э, Ю XF. DDB1 и Cul4A необходимы для остановки G2, вызванной вирусом иммунодефицита человека 1 типа. J Virol. Октябрь 2007 г.; 81 (19): 10822–10830. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 19.Hrecka K, Gierszewska M, Srivastava S, Kozaczkiewicz L, Swanson SK, Florens L, et al. Лентивирус Vpr узурпирует Cul4-DDB1VprBP E3 убиквитинлигазу для модуляции клеточного цикла. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007, 10 июля; 104 (28): 11778–11783. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. ДеХарт Дж. Л., Циммерман Е. С., Ардон О., Монтейро-Филхо С. М., Арганараз Э. Р., Планеллес В. Vpr ВИЧ-1 активирует контрольную точку G2 посредством манипулирования протеасомной системой убиквитина. Журнал вирусологии. 2007; 4: 57. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21.Schrofelbauer B, Hakata Y, Landau NR. Функция Vpr ВИЧ-1 опосредуется взаимодействием со специфическим для повреждений ДНК-связывающим белком DDB1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007 6 марта; 104 (10): 4130–4135. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 22. Ле Рузик Э., Белаидуни Н., Эстрабо Э., Морель М., Рейн Дж. К., Транси С. и др. Vpr ВИЧ1 останавливает клеточный цикл, рекрутируя DCAF1 / VprBP, рецептор убиквитинлигазы Cul4-DDB1. Клеточный цикл (Джорджтаун, Техас. 15 января 2007 г .; 6 (2): 182–188. [PubMed] [Google Scholar] 23.Рошаль М., Ким Б., Чжу И., Нгием П., Планеллес В. Активация ATR-опосредованного ответа на повреждение ДНК вирусным белком ВИЧ-1 Р. J. Biol Chem. 11 июля 2003 г.; 278 (28): 25879–25886. [PubMed] [Google Scholar] 24. Goh WC, Rogel ME, Kinsey CM, Michael SF, Fultz PN, Nowak MA, et al. Vpr ВИЧ-1 увеличивает вирусную экспрессию путем манипулирования клеточным циклом: механизм отбора Vpr in vivo. Nat Med. 1998. 4 (1): 65–71. [PubMed] [Google Scholar] 25. Ричард Дж., Синдху С., Фам Т.Н., Белзил Дж. П., Коэн Э. А.. Vpr ВИЧ-1 регулирует экспрессию лигандов активирующего рецептора NKG2D и способствует опосредованному NK киллингу.Кровь. 18 февраля 2010 г.; 115 (7): 1354–1363. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 26. Ward J, Davis Z, DeHart J, Zimmerman E, Bosque A, Brunetta E, et al. Vpr ВИЧ-1 запускает опосредованный естественными клетками-киллерами лизис инфицированных клеток посредством активации реакции на повреждение ДНК, опосредованной ATR. PLoS Pathog. 2009 Октябрь; 5 (10): e1000613. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 27. Дженкинс Y, МакЭнти М, Вейс К., Грин WC. Характеристика ядерного импорта vpr ВИЧ-1: анализ сигналов и путей. J Cell Biol.1998. 143 (4): 875–885. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Хайнцингер Н.К., Букинский М.И., Хаггерти С.А., Рагланд А.М., Кевальрамани В., Ли М.А. и др. Белок Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа влияет на ядерную локализацию вирусных нуклеиновых кислот в неделящихся клетках-хозяевах. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1994; 91 (15): 7311–7315. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 29. Букринский М.И., Шарова Н., Демпси М.П., ​​Стэнвик Т.Л., Букринская А.Г., Хаггерти С. и др. Активный ядерный импорт преинтеграционных комплексов вируса иммунодефицита человека 1 типа.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1992; 89 (14): 6580–6584. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30. Попов С., Рексач М., Ратнер Л., Блобель Г., Букринский М. Вирусный белок R регулирует стыковку прединтеграционного комплекса ВИЧ-1 с комплексом ядерной поры. J Biol Chem. 1998. 273 (21): 13347–13352. [PubMed] [Google Scholar] 31. Попов С., Рексач М., Зибарт Г., Рейлинг Н., Ли М.А., Ратнер Л. и др. Вирусный белок R регулирует ядерный импорт преинтеграционного комплекса ВИЧ-1. Эмбо Дж. 1998; 17 (4): 909–917. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 32.Суббраманиан Р.А., Кессоус-Эльбаз А., Лодж Р., Забыть Дж., Яо XJ, Бержерон Д. и др. Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 является положительным регулятором вирусной транскрипции и инфекционности в первичных макрофагах человека. J Exp Med. 1998. 187 (7): 1103–1111. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Ямасита М., Эмерман М. Ретровирусная инфекция неделящихся клеток: старые и новые перспективы. Вирусология. 5 января 2006 г.; 344 (1): 88–93. [PubMed] [Google Scholar] 34. Ривьер Л., Дарликс Дж. Л., Чимарелли А. Анализ вирусных элементов, необходимых для ядерного импорта ДНК ВИЧ-1.J Virol. 2010, январь; 84 (2): 729–739. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 35. Ямасита М., Эмерман М. Независимость клеточного цикла ВИЧ-инфекций не определяется известными кариофильными вирусными элементами. PLoS Pathog. 2005 11 ноября; 1 (3): e18. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Srivastava S, Swanson SK, Manel N, Florens L, Washburn MP, Skowronski J. Лентивирусный вспомогательный фактор Vpx нацелен на адаптер субстрата VprBP / DCAF1 для убиквитинлигазы cullin 4 E3, что способствует заражению макрофагами. PLoS Pathog.2008; 4 (5): e1000059. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Шарова Н., Ву Й, Чжу Х, Странска Р., Каушик Р., Шарки М. и др. Примат лентивирус Vpx командует DDB1, чтобы противодействовать ограничению макрофагов. PLoS Pathog. 2008; 4 (5): e1000057. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Kaushik R, Zhu X, Stranska R, Wu Y, Stevenson M. Клеточное ограничение диктует способность неделящихся моноцитов / макрофагов лентивирусной и гаммаретровирусной инфекции. Клетка-хозяин и микроб. 23 июля 2009 г.; 6 (1): 68–80.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 39. Коннор Р.И., Чен Б.К., Чхве С., Ландау Н.Р. Vpr необходим для эффективной репликации вируса иммунодефицита человека типа 1 в мононуклеарных фагоцитах. Вирусология. 1995. 206 (2): 935–944. [PubMed] [Google Scholar] 40. Fletcher TM, 3rd, Brichacek B, Sharova N, Newman MA, Stivahtis G, Sharp PM, et al. Функции ядерного импорта и остановки клеточного цикла белка Vpr ВИЧ-1 кодируются двумя отдельными генами в HIV-2 / SIV (SM) Embo J. 1996; 15 (22): 6155-6165. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 41.Tristem M, Marshall C, Karpas A, Hill F. Эволюция лентивирусов приматов: данные vpx и vpr. Эмбо Дж. 1992; 11 (9): 3405–3412. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 42. Hrecka K, Hao C, Gierszewska M, Swanson SK, Kesik-Brodacka M, Srivastava S, et al. Vpx снимает подавление ВИЧ-1-инфекции макрофагов, опосредованной белком SAMHD1. Природа. 30 июня 2011 г .; 474 (7353): 658–661. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Эта статья идентифицирует SAMHD1 как новый противовирусный фактор, который ингибирует макрофаги, происходящие из моноцитов ВИЧ-1, и связывает эту активность с комплексом убиквитин-лигазы CRL4 DCAF1 .43. Laguette N, Sobhian B, Casartelli N, Ringeard M, Chable-Bessia C, Segeral E, et al. SAMHD1 представляет собой специфический для дендритных и миелоидных клеток фактор рестрикции ВИЧ-1, которому противодействует Vpx. Природа. 2011 25 мая; [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Эта статья идентифицирует SAMHD1 как новый противовирусный фактор, который ингибирует ВИЧ-1 в дендритных клетках, происходящих из моноцитов. Пауэлл Р.Д., Холланд П.Дж., Холлис Т., Перрино Ф.В. Ген синдрома Айкарди-Гутьера и фактор рестрикции ВИЧ-1 SAMHD1 представляет собой dGTP-регулируемую дезоксинуклеотидтрифосфогидролазу.J Biol Chem. 2011 7 ноября; [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 45. Голдстоун, округ Колумбия, Эннис-Адениран В., Хедден Дж. Дж., Грум Х. С., Райс Г. И., Христодулу Э и др. Фактор рестрикции ВИЧ-1 SAMHD1 представляет собой дезоксинуклеозидтрифосфаттрифосфогидролазу. Природа. 2011 6 ноября; [PubMed] [Google Scholar] 46. Pertel T, Reinhard C, Luban J. Vpx спасает трансдукцию ВИЧ-1 дендритных клеток от антивирусного состояния, установленного интерфероном 1 типа. Ретровирология. 2011; 8: 49. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Эта работа выявила LPS- / IFN-β-индуцируемую рестрикцию в дендритных клетках, происходящих из моноцитов, которая имеет характеристики, обусловленные рестрикцией SAMHD1.47. Kokkotou EG, Sankale JL, Mani I., Gueye-Ndiaye A, Schwartz D, Essex ME, et al. In vitro корреляты опосредованной ВИЧ-2 защиты от ВИЧ-1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000, 6 июня; 97 (12): 6797–6802. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 48. Schrofelbauer B, Yu Q, Zeitlin SG, Landau NR. Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 индуцирует деградацию урацил-ДНК гликозилаз UNG и SMUG. J Virol. 2005 сентябрь; 79 (17): 10978–10987. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 49. Фам Т.Н., Ричард Дж., Джерард ФК, Power C, Коэн EA.Модуляция NKG2D-опосредованных цитотоксических функций естественных клеток-киллеров вирусным белком R (Vpr) из первичных изолятов ВИЧ-1. J Virol. 2011, 28 сентября; [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Эта публикация расширила предыдущую работу, показав, что Vpr может запускать экспрессию лигандов NK-клеток на клеточной поверхности, демонстрируя, что этот фенотип консервативен среди Vpr из различных групп и клад 50. Леви Д. Н., Рафаэли Ю., Вайнер Д.Б. Внеклеточный белок Vpr увеличивает клеточную проницаемость для репликации вируса иммунодефицита человека и реактивирует вирус с латентного периода.J Virol. 1995. 69 (2): 1243–1252. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 51. Norman JM, Mashiba M, McNamara LA, Onafuwa-Nuga A, Chiari-Fort E, Shen W и др. Противовирусный фактор APOBEC3G усиливает распознавание ВИЧ-инфицированных первичных Т-клеток естественными клетками-киллерами. Иммунология природы. 2011; 12 (10): 975–983. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Это исследование продемонстрировало взаимодействие между различными ВИЧ и белками-хозяевами в модулировании экспрессии лигандов NK-клеток на клеточной поверхности в инфицированных ВИЧ-1 клетках.52. Фенард Д., Хузет Л., Бернар Э., Тупин А., Брун С., Мугель М. и др. Урацил ДНК-гликозилаза 2 отрицательно регулирует транскрипцию LTR ВИЧ-1. Nucleic Acids Res. Октябрь 2009 г.; 37 (18): 6008–6018. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 53. Гиббс Дж. С., Лакнер А. А., Ланг С. М., Саймон М. А., Сегал П. К., Дэниел М. Д. и др. Развитие СПИДа при отсутствии гена vpr или vpx. J Virol. 1995. 69 (4): 2378–2383. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 54. Хирш В.М., Шарки М.Э., Браун С.Р., Бричачек Б., Гольдштейн С., Уэйкфилд Дж. И др.Vpx необходим для распространения и патогенеза SIV (SM) PBj: свидетельство макрофагозависимой вирусной амплификации. Nat Med. 1998 декабрь; 4 (12): 1401–1408. [PubMed] [Google Scholar] 55. Мутумани К., Багарацци М., Конвей Д., Хван Д.С., Айяву В., Чжан Д. и др. Включение дополнительного гена Vpr в коктейль плазмидной вакцины заметно снижает эффективность вакцины Nef in vivo, что приводит к потере клеток CD4 и увеличению вирусной нагрузки у макак-резусов. Журнал медицинской приматологии. 2002 августа; 31 (4–5): 179–185.[PubMed] [Google Scholar] 56. Muthumani K, Hwang DS, Dayes NS, Kim JJ, Weiner DB. Дополнительный ген vpr ВИЧ-1 может подавлять антиген-специфическую иммунную функцию. ДНК и клеточная биология. 2002 Сен; 21 (9): 689–695. [PubMed] [Google Scholar] 57. Сильвестри Г., Содора Д.Л., Куп Р.А., Пайардини М., О’Нил С.П., МакКлюр Н.М. и др. Непатогенная SIV-инфекция покрытых сажей мангабеев характеризуется ограниченной иммунопатологией со стороны сторонних наблюдателей, несмотря на хроническую виремию высокого уровня. Иммунитет. Март 2003 г .; 18 (3): 441–452. [PubMed] [Google Scholar] 58.Самптер Б., Данхэм Р., Гордон С., Энграм Дж., Хеннесси М., Кинтер А. и др. Корреляты сохраненного гомеостаза CD4 (+) Т-клеток во время естественного, непатогенного заражения обезьяньим вирусом иммунодефицита сажистых мангабей: последствия для патогенеза СПИДа. J Immunol. 2007, 1 февраля; 178 (3): 1680–1691. [PubMed] [Google Scholar] 59. Ледерер С., Фавр Д., Уолтерс К.А., Пролл С., Канвар Б., Касаков З. и др. Транскрипционное профилирование при патогенных и непатогенных инфекциях SIV выявляет значительные различия в кинетике и компартментализации тканей.Патогены PLoS. 2009 Февраль; 5 (2): e1000296. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 60. Харрис Л.Д., Табб Б., Содора Д.Л., Пайардини М., Клатт Н.Р., Дуэк Д.К. и др. Подавление устойчивой острой реакции интерферона типа I отличает непатогенную инфекцию вируса иммунодефицита обезьян (SIV) естественных хозяев от патогенной инфекции SIV макак-резус. Журнал вирусологии. 2010 август; 84 (15): 7886–7891. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 61. Giorgi JV, Hultin LE, McKeating JA, Johnson TD, Owens B, Jacobson LP и др.Более короткая выживаемость при запущенной инфекции вируса иммунодефицита человека типа 1 более тесно связана с активацией Т-лимфоцитов, чем с вирусной нагрузкой в ​​плазме крови или использованием вирусных хемокиновых корецепторов. J Infect Dis. 1999, апрель; 179 (4): 859–870. [PubMed] [Google Scholar] 62. Grossman Z, Meier-Schellersheim M, Paul WE, Picker LJ. Патогенез ВИЧ-инфекции: то, что сохраняет вирус, не менее важно, чем то, что он уничтожает. Nat Med. 2006 Март; 12 (3): 289–295. [PubMed] [Google Scholar] 63. Arhel N, Lehmann M, Clauss K, Nienhaus GU, Piguet V, Kirchhoff F.Неспособность нарушить иммунологический синапс между инфицированными человеческими Т-клетками и APC отличает ВИЧ-1 от большинства других лентивирусов приматов. J Clin Invest. Октябрь 2009 г .; 119 (10): 2965–2975. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Исполнительный директор по операциям | Канзасский государственный университет

Об этой роли:

Исполнительный директор Операционный директор подчиняется вице-президенту по исследованиям (VPR) и обеспечивает кадровую поддержку исполнительного уровня для VPR, в том числе берет на себя руководящие роли и координирует инициативы.Операционный директор будет представлять VPR в различных административных вопросах в университете в соответствии с полномочиями, работать согласованно и совместно с подразделениями и подразделениями, ответственными за основные проекты и инициативы, а также работать в комитетах. Директор поможет организовать и обеспечить реализацию мероприятий в масштабах кампуса, исходящих из офиса VPR.

Почему присоединяйтесь к нам:

Университет штата Канзас, первый в стране действующий университет, предоставляющий землю, занимается исследованиями, которые улучшат положение нашего сообщества, штата и мира.Университет является лидером в мировых продовольственных системах, проводя исследования и обучение, которые направлены на растущий в мире средний класс и потребности в качественной и питательной пище. Хотя эта область является фокусом, это лишь верхушка наших исследовательских возможностей. Мы небольшая команда, работающая над улучшением исследований в Университете штата Канзас.

Университет штата Канзас предлагает комплексный пакет льгот, который включает медицинское страхование, страхование жизни, пенсионные планы, оплачиваемый отпуск — отпуск, больничный и праздничные дни.Чтобы узнать, какие преимущества доступны, посетите: https://www.k-state.edu/hcs/benefits

Мы поддерживаем разнообразие и инклюзивность:

Университет штата Канзас поддерживает разнообразие и инклюзивность. Университет активно ищет людей, которые способствуют созданию коллегиальной среды и сотрудничества с коллегами, студентами и другими людьми. Университет стремится продвигать Принципы сообщества .

Что вам понадобится для достижения успеха:

Минимальная квалификация:

  • Требуется степень бакалавра и 10 или более лет соответствующего опыта работы с пятью из 10 в деловой, финансовой или технической сфере

Предпочтительная квалификация:

  • Пять лет опыта работы на руководящем уровне в реализации крупных программных инициатив и надзоре за ключевым административным персоналом в крупных и сложных организациях, предпочтительно в высших учебных заведениях
  • Должен уметь планировать, разрабатывать и реализовывать сложные стратегические цели и программные инициативы, которые требуют эффективного управления ресурсами в краткосрочных и долгосрочных периодах
  • Творческий мыслитель, способный решать сложные задачи
  • Должен обладать или уметь быстро развиваться знаниями о миссии, процессах, организации, культуре университета и сложных взаимоотношениях с внутренними и внешними организациями
  • Должен уметь анализировать и определять приоритеты институциональных проблем и действовать от имени VPR
  • Должен уметь работать коллегиально и поддерживать эффективные отношения с различными людьми, как внутренними, так и внешними по отношению к организации
  • Должен обладать высоким уровнем межличностных навыков при работе с лицами, занимающими побочные, высшие и подчиненные должности
  • Возможность сохранения конфиденциальности
  • Превосходное внимание к деталям и умение заранее планировать
  • Отличные навыки управления проектами / программами
  • Отличные письменные и устные коммуникативные навыки

Прочие требования:

  • Кандидаты должны иметь разрешение на работу в США на момент трудоустройства

Как подать заявление:

Предоставьте следующие документы:

  1. Сопроводительное письмо
  2. Резюме
  3. Онлайн-заявка

Начинается проверка заявок:

Немедленно и продолжается до заполнения позиции.Для наилучшего рассмотрения подайте заявку до 20 сентября 2021 года .

Предполагаемый диапазон заработной платы при найме на работу:

75 317 долл. США — 99 786 долл. США в год

Равные возможности трудоустройства:

Университет штата Канзас — работодатель с равными возможностями. Все кандидаты получат вознаграждение за трудоустройство независимо от расы, цвета кожи, религии, пола, сексуальной ориентации, пола, гендерной идентичности, возраста, национального происхождения, инвалидности или статуса ветерана, находящегося под защитой.

Заявление о проверке фона:

В связи с вашим заявлением о приеме на работу Университет штата Канзас предоставит вам фоновый экран в рамках процесса рассмотрения вашей кандидатуры в качестве сотрудника.

% PDF-1.6 % 145 0 объект > эндобдж 144 0 объект > поток StampPDF Batch 2.7 для Solaris — SPDF 10452007-02-27T16: 20: 33Z2021-10-21T00: 34: 33-07: 002021-10-21T00: 34: 33-07: 00XPPapplication / pdf

  • uuid: 44ce8e29-1dd2-11b2-0a00-560827bd3700uuid: 44ce8e31-1dd2-11b2-0a00-5b0000000000
  • dc: создатель
  • dc: название
  • dc: описание
  • конечный поток эндобдж 142 0 объект > эндобдж 140 0 объект > эндобдж 146 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / TrimBox [9 9 603 792] / Type / Page >> эндобдж 1 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / TrimBox [9 9 603 792] / Type / Page >> эндобдж 34 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / TrimBox [9 9 603 792] / Type / Page >> эндобдж 57 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / TrimBox [9 9 603 792] / Type / Page >> эндобдж 99 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / TrimBox [9 9 603 792] / Type / Page >> эндобдж 129 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / TrimBox [9 9 603 792] / Type / Page >> эндобдж 240 0 объект > поток 0 0 0 0.2 к / GS0 гс 573,676 131,383 38,324 -66 рэ ж BT 0 0 0 1 к / T1_0 1 Тс 0,005 Tc 9 0 0 9 51,6761 734,8835 Tm [(te) 19,9 (st) -301,5 (this) -301,5 (model,) — 301,5 (we) -301,5 (overx) -30 (pre) 19,9 (ssed) -301,5 (DDB1) -301,5 (in) -301,5 ») (клетки) -301,5 (то) -301,5 (отл.) -30 (до) 19,9 (ссед)] ТДж 0 -1,1111 ТД [(ограничение) -314,4 (количество) -314,4 (из) -314,4 (впр.) — 314,4 (однако) — 314,4 (впр) -314,4 (сверхэкс) -30 (до) 19,9 (ссион) -314,4 (выпадение) -314,4 (не)] ТДж Т * [(отменить) -337,8 (индуцированный Vpr) -337,8 (G)] TJ 0 Tc 6.5 0 0 6 148.5441 713,6335 тм (2) Tj 0,005 Тс 9 0 0 9 154,8652 714,8835 Тм [(arre) 19.9 (st) -337.8 (\ (dat) -30 (a) -337.8 (not) -337.8 (показано \).)] TJ -10,4655 -1,1111 тд [(In) -221,9 (прибавление) -221,9 (к) -221,9 (DDB1,) — 221,9 (the) -221,9 (TA) -60 (P) -221,9 (анализ) -221,9 (идентифицировано) -221,9 (VprBP) -221.9 (\ (19 \).)] ТДж -1 -1,1111 тд [(Интерес) 19,9 (скупо,) — 229,8 (VprBP) -229,8 (было) -229,8 (недавно) -229,8 (идентифицировано) -229,8 (как) -229,8 (а) -229,8 (связывание) -229,8 (партнер)] TJ Т * [(для) -238,4 (DDB1.) — 238,4 (VprBP) -238,3 (было) -238.4 (предложено) -238,3 (к) -238,3 (быть) -238,4 (а) -238,4 (член) -238,4 (из) -238,4 (а) -238,3 (роман) -238,4 (класс)] TJ Т * [(из) -486,1 (DDB1-Cul4A) -486,1 (связанный) -486,1 (WD40) -486,1 (домен) -486,1 (белки) -486,1 (\ (DCAF \))] TJ Т * [(это) -281 (может) -281 (быть) -281 (субстрат) 19,9 (s) -281 (для) -281 (the) -281 (DDB1-Cul4A) -281 (E3) -281 (убиквитин) -281 (лигаза)] TJ Т * [(\ (21,) — 274 (37 \).) — 274 (Наши) -274 (выводы) -274 (делаю) -274 (нет) -274 (различать) -274 (ставка) -30 (весить) -274 (прямой) -274 (связывание)] TJ Т * [(из) -337.8 (DDB1) -337,8 (к) -337,8 (Vpr) -337,8 (или) -337,8 (мостовое соединение) -337,8 (через) -337,8 (VprBP.)] TJ 1 -1,1111 тд [(The) -213.1 (выводы) -213.1 (pre) 19.9 (sented) -213.1 (здесь) -213.1 (prov) -39.8 (ide) -213.1 (an) -213.1 (import) -30 (ant) -213.1 (подсказка) -213,1 (в сторону)] TJ -1 -1,1111 тд [(underst) -30 (anding) -187,5 (the) -187,5 (роль) -187,5 (of) -187,5 (Vpr) -187,5 (in) -187,5 (HI) -60 (V-1) -187,5 (репликация) .) — 187,5 (Они) -187,5 (сугге) 19,9 (ст)] TJ Т * [(это) -475,4 (Vpr) -475,4 (посредник) 19,9 (s) -475,4 (некоторые,) — 475,4 (если) -475.4 (не) -475,4 (все) -475,4 (из) -475,4 (его) -475,4 (биологический) -475,4 (активный) -39,8 (итиэ) 19,9 (с)] TJ Т * [(через) -414,5 (его) -414,5 (взаимодействие) -414,5 (w) -39,8 (iith) -414,5 (DDB1.) — 414,5 (Как) -414,5 (the) 19,9 (se) -414,5 (функции) — 414,5 (за -)] ТДж Т * [(частичка) -316,3 (HI) -60 (V-1) -316,3 (репликация) -316,3 (остатки) -316,3 (к) -316,3 (быть) -316,3 (детерминировать) -30 (добыто.) — 316,3 ( ) 19,9 (SE) -316,3 (найти -)] TJ Т * [(ings) -389,6 (повышение) -389,5 (интерес) 19,9 (жало) -389,6 (возможность) 19,9 (с) -389,6 (относительно) -389.5 (в) -389,6 (роль) -389,6 (из) -389,6 (впр) -389,6 (в)] TJ Т * [(HI) -60 (V-1) -337,8 (репликация) -337,8 (та) -337,8 (может) -337,8 (быть) -337,8 (экс) -30 (перимент) -30 (союзник) -337,8 (адрес ) 19.9 (усл.)] TJ / T1_1 1 Тс -0,01961 Тс 0 -2 ТД [(Материалы) -313.1 (и) -313.1 (Методы)] TJ / T1_0 1 Тс 0,005 Tc 0 -1,3333 TD [(pcH) -60 (A-Vpr) -386,1 (ex) -30 (pre) 19,9 (sse) 19,9 (s) -386,1 (an) -386,1 (N-ter) -30 (minal) -386,1 (H) ) -60 (At) -30 (возраст) -386,1 (NL) -30 (4-3) -386,1 (Vpr) -386,1 (дюйм)] TJ 0 -1,1111 ТД [(тот) -318.5 (с) -30 (у) -30 (томегалов) -39.8 (ir) -30 (us) -318,5 (промотор) -318,5 (управляемый) -318,5 (вектор) -318,5 (pcDNA) -60 (I / amp) -318,5 (\ (In -)] TJ Т * [(v) -39,8 (itrogen \).) — 387,7 (The) -387,7 (L64P) -387,7 (mut) -30 (ation) -387,7 (было) -387,7 (введено) -387,7 (by) -387,7 ( сайт-ориентированный)] TJ Т * [(mut) -30 (agene) 19,9 (sis.) — 343,2 (3X-Flag-DDB2) -343,1 (ex) -30 (pre) 19,9 (ssion) -343,1 (вектор) -343,2 (было) -343,2 ( а) -343,2 (gif) -30 (t) -343,2 (f) -30 (rom)] TJ Т * [(Hitoshi) -407,6 (Endo) -407,5 (\ (38 \).) — 407,6 (The) -407,5 (T7-DDB1) -407,5 (ex) -30 (pre) 19.9 (ssion) -407,5 (вектор) -407,5 (was) -407,5 (pro -)] TJ 29,1667 25,5556 тд [(v) -39,8 (ided) -364 (by) -364 (P.) — 364 (R.) — 364 (Raychaudhuri.) — 364 (The) -364 (T7) -364 (t) -30 ( ag) -364 (было) -364 (заменено) -364 (w) -39,8 (iith) -364 (a)] TJ 0 -1,1591 TD [(myc-t) -30 (ag) -365.6 (by) -365.6 (PCR,) — 365.6 (и) -365.6 (the) -365.6 (W561A) -365.5 (mut) -30 (ation) -365.6 ( было) -365.6 (введено) -365.6 (by)] TJ Т * [(сайт-направленный) -189,4 (mut) -30 (аген) 19,9 (sis.) — 189,4 (NTA) -60 (P-Vpr) -189,4 (было) -189,4 (генерировалось) -189,4 (по) -189 .4 (субклон -)] TJ Т * [(ing) -384,2 (Vpr) -384,2 (f) -30 (rom) -384,2 (pcH) -60 (A-Vpr) -384,2 (into) -384,2 (the) -384,2 (pNTA) -60 (P) ) -384.2 (\ (Strat) -30 (agene \)) — 384.2 (at) -384.2 (the)] TJ Т * [(Bam-HI) -591.6 (и) -591.6 (HindIII) -591.6 (сайт) 19.9 (s.) — 591.6 (UNG2) -591.6 (и) -591.6 (SMUG1) -591.6 (ex) -30 (pre ) 19.9 (ssion)] TJ Т * [(векторы) -584,3 (имеют) -584,3 (было) -584,3 (сообщается) -584,3 (\ (8 \).) — 584,3 (pNL) -30 (43 \ (H) -60 (A-Vpr \) ) -584,3 (было) -584,3 (в) -30 (по -)] TJ Т * [(str) -30 (ucted) -330,5 (by) -330,5 (вставка) -330.5 (а) -330,5 (HindIII) -330,5 (сайт) -330,5 (в) -330,5 (в) -330,5 (ст) -30 (арт) -330,5 (в) -30 (одон) -330,5 (из)] TJ / T1_2 1 Тс 25,0009 0 Тд (vpr) Tj / T1_0 1 Тс 1,6276 0 тд (из) Tj -26,6285 -1,1591 тд [(pNL) -30 (43.) — 241,8 (pNL) -30 (43) -241,8 (было) -241,8 (чем) -241,8 (расщеплено) -241,8 (w) -39,8 (iith) -241,8 (HindIII). -241,8 (и) -241,8 (at) -241,8 (the) -241,8 (un) -30 (ique)] TJ Т * [(Ec) -30 (oR) -60 (I) -284,8 (площадка) -284,8 (дюйм)] TJ / T1_2 1 Тс 6.1285 0 Тд (vpr) Tj / T1_0 1 Тс [-0,1 (,) — 284,8 (и) -284,7 (в) -284,8 (повторно) 19.9 (результат) -284,8 (f) -30 (фрагмент) -284,8 (был) -284,8 (заменен) -284,7 (w) -39,8 (iith)] TJ -6,1285 -1,1591 тд [(а) -366,5 (HindIII / Ec) -30 (oR) -60 (I) -366,5 (f) -30 (фрагмент) -366,5 (f) -30 (rom) -366,5 (pcH) -60 (A -Впр.) — 366,5 (В) -366,5 (модификация)] ТДж. Т * [(doe) 19,9 (s) -337,8 (не) -337,8 (inter) -49,9 (fere) -337,8 (w) -39,8 (iith) -337,8 (v) -39,8 (ir) -30 (us) -337,8 (репликация) -337,8 (дюйм) -337,8 (T) -337,8 (ячейка) -337,8 (линия) 19,9 (s.)] TJ 1 -1,1591 тд [(Доп.) -546.1 (пр.) -30 (перимент) -30 (ал) -546.1 (методы) -546.1 (ар) -546,1 (дюйм)] ТДж 0 0 1 рг / T1_2 1 Тс 18.9995 0 тд [(SI) -546,1 (Mater) -30 (ials) -546,1 (и)] TJ -19.9995 -1.1591 Td (Методы) Tj 0 0 0 рг / T1_0 1 Тс 0 Tc [-0,2 (.)] TJ 0,005 Тс 8 0 0 8 314,1761 589,7699 Тм [(Мы) -480,1 (спасибо) -480,1 (Хитоши) -480,1 (Эндо) -480,1 (\ (Дзичи) -480,1 (Медицинский) -480,1 (Школа,) — 480,1 (Тотиги,) — 480,1 (Япония))) -480,1 (и)] TJ 0 -1,179 TD [(Прадип) -235 (Райчаудхури) -235,1 (\ (Ун) -29,8 (иверсит) -29,8 (г) -235,1 (из) -235,1 (Иллинойс) -235,1 (в) -235,1 (Чикаго,)) — 235,1 ( Чикаго) — 235.1 (Ил \)) — 235 (для)] ТДж Т * [(реагенты;) — 428,6 (Вольфганг) -428,6 (Фишер) -428,6 (для) -428,6 (масса) -428,6 (спектрометр) -59,6 (у;) — 428,6 (Эстер) -428,6 (Франциск) -29,8 (о ,)] TJ Т * [(Джоди) -279,8 (Чоу,) — 279,8 (и) -279,8 (Димас) -279,8 (Эспинола) -279,8 (для) -279,8 (техн.) -29,8 (ical) -279,8 (ассист) -29,8 (наследник; ) -279,8 (и) -279,8 (хуэй) -279,8 (чен)] TJ Т * [(и) -342,6 (Эрика) -342,6 (Дхуи) -342,6 (для) -342,7 (критическое) -342,7 (чтение) -342,7 (из) -342,7 (в) -342,6 (рукопись.) — 342,7 (Это) -342,6 (работа) -342.6 (был)] TJ Т * [(поддерживается) -473,3 (автор) -473,3 (национальный) -473,3 (институт) 19,9 (с) -473,3 (из) -473,3 (здравоохранение) -473,3 (гранты) -473,3 (A) -59,6 (I058864-03) -473,3 (и)] TJ Т * [(DA014494-05,) — 471,6 (в) -471,6 (Un) -29,8 (иверсит) -29,8 (у) -471,6 (из) -471,6 (Калифорния) -29,8 (ia) -471,6 (ат) -471,6 ( Сан) -471,6 (Диего) -471,6 (Центр) -471,6 (для)] TJ Т * [(A) -59.6 (IDS) -490 (Re) 19.9 (поиск) — 490 (и) -490 (the) -490 (American) -490 (Foundation) -490 (for) -490 (A) — 59.6 (IDS) -490 (Re) 19.9 (поиск)] TJ Т * [(\ (AmfA) -29,8 (R \).) -311,8 (NRL) -311,8 (is) -311,8 (an) -311,8 (Elizabeth) -311,8 (Glaser) -311,8 (Fellow) -311,8 (of) -311,8 (the) -311,8 (Pediatric) -311,7 (A ) -59,6 (IDS)] TJ Т * (Основание) Tj 7 0 0 7 55,392 480,2841 тм [(1.) — 423,7 (L) -29,6 (угл) -342,5 (SM,) — 342,5 (Weeger) -342,5 (M,) — 342,5 (St) -29,6 (ahl-Henn) -29,6 (ig) — 342,5 (C,) — 342,5 (Coulibaly) -342,5 (C,) — 342,5 (Hunsmann) -342,5 (G,) — 342,5 (Muller) -342,5 (J,)] TJ 1,1834 -1,2143 тд [(Muller-Her) -29,6 (мелинк) -339,3 (H,) — 339,3 (Fuchs) -339,3 (D,) — 339,3 (Wachter) -339,3 (H,) — 339.3 (Dan) -29,6 (iel) -339,3 (MM,)] TJ / T1_2 1 Тс 25.2883 0 тд [(et) -339,3 (al)] TJ / T1_0 1 Тс 1.8308 0 тд [(.) — 339,3 (\ (1993 \))] TJ / T1_2 1 Тс 3,7287 0 тд [(Дж) -339,3 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс -30,8478 -1,2143 тд (67: 902 \ 226912.) Tj -1,1834 -1,2143 тд [(2.) — 423,7 (Гиббс) -562,1 (JS,) — 562,1 (L) -29,6 (ack) -29,6 (Ner) -562,1 (A) -59,6 (A,) — 562,1 (L) -29,6 ( ang) -562,1 (SM,) — 562,1 (Simon) -562,1 (M) -29,6 (A,) — 562,1 (Sehgal) -562,1 (PK,) — 562,1 (Dan) -29,6 (iel) -562,1 (MD, )] TJ 1,1834 -1,2143 тд [(De) 19,9 (srosiers) -337.6 (RC) -337,6 (\ (1995 \))] TJ / T1_2 1 Тс 9,8499 0 тд [(Дж) -337,6 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс 3,1422 0 Тд [(69: 2378) -89,7 (\ 2262383.)] TJ -14,1756 -1,2143 тд [(3.) — 423,7 (Шер) -29,6 (мужчина) -349 (МП,) — 349 (Де) -349 (Норонья) -349 (СМ,) — 349 (Уильямс) -349 (SA,) — 349 (Грин) -349 (WC) -349 (\ (2002 \))] TJ / T1_2 1 Тс 30.6257 0 Тд [(ДНК) -349 (клетка)] TJ -29,4422 -1,2143 тд (Биол) Tj / T1_0 1 Тс 2,0532 0 тд [(21: 679) -89,7 (\ 226) -89,7 (688.)] TJ -3,2366 -1,2143 тд [(4.) — 423,7 (Muthuman) -29,6 (i) -344,1 (K,) — 344,1 (De) 19.9 (сай) -344,1 (BM,) — 344,1 (Hwang) -344,1 (DS,) — 344,1 (Choo) -344,1 (AY,) — 344,1 (L) -29,6 (адди) -344,1 (DJ,) — 344,1 (Thieu) -344,1 (KP,) — 344,1 (Rao)] TJ 1,1834 -1,2143 тд [(RG,) — 337,6 (Вайнер) -337,6 (DB) -337,6 (\ (2004 \))] TJ / T1_2 1 Тс 10.6966 0 Тд [(ДНК) -337,6 (клетка) -337,6 (биол)] TJ / T1_0 1 Тс 6.5957 0 тд [(23: 239) -89,7 (\ 226247.)] TJ -18,4757 -1,2143 тд [(5.) — 423,7 (Goh) -183,8 (WC,) — 183,8 (Rogel) -183,8 (ME,) — 183,8 (K) -29,6 (insey) -183,8 (CM,) — 183,8 (Michael) -183,8 (SF,) — 183,8 (Фульц) -183,8 (PN,) — 183,8 (Новак) -183.8 (M) -29,6 (A,) — 183,8 (Hahn) -183,8 (BH,)] TJ 1,1834 -1,2143 тд [(Emer) -29,6 (мужчина) -337,6 (M) -337,7 (\ (1998 \))] TJ / T1_2 1 Тс 9.0809 0 тд [(Nat) -337,6 (Med)] TJ / T1_0 1 Тс 4.0706 0 тд (4: 65 \ 22671.) Tj -14,335 -1,2143 тд [(6.) — 423,7 (Heinzinger) -380,7 (NK,) — 380,7 (Бук) -29,6 (ински) -380,7 (MI,) — 380,7 (Haggert) -29,6 (y) -380,7 (SA,) — 380,7 (Ragland) -380,7 (A) -59,6 (M,) — 380,7 (Kewalraman) -29,6 (i) -380,7 (V,)] TJ 1,1834 -1,2143 тд [(Ли) -327,5 (М) -29,6 (А,) — 327,5 (Гендельман) -327,5 (НЕ,) — 327,5 (Ратнер) -327,5 (L,) — 327.5 (Стивенсон) -327,5 (M,) — 327,5 (Emer) -29,6 (мужчина) -327,5 (M) -327,5 (\ (1994 \))] TJ / T1_2 1 Тс 31,7088 0 Тд [(P) -29,6 (roc)] TJ -31,7088 -1,2143 тд [(Natl) -337,6 (Acad) -337,6 (Sci) -337,6 (США)] TJ / T1_0 1 Тс 8.606 0 тд (91: 7311 \ 2267315.) Tj -9,7894 -1,2143 тд [(7.) — 423,7 (Мански) -492,3 (LM,) — 492,3 (Преверал) -492,3 (S,) — 492,3 (Селиг) -492,3 (L,) — 492,3 (Бенарус) -492,3 (R,) — 492,3 (Бен) -29,6 (ихоу) -492,3 (S) -492,3 (\ (2000 \))] TJ / T1_2 1 Тс 31,8811 0 тд [(Дж) -492,3 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс -30,6976 -1,2143 тд [(74: 7039) -89.7 (\ 2267047.)] Т.Дж. -1,1834 -1,2143 тд [(8.) — 423,7 (Шрофельбауэр) -215,1 (B,) — 215,1 (Yu) -215,1 (Q,) — 215,1 (Цейтлин) -215,1 (SG,) — 215,1 (L) -29,6 (андау) -215,1 (NR) -215.1 (\ (2005 \))] TJ / T1_2 1 Тс 24.7557 0 тд [(Дж) -215,1 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс 2,8971 0 тд [(79: 10978) -89,7 (\ 22610987.)] TJ -27,6528 -1,2143 тд [(9.) — 423,7 (L) -29,6 (ai) -337,6 (M,) — 337,6 (Zimmer) -29,6 (мужчина) -337,6 (ES,) — 337,6 (Planelle) 19,9 (s) -337,6 (V ,) — 337,6 (Чен) -337,6 (Дж) -337,6 (\ (2005 \))] ТДж / T1_2 1 Тс 24.269 0 Тд [(Дж) -337,6 (В) -29.6 (irol)] TJ / T1_0 1 Тс 3,1422 0 Тд (79: 15443 \ 22615451.) Tj -27,9161 -1,2143 тд [(10.) — 423,6 (Рошаль) -571 (M,) — 571 (K) -29,6 (im) -571 (B,) — 571 (Zhu) -571 (Y,) — 571 (Nghiem) -571 (P,) — 571 (Planelle) 19.9 (s) -571 (V) -571 (\ (2003 \))] TJ / T1_2 1 Тс 29.5942 0 Тд [(J) -571 (Biol) -571 (Chem)] TJ / T1_0 1 Тс -27,9059 -1,2143 тд [(278: 25879) -89,7 (\ 22625886.)] TJ -1,6883 -1,2143 тд [(11.) — 423,6 (Циммер) -29,6 (мужчина) -500,8 (ES,) — 500,8 (Чен) -500,8 (Дж,) — 500,8 (А) -29,6 (ндерсен) -500,8 (JL,) — 500,8 (Ардон) -500,8 (О,) — 500,8 (Дехарт) -500.8 (JL,) — 500,8 (Blackett) -500,8 (J,)] TJ 1.6883 -1.2143 тд [(Choudhar) -59,6 (y) -485,8 (SK,) — 485,8 (Camerin) -29,6 (i) -485,8 (D,) — 485,8 (Nghiem) -485,8 (P,) — 485,8 (Planelle) 19,9 (s)). ) -485,8 (В) -485,8 (\ (2004 \))] ТДж / T1_2 1 Тс 27.633 0 Тд [(Мол.) -485,8 (клетка) -485,8 (биол)] ТДж / T1_0 1 Тс -27,633 -1,2143 тд [(24: 9286) -89,7 (\ 2269294.)] TJ -1,6883 -1,2143 тд [(12.) — 423,6 (Циммер) -29,6 (мужчина) -248 (ES,) — 247,9 (Шер) -29,6 (мужчина) -247,9 (МП,) — 247,9 (Блэкетт) -247,9 (JL,) — 247,9 (Neidleman) -247,9 (JA,) — 247,9 (K) -29,6 (рейс) -247.9 (C,) — 247,9 (Mundt) -247,9 (P,)] TJ 1.6883 -1.2143 тд [(Уильямс) -585,2 (SA,) — 585,2 (Война) -29,6 (Мердам) -585,2 (M,) — 585,2 (Кан) -585,2 (J,) — 585,2 (Hecht) -585,2 (FM,)] TJ / T1_2 1 Тс 24.3041 0 Тд [(et) -585,2 (al)] TJ / T1_0 1 Тс 2,0767 0 тд [(.) — 585,2 (\ (2006 \))] TJ / T1_2 1 Тс 4.2206 0 Тд [(Дж) -585,2 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс -30,6014 -1,2143 тд (80: 10407 \ 22610418.) Tj -1,6883 -1,2143 тд [(13.) — 423,6 (Нак) -29,6 (ай-Мурак) -29,6 (ами) -473,2 (С,) — 473,2 (Шимура) -473,2 (М,) — 473,2 (К) -29,6 (иномото) — 473,2 (М,) — 473.2 (Так) -29,6 (Идзава) -473,2 (Y,) — 473,2 (Токунага) -473,2 (K,)] TJ 1.6883 -1.2143 тд [(Тагучи) -465,9 (T,) — 465,9 (Хосино) -465,9 (S,) — 465,9 (Миягава) -465,9 (K,) — 465,9 (сб) -29,6 (a) -465,9 (T,) — 465,9 (Кур) -29,6 (умизак) -29,6 (а) -465,9 (H,)] TJ / T1_2 1 Тс 28.1814 0 Тд [(et) -465,9 (al)] TJ / T1_0 1 Тс 1.9574 0 Тд [(.) — 465.9 (\ (2006 \))] TJ / T1_2 1 Тс -30,1388 -1,2143 тд (Онкоген) Tj / T1_0 1 Тс 4,4777 0 тд [(26: 477 \ 226) -89,7 (486.)] TJ -6,166 -1,2143 тд [(14.) — 423,6 (А) -29,6 (ндерсен) -389,2 (JL,) — 389,2 (Циммер) -29.6 (мужчина) -389,2 (ES,) — 389,2 (ДеХарт) -389,2 (JL,) — 389,2 (Мурала) -389,2 (S,) — 389,2 (Ардон) -389,2 (O,) — 389,2 (Блэкетт) -389,2 (J,)] TJ 1.6883 -1.2143 тд [(Чен) -337,6 (Дж,) — 337,6 (Планелла) 19,9 (с) -337,6 (В) -337,6 (\ (2005 \))] TJ / T1_2 1 Тс 12.1257 0 Тд [(Cell) -337,6 (Death) -337,6 (Dif) -29,6 (fer)] TJ / T1_0 1 Тс 7,6378 0 тд [(12: 326) -89,7 (\ 226334.)] TJ -21,4518 -1,2143 тд [(15.) — 423,6 (K) -29,6 (ino) -337,6 (T,) — 337,6 (Pavlak) -29,6 (is) -337,6 (GN) -337,6 (\ (2004 \))] TJ / T1_2 1 Тс 14.3942 0 Тд [(ДНК) -337,6 (клетка) -337.6 (Биол)] TJ / T1_0 1 Тс 6.5957 0 тд (23: 193 \ 226205.) Tj -20,9899 -1,2143 тд [(16.) — 423,6 (Barr) -59,6 (y) -337,6 (M,) — 337,6 (Fr) -29,6 (uh) -337,6 (K) -337,6 (\ (2006 \))] TJ / T1_2 1 Тс 12.7447 0 Тд [(Sci) -337,6 (STKE)] TJ / T1_0 1 Тс 4.1548 0 Тд [(,) — 337,6 (pe21.)] ТДж 20.6005 38.8571 Td [(17.) — 423,7 (Тан) -337,6 (Дж,) — 337,6 (Чу) -337,6 (G) -337,6 (\ (2002 \))] TJ / T1_2 1 Тс 11.7117 0 Тд [(ДНК) -337,6 (Ремонт) -337,6 (\ (Амстердам \))] TJ / T1_0 1 Тс 11,5626 0 тд [(1: 601 \ 226) -89,7 (616.)] TJ -23,2743 -1,2532 тд [(18.) — 423.7 (Витчибен) -337,6 (BB,) — 337,6 (Дерево) -337,6 (R) -29,6 (D) -337,6 (\ (2003 \))] TJ / T1_2 1 Тс 17,739 0 тд [(ДНК) -337,6 (Ремонт) -337,6 (\ (Амстердам \))] TJ / T1_0 1 Тс 11,5626 0 тд (2: 1065 \ 2261069.) Tj -29,3016 -1,2533 тд [(19.) — 423,7 (Чжан) -337,6 (S,) — 337,6 (Фэн) -337,6 (Y,) — 337,6 (Нараян) -337,6 (O,) — 337,6 (Чжао) -337,6 (LJ) -337,6 (\ (2001 \))] Т.Дж. / T1_2 1 Тс 22,4752 0 тд (Джин) Tj / T1_0 1 Тс 2,5612 0 Тд (263: 131 \ 226140.) Tj -25,0363 -1,2532 тд [(20.) — 423,7 (Бондарь) -332,8 (Т,) — 332,8 (Калин) -29,6 (ина) -332,8 (А,) — 332.8 (K) -29,6 (волосы) -332,8 (L,) — 332,8 (Kopanja) -332,8 (D,) — 332,8 (Nag) -332,8 (A,) — 332,8 (Багчи) -332,8 (S,) — 332,8 (Райчаудхури)] TJ 1,6883 -1,2533 тд [(P) -337,6 (\ (2006 \))] TJ / T1_2 1 Тс 4.0795 0 Тд [(Мол) -337,6 (клетка) -337,6 (биол)] ТДж / T1_0 1 Тс 6.0627 0 Тд (26: 2531 \ 2262539.) Tj -11,8304 -1,2532 тд [(21.) — 423,7 (Hu) -337,6 (J,) — 337,6 (McCall) -337,6 (CM,) — 337,6 (Oht) -29,6 (a) -337,6 (T,) — 337,6 (Xiong) -337,6 (Y) -337.6 (\ (2004 \))] TJ / T1_2 1 Тс 21,2422 0 Тд [(Nat) -337,6 (Cell) -337,6 (Biol)] TJ / T1_0 1 Тс 5.9376 0 тд (6: 1003 \ 2261009.) Tj -27,1798 -1,2533 тд [(22.) — 423,7 (Цзянь) -337,6 (H,) — 337,6 (Чжао) -337,6 (LJ) -337,6 (\ (2003 \))] TJ / T1_2 1 Тс 12,4324 0 тд [(J) -337,6 (Biol) -337,6 (Chem)] TJ / T1_0 1 Тс 5,6199 0 тд [(278: 44326) -89,7 (\ 226) -89,7 (44330.)] TJ -18,0523 -1,2532 тд [(23.) — 423,7 (Селиг) -396,1 (L,) — 396,1 (Бен) -29,6 (ichou) -396,1 (S,) — 396,1 (Рогель) -396,1 (ME,) — 396,1 (Ву) -396,1 (LI,) — 396,1 (Водик) -29,6 (a) -396,1 (M) -29,6 (A,) — 396,1 (Отец) -396,1 (J,) — 396,1 (Бенарус) -396,1 (R,)] TJ 1.6883 -1.2532 тд [(Emer) -29,6 (мужчина) -337,6 (M) -337.7 (\ (1997 \))] Т.Дж. / T1_2 1 Тс 9.0809 0 тд [(Дж) -337,6 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс 3,1422 0 Тд [(71: 4842 \ 226) -89,7 (4846.)] TJ -13,9115 -1,2533 тд [(24.) — 423,7 (Li) -337,6 (T,) — 337,6 (Chen) -337,6 (X,) — 337,6 (Garbutt) -337,6 (KC,) — 337,6 (Чжоу) -337,6 (P,) — 337,6 (Чжэн) -337,6 (N) -337,6 (\ (2006 \))] TJ / T1_2 1 Тс 25.378 0 Тд (Ячейка) Tj / T1_0 1 Тс 2.0002 0 тд (124: 105 \ 226117.) Tj -27,3782 -1,2532 тд [(25.) — 423,7 (Лю) -200,1 (W,) — 200,1 (Николс) -200,1 (AF,) — 200,1 (Грэм) -200,1 (JA,) — 200,1 (Дуалан) -200,1 (R,) — 200.1 (Аббас) -200 (A,) — 200,1 (Линн) -200,1 (S) -200,1 (\ (2000 \))] TJ / T1_2 1 Тс 30.3383 0 Тд [(J) -200 (Biol) -200 (Chem)] TJ / T1_0 1 Тс -28,65 -1,2532 тд [(275: 21429) -89,7 (\ 22621434.)] TJ -1,6883 -1,2533 тд [(26.) — 423,7 (Вак) -29,6 (асуги) -332 (М,) — 332 (Кавасима) -332 (А,) — 332 (Мориок) -29,6 (а) -332 (H,) — 332 (Linn) -332 (S,) — 332 (Sancar) -332 (A,) — 332 (Mori) -332 (T,) — 332 (Nik) -29,6 (aido)] TJ 1,6883 -1,2516 тд [(O,) — 337,6 (Мацунага) -337,6 (T) -337,6 (\ (2002 \))] TJ / T1_2 1 Тс 10,6415 0 тд [(J) -337,6 (Biol) -337,6 (Chem)] TJ / T1_0 1 Тс 5.6199 0 тд (277: 1637 \ 2261640.) Tj -17,9497 -1,2516 тд [(27.) — 423,7 (Ulane) -383,1 (CM,) — 383,1 (Родригес) -383,1 (JJ,) — 383,1 (Parisien) -383,1 (JP,) — 383,1 (Hor) -59,6 (vath) -383,1 (CM) -383,1 (\ (2003 \))] TJ / T1_2 1 Тс 28.2984 0 тд [(Дж) -383,1 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс 3,2331 0 тд (77: 6385 \ 226) Вт -29,8433 -1,2516 тд (6393.) Ти -1,6883 -1,2516 тд [(28.) — 423,7 (Лин) -358,7 (GY,) — 358,7 (Патерсон) -358,7 (RG,) — 358,7 (Ричардсон) -358,7 (CD,) — 358,7 (L) -29,6 (амб.) -358,8 (R) -59,6 (A) -358,7 (\ (1998 \))] TJ / T1_2 1 Тс 27.5894 0 тд [(V) -29.6 (irolog) -49.9 (y)] TJ / T1_0 1 Тс 3.8533 0 тд [(249: 189) -89,7 (\ 226)] TJ -29,7544 -1,2516 тд (200.) Tj -1,6883 -1,2516 тд [(29.) — 423,7 (Ulane) -441,1 (CM,) — 441,1 (Kentsis) -441,1 (A,) — 441,1 (Cr) -29,6 (uz) -441,1 (CD,) — 441,1 (Parisien) -441,1 (JP,) — 441,1 (Schneider) -441,1 (K) -29,6 (L,) — 441,1 (Hor) -59,6 (vath) -441,1 (CM)] TJ 1,6883 -1,2516 тд (\ (2005 \)) Tj / T1_2 1 Тс 3,1329 0 тд [(Дж) -337,6 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс 3,1422 0 Тд [(79: 10180) -89,7 (\ 22610189.)] TJ -7,9635 -1,2516 тд [(30.) — 423.7 (Palosaari) -247,5 (H,) — 247,5 (Parisien) -247,5 (JP,) — 247,5 (Rodriguez) -247,5 (JJ,) — 247,5 (Ulane) -247,5 (CM,) — 247,5 (Hor) -59,6 (НДС) -247,5 (CM) -247,6 (\ (2003 \))] TJ / T1_2 1 Тс 32,6353 0 тд [(Дж) -247,5 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс -30,9469 -1,2516 тд (77: 7635 \ 2267644.) Tj -1,6883 -1,2516 тд [(31.) — 423,7 (Leupin) -337,6 (O,) — 337,6 (Bontron) -337,6 (S,) — 337,6 (Str) -29,6 (убин) -337,6 (M) -337,6 (\ (2003 \) )] TJ / T1_2 1 Тс 19.5928 0 Td [(Дж) -337,6 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс 3,1422 0 Тд [(77: 6274) -89,7 (\ 226) -89.7 (6283.)] Т.Дж. -22,735 -1,2516 тд [(32.) — 423,7 (Bontron) -337,6 (S,) — 337,6 (Lin-Marq) -337,6 (N,) — 337,6 (Str) -29,6 (убин) -337,6 (M) -337,7 (\ (2002) \))] TJ / T1_2 1 Тс 20.6656 0 Тд [(J) -337,6 (Biol) -337,6 (Chem)] TJ / T1_0 1 Тс 5,6199 0 тд (277: 38847 \ 22638854.) Tj -26,2855 -1,2516 тд [(33.) — 423,7 (Лин-Марк) -337,6 (N,) — 337,6 (Бонтрон) -337,6 (S,) — 337,6 (Леупин) -337,6 (O,) — 337,6 (Стр) -29,6 (убин) -337,6 (M) -337,7 (\ (2001 \))] TJ / T1_2 1 Тс 25,4939 0 тд [(V) -29.6 (irolog) -49.9 (y)] TJ / T1_0 1 Тс 3.8322 0 тд [(287: 266) -89.7 (\ 226274.)] Т.Дж. -29,3262 -1,2516 тд [(34.) — 423,7 (Беккер) -337,6 (SA,) — 337,6 (Ли) -337,6 (T) -59,6 (H,) — 337,6 (Butel) -337,6 (JS,) — 337,6 (Slagle) -337,6 (BL) -337,6 (\ (1998 \))] TJ / T1_2 1 Тс 23.1204 0 Тд [(Дж) -337,6 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс 3,1422 0 Тд [(72: 266) -89,7 (\ 226272.)] TJ -26,2626 -1,2516 тд [(35.) — 423,7 (Lin) -337,6 (GY,) — 337,6 (L) -29,6 (атмосфер) -337,6 (R) -59,6 (A) -337,6 (\ (2000 \))] TJ / T1_2 1 Тс 13,6347 0 тд [(Дж) -337,6 (В) -29,6 (ирол)] ТДж / T1_0 1 Тс 3,1422 0 Тд (74: 9152 \ 2269166.) Tj -16,777 -1,2516 тд [(36.) -423,7 (Ситтерлин) -337,6 (D,) — 337,6 (Бергаметти) -337,6 (F,) — 337,6 (Транси) -337,6 (C) -337,6 (\ (2000 \))] TJ / T1_2 1 Тс 20.7646 0 тд (Онкоген) Tj / T1_0 1 Тс 4,4777 0 тд [(19: 4417 \ 226) -89,7 (4426.)] TJ -25,2423 -1,2516 тд [(37.) — 423,7 (A) -29,6 (пальцы) -530 (S,) — 530 (Li) -530 (T,) — 530 (Yi) -530 (X,) — 530 (Mac) -29,6 (c) -29,6 (oss) -530 (MJ,) — 530 (Moon) -530 (RT,) — 530 (Zheng) -530 (N) -530 (\ (2006 \))] TJ / T1_2 1 Тс 32,4812 0 тд (Природа) Tj / T1_0 1 Тс -30,7929 -1,2516 тд [(493: 590) -89,7 (\ 226593.)] TJ -1,6883 -1,2516 тд [(38.) -423,7 (Inok) -29,6 (i) -364,4 (T,) — 364,4 (Yamagami) -364,4 (S,) — 364,4 (Inok) -29,6 (i) -364,4 (Y,) — 364,4 (Tsur) — 29,6 (u) -364,4 (T,) — 364,4 (Хамамото) -364,4 (T,) — 364,4 (Кагава) -364,4 (Y,) — 364,4 (Мори) -364,4 (T,)] TJ 1,6883 -1,2516 тд [(Эндо) -337,6 (H) -337,6 (\ (2004 \))] TJ / T1_2 1 Тс 6.9887 0 тд [(Biochem) -337,6 (Biophys) -337,6 (Res) -337,6 (Commun)] TJ / T1_0 1 Тс 13.7989 0 тд [(314: 1036) -89,7 (\ 2261043.)] TJ / T1_3 1 Тс 0 Tc 6.5 0 0 6.5 51.6761 39.8835 Tm [(Schro) 444,4 (\ 250) -166,5 (felbauer)] TJ / T1_4 1 Тс 6.8064 0 тд [(et) -305,1 (al)] TJ / T1_3 1 Тс (.) Tj 45,0551 0 тд (PNAS) Tj / T1_5 1 Тс 9,75 0 0 6,5 411,0262 39,8835 тм (\ 001) Tj / T1_6 1 Тс 6,5 0 0 6,5 419,1908 39,8835 тм [(Март) -305,1 (6,) — ​​305,1 (2007)] TJ / T1_5 1 Тс 9,75 0 0 6,5 468,1711 39,8835 тм (\ 001) Tj / T1_3 1 Тс 6,5 0 0 6,5 476,3358 39,8835 тм [(об.) — 305,1 (104)] ТДж / T1_5 1 Тс 9,75 0 0 6,5 505,997 39,8835 тм (\ 001) Tj / T1_3 1 Тс 6,5 0 0 6,5 514,1616 39,8835 тм [(кол.) — 305,1 (10)] ТДж / T1_5 1 Тс 9,75 0 0 6,5 539,1232 39,8835 тм (\ 001) Tj / T1_6 1 Тс 6.5 0 0 6,5 547,2878 39,8835 тм (4135) Tj / T1_1 1 Тс 0 6,5 -6,5 0585,1761 75,7045 тм (МИКРОБИОЛОГИЯ) Tj ET q / GS1 GS 19 0 0815,5 9 9 см 1.179 TL / Im0 Do Q BT 0 г / GS1 GS / T1_7 1 Тс 0 4-4 0 23 14 тм (Загружено гостем 21 октября 2021 г.) Tj ET конечный поток эндобдж 132 0 объект > поток

    Команда UVM использует технологии, чтобы дать голос детям с нарушениями общения

    Технологии упростили общение для многих из нас — мы можем общаться с сотовыми телефонами и компьютерами способами, о которых даже не догадывались несколько десятилетий назад.Но как насчет части людей, для которых даже самое простое общение было проблемой? Как им помогли технологии?

    Энтони Аргуин, 5-летний мальчик из Джефферсонвилля, со сложными формами инвалидности. Но устройство, которое он начал использовать прошлой весной, учит свою семью тому, на что способен Энтони.

    У Энтони церебральный паралич. У него также есть нарушения слуха и зрения. Его инвалидность не позволяет ему ходить, есть или общаться устно. Однако это не значит, что ему нечего сказать — наоборот.

    Когда Энтони было 2 года, его родители и старшие сестры поняли, что он их понимает. С тех пор они пытаются выяснить желания и потребности Энтони, используя язык жестов и много гаданий.

    Но полгода назад Энтони подарили коммуникатор, и почти сразу его внутренний мир стал открываться им.

    Что они узнали о нем первым? Его мать, Тиффани Аргуин, смеется, отвечая на этот вопрос.

    «Он любит Wii !! И определенные цвета », — говорит она.«И у него есть просто чувство юмора, которое он будет использовать с этим, как мы уже знали, что он это сделал, но насколько больше он выходит, так как он мог использовать это … Он говорил что-то глупое, и мы как бы хихикать, но он подумал, что это было весело… просто такие вещи. Я имею в виду, это типа: «Ты так думаешь ?!»

    Они обнаружили, что Энтони любит музыку и играет на пианино.

    Технология Энтони называется дополнительным коммуникационным устройством. Это помогает детям и взрослым, имеющим проблемы с общением или по существу невербальным, выражать свои мысли словами.Конкретное устройство Энтони — это Nova Chat 10 производства Saltillo. Это портативное устройство для распознавания речи, немного напоминающее iPad, с 10-дюймовым экраном и красочными значками.

    Тиффани Аргуин называет устройство «говорящим» — оно генерирует слова и фразы вслух, и Энтони может выбирать фразы, соответствующие его мыслям.

    Тиффани Аргуин называет устройство «болтуном». Он генерирует слова и фразы вслух, и ее сын Энтони может выбирать фразы, которые соответствуют его мыслям.

    Его мама говорит, что это очень важно для Энтони.

    «Он так взволнован, — говорит она. «Он бросал свое тело, типа, он был бы разочарован, и мы бы знали, чего он хотел. Но чтобы он действительно мог подойти к говорящему и сказать: «Мама, я хочу обнять», и просто был так взволнован, как: «Она получила это!» И это просто подкрепление… огромное! Что он может общаться, что это то, в чем я нуждаюсь или хочу ».

    Семья Энтони узнала об этой технологии из программы I-Team в Университете Вермонта.Это группа специалистов, которые обучают и обучают детей в возрасте от 2 до 22 лет по всему штату. Это дети, которым нужна помощь как в учебе, так и в основных повседневных жизненных навыках. Многие из них невербальны, как Энтони.

    I-Team работает со 150 детьми в системе государственных школ. Тиффани говорит, что они подписали Энтони с I-Team, когда ему было 2 года.

    «Они привлекли целую группу людей, чтобы помочь… с выяснением аугментативного общения, и мы просто знали, как он будет общаться», — говорит она.«Вы знаете, как только он достигнет определенного возраста, мы будем двигаться именно туда».

    Семья Энтони узнала об этой технологии от I-Team UVM. Это группа специалистов, которые обучают и обучают детей в возрасте от 2 до 22 лет по всему штату.

    Одной из участниц группы была Эми Старбл, логопед и консультант I-Team. Она путешествует в отдаленные районы штата, встречаясь с семьями, которые не знают, как справиться, не говоря уже о том, как общаться со своими детьми.

    Работа Старбла — помочь адаптировать технологии к потребностям ребенка. И она говорит, что по эмоциональной реакции этих семей, когда она появляется на месте происшествия, может сказать, что она также приносит с собой надежду.

    Недавно днем ​​Старбл навещает Аргинов дома в Джефферсонвилле. Сегодня собралась большая группа: речевой патолог из местной школы, члены I-Team и несколько членов семьи.

    Энтони лежит на коврике в гостиной, издавая кряхтение и пронзительный визг от возбуждения при виде такого количества людей, собирающихся вокруг него.

    Кредит Джессике Тиктин для VPR

    Тиффани Аргуин и ее сын Энтони дома в Джефферсонвилле. Тиффани говорит, что когда Энтони начал использовать усиливающее устройство связи, его семья узнала, что он любит музыку, играет на пианино и семейную Wii.

    Тиффани Аргуин усаживает Энтони к себе на колени, пока Старбл работает с пятилетним мальчиком и его устройством. «Говорящий» имеет сенсорный экран, но Энтони борется с управлением двигателем, поэтому он использует большую оранжевую кнопку, прикрепленную к планшету.

    Старбл начинает с чтения книги.

    «Если тебе есть что сказать, пока мы читаем, давай, ладно? Я положу тебе сюда под ногу, — говорит она. «О, тебе есть что сказать?»

    Способность общаться дала Энтони чувство контроля. Вместо того, чтобы кричать, чтобы привлечь внимание мамы, он может использовать свой электронный голос, чтобы сказать ей, чего он хочет.

    «У него будет сканирующий голос, но также есть детский голос, поэтому, когда вы выбираете то, что хотите сказать, он меняется», — говорит Тиффани.«Так что мы как бы проигнорируем — не совсем игнорируем — сканируемый взрослый голос, потому что это похоже на то, что он так думает. А потом, когда он услышит то, что хочет сказать, и ударит по нему, это прозвучит детским голосом, и мы скажем: «О, Энтони, тебе не хватало объятий?» или прибежит из другой комнаты. И это дает ему больше возможностей, чем он может ».

    «У него будет сканирующий голос, но у него также будет свой дочерний голос, поэтому, когда вы выбираете, что хотите сказать, он меняется… И это дает ему больше возможностей, чем он может для него. «- Тиффани Аргуин

    Но достать эти устройства непросто. Тиффани Аргуин пришлось заполнить то, что она называет «грудой документов» для Medicaid, чтобы Энтони получил свое первое пробное устройство. Теперь, когда он успешно использует его в течение шести месяцев или около того, Старбл помогает Тиффани отправить еще больше документов, чтобы доказать, что Энтони выиграет от постоянного устройства.

    «Для нас это ясно, но вы должны показать это в бумаге, очень четко.Так что потребовалось много сотрудничества между обеими командами — и школой, и I-Team, чтобы иметь возможность работать вместе ».

    Старбл называет это надежной системой, разработанной, чтобы расти вместе с ним, чтобы ему не пришлось менять или приобретать новую.

    «Мы бы не хотели, чтобы, скажем, через пять лет пришлось резко поменяться и дать ему другой», — говорит Старбл. «Мы хотим, чтобы он рос вместе с ним, а также имел безграничные возможности построения предложений, комбинируя слова и делая длинные высказывания и просто конструируя свои собственные мысли.

    С такими детьми, как Энтони, которые не могут общаться вербально, часто разговаривают или разговаривают с ними. «Они становятся пассивными наблюдателями за жизнью», — говорит Старбл. С помощью этой технологии она побуждает команды подумать о том, как они могут помочь ребенку инициировать взаимодействие.

    «Я знаю, что всем детям есть что сказать, и моя работа — попытаться найти лучший способ, которым они могут это сделать». — Эми Старбл, UVM I-Team

    «Это позволяет им начать разговор», — говорит Старбл.«Это позволяет им устанавливать связь с людьми».

    Старбл также говорит семьям, что можно ожидать многого от ребенка с ограниченными возможностями.

    «Я знаю, что всем детям есть что сказать, и моя работа — попытаться найти лучший способ, которым они могут это сделать», — говорит она. «Я могу внести свой вклад в команды и работать со школьными SLP, чтобы убедиться, что у этих детей есть системы, которые они могут использовать всю свою жизнь… если им нужно».

    Когда Энтони использует свое устройство для общения, он кажется переполненным радостью от того, что люди могут его понять.Технология дает Энтони право голоса. А его семья может познакомиться с настоящим мальчиком, живущим внутри его недееспособного тела.

    Руководство по исследованиям во время COVID-19 — Отдел исследований

    Последнее обновление страницы 14:00, 1 сентября 2021 г.

    По мере того, как ситуация с COVID-19 продолжает развиваться, возникнут проблемы с выполнением нашей исследовательской миссии, а также нашей образовательной миссии.Эта веб-страница была создана, доступ к ней можно получить с веб-страницы TAMU.edu/coronavirus, чтобы предоставлять регулярные обновления для исследователей Texas A&M. Руководство предоставляется в формате часто задаваемых вопросов, чтобы помочь преподавателям и исследователям во всех кампусах с активными исследовательскими программами управлять своими текущими исследованиями и планировать возможные будущие ограничения. Вопросы также можно отправлять через поле ниже.

    Для получения дополнительной информации посетите сайт TAMU.edu/coronavirus, чтобы получить самый последний ответ Техасского университета A&M по поводу коронавируса.

    Помните, что весь персонал должен оставаться дома, если у него появятся какие-либо симптомы, включая жар, кашель или затрудненное дыхание.

    Последние объявления

    Статус исследования и планы на начало осеннего семестра — 27 августа 2021 г.

    Обновление руководства по исследованиям — 20 мая 2021 г.

    Здоровье и безопасность в исследованиях — 18 августа 2020 г.

    Статус исследования и планы на осенний семестр — 11 августа 2020 г.

    Руководство по очным исследованиям для бакалавриата — 21 июля 2020 г.

    Планы по возобновлению клинических исследований, обучения и оказания услуг с участием людей — 8 июня 2020 г.

    Руководство для аспирантов и студентов-исследователей — 20 мая 2020 г.

    Исследования COVID-19

    Объявление о финансировании федеральных исследований COVID-19

    Индекс исследований COVID-19

    Ответы Texas A&M: COVID-19

    Представители Палаты представителей представили двухпартийный закон в поддержку У.С. исследовательское сообщество во время пандемии

    Вопросы

    Ресурсы

    Совет по связям с государством

    Институциональные ресурсы по наращиванию и возобновлению работы
    https://www.cogr.edu/institutional-resources-ramping-and-reopening

    Центры по контролю и профилактике заболеваний

    Рекомендации для институтов высшего образования
    https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/community/colleges-universities/considerations.html
    (CDC подчеркивает, что «эти соображения предназначены для дополнения, а не замены — любых государственных, местных, территориальных или племенных законов, правил и положений в области здравоохранения и безопасности, которым должны соответствовать IHE».)

    Мировой измеритель

    (управляется международной командой разработчиков, исследователей и добровольцев, чтобы сделать мировую статистику доступной для широкой аудитории во всем мире. Данные о COVID-19 собираются из официальных отчетов, напрямую из правительственных каналов связи или косвенно через местные СМИ, когда это считается надежный.Включает живые счетчики).

    https://www.worldometer.info/coronavirus/

    Рекомендации Белого дома — снова открыть Америку

    https://www.whitehouse.gov/openingamerica

    Открытые контрольные списки штата Техас и отчет губернатора штата Техас

    (включает отчет губернатора, а также контрольные списки для частных лиц и работодателей)
    https://gov.texas.gov/organization/opentexas/homepage

    Департамент здравоохранения штата Техас (DSHS) -COVID-19

    (включает минимальные стандартные протоколы здравоохранения для COViD-19, а также информацию и ссылки, связанные с количеством случаев заболевания, что делать, если вы заболели, информацию о тестировании, симптомы и советы по профилактике: самопроверка COVID-10)
    https: // www.dshs.texas.gov/coronavirus/

    CDC

    (включает информацию о том, что делать, если вы заболели, а также рекомендации по очистке и дезинфекции)
    https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/index.html

    Руководство по маскировке лица
    (включает информацию о том, как сделать маску для лица)
    https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/diy-cloth-face-coverings.html

    Руководство по возобновлению работы
    (уборка и дезинфекция общественных мест, рабочих мест, предприятий, школ и домов)
    https: // www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/community/reopen-guidance.html

    TAMU COVID-19 Руководство

    (центральный узел общей информации с ответами на часто задаваемые вопросы и ссылками на ресурсы на федеральном, государственном, местном и университетском уровнях. Включает ответы на часто задаваемые вопросы по ряду вопросов, включая поездки, действия в кампусе для борьбы с инфекциями; способы очистки и дезинфекции; что делать, если у сотрудника проявляются симптомы / признаки, соответствующие коронавирусу и т. д.)
    https://www.tamu.edu/coronavirus/index.html

    ТАМУ HR информация, связанная с работой по коронавирусу

    https: // сотрудники.tamu.edu/COVID-19

    Возобновление исследовательской деятельности

    1. Действуют ли еще защитные меры?

    • 1.1.

      Да. К ним относятся:

      • Всегда держите дистанцию ​​в обществе.
      • Соблюдайте личную гигиену, включая надлежащее мытье рук, соблюдение этикета при кашле / чихании, не прикасайтесь к лицу, глазам, носу и рту.
      • Дезинфицирующее средство для рук должно быть под рукой у всех входов в здание и в точках доступа на каждом этаже.
      • Использование соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ) для защиты себя и других от распространения вируса как в лабораториях, так и в исследовательском центре.
      • Очистите / продезинфицируйте места, подверженные сильному прикосновению, в общих помещениях, включая лаборатории.
      • Самостоятельное обследование перед приездом в кампус на предмет новых или ухудшающихся признаков или симптомов возможного COVID-19.
      • Не приходите на работу, если вы больны или у вас есть признаки или симптомы COVID-19.
    2. Какие гигиенические процедуры требуются для работы в исследовательских центрах Texas A&M?

    • 2.1.

      Обязательные гигиенические процедуры для всех исследовательских центров и персонала Texas A&M включают следующее:

      • Весь персонал должен носить защитные маски (т.е., использование материала для покрытия носа и рта) в местах общего пользования, включая лаборатории.
      • Все двери и ручки шкафа, поверхности скамей, клавиатуры, панели управления инструментами и т. Д. Следует чистить в начале и конце каждого дня или, если исследователи работают посменно, в начале и в конце каждой смены.
      • Все совместно используемое оборудование, включая компьютерные клавиатуры и столы, должно иметь очищаемые поверхности пользовательского интерфейса между каждым пользователем.
      • Прочие предметы, требующие особого внимания, такие как ручные инструменты, микропипетки, ручки кранов, флаконы с химикатами и распылителями, спинки стульев и подлокотники, ручки и маркеры для белых досок следует чистить в перерывах между пользователями.
      • Очистка должна производиться одобренным EPA дезинфицирующим средством, которое эффективно против COVID-19, в дополнение к другим биологически опасным агентам, которые могут использоваться. Список можно найти по адресу https://www.epa.gov/pesticide-registration/list-n-disinfectants-use-against-sars-cov-2
      • .
      • Обратите внимание на время контакта с дезинфицирующим средством; большинство дезинфицирующих средств не действуют при контакте.
      • Используйте соответствующие СИЗ при использовании дезинфицирующих / чистящих средств, включая средства защиты глаз и химически совместимые непроницаемые перчатки.

    Научно-исследовательские центры / Безопасность лабораторий

    EPA — Дезинфицирующие средства от COVID-19

    https://www.epa.gov/pesticide-registration/list-n-disinfectants-use-against-sars-cov-2

    CDC

    (временные руководящие принципы лабораторной биобезопасности при обращении и обработке образцов, связанных с коронавирусной болезнью 2019 (COVID-19))
    https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html

    (вопросы и ответы о лабораторной биобезопасности и COVID-19)
    https: // www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/biosafety-faqs.html

    Университет штата Пенсильвания

    (руководство по очистке лабораторий и исследовательских центров)
    https://ehs.psu.edu/sites/ehs/files/cleaningguidance-laboratory.pdf

    OSHA

    Подверженность работников COVID-19
    (описывается классификация рабочих рисков COVID-19)
    https://www.osha.gov/Publications/OSHA3993.pdf

    Руководство по подготовке рабочего места к COVID-19
    https://www.osha.gov/Publications/OSHA3990.pdf

    Вашингтонский университет

    (уровень риска COVID-19 и выбор средств индивидуальной защиты (СИЗ)
    https://www.ehs.washington.edu/system/files/resources/COVID-19-risk-ppe-selection.pdf

    (руководство по использованию лицевых масок)
    https://www.ehs.washington.edu/system/files/resources/facemask-guidance-COVID-19.pdf

    1. Открыты и функционируют ли исследовательские лаборатории и помещения? Как на исследования влияют приказы штатов, округов и городов?

    • 1.1.

      Техасский университет A&M будет следовать распоряжению губернатора Эбботта GA-34 и руководству Техасского университета A&M и руководства системы при определении текущих операций и функций.

    • 1.2.

      При рекомендованных защитных лабораторных методах исследовательская деятельность может вернуться к уровням, существовавшим до COVID.

    2. Какие защитные меры мне следует предпринять для проведения исследований осенью 2021 года?

    • 2.1.

      Поскольку исследовательская деятельность начнется осенью 2021 года, следующие меры защиты в лабораториях рекомендуются , но не требуются . К ним относятся

      • Самостоятельное обследование перед приездом в кампус на предмет новых или ухудшающихся признаков или симптомов возможного COVID-19. Не приходите на работу, если вы больны или у вас есть признаки или симптомы COVID-19.
      • Сохраняйте социальное дистанцирование.
      • Соблюдайте личную гигиену, включая надлежащее мытье рук, соблюдение этикета при кашле / чихании, не прикасайтесь к лицу, глазам, носу и рту.
      • Дезинфицирующее средство для рук должно быть под рукой у всех входов в здание и в точках доступа на каждом этаже.
      • Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), чтобы защитить себя и других от распространения вируса как в лабораториях, так и в исследовательском здании.
      • Очистите / продезинфицируйте места, подверженные сильному прикосновению, в общих помещениях, включая лаборатории.
    3. Какие гигиенические процедуры рекомендуются для исследовательских центров / персонала?

    • 3.1.

      PI несут ответственность за разработку и внедрение соответствующих планов управления для своих лабораторий и за обучение своего персонала надлежащей очистке и дезинфекции, гигиене рук и предпочтительному / рекомендуемому респираторному этикету.

    • 3.2.

      Рекомендуемые гигиенические процедуры для исследовательских центров / персонала включают

      • Маски для лица (т. Е. Использование материала для покрытия носа и рта) рекомендуются в местах общего пользования, в том числе в лабораториях.
      • Вирус, вызывающий COVID-19, может приземлиться на поверхности. Люди могут заразиться, если коснутся этих поверхностей, а затем коснутся носа, рта или глаз.В большинстве случаев риск заражения от прикосновения к поверхности невелик. Самый надежный способ предотвратить заражение поверхностей — это регулярно мыть руки или использовать дезинфицирующее средство для рук. Очистка и дезинфекция поверхностей также может снизить риск заражения.
      • Очистка всех ручек дверей и шкафов, поверхностей скамей, клавиатур, панелей управления приборами и т. Д. В начале и конце дня или, если исследователи работают посменно, в начале и конце каждой смены.
      • Все совместно используемое оборудование, включая компьютерные клавиатуры и столы, должно иметь очищаемые поверхности пользовательского интерфейса между каждым пользователем.
      • Прочие предметы, требующие особого внимания, такие как ручные инструменты, микропипетки, ручки кранов, флаконы с химикатами и распылителями, спинки стульев и подлокотники, ручки и маркеры для белых досок следует чистить в перерывах между пользователями.
      • Очистка должна производиться одобренным EPA дезинфицирующим средством, которое эффективно против COVID-19, в дополнение к другим биологически опасным агентам, которые могут использоваться.Список можно найти по адресу https://www.epa.gov/pesticide-registration/list-n-disinfectants-use-against-sars-cov-2
      • .
      • Обратите внимание на время контакта с дезинфицирующим средством; большинство дезинфицирующих средств не действуют при контакте.
      • Используйте соответствующие СИЗ при использовании дезинфицирующих / чистящих средств, включая средства защиты глаз и химически совместимые непроницаемые перчатки.
    4. Открыты ли основные объекты?

    • 4.1.

      Да. Основные объекты открыты для поддержки исследовательской деятельности. Признайте, что каждый основной объект уникален, а правила работы и доступа устанавливаются директором каждого объекта. Мы выпустили приведенное ниже руководство, чтобы помочь директорам, персоналу и пользователям основных предприятий. Отдельные помещения могут добавлять требования к оборудованию и использованию помещений.

      • Установите и публикуйте часы личной работы в соответствии с университетскими руководящими принципами для лаборатории.
      • Сообщите пользователям, что в случае плохого самочувствия им не следует входить в учреждение.
      • Установите процедуры очистки инструментов и пространства в конце каждого дня, чтобы каждый рабочий день начинался с чистого пространства.
      • В соответствии с принципами социального дистанцирования может быть предпочтительнее меньшее количество личных пользователей объекта.
      • Сообщите пользователям, что они должны использовать новые перчатки и имеющееся дезинфицирующее средство для рук перед входом в комнату, чтобы использовать инструмент и дезинфицирующее средство для рук перед тем, как покинуть учреждение.
      • Напомните пользователям, что в перчатках они не должны прикасаться к чему-либо в лаборатории, что не является необходимым для их работы.
      • Сообщите пользователям, что они должны снять перчатки перед тем, как покинуть лабораторию, и выбросить их в лаборатории после окончания работы.
      • Посоветуйте пользователям носить соответствующие маски для дополнительной защиты при использовании инструментов.
    5. Какие меры предосторожности следует использовать исследователям при работе с образцами человеческого материала в исследовательской лаборатории?

    • 5.1.

      Лабораторный исследовательский персонал должен продолжать соблюдать универсальные меры предосторожности, носить соответствующие средства индивидуальной защиты (одноразовые перчатки, лабораторный халат / халат, средства защиты глаз и т. Д.) И соблюдать меры биологической безопасности уровня 2 при обращении со всеми человеческими материалами.

    6. Работа с образцами человека, положительными или предполагаемыми на COVID-19.

    • 6.1.

      Исследователи должны иметь разрешение IBC для работы с образцами человека, положительными или предполагаемыми на COVID-19. Исследователи, которым разрешено работать с такими образцами, должны постоянно носить все необходимые СИЗ, включая лабораторные халаты, перчатки, респираторные (N95 или PAPR) и средства защиты глаз. Одноразовые СИЗ предпочтительнее. Никакие СИЗ не должны покидать лабораторию, если они не автоклавированы. Процедуры, потенциально способные создать инфекционные аэрозоли или брызги, должны проводиться в надлежащим образом обслуживаемом шкафу биобезопасности (BSC) класса II или других устройствах физического сдерживания, таких как герметичные головки ротора или защитные стаканы центрифуги, а также в утвержденной лаборатории BSL-2.Все биологически опасные отходы, образующиеся в результате такой деятельности, перед утилизацией необходимо автоклавировать. Исследователи должны строго соблюдать правила гигиены рук и мыть руки перед входом в лабораторию и выходом из нее. Рабочие поверхности и оборудование необходимо обеззараживать соответствующими дезинфицирующими средствами до и после работы. Используйте больничные дезинфицирующие средства, зарегистрированные EPA, с заявлением на этикетке, что они эффективны против SARS-CoV-2. Следуйте рекомендациям производителя по использованию, таким как разбавление, время контакта и безопасное обращение.Исследователи, использующие обычные компьютеры и клавиатуры (например, управляющие инструментом), должны мыть руки с мылом до и после использования клавиатуры. Клавиатуру следует протирать дезинфицирующей салфеткой до и после каждого использования. Члены лаборатории должны работать на безопасном расстоянии (не менее 6 футов) друг от друга, находясь в лаборатории вместе, и строго придерживаться всех стандартных микробиологических практик, изложенных в BMBL, во время своей работы.

      Действия с живым вирусом SARS-CoV-2 должны быть рассмотрены и одобрены TAMU IBC и могут выполняться только в сертифицированной лаборатории BSL-3 уполномоченным персоналом IBC.

    7. Какие дезинфицирующие средства следует использовать в исследовательских лабораториях?

    • 7.1.

      Список EPA N указывает, что этот вирус чувствителен к дезинфицирующим средствам с доказанной активностью против вирусов в оболочке, включая растворы отбеливателя или этанол. Для общей дезинфекции лабораторных поверхностей приготовьте свежий раствор 1:10 (0.5% активного гипохлорита натрия) бытового отбеливателя или 70% -ного разбавления этанола. Готовьте свежие дезинфицирующие растворы в начале недели и утилизируйте то, что не использовалось в конце недели. Подождите не менее 10 минут для контакта как с 10% отбеливателем, так и с 70% этанолом. Никогда не используйте дезинфицирующие средства с истекшим сроком годности.

    • 7.2.

      Исследователи, работающие с SARS-CoV-2 или с образцами, потенциально содержащими SARS-CoV-2, должны выбрать конкретное дезинфицирующее средство из списка зарегистрированных дезинфицирующих средств Агентства по охране окружающей среды и следовать всем инструкциям производителя по приготовлению и применению.Это дезинфицирующее средство следует использовать вместе с другими дезинфицирующими средствами для конкретных агентов, которые уже требуются для использования в лаборатории.

    8. Будут ли при необходимости доступны офисы по соблюдению требований исследований и биобезопасности, а также по охране окружающей среды, здоровья и безопасности (EHS)?

    • 8.1.

      EHS будет поддерживать все функции, такие как аварийное разливание и пожаротушение, сбор и поставка опасных отходов, доставка радиоактивных упаковок и деятельность в области общественного здравоохранения.С обычными вопросами и проблемами обращайтесь по телефону 979-845-2132 или по электронной почте [email protected] После ответа свяжитесь с центром связи по телефону 979-845-4311. В экстренных случаях звоните 911.

      .
      8.2.

      Отделы по соблюдению требований к исследованиям и биобезопасности будут функционировать для обслуживания всех потребностей в исследованиях осенью 2021 года.

    9. Будет ли институциональный комитет по биобезопасности продолжать встречаться и рассматривать представленные материалы?

    • 9.1.

      Да. IBC будет продолжать встречаться раз в месяц, как и запланировано. Аналогичным образом, процесс рассмотрения заявки будет продолжен, как и раньше, а сроки продления останутся в соответствии с графиком. Продление действующих, но истекающих разрешений IBC будет предоставлено при условии получения заявки на продление , чтобы ранее утвержденные работы могли продолжаться в максимально допустимой степени. По конкретным вопросам о представлении IBC обращайтесь по адресу [email protected]

    Research Travel

    1. Какая последняя туристическая информация?

    Подача предложений и управление наградами

    1. На мое исследование могут повлиять меры, принятые в рамках реагирования TAMU на COVID-19, что может привести к задержкам в завершении моего исследования к концу периода проекта или к концу семестра. Что я должен делать?

    • 1.1.

      Большинство федеральных спонсоров допускают единовременное бесплатное продление на 12 месяцев в конце проекта. Многие спонсоры рассматривают влияние COVID-19 на сроки проекта. Сообщите вашему финансирующему агентству или спонсору о приостановке учебной деятельности. Обязательно сообщайте им обо всех изменениях, которые вы внесете в свое исследование.

    2. Будет ли мое предложение передано спонсору в срок во время вспышки COVID-19?

    • 2.1.

      Предложения подаются офисом спонсируемых исследовательских услуг (SRS) до крайнего срока в соответствии с Руководством по подаче предложений.

    3. Если агентство, в которое я собираюсь подать предложение, закрывается из-за вспышки COVID-19, будет ли мое предложение отправлено в установленный срок?

    • 3.1.

      Мы ожидаем, что все федеральные агентства будут продолжать принимать предложения, даже если агентство будет закрыто. Предложение, скорее всего, будет оставаться в электронной очереди до тех пор, пока сотрудники федерального агентства не вернутся к работе, подобно тому, что мы испытываем во время федерального закрытия.

    4. Как я могу связаться со своим контактным лицом в SRS?

    • 4.1

      Как и в других подразделениях, некоторые сотрудники СГД будут работать удаленно. Они по-прежнему будут отвечать на электронные и голосовые сообщения в обычном режиме.

    5. Смогу ли я продлить срок подачи заявок в случае вспышки COVID-19?

    • 5.1.

      Бюджетно-управленческое управление (OMB) выпустило M-20-17, «Административная помощь для получателей и соискателей федеральной финансовой помощи, непосредственно пострадавших от нового коронавируса (COVID-19) из-за потери операций»., который предоставляет административные льготы, аналогичные перечисленным в M-20-11, расширенному кругу получателей, пострадавших от потери операционных возможностей и увеличения затрат из-за кризиса COVID-19. OMB опубликовало информацию о том, что МОГУТ делать федеральные агентства, но они явно оставляют решения на усмотрение отдельных агентств.

    6. Где я могу найти рекомендации Национальных институтов здравоохранения по COVID-19 в отношении подачи заявок и управления наградами?

    7. Где я могу найти рекомендации Национального научного фонда по COVID-19?

    8. Может ли главный исследователь, работающий удаленно во время самоизоляции, взимать зарплату / усилия по федеральному гранту?

    • 8.1.

      Да, пока исследователь участвует в проекте.Требования NIH и NSF к предварительному одобрению выхода из проекта на три (3) месяца или более, а также сокращение усилий на 25 процентов или более, остаются в силе.

    9. Как насчет рекомендаций относительно поездок и расходов, связанных с COVID-19?

    • 9.1.

      В настоящее время нет федерального руководства, касающегося платы за проезд, конференции и связанных с этим расходов из-за COVID-19.Мы ожидаем, что прогноз будет доступен в ближайшее время.

    10. Будут ли агентства рассматривать более бесплатное продление времени, если они необходимы для завершения проекта после сбоя?

    • 10.1.

      Неизвестно, рассмотрят ли федеральные агентства возможность бесплатного продления на более длительный срок, чем обычно.Поэтому исследователи должны задокументировать влияние COVID-19 на свои гранты для будущих запросов на бесплатное продление.

    11. Где я могу найти дополнительную информацию по этой теме?

    Исследования с участием животных

    Хотя исследовательская деятельность возобновлена ​​во всех кампусах, для обеспечения непрерывности работы исследователи должны спланировать, как их эксперименты и животные будут надлежащим образом управляться в случае, если один или несколько сотрудников станут недоступны для работы в лаборатории.Исследователи, которые не могут или становятся неспособными обеспечить свой обычный уровень ухода за своими животными, должны немедленно уведомить персонал своего зоопарка. Хотя CMP и другие сотрудники виварии всегда будут оказывать медицинскую помощь, они могут быть не в состоянии проводить экспериментальные протоколы, поэтому, пожалуйста, планируйте соответственно.

    1. Какие планы у Texas A&M по уходу за животными?

    • 1.1.

      Уход за животными всегда является приоритетом и будет оставаться приоритетом. В случае необходимости животноводческие учреждения будут внедрять протоколы оказания экстренной помощи, чтобы продолжать обеспечивать ежедневный уход за подопытными животными в случае нарушения нормальной работы. Такие планы существуют для защиты животных в случае стихийного бедствия, нехватки персонала или других чрезвычайных обстоятельств, а также для обеспечения доступа к пище, воде, надлежащим условиям окружающей среды и ветеринарной помощи.

    • 1.2.

      Помещения для содержания животных содержат соответствующие объемы запасов для обеспечения надлежащего ухода в чрезвычайных обстоятельствах и продолжают поддерживать связь с поставщиками, чтобы гарантировать, что подстилка, корм и другие важные материалы остаются доступными.

    • 1.3.

      Лечащий ветеринар (AV) и ветеринарный персонал доступны для решения любых проблем со здоровьем животных. Офицер по защите прав животных и животных (AWO) доступен для решения любых проблем, связанных с благополучием животных.

    • 1.5.

      Пожалуйста, проконсультируйтесь с лечащим ветеринаром по вашей программе для животных для получения дополнительной информации об управлении популяцией, нормировании средств индивидуальной защиты, изменениях часов вивария и циклах смены клеток / уборки помещений для животных.

    2. Как мне запросить уход за животными или другую помощь?

    • 2.1.

      Central Vivaria Контакты:

      • Колледж-Стейшн / Галвестон (CMP): (979) 845-7433
      • Даллас (ARU): (214) 828-8149
      • Галвестон (Морской центр): (409) 740-4574
      • Хьюстон (PAR): (713) 677-7471
      • Кингсвилл (PRF): (361) 221-0770
    3. Что мне делать, если у меня есть другие вопросы?

    • 3.1.

      Все аспекты ухода за животными будут по-прежнему тщательно контролироваться. Свяжитесь с лечащим ветеринаром вашего кампуса для получения дополнительных вопросов. (См. Список контактов vivaria в Разделе 2.1.).

    • 3.2.

      Пожалуйста, проконсультируйтесь с лечащим ветеринаром по вашей программе для животных для получения дополнительной информации о средствах защиты персонала, изменениях часов вивария и циклах смены клетки / уборки помещений для животных.

    Cullin4A и Cullin4B взаимозаменяемы для действия Vpr и Vpx ВИЧ посредством комплекса убиквитин-лигазы CRL4

    ВВЕДЕНИЕ

    Инфекция, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), остается серьезной угрозой для здоровья человека. Понимание молекулярной биологии, лежащей в основе репликации и патогенеза ВИЧ, будет иметь решающее значение для остановки этого разрушительного патогена. Молекулярная биология ВИЧ отражает эволюционное взаимодействие между вирусом и хозяином.ВИЧ инфицирует в первую очередь CD4 + Т-клетки и макрофаги, и для этого необходимо преодолеть внутриклеточные ограничения. ВИЧ и вирус иммунодефицита обезьян (SIV) используют клеточные убиквитин-лигазы для устранения внутренних противовирусных белков. Белок Vif ВИЧ привлекает клеточную цитидиндезаминазу APOBEC3G к комплексу cullin5-elonginB / C (1). Это взаимодействие приводит к полиубиквитинированию и последующей протеасомно-зависимой деструкции APOBEC3G (2-6). В отсутствие Vif APOBEC3G упаковывается в потомство вируса, где при инфицировании он дезаминирует цитидины отрицательной цепи ДНК во время обратной транскрипции, тем самым вводя мутации G-to-A в кодирующую цепь.Таким образом, гипермутированный вирусный геном оказывается неэффективным для производства вирусного потомства (7–12). Vpu ВИЧ-1 может задействовать комплекс убиквитин-лигазы SCFβ-TrCP E3, чтобы помочь очистить tetherin с поверхности клетки (13-15). В отсутствие Vpu тезерин связывает клеточные и вирусные мембраны, чтобы закрепить вирус на плазматической мембране клетки-хозяина. Таким образом, Tetherin ограничивает распространение вируса (16–18). Vpr и Vpr ВИЧ-2 / SIV Vpx действуют через комплекс убиквитин-лигазы cullin4 (CUL4) -RING E3 (CRL4). Vpx рекрутирует SAMHD1, клеточную дезоксинуклеозидтрифосфаттрифосфогидролазу (19), в CRL4, чтобы запустить его протеасомозависимое разрушение (20–22).Устранение SAMHD1 с помощью Vpx позволяет уровням клеточного дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP) повышаться в достаточной степени, чтобы разрешить обратную транскрипцию (23). Экспрессия Vpr ВИЧ-1 и ВИЧ-2 / SIV запускает остановку клеточного цикла G 2 (24–30) через комплексы CRL4 (31–36). В недавней работе было обнаружено, что Vpr ВИЧ-1 инициирует арест G 2 за счет CRL4-зависимой активации комплекса SLX4 (37). Действует ли Vpr ВИЧ-2 / SIV аналогичным образом, еще предстоит определить. Vpr ВИЧ-1 также усиливает обмен урацил- N -гликозилазы 2 (UNG2) и одноцепочечной монофункциональной урацил-ДНК-гликозилазы (SMUG1) через комплекс CRL4 (38-40).Влияние остановки клеточного цикла G 2 или деградации UNG2 и SMUG1 на репликацию и патогенез ВИЧ остается неясным; однако арест G 2 был связан с уклонением от иммунитета (37), а повышенная продукция вируса (41) комплексами ВИЧ-1.CRL4 определяется включением CUL4, каркаса для сборки убиквитинлигазы E3. Карбоксильный конец CUL4 включает ROC1, белок, содержащий кольцевой домен, который, в свою очередь, связывает и активирует лигазу E2. Лигаза E2 заряжается убиквитином и переносит его к белкам-мишеням.Амино-конец CUL4 защищает связывающий повреждение адаптерной ДНК белок 1 (DDB1), который рекрутирует мишени убиквитинирования прямо или косвенно через один из примерно 90 белков, содержащих домен WD40, которые придают субстратную специфичность комплексу (42–45). HIV-1 и HIV-2 / SIV Vprs и HIV-2 / SIV Vpx все задействуют белок WD40 DCAF1 (также обозначенный как VprBP) для сборки с CRL4. DCAF1 и DDB1 необходимы для CRL4-зависимых функций Vpr и Vpx (20, 31–33, 35, 37, 38, 40, 46–50). Клетки человека кодируют два типа CUL4: типы A и B.Эти типы CUL4 имеют примерно 80% идентичности на аминокислотном уровне, различаются в основном на аминоконце, где CUL4B примерно на 15% длиннее и несет сигнал ядерной локализации (NLS) ( 55 KKRK 58 ) (51). Ген CUL4A находится на 13-й хромосоме человека, а ген CUL4B — на X-хромосоме всех исследованных млекопитающих. Тип CUL4, необходимый для действия Vpr и Vpx, не определен. Сходство аминокислотной последовательности между CUL4A и CUL4B предполагает, что эти два белка могут быть взаимозаменяемыми, но это не так.Не было идентифицировано людей, у которых отсутствует функциональный CUL4A, вероятно, из-за роли в сперматогенезе, аналогичной той, что наблюдается у мышей (52). Мужчины-мужчины, лишенные функционального CUL4B, имеют Х-сцепленную интеллектуальную отсталость (XLID), в то время как женщины-носители не подвержены влиянию (53–56). Накагава и Ксион ранее показали, что WDR5, метилтрансфераза h4K4, специфически истощается CUL4B, но не CUL4A, и что это определяет профили экспрессии генов нейронов (57). Сверхэкспрессия CUL4A была связана с раком груди (58), гепатоцеллюлярной карциномой (59) и мезотелиомой плевры (60).Дополнительное наблюдение показало, что кожно-специфическая делеция CUL4A защищает мышей от УФ-индуцированного рака кожи (61). Schröfelbauer et al. Ранее было продемонстрировано, что Vpr ВИЧ-1 может быть коизолирован с CUL4A из лизатов клеток, сверхэкспрессирующих версии обоих белков, меченные эпитопом (39). CUL4B не тестировался в этих ранних экспериментах, оставляя открытой возможность того, что он также может собираться в комплексы с Vpr и, следовательно, опосредовать функции Vpr. Основываясь на сообщенных различиях в структурном и субклеточном распределении между CUL4A и CUL4B, мы предположили, что существуют специфические CUL4A и CUL4B. Требования CUL4B для разных фенотипов ВИЧ.Предыдущая работа, показывающая, что HIV-1 Vpr запускает остановку клеточного цикла G 2 , вызывая сигналы повреждения ДНК (37, 62–66), привела нас к предположению, что NLS-содержащий CUL4B необходим для этой функции. Сообщения, показывающие, что истощение SAMHD1 запускается в ядре (67-69), привели нас к предположению, что CUL4B также необходим для этого фенотипа. UNG2 может быть обнаружен как в цитоплазме, так и в ядре (38), предполагая, что Vpr-направленная деградация UNG2 ВИЧ-1 может быть инициирована через CUL4A или CUL4B. В этой работе мы исследовали потребность в CUL4A и / или CUL4B для фенотипов Vpr и Vpx, которые требуют убиквитинлигазы CRL4, и показали, что два типа CUL4 могут быть заменены на остановку клеточного цикла G 2 , оборот UNG2 и истощение SAMHD1. .Кроме того, мы показываем, что в первичных человеческих макрофагах, происходящих из моноцитов (hMDMs), оба типа CUL4 необходимы для оптимального истощения SAMHD1 с помощью Vpx. Наконец, мы демонстрируем, что субклеточное распределение CUL4A и CUL4B может варьироваться между типами клеток.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Стабильно трансдуцированные клеточные линии.

    Следующие плазмиды были использованы для создания лентивирусных векторов для использования в создании стабильных клеточных линий: нецелевые (каталожный номер RHS4743), CUL4A-специфичные (клон V2THS_32527), CUL4B-специфические (клон V2THS_32515]), DCAF1 / VprBP-специфические ( клон V2THS_74081) и DDB1-специфические (клон V2THS_151130) векторы экспрессии короткой шпилечной РНК (shRNA) pTRIPZ для индуцибельной трансдукции (Thermo Scientific Life Science Research) и shRNA, специфичной для люциферазы светлячков (контрольная shRNA) (pSicoRshluc был подарком Tyler Jacks) (Плазмида Addgene 14782), CUL4A-специфическая кшРНК (каталожный номер.RHS4430-9

    52, олигонуклеотид V2LHS_32529; Thermo Scientific Life Science Research) и CUL4B-специфическая кшРНК (каталожный номер RHS4430-98475972, олигонуклеотид V2LHS_32515; Thermo Scientific Life Science Research) для конститутивной трансдукции. Следует отметить, что мы заблокировали экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) в конститутивных CUL4A- и CUL4B-специфичных векторах shRNA путем введения мутации сдвига рамки считывания в ген

    gfp .

    Пять миллионов клеток HEK293T трансфицировали вектором экспрессии shRNA вместе с pLP1 (кодирует Gag и Pol), pLP2 (кодирует Rev) и pLP-VSV-G (кодирует G-белок вируса везикулярного стоматита [VSV-G]) ( Набор экспрессии ViraPower Lentiviral Gateway Expression, номер по каталогуK496000; Invitrogen) в эквимолярном соотношении. Через 48 часов после трансфекции клеточный супернатант переносили в 10-сантиметровую чашку Петри, обработанную тканевой культурой, содержащую 2,5 миллиона клеток HEK293T. Через пять часов после заражения наносили свежую среду. Через 48 часов после заражения трансдуцированные клетки HEK293T отбирали путем культивирования в среде с добавлением 3 мкг / мл пуромицина. Среду с добавлением пуромицина заменяли каждые 3 дня до увеличения популяции выживших клеток. Если указано, клеточные линии индуцировали экспрессировать shРНК путем инкубации в среде, содержащей доксициклин в концентрации 0.5 мкг / мл. Истощение целевых белков подтверждали вестерн-блоттингом.

    Жизнеспособность клеток определяли с использованием набора для подсчета клеток 8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) в соответствии с инструкциями производителя. Обработку клеток ингибитором трансляции бластицидином в концентрации 10 мкг / мл в течение 24 часов использовали в качестве положительного контроля для уничтожения клеток.

    Культура клеток.

    Клетки HEK293T поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, 1 мМ глутамина, 50 единиц / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина.Стабильные линии HEK293T культивировали в той же среде с добавлением 3 мкг / мл пуромицина.

    Элютриированные человеческие моноциты были получены от здоровых доноров в Медицинском центре Университета Небраски (Омаха, Северная Каролина). Моноциты дифференцировали в макрофаги путем инкубации в бессывороточной среде DMEM в течение 2 часов с последующей 12-дневной инкубацией в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки AB человека. Лимфоциты периферической крови (PBL) получали путем выделения лейкоцитов и культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки AB человека, 2.5 мкг / мл фитогемагглютинина (PHA) и 10 единиц / мл интерлейкина 2 (IL-2) в течение 1 недели для стимулирования активации и размножения Т-клеток. Комитет Медицинского колледжа Олбани по исследованиям с участием людей одобрил наш протокол использования первичных лейкоцитов человека. Исключение категории 4 из процедур получения согласия было предоставлено для использования деидентифицированных образцов. Все культуры поддерживали при 37 ° C в присутствии 5% CO 2 .

    Иммунопреципитации.

    Плазмиды экспрессии белка ВИЧ / SIV, использованные в этих анализах, представляли собой pcDNA3.1 (-) HIV-1huVpr, pcDNA3.1 (-) HIV-1FLAG-huVpr (31), pCMV-FLAG-SIV mac239 Vpr и pCMV-FLAG-SIV mac239 Vpx. SIV mac239 Vpr и SIV mac239 Vpx амплифицировали с помощью ПЦР из SIV mac239 и субклонировали в вектор экспрессии pCMV4. Пять миллионов клеток HEK293T трансфицировали 20 мкг вектора экспрессии белка с использованием стандартного протокола трансфекции фосфатом кальция. Через 24 часа после трансфекции клетки лизировали 1 мл холодного буфера ELB (50 мМ HEPES [pH 7.3], 400 мМ NaCl, 0,2% NP-40, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол [DTT] и коктейль ингибиторов протеазы [каталожный №. 11 836 153 001; Рош]). Лизаты осветляли центрифугированием при 14000 × g в течение 15 мин при 4 ° C. Затем супернатанты инкубировали с 25 мкл агарозной смолы против FLAG M2 (номер по каталогу A2220-5ML; Sigma-Aldrich) в течение 2 часов при 4 ° C на ротаторе. Гранулы анти-FLAG M2 промывали трижды по 20 мин в 1 мл буфера ELB. Связанные белки элюировали путем конкуренции с 50 мкл 200 мг / мл пептида FLAG (каталожный номер.F3290; Sigma-Aldrich) при 25 ° C в течение 30 мин. К каждому элюату добавляли равный объем 2 × буфера Лэммли. Образцы кипятили в течение 10 минут, разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали на эндогенные DCAF1, DDB1, CUL4A, CUL4B, SAMHD1 и UNG2 с помощью вестерн-блоттинга с использованием указанных специфических антител (специфичных для DCAF1 [каталожный номер A301-887A; Bethyl Laboratories, Inc.], специфично для DDB1 [каталожный номер 342300; Invitrogen], специфично для CUL4A [каталожный номер 2699; Cell Signaling Technology], специфично для CUL4B [каталожный номер C99995; Sigma-Aldrich], анти-SAMHD1 [кат.GTX83687; GeneTex [и анти-UNG2 [подарок от Гейра Слаппхауга]). Метка эпитопа FLAG была обнаружена с использованием анти-FLAG M2 (номер в каталоге F1804; Sigma-Aldrich).

    Анализ клеточного цикла и инфекционности.

    Культуры клеток HEK293T или клеточных линий HEK293T, стабильно экспрессирующих shРНК (описанных выше), инфицировали вирусом при множественности инфицирования (MOI), равной 3, как описано ниже. Через 48 часов после заражения клетки собирали и трижды промывали 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).Ядра клеток выделяли путем инкубации осадка клеток в растворе, содержащем 10 мМ PIPES [пиперазин- N , N ‘-бис (2-этансульфоновая кислота)], 0,1 М NaCl, 2 мМ MgCl 2 и 0,1 % Triton X-100 (pH 6,8). К суспендированным ядрам добавляли РНКазу A (0,2 мг / мл) и иодид пропидия (0,02 мг / мл) для разрушения РНК и окрашивания ДНК соответственно. Содержание ядерной ДНК определяли методом проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FACSCanto (BD Biosciences). Долю клеток в фазе G 1 или G 2 / M клеточного цикла определяли анализом с использованием программного обеспечения FlowJo.Для анализов инфекционности клетки, инфицированные репортерным вирусом люциферазы, были подготовлены для анализов люциферазы с использованием набора для анализа люциферазы Promega в соответствии с инструкциями производителя (каталожный номер E501; Promega). Эмиссию фотонов измеряли с помощью люминометра Victor V3 (PerkinElmer).

    Вирусный препарат.

    Пять миллионов клеток HEK293T котрансфицировали векторами экспрессии либо для ВИЧ-1 [pNL4-3 env (-) nef (-) gfp (+)], либо для ВИЧ-1 без Vpr [pNL4-3 env (-) vpr (-) nef (-) gfp (+)], ВИЧ-2 [pGL-AN nef (-) gfp (+)], ВИЧ-2 без Vpx [pGL-St vpx (-) nef (-) gfp (+)], ВИЧ-2 без Vpr [pGL-Ec vpr (-) nef (-) gfp (+ )] или ВИЧ-2, лишенный как Vpx, так и Vpr [pGL-St / Ec vpr (-) nef (-) gfp (+)] вместе с pCL-VSV-G для псевдотипирования ВИЧ с гликопротеин оболочки вируса везикулярного стоматита.Клоны ВИЧ-1 были подарком от Висенте Планеллеса, а клоны ВИЧ-2 возникли в качестве подарка от Микако Фудзиты, но были модифицированы для экспрессии GFP вместо Nef. Репортерный клон люциферазы ВИЧ-1 [pNL4-3 env (-) nef (-) luc (+)] был подарком Натаниэля Ландау. Трансфекцию проводили с использованием стандартного протокола фосфата кальция с общим количеством 20 мкг ДНК при эквимолярном соотношении вектора экспрессии вируса к вектору экспрессии VSV-G. Псевдотипирование VSV-G использовалось для содействия эффективному проникновению во все типы клеток, использованные в этом исследовании.Через 24 часа после трансфекции супернатант инфицированных клеток очищали от клеток-продуцентов центрифугированием и затем переносили в экспериментальные культуры. Аликвоты супернатантов, полученных из клеток-продуцентов вируса, тестировали на получение эквивалентных вирусных титров путем серийного разведения и последующего инфицирования индикаторной клеточной линии GHOST X4 / R5 (от Vineet N. KewalRamani и Dan R. Littman через NIH AIDS Research and Reference Реагентная программа) (70).

    Фракционирование клеток.Клетки

    были разделены на ядерную и цитозольную фракции, как описано ранее, но с небольшими модификациями (71). Неинфицированные клетки HEK293T, PBL или MDM собирали и дважды промывали в PBS. Клетки инкубировали в 1 мл буфера В (10 мМ HEPES [pH 7,9], 1,5 мМ MgCl 2 , 10 мМ KCl и коктейль ингибиторов протеазы [каталожный № 11 836 153 001; Roche]) на льду в течение 10 мин. . При перемешивании образцов добавляли тридцать микролитров 1% NP-40. Образцы, обработанные NP-40, накладывали на 1 мл 1 М сахарозы, растворенной в буфере B.После центрифугирования при 3000 × g при 4 ° C в течение 10 минут 200 мкл супернатанта собирали в виде цитозольной фракции. Оставшийся супернатант удаляли, осадок ядер промывали, а затем ресуспендировали в 1 мл буфера B. Двести микролитров ядер в буфере B собирали как ядерную фракцию. К цитозольной и ядерной фракциям добавляли равный объем 2 × буфера Лэммли. Цитоплазматические и ядерные лизаты нагревали до 94 ° C в течение 10 минут перед вестерн-блоттингом.Образцы были исследованы на гистон h4 (антигистон h4, номер в каталоге 9715; Cell Signaling Technology) и тубулин (антитубулин, номер в каталоге 3873S; Cell Signaling Technology) для подтверждения чистоты ядерных и цитоплазматических фракций соответственно. Сигналы тубулина или гистона от фракционированных образцов были нормализованы к сигналам лизатов цельных клеток, чтобы гарантировать равное представление цитоплазмы и ядра. Трансфекция

    siRNA.

    Следующие короткие интерферирующие РНК (миРНК) были получены от Thermo Fisher Scientific Biosciences, Inc.(Dharmacon): нетаргетирующая миРНК (каталожный номер D-001210-02-50), CUL4A-специфическая миРНК (каталожный номер L-012610-00-0020), CUL4B-специфическая миРНК (каталожный номер L-017965-00- 0020), и DCAF1-специфичная миРНК (номер в каталоге L-021119-01-0020). siRNA трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 (номер по каталогу 11668-019; Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.

    Доминантно-отрицательные векторы экспрессии CUL4.

    Конструкции доминантно-отрицательной экспрессии CUL4 (DNCUL4) были созданы с помощью ПЦР-амплификации последовательности кДНК CUL4 с праймерами, которые вводят дополнительные остатки для кодирования метки эпитопа гемагглютинина (HA) на 5′-конце и преждевременного стоп-кодона на 3′-конце. конец.Полученные в результате укороченные белки лишены как карбоксиконца, необходимого для связывания ROC1, так и сайта неддилирования. ROC1 необходим для связывания E2 и, таким образом, для переноса убиквитина к субстратам-мишеням. Неддилирование необходимо для активации комплексов cullin ubiquitin ligase. Праймеры, использованные для создания конструкции DNCUL4A, представляли собой прямой праймер 5′-GCACTCTAGAACCATGGCCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCATGGCGGACGAGGCCCCG-3 ‘и обратный праймер 5′-GTTTAAGCTTCACTGGGGTTAAGTGCACTTCC-3’. Эти праймеры амплифицировали первые 545 аминокислот CUL4A.ДНК вставляли в сайты XbaI и HindIII вектора pcDNA3.1 (-) (номер по каталогу V795-20; Invitrogen / Life Science Technologies). Праймеры, использованные для создания конструкции DNCUL4B, представляли собой прямой праймер 5′-GCACCTCGAGACCATGGCCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCATGATGTCACAGTCATCTGG-3 ‘и обратный праймер 5′-GTACAAGCTTCACTGCTGCAAAAGAACC-3’ с первой аминокислотой CULA-3 ‘, который амплифицировал первую аминокислоту CULA-3. ДНК вставляли в сайты XhoI и HindIII вектора pcDNA3.1 (-). Источниками кДНК CUL4A и CUL4B были pCMVFLAG-CUL4A и pCMVFLAG-CUL4B соответственно.Обе конструкции FLAG-CUL4 были подарком Цзяньпин Цзинь.

    Другие реагенты, использованные в этом исследовании. Анти-HA-антитело

    (каталожный номер 12CA5; Roche) использовали для эпитопных меток, а также антитела против β-актина (каталожный номер A5441; Sigma-Aldrich) и анти-CDC6 (каталожный номер AHF0322; Invitrogen). для клеточных белков. Что касается вирусных белков, анти-ВИЧ-1 p24 (каталожный номер 183-h22-5C) был получен от Брюса Чезебро и Харди Чена в рамках Программы исследований и эталонных реагентов Национального института здравоохранения США (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) (72) (примечательно, что эта антисыворотка к p24 ВИЧ-1 перекрестно реагирует с ВИЧ-2 p27), анти-ВИЧ-1 Vpr (каталожный номер.3951) был получен от Джеффри Коппа в рамках программы реагентов NIH AIDS Reagent Program, а анти-Vpx (каталожный номер 2609) был получен от Lee Ratner в рамках программы NIH AIDS Reagent Program (73). Для плазмид конструкция LaminC-eGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) была подарком от Рональда Голдмана, а экспрессионные конструкции pcDNA3.1 (-) HIV-2FLAG-huVpr и UNG2-2HA были созданы, как описано ранее (31, 38) . Ингибитор неддилирования MLN4924 был подарком от Millennium Pharmaceuticals.

    Денситометрический анализ.

    Все денситометрические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения для анализа изображений ImageJ от NIH (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Все хемилюминесцентные изображения были выполнены с использованием системы визуализации Alpha Innotech FluorChem HD2.

    Статистический анализ.

    Двусторонний критерий Стьюдента t использовался для определения статистической значимости.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Работа, представленная здесь, демонстрирует, что хотя CUL4A и CUL4B имеют разные биологические роли, они взаимозаменяемы для функций Vpr и Vpx ВИЧ.Vpr ВИЧ-1 и Vpr ВИЧ-2 / SIV могут действовать в отсутствие CUL4A или CUL4B, но не в обоих случаях, чтобы вызвать остановку клеточного цикла G 2 . HIV-1 Vpr может использовать любой тип CUL4 для опосредования деградации UNG2, а для HIV-2 Vpx два типа CUL4 взаимозаменяемы для деградации SAMHD1.

    С момента первоначального наблюдения, что HIV-1 Vpr коизолирован с CUL4A, концепция, согласно которой Vpr и Vpx собираются с CUL4A-содержащими комплексами CRL4 и действуют исключительно через них, получила распространение в многочисленных исследованиях.Действуют ли Vpr и Vpx через CUL4A- или CUL4B-содержащие комплексы CRL4, до сих пор не исследовалось. В этой работе мы демонстрируем, что Vpr или Vpx могут использовать CUL4A или CUL4B для продвижения функций, зависимых от CRL4. Эти находки расширяют наше понимание взаимосвязи между комплексом CRL4 и ВИЧ и подчеркивают важность обоих типов CUL4 в функции Vpr или Vpx.

    Хотя CUL4A и CUL4B демонстрируют взаимозаменяемость для функций Vpr и Vpx, изучаемых здесь, они демонстрируют уникальные роли для ряда нормальных клеточных функций.Небольшие, но отчетливые различия в последовательностях между двумя типами CUL4 свидетельствуют против идеальной функциональной избыточности. В самом деле, сходство последовательностей двух белков CUL4 не всегда достаточно для функциональной избыточности, что подчеркивается различными патологиями, связанными с нарушением регуляции CUL4A и CUL4B. В то время как уровни экспрессии CUL4A заметно повышены при некоторых формах рака (58-60) и могут влиять на сперматогенез (52), CUL4B имеет решающее значение для нормального развития нейронов (53-57). CUL4B структурно отличается от CUL4A главным образом удлиненным аминоконцом, содержащим сигнал ядерной локализации (51).Различия между субклеточным распределением CUL4B и CUL4A могут определять специфичность их ролей в нормальной клеточной биологии. CUL4B может переходить в ядро ​​для выполнения определенных требований CUL4, в то время как CUL4A остается в цитозоле для выполнения других функций. Это может быть особенно важно для неделящихся клеток, таких как окончательно дифференцированные макрофаги. Хотя внутриклеточная локализация может обеспечивать функциональную специфичность, NLS CUL4B составляет относительно небольшую часть удлиненного аминоконца.Таким образом, также возможно, что CUL4B и CUL4A проявляют разные структурные конформации, которые позволяют задействовать уникальные наборы молекулярных партнеров. Наконец, хотя мы никогда не наблюдали экспрессию только одного типа CUL4 в неманипулированных клетках HEK293T, первичных Т-клетках или первичных hMDM, мы не можем исключить, что две формы CUL4 по-разному регулируются таким образом in vivo , тем более что они транскрибируются независимо от разных хромосом.

    Сообщенные различия между CUL4A и CUL4B привели нас к гипотезе, что Vpr-опосредованная остановка клеточного цикла G 2 в значительной степени, если не исключительно, зависит от NLS-содержащего CUL4B.Эта гипотеза была основана на работе, связывающей задержку G 2 , инициированную Vpr, с ядерными событиями. Как в клетках HEK293T, так и в первичных Т-клетках мы обнаружили, что обе формы CUL4 присутствуют в цитозоле в изобилии. Интересно, что оба типа CUL4 также были обнаружены в ядре в преимущественно неддилированной и, следовательно, предположительно более активной форме. Мы предполагаем, что почти идентичные модели распределения для CUL4A и CUL4B являются причиной их функциональной взаимозаменяемости в этом сценарии.

    Помимо остановки клеточного цикла и истощения UNG2, обнаруживаются новые фенотипы Vpr ВИЧ-1.Vpr ВИЧ-1 индуцирует экспрессию лиганда NK-клеток на поверхности инфицированных клеток (98–100), а также истощение эндорибонуклеазы Dicer (101, 102). Оба эти фенотипа требуют функции комплекса CRL4. Дальнейшая работа по изучению роли CUL4A или CUL4B в этих фенотипах прольет дополнительный свет на эти новые функции Vpr ВИЧ-1. Наблюдение, что Vpx-опосредованная деградация SAMHD1 может протекать с помощью CUL4A или CUL4B, особенно интересно из-за противоречивых сообщений о субклеточном расположении. деградации SAMHD1 на Vpx.SAMHD1 имеет сигнал ядерной локализации на своем амино-конце (68, 69, 103). Несколько лабораторий продемонстрировали, что удаление NLS путем усечения или мутагенеза вызывает накопление SAMHD1 в цитозоле. Важно, что цитоплазматический SAMHD1 был защищен от Vpx-обусловленной деградации, несмотря на сохранение способности собираться с Vpx (67-69). Кроме того, было обнаружено, что стационарный уровень NLS-дефицитного SAMHD1 выше, чем у его аналога дикого типа (68). Эти находки способствовали заключению, что деградация SAMHD1 происходит в ядре.Другая работа привела к выводу, что Vpx переносит SAMHD1 из ядра в цитозоль, чтобы способствовать его разрушению (104). Этот вывод был сделан потому, что обработка клеток лептомицином B, ингибитором ядерного экспорта, уменьшала Vpx-опосредованную деградацию SAMHD1. Демонстрация того, что аллель Vpx, который не может проникнуть в ядро, по-прежнему способствует деградации SAMHD1, дополнительно подтверждает модель, в которой SAMHD1 разрушается в цитозоле (69, 104). Наша работа определила CUL4B как преобладающий тип CUL4 в ядрах первичных макрофагов.Т.о., если деградация SAMHD1 происходит исключительно в ядре, истощение CUL4B должно иметь наибольшее влияние на уровни SAMHD1 в присутствии Vpx. Это был не тот случай. В первичных hMDM истощение ни CUL4A, ни CUL4B не было достаточным, чтобы максимально блокировать деградацию SAMHD1 на Vpx. Только когда и CUL4A, и CUL4B были одновременно истощены, Vpx-опосредованная деградация SAMHD1 была максимально заблокирована. Более того, в hMDMs SAMDh2 легко обнаруживается как в цитоплазме, так и в ядре.Для первичных hMDMs паттерн истощения SAMHD1 с помощью Vpx (Fig. 6C) и внутриклеточное распределение CUL4A, CUL4B и SAMHD1 (Fig. 7A) хорошо дополняют друг друга. В самом деле, истощение только CUL4A или CUL4B только частично спасало SAMHD1 от Vpx-опосредованного истощения. Учитывая эти данные, мы предлагаем модель, в которой упакованный Vpx использует CUL4A в цитоплазме, чтобы обеспечить деградацию SAMHD1 там, и использует CUL4B в ядре, чтобы обеспечить ядерную деградацию SAMHD1. В этом сценарии CUL4A и CUL4B не могут быть полностью заменены из-за их различий в субклеточном распределении.Дальнейшая работа по проверке этой модели может также помочь устранить расхождения в отношении истощения SAMHD1. Независимо от того, где происходит истощение SAMHD1, данные, представленные в этой работе, демонстрируют, что любой тип CUL4 может способствовать Vpx-опосредованной деградации SAMHD1. Интересно, что мы не наблюдали, чтобы SAMHD1 был исключительно ядерным, как сообщалось в ряде исследований, основанных на иммунофлуоресценции. Наши наблюдения наиболее согласуются с данными Baldauf et al., Которые использовали как трехмерную визуализацию, так и субклеточное фракционирование покоящихся и активированных Т-клеток и макрофагов, чтобы показать, что SAMHD1 может быть обнаружен как в ядре, так и в цитоплазме (105).Конечно, также возможно, что внутриклеточное распределение SAMHD1 варьируется среди типов клеток и со статусом пролиферации. Наконец, наши эксперименты по коиммунопреципитации показали, что CUL4A и CUL4B связываются с Vpr и Vpx на разных уровнях. Хотя оба типа CUL4 были легко обнаружены после иммунопреципитации Vpr или Vpx, CUL4A был преобладающим видом, коизолированным с Vpr, тогда как большее количество CUL4B было соизолировано с Vpx. Это различие было неожиданным, потому что оно не нашло отражения в тестируемых здесь CRL4-зависимых фенотипах Vpr и Vpx.Интересно, что несмотря на эффективную соизоляцию CUL4B, Vpx соизолировался с DCAF1 и DDB1 менее эффективно, чем Vpr. DCAF1 требуется для действий Vpr и Vpx через CRL4; однако неясно, все ли функции Vpx требуют DCAF1 (106, 107). В частности, Vpx спасает ВИЧ-1 от состояния, индуцированного интерфероном, используя механизм, который не зависит от концентраций DCAF1 и dNTP. Неизвестно, важна ли остальная часть комплекса CRL4 для этой функции Vpx. Также возможно, что CUL4A и CUL4B имеют разное сродство или возможности взаимодействия с DDB1.В работе по идентификации клеточных партнеров для белков cullin Беннет и его коллеги обнаружили, что пропорционально больше DDB1 соочищается с CUL4A, чем с CUL4B (108). Эта работа также показала, что оба типа CUL4 связаны с многочисленными адаптерами, содержащими домен WD, которые потенциально могут связываться с Vpr или Vpx, чтобы обеспечить независимый от DCAF1 доступ к CRL4.

    HIV-1 Vpr вызывает деградацию ZIP и sZIP, адаптеров комплекса ремоделирования хроматина NuRD, путем захвата DCAF1 / VprBP

    Abstract

    Считается, что белок Vpr из вирусов иммунодефицита человека 1 и 2 типа (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) инактивирует несколько белков-хозяев за счет захвата адаптера DCAF1 убиквитинлигазы Cul4A.Здесь мы идентифицировали два регулятора транскрипции, ZIP и sZIP, поскольку Vpr-связывающие белки деградируют в присутствии Vpr. ZIP и sZIP, как было показано, действуют посредством рекрутирования комплекса ремоделирования хроматина NuRD. Поразительно, что хроматин является единственной клеточной фракцией, в которой Vpr присутствует вместе с субъединицами убиквитинлигазы Cul4A. Компоненты комплекса NuRD и экзогенные ZIP и sZIP также были связаны с этой фракцией. Несколько линий доказательств указывают на то, что Vpr индуцирует деградацию ZIP и sZIP путем захвата DCAF1: (i) Vpr индуцировал резкое снижение экзогенно экспрессируемых ZIP и sZIP дозозависимым образом, (ii) это снижение зависело от активности протеасом, (iii) Деградация ZIP или sZIP нарушалась в присутствии DCAF1-связывающего дефицитного мутанта Vpr или когда экспрессия DCAF1 подавлялась.Опосредованная Vpr деградация ZIP и sZIP не коррелировала с связанной с ростом активностью Vpr, а именно с остановкой G2 и независимой от остановки G2 цитотоксичностью. Тем не менее, инфицирование вирусами ВИЧ-1, экспрессирующими Vpr, привело к деградации двух белков. В целом наши результаты подчеркивают существование двух факторов транскрипции хозяина, инактивированных Vpr. Роль Vpr-опосредованной деградации ZIP и sZIP в цикле репликации ВИЧ-1 еще предстоит расшифровать.

    Образец цитирования: Maudet C, Sourisce A, Dragin L, Lahouassa H, Rain J-C, Bouaziz S, et al.(2013) ВИЧ-1 Vpr индуцирует деградацию ZIP и sZIP, адаптеров комплекса ремоделирования хроматина NuRD, путем перехвата DCAF1 / VprBP. PLoS ONE 8 (10): e77320. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320

    Редактор: Фатх Кашанчи, Университет Джорджа Мейсона, Соединенные Штаты Америки

    Поступила: 20 февраля 2013 г .; Одобрена: 6 сентября 2013 г .; Опубликован: 8 октября 2013 г.

    Авторские права: © 2013 Maudet et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Финансирование: Эта работа была поддержана грантами «Agence Nationale de la Recherche sur le SIDA et les. hépatites virales »(ANRS),« Sidaction »и« Fondation de France ». CM и LD получили поддержку от университетов Парижа Дидро и Парижа Декарта соответственно; AS и LH получил поддержку от «Sidaction» и ANRS соответственно.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов. Использование JCR от компании Hybrigenics не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

    Введение

    Vpr представляет собой белок из 96 аминокислот, кодируемый как ВИЧ-1, так и ВИЧ-2, которые перекрестно передаются человеку от двух различных лентивирусных линий приматов, которые естественным образом инфицируют шимпанзе и сажу мангабея соответственно [1].Vpr принадлежит к набору так называемых вирусных вспомогательных белков, которые играют решающую роль на интерфейсе хозяин-вирус, инактивируя факторы рестрикции хозяина. Например, Vif индуцирует деградацию APOBEC3G, чтобы избежать мутаций в вирусной ДНК, Vpu инактивирует tetherin / BST-2 для запуска высвобождения вируса, а Vpx инактивирует SAMHD1 для повышения уровня dNTP, основных предшественников синтеза вирусной ДНК [2-8] . Однако функция Vpr так и осталась неуловимой.

    Присутствие Vpr во входящем вирионе свидетельствует о роли этого белка на ранних этапах жизненного цикла вируса, до de novo экспрессии интегрированной провирусной ДНК.Соответственно, увеличение трансдукции ВИЧ-1 наблюдается в присутствии Vpr в макрофагах и в дендритных клетках [9–12]. Многочисленные действия были приписаны Vpr, включая его способность останавливать делящиеся клетки при переходе G2 / M, опосредовать цитотоксический эффект, не зависящий от остановки G2, активировать транскрипцию с LTR и клеточных промоторов, повышать точность обратной транскрипции или индуцируют деградацию урацил-гликозилазы UNG2 (см. обзоры [13,14]). Среди этих свойств наиболее широко изучается его способность останавливать развитие клеточного цикла в фазе G2.Мы и другие описали механизм, в котором Vpr соединяет адаптер DCAF1 убиквитинлигазы Cul4A с пока не идентифицированным целевым белком хозяина (далее называемым мишенью G2), который необходим для перехода G2 / M [15-21 ]. В результате белок-мишень Vpr подвергается полиубиквитинированию и последующей протеасомной деградации, что препятствует вступлению клетки в митоз. Было показано, что эта цитостатическая активность зависит от вступления в S-фазу и от способности Vpr связываться с хроматином [22-24].Кроме того, Vpr может использовать DCAF1 для запуска независимого от остановки G2 цитотоксического эффекта и для индукции деградации UNG2 [25-27]. Неизвестно, зависят ли другие активности Vpr от рекрутирования Cul4A. Как описано для Vif и Vpu, Vpr может использовать одну и ту же убиквитинлигазу для индукции деградации нескольких специфических белков-хозяев. Ли и др. далее предложил модель, в которой взаимодействие Vpr с белком hHR23A будет дополнительным шагом к нацеливанию субстратов Vpr на протеасому [28].Теперь перед нами стоит задача идентификации этих соответствующих белков-мишеней, которые могут представлять отрицательные клеточные факторы для вирусного роста.

    Ремоделирующий нуклеосомы комплекс Mi-2 / NuRD играет ключевую роль в различных клеточных процессах, таких как репрессия транскрипции, прогрессирование клеточного цикла, сборка хроматина, реакция на повреждение ДНК и поддержание целостности генома (обзоры см. [29-31]). Он содержит различные белковые субъединицы, которые собираются комбинаторным образом, что приводит к различным результатам и функциям, специфичным для определенного типа клеток.Основные субъединицы с ферментативной активностью представляют собой ДНК-связывающий белок 3 хромодомена-геликазы (CHD3 или Mi2-α) и CHD4 (или Mi-2β) и гистондеацетилаза 1 и 2 (HDAC1 и HDAC2). Помимо своей роли в комплексе NuRD, некоторые субъединицы также взаимодействуют с другими комплексами, такими как RbAp46 (также называемый RBBP7), присутствующим в нескольких комплексах модификации хроматина, и HDAC1 и HDAC2, обнаруженные в других комплексах репрессоров транскрипции. Комплекс NuRD играет роль в нормальных процессах развития, напр. На разных стадиях гемопоэтической дифференцировки (rev. [31]).Его роль в прогрессировании рака четко не определена, поскольку он может способствовать или подавлять онкогенез в зависимости от контекста (см. Обзор [30]). Репрессия транскрипции комплексом NuRD обычно опосредуется посредством его рекрутирования на промоторы генов тканеспецифическим фактором транскрипции, в основном онкогеном, но иногда и опухолевым супрессором. ZIP, также известный как ZGPAT, представляет собой репрессор транскрипции, содержащий Zn-палец и домен G-patch, который рекрутирует комплекс NuRD и ингибирует пролиферацию и выживаемость клеток, в то время как его изоформа sZIP, по-видимому, оказывает противоположный эффект [32,33].

    Здесь мы определили ZIP и sZIP как партнеров прямого взаимодействия Vpr ВИЧ-1. Оба белка разрушаются в присутствии вирусного белка за счет захвата убиквитинлигазы DCAF1. Тем не менее, Vpr-опосредованная деградация ZIP или sZIP не объясняет цитостатическую или цитотоксическую активность Vpr.

    Результаты

    HIV-1 Vpr взаимодействует с ZIP и sZIP

    Чтобы идентифицировать новых клеточных партнеров Vpr ВИЧ-1, был проведен исчерпывающий дрожжевой двугибридный скрининг кДНК из клеток CEMC7 человека с использованием Vpr в качестве приманки.Среди белков, идентифицированных с несколькими клонами-жертвами, были известные партнеры Vpr, такие как DCAF1, UNG2 или SAP145, и новый потенциальный партнер Vpr, репрессор транскрипции ZIP. Выравнивание последовательностей вставок жертвы показало, что домен, взаимодействующий с Vpr, был ограничен С-концевой областью ZIP (рис. 1А), областью, общей для его изоформы sZIP. Эксперименты по совместной иммунопреципитации на клетках HEK293T подтвердили взаимодействие между экзогенно экспрессируемыми Vpr и ZIP (рис. 1B, сравните дорожки 1 и 3) и между Vpr и sZIP (рис. 1B, дорожка 2).Затем мы спросили, могут ли Vpr и ZIP / sZIP присутствовать в одном и том же клеточном компартменте, поскольку, с одной стороны, ZIP / sZIP ассоциируется с комплексом ремоделирования хроматина NuRD [32,33], а с другой стороны, Vpr ассоциируется с хроматином [22]. , 23]. Мы использовали анализ клеточного фракционирования, который позволяет разделить пять различных пулов белков: цитоплазматические, мембраносвязанные, ядерно-растворимые, связанные с хроматином и нерастворимые белки. Мы проверили метод фракционирования, проанализировав локализацию тубулина, присутствующего в основном в цитоплазматической фракции (C), гистона h5, обнаруженного во фракции хроматина (Chr), субъединиц HDAC1 и MTA2 NuRD, присутствующих в растворимой фракции (SN) и во фракции, ассоциированной с хроматином (Chr) ядра, и, наконец, RbAp46, обнаруженном во всех фракциях [34–36].Гистонацетилтрансфераза 1 (HAT1), ранее охарактеризованный партнер RbAp46, была обнаружена в цитоплазме, что также подтвердило предыдущие исследования, показавшие, что этот фермент перемещается между цитоплазмой и ядром, где он быстро диссоциирует от гистонов [37]. Трансфицированный HA-Vpr был обнаружен в пяти различных фракциях, около 2,5% от общего количества белка присутствовало во фракции, связанной с хроматином (рис. 1С, панель НА и рис. S1). Отсутствие действительных антител к ZIP и sZIP побудило нас изучить локализацию белков, экспрессируемых из трансфицированных векторов.Обе изоформы были обнаружены во всех фракциях, за исключением нерастворимой фракции, где можно было обнаружить только ZIP (рис. 1D). Поразительно, что хроматин был единственным компартментом, в котором и Vpr, и субъединицы убиквитинлигазы Cul4A DDB1 (DCAF1, DDB1 и Cul4A) присутствовали вместе (рис. 1C). Экспрессия Vpr существенно не изменяла клеточное перераспределение Cul4A DDB1 (фиг. 1C) или локализацию экзогенного ZIP или sZIP (данные не показаны). Затем мы задались вопросом, может ли Vpr рекрутировать комплекс NuRD, как это делают ZIP или sZIP [32,33].Vpr взаимодействует с RbAp46, а также с HAT1, подтверждая данные Jäger et al., Полученные из глобального анализа взаимодействующих с ВИЧ клеточных партнеров [38] (Figure 1E). Следует отметить, что ZIP и sZIP также были способны рекрутировать HAT1 в дополнение к субъединицам комплекса NuRD (Рисунок S2). Однако Vpr не взаимодействовал с HDAC1 и слабо взаимодействовал с MTA-2 (рисунок 1E). Наши данные, обобщенные на схеме на рисунке 1F, показывают, что Vpr рекрутирует RbAp46, HAT1, ZIP и sZIP в дополнение к убиквитинлигазе Cul4A.

    Рис. 1. Взаимодействие Vpr ВИЧ-1 с ZIP и sZIP и с комплексом NuRD.

    А . Схема ZIP, sZIP и Vpr-взаимодействующих фрагментов. Vpr использовали в качестве приманки в дрожжевом двугибридном скрининге олиго d (T) -примированных кДНК из клеток CEMC7 человека. Изоформы ZIP и sZIP представлены прямоугольниками, известные домены которых показаны разными оттенками серого. Жертвы, совпадающие с ZIP, нарисованы тонкими линиями под диаграммой, представляющей белки ZIP и sZIP. В .Vpr взаимодействует как с ZIP, так и с sZIP в клетках HEK293T. Клетки HEK293T трансфицировали векторами, экспрессирующими меченный НА Vpr и указанные белки, меченные FLAG. Лизаты клеток получали через 48 часов после трансфекции и подвергали иммунопреципитации с использованием антител против FLAG. После обширной промывки связанные белки элюировали с гранул пептидом FLAG. Иммунопреципитаты (IP) и неочищенные клеточные лизаты (лизаты) анализировали вестерн-блоттингом с использованием указанных антител. С .Хроматин — единственная фракция, где Vpr, Cul4A DDB1 и члены комплекса Mi-2 / NuRD (RbAp46, HDAC1 и MTA2) обнаруживаются вместе. Клетки HeLa трансфицировали либо вектором, экспрессирующим меченый НА Vpr, либо пустым вектором. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции и проводили субклеточное фракционирование 2 10 6 клеток для получения экстрактов цитоплазматических (C), мембранных (M), ядерно-растворимых (SN), связанных с хроматином (Chr) и нерастворимых (Ins) белков. . Конечное объемное соотношение каждой фракции составляет 2: 2: 1: 1: 1 соответственно.Распределение белка Vpr в клетках анализировали с помощью вестерн-блоттинга, а также распределение указанных эндогенных белков в клетках. Д . ZIP и sZIP обнаруживаются во фракции хроматина. Клетки HeLa трансфицировали вектором, экспрессирующим либо FLAG-ZIP, либо FLAG-sZIP. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, и субклеточное фракционирование выполняли в тех же условиях, что описаны выше. Е . Vpr рекрутирует RbAp46 и HAT1 в клетки HEK293T. Клетки HEK293T трансфицировали либо вектором, экспрессирующим Vpr, меченный НА, либо пустым вектором.Лизаты клеток получали через 48 часов после трансфекции и подвергали иммунопреципитации с использованием антител против НА. Иммунопреципитаты (IP) и неочищенные клеточные лизаты (лизаты) анализировали вестерн-блоттингом с использованием указанных антител. Ф . Обнаружены взаимодействия между Vpr, ZIP / sZIP и комплексом Mi-2 / NuRD. Взаимодействия, обнаруженные при коиммунопреципитации, представлены на этой диаграмме. Направление стрелки указывает направление коиммунопреципитации (основание стрелки: иммунопреципитированный белок, стрелка: коиммунопреципитированный белок).Полные стрелки соответствуют новым взаимодействиям, которые мы раскрыли здесь, а стрелки в пунктирных линиях взаимодействий, ранее описанных и подтвержденных в этом исследовании [32,33,38]. Взаимодействие между ZIP / sZIP и HAT1, RbAp46 и HDAC1 показано на рисунке S2.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320.g001

    HIV-1 Vpr индуцирует деградацию ZIP и sZIP через убиквитинлигазу DCAF1

    Далее мы исследовали, как уровни экспрессии ZIP или sZIP зависят от присутствия Vpr.Идентичные результаты были получены с sZIP (основные рисунки) и ZIP (дополнительные рисунки). sZIP / ZIP коэкспрессировался с GFP в качестве внутреннего контроля в клетках HeLa в присутствии или в отсутствие Vpr. После сбора клеток и анализа вестерн-блоттингом определяли отношения sZIP / GFP (или ZIP / GFP). Vpr индуцировал резкое снижение экспрессии sZIP или ZIP дозозависимым образом (рисунок 2A и рисунок S3A соответственно). Напротив, увеличение количества sZIP или ZIP преодолело опосредованное Vpr снижение их экспрессии, указывая на то, что относительное отношение sZIP или ZIP к Vpr определяет деградацию sZIP / ZIP (Рисунок 2B и Рисунок S3B соответственно).В дальнейшем мы будем ссылаться на «условия деградации» (использование соотношений, которые благоприятствуют опосредованному Vpr деградации ZIP / sZIP) или «условия не деградации» (использование соотношений, которые не приводят к деградации ZIP / sZIP в присутствии Vpr). . Последующие эксперименты проводились в «условиях деградации», что привело примерно к 85% снижению экспрессии sZIP или ZIP. Ингибирование протеасом с помощью MG132 привело к реверсии Vpr-опосредованного ингибирования экспрессии sZIP (фиг. 3A, данные для ZIP не показаны), предполагая, что Vpr индуцирует деградацию sZIP и ZIP протеасомозависимым образом.Сверхэкспрессия мутанта VprQ65R, у которого нарушена его способность рекрутировать убиквитинлигазу DCAF1, не снижает экспрессию sZIP (или ZIP) так же эффективно, как Vpr wt (около 50% sZIP восстанавливается с помощью VprQ65R по сравнению с менее 15% для wt Впр, рис. 3Б). Остающийся эффект этого мутанта на экспрессию sZIP (или ZIP), вероятно, связан с остаточным связыванием с DCAF1 (данные не показаны). Более того, подавление DCAF1 полностью устраняет опосредованную Vpr деградацию sZIP (сравните дорожки 2 и 4, фиг. 3C) или ZIP (сравните дорожки 2 и 4, фиг. S3C).В целом эти данные убедительно указывают на то, что Vpr захватывает убиквитинлигазу DCAF1, чтобы вызвать деградацию sZIP и ZIP.

    Рис. 2. Vpr ВИЧ-1 снижает экспрессию sZIP в зависимости от дозы.

    А . Клетки HeLa котрансфицировали вектором, экспрессирующим FLAG-sZIP, и увеличивающимися количествами вектора, экспрессирующего меченый НА Vpr. Вектор экспрессии GFP использовали в качестве внутреннего контроля трансфекции. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, лизировали и экспрессию белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга (верхняя панель).Гистограмма (нижняя панель) отображает соотношение между сигналом FLAG и сигналом GFP по сравнению с этим соотношением без Vpr. B. То же, что и в A, за исключением увеличения количества вектора, экспрессирующего FLAG-sZIP, с или без HA-меченного Vpr.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320.g002

    Рис. 3. Vpr ВИЧ-1 индуцирует деградацию sZIP через убиквитинлигазу DCAF1.

    А . Vpr-опосредованная деградация sZIP зависит от активности протеасомы.Клетки HeLa котрансфицировали векторами, экспрессирующими указанные белки. Клетки обрабатывали через 48 часов после трансфекции 20 мкМ MG132 или без него в течение 6 часов, собирали и лизировали. Экспрессию белков анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Левая панель отображает один репрезентативный эксперимент; гистограмма показывает кратное увеличение экспрессии sZIP (соотношение по сравнению с GFP), индуцированное MG132 с Vpr и без него (7 независимых экспериментов, значение p ≈ 0,001). В . Мутант Vpr с дефицитом связывания DCAF1, VprQ65R, менее эффективен, чем Vpr дикого типа, для индукции деградации sZIP.Клетки HeLa котрансфицировали векторами, экспрессирующими FLAG-sZIP, HA-меченными белками Vpr, как указано, и вектором экспрессии GFP в качестве внутреннего контроля (соотношение 10: 1). Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, лизировали и экспрессию белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга (левая панель, один репрезентативный эксперимент). Гистограмма показывает количественную оценку отношения между сигналами FLAG и GFP для 7 независимых экспериментов. С . Подавление DCAF1 нарушает индуцированную Vpr деградацию sZIP.Клетки HeLa обрабатывали либо 50 нМ контрольной миРНК, либо 50 нМ миРНК, направленной против DCAF1. Через 24 часа клетки трансфицировали векторами, экспрессирующими указанные белки. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, лизировали и экспрессию белков анализировали с помощью вестерн-блоттинга (левая панель, один репрезентативный эксперимент). Гистограммы (правая панель) отображают отношения между сигналами FLAG и GFP.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320.g003

    Опосредованная Vpr деградация sZIP / ZIP не участвует в связанных с ростом клеток активностях Vpr

    Мы далее исследовали, могут ли две связанные с клеточным ростом активности Vpr (задержка G2 и независимая от остановки G2 цитотоксичность) быть результатом Vpr-опосредованной деградации sZIP или ZIP.С этой целью мы использовали ранее охарактеризованные мутанты Vpr и попытались сопоставить их функциональный фенотип с их способностью разрушать sZIP или ZIP. Сначала мы изучили фенотип мутанта VprK27M, который не останавливает клеточный цикл в фазе G2, но все еще является цитотоксичным, не зависящим от остановки G2 [26]. Этот мутант не смог вызвать деградацию ZIP и sZIP (Рисунок 4A и Рисунок S4A, сравните дорожки с 1 по 3), но все еще взаимодействовал с обоими белками (Рисунок 4B). Таким образом, sZIP и ZIP, скорее всего, не являются клеточными факторами, на которые нацелен Vpr, чтобы вызвать гибель клеток, не зависящую от остановки G2.Второй мутант, VprS79A, который потерял способность останавливать клеточный цикл в G2 [15,18], по-прежнему взаимодействовал как с sZIP, так и с ZIP in vivo (Рисунок 4C) и индуцировал их деградацию (Рисунок 4A и Рисунок S4A, сравните дорожки 1, 2 и 4). Этот результат предполагает, что sZIP и ZIP не участвуют в цитостатической активности Vpr или, по крайней мере, их деградация недостаточна для Vpr-опосредованной остановки G2. Мы предположили, что если деградация ZIP или sZIP необходима для цитостатической активности Vpr, их сверхэкспрессия отменяет Vpr-опосредованный арест G2.Мы провели эксперимент с клеточным циклом, в котором экзогенные ZIP и sZIP экспрессировались в клетках HeLa за день до доставки Vpr с вирусоподобными частицами (VLP). Анализ клеточного цикла проводили через 18 часов после доставки Vpr. В этих «нераспадающихся условиях» (см. Вестерн-блот, фиг. 4D, нижняя панель), присутствие ZIP или sZIP не влияло на Vpr-опосредованный арест G2 (фиг. 4D, верхняя панель). Этот результат также указывает на то, что ZIP и sZIP не участвуют в цитостатической активности Vpr.Мы также проанализировали способность белков Vpr из разных лентивирусных линий индуцировать деградацию sZIP или ZIP. Vpr из SIVmnd-2, который способен вызывать остановку G2 ([26] и рисунок S5), опосредовал деградацию обеих изоформ так же эффективно, как Vpr из ВИЧ-1 (рисунок 4E и рисунок S4B, сравните дорожки 1, 2 и 5). ) и Vpr из SIVdrl, который не вызывает остановку G2 (рисунок S4C), не смог вызвать деградацию sZIP и ZIP (рисунок 4E и рисунок S4B). Однако, несмотря на их способность останавливать клеточный цикл [26,39], белки Vpr из SIVrcm и SIVmac251 не могут индуцировать деградацию ZIP или sZIP.Следовательно, способность Vpr индуцировать деградацию sZIP или ZIP не коррелирует с его способностью вызывать остановку клеточного цикла в клетках человека. В целом, наши результаты отбрасывают sZIP и ZIP как клеточные факторы, на которые нацелен Vpr, чтобы вызвать остановку клеточного цикла в фазе G2.

    Рисунок 4. Vpr-опосредованная деградация sZIP не коррелирует ни с цитотоксической активностью Vpr, не зависящей от G2, ни с его способностью вызывать задержку G2.

    А . Характеристика мутантов Vpr по их способности запускать деградацию sZIP.Клетки HeLa котрансфицировали векторами, экспрессирующими FLAG-sZIP и указанные белки Vpr, меченные НА, и вектор экспрессии GFP в качестве внутреннего контроля (соотношение 10: 1). Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, лизировали и экспрессию белков анализировали с помощью вестерн-блоттинга. На верхней панели отображаются результаты одного репрезентативного эксперимента. Нижняя панель показывает количественную оценку отношения между сигналами FLAG и GFP для нескольких независимых экспериментов. B и C .Мутанты Vpr с дефектом G2, VprK27M и VprS79A, все еще взаимодействуют с ZIP и sZIP. Клетки HEK293T трансфицировали векторами, экспрессирующими мутанты Vpr с меткой НА, VprK27M ( B ) и VprS79A ( C ), а также вектором, экспрессирующим указанные белки с меткой FLAG. Клеточные лизаты получали через 48 часов после трансфекции и подвергали иммунопреципитации с использованием антител против FLAG, как описано на Фигуре 1B. Д . Сверхэкспрессия ZIP или sZIP не преодолевает Vpr-опосредованный арест G2.Клетки HeLa котрансфицировали векторами, экспрессирующими либо FLAG-ZIP, либо FLAG-sZIP, вместе с вектором, экспрессирующим белок GFP. Через 24 часа после трансфекции клетки инкубировали с пустыми VLP или VLP, содержащими белок Vpr дикого типа, в течение 2 часов (800 нг GAG CAp24 на VLP). Клетки собирали через 18 часов после обработки VLP. Половину клеток фиксировали, окрашивали йодидом пропидия и анализировали проточной цитометрией для мониторинга содержания ДНК в GFP-положительной популяции (верхняя панель). Другую половину клеток лизировали и экспрессию белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга (нижняя панель). E . Vpr-индуцированная деградация sZIP имеет некоторую Vpr-видовую специфичность (которая не коррелирует с Vpr-видовой специфичностью в отношении остановки клеточного цикла). Клетки HeLa котрансфицировали вектором, экспрессирующим FLAG-sZIP, вместе с вектором, экспрессирующим указанные HA-меченые белки Vpr. GFP использовали в качестве внутреннего контроля, как и в A. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, лизировали и экспрессию белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга (верхняя панель). На нижней панели показаны соотношения между сигналами FLAG и GFP.Активность по блокированию G2 каждого белка Vpr в клетках Hela указана под гистограммой.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320.g004

    Пытаясь понять роль ZIP и sZIP в жизненном цикле вируса, мы задались вопросом, могут ли эти два белка вмешиваться в LTR- ВИЧ-1. управляемая вирусная транскрипция. Клетки HeLa трансфицировали возрастающими дозами векторов, экспрессирующих ZIP или sZIP, затем инфицировали псевдотипированным вирусом ВИЧ-1 VSV-G, экспрессирующим люциферазу (pNL4.3LucΔEnvΔVpr). Количественная оценка люциферазы показала, что ZIP и sZIP не смогли репрессировать или активировать LTR-управляемую транскрипцию в клетках HeLa (рисунок S5A).

    Мы также спросили, могут ли два фактора транскрипции разрушаться в контексте вирусной инфекции. Клетки HEK293 сначала трансфицировали векторами, кодирующими ZIP и sZIP, затем инфицировали вирусами ВИЧ-1, лишенными или кодирующими ген Vpr или несущими ген Vpr, мутированный по остатку Q65. Экспрессия sZIP и ZIP снижалась в присутствии вирусов дикого типа, но не тогда, когда Vpr был удален или мутирован в его сайте связывания DCAF1 (фиг. 5 и S5B).

    Фиг. 5. Vpr, экспрессируемый после инфицирования ВИЧ-1, снижает уровни экзогенной экспрессии sZIP.

    Клетки 293T котрансфицировали равными количествами пустой плазмиды или плазмиды, экспрессирующей FLAG-sZIP, в присутствии вектора экспрессии GFP в качестве внутреннего контроля трансфекции (соотношение 10: 1). Через 24 часа клетки ложно инфицировали или инфицировали двумя дозами указанных вирусов ВИЧ-1 (50 и 250 нг GAG CAp24 на 10 5 клеток). Через два дня после инфицирования клетки лизировали и уровни экспрессии продуктов FLAG-sZIP, GFP и GAG оценивали с помощью вестерн-блоттинга во всех экстрактах клеток (верхняя панель).Гистограмма (нижняя панель) отображает отношения сигналов FLAG / GFP.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320.g005

    Обсуждение

    Мы обнаружили ZIP как нового партнера, взаимодействующего с Vpr ВИЧ-1, с высокой степенью достоверности в двухгибридном скрининге. Мы рассматривали ZIP и его изоформу sZIP в качестве потенциальных мишеней Vpr по нескольким причинам: (i) Vpr связывается с хроматином, (ii) ZIP и sZIP рекрутируют комплекс ремоделирования хроматина NuRD и (iii) эти два белка играют роль в пролиферации и выживании клеток. .Мы обнаружили, что Vpr индуцирует деградацию ZIP и sZIP за счет использования DCAF1 адаптера убиквитинлигазы Cul4A DDB1 . Физиологическое значение этого явления в отношении ВИЧ-1 остается неопределенным. Однако деградация сверхэкспрессированного ZIP или sZIP также происходила в контексте инфицирования вирусами ВИЧ-1, несущими ген Vpr дикого типа, а не соответствующий мутант с дефицитом связывания DCAF1.

    Предыдущие сообщения показали, что Vpr ассоциируется с хроматином, хотя процент Vpr, связанного с фракцией хроматина, не был определен [22,23,40,41].Важно отметить, что биохимический и иммунофлуоресцентный подходы показали, что Vpr может образовывать комплекс с DCAF1 на хроматине [22]. Кроме того, Cul4A DDB1 представляет собой убиквитинлигазу, специализирующуюся на деградации субстратов, присутствующих вблизи хроматина [42]. Обнаружение того факта, что фракция хроматина является единственной, в которой вместе присутствуют Vpr, DCAF1, DDB1 и Cul4A, хорошо согласуется с этими данными, подтверждая идею, ранее высказанную Belzile et al., Что Vpr может вызывать деградацию клеточных мишеней на хроматин [22].Тем не менее, в наших руках большая часть ядерной части Vpr была растворимой, и только менее 3% вирусного белка было прочно связано с хроматином. Это плохое привлечение Vpr к хроматину может быть результатом нашей экспериментальной процедуры, в которой фракция хроматина содержит белки, только тесно связанные с хроматином. В любом случае небольшого количества вирусного белка должно быть достаточно для обеспечения его активности за счет ферментативной активности убиквитинлигазы. Аналогичным образом Precious et al. подчеркнули каталитический процесс, при котором небольшой пул белка SV5 V рециклируется, чтобы разрушить большой избыток STAT1 за счет использования Cul4A DDB1 [43].

    Наш интерес к NuRD был обусловлен тем фактом, что как ZIP, так и sZIP, как было показано, рекрутируют этот комплекс ремоделирования хроматина [32,33]. Интересно, что RbAp46, HDAC1 и MTA2, с одной стороны, и ZIP и sZIP, экспрессируемые из трансфицированных векторов, с другой стороны, присутствовали во фракции хроматина. Следует отметить, что Vpr взаимодействует с RbAp46, слабо с MTA2, но не со всеми составляющими комплекса NuRD, а именно не с HDAC1. К сожалению, до сих пор не удалось выделить мутант Vpr, дефектный по взаимодействию ZIP или sZIP.В целом, наши данные предполагают, что Vpr может присутствовать в субкомплексе, содержащем ZIP (или sZIP), RbAp46 и HAT1 (рис. 1F, пунктирная линия).

    Дозозависимый эффект, который мы заметили в отношении Vpr-опосредованной деградации ZIP или sZIP, был также зарегистрирован в случае UNG2 [27]. В обоих примерах отношение Vpr к клеточной мишени является критическим для возникновения деградации. В зависимости от этого соотношения в результате взаимодействия могут возникнуть разные физиологические результаты. Дальнейшие исследования необходимы для определения относительной экспрессии ZIP и sZIP в первичных клетках, имеющих отношение к ВИЧ-инфекции.

    За последние годы были идентифицированы многие клеточные партнеры Vpr, и новые взаимодействия все еще не раскрываются. Актуальность этих взаимодействий иногда трудно оценить. Изучение роли взаимодействия Vpr-ZIP (или sZIP) связано с отсутствием четкой системы культивирования in vitro , где репликация ВИЧ-1 могла бы показывать сильную зависимость от присутствия вирусного белка. Действительно, только в такой системе ожидается, что клеточная мишень, инактивированная Vpr, будет проявлять противовирусную активность.Точно так же специфические клеточные системы важны для выявления активности факторов клеточного ограничения против ВИЧ. В этих клетках фактор рестрикции присутствует и активен. Например, противовирусная активность фактора рестрикции SAMHD1 может быть раскрыта только в покоящихся клетках, где его вирусный аналог, Vpx, усиливает трансдукцию ВИЧ-1 [2,7,8]. В системе, где активность Vpr можно легко контролировать, подавление экспрессии ZIP или sZIP с помощью siRNA могло бы стать ценным инструментом для демонстрации потенциальной противовирусной активности, связанной с этими клеточными белками.

    Ситуация еще более сложная с Vpr, поскольку Vpr, вероятно, использует ту же убиквитинлигазу, Cul4A DDB1 , для инактивации нескольких белков, которые могут проявлять противовирусную активность в различных условиях. Действительно, с одной стороны, мы предоставили генетические доказательства того, что Vpr захватывает Cul4A DDB1 , чтобы остановить клеточный цикл и вызвать фенотип цитотоксичности, не зависящий от остановки G2 [18,26]. С другой стороны, сообщалось, что Vpr использует Cul4A DDB1 для инактивации нескольких отдельных белков, а именно Mfn2, Ung2 и Dicer [25,44,45].Точно так же белок E6 из папилломавируса нацелен на широкий спектр клеточных белков для опосредованной протеасомой деградации, включая p53, член семейства Bcl-2 Bak и многие другие мишени, содержащие домены PDZ класса 1, включая Akt, Dlg и Scribble (для обзора, см. [46]).

    Клеточные белки, инактивированные Vpr, могут иметь некоторые структурные или функциональные особенности. Имея в виду, что (i) UNG2 представляет собой гликозилазу, которая удаляет урацил вблизи вилок репликации; (ii) предполагается, что мишень G2 присутствует вблизи хроматина [22]; (iii) что ZIP / sZIP являются партнерами по связыванию NuRD и (iv) что Cul4A и DDB1 присутствуют в основном во фракции хроматина, общей чертой мишеней Vpr может быть их ассоциация с хроматином, по крайней мере, когда происходит деградация.

    Vpr-опосредованная деградация ZIP или sZIP не коррелировала ни с наиболее изученным свойством Vpr, то есть с его способностью вызывать задержку G2, ни с его цитотоксическим свойством, независимым от остановки G2. Взаимодействие Vpr с ZIP или sZIP может быть вовлечено в некоторую другую активность Vpr, а именно в его способность трансактивировать LTR или модулировать транскрипцию с клеточных промоторов [47-58]. Мы еще не исследовали эту гипотезу из-за отсутствия мутантов Vpr для такой активности. Кроме того, мы обнаружили, что сверхэкспрессия ZIP или sZIP не влияет на транскрипцию, управляемую промотором ВИЧ-1 в клетках HeLa.Дальнейшая работа будет необходима, чтобы оценить, мешает ли Vpr транскрипционной активности ZIP и sZIP, чтобы обеспечить благоприятную среду для вирусной репликации и распространения. Сравнительное профилирование транскрипции клеток, экспрессирующих или не экспрессирующих Vpr, может помочь получить некоторое представление о функции Vpr.

    Материалы и методы

    Плазмидные конструкции.

    векторов pAS1B, кодирующих меченый НА Vpr из LAI ВИЧ-1, Vpr из SIVrcm, Vpr из SIVmnd2 и Vpr из SIVmac251, были описаны ранее [18,26,59].Ген Vpr, соответствующий SIVdrl, был синтезирован GeneCust Europe после оптимизации кодонов для экспрессии в клетках человека и затем вставлен в вектор pAS1B. Плазмиды, кодирующие ZIP и sZIP, слитые с тегом FLAG на N-конце, были описаны ранее [32,33]. GFP, заякоренный внутренней мембраной, экспрессировался из вектора pBabe / GEM2 [60].

    Двухгибридный анализ дрожжей

    Кодирующую последовательность для полноразмерного YU2 VPR (от нуклеотидов 5557 до нуклеотидов 5850) амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в pB27 в виде C-концевого слияния с LexA.Конструкции использовали в качестве приманок для скрининга при насыщении высокосложной dT-примированной библиотеки CEMC7 человека. 60,3 миллиона клонов (6-кратная сложность библиотеки) были подвергнуты скринингу с использованием метода скрещивания со штаммами дрожжей Y187 (mata) и L40DGal4 (mata), как описано ранее [61]. Колонии His + LacZ + выращивали на среде без триптофана, лейцина и гистидина. Было отобрано 265 колоний. Фрагменты-жертвы положительных клонов амплифицировали с помощью ПЦР и секвенировали на их соединении 5p. Полученные последовательности были использованы для идентификации соответствующих взаимодействующих белков в базе данных GenBank (NCBI) с использованием полностью автоматизированной процедуры.Вкратце, последовательности 5p были отфильтрованы с использованием PHRED. Контиги последовательностей были построены с использованием CAP3 и сравнены с последней версией GenBank с использованием BLASTN [62]. Было отобрано 14 клонов, кодирующих ZIP, с 8 различными слияниями.

    Культура клеток, процедуры трансфекции и реагенты

    клеток HeLa и HEK293T поддерживали в среде DMEM с добавлением глутамина и 10% фетальной телячьей сыворотки. Трансфекции плазмид выполняли с использованием реагента для трансфекции Fugene 6 (Roche), а трансфекции siРНК выполняли с использованием реагента Dharmafect (Dharmacon).Контрольные миРНК и миРНК DCAF1 были приобретены у Dharmacon. Следующая миРНК была использована для нацеливания на DCAF1: 09, ggagggaaUUgucgagaauuu. Ингибитор протеасом MG132 был приобретен у Sigma и использовался в конечной концентрации 20 мкМ в течение 6 часов.

    Анализ субклеточного фракционирования

    Субклеточное фракционирование проводили с использованием набора «Subcellular Protein Fractionation» от Pierce в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 2×10 6 клеток HeLa были лизированы последовательными буферами в присутствии ингибиторов протеаз, что позволило провести последовательную экстракцию растворимых цитоплазматических белков, мембраносвязанных белков, растворимых ядерных белков и затем связанных с хроматином белков (полученных в результате расщепления микрококковой нуклеазой. ), оставляя нерастворимые белки в оставшемся осадке.Соотношение конечных объемов каждой фракции составляет 2: 2: 1: 1: 1.

    Процедура иммунопреципитации Anti-FLAG

    Клетки, выращенные в 10-см чашках, лизировали в 700 мкл SD-буфера (50 мМ Tris ‑ HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5% Triton X100), содержащего коктейль против протеаз (Sigma). Лизаты клеток осветляли центрифугированием и инкубировали с гранулами против FLAG (EZview Red ANTI-FLAG ® M2 Affinity Gel, Sigma) в течение ночи при 4 ° C. После четырех промывок в буфере SD иммунопреципитированные белки выделяли элюированием пептидом Flag (Sigma) в течение одного часа при 4 ° C.

    Процедура иммунопреципитации против HA

    Клетки, выращенные в 10-см чашках, лизировали в 700 мкл SD-буфера, содержащего коктейль против протеаз (Sigma). Лизаты клеток осветляли центрифугированием и инкубировали с гранулами против НА (Anti-HA Affinity Matrix, Roche) в течение ночи при 4 ° C. После четырех промывок в буфере SD иммунопреципитированные белки выделяли путем элюирования пептидом HA (Roche) в течение одного часа при 37 ° C.

    Вестерн-блоттинг и антитела

    Клетки лизировали в 500 мкл буфера SB (60 мМ Трис pH 8, 10% глицерин, 2% SDS, 1% бромфеноловый синий, 100 мМ DTT) с использованием иглы 27G, и экстракты белков разделяли электрофорезом в SDS-PAGE.После переноса на PVDF-мембраны белки были обнаружены с помощью иммуноблот-анализа с использованием хемилюминесцентной процедуры (CDP Star ®, Applied Biosystems). Сигналы регистрировались аппаратом LAS 3000 (Fujifilm) для дальнейшей количественной оценки с использованием программного обеспечения Multigauge (Fujifilm). Моноклональное антитело, направленное против метки HA (16B12), было приобретено у Covance Research Products; анти-GFP от Roche; моноклональные антитела против FLAG M2 и против тубулина от Sigma, кроличьи поликлональные антитела против Cullin4A и RbAp46 и мышиные моноклональные антитела против MTA2 от Abcam; кроличьи поликлональные антитела против гистона h5 и против HDAC1 были приобретены у Cell Signaling; кроличьи поликлональные антитела против DCAF1 были получены от Gentaur; Мышиные моноклональные антитела против DDB1 были приобретены у Zymed, а мышиные моноклональные антитела против HAT1 были приобретены у Santa Cruz.

    Производство вирусов

    Для вирусов delta-Env HIV-1 (DHIV) клетки 293T (4 × 10 6 клеток) котрансфицировали конструкциями pNL4.3 deltaEnv HIV-1, лишенными гена, кодирующего Vpr (DHIV ΔVpr) или кодирующего либо wt Vpr (DHIV wt) или VprQ65R (DHIV VprQ65R) [63] вместе с плазмидой, кодирующей гликопротеин G вируса везикулярного стоматита (VSV-G). Для репортерных вирусов люциферазы клетки 293T котрансфицировали конструкцией pNL4.3 deltaEnv-deltaVpr HIV-1, экспрессирующей белок люциферазы вместо Nef [10] вместе с плазмидой, кодирующей VSV-G.Для псевдочастиц (VLP) клетки 293T котрансфицировали минимальным упаковывающим вектором ВИЧ-1 pCMVdelta8.91 [11] вместе с плазмидой, кодирующей VSV-G, и плазмидой, кодирующей HA-меченый Vpr в соотношении 5: 1: 5. Супернатанты культур собирали через 48 часов после трансфекции и фильтровали через фильтры с размером пор 0,45 мкм. Затем вирусные частицы концентрировали в 10% полиэтиленгликоле 6000 (PEG-6000) (Sigma), содержащем 300 мМ NaCl, и титровали количественным определением капсида p24 ВИЧ-1 с использованием иммуноферментного анализа (ELISA) (ZeptoMetrix Corporation).

    Анализ активности люциферазы

    Активность люциферазы измеряли с использованием анализа Dual-Luciferase® Reporter Assay от Promega в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки, экспрессирующие люциферазу, дважды промывали PBS и лизировали непосредственно в лунках с использованием 1X буфера для пассивного лизиса в течение 15 минут при комнатной температуре. Лизаты клеток осветляли центрифугированием, и активность люциферазы измеряли с использованием субстрата для анализа люциферазы с помощью FLUOstar OPTIMA от BMG LABTECH.

    Анализ клеточного цикла

    5×10 5 Клетки HeLa высевали на чашки диаметром 6 см за 24 часа до трансфекции. Клетки трансфицировали 1 мкг pAS1B-Vpr в комбинации с 0,1 мкг pBabe / GEM2 в качестве внутреннего маркера трансфекции. Спустя 24 часа клетки собирали, высевали на чашки диаметром 10 см и выращивали еще один день. Затем клетки отделяли (вручную) и фиксировали в 70% этаноле. После обработки в течение 30 минут при 37 ° C 0,2 мг / мл РНКазы A и 50 мкг / мл йодида пропидия в буфере H (20 мМ Hepes, 160 мМ NaCl, 1 мМ EGTA) клетки, экспрессирующие котрансфицированный GFP, анализировали на предмет их ДНК. содержимого с помощью анализатора клеток Cytomics FC500 (Beckman Coulter).По меньшей мере 10 000 GFP-положительных клеток были проанализированы на предмет их распределения в различных фазах клеточного цикла.

    Вспомогательная информация

    Рисунок S1.

    Лишь небольшая фракция Vpr обнаруживается во фракции ассоциированных с хроматином белков. Гистограмма отображает количественную оценку сигнала HA в каждой фракции, выраженную в процентах от общего сигнала HA для клеток, экспрессирующих HA-Vpr WT, по данным вестерн-блоттинга, показанного на рисунке 1C.

    https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0077320.s001

    (TIF)

    Рисунок S2.

    ZIP и sZIP взаимодействуют с субъединицами комплекса Mi2 / NuRD и с HAT1, партнером RbAp46. Клетки HEK293T трансфицировали векторами, экспрессирующими меченный НА Vpr и указанные белки, меченные FLAG. Лизаты клеток получали через 48 часов после трансфекции и подвергали иммунопреципитации с использованием антител против FLAG. После обширной промывки связанные белки элюировали с гранул пептидом FLAG.Иммунопреципитаты ( IP ) и неочищенные клеточные лизаты ( лизатов ) анализировали вестерн-блоттингом с использованием указанных антител.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320.s002

    (TIF)

    Рисунок S3.

    ВИЧ-1 Vpr индуцирует деградацию ZIP через убиквитинлигазу DCAF1. A и B . Vpr ВИЧ-1 снижает экспрессию ZIP в зависимости от дозы. А . Клетки HeLa котрансфицировали вектором, экспрессирующим FLAG-ZIP, и увеличивающимися количествами вектора, экспрессирующего меченый НА Vpr.Вектор экспрессии GFP использовали в качестве внутреннего контроля трансфекции. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, лизировали и экспрессию белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга (верхняя панель). Гистограмма (нижняя панель) отображает соотношение между сигналом FLAG и сигналом GFP по сравнению с этим соотношением без Vpr. B. То же, что и в A, за исключением увеличения количества вектора, экспрессирующего FLAG-ZIP, с или без HA-тегированного Vpr. C. Молчание DCAF1 нарушает индуцированную Vpr деградацию ZIP. Клетки HeLa обрабатывали либо 50 нМ контрольной миРНК, либо 50 нМ миРНК, направленной против DCAF1.Через 24 часа клетки трансфицировали векторами, экспрессирующими указанные белки. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, лизировали и экспрессию белков анализировали с помощью вестерн-блоттинга (левая панель, один репрезентативный эксперимент). Гистограммы (правая панель) отображают отношения между сигналами FLAG и GFP.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320.s003

    (TIF)

    Рисунок S4.

    Vpr-опосредованная деградация ZIP не коррелирует с цитотоксической активностью Vpr, не зависящей от G2, а также с его способностью вызывать задержку G2. А . Характеристика мутантов Vpr по их способности запускать деградацию ZIP. Клетки HeLa котрансфицировали векторами, экспрессирующими FLAG-ZIP и указанные белки Vpr, меченные НА, и вектор экспрессии GFP в качестве внутреннего контроля (соотношение 10: 1). Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, лизировали и экспрессию белков анализировали с помощью вестерн-блоттинга. На верхней панели отображаются результаты одного репрезентативного эксперимента. Нижняя панель показывает количественную оценку отношения между сигналами FLAG и GFP для нескольких независимых экспериментов. В . Vpr-индуцированная деградация ZIP имеет некоторую Vpr-видовую специфичность (которая не коррелирует с Vpr-видовой специфичностью в отношении остановки клеточного цикла). Клетки HeLa котрансфицировали вектором, экспрессирующим FLAG-ZIP, вместе с вектором, экспрессирующим указанные HA-меченые белки Vpr. GFP использовали в качестве внутреннего контроля, как и в A. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции, лизировали и экспрессию белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга (верхняя панель). На нижней панели показаны соотношения между сигналами FLAG и GFP.Активность по блокированию G2 каждого белка Vpr в клетках Hela указана под гистограммой. С . SIVdrl Vpr не вызывает остановки клеточного цикла при переходе G2 / M. Клетки HeLa трансфицировали векторами, экспрессирующими указанные белки, меченные НА, вместе с вектором, экспрессирующим белок GFP. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции. После фиксации и окрашивания йодидом пропидия клетки анализировали проточной цитометрией для мониторинга содержания ДНК в GFP-положительной популяции.Отношение G2 / G1 указано над каждой диаграммой.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320.s004

    (TIF)

    Рисунок S5.

    A. ZIP и sZIP не влияют на транскрипцию с промотора LTR в клетках HeLa. Клетки HeLa трансфицировали векторами, экспрессирующими либо FLAG-ZIP, либо FLAG-sZIP (по 1,5 и 3 мкг каждого). Затем клетки инфицировали через 24 часа после трансфекции псевдотипированным VSV-G pNL4.3LucΔEnvΔVpr при MOI 0,5. Клетки собирали через 48 часов после инфицирования, лизировали и активность люциферазы измеряли с использованием FLUOstar OPTIMA от BMG Labtech (AU, Arbitrary Units) (верхняя панель).Эксперимент проводили в трех повторностях. Уровни экспрессии FLAG-ZIP и FLAG-sZIP определяли с помощью вестерн-блоттинга (нижняя панель) B . Vpr, экспрессируемый после инфицирования ВИЧ-1, снижает экзогенную экспрессию ZIP . Клетки 293T котрансфицировали равными количествами пустой плазмиды или плазмиды, экспрессирующей FLAG-ZIP, в присутствии вектора экспрессии GFP. Через 24 часа после трансфекции клетки инфицировали двумя дозами указанных вирусов ВИЧ-1 (50 и 250 нг GAG CAp24 на 10 5 клеток).Через два дня после инфицирования клетки лизировали и оценивали уровни экспрессии продуктов FLAG-ZIP, GFP и GAG с помощью вестерн-блоттинга в экстрактах целых клеток.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077320.s005

    (TIF)

    Благодарности

    Мы благодарим Диану Айнде за ее комментарии к рукописи. Мы благодарим Ричарда Бенаруса за плодотворные обсуждения. Мы благодарим Юнфэна Шанга за его ценный вклад в виде подарка конструкций ZIP и sZIP, Натаниэля Ландау за его дар pNL4.3 deltaEnv-deltaVpr HIV-1 и Эдварду Баркеру за его дар конструкции DHIV. Мы благодарим Центр цитометрии и иммунобиологии Кохин за их помощь в анализе FACS.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: CM BCR FMG. Проведены эксперименты: CM AS LD HL BCR. Проанализированы данные: CM JCR SB BCR FMG. Написал рукопись: CM FMG.

    Ссылки

    1. 1. Sharp PM, Bailes E, Chaudhuri RR, Rodenburg CM, Santiago MO et al.(2001) Истоки вирусов синдрома приобретенного иммунодефицита: где и когда? Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 356: 867-876. DOI: https: //doi.org/10.1098/rstb.2001.0863. PubMed: 11405934.
    2. 2. Laguette N, Sobhian B, Casartelli N, Ringeard M, Chable-Bessia C et al. (2011) SAMHD1 представляет собой специфический для дендритных и миелоидных клеток фактор рестрикции ВИЧ-1, которому противодействует Vpx. Nature 474: 654-657. DOI: https: //doi.org/10.1038/nature10117. PubMed: 21613998.
    3. 3. Марин М., Роуз К.М., Козак С.Л., Кабат Д. (2003) Белок Vif ВИЧ-1 связывает редактирующий фермент APOBEC3G и вызывает его деградацию.Нат Мед 9: 1398-1403. DOI: https: //doi.org/10.1038/nm946. PubMed: 14528301.
    4. 4. Neil SJ, Zang T, Bieniasz PD (2008) Тетерин ингибирует высвобождение ретровируса и противостоит Vpu ВИЧ-1. Nature 451: 425-430. DOI: https: //doi.org/10.1038/nature06553. PubMed: 18200009.
    5. 5. Sheehy AM, Gaddis NC, Malim MH (2003) Антиретровирусный фермент APOBEC3G расщепляется протеасомой в ответ на ВИЧ-1 Vif. Нат Мед 9: 1404-1407. DOI: https: //doi.org/10.1038/nm945.PubMed: 14528300.
    6. 6. Ван Дамм Н., Гофф Д., Кацура С., Йоргенсон Р. Л., Митчелл Р. и др. (2008) Интерферон-индуцированный белок BST-2 ограничивает высвобождение ВИЧ-1 и подавляется с поверхности клетки вирусным белком Vpu. Клеточный микроб-хозяин 3: 245-252. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2008.03.001. PubMed: 18342597.
    7. 7. Lahouassa H, Daddacha W., Hofmann H, Ayinde D, Logue EC et al. (2012) SAMHD1 ограничивает репликацию вируса иммунодефицита человека типа 1, истощая внутриклеточный пул дезоксинуклеозидтрифосфатов.Nat Immunol 13: 621. DOI: https: //doi.org/10.1038/ni0612-621c. PubMed: 22327569.
    8. 8. Hrecka K, Hao C, Gierszewska M, Swanson SK, Kesik-Brodacka M et al. (2011) Vpx снимает подавление ВИЧ-1-инфекции макрофагов, опосредованной белком SAMHD1. Nature 474: 658-661. DOI: https: //doi.org/10.1038/nature10195. PubMed: 21720370.
    9. 9. Balliet JW, Kolson DL, Eiger G, Kim FM, McGann KA et al. (1994) Отчетливые эффекты в первичных макрофагах и лимфоцитах дополнительных генов вируса иммунодефицита человека типа 1 vpr, vpu и nef: мутационный анализ первичного изолята ВИЧ-1.Вирусология 200: 623-631. DOI: https://doi.org/10.1006/viro.1994.1225. PubMed: 8178448.
    10. 10. Connor RI, Chen BK, Choe S, Landau NR (1995) Vpr требуется для эффективной репликации вируса иммунодефицита человека типа 1 в мононуклеарных фагоцитах. Вирусология 206: 935-944. DOI: https: //doi.org/10.1006/viro.1995.1016. PubMed: 7531918.
    11. 11. Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D (1997) Множественно ослабленный лентивирусный вектор обеспечивает эффективную доставку гена in vivo.Nat Biotechnol 15: 871-875. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt0997-871. PubMed: 9306402.
    12. 12. de Silva S, Planelles V, Wu L (2012) Дифференциальные эффекты Vpr на одноцикловые и распространяющиеся инфекции ВИЧ-1 в CD4 + Т-клетках и дендритных клетках. PLOS ONE 7: e35385. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0035385. PubMed: 22570689.
    13. 13. Casey L, Wen X, de Noronha CM (2010) Функции белка Vpr ВИЧ1 и его действие через убиквитинлигазу DCAF1.DDB1.Cullin4.Цитокин 51: 1-9. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.cyto.2010.02.018. PubMed: 20347598.
    14. 14. Planelles V, Barker E (2010) Роль Vpr и Vpx в модулировании взаимоотношений вируса и клетки-хозяина. Мол Аспекты Мед 31: 398-406. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.mam.2010.05.002. PubMed: 20558198.
    15. 15. Belzile JP, Duisit G, Rougeau N, Mercier J, Finzi A et al. (2007) Vpr-опосредованная остановка G2 ВИЧ-1 включает убиквитинлигазу DDB1-CUL4AVPRBP E3. PLOS Pathog 3: e85.DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.ppat.0030085. PubMed: 17630831.
    16. 16. ДеХарт Дж. Л., Циммерман Э. С., Ардон О., Монтейро-Филхо С. М., Арганьяраз Э. Р. и др. (2007) ВИЧ-1 Vpr активирует контрольную точку G2 посредством манипулирования протеасомной системой убиквитина. Virol J 4: 57. DOI: https: //doi.org/10.1186/1743-422X-4-57. PubMed: 17559673.
    17. 17. Hrecka K, Gierszewska M, Srivastava S, Kozaczkiewicz L, Swanson SK et al. (2007) Лентивирус Vpr узурпирует Cul4-DDB1 [VprBP] E3 убиквитинлигазу для модуляции клеточного цикла.Proc Natl Acad Sci U S A 104: 11778-11783. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0702102104. PubMed: 17609381.
    18. 18. Le Rouzic E, Belaïdouni N, Estrabaud E, Morel M, Rain JC et al. (2007) HIV1 Vpr останавливает клеточный цикл, рекрутируя DCAF1 / VprBP, рецептор убиквитинлигазы Cul4-DDB1. Клеточный цикл 6: 182-188. DOI: https: //doi.org/10.4161/cc.6.2.3732. PubMed: 17314515.
    19. 19. Schröfelbauer B, Hakata Y, Landau NR (2007) Функция Vpr ВИЧ-1 опосредуется взаимодействием со специфическим для повреждений ДНК-связывающим белком DDB1.Proc Natl Acad Sci U S A 104: 4130-4135. DOI: https: //doi.org/10.1073/pnas.0610167104. PubMed: 17360488.
    20. 20. Tan L, Ehrlich E, Yu XF (2007) DDB1 и Cul4A необходимы для остановки G2, вызванной вирусом иммунодефицита человека 1 типа, вызванной Vpr. Дж. Вирол 81: 10822-10830. DOI: https: //doi.org/10.1128/JVI.01380-07. PubMed: 17626091.
    21. 21. Wen X, Duus KM, Friedrich TD, de Noronha CM (2007). Белок Vpr ВИЧ1 способствует остановке клеточного цикла G2 путем взаимодействия с DDB1 и Cullin4A-содержащим комплексом убиквитин-лигазы с использованием VprBP / DCAF1 в качестве адаптера.J Biol Chem 282: 27046-27057. DOI: https: //doi.org/10.1074/jbc.M703955200. PubMed: 17620334.
    22. 22. Belzile JP, Abrahamyan LG, Gérard FC, Rougeau N, Cohen EA (2010) Формирование мобильных связанных с хроматином ядерных фокусов, содержащих ВИЧ-1 Vpr и VPRBP, имеет решающее значение для индукции остановки клеточного цикла G2. PLOS Pathog 6: e1001080. PubMed: 20824083.
    23. 23. Lai M, Zimmerman ES, Planelles V, Chen J (2005) Активация пути ATR Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 включает его прямое связывание с хроматином in vivo.Дж. Вирол 79: 15443-15451. DOI: https: //doi.org/10.1128/JVI.79.24.15443-15451.2005. PubMed: 16306615.
    24. ,
    25. 24. Li G, Park HU, Liang D, Zhao RY (2010) Остановка G2 / M клеточного цикла посредством S-фазозависимого механизма вирусным белком ВИЧ-1 R. Retrovirology 7: 59. doi: https: //doi.org/ 10.1186 / 1742-4690-7-S1-P59. PubMed: 20609246.
    26. 25. Ан Дж., Ву Т, Новинце З., Герреро-Санторо Дж., Рапик-Отрин В. и др. (2010) Vpr ВИЧ-1 загружает урацил-ДНК-гликозилазу-2 на DCAF1, субъединицу распознавания субстрата убиквитинлигазы cullin 4A-RING E3 для протеасомозависимой деградации.J Biol Chem, 285: 37333–41. PubMed: 20870715.
    27. 26. Maudet C, Bertrand M, Le Rouzic E, Lahouassa H, Ayinde D et al. (2011) Молекулярное понимание того, как белок Vpr ВИЧ-1 влияет на рост клеток двумя генетически разными путями. J Biol Chem 286: 23742-23752. DOI: https: //doi.org/10.1074/jbc.M111.220780. PubMed: 21566118.
    28. 27. Wen X, Casey Klockow L, Nekorchuk M, Sharifi HJ, de Noronha CM (2012) Белок Vpr ВИЧ1 действует, усиливая конститутивный DCAF1-зависимый оборот UNG2.PLOS ONE 7: e30939. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0030939. PubMed: 222.
    29. 28. Ли Г., старейшина Р. Т., Дубровский Л., Лян Д., Пушкарский Т. и др. (2010) Репликация ВИЧ-1 посредством hHR23A-опосредованного взаимодействия Vpr с 26S протеасомой. PLOS ONE 5: e11371. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0011371. PubMed: 20614012.
    30. 29. Denslow SA, Wade PA (2007) Комплекс Mi-2 / NuRD человека и регуляция гена. Онкоген 26: 5433-5438. doi: https: //doi.org/10.1038 / sj.onc.1210611. PubMed: 17694084.
    31. 30. Lai AY, Wade PA (2011) Биология рака и NuRD: многогранный комплекс ремоделирования хроматина. Нат Рев Рак 11: 588-596. DOI: https: //doi.org/10.1038/nrc3091. PubMed: 21734722.
    32. 31. Рамирес Дж., Хагман Дж. (2009) Комплекс Mi-2 / NuRD: критический эпигенетический регулятор гемопоэтического развития, дифференцировки и рака. Эпигенетика 4: 532-536. DOI: https: //doi.org/10.4161/epi.4.8.10108. PubMed: 19923891.
    33. 32.Ли Р, Чжан Х., Ю В, Чен И, Гуй Б. и др. (2009) ZIP: новый репрессор транскрипции, репрессирует онкоген EGFR и подавляет канцерогенез груди. EMBO J 28: 2763-2776. DOI: https://doi.org/10.1038/emboj.2009.211. PubMed: 19644445.
    34. 33. Yu W, Li R, Gui B, Shang Y (2010) sZIP, альтернативный вариант сплайсинга ZIP, противодействует репрессии транскрипции и ингибированию роста ZIP. J Biol Chem 285: 14301-14307. DOI: https: //doi.org/10.1074/jbc.M110.107508. PubMed: 20233718.
    35. 34. Хаяси Т., Фудзита Ю., Ивасаки О., Адачи Ю., Такахаши К. и др. (2004) Mis16 и Mis18 необходимы для загрузки CENP-A и деацетилирования гистонов на центромерах. Ячейка 118: 715-729. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.cell.2004.09.002. PubMed: 15369671.
    36. 35. Таплик Дж., Куртев В., Кробот К., Пош М., Лехнер Т. и др. (2001) Гомоолигомеризация и ядерная локализация гистондеацетилазы мыши 1. J Mol Biol 308: 27-38. DOI: https: //doi.org/10.1006/jmbi.2001.4569. PubMed: 11302704.
    37. 36. Yao YL, Yang WM (2003) Связанные с метастазами белки 1 и 2 образуют отдельные белковые комплексы с активностью гистондеацетилазы. J Biol Chem 278: 42560-42568. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M302955200. PubMed: 122.
    38. 37. Parthun MR (2007) Hat1: новые клеточные роли гистонацетилтрансферазы типа B. Онкоген 26: 5319-5328. DOI: https: //doi.org/10.1038/sj.onc.1210602. PubMed: 17694075.
    39. 38.Jäger S, Cimermancic P, Gulbahce N, Johnson JR, McGovern KE et al. (2012) Глобальный ландшафт белковых комплексов ВИЧ-человека. Природа 481: 365-370. PubMed: 221

      .

    40. 39. Planelles V, Jowett JB, Li QX, Xie Y, Hahn B. et al. (1996) Vpr-индуцированная остановка клеточного цикла консервативна среди лентивирусов приматов. Дж. Вирол 70: 2516-2524. PubMed: 8642681.
    41. 40. Шимура М., Тойода Ю., Иидзима К., Киномото М., Токунага К. и др. (2011) Эпигенетическое вытеснение HP1 из гетерохроматина с помощью HIV-1 Vpr вызывает преждевременное разделение сестринских хроматид.J Cell Biol 194: 721-735. DOI: https: //doi.org/10.1083/jcb.201010118. PubMed: 21875947.
    42. 41. Танейчи Д., Иидзима К., Дои А., Кояма Т., Минемото Й. и др. (2011) Идентификация SNF2h, фактора ремоделирования хроматина, как нового связывающего белка Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1. J. Neuroimmune Pharmacol. 6: 177-187. DOI: https: //doi.org/10.1007/s11481-011-9276-5. PubMed: 21519849.
    43. 42. Хига Л.А., Ву М., Йе Т, Кобаяши Р., Сун Х и др. (2006) Убиквитинлигаза CUL4-DDB1 взаимодействует с множественными белками WD40-повторов и регулирует метилирование гистонов.Nat Cell Biol 8: 1277-1283. DOI: https: //doi.org/10.1038/ncb1490. PubMed: 17041588.
    44. 43. Precious BL, Carlos TS, Goodbourn S, Randall RE (2007) Статистический анализ каталитического обмена 1 позволяет PIV5 устранять индуцированное интерфероном антивирусное состояние клеток. Вирусология 368: 114-121.
    45. 44. Huang CY, Chiang SF, Lin TY, Chiou SH, Chow KC (2012) Vpr ВИЧ-1 запускает разрушение митохондрий, нарушая Mfn2-опосредованное взаимодействие ER-митохондрий. PLOS ONE 7: e33657. doi: https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0033657. PubMed: 22438978.
    46. 45. Casey Klockow L, Sharifi HJ, Wen X, Flagg M, Furuya AK et al. (2013) Белок Vpr ВИЧ-1 нацелен на Dicer эндорибонуклеазы для протеасомной деградации, чтобы усилить инфекцию макрофагов. Вирусология, 444: 191–202. PubMed: 23849790.
    47. 46. Thomas M, Narayan N, Pim D, Tomaić V, Massimi P et al. (2008) Вирусы папилломы человека, рак шейки матки и полярность клеток. Онкоген 27: 7018-7030. doi: https: //doi.org/10.1038 / onc.2008.351. PubMed: 142.
    48. ,
    49. , 47. Agostini I, Navarro JM, Rey F, Bouhamdan M, Spire B et al. (1996) Трансактиватор Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1: взаимодействие с активаторными доменами, связанными с промотором, и связывание с TFIIB. J Mol Biol 261: 599-606. DOI: https: //doi.org/10.1006/jmbi.1996.0485. PubMed: 8800208.
    50. 48. Amini S, Khalili K, Sawaya BE (2004) Эффект Vpr ВИЧ-1 на регуляторы клеточного цикла. ДНК Cell Biol 23: 249-260. doi: https: // doi.org / 10.1089 / 1044543819833. PubMed: 15142382.
    51. ,
    52. , 49. Чоудхури И.Х., Ван XF, Ландау Н.Р., Робб М.Л., Полонис В.Р. и др. (2003) Vpr ВИЧ-1 активирует ингибитор клеточного цикла p21 / Waf1 / Cip1: потенциальный механизм остановки клеточного цикла G2 / M. Вирусология 305: 371-377. DOI: https: //doi.org/10.1006/viro.2002.1777. PubMed: 12573582.
    53. 50. Цуй Дж., Тунгатурти П.К., Айяву В., Гафури М., Арига Х. и др. (2006) Роль Vpr в регуляции экспрессии гена ВИЧ-1. Клеточный цикл 5: 2626-2638.DOI: https: //doi.org/10.4161/cc.5.22.3442. PubMed: 17172832.
    54. 51. Джанкет М.Л., Маникам П., Маджумдер Б., Тхотала Д., Вагнер М. и др. (2004) Дифференциальная регуляция генов клеток-хозяев вирусным белком R (Vpr) ВИЧ-1: анализ микрочипов кДНК с использованием изогенного вируса. Biochem Biophys Res Commun 314: 1126-1132. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2004.01.008. PubMed: 14751250.
    55. 52. Langevin C, Maidou-Peindara P, Aas PA, Jacquot G, Otterlei M et al. (2009) Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 модулирует клеточную экспрессию UNG2 посредством отрицательного транскрипционного эффекта.Дж. Вирол 83: 10256-10263. DOI: https: //doi.org/10.1128/JVI.02654-08. PubMed: 19625402.
    56. 53. Roux P, Alfieri C, Hrimech M, Cohen EA, Tanner JE (2000) Активация факторов транскрипции NF-kappaB и NF-IL-6 белком R вируса иммунодефицита человека типа 1 (Vpr) индуцирует экспрессию интерлейкина-8. J Virol 74: 4658-4665. DOI: https: //doi.org/10.1128/JVI.74.10.4658-4665.2000. PubMed: 10775602.
    57. 54. Варин А., Декрион АЗ., Саббах Э, Куиви В., Сир Дж. И др. (2005) Синтетический белок Vpr активирует протеин-активатор-1, N-концевую киназу c-Jun и NF-kappaB и стимулирует транскрипцию ВИЧ-1 в промоноцитарных клетках и первичных макрофагах.J Biol Chem 280: 42557-42567. DOI: https: //doi.org/10.1074/jbc.M502211200. PubMed: 16243842.
    58. ,
    59. , 55. Wang L, Mukherjee S, Jia F, Narayan O, Zhao LJ (1995) Взаимодействие вирионного белка Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 с клеточным транскрипционным фактором Sp1 и трансактивация вирусного длинного концевого повтора. J Biol Chem 270: 25564-25569. DOI: https: //doi.org/10.1074/jbc.270.43.25564. PubMed: 7592727.
    60. 56. Zhu Y, Roshal M, Li F, Blackett J, Planelles V (2003) Повышение регуляции сурвивина ВИЧ-1 Vpr.Апоптоз 8: 71-79. DOI: https: //doi.org/10.1023/A: 1021653119934. PubMed: 12510154.
    61. 57. Deshmane SL, Mukerjee R, Fan S, Del Valle L, Michiels C et al. (2009) Активация пути окислительного стресса с помощью ВИЧ-1 Vpr приводит к индукции индуцируемой гипоксией экспрессии фактора 1альфа. J. Biol Chem. 284: 11364-11373. PubMed: 1

      00.

    62. 58. Deshmane SL, Amini S, Sen S, Khalili K, Sawaya BE (2011) Регулирование промотора ВИЧ-1 белками HIF-1α и Vpr.Virol J 8: 477. DOI: https: //doi.org/10.1186/1743-422X-8-477. PubMed: 22023789.
    63. 59. Bergamaschi A, Ayinde D, David A, Le Rouzic E, Morel M et al. (2009) Белок Vpx ВИЧ-2 узурпирует убиквитинлигазу CUL4A-DDB1DCAF1, чтобы преодолеть пост-входной блок при макрофагальной инфекции. Дж. Вирол, 83 (10): 4854-60.
    64. 60. Пестов Д.Г., Полонская М., Лау Л.Ф. (1999) Проточно-цитометрический анализ клеточного цикла в трансфицированных клетках без фиксации клеток. Биотехнологии 26: 102-106.PubMed: 9894598.
    65. 61. Fromont-Racine M, Rain JC, Legrain P (1997) К функциональному анализу генома дрожжей с помощью исчерпывающих двухгибридных скринингов. Нат Генет 16: 277-282. DOI: https://doi.org/10.1038/ng0797-277. PubMed: 94.
    66. 62. Formstecher E, Aresta S, Collura V, Hamburger A, Meil ​​A et al. (2005) Картирование взаимодействия белков: тематическое исследование дрозофилы. Genome Res 15: 376-384. DOI: https: //doi.org/10.1101/gr.2659105. PubMed: 15710747.
    67. 63.Уорд Дж., Дэвис З., ДеХарт Дж., Циммерман Э., Боске А. и др. (2009) Vpr ВИЧ-1 запускает опосредованный естественными клетками-киллерами лизис инфицированных клеток посредством активации реакции на повреждение ДНК, опосредованной ATR. PLOS Pathog 5: e1000613. PubMed: 19798433.
    .

    Author: alexxlab

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.