Биологический состав клетки: Решутест. Продвинутый тренажёр тестов

Содержание

Химический состав клетки – онлайн-тренажер для подготовки к ЕНТ, итоговой аттестации и ВОУД

Химический состав клетки определяется наличием в ней органических и неорганических веществ.

Из неорганических веществ клетки вода составляет около 65% ее массы: она является средой и растворителем, участвует в химических реакциях, перемещении веществ, терморегуляции, образовании клеточных структур, определяет объем и упругость клетки. Большинство веществ поступает в организм и выводится из него в водном растворе.

Содержание минеральных веществ в клетках незначительно, но роль их велика: они поддерживают осмотическое равновесие, регулируют различные биохимические и физиологические процессы. Например, ионы Na+ и К+ нужны для образования нервных импульсов, ионы Са2+ нужны для свертывания крови и др.

Органические вещества – составляют 20–30% состава клетки. Они могут быть простыми (аминокислоты, глюкоза, глицерин и жирные кислоты) и

сложными (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, липиды). Наиболее важное значение имеют белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты.

Белки – это основные и наиболее сложные вещества любой клетки. Белки являются макромолекулами, и состоят из простых соединений – аминокислот (в естественных белках содержится 20 альфа-аминокислот). Объединяясь в различной последовательности и количестве, они образуют большое разнообразие (до 1000) белков. Их роль в жизни клетки огромна: строительный материал организма, катализаторы (белки-ферменты ускоряют химические реакции), транспорт (гемоглобин крови доставляет клеткам кислород и питательные вещества и уносит углекислый газ и продукты распада). Белки выполняют защитную функцию, энергетическую.

Углеводы – органические вещества, состоящие из углерода, водорода и кислорода. Наиболее простые из них моносахариды – гексоза, фруктоза, глюкоза (содержатся в фруктах, меде), галактоза (в молоке) и полисахариды – состоящие из нескольких простых углеводов. К ним относятся крахмал, гликоген. Углеводы – основной источник энергии для всех форм клеточной активности (движение, биосинтез, секреция и т. д.), играют роль запасных веществ.

Липиды – нерастворимые в воде жиры и жироподобные вещества. Они являются основным структурным компонентом биологических мембран. Липиды выполняют энергетическую функцию, в них содержатся жирорастворимые витамины.

Нуклеиновые кислоты – (от латинского слова «нуклеус» – ядро) – образуются в ядре клетки. Они бывают двух типов: дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК). Биологическая роль их очень велика. Они определяют синтез белков и передачу наследственной информации.

«Химический состав клетки» (ОГЭ, ЕГЭ)

Конспект по биологии на тему: «Химический состав клетки»

Химические элементы клетки образуют неорганические и органические вещества. Несмотря на то что в живых организмах преобладают неорганические вещества, именно органические вещества определяют уникальность их химического состава и феномена жизни в целом, поскольку они синтезируются преимущественно организмами в процессе жизнедеятельности и играют в реакциях важнейшую роль.

Следует отметить, что содержание химических веществ в различных клетках и тканях может существенно различаться. Например, если в животных клетках среди органических соединений преобладают белки, то в клетках растений — углеводы.

Макро- и микроэлементы

В живых организмах встречается около 80 химических элементов, однако только для 27 из этих элементов установлены их функции в клетке и организме. Остальные элементы присутствуют в незначительных количествах, и, по-видимому, попадают в организм с пищей, водой и воздухом.  В зависимости от концентрации их делят на 

макроэлементы и микроэлементы.

Концентрация каждого из макроэлементов в организме превышает 0,01 % , а их суммарное содержание — 99 %. К макроэлементам относят кислород, углерод, водород, азот, фосфор, серу, калий, кальций, натрий, хлор, магний и железо. Первые четыре из перечисленных элементов (кислород, углерод, водород и азот) называют также органогенными, поскольку они входят в состав основных органических соединений. Фосфор и сера также являются компонентами ряда органических веществ, например белков и нуклеиновых кислот. Фосфор необходим для формирования костей и зубов.

Без оставшихся макроэлементов невозможно нормальное функционирование организма.

Так, калий, натрий и хлор участвуют в процессах возбуждения клеток. Кальций входит в состав клеточных стенок растений, костей, зубов и раковин моллюсков, требуется для сокращения мышечных клеток и свертывания крови. Магний является компонентом хлорофилла — пигмента, обеспечивающего протекание фотосинтеза. Он также принимает участие в биосинтезе белка и нуклеиновых кислот. Железо входит в состав гемоглобина, и необходимо для функционирования многих ферментов.

 Микроэлементы содержатся в организме в концентрациях менее 0,01 % , а их суммарная концентрация в клетке не достигает и 0,1 %. К микроэлементам относятся цинк, медь, марганец, кобальт, йод, фтор и др.

Цинк входит в состав молекулы гормона поджелудочной железы — инсулина, медь требуется для процессов фотосинтеза и дыхания. Кобальт является компонентом витамина В12, отсутствие которого приводит к анемии. Йод необходим для синтеза гормонов щитовидной железы, обеспечивающих нормальное протекание обмена веществ, а фтор связан с формированием эмали зубов.

Как недостаток, так и избыток или нарушение обмена макро- и микроэлементов приводят к развитию различных заболеваний.

В частности, недостаток кальция и фосфора вызывают рахит, нехватка азота — тяжелую белковую недостаточность, дефицит железа — анемию, отсутствие йода — нарушение образования гормонов щитовидной железы и снижение интенсивности обмена веществ, уменьшение поступления фтора — кариес. Свинец токсичен почти для всех организмов.

Недостаток макро- и микроэлементов можно компенсировать путем увеличения их содержания в пище и питьевой воде, а также за счет приема лекарственных препаратов.

Химические элементы клетки образуют различные соединения — неорганические и органические.

Неорганические вещества

К неорганическим веществам клетки относятся вода, минеральные соли, кислоты и др.

Вода (Н2О) — наиболее распространенное неорганическое вещество клетки, обладающее уникальными физико-химическими свойствами. В теле взрослого человека ее в среднем 66 %, однако кости содержат около 20 % воды, печени — 70 %, а мозг — 86 %.

В клетке вода является растворителем, средой для протекания реакций, исходным веществом и продуктом химических реакций, выполняет транспортную и терморегуляторную функции, придает клетке упругость, обеспечивает тургор растительной клетки. Все вещества делятся на растворимые в воде (гидрофильные) и нерастворимые в ней (гидрофобные).

Минеральные соли могут находиться в растворенном или нерастворенном состояниях. Растворимые соли диссоциируют на ионы — катионы и анионы. Наиболее важными катионами являются ионы калия и натрия, облегчающие перенос веществ через мембрану и участвующие в возникновении и проведении нервного импульса, а также ионы кальция, которые принимают участие в процессах сокращения мышечных волокон и свертывании крови; магния, входящего в состав хлорофилла; железа, входящего в состав ряда белков, в том числе гемоглобина. Важнейшими анионами являются фосфат-анион, входящий в состав АТФ и нуклеиновых кислот, и остаток угольной кислоты, смягчающий колебания рН среды. Ионы минеральных солей обеспечивают проникновение самой воды в клетку и ее удержание в ней. Если в среде концентрация солей ниже, чем в клетке, то вода проникает в клетку. Также ионы определяют буферные свойства цитоплазмы, т. е. ее способность поддерживать постоянство слабощелочной рН цитоплазмы, несмотря на постоянное образование в клетке кислотных и щелочных продуктов.

Нерастворимые соли (CaCO3, Ca3(PO4)2 и др.) входят в состав костей, зубов, раковин и панцирей одноклеточных и многоклеточных животных.

Кроме того, в организмах могут вырабатываться и другие неорганические соединения, например кислоты и оксиды. Так, обкладочные клетки желудка человека вырабатывают соляную кислоту, которая активирует пищеварительный фермент пепсин, а оксид кремния пропитывает клеточные стенки хвощей и образует панцири диатомовых водорослей.

Органические вещества

К органическим веществам клетки относят углеводы, липиды, белки, нуклеиновые кислоты, АТФ, витамины и др. они могут быть представлены как относительно простыми молекулами, так и более сложными. В тех случаях, когда сложная молекула (макромолекула) образована значительным числом повторяющихся более простых молекул, ее называют полимером, а ее структурные единицы — мономерами. В зависимости от того, повторяются или нет звенья полимеров, их относят к регулярным или нерегулярным.

 Углеводы

Углеводы — это органические соединения, в состав которых входят в основном три химических элемента — углерод, водород и кислород, хотя целый ряд углеводов содержит также азот или серу.

Общая формула углеводов — Cm(H2O)n. Их делят на моно-, олиго- и полисахариды.

1) Моносахариды содержат единственную молекулу сахара, которую невозможно расщепить на более простые. Это кристаллические вещества, сладкие на вкус и хорошо растворимые в воде. Моносахариды принимают активное участие в обмене веществ в клетке и входят в состав сложных углеводов — олигосахаридов и полисахаридов.

Моносахариды классифицируют по количеству углеродных атомов (C3 — C9), например пентозы (C5) и гексозы (C6). К пентозам относятся рибоза и дезоксирибоза. Рибоза входит в состав РНК и АТФ. Дезоксирибоза является компонентом ДНК. Гексозы (С6Н12О6) — это глюкоза, фруктоза, галактоза и др. Глюкоза (виноградный сахар) встречается во всех организмах, в том числе в крови человека, поскольку является энергетическим резервом. Она входит в состав сахарозы, лактозы, мальтозы, крахмала, целлюлозы и др. 

Фруктоза (плодовый сахар) в наибольших концентрациях содержится в плодах, меде, корнеплодах сахарной свеклы. Она не только принимает активное участие в процессах обмена веществ, но и входит в состав сахарозы и некоторых полисахаридов, например инсулина.

2) К олигосахаридам относят углеводы, образованные несколькими остатками моносахаридов. Они в основном также хорошо растворимы в воде и сладки на вкус. В зависимости от количества этих остатков различают дисахариды (два остатка), трисахариды (три) и др.

К дисахаридам относятся сахароза, лактоза, мальтоза и др. Сахароза (свекловичный или тростниковый сахар) состоит из остатков глюкозы и фруктозы, она встречается в запасающих органах некоторых растений. Особенно много сахарозы в корнеплодах сахарной свеклы и сахарного тростника, откуда их получают промышленным способом. Она служит эталоном сладости углеводов. Лактоза (молочный сахар), образована остатками глюкозы и галактозы, содержится в материнском и коровьем молоке. Мальтоза (солодовый сахар) состоит из двух остатков глюкозы. Она образуется в процессе расщепления полисахаридов в семенах растений и в пищеварительной системе человека, используется при производстве пива.

3) Полисахариды — это биополимеры, мономерами которых являются остатки моно- или дисахаридов. Большинство полисахаридов нерастворимы в воде и несладкие на вкус. К ним относятся крахмал, гликоген, целлюлоза и хитин. Крахмал — это белое порошкообразное вещество, не смачиваемое водой, но образующее при заваривании горячей водой взвесь — клейстер. Мономером крахмала является глюкоза (рис. 3). Крахмал — основное запасное вещество растений, которое накапливается в запасающих органах растений. Качественной реакцией на крахмал является реакция с йодом, при которой он окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

Гликоген (животный крахмал) — это запасной полисахарид животных и грибов, который у человека в наибольших количествах накапливается в мышцах и печени. Мономером гликогена является глюкоза. По сравнению с молекулами крахмала молекулы гликогена более разветвлены.

Целлюлоза, или клетчатка, — основной опорный полисахарид растений. Мономером целлюлозы является глюкоза. Целлюлоза входит в состав клеточных стенок растений. Целлюлоза является основой древесины, она используется в строительстве, при производстве тканей, бумаги, спирта и многих органических веществ.

Хитин — это полисахарид, мономером которого является азотсодержащий моносахарид на основе глюкозы. Он входит в состав клеточных стенок грибов и панцирей членистоногих.

 Функции углеводов. Углеводы выполняют в клетке пластическую (строительную), энергетическую, запасающую и опорную функции. Энергетическая ценность расщепления 1 г углеводов составляет 17,2 кДж. Углеводы могут также входить в состав сложных липидов и белков, образуя гликолипиды и гликопротеины, в частности в клеточных мембранах.

Липиды

Липиды — это разнородная в химическом отношении группа низкомолекулярных веществ с гидрофобными свойствами. Данные вещества нерастворимы в воде, образуют в ней эмульсии, но при этом хорошо растворяются в органических растворителях. Липиды маслянисты на ощупь, многие из них оставляют на бумаге характерные невысыхающие следы.

В зависимости от строения молекулы липиды делят на простые и сложные. К простым липидам относятся нейтральные липиды (жиры), воски, стерины и стероиды. Сложные липиды содержат и другой, нелипидный компонент. Наиболее важными из них являются фосфолипиды и гликолипиды.

 Жиры являются производными трехатомного спирта глицерина и высших жирных кислот. Среди жирных кислот есть как насыщенные, так и ненасыщенные, то есть содержащие двойные связи.

Из насыщенных жирных кислот чаще всего встречаются пальмитиновая и стеариновая, а из ненасыщенных — олеиновая. Некоторые ненасыщенные жирные кислоты не синтезируются в организме человека или синтезируются в недостаточном количестве, и поэтому являются незаменимыми. Остатки глицерина образуют гидрофильные «головки», а остатки жирных кислот — «хвосты». Жиры растений большей частью содержат ненасыщенные жирные кислоты, вследствие чего они являются жидкими и называются маслами. Масла содержатся в семенах многих растений, таких как подсолнечник, соя, рапс и др.

Воски — это сложные смеси жирных кислот и жирных спиртов. У растений они образуют пленку на поверхности листа, которая защищает от испарения, проникновения возбудителей заболеваний и т. п. У ряда животных они также покрывают тело или служат для построения сот.

К стеринам относятся такой липид, как витамин D, и холестерол — обязательный компонент клеточных мембран, а к стероидам — половые гормоны: эстрадиол, тестостерон и др.

Фосфолипиды, помимо остатков глицерина и жирных кислот, содержат остаток ортофосфорной кислоты. Они входят в состав клеточных мембран и обеспечивают их барьерные свойства.

Гликолипиды также являются компонентами мембран, но их содержание там невелико. Нелипидной частью гликолипидов являются углеводы.

 Функции липидов. Липиды выполняют в клетке пластическую (строительную), энергетическую, запасающую, защитную и регуляторную функции. При расщеплении 1 г липидов выделяется 38,9 кДж энергии. Они откладываются в запас в различных органах растений и животных. Подкожная жировая клетчатка защищает внутренние органы животных от переохлаждения или перегревания, от ударов, а у водных животных — еще и повышает плавучесть. Регуляторная функция липидов связана с тем, что некоторые из них являются гормонами.

Белки

 Белки — это высокомолекулярные соединения, биополимеры, мономерами которых являются аминокислоты, связанные пептидными связями. Аминокислотой называют органическое соединение, имеющее аминогруппу, карбоксильную группу и радикал. В состав белка могут входить 20 аминокислот, которые различаются радикалами. Аминокислоты делят на заменимые и незаменимые.

 Заменимые аминокислоты, образуются в организме человека в необходимом количестве, а незаменимые должны поступать с пищей, но могут частично синтезироваться микроорганизмами кишечника. Полностью незаменимых аминокислот насчитывается 8: валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан и фенилаланин.

Последовательность из двух аминокислот, связанных пептидными связями, называется дипептидом, из трех — трипептидом и т. д. Среди пептидов встречаются такие важные соединения, как гормоны (окситоцин, вазопрессин), антибиотики и др. Цепочка из более чем двадцати аминокислот называется полипептидом, а полипептиды, содержащие более 60 аминокислотных остатков, — это белки.

Уровни структурной организации белка. Белки могут иметь первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Третичная структура характерна для большинства белков организма, например миоглобина мышц.

По форме молекулы различают фибриллярные и глобулярные белки. Первые из них вытянуты, как, например, коллаген соединительной ткани или кератины волос и ногтей. Глобулярные же белки имеют форму клубка (глобулы), как миоглобин мышц.

Простые и сложные белки. Простые белки состоят только из аминокислот, тогда как сложные белки (липопротеины, хромопротеины, гликопротеины, нуклеопротеины и др.) содержат белковую и небелковую части. Хромопротеины содержат окрашенную небелковую часть. К ним относятся гемоглобин, миоглобин, хлорофилл, цитохромы и др. Небелковой частью липопротеинов является липид, а гликопротеинов — углевод. Как липопротеины, так и гликопротеины входят в состав клеточных мембран. Нуклеопротеины представляют собой комплексы белков и нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Они выполняют важнейшие функции в процессах хранения и передачи наследственной информации.

Свойства белков. Многие белки хорошо растворимы в воде, однако есть среди них и такие, которые растворяются только в растворах солей, щелочей, кислот или органических растворителях. Структура молекулы белка и его функциональная активность зависят от условий окружающей среды. Утрата белковой молекулой своей структуры, вплоть до первичной, называется денатурацией. Она происходит вследствие изменения температуры, рН, атмосферного давления, под действием кислот, щелочей, солей тяжелых металлов, органических растворителей и т. п. Обратный процесс восстановления вторичной и более высоких структур называется ренатурацией, однако он не всегда возможен. Полное разрушение белковой молекулы называется деструкцией.

 Функции белков. Белки выполняют в клетке ряд функций: пластическую (строительную), каталитическую (ферментативную), энергетическую, сигнальную (рецепторную), сократительную (двигательную), транспортную, защитную, регуляторную и запасающую.

Энергетическая ценность 1 г белка составляет 17,2 кДж. Белки-рецепторы мембран принимают активное участие в восприятии сигналов окружающей среды и их передаче по клетке. Без белков невозможно движение клеток и организмов в целом, так как они составляют основу жгутиков и ресничек, а также обеспечивают сокращение мышц и перемещение внутриклеточных компонентов. В крови человека и многих животных белок гемоглобин переносит кислород и часть углекислого газа, другие белки транспортируют ионы и электроны. Защитная роль белков связана, в первую очередь, с иммунитетом, поскольку белок интерферон способен уничтожать многие вирусы, а белки-антитела подавляют развитие бактерий и иных чужеродных агентов. Среди белков и пептидов немало гормонов, например, гормон поджелудочной железы инсулин, регулирующий концентрацию глюкозы в крови. У некоторых организмов белки могут откладываться в запас, как в семенах бобовых, или белки куриного яйца.

Нуклеиновые кислоты

Нуклеиновые кислоты — это биополимеры, мономерами которых являются нуклеотиды. В настоящее время известно два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая (РНК) и дезоксирибонуклеиновая (ДНК).

Нуклеотид образован азотистым основанием, остатком сахара-пентозы и остатком ортофосфорной кислоты. Особенности нуклеотидов в основном определяются азотистыми основаниями, входящими в их состав, поэтому даже условно нуклеотиды обозначаются по первым буквам их названий. В состав нуклеотидов могут входить пять азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), урацил (У) и цитозин (Ц). Пентозы нуклеотидов — рибоза и дезоксирибоза — определяют, какой нуклеотид будет образован — рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид. Рибонуклеотиды являются мономерами РНК, могут выступать в качестве сигнальных молекул (цАМФ) и входить в состав макроэргических соединений, например АТФ, и коферментов, таких как НАДФН + Н+, НАДН + Н+, ФАДН2 и др., а дезоксирибонуклеотиды входят в состав ДНК.

 Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — двухцепочечный биополимер, мономерами которого являются дезоксирибонуклеотиды. В состав дезоксирибонуклеотидов входят только четыре азотистых основания из пяти возможных — аде-нин (А), тимин (Т), гуанин (Г) и цитозин (Ц), а также остатки дезоксирибозы и ортофосфорной кислоты. Нуклеотиды в цепи ДНК соединяются между собой через остатки ортофосфорной кислоты, образуя фосфодиэфирную связь.Ц) (рис. 14). Для нее были установлены правила Чаргаффа.

Структура ДНК была расшифрована Ф. Криком и Д. Уотсоном. Согласно их модели третичная структура молекулы ДНК представляет собой правозакрученную двойную спираль. Расстояние между нуклеотидами в цепи ДНК равно 0,34 нм.

Основной функцией ДНК является хранение и передача наследственной информации, которая записана в виде последовательностей нуклеотидов.

ДНК эукариотических клеток сосредоточена в ядре, митохондриях и пластидах, а прокариотических — находится прямо в цитоплазме. Ядерная ДНК является основой хромосом, она представлена незамкнутыми молекулами. ДНК митохондрий, пластид и прокариот имеет кольцевую форму.

Рибонуклеиновая кислота (РНК) — биополимер, мономерами которого являются рибонуклеотиды. Они содержат также четыре азотистых основания — аденин (А), урацил (У), гуанин (Г) и цитозин (Ц), отличаясь тем самым от ДНК по одному из оснований (вместо тимина в РНК встречается урацил). Остаток сахара-пентозы в рибонуклеотидах представлен рибозой. РНК — в основном одноцепочечные молекулы, за исключением некоторых вирусных. Выделяют три основных типа РНК: информационные, или матричные (иРНК, мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все они образуются в процессе транскрипции — переписывания с молекул ДНК.

 иРНК составляют наименьшую фракцию РНК в клетке (2—4 %). Они являются матрицами для синтеза полипептидных цепей. Информация о структуре белка записана в них в виде последовательностей нуклеотидов, причем каждую аминокислоту кодирует триплет нуклеотидов — кодон.

 рРНК представляют собой наиболее многочисленный тип РНК в клетке (до 80 °%). Они образуются в ядрышках и входят в состав клеточных органоидов — рибосом.

 тРНК — наименьшие из молекул РНК, так как содержат всего 73—85 нуклеотидов. Их доля от общего количества РНК клетки составляет около 16 °%. Функция тРНК — транспорт аминокислот к месту синтеза белка (на рибосомы). Вторичная структура молекулы тРНК напоминает листок клевера. На одном из концов молекулы находится участок для прикрепления аминокислоты, а в одной из петель — триплет нуклеотидов, комплементарный кодону иРНК и определяющий, какую именно аминокислоту будет переносить тРНК — антикодон (рис. 16).

Все типы РНК принимают активное участие в процессе реализации наследственной информации, которая с ДНК переписывается на иРНК, а на последней осуществляется синтез белка. тРНК в процессе синтеза белка доставляет аминокислоты к рибосомам, а рРНК входит в состав непосредственно рибосом.

Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) — это нуклеотид, содержащий, помимо азотистого основания аденина и остатка рибозы, три остатка фосфорной кислоты. Связи между остатками фосфорной кислоты — макроэргические (при расщеплении выделяется 42 кДж/ моль энергии, тогда как стандартная химическая связь при расщеплении дает 12 кДж/моль).

При необходимости макроэргическая связь АТФ расщепляется с образованием аденозиндифосфорной кислоты (АДФ), фосфорного остатка и выделением энергии:

АТФ + Н2О → АДФ + H3PO4 + 42 кДж.

 АДФ также может расщепляться с образованием АМФ (аденозинмонофосфорной кислоты) и остатка фосфорной кислоты:

 АДФ + Н2О → АМФ + H3PO4 + 42 кДж.

 В процессе энергетического обмена (при дыхании, брожении), а также в процессе фотосинтеза АДФ присоединяет фосфорный остаток и превращается в АТФ. Реакция восстановления АТФ называется фосфорилированием. АТФ является универсальным источником энергии для всех процессов жизнедеятельности живых организмов.

Химический состав клетки реферат по биологии

Опорный конспект по теме: «Химический состав клетки» В микроскопической клетке содержится несколько тысяч веществ, которые участвуют в разнообразных химических реакциях. Соединения в % Не органические органические Вода 70-80 белки 10-20 Неорганические вещества 1.0-1.5 углеводы 0.2-2.0 Жиры 1-5 Нуклеиновые кислоты 1.0-2.0 АТФ и другие низкомолекулярные органические вещества 0.1-0.5 I. Неорганические вещества 1. ВОДА. А. Вода — важнейший компонент клетки. Ей принадлежит существенная и многообразная роль в жизни клетки. • Вода определяет физические свойства клетки – объём, упругость. • Велико значение в образовании структуры молекул органических веществ, в частности, белков. • Велико значение воды как растворителя. • Является непосредственным участником многих химических реакций. В. Вещества растворимые в воде гидрофильные (от греческого «гидрос» — вода, «филео» — любовь). — спирты, амины, углеводы, белки, соли, низкокалорийные органические вещества и др.). нерастворимые в воде гидрофобные (от греческого «гидрос» – вода, «фобос» – страх, ненависть). -жиры, клетчатка. 2. СОЛИ. А. Для процессов жизнедеятельности из входящих в состав солей катионов наиболее важны: К+, Na+, Ca2+, Mg2+ из анионов: 0 0 4 FHP 4²ˉ, h3PO4ˉ, Clˉ, HCO3ˉ В. Концентрация катионов и анионов в клетке и в среде её обитания, как правило, резко различна. Так, внутри клетки всегда довольно высокая концентрация ионов калия и очень малая ионов натрия. Напротив, в окружающей среде – в плазме крови, в морской воде – мало ионов калия и много ионов натрия. Пока клетка жива, это соотношение ионов внутри и вне клетки стойко поддерживается. С. Неорганические вещества содержаться в клетке не только в растворённом, но и в твёрдом состоянии. В частности, прочность и твёрдость костной ткани обеспечивается фосфатом кальция, а раковин моллюсков – карбонатом кальция. II. Органические вещества 1. Белки. Из органических веществ клетки на первом месте по количеству и значению стоят белки. В состав входят атомы углерода, водорода, кислорода, азота, а также Me- Fe, Zn, Cu. Белкам присуща огромная мон. масса. Строение белков Среди органических соединений белки самые сложные. Они относятся к соединениям называемым полимерами. Её мономером являются нуклеотиды, состоящие нуклеиновые кислоты, т.е. первичная структура белка – это последовательное соединение аминокислот, остающееся за счёт образования пептидной связи. Вторичное строение белка- это закрученная в спираль полипептидная цепочка. Третичная структура белка- пространственное расположение закрученной в спираль полипептидной цепочки. Четвертичная структура белка- существует в белках, в состав молекул которых входит более одной полипептидной цепочки. Свойства и функции белков Свойства: 1. Существуют белки совершенно нерастворимые в воде. 2. Малоактивные и химически устойчивые к воздействию агентов 3. Есть белки, имеющие вид нитей или молекулы в виде жирков диаметром 5-7мм. Под влиянием различных физических и химических факторов (высокой t°, ряда Функции: 1. Строительная. Из белков состоят мембраны клеток и клеточных органоидов. 2. Каталитическая. Они ускоряют реакции в десятки, сотни, млн. раз 3. Сигнальная. В поверхностную мембрану клетки встроены молекулы белков, химических веществ, облучения, механического воздействия) слабые связи, поддерживающие вторичное и третичное строение белка – рвутся и молекула развёртывается. Нарушение природного строения белка называется денатурацией. способных изменять своё третичное строение в ответ на действие факторов внешней среды. 4. Двигательная. Все виды движения, к которым способны клетки, выполняют особые сократительные белки. 5. Транспортная. Способны присоединять различные вещества и переносить их из одного места в другое. 6. Защитная 7. Энергетическая. При расщеплении 1г. белка освобождается 17,6 кДЖ 2. Углеводы. Представляю собой сложные органические соединения, в их состав входят атомы углерода, кислорода, водорода. Сложные – полимеры с мономерами в виде моносахаридов (глюкоза, рибоза, дезоксирибоза). Биологическая роль • Играют роль источника энергии. При расщеплении углевода освобождается 17,6 кДЖ • Выполняют строительную функцию: из целлюлозы сост. Стенки растительных клеток. 3. Липиды. Представляют собой органические вещества, нерастворимые в воде, но растворимые в бензине, эфире, ацетоне. Из липидов самые распространенные и известные жиры, а также лецитин, холестерин и витамины А, D и гормоны. Биологическое значение велико и многообразно • Строительная функция • Энергетическая функция (жир) • Источник воды • Защитная функция ( низкая теплопроводность) 4. Нуклеиновые кислоты – ДНК, РНК, АТФ. ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота РНК рибонуклеиновая кислота АТФ аденозинтрифосфорная кислота 1. Молекула ДНК – представляет собой две спирали замкнутые одна вокруг другой. ДНК содержится в ядре клетки, в митохондриях и хлоропластах. И является носителем наследственности. 2.Полимер состоит из монополимеров- нуклеотидов: остатки фосфорной кислоты, дезоксирибоза, азотистое основание (аденин + тимин) (цитозин + гуанин) Односпиральная молекула, нуклеотид состоит из: рибозы, остатков фосфорной кислоты, азотистого основания (аденин гуанин, цитозин, урацил). Более короткая молекула. Находится в ядре, цитоплазме и митохондриях. Виды РНК: • Транспортные РНК (т-РНК) связывают аминокислоты и транспортируют их к месту синтеза белка. • Информационные (и-РНК). Переносят информацию о структуре белка от ДНК к месту синтеза белка. • Рибосомные РНК (р-РНК) Входят в состав рибосом По химическому строение относится к нуклеотидам, состоящим из трёх остатков фосфорной кислоты, рибозы и остатков азотистого основания (аденина). АТФ играет центральную роль в энергетическом обмене клетки. Является непосредственным источников энергообеспечения любой клеточной функции. Под влиянием специфических ферментов она подвергается гидролизу. Эта реакция сопровождается освобождением энергии.

10. Химический состав клетки (белки, их структура и функции).

Белки, или протеины, составляюи ри 50 до 85% органических соединений, входящих в состав живых организмов. Во всех тканях любых существ важнейшей частью являются белки. Они входят в состав всех клеток, клеточных органоидов и межклеточных жидкостей. Основными элементами белка являются: кислород, водород, азот и сера. Кроме того, в их состав могут входить фосфор, железо, магний и другие. Молекула белка — типичный полимер, она состоит из аминокислот. При соединении аминокислот в молекуле белка образуется химическая связь между карбоксильной группой аминокислоты и аминной группой другой. Связь которая образуется между молекулами аминокислота, называется пептидной. Белки имеют 4 структуры белка: Первичной структурой белковой молекулы является полипептидная цепь. Внутримолекулярные силы заставляют цепь изгибаться – возникает вторичная структура. Молекула белка бывает складчатой и спиральной. Складчатая структура при этом характерна для белков с низким метаболизмом. Большинству белковых молекул присуща третичная структура, получавшая название третичной. Полипептидные цепи скручиваются, образуя глобулу. Группы белковых молекул образуют устойчивые комплексы, которые называются четвертичными структурными. Функции белков. В клетке белки выполняют структурную, сократительную. Ферментативную функции. Структурная функция выражается в том, что белки – основной строительный материал цитоплазмы, наружной и внутренней мембран – входят в состав хромосом и других органоидов клетки. Сократительная функция обеспечивает одно из основных свойств жизни – явления раздражительности и движения. С ферментативной функцией белков связано то, что они катализируюи все реакции, протекающие в организме.

11. Нуклеиновые кислоты, их строение, локализация, значение

Простейшие нуклеиновые кислоты – мононуклеотиды. Более сложные нуклеиновые кислоты состоят из двух или более нуклеотидов – полинуклеотиды. В состав нуклеиновых кислот входят углерод, кислород, водород, азот и фосфор. Известны 2 типа нуклеиновых кислот: ДНК и РНК. Они отличаются и строением и биологическими свойствами. ДНК и РНК в клетке имеют различную локализацию. ДНК имеется в ядре, входит в состав хроматина, сосредоточена в хромосомах, имеется внутри митохондрий и пластид. В ядре ДНК вступает соединение с гистонами и протаминами, образуя нуклепротеиды. Основные хранители РНК – ядрышки, находящиеся в ядре, и рибосомы, расположенные в цитоплазме. Кроме того, РНК находится в гиалоплазме. В состав нуклеотида входит молекула фосфорной кислоты, моносахарида и 4 азотистых оснований: Аденин, Гуанин, Цитозин, Тимин или Урацил. РНК содержит моносахарид рибозу, в то время как в состав ДНК входит дезоксирибоза. Азотистые основания аденин, гуанин, цитозин есть в составе как ДНК, так и РНК, но тимин входит в состав ДНК, а урацил – в состав РНК. С нуклеиновыми кислотами связаны процессы синтеза белка, а этим в свою очередь определяется характер обмена веществ, закономерности роста и развития, явления наследственности и изменчивости.

12. Роль ДНК и РНК в передаче наследственной информации. Основные этапы: транскрипция, процессинг, трансляция. Главную роль в процессе передачи и реализации наследственной информации играют нуклеиновые кислоты. Основная биологическая функция ДНК заключается в хранении, постоянном самовозобновлении, самовоспроизведении и передаче генетической информации клетке. Информация хранится в последовательности нуклеотидов. Эта последовательность нуклеотидов, или генетический код, контролирует последовательность аминокислот в молекуле белка. ДНК является матрицей для построения иРНК. ДНК принимает участие только в одном этапе биосинтеза белка: транскрипции. Транскрипция – процесс переноса генетического кода, записанного на молекуле ДНК на молекулу иРНК. Транскрипция происходит при синтезе молекул иРНК, нуклеотиды которой присоединяются к нуклеотидам ДНК по принципу комплементарности. Молекула иРНК снимается с ДНК, как с матрицы, после чего она отделяется и перемещается в цитоплазму, где в специальных органоидах – рибосомах происходит процесс трансляции. Непосредственное участие в синтезе белка принимает иРНК. Биологическая роль иРНК связана преимущественно синтезом белка, т.е. реализацией наследственной информации. Именно РНК является посредником между ДНК и строящейся в клетке белковой молекулой. Выделяют иРНК, тРНК и рРНК. иРНК обеспечивает перенос информации о структуре белка от молекулы ДНК в рибосомы, где синтезируется белок. рРНК содержится в рибосомах и участвует в синтезе белка. тРНК доставляет аминокислоты к месту синтеза белка, т.е. к рибосомам. Трансляция – процесс перевода генетической информации, записанной на иРНК в структуру белковой молекулы, синтезируемой на рибосомах при участии тРНК. На иРНК генетический код записан «языком» триплетов нуклеотидов. Они передают информацию только тем тРНК, кодовый триплет которых комплементарен триплету иРНК. При образовании связи между кодовыми триплетами происходит передача информации и аминокислота присоединяется к цепочке белковой молекулы.

Компоненты и структура | Безграничная биология

Компоненты плазменных мембран

Плазматическая мембрана защищает клетку от внешней среды, опосредует клеточный транспорт и передает клеточные сигналы.

Цели обучения

Опишите функцию и компоненты плазматической мембраны

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Основными компонентами плазматической мембраны являются липиды (фосфолипиды и холестерин), белки и углеводы.
  • Плазматическая мембрана защищает внутриклеточные компоненты от внеклеточной среды.
  • Плазматическая мембрана опосредует клеточные процессы, регулируя материалы, входящие и выходящие из клетки.
  • Плазматическая мембрана несет маркеры, которые позволяют клеткам узнавать друг друга и могут передавать сигналы другим клеткам через рецепторы.
Ключевые термины
  • плазматическая мембрана : полупроницаемый барьер, окружающий цитоплазму клетки.
  • рецептор : белок на клеточной стенке, который связывается с определенными молекулами, чтобы они могли всасываться в клетку.

Структура плазменных мембран

Плазматическая мембрана (также известная как клеточная мембрана или цитоплазматическая мембрана) — это биологическая мембрана, которая отделяет внутреннюю часть клетки от внешней среды.

Основная функция плазматической мембраны — защищать клетку от окружающей среды. Плазматическая мембрана, состоящая из фосфолипидного бислоя со встроенными белками, избирательно проницаема для ионов и органических молекул и регулирует перемещение веществ в клетки и из них.Плазменные мембраны должны быть очень гибкими, чтобы определенные клетки, такие как эритроциты и белые кровяные тельца, могли изменять форму при прохождении через узкие капилляры.

Плазматическая мембрана также играет роль в закреплении цитоскелета, чтобы придать форму клетке, и в прикреплении к внеклеточному матриксу и другим клеткам, помогая группировать клетки вместе для образования тканей. Мембрана также поддерживает клеточный потенциал.

Короче говоря, если ячейка представлена ​​замком, плазматическая мембрана — это стена, которая обеспечивает структуру для зданий внутри стены, регулирует, какие люди покидают и входят в замок, и передает сообщения в соседние замки и из них.Подобно тому, как дыра в стене может стать катастрофой для замка, разрыв плазматической мембраны заставляет клетку лизироваться и погибать.

Плазматическая мембрана : Плазматическая мембрана состоит из фосфолипидов и белков, которые создают барьер между внешней средой и клеткой, регулируют транспортировку молекул через мембрану и связываются с другими клетками через белковые рецепторы.

Плазменная мембрана и клеточный транспорт

Движение вещества через избирательно проницаемую плазматическую мембрану может быть «пассивным» —i.е., происходящий без ввода клеточной энергии — или «активный» — то есть его транспортировка требует от клетки расходовать энергию.

Клетка задействует ряд транспортных механизмов, в которых задействованы биологические мембраны:

  1. Пассивный осмос и диффузия: переносит газы (например, O 2 и CO 2) и другие небольшие молекулы и ионы
  2. Трансмембранные белковые каналы и переносчики: транспортирует небольшие органические молекулы, такие как сахара или аминокислоты
  3. Эндоцитоз: переносит большие молекулы (или даже целые клетки), поглощая их
  4. Экзоцитоз: удаляет или выделяет такие вещества, как гормоны или ферменты

Плазменная мембрана и клеточная сигнализация

Одной из наиболее сложных функций плазматической мембраны является ее способность передавать сигналы через сложные белки.Эти белки могут быть рецепторами, которые работают как приемники внеклеточных входов и как активаторы внутриклеточных процессов, или маркерами, которые позволяют клеткам узнавать друг друга.

Мембранные рецепторы обеспечивают внеклеточные сайты прикрепления для эффекторов, таких как гормоны и факторы роста, которые затем запускают внутриклеточные ответы. Некоторые вирусы, такие как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), могут захватывать эти рецепторы, чтобы проникнуть в клетки, вызывая инфекции.

Мембранные маркеры позволяют клеткам узнавать друг друга, что жизненно важно для клеточных сигнальных процессов, влияющих на формирование тканей и органов на раннем этапе развития.Эта функция маркирования также играет более позднюю роль в различении иммунного ответа «я» — «не-я». Белки-маркеры на эритроцитах человека, например, определяют группу крови (A, B, AB или O).

Жидкая мозаика Модель

Модель жидкой мозаики описывает структуру плазматической мембраны как мозаику из фосфолипидов, холестерина, белков и углеводов.

Цели обучения

Описание жидкой мозаичной модели клеточных мембран

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Основная ткань мембраны состоит из амфифильных или двойных молекул фосфолипидов.
  • Интегральные белки, второй основной компонент плазматических мембран, полностью интегрированы в структуру мембраны, их гидрофобные области, охватывающие мембрану, взаимодействуют с гидрофобной областью фосфолипидного бислоя.
  • Углеводы, третий главный компонент плазматических мембран, всегда находятся на внешней поверхности клеток, где они связаны либо с белками (образуя гликопротеины), либо с липидами (образуя гликолипиды).
Ключевые термины
  • амфифильный : имеющий одну поверхность, состоящую из гидрофильных аминокислот, и противоположную поверхность, состоящую из гидрофобных (или липофильных) аминокислот.
  • гидрофильный : обладает сродством к воде; может впитывать или намокать водой, «водолюбив».
  • гидрофобный : отсутствие сродства к воде; не может впитывать или намокать водой, «боится воды».

Модель жидкой мозаики была впервые предложена С.Дж. Сингер и Гарт Л. Николсон в 1972 году объяснили структуру плазматической мембраны. Модель со временем несколько эволюционировала, но она по-прежнему лучше всего объясняет структуру и функции плазматической мембраны в том виде, в каком мы их теперь понимаем.Модель жидкой мозаики описывает структуру плазматической мембраны как мозаику компонентов, включая фосфолипиды, холестерин, белки и углеводы, что придает мембране жидкий характер. Плазменные мембраны имеют толщину от 5 до 10 нм. Для сравнения, красные кровяные тельца человека, видимые с помощью световой микроскопии, имеют ширину примерно 8 мкм, или примерно в 1000 раз шире плазматической мембраны. Соотношение белков, липидов и углеводов в плазматической мембране зависит от типа клетки.Например, миелин содержит 18% белка и 76% липидов. Внутренняя мембрана митохондрий содержит 76% белка и 24% липидов.

Компоненты и функции плазматической мембраны : Основными компонентами плазматической мембраны являются липиды (фосфолипиды и холестерин), белки и углеводы, связанные с некоторыми липидами и некоторыми белками.

Жидкая мозаичная модель плазматической мембраны : Жидкая мозаичная модель плазматической мембраны описывает плазматическую мембрану как жидкую комбинацию фосфолипидов, холестерина и белков.Углеводы, прикрепленные к липидам (гликолипидам) и белкам (гликопротеинам), выходят из обращенной наружу поверхности мембраны.

Основная ткань мембраны состоит из амфифильных или двойных молекул фосфолипидов. Гидрофильные или водолюбивые области этих молекул контактируют с водной жидкостью как внутри, так и снаружи клетки. Гидрофобные или ненавидящие воду молекулы обычно неполярны. Молекула фосфолипида состоит из трехуглеродного глицеринового остова с двумя молекулами жирных кислот, присоединенными к атомам углерода 1 и 2, и фосфатсодержащей группой, присоединенной к третьему атому углерода.Такое расположение дает всей молекуле область, описываемую как ее голова (фосфатсодержащая группа), которая имеет полярный характер или отрицательный заряд, и область, называемую хвостом (жирные кислоты), которая не имеет заряда. Они взаимодействуют с другими неполярными молекулами в химических реакциях, но обычно не взаимодействуют с полярными молекулами. При помещении в воду гидрофобные молекулы имеют тенденцию образовывать шар или кластер. Гидрофильные области фосфолипидов имеют тенденцию к образованию водородных связей с водой и другими полярными молекулами как снаружи, так и внутри клетки.Таким образом, поверхности мембраны, обращенные внутрь и снаружи клетки, являются гидрофильными. Напротив, середина клеточной мембраны гидрофобна и не взаимодействует с водой. Следовательно, фосфолипиды образуют превосходную двухслойную липидную клеточную мембрану, которая отделяет жидкость внутри клетки от жидкости вне клетки.

Агрегация фосфолипидов : В водном растворе фосфолипиды имеют тенденцию располагаться так, чтобы их полярные головки были обращены наружу, а их гидрофобные хвосты были обращены внутрь.

Структура молекулы фосфолипида : Эта молекула фосфолипида состоит из гидрофильной головки и двух гидрофобных хвостов. Гидрофильная головная группа состоит из фосфатсодержащей группы, присоединенной к молекуле глицерина. Гидрофобные хвосты, каждый из которых содержит насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту, представляют собой длинные углеводородные цепи.

Белки составляют второй основной компонент плазматических мембран. Интегральные белки (некоторые специализированные типы называются интегринами), как следует из их названия, полностью интегрированы в структуру мембраны, и их гидрофобные области, охватывающие мембрану, взаимодействуют с гидрофобной областью фосфолипидного бислоя.Однопроходные интегральные мембранные белки обычно имеют гидрофобный трансмембранный сегмент, состоящий из 20-25 аминокислот. Некоторые охватывают только часть мембраны, соединяясь с одним слоем, в то время как другие простираются от одной стороны мембраны к другой и открываются с обеих сторон. Некоторые сложные белки состоят из до 12 сегментов одного белка, которые сильно свернуты и встроены в мембрану. Этот тип белка имеет гидрофильную область или области и одну или несколько умеренно гидрофобных областей.Такое расположение областей белка имеет тенденцию ориентировать белок рядом с фосфолипидами, при этом гидрофобная область белка прилегает к хвостам фосфолипидов, а гидрофильная область или области белка выступают из мембраны и контактируют с цитозолем или внеклеточной жидкости.

Структура интегральных мембранных белков : Интегральные мембранные белки могут иметь одну или несколько альфа-спиралей, охватывающих мембрану (примеры 1 и 2), или они могут иметь бета-листы, которые охватывают мембрану (пример 3).

Углеводы — третий важный компонент плазматических мембран. Они всегда находятся на внешней поверхности клеток и связаны либо с белками (образуя гликопротеины), либо с липидами (образуя гликолипиды). Эти углеводные цепи могут состоять из 2–60 моносахаридных единиц и могут быть прямыми или разветвленными. Наряду с периферическими белками углеводы образуют на поверхности клетки специализированные участки, которые позволяют клеткам узнавать друг друга. Эта функция распознавания очень важна для клеток, поскольку позволяет иммунной системе различать клетки тела (называемые «самими») и чужеродные клетки или ткани (называемые «чужими»).Подобные типы гликопротеинов и гликолипидов находятся на поверхности вирусов и могут часто меняться, не позволяя иммунным клеткам распознавать их и атаковать их. Эти углеводы на внешней поверхности клетки — углеводные компоненты как гликопротеинов, так и гликолипидов — вместе называются гликокаликсом (что означает «сахарное покрытие»). Гликокаликс очень гидрофильный и привлекает большое количество воды к поверхности клетки. Это помогает во взаимодействии клетки с водной средой и в способности клетки получать вещества, растворенные в воде.

Текучесть мембраны

Мозаичный характер мембраны, ее фосфолипидный химический состав и присутствие холестерина способствуют текучести мембраны.

Цели обучения

Объясните функцию текучести мембран в структуре клеток

Основные выводы

Ключевые моменты
  • Мембрана жидкая, но также довольно жесткая и может лопнуть при проникновении внутрь или при попадании в ячейку слишком большого количества воды.
  • Мозаичный характер плазматической мембраны позволяет очень тонкой игле легко проникать в нее, не вызывая ее разрыва, и позволяет ей самоуплотняться при извлечении иглы.
  • Если насыщенные жирные кислоты сжимаются при понижении температуры, они давят друг на друга, образуя плотную и довольно жесткую мембрану.
  • Если ненасыщенные жирные кислоты сжимаются, «изгибы» на их хвостах отталкивают соседние молекулы фосфолипидов, что помогает поддерживать текучесть мембраны.
  • Соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот определяет текучесть мембраны при низких температурах.
  • Холестерин действует как буфер, препятствуя снижению текучести при низких температурах и препятствуя повышению текучести при высоких температурах.
Ключевые термины
  • фосфолипид : любой липид, состоящий из диглицерида в сочетании с фосфатной группой и простой органической молекулой, такой как холин или этаноламин; они являются важными составляющими биологических мембран
  • текучесть : мера степени текучести чего-либо. Величина, обратная его вязкости.

Мембранная текучесть

Есть несколько факторов, которые приводят к текучести мембраны.Во-первых, мозаичность мембраны помогает плазматической мембране оставаться жидкой. Интегральные белки и липиды существуют в мембране как отдельные, но слабо связанные молекулы. Мембрана не похожа на воздушный шар, который может расширяться и сжиматься; скорее, он довольно жесткий и может лопнуть, если в него проникнуть или если ячейка впитает слишком много воды. Однако из-за своей мозаичности очень тонкая игла может легко проникнуть в плазматическую мембрану, не вызывая ее разрыва; мембрана будет течь и самоуплотняться при извлечении иглы.

Текучесть мембраны : плазматическая мембрана представляет собой жидкую комбинацию фосфолипидов, холестерина и белков. Углеводы, прикрепленные к липидам (гликолипидам) и белкам (гликопротеинам), выходят из обращенной наружу поверхности мембраны.

Второй фактор, который приводит к текучести, — это природа самих фосфолипидов. В своей насыщенной форме жирные кислоты в фосфолипидных хвостах насыщены связанными атомами водорода; между соседними атомами углерода нет двойных связей.В результате хвосты получаются относительно прямыми. Напротив, ненасыщенные жирные кислоты не содержат максимальное количество атомов водорода, хотя они действительно содержат некоторые двойные связи между соседними атомами углерода; двойная связь приводит к изгибу цепочки атомов углерода примерно на 30 градусов. Таким образом, если насыщенные жирные кислоты с их прямыми хвостами сжимаются при понижении температуры, они давят друг на друга, образуя плотную и довольно жесткую мембрану. Если ненасыщенные жирные кислоты сжаты, «изгибы» в своих хвостах отталкивают соседние молекулы фосфолипидов, сохраняя некоторое пространство между молекулами фосфолипидов.Это «локальное пространство» помогает поддерживать текучесть мембраны при температурах, при которых мембраны с хвостами насыщенных жирных кислот в их фосфолипидах «замерзают» или затвердевают. Относительная текучесть мембраны особенно важна в холодных условиях. Холодная среда имеет тенденцию сжимать мембраны, состоящие в основном из насыщенных жирных кислот, что делает их менее текучими и более восприимчивыми к разрыву. Многие организмы (например, рыба) способны адаптироваться к холоду, изменяя долю ненасыщенных жирных кислот в своих мембранах в ответ на понижение температуры.

У животных третьим фактором, удерживающим мембранную жидкость, является холестерин. Он находится рядом с фосфолипидами в мембране и имеет тенденцию ослаблять воздействие температуры на мембрану. Таким образом, холестерин действует как буфер, не позволяя более низким температурам препятствовать текучести и предотвращая чрезмерное повышение текучести при высоких температурах. Холестерин расширяет в обоих направлениях диапазон температур, при котором мембрана является соответственно текучей и, следовательно, функциональной.Холестерин также выполняет другие функции, такие как организация кластеров трансмембранных белков в липидные рафты.

Biology4Kids.com: Структура клетки



Все живые организмы на Земле разделены на клеток, . Основная концепция теории клеток состоит в том, что клетки являются основной структурной единицей для всех организмов. Клетки — это небольшие отсеки, в которых находится биологическое оборудование, необходимое для поддержания жизни и благополучия организма.Живые существа могут быть одноклеточными или очень сложными, например, человек.

Есть более мелкие части, которые составляют клетки, такие как макромолекулы и органеллы . Белок является примером макромолекулы, а митохондрия — примером органеллы. Клетки также могут соединяться, образуя более крупные структуры. Они могут группироваться вместе, чтобы сформировать тканей желудка и, в конечном итоге, всю пищеварительную систему . Однако точно так же, как атомы являются основной единицей при изучении материи, клетки являются основной единицей для биологии и организмов.

У более крупных организмов основная цель клетки — организовать . Ячейки содержат множество элементов, и каждый тип ячеек имеет свое назначение . Распределяя обязанности между различными группами клеток, организму легче выживать и расти.

Если бы вы были сделаны только из одной клетки, вы были бы очень ограничены. Вы не найдете отдельных клеток размером с корову. Когда клетки становятся слишком большими, у них возникают проблемы с функционированием. Кроме того, если бы у вас была всего одна клетка, у вас не было бы нервной системы, никаких мышц для движения, и об использовании Интернета не могло бы быть и речи.Триллионы клеток в вашем теле делают возможным ваш образ жизни.


Есть много типов клеток. На уроке биологии вы обычно будете работать с растительными клетками и животными клетками. Мы говорим «животный», потому что клеткой животного типа может быть что угодно, от крошечного микроорганизма до нервной клетки в вашем мозгу. На уроках биологии часто берут микроскоп и изучают одноклеточные микробы из воды пруда. Вы можете увидеть гидру, амебу или эвглену.

Клетки растений легче идентифицировать, потому что они имеют защитную структуру, называемую клеточной стенкой, сделанной из целлюлозы. У растений есть стена; животные нет. У растений также есть органеллы, такие как зеленый хлоропласт или большие заполненные водой вакуоли. Хлоропласты являются ключевой структурой в процессе фотосинтеза .


Клетки уникальны для каждого типа организма. Если вы посмотрите на очень простые организмы, вы обнаружите клетки, у которых нет определенного ядра (прокариоты), и другие клетки, которые имеют сотни ядер (, многоядерные, ).

У человека есть сотни различных типов клеток. У вас есть красные кровяные тельца, которые используются для переноса кислорода (O 2 ) по телу, и другие клетки, характерные для вашей сердечной мышцы. Несмотря на то, что клетки могут быть самыми разными, в основном они представляют собой компартменты, окруженные мембранами определенного типа.

Внутри клетки (Канадский музей природы, видео)



Полезные ссылки

Энциклопедия.com:
http://www.encyclopedia.com/topic/centriole.aspx
Википедия:
http://en.wikipedia.org/wiki/Centriole
Encyclopædia Britannica (Cell Division) :
http://www.britannica.com/EBchecked/topic/101396/cell/37458/Cell-division

Биологические мембраны | Очерки биохимии

Мембранные белки — важные мишени для лекарств. По мере расширения наших структурных и функциональных знаний о мембранных белках появляется возможность создавать более эффективные лекарства.Вычислительные инструменты становятся все более важной частью процесса. Одним из важных классов мишеней для лекарств являются порообразующие мембранные белки, кодируемые вирусами. ВИЧ, грипп и полиомиелит, среди других вирусов, кодируют мембранные белки, которые образуют поры в мембранах клетки-хозяина, чтобы вызвать утечку и способствовать инфекции. Один из этих порообразующих белков ранее использовался в качестве лекарственной мишени при лечении гриппа. ЯМР-исследования предоставили структурную информацию о порообразующем белке Vpu из ВИЧ-1.Используя эти данные вместе со структурной информацией о порах с аналогичными последовательностями, можно создать вычислительные модели структуры канала в мембране хозяина. Эти модели в сочетании с передовыми биофизическими методами имеют неоценимое значение для прогнозирования участков потенциального связывания молекулы лекарственного средства, которые затем могут быть протестированы как вычислительными, так и экспериментальными методами.

Больше лекарств нацелено на GPCR, чем любая другая отдельная группа белков.Как объяснялось ранее, конформационные изменения в GPCR позволяют сигналам пересекать мембрану. Однако эти большие изменения в конформации придают белкам гибкость, что затрудняет для исследователей точное определение структур GPCR в какой-либо одной конформации. Решение структур различных конформаций с помощью рентгеновской кристаллографии является сложной задачей. Поскольку GPCR являются такими важными мишенями для лекарств, многие исследования были сосредоточены на выяснении их структур, чтобы сообщить об открытии новых лекарств.Вычислительные методы снова оказались решающими для понимания детальной молекулярной структуры этих белков. Моделирование молекулярной динамики использовалось, чтобы помочь нам понять молекулярные изменения, которые происходят во время активации GPCR, а также какие липиды необходимы для функционирования GPCR. Хотя молекулярно-динамическое моделирование является ключевым методом в этой области исследований, оно имеет некоторые ограничения. Биологические мембраны, окружающие клетки, чрезвычайно сложны и содержат разные типы липидов и белков, как внутри, так и связанные с мембраной.В настоящее время время и финансовые ресурсы, необходимые для обеспечения вычислительной мощности для моделирования такой сложной среды, часто непомерно высоки. Поэтому создаются более простые модели, которые, хотя и способны предсказывать конформационные изменения в рецепторах, таких как GPCR, могут опускать другие взаимодействия, которые важны для активности мембранных белков. Как это часто бывает, для лучшего понимания конформационной гибкости GPCR потребуется комбинация методов.Из исследований, проведенных на сегодняшний день, очевидно, что эти рецепторы могут принимать множество различных конформаций, а не иметь простой механизм «включения» и «выключения». Использование разных молекул лекарств для стабилизации различных конформаций в разных сигнальных путях может быть лучшим подходом к поиску более эффективных лекарств в будущем. В настоящее время на исследователей оказывается большое давление с целью заменить, усовершенствовать и сократить использование животных при открытии лекарств (подход, называемый «тремя Р»). Используя компьютеры на ранних стадиях процесса для моделирования взаимодействий лекарство-мишень, исследователи могут производить гораздо более многообещающие соединения для тестирования в экспериментах и ​​испытаниях лекарств.

5.1: Компоненты и структура — Biology LibreTexts

Навыки для развития

  • Понять жидкую мозаичную модель клеточных мембран
  • Описать функции фосфолипидов, белков и углеводов в мембранах
  • Обсудить текучесть мембраны

Плазматическая мембрана клетки определяет клетку, очерчивает ее границы и определяет характер ее взаимодействия с окружающей средой (см. Сводку в таблице \ (\ PageIndex {1} \)).Клетки исключают одни вещества, поглощают другие и выделяют третьи в контролируемых количествах. Плазматическая мембрана должна быть очень гибкой, чтобы определенные клетки, такие как эритроциты и лейкоциты, могли изменять форму при прохождении через узкие капилляры. Это наиболее очевидные функции плазматической мембраны. Кроме того, поверхность плазматической мембраны несет маркеры, которые позволяют клеткам узнавать друг друга, что имеет жизненно важное значение для формирования тканей и органов на раннем этапе развития, а затем играет роль в различении между «я» и «не-я». иммунный ответ.

Одной из наиболее сложных функций плазматической мембраны является способность передавать сигналы с помощью сложных интегральных белков, известных как рецепторы. Эти белки действуют как приемники внеклеточных входов, так и как активаторы внутриклеточных процессов. Эти мембранные рецепторы обеспечивают внеклеточные сайты прикрепления для эффекторов, таких как гормоны и факторы роста, и они активируют каскады внутриклеточных ответов, когда их эффекторы связаны. Иногда рецепторы захватываются вирусами (ВИЧ, вирус иммунодефицита человека, является одним из примеров), которые используют их для проникновения в клетки, а иногда гены, кодирующие рецепторы, мутируют, вызывая сбои в процессе передачи сигналов с катастрофическими последствиями.

Жидкая мозаика Модель

Существование плазматической мембраны было идентифицировано в 1890-х годах, а ее химические компоненты были идентифицированы в 1915 году. Основными компонентами, идентифицированными в то время, были липиды и белки. Первая широко принятая модель структуры плазматической мембраны была предложена в 1935 году Хью Дэвсоном и Джеймсом Даниелли; это было основано на появлении «железной дороги» плазматической мембраны на ранних электронных микрофотографиях. Они предположили, что структура плазматической мембраны напоминает бутерброд, где белок аналогичен хлебу, а липиды аналогичны начинке.В 1950-х годах достижения в области микроскопии, особенно просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), позволили исследователям увидеть, что ядро ​​плазматической мембраны состоит из двойного, а не из одного слоя. Новая модель, которая лучше объясняет как микроскопические наблюдения, так и функцию этой плазматической мембраны, была предложена С.Дж. Певица и Гарт Л. Николсон в 1972 году.

Объяснение, предложенное Сингером и Николсоном, называется моделью жидкой мозаики. Модель со временем несколько эволюционировала, но она по-прежнему лучше всего объясняет структуру и функции плазматической мембраны в том виде, в каком мы их теперь понимаем.Модель жидкой мозаики описывает структуру плазматической мембраны как мозаику компонентов, включая фосфолипиды, холестерин, белки и углеводы, что придает мембране жидкий характер. Плазменные мембраны имеют толщину от 5 до 10 нм. Для сравнения, красные кровяные тельца человека, видимые с помощью световой микроскопии, имеют ширину примерно 8 мкм, или примерно в 1000 раз шире плазматической мембраны. Мембрана действительно немного похожа на бутерброд (Рисунок \ (\ PageIndex {1} \)).

Рисунок \ (\ PageIndex {1} \): жидкая мозаичная модель плазматической мембраны описывает плазматическую мембрану как жидкую комбинацию фосфолипидов, холестерина и белков.Углеводы, прикрепленные к липидам (гликолипидам) и белкам (гликопротеинам), выходят из обращенной наружу поверхности мембраны.

Основными компонентами плазматической мембраны являются липиды (фосфолипиды и холестерин), белки и углеводы, связанные с некоторыми липидами и некоторыми белками. Фосфолипид — это молекула, состоящая из глицерина, двух жирных кислот и головной группы, связанной с фосфатом. Холестерин, еще один липид, состоящий из четырех конденсированных углеродных колец, находится рядом с фосфолипидами в ядре мембраны.Пропорции белков, липидов и углеводов в плазматической мембране варьируются в зависимости от типа клетки, но для типичной клетки человека белок составляет около 50 процентов композиции по массе, липиды (всех типов) составляют около 40 процентов состава. композицию по массе, а остальные 10 процентов композиции по массе составляют углеводы. Однако концентрация белков и липидов зависит от клеточных мембран. Например, миелин, продукт мембраны специализированных клеток, изолирующий аксоны периферических нервов, содержит только 18 процентов белка и 76 процентов липидов.Внутренняя мембрана митохондрий содержит 76 процентов белка и только 24 процента липидов. Плазматическая мембрана эритроцитов человека на 30 процентов состоит из липидов. Углеводы присутствуют только на внешней поверхности плазматической мембраны и присоединяются к белкам, образуя гликопротеины, или присоединяются к липидам, образуя гликолипиды.

Фосфолипиды

Основная ткань мембраны состоит из амфифильных молекул фосфолипидов. Гидрофильные или «водолюбивые» области этих молекул (которые выглядят как набор шариков в изображении модели художником) (рис. \ (\ PageIndex {1} \)) находятся в контакте с водной жидкостью как внутри, так и вне камеры.Гидрофобные или ненавидящие воду молекулы обычно неполярны. Они взаимодействуют с другими неполярными молекулами в химических реакциях, но обычно не взаимодействуют с полярными молекулами. При помещении в воду гидрофобные молекулы имеют тенденцию образовывать шар или кластер. Гидрофильные области фосфолипидов имеют тенденцию к образованию водородных связей с водой и другими полярными молекулами как снаружи, так и внутри клетки. Таким образом, поверхности мембраны, обращенные внутрь и снаружи клетки, являются гидрофильными.Напротив, внутренняя часть клеточной мембраны гидрофобна и не взаимодействует с водой. Таким образом, фосфолипиды образуют превосходную двухслойную клеточную мембрану, которая отделяет жидкость внутри клетки от жидкости вне клетки.

Молекула фосфолипида (рисунок \ (\ PageIndex {2} \)) состоит из трехуглеродного глицеринового каркаса с двумя молекулами жирных кислот, присоединенными к атомам углерода 1 и 2, и фосфатсодержащей группой, присоединенной к третьему атому углерода. Такое расположение дает всей молекуле область, описываемую как ее голова (фосфатсодержащая группа), которая имеет полярный характер или отрицательный заряд, и область, называемую хвостом (жирные кислоты), которая не имеет заряда.Голова может образовывать водородные связи, а хвост — нет. Молекула с таким расположением положительно или отрицательно заряженной области и незаряженной или неполярной области называется амфифильной или «двоякой».

Рисунок \ (\ PageIndex {2} \): Эта молекула фосфолипида состоит из гидрофильной головки и двух гидрофобных хвостов. Гидрофильная головная группа состоит из фосфатсодержащей группы, присоединенной к молекуле глицерина. Гидрофобные хвосты, каждый из которых содержит насыщенную или ненасыщенную жирную кислоту, представляют собой длинные углеводородные цепи.

Эта характеристика жизненно важна для структуры плазматической мембраны, потому что в воде фосфолипиды имеют тенденцию располагаться так, чтобы их гидрофобные хвосты были обращены друг к другу, а их гидрофильные головки были обращены наружу. Таким образом, они образуют липидный бислой — барьер, состоящий из двойного слоя фосфолипидов, который отделяет воду и другие материалы на одной стороне барьера от воды и других материалов на другой стороне. Фактически, фосфолипиды, нагретые в водном растворе, имеют тенденцию спонтанно образовывать маленькие сферы или капли (называемые мицеллами или липосомами), причем их гидрофильные головки образуют внешнюю поверхность, а их гидрофобные хвосты — внутри (Рисунок \ (\ PageIndex {3} \)). .

Рисунок \ (\ PageIndex {3} \): В водном растворе фосфолипиды имеют тенденцию располагаться так, чтобы их полярные головки были обращены наружу, а их гидрофобные хвосты были обращены внутрь. (кредит: модификация работы Марианы Руис Вильярреал)

Proteins

Белки составляют второй основной компонент плазматических мембран. Интегральные белки (некоторые специализированные типы называются интегринами), как следует из их названия, полностью интегрированы в структуру мембраны, и их гидрофобные области, охватывающие мембрану, взаимодействуют с гидрофобной областью фосфолипидного бислоя (Рисунок \ (\ PageIndex {1}) \)).Однопроходные интегральные мембранные белки обычно имеют гидрофобный трансмембранный сегмент, состоящий из 20-25 аминокислот. Некоторые охватывают только часть мембраны, соединяясь с одним слоем, в то время как другие простираются от одной стороны мембраны к другой и открываются с обеих сторон. Некоторые сложные белки состоят из до 12 сегментов одного белка, которые сильно свернуты и встроены в мембрану (рисунок \ (\ PageIndex {4} \)). Этот тип белка имеет гидрофильную область или области и одну или несколько умеренно гидрофобных областей.Такое расположение областей белка имеет тенденцию ориентировать белок рядом с фосфолипидами, при этом гидрофобная область белка прилегает к хвостам фосфолипидов, а гидрофильная область или области белка выступают из мембраны и контактируют с цитозолем или внеклеточной жидкости.

Рисунок \ (\ PageIndex {4} \): Белки интегральных мембран могут иметь одну или несколько альфа-спиралей, охватывающих мембрану (примеры 1 и 2), или они могут иметь бета-листы, охватывающие мембрану (пример 3).(кредит: «Foobar» / Wikimedia Commons)

Периферийные белки обнаружены на внешней и внутренней поверхности мембран, прикреплены либо к интегральным белкам, либо к фосфолипидам. Периферические белки, наряду с интегральными белками, могут служить ферментами, структурными прикреплениями волокон цитоскелета или частью сайтов узнавания клетки. Иногда их называют «клеточно-специфическими» белками. Организм распознает свои собственные белки и атакует чужеродные белки, связанные с инвазивными патогенами.

Углеводы

Углеводы — третий важный компонент плазматических мембран. Они всегда находятся на внешней поверхности клеток и связаны либо с белками (образуя гликопротеины), либо с липидами (образуя гликолипиды) (Рисунок \ (\ PageIndex {1} \)). Эти углеводные цепи могут состоять из 2–60 моносахаридных единиц и могут быть прямыми или разветвленными. Наряду с периферическими белками углеводы образуют на поверхности клетки специализированные участки, которые позволяют клеткам узнавать друг друга.Эти участки имеют уникальные образцы, которые позволяют распознавать клетку, во многом так же, как черты лица, уникальные для каждого человека, позволяют его или ее узнавать. Эта функция распознавания очень важна для клеток, поскольку позволяет иммунной системе различать клетки тела (называемые «самими») и чужеродные клетки или ткани (называемые «чужими»). Подобные типы гликопротеинов и гликолипидов находятся на поверхности вирусов и могут часто меняться, не позволяя иммунным клеткам распознавать их и атаковать их.

Эти углеводы на внешней поверхности клетки — углеводные компоненты как гликопротеинов, так и гликолипидов — вместе называются гликокаликсом (что означает «сахарное покрытие»). Гликокаликс очень гидрофильный и привлекает большое количество воды к поверхности клетки. Это помогает во взаимодействии клетки с водной средой и в способности клетки получать вещества, растворенные в воде. Как обсуждалось выше, гликокаликс также важен для идентификации клеток, самоопределения / несамоопределения и эмбрионального развития и используется для прикрепления клеток к клеткам для формирования тканей.

Evolution Connection: как вирусы заражают определенные органы

Гликопротеиновые и гликолипидные структуры на поверхности клеток дают многим вирусам возможность инфицирования. Вирусы ВИЧ и гепатита поражают только определенные органы или клетки в организме человека. ВИЧ способен проникать через плазматические мембраны подтипа лимфоцитов, называемых Т-хелперами, а также через некоторые моноциты и клетки центральной нервной системы. Вирус гепатита атакует клетки печени.

Эти вирусы могут проникать в эти клетки, потому что на поверхности клеток есть сайты связывания, которые специфичны и совместимы с определенными вирусами (Рисунок \ (\ PageIndex {5} \)).Другие сайты узнавания на поверхности вируса взаимодействуют с иммунной системой человека, побуждая организм вырабатывать антитела. Антитела образуются в ответ на антигены или белки, связанные с инвазивными патогенами, или в ответ на чужеродные клетки, например, при трансплантации органов. Эти же сайты служат местами для прикрепления антител и либо уничтожения, либо подавления активности вируса. К сожалению, эти сайты узнавания на ВИЧ меняются очень быстро из-за мутаций, что очень затрудняет производство эффективной вакцины против вируса по мере того, как вирус эволюционирует и адаптируется.У человека, инфицированного ВИЧ, быстро разовьются разные популяции или варианты вируса, которые различаются по разным сайтам распознавания. Такое быстрое изменение поверхностных маркеров снижает эффективность иммунной системы человека при атаке вируса, поскольку антитела не распознают новые вариации поверхностных структур. В случае ВИЧ проблема усугубляется тем фактом, что вирус специфически инфицирует и разрушает клетки, участвующие в иммунном ответе, еще больше выводя из строя хозяина.

Рисунок \ (\ PageIndex {5} \): ВИЧ связывается с рецептором CD4, гликопротеином на поверхности Т-клеток. (кредит: модификация работы NIH, NIAID)

Текучесть мембраны

Мозаичная характеристика мембраны, описанная в модели жидкой мозаики, помогает проиллюстрировать ее природу. Интегральные белки и липиды существуют в мембране как отдельные, но слабо прикрепленные молекулы. Они напоминают отдельные разноцветные плитки мозаичной картины и плавают, несколько перемещаясь друг относительно друга.Однако мембрана не похожа на воздушный шар, который может расширяться и сжиматься; скорее, он довольно жесткий и может лопнуть, если в него проникнуть или если ячейка впитает слишком много воды. Однако из-за своей мозаичности очень тонкая игла может легко проникнуть в плазматическую мембрану, не вызывая ее разрыва, и мембрана будет течь и самоуплотняться при извлечении иглы.

Мозаичные характеристики мембраны частично объясняют ее текучесть. Есть два других фактора, которые помогают поддерживать эту характеристику жидкости.Одним из факторов является природа самих фосфолипидов. В своей насыщенной форме жирные кислоты в фосфолипидных хвостах насыщены связанными атомами водорода. Между соседними атомами углерода нет двойных связей. В результате хвосты получаются относительно прямыми. Напротив, ненасыщенные жирные кислоты не содержат максимальное количество атомов водорода, но они действительно содержат некоторые двойные связи между соседними атомами углерода; двойная связь приводит к изгибу цепочки атомов углерода примерно на 30 градусов (Рисунок \ (\ PageIndex {2} \)).

Таким образом, если насыщенные жирные кислоты с их прямыми хвостами сжимаются при понижении температуры, они давят друг на друга, образуя плотную и довольно жесткую мембрану. Если ненасыщенные жирные кислоты сжаты, «изгибы» в своих хвостах отталкивают соседние молекулы фосфолипидов, сохраняя некоторое пространство между молекулами фосфолипидов. Это «локальное пространство» помогает поддерживать текучесть мембраны при температурах, при которых мембраны с хвостами насыщенных жирных кислот в их фосфолипидах «замерзают» или затвердевают.Относительная текучесть мембраны особенно важна в холодных условиях. Холодная среда имеет тенденцию сжимать мембраны, состоящие в основном из насыщенных жирных кислот, что делает их менее текучими и более восприимчивыми к разрыву. Многие организмы (например, рыба) способны адаптироваться к холоду, изменяя долю ненасыщенных жирных кислот в своих мембранах в ответ на понижение температуры.

Ссылка на обучение

Посетите этот сайт, чтобы увидеть анимацию текучести и мозаичности мембран.

У животных есть дополнительный компонент мембраны, который помогает поддерживать текучесть. Холестерин, который находится рядом с фосфолипидами в мембране, имеет тенденцию ослаблять воздействие температуры на мембрану. Таким образом, этот липид действует как буфер, предотвращая снижение текучести при низких температурах и предотвращая чрезмерное повышение текучести при повышенных температурах. Таким образом, холестерин расширяет в обоих направлениях диапазон температур, в котором мембрана является подходящей текучей и, следовательно, функциональной.Холестерин также выполняет другие функции, такие как организация кластеров трансмембранных белков в липидные рафты.

Таблица \ (\ PageIndex {1} \): Компоненты и функции плазменной мембраны.
Компонент Расположение
Фосфолипид Основная ткань мембраны
Холестерин Присоединяется между фосфолипидами и между двумя слоями фосфолипидов
Интегральные белки (например, интегрины) Встраивается в фосфолипидный слой (слои).Может или не может проникать через оба слоя
Периферические белки На внутренней или внешней поверхности бислоя фосфолипидов; не встроен в фосфолипиды
Углеводы (компоненты гликопротеинов и гликолипидов) Обычно прикрепляется к белкам на внешнем слое мембраны

Карьера: иммунолог

Вариации периферических белков и углеводов, которые влияют на сайты узнавания клетки, представляют первостепенный интерес в иммунологии.Эти изменения учитываются при разработке вакцины. Многие инфекционные болезни, такие как оспа, полиомиелит, дифтерия и столбняк, были побеждены с помощью вакцин.

Иммунологи — это врачи и ученые, которые исследуют и разрабатывают вакцины, а также лечат и изучают аллергии или другие проблемы с иммунитетом. Некоторые иммунологи изучают и лечат аутоиммунные проблемы (заболевания, при которых иммунная система человека атакует его или ее собственные клетки или ткани, например, волчанка) и иммунодефициты, приобретенные (например, синдром приобретенного иммунодефицита или СПИД) или наследственные (например, тяжелые комбинированные заболевания). иммунодефицит, или ТКИД).Иммунологи призваны помочь лечить пациентов с трансплантацией органов, у которых должна быть подавлена ​​их иммунная система, чтобы их тела не отторгали пересаженный орган. Некоторые иммунологи работают, чтобы понять естественный иммунитет и влияние на него окружающей человека среды. Другие работают над вопросами о том, как иммунная система влияет на такие заболевания, как рак. В прошлом важность наличия здоровой иммунной системы для предотвращения рака вообще не понималась.

Для работы иммунологом требуется кандидат или доктор медицинских наук.Кроме того, иммунологи проходят не менее 2–3 лет обучения по аккредитованной программе и должны сдать экзамен Американского совета по аллергии и иммунологии. Иммунологи должны обладать знаниями о функциях человеческого тела, связанных с вопросами, выходящими за рамки иммунизации, а также знаниями фармакологии и медицинских технологий, таких как лекарства, методы лечения, материалы для испытаний и хирургические процедуры.

Сводка

Современное понимание плазматической мембраны называется моделью жидкой мозаики.Плазматическая мембрана состоит из бислоя фосфолипидов с их гидрофобными хвостами жирных кислот, контактирующими друг с другом. Ландшафт мембраны усыпан белками, некоторые из которых покрывают мембрану. Некоторые из этих белков служат для транспортировки материалов в клетку или из клетки. Углеводы присоединяются к некоторым белкам и липидам на обращенной наружу поверхности мембраны, образуя комплексы, которые функционируют для идентификации клетки для других клеток. Жидкая природа мембраны обусловлена ​​температурой, конфигурацией хвостов жирных кислот (некоторые из которых изогнуты двойными связями), присутствием холестерина, встроенного в мембрану, а также мозаичной природой белков и комбинаций белков и углеводов, которые являются не закреплен прочно на месте.Плазматические мембраны ограничивают и определяют границы клеток, но они не являются статическим мешком, а динамичны и постоянно находятся в движении.

Глоссарий

амфифильный
Молекула, обладающая полярной или заряженной областью и неполярной или незаряженной областью, способной взаимодействовать как с гидрофильной, так и с гидрофобной средой
модель жидкой мозаики
описывает структуру плазматической мембраны как мозаику компонентов, включая фосфолипиды, холестерин, белки, гликопротеины и гликолипиды (сахарные цепи, прикрепленные к белкам или липидам, соответственно), что приводит к текучести (текучесть).
гликолипид
сочетание углеводов и липидов
гликопротеин
сочетание углеводов и белков
гидрофильный
Молекула
со способностью связываться с водой; «Водолюбивый»
гидрофобный
молекула, не имеющая способности связываться с водой; «Ненавидящие воду»
интегральный белок
Белок
, интегрированный в структуру мембраны, который широко взаимодействует с углеводородными цепями мембранных липидов и часто охватывает мембрану; эти белки могут быть удалены только путем разрушения мембраны детергентами
периферический белок
Белок
, обнаруженный на поверхности плазматической мембраны либо на ее внешней, либо на внутренней стороне; эти белки могут быть удалены (смыты с мембраны) промывкой с высоким содержанием соли

Авторы и авторство

  • Конни Рай (Общественный колледж Восточного Миссисипи), Роберт Уайз (Университет Висконсина, Ошкош), Владимир Юруковски (Общественный колледж округа Саффолк), Жан ДеСе (Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл), Джанг Чой (Технологический институт Джорджии) ), Яэль Ависсар (Колледж Род-Айленда) среди других авторов.Исходный контент OpenStax (CC BY 4.0; бесплатно можно загрузить с http://cnx.org/contents/185cbf87-c72…[email protected]).

Клеточная (плазменная) мембрана — структура, состав, функции

Home »Клеточная биология» Клеточная (плазменная) мембрана — структура, состав, функции

Определение клеточной (плазменной) мембраны

  • Мембраны — это липидные структуры, которые отделяют содержимое окружающего их компартмента от окружающей среды.
  • Плазменные мембраны отделяют клетку от окружающей среды, в то время как другие мембраны определяют границы органелл и обеспечивают матрицу, на которой могут происходить сложные химические реакции.
  • Плазматическая мембрана, также известная как мембрана клеточной поверхности или плазмалемма, определяет границу клетки.
  • Это фосфолипидный бислой со встроенными белками, который окружает каждую живую клетку.
  • Он регулирует перемещение материалов внутрь и из ячейки и облегчает передачу электрических сигналов между ними.
  • Считается, что он полупроницаемый, потому что он позволяет одним молекулам, но не другим, проникать в клетку.
  • Он выполняет некоторые специфические функции, такие как управление потоком питательных веществ и ионов в клетки и из них, опосредование реакции клетки на внешние стимулы (процесс, называемый трансдукцией сигнала) и взаимодействие с соседними клетками.

Рисунок: Схема клеточной (плазменной) мембраны

Структура и состав

Все биологические мембраны построены по стандартной схеме.Они состоят из непрерывного бислоя амфипатических липидов толщиной примерно 5 нм, в который встроены белки. Кроме того, некоторые мембраны также несут на своей внешней стороне углеводы (моно- и олигосахариды), которые связаны с липидами и белками. Пропорции липидов, белков и углеводов заметно различаются в зависимости от типа клетки и мембраны.

  • Плазматическая мембрана состоит из липидного бислоя , содержащего встроенные и периферические белки.Основной компонент мембран — липиды.
  • Липиды в плазматической мембране находятся в форме фосфолипидов , которые содержат полярную головную группу, присоединенную к двум гидрофобным хвостам жирных кислот; головная группа обращена к водной среде, жирная кислота — к внутренней части бислоя.
  1. Липиды на основе глицерина содержат глицериновую основу и состоят из фосфатидовой кислоты (PA), фосфатидилэтаноламина (PE), фосфатидилхолина (PC), фосфатидилсерина (PS), фосфатидилглицерина (PG), фосфатидилглицерина (PG), фосфатидолипилинозита (CL). ).
  2. Одним из липидов на основе сфингозина является сфингомиелин (SM).
  3. Холестерин присутствует в мембранах эукариот и поддерживает текучесть мембран при различных температурах. Текучесть также определяется содержанием ненасыщенных жирных кислот в мембране, которые являются жидкостями при комнатной температуре, и длиной цепи жирных кислот (более короткие цепи более текучие, чем более длинные цепи).
  • Встроенные белки в плазматическую мембрану функционируют либо как каналы, либо как переносчики для перемещения соединений через мембрану, как рецепторы для связывания гормонов и нейротрансмиттеров или как структурные белки.
  • Белки периферической мембраны обеспечивают механическую поддержку мембраны через скелет внутренней мембраны или кортикальный скелет. Примером этого является спектрин в мембране эритроцитов. Их можно удалить с мембраны с помощью ионных агентов.
  • Третий тип мембранных белков — это гликано-заякоренные белки с гликофосфатидилинозитолом (GPI). Одним из примеров GPI-заякоренного белка является прионный белок, присутствующий в мембранах нейронов.
  • Плазматическая мембрана гликокаликс состоит из коротких цепочек углеводов, прикрепленных к белкам и липидам, которые простираются в водной среде и оба защищают клетку от переваривания и ограничивают поглощение гидрофобных молекул.

Примечание:

  • Мембранные липиды — это сильно амфипатические молекулы с полярной гидрофильной «головной группой» и полярным гидрофобным «хвостом». В мембранах они в первую очередь удерживаются вместе за счет гидрофобного эффекта и слабых сил Ван-дер-Ваальса и поэтому подвижны друг относительно друга. Это придает мембранам более или менее жидкое качество.
  • Липиды и белки внутри мембраны подвижны. Если они не фиксируются на месте специальными механизмами, они плавают в липидном слое, как в двумерной жидкости; поэтому биологические мембраны также описываются как «жидкая мозаика» .

Функции мембран (клеточная / плазменная мембрана и биологические мембраны)
  • Наиболее важными мембранами в клетках животных являются плазматическая мембрана, внутренняя и внешняя ядерные мембраны, мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и аппарата Гольджи, а также внутренняя и внешняя мембраны митохондрий. Лизосомы, пероксисомы и различные везикулы также отделены от цитоплазмы мембранами.
  • У растений в пластидах и вакуолях видны дополнительные мембраны.

Мембраны и их компоненты выполняют следующие функции:

  1. Ограждение и изоляция клеток и органелл.
  • Корпус, обеспечиваемый плазматической мембраной, защищает клетки от окружающей среды как механически, так и химически.
  • Плазматическая мембрана необходима для поддержания различий в концентрации многих веществ между внутриклеточными и внеклеточными компартментами.
  1. Регулируемые перевозки веществ
  • Это определяет внутреннюю среду и является предварительным условием гомеостаза — i.е., поддержание постоянных концентраций веществ и физиологических показателей.
  • Регулируемый и избирательный транспорт веществ через поры, каналы и переносчики необходим, потому что клетки и органеллы окружены мембранными системами.
  1. Передача сигнала
  • Прием внеклеточных сигналов и передача этих сигналов внутрь клетки, а также производство сигналов.
  1. Ферментативный катализ реакций .
  • Важные ферменты расположены в мембранах на границе между липидной и водной фазами. Здесь происходят реакции с неполярными субстратами.
  • Примеры включают биосинтез липидов и метаболизм аполярных ксенобиотиков. Наиболее важные реакции преобразования энергии — i. е. окислительное фосфорилирование и фотосинтез также происходят в мембранах.
  1. Взаимодействие с другими ячейками
  • Для слияния клеток и образования тканей, а также для связи с внеклеточным матриксом.
  1. Закрепление цитоскелета
  • Для поддержания формы клеток и органелл и обеспечения основы для процессов движения.

Список литературы
  1. Смит, К. М., Маркс, А. Д., Либерман, М. А., Маркс, Д. Б., и Маркс, Д. Б. (2005). Базовая медицинская биохимия Марка: клинический подход. Филадельфия: Липпинкотт Уильямс и Уилкинс.
  2. Koolman, J. & Röhm, K.-H.(2005). Цветной атлас биохимии. Штутгарт: Тиме.
  3. Альбертс, Б. (2004). Существенная клеточная биология. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: научный паб Garland.
  4. https://www.mheducation.co.uk/he/chapters/9780071102087.pdf
  5. http://www.nslc.wustl.edu/courses/bio101/cruz/Organelles/Organelle.htm

Клеточная (плазменная) мембрана — структура, состав, функции Категории Биология клетки Теги Клеточная (плазменная) мембрана, Клеточная мембрана, Состав клеточной мембраны, Функции клеточной мембраны, Свойства клеточной мембраны, Структура клеточной мембраны, поверхностная мембрана клетки, Мембрана, Плазменная мембрана, плазмалемма Сообщение навигации

Структура биологических мембран in vivo и доказательства наличия липидных доменов

Abstract

Изучение фундаментальной структуры и процессов живых клеток на наноуровне представляет собой уникальную аналитическую задачу, поскольку клетки динамичны, химически разнообразны и хрупки.Речь идет о клеточной мембране, которая слишком мала, чтобы ее можно было увидеть непосредственно с помощью оптической микроскопии, и не дает большого контраста для других методов. Как следствие, определение характеристик мембраны в наномасштабе проводилось ex vivo или в присутствии экзогенных меток, используемых для усиления контраста и придания специфичности. Здесь мы представляем стратегию изотопного мечения в грамположительной бактерии Bacillus subtilis для исследования наноразмерной структуры и организации ее плазматической мембраны in vivo.Посредством генетических и химических манипуляций с организмом мы независимо пометили клетку и ее мембрану определенными количествами водорода (H) и дейтерия (D). Эти изотопы обладают разными свойствами рассеяния нейтронов без изменения химического состава клеток. По спектрам рассеяния нейтронов мы подтвердили, что B . Клеточная мембрана subtilis является пластинчатой, и было определено, что ее средняя гидрофобная толщина составляет 24,3 ± 0,9 Ангстрем (Å). Кроме того, создав нейтронный контраст в плоскости мембраны с использованием смеси H- и D-жирных кислот, мы обнаружили латеральные особенности размером менее 40 нм, которые согласуются с понятием липидных рафтов.Эти эксперименты, проводимые в биологически значимых условиях, отвечают на давние вопросы мембранной биологии и иллюстрируют принципиально новый подход к систематическим исследованиям структуры клеточных мембран in vivo.

Информация об авторе

Структура и организация клеточной мембраны являются центральными для многих биологических функций, и, хотя они были тщательно изучены, мы все еще многого не понимаем. Большое количество подробной информации было получено в результате исследований модельных липидных мембран.Однако эти системы часто очень упрощены по составу и всегда лишены активных процессов, обнаруживаемых в клетках. Основным препятствием для изучения мембран in vivo в живых клетках было то, что физические методы с высоким разрешением, используемые для исследования структуры мембран, несовместимы с живыми организмами. Чтобы преодолеть это препятствие, мы использовали новый подход in vivo, который позволяет наблюдать структуру мембраны непосредственно у грамположительной бактерии B . subtilis .Этот подход основан на настройке изотопного содержания водорода в мембране и других частях бактерии, чтобы генерировать спектры рассеяния нейтронов исключительно на мембране. Используя этот подход, мы подтвердили, что структура B . Мембрана subtilis пластинчатая и имеет среднюю гидрофобную толщину 23,9 ± 0,9 Ангстрем (Å). Мы также смогли наблюдать наноскопические латеральные мембранные структуры, соответствующие представлению о липидных рафтах. Этот экспериментальный подход позволит в будущем проводить широкий спектр структурных исследований клеточной мембраны (и, возможно, других классов биомолекул) без необходимости использования внешних зондов или меток.Таким образом, он коренным образом меняет круг структурных вопросов наноразмерного масштаба, которые могут быть решены in vivo.

Образец цитирования: Nickels JD, Chatterjee S, Stanley CB, Qian S, Cheng X, Myles DAA и др. (2017) Структура биологических мембран in vivo и доказательства существования липидных доменов. PLoS Biol 15 (5): e2002214. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214

Академический редактор: Даниэль Лопес, Centro Nacional de Biotecnologia, Испания

Поступила: 10 февраля 2017 г .; Одобрена: 11 апреля 2017 г .; Опубликован: 23 мая 2017 г.

Авторские права: © 2017 Nickels et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Это исследование спонсировалось Программой исследований и разработок под руководством лаборатории (номер гранта 6988) Национальной лаборатории Ок-Ридж (ORNL), управляемой UT-Battelle, LLC, для США.S. Министерство энергетики (DOE) по контракту № DE-AC05-00OR22725. Поддержка J.K. предоставлено Управлением фундаментальных энергетических наук Министерства энергетики США, Отделом научных пользователей и Департаментом биологических и экологических исследований Министерства энергетики США (номер гранта ERKP-851). В этом исследовании использовались ресурсы центра Oak Ridge Leadership Computing Facility в ORNL при поддержке Департамента перспективных научных компьютерных исследований Министерства энергетики США. Малоугловое рассеяние нейтронов было выполнено в ORNL с использованием прибора Bio-SANS на реакторе с изотопами с высоким потоком при поддержке Управления биологических и экологических исследований Министерства энергетики США, Отдела биологических систем, через Центр структурной молекулярной биологии ORNL и EQ. -Прибор SANS на источнике нейтронов расщепления, при поддержке Управления фундаментальных энергетических наук Министерства энергетики США, Подразделения научных пользователей (номер гранта ERKP-SNX).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения: Å, Ангстремс; а15: 0, антеизопентадекановая кислота; D, дейтерий; Д-М9, обогащенная дейтерием минимальная среда М9; ЭМ, электронная микроскопия; FA, жирная кислота; СЛАВА, метиловый эфир жирной кислоты; ГХ / МС, газовая хроматография / масс-спектрометрия; ЧАС, водород; H-M9, стандартный M9 минимальный средний; n16: 0, нормальная гексадекановая кислота; PBS, забуференный фосфатом физиологический раствор; ПК, фосфатидилхолин; SANS, малоугловое рассеяние нейтронов; ρ , плотность длины рассеяния нейтронов

Введение

Из-за присущей живым клеткам сложности, аналитические методы с высоким разрешением обычно используются ex vivo, и многие из них зависят от меток для дифференциации интересующих видов.В случае клеточных мембран их наноскопическая структура (ультраструктура) была выяснена в основном с помощью электронной микроскопии (ЭМ) с метками тяжелых атомов [1], дополненных биофизическими исследованиями in vitro модельных мембран. [2–12] Мембрана in vivo. исследования с более низким разрешением, особенно с помощью флуоресцентной микроскопии, предоставили дополнительные детали латеральной структуры, а также важную информацию о диффузии и других динамических процессах [13]. Благодаря этим методам появилась яркая картина мембраны.[14–19] Тем не менее, они имеют значительные ограничения, и фундаментальные вопросы об ультраструктуре мембраны in vivo остаются нерешенными. [20]

Например, гидрофобная толщина мембраны является основным структурным параметром, влияющим на мембранный транспорт, а также складывание и функцию мембранных белков. Однако гидрофобная толщина мембран никогда не определялась in vivo. Другой нерешенный вопрос касается существования наноскопических доменов или липидных рафтов.Гипотеза липидного рафта [21] предполагает латеральную организацию мембранных липидов и белков в отдельные домены в плоскости мембраны, чтобы облегчить сборку и регуляцию многомолекулярных комплексов. Эта гипотеза дает убедительное обоснование для многочисленных наблюдений, связанных с переносом через мембрану, эндоцитозом, передачей сигналов и другими процессами. [22-25] Однако доказательства существования липидных доменов были в значительной степени предположительными, и в настоящее время широко распространено мнение, что эти домены являются наноскопическими. а также переходные [26,27], что затрудняет их обнаружение.Новые методы исследования латеральной структуры in vivo — в идеале без использования внешних зондов — помогли бы нам понять роль латеральной гетерогенности во многих клеточных процессах, в которых она была задействована.

В этом контексте малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН) стало уникальным мощным инструментом для изучения структуры липидного бислоя in vitro. Нейтроны имеют длину волны порядка Ангстремов (Å) и, таким образом, по своей сути являются наноскопическими зондами, хорошо подобранными по размерам мембранной структуры.Используя правильно спланированные эксперименты, можно точно определить как поперечную (перпендикулярно плоскости мембраны) [7], так и латеральную (внутри плоскости мембраны) [28,29] структуру. Важно отметить, что методы рассеяния нейтронов не требуют внешних молекул или тяжелых атомов в качестве меток и вместо этого полагаются на изотопное замещение водородом (H) / дейтерием (D). Холодные и тепловые нейтроны также неразрушающие [30–32], что делает их идеальными для изучения живых систем. Однако применение мощных ультраструктурных методов на основе нейтронов было ограничено моделями мембран in vitro из-за сложного сигнала рассеяния, возникающего от клеток в результате их разнообразного биомолекулярного состава.

Эксперименты по рассеянию и визуализации требуют, чтобы интересующие объекты имели наблюдаемый сигнал, отличный от фона. Если контраст в исходной системе недостаточен, он должен передаваться с помощью меток. В случае флуоресцентной визуализации контраст возникает из-за отличительных свойств возбуждения и излучения нативных или, чаще, введенных флуорофоров. В случае рентгеновских лучей и электронов контраст рассеяния возникает из-за разницы в электронной плотности, которая масштабируется с атомным номером.С другой стороны, нейтроны рассеиваются атомными ядрами, и ключевым параметром контраста, аналогичным электронной плотности, является плотность длины рассеяния ( ρ ). Длины рассеяния нейтронов ( b ) не связаны с атомным номером и, фактически, различаются для разных изотопов одного и того же элемента (S1 Рис.). Наиболее важно то, что длины рассеяния водорода ( b H = -3,74 фм) и дейтерия ( b D = 6,67 фм) существенно различаются. [31] Таким образом, нейтронный контраст уникален тем, что его можно варьировать в богатых водородом биологических системах с изотопными метками H / D, в отличие от меток тяжелых атомов, используемых в рентгеновском и электронном рассеянии, или флуоресцентных меток, используемых в микроскопии.

Различные классы биомолекул (т.е. белки, липиды, углеводы и нуклеиновые кислоты) имеют разный элементный состав, что дает каждому классу разное значение ρ (рис. 1a и 1b; таблица A в тексте S1). Многокомпонентные системы могут быть спроектированы таким образом, что 2 или более компонентов имеют одинаковое ρ , например, белок примерно на 42% D 2 O / H 2 O. В этом случае белок и растворитель называются подобран по контрасту, и белок не генерирует отчетливого сигнала рассеяния — i.е., он фактически невидим для нейтронов. [30] Если вводится третий компонент с другим ρ (например, ДНК), он становится единственным участником чистого рассеяния. Посредством разумного H / D-мечения образца и водной среды можно настроить ? для различных биомолекул, чтобы усилить или ослабить их рассеяние. Таким образом, контраст можно изменять без изменения химического состава системы.

Рис. 1. Структура оболочки и рассеивающие свойства B . subtilis .

(а) Изображение клеточной стенки, мембраны и части цитоплазмы. (b) Плотности длины рассеяния нейтронов, ρ , различных немеченых биомолекул в зависимости от процента D 2 O в водной среде. Цвета линий соответствуют (а). Наклонные линии являются результатом частичного дейтерирования за счет обмена водородов NH, OH и SH со все более дейтерированной водой. Где линия для каждого типа биомолекул пересекает черную ватерлинию, e.g., приблизительно при 42% D 2 O для белка (оранжевая линия), класс биомолекул сопоставим по контрасту и фактически невидим для нейтронов. (c) Общее рассеяние нейтронов от клеток, выращенных в обычной водородной (H) среде и ресуспендированных в фосфатно-солевом буфере (PBS) при различных концентрациях D 2 O (см. данные S1). Расчетная интенсивность I (0) показана с наблюдаемой интенсивностью, выраженной как инвариант Порода Q *, из экспериментов по малоугловому рассеянию нейтронов (МУРН). I (0) был рассчитан с использованием значений ρ в (b) и биомолекулярного состава B . subtilis (таблицы A – E в тексте S1). Вклад отдельных видов показан с использованием той же цветовой схемы, что и на (b). Интенсивность масштабируется с Δ ρ 2 и отображается как квадратный корень для сохранения пропорциональности по ординатам между (b) и (c).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.g001

В этом отчете мы описываем химико-биологический подход к управлению изменением нейтронного контраста in vivo и его применение для изучения ультраструктуры клеточной мембраны.В качестве платформы мы выбрали грамположительную бактерию B . subtilis . Этот организм имеет ряд привлекательных особенностей, таких как способность к генетической трактовке, хорошо изученный липидный обмен и легко расти в дейтерированных средах. Важно отметить, что он имеет единственную мембрану и использует только насыщенные жирные кислоты (ЖК), которые можно легко приготовить в дейтерированной форме, что позволяет регулировать контраст мембран. После подавления клеточного контраста посредством глобального D-мечения (т. Е.(заменяя большую часть H на D по всей клетке), мы выборочно повторно вводили контраст в мембрану, поставляя H-FA, которые включала клетка. Таким образом, мы смогли выделить спектр МУРН мембраны, который показал, что это пластинчатая структура с гидрофобной толщиной 24,3 ± 0,9 Å. Модификация схемы контрастного мечения привела к наблюдению наноскопических липидных структур размером <40 нм в плоскости клеточной мембраны, предоставив экспериментальные доказательства существования наноскопических липидных доменов (липидных рафтов) в активной биологической мембране.

Результаты

Стратегия согласования общего клеточного нейтронного контраста для

B . subtilis

Сигнал нейтронного рассеяния от клетки отражает сумму вкладов всех клеточных компонентов, в данном случае воды, белка, РНК, ДНК, углеводов и липидов (рис. 1а). Каждый из них имеет характеристику ρ (рис. 1b), а из их относительного содержания в B . subtilis , [33] мы оценили общее рассеяние от организма в зависимости от концентрации D 2 O в водной среде.Вода составляет примерно 85% клеточного объема и быстро обменивается через мембрану. Таким образом, погружение клеток в дейтерированный буфер изменяет нейтронный контраст, следовательно, суммарное рассеяние, при этом относительные вклады различных молекулярных видов меняются в зависимости от концентрации D 2 O (Рис. 1c; S2 Рис.).

Затем мы измерили полное рассеяние от B . subtilis культивировали в стандартной минимальной среде M9 (H-M9) и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) при различных концентрациях D 2 O.Наблюдаемое рассеяние близко соответствовало предсказаниям простой композиционной модели, как показано на рис. 1c. Обратите внимание, что клетки сильно разлетаются во всем диапазоне процентов D 2 O, а общий сигнал при любой концентрации D 2 O отражает вклады от множества классов биомолекул, присутствующих в клетке. Структурный анализ на основе перекрывающихся сигналов непрактичен, если вообще возможен.

Чтобы изолировать значимый сигнал рассеяния от мембраны, сначала необходимо было подавить нейтронный контраст от всей клетки, манипулируя ее H / D-составом.Эта цель была достигнута путем культивирования B . subtilis в обогащенной дейтерием минимальной среде M9 (D-M9, приготовленный на 90% D 2 O с H-глюкозой в качестве источника углерода). Благодаря метаболическому обмену H / D дейтерий из ростовой среды постоянно включается в углеродные скелеты биосинтетических молекул. В целом, дейтерирование скелета составляло приблизительно 70% (S4 Рис., Таблицы B и C в S1 Text), что, как было предсказано, создаст условия, близкие к контрастному, совпадающие для всех биомолекул, когда клетки были погружены приблизительно в 85% D 2 O буфер. (Рис. 2а).Это ожидание подтвердилось в эксперименте по рассеянию, где сильное уменьшение общего рассеяния наблюдалось примерно при 85% D 2 O (рис. 2b, светлые кружки; S2 рис.).

Рис. 2. Условия роста для контроля состава мембраны и нейтронного контраста.

(a) Плотность длины рассеяния ρ для различных классов биомолекул в B . subtilis культивировали в 90% D 2 O с водородом (H) -глюкозой. По сравнению с рис. 1b наблюдается явный сдвиг ρ к более высоким значениям для всех классов биомолекул в результате дейтерирования, сходящийся в диапазоне 90% –100% D 2 O.Включение экзогенных H-жирных кислот (ЖК; сплошная синяя линия) создает сильный нейтронный контраст (синяя стрелка вниз). (b) Общее рассеяние нейтронов от клеток, выращенных в дейтерированной среде и ресуспендированных в фосфатно-солевом буфере (PBS) при различных концентрациях D 2 O. Наблюдаемая интенсивность рассеяния Q * показана вместе с рассчитанными интенсивностями I (0) для клеток Δ yusL , выращенных в отсутствие (белые кружки) или в присутствии (белые квадраты) церуленина и H-FA.Разница при 85% D 2 O (синяя стрелка вверх) является результатом сильного контраста между H-FA и остальной частью клетки и буфера. (c) Клеточные липиды экстрагировали, затем подвергали метанолизу для высвобождения ЖК в виде сложных метиловых эфиров для анализа с помощью газовой хроматографии / масс-спектрометрии (S3 фиг.). (вверху) B . Мембраны subtilis содержат смесь 7 линейных и разветвленных насыщенных ЖК [34]. (посередине) Рост клеток в дейтерированной среде существенно не изменяет состав ЖК (S4 рис. и таблица B в тексте S1).Пики смещаются, потому что дейтерирование снижает удерживание на колонке и расширяется из-за присутствия нескольких изотопомеров, в среднем около 70% дейтерия (D). (внизу) Обработанные церуленином клетки Δ yusL , спасенные добавлением 2 нативных ЖК, H-антеизопентадекановой кислоты (a15: 0) и H-нормальной-гексадекановой кислоты (n16: 0), включают только эти 2 ЖК в их мембраны. См. Данные S2. (d) деградация ЖК посредством β-окисления подавлялась делецией гена yusL ( fadN ) (локус BSU32840), а биосинтез ЖК блокировался условно добавлением церуленина в среду.Экзогенные ЖК спасают рост и включаются в фосфолипиды мембран.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.g002

Включение H / D-меченных ЖК в клеточную мембрану

При подавлении контраста следующим шагом было повторное введение контраста конкретно в мембрану путем предоставления экзогенных ЖК для включения в фосфолипиды мембраны. Мембранные ЖК после превращения в метиловые эфиры ЖК (МЭЖК) легко анализируются на структуру и изотопное замещение с помощью газовой хроматографии / масс-спектрометрии (ГХ / МС).Как показано на рис. 2c (вверху), B . subtilis использует смесь 7 основных ЖК, все из которых являются насыщенными (не имеют двойных связей) и все, кроме одной, разветвленные. [34,35] Первоначальные эксперименты по добавлению добавок с B дикого типа. subtilis показал, что экзогенные ЖК не были включены в мембранные липиды в неповрежденном виде, поэтому нативные пути как катаболизма, так и анаболизма ЖК должны быть заблокированы (рис. 2d).

Катаболизм был заблокирован генетически путем делеции yusL , гена, кодирующего критический фермент β-окисления, еноил-КоА гидратазу.[36] Анаболизм был заблокирован химически с помощью церуленина, необратимого ингибитора β-кетоацил-ACP-синтазы, который подавляет биосинтез de novo FA. [37] Эта комбинация привела к условному FA-зависимому росту (продемонстрировано на S5 Fig). Ингибирование роста, вызванное церуленином, может быть устранено с помощью смеси всего лишь двух природных компонентов ЖК — пальмитиновой кислоты (нормальная гексадекановая кислота [n16: 0]) и 12-метилтетрадекановой кислоты (антеизопентадекановая кислота [a15: 0]). . [38] Эти 2 составляют минимальный набор из 1 тугоплавкой (n16: 0) и 1 легкоплавкой (a15: 0) ЖК, с помощью которых клетка может регулировать текучесть и структуру своей мембраны.Немеченые (H) и пердейтерированные (D) формы этих 2 FA затем использовали в различных смесях для настройки нейтронного контраста в мембране.

Рост B . subtilis Δ yusL в среде D-M9 не изменяет состав ЖК мембраны (рис. 2c, верхняя и средняя панели; см. Рис. S4 для распределения пиков и таблицу B в тексте S1 для площадей пиков и анализа дейтерирования). Однако, когда обработанные церуленином клетки Δ yusL выращивали в той же среде D-M9, дополненной H-n16: 0 и H-a15: 0, их мембранные ЖК состояли исключительно из этих 2 ЖК, без дейтерий, включенный из среды (рис. 2в, нижняя панель).Общее рассеяние нейтронов от этих клеток показало большое увеличение рассеяния при 85% D 2 O (отмечено синей стрелкой на фиг. 2b), что можно полностью отнести на счет H-FA, включенных в фосфолипиды мембраны.

Измерения SANS для определения толщины гидрофобной мембраны

Придавая контраст мембране (рис. 3a), мы использовали SANS для определения поперечной структуры мембраны путем регистрации интенсивности рассеяния, I (q) , как функции волнового вектора рассеяния, q .Клетки для этого эксперимента культивировали, как описано выше, в среде D-M9 с добавлением церуленина и H-n16: 0 и H-a15: 0 для мечения мембраны, затем переносили в 85% буфер D 2 O. Поскольку это более трудоемкие эксперименты, клетки ресуспендировали в 85% буфере D 2 O с добавлением глюкозы, Mg 2+ и церуленина. Эти добавки предотвращают автолиз и сохраняют мембранный потенциал [39,40], так что клетки в суспензии оставались жизнеспособными на> 90% в течение 4 часов при 25 ° C, что было определено прямым подсчетом клеток, измерениями оптической плотности и живыми / мертвое окрашивание (S6 и S7 фиг.).Остаточный фон регистрировали с использованием обработанных церуленином клеток Δ yusL , которым скармливали смесью ЖК, сопоставимую по контрасту с 85% D 2 O (a15: 0 и n16: 0, каждый 30% H и 70% D ), которые не вносят существенного вклада в суммарный сигнал рассеяния нейтронов.

Рис. 3. Малоугловое рассеяние нейтронов с изменением контраста (МУРН) показывает структуру B . subtilis мембрана.

(a) Схема мембраны, меченной водородом (H), в свете нейтронов.Клеточная стенка и содержимое цитоплазмы сопоставимы по контрасту при 85% D 2 O, следовательно, невидимы для нейтронов, в то время как мембрана с включенными H-жирными кислотами (ЖК) выделяется сильным контрастом. (b) Данные SANS, построенные как интенсивность рассеяния, I (q) , как функция волнового вектора рассеяния, q -1 ), от B . subtilis мембрана. Планки погрешностей соответствуют ± σ . Экспериментальные данные показаны наложенными на наиболее подходящие (красная сплошная линия) с использованием пластинчатого форм-фактора [45], показывая среднюю гидрофобную толщину 24.3 ± 0,9 Å, что соответствует липидному бислою жидкой фазы (см. Данные S3). Анализ мембранных ЖК методом газовой хроматографии / масс-спектрометрии (ГХ / МС) показан на рис. 2с с интегралами пиков в таблице E в тексте S1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.g003

В SANS форма данных I (q) по сравнению с данными q описывает структуру выборки от порядка Ангстремов до приблизительно 100 нм. Формально эти данные моделируются с использованием пластинчатого форм-фактора, представляющего ацильное ядро ​​бислоя, с двумя идентичными областями головной группы с каждой стороны, сопоставленными по контрасту с плотностью рассеяния окружающей клеточной среды.Пластинчатый форм-фактор характеризуется зависимостью q −2 при низком уровне — q , возникающей из поверхности двумерной мембраны всей бактерии, переходящей к зависимости q −4 , типичной для трехмерных объектов с гладкие поверхности и острые границы раздела — более подробная информация доступна в литературе [41–44], а также в материалах и методах .

Вычитание фона из рассеяния образца показало чистый мембранный спектр, который демонстрировал пластинчатый форм-фактор, характерный для липидного бислоя (рис. 3b), с ожидаемой зависимостью q −2 при низком уровне — q (пунктирная линия линия).Подгонка данных (сплошная красная линия) показала, что средняя гидрофобная толщина мембраны (2 D C ) составляла 24,3 ± 0,9 Å при 25 ° C (S8, рис.). Гидрофобная толщина живого B . Таким образом, мембрана subtilis сравнима с мембраной синтетических фосфатидилхолиновых (PC) бислоев, таких как димиристоил PC (2 D C = 25,7 Å при 30 ° C) или 1-пальмитоил-2-олеоил PC (2 D C = 28.8 Å при 30 ° C). [46] Он также сопоставим с очищенными базолатеральными плазматическими мембранами гепатоцитов крыс (приблизительно 26 Å), как измерено с помощью малоуглового рассеяния рентгеновских лучей [6], подчеркивая сохранение структуры мембран в царствах животных и эубактерий.

Определение латеральной структуры мембраны in vivo с помощью SANS

Наконец, мы попытались изучить боковую структуру внутри мембраны, чтобы определить, присутствуют ли липиды в B . Мембраны subtilis и однородно перемешаны или демонстрируют наноскопическую организацию, как предсказывает гипотеза липидного плотика.[21] Считается, что канонические липидные домены млекопитающих обогащены высокоплавкими липидами, холестерином и сфингомиелином. Бактерии обычно лишены этих липидов, но, тем не менее, считается, что липидные домены [47–53] образованы из видов липидов, играющих аналогичные роли. [54,55] Ожидаемым признаком липидных доменов в любой системе является латеральное разделение липидов с более высокой и низкой температурой плавления с ассоциированными белками на отдельные фазы.

Мы недавно ввели стратегию вариации контраста для обнаружения латеральной липидной организации в синтетических везикулах с использованием SANS [28,29].Эта стратегия основана на дифференциальной H / D-маркировке липидных фаз для контроля контраста в плоскости мембраны. С помощью подходящей стратегии мечения разделенные фазы можно либо сопоставить, либо сопоставить друг с другом и с буфером. Особенно важным является случай, когда смесь липидов имеет средний контраст, соответствующий таковому у буфера, но разделяется на H- и D-обогащенные фазы, которые контрастируют друг с другом и с буфером. Экспериментально равномерное перемешивание создает условие нулевого рассеяния, тогда как разделение фаз в плоскости мембраны (образование доменов) вызывает нейтронный контраст и наблюдаемый сигнал в спектре МУРН.На рис. S9 и в таблице F в тексте S1 мы представляем серию аналогичных экспериментов МУРН, которые показывают, как нейтроны чувствительны к контрасту в плоскости бислоя и как нейтронный контраст можно контролировать с помощью термически индуцированного смешивания двух фаз или путем выбора конкретных смеси изотопов, в результате которых получаются согласованные по контрасту фазы.

При адаптации этой стратегии in vivo сравнивается рассеяние от клеток с 2 различными смесями H- и D-FA, которые, в среднем, сопоставимы по контрасту со средой (рис. 4a).В контрольной смеси не может быть контраста независимо от того, равномерно ли смешаны мембранные липиды, потому что все виды присутствуют при одинаковом соотношении H / D. Однако в экспериментальной смеси рассредоточение липидов создает контраст, как описано выше, производя измеримое увеличение интенсивности рассеяния в результате локальных неоднородностей в распределении H / D.

Рис. 4. Обнаружение латеральной липидной организации в B . subtilis .

(а) Схема эксперимента.Контраст нейтронов в мембране контролировали с помощью различных смесей водородных (H) и дейтериевых (D) жирных кислот (ЖК). Контрольная смесь состояла из антеизопентадекановой кислоты (a15: 0) и нормальной гексадекановой кислоты (n16: 0), каждый из которых составлял 30% H и 70% D (вставка на фиг. 3b, красная кривая). Эта смесь согласована по контрасту с 85% D 2 O и дает только фоновое рассеяние независимо от того, равномерно ли распределены липиды (нижняя левая и нижняя центральная панели). Экспериментальная смесь содержала те же ЖК, но с другим распределением изотопов, т.е.е., n16: 0 соответствует 100% D, а a15: 0 соответствует 40/60 H / D. В Б . subtilis , эта смесь дает общее соотношение 30/70 H / D, потому что a15: 0 более распространено (рис. 2c, внизу). Если липиды распределены равномерно, мембрана будет согласована по контрасту и не будет давать чистого рассеяния над фоном (неотличимо от контрольной нижней центральной панели). Однако, если липиды организованы таким образом, что тугоплавкие n16: 0 и легкоплавкие a15: 0 в мембранных липидах распределены неравномерно, возникнет нейтронный контраст и сигнал рассеяния, как показано на нижней правой панели (a ) и в (c), которые имеют пятна, обогащенные n16: 0.Подобно тому, как эти пятна создают контраст, видимый глазом на иллюстрации, они создают контраст, видимый нейтронами в эксперименте, в виде избыточного рассеяния. (б) Спектры малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН) обработанного церуленином B . subtilis Δ yusL , включающий экспериментальную и контрольную смеси. Экспериментальная смесь демонстрирует явное избыточное рассеяние (вставка), которое может быть результатом только неравномерного распределения липидов с разным контрастом.Из соотношения ℓ = 2π / q можно заключить, что избыточное рассеяние в диапазоне q = 0,01–0,15 Å –1 соответствует структурам с масштабами длины 3–40 нм. Планки погрешностей соответствуют ± σ . См. Данные S4. Анализ мембранных ЖК с помощью газовой хроматографии / масс-спектрометрии (ГХ / МС) представлен на рис. S10. (C) Изображение мембраны, имеющей видимые липидные пятна (произвольной структуры), при этом буфер, клеточная стенка и цитоплазматическое содержимое контрастируют -подобный.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.g004

Мы реализовали эту стратегию для обработанного церуленином B . subtilis Δ yusL клеток с использованием экспериментальной смеси 100% D n16: 0 (тугоплавкие) и 40/60 H / D a15: 0 (легкоплавкие). После корректировки на относительное содержание этих ЖК в клетке (S10 рис.) Эта смесь создает средний контраст мембраны, соответствующий соотношению H / D FA 30/70 (a15: 0 и n16: 0, каждое 30% H и 70% D), используемый для контрольной смеси (вставка на фиг. 4b), а также остальных клеточных компонентов, включая 85% буфер D 2 O.Спектры МУРН от B . subtilis , подаваемый экспериментальной смесью, воспроизводимо демонстрировал избыточное рассеяние в диапазоне q 0,015–0,2 Å -1 по сравнению с клетками, получавшими контрольную смесь (результаты повторного эксперимента показаны на S11 Фиг.). Поскольку единственным источником контраста в эксперименте был пул мембранных H / D FA, этот результат подтверждает представление о латеральном рассмешивании липидов, содержащих высокоплавкие и легкоплавкие ЖК, в масштабе от 3 до 40. нм (= 2π / q ) (рис. 4c), что согласуется с гипотезой липидного рафта.

Обсуждение

Понимание того, как наноразмерная структура биологических систем соотносится с функциями, — непростая и постоянная задача. Одна из трудностей заключается в том, что только несколько зондов способны напрямую опрашивать структуру в этом масштабе: электроны, рентгеновские лучи и нейтроны. Электроны получили самое широкое применение в клеточной биологии, и ЭМ остается самым мощным инструментом для изучения ультраструктуры клеток. Что касается B . Мембрана subtilis , крио-ЭМ исследование секционированных замороженных клеток предоставило поразительную картину клеточной архитектуры, включая клеточную стенку.[56] Однако структура плазматической мембраны не была хорошо определена, и ее толщина была оценена в 66 ± 8 Å, что является удивительно большим значением. Наши результаты дополняют эту ЭМ-картину клеточной оболочки, обеспечивая определение гидрофобной толщины с высоким разрешением, полученное в физиологических условиях.

Рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов широко использовалось для изучения структуры модельных мембран, состоящих из определенных липидных смесей [3–5,28,29,46] или природных липидных экстрактов.[6–12] Рассеяние рентгеновских лучей недавно также использовалось для исследования клеточных мембран ex vivo [6], но его применение к интактным клеткам затруднено из-за фонового рассеяния от воды и биомолекул. Рассеяние нейтронов однозначно решает проблему фона в виде изменения изотопического контраста. Мы показали здесь, что изменение контраста in vivo посредством метаболического мечения может эффективно подавлять рассеяние из сложной клеточной среды, выделяя при этом конкретные интересующие особенности, даже когда они возникают из-за второстепенных компонентов, таких как липиды (примерно 1% влажной клеточной массы).Более того, холодные нейтроны, используемые для экспериментов по рассеянию, хорошо подходят для исследований живых клеток из-за их низкой кинетической энергии (<0,025 эВ) и их неионизирующего характера - в отличие от высокоэнергетических рентгеновских лучей и электронных пучков (> 5000 эВ). .

Предыдущие применения рассеяния нейтронов in vivo основывались только на внешнем контрасте растворителя, которого в некоторых случаях было достаточно для наблюдения брэгговского рассеяния на повторяющихся структурах в тилакоидных мембранах [57,58] и митохондриях.[59] Эти исследования не выявили мембранную структуру как таковую, но предоставили информацию о расположении плотно упакованных мембран. Создавая внутренний контраст, то есть путем дифференцированной маркировки определенных клеточных компонентов, мы впервые обеспечили ультраструктурные измерения с высоким разрешением на одной мембране. В этой работе мы продемонстрировали возможности основанного на химии и биологии подхода к созданию селективного внутреннего контраста, что позволяет проводить измерения толщины мембран in vivo с высоким разрешением.

Наш подход к вариации контраста in vivo также предоставляет новый инструмент для изучения структуры латеральной мембраны в живых клетках. Структурные методы, основанные на нейтронах, предлагают явные преимущества в том, что они напрямую сообщают о наноскопической структуре липидов, без необходимости использования моделей или внешних зондов. Признаки неравномерного перемешивания [60,61] в плазматической мембране появились одновременно с эпохальной жидко-мозаичной моделью, предложенной в 1972 году [16], концепция мембранных доменов стала прочно обоснованной к середине 1970-х годов [62], а липидный плот Гипотеза была формализована в 1997 году.[21] Тем не менее, существование липидных доменов остается спорным, [63] и поскольку они считаются временными и меньше дифракционного предела света (200 нм), они ускользают от наблюдения с помощью обычных микроскопических методов. Однако недавно флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения была использована для идентификации диффузно ограниченных островков в масштабе 20 нм в плазматической мембране эпителиальных клеток почек крысы [6]. Наше наблюдение сегрегации липидов в сопоставимых масштабах в плазматической мембране B . subtilis согласуется с существованием аналогичных липидных доменов у бактерий и поддерживает идею о том, что наноскопические липидные ансамбли являются неотъемлемой особенностью биологических мембран.

Критическим барьером, который помешал применению методов рассеяния нейтронов с высоким разрешением in vivo, было отсутствие средств для создания внутреннего контраста. В этой работе мы преодолели барьер и показали, что B . subtilis — идеальная модельная система in vivo для применения стратегий изменения нейтронного контраста.Благодаря специфическим условиям роста и выбранным генотипам мы смогли глобально ослабить клеточный контраст и точно повторно ввести контраст в мембрану. Обладая способностью контролировать как химические, так и изотопные свойства липидов мембран, мы смогли исследовать как поперечную, так и латеральную структуру мембраны. Тот же общий подход к селективному контрастированию потенциально может быть распространен на другие биомолекулы и модельные организмы для приложений вне мембранной арены. Более того, экспериментальная платформа in vivo может быть использована для исследования реакции плазматической мембраны на широкий спектр физических, химических, генетических и экологических стимулов.Мы ожидаем, что эта возможность окажется полезной во многих областях, таких как разработка антибиотиков, производство биотоплива, функция мембранного белка и понимание взаимодействия между мембраной, цитоскелетом и клеточной стенкой в ​​создании защитного, адаптируемого, многофункционального интерфейса.

Материалы и методы

Материалы

Оксид дейтерия (99,9% D) и аминокислоты водорослей (немеченые и однородно меченные D, с изотопной чистотой 98%) были получены из Cambridge Isotope Laboratories.Пальмитиновая кислота (H-n16: 0) и пальмитиновая кислота-d 31 (D-n16: 0) были получены от Sigma-Aldrich. 12-Метилтетрадекановая кислота (H-a15: 0) была приобретена у Sigma-Aldrich или получена из s -бутилхлорида магния (Sigma-Aldrich) и 11-бромундекановой кислоты (Sigma-Aldrich) по методу Баера и Карни. [64] и очищен вакуумной перегонкой. Педейтерированный D-a15: 0 получали из H-a15: 0 через 3 цикла обмена H / D с D 2 O, катализируемого 10% Pt / C при 220 ° C, как описано Yepuri et al., [65] с последующей хроматографией на силикагеле и вакуумной перегонкой. Конечный продукт был химически гомогенным и имел изотопную чистоту 99%, как определено анализом его производного метилового эфира с помощью ГХ / МС. Церуленин получали от Alfa Aesar (Тевскбери, Массачусетс) и хранили в темноте при –80 ° C в виде твердого вещества. Бычий сывороточный альбумин без ЖК (BSA, каталожный номер A8806) был получен от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Все остальные материалы были получены от коммерческих поставщиков и использовались в том виде, в котором они были получены.

Условия культивирования, подготовка образцов и жизнеспособность клеток

Б . subtilis 168 (родительский штамм) и мутант Δ yusL (штамм BKE32840) были получены из Bacillus Genetic Stock Center (Государственный университет Огайо, Колумбус, Огайо). Штамм Δ yusL лишен активности еноил-КоА-гидратазы / 3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы и сильно не обладает способностью расщеплять экзогенные длинноцепочечные ЖК; [36] поэтому этот штамм использовался во всех экспериментах, в которых использовались экзогенные ЖК. поставляется в среде культивирования.Общий рост и обслуживание B . subtilis выполняли либо на богатой среде Лурия-Бертани (LB), либо на минимальной среде M9 с 2% глюкозы с добавлением 5 мМ l-триптофана. Твердые среды были приготовлены путем добавления 1,5% Bacto или благородного агара (Difco) к среде LB или M9 соответственно. Эритромицин добавляли до 0,5 мкг / мл для обычного поддержания BKE32840. Культуры инкубировали при 37 ° C, а жидкие культуры аэрировали встряхиванием со скоростью 250 об / мин. Где применимо, дополнительные ЖК добавляли до конечной концентрации 8 мг / л каждого из растворов a15: 0 и n16: 0 из 25 мг / мл исходных растворов в этаноле вместе с 10 г / л БСА без ЖК в качестве носителя для способствует растворимости.Церуленин (10 мг / мл в исходном растворе этанола) готовили свежим и добавляли непосредственно перед инокуляцией. Требуемая конечная концентрация определялась эмпирически и варьировалась в зависимости от поставщика и партии. Для работы, описанной здесь, церуленин от Alfa Aesar был использован в конечной концентрации 50 мкг / мл, что было достаточно для полного подавления эндогенного синтеза ЖК, о чем судили по ингибированию роста и спасения за счет экзогенной ЖК (S5 Фиг.).

Частично дейтерированные клетки выращивали в M9, приготовленные с использованием 90% об. / Об. D 2 O и H-глюкозы.Эта среда производила примерно 60–70% дейтерирования углеродных скелетов в биосинтетических молекулах (анализ описан ниже). Б . subtilis 168 и BKE32840 были адаптированы для роста в M9-Gluc + 5 мМ l-триптофана, приготовленного с 90% ( об / об ) D 2 O путем серийного пассажа (посевной материал 1: 100) в среде, приготовленной с увеличением концентрации D 2 O (H 2 O: D 2 O 100: 0, 50:50 и 10:90). Обработанные церуленином клетки с добавкой FA выращивали, начиная с культуры необработанных клеток без добавок.Заквасочную культуру (OD 600 0,8–1,0) разводили 1:20 в среде церуленин / FA до OD 600 , равной ок. 0,05, инкубировали для роста до OD 600 0,8–1,0, затем пассировали путем разведения (1:20) в свежую среду. Состав FA контролировали при каждом пассаже с помощью ГХ / МС; 5-8 пассажей требовалось для очистки нативных FA и адаптации клеток к FA-зависимому состоянию. Контрольные культуры без предоставленных FA (контроль без роста) контролировали параллельно для каждого эксперимента, чтобы гарантировать, что церуленин оставался активным в течение периода инкубации.Оптическую плотность определяли при 600 нм, используя планшет-ридер Synergy Mx (BioTek, Winooski, VT, USA), используя 96-луночный микротитровальный планшет и объемы лунок 300 мкл.

Для экспериментов с контрастом (рис. 1 и 2 и рис. S2): B . subtilis 168 клеток ресуспендировали в PBS (10 мМ Na 2 HPO 4 , 1,8 мМ KH 2 PO 4 , 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl), приготовленных либо с H 2 O или D 2 O (H-PBS или D-PBS, соответственно), затем смешанные в соответствующих пропорциях.Для всех H-клеток (рис. 1c) 250 мл свежей культуры (OD 600 = 1,5) в среде H-M9 были разделены на 2 части, которые обрабатывались параллельно. Клетки собирали центрифугированием при 6000 × g в течение 20 минут при 4 ° C, затем промывали центрифугированием / ресуспендированием с 3 × 10 мл H- или D-PBS, давая 5 минут для уравновешивания на каждом этапе. Затем промытые осадки клеток ресуспендировали в 11 мл того же буфера для обеспечения концентрации клеток приблизительно 50 мг / мл сырого веса, что эквивалентно приблизительно 10 мг / мл сухого веса.Для дейтерированных клеток (рис. 2) применялась та же процедура, за исключением того, что использовалась 125-мл культура, выращенная в D-M9, приготовленная с 90% D 2 O, обеспечивающая конечную концентрацию клеток приблизительно 5 мг / мл сухой массы. . Суспензии клеток загружали в кварцевые «банджо» ячейки (диаметр 22 мм, длина пути 1 мм) для исследования методом SANS. Измерения проводились при 37 ° C с использованием одного положения детектора, и общее рассеяние анализировалось, как описано ниже.

Для структурного анализа мембран (рис. 3 и 4, рис. S7 и S11), с подачей ТВС B . subtilis 168 Δ yusL клеток выращивали в M9-Gluc, приготовленном с 90% D 2 О. Клетки из 35-мл культуры собирали при OD 600 0,5, промывали 3 × 3 мл PBS, приготовленный с 85% D 2 O и ресуспендированный в 1 мл того же буфера, обеспечивая конечную концентрацию клеток приблизительно 5 мг / мл сухой массы. Из-за того, что требуется длительное время сбора данных (до 4 ч), глюкоза (0,1% мас. / Об. ), MgSO 4 (10 мМ) и церуленин (50 мкг / мл) были добавлены в окончательный буфер для ресуспендирования. , pH снизился до 6.8, и измерения проводились при 25 ° C, чтобы продлить жизнеспособность клеток и минимизировать автолиз. [39,40] Как обсуждается ниже в разделе «Жизнеспособность и целостность клеток » и показано на фиг. S6 и S7, клетки оставались жизнеспособными на> 90% и отображались. согласованные спектры МУРН в течение 4 часов в этих условиях.

Экстракция клеточных липидов и получение FAME

Липиды были извлечены из клеток и охарактеризованы на содержание ЖК с помощью ГХ / МС производных FAME (схематическое описание представлено на рис. S4).Экстракты общих липидов были приготовлены с использованием модификации [66] метода Блая и Дайера. [67] Вкратце, клетки осаждали центрифугированием при 6000 × g в течение 15 минут с последующими 3 промывками в 1% (мас. / Об.) NaCl. Образцы лиофилизировали в стеклянных пробирках объемом 10 мл с завинчивающимися крышками с тефлоновым покрытием, в каждую из которых последовательно добавляли 0,5 мл хлороформа, 1 мл метанола и 0,4 мл воды при энергичном перемешивании на каждой стадии. Эта смесь образует единую фазу, и ее оставляют на 18 ч при комнатной температуре с периодическим перемешиванием.Через 18 ч разделение фаз вызывали добавлением 0,5 мл хлороформа и 0,5 мл воды. Липиды выделяли из нижней фазы хлороформа испарением растворителя в новой стеклянной пробирке объемом 10 мл в токе аргона. МЭЖК получали кислотным метанолизом высушенных липидных экстрактов или интактных клеток. [68] Растворители, если они присутствовали, выпаривали в потоке аргона перед добавлением 1 мл концентрированной HCl / метанола (10% об. / Об.). Затем пробирку продували аргоном, герметично закрывали и нагревали до 85 ° C в течение 2 часов.После охлаждения добавляли 1 мл воды и 1 мл гексана и содержимое перемешивали на вортексе. После разделения фаз часть (примерно 700 мкл) верхней фазы отбирали для анализа ГХ / МС.

Получение и дериватизация клеточных аминокислот

Клеточные аминокислоты были проанализированы с помощью ГХ / МС, как описано Даунером и Зауэром. [69] Клетки из 10 мл культуры с OD 600 ≈ 0,7 собирали центрифугированием, промывали 3 раза водой путем ресуспендирования / центрифугирования и хранили замороженными.Для анализа клетки ресуспендировали в 1 мл воды в микроцентрифужной пробирке и лизировали ультразвуком. После центрифугирования при 14000 × g в течение 15 минут порцию супернатанта объемом 500 мкл переносили в стеклянный флакон и смешивали с 1,5 мл 6 М HCl. Стандартные растворы готовили из смесей аминокислот H- или D-водорослей и обрабатывали таким же образом. Флаконы закрывали крышками с тефлоновым покрытием и нагревали при 110 ° C в течение 24 часов для гидролиза белка, после чего летучие вещества удаляли роторным испарением.Гидролизаты ресуспендировали в тетрагидрофуране (100 мкл) и N трет -бутилдиметилсилил- N -метилтрфторацетамид (100 мкл), а затем нагревали до 60 ° C в течение 1 ч с получением трет-метилметилсилил-амино-бутилированной кислоты. подходит для анализа ГХ / МС. Перед анализом образцы разбавляли гексаном 1:10 (об. / Об.).

ГХ / МС

Анализ

ГХ / МС выполняли с использованием газового хроматографа Agilent 5890A с масс-чувствительным детектором 5975C, работающим в режиме электронного удара (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния).Прибор был оснащен капиллярной колонкой HP-5ms (длиной 30 м, внешним диаметром 0,25 мм и толщиной покрытия 0,25 мкм) с использованием гелия со скоростью 1 мл / мин в качестве газа-носителя. Образцы объемом 1 мкл вводили с использованием безразделенной инъекции при температуре на входе 270 ° C. МЭЖК элюировали с использованием 2-минутной температурной программы при 60 ° C; От 20 ° C / мин до 170 ° C; От 5 ° C / мин до 240 ° C; и от 30 ° C / мин до 300 ° C в течение 2 мин. Дериватизированные аминокислоты элюировали с температурной программой 2 мин при 100 ° C; От 10 ° C / мин до 280 ° C в течение 2 мин.; и от 25 ° C / мин до 325 ° C в течение 2 минут. Присвоение пиков, интегрирование и масс-спектральный анализ выполняли с использованием программного обеспечения прибора ChemStation Enhanced Data Analysis и базы данных масс-спектров NIST. Пики для дейтерированных соединений были идентифицированы на основе времени удерживания и спектрального сравнения с недейтерированными соединениями. Степень дейтерирования оценивали путем определения увеличения молекулярной массы исходных ионов FAME (таблица B в тексте S1) или выбранных фрагментных ионов для аминокислот (таблица C в тексте S1).

SANS

Данные

SANS были собраны с помощью Bio-SANS [70] и малоуглового нейтронного спектрометра с расширенным Q-диапазоном (EQ-SANS) [71] в реакторе изотопов с высоким потоком и источнике нейтронов расщепления соответственно, расположенных в Оук. Риджская национальная лаборатория. Данные двумерного рассеяния от обоих приборов были сокращены с помощью программного обеспечения Mantid [72] и нормализованы по стандарту пористого кремнезема для установления абсолютной шкалы, а также скорректированы на чувствительность пикселей, темновой ток и пропускание образца.Фоновое рассеяние было вычтено из одномерной интенсивности по сравнению с q , что определяется как: (1) где λ — длина волны нейтронов, а 2θ — угол рассеяния относительно падающего луча. В EQ-SANS данные были собраны в режиме 60 Гц с двумя конфигурациями приборов: расстояние от образца до детектора 1,3 м с нейтронами 4–7 Å ( q = 0,050–0,4 Å −1 ) и 4,0 м. расстояние от образца до детектора с нейтронами 10–13,4 Å ( q = 0,009–0,07 Å −1 ), что дает общий диапазон q от приблизительно 0.009 до 0,4 Å -1 . В BioSANS нейтроны 6 Å использовались на двух расстояниях от образца до детектора, 2,5 м ( q = 0,050–0,30 Å −1 ) и 15,3 м ( q = 0,005–0,060 Å −1 ), что дает всего q -диапазон от 0,005 до 0,30 Å -1 . Время сбора не превышало 4 ч, после чего было определено, что жизнеспособность клеток выше 90%, как показано ниже в разделе «Жизнеспособность клеток и целостность образца » (S6 и S7, фиг.). Данные по рассеянию клеток не демонстрируют статистически значимого изменения интенсивности рассеяния через 4 часа (S7, фиг.).

Модельные липидные смеси (S9 Fig) были получены с использованием синтетических липидов Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) и приготовлены следующим образом: липиды растворяли в хлороформе, диспергировали в виде пленки путем выпаривания в 20-миллилитровом сцинтилляционном флаконе и сушили в течение ночи. под вакуумом (> 6 ч). Затем липидные пленки повторно гидратировали в подходящем изотопном растворителе (H 2 O, D 2 O или их комбинации) и подвергали 5 циклам замораживания-оттаивания перед экструзией через протравленную дорожку с диаметром пор 100 нм. поликарбонатные мембранные фильтры.Конечная концентрация везикул для измерений рассеяния составляла 10 мг / мл.

Данные, использованные для экспериментов по контрастированию (рис. 1 и 2), были собраны с помощью EQ-SANS для 0,009 Å -1 < q <0,06 Å -1 . Данные оценивались как инвариант Порода: (2)

Пропорциональность Q * общей интенсивности рассеяния I (0) делает его полезным показателем для сравнения с независимыми от структуры оценками I (0), основанными только на составе и плотности длины рассеяния, ρ . V p — объем Порода. Для анализа ацильной толщины бислоя данные были смоделированы с использованием выражения: [73] (3) для произвольного числа бислоев, N , объема, V s , с плотностью длины рассеяния ρ s , в растворителе ρ м , где F ( q ) — форм-фактор, описывающий пластинчатую форму, и ( ρ м — ρ s ) — контрастный член.Закон рассеяния, используемый для моделирования данных, представлял собой пластинчатый форм-фактор, представляющий углеводородное ядро ​​бислоя, с двумя идентичными областями головной группы с каждой стороны, с плотностями рассеяния, соответствующими плотности рассеяния окружающей клеточной среды. Подбор данных SANS был выполнен в SASview. [74]

Оценка молекулярного и клеточного рассеяния

Оценки полного рассеяния от B . subtilis (Фиг.1 и 2) получали следующим образом. Сигнал рассеяния нейтронов возникает, когда существует разница в плотности длины рассеяния нейтронов, ρ , между разновидностью, s , и средой, в которой он находится, m .Разница ( ρ м −ρ s ) называется контрастом, и интенсивность рассеяния пропорциональна его квадрату. Для любого вида, (4) где n — количество атомов, b — длина когерентного рассеяния нейтронов для каждого атома, а V — объем частицы. Поскольку каждый класс биомолекул (то есть белок, липид, углевод, РНК или ДНК) имеет почти постоянный химический состав и плотность, ρ хорошо аппроксимируется как единое значение для каждого класса (таблица A в тексте S1).[30]

Мечение дейтерием увеличивает ρ немеченой молекулы ( ρ H ), поскольку длина рассеяния b больше для D, чем для H (6,67 против –3,74 фм) [31]. В биомолекулах атомы водорода можно разделить на 2 категории: атомы, связанные с углеродом (CH), которые не обмениваются с водой, и атомы, связанные с гетероатомами (XH, X = N, O или S), которые обмениваются с воды. Доли в двух категориях согласованы внутри каждого класса биомолекул, что позволяет дать определение терминов Δ ρ CD и Δ ρ XD , которые представляют собой увеличение ρ в результате полное дейтерирование каждой категории.Для дейтерированной биомолекулы: (5) где ρ H составляет ρ для немеченой (полностью H) молекулы, а f XD и f CD — доли замещения дейтерия в категориях XH и CH соответственно. Оценки (рис. 1b и 2a) были получены с использованием уравнения 5 и значений для ρ H , Δ ρ XD и Δ ρ CD в таблице A в тексте S1. Разные наклоны для каждого класса биомолекул отражают различия в Δ XD .

Общее рассеяние от клетки, I клетка (0), представляет собой сумму вкладов рассеяния от всех биомолекулярных видов клетки, определяемых соотношением (6) где χ s — объемная доля каждого компонента. (все виды s , включая внутриклеточную воду).Когда ρ s = ρ m , частицы сопоставимы по контрасту и, таким образом, фактически невидимы для нейтронов, при условии, что среда однородна. Рассеяние, относящееся к отдельному виду j , определяется по формуле: (7)

В недейтерированной клетке χ j для биомолекул достаточно велико, а ρ j настолько отличается, что окружающая среда не является действительно однородной.В результате общее рассеяние для данного вида j отражает межвидовой контраст и не обнуляется полностью при номинальном совпадении контраста, определяемом средним значением (χ j = χ m ). Однако разумное дейтерирование можно использовать для сведения ρ для воды и большинства биомолекул (см. Рис. 1b и 2a), эффективно подавляя межвидовые вклады.

Знание клеточного состава (таблица A в тексте S1) позволяет оценить общее клеточное рассеяние — разбитое на биомолекулярные частицы как функцию дейтерирования в растворителе и в скелетах CH различных биомолекул (рис. 1c и 2d). .Примерно 80% от сухой массы B . subtilis Клетка состоит из белка (53%), РНК (18%), ДНК (2,6%), липидов (5,2%) и углеводов (2,8%). [33] Оставшаяся масса — которой мы пренебрегли в наших оценках — состоит из небольших органических молекул, таких как аминокислоты, кофакторы и нуклеотиды, плюс неорганический материал. Эти данные были использованы с уравнениями 6 и 7 для расчета предсказанного полного рассеяния на рис. 1c.

Расчетное рассеяние для клеток, выращенных в D-M9 (рис. 2b), основано на анализе липидов и белков, экстрагированных из B . subtilis в соответствующих условиях для корректировки ρ в соответствии с уравнением 5. Чистое дейтерирование пула ЖК в отсутствие церуленина и дополнительных ЖК составляло 68,5%, при этом дейтерирование отдельных ЖК варьировалось от 66% до 71% (Таблица B в тексте S1). Дейтерирование аминокислотного пула было более вариабельным и имело более низкое среднее дейтерирование 60% (таблица C в тексте S1), что аналогично тому, что можно было бы ожидать в Escherichia coli . [75] Значение 70% было предполагалось для других биомолекул, и предполагалось, что степень дейтерирования в водообменных позициях соответствует таковой для среды.

Жизнеспособность клеток и целостность образца

Жизнеспособность клеток

оценивали с помощью измерений оптической плотности, ручного подсчета клеток с помощью гемоцитометра и флуоресцентного окрашивания живых / мертвых клеток с помощью набора BacLight Bacterial Viability Kit (номер по каталогу L7012, Molecular Probes, Юджин, штат Орегон). В анализе живых / мертвых клеток используется смесь двух флуоресцентных красителей нуклеиновых кислот (SYTO 9 и йодид пропидия), которые окрашивают живые клетки в зеленый цвет, а мертвые клетки с поврежденными мембранами — в красный цвет. Флуоресцентные микрофотографии окрашенных клеток получали с помощью Zeiss Axioskop 2 Plus и анализировали с помощью ImageJ [76] для подсчета клеток с использованием зеленого и красного каналов флуоресценции.Необлученные суспензии штамма Δ yusL , приготовленные так же, как образцы, использованные для экспериментов на пучке нейтронов, использовали в качестве контроля. Суспензии клеток инкубировали в запечатанной кювете при 25 ° C, и оптическую плотность (OD 600 ) регистрировали с 1-минутными интервалами в течение 24 часов (S6a фиг.). Прямой подсчет клеток и окрашивание живых / мертвых необлученных образцов выполняли сразу после обработки и через 4 и 24 часа (S6b Рис.). Эти эксперименты показали тесное соответствие между тремя показателями жизнеспособности и что клетки оставались жизнеспособными на 90% в течение 4 часов и на 50–60% в течение 24 часов в условиях эксперимента.Облученные клеточные суспензии были взяты из нейтронного пучка после сбора данных и оставлены на распад в течение примерно 30 минут, после чего они были подвергнуты радиологическому исследованию. Протоколы радиологической безопасности не позволяют своевременно извлекать суспензии клеток для микроскопического исследования. Вместо этого измерения оптической плотности клеток через 4 и 24 часа проводили с использованием спектрофотометра Shimadzu UV-2700 UV-Vis (S6a, рис.). Стабильность FA контролировали в течение 4 часов, которые потребовались для сбора полного набора данных SANS с использованием ГХ / МС, как описано выше для необлученных образцов (S7 Рис).Наконец, стабильность ячейки в нейтронном пучке была оценена путем повторения измерения SANS через 3,5 часа после того, как ячейки были помещены в пучок, показав отсутствие изменений в интенсивности рассеяния (S7, фиг.).

Дополнительная информация

S1 Рис. Относительная чувствительность различных датчиков к элементному составу.

Для нейтронов и рентгеновских лучей радиусы кружков масштабируются до длины рассеяния, которая пропорциональна атомному номеру Z для рентгеновских лучей и не связана с Z для нейтронов.Водород ( 1 H) отличается от других элементов, показанных тем, что его длина рассеяния b отрицательна, и соответствующий кружок окрашен в красный цвет, чтобы отметить это различие. Для электронов площади масштабируются до сечений упругого рассеяния, которые приблизительно пропорциональны Z 3/2 . [77] Мощность рассеяния нормирована на кислород ( Z = 8).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s001

(TIF)

S2 Рис.Необработанные данные SANS.

Исходные данные для экспериментов с серией контрастов показаны в основном тексте как ( a ) Рис. 1c и ( b и c ) 2d . Малоугловое рассеяние измеряли как функцию% D 2 O в буфере. Данные в S5 Data, которые необходимо скорректировать для инструментального фона и фона растворителя и масштабировать до стандарта пористого кремнезема. Инвариант Порода был оценен из этих измерений, как в наблюдаемом диапазоне q от 0,009 Å -1 < q <0.06 Å -1 . Эта величина, Q *, прямо пропорциональна I (0) [ I (0) / Q * = V P / 2π 2 , где V P — объем Порода), что делает его полезным показателем для сравнения с расчетными значениями I (0).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s002

(TIF)

S3 Рис. Схема протокола экстракции жирных кислот и метанолиза.

Общую липидную фракцию экстрагировали из аликвоты клеток с использованием метода Блая-Дайера.После экстракции фазу, содержащую нижний липид, сушили в атмосфере аргона и липиды нагревали в кислом метаноле для получения метиловых эфиров жирных кислот, которые затем экстрагировали гексаном и анализировали с помощью ГХ / МС.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s003

(TIF)

S4 Рис. Сводка ГХ / МС анализа липидных экстрактов немодифицированного

B . subtilis , выращенный в условиях H 2 O и 90% D 2 O.

(a) Общие ионные хроматограммы ГХ / МС для МЭЖК, экстрагированных из B . subtilis , выращенный в среде M9, приготовленной с H-глюкозой и либо H 2 O (черный, вверху), либо 90% D 2 O (красный, внизу). Фосфолипиды в нативной мембране B . subtilis содержат смесь насыщенных линейных (нормальных) и разветвленных (изо- или антеизо-) жирных кислот, показанных в (b). Как и ожидалось, 7 FAME наблюдали из клеток, культивированных в 90% D 2 O (a, нижняя панель). Дейтерированные FAME элюировались раньше, и связанные с ними пики были шире из-за присутствия нескольких изотопомеров для каждого вида.(c) и (d) показывают масс-спектры для каждого FAME из клеток, выращенных в H- или D-среде, соответственно. Из спектров определяли степень дейтерирования, отмечая изменение массы молекулярного иона [M] + • (таблица B в тексте S1 и данных S2). Распределение изотопмеров показано на (d).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s004

(TIF)

S5 Рис. FA-зависимый рост

B . subtilis BKE32840 в присутствии церуленина.

Рост клеток сильно подавлялся в присутствии церуленина (Cer; 50 мкг / мл). Однако рост может быть предотвращен добавлением экзогенных жирных кислот ( a 15: 0 + n 16: 0) в присутствии БСА, не содержащего жирных кислот, в качестве носителя, что обеспечивает химический и изотопный контроль клеточной мембраны. Состав FA. Показаны конечные значения оптической плотности (OD 600 ) для клеток, выращенных в минимальной среде M9, содержащей 5 мМ 1-триптофана, 2% глюкозы (за исключением случаев, где указано) и указанные добавки (см. Данные S6).Конечные измерения регистрировали через 24 часа для контрольных условий (только BSA) и через 64 ​​часа для других условий, при которых клетки росли медленнее. Все эксперименты проводили в трех повторностях.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s005

(TIF)

S6 Рис. Устойчивость и жизнеспособность

B . subtilis клеток в суспензии.

Для исследований SANS при 25 ° C клетки суспендировали в 85% D 2 O PBS (pH 6,8), содержащем глюкозу (0.1% мас. / Об.), MgSO 4 (10 мМ) и церуленин (50 мкг / мл), а затем переносили в кварцевые кюветы в форме банджо с длиной пути луча 1 или 2 мм. После переноса клеток кюветы закрывали. Измерения МУРН проводились в течение максимум 4 часов. (а) OD 600 падает медленно в течение первых 8 часов и более быстро после этого. Голубые ромбы обозначают измерения OD 600 , сделанные для облученного образца, спектр МУРН которого показан на рис. 4. Падение OD 600 за период измерения 4 часа составило 5% для образца в пучке и 7% для образца. контрольный (необлученный), непрерывно контролируемый образец.(b) Плотность клеток также определяли прямым подсчетом с использованием гемоцитометра на аликвотах контрольного образца из (а). Плотность клеток соответствует измерениям OD 600 . (c) Долю интактных клеток (которые также оказались живыми) определяли количественно с использованием стандартной окраски живых / мертвых клеток на аликвотах непрерывно контролируемого образца из (а). В течение 24-часового периода наблюдения> 90% интактных клеток окрашивались в зеленый цвет, что указывает на превосходную жизнеспособность клеток и целостность мембран.Через 4 часа, что соответствует максимальному времени воздействия нейтронов на клетки, 95% клеток были живы (см. Данные S6). (d-f) Типичные ложно окрашенные, наложенные друг на друга микрофотографии флуоресценции с красным и зеленым каналами, соответствующие результатам, показанным на (c). Живые клетки выглядят зелеными, а мертвые клетки — красными, шкала соответствует 20 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s006

(TIF)

S7 Рис. Стабильность образца: содержание ЖК и повторные измерения рассеяния.

Содержание жирных кислот в течение периода измерений оценивали путем извлечения мембранных липидов, проведения кислотного метанолиза и количественного определения содержания FAME с помощью ГХ / МС. (а) Общие ионные хроматограммы показаны для липидов, экстрагированных из B . subtilis при сборе, после 4 часов инкубации, т.е. в условиях, которые соответствовали условиям измерений SANS, и через 24 часа инкубации в модифицированном буфере PBS. (б) Интегрированные площади пиков для хроматограмм в (а).Менее 1% изменения наблюдается для любой FA через 4 часа, и только 1-2% изменение через 24 часа вне культуры. (c) Повторное измерение рассеяния (розовый), выполненное через 2 часа после первоначального измерения, накладывается на данные, показанные на рис. 3 основного текста (синий). Этот результат разброса показывает, что образец стабилен в течение 4-часового периода сбора данных (см. Данные S6). Примечание: статистика повторных измерений хуже (следовательно, больше шума) просто из-за более короткого времени сбора.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s007

(TIF)

S8 Рис. Обработка данных для получения рассеяния

B . subtilis клеточная мембрана.

( a ) Остаточный фон регистрировали с использованием обработанных церуленином клеток Δ yusL , которым вводили смесь ЖК, сопоставленных по контрасту с 85% D 2 O ( a 15: 0 и n. 16: 0, каждое 30% H и 70% D), рассеяние образца регистрировали от клеток, культивируемых идентично, за исключением того, что в культуральной среде присутствовали H-a 15: 0 и H- n 16: 0.Вычитание фона из рассеяния образца выявило чистый спектр мембраны, который показал пластинчатый форм-фактор, характерный для липидного бислоя (рис. 3b). ( b ) Подгонка пластинчатого форм-фактора с посадками, иллюстрирующими огибающую модели ± 2σ и ± 4σ, наложенную на данные.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s008

(TIF)

S9 Рис. Стратегия изменения контраста, используемая для выявления латеральной липидной организации.

Мы демонстрируем, как нейтронный контраст можно манипулировать с помощью изотопного замещения, чтобы выявить латеральное рассмешивание с использованием везикул POPC / DSPC / Chol.(см. Таблицу F в S1 Text и S7 Data). Обнаружение рассмешивания требует наблюдения бислоя в двух состояниях: смешанном (розовый) и рассредоточенном (красный и синий). Этого можно достичь двумя способами. Первая (а, верхняя строка) сравнивает систему в двух разных состояниях (т.е. смешанном и рассредоточенном). При высокой температуре различные липиды NSLD равномерно смешиваются, при этом их средний NSLD соответствует среднему значению NSLD в буфере. Понижение температуры вызывает расслоение липидов. Хотя средний липидный NSLD не изменился, домены и окружение имеют NSLD, которые отличаются от NSLD буфера и друг друга, что приводит к избыточному рассеянию.Мы провели этот эксперимент, и результаты показаны на (б). Хотя этот подход можно успешно использовать, когда температура является переменной, его нельзя применять к живым клеткам, поскольку изменения температуры могут отрицательно повлиять на их жизнеспособность. В качестве альтернативы (а, нижняя строка) можно построить систему, в которой домены и окружение имеют одинаковое среднее значение NSLD, которое соответствует буферу. Это достигается за счет обеспечения всех компонентов одинаковым изотопным соотношением, так что один и тот же NSLD сохраняется независимо от того, смешаны ли липиды или нет.В этом сценарии сигнал рассеяния одинаков для обоих состояний, как показано на (c). Эта стратегия была адаптирована для B . subtilis эксперименты при 25 ° C, в которых использовалось только изотопное замещение, чтобы управлять контрастом в бислое.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s009

(TIF)

S11 Рис. Повторите SANS-наблюдение бокового размешивания жирных кислот в

B . subtilis .

( a ) Эксперименты, показанные на рис. 4, были повторены.Такое же избыточное рассеяние наблюдается в диапазоне q от ~ 0,015 до 0,15 Å -1 , подтверждая наличие наноскопических особенностей порядка 40 нм. ( b ) ГХ / МС хроматограммы липидов в этих мембранах (цвета соответствуют спектрам на панели ( a ), показывая ожидаемое H / D-распределение жирных кислот, аналогичное тому, которое показано на S10 Fig (см. S8 Данные).

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002214.s011

(TIF)

Благодарности

Благодарим Ф.A. Heberle за обсуждения и вклад, MA Matheson и JD Hemman за визуализацию изображений и мультимедийной графики, C. Gao и L. Walker за поддержку канала передачи, а также DT Reeves и K. Hong за помощь в подготовке и дейтерировании a15: 0 .

Ссылки

  1. 1. Хендерсон Р., Анвин PNT. Трехмерная модель фиолетовой мембраны, полученная с помощью электронной микроскопии. Природа. 1975. 257 (5521): 28–32. pmid: 1161000
  2. 2. Едидин М. Состояние липидных рафтов: от модельных мембран к клеткам.Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2003. 32: 257–83. pmid: 12543707
  3. 3. Нэгл Дж. Ф., Тристрам-Нэгл С. Структура липидных бислоев. Biochim Biophys Acta, Rev Biomembr. 2000. 1469 (3): 159–95.
  4. 4. Петраче Х.И., Додд С.В., Браун М.Ф. Распределение площади на липид и длину ацила в жидких фосфатидилхолинах, определенное с помощью спектроскопии ЯМР 2 H. Biophys J. 2000; 79 (6): 3172–92. pmid: 11106622
  5. 5. Силиг Дж., Силиг А. Конформация липидов в модельных мембранах и биологических мембранах.Q Rev Biophys. 1980. 13 (1): 19–61. pmid: 7220788
  6. 6. Mitra K, Ubarretxena-Belandia I, Taguchi T, Warren G, Engelman DM. Модуляция двуслойной толщины мембран экзоцитарного пути мембранными белками, а не холестерином. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101 (12): 4083–8. pmid: 15016920
  7. 7. Zaccai G, Blasie J, Schoenborn B. Исследования нейтронной дифракции на расположении воды в мембранах двухслойной лецитиновой модели. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1975. 72 (1): 376–80.pmid: 16592215
  8. 8. Herbette L, DeFoor P, Fleischer S, Pascolini D, Scarpa A, Blasie J. Раздельные профильные структуры функционального белка кальциевой помпы и фосфолипидного бислоя в изолированных мембранах саркоплазматической ретикулума, определенные с помощью рентгеновского излучения и нейтронной дифракции. Biochim Biophys Acta — Biomembr. 1985. 817 (1): 103–22.
  9. 9. Уилкинс М., Блаурок А., Энгельман Д. Двухслойная структура в мембранах. Природа. 1971. 230 (11): 72–6.
  10. 10. Шварц С., Каин Дж., Дратц Э., Блейси Дж.Анализ ламеллярной дифракции рентгеновских лучей на многослойных неупорядоченных мембранах с приложением к данным внешних сегментов стержня сетчатки. Biophys J. 1975; 15 (12): 1201–33. pmid: 1203447
  11. 11. Энгельман ДМ. Рентгеноструктурные исследования фазовых переходов в мембране Mycoplasma laylawii . J Mol Biol. 1970; 47 (1): 115IN13117–116.
  12. 12. Энгельман ДМ. Структура липидного бислоя в мембране Mycoplasma laylawii . J Mol Biol.1971. 58 (1): 153–65. pmid: 5088924
  13. 13. Эггелинг С., Рингеманн С., Медда Р., Шварцманн Г., Сандхофф К., Полякова С. и др. Прямое наблюдение за наномасштабной динамикой мембранных липидов в живой клетке. Природа. 2009. 457 (7233): 1159–62. pmid: 197
  14. 14. Браун Д.А., Лондон Э. Функции липидных рафтов в биологических мембранах. Annu Rev Cell Dev Biol. 1998. 14: 111–36. pmid: 98
  15. 15. Op den Kamp JAF. Липидная асимметрия мембран.Анну Рев Биохим. 1979; 48: 47–71. pmid: 382989
  16. 16. Певица С, Николсон Г.Л. Модель жидкой мозаики структуры клеточных мембран. Наука. 1972; 175: 720–31. pmid: 4333397
  17. 17. Спектор А.А., Йорек М.А. Состав мембранных липидов и клеточная функция. J Lipid Res. 1985. 26 (9): 1015–35. pmid: 38
  18. 18. ван Меер Г., Фолькер Д. Р., Фейгенсон Г. В.. Мембранные липиды: где они и как ведут себя. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008. 9 (2): 112–24.pmid: 18216768
  19. 19. Никелс Дж. Д., Смит Дж. С., Ченг X. Боковая организация, двухслойная асимметрия и межлистовое сцепление биологических мембран. Chem Phys Lipids. 2015; 192: 87–99. pmid: 26232661
  20. 20. Якобсон К., Моуритсен О.Г., Андерсон Р.Г.В. Липидные рафты: на перекрестке между клеточной биологией и физикой. Nat Cell Biol. 2007. 9 (1): 7–14. pmid: 17199125
  21. 21. Саймонс К., Иконен Э. Функциональные рафты в клеточных мембранах. Природа. 1997. 387 (6633): 569–72.pmid:
  22. 42
  23. 22. Аллен Дж. А., Халверсон-Тамболи Р. А., Расеник М. М.. Микродомены липидного рафта и передача сигналов нейротрансмиттерами. Nat Rev Neurosci. 2007. 8 (2): 128–40. pmid: 17195035
  24. 23. Шоу А.С. Липидные рафты: теперь вы их видите, а теперь нет. Nat Immunol. 2006. 7 (11): 1139–42. pmid: 17053798
  25. 24. Саймонс К., Эхехальт Р. Холестерин, липидные рафты и болезни. J Clin Invest. 2002. 110 (5): 597–603. pmid: 12208858
  26. 25. Саймонс К., Тоомре Д.Липидные рафты и передача сигналов. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000; 1 (1): 31–9. pmid: 11413487
  27. 26. Лингвуд Д., Саймонс К. Липидные рафты как принцип организации мембраны. Наука. 2010. 327 (5961): 46–50. pmid: 20044567
  28. 27. Мукерджи С, Максфилд Фр. Мембранные домены. Annu Rev Cell Dev Biol. 2004. 20: 839–66. pmid: 15473862
  29. 28. Heberle F, Petruzielo R, Pan J, Drazba P, Kučerka N, Standaert R и др. Несоответствие толщины двух слоев контролирует размер домена в модельных мембранах.J Am Chem Soc. 2013. 135 (18): 6853–9. pmid: 233

  30. 29. Никелс Дж. Д., Ченг Х, Мостофиан Б., Стэнли С., Линднер Б., Хеберле Ф. А. и др. Механические свойства наноскопических липидных доменов. J Am Chem Soc. 2015; 137 (50): 15772–80. pmid: 26415030
  31. 30. Жакро Б. Исследование биологических структур методом рассеяния нейтронов из раствора. Rep Prog Phys. 1976; 39 (10): 911–53.
  32. 31. Sears VF. Длины рассеяния и сечения нейтронов. Нейтронные новости.1992. 3 (3): 26–37.
  33. 32. Марти В., Яснин М., Фабиани Э., Воклар П., Габель Ф., Трапп М. и др. Рассеяние нейтронов: инструмент для обнаружения эффектов теплового стресса in vivo на уровне молекулярной динамики в микроорганизмах. J R Soc, Интерфейс. 2013; 10 (82): 20130003.
  34. 33. Бишоп Д., Рутберг Л., Самуэльссон Б. Химический состав цитоплазматической мембраны Bacillus subtilis . Eur J Biochem. 1967. 2 (4): 448–53. pmid: 4295208
  35. 34. Канеда Т.Биосинтез жирных кислот с разветвленной цепью. I. Выделение и идентификация жирных кислот из Bacillus subtilis (ATCC 7059). J Biol Chem. 1963. 238 (4): 1222–8.
  36. 35. Оп ден Камп ЯФ, Редай I, ван Динен, магистр права. Фосфолипидный состав Bacillus subtilis . J Bacteriol. 1969; 99 (1): 298–303. pmid: 4979443
  37. 36. Мацуока Х., Хироока К., Фудзита Ю. Организация и функция Ysia Regulon Bacillus subtilis , участвующего в деградации жирных кислот.J Biol Chem. 2007. 282 (8): 5180–94. pmid: 17189250
  38. 37. Price AC, Choi K-H, Heath RJ, Li Z, White SW, Rock CO. Ингибирование синтаз белка-носителя β-кетоацил-ацила с помощью тиолактомицина и структуры и механизма церуленина. J Biol Chem. 2001. 276 (9): 6551–9. pmid: 11050088
  39. 38. Вилле В., Эйзенштадт Э., Виллеке К. Ингибирование синтеза жирных кислот De Novo антибиотиком церуленином в Bacillus subtilis : влияние на цитрат-Mg 2+ Транспорт и синтез макромолекул.Антимикробные агенты Chemother. 1975. 8 (3): 231–7. pmid: 810081
  40. 39. Джоллифф Л.К., Дойл Р.Дж., Стрейпс ООН. Энергетическая мембрана и клеточный автолиз у Bacillus subtilis . Клетка. 1981; 25 (3): 753–63. pmid: 6793239
  41. 40. Сварачорн А., Синмё А., Цучидо Т., Такано М. Автолиз Bacillus subtilis , индуцированный одновалентными катионами. Appl Microbiol Biotechnol. 1989. 30 (3): 299–304.
  42. 41. Балгавы П., Дубничкова М., Кучерка Н., Киселев М.А., Ярадайкин С.П., Урикова Д.Толщина бислоя и площадь поверхности раздела липидов в однослойных экструдированных 1,2-диацилфосфатидилхолиновых липосомах: исследование малоуглового рассеяния нейтронов. Biochim Biochim Acta — Biomembr. 2001; 1512 (1): 40–52.
  43. 42. Kučerka N, Nagle JF, Feller SE, Balgavý P. Модели для анализа малоуглового рассеяния нейтронов на однослойных липидных пузырьках. Physical Review E. 2004; 69 (5): 051903.
  44. 43. Marquardt D, Heberle FA, Nickels JD, Pabst G, Katsaras J. О рассеянных волнах и липидных доменах: обнаружение мембранных рафтов с помощью рентгеновских лучей и нейтронов.Мягкая материя. 2015; 11 (47): 9055–72. pmid: 26428538
  45. 44. Kučerka N, Nagle JF, Sachs JN, Feller SE, Pencer J, Jackson A, et al. Структура липидного бислоя, определенная одновременным анализом данных рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей. Biophys J. 2008; 95 (5): 2356–67. pmid: 18502796
  46. 45. Nallet F, Laversanne R, Roux D. Моделирование спектров рассеяния рентгеновских лучей или нейтронов лиотропных ламеллярных фаз: взаимодействие между формами и структурными факторами. J. Phys II. 1993. 3 (4): 487–502.
  47. 46. Kučerka N, Nieh M-P, Katsaras J. Липидные области жидкой фазы и двухслойная толщина широко используемых фосфатидилхолинов в зависимости от температуры. Biochim Biophys Acta, Biomembr. 2011; 1808 (11): 2761–71.
  48. 47. Милейковская Е., Доухан В. Визуализация фосфолипидных доменов в Escherichia coli с использованием кардиолипин-специфичного флуоресцентного красителя 10- N -Нонилакридиновый апельсин. J Bacteriol. 2000. 182 (4): 1172–5. pmid: 10648548
  49. 48.Kawai F, Shoda M, Harashima R, Sadaie Y, Hara H, Matsumoto K. Кардиолипиновые домены в Bacillus subtilis Marburg Membranes. J Bacteriol. 2004. 186 (5): 1475–83. pmid: 14973018
  50. 49. Мацумото К., Кусака Дж., Нисибори А., Хара Х. Липидные домены в бактериальных мембранах. Mol Microbiol. 2006. 61 (5): 1110–7. pmid: 16925550
  51. 50. Донован С., Брамкамп М. Характеристика и субклеточная локализация гомолога бактериального флотилина. Микробиология (Лондон, Великобритания).2009; 155: 1786–99.
  52. 51. Лопес Д., Колтер Р. Функциональные микродомены в бактериальных мембранах. Genes Dev. 2010. 24 (17): 1893–902. pmid: 20713508
  53. 52. Бах Дж. Н., Брамкамп М. Флотилины функционально организуют бактериальную мембрану. Mol Microbiol. 2013. 88 (6): 1205–17. pmid: 23651456
  54. 53. Брамкамп М., Лопес Д. Изучение существования липидных рафтов в бактериях. Microbiol Mol Biol Rev.2015; 79 (1): 81–100. pmid: 25652542
  55. 54. ЛаРокка Т.Дж., Кроули Д.Т., Кьюсак Б.Дж., Патак П., Бенах Дж., Лондон Э. и др.Липиды холестерина Borrelia burgdorferi образуют липидные рафты и необходимы для бактерицидной активности комплемент-независимого антитела. Клеточный микроб-хозяин. 2010. 8 (4): 331–42. pmid: 20951967
  56. 55. Саенс Дж. П., Гроссер Д., Брэдли А.С., Лагни Т.Дж., Лавриненко О., Брода М. и др. Гопаноиды как функциональные аналоги холестерина в бактериальных мембранах. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2015; 112 (38): 11971–6. pmid: 26351677
  57. 56. Матиас VRF, Беверидж Т.Дж.Криоэлектронная микроскопия выявляет структуру нативной полимерной клеточной стенки в Bacillus subtilis 168 и существование периплазматического пространства. Mol Microbiol. 2005. 56 (1): 240–51. pmid: 15773993
  58. 57. Либертон М., Пейдж ЛЭ, О’Делл В.Б., О’Нил Х., Мамонтов Э., Урбан В.С. и др. Организация и гибкость тилакоидных мембран цианобактерий, исследованных методом рассеяния нейтронов. J Biol Chem. 2013. 288 (5): 3632–40. pmid: 23255600
  59. 58. Надь Г., Посселт Д., Ковач Л., Холм Дж. К., Сабо М., Угги Б. и др.Обратимые реорганизации мембран во время фотосинтеза in vivo: выявленные методом малоуглового рассеяния нейтронов. Биохим Дж. 2011; 436: 225–30. pmid: 21473741
  60. 59. Муругова Т.Н., Солодовникова И.М., Юрков В.И., Горделий В.И., Куклин А.И., Иванков О.И. и др. Возможности малоуглового рассеяния нейтронов для исследования структуры «живых» митохондрий. Нейтронные новости. 2011; 22 (3): 11–4.
  61. 60. Стир А., Сакманн Э. Спиновые метки как ферментные субстраты. Гетерогенное распределение липидов в мембранах микросом печени.Biochim Biophys Acta, Biomembr. 1973; 311 (3): 400–8.
  62. 61. Verkleij A, Zwaal R, Roelofsen B, Comfurius P, Kastelijn D, Van Deenen L. Асимметричное распределение фосфолипидов в мембране красных клеток человека. Комбинированное исследование с использованием фосфолипаз и электронной микроскопии с замораживанием. Biochim Biophys Acta, Biomembr. 1973; 323 (2): 178–93.
  63. 62. Клауснер Р., Кляйнфельд А., Гувер Р., Карновский М.Дж. Липидные домены в мембранах. Доказательства, полученные на основе структурных возмущений, вызванных свободными жирными кислотами, и анализа неоднородности за время жизни.J Biol Chem. 1980; 255 (4): 1286–95. pmid: 7354027
  64. 63. Манро С. Липидные плоты: неуловимые или призрачные? Клетка. 2003. 115 (4): 377–88. pmid: 14622593
  65. 64. Баер Т.А., Карни Р.Л. Катализируемая медью реакция реактивов Гриньяра с хлормагниевыми солями Ω-бромокислот. Tetrahedron Lett. 1976; 17 (51): 4697–700.
  66. 65. Епури Н.Р., Джеймисон С.А., Дарвиш Т.А., Равал А., Хук Дж. М., Тордарсон П. и др. Синтез пердейтерированных алкиламинов для получения дейтерированных органических гелеобразователей пиромеллитамида.Tetrahedron Lett. 2013. 54 (20): 2538–41.
  67. 66. Льюис Т., Николс П.Д., МакМикин Т.А. Оценка методов экстракции для извлечения жирных кислот из липид-продуцирующих микрогетеротрофов. J Microbiol Methods. 2000. 43 (2): 107–16. pmid: 11121609
  68. 67. Блай EG, Дайер WJ. Быстрый метод экстракции и очистки общих липидов. Может J Biochem Physiol. 1959; 37 (8): 911–7. pmid: 13671378
  69. 68. Ичихара Ки, Фукубаяси Ю. Приготовление метиловых эфиров жирных кислот для газожидкостной хроматографии.J Lipid Res. 2010. 51 (3): 635–40. pmid: 19759389
  70. 69. Даунер М., Зауэр У. Анализ Gc-Ms аминокислот быстро предоставляет обширную информацию для балансировки изотопомеров. Biotechnol Prog. 2000. 16 (4): 642–9. pmid: 10933840
  71. 70. Линн Г.В., Хеллер В., Урбан В., Виньял Г.Д., Вайс К., Майлз DAA. Bio-Sans — специализированный центр нейтронной структурной биологии в Национальной лаборатории Окриджа. Phys B (Амстердам, Нет). 2006; 385: 880–2.
  72. 71. Чжао Дж. К., Гао С. Ю., Лю Д.Малоугловой дифрактометр нейтронного рассеяния с расширенным Q-диапазоном на Sns. J Appl Crystallogr. 2010; 43 (5 часть 1): 1068–77.
  73. 72. О’Доннелл А., Нахайе М., Гудфеллоу М., Минникин Д., Хайек В. Численный анализ профилей жирных кислот при идентификации стафилококков. Микробиология. 1985. 131 (8): 2023–2033.
  74. 73. Гинье А., Фурне Г. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей. Нью-Йорк: J. Wiley & Sons; 1955.
  75. 74. Пенсер Дж., Миллс Т., Ангел В., Крюгер С., Эпанд Р.М., Катсарас Дж.Обнаружение плотоводных доменов субмикронных размеров в мембранах методом малоуглового рассеяния нейтронов. Eur Phys J E. 2005; 18: 447–58. pmid: 16292472
  76. 75. Лейтинг Б., Марсилио Ф., О’Коннелл Дж. Ф. Прогнозируемое дейтерирование рекомбинантных белков, экспрессируемых в Escherichia coli . Анальная биохимия. 1998. 265 (2): 351–5. pmid: 9882413
  77. 76. Шнайдер CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 лет анализа изображений. Нат методы. 2012; 9 (7): 671–5. pmid: 22930834
  78. 77.Лэнгмор Дж. П., Уолл Дж., Исааксон М. С.. Сбор рассеянных электронов в электронной микроскопии темного поля. 1. Упругое рассеяние. Оптик. 1973; 38 (4): 335–50.

детергентов для лизиса клеток и экстракции белков | Thermo Fisher Scientific

Детергенты — это класс молекул, уникальные свойства которых позволяют манипулировать (нарушать или формировать) гидрофобно-гидрофильными взаимодействиями между молекулами в биологических образцах. В биологических исследованиях детергенты используются для лизиса клеток (высвобождения растворимых белков), солюбилизации мембранных белков и липидов, контроля кристаллизации белков, предотвращения неспецифического связывания в процедурах аффинной очистки и иммуноанализа, а также используются в качестве добавок при электрофорезе.


Свойства и виды моющих средств

Состав ПАВ. Обобщенная структура отдельной молекулы детергента (вверху) и полная структура CHAPS (внизу), пример цвиттерионного детергента.

Химическое определение моющего средства

Моющие средства представляют собой амфипатические молекулы, что означает, что они содержат как неполярный «хвост», имеющий алифатический или ароматический характер, так и полярную «голову». Ионный характер группы полярных голов лежит в основе широкой классификации моющих средств; они могут быть ионными (заряженными, анионными или катионными), неионными (незаряженными) или цвиттерионными (имеющими как положительно, так и отрицательно заряженные группы, но с нулевым суммарным зарядом).


Подобно компонентам биологических мембран, детергенты обладают гидрофобно-связывающими свойствами в результате их неполярных хвостовых групп. Тем не менее, моющие средства сами по себе растворимы в воде. Следовательно, молекулы детергента позволяют диспергировать (смешивать) нерастворимые в воде гидрофобные соединения в водной среде, включая экстракцию и солюбилизацию мембранных белков.

Моющие средства при низкой концентрации в водном растворе образуют монослой на границе раздела воздух – жидкость.При более высоких концентрациях мономеры детергента объединяются в структуры, называемые мицеллами. Мицелла представляет собой термодинамически стабильный коллоидный агрегат мономеров детергента, в котором неполярные концы изолированы внутрь, избегая воздействия воды, а полярные концы ориентированы наружу при контакте с водой.

Идеализированная структура мицеллы детергента.


И количество мономеров детергента на мицеллу (число агрегации), и диапазон концентрации детергента, выше которого образуются мицеллы (так называемая критическая концентрация мицелл, CMC), являются свойствами, специфичными для каждого конкретного детергента (см. Таблицу).Критическая температура мицелл (CMT) — это самая низкая температура, при которой мицеллы могут образовываться. CMT соответствует так называемой температуре помутнения, поскольку мицеллы детергента образуют кристаллические суспензии при температурах ниже CMT и снова становятся прозрачными при температурах выше CMT.

На свойства моющего средства влияют экспериментальные условия, такие как концентрация, температура, pH буферного раствора и ионная сила, а также наличие различных добавок. Например, CMC некоторых неионных детергентов уменьшается с повышением температуры, в то время как CMC ионных детергентов уменьшается с добавлением противоиона в результате уменьшения электростатического отталкивания между заряженными головными группами.В других случаях добавки, такие как мочевина, эффективно нарушают структуру воды и вызывают снижение содержания КМЦ моющего средства. Как правило, с увеличением ионной силы происходит резкое увеличение числа агрегаций.

Детергенты могут быть денатурирующими или неденатурирующими по отношению к структуре белка. Денатурирующие детергенты могут быть анионными, такими как додецилсульфат натрия (SDS), или катионными, такими как бромид этилтриметиламмония. Эти детергенты полностью разрушают мембраны и денатурируют белки, нарушая межбелковые взаимодействия.Неденатурирующие детергенты можно разделить на неионные детергенты, такие как Triton X-100, соли желчных кислот, такие как холат, и цвиттерионные детергенты, такие как CHAPS.

Свойства обычных моющих средств. NP 40 9 Agg. # = Число агрегации, которое представляет собой количество молекул на мицеллу.


Очищенные моющие растворы

Хотя моющие средства доступны из нескольких коммерческих источников и регулярно используются во многих исследовательских лабораториях, важность чистоты и стабильности моющих средств не получила широкого признания.Моющие средства часто содержат следовые примеси, полученные при их производстве. Некоторые из этих примесей, особенно пероксиды, которые содержатся в большинстве неионных моющих средств, нарушают активность белка. Кроме того, некоторые типы моющих средств легко окисляются под воздействием воздуха или ультрафиолетового излучения, что приводит к потере их свойств и активности в качестве солюбилизирующих агентов. Мы предлагаем несколько моющих средств высокой чистоты с низким содержанием пероксидов, которые расфасовываются под азотом в прозрачные стеклянные ампулы. Эти моющие растворы Thermo Scientific Surfact-Amps обеспечивают непревзойденное удобство, качество и постоянство всех видов моющих средств.Набор пробоотборника включает 10 различных очищенных моющих средств (семь в формате Surfact-Amps и три в твердом виде).


Структура клеточной мембраны, солюбилизация белков и детергенты

Строение клеточных мембран

Основным фактором, определяющим поведение и взаимодействие молекул в биологических образцах, является их гидрофильность или гидрофобность. Большинство белков и других молекул с заряженными или полярными функциональными группами растворимы (или смешиваются) в воде, поскольку они участвуют в высокоупорядоченной межмолекулярной структуре воды с водородными связями.Некоторые другие белки (или, по крайней мере, части белков), а также жиры и липиды не имеют полярных или заряженных функциональных групп; следовательно, они исключены из упорядоченного взаимодействия воды с другими полярными молекулами и имеют тенденцию объединяться в структуры, имеющие минимальную площадь контакта с полярным окружением. Эта ассоциация неполярных молекул в водных растворах обычно называется гидрофобным притяжением, хотя более точно ее следует понимать как исключение из гидрофильной среды.

Образование и стабильность биологических мембран в значительной степени является результатом гидрофобного притяжения фосфолипидов, которые образуют двухслойные листы, имеющие гидрофобные липидные «хвосты», ориентированные в пределах толщины листа, и полярные «головные» группы, ориентированные на внешнюю и внутреннюю водную среду. Мембранные белки полностью покрывают толщину мембраны или встроены с одной стороны мембраны в соответствии с их структурой гидрофобных и гидрофильных боковых цепей аминокислот и других функциональных групп.

Разрушение мембраны, связывание с белками и солюбилизация

Обычно умеренные концентрации мягких (т.е. неионных) детергентов нарушают целостность клеточных мембран, тем самым облегчая лизис клеток и экстракцию растворимого белка, часто в нативной форме. При определенных буферных условиях различные детергенты эффективно проникают между бислоями мембраны в концентрациях, достаточных для образования смешанных мицелл с изолированными фосфолипидами и мембранными белками.

Лизис клеток на основе детергентов. Для процедур экстракции белков можно использовать как денатурирующие, так и неденатурирующие реагенты для лизиса клеток.


Денатурирующие детергенты, такие как SDS, связываются как с мембранными (гидрофобными), так и с немембранными (водорастворимыми, гидрофильными) белками при концентрациях ниже CMC (то есть в виде мономеров). Реакция является равновесной до насыщения. Следовательно, свободная концентрация мономеров определяет концентрацию детергента.Связывание SDS является кооперативным (т.е. связывание одной молекулы SDS увеличивает вероятность связывания другой молекулы SDS с этим белком) и превращает большинство белков в жесткие стержни, длина которых пропорциональна молекулярной массе.

Неденатурирующие детергенты, такие как Triton X-100, имеют жесткие и объемные неполярные головки, которые не проникают в водорастворимые белки; следовательно, они обычно не нарушают нативных взаимодействий и структур водорастворимых белков и не обладают свойствами кооперативного связывания.Основной эффект неденатурирующих детергентов — связываться с гидрофобными частями мембранных белков, тем самым придавая им смешиваемость.

При концентрациях ниже CMC мономеры детергента связываются с водорастворимыми белками. Выше CMC связывание детергента с белками конкурирует с самоассоциацией молекул детергента в мицеллы. Следовательно, при увеличении концентрации детергента сверх КМЦ увеличение количества мономеров детергента, связанных с белком, не происходит.

Детергентные мономеры солюбилизируют мембранные белки, разделяясь на бислой мембраны. С увеличением количества моющих средств мембраны проходят различные стадии солюбилизации. Начальная стадия — лизис или разрыв оболочки. При молярном соотношении детергент: мембранный липид от 0,1: 1 до 1: 1 липидный бислой обычно остается неповрежденным, но происходит избирательная экстракция некоторых мембранных белков. При увеличении соотношения до 2: 1 происходит солюбилизация мембраны, в результате чего образуются смешанные мицеллы.К ним относятся мицеллы фосфолипид-детергент, мицеллы детергент-белок и мицеллы липид-детергент-белок. При соотношении 10: 1 все взаимодействия липид: белок нативной мембраны эффективно заменяются на взаимодействия детергент: белок.

Количество детергента, необходимое для оптимальной экстракции белка, зависит от CMC, числа агрегации, температуры и природы мембраны и детергента. Буфер для солюбилизации должен содержать достаточное количество детергента, чтобы обеспечить более 1 мицеллы на молекулу мембранного белка, чтобы гарантировать, что отдельные молекулы белка изолированы в отдельные мицеллы.

Моющие средства, используемые для лизиса клеток. Основные характеристики денатурирующих и неденатурирующих детергентов, используемых для экстракции белков.


Методы удаления моющих средств

Удаление детергента из солюбилизированных белков

Каким бы необходимым и полезным ни было использование детергента для начального лизиса клеток или экстракции мембранных белков, последующие применения или эксперименты с экстрагированными белками могут потребовать удаления части или всего детергента.Например, хотя многие водорастворимые белки функциональны в форме, солюбилизированной детергентом, мембранные белки часто модифицируются и инактивируются солюбилизацией детергента в результате нарушения взаимодействия природных липидов. В некоторых таких случаях функция мембранных белков восстанавливается, когда они восстанавливаются в двухслойные мембраны путем замены детергента фосфолипидами или другими мембраноподобными липидными смесями.

Функцию отдельного белка можно изучать изолированно, если его сначала очистить, а затем воссоздать в искусственной мембране (хотя восстановление нативной ориентации в мембране является серьезной проблемой).Даже если восстановление функции белка не является проблемой, может потребоваться уменьшить концентрацию детергента в образце, чтобы сделать его совместимым с анализами белков или гель-электрофорезом.

Удалить моющее средство можно разными способами. Диализ эффективен для удаления детергентов с очень высокими КМЦ и / или небольшими числами агрегации, таких как N-октилглюкозиды. Детергенты с низким содержанием CMC и большим числом агрегации не могут быть подвергнуты диализу, так как большинство молекул детергента будут находиться в мицеллах, которые слишком велики, чтобы диффундировать через поры диализной мембраны; только избыток мономера может быть подвергнут диализу.

Author: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Моющее средство Тип Агг. № ‡ MW
mono
(мицелла)
CMC
mM
(% мас.
Thermo Scientific Triton X-100 Неионный 140 647 (90K) 0.24 (0,0155) 64 Нет
Thermo Scientific Triton X-114 Неионный 537 (-) 0,21 (0,0113) 23
Неионный 149 617 (90K) 0,29 (0,0179) 80 Нет
Thermo Scientific Brij-35 Неионный 4034909 (0,0110) > 100 Нет
Thermo Scientific Brij-58 Неионный 70 1120 (82K) 0,08 (0,0086) > 100 Нет Нет Scientific Tween 20 Неионный 1228 (-) 0,06 (0,0074) 95
Thermo Scientific Tween 80 Неионный 0349 60 9019 .01 (0,0016) Нет
Октилглюкозид Неионогенный 27 292 (8K) 23-24 (~ 0,70) > 100 Да
Неионный 308 (-) 9 (0,2772) > 100 Да
SDS Анионный 62-8349 288 (919-19) 0,23) > 100 Нет
CHAPS Цвиттерионный 10 615 (6K) 8-10 (0.5-0.6) > 100 Да
CHAPSO Цвиттерионный 11 631 (7K) 8-10 (~ 0.505) 19 90 9345