Заполните таблицу органоид значение в клетке: Заполните таблицу.                                   Строение клетки        Органоид         

Содержание

Задание 1.3. Заполните таблицу

Глава 1. Организм человека и его строение

Тема: Строение, химический состав и физиология клетки

Задание 1.1. Рассмотрите рисунок и ответьте на вопросы:

Рисунок 1. Схема строения животной клетки.

 
 

1. Что обозначено на рисунке цифрами 1 — 6?

2. Какие органоиды обеспечивают клетку энергией?

3. Какие органоиды отвечают за синтез клеточных белков?

4. Какой органоид отвечает за клеточное деление?

5. Где хранится информация о клеточных белках?

Задание 1.2. Заполните таблицу:

Таблица 1. Органоиды клетки и их функции.

Название органоидов или структур клетки Функции
1. Клеточная оболочка 2. Цитоплазма 3. Ядро 4. Митохондрии 5. Рибосомы 6. Клеточный центр 7. Сеть канальцев (ЭПС) 11. Хромосомы  

Задание 1.3. Заполните таблицу.

Таблица 2. Вещества клетки и их значение:

Вещества клетки Значение
Неорганические: Вода, соли Органические: 1. Белки 2. Жиры 3. Углеводы 4. Нуклеиновые кислоты  

Задание 1.4. Рассмотрите рисунок и ответьте на вопросы:

Рисунок 2. Набор хромосом человека.

1. Определите, чей хромосомный набор изображен на рисунке — мужчины или женщины? Объясните почему.

2. Сколько хромосом на рисунке и молекул ДНК в данных хромосомах?

Задание 1.5. Заполните таблицу:

Таблица 3. Жизненные свойства клетки.

Жизненные свойства Происходящие процессы
1. Обмен веществ: Питание Дыхание Выделение 2. Возбудимость 3. Рост 4. Движение 5. Размножение  

Задание 1.6. Рассмотрите рисунки и ответьте на вопросы:

Рисунок 3. Митотическое деление клетки.

 
 

1. Что происходит на первой стадии деления клетки, изображенной на рис. А? Какой набор хромосом и ДНК в клетке в этот период?

2. Что происходит на стадии деления клетки, изображенной на рис. Б? Какой набор хромосом и ДНК в клетке в этот период

3. Что происходит на стадии деления клетки, изображенной на рис. В? Какой набор хромосом и ДНК в клетке в этот период

4. Что происходит на стадии деления клетки, изображенной на рис. Г? Какой набор хромосом и ДНК в клетке в этот период

Задание 1.7. Укажите правильные варианты ответов:

Строение и жизненные свойства клетки.

Тест 1. Какие органические вещества являются основным источником получения энергии в клетках?

  1. Белки.
  2. Жиры.
  3. Углеводы.
  4. Все вышеперечисленные.

Тест 2. Какие органические вещества выполняют функции внутриклеточных катализаторов и называются ферментами?

  1. Белки.
  2. Жиры.
  3. Углеводы.
  4. Все вышеперечисленные.

Тест 3. Какие органические молекулы клетки хранят наследственную информацию?

  1. Белки.
  2. Жиры.
  3. Углеводы.
  4. Нуклеиновые кислоты.

Тест 4. Какие органоиды обеспечивают клетку основной энергией?

  1. Рибосомы.
  2. Митохондрии.
  3. Клеточный центр.
  4. Ядро.

Тест 5. Какие органоиды обеспечивают биосинтез белков клетки?

  1. Рибосомы.
  2. Митохондрии.
  3. Клеточный центр.
  4. Ядро.

Тест 6. Какие органоиды отвечают за расхождение хромосом при делении клетки?

  1. Рибосомы.
  2. Митохондрии.
  3. Клеточный центр.
  4. Ядро.

Тест 7. Какие половые хромосомы у мужчины?

  1. ХХ.
  2. ХУ.
  3. УУ.

Тест 8. Сколько хромосом и ДНК в клетках тела человека перед делением?

  1. 23 хромосомы, 23 молекулы ДНК.
  2. 23 хромосомы, 46 молекул ДНК.
  3. 46 хромосом, 46 молекул ДНК.
  4. 46 хромосом, 92 молекулы ДНК.

Тест 9. Сколько хромосом в клетках тела человека после деления?

Биология 5 класс (ФГОС) карточки к уроку

Глава 1. Биология — наука о живом мире

§ 1.  

Задание 1.Вставьте пропущенные слова.

  1. Биология – это –––––––––––––––, которая изучает живые ––––––––––,

их ______________________________ и ______________________.

  1. Ботаника изучает _____________________, зоология________________,

микология____________________.                                                                                      Задание 2. Напишите, что означают греческие слова:

«биос» —        

«логос» —________________________________

Задание 3

Заполните схему, которая отражает использование растений человеком.

Задание 4. Заполните таблицу

Животные в жизни человека

животное

Хозяйственное  значение

корова

Получение молока, мяса, кожи, жира

Лошадь

кролик

Задание 5.  Вставьте пропущенные буквы в словах.

  1. Соб…ратель
  2. Мног..клет…чный
  3. Орг…низм
  4. Би…логия
  5. Ихт..ология

Задание 6. Где используются биологические знания?

В сельском хозяйстве_______

В окружающей среде________

В производстве продуктов питания______

Медицине_________

Задание 7.

             Прочитайте внимательно текст и ответьте на вопросы.

  1. Кому из учёных, упомянутых в тексте, была присуждена Нобелевская премия?
  2. В какой научной области он достиг выдающихся результатов?

     Большой вклад в развитие биологии в ХХ веке внесли такие всемирно известные учёные, К.А. Тимирязев, И.И. Мечников, В.И. Вернадский, Н.И. Вавилов. Всемирно известному русскому учёному ХХ века, физиологу Ивану Петровичу Павлову  в1904 году была присуждена Нобелевская премия в области медицины и физиологии.              

Задание 8. Составьте два предложения со словами, перечисленными в задании 5.

Отрабатываем тему

ТЕМА. Что такое живой организм. Наука о живой природе.    

ВАРИАНТ 1

Выберите один правильный ответ из четырёх.

1. Живым организмом является:

 а)сердце         в)берёза    б) лист берёзы           г) клетка печени

2. К объектам живой природы не относятся:

 а) кристаллы льда     в) грибы     б) водоросли                 г) морские звёзды

3.  Мельчайшей частицей живого, выполняющей все функции живого, является:

а) ноготь        б)волос      в) клетка    г) зуб

4. Способность живых организмов воспроизводить себе подобных называется:

 а) радражимость    б) выделение    в) обмен веществ    г) размножение

5. Наука о живой природе:

 а) геология         в) физика     б) биология             г) астрономия

6. Наука о растениях называется:

 а) геология      в) ботаника    б) биология          г) ихтиология

7. Наука о рыбах называется:

 а) ботаника    б) ихтиология     в) физиология     г) микология

8. Живой организм, изображённый на рисунке, относится к: 

а) растениям |б) бактериям    в) грибам       г) животным

Выберите правильные утверждения.

1. Все живые организмы состоят из множества клеток.

2. Клетки не сходны по составу образующих их веществ.

3. Обмен веществ свойственен только животным организмам.

4. Все живые организмы имеют клеточное строение.

Прочитайте текст.  Вставьте на месте пропусков соответствующие слова из словарика. 

Словарик: 1) организмы, 2) одноклеточными, 3) многоклеточными.

А)         ___________бывают_________, например некоторые водоросли, бактерии, и______________в которых все клетки тесно связаны между собой.

Удачи!

ТЕМА. Что такое живой организм. Наука о живой природе.               ВАРИАНТ 2

Выберите правильный ответ из четырёх.

1. Объектом неживой природы является:

 а) бактерия        в) кристалл соли          б) гриб                  г) жук

2. Живым организмом является:

 а) цветок растения         в) берёза   б) сердце              г) клетка кожи

3. Клетки слона в сравнении с клетками мыши:

 а) значительно крупнее              б) значительно меньше

в) не отличаются по размерам   г) немного крупнее

4. Развитие — это процесс:

 а) воспроизведения себе подобных

б) изменения в строении организма и его органов

 в) поступления веществ из внешней среды

 г) реагирования на изменения в окружающей среде

5.  Главным отличием растений от животных является способность:

 а) к обмену веществ    в) осуществлять дыхание         г) реагировать на внешние раздражители       б) образовывать органические вещества из неорганических

6. Грибы изучает наука:

а) ботаника     в) орнитология    б) микология           г) зоология

7. Жизнедеятельность организмов изучает наука:

 а) анатомия           в) физиология   б) зоология                г) биология

8. Организмы, изображённые на рисунке, изучает наука:

 а) ботаника     б) микология    в) орнитология     г) ихтиология

Часть В .   Выберите правильные утверждения.

1. Клетка — мельчайшая единица строения живого организма.

2. Обмен веществ невозможен без питания и выделения.

 3. Питание — это процесс поступления кислорода и выделения углекислого газа.

 4. Первую классификацию животных предложил древнегреческий учёный Аристотель.

Часть С.      Прочитайте текст. Вставьте на месте пропусков соответствующие слова из словарика.

Словарик: 1) жизнь, 2) наука, слово, 3) живых существ, 4)человека.                                                               Так  зарождалась  наука  о  живой  природе  —  биология.

Её название произошло от двух греческих слов «биос» —.»______» и «логос» — «___________».        Биология изучает разнообразие __________., строение их тел и

работу их органов, размножение и развитие организмов,

а также влияние______________на живую природу.

Удачи!

Биология – наука о живом мире.


Биология – наука о живом мире.
Вариант № 1
Часть А.  выберите один ответ из предложенных


А1. Наука о живой природе носит название:
1. Физика
2. Химия
3. Биология
4. География 

А2. Какие признаки характерны для всех живых организмов:
1. Активное передвижение
2. Дыхание, питание, рост, размножение
3. Поглощение из почвы растворённых в воде минеральных солей
4. Образование органических веществ из неорганических

А3. Часть клетки, где хранится наследственная информация:
1. Цитоплазма
2. Ядро
3. Вакуоль
4. Клеточная стенка
А4. Молодая клетка отличается от старой тем, что …
1. В ней несколько маленьких вакуолей, ядро прилегает к клеточной оболочке
2. В ней одна большая вакуоль, ядро прилегает к клеточной оболочке
3. В ней одна большая вакуоль, ядро располагается в центре
4. В ней несколько маленьких вакуолей, ядро располагается в центре
А5. Имя учёного, который первым обобщил биологические знания о животных, накопленные до него человечеством:
1. Аристотель
2. Теофраст
3. К.Линней
4. Ч.Дарвин
Часть В
В1. К органическим веществам клетки относят:
А) минеральные соли
Б) жиры
В) белки
Г) углеводы
Д) воду
Е) зола

Часть С
С1. Часть организма, которая выполняет особую функцию и обладает особым строением называют …….
С2. Какие методы изучения живых организмов применяют в природе, а какие в лаборатории. Приведите примеры.

Биология – наука о живом мире.
Вариант № 2
Часть А.  выберите один ответ из предложенных 

А1. Наука о растениях носит название:
1. Ботаника 
2. Зоология 
3. Биология
4. Микология 
А2. Укажите метод, с помощью которого можно изучать продолжительность зимней спячки у бурого медведя:
1. Наблюдение
2. Эксперимент
3. Сравнение
4. Моделирование 
А3. Гемоглобин – это …
1. Углевод
2. клетка
3. Белок крови
4. жир
А4. Название наследственного материала в ядре клетки:
1. Хромосомы
2. Хлоропласты
3. Ядрышко
4. Вакуоль 
А5. Имя учёного, который создал первую систему ботанических понятий:
1. Аристотель
2. Теофраст
3. К.Линней
4. Ч.Дарвин
Часть В
В1. Выберите признаки живых организмов:
А) обмен веществ и энергии
Б) раздражимость
В) сократимость
Г) размножение
Д) поглощение световых лучей
Часть С
С1. Как определить увеличение микроскопа?
С2. Зарисуйте клетку кожицы лука. Подпишите её части. Какую функцию выполняет клеточная мембрана?

Биология – наука о живом мире.
Вариант № 3
Часть А.  выберите один ответ из предложенных 

А1. Наука о животных носит название:
1. Ботаника 
2. Зоология 
3. Биология
4. Микология 
А2. В старой клетке хорошо заметны …
1. Оболочка
2. Вакуоль
3. Ядро
4. Хромосомы 
А3. Укажите, что доказывают результаты опыта. Немного муки размешали в воде, добавили две капли йода. Мучная смесь окрасилась в синий цвет.
1. Наличие в муке белков
2. Наличие в муке минеральных солей
3. Наличие в муке углеводов – крахмала
4. Наличие в муке жиров
А4. Назовите главную часть микроскопа:
1. Тубус
2. Предметный столик
3. Зеркало
4. Штатив 
А5. Имя учёного, который создал классификацию организмов:
1. Аристотель
2. Теофраст
3. К.Линней
4. Ч.Дарвин
Часть В
В1. Найдите соответствие между названиями клеточных структур и соответствующими им признаками:
1. Вакуоль
2. Мембрана
3. Ядро
4. Клеточная стенка А. деление клетки
Б. клеточный сок
В. поступление веществ в клетку
Г. обеспечение прочности

Часть С
С1. Группу клеток, сходных по строению, функциям и имеющих общее происхождение называют ……
С2. Докажите, что растение – живой организм.

Биология – наука о живом мире.
Вариант № 4
Часть А.  выберите один ответ из предложенных
А1. Наука о грибах носит название:
1. Ботаника 
2. Зоология 
3. Биология
4. Микология 
А2. Часть клетки, содержащая клеточный сок:
1. Цитоплазма
2. Ядро
3. Вакуоль
4. Клеточная стенка
А3. Укажите, что доказывают результаты опыта. Промыли кусочек теста в сосуде с водой, в марле осталась клейкая тягучая масса – клейковина.
1. Наличие в муке белков
2. Наличие в муке минеральных солей
3. Наличие в муке углеводов – крахмала
4. Наличие в муке жиров
А4. Каким образом можно рассмотреть клетки в кожице лука?
1. Рассмотреть кожицу невооружённым глазом
2. Рассмотреть кожицу с помощью лупы
3. Сделать микропрепарат и рассмотреть его под микроскопом
4. Сделать микропрепарат и рассмотреть его в лупу
А5. Имя учёного, который объяснил причины многообразия живых организмов:
1. Аристотель
2. Теофраст
3. К.Линней
4. Ч.Дарвин
Часть В
В1. Перечислите растительные ткани:
А) покровная
Б) мышечная
В) нервная
Г) соединительная
Д) проводящая
Е) механическая

Часть С
С1. Метод изучения природы, при котором используют микроскоп, называется ……
С2. Зарисуйте клетку кожицы лука. Подпишите её части. Какую функцию выполняет цитоплазма?

ОТВЕТЫ

Ответы на контрольную работу №1.
Биология. 5 класс. 
Биология – наука о живом мире.

Уровень А.
По вертикали: вариант, 
По горизонтали: номер вопроса.
1 2 3 4 5
1 3 2 2 4 1
2 1 1 3 1 2
3 2 2 3 1 3
4 4 3 1 3 4
Уровень В и С
1 вариант
В — Б, В, Г
С1 — Орган
С2 — Методы в природе: наблюдение, описание, измерение.
Методы в лаборатории: наблюдение, эксперимент, моделирование
2 вариант
В — А, Б, Г
С1 — Увеличение объектива умножить на увеличение окуляра
С2 – Клетка состоит из мембраны, ядра и цитоплазмы. Основной функцией клеточной мембраны является поступление веществ в клетку.
3 вариант 
В — 1-Б , 2-В, 3-А, 4-Г
С1 — Ткань
С2 — Живой организм: обмен веществ и энергии, рост и развитие, размножение, раздражимость
4 вариант
В — А, Д, Е
С1 – Наблюдение
С2 – клетка состоит из мембраны, ядра и цитоплазмы. Цитоплазма -это часть клетки, в которой расположены органоиды.

Система оценивания контрольной работы:

1-5 задание уровень А – 1 балл
В1 уровень В – 2 балла
С1 уровень С – 2 балла
С2 уровень С – з балла

12 – 10 баллов — оценка «5»
9 – 8 баллов — оценка «4»
7 – 5 баллов — оценка «3»
Менее 5 баллов — оценка «2»

Информио

×

Неверный логин или пароль

×

Все поля являются обязательными для заполнения

×

Сервис «Комментарии» — это возможность для всех наших читателей дополнить опубликованный на сайте материал фактами или выразить свое мнение по затрагиваемой материалом теме.

Редакция Информио.ру оставляет за собой право удалить комментарий пользователя без предупреждения и объяснения причин. Однако этого, скорее всего, не произойдет, если Вы будете придерживаться следующих правил:

  1. Не стоит размещать бессодержательные сообщения, не несущие смысловой нагрузки.
  2. Не разрешается публикация комментариев, написанных полностью или частично в режиме Caps Lock (Заглавными буквами). Запрещается использование нецензурных выражений и ругательств, способных оскорбить честь и достоинство, а также национальные и религиозные чувства людей (на любом языке, в любой кодировке, в любой части сообщения — заголовке, тексте, подписи и пр.)
  3. Запрещается пропаганда употребления наркотиков и спиртных напитков. Например, обсуждать преимущества употребления того или иного вида наркотиков; утверждать, что они якобы безвредны для здоровья.
  4. Запрещается обсуждать способы изготовления, а также места и способы распространения наркотиков, оружия и взрывчатых веществ.
  5. Запрещается размещение сообщений, направленных на разжигание социальной, национальной, половой и религиозной ненависти и нетерпимости в любых формах.
  6. Запрещается размещение сообщений, прямо либо косвенно призывающих к нарушению законодательства РФ. Например: не платить налоги, не служить в армии, саботировать работу городских служб и т.д.
  7. Запрещается использование в качестве аватара фотографии эротического характера, изображения с зарегистрированным товарным знаком и фотоснимки с узнаваемым изображением известных людей. Редакция оставляет за собой право удалять аватары без предупреждения и объяснения причин.
  8. Запрещается публикация комментариев, содержащих личные оскорбления собеседника по форуму, комментатора, чье мнение приводится в статье, а также журналиста.

Претензии к качеству материалов, заголовкам, работе журналистов и СМИ в целом присылайте на адрес

×

Информация доступна только для зарегистрированных пользователей.

×

Уважаемые коллеги. Убедительная просьба быть внимательнее при оформлении заявки. На основании заполненной формы оформляется электронное свидетельство. В случае неверно указанных данных организация ответственности не несёт.

Перспективное создание биобанка живых органоидов пациентов с колоректальным раком

Марк ван де Ветеринг

1 Институт Хубрехта, Королевская Нидерландская академия искусств и наук (KNAW), Cancer Genomics.nl и Университетский медицинский центр Утрехта, 3584 CT, Нидерланды

2 фонд Hubrecht Organoid Technology (HUB), 3584CT Утрехт, Нидерланды

Hayley E. Francies

3 Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton CB10 1SA, Кембриджшир, Великобритания

Джошуа М.Фрэнсис

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Гергана Боунова

5 Компьютерная биология рака, Нидерландский институт рака, 1066 CX Amsterdam, Нидерланды

Francesco Iorio

6 Европейская лаборатория молекулярной биологии — Европейский институт биоинформатики, Wellcome Trust Genome Campus, Кембридж CB10 1SA, Великобритания

Apollo Pronk

7 Хирургическое отделение, Diakonessenhuis, 3582 ke Utrecht, Нидерланды

Winan van Houdt

7 Отделение хирургии, Diakonessenhuis, 3582 ke Utrecht, Нидерланды

Joost van Gorp

8 Отделение патологии, Diakonessenhuis, 3582 ke Utrecht, Нидерланды

Amaro Taylor-Weiner

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Леннарт Кестер

1 Институт Хубрехта Королевской Нидерландской академии искусств и наук (KNAW), Геномика рака.nl и Университетский медицинский центр Утрехта, 3584 CT, Нидерланды

Anne McLaren-Douglas

3 Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton CB10 1SA, Кембриджшир, Великобритания

Джойс Блоккер

1 Институт Хубрехта, Королевская Нидерландская академия искусств и наук (KNAW), Cancer Genomics.nl и Университетский медицинский центр Утрехта, 3584 CT, Нидерланды

2 фонд Hubrecht Organoid Technology (HUB), 3584CT Утрехт, Нидерланды

Шридеви Яксани

1 Институт Хубрехта Королевской Нидерландской академии искусств и наук (KNAW), Геномика рака.nl и Университетский медицинский центр Утрехта, 3584 CT, Нидерланды

2 фонд Hubrecht Organoid Technology (HUB), 3584CT Утрехт, Нидерланды

Сина Бартфельд

1 Институт Хубрехта Королевской Нидерландской академии искусств и наук (KNAW), Cancer Genomics.nl и Университетский медицинский центр Утрехт, 3584 Коннектикут, Нидерланды

Ричард Волкман

9 Отделение онкогеномики Академического медицинского центра Амстердамского университета, 1105 AZ Амстердам, Нидерланды

Питер ван Слуис

9 Отделение онкогеномики, Академический медицинский центр, Амстердамский университет, 1105 AZ Амстердам, Нидерланды

Vivian S.В. Ли

10 Отдел биологии стволовых клеток и генетики развития, MRC Национальный институт медицинских исследований, Риджуэй, Милл-Хилл, Лондон NW7 1AA, Великобритания

Сара Сипо

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Чандра Секхар Педамаллу

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Кристиан Цибулскис

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Скотт Л.Картер

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Аарон МакКенна

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Майкл С. Лоуренс

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Ли Лихтенштейн

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Чип Стюарт

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Ян Костер

9 Отделение онкогеномики Академического медицинского центра Амстердамского университета, 1105 AZ Амстердам, Нидерланды

Rogier Versteeg

9 Отделение онкогеномики Академического медицинского центра Амстердамского университета, 1105 AZ Амстердам, Нидерланды

Александр ван Ауденаарден

1 Институт Хубрехта Королевской Нидерландской академии искусств и наук (KNAW), Геномика рака.nl и Университетский медицинский центр Утрехта, 3584 CT Нидерланды

Хулио Саез-Родригес

6 Европейская лаборатория молекулярной биологии — Европейский институт биоинформатики, Wellcome Trust Genome Campus, Cambridge CB10 1SA, UK

Robert G.J. Vries

1 Институт Хубрехта, Королевская Нидерландская академия искусств и наук (KNAW), Cancer Genomics.nl и Университетский медицинский центр Утрехта, 3584 CT, Нидерланды

2 фонд Hubrecht Organoid Technology (HUB), 3584CT Утрехт, Нидерланды

Gad Getz

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Лодевик Весселс

5 Компьютерная биология рака, Нидерландский институт рака, 1066 CX, Амстердам, Нидерланды

Майкл Р.Страттон

3 Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton CB10 1SA, Кембриджшир, Великобритания

Ultan McDermott

3 Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton CB10 1SA, Кембриджшир, Великобритания

Мэтью Мейерсон

4 [1] Институт Броуда Массачусетского технологического института и Гарвард, Кембридж, Массачусетс, 02142, США [2] Отделение медицинской онкологии, Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс, 02115, США

Мэтью Дж.Гарнетт

3 Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton CB10 1SA, Кембриджшир, Великобритания

Hans Clevers

1 Институт Хубрехта, Королевская Нидерландская академия искусств и наук (KNAW), Cancer Genomics.nl и Университетский медицинский центр Утрехта, 3584 CT, Нидерланды

2 Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB), 3584CT Утрехт, Нидерланды

Культуры органоидов из нормальных и склонных к раку тканей груди человека сохраняют сложные эпителиальные линии

Размножение нормальных органоидов молочной железы человека

Мы успешно создали 79 культур органоидов из нормальные ткани молочной железы человека, полученные либо в результате редукционной маммопластики (выполняемой для уменьшения размера груди), либо в результате профилактической мастэктомии (выполняемой для предотвращения РМЖ) с использованием условий культивирования, описанных ранее 4 .Во всех случаях нормальная гистология исходной ткани была подтверждена при осмотре патологом груди (D.D.). Скорость создания органоидных культур была высокой, с эффективностью 95%. Как и в случае с другими органоидными системами 15 , культуры можно размножать в течение длительного времени, при этом самая длинная органоидная культура выдерживается в течение> 16 месяцев. Органоиды обычно диссоциировали и пассировали каждые 2–4 недели.

Было обнаружено, что органоиды нескольких типов тканей демонстрируют единую определяющую морфологию, которая напоминает гистологию ткани происхождения, такой как кишечная крипта 16 .Напротив, мы обнаружили, что эпителиальные клетки молочных желез самоорганизуются в множество различных структурных типов в культуре органоидов (Fig. 1a, b). Большинство структур были ацинарного типа и имели просвет, который был либо изолирован, либо ассоциирован с зарождающимся органоидом. Также присутствовали твердые сферы в дополнение к разветвленным трубчатым структурам. Ветвящиеся или почкующиеся структуры присутствовали в 1 из 102 органоидов ( n = 3 культуры, дополнительная таблица 1). Последние были отмечены во время ранних пассажей, но стали менее частыми с повторной диссоциацией и продолжительным ростом.Органоиды окрашивали на люминальный маркер цитокератин 8 (CK8) и базальный маркер цитокератин 14 (CK14), и было обнаружено, что они состоят из люминальных клеток, базальных клеток или смеси обоих типов клеток (рис. 1c – e). это указывает на то, что в этих культурах сохраняются как базальные, так и просветные клетки.

Рис. 1: Эпителий молочной железы человека можно размножать без иммортализации как органоидные культуры.

a Ткань молочной железы человека переваривали и культивировали в органоидной среде BC, как описано ранее 4 .Культуру, демонстрирующую несколько типов органоидной структуры (обозначенные красными стрелками, представляющие n = 79), визуализировали с помощью фазово-контрастной микроскопии, масштабная линейка = 100 мкм. b , c Органоиды окрашивали, как указано, для актина (красный) и расщепленной каспазы 3 (зеленый), чтобы продемонстрировать клиренс просвета, или окрашивали на CK8 (зеленый), CK14 (красный) и актин (белый), и контрастное окрашивание DAPI (синий), n = 4, масштабная линейка = 100 мкм. Органоиды были визуализированы с помощью конфокальной микроскопии. d Показаны конфокальные изображения с малым увеличением для репрезентативной культуры, n = 4, масштабная линейка = 100 мкм. e Количественное определение органоидов, положительных по CK8 и / или CK14 в каждой из четырех нормальных культур молочной железы. f Органоиды окрашивали на ERα (зеленый), актин (красный) и DAPI (синий) и отображали с помощью конфокальной микроскопии (левая панель, масштабная линейка = 100 мкм). Органоиды обрабатывали 0,5 нг / мл эстрадиола в течение 7 дней, и жизнеспособность органоидов анализировали с помощью Cell-Titer-Glo (правая панель).Показаны среднее и стандартное отклонение (ORG9, n = 3). г Три репрезентативные культуры органоидов (ORG45, ORG9 и ORG24) окрашивали EpCAM и CD49f, и эти маркеры, а также включение EDU измеряли с помощью проточной цитометрии.

Этот метод культивирования особенно отличался эффективным размножением просветных клеток. Это было очевидно на основе экспрессии цитокератина в просвете с помощью иммунофлуоресценции, идентификации клеток с высоким содержанием EpCAM с помощью проточной цитометрии и создания органоидных структур просвета ацинарного типа.Подмножество органоидов молочной железы сохраняло экспрессию рецептора эстрогена альфа (ERα) в культуре и росло в ответ на лечение эстрадиолом (рис. 1f и дополнительный рис. 1а). В среднем 34% органоидов в культуре содержали по крайней мере одну клетку, положительную по ER ( n = 5 культур). При подсчете на клетку, а не на органоид, в среднем 10% всех клеток в культуре были положительными по ER ( n = 5 культур) (дополнительная таблица 2).

Анализ проточной цитометрии культур органоидов с использованием маркеров EpCAM и CD49f показал, что зрелый просвет (EpCAM + CD49f ), предшественник просвета (EpCAM + CD49f + ) и базальный / стеблевой (EpCAM ) — CD49f + ) все клетки поддерживали в культуре (см. Три репрезентативных примера на рис.1г).

Молочные линии образуют различные морфологии органоидов

Морфологическая оценка отдельных органоидов в культуре показала, что они демонстрируют различные типы структур; при последующем анализе каждая морфология могла быть сопоставлена ​​с отдельным клоном клеток молочной железы (Fig. 2a, b). Клетки из органоидов были отсортированы с помощью FACS с использованием EpCAM и CD49f на зрелые просветные клетки (EpCAM + CD49f ), предшественники просвета (EpCAM + CD49f + ) и базальные / стволовые клетки (EpCAM CD495). + ) подтипы 6,10,17,18 , а затем повторно культивировали в органоидных условиях.Отсортированные клетки экспрессировали базальные и люминальные маркеры, как и ожидалось (рис. 2c). Зрелые просветные клетки образовывали ацинусы с просветом, тогда как просветные клетки-предшественники образовывали меньшие сферы с меньшим просветом, и последний тип органоидов экспрессировал известные маркеры LP-клеток (рис. 2b, c и дополнительный рис. 1b, c). Базальные / стволовые клетки формируют большие дезорганизованные сферы, которые могут демонстрировать почкование просвета или ветвящиеся выросты (Fig. 2b, c).

Рис. 2: Типы клеток эпителия молочной железы образуют отдельные структуры в культуре органоидов.

a Изображение под микроскопом в светлом поле репрезентативной культуры органоидов, демонстрирующее несколько типов структур, выделенных красными стрелками. b Репрезентативные примеры морфологии органоидов для каждой из указанных линий клеток молочной железы. c Клетки из органоидной культуры (представитель n = 9 культур) окрашивали на EpCAM и CD49f и сортировали с помощью FACS на зрелый просвет (ML, красный), предшественник просвета (LP, оранжевый) и базальный / стволовый клеточные (BS, зеленые) популяции.Клетки рекультивировали как органоиды, а затем оценивали с помощью светлопольной микроскопии ( n = 9) или конфокальной микроскопии после окрашивания на указанные маркеры (столбец 1, столбцы 2-3 и столбцы 4-6 взяты из отдельных изображений, n = 3). Масштабные линейки = 100 мкм. d , e Клетки указанных типов повторно культивировали после сортировки в течение> 6 недель, затем визуализировали с помощью микроскопии в светлом поле d (репрезентативно для n = 9, масштабная линейка = 100 мкм) или анализировали для экспрессии EpCAM и CD49f с помощью проточной цитометрии в и .Культуры с клетками-предшественниками просвета, которые дифференцировались с образованием других типов клеток молочной железы, были ORG7, ORG43, ORG46, ORG48, ORG49 и ORG51. ORG41, ORG42 и ORG50 имели клетки-предшественники просвета, которые не дифференцировались с образованием других типов клеток молочных желез. f Клетки-предшественники просвета (EpCAM + CD49f + ), отсортированные из двух разных культур органоидов, повторно культивировали как органоиды, окрашивали на CK8 (зеленый) или EpCAM (зеленый), CK14 (красный) и DAPI (синий) , и изображение было получено с помощью конфокальной микроскопии (репрезентативно для n = 6, масштабная линейка = 100 мкм). г. Клетки дважды сортировали на EpCAM и CD49f, затем повторно выращивали и анализировали, как в e .

Эти типы структур аналогичны тем, которые генерируются другими методами трехмерного культивирования молочных желез, что отражает врожденную способность нормальных клеток молочной железы самоорганизовываться в протоковые или долькообразные структуры при воздействии экстракта базальной мембраны 19,20, 21,22 . Однако созданные нами органоиды были примечательны тем, что несколько структур и типов клеток сосуществовали в одной культуре, и разнообразие можно было воспроизвести даже после повторной диссоциации и пассирования органоидов.Все типы клеток могут образовывать органоиды. Хотя базальные / стволовые клетки образовывали более крупные органоиды, их общая эффективность образования органоидов была ниже, чем у других типов клеток. Эффективность образования органоидов рассчитывалась как 1 из 16 зрелых клеток просвета, 1 из 10 клеток-предшественников просвета и 1 из 117 базальных / стволовых клеток ( n ≥ 3 культур, оцененных для каждой) (дополнительная таблица 3).

Чтобы оценить их рост и дифференцировку в культуре, клетки, отсортированные по EpCAM и CD49f, впоследствии отслеживали в культуре органоидов в течение не менее 6 недель.В то время как EpCAM + CD49f зрелые просветные клетки генерировали преимущественно ацинарные структуры, которые оставались EpCAM + , EpCAM CD49f + базальные / стволовые клетки генерировали более разнообразные типы структур, включая базальные, просветные клетки-предшественники и зрелые просветные клетки. типы (рис. 2г, д). Интересно, что отсортированные клетки-предшественники просвета EpCAM + CD49f + были способны генерировать как зрелые просветные, так и базальные клетки (рис. 2d, e, шесть из девяти протестированных культур).Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило экспрессию базальных и люминальных маркеров в органоидах, полученных из одиночных просветных клеток-предшественников (рис. 2f). Эти результаты можно было обобщить после двойной сортировки клеток для повышения чистоты (рис. 2g). Ранее сообщалось о способности предшественников просвета генерировать как просветные, так и базальные клетки in vitro и in vivo (в экспериментах по восстановлению молочных желез) 23,24 .

В трех из девяти случаев отсортированные клетки-предшественники просвета не дифференцировались в культуре ни на просветные, ни на базальные клоны (процент клеток, которые были предшественниками просвета после сортировки и повторного культивирования, составлял 95.2, 97,4 и 99,6%). В двух из этих случаев родительские несортированные культуры преимущественно состояли из органоидов типа предшественников просвета на основании морфологии (процент клеток, являющихся предшественниками просвета, составлял 96,6%, 30,6% и 87,4% соответственно). Возможно, что зрелые люминальные и базальные типы клеток не присутствуют в некоторых культурах, потому что люминальные клетки-предшественники неспособны дифференцироваться в другие типы клеток.

Органоиды сохраняют сложные эпителиальные клоны молочных желез

Чтобы получить более высокое разрешение сложных типов клеток молочных желез в культуре органоидов, мы использовали массовую цитометрию, или CyTOF.Этот метод позволил нам измерить уровни 38 белков на уровне одной клетки по сравнению с проточной цитометрией, где обычно измеряются только 2–4 белка 25,26 . Мы создали уникальную панель из 38 меченных металлами антител, распознающих белки, связанные с функцией клеток молочной железы, происхождением и онкогенезом (дополнительный рис. 2), чтобы очертить паттерны экспрессии специфичных для молочных желез белков на отдельных клетках в культурах органоидов.

Массовая цитометрия была выполнена на панели из 12 культур органоидов, полученных из нормальных тканей молочной железы пациентов разного возраста (19–58 лет), паритета (G0 – G4) и статуса наследственной мутации (нет, BRCA1 , BRCA2 , TP53 , ATM и PALB2 ).Как уже упоминалось, все ткани были гистологически нормальными. У большинства пациентов ранее не было РМЖ; у двух пациентов с наследственными мутациями в генах предрасположенности к раку и анамнезом предшествующей РМЖ мы также подтвердили, что клетки в культуре органоидов были диплоидными (дополнительный рис. 3). Чтобы свести к минимуму контаминацию стромы, культуры анализировали после пассажа 4. Стромальные клетки могут сохраняться в культуре во время ранних пассажей, но к пассажу 4 стромальные клетки не оставались в 11 из 12 культур (описанных ниже), и оставалось лишь небольшое количество остаточных. фибробласты присутствуют в одной культуре.

Результаты CyTOF были проанализированы с использованием алгоритма кластеризации с X-сдвигом для поиска групп или кластеров похожих клеток на основе уровней экспрессии 38 маркеров молочной железы. Затем кластеры отображались с помощью силовой схемы (рис. 3а). Как описано в другом месте 27 , здесь каждая точка представляет одну клетку, а близость клеток, как показано на графике, соответствует сходству их паттернов экспрессии белка. Анализ X-сдвига определил 29 кластеров эпителиальных клеток в культурах органоидов, представляющих разные типы клеток, а также различия в экспрессии белков внутри клеточных линий и между пациентами (рис.3а). Оценка базальных и просветных маркеров снова подтвердила, что основные подтипы эпителия сохранялись в культуре (рис. 3b – d и дополнительный рис. 4) с минимальным загрязнением стромы в одной культуре (121 клетка, рис. 3c). Важно отметить, что мы подтвердили, что уровни BRCA1 и p53 не влияли на определение основных кластеров, даже несмотря на то, что некоторые из этих пациентов имели унаследованные мутации в этих генах; повторный запуск алгоритма X-сдвига без BRCA1 и p53 воспроизвел почти идентичный шаблон кластеризации с первым анализом (дополнительный рис.5).

Рис. 3. Массовая цитометрическая оценка подтипов клеток молочной железы в нормальных органоидах молочной железы.

Форс-направленная схема, изображающая CyTOF-анализ 12 нормальных культур органоидов молочной железы. Каждая точка представляет одну ячейку и окрашена кластером, заданным с помощью X-сдвига. b Показаны уровни экспрессии маркеров, используемых для определения основных популяций молочных желез (более теплые цвета = более высокие уровни экспрессии). c Выделение основных клонов молочных желез на направленном по силе макете, как определено по экспрессии маркера в b . d Тепловая карта, показывающая уровни экспрессии указанных маркеров в клетках из репрезентативной культуры органоидов (красный = высокая экспрессия, синий = низкая экспрессия). 38 маркеров на панели CyTOF показаны на оси x , а отдельные ячейки на оси y упорядочены на основе кластеризации с X-сдвигом.

При анализе CyTOF этого большого набора образцов органоидной культуры было обнаружено несколько примечательных результатов, как показано на кластерной тепловой карте на рис.3d и дополнительный рис. 4 с дополнительными примерами, показанными в виде направленной по силе компоновки на дополнительном рис. 6. Зрелые клетки просвета органоидов поддерживали экспрессию белков, которые характерны для их аналогов в первичных тканях, например, CK8, MUC1, EPCAM, CD24, HER2 и вариабельная экспрессия ERα 11,28 . Уровни экспрессии PR в органоидах также были вариабельными, но в целом низкими. Кроме того, ранее сообщалось, что BRCA1 экспрессируется на самом высоком уровне в зрелых клетках просвета, с промежуточной экспрессией в клетках-предшественниках просвета и на самом низком уровне экспрессии в базальных / стволовых клетках, и этот паттерн хорошо сохраняется в органоидах . 28,29 .Предшественники просвета отличались более высокой экспрессией CD133 11 , а базальные клетки экспрессировали CD49f и по-разному экспрессировали SMA, EGFR, CD90 и CD10 30 . Кроме того, небольшая (<1%) популяция клеток, экспрессирующих EPCR (также известных как PROCR), может быть идентифицирована в основной популяции. Было показано, что PROCR маркирует редкую популяцию базальных мультипотентных стволовых клеток в молочной железе мыши 31 , и было показано, что он связан с экспрессией связанных со стволовостью факторов транскрипции и более высокой способностью к формированию атмосферы в клетках молочной железы человека 32 .

Для более прямого сравнения экспрессии белка в культурах органоидов с тканями, из которых они были получены, четыре ткани молочной железы были использованы для создания свежедиссоциированных единичных клеток, которые немедленно фиксировались параформальдегидом и замораживались для CyTOF, а также культуры органоидов, которые поддерживали в течение четырех пассажей, а затем диссоциировали на отдельные клетки и готовили для CyTOF. Ткани и соответствующие культуры органоидов были проанализированы CyTOF в одной партии с использованием нашей панели антител, специфичных для молочной железы.Для сравнения, одну ткань культивировали как HMEC в каноническом двумерном формате культуры, и снова соответствующие HMEC запускали в той же партии, что и клетки, выделенные непосредственно из исходной ткани.

X-сдвиг определяет 70 кластеров в четырех парах совпадающих тканей и органоидов; 44 из них были эпителиальными скоплениями (рис. 4а). Используя стандартные маркеры для определения стромальных клеток, а также люминальных и базальных эпителиальных клеток, мы подтвердили, что основные типы эпителиальных клеток молочной железы сохраняются в культуре (рис.4б – г). Культуры органоидов сохранили значительную степень сходства с тканями, из которых они были получены, что отражено в близости в пространстве на направленном по силе макете, а также в кластеризации, определяемой с помощью X-сдвига, и отображении экспрессии белков на тепловой карте (рис. 4d, левая панель и дополнительный рис. 7а). В отличие от органоидов, HMECs, выращенные только для двух пассажей в стандартной двумерной культуре с использованием среды Lonza MEGM, значительно отличались от первичных тканей, теряли большую часть просветных клеток и демонстрировали паттерн экспрессии белка со смешанными базальными и просветными характеристиками, которые не походили на любые клетки первичной ткани (рис.4d, правые панели и дополнительный рис. 7b).

Рис. 4. Сложные паттерны экспрессии белка, специфичного для молочной железы, из исходной ткани сохраняются в культуре.

Четыре нормальные ткани молочной железы переваривали до отдельных клеток и фиксировали параформальдегидом. Параллельно с этим из каждой ткани генерировали культуры органоидов, пассировали четыре раза, расщепляли до отдельных клеток и фиксировали. Уровни экспрессии белков 38 маркеров, связанных с онкогенезом и развитием молочной железы, анализировали на уровне отдельных клеток в культурах органоидов и соответствующих тканях происхождения с использованием цитометрии по времени пролета (CyTOF). a Силовое расположение органоидных культур и совпадающих исходных тканей, где каждая точка представляет одну клетку, а близость в пространстве связана с их сходством с точки зрения паттернов экспрессии белков. Ячейки окрашены кластерами, заданными с помощью X-сдвига. b Выделение основных популяций молочной железы по силовому расположению на основе экспрессии стандартных белковых маркеров для этих типов клеток. c Примеры клон-специфичных маркеров, используемых для определения популяций молочных желез, показанных в b , включая просвет (CK8 и EpCAM), зрелый просвет (GATA3) и базальный / стержневой (CK14, SMA и CD49f), а также в качестве стромальных маркеров (CD31, CD45 и CD140b) (более теплые цвета = более высокие уровни экспрессии). d Для сравнения нормальную ткань молочной железы переваривали до отдельных клеток и фиксировали, и параллельно получали и дважды пассировали двумерную культуру эпителиальных клеток молочной железы человека (HMEC, культивируемые в Lonza MEGM). HMEC и соответствующая ткань происхождения также были проанализированы с использованием CyTOF, как в a . Экспериментальная схема, разграничение типов клеток на направленном под действием силе макете и клетки из ткани или клетки из культуры выделены на разных панелях как для органоидов (левый столбец), так и для HMEC (правый столбец). e Корреляция между профилями экспрессии белка каждой HMEC или органоидной клетки и сигнатурами экспрессии, полученными из основных эпителиальных кластеров в соответствующей первичной ткани. Прямоугольные диаграммы (центральная линия, медиана; границы прямоугольника, верхний и нижний квартили; усы, 1,5 × межквартильный размах) показывают максимальное значение каждой клетки для основных эпителиальных кластеров, стратифицированных по образцам. Статистическая значимость оценивалась с помощью двустороннего критерия Манна – Уитни (*** p <2.2e − 16).

Мы провели статистическое сравнение профилей экспрессии белка каждой клетки в культурах HMEC и органоидов с сигнатурами, полученными из основных типов эпителия в соответствующей первичной ткани. Клетки из культур органоидов продемонстрировали значительно более сильную корреляцию с первичными тканевыми эпителиальными сигнатурами экспрессии, чем клетки из культуры HMEC (рис. 4e).

Чтобы гарантировать, что различия между HMEC и тканями не связаны с вариациями от пациента к пациенту, мы создали культуру органоидов и HMEC, происходящие из одного и того же образца ткани молочной железы.Множественные клоны эпителия молочных желез могут быть обнаружены в культуре органоидов, но не в HMECs (Fig. 5a). HMECs снова значительно отклонились от первичных тканей (рис. 5b). Аналогичное сравнение десяти культур органоидов с набором из четырех несовпадающих первичных тканей молочной железы продемонстрировало, что паттерны экспрессии белка отдельных клеток коррелировали между культурой и несоответствующей тканью со средним значением r Пирсона в диапазоне от 0,54 до 0,76 (в среднем 0,67, рис. 5c). . CyTOF-анализ трех иммортализованных линий HMEC аналогичным образом показал значительные различия в экспрессии маркеров клонов 33 , как и клетки MCF10A, выращенные в трехмерной культуре, которые часто используются для моделирования нормального эпителия молочной железы человека (дополнительный рис.8).

Рис. 5: Анализ подобранной органоидной культуры, HMEC и первичной ткани с помощью CyTOF.

Ткань молочной железы была диссоциирована и использована для создания культуры органоидов (ORG24), а также стандартной двумерной культуры HMEC (HMEC24). Клетки из ткани также напрямую фиксировали и замораживали для будущего анализа. Клетки из культур вместе с клетками из ткани анализировали CyTOF. На тепловых картах и показаны отдельные клетки из культур или сопоставленных тканей, как указано, с цветной полосой слева, указывающей на различные кластеры, определенные с помощью X-сдвига. b Корреляция между профилями экспрессии белка HMEC или органоидной клетки и сигнатурами экспрессии, происходящими из основных эпителиальных кластеров в согласованной первичной ткани. Прямоугольные диаграммы (центральная линия, медиана; границы прямоугольника, верхний и нижний квартили; усы, 1,5 × межквартильный размах) показывают максимальное значение каждой клетки для основных эпителиальных кластеров, стратифицированных по образцам. Статистическая значимость оценивалась с помощью двустороннего критерия Манна – Уитни (*** p <2.2e − 16). c Корреляционный анализ, как в b , проведенный для указанных десяти культур органоидов по сравнению с набором из четырех несовпадающих первичных тканей молочной железы.

В этих анализах также наблюдались заметные различия между культурами органоидов и первичными тканями. В некоторых культурах органоидов экспрессия CD10 была потеряна (дополнительный рис. 7a). Это может означать потерю взаимодействующих стромальных клеток или врожденной тканевой архитектуры, и то и другое не может быть полностью воспроизведено in vitro.В тех случаях, когда экспрессия CD10 сохранялась, эти клетки представляли собой субпопуляцию базовой популяции CD90 + (дополнительная фигура 6). Кроме того, органоиды проявляли высокие уровни экспрессии CD44 по сравнению с первичными тканями молочной железы (дополнительные рисунки 6 и 7a). Ранее сообщалось об увеличении CD44 в культивируемых клетках молочной железы, что объяснялось их повышенной скоростью пролиферации в культуре 34 . Кроме того, CD44 является геном-мишенью Wnt и может индуцироваться R-спондином 1 в культуральной среде органоидов 35 .Наконец, как отмечалось выше, экспрессия PR в культурах органоидов в целом была низкой (дополнительный рис. 7a). Однако эти изменения не были столь разительными, как различия между первичными тканями и культурами HMEC, где наблюдалась значительная потеря разнообразия клонов и нормальных различий между тремя основными популяциями молочных желез.

Многие изменения, наблюдаемые в HMEC и MCF10A, были ранее описаны на основе небольшого количества маркеров (например, CK14, CK8, виментин и ERα), указывающих на клетки со смешанным базальным и просветным фенотипом 3,36,37 ; однако анализ CyTOF с большей панелью маркеров обеспечил анализ этих клеток с более высоким разрешением.

Неоднородность органоидов с и без мутаций

BRCA1

Предыдущие анализы тканей молочной железы человека показали высокую степень вариабельности клеточного состава от пациента к пациенту 38,39,40 . Чтобы оценить, присутствуют ли аналогичные результаты в культурах органоидов, мы извлекли уровни экспрессии EpCAM и CD49f из анализов CyTOF 12 культур органоидов, а также из трех дополнительных культур, запущенных в более раннем пилотном проекте, чтобы определить долю клеток, присутствующих в каждой. из трех основных линий молочной железы.Мы обнаружили, что хотя линии молочных желез сохраняются в культуре органоидов, относительная доля каждой линии действительно варьируется от культуры к культуре (Рис. 6a). Это также заметно в кластерах, определяемых X-сдвигом, и в компоновке, направленной по силе (Рис. 6b и Дополнительный Рис. 9). Чтобы оценить, отражает ли эта вариабельность врожденную вариабельность от пациента к пациенту, мы сравнили распределение по клонам пяти культур органоидов из рис. 4 и 5 к соответствующим тканям и обнаружил, что распределение клонов было сходным в трех случаях, но разительно различающимся в двух (рис.6в). Различия в распределении клонов могут быть связаны с артефактом отбора проб, поскольку только относительно небольшая часть груди используется для создания органоидной культуры. Кроме того, различия в клинических переменных, таких как возраст, половая принадлежность и статус наследственной мутации, могут способствовать изменчивости и могут привести к обогащению определенных популяций клеток в культуре.

Рис. 6: Гетерогенность присутствует в распределении клонов молочных желез в культурах органоидов.

a Долю клеток в базальных, предшественниках просвета и зрелых клетках просвета определяли с использованием уровней EpCAM и CD49f, измеренных с помощью CyTOF для каждой из указанных 15 культур органоидов молочной железы.Образцы без известной мутации в гене предрасположенности к раку груди отмечены звездочкой. По гистологическим данным все случаи были нормальными. b Схема с принудительной ориентацией, в которой каждая точка представляет одну клетку, окрашенную в соответствии с идентификатором культуры (см. Дополнительный рис. 9). c Процент эпителиальных клеток в каждой из указанных основных клонов молочной железы показан для указанных культур органоидов и соответствующих первичных тканей.

Ранее сообщалось, что ткани груди женщин с наследственной мутацией в BRCA1 имеют более высокую долю просветных клеток-предшественников, которые могут быть обнаружены до любого явного туморогенеза 11 .Мы предположили, что часть очевидных вариаций от пациента к пациенту в клеточных клонах в культурах органоидов может быть связана с аналогичным увеличением доли просветных клеток-предшественников в культурах с мутацией в BRCA1 . Анализ 12 культур органоидов, полученных из восстановительных маммопластов, по сравнению с 12 культурами органоидов, полученных от носителей мутации BRCA1 , действительно показал, что BRCA1 -мутировавшие культуры органоидов имеют более высокую долю просветных предшественников (рис.7а, б). Важно отметить, что для этого анализа пациенты были сопоставлены в отношении потенциальных смешивающих переменных возраста и половой принадлежности (дополнительный рисунок 10). Интересно, что это различие не было результатом увеличения пролиферации предшественников просвета от носителей мутации BRCA1 на основе включения EDU (рис. 7c), что позволяет предположить, что увеличение числа предшественников просвета не было результатом преимущественного распространения во время культивирования. процесс, но вместо этого может отражать другие присущие свойства или высокую долю предшественников просвета в нативных тканях, как сообщалось ранее 11 .

Рис. 7: BRCA1 -гетерозиготные органоиды молочной железы имеют повышенную долю предшественников просвета.

a Репрезентативные культуры органоидов без (дикого типа) и с известной наследственной мутацией в BRCA1 расщепляли до единичных клеток, фиксировали и окрашивали на EpCAM и CD49f. Показаны графики проточной цитометрии. b Количественная оценка популяций зрелых просветов (ML), предшественников просвета (LP) и базальных / стволовых (базальных) популяций, как определено с помощью проточной цитометрии оценки уровней EpCAM и CD49f, показаны для 12 культур органоидов дикого типа (WT) в сравнении с 12 культурами, полученными из тканей груди пациентов с наследственной мутацией BRCA1 (B1 mut). c Пролиферацию клеток молочной железы измеряли во всех 24 культурах путем инкубации с EDU в течение 16 часов и измерения включения EDU. В b и c показано среднее значение с доверительным интервалом 95%. * p = 0,037, по критерию Стьюдента t , двусторонний.

В дополнение к культурам с расширенными популяциями просветных предшественников были идентифицированы две культуры со значительно большей долей зрелых просветных популяций. Удивительно, но эти культуры «преимущественно зрелых люминальных клеток» можно было пассировать в течение> 8 месяцев in vitro, несмотря на то, что они почти полностью состоят из более дифференцированных клеток (дополнительный рис.11а). Культуры состояли из полых ацинарных структур; со временем развились более крупные структуры с многопросветной морфологией. Они также иногда наблюдались в других культурах с меньшей частотой, были ранее описаны 41 и напоминают доброкачественную обычную гиперплазию протоков (дополнительный рис. 11b, c). Интересно, что пролиферирующие зрелые клетки просвета экспрессировали более высокие уровни субъединицы γ2 ламинина 332 (ранее называвшегося ламинином 5 (V)), белка базальной мембраны, который обычно продуцируется базальными миоэпителиальными клетками (дополнительный рис.11г). В органоидах это может быть следствием близости клеток просвета к экстракту базальной мембраны, в котором они выращиваются.

Таким образом, большинство тканей молочной железы при культивировании в виде органоидов давало зрелые просветные, просветные предшественники, а также базальные / стволовые эпителиальные клетки. Однако существует значительная неоднородность между пациентами. В некоторых тканях, предрасположенных к раку, это отражало повышенную долю клеток-предшественников просвета, тогда как в других тканях это было связано с разными уровнями других подтипов эпителия молочных желез.

Компоненты органоидной среды влияют на пропорцию клонов

Чтобы определить вклад отдельных факторов роста и ингибиторов в репрезентативность различных типов эпителиальных клеток молочной железы в культуре органоидов, мы создали набор из десяти органоидных сред с отсутствием одного фактора в каждая из восьми композиций (EGF, добавка B27, ингибитор TGFβ A83-01, R-спондин 1, FGF7 и FGF10, ингибитор p38 MAPK SB202190, херегулин β1 и Noggin) и с двумя контролями (с разными источниками R- спондин 1).Используя каждую из этих десяти сред, мы культивировали ткани молочной железы четырех разных женщин. Культуры пассировали по крайней мере дважды для получения достаточного количества клеток и анализировали с помощью CyTOF.

Анализ клонов молочных желез, присутствующих в наборе из десяти культур органоидов, показал, что удаление отдельных факторов из среды влияло на долю клеток в каждой из клонов молочных желез в большинстве случаев (рис. 8а и дополнительный рис. 12а). . Это также было очевидно по направленной силе компоновки, когда клетки, выращенные в каждом из десяти условий, не перекрывались и демонстрировали различия в кластеризации как между, так и внутри основных клонов молочных желез (рис.8б).

Рис. 8: Распределение клонов эпителия молочной железы после удаления факторов из органоидной среды.

Четыре ткани молочной железы человека были диссоциированы, и был получен набор из десяти совпадающих культур органоидов с использованием составов сред, каждая из которых была удалена с указанным компонентом среды. a Фракция зрелых просветных (ML), просветных клеток-предшественников (LP) и базальных клеток в культурах органоидов, выращенных в среде без указанного фактора, как нормализовано к контролю (полная среда).Показано среднее значение со стандартной ошибкой среднего ( n = четыре культуры). b Показаны схемы с направленным усилием для четырех наборов органоидных культур, где каждая точка, представляющая отдельную клетку, окрашена в зависимости от конкретного состава используемой среды. c Уровни экспрессии EGFR в зрелых просветных, просветных клетках-предшественниках и базальных / стволовых клетках показаны на гистограмме, измеренной с помощью CyTOF, в согласованных культурах органоидов, выращенных в присутствии или в отсутствие EGF, как указано.

Наиболее заметные изменения произошли в результате удаления EGF, что привело к увеличению относительной доли зрелых люминальных клеток с одновременным уменьшением базальных клеток (рис.8а). Анализ уровней EGFR в отдельных клетках из популяций молочных желез показал, что в отсутствие EGF доля базальных клеток EGFR + была снижена во всех четырех испытанных случаях, но EGFR + клетки-предшественники просвета были уменьшены только в двух из четырех случаев (рис. . 8c). Все линии молочных желез демонстрировали последовательные изменения в экспрессии белка в условиях отсутствия EGF. Зрелые клетки просвета показали пониженную экспрессию маркеров MUC1 и галектина-1, клетки-предшественники просвета продемонстрировали пониженную экспрессию ANPEP (CD13), а базальные клетки продемонстрировали повышенную экспрессию CD90 во всех четырех случаях (дополнительный рис.12б).

В отличие от EGF, удаление либо херегулина β 1, ингибитора p38 MAPK, либо FGF7 и FGF10 привело к относительному снижению зрелых клеток просвета с одновременным увеличением в одной из других клонов молочных желез (рис. 8a). Удаление ингибитора TGFβ и в различной степени удаление Noggin из среды привело к относительному увеличению количества клеток-предшественников просвета, тогда как удаление R-спондина 1 привело к относительному уменьшению фракции предшественников просвета (рис.8а). Интересно, что удаление добавки B27 не повлияло на распределение клонов молочных желез в культуре. Однако удаление B27 или EGF действительно повлияло на культуру органоидов в целом, о чем свидетельствует уменьшение слияния и размера органоидов во всех четырех случаях (дополнительный рис. 12c). Также наблюдалось снижение процента базальных клеток, которые являются CD73 + CD90 , в трех из четырех случаев после удаления B27 и во всех четырех случаях после удаления EGF (дополнительный рис.13). Отдельный тип клеток CD73 + CD90 был описан как минорная популяция эпителиальных клеток молочной железы с бипотентной активностью предшественников 42 .

Эти находки демонстрируют, что состав органоидной среды может быть изменен, чтобы влиять на относительную долю клонов молочных желез, присутствующих в культуре органоидов, и имеют значение для дальнейших исследований дифференцировки эпителиальных клеток молочных желез и автономной, а также не клеточной автономной передачи сигналов.

Технология органоидов и их применение в исследованиях рака | Журнал гематологии и онкологии

  • 1.

    Lai YH, Lin SY, Wu YS, Chen HW, Chen JJW. Иодид AC-93253, новый ингибитор Src, подавляет прогрессирование NSCLC, модулируя несколько сигнальных путей, связанных с Src. J Hematol Oncol. 2017; 10: 172.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 2.

    Лай И, Вэй Х, Лин С, Цинь Л, Ченг Л, Ли П.Текущее состояние и перспективы моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, в исследованиях рака. J Hematol Oncol. 2017; 10: 106.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 3.

    Мэн С., Чжоу Х, Фенг З, Сюй З, Тан И, Ли П и др. CircRNA: функции и свойства нового потенциального биомаркера рака. Молочный рак. 2017; 16:94.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 4.

    Ли А., Чжан Т., Чжэн М., Лю Ю., Чен З. Экзосомные белки как потенциальные маркеры диагностики опухолей. J Hematol Oncol. 2017; 10: 175.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 5.

    Виардо А., Баргу Р. Биспецифические антитела при злокачественных гематологических заболеваниях. Лечение рака Ред. 2018; 65: 87–95.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 6.

    Yu S, Liu Q, Han X, Qin S, Zhao W., Li A, et al. Разработка и клиническое применение моноклональных и биспецифических антител против HER2 для лечения рака. Exp Hematol Oncol. 2017; 6:31.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 7.

    Yu S, Li A, Liu Q, Yuan X, Xu H, Jiao D, et al. Последние достижения биспецифических антител при солидных опухолях. J Hematol Oncol. 2017; 10: 155.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 8.

    Yi M, Jiao D, Xu H, Liu Q, Zhao W., Han X, et al. Биомаркеры для прогнозирования эффективности ингибиторов PD-1 / PD-L1. Молочный рак. 2018; 17: 129.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 9.

    Wei G, Ding L, Wang J, Hu Y, Huang H. Успехи CD19-направленных T-клеток, модифицированных химерным антигенным рецептором, при рефрактерном / рецидивирующем остром лимфобластном лейкозе. Exp Hematol Oncol. 2017; 6: 10.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 10.

    Xu H, Yu S, Liu Q, Yuan X, Mani S, Pestell RG и др. Последние достижения высокоселективных ингибиторов CDK4 / 6 при раке груди. J Hematol Oncol. 2017; 10: 97.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 11.

    Панг И, Хоу Х, Ян Ц., Лю И, Цзян Г. Успехи в терапии Т-клеток, модифицированных химерными антигенами, для лечения онкозаболеваний. Молочный рак. 2018; 17: 91.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 12.

    Лю Б., Сун Ю., Лю Д. Последние разработки в области клинического применения антител к PD-1 и PD-L1 для иммунотерапии рака. J Hematol Oncol. 2017; 10: 174.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 13.

    Чжоу Дж, Су Дж, Фу Х, Чжэн Л., Инь З. Микрожидкостное устройство для выделения сфероидов первичной опухоли. Exp Hematol Oncol. 2017; 6:22.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 14.

    Бен-Дэвид У, Ха Г, Ценг Й.Й., Гринвальд Н.Ф., О Ч., Ши Дж. И др. Ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, претерпевают эволюцию опухоли, специфичную для мыши. Нат Жене. 2017; 49: 1567–75.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 15.

    Бирн А.Т., Алфрез Д.Г., Амант Ф., Аннибали Д., Аррибас Дж., Бианкин А.В. и др. Изучение открытых вопросов в медицине рака с использованием ксенотрансплантатов, полученных от пациентов. Нат Рев Рак. 2017; 17: 632.

    PubMed Статья CAS PubMed Central Google ученый

  • 16.

    Lancaster MA, Knoblich JA. Органогенез в блюде: моделирование развития и заболевания с помощью органоидных технологий. Наука. 2014; 345: 1247125.

    PubMed Статья CAS PubMed Central Google ученый

  • 17.

    Дрост Дж, Клеверс Х. Органоиды в исследованиях рака. Нат Рев Рак. 2018; 18: 407–18.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 18.

    Yeung TM, Gandhi SC, Wilding JL, Muschel R, Bodmer WF. Раковые стволовые клетки из линий клеток, происходящих от колоректального рака. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2010; 107: 3722–7.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 19.

    Onuma K, Ochiai M, Orihashi K, Takahashi M, Imai T., Nakagama H, et al. Генетическая реконструкция туморогенеза в первичных клетках кишечника. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013; 110: 11127–32.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 20.

    Scanu T, Spaapen RM, Bakker JM, Pratap CB, Wu LE, Hofland I, et al. Манипуляции сальмонеллами сигнальных путей хозяина вызывают клеточную трансформацию, связанную с карциномой желчного пузыря. Клеточный микроб-хозяин. 2015; 17: 763–74.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 21.

    Yin Y, Bijvelds M, Dang W., Xu L, van der Eijk AA, Knipping K, et al. Моделирование ротавирусной инфекции и противовирусная терапия с использованием первичных кишечных органоидов. Antivir Res. 2015; 123: 120–31.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 22.

    Дэвис Х., Глодзик Д., Морганелла С., Йейтс Л. Р., Стааф Дж., Зоу Х и др. HRDetect является предиктором дефицита BRCA1 и BRCA2 на основе мутационных сигнатур. Nat Med.2017; 23: 517–25.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 23.

    Дрост Дж., Ван Бокстел Р., Блокзейл Ф., Мизутани Т., Сасаки Н., Сасселли В. и др. Использование CRISPR-модифицированных органоидов стволовых клеток человека для изучения происхождения мутационных сигнатур при раке. Наука. 2017; 358: 234–8.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 24.

    Матано М., Дате С., Симокава М., Такано А., Фуджи М., Охта Ю. и др. Моделирование колоректального рака с использованием CRISPR-Cas9-опосредованной инженерии кишечных органоидов человека. Nat Med. 2015; 21: 256–62.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 25.

    Li X, Nadauld L, Ootani A, Corney DC, Pai RK, Gevaert O, et al. Онкогенная трансформация различных тканей желудочно-кишечного тракта в первичной культуре органоидов. Nat Med.2014; 20: 769–77.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 26.

    Vlachogiannis G, Hedayat S, Vatsiou A, Jamin Y, Fernandez-Mateos J, Khan K, et al. Органоиды, полученные от пациентов, моделируют терапевтический ответ метастатического рака желудочно-кишечного тракта. Наука. 2018; 359: 920–6.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 27.

    Sampaziotis F, Justin AW, Tysoe OC, Sawiak S, Godfrey EM, Upponi SS, et al. Реконструкция внепеченочного билиарного дерева мыши с использованием органоидов первичных внепеченочных холангиоцитов человека. Nat Med. 2017; 23: 954–63.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 28.

    Рамсден С.М., Паунер М.Б., Карр А.Дж., Смарт М.Дж., да Круз Л., Коффи П.Дж. Стволовые клетки в регенерации сетчатки: прошлое, настоящее и будущее. Разработка. 2013; 140: 2576–85.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 29.

    Паули С., Хопкинс Б.Д., Пранди Д., Шоу Р., Федриззи Т., Сбонер А. и др. Персонализированные модели рака in vitro и in vivo для точной медицины. Рак Discov. 2017; 7: 462–77.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 30.

    Papapetrou EP. Плюрипотентные стволовые клетки, полученные от пациентов, в онкологических исследованиях и прецизионной онкологии.Nat Med. 2016; 22: 1392–401.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 31.

    Fujii M, Shimokawa M, Date S, Takano A, Matano M, Nanki K, et al. Библиотека органоидов колоректальной опухоли демонстрирует прогрессирующую потерю потребности в нишевом факторе во время туморогенеза. Стволовая клетка. 2016; 18: 827–38.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 32.

    Schutte M, Risch T., Abdavi-Azar N, Boehnke K, Schumacher D., Keil M, et al. Молекулярное рассечение колоректального рака на доклинических моделях позволяет выявить биомаркеры, предсказывающие чувствительность к ингибиторам EGFR. Nat Commun. 2017; 8: 14262.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 33.

    Weeber F, van de Wetering M, Hoogstraat M, Dijkstra KK, Krijgsman O, Kuilman T, et al. Сохранение генетического разнообразия органоидов, культивированных из биоптатов метастазов колоректального рака человека.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2015; 112: 13308–11.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 34.

    Broutier L, Mastrogiovanni G, Verstegen MM, Francies HE, Gavarro LM, Bradshaw CR, et al. Культуры органоидов, полученных из первичного рака печени человека, для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Nat Med. 2017; 23: 1424–35.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 35.

    Huang L, Holtzinger A, Jagan I, BeGora M, Lohse I, Ngai N и др. Моделирование протокового рака поджелудочной железы и скрининг лекарств с использованием опухолевых органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека и пациентов. Nat Med. 2015; 21: 1364–71.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 36.

    Сейно Т., Кавасаки С., Симокава М., Тамагава Х., Тошимицу К., Фуджи М. и др. Органоиды опухоли поджелудочной железы человека обнаруживают потерю зависимости от фактора ниши стволовых клеток во время прогрессирования заболевания.Стволовая клетка. 2018; 22: 454–67.e6.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 37.

    Гао Д., Вела И., Сбонер А., Яквинта П.Дж., Картхаус В.Р., Гопалан А. и др. Культуры органоидов, полученные от пациентов с распространенным раком простаты. Клетка. 2014; 159: 176–87.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 38.

    Sachs N, de Ligt J, Kopper O, Gogola E, Bounova G, Weeber F, et al.Живой биобанк органоидов рака груди отражает неоднородность заболевания. Клетка. 2018; 172: 373–86.e10.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 39.

    Evans GS, Flint N, Somers AS, Eyden B, Potten CS. Разработка метода приготовления первичных культур эпителиальных клеток кишечника крыс. J Cell Sci. 1992; 101: 219–31.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 40.

    Уайтхед Р.Х., Деммлер К., Рокман С.П., Уотсон Н.К. Клоногенный рост эпителиальных клеток нормальной слизистой оболочки толстой кишки как мышей, так и людей. Гастроэнтерология. 1999; 117: 858–65.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 41.

    Фукамачи Х. Пролиферация и дифференцировка эпителиальных клеток кишечника плодов крысы в ​​первичной бессывороточной культуре. J Cell Sci. 1992; 103: 511–9.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 42.

    Perreault N, Beaulieu JF. Использование диссоциирующего фермента термолизина для создания жизнеспособных культур нормальных кишечных эпителиальных клеток человека. Exp Cell Res. 1996. 224: 354–64.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 43.

    Сато Т., Фриз Р.Г., Снапперт Х.Д., ван де Ветеринг М., Баркер Н., Штанге Д.Э. и др. Единичные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинки in vitro без мезенхимальной ниши. Природа.2009; 459: 262–5.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 44.

    Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, Van Es JH, Van den Brink S, et al. Длительное распространение эпителиальных органоидов из толстой кишки, аденомы, аденокарциномы и эпителия Барретта человека. Гастроэнтерология. 2011; 141: 1762–72.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 45.

    Штанге Д.Е., Ку Б.К., Хуч М., Сиббел Г., Басак О., Любимова А. и др.Дифференцированные тройские + главные клетки действуют как резервные стволовые клетки, генерируя все клоны эпителия желудка. Клетка. 2013; 155: 357–68.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 46.

    Хуч М., Доррелл С., Бой С.Ф., ван Эс Дж. Х., Ли В.С., ван де Ветеринг М. и др. Экспансия in vitro единичных Lgr5 + стволовых клеток печени, индуцированная регенерацией, управляемой Wnt. Природа. 2013; 494: 247–50.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 47.

    Messner S, Agarkova I, Moritz W, Kelm JM. Многоклеточные микроткани печени человека для тестирования гепатотоксичности. Arch Toxicol. 2013; 87: 209–13.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 48.

    Binas B, Spitzer E, Zschiesche W., Erdmann B, Kurtz A, Muller T, et al. Гормональная индукция функциональной дифференцировки и экспрессии ингибиторов роста молочных желез в культивируемых эксплантатах молочных желез мышей.In vitro Cell Dev Biol. 1992; 28а: 625–34.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 49.

    Ван М., Лю Ю.Е., Ни Дж., Айгун Б., Голдберг И.Д., Ши Ю. Индукция дифференцировки молочной железы с помощью гена, происходящего из молочной железы, связанного с ингибитором роста, который взаимодействует с жирной кислотой омега-3, подавляя рост клеток рака молочной железы. Cancer Res. 2000. 60: 6482–7.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 50.

    Брок Э.Дж., Джи К., Шах С., Мэттингли Р.Р., Слоан Б.Ф. Модели in vitro для изучения инвазивных переходов протоковой карциномы in situ. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2018. https://doi.org/10.1007/s10911-018-9405-3.

  • 51.

    Saxen L, Lehtonen E. Эмбриональная почка в органной культуре. Дифференциация. 1987; 36: 2–11.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 52.

    Avner ED, Piesco NP, Sweeney WE Jr, Ellis D.Развитие почечного эпителия в органотипической культуре. Педиатр Нефрол. 1988; 2: 92–9.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 53.

    van den Berg CW, Ritsma L, Avramut MC, Wiersma LE, van den Berg BM, Leuning DG, et al. Субкапсулярная трансплантация почечных органоидов, происходящих из PSC, индуцирует неоваскулогенез и значительное созревание клубочков и канальцев in vivo. Отчеты о стволовых клетках. 2018; 10: 751–65.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 54.

    Боттенштейн Дж. Э., Сато Г. Х. Рост линии клеток нейробластомы крысы в ​​бессывороточной среде с добавками. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1979; 76: 514–7.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 55.

    Honegger P, Lenoir D, Favrod P. Рост и дифференциация агрегированных эмбриональных клеток мозга в бессывороточной определенной среде.Природа. 1979; 282: 305–8.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 56.

    Снайдер Е.Ю., Ким СУ. Гормональные требования для выживания нейронов в культуре. Neurosci Lett. 1979; 13: 225–30.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 57.

    Паска SP. Построение трехмерных органоидов человеческого мозга. Nat Neurosci.2018. https://doi.org/10.1038/s41593-018-0107-3.

  • 58.

    Qian X, Nguyen HN, Song MM, Hadiono C, Ogden SC, Hammack C, et al. Органоиды, специфичные для области мозга, с использованием мини-биореакторов для моделирования воздействия ZIKV. Клетка. 2016; 165: 1238–54.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 59.

    Suga H, Kadoshima T, Minaguchi M, Ohgushi M, Soen M, Nakano T. и др. Самообразование функционального аденогипофиза в трехмерной культуре.Природа. 2011; 480: 57–62.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 60.

    Джо Дж, Сяо Й, Сунь АКС, Цукуроглу Э, Тран HD, Гоке Дж и др. Органоиды, подобные среднему мозгу, из плюрипотентных стволовых клеток человека содержат функциональные дофаминергические и нейромеланин-продуцирующие нейроны. Стволовая клетка. 2016; 19: 248–57.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 61.

    Мугурума К., Нишияма А., Каваками Х., Хашимото К., Сасай Ю. Самоорганизация поляризованной ткани мозжечка в трехмерной культуре плюрипотентных стволовых клеток человека. Cell Rep. 2015; 10: 537–50.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 62.

    Сакагути Х., Кадосима Т., Соен М., Нари Н., Исида Й., Огуши М. и др. Генерация функциональных нейронов гиппокампа из самоорганизующихся человеческих эмбриональных стволовых клеток, полученных из дорсомедиальной телэнцефальной ткани.Nat Commun. 2015; 6: 8896.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 63.

    Куо CJ, Curtis C. Органоиды показывают динамику рака. Природа. 2018; 556: 441–2.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 64.

    Muthuswamy SK. Органоидные модели рака полны возможностей. Стволовая клетка. 2018; 22: 290–1.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 65.

    Креспо М., Вилар Э, Цай С.Ю., Чанг К., Амин С., Сринивасан Т. и др. Органоиды толстой кишки, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для моделирования колоректального рака и тестирования лекарств. Nat Med. 2017; 23: 878–84.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 66.

    Бодж С.Ф., Хван С.И., Бейкер Л.А., Чио II, Энгл Д.Д., Корбо В.и др. Органоидные модели протокового рака поджелудочной железы человека и мыши. Клетка. 2015; 160: 324–38.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 67.

    Ли Ш., Ху В., Матулай Дж. Т., Сильва М. В., Овцарек Т. Б., Ким К. и др. Эволюция опухоли и лекарственный ответ на органоидных моделях рака мочевого пузыря, полученных от пациентов. Клетка. 2018; 173: 515–28.e17.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 68.

    Пука Л., Бареджа Р., Пранди Д., Шоу Р., Бенелли М., Картхаус В. Р. и др. Органоиды, полученные от пациентов, для моделирования редких фенотипов рака простаты. Nat Commun. 2018; 9: 2404.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 69.

    Зейдлитц Т., Меркер С.Р., Роте А., Закжевски Ф., фон Нойбек С., Груцманн К. и др. Моделирование рака желудка человека с использованием органоидов. Кишечник. 2018. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2017-314549.

  • 70.

    Ропер Дж., Таммела Т., Цетинбас Н.М., Аккад А., Роганян А., Рикельт С. и др. Редактирование генома in vivo и модели трансплантации органоидов колоректального рака и метастазов. Nat Biotechnol. 2017; 35: 569–76.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 71.

    Cristobal A, van den Toorn HWP, van de Wetering M, Clevers H, Heck AJR, Mohammed S. Персонализированные протеомные профили органоидов здоровой и опухолевой толстой кишки человека раскрывают как индивидуальное разнообразие, так и основные особенности колоректального рака.Cell Rep. 2017; 18: 263–74.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 72.

    Нуцифоро С., Фофана И., Материя М.С., Блумер Т., Калабрезе Д., Болданова Т. и др. Органоидные модели рака печени человека, полученные из биопсии опухолевой иглы. Cell Rep.2018; 24: 1363–76.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 73.

    Zhang HC, Kuo CJ.Персонализация органоидов рака поджелудочной железы с помощью hPSC. Nat Med. 2015; 21: 1249–51.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 74.

    Уолш А.Дж., Кастелланос Д.А., Нагатихалли Н.С., Торговец Н.Б., Скала МС. Оптическая визуализация изменений метаболизма, вызванных лекарственными средствами, в органоидах рака поджелудочной железы у мышей и человека выявляет гетерогенный лекарственный ответ. Поджелудочная железа. 2016; 45: 863–9.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 75.

    Ranftl RE, Calvo F. Анализ инвазии клеток рака груди с использованием системы органотипической культуры. Методы Мол биол. 2017; 1612: 199–212.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 76.

    Duarte AA, Gogola E, Sachs N, Barazas M, Annunziato S, de Ruiter JR, et al. BRCA-дефицитные органоиды опухолей молочной железы мышей для изучения устойчивости к противораковым препаратам. Нат методы. 2018; 15: 134–40.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 77.

    Йошида Т., Сопко Н.А., Кейтс М., Лю Х, Джойс Дж., МакКонки Д.Д. и др. Трехмерная культура органоидов показывает участие пути Wnt / бета-катенин в пролиферации клеток рака мочевого пузыря. Oncotarget. 2018; 9: 11060–70.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 78.

    Шеной Т.Р., Бойсен Дж., Ван М.Ю., Сюй QZ, Гуо В., Кох FM и др. Потеря CHD1 повышает чувствительность рака простаты к терапии, повреждающей ДНК, способствуя исправлению двухцепочечных разрывов, подверженных ошибкам.Энн Онкол. 2017; 28: 1495–507.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 79.

    Sung SY, Hsieh CL, Law A, Zhau HE, Pathak S, Multani AS, et al. Коэволюция рака простаты и костной стромы в трехмерной совместной культуре: последствия для роста и метастазирования рака. Cancer Res. 2008; 68: 9996–10003.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 80.

    Сайто Й., Ониси Н., Таками Х., Сейшима Р., Иноуэ Х., Хирата Й. и др. Разработка функциональной модели щитовидной железы на основе системы культивирования органоидов. Biochem Biophys Res Commun. 2018; 497: 783–9.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 81.

    Jabs J, Zickgraf FM, Park J, Wagner S, Jiang X, Jechow K, et al. Скрининг эффектов лекарств в раковых клетках, полученных от пациентов, связывает реакции органоидов с изменениями генома.Mol Syst Biol. 2017; 13: 955.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 82.

    da Silva B, Mathew RK, Polson ES, Williams J, Wurdak H. Спонтанная инфильтрация сфероидом глиобластомы церебральными органоидами на ранней стадии моделирует инвазию опухоли головного мозга. SLAS Discov. 2018; 23: 862–8.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 83.

    Батлер CR, Hynds RE, Gowers KH, Lee Ddo H, Brown JM, Crowley C и др. Быстрое распространение эпителиальных стволовых клеток человека, пригодных для тканевой инженерии дыхательных путей. Am J Respir Crit Care Med. 2016; 194: 156–68.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 84.

    Hild M, Jaffe AB. Производство трехмерных органоидов дыхательных путей из первичных базальных клеток дыхательных путей человека и их использование в высокопроизводительном скрининге. Curr Protoc Stem Cell Biol.2016; 37: Ie.9.1 – ie.9.15.

    Артикул Google ученый

  • 85.

    Чу Х.В., Риос С., Хуанг С., Весоловска-Андерсен А., Бурчард Е.Г., О’Коннор Б.П. и др. Опосредованный CRISPR-Cas9 нокаут гена в первичных эпителиальных клетках дыхательных путей человека показывает провоспалительную роль MUC18. Gene Ther. 2015; 22: 822–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 86.

    Gao X, Bali AS, Randell SH, Hogan BL. GRHL2 координирует регенерацию поляризованного мукоцилиарного эпителия из базальных стволовых клеток. J Cell Biol. 2015; 211: 669–82.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 87.

    Реринк С.Ф., Сасаки Н., Ли-Сикс Х., Янг М.Д., Александров Л.Б., Бехджати С. и др. Внутриопухолевая диверсификация колоректального рака на одноклеточном уровне. Природа. 2018; 556: 457–62.

    PubMed Статья CAS PubMed Central Google ученый

  • 88.

    Fessler E, Drost J, van Hooff SR, Linnekamp JF, Wang X, Jansen M и др. Передача сигналов TGFbeta направляет зубчатые аденомы к подтипу мезенхимального колоректального рака. EMBO Mol Med. 2016; 8: 745–60.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 89.

    Сакамото Н., Фенг Й., Столфи С., Куросу Ю., Грин М., Лин Дж. И др. BRAF (V600E) взаимодействует с инактивацией CDX2, способствуя зазубренному колоректальному онкогенезу.Элиф. 2017; 6. https://doi.org/10.7554/eLife.20331.

  • 90.

    Drost J, van Jaarsveld RH, Ponsioen B, Zimberlin C, van Boxtel R, Buijs A, et al. Последовательные мутации рака в культивируемых стволовых клетках кишечника человека. Природа. 2015; 521: 43–7.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 91.

    Ян ХХН, Лай Дж.С.В., Хо С.Л., Люнг В.К., Ло В.Л., Ли Дж.Ф.и. и др. Зародышевая линия RNF43 и соматическая мутация в пути зубчатой ​​неоплазии и ее связь с мутацией BRAF.Кишечник. 2017; 66: 1645–56.

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 92.

    Камб А. Что не так с нашими моделями рака? Nat Rev Drug Discov. 2005; 4: 161–5.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 93.

    Caponigro G, Продавцы WR. Достижения в доклинической проверке терапевтических гипотез рака. Nat Rev Drug Discov.2011; 10: 179–87.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 94.

    Voskoglou-Nomikos T, Pater JL, Seymour L. Клиническая прогностическая ценность доклинических моделей рака линии клеток in vitro, человеческого ксенотрансплантата и аллотрансплантата мыши. Clin Cancer Res. 2003; 9: 4227–39.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 95.

    Аббаси Дж. Органоиды, полученные от пациентов, позволяют прогнозировать ответ на лечение рака.ДЖАМА. 2018; 319: 1427.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 96.

    Эдер А., Воллерт И., Хансен А., Эшенхаген Т. Ткань сердца, сконструированная человеком, как модельная система для тестирования лекарств. Adv Drug Deliv Rev. 2016; 96: 214–24.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 97.

    Штаб-квартира Дуонг, Немазаньи I, Рамбоу Ф., Тан С.К., Делоне С., Тарун Л. и др.Эндосомный белок CEMIP связывает передачу сигналов Wnt с активацией MEK1-ERK1 / 2 в устойчивых к Селуметинибу кишечных органоидах. Cancer Res. 2018; 78: 4533–48.

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 98.

    ван де Ветеринг М., Фрэнсис Х.М., Фрэнсис Дж. М., Боунова Г., Иорио Ф., Пронк А. и др. Перспективное создание биобанка живых органоидов больных колоректальным раком. Клетка. 2015; 161: 933–45.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 99.

    Шерр CJ, Пляж D, Шапиро Г.И. Ориентация на CDK4 и CDK6: от открытия к терапии. Рак Discov. 2016; 6: 353–67.

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 100.

    Verissimo CS, Overmeer RM, Ponsioen B, Drost J, Mertens S, Verlaan-Klink I, et al. Нацеливание на мутантный RAS в органоидах колоректального рака, полученных от пациентов, с помощью комбинаторного скрининга лекарственных средств. Элиф. 2016; 5. https://doi.org/10.7554/eLife.18489.

  • 101.

    Онозато Д., Ямасита М., Наканиси А., Акагава Т., Кида Ю., Огава И. и др. Получение кишечных органоидов, подходящих для фармакокинетических исследований, из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Утилизация наркотиков. 2018. https://doi.org/10.1124/dmd.118.080374.

  • 102.

    Костадинова Р., Бесс Ф., Эпплгейт Д., Сутер Л., Вайзер Т., Сингер Т. и др. Долгосрочная трехмерная система совместного культивирования печени для улучшенного прогнозирования клинически значимой лекарственной гепатотоксичности. Toxicol Appl Pharmacol.2013; 268: 1–16.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 103.

    Мэн К. Трехмерное культивирование гепатоцитов для прогнозирования гепатотоксичности, вызванной лекарственными средствами. Мнение эксперта Drug Metab Toxicol. 2010; 6: 733–46.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 104.

    Кацуда Т., Кавамата М., Хагивара К., Такахаши РУ, Ямамото Ю., Камарго Ф.Д. и др.Превращение окончательно коммитированных гепатоцитов в культивируемые бипотентные клетки-предшественники с регенеративной способностью. Стволовая клетка. 2017; 20: 41–55.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 105.

    Huch M, Gehart H, van Boxtel R, Hamer K, Blokzijl F, Verstegen MM, et al. Долгосрочная культура геном-стабильных бипотентных стволовых клеток печени взрослого человека. Клетка. 2015; 160: 299–312.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 106.

    Voges HK, Mills RJ, Elliott DA, Parton RG, Porrello ER, Hudson JE. Разработка модели повреждения органоидов сердца человека раскрывает врожденный регенеративный потенциал. Разработка. 2017; 144: 1118–27.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 107.

    Takasato M, Er PX, Chiu HS, Maier B, Baillie GJ, Ferguson C, et al. Органоиды почек из iPS-клеток человека содержат множество клонов и моделируют нефрогенез человека.Природа. 2015; 526: 564–8.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 108.

    Сато Т., Клеверс Х. SnapShot: выращивание органоидов из стволовых клеток. Клетка. 2015; 161: 1700-.e1.

    Артикул CAS Google ученый

  • 109.

    Ризви Н.А., Хеллманн М.Д., Снайдер А., Квистборг П., Макаров В., Гавел Дж. Дж. И др. Иммунология рака. Мутационный ландшафт определяет чувствительность к блокаде PD-1 при немелкоклеточном раке легкого.Наука. 2015; 348: 124–8.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 110.

    Asaoka Y, Ijichi H, Koike K. Блокада PD-1 в опухолях с недостаточностью репарации несовпадений. N Engl J Med. 2015; 373: 1979.

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 111.

    Нодзаки К., Мотидзуки В., Мацумото Ю., Мацумото Т., Фукуда М., Мизутани Т. и др.Совместное культивирование с органоидами кишечного эпителия позволяет эффективно анализировать рост и подвижность интраэпителиальных лимфоцитов. J Gastroenterol. 2016; 51: 206–13.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 112.

    Финнберг Н.К., Гокаре П., Лев А., Гривенников С.И., АВт М.Ф., Кэмпбелл К.С. и др. Применение трехмерных опухолевых систем для определения иммунных и цитотоксических терапевтических ответов на основе молекулярных сигнатур опухолевых и тканевых срезов.Oncotarget. 2017; 8: 66747–57.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 113.

    Zumwalde NA, Haag JD, Sharma D, Mirrielees JA, Wilke LG, Gould MN, et al. Анализ иммунных клеток из органоидов эпителия протоков молочной железы человека выявил Vdelta2 + Т-клетки, которые эффективно воздействуют на клетки карциномы молочной железы в присутствии бисфосфоната. Рак Prev Res (Phila). 2016; 9: 305–16.

    CAS Статья Google ученый

  • 114.

    Tiriac H, Bucobo JC, Tzimas D, Grewel S, Lacomb JF, Rowehl LM, et al. Успешное создание органоидов рака поджелудочной железы с помощью тонкоигольной биопсии под контролем EUS для индивидуального лечения рака. Gastrointest Endosc. 2018; 87: 1474–80.

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 115.

    Органоиды могут указывать на лучшую терапию. Рак Discov. 2018; 8: 524.

  • 116.

    Усуи Т., Сакураи М., Умата К., Эльбадави М., Охама Т., Ямаваки Х. и др.Сигналы ежа опосредуют устойчивость к противораковым лекарствам в трехмерной культуре органоидов первичного колоректального рака. Int J Mol Sci. 2018; 19 (4). https://doi.org/10.3390/ijms198.

    PubMed Central Статья Google ученый

  • 117.

    Карнейро Б.А., Памарти С., Шах А.Н., Сагар В., Унно К., Хан Х и др. Мутация киназы анапластической лимфомы (ALK F1174C) при мелкоклеточной карциноме простаты и молекулярный ответ на алектиниб.Clin Cancer Res. 2018; 24: 2732–9.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 118.

    Брокгаарден М., Ризви И., Булин А.Л., Петрович Л., Гольдшмидт Р., Массоди И. и др. Неоадъювантная фотодинамическая терапия увеличивает немедленную и пролонгированную эффективность оксалиплатина при метастатических органоидах рака поджелудочной железы. Oncotarget. 2018; 9: 13009–22.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 119.

    Workman MJ, Mahe MM, Trisno S, Poling HM, Watson CL, Sundaram N, et al. Сконструированы кишечные ткани, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, с функциональной кишечной нервной системой. Nat Med. 2017; 23: 49–59.

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 120.

    Ohlund D, Handly-Santana A, Biffi G, Elyada E, Almeida AS, Ponz-Sarvise M, et al. Определенные популяции воспалительных фибробластов и миофибробластов при раке поджелудочной железы.J Exp Med. 2017; 214: 579–96.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • Двухмерные монослои кишечных органоидов, имитирующие физиологические и патофизиологические свойства кишечника свиньи

    Abstract

    Инфекционные заболевания желудочно-кишечного тракта остаются важной проблемой для здоровья человека и животных. Исследования желудочно-кишечных инфекционных заболеваний обычно проводятся на лабораторных животных, что приводит к тому, что видоспецифичные модели практически недоступны, особенно когда речь идет о сельскохозяйственных животных.Принципы 3R Рассела и Берча были достигнуты с использованием кишечных органоидов тощей кишки свиньи. Эти органоиды кажутся многообещающим инструментом для создания видоспецифичных моделей in vitro кишечного эпителия. 3D органоиды были выращены во внеклеточном матриксе и охарактеризованы с помощью КПЦР. Органоиды также высевали на проницаемые фильтрующие опоры для создания двумерных эпителиальных монослоев. Двухмерные монослои на основе органоидов были охарактеризованы морфологически и исследованы на предмет их способности изучать физиологические транспортные свойства и патофизиологические процессы.Они показали монослойную структуру, содержащую разные типы клеток. Более того, их функциональная активность была продемонстрирована увеличением трансэпителиального электрического сопротивления в течение 18 дней, а также активным транспортом глюкозы и секрецией хлоридов. Кроме того, двухмерные монослои на основе органоидов также столкнулись с токсином холеры, полученным из Vibrio cholerae , в качестве доказательства концепции. Инкубация с токсином холеры приводила к увеличению тока короткого замыкания, что указывало на усиленную секрецию хлорида эпителия, что является типичной характеристикой инфекций холеры.Взятые вместе, наша модель позволяет исследовать физиологические и патофизиологические механизмы с акцентом на тонкий кишечник свиней. Это соответствует принципу 3R и позволяет сократить количество классических экспериментов на животных.

    Образец цитирования: Hoffmann P, Schnepel N, Langeheine M, Künnemann K, Grassl GA, Brehm R, et al. (2021) Двухмерные монослои на основе органоидов кишечника имитируют физиологические и патофизиологические свойства кишечника свиньи. PLoS ONE 16 (8): e0256143.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256143

    Редактор: Джанфранко Д. Альпини, Техасский университет A&M, США

    Поступило: 31 марта 2021 г .; Принята к печати: 30 июля 2021 г .; Опубликовано: 23 августа 2021 г.

    Авторские права: © 2021 Hoffmann et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

    Финансирование: Этот проект финансировался Федеральной землей Нижняя Саксония в рамках совместного проекта R2N — «Заменить» и «Уменьшить» в Нижней Саксонии (Нижняя Саксония) — Альтернативные методы замены или сокращения животных моделей в биомедицинских исследованиях. Эта публикация была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft и Университетом ветеринарной медицины Ганновера, Фондом в рамках программы финансирования Open Access Publishing.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    До сих пор лабораторных животных часто используют для исследования физиологических и патофизиологических функций желудочно-кишечного тракта. Сюда входят исследования взаимодействия кишечного эпителия с патогенами и их энтеротоксинами. Подходом для исследования таких тем с использованием альтернативных моделей является использование систем на основе клеточных культур.Однако, когда такие эксперименты сосредоточены на домашнем скоте, таком как свиньи, которые не только используются для изучения специфических для свиней болезней, но и широко используются в качестве модели патофизиологии кишечника человека [обзор 1], альтернативные модели все еще ограничены. Линии клеток свиней, такие как клетки IPEC-J2 из тонкой кишки [2] и линия клеток PoCo83-3 [3] из толстой кишки, служат потенциальным подходом для исследования взаимодействий патоген-хозяин [4, 5]. Однако эти клеточные линии содержат только энтероциты и не имеют других типов клеток, таких как бокаловидные клетки.Техника органоидов была внедрена в 2009 г. [6]; этот метод позволяет отображать полный клеточный состав кишечного эпителия, обеспечивая лучшую модель для сравнения с ситуацией in vivo . С тех пор органоиды свиней молоди [7] и взрослых свиней [8] успешно культивировались. Кроме того, органоиды можно диссоциировать и выращивать в 2D-монослойной системе [9], и этот подход был предложен в качестве оптимального инструмента для открытия лекарств и разработки лекарств в обзоре Olayanju, Jones [10].Однако, несмотря на применение этого инструмента во многих областях, соответствующие физиологические транспортные характеристики, а также патофизиологические реакции на энтеротоксины в этой системе не охарактеризованы. Таким образом, первоначальной целью нашего исследования было создание системы на основе кишечных органоидов свиней для исследования физиологических транспортных свойств кишечного эпителия с использованием метода камеры Уссинга. Это можно сравнить с использованием классических тканей животного происхождения и в конечном итоге заменить их.После описания этой модели нашей второй целью было доказать ее пригодность для изучения патофизиологических механизмов: таким образом, мы применили холерный токсин (CTX) в этой системе и исследовали его патофизиологические эффекты.

    Материалы и методы

    Образование органоидов кишечника

    Органоиды кишечника были получены из кишечных крипт [11]. Одна здоровая свинья (61,5 кг) была умерщвлена ​​выстрелом болта и кровотечением. Согласно Закону о защите животных, это (убой и удаление тканей) не классифицируется как эксперимент на животных, но о нем необходимо сообщить в университетскую службу защиты животных (регистрационный номер.TiHo-T-2017-22). Кишечные крипты получали путем рассечения части тощей кишки свиньи длиной 10 см, которую промывали ледяным PBS, открывали продольно ножницами, разрезали на кусочки 2–4 см и трижды промывали ледяным PBS в конической пробирке. Супернатант удаляли после каждой стадии промывки. Кусочки кишечника далее обрабатывали на кусочки размером менее 0,5 см, переносили в пробирку, предварительно заполненную 10 мл ледяного хелатирующего буфера крипт (0,01 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в PBS, pH 8 [Sigma-Aldrich, Schnelldorf , Германия]) и помещали на лед на орбитальном шейкере на щадящих режимах на 90 мин.После этого кишечным фрагментам давали осесть на дно пробирки, а супернатант отбрасывали. Добавляли пять мл ледяного PBS и пипетировали 20 раз вверх и вниз стеклянной пипеткой. Фрагментам давали осесть на дно пробирки, а супернатант переносили в свежую пробирку. Этот процесс повторяли два раза, и супернатант центрифугировали 5 мин, 200 x g, и 4 ° C. Осадок ресуспендировали в ледяном PBS и подсчитывали крипты. Раствор снова центрифугировали, как описано выше, и 25 мкл культуральной среды (таблица S1) на 1000 крипт использовали для разделения осадка.Кроме того, добавляли 25 мкл матригеля (FALC354234, Omnilab, Бремен, Германия) на 1000 крипт. Суспензию крипт в объеме 50 мкл каждой наносили на предварительно нагретый 24-луночный планшет и культивировали, как описано ниже.

    Выращивание 3D органоидов

    3D органоидов культивировали при 37 ° C и 5% CO. 2 , при этом культуральную среду меняли каждые два-три дня. Для еженедельного субкультивирования органоидов культуральную среду удаляли и в каждую лунку добавляли 1 мл ледяного PBS.Матригель разрушали путем пипетирования PBS 20 раз с наконечником на 1000 мкл и еще 15 раз с наконечником на 200 мкл, установленным на наконечнике на 1000 мкл. Органоиды аспирировали и переносили в предварительно охлажденную пробирку. На этом этапе были объединены четыре лунки трехмерных органоидов. Органоиды центрифугировали при 200 × g , 5 мин при 4 ° C. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 50 мкл культуральной среды и смешивали с 200 мкл матригеля. 50 мкл этой комбинации переносили в свежую лунку предварительно нагретого (37 ° C) 24-луночного планшета.Матригелю давали возможность затвердеть в инкубаторе при 37 ° C в течение 45 минут и покрывали 500 мкл культуральной среды на лунку.

    Выделение РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени

    При каждом еженедельном субкультивировании органоиды собирали в пробирку, предварительно заполненную 10 мл ледяного PBS, и центрифугировали в течение 10 минут при 4 ° C и 200 x г . Супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 1 мл PBS и переносили в новую пробирку. После центрифугирования при 16100 x g при 4 ° C в течение 10 минут супернатант удаляли и органоиды хранили при -80 ° C до дальнейшей обработки.Экстракцию РНК, обратную транскрипцию и КПЦР проводили, как описано ранее [12]. Праймеры генов, представляющих физиологический интерес для данной работы, перечислены в таблице S2.

    Двухмерная монослойная культура на основе органоидов

    Создание двухмерной монослойной культуры на основе органоидов осуществляли путем удаления супернатанта из лунок, содержащих трехмерные органоиды, и последующего добавления 1 мл ледяного PBS. Матригель препарировали пипеткой и органоиды собирали в пробирку, предварительно заполненную 10 мл ледяного PBS.После центрифугирования при 4 ° C и 600 × г в течение 10 мин супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 0,05% трипсине / ЭДТА и инкубировали в течение 5 минут при 37 ° C перед ресуспендированием раствора 20 раз с наконечником на 1000 мкл и еще 15 раз с наконечником на 200 мкл, установленным на наконечнике на 1000 мкл. Добавляли 10% (об. / Об.) Охлажденную льдом фетальную бычью сыворотку в DMEM и центрифугировали пробирку при 3000 x g , 4 ° C в течение 10 мин. Супернатант удаляли и осадок ресуспендировали в однослойной среде (таблица S3).Подсчитывали клетки и высевали 2 * 10 5 клеток на предварительно покрытые (Matrigel 1:40 в PBS) Snapwells ® (Corning, Kaiserslautern, Германия; диаметр: 12 мм; размер пор: 0,4 мкм). Базолатеральную камеру заполняли 3 мл монослойной среды, апикальную камеру — 0,5 мл монослойной среды соответственно. После 16 дней культивирования среду меняли на среду для дифференцировки еще на 2 дня (таблица S4) до проведения экспериментов после общего времени инкубации 18 дней.

    Измерение трансэпителиального электрического сопротивления

    Для определения целостности клеточного монослоя трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) измеряли с помощью эпителиального вольт-омметра (EVOM 2 ; WPI, Берлин, Германия).Измерения выполняли одновременно с каждой заменой культуральной среды органоидов, культивируемых на Snapwells ® , путем измерения TEER лунок с органоидами, скорректированного на соответствующее значение лунок, не содержащих органоидов (бланк), согласно данным производителя.

    Эксперименты в камере Уссинга — физиология транспорта

    Органоиды, культивированные на Snapwells ® , были помещены в клетки Уссинга [13], имитирующие слизистую и серозную сторону кишечника.Камеры Уссинга были подключены к зажиму напряжения с компьютерным управлением (K. Mussler, Аахен, Германия). Каждое отделение заполняли 5 мл соответствующих буферов (таблица S5), которые нагревали до 37 ° C и аэрировали карбогеном. После фазы уравновешивания в течение 5 минут ткани приводили в состояние короткого замыкания при 0 мВ, чтобы препятствовать электрогенному переносу.

    Камера Уссинга — клеточная характеристика.

    Через пятнадцать минут после установки условий короткого замыкания на 0 мВ двумерные монослои на основе органоидов инкубировали с глюкозой (10 мМ, слизистая, разведенная в aqua destillata ) и маннитом (10 мМ, серозная зона для уравновешивания осмоляльности, разбавленная в aqua destillata ) в течение 20 минут с последующей 15-минутной инкубацией с форсколином (10 мкМ, серозный, Sigma-Aldrich, разведенный в диметилсульфоксиде) и карбахолом (10 мкМ, серозный раствор, Sigma-Aldrich, разведенный в aqua destillata. ) еще на 10 мин.Индометацин (10 мкМ, разведенный в aqua destillata ) был добавлен, чтобы препятствовать синтезу простагландинов и избежать спонтанной секреции хлорида (Cl ) [14]. В ходе эксперимента измерялись как токи короткого замыкания (I sc ), так и сопротивления (R t ). В каждом эксперименте выполнялись три камеры в качестве технической повторности.

    Камера Уссинга — инкубация с токсинами, полученными из бактерий.

    Через пятнадцать минут после того, как ткани были установлены в условия короткого замыкания, 2D-монослои на основе органоидов инкубировали в течение 80 минут с 7.5 мкг / мл CTX (CAS 9012-63-9; Enzo Life Sciences, Lörrach, Германия, разбавленный в aqua destillata ). За этим следовало добавление 10 мкМ форсколина в серозную камеру на 15 мин и заключительная 10 мин инкубация со 100 мкМ уабаином (Sigma-Aldrich) на серозной стороне. I sc и R t измерялись непрерывно. Технические реплики были получены, как указано выше.

    Гистологический анализ

    Анализ образования слизистой оболочки.

    Формирование слизистого слоя анализировали путем окрашивания муцина периодическим кислотным реагентом Шиффа (PAS).Органоиды культивировали на Snapwells ® , как описано выше, перед тем, как мембраны Snapwell ® были вырезаны, зафиксированы в растворе Буэна в течение 10 минут и затем трижды промыты PBS. После фиксации мембраны разрезали на две части и заливали 5% (мас. / Об.) Агарозой с последующим заливанием в парафин. Для морфологической оценки делали срезы 3 мкм и проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H & E). Чтобы подтвердить существование бокаловидных клеток, депарафинизированные слайды окрашивали PAS, обезвоживали и наносили Eukitt ® (О.Kindler GmbH, Фрайбург, Германия), все в соответствии со стандартными протоколами [15].

    Иммуногистохимическое окрашивание.

    Иммуногистохимическое окрашивание белка zonula occludens-1 (ZO-1) и регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR) получали путем фиксации, заделки и разделения органоидов на мембранах Snapwell ® , как описано выше. После депарафинизации и ингибирования активности эндогенной пероксидазы с помощью 3% H 2 O 2 в 80% этаноле в течение 30 минут срезы ZO-1, Claudin-2 и Claudin-3 предварительно обрабатывали в микроволновой печи цитратным буфером ( pH 6.0) в течение 3 х 5 мин при 800 Вт и дать остыть до комнатной температуры в течение 30 мин. Срезы CFTR нагревали до 96–99 ° C в трис-EDTA-цитратном буфере (pH 7,8) в течение 20 мин, давали остыть до 60 ° C и промывали 5 мин в TBST [15]. После этого предметные стекла для обоих окрашиваний блокировали 3% BSA в течение 20 минут, прежде чем их инкубировали с первичным антителом (ZO-1: Santa Cruz Biotechnology, Даллас, США; каталожный номер: sc-10804, коэффициент разведения: 1: 80; Claudin-2: Biologo, Кроншаген, Германия; каталожный номер.: CLA002, фактор разведения 1:50; Claudin-3, Invitrogen, Waltham, США: каталожный номер; 34–1700, коэффициент разбавления 1: 1000; CFTR: Cell Signaling Technology, Данверс, США; номер по каталогу: 78335, коэффициент разбавления: 1: 100) в течение ночи при 4 ° C. Затем срезы подвергали воздействию вторичного антитела (меченное биотином козье антикроличье; Vector, Burlingame, USA; номер по каталогу: BA-1000; коэффициент разведения: 1: 200) в течение 60 мин при комнатной температуре и после промывания. , 30 мин с помощью системы ABC (Vector; каталожный номер: PK-6100) согласно протоколу производителя.После визуализации с помощью 3,3′-диаминобензидина (DAB) срезы на короткое время контрастировали гематоксилином в течение 10 секунд и промывали проточной водой. Наконец, предметные стекла были обезвожены и закреплены с помощью Eukitt®. Отрицательные и изотипические контроли были включены в анализ, и изображения были получены с использованием Zeiss Axioskop (Zeiss, Jena, Germany) с камерой Olympus SC50, управляемой программным обеспечением Olympus CellSens (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Германия).

    Иммунофлуоресцентное окрашивание.

    Иммунофлуоресценцию проводили путем культивирования двухмерных монослоев на основе органоидов на Snapwells®, как описано выше. Фиксацию, заделку и разделение органоидов на мембранах Snapwell ® выполняли, как описано выше. После депарафинизации монослои, используемые для окрашивания виллина, нагревали до 96–99 ° C в трис-ЭДТА-цитратном буфере (pH 7,8) в течение 20 минут, давали остыть до 60 ° C и промывали 5 минут в TBST [15]. . Все срезы подвергали проницаемости в течение 60 минут с использованием 0,25% Triton X-100 / PBS и блокировали 5% козьей сывороткой в ​​PBST в течение одного часа.Первичный анти-е-кадгерин (Abcam, Кембридж, Великобритания; каталожный номер: ab76055, фактор разведения 1: 500), антивилин (Abcam; каталожный номер: ab130751, фактор разведения 1: 250) и антихромогранин А ( Immunostar, Hudson, USA; номер по каталогу: 20085, коэффициент разведения: 1: 1000) инкубировали со слайдами при 4 ° C в течение ночи. После трехкратной промывки PBS инкубация с антителом, меченным вторичной флуоресценцией (ослиные антимышиные антитела для е-кадгерина (Invitrogen; каталожный номер: A10036; коэффициент разведения: 1: 1000) и козьи анти-кроличьи антитела (Sigma-Aldrich; каталог нет.: SAB4600084; фактор разведения: 1: 1000) для виллина и хромогранина A) проводили в течение 60 мин при комнатной температуре. Контрастное окрашивание ядер проводили с помощью окрашивания DAPI, а покровные стекла заключали с помощью Pro Long Gold (Invitrogen, США). Анализ выполняли с использованием микроскопа Zeiss Axiovert 200M, присоединенного к системе визуализации Zeiss AxioVision. Числовые апертуры использованных линз объектива составляли: 40 x масло / числовая апертура 1,3.

    Анализ данных и статистика

    Базальные значения I sc и R t были определены путем вычисления среднего арифметического последних 10 точек данных перед добавлением агента.Изменения токов короткого замыкания (ΔI sc ) рассчитывали путем вычитания среднего арифметического из максимального значения после добавления каждого агента. Нормальное распределение остатков проверялось с помощью теста Д’Агостино и Пирсона. Парный тест t использовался для сравнения наборов данных. Все статистические анализы были выполнены с использованием Prism версии 8.0.1 (GraphPad, Сан-Диего, США), и значения p ≤ 0,05 считались статистически значимыми.

    Результаты

    3D-органоиды, полученные из крипт кишечника

    Изолированные кишечные крипты тощей кишки свиньи, внедренные в Matrigel ® , образовывали трехмерные органоидные структуры в течение семидневного периода культивирования (рис. 1).

    Экспрессия генов 3D органоидов свиней

    Экспрессия генов котранспортера 1 натрия / глюкозы ( SGLT1 ), регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе ( CFTR ) и муцина 2 ( MUC2 ) определялась в трехмерных органоидах и сравнивалась с экспрессией генов в нативной тощей кишке свиньи. В то время как экспрессия SGLT1 , а также MUC2 не показала различий между органоидами и нативным эпителием, экспрессия CFTR была значительно выше в органоидах (рис. 2).

    Рис. 2. Экспрессия генов котранспортера натрия / глюкозы 1 ( SGLT1 ), регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе ( CFTR ) и муцина 2 ( MUC2 ) в органоидах кишечника тощей кишки свиньи, культивируемых в течение семи дней по сравнению с родная ткань.

    Контрольные гены рибосомного белка S23 и рибосомного белка P0 использовали для нормализации экспрессии. Показанные значения представляют собой среднее геометрическое ± стандартное геометрическое отклонение (SD) четырех независимых экспериментов.* р <0,05.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256143.g002

    Клеточный монослой и продукция муцина

    Целостность клеточного слоя определяли каждый день после смены среды путем измерения TEER. Через 18 дней культивирования было достигнуто электрическое сопротивление 151,4 ± 38,8 Ом * см 2 (рис. 3). Органоиды, выращенные двумерным способом на мембранах Snapwell ® , окрашивали H и E, а также гематоксилином и PAS для определения клеточного расположения и образования слизи.Могут быть обнаружены клеточные монослои, в том числе некоторые клетки с бокаловидным, чашеобразным видом (зеленые треугольники, рис. 4). Окрашивание гематоксилином и PAS показало сильный сигнал для некоторых клеток (фиолетовые треугольники, рис. 4). Окрашивание Zonula occludens-1 показало положительный сигнал на апикальной стороне клеточного слоя (черные треугольники, рис. 4), тогда как изотипический контроль был отрицательным. Иммуногистохимическое окрашивание клаудина-2 (синие треугольники, фиг. 5) и клаудина-3 (оранжевые треугольники, фиг. 5) показало положительный сигнал на апикальной стороне клеточного слоя, тогда как изотипический контроль был отрицательным.Иммуногистологическое окрашивание CFTR показало сильный сигнал на апикальной мембране некоторых клеток (красные треугольники, рис. 6). Иммунофлуоресцентное окрашивание показало положительный сигнал для е-кадгерина между отдельными клетками, сигналы ворсин были обнаружены на апикальной мембране клеток, в то время как хромогранин А был в большом количестве только в нескольких клетках (рис. 7).

    Рис. 3. Изменения значений трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) в течение 18-дневного периода культивирования на Snapwells ® двумерных монослоев на основе органоидов в зависимости от времени.

    Показанные значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов (пассажей).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256143.g003

    Рис. 4. Расположение клеток (поперечные сечения) органоидов тощей кишки, выращенных в 2D на Snapwells ® в течение 18 дней.

    Клетки окрашивали либо гематоксилином и эозином (H & E), либо гематоксилином и PAS (H & PAS), а также иммуногистохимическим окрашиванием (включая контрольные изотипы) ZO-1 (поперечное сечение).Зеленые треугольники указывают на клетки с чашеобразным видом, фиолетовые треугольники указывают на PAS-положительные клетки, а черные треугольники показывают положительный сигнал ZO-1. Показаны репрезентативные цифры, выбранные из трех независимых экспериментов с тремя техническими повторами на окрашивание.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256143.g004

    Рис. 5. Расположение клеток (поперечные сечения) органоидов тощей кишки, выращенных в 2D на Snapwells ® в течение 18 дней.

    Было проведено иммуногистохимическое окрашивание (включая изотипические контроли) клаудина-2 и клаудина-3.Синие треугольники обозначают клетки с положительным сигналом Клаудина-2, оранжевые треугольники обозначают клетки с положительным сигналом Клаудина-3. Показаны репрезентативные цифры, выбранные из трех независимых экспериментов с тремя техническими повторами на окрашивание.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256143.g005

    Рис. 6. Расположение клеток (поперечные сечения) органоидов тощей кишки, выращенных в 2D на Snapwells ® в течение 18 дней.

    Было выполнено иммуногистохимическое окрашивание (включая изотипический контроль) CFTR.Красные треугольники обозначают клетки с положительным сигналом CFTR. Показаны репрезентативные цифры, выбранные из трех независимых экспериментов с тремя техническими повторами на окрашивание.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256143.g006

    Рис. 7. Иммунофлуоресцентное окрашивание (поперечные сечения) органоидов тощей кишки, выращенных в 2D на Snapwells ® в течение 18 дней.

    E-кадгерин, виллин и хромогранин A отображаются красным цветом, ядра контрастируют с синим цветом.Показаны репрезентативные цифры, выбранные из трех независимых экспериментов с тремя техническими повторами для каждого клеточного подхода.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256143.g007

    Исследования камеры Юссинга — транспортные характеристики

    Физиологические транспортные характеристики исследовали с использованием системы камер Уссинга. Добавление 10 мМ глюкозы в слизистую привело к значительному увеличению I sc . Затем следовала серозная инкубация с 10 мкМ форсколина, приводящая к увеличению I sc , а также уменьшению R t .Окончательное серозное добавление 10 мкМ карбахола значительно увеличивало I sc (фиг. 8).

    Рис. 8. Базальные и максимальные значения I sc и R t 2D-монослоев на основе органоидов, культивируемых в течение 18 дней, определенные до и после последующего добавления глюкозы, карбахола и форсколина.

    Показанные значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов. ** р <0,01.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256143.g008

    Исследования камеры Уссинга — эффекты CTX

    Инкубация двухмерных монослоев на основе органоидов с 7.5 мкг / мл CTX со стороны слизистой оболочки приводит к значительному увеличению I sc , тогда как R t снижается. После серозной инкубации с 10 мкМ форсколина также наблюдалось значительное увеличение I sc , тогда как R t значительно снизилось. Окончательное серозное добавление 100 мкМ уабаина в серозную камеру значительно снизилось в I sc (фиг.9).

    Рис. 9. Базальные и максимальные значения I sc и R t 2D-монослоев на основе органоидов, культивируемых в течение 18 дней, определенные до и после последующего добавления CTX, форсколина и уабаина.

    Показанные значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение четырех независимых экспериментов. * р <0,05; ** р <0,01.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0256143.g009

    Обсуждение

    Органоиды характеризуются повышенным электрическим сопротивлением, а также экспрессией бокаловидных клеток, энтероцитов и белков, связанных с плотными контактами

    Изолированные крипты тощей кишки свиньи генерировали 3D-органоиды после времени культивирования 7 дней. Это опосредуется мультипотентными или так называемыми взрослыми стволовыми клетками, присутствующими в криптах кишечника, дифференцирующимися в эпителиальные клетки кишечника [16–18].Эти органоиды в дальнейшем были использованы для создания 2D монослоев. Эти органоиды, посеянные в 2D-режиме на Snapwells ® , показали увеличение значений TEER примерно до 150 Ом * см 2 после 18 дней культивирования по сравнению с нативным эпителием свиньи с примерно 120 Ом * см 2 [19]. Данные, полученные в этом исследовании, контрастируют с данными van der Hee, Madsen [20], которые показали увеличение до 750–850 Ом * см 2 . Это несоответствие может быть связано с немного разными условиями культивирования, такими как различный состав среды.Гистологический анализ наших органоидов выявил интактный монослой, включающий экспрессию белка ZO-1, связанного с плотными контактами, который очень сопоставим с монослоями на основе Caco-2 / HT29-MTX [21, 22] [Hoffmann et al. 2021 г., редакция: PLOS ONE]. Кроме того, было показано, что белок адгезивного соединения е-кадгерин, а также белки плотного соединения Claudin-2 и Claudin-3 экспрессируются в монослоях на основе органоидов. Исследования на поросятах показали изменения в развитии межклеточных соединений, такие как увеличение экспрессии белков клаудина-1, клаудина-3, окклюдина и ZO-1 в период кормления грудью [23].Это увеличение экспрессии белков плотных контактов также можно предположить в процессе культивирования органоидов, но его необходимо продемонстрировать в дальнейших экспериментах. В дополнение к экспрессии ZO-1 гистохимическое окрашивание 2D-монослоев на основе органоидов показало обилие клеток, заполненных слизью, по всему монослою, что может дополнительно подтверждаться экспрессией гена MUC2 в 3D-органоидах, поэтому эти клетки могут идентифицироваться как бокаловидные клетки. Количество бокаловидных клеток, обнаруживаемых иммуногистохимическим методом в монослое, по-видимому, немного выше по сравнению с нативной тощей кишкой свиньи, которая показывает только умеренное количество бокаловидных клеток [24].Это открытие можно объяснить составом среды дифференцировки, содержащей ингибитор гамма-секретазы DAPT, что приводит к увеличению образования бокаловидных клеток [25]. Экспрессия ворсин показывает зрелые энтероциты, что указывает на формирование типичной кишечной щеточной пограничной мембраны [9, 26]. Хромогранин А позволил идентифицировать отдельные энтероэндокринные клетки в нашей 2D-модели на основе органоидов [9, 26]. Клеточный состав трехмерных органоидов свиней был показан в предыдущих исследованиях, что также указывает на присутствие абсорбирующих энтероцитов, бокаловидных клеток и энтероэндокринных клеток [26, 27], но, насколько нам известно, не в 2D-модели в этих условиях культивирования.Обилие энтероцитов, бокаловидных клеток и энтероэндокринных клеток обеспечивает секреторный, функционально активный эпителий, включая богатую муцином среду, которая служит барьером против инфекций и позволяет этим органоидам служить оптимальной системой для решения основного вопроса.

    Развитие неповрежденного клеточного слоя во время культивирования, а также клеточная композиция, включающая абсорбирующие энтероциты и бокаловидные клетки, позволяет сравнить нашу модель с нативным эпителием.

    Сотовая характеристика показывает функциональные транспортные характеристики

    Кишечный транспорт глюкозы в основном опосредуется котранспортером натрия / глюкозы 1 (SGLT1) [28], что приводит к увеличению I sc в ответ на добавление глюкозы в слизистые оболочки, как показано в органоидах свиней, посеянных на вкладышах Snapwell ® как а также в тощей кишке местной свиньи в более ранних исследованиях [29]. Изобилие SGLT1 и других транспортных белков было показано в более ранних исследованиях органоидов мышей [30, 31] и также может быть подтверждено в нашем исследовании на основе экспрессии гена SGLT1 .Однако экспрессия генов в органоидах была ниже по сравнению с нативным эпителием, что могло бы объяснить умеренное увеличение I sc в ответ на добавление глюкозы в слизистые оболочки. Одной из причин может быть относительно высокое количество бокаловидных клеток в этой модели и результирующее низкое количество энтероцитов, которые экспрессируют только SGLT1 , как уже было показано на крысах [32].

    Секреция Cl регулятором трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR) может быть стимулирована добавлением форсколина, что приводит к активации аденилатциклазы и повышению внутриклеточных уровней циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) [33].Эта секреция Cl приводит к увеличению I sc в экспериментах с камерой Уссинга, проведенных в этом исследовании. Такой же механизм показан в нативном эпителии кишечника свиней [29, 34, 35]. Экспрессия CFTR была дополнительно подтверждена анализом кПЦР, показав значительно более высокую экспрессию в 3D органоидах по сравнению с нативной тканью. Это дополнительно подтверждает высокое увеличение I sc с использованием двумерного монослоя на основе органоидов. Однако гистологический анализ показал экспрессию CFTR в нескольких клетках, что указывает на высокую транспортную способность.Помимо секреции Cl , CFTR играет важную роль в отношении роста бактерий в кишечнике [36–38], а также в составе слизи, покрывающей эпителий [39]. Снижение резистентности ткани из-за добавления форсколина опосредуется активацией протеинкиназы А из-за более высоких уровней цАМФ, что приводит к модификации барьера плотного соединения, как было показано в нескольких других исследованиях [40–42].

    Дальнейшая Ca 2+ -зависимая секреция Cl [43], приводящая к увеличению I sc , может быть продемонстрирована в нашей системе путем добавления карбахола и потенциальной активации кальциевых кальциевых каналов [44], которые имеют уже было показано для нативного эпителия свиней [45, 46].

    Физиологические транспортные свойства, вызванные различными агентами, исследованными в этом исследовании, в значительной степени сопоставимы с реакцией нативной ткани, полученной в более ранних исследованиях. Это ясно демонстрирует пригодность данной модели в качестве альтернативы для исследований на животных, таких как эксперименты в камере Уссинга, для которых требуется свежеприготовленный материал от забитых животных. Напротив, наша система на основе органоидов позволяет непрерывное культивирование эпителия без потребности в новом природном материале, как это было рассмотрено Сигером [47].

    Инкубация с CTX приводит к патофизиологическим ответам

    В наших экспериментах инкубация с CTX приводила к увеличению I sc . Вероятно, это было результатом активации аденилатциклазы, что привело к повышению клеточных уровней цАМФ, что привело к увеличению секреции Cl и снижению всасывания натрия [48, 49]. Более подробно, секреция Cl опосредуется либо фосфорилированием CFTR [50], либо привлечением CFTR к апикальной мембране клеток [51].Кроме того, в нашей установке инкубация с CTX привела к снижению R t . Это снижение можно объяснить нарушением эпителиального барьера и нарушением клеточных контактов [52]. Тем не менее, инфекции, вызванные Vibrio cholerae , не вызывают клинически значимых инфекций у свиней. Это, вероятно, зависит от компонентов, которые находятся исключительно в кишечнике и особенно в слизи свиней, которые позволяют связывать токсин и, следовательно, препятствуют его действию [53].Более того, эти компоненты, химически идентифицируемые как нейтральный гликосфинголипид, по-видимому, зависят от группы крови ABO инфицированного организма [54]. С 1977 г. [55] была признана связь между группой крови и тяжестью холерной инфекции. Недавние исследования выявили прямую молекулярную связь между группой крови и CTX-инфекцией [56], но детальный клеточный механизм все еще остается неясным. Несмотря на клиническую неприменимость для свиней, CTX использовался в этом исследовании как доказательство концепции, позволяющее провести сравнение с более ранними исследованиями и моделями [Hoffmann et al.2021 г., редакция: PLOS ONE].

    После лечения CTX форсколин все еще мог вызывать повышение I sc . Это не было показано в более раннем исследовании с использованием Caco-2 / HT29-MTX [Hoffmann et al. 2021, пересматривается по адресу: PLOS ONE], и можно предположить, что этому препятствует полная активация CFTR. Однако количественная ПЦР показывает высокую распространенность переносчика, а сам токсин, как обсуждалось ранее, считается менее вредным при использовании свиного материала.

    Хотя эту часть исследования можно рассматривать как доказательство концепции, имитирующую патофизиологические реакции in vivo , это повышает пригодность нашей модели для дальнейших патофизиологических актуальных вопросов, таких как исследование эффектов других бактериальных токсинов или живых патогенов.

    Заключение

    С помощью настоящего исследования мы смогли создать основанную на органоидах свинью модель тонкого кишечника, полученную из взрослых стволовых клеток из кишечных крипт, образующих исследуемые органоиды. Это исследование дополнительно доказывает возможность использования этой модели для изучения физиологических (например, транспорта глюкозы или секреции Cl ) и патофизиологических реакций на CTX в качестве доказательства концепции. Экспрессия белков, ассоциированных с плотными контактами, а также транспортные характеристики сопоставимы с данными, полученными для нативного эпителия свиней.Это подчеркивает пригодность нашей модели на основе органоидов для замены природного эпителия. В совокупности настоящее исследование предлагает модель с большим потенциалом в качестве альтернативы классически используемым образцам кишечной ткани, полученным непосредственно от свиней, что предполагает возможность сокращения количества экспериментов на животных.

    Благодарности

    Авторы благодарят Александра Крыбуса за отличную техническую помощь в получении данных по экспрессии генов.

    Список литературы

    1. 1.Зиглер А., Гонсалес Л., Бликслагер А. Модели крупных животных: ключ к трансляционным открытиям в исследованиях болезней органов пищеварения. Клеточная и молекулярная гастроэнтерология и гепатология. 2016; 2 (6): 716–24. pmid: 280
    2. 2. Бершнайдер Х. Развитие нормальных культивируемых линий эпителиальных клеток тонкого кишечника, которые транспортируют Na и Cl. Гастроэнтерология. 1989; 96 (Дополнение, часть 2): A41.
    3. 3. Кайзер Б., Боттнер М., Ведель Т., Бруннер Р.М., Голдаммер Т., Леско С. и др.Создание и характеристика линии эпителиальных клеток толстой кишки свиньи, трансдуцированной большим Т-антигеном SV40. Клетки Тканевые Органы. 2017; 203 (5): 267–86. pmid: 28052271
    4. 4. Арсе С., Рамирес-Бу М., Лусена С., Гарридо Дж. Врожденная иммунная активация линий эпителиальных клеток кишечника свиней (IPEC-J2 и IPI-2I) в ответ на ЛПС из Salmonella typhimurium. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2010. 33 (2): 161–74. pmid: 18799216
    5. 5. Ко С.Ю., Джордж С., Брёзель В., Моксли Р., Фрэнсис Д., Кошик Р.С.Линии кишечных эпителиальных клеток свиней как новая модель in vitro для изучения адгезии и патогенеза энтеротоксигенной Escherichia coli. Vet Microbiol. 2008. 130 (1–2): 191–7. pmid: 18261863
    6. 6. Сато Т., Фриз Р.Г., Снапперт Х.Дж., ван де Ветеринг М., Баркер Н., Штанге Д.Э. и др. Единичные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинки in vitro без мезенхимальной ниши. Природа. 2009. 459 (7244): 262–5. pmid: 19329995
    7. 7. Гонсалес Л. М., Уильямсон И., Пьедрахита Дж. А., Бликслагер А. Т., Магнесс ST.Идентификация клеточных линий и культура стволовых клеток на модели свиней для изучения регенерации кишечного эпителия. PLOS ONE. 2013; 8 (6): e66465. pmid: 23840480
    8. 8. Khalil HA, Lei NY, Brinkley G, Scott A, Wang J, Kar UK и др. Новая система культивирования кишечных крипт взрослых свиней. Клеточные и тканевые исследования. 2016; 365 (1): 123–34. pmid: 26928041
    9. 9. ван дер Хи Б., Лунен Л. М., Таверн Н., Таверн-Тиле Дж. Дж., Смидт Г., Уэллс Дж. М.. Оптимизированные процедуры для создания улучшенной, почти физиологической 2D системы культивирования из органоидов кишечника свиней.Stem Cell Res. 2018; 28: 165–71. pmid: 29499500
    10. 10. Olayanju A, Jones L, Greco K, Goldring CE, Ansari T. Применение органоидов желудочно-кишечного тракта свиней в качестве потенциального инструмента in vitro для открытия и разработки лекарств. J Appl Toxicol. 2019; 39 (1): 4–15. pmid: 29893059
    11. 11. Миёси Х., Стаппенбек Т.С. Экспансия in vitro и генетическая модификация стволовых клеток желудочно-кишечного тракта в культуре сфероидов. Nat Protoc. 2013. 8 (12): 2471–82. pmid: 24232249
    12. 12.Шенке М., Шейде Б.М., Пушель Г.П., Сигер Б. Анализ моторных нейронов, дифференцированных от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для использования в клеточных анализах активности нейротоксина ботулина. Токсины (Базель). 2020; 12 (5). pmid: 32344847
    13. 13. Schaar S, Schubert R, Hänel I, Leiterer M, Jahreis G. Клетки Caco ‐ 2 на мембранах Snapwell® и система камеры Уссинга как модель для транспорта кадмия in vitro. Приборостроение и технологии. 2004. 32 (6): 627–39.
    14. 14. Феррейра С.Х., Монкада С., Вейн-младший. Индометацин и аспирин отменяют высвобождение простагландина из селезенки. Nat New Biol. 1971. 231 (25): 237–9. pmid: 5284362
    15. 15. Böck P. Romeis Mikroskopische Technik. Вена: Урбан и Шварценберг; 1989.
    16. 16. Суванди А., Галеев А., Ридель Р., Шарма С., Сигер К., Стерценбах Т. и др. Взаимодействие Std фимбрий с фукозой усиливает воспаление кишечника, вызванное сальмонеллой, и продлевает колонизацию.PLOS Патогены. 2019; 15 (7): e1007915. pmid: 31329635
    17. 17. Дрост Дж., Клеверс Х. Трансляционные приложения органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток. Разработка. 2017; 144 (6): 968–75. pmid: 28292843
    18. 18. Ким Дж, Ку Би К, Кноблич Дж. Органоиды человека: модельные системы для биологии и медицины человека. Обзоры природы Молекулярная клеточная биология. 2020; 21 (10): 571–84. pmid: 32636524
    19. 19. Леген I, Салобир М., Керк Дж. Сравнение различных кишечных эпителий как моделей для исследований усиления абсорбции.Int J Pharm. 2005. 291 (1–2): 183–8. pmid: 15707745
    20. 20. ван дер Хи Б., Мэдсен О., Вервурт Дж., Смидт Х., Уэллс Дж. М.. Конгруэнтность программ транскрипции органоидов тощей кишки, полученных из взрослых стволовых клеток, и исходной ткани во время длительного культивирования. Front Cell Dev Biol. 2020; 8: 375. pmid: 32714922
    21. 21. Бедно А., Темпеста С., Фимбел С., Пеллекер Ю., Джаннин В., Демарн Ф. и др. Настраиваемая модель совместного культивирования Caco-2 / HT29-MTX, имитирующая переменную проницаемость кишечника человека, полученную с помощью оригинальной процедуры посева.Eur J Pharm Biopharm. 2014. 87 (2): 290–8. pmid: 24704198
    22. 22. Араухо Ф., Сарменто Б. К характеристике модели клеток кишечника с тройной совместной культурой in vitro для исследований проницаемости. Int J Pharm. 2013. 458 (1): 128–34. pmid: 24120728
    23. 23. Ван Дж, Цзэн Л., Тан Б., Ли Дж, Хуанг Б., Сюн Х и др. Изменения в развитии межклеточных соединений и Kv-каналов в кишечнике поросят в период сосания и после отъема. J Anim Sci Biotechnol.2016; 7 (1): 4. pmid: 26819706
    24. 24. Юнг К., Саиф Л.Дж. Вирусная инфекция эпидемической диареи свиней: этиология, эпидемиология, патогенез и иммунопрофилактика. Вет Дж. 2015; 204 (2): 134–43. pmid: 25841898
    25. 25. van Es JH, van Gijn ME, Riccio O, van den Born M, Vooijs M, Begthel H, et al. Ингибирование Notch / гамма-секретазы превращает пролиферативные клетки в кишечных криптах и ​​аденомах в бокаловидные клетки. Природа. 2005. 435 (7044): 959–63. pmid: 15959515
    26. 26.Бомон М., Блан Ф, Шербуи С., Эджиди Дж., Джуффра Е., Лакруа-Ламанд С. и др. Органоиды кишечника сельскохозяйственных животных. Ветеринарные исследования. 2021; 52 (1): 33. pmid: 33632315
    27. 27. Деррикотт Х., Луу Л., Фонг В.Й., Хартли С.С., Джонстон Л.Дж., Армстронг С.Д. и др. Разработка трехмерной модели кишечного эпителия для сельскохозяйственных животных. Клеточные и тканевые исследования. 2019; 375 (2): 409–24. pmid: 30259138
    28. 28. Кран РК. Na + -зависимый транспорт в кишечнике и других тканях животных.Fed Proc. 1965. 24 (5): 1000–6. pmid: 5838166
    29. 29. Herrmann J, Schroder B, Klinger S, Thorenz A, Werner AC, Abel H, et al. Сегментарное разнообразие характеристик транспорта электрогенной глюкозы в тонком кишечнике свиней-отъемышей. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2012. 163 (1): 161–9. pmid: 22683689
    30. 30. Zietek T, Rath E, Haller D, Daniel H. Кишечные органоиды для оценки транспорта питательных веществ, восприятия и секреции инкретина. Научный доклад 2015; 5 (1): 16831.
    31. 31. Кишида К., Пирс СК, Ю С, Гао Н., Феррарис Р.П. Восприятие питательных веществ абсорбционными и секреторными потомками стволовых клеток тонкого кишечника. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2017; 312 (6): G592 – g605. pmid: 28336548
    32. 32. Йошида А., Таката К., Касахара Т., Аояги Т., Сайто С., Хирано Х. Иммуногистохимическая локализация Na (+) — зависимого переносчика глюкозы в пищеварительном тракте крыс. Histochem J. 1995; 27 (5): 420–6. pmid: 7657561
    33. 33. Симон КБ, Пэджетт У., Дейли Дж. У.Форсколин: уникальный дитерпеновый активатор аденилатциклазы в мембранах и в интактных клетках. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1981; 78 (6): 3363–7. pmid: 6267587
    34. 34. Guschlbauer M, Klinger S, Burmester M, Horn J, Kulling SE, Breves G. транс-ресвератрол и эпсилон-виниферин снижают всасывание глюкозы в тощей и подвздошной кишке свиньи in vitro. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2013. 165 (3): 313–8. pmid: 23570675
    35. 35. Klinger S, Breves G. Ресвератрол ингибирует транспорт глюкозы и аланина в кишечнике свиней: потенциальная роль Na (+) / K (+) — АТФазы, протеинкиназы A, AMP-активированной протеинкиназы и ассоциации выбранных транспортных белков питательных веществ с детергентом Устойчивые мембраны.Питательные вещества. 2018; 10 (3). pmid: 29510506
    36. 36. Fridge JL, Conrad C, Gerson L, Castillo RO, Cox K. Факторы риска избыточного бактериального роста в тонком кишечнике при муковисцидозе. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2007. 44 (2): 212–8. pmid: 17255834
    37. 37. Lisowska A, Wójtowicz J, Walkowiak J. Избыточный бактериальный рост тонкой кишки часто встречается при муковисцидозе: для его обнаружения требуются комбинированные измерения водорода и метана. Acta Biochim Pol. 2009. 56 (4): 631–4. pmid: 19997657
    38. 38.Верлин С.Л., Бенури-Сильбигер I, Керем Э., Адлер С.Н., Голдин Э., Циммерман Дж. И др. Доказательства воспаления кишечника у пациентов с муковисцидозом. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010. 51 (3): 304–8. pmid: 20512061
    39. 39. Ferec C, Режущий GR. Оценка подверженности болезням мутаций в CFTR. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012; 2 (12): a009480. pmid: 23209179
    40. 40. Икари А., Мацумото С., Харада Х, Такаги К., Хаяши Х, Сузуки Ю. и др. Фосфорилирование парацеллина-1 по Ser217 протеинкиназой А необходимо для локализации в плотных контактах.J Cell Sci. 2006; 119 (Pt 9): 1781–9. pmid: 16608877
    41. 41. Коттра Дж., Ванк С. Форсколин-индуцированное открытие плотных контактов в эпителии желчного пузыря Xenopus опосредуется протеинкиназой С. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2003. 49 (1): 33–43. pmid: 12839335
    42. 42. Ли Дж. Си, Мрук Д., Ченг Си. Барьер проницаемости между плотными соединениями Сертоли регулируется взаимодействием протеинфосфатаз и киназ: исследование in vitro. Дж. Андрол. 2001. 22 (5): 847–56.pmid: 11545299
    43. 43. Dharmsathaphorn K, Pandol SJ. Механизм секреции хлоридов, индуцированной карбахолом в линии эпителиальных клеток толстой кишки. J Clin Invest. 1986. 77 (2): 348–54. pmid: 3003156
    44. 44. Kunzelmann K, Mehta A. CFTR: центр киназ и перекрестных помех цАМФ и Ca2 +. FEBS J. 2013; 280 (18): 4417–29. pmid: 23895508
    45. 45. Hoppe S, Breves G, Klinger S. Вызванная кальцием секреция хлорида снижается ресвератролом в подвздошной ткани свиньи.BMC Res Notes. 2018; 11 (1): 719. pmid: 30309374
    46. 46. Леонард-Марек С., Хемпе Дж., Шредер Б., Бревес Г. Электрофизиологическая характеристика секреции хлоридов через тощую и толстую кишку свиней в зависимости от возраста и отъема. J. Comp Physiol B. 2009; 179 (7): 883–96. pmid: 19488761
    47. 47. Сигер Б. Модели кишечного эпителия, полученные от сельскохозяйственных животных: последние достижения и будущее применение органоидов кишечника. Альтернативная лаборатория Аним. 2020: 261192

      4026.pmid: 33337913
    48. 48. Sharp GW, Hynie S. Стимуляция кишечной аденилциклазы холерным токсином. Природа. 1971: 229 (5282): 266–9. pmid: 4323551
    49. 49. Поле М, Фромм Д., аль-Авкати К., Гриноу В.Б., 3-й. Влияние энтеротоксина холеры на транспорт ионов через изолированную слизистую оболочку подвздошной кишки. J Clin Invest. 1972. 51 (4): 796–804. pmid: 4335444
    50. 50. Picciotto MR, Cohn JA, Bertuzzi G, Greengard P, Nairn AC. Фосфорилирование регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза.Журнал биологической химии. 1992. 267 (18): 12742–52. pmid: 1377674
    51. 51. Туссон А., Фуллер С.М., Бенос Д. Апикальное рекрутирование CFTR в клетках Т-84 зависит от цАМФ и микротрубочек, но не Ca2 + или микрофиламентов. J Cell Sci. 1996; 109 (Pt 6): 1325–34. pmid: 8799821
    52. 52. Гишард А., Круз-Морено Б., Агилар Б., ван Зорге Н.М., Куанг Дж., Куркчиян А.А. и др. Токсин холеры нарушает барьерную функцию, ингибируя опосредованный экзоцистами перенос белков-хозяев к соединениям клеток кишечника.Клеточный микроб-хозяин. 2013. 14 (3): 294–305. pmid: 24034615
    53. 53. Стромбек Д. Р., Харролд Д. Связывание токсина холеры с муцинами и ингибирование муцином желудка. Заражение иммунной. 1974. 10 (6): 1266–72. pmid: 4435956
    54. 54. Беннун Ф. Р., Рот Г. А., Монферран К. Г., Кумар Ф. А. Связывание токсина холеры с гликосфинголипидами слизистой оболочки кишечника свиней: взаимосвязь с системой групп крови ABO. Заражение иммунной. 1989. 57 (3): 969–74. pmid: 2
    55. 6
    56. 55. Баруа Д., Пагио А.С.Группы крови АВО и холера. Ann Hum Biol. 1977; 4 (5): 489–92. pmid: 603230
    57. 56. Kuhlmann FM, Santhanam S, Kumar P, Luo Q, Ciorba MA, Fleckenstein JM. O-зависимые клеточные ответы на токсин холеры: параллельные клинические и эпидемиологические связи с тяжелой холерой. Am J Trop Med Hyg. 2016; 95 (2): 440–3. pmid: 27162272

    Millifluidic культура улучшает жизнеспособность и дифференциацию органоидов среднего мозга человека

    Специфические органоиды среднего мозга человека (hMO) служат экспериментальной моделью in vitro для изучения патогенеза болезни Паркинсона (БП).В hMO нейроэпителиальные стволовые клетки (NESC) дают начало функциональным дофаминергическим (mDA) нейронам среднего мозга, которые избирательно дегенерируют во время PD. Ограничением модели hMO является недостаточное снабжение кислородом и питательными веществами плотно упакованной области ядра, что в конечном итоге приводит к «мертвому ядру». Чтобы уменьшить это явление, мы применили миллифлюидную систему культивирования, которая обеспечивает подачу среды непрерывным ламинарным потоком. Мы разработали вычислительную модель переноса и потребления кислорода для прогнозирования уровней кислорода в hMOs.Моделирование предсказывает более высокие уровни кислорода в области ядра hMO в миллифлюидных условиях. В соответствии с вычислительной моделью, значительно меньшее «мертвое ядро» наблюдалось в hMOs, культивируемых в системе биореактора, по сравнению с теми, которые содержались в обычных условиях встряхивания. Сравнение областей некротического ядра в органоидах с теми, которые получены из модели, позволило оценить критическую концентрацию кислорода, необходимую для обеспечения жизнеспособности клеток. Помимо уменьшенного размера «мертвого ядра», эффективность дифференцировки от NESCs к mDA-нейронам была повышена в hMOs, подвергнутых воздействию среднего потока.Повышенная дифференциация связана с процессом метаболического созревания, который получил дальнейшее развитие в миллифлюидной культуре. В целом, условия биореактора, улучшающие качество hMO, заслуживают рассмотрения в контексте расширенного моделирования частичных разрядов.

    Эта статья в открытом доступе

    Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

    Моделирование заболеваний органоидов человека | Модели и механизмы заболеваний

    Вставка 2. Рождение поля органоидов

    С момента зарождения биологии как области науки ученые стремились понять механизмы болезней человека.Хотя изучение пациентов может дать представление о симптомах и помочь описать течение болезни, основные причины часто остаются загадочными. Таким образом, модели на животных были основным продуктом исследования болезней человека, поскольку они могут быть сконструированы для развития болезни, например, путем введения соответствующих мутаций. Однако из-за эволюционного расхождения существует множество особенностей биологии человека и механизмов болезней, которые невозможно точно смоделировать на животных. Например, модели болезни Альцгеймера на грызунах не всегда отображают характерные бляшки и клубки (Asaad and Lee, 2018).Когда ключевые признаки заболевания отсутствуют в моделях на животных, трудно изучить основные механизмы.

    По этим причинам в течение последних нескольких десятилетий усилия были сосредоточены на моделировании биологии болезней человека в чашке. Хотя клетки HeLa и другие иммортализованные линии клеток человека оказались мощным инструментом, их использование имеет несколько существенных недостатков, включая их геномную нестабильность и ограниченную тканевую идентичность (Adey et al., 2013). Более того, распространение первичных тканей взрослого организма далеко за пределы предсказанного предела Хейфлика является реальной проблемой (Hayflick, 1965).Таким образом, более поздние подходы были сосредоточены на in vitro моделях , полученных из стволовых клеток, которые обеспечивают более широкий спектр тканевых идентичностей, долгосрочное распространение, лучшую геномную целостность и улучшенное моделирование здоровой биологии. Стволовая клетка — это любая клетка, которая способна самообновляться и генерировать дифференцированное потомство, то есть способная генерировать несколько определенных идентичностей. Таким образом, дифференцированные типы клеток органов могут быть получены in vitro из плюрипотентных стволовых клеток (PSCs) путем выполнения ряда этапов дифференцировки, которые имитируют раннее эмбриональное развитие.Альтернативно, можно использовать дифференцированные клетки, происходящие из резидентных взрослых стволовых клеток / клеток-предшественников, таких как стволовые клетки кишечной крипты, но исторически оказалось, что они трудно размножить in vitro (Bjerknes and Cheng, 2006).

    Чтобы преодолеть эти ограничения, а также лучше воспроизвести архитектуру ткани, в центре внимания появилась новая область биологии 3D in vitro , называемая тканевой инженерией. Путем объединения биологии и инженерии были установлены более сложные конформации клеток, позволяющие объединить несколько типов клеток в конфигурацию, которая более точно имитирует архитектуру органов.Возможно, наиболее захватывающими разработками стали недавние методы «орган на чипе», которые позволяют создавать связанные камеры, имитирующие различные компартменты органов, например, протоки печени и сосудистую сеть (Huh et al., 2011).

    Хотя тканевая инженерия предоставила ряд очень полезных моделей для изучения взаимодействия между различными типами клеток, существуют определенные искусственные аспекты, которые влияют на их способность точно моделировать структуру органов и, следовательно, функционировать.Например, использование искусственных мембран и матриц означает, что клетки позиционируются посредством экзогенных процессов, а не посредством восходящих принципов самоорганизации, как при развитии органов in vivo . Т.о., чтобы более точно моделировать архитектуру органов, самые недавние усилия были сосредоточены на поддержке самоорганизующегося развития этих тканей in vitro . Так родилось поле органоидов.

    Спектроскопическая микроскопия изменений хроматина живых клеток и биохимического состава в трансплантируемых органоидах без меток , который преодолевает проблему быстрого образования гомогенных органоидов (см.рис.1А и Материалы и методы). Агароза, которая не имеет адгезионных свойств клеток, позволяет спонтанную и быструю агрегацию первоначально диссоциированных hiPSCs точно в один hEB в каждой микролунке примерно за 18-24 часа, что значительно быстрее, чем большинство других методов, без Rho-ассоциированных Ингибитор протеинкиназы и прядение не использовались на протяжении всего процесса. Размер и однородность hEB зависят от количества hiPSC, помещенных в одну микролунку с круглым дном диаметром 700 мкм (рис.1Б). В то время как размещение менее 15 000 hiPSC на микролунку приводит к нестабильной агрегации в основном неоднородных hEB, размещение от 15 000 до 35 000 hiPSC приводит к существенному улучшению стабильности агрегации и однородности hEB. Оптимальные условия были достигнуты при 35000 клеток на микролунку, при этом размеры hEB находились в диапазоне от 450 до 500 мкм, а агрегация становилась наиболее стабильной. Дальнейшее увеличение количества hiPSC в одной микролунке заставляет сформированные hEB снова становиться маленькими и нестабильными.

    Рис. 1. Формирование органоидов печени с использованием массивов микролунок в репеллентной агарозе.

    ( A ) Рабочий процесс для образования больших количеств hEB с HAMEC, смешанными с hiPSC в соотношении 1: 3. ( B ) Общая морфология hEB при формировании с различной плотностью высева hiPSC в микролунке с агарозой. Масштабные линейки 500 мкм. ( C ) Агрегация суспензии hiPSC сразу после посева в микролунки и после 6- и 24-часового образования.( D ) Схематическое изображение протокола дифференцировки для образования функциональных органоидов печени.

    Эндотелиальные клетки, которые являются одними из первых клеток, присутствующих в естественных условиях на начальных этапах эмбриогенеза ( 36 ) и в конечном итоге составляют примерно одну пятую от общей массы клеток печени взрослого человека ( 37 ), были включены в органоиды. . Эндотелиальные клетки играют важную роль в органогенезе, формируя сосудистые сети, которые секретируют ангиокринные факторы, которые являются органо-специфическими факторами роста ( 38 , 39 ).Эндотелиальные клетки также поддерживают гомеостаз и метаболизм, а также обеспечивают пассивные каналы для крови и распределения питательных веществ по нескольким органам. При формировании органоидов печени мы использовали эндотелиальные клетки микрососудов человека (HAMEC), смешанные с hiPSC в соотношении 1: 3 внутри эмбриоидных тел. И hiPSC, и эндотелиальные клетки самоорганизуются в органоидах с течением времени, образуя каналы эндотелиальных клеток в конце процесса дифференцировки ( 40 ) .После образования hEB через 18-24 часа (рис.1C), мы использовали протокол, который мы разработали для формирования функциональных органоидов печени, состоящих из зрелых гепатоцитов и эндотелиальных клеток (см. Рис. 1D и материалы и методы). Четыре этапа протокола: дефинитивная энтодерма, энтодерма передней кишки, гепатобласты и зрелые гепатоциты, каждая из которых длится 4 дня. Чтобы имитировать процессы, происходящие во время эмбриогенеза in vivo, мы использовали ингибиторы пути, специфичные для каждой из четырех стадий дифференцировки. Например, ингибитор MK-4101 пути Sonic hedgehog вместе с активином A, основным фактором роста фибробластов (bFGF) и трансформирующим фактором роста β1 (TGF-β1) был использован для развития дефинитивной энтодермы, ингибитора сигнального пути Notch LY- 41575 использовался в сочетании с костным морфогенетическим белком 4 (BMP-4) и FGF4 для формирования энтодермы передней кишки, в то время как фактор ингибирования 1 WNT (WIF-1) и ингибитор 1 пути передачи сигнала dickkopf WNT (DKK-1) ингибиторы Wnt / β. -катенин были использованы для индукции дифференцировки гепатобластов.Чтобы выяснить, успешно ли в протоколе производятся функциональные органоиды печени, мы отслеживали специфические для стадии маркеры на протяжении всего протокола. Мы наблюдали, что сформированные органоиды печени демонстрируют высокие уровни экспрессии специфичных для печени генов, связанных с множеством функций, типичных для первичных гепатоцитов человека (HPH). Одна из основных функций печени — выработка альбумина, который отвечает за большую часть онкотического давления в плазме кровеносных сосудов, предотвращая попадание жидкостей из кровотока в окружающие ткани.Кроме того, альбумин также играет важную роль в антиоксидантной, иммуномодулирующей активности и регуляции эндотелия. Как можно видеть на фиг. 2A, экспрессия гена альбумина в органоидах печени показала уровни, сопоставимые с уровнем HPH in vitro и с опубликованными данными секвенирования РНК in vivo ( 41 ) (см. Также таблицу S1). Еще одна важная функция печени связана с ее детоксикационной способностью. Поэтому мы протестировали органоиды печени на наличие экспрессии генов цитохромов цитохрома P450 1A2 (CYP1A2), CYP3A4, CYP2B6 (рис.2A), CYP1B1 и CYP2C9 (рис. S1A), которые наиболее заметны в фазе 1 детоксикации печени, и ферменты UDP-глюкуронозилтрансферазы 1 члена семейства A1 (UGT1A1), UGT1A3 (рис. S1A) и UGT1A4 (рис. 2A). , которые проявляются во второй фазе детоксикации печени. И снова их уровни экспрессии были очень похожи на уровни, наблюдаемые in vitro в HPHs, и на данные in vivo (таблица S1). Мы также наблюдали сопоставимые уровни с HPH в других генетических маркерах печени, таких как α-фетопротеин (AFP), орнитин-транскарбамилаза (OTC), цитокератин 18 (CK-18), альфа-1-антитрипсин (A1AT), фенилаланин-гидроксилаза (PAH). , ядерный фактор гепатоцитов – 1β (HNF-1β), HNF-4α, HNF-6, гликогенсинтаза 2 и синтаза жирных кислот 1 (рис.S1A).

    Рис. 2. Функциональная характеристика органоидов печени.

    Измерения ПЦР в реальном времени маркеров печени ( A ) и маркеров фактора свертывания крови ( B ). ( C ) Измерения маркеров фактора свертывания крови методом ELISA. ( D ) Анализ образования фактора Ха. HPH (зеленый) и HAMEC (красный) в 2D-культуре показали одинаковые наклоны кривой, в то время как 3D-культура HAMEC (коричневый) и органоидов печени (синий) продемонстрировали одинаковый наклон кривой. Максимальная скорость реакции V max органоидов печени (0.26) был ниже, чем у всех положительных контролей (HPH, 0,40; HAMEC 2D, 0,41; HAMEC 3D, 0,33), что указывает на лучшую ферментативную активность органоидов. ( E ) Анализ образования тромбина и активности фактора VIIIa показал лучшие результаты для органоидов по сравнению с HPH и HAMEC. ( F ) Измерение альбумина в органоидах печени с помощью ELISA показало сопоставимые результаты с HPH (13,05 нг / мл против 11,30 нг / мл, соответственно). ( G ) Анализ альбумина с помощью клеточной сортировки по флуоресценции (FACS).( H ) FACS-анализ HNF-4α. ( I ) Анализ CYP450 детоксикации печени I (индукция CYP450 показала удвоенную активность после введения лекарства в отношении CYP1A2 и CYP2B6) и конъюгация резоруфина для анализа детоксикации печени II (скорость образования резоруфина была статистически выше, чем HPH). ( J ) Анализ метаболизма аммония. ( K ) Анализ внутриклеточной концентрации мочевины. ( L ) Анализ концентрации внутриклеточного аммония. ( M и N ) Иммунофлуоресценция печеночных маркеров.Масштабные линейки, 50 мкм. ( O ) Гликановый профиль зрелых органоидов печени. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение ( n = 3). * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001.

    Другой важной функцией печени является ее роль в гемостазе, который включает свертывание крови. Печень синтезирует почти все факторы свертывания и их ингибиторы, в то время как повреждение печени обычно связано с нарушением коагуляции. Мы наблюдали, что экспрессия генов основных факторов свертывания, связанных с внутренними, внешними и общими путями каскада свертывания, фибринолиза и регуляции тромбоцитов, была сопоставима с таковой, наблюдаемой в HPH (рис.2B и рис. S1B). Некоторые из основных факторов, ответственных за заключительную и наиболее важную часть каскада свертывания, а именно факторы V, VII, X и тромбин, были экспрессированы на уровнях даже выше, чем в HPH (рис. 2B и таблица S2). Существенные улучшения функциональных характеристик органоидов печени с эндотелиальными клетками по сравнению с органоидами печени, образованными только hiPSC, включая как печеночные маркеры, так и факторы свертывания крови, представлены на рис. S2.В дополнение к количественной оценке экспрессии генов важно также оценить соответствующее производство белка.Используя иммуноферментный анализ (ELISA), мы установили, что ряд факторов свертывания, таких как факторы IX и X, плазминоген, металлопептидаза ADAM с мотивом 13 тромбоспондина 1 типа (ADAMTS13), антитромбин III, протеин C и протеин S были экспрессированы на уровнях, сопоставимых с уровнями HPH и HAMEC (фиг. 2C и фиг. S1C). Кроме того, факторы свертывания крови, обычно продуцируемые эндотелиальными клетками [тканевой активатор плазминогена и фактор фон Виллебранда (VWF)], также экспрессируются в органоидах печени, демонстрируя успешную интеграцию HAMEC в органоиды (рис.S1C). Мы также проверили ферментативную активность трех основных факторов свертывания, которые являются частью общего пути, а именно фактора Ха, образования тромбина и активности фактора VIIIa. В очередной раз мы обнаружили, что они были сопоставимы с ферментативной активностью HPH и HAMEC (рис. 2, D и E). Мы также использовали ELISA для анализа продукции альбумина и установили, что она была сопоставима с продукцией белка в HPH (рис. 2F), в то время как анализ клеточной сортировки с активацией флуоресценции (FACS) на альбумин и HNF-4α дал 31.82% (фиг. 2G) и 35% (фиг. 2H) положительных клеток соответственно. Детоксикация в фазе 1 печени также была протестирована на функциональных уровнях путем индукции основных цитохромов P450 (CYP1A2, CYP2B6 и CYP3A4) с помощью различных препаратов. Повышенные уровни цитохромов наблюдались после индукции по сравнению с базовыми уровнями [диметилсульфоксида (ДМСО)], аналогичными тем, которые наблюдаются в HPH (рис. 2I). Продукция резоруфина также была протестирована в качестве маркера фазы 2 печени, демонстрируя значительно более высокую скорость образования, чем у HPH (рис.2I). Анализ метаболизма аммония органоидов печени показал снижение содержания аммония в среде, которое уменьшалось вдвое каждые 3 часа (рис. 2J), что подтверждается также повышенным количеством внутриклеточной мочевины (рис. 2K) и снижением внутриклеточного аммония (рис. 2L). ) в результате эффективности очистки органоидов печени от аммония. Иммунофлуоресцентная визуализация органоидов альбумина, связанного с несколькими маркерами печени [аланинаминотрансфераза (ALT), аспартаттрансаминаза (AST), HNF-4α, HNF-1α, HNF-3β, A1AT, тирозин -протеинкиназа Met (C-MET) и CK18] была проведена для проверки способности органоида одновременно коэкспрессировать несколько белков печени (рис.2, M и N, и рис. S1D). Мы также наблюдали образование CD31-положительных трубчатых структур с круглыми поперечными сечениями внутри дифференцированных органоидов печени. Поскольку CD31 является известным маркером сосудистого развития, это может быть ранним признаком сосудистого образования (рис. S1E). Микроскопические изображения морфологии органоидов продемонстрировали постепенное увеличение размера и удлинения органоидов и изменение клеточной морфологии до многоугольной формы (рис. S1, F и G). Тест с индоцианиновым зеленым (ICG) был проведен как индикатор способности поглощать и секретировать альбумин из интерстициальных жидкостей (рис.S3, A и B). Были протестированы накопление и поглощение липидов, а также накопление гликогена (рис. S3, от C до E), что доказало, что органоиды способны накапливать липиды и гликоген. Поглощение ацетилированных липопротеинов низкой плотности (Ас-ЛПНП) использовалось в качестве индикатора полной функциональности органоидов. Наконец, мы выполнили гликомический анализ, чтобы сравнить гликановый профиль органоидов печени с профилем HPH (рис. S1H). В то время как разработанные органоиды печени имели довольно другой профиль N -гликана по сравнению с криоконсервированным HPH ( 42 ), они имели довольно похожий профиль на профиль, наблюдаемый в свежем изолированном HPH ( 41 ) и настоящих тканях печени, с более низкая встречаемость высоких маннозов по сравнению с высокими количествами, которые обычно наблюдаются в культурах клеток (рис.2O).

    Рамановская спектроскопия живых органоидов во время дифференциации

    Хотя было показано, что обычные методы могут быть полезны для мониторинга биохимических изменений, мы также использовали рамановскую спектроскопию для мониторинга биохимического состава, поскольку ее можно проводить на живых клетках. Спектры комбинационного рассеяния были получены от живых дифференцирующихся органоидов hiPSC в течение 16 дней, причем этот 16-дневный период соответствовал четырем этапам протокола. В то время как большинство рамановских систем анализируют побочные продукты ниже по потоку, наша система (см. «Материалы и методы») фокусирует возбуждающий лазерный луч ближнего инфракрасного диапазона непосредственно на органоиды.Органоиды первоначально были взяты из инкубатора и помещены в кварцевую чашку, заполненную базальной средой дифференцировки, без добавления фактора роста. Измерения проводились через день на нескольких отдельных неокрашенных органоидах, при этом продолжительность измерений была достаточно короткой, чтобы органоиды оставались живыми. На рисунке 3А показаны средние спектры, собранные в hEBs и в органоидах на четырех стадиях. В пределах одного органоида в спектрах комбинационного рассеяния было примерно 3.Разница между точками составляла 5%, в то время как изменение органоидов в спектрах комбинационного рассеяния составляло 5,8%. Из-за остановки клеточного цикла во время дифференцировки ( 43 ) содержание ДНК остается стабильным ( 20 ), и поэтому имеет смысл нормализовать спектры по пику, связанному с ДНК на 722 см -1 ( 44 ). Хотя некоторые из заметных пиков в спектрах комбинационного рассеяния органоидов печени могут быть в основном связаны со специфическими биохимическими веществами, важными для функции печени, такими как альбумин (1006 см -1 ), AFP (1746 см -1 ), гликоген ( 490 см -1 ) или липидов печени (1452 см -1 ), каждый из этих биохимических веществ имеет несколько пиков (см.рис.3А), накладывающиеся друг на друга. Кроме того, биохимические вещества, присутствующие в hEB в начале процесса дифференцировки, также имеют пики, перекрывающиеся с пиками вышеупомянутых биомолекул. Поэтому для количественной оценки изменений индивидуального биохимического состава органоидов hiPSC в процессе дифференцировки мы использовали алгоритм спектрального разделения ( 45 , 46 ) с некоторыми улучшениями.

    Рис. 3. Рамановские спектры дифференцирующихся органоидов печени.

    ( A ) Экспериментально измеренные средние спектры комбинационного рассеяния hEB и органоидов печени во время четырех стадий дифференцировки с заметными пиками, характерными для основных отмеченных биомолекул, вносящих рамановский вклад.( B ) Четыре основных спектра комбинационного рассеяния: альбумин, AFP, гликоген и липиды печени. а.е., условные единицы. ( C ) Экспериментально измеренный спектр комбинационного рассеяния органоида печени на стадии гепатобластов и соответствие модели. а.е., условные единицы.

    Экспериментально наблюдаемый спектр комбинационного рассеяния органоидов на стадии k дифференцировки S ( k ) (λ), где k изменяется от 1 до 4 для стадий дефинитивной энтодермы, энтодермы передней кишки, гепатобластов, и зрелые гепатоциты, соответственно, а λ — сдвиги частоты комбинационного рассеяния, можно записать как

    S (k) (λ) = ShEB (λ) + ∑i = 1Nci (k) Si (λ) + ε (λ)

    ( 1)

    , где N — количество известных основных биохимических веществ, вносящих вклад в спектр органоидов, ci (k) — концентрация биохимического вещества i на стадии k , S i (λ) — основание спектр биохимического i , S hEB (λ) — это спектр hEB в начале процесса дифференциации, а ε (λ) — ошибка, которая включает экспериментальный шум и вклад биохимических веществ, которые либо отсутствуют. в hEBs или не входит в число основных биохимических веществ, которые, как известно, присутствует в дифференцирующихся органоидах.Экспериментальные спектры могут быть приспособлены к формуле. 1 с использованием линейного метода минимизации по методу наименьших квадратов. Однако, поскольку известно, что это некорректная задача ( 47 ), необходимо использовать дополнительную априорную информацию о спектре. Поэтому для улучшения обусловленности задачи мы использовали функцию стоимости

    J (c1 (k),… cN (k)) = ∑λ [(S (k) (λ) −ShEB (λ) −i = 1Nci ( k) Si (λ)) 2 + αP (λ) 2]

    (2)

    с членом регуляризации P (λ), равным разнице между экспериментальным и смоделированным спектрами при сдвиге частоты комбинационного рассеяния, где эта разница составляет отрицательный, что ухудшает потенциальное решение, когда смоделированные спектры превышают экспериментальный спектр.Прежде чем использовать описанный линейный подход к минимизации по методу наименьших квадратов, мы сначала должны были идентифицировать основные биохимические вещества, влияющие на спектры органоидов. В дополнение к спектрам комбинационного рассеяния света hEB, мы идентифицировали четыре основных фактора комбинационного рассеяния, вносящих вклад в дифференцирующие спектры органоидов печени. Этими участниками являются альбумин, AFP, гликоген и липиды печени. Базовые спектры альбумина, AFP и гликогена измеряли с помощью системы Рамана. Клетки печени содержат множество жирных кислот и триглицеридов, и хотя большинство липидов имеют схожие спектры комбинационного рассеяния, мы решили использовать опубликованные спектры липидных капель печени ( 48 ) как наиболее репрезентативный спектр липидов в клетках печени.Все базовые спектры представлены на рис. 3В. После идентификации основных биохимических веществ и сбора соответствующих базовых спектров мы подогнали экспериментально измеренные спектры комбинационного рассеяния органоидов печени для каждой стадии дифференцировки. Типичное сравнение рамановского спектра для стадии гепатобластов и соответствия модели представлено на рис. 3C. Продукция альбумина, AFP, гликогена и липидов печени, обнаруженная в живых органоидах во время дифференциации с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, показана на рис.4 (от A до D) и согласуется с изменениями, наблюдавшимися ранее при использовании обычных методов. Например, относительная концентрация альбумина (фиг. 4A) постоянно увеличивается на протяжении каждой стадии дифференцировки с ускоренной скоростью на стадиях гепатобластов и зрелых гепатоцитов, двух заключительных стадиях дифференцировки в печени. Продукция AFP (рис. 4B), типичного маркера гепатобластов ( 49 ), несколько снизилась на стадии энтодермы передней кишки, а затем значительно увеличилась и достигла максимума на стадии гепатобластов и снова снизилась на стадии зрелых гепатоцитов. в соответствии с опубликованными результатами ПЦР в реальном времени ( 50 , 51 ).С другой стороны, как гликоген (рис. 4C), так и липиды печени (рис. 4D) неуклонно увеличивают свою относительную концентрацию на всех стадиях дифференцировки, что еще раз согласуется с опубликованными результатами ( 52 ).

    Рис. 4. Восстановленные концентрации четырех биомолекул во время дифференцировки органоидов печени.

    Сравнение отдельных точек данных для ( A ) альбумина, ( B ) AFP, ( C ) гликогена и ( D ) липидов печени для каждой из стадий дифференцировки относительно стадии hEB.Каждая точка данных представляет собой единичный объем коллекции, содержащий приблизительно 10 000 ячеек. Был проведен односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки. Все эксперименты проводились с тремя биологическими повторностями из трех технических повторностей. Результаты представляют собой средние значения ± SEM. ** P <0,01 и **** P <0,0001.

    КЛАСС-микроскопия хроматина в живых дифференцирующихся органоидах

    В дополнение к мониторингу изменений экспрессии генов и биохимического состава с помощью как традиционных методов, так и рамановской спектроскопии, мы также отслеживали изменения в распределении хроматина в живых дифференцирующихся клетках.Чтобы упаковать ДНК длиной 2 м в ядро ​​размером в несколько микрометров, хроматин должен быть организован в отдельные домены. Некоторые из этих доменов демонстрируют более открытую форму хроматина с высокой плотностью генов и высокой экспрессией генов, в то время как другие более плотно упакованы, демонстрируя закрытое состояние хроматина. Эти домены называются эухроматином и гетерохроматином соответственно. Хроматин может состоять из других типов доменов, называемых топологически ассоциированными доменами (TAD) ( 53 ). Точная природа ТАД не выяснена, что приводит к противоречивым определениям их границ в геноме ( 54 ).Первоначально было постулировано ( 55 ), что эти домены образуют сильно узловое равновесное состояние с вероятностью контакта P c ( s ) ~ s −3/2 для двух локусов, которые представляют собой геномное расстояние с друг от друга. Позже экспериментально было установлено ( 56 ), что P c ( s ) ~ s −1,08 . Единственная конформация, согласующаяся с этим почти линейным поведением вероятности контакта, — это неравновесное состояние, организованное самоподобным образом ( 57 ), такое как фрактал ( 58 ).Фрактальная организация приводит к смежным пространственным областям с транскрипционно активным и неактивным хроматином, облегчая легкое разворачивание и рефолдинг во время активации или репрессии гена. Оба свойства наблюдаются в эукариотическом хроматине, что является дополнительным доказательством того, что хроматин имеет фрактальную организацию. Самоподобные свойства фрактала хроматина могут быть отражены в спектрах светорассеяния хроматина. Спектры рассеяния света не ограничиваются дифракцией и могут характеризовать субклеточные и субядерные структуры, значительно меньшие, чем длина волны света ( 45 ).Мы решили использовать микроскопию CLASS (см. Материалы и методы и рис. 5A), которая использует спектры светорассеяния в качестве нативного маркера ( 32 ), что позволяет без метки определять хроматин в нанометровых масштабах в живых клетках. Рассеяние на хроматине в ядре клетки можно описать как рассеяние скоплением N плотно упакованных мелких рассеивателей с объемами V и близкими к единице относительными показателями преломления m . Интенсивность рассеяния, регистрируемого микроскопом CLASS из фокального пятна, может быть найдена ( 59 ) путем интегрирования квадрата амплитуды электромагнитного поля по телесному углу объектива Ω относительно его числовой апертуры (NA), давая следующее выражение

    I = ∫Ω∫Ω8π2V2∣E0∣2 (м − 1) 2λ4R21 + cos2θ2∣∑iNei2πλri (k̂′ − k̂) ∣2P (−k̂) P (k̂ ′) dk̂dk̂ ′

    (3)

    , где r i — вектор положения отдельных рассеивателей относительно фокуса, λ — длина волны падающего и рассеянного света (поскольку мы рассматриваем только упругое рассеяние), k̂ и k̂ ′ — единичные векторы в направлении распространения падающего и рассеянного света. рассеянный свет, соответственно, θ — угол рассеяния между k̂ и k̂ ′, R — расстояние до детектора, E 0 — амплитуда падающего поля, P (k̂) — функция целевого зрачка ( доставка и сбор света описываются одной и той же функцией зрачка), и суммирование проводится по всем рассеивателям, образующим хроматин.Из-за усреднения угла ( 60 ) для выражения с большой числовой апертурой (уравнение 3) интенсивность рассеяния может быть связана со структурным фактором и аппроксимирована как I∝λ − 3∫0∞g (r) sin (2πr / λ) rdr, где g ( r ) — парная корреляционная функция хроматина. Следовательно, явная зависимость интенсивности рассеяния хроматина от длины волны зависит от формы парной корреляционной функции, которая, в свою очередь, может быть охарактеризована статистическим индексом сложности, связанным с фракталами, называемым размерностью Хаусдорфа ( 58 ).

    Рис. 5. КЛАСС-микроскопические измерения упаковки хроматина в живых клетках.

    ( A ) Визуализация в SolidWorks системы микроскопии CLASS. На схеме показан путь света в настраиваемом конфокальном сканирующем блоке и оптических элементах, которые включают в себя широкополосный лазерный источник суперконтинуума, настраиваемый комбайнер суперконтинуумного лазера и обычных лазеров и дополнительный металлооксидный полупроводниковый спектрометр. ( B ) Визуализация измерений упаковки хроматина в ядре клетки с помощью микроскопии CLASS с различными TAD, выделенными разными цветами, и освещенным одним из TAD.

    Конфокальный дифракционно ограниченный дозирующий объем микроскопа CLASS сопоставим по размеру с характерными размерами TAD ( 61 ) (рис. 5B). Следовательно, связывая спектры CLASS с фрактальной организацией хроматина, имеет смысл рассматривать как массовую фрактальную организацию хроматина внутри домена, так и поверхностную фрактальную организацию границы домена. Это позволяет описывать хроматин, используя наиболее общий случай массовых фракталов, ограниченных поверхностными фракталами.Хотя явная зависимость парной корреляционной функции и структурного фактора от массы и фрактальной размерности поверхности d м и d s , соответственно, малоизвестна ( 62 ), можно использовать полуэмпирическую форму структурного фактора, предложенного Синхой ( 63 ), и аналогичной зависимости, полученной из соображений масштабирования О и Соренсена ( 64 ). Он дает I ~ λ −4 + ​​χ для интенсивности рассеяния массового фрактала, ограниченного поверхностным фракталом с χ = 2 d м d s .Здесь следует отметить, что некоторые важные характеристики хроматина могут быть описаны с использованием концепции массового фрактала ( 30 , 31 ), причем массовая фрактальная размерность d m выше в более плотном гетерохроматине ( 65 ) . На границе домена увеличение фрактальной размерности поверхности d s могло бы указывать на присутствие транскрипционно активного эухроматина, открывающего большую поверхность для ядерных белков и, таким образом, способствуя транскрипции гена за счет лучшего доступа факторов транскрипции к ДНК. .Следовательно, на границе домена присутствие гетерохроматина приведет к тому, что фрактальная размерность поверхности d s будет ниже. Обе эти тенденции должны приводить к более высокому значению χ для гетерохроматина. Поскольку χ можно напрямую оценить из спектров CLASS, мы будем использовать χ для характеристики плотности фрактальной упаковки хроматина в конфокальном объеме микроскопа CLASS. Мы отслеживали изменения хроматина в живых органоидах, содержащих только hiPSC, подвергающихся дифференцировке, собирая изображения микроскопии CLASS. в течение 16 дней.Подобно нашим измерениям рамановской спектроскопии, этот 16-дневный период соответствовал четырем этапам протокола (дефинитивная энтодерма, энтодерма передней кишки, гепатобласты и зрелые гепатоциты). Измерения проводили, сначала удаляя органоиды из инкубатора и помещая их в 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном, заполненную базальной средой дифференцировки, без добавления фактора роста (рис. 6А). Продолжительность измерений была достаточно короткой, чтобы сохранить живыми hiPSC в органоидах, и окрашивание не использовали.Ядра, расположенные на глубине примерно 15-25% внутри органоида, первоначально были идентифицированы с помощью визуализации с коэффициентом отражения белого света. После идентификации ядра одновременно были получены микроскопические изображения CLASS и изображения в белом свете, что позволило легко идентифицировать ядро ​​для обработки данных. По мере прогрессирования дифференцировки наклон спектров рассеяния от хроматина в живых hiPSCs обнаруживает очень значимые изменения (Fig. 6B). Этот результат согласуется с постоянным увеличением параметра упаковки χ из-за ожидаемого увеличения фракции гетерохроматина по мере прогрессирования дифференцировки.Спектры рассеяния, показанные на рис. 6В, являются средними спектрами для всего ядра. Кроме того, спектры можно анализировать локально, что позволяет также локально получить соответствующий наклон и параметр упаковки χ. Это проиллюстрировано на фиг. 6C, где пространственные карты параметра упаковки χ представлены псевдоцветами. На рис. 6D показаны средние значения χ для нескольких органоидов, рассчитанные по всему ядру на каждой стадии дифференцировки. Как видно на фиг. 6D, hEBs характеризуются низким значением χ, отражающим типичный высокий процент деконденсированного эухроматина в недифференцированных стволовых клетках.Этот высокий уровень эухроматина сохраняется на протяжении всей стадии дефинитивной энтодермы и может также ожидаться для первого зародышевого листка, развивающегося после инициации процесса дифференцировки. После этого, когда клетки достигают стадии энтодермы передней кишки, которая представляет собой более специализированную ткань, из которой возникает большинство внутренних органов, все больше и больше генов выделяются как неактивные, и только гены, специфичные для специализированной ткани, остаются в деконденсированном хроматине. Это значительное снижение деконденсированного хроматина на стадии энтодермы передней кишки отражается в увеличении параметра χ.Это продолжается через стадии гепатобластов и зрелых гепатоцитов, при этом максимальное присутствие гетерохроматина наблюдается на заключительной стадии дифференцировки. Эти результаты превосходно согласуются с измерениями просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), которые мы выполнили на тех же партиях дифференцированных органоидов hiPSC в те же дни, что и измерения с помощью микроскопии CLASS (рис. 6, E и F), где были получены изображения ядер клеток с помощью ПЭМ. бинаризованы для классификации областей плотного гетерохроматина и рыхлого эухроматина (см. Материалы и методы).Результаты CLASS также хорошо согласуются с опубликованными исследованиями ( 66 ), которые демонстрируют, что стволовые клетки, имеющие более 75% хроматина в транскрипционно активном состоянии эухроматина, подвергаются реорганизации и накапливают высококонденсированный и неактивный гетерохроматин при дифференцировке с уменьшением эухроматина примерно на 40%.

    Рис. 6. Упаковка хроматина в живых органоидах на разных стадиях дифференцировки.

    ( A ) Визуализация измерений упаковки хроматина в одном из ядер живых дифференцирующихся органоидов hiPSC с использованием микроскопа CLASS.( B ) Средние спектры светорассеяния, полученные с помощью микроскопа CLASS для органоидов hiPSC. Фиолетовые точки показывают спектры хроматина на стадии дефинитивной энтодермы ( n = 19), розовые на стадии гепатобластов (n = 21) и красные на стадии зрелых гепатоцитов ( n = 24). Подгонки модели представлены сплошными линиями. ( C ) Пространственные карты плотности фрактальной упаковки хроматина χ в живых органоидах hiPSC на разных стадиях дифференцировки. Показаны две типичные карты для каждой ступени, наложенные на изображения ядер в белом свете.Значения χ в диапазоне от 2,3 до 2,9 показаны как оттенки пурпурного и могут быть слабо связаны с эухроматином, тогда как значения в диапазоне от 2,9 до 3,5 показаны как оттенки красного и могут быть связаны с гетерохроматином. Шкала 5 мкм. ( D ) Параметр χ, отражающий изменения в соотношении гетерохроматина и эухроматина и SE для hEB ( n = 9), дефинитивной энтодермы ( n = 19), энтодермы передней кишки ( n = 21), гепатобластов ( n = 21), а зрелые гепатоциты ( n = 24) стадии дифференцировки.( E ) Типичные ПЭМ-изображения ядер органоидов hiPSC на разных стадиях дифференцировки. Верхний ряд: исходные изображения. Нижний ряд: те же изображения, наложенные псевдоцветными картами, где гетерохроматин выделен красным цветом, а эухроматин — фиолетовым.

    Author: alexxlab

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.