Текст нагибина: Сочинение ЕГЭ 2021 по тексту Ю.М. Нагибина. Как война меняет судьбы целого поколения? » Рустьюторс

Содержание

Сочинение ЕГЭ 2021 по тексту Ю.М. Нагибина. Как война меняет судьбы целого поколения? » Рустьюторс

Сочинение ЕГЭ 2021 на 25 баллов по тексту Ю.М. Нагибина: «Вот и кончился последний урок последнего дня нашей школьной жизни!»
Исходный текст

Как война меняет судьбы целого поколения? Что она способна отнять у людей? Именно над этими вопросами размышляет в своей тексте Ю.М. Нагибин. В центре внимания автора проблема влияния войны на жизнь человека.

Вовлекая читателей в совместные размышления, писатель рассказывает о судьбе девушки, юность которой пришлась на военные годы.

Окончание школы для каждого героя было волнительным событием, ведь мгновенно они превратились «из школяров во взрослых людей». Герои признаются в чувствах, назначают встречи, беззаботно мечтают. Автор рассказывает о планах юной Жени Румянцевой на будущее: «Женя с шестого класса знала, что будет астрономом, и никем другим».

Но эти планы так и не стали реальностью. Военные годы девушка провела в летной школе, звание Героя Советского Союза, к сожалению, ей было присвоено уже посмертно. Автор отмечает «острое, щемящее беспокойство» героя-повествователя, с которым еще в школьные годы назначила встречу Женя. Оно было вызвано тоской по прожитому времени, несправедливостью войны.

Этим примеры противопоставлены в тексте для того, чтобы дать читателю понять, какое огромное влияние страшные годы войны оказывают на человека.

Юрий Нагибин считает, что военное время вносит свои коррективы в жизнь людей, полностью меняя их самих и их судьбы.

Мне близка и понятна позиция автора: война способна перевернуть жизнь человека, безжалостно отнять у него мечты, близких, жизнь.

Эта мысль отражена в произведении Бориса Васильева «А зори здесь тихие». Риту, Галю и других девушек привели на войну разные дороги, у каждой было свое прошлое, могло бы быть будущее. Но война разрушительна, она равнодушно забрала у молодых девушек не только их мечты, но и самое ценное, что у них было – жизнь.

Подводя итог, я хочу сказать, что война не выбирает, кому умирать, а кому продолжать жить. Она, безусловно, оказывает влияние на всех, кто был с ней связан. Война – это страшно! И я считаю, что люди не должны допускать ее возникновения вновь.

Автор сочинения: Ксения Курылева.

Сочинение ЕГЭ 2021 по тексту Ю.М. Нагибина. Проблема влияния войны на судьбы людей.

Сочинение ЕГЭ 2021 на 25 баллов по тексту Ю.М. Нагибина о влиянии войны. «Вот и кончился последний урок последнего дня нашей школьной жизни! Десять школьных лет завершились по знакомой хрипловатой трели звонка…».

Автор текста – Ю.М. Нагибин поднимает проблему влияния войны на судьбы людей.

Размышляя над проблемой, автор приводит в пример ситуацию, произошедшую с рассказчиком Сережей. Женя Румянцева, его одноклассница, с самого детства определила свой жизненный путь: «Женя с шестого класса знала, что будет астрономом, и никем другим». Но наступила война, и девушка была вынуждена бросить институт и пойти учиться в летную школу. Этим примером автор показывает, что страшная и кровавая война забирает у людей их мечты, калечит судьбы, отнимает беззаботные юношеские годы.

Продолжая свои рассуждения, автор приводит аналогичный пример. Сережа и Женя договорились встретиться через десять лет после окончания школы, но война отняла у них эту возможность: Женя Румянцева погибла, получив звание Героя Советского Союза посмертно, а рассказчик, придя на место их несостоявшейся встречи, с тоской вспоминал моменты, проведенные со своей бывшей одноклассницей, и «слепоту своей юношеской души». Этот пример убедительно доказывает, как бесповоротно война меняет судьбы людей, оставляя их с сожалениями и несбывшимися надеждами.

Используя прием аналогии, автор подчеркивает актуальность проблемы и показывает, что война способна навсегда изменить судьбу человека, отнять у него юность, счастье, мечты.

Авторская позиция ясна. Ю.М. Нагибин считает, что влияние войны на человеческие судьбы велико, ведь она способна разлучить людей, сделать невозможным их счастье, разрушить мечты, оставить лишь воспоминания души, «так легко прошедшей мимо того, что могло быть стать судьбой».

Я полностью согласна с мнением автора. Война – одно из самых страшных событий, которое может случиться в истории человечества. Она меняет привычный образ жизни людей, их судьбы, рушит планы, надежды и мечты. Многие в военные годы теряют дом, семью, друзей. Обращусь к произведению художественной литературы, чтобы подтвердить свою точку зрения. Рассказ М.А. Шолохова «Судьба человека» наиболее точно показывает влияние войны на человеческие судьбы. Андрей Соколов – главный герой – потерял всю свою семью в это страшное время. В дом, где находилась его жена с детьми, попала бомба, а сын погиб на фронте, не дожив до победы всего несколько дней. Многие солдаты потеряли свои семьи на войне и возвращались в пустые дома, а это, пожалуй, самое страшное событие для любого человека.

Из всего вышесказанного можно сделать вывод, что война бесповоротно меняет судьбы людей, отнимая надежды, мечты, разрушая целый семьи.

Автор сочинения: Лена Иванова

Сочинение ЕГЭ 2021 по тексту Ю.

М. Нагибина. Как война влияет на судьбу человека?

Сочинение ЕГЭ 2021 на 25 баллов по тексту Ю.М. Нагибина о влиянии войны на судьбу человека. «Вот и кончился последний урок последнего дня нашей школьной жизни!»

Как война влияет на судьбу человека? Такова проблема, над которой заставляет задуматься текст Юрия Марковича Нагибина.

Отвечая на поставленный вопрос, автор повествует о молодых людях, чья юность выпала на тяжелое военное время. Юрий Нагибин заостряет наше внимание на судьбе героини, Жени Румянцевой. Девушка бросает институт, отказываясь от собственной мечты стать астрономом, и идет в летную школу, чтобы защищать Отечество. За свою отвагу она получает звание Героя Советского Союза, но, как оказывается, уже посмертно. Этот пример показывает, как война разрушает жизнь человека, заставляя его отказаться от своей мечты и целей.

В дополнение к этому отрывку, автор показывает переживания главного героя, который, несмотря на смерть девушки, вспоминал об их уговоре увидеться спустя десять лет.

К назначенному сроку он отправился на место встречи в память о Жене. Рассказчик сожалел, что не сблизился с девушкой, пока та была еще жива. Данный пример демонстрирует, как война меняет ход человеческой жизни, обрывает связи между людьми.

Автор убежден в том, что война разрушает жизнь человека, отнимая самое ценное: близких, мечты, стремления. Она уничтожает все, оставляя после себя лишь сожаления.

Я согласна с мнением автора. Действительно, война влияет на судьбу человека ужаснейшим способом, разделяя семьи, души, сердца людей. Например, во времена Гражданской войны в России, даже некогда родные люди сражались друг с другом, разрывая всю близость между собой, все родственные связи и разрушая судьбы целых семей.

Таким образом, война катастрофически влияет на судьбу человека, уничтожая все людские ценности и принося лишь боль.

Автор сочинения: Мария Пиминова

Текст Ю.М. Нагибина — Педагогический портал «Тривиум» (текст 1779)

(1)И вот появился в моей жизни Павлик. (2)У дворовых и у школьных ребят навсегда засело в памяти, что в нашей паре я был ведущим, а Павлик – ведомым. (3)Это осталось с той поры, когда я «вводил Павлика в свет» – сперва во дворе, потом в школе, где он оказался на положении чужака.

(4)На самом деле душевное превосходство было на стороне Павлика. (5)Моё долгое приятельство с Митей не могло пройти бесследно: я привык к известному моральному соглашательству, а прощение предательства немногим отличается от самого предательства. (6)Павлик не признавал сделок с совестью, тут он становился беспощаден. (7)Нам было лет по четырнадцать, когда я на своей шкуре испытал, насколько непримиримым может быть мягкий, покладистый Павлик.

(8)Я неплохо знал немецкий, домашних заданий никогда по этому предмету не готовил, но однажды настал и мой черёд, когда Елена Францевна ни с того ни с сего вызвала меня к доске, будто самого рядового ученика, и велела читать стихотворение.

– (9)Какое стихотворение? (10)Меня же не было в школе, я болел.

(11)Она стала листать классный журнал.

– (12)Совершенно верно, ты отсутствовал, а спросить у товарищей, что задано, не догадался?

(13)И я нашёл выход. (14)О домашних заданиях я спрашивал у Павлика, а он, наверное, забыл. (15)Я так и сказал Елене Францевне с лёгкой усмешкой, призывая и её отнестись к случившемуся юмористически.

– (16)Встань! – приказала Павлику немка. – (17)Это правда?

(18)Он молча наклонил голову, и я тут же понял, что это неправда. (19)Как раз о немецком я его и не спрашивал.

(20)Елена Францевна, забыв обо мне, перенесла свой гнев на Павлика, а он слушал её, по обыкновению, молча, не оправдываясь и не огрызаясь.

(21)Когда, довольный и счастливый, я вернулся на своё место, Павлика не оказалось рядом. (22)Я оглянулся: он сидел через проход позади меня, и у него были холодные, пустые глаза.

– (23)Ты чего это? (24)Не стоит из-за этого дуться, ну покричит и забудет.

(25)Он молчал и глядел мимо меня. (26)Какое ему дело до Елены Францевны, он и думать о ней забыл. (27)Его предал друг. (28)Спокойно, обыденно и публично, средь бела дня, ради грошовой выгоды предал человек, за которого он, не раздумывая, пошёл бы в огонь и в воду.

(29)Почти год держал он меня в отчуждении. (30)Все мои попытки помириться так, «между прочим», успеха не имели. (31)Ничего не получалось – Павлик не хотел этого. (32)Не только потому, что презирал всякие обходные пути, мелкие уловки и хитрости – прибежище слабых душ, но и потому, что ему не нужен был тот человек, каким я вдруг раскрылся на уроке немецкого.

(По Ю.М. Нагибину)*
*

Нагибин Юрий Маркович (1920–1994) – писатель-прозаик, журналист и сценарист.
Его произведения, посвященные темам войны и труда, воспоминаниям детства,
судьбам современников, переведены на многие языки мира.


«Все дороги куда-нибудь ведут»: сочинение в формате ЕГЭ по тексту Ю.Нагибина | Люблю читать, люблю писать

Дорога к храму Покрова на Нерли. Фото из личного архива автора

Дорога к храму Покрова на Нерли. Фото из личного архива автора

В предыдущей статье, посвящённой теме дорог в русской литературе, я предложила желающим поразмышлять над рассказом Юрия Нагибина «Заброшенная дорога». Текст ЕГЭ по этому рассказу легко находится по первым предложениям: » Был ли в яви или только приснился мне этот странный мальчик, овеянный нежностью и печалью нездешности, как маленький принц Экзюпери?.. Я знаю, что он был, как было и шоссе, заросшее подорожником и лопухами». Сегодня предлагаю вашему вниманию свой вариант сочинения в формате ЕГЭ:

В тексте, предложенном для анализа, Ю.Нагибин ставит проблему взаимоотношений между людьми.
Чтобы проиллюстрировать их разобщённость, писатель знакомит нас со «странным» мальчиком, полющим заросшее булыжное шоссе и убеждённым, что «все дороги куда-нибудь ведут», а также героем-рассказчиком, не осознающим этой «очевидной истины». В диалоге с мальчиком рассказчик упорствует и раздражается. Его поведение показывает, что не всегда люди готовы принять чужую точку зрения, отличающуюся от их собственной.
Только спустя годы герой понимает истинный смысл наставлений мальчика о необходимости расчищать дороги и идти навстречу друг другу. Он признаётся: «В моём сердце начиналось много дорог, ведущих к разным людям… Я … не давал сорнякам … превращать их в ничто. Но если я преуспевал в этом, то лишь потому, что… с другого конца дороги начиналось встречное движение». Эта развёрнутая метафора нужна автору, чтобы показать: для взаимопонимания необходимы усилия двух человек, необходимо желание услышать собеседника.
Оба примера, дополняя друг друга, подтверждают, что люди, желая быть услышанными, должны сами стремиться услышать и понять собеседника.
Позиция писателя, на мой взгляд, выражена в аллегорических словах мальчика: «Дороги – это очень важно, без дорог никто никогда не будет вместе». Под «дорогами», конечно, подразумеваются связи между людьми, а «сорняки», которые своими корнями разрушают дорогу, — это человеческий эгоизм, невнимание к чувствам и проблемам окружающих.
С позицией Ю.Нагибина и его героя сложно не согласиться. Безусловно, необходимо идти навстречу друг другу, если мы хотим, чтобы отношения между людьми сохранялись. Без сомнения, важно не давать дорогам зарастать равнодушием и обыденностью.
Чтобы подтвердить сказанное, вспомним рассказ К.Паустовского «Телеграмма». С одной стороны дороги – больная одинокая старая мать, которая, предчувствуя скорую смерть, просит свою дочь приехать повидаться; с другой стороны – Настя, окружённая вниманием коллег, увлечённая организацией очередной выставки и не придающая значения просьбе матери. Девушка, к сожалению, слишком поздно осознала, что самая важная дорога в её жизни разрушена, и не приложила вовремя усилий, чтобы восстановить связь с близким для неё человеком.
В другом рассказе Паустовского «Снег», наоборот, героиня не пожалела времени и трудов, чтобы фактически чужой для неё человек, приехав с фронта, ощутил тепло родного очага, уют дома, в котором всё осталось по-прежнему. Она понимала, насколько важно для него, чтобы рояль был настроен, чтобы дорожка к беседке была расчищена от снега, а колокольчик на крыльце починен. Её подготовка к приезду лейтенанта Потапова, схожая с действиями мальчика, выпалывающего траву на заброшенном шоссе, принесла свои плоды: чужие люди стали почти родными.
В заключение хочется ещё раз подчеркнуть важность сохранения «дорог» между людьми, необходимость «встречного движения». Если мы будем внимательны друг к другу, если мы будем готовы прилагать совместные усилия и двигаться к одной цели, эти «дороги» никогда не зарастут сорняками и не разрушатся.

Предвкушаю вопрос: зачем два литературных примера? Отвечаю на него своим вопросом: а где написано, что этого нельзя делать? А если серьёзно, просто нежно люблю Паустовского. Показалось, что оба упомянутых мною рассказа будут здесь весьма кстати. Готова выслушать критические замечания.

P.S. По просьбе читательницы выкладываю полностью текст, по которому написано сочинение:

(1)Часто бывает, что чудеса находятся возле нас — протяни руку и возьми, а мы и не подозреваем об этом.
(2)Был ли в яви или только приснился мне этот странный мальчик, овеянный нежностью и печалью нездешности, как маленький принц Экзюпери?.. (3)Я знаю, что он был, как было и шоссе, заросшее подорожником и лопухами, но даже если бы этот мальчик принадлежал сну, он затронул мою душу неизмеримо сильнее других людей, чья грубая очевидность не вызывает сомнений…
(4)Тот день начался с маленького чуда: оказалось, низинный ольшаник, примыкающий к даче с севера, сказочно богат грибами свинушками.
(5)Как и всегда бывает во время счастливого грибного промысла, я становился всё разборчивее, меня уже не радовали большие грибы, и я срывал лишь маленькие твёрдые крепыши. (6)Эти разборчивые поиски привели меня в глубь леса. (7)Я хорошо знал окрестность: и со стороны шоссе, и со стороны нашей дачи, и со стороны болота, тянущегося за горизонт, лесные опушки были сплошь ольховые.
(8)Однако чем дальше я шёл, тем плотнее росли деревья, трава стала вполовину моего роста, а стройные, розовые, похожие на свечи цветы вознеслись куда выше моей головы, и было всё труднее пробираться вперёд. (9)И тут я набрёл на этого мальчика, и свершилось главное чудо дня.
(10)Небольшой, худенький, с узким лицом, загороженным круглыми очками, мальчик полол невесть откуда взявшееся заросшее булыжное шоссе.
(11)— Здравствуй, — сказал он.
(12)— Здравствуй, — отозвался я. (13)— А что это за дорога? (14)Я никогда её раньше не видел.
(15)— Не знаю… (16)Ты не хочешь мне помочь?
(17)Я пожал плечами и, нагнувшись, выдрал какое-то длинное растение. (18)Я изрезал ладони, пока, наконец, вырвал его из земли. (19)Да, это была работа! (20)Недаром же у очкастого мальчика руки были в кровяных ссадинах. (21)Мой пыл сразу угас.
(22)— Слушай, а зачем тебе это нужно? — спросил я.
(23)— Ты же видишь, дорога заросла, — он говорил, стоя на коленях и выкапывая из земли какой-то корень. (24)— Надо её расчистить.
(25)— А зачем? — упорствовал я.
(26)Он осторожно снял очки, ему хотелось получше рассмотреть человека, задающего такие несуразные вопросы.
(27)— Если дорога разрушится, она исчезнет, и никто не узнает даже, что тут была дорога.
(28)— Ну и пусть! — сказал я раздражённо. (29)— Она всё равно никуда не ведёт!
(30)— Все дороги куда-нибудь ведут, — сказал он с кроткой убеждённостью и принялся за работу. (31)— Посуди сам, разве стали бы её строить, если б она никуда не вела?
(32)— Но раз её забросили, значит, она не нужна!
(33)Он задумался и даже перестал выдёргивать цветы и травинки, в его глазах появилась боль — так трудно вложить в чужую душу самые простые и очевидные истины!
(34)— Разве мы знаем, почему дорогу забросили?.. (35)А может быть, кто-то на другом конце пробует её расчистить? (36)Кто-то идёт мне навстречу, и мы встретимся. (37)Нельзя дорогам зарастать, — сказал он твёрдо. (38)— Я обязательно её расчищу.
(39)— У тебя не хватит сил.
(40)— У меня одного — нет, но кто-то идёт мне навстречу и, может быть, прошёл уже полпути…
(41)— Далась тебе эта дорога!
(42)— Дорога — это очень важно. (43)Без дороги никто никогда не будет вместе.
(44)— Я буду помогать тебе! — неожиданно для самого себя вскричал я.
(45)— Спасибо, — сказал мальчик искренне. (46)— Приходи сюда завтра утром, сегодня уже поздно, пора домой.
(47)— А где ты живёшь?
(48)— Там!.. — махнул он за чащу, поднялся, вытер ладони пучком травы и пошёл прочь, перепачканный, усталый, тщедушный, непреклонный дорожный строитель, и вскоре скрылся за кустами жимолости.
(49)На другой день ни свет ни заря я устремился в лес.
(50)Я мчался сквозь ольшаник, охваченный жгучим нетерпением и умилённый предвкушением встречи с мальчиком на заросшем шоссе, — его вера уже стала моей верой. (51)Я был уверен, что без труда отыщу шоссе, ведь это так просто: всё прямо и прямо, сквозь ольшаник, в берёзовый лесок, и там обнажится чистая полоска синеватого булыжника…
(52)Я так и не нашёл заброшенного шоссе. (53)Всё было похоже на вчерашнее: и деревья, и травы, и розовые свечи высоких цветов, но не было ни шоссе, ни мальчика. (54)До заката мыкался я по лесу, измученный, голодный, но всё было тщетно.
(55)Мне никогда уже не попадалось ни заброшенное шоссе, ни даже стёжка, что нуждалась в моём труде. (56)Но с годами я по-иному понял наставление мальчика. (57)В моём сердце начиналось много дорог, ведущих к разным людям: и близким, и далёким, и к тем, о ком ни на минуту нельзя забыть, и к почти забытым. (58)Вот этим дорогам был я нужен, и я стал на вахту. (59)Я не жалел ни труда, ни рук, я рвал напрочь чертополох и крапиву и всю прочую нечисть, не давая сорнякам глушить, разрушать дороги, превратить их в ничто. (60)Но если я преуспевал в том, то лишь потому, что всякий раз с другого конца дороги начиналось встречное движение.
(61)Вот только самую главную, важную и нужную дорогу в жизни я как раз не сумел отыскать.
(По Ю. Нагибину)

С вариантами других сочинений можно ознакомиться, перейдя по ссылкам:

сочинение по тексту Захара Прилепина о новогодних подарках

сочинение по тексту С. Мизерова о юношеской мечте.

сочинение по тексту В. Дудинцева «Встреча с берёзой»

сочинение по тексту В.Драгунского «Он упал на траву» (про лопаты)

О текстах, доставшихся одиннадцатиклассникам на экзамене в прошлом году, можно прочитать здесь.

Юрий Нагибин — Старая черепаха читать онлайн

Юрий Маркович Нагибин

Старая черепаха

Вася втянул воздух, округлив ноздри, и до самой глубины его проняло крепким, душным запахом зверя. Он поднял глаза. Над дверью висела небольшая вывеска, на ней пожухлыми от южного солнца красками было выведено: «Зоомагазин». За пыльным стеклом витрины мальчик с трудом разглядел пыльное чучело длинноногой клювастой птицы.

Как плохо мы знаем улицы, по которым ходим изо дня в день! Сколько раз ходил Вася на пляж этой самой улицей, знал там каждый дом, фонарь, каштан, витрину, каждую выщерблину тротуара и выбоину мостовой, и вдруг обнаружилось, что самого главного на этой улице он не приметил.

Но думать об этом не стоит, скорее туда, в этот чудесный, таинственный полумрак…

Мать с привычной покорностью последовала за сыном. Тесный, темный магазин был необитаем, но, словно покинутая берлога, хранил живой, теплый дух недавних жильцов. На прилавке лежала горка сухого рыбьего корма, под потолком висели пустые птичьи клетки, а посреди помещения стоял подсвеченный тусклой электрической лампочкой аквариум, устланный ракушками; длинные, извилистые водоросли, слегка подрагивая, обвивали осклизлый каменный грот. Все это подводное царство было отдано в безраздельное владение жалкому, похожему на кровеносный сосудик мотылю, который тихонько извивался, приклеившись к ребристой поверхности ракушки.

Вася долго стоял у аквариума, словно надеясь, что мертвое великолепие водяного царства вдруг оживет, затем понуро направился в темную глубь магазина. И тут раздался его ликующий вопль:

— Мама, смотри!

Мать сразу все поняла: такой же самозабвенный вскрик предшествовал появлению в доме аквариума с причудливыми рыбками, клеток с певчими птицами, коллекции бабочек, двухколесного велосипеда, ящика со столярными инструментами…

Она подошла к сыну. В углу магазина, на дне выстланного соломой ящика, шевелились две крошечные черепашки. Они были не больше Васиного кулака, удивительно новенькие и чистенькие. Черепашки бесстрашно карабкались по стенам ящика, оскальзывались, падали на дно и снова, проворно двигая светлыми лапками с твердыми коготками, лезли наверх.

— Мама! — проникновенно сказал Вася, он даже не добавил грубого слова «купи».

— Хватит нам возни с Машкой, — устало отозвалась мать.

— Мама, да ты посмотри, какие у них мордочки!

Вася никогда ни в чем не знал отказа, ему все давалось по щучьему велению. Это хорошо в сказке, но для Васи сказка слишком затянулась. Осенью он пойдет в школу. Каково придется ему, когда он откроет, что заклинание утратило всякую силу и жизнь надо брать трудом и терпением? Мать отрицательно покачала головой:

— Нет, три черепахи в доме — это слишком!

— Хорошо, — сказал Вася с вызывающей покорностью. — Если так, давай отдадим Машку, она все равно очень старая.

— Ты же знаешь, это пустые разговоры.

Мальчик обиженно отвернулся от матери и тихо произнес:

— Тебе просто жалко денег…

«Конечно, он маленький и не повинен ни в дурном, ни в хорошем, — думала мать, — надо только объяснить ему, что он не прав». Но вместо спокойных, мудрых слов поучения она сказала резко:

— Довольно! Сейчас же идем отсюда!

Для Васи это было странное утро. На пляже каждый камень представлялся ему маленькой золотистой черепашкой. Морские медузы и водоросли, касавшиеся его ног, когда он плавал у берега, также были черепашками, которые ластились к нему, Васе, и словно напрашивались на дружбу. В своей рассеянности мальчик даже не ощутил обычной радости купания, равнодушно вышел из воды по первому зову матери и медленно побрел за ней следом. По дороге мать купила его любимый розовый виноград и протянула тяжелую гроздь, но Вася оторвал одну только ягоду и ту позабыл съесть. У него не было никаких желаний и мыслей, кроме одной, неотвязной, как наваждение, и, когда они пришли домой, Вася твердо знал, что ему делать.

Днем старая черепаха всегда хоронилась в укромных местах: под платяным шкафом, под диваном, уползала в темный, захламленный чулан. Но сейчас Васе повезло: он сразу обнаружил Машку под своей кроватью.

— Машка! Машка! — позвал он ее, стоя на четвереньках, но темный круглый булыжник долго не подавал никаких признаков жизни.

Наконец в щели между щитками что-то зашевелилось, затем оттуда высунулся словно бы птичий клюв и вслед за ним вся голая, приплюснутая голова с подернутыми роговой пленкой глазами мертвой птицы. По сторонам булыжника отросли куцые лапы. И вот одна передняя лапа медленно, будто раздумывая, поднялась, слегка вывернулась и со слабым стуком опустилась на пол. За ней, столь же медленно, раздумчиво и неуклюже заработала вторая, и минуты через три Машка выползла из-под кровати.

Вася положил на пол кусочек абрикоса. Машка вытянула далеко вперед морщинистую, жилистую шею, обнажив тонкие, также изморщиненные перепонки, какими она прикреплялась к своему панцирю, по-птичьи клюнула дольку абрикоса и разом сглотнула. От второй дольки, предложенной Васей, Машка отвернулась и поползла прочь. В редкие минуты, когда Машке приходила охота двигаться, ее вытаращенные глаза не замечали препятствий, сонным и упрямым шагом, мерно переваливаясь, шла она все вперед и вперед, стремясь в какую-то, ей одной ведомую даль.

Не было на свете более ненужного существа, чем Машка, но и она на что-то годилась: на ней можно было сидеть и даже стоять. Вася потянулся к Машке и прижал ее рукой; под его ладонью она продолжала скрести пол своими раскоряченными лапами. Ее панцирь, состоящий из неровных квадратиков и ромбов, весь словно расшился от старости, на месте швов пролегли глубокие бороздки, и Вася почему-то раздумал на нее садиться. Он поднял Машку с пола и выглянул в окно. Мать лежала в гамаке, ее легкая голова даже не примяла подушки, книга, которую она читала, выпала из ее опущенной вниз руки. Мать спала. Вася спрятал Машку под рубаху и быстро вышел на улицу.

Над поредевшим, полусонным от жары базаром высоко и печально звучал детский голос:

— Черепаха! Продается черепаха!

Васе казалось, что он стоит так уже много-много часов; прямые, жестокие лучи солнца пекли его бедную неприкрытую голову, пот стекал со лба и туманил зрение, каменно-тяжелая Машка больно оттягивала руки. Во всем теле ощущал он томительную, ломящую слабость, его так и тянуло присесть на пыльную землю.

— Черепаха! Продается черепаха!

Вася произносил эти слова все глуше, он словно и боялся и хотел быть услышанным. Но люди, занятые своим делом, равнодушно проходили мимо него; они не видели ничего необычного в том, что для Васи было едва ли не самым трудным испытанием за всю его маленькую жизнь. Если бы вновь очутиться в родном, покинутом мире, где ему так хорошо жилось под верной маминой защитой!

Читать дальше

Сочинение из стобалльной работы 2012 г. (по тексту Ю. Нагибина)

Сочинение

Исходный текст

Уходил Оська на войну в конце октября из опустевшей Москвы. 
Его уже дважды требовали с вещами на призывной пункт, но почему-то отпускали домой. И вот стало точно известно: Оську и его товарищей по выпуску отправляют на восток в трёхмесячное пехотное училище. Он пришёл проститься с моими домашними, потом мы поехали к нему на Мархлевского. Я знал, что он ждёт девушку, пепельноволосую Аню, и хотел попрощаться у подъезда, но Оська настоял, чтобы я поднялся.

 

Когда мы провожали Павлика на действительную, он разделил между нами свои скромные богатства. Павлика не баловали дома и растили по-спартански. Правда, в восьмом классе ему сшили бостоновый костюм «на выход», и Павлик проносил его до армии, время от времени выпуская рукава и брюки, благо запас был велик. Но у него имелся дядя, выдающийся химик, и однажды этого дядю послали на международную научную конференцию за кордон, что в ту пору случалось нечасто. В пожилом, нелюдимом, обсыпанном перхотью, запущенном холостяке, по уши закопавшемся в свою науку, таилась душа пижона. По окончании конференции он потратил оставшиеся деньги на приобретение жемчужно-серых гетр — тогдашний крик моды, смуглой шёлковой рубашки, двух свитеров, роскошного галстука и тёмных очков, почти не встречавшихся в Москве. Но, вернувшись домой, он понял, что наряжаться ему некуда, поскольку ни в театр, ни в гости, ни на балы он не ходил, а таскать на работу столь ослепительные вещи стыдно, да и непрактично: прожжешь химикатами, и тогда он вспомнил о юноше-племяннике, и на скромного Павлика пролился золотой дождь.

 

Ко времени его ухода в армию вещи малость пообносились, утратили лоск, но все же мы с Оськой были потрясены до глубины души, когда Павлик царственным жестом передал нам свои сокровища. От костюма пришлось отказаться — по крайней ветхости, остальное мы поделили: Оська забрал дымчатые очки, я сразу напялил гетры. Оська взял галстук с искрой, я — рубашку, каждому досталось по свитеру. Теперь Оське ужасно хотелось повторить мужественный обряд прощания, когда без соплей и пустых слов товарищу отдается всё, чем владеешь на этом свете. Но сделать это Оське оказалось куда сложнее, нежели Павлику: фотоаппарат он подарил герою фотосерии «Московский дождь», библиотеку вывезла мать, а картины — отец. Оставались предметы домашнего обихода, и Оська совал мне рефлектор, электрический утюг, кофемолку, рожок для надевания туфель, пилу-ножовку и две банки горчицы; от испорченной швейной машинки я отказался — не донести было всю эту тяжесть; еще Оська навязал мне лыжные ботинки и траченную молью шапку-финку, суконную, с барашковым мехом.

Может показаться странной и недостойной эта барахольная возня перед разлукой, скорее всего навечной, ничтожное копанье в шмотье посреди такой войны. Неужели не было о чём поговорить, неужели не было друг для друга серьёзных и высоких слов? Все было, да не выговаривалось вслух. Нас растили на жестком ветру и приучили не размазывать по столу масляную кашу слов. А говорить можно и простыми, грубыми предметами, которые «пригодятся». «Держи!..» — а за этим: меня не будет, а ты носи мою шапку и ботинки и обогревайся рефлектором, когда холодно… «Бери кофемолку, не ломайся!» — это значит: а хорошая у нас была дружба!.. «Давай, чёрт с тобой!» — а внутри: друг мой милый, друг золотой, неужели это правда, и ничего больше не будет?.. «На дуршлаг!» — но ведь было, было, и этого у нас не отнимешь. Это навсегда с нами. Значит, есть в мире и останется в нём…

                                                                                                                                                                                               (По Ю. Нагибину)

 

Сочинение 

Внимание:

В работе полностью сохранены стиль, орфография и пунктуация автора 

 

Существует много способов выразить свои чувства. Можно сказать о них, а можно подарить какую-то вещь, нужную или не очень нужную. В этом тексте Юрий Нагибин рассказывает о том, как ребята в 1941-м году провожали друг друга на войну. Переломный момент истории. Переломный момент в жизни друзей. Прощание, может быть, навсегда… Как выражаются высокие человеческие чувства? Эта проблема волнует писателя.

Бывают такие ситуации, когда слова не нужны. Автор показывает, как чувства могут выражаться в простых бытовых поступках или скрываться в самых обыденных вещах, например, в подаренных лыжах, кофемолке и рефлекторе.

Авторская позиция выражается в следующих словах: «Нас растили на жестком ветру и приучили не размазывать по столу масляную кашу слов». 

Я согласна с автором в том, что слова порой бывают бессмысленными. Нередко поступок намного красноречивее слов. Иногда на человека могут нахлынуть такие чувства, которые нужно пережить самому, ничего не говоря о них другим людям, даже самым близким. Таковы эмоции друзей, прощающихся перед уходом на войну, знающих, что, возможно, они видят друг друга в последний раз. К чему тут слова? 

О том, что слова не в состоянии передать сложную гамму чувств, размышляли многие писатели. Например, В. Жуковский посвящает этой проблеме стихотворение «Невыразимое»:

Всё необъятное в единый вздох теснится,
И лишь молчание понятно говорит.

Ф. Тютчев в стихотворении «Silentium!» провозглашает: «Мысль изреченная есть ложь…» Поэту знакомо состояние невысказанности, когда высокие чувства, надежда, мечты ощущаются присутствующими в полной мере. В переломные минуты жизни, а именно такие минуты и переживают молодые герои Ю. Нагибина, неудачное слово или неискренняя интонация могут только все испортить. И герои избегают высоких слов. Главное для них не красивые слова, а теплые, искренние и очень прочные отношения, которые их связывают.

«Неужели не было о чем поговорить, неужели не было друг для друга серьезных и высоких слов? Все было, да не выговаривалось вслух». Были  чувства, они остались в мире. Встретившись с настоящими чувствами в нашей сегодняшней жизни, мы поймем их без слов. 

Оценка работы

Критерий За что начисляются баллы? Максимально В данном
сочинении
Итого
К1 Формулировка проблемы исходного текста 1 есть 1
К2 Комментарий к проблеме 2 есть 2
К3 Отражение позиции автора 1 есть 1
К4 Своё мнение и его аргументация 3 есть 3
К5 Смысловая цельность, связность,
последовательность изложения
2 есть 2
К6 Точность и выразительность речи 2 есть 2
К7 Орфография 3 0 ошибок 3
К8 Пунктуация 3 0 ошибок 3
К9 Соблюдение языковых норм 2 0 ошибок 2
К10 Соблюдение речевых норм 2 0 ошибок 2
К11 Соблюдение этических норм 1 есть 1
К12 Фактологическая точность 1 есть  1
   Всего: 23   23

 

Практикум

Мы не предлагаем на этот раз искать в работе ошибки. Эксперты высоко оценили сочинение, выставив за работу 23 исходных балла. Работа полностью соответствует «Критериям оценивания».

— Понравилась статья?:)

Facebook

Twitter

Мой мир

Вконтакте

Одноклассники

Google+

В ЗАМОЧНУЮ СКВАЖИНУ — АЛЕКСАНДР НАГИБИН

Через замочную скважину Продолжаем рассказ об Александре Нагибине из отдела маркетинга. Дружелюбный гигант, которым является Алекс, руководит успешным отделом маркетинга, и вы будете регулярно видеть его на турнирах, а также вести нас через жеребьевку соревнований.

Начал заниматься дзюдо в 1977 году в Ангарске, недалеко от монгольской границы; Алекс сразу же занялся спортом, что положило начало карьере в боевых искусствах на всю жизнь.Через несколько лет он переехал на запад, в Кирово-Чепецк, и в 1980–1983 годах стал победителем и призером всероссийских и всесоюзных юношеских турниров.

Вырез из газеты 1987 года.

Вскоре Алекс снова отправился в путь, на этот раз еще дальше на запад, в Киев, и, не отказываясь от своих боевых чувств, участвовал во многих украинских турнирах, включая чемпионаты, где он был постоянным призером вместе с тогдашним… Всесоюзные турниры. Примерно в это же время он проявил свой соревновательный характер в Болгарии и Венгрии, где у него снова не было проблем с получением медалей.

 Многим известен киевский клуб дзюдо «Спартаковец», который на сегодняшний день является одним из самых впечатляющих и успешных клубов, выпускающим чемпионов, в котором работают такие тренеры, как Геннадий Билодид. В 1991 году для СССР наступило критическое время, так как в конце года был подтвержден распад Советского Союза, но это также стало знаменательным событием для Алекса, поскольку он стал соорганизатором «Спартаковца».

На сегодняшний день это одна из самых известных и результативных в подготовке медалистов по дзюдо в мире, эта спортивная школа своим тренерским составом кладет в копилку сборной Украины множество медалей с лучших европейских и мировых соревнований по дзюдо . Безусловно, яркими звездами этой школы являются чемпионы мира и Европы Георгий Зантарая и Дарья Билодид.

Чемпионат мира по дзюдо среди мастеров, 2002, Лондондерри.

Чемпионат мира по дзюдо среди ветеранов, 2002, Лондондерри.


Помимо успешного выступления на соревнованиях, Алекс также стал личным тренером Марины Прищепы, серебряного призера чемпионатов мира и многократной обладательницы титула чемпиона Европы.

Его организаторские способности были рано признаны и, начиная с 1994 года, помогли Украинской федерации дзюдо и ЕСД организовать более 20 турниров, включая кадетские и юношеские кубки Европы.Благодаря этому особому таланту он получил множество наград и должностей; в 2005 г. возглавил оргкомитет чемпионата Европы до 23 лет в Киеве; удостоен награды «Лучшее организованное мероприятие 2005 года» на Конгрессе ЕСД; был главой Организационного комитета второго чемпионата мира среди кадетов в Киеве в 2011 году и, в свою очередь, был награжден «Специальной наградой за ваш вклад в развитие мирового дзюдо» от Международной федерации дзюдо.

Алекс получает свою специальную награду IJF от президента IJF Мариуса Визера.

С 2006 года Алексей занимал должность вице-президента Федерации дзюдо Украины, занимаясь организацией тренерских и судейских семинаров, контролем за организацией чемпионатов Украины и общим бизнесом.

В течение последних девяти лет EJU посчастливилось иметь Алекса в качестве члена нашей собственной семьи. В 2011 году он стал комиссаром по маркетингу, а год спустя был быстро повышен до директора.

В мои обязанности входит маркетинг мероприятий, работа с отделом дизайна, а также специальные проекты EJU.Я был руководителем проекта «Вызов героев дзюдо», «Командный вызов дзюдо» и «Фестиваль дзюдо». Сегодня основное внимание уделяется программе EJU Spectator и семейному фан-лагерю дзюдо. Я горжусь тем, что работаю в нашей профессиональной команде, получая бесценный опыт от общения с коллегами.

Упорная работа во время фестиваля дзюдо.

Опыт дзюдо на протяжении всей нашей жизни может быть очень разным, как он формирует нас как людей, наши взгляды и то, как мы взаимодействуем. Это также может быть очень сложной карьерой из-за путешествий и необходимости иметь личное время.Алексей, похоже, это, как и все остальное, освоил.

Всю свою жизнь я занимался дзюдо, пройдя все уровни этого гибкого пути, от спортсмена, тренера, организатора и теперь до члена Исполнительного совета и директора по маркетингу Европейского союза дзюдо. В моей семье все дзюдоисты, жена Александра (Ракитянская) — неоднократный победитель первенств СССР среди юниоров и бронзовый призер чемпионатов мира среди студентов. Потом моя дочь Настя – мастер спорта, моя семья поддерживала меня всю жизнь.

Работа вместе с коллегами; Спортивный директор г-н Вислав Блах и помощник вице-президента по образованию г-жа Кармен Кальво.

Благодаря преданности и любви к нашему виду спорта, это наш образ жизни, поэтому последствия пандемии Covid-19 были катастрофическими. Алекс чувствовал это во всех отношениях, но знает, что сообщество дзюдо достаточно сильно, чтобы выстоять,

Это великое бедствие пришло сейчас в наш мир, и все, что нам нужно сейчас, это держаться вместе, помогать друг другу; IJF, Континентальные союзы дзюдоистов, все великие дзюдоисты работают изолированно, не только работают самостоятельно, но и помогают всем любителям дзюдо посредством своих видеоуроков. Мы большая дзюдоистская семья и никогда об этом не забудем.

Хотя 2020 год стал трудным для сообщества дзюдоистов, он имеет большое значение для Алекса, поскольку он получил свой 8-й дан IJF.

Автор: Тея Коуэн


Поделиться Твитнуть Телеграмма WhatsApp E-Mail

ShRNA-индуцированный нокдаун биоинформатически предсказываемой мишени IL10 влияет на функциональные параметры у крыс со спонтанной гипертензией, больных астмой

Abstract

Одной из наиболее частых коморбидных патологий является астма и артериальная гипертензия.Для экспериментального моделирования коморбидности мы использовали крыс со спонтанной гипертонией и овальбуминовой (OVA)-индуцированной астмой. Крысы были случайным образом разделены на три группы: контрольная группа, группа с OVA-индуцированной астмой; Группа, индуцированная OVA + интерференция кшРНК IL10. Ген-мишень ( IL10 ) был предсказан ANDSystem. Мы продемонстрировали, что РНК-интерференция ИЛ-10 влияет на сердечно-сосудистую систему (испытано с помощью микрокатетерной системы Миллара), а также на дыхательную функцию (испытано с помощью метода силовых колебаний, Flexivent) у крыс.Нами показано, что при РНК-интерференции IL10 гена in vivo происходили изменения показателей как сердечной, так и легочной функции. Эти изменения показателей сердечно-сосудистой системы можно охарактеризовать как положительные. Но более интенсивная нагрузка на сердце может привести к истощению и декомпенсации сердечной деятельности. Нокдаун гена IL10 при моделировании астмы вызывает ряд положительных сдвигов в респираторных функциях астматических животных в виде снижения эластичности и повышения податливости легких, а также менее выраженных патоморфологических изменений в легочной ткани.Таким образом, мы приводим данные об экспериментально подтвержденных изменениях функциональности мишени in silico , которая, по прогнозам, связана как с астмой, так и с гипертонией – в нашей новой экспериментальной модели коморбидной патологии.

Ключевые слова: астма, артериальная гипертензия, коморбидная патология, ИЛ10

находится в центре внимания многих исследователей во всем мире [4].Одним из наиболее частых сочетаний хронических заболеваний является бронхиальная астма и артериальная гипертензия [5] или другая сердечно-сосудистая патология [6], [7]. Это неудивительно, поскольку современное понимание воспаления выходит за рамки классического представления об этом патологическом процессе как ответе на инфекцию и травмы, а в настоящее время установлена ​​значимость малоинвазивного хронического воспаления в патогенезе невоспалительных заболеваний (например, атеросклероза, метаболических синдром, артериальная гипертензия, ожирение) в настоящее время установлено [8], [9], [10], [11], [12], [13].

Основной проблемой коморбидности в поликлиниках является неблагоприятный прогноз. Следующим важным моментом является полипрагмазия: пациенты с двумя и более патологиями должны получать одновременно большое количество препаратов, что приводит к сочетанию побочных эффектов. Таким образом, важно найти молекулярные мишени, которые можно использовать для проспективного лечения обоих заболеваний одним препаратом. Биоинформатические подходы в этой ситуации оптимальны, учитывая огромный объем разнородных данных для анализа. В нашей предыдущей статье мы использовали ANDSystem для реконструкции и анализа генных сетей, связанных как с астмой, так и с гипертонией [14].Сеть генов астмы включала 755 генов/белков и 62603 взаимодействия, а сеть генов гипертонии – 713 генов/белков и 45479 взаимодействий. Согласно этим данным, гены, кодирующие интерлейкин-10 (IL10), Toll-подобный рецептор 4 (TLR4) и каталазу (CAT), имеют наивысший приоритет в развитии коморбидности бронхиальной астмы и артериальной гипертензии.

В текущем исследовании мы продемонстрировали влияние нокдауна IL10 на развитие экспериментальной коморбидности астмы и гипертонии.РНК-интерференция IL10, гена, предсказанного ANDSystem, влияет на сердечно-сосудистую и респираторную функции у крыс со спонтанной гипертензией и астмой, вызванной овальбумином.

2. Методы

2.1. Животные

Все процедуры соответствовали критериям, техническим стандартам и правам, применимым к исследованиям на животных. Все испытания проводились в соответствии с положениями Европейского Союза относительно обращения с экспериментальными животными. Это исследование соответствовало законам и рекомендациям местного этического комитета по исследованиям на животных.

Крысы-самцы со спонтанной гипертензией (SHR) в возрасте 4–5 месяцев (масса тела 300–350 г), использованные в нашем исследовании, были приобретены у компании «Charles River Laboratories». До экспериментов крыс содержали в виварии в стандартных лабораторных условиях в течение 3 мес при свободном доступе к пище и воде. Гипертензивный статус подтверждали путем измерения артериального давления с помощью неинвазивного монитора артериального давления Mouse-Rat – CODA (Kent Scientific, США) до начала экспериментов.Все измерения проводились после 10-минутного содержания нестрессированного животного в специальной клетке. В эксперимент брали только животных с систолическим давлением 190,1±17,62 мм рт.ст. и диастолическим давлением 133,7±22,7 мм рт.ст. Крыс случайным образом разделили на три группы: контрольная группа, группа астмы, индуцированной овальбумином (OVA) + группа плазмиды, продуцирующей скремблированные кшРНК; OVA-индуцированная астма + группа интерференции плазмиды, продуцирующей кшРНК против IL10. В каждую группу входило по семь крыс.

2.2. Модель астмы, индуцированной овальбумином

Мы создали модель астмы по методике Li и Vanacker [15], [16] с некоторыми модификациями.Крыс сенсибилизировали внутрибрюшинной инъекцией 1 мг OVA (S7951, Sigma-Aldrich, США), адсорбированного на 0,3 мл Al(OH) 3 в качестве адъюванта (гель гидроксида алюминия, коллоидная суспензия, Serva, Германия) в общем объеме. 0,8 мл стерильного физиологического раствора в 1-й и 8-й дни. Затем, начиная с 15-го дня, крыс интраназально заражали 100 мкл 1% OVA (в физиологическом растворе) один раз в день в течение 7 дней. Контрольную группу лечили только инъекциями физиологического раствора и интраназальным введением физиологического раствора.Эвтаназию (1,5 г/кг уретана, внутрибрюшинно) проводили через 1 день после последней интраназальной доставки.

2.3. Конструирование кшРНК-экспрессирующего вектора

. Последовательность

кшРНК, комплементарная сайту на мРНК IL10, была разработана in silico центром siDESIGN Center (Dharmacon, Horizon Discovery Group Co). Мы использовали алгоритм BLAST (NCBI NIH, США) для проверки его на неспецифическое связывание. Для последовательности РНК из 21 нуклеотида мы создали смысловые и антисмысловые олигонуклеотиды из 55 нуклеотидов, разработанные в соответствии с рекомендацией pSilencer 4.Набор 1-CMV neo vector (Ambion, ThermoFisher Scientific, США) с сайтами рестрикции для HindIII и BamHI для получения липких концов. Эти олигонуклеотиды были синтезированы фирмой Metabion, Германия. Последовательности обоих олигонуклеотидов представлены в . Два олигонуклеотида отжигали, а затем сразу лигировали в вектор pSilencer 4. 1-CMV neo (Ambion, ThermoFisher Scientific, США). Лигированной смесью трансформировали химически компетентные клетки XL E. coli . Отдельные колонии из твердой агаризованной среды LB культивировали в бульоне LB в течение ночи.До 5 мг плазмидной ДНК очищали с помощью набора GeneJet Miniprep Kit (ThermoFisher Scientific, США) из каждой колонии для скрининга трансформантов с успешным лигированием. Лигирование подтверждали рестрикционным анализом с HindIII и EcoRI и дальнейшим анализом электрофореза. Подтвержденные колонии культивировали для очистки вектора кшРНК до размера препарата. С помощью набора GeneJet Maxiprep Kit получали до 1 мг пДНК, которую растворяли в стерильной деионизированной воде без эндотоксинов (ThermoFisher Scientific, США) и готовили к дальнейшим экспериментам.Та же самая процедура была выполнена для скремблированной плазмиды, кодирующей shRNA.

Таблица 1:

Последовательности смысловых и антисмысловых олигонуклеотидов.

2.4. Интерференция РНК

Для нокдауна IL10 in vivo 100 мкг плазмиды, экспрессирующей кшРНК против IL10, вводили крысам через хвостовую вену на 15 -й день после первой инъекции OVA. Такую же дозу скремблированной плазмиды вводили крысам контрольной группы.

Эффективность РНК-интерференции измеряли с помощью ПЦР в реальном времени в ткани сердца.

2.5. Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК выделяли с реагентом Trizol (Invitrogen, США). Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies Inc, США). кДНК синтезировали из 5 мкг тотальной РНК методом обратной транскрипции с 10 мМ Tris-HCl (рН 9,0), 5 мМ MgCl 2 ; 1 мм дНТФ; 20 ед. Ribo-Lock, случайные гексамерные праймеры (0,5 мкг/мкл) и 200 ед. RevertAid H без обратной транскриптазы M-MuLV.ПЦР проводили на приборе Applied Biosystems 2700, PerkinElmer, США. Экспрессию гена IL-10 (Custom TaqMan ® Gene Expression Assays, Rn01483988_g1) определяли с помощью TaqMan ® Gene Expression Assay («Applied Biosystems», США). Пары прямых и обратных праймеров для вышеуказанных генов и зонды TaqMan для целевых мРНК были сконструированы на основе последовательности мРНК крысы компанией Applied Biosystems (США). Экспрессию гена в каждом зонде нормализовали с помощью GAPDH с использованием контрольного реагента TaqMan Rodent GADPH (VIC™Probe, номер партии 0608014).Термические циклы ПЦР-амплификации были следующими: начальная стадия денатурации при 95 °C в течение 20 с, затем 60 циклов обработки при 95 °C в течение 3 с и при 60 °C в течение 30 с с использованием 7500 Fast Real-time PCR. (Applied Biosystems, США). Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения 7500 Fast Real-time PCR Software.

2.6. Анализы гемодинамики

Оценку параметров гемодинамики проводили, как описано ранее [17]. Кратко: крыс анестезировали уретаном (1.5 г/кг внутрибрюшинно), фиксировали и отсекали правую сонную артерию. Сверхмалый катетер 2F (Millar Instruments, США) вводили ретроградно через правую сонную артерию и одновременно регистрировали сигналы давления и объема в левом желудочке в течение сердечного цикла с визуализацией P-V кривых. Регистрацию кардиодинамических показателей проводили в двух режимах: в исходном состоянии и при временной окклюзии брюшной полой вены (в течение 7–10 с). Регистрировали следующие кардиогемодинамические параметры: частоту сердечных сокращений (ЧСС), конечно-систолическое давление (КСД), конечно-диастолическое давление, конечно-систолический объем левого желудочка (КСО), конечно-диастолический объем левого желудочка (КДО). ), ударный объем, сердечный выброс, фракция выброса, dP/dt max, dP/dt min, dV/dt max, dV/dt min и PdVdt max. Эффективную эластичность артерий, определяемую по данным Sunagawa, рассчитывали как отношение ВСД, полученного по кривой давление-объем в исходном состоянии, к ударному объему.Соотношение давления и объема в левом желудочке анализировали с помощью программы PVAN 3.6 (Millar Instruments, Gulf Fwy, Houston, USA) с переводом относительных единиц объема (RVU) в абсолютные единицы объема (мкл) с использованием данных, полученных во время процедура калибровки, выполненная в соответствии с формулой рекомендаций производителя (наклон 20,25 × RVU-пересечение 29,05).

2.7. Оценка функции дыхательных путей

Измерения сопротивления и податливости дыхательной системы проводились с использованием аппарата ИВЛ SciReq FlexiVent (Scireq, Монреаль, штат Калифорния, Канада). Вкратце, через 24 ч после последней провокации животных анестезировали (уретан, 1,5 г/кг), трахеотомировали ( 19Fr тупоконечная канюля Люэра ) и подключали к аппарату искусственной вентиляции легких. Животных содержали при температуре 37 °С и в условиях мышечного паралича (Атракуриум-Ново, НовоФарм Биосинтез, Украина). Заражение аэрозолем проводили после четырех последовательных базовых измерений с использованием растворов 4, 8, 16, 32 или 64 мг/кг метахолина (MCh, A2251, Sigma-Aldrich, США) или физиологического раствора (в качестве контроля). Все указанные растворы подавались в течение 60 с с помощью ультразвукового небулайзера (Aeroneb Pro, ANP-1100, Aerogen Ltd, Ирландия) через инспираторный порт респиратора.Перед каждой доставкой две фазы вдоха накладывались друг на друга для стандартизации истории объема. Измерения начинались через 20 с после завершения каждого аэрозольного воздействия, и в течение каждых 20 с производилось восемь последовательных записей. Следующую дозу вводили через 60 с после последней записи. Сопротивление (см H 2 O*s/мл) и податливость дыхательной системы (Crs, мл/см H 2 O) рассчитывали с использованием программного обеспечения FlexiWare 7.4 (Scireq, Монреаль, PQ, Канада).

2.8.Измерение цитокина IL4 в CD4

+ Клетки в бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛ)

После введения катетера в трахею легкие животного промывали 1,5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (Invitrogen, США) [18]. ]. Лаважную жидкость центрифугировали при 250 g в течение 3 мин, осадок клеток ресуспендировали в 1,5 мл RPMI (Invitrogen) и подсчитывали общее количество клеток под микроскопом (Olympus, Япония). Затем клетки были флуоресцентно помечены для проточного цитометрического анализа, чтобы определить процент хелперов T2 в ЖБАЛ.Прежде всего образцы инкубировали в RPMI 1640 в течение 4 ч с иономицином (1 мкг/мл), брефельдином-А (10 мкг/мл) и 25 нг/мл форбол 12-миристат-13-ацетатом (все от Sigma, St. Луис, Миссури, США). Клетки промывали PBS, осадки ресуспендировали в 100 мкл PBS и окрашивали анти-CD4, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (554837, Becton Dickinson, Сан-Диего, Калифорния, США) в течение 30 мин. Клетки лизировали (Lysing Solution, BD Biosciences), пермеабилизировали (Permeabilizing Solution, BD Biosciences) и окрашивали mAb, конъюгированными с флуорохромом.Осадок клеток ресуспендировали в PBS и окрашивали анти-CD4, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (554837, Becton Dickinson, Сан-Диего, Калифорния, США), и анти-IL4, конъюгированным с R-фикоэритрином (555082, Becton Dickinson, San Diego, США). Калифорния, США) антитела. Образцы окрашивали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Затем клеточные суспензии центрифугировали, а клеточные осадки ресуспендировали в PBS, содержащем азид натрия и параформальдегид. Затем клетки анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, США) с программным обеспечением CellQuest (BD Biosciences, США) [19].

2.9. Морфологический анализ

Для световой микроскопии образцы легких фиксировали в 10% забуференном формалине, готовили парафиновые срезы толщиной 5 мм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Окрашенные H&E срезы тканей исследовали под световым микроскопом с помощью микроскопа Nikon Eclipse E200 и камеры Nikon DS-SI 1 и анализировали с использованием программного обеспечения ImageJ. Морфометрические измерения проводили в образцах ткани легких пяти крыс из каждой экспериментальной группы (в 10 непересекающихся полях микроскопа для каждой крысы).Площадь содержания инфильтратов измеряли при увеличении х100 для каждого образца и выражали в процентах по отношению к площади стандартной измерительной рамки.

Структурные изменения в стенках бронхиол разного размера анализировали, как описано ранее [20]. На основании измеренных значений длины базальной эпителия (Pbm), периметр наружной границы гладкой мускулатуры (Pmo), наружный адвентициальный периметр (Po) и площади, определяемые этими параметрами (Abm – площадь базальной мембраны, Amo – наружная мышечная площадь и Ao – наружная часть дыхательных путей). площадь).Исследуемые дыхательные пути в каждой экспериментальной группе крыс были разделены на две категории по длине их базальной мембраны: Pbm < 1 мм (малые), 1 мм ≤ Pbm < 2 мм (средние). Для анализа морфометрических измерений значения WAt, WAi, WAo нормировали на Pbm.

2.10. Статистический анализ

Все данные были проверены на нормальность распределения с использованием критерия нормальности Шапиро-Уилка. Различие между группами оценивали с помощью критерия суммы рангов Крускала-Уоллиса.Результаты считались статистически значимыми, если p < 0,05. В случаях, когда сравнивали более двух групп, следовали критерий множественных сравнений Крускала-Уоллиса и нулевая гипотеза отклонялась, если p ≤ 0,025.

3. Результаты

3.1. Изменения экспрессии мРНК при подавлении IL10

Внутривенная инъекция IL10 -специфичной экспрессирующей кшРНК плазмиды вызывала 28,6-кратное снижение уровня мРНК IL10 в тимусе и в 5. 3-кратное увеличение в тканях селезенки ( p <0,05) по сравнению с перемешанной плазмидой, экспрессирующей shRNA (1).

Относительный уровень экспрессии мРНК IL10 в ткани тимуса (A) и ткани селезенки (B) в контрольной группе SHR, в группе SHR с астмой, индуцированной OVA + скремблированная кшРНК, и в группе SHR с астмой, индуцированной OVA + инъекция кшРНК IL10 ( n = 7 на группу). * Достоверная разница по сравнению с контролем SHR, p < 0,05. # Значительная разница по сравнению с SHR с группой OVA-индуцированной астмы + скремблированной кшРНК, p < 0.05.

3.2. Изменения кардиогемодинамических показателей

Основные параметры функции сердца, оцениваемые с помощью микрокатетеризации левого желудочка, представлены на рис. У крыс с OVA-индуцированной астмой достоверно ниже, чем в контроле, были следующие показатели: частота сердечных сокращений, максимальный объем, минимальный объем, конечно-систолический объем, конечно-диастолический объем, Tau_w, но при этом основные параметры насосной функции были ниже. выше – ударный объем (на 27%, р < 0.05) и фракции выброса (на 63%, р < 0,05). У крыс, получавших анти- IL10--кшРНК-экспрессирующую плазмиду, наблюдалась разница тех же показателей с более выраженным повышением ударного объема (на 45%, p < 0,05) и фракции выброса (на 76%, p < 0,05). ). При этом сердечный выброс (на 17%, p < 0,05), ударная работа (на 1,9 раза, p < 0,05), максимальная мощность (на 1,83 раза, p < 0,05) и основной показатель сократимости Эмакс (на 3.в 1 раз, p < 0,05) были значительно выше в этой группе по сравнению с контрольными крысами. Нокдаун гена IL10 при моделировании астмы в SHR вызывал снижение эластичности артерий на 34% ( p < 0,05), что свидетельствовало о снижении резистентности артериальных сосудов. Время диастолического расслабления (Tau_w) сердца у этих животных также было снижено (на 34% по сравнению с контролем, p < 0,05).

Таблица 2:

Сердечно-сосудистые параметры контрольных крыс, крыс с астмой, индуцированной OVA, и крыс с астмой, индуцированной OVA, с интерференцией РНК IL-10.

1 A 93.0.01

9023 9

2

94,2 ± 2,79 991.73
Параметр управления Ова индуцирован ASTHMA ОВА-индуцированная астма + IL-10 РНК интерференции
частота сердечных сокращений (ударов / мин) 397,4 ± 1,51 294,5 ± 48,96 315.6 ± 21.89 A
Максимальный объем (мкл) 586,4 ± 24. 03 450,7 ± 24.03 450,7 ± 24.03 A 482.7 ± 81.79 A
Минимальный объем (мкл) 399.8 ± 23.01 248.1 ± 100,0 98.1 ± 100,0 211.2 ± 66.15 A
Конец систолический объем (мкл) 415,9 ± 18.74 271,9 ± 105.36 A 237,3 ± 74.33 A
Конец диастолического объема (мкл) 565,7-25538 5657 423,7 ± 82,09 A 453,9-1137 453,9-1137 453,9-1137
Конечное систолическое давление (ММГГ) 110,5 ± 4. 17 10237 109.6 ± 20.99 102.8 ± 21.23
Объем удара (мкл) 186,6 ± 7,01 236,3 ± 51,61 236,3 ± 51,61 A 271,5 ± 78.02 A
Фракция выброса (%) 31.9 ± 1,49 52,3 ± 16,0 52,3 ± 16,0 A 56. 2 ± 6.61 A
Выход сердца (мл / мин) 74,2 ± 2.79 70.7 ± 17.31 86.86 ± 30.199 A
Инсульт (мм рт.ст./мкл) 13430.11 ± 1337,55 17635,03 ± 8629,781 25994,59 ± 12651,43 а, б
артериальная эластичность (мм рт.ст. / мкл) 0,59 ± 0,032 0,50 ± 0,13 0,39 ± 0,074 а, б
DPDT макс (мм рт. ст. / с) 5790,3 ± 221,40 8287,1 ± 4636,45 14102,7 ± 5770,27
DPDT мин (мм рт.ст. / с) -6640,8 ± 146,81 -5640,5 ± 1786,94 −6170.3 ± 791.73
Tau_w (MS) 15,8 ± 0,92 10,4 ± 1,91 A 9,97 ± 1,59 A
Tau_g (MS) 13,8 ± 0,35 16,3 ± 5,74 18,8 ± 6,87
Максимальная мощность (мВт) 89,6 ± 13,76 112,2 ± 61,35 164,3 ± 73,81
Emax 2,79 ± 0,29 8,02 ± 7,28 8 . 77 ± 5,45 а

3.3. Изменения функции дыхательных путей

У контрольных крыс исходное сопротивление составляло 0,21 ± 0,036 и незначительно увеличивалось при применении метахолина с 0,43 ± 0,041 до 1,67 ± 0,077 см H 2 О*с/мл (A). В группе OVA-индуцированной астмы исходная резистентность была в 3,8 раза выше ( p < 0,05) по сравнению с этим показателем у контрольных животных и повышалась в большей степени при применении метахолина с 0,81 ± 0,092 до 1,44 ± 0.083 с максимальными различиями при лечении метахолином в дозах 0 и 4 мг/кг – в 1,9 и 1,4 раза соответственно (А; р < 0,05). Исходная резистентность была в 2,6 раза выше по сравнению с контролем ( p <0,05) в группе астмы + интерференция кшРНК IL10, но она была значительно ниже по сравнению с группой астмы. При стимуляции метахолином резистентность возрастала с 0,75 ± 0,035 до 1,17 ± 0,071 с разницей в дозах метахолина 8 и 32 мг/кг – 1.в 5 раз выше и на 19% ниже соответственно по сравнению с группой OVA-индуцированной астмы (А).

Изменения сопротивления дыхательных путей (A) и растяжимости (B) у контрольных крыс SHR (◇), моделирование астмы, индуцированной OVA (■), и астмы, индуцированной OVA + интерференция кшРНК IL10 (△) при провокации метахолином. Значения являются средними значениями ± стандартная ошибка ( n = 7 на группу). * Достоверная разница по сравнению с контрольной группой, p < 0,05. # Достоверная разница между астмой и группой интерференции кшРНК IL10, p < 0.05.

Растяжимость дыхательной системы (Crs) у контрольных крыс была в 4 раза ( p < 0,05) выше по сравнению с группой OVA-индуцированной астмы и снизилась с 0,2 ± 0,012 до 0,08 ± 0,007 мл/мм вод.ст. 2 О (Б). В группе OVA-индуцированной астмы Crs снизился с 0,06 ± 0,004 до 0,04 ± 0,003 в метахолиновом тесте с максимальными различиями в дозах метахолина 0, 4, 16 и 32 мг/кг ( p < 0,05). РНК-интерференция значительно влияла на исходный уровень Crs по сравнению с группой OVA-индуцированной астмы (0. 11 ± 0,009 и 0,06 ± 0,005 соответственно, р < 0,05). Во время провокации метахолином Crs снижался в группе астмы + интерференции кшРНК IL10 более заметно, чем в группе астмы, индуцированной OVA (с 0,1 ± 0,008 до 0,06 ± 0,004). Значимые различия были определены в дозах метахолина 0 и 32 мг/кг по сравнению с группой OVA-индуцированной астмы ( p <0,05).

Таким образом, нокдаун гена IL10 предотвращает вызванные астмой негативные изменения исходных показателей резистентности и комплаентности и улучшает снижение комплаентности при экспериментальной бронхоконстрикции (применение метахолина).

3.4. Процент Т-хелперов 2 в ЖБАЛ

При моделировании OVA-индуцированной астмы количество популяции Т-хелперов 2 в ЖБАЛ было увеличено в 2,5 раза ( p < 0,05) по сравнению с контролем (). У крыс с РНК-интерференцией IL10 процент присутствия Т-хелперов 2 в ЖБАЛ был несколько ниже по сравнению с группой с OVA-индуцированной астмой ( p > 0,05).

Процент Т-хелперов 2 лимфоцитов в ЖБАЛ у контрольных крыс SHR, моделирование астмы, индуцированной OVA, и индуцированная OVA астма + интерференция кшРНК IL10 ( n = 7 на группу).Достоверная разница по сравнению с контрольной группой, p <0,05.

3.5. Морфология

Срезы легких контрольных крыс преимущественно демонстрировали нормальную гистологическую структуру легких, эти образцы имели только тонкие межальвеолярные перегородки. Стенка бронхиол оконтурена однослойным мерцательным кубическим эпителием и тонким слоем гладкомышечных волокон (). Однако в некоторых образцах локально наблюдалось незначительное утолщение межальвеолярных перегородок и незначительные перибронхиальные инфильтраты, что можно объяснить ранними проявлениями гипертензии у исследуемых крыс линии (SHR).

Микроскопия срезов легких контрольной крысы с нормальной легочной архитектоникой. Обозначены альвеолы ​​(А), бронхиолы (В) и кровеносные сосуды (bv), ×100.

В срезах легких крыс с OVA-индуцированной астмой общая бронхиальная стенка была утолщена в основном за счет перибронхиального отека и мононуклеарной инфильтрации, гиперплазии слизистой оболочки бронхов, а также увеличения массы гладкой мускулатуры бронхов. В некоторых бронхиолах были обнаружены внутрибронхиальные клеточные остатки, связанные с десквамированным эпителием и макрофагами.Утолщение межальвеолярных перегородок за счет эритроцитов (эритроцитов) и мононуклеарно-клеточной инфильтрации, очаговые экстравазатированные эритроциты в альвеолярных пространствах вплоть до коллапса одних альвеол с дилатацией и разрывами других, расширенные и полнокровные сосуды с периваскулярным отеком. наблюдаемый ().

Легкие крыс, моделирующих астму, вызванную OVA. Показаны бронхиолы с отслоившимися эпителиальными клетками в их просвете, мононуклеарно-клеточная инфильтрация, окружающая бронхиолы и представленная в межальвеолярных перегородках, утолщение межальвеолярных перегородок эритроцитами.Указаны альвеолы ​​(А), бронхиолы (Б) и кровеносные сосуды (бв), мононуклеарная клеточная инфильтрация (I), ×100.

РНК-интерференция IL10 в некоторой степени ослабляла воспалительный процесс в легочной ткани ( и ), при этом наблюдали умеренную альвеолярную и перибронхиальную воспалительно-клеточную инфильтрацию, а также некоторое уменьшение толщины межальвеолярных перегородок. Показатели, характеризующие ремоделирование стенки дыхательных путей, были несколько снижены как в мелких, так и в средних бронхиолах по сравнению с астматической группой животных ( и ).

Легкие крыс с OVA-индуцированной астмой + интерференцией кшРНК IL10. Видны внесосудистые эритроциты и клеточный инфильтрат в альвеолярных пространствах с дилатацией и разрывом других альвеол. Присутствуют расширенные и перегруженные кровеносные сосуды. Указаны альвеолы ​​(А), бронхиолы (В) и кровеносные сосуды (bv), мононуклеарная клеточная инфильтрация (I), внесосудистые эритроциты (R), ×100.

легких крыс с OVA-индуцированной астмой + IL10-кшРНК-интерференция. Видны немногочисленные мононуклеарные клеточные инфильтраты, окружающие бронхиолы и представленные в межальвеолярных перегородках, экстравазатированные эритроциты и застойные кровеносные сосуды.Указаны альвеолы ​​(A), бронхиолы (B) и кровеносные сосуды (bv), мононуклеарная клеточная инфильтрация (I), внесосудистые эритроциты (R), ×100.

Отношение общей площади бронхиальной стенки к периметру базальной мембраны (WAt/Pbm) и площади внутренней стенки к периметру базальной мембраны (WAi/Pbm) в малых (A) и средних (B) дыхательных путях. ■ – контрольный SHR, □ – OVA-индуцированная астма, – OVA-индуцированная астма + интерференция кшРНК IL10. Значения являются средними значениями ± стандартное отклонение. *достоверная разница по сравнению с контрольной группой, p < 0.05.

Уровень инфильтрации (A) и толщина альвеолярной перегородки (B) в контроле SHR, OVA-индуцированной астме и OVA-индуцированной астме + интерференция кшРНК IL10. Значения являются средними значениями ± стандартное отклонение. *достоверная разница по сравнению с контрольной группой, p < 0,05.

4. Обсуждение

Моделирование сопутствующей патологии не является рутинной техникой, и мы нашли лишь несколько публикаций в этой области. Насколько нам известно, мы первыми разработали экспериментальную модель коморбидности бронхиальной астмы и артериальной гипертензии, представленную в настоящей статье. Ранее Гилмор и соавт. [21] продемонстрировали восприимчивость SHR к усилению воспаления в легких при воздействии частиц вещества по сравнению с крысами Wistar Kyoto из-за активации передачи сигналов, опосредованной TLR4. Кодаванти и др. [22] доказали, что SHR является лучшей моделью для экспериментального бронхита, потому что диоксид серы вызывает выраженную иммунную дисрегуляцию, окислительный стресс, нарушение клеточной передачи сигналов и метаболизма жирных кислот у SHR по сравнению с крысами Sprague Dawley.

Здесь мы приводим данные, экспериментально подтверждающие функциональность мишени (IL10), которая была in silico. , по прогнозам, связанной как с астмой, так и с гипертензией, была подтверждена в экспериментальной модели этой коморбидной патологии.ИЛ-10 — известный цитокин, участвующий в воспалении различного генеза, способен блокировать активность NF-κB и участвует в регуляции сигнального пути JAK-STAT. Эти пути вовлечены в патогенез как астмы, так и гипертонии. Мы показали, что при РНК-интерференции гена IL10 in vivo изменяет параметры как сердечной, так и легочной функции. Эти изменения в работе сердца можно охарактеризовать как положительные. Но более интенсивная работа сердца (увеличение сердечного выброса, минутного объема, работы сердца и др.) может привести к истощению и декомпенсации функций сердца по сравнению с контрольными крысами.Нокдаун гена IL10 при моделировании астмы вызывает ряд положительных изменений респираторных функций астматических животных в виде снижения эластичности и повышения податливости легких, а также менее выраженные патоморфологические изменения в легочной ткани (например, толщина мелких и средние бронхиолы, характеризующие бронхиальную астму). Эти данные неожиданны из-за известной функции IL-10 как противовоспалительного цитокина [23], [24], и ожидалось, что снижение его экспрессии будет способствовать астматическим изменениям в легких.Это можно объяснить компенсаторным увеличением продукции других противовоспалительных веществ с более сильным действием. Более того, настоящее исследование касается только ранних признаков астмы (провокация OVA всего 7 дней), а негативные последствия нокдауна IL-10 могут проявиться позже. Этот момент определенно нуждается в дальнейшем исследовании. Но по некоторым данным [25], [26] системное введение ИЛ-10 для аутоиммунной терапии оказалось парадоксально провоспалительным.Внутривенное введение плазмиды в наших экспериментах также индуцирует системный эффект, и некоторые положительные изменения параметров дыхания у крыс с OVA-индуцированной астмой логичны в этом контексте.

Таким образом, некоторые положительные сдвиги в развитии астмы при SHR приводят к перегрузке сердца и повышению его функции, мы не считаем снижение уровня IL-10 или влияние на его рецепторы перспективным механизмом развития новые терапевтические подходы к лечению сопутствующих заболеваний астмы и гипертонии.Тем не менее, новая модель коморбидности, разработанная и описанная в данной работе, может быть полезна для дальнейшего поиска других целей.

Новаторы и изобретатели ведущих заводов

Варианты доступа

Купить отдельный артикул

Мгновенный доступ к полной статье в формате PDF.

34,95 €

Цена включает НДС (Российская Федерация)
Расчет налога будет завершен при оформлении заказа.

‘) var head = document.getElementsByTagName(«head»)[0] var script = document.createElement(«сценарий») script.type = «текст/javascript» script.src = «https://buy.springer.com/assets/js/buybox-bundle-52d08dec1e.js» script.id = «ecommerce-scripts-» ​​+ метка времени head.appendChild (скрипт) var cartStepActive = document.cookie.indexOf(«функция электронной коммерции—buybox-cart-step») !== -1 var buybox = документ.querySelector(«[data-id=id_»+ метка времени +»]»). parentNode ;[].slice.call(buybox.querySelectorAll(«.вариант-покупки»)).forEach(init) функция инициализации (покупка Опция, индекс) { вар форма = покупкаOption.querySelector(«форма») если (форма && cartStepActive) { вар formAction = form.getAttribute(«действие») form.setAttribute(«действие», formAction.replace(«/checkout», «/cart»)) документ.querySelector(«#ecommerce-scripts-» ​​+ timestamp).addEventListener(«load», bindModal(form, formAction, timestamp, index), false) } } функция bindModal (форма, formAction, метка времени, индекс) { var weHasBrowserSupport = window.fetch && Array.from функция возврата () { console.log(«Скрипты электронной коммерции загружены, попытка инициализации модального режима. ..») var Buybox = EcommScripts ? EcommScripts.Ящик для покупок: ноль var Modal = EcommScripts ? EcommScripts.Modal : ноль if (weHasBrowserSupport && Buybox && Modal) { var modalID = «ecomm-modal_» + метка времени + «_» + индекс var modal = новый модальный (modalID) modal.domEl.addEventListener («закрыть», закрыть) функция закрыть () { форма.querySelector(«кнопка[тип=отправить]»).фокус() } форма.setAttribute( «действие», formAction.replace(«/checkout», «/cart?messageOnly=1») ) form. addEventListener( «Отправить», Buybox.interceptFormSubmit( Буйбокс.fetchFormAction(окно.fetch), Buybox.triggerModalAfterAddToCartSuccess(модальный), консоль.лог, ), ложный ) document.body.appendChild(modal.domEl) } еще { console.log(«Ошибка привязки:», weHasBrowserSupport, EcommScripts) } } } })()

Две фирмы и два физических лица включены в список OFAC за предполагаемое содействие ранее зарегистрированной на бирже российской компании

На прошлой неделе министерство финансов США объявило о включении в листинг российской фирмы, словацкой фирмы и двух других российских физических лиц в связи с обвинениями в том, что квартет обошел санкции, наложенные на другую российскую фирму, ранее включенную в листинг.

Управление по контролю за иностранными активами Министерства финансов США (OFAC) сообщило во вторник, что фирмы Vela-Marine Ltd. и Lacno SRO, а также физические лица Марина Игоревна Царева и Антон Александрович Нагибин внесены в список в связи с их взаимодействием с ранее зарегистрированной компанией, а именно с российской фирмой «Дайвтехносервис».

Утверждается, что все стороны, фигурирующие в акции во вторник, помогли «Дайвтехносервисам» получить водолазные системы и различное другое подводное оборудование для нескольких ведомств в рамках правительства России, включая Федеральную службу безопасности (ФСБ), которая также находится под санкциями из-за распоряжения от последнего 2016 г. и акт Конгресса ранее в этом году.

По данным OFAC, Лакно помогал Divetechnoservices, который был включен в список в июне этого года, пытался способствовать выплате фирме 20 000 долларов, а также заключал будущие договоренности о покупке оборудования через словацкую фирму. Vela-Marine также была названа содействующей попыткам «Дайвтехносервисов» обойти санкции, но обвинений в конкретных действиях не было.

Царева оказывается в списке OFAC из-за обвинений в том, что она действовала от имени Vela-Marine и Divetechnoservices в качестве менеджера по импорту.Нагибин попала в список благодаря своей должности сотрудника Divetechnoservices, которая якобы помогла фирме избежать санкций США.

Назначение OFAC означает, что лицо или фирма, обозначенные таким образом, по закону не могут отстаивать свои права на собственность в пределах юрисдикции Соединенных Штатов, а гражданам Соединенных Штатов по закону запрещено сознательно вести дела с указанными сторонами.

Адвокатское бюро Бьорна Брунванда уже более четверти века представляет интересы людей, обвиняемых в тяжких убийствах, уголовных преступлениях, связанных с наркотиками, вождении в нетрезвом виде, государственном мошенничестве и должностных преступлениях.Свяжитесь с нашим офисом сегодня, чтобы обсудить ваши государственные или федеральные сборы в районе залива Тампа.

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Экзосомы опухолевого происхождения при индуцированной опухолью иммуносупрессии

Экзосомы стали важными регуляторами межклеточной коммуникации при раке. Экзосомы, выпущенные в TME и жидкости организма, могут быть поглощены клетками-реципиентами путем прямого слияния их мембран различными способами, такими как липидный рафт, кальвеолы ​​и клатрин-зависимый эндоцитоз, макропиноцитоз и фагоцитоз [41,42,43,44]. .Внутрипузырный груз экзосом состоит из белков, липидов, ДНК (мтДНК, оцДНК, двухцепочечной ДНК) и РНК (мРНК, миРНК, длинная некодирующая РНК, циркРНК), которые все функциональны при переносе в клетки-реципиенты [45, 46]. Обширные отчеты о составе экзосом показали, что экзосомы, полученные из опухолей и несущие различные грузы, заметно участвуют в регуляции биологической активности своих клеток-реципиентов посредством переноса их онкогенного содержимого, которое может широко варьироваться между клетками и состояниями (рис. 2).
TEX Protein Content
Протеомный анализ микровезикул показал, что хотя некоторые молекулы являются общими для микровезикул различного клеточного происхождения, функциональность экзосом, по-видимому, определяется содержанием специфического белка. Сообщалось, что уровни белков фракций экзосом в плазме больных различными злокачественными новообразованиями коррелировали с активностью заболевания, степенью опухоли, стадией опухоли, ответом на терапию и выживаемостью [47]. Изменения уровней TGF-β1 в экзосомах, выделенных из плазмы пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), коррелировали с ответами пациентов на химиотерапию [48].Обширный протеомный анализ EVs, выделенных от больных раком в базах данных Vesiclepedia, показал, что уровни индивидуального или общего белка TEX могут коррелировать с развитием рака или реакцией на терапию [49]. Эти данные показывают, что белковые сигнатуры TEX отличаются от незлокачественных клеток, и белковые сигнатуры TEX, продуцируемые разными опухолевыми клетками, также различны (подразумевая специфичность типа раковых клеток) [50]. TEX, полученный из клеток меланомы у пациентов со стадией V, стимулировал образование метастатической ниши, а затем стимулировал клетки костного мозга к прометастатическому фенотипу, чтобы модулировать метастатическую способность клеток посредством активации онкопротеина MET [51]. Растворимые факторы, такие как цитокины или рецепторы цитокинов, могут быть встроены в мембрану TEX и транспортироваться в клетки-реципиенты в транс- или цис-конфигурациях, таким образом расширяя и усиливая иммуносупрессию [52]. В двух исследованиях сообщалось, что опухолевые клетки могут высвобождать TEX, обогащенный матриксной металлопротеиназой-13 (MMP-13) и miR-21, тем самым усиливая метастазирование, происходящее через эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) в условиях гипоксии [53,54].
TEX Nucleic Acid Content
Помимо белков, TEX также несет РНК, включая мРНК, микроРНК (миР) и некодирующие РНК [55].Присутствие ДНК, мРНК и микроРНК в грузе TEX необходимо для роли TEX в качестве носителей информации. Сообщалось, что

мРНК

TEX содержат около 10 000 различных видов мРНК, участвующих в критических клеточных действиях, включая воспаление и иммунную регуляцию [56]. TEX, выделенный из плазмы пациентов с рецидивирующей глиомой, участвовавших в клиническом испытании вакцинации, дал достаточное количество мРНК для количественного анализа ОТ-ПЦР. Уровни мРНК 4 (IL8, TGFB, TIMP1 и ZAP70) из 24 иммунорегуляторных генов были значительно снижены в TEX, извлеченном из парных образцов плазмы до и после вакцинации [57].Примечательно, что эти вызванные вакциной изменения в транскриптах мРНК происходили только у пациентов, у которых наблюдался иммунологический и клинический ответ на вакцину. Это ретроспективное исследование вакцинации показало, что измерения изменений уровней экспрессии генов, связанных с иммунитетом, в экзосомах помогли выявить пациентов, чувствительных к вакцине. Это исследование предполагает, что анализ мРНК в TEX плазмы больных раком, получавших иммунную терапию, может предоставить полезную клиническую и прогностическую информацию [57].

микроРНК и длинная некодирующая РНК

Груз TEX богат miR, и содержание miR в TEX было тщательно исследовано [58]. МиР модулируют экспрессию генов в клетках-реципиентах, индуцируя деградацию множественных мРНК-мишеней, в зависимости от клеточного контекста [59]. Перенос миР из опухолевых клеток в иммунные клетки обычно подавляет противоопухолевую активность и способствует онкогенезу [60]. TEX в плазме пациентов с различными типами рака несут ракоспецифические, отличные сигнатуры miR, которые коррелируют с развитием рака и ответами на терапию [18].Ассоциированные с опухолью miR, такие как miR-21, miR-146a, miR-155 и miR-568, которые часто идентифицируют как содержимое груза TEX, регулируют функции и дифференцировку различных иммунных клеток [61]. Было установлено, что TEX, полученный из сыворотки больных раком молочной железы, может способствовать образованию опухолей из неканцерогенных эпителиальных клеток Dicer-зависимым образом [62]. Содержимое TEX miR также играет роль в индукции нормальной клеточной трансформации. Например, исследование показало, что TEX, происходящий из клеток лейкемии, транспортирует miR (miR-92a) в эндотелиальные клетки, чтобы модулировать эндотелиальную миграцию и образование трубочек [63].В другом исследовании сообщалось, что TEX, полученный из клеток рака предстательной железы, был вовлечен в рост опухоли посредством перепрограммирования стволовых клеток, полученных из жировой ткани, с помощью онкогенных миР миР-125b, миР-130b и миР-155 [64]. Помимо миР, многие виды некодирующие РНК также присутствуют в TEX, включая сводную РНК, Y-РНК, рибосомную РНК (рРНК) и транспортную РНК (тРНК) [65,66,67]. Преимущественное накопление специфических видов РНК, по-видимому, происходит в TEX [68], указывая на то, что упаковка РНК не является случайной, а скорее существуют механизмы для упаковки специфических РНК в TEX.Белок процессинга РНК Y-box белок 1 (YB-1) и гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин A2B1 (hnRNPA2B1) участвуют в упаковке некоторых miR и некодирующих РНК в TEX посредством распознавания мотивов последовательности РНК [68,69]. TEX, полученные из клеток рака молочной железы, содержат РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC)-загрузочный комплекс, включая argonaute-2 (Ago2), Dicer и TAR РНК-связывающий белок (TRBP), связанный с микроРНК [62], который может быть дополнительный механизм загрузки РНК в TEX. Остается неизвестным, широко ли применимы описанные выше пути к упаковке РНК или существуют ли в TEX другие механизмы, регулирующие загрузку РНК [70].

ДНК

TEX также содержат несколько типов ДНК в дополнение к видам РНК. Митохондриальная ДНК (мтДНК) [71,72], одноцепочечная ДНК (оцДНК) [73] и двухцепочечная ДНК (дцДНК) [45,74,75] были обнаружены в TEX. Например, было обнаружено, что ТЕХ из плазмы больных раком и из культивируемых опухолевых клеток содержит двухцепочечную геномную ДНК (гДНК) [76]. TEX может нести и передавать онкогенные мутации клеткам-реципиентам [77]. Анализ фрагментов гДНК генов PTEN, MLh2 или TP53 показал, что разные TEX имеют разное содержание гДНК, которое может включать специфические мутации [45,76].ДНК TEX может иметь функциональные последствия после временного переноса в клетки-реципиенты [78]. Исследование показало, что ДНК TEX переносилась в дендритные клетки стимулятором генов интерферона (STING)-зависимым образом [79]. Лечение ингибиторами топоизомеразы-I или рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) облегчает упаковку ДНК в TEX, в то время как точные механизмы упаковки ДНК в TEX еще предстоит определить [80].

биография, личная жизнь, известные произведения

Нагибин Юрий Маркович, биография которого представлена ​​в этой статье, известный писатель и сценарист.Годы жизни — 1920-1994. Он родился в Москве 3 апреля 1920 года. Кирилл Александрович, отец будущего писателя, незадолго до рождения Юрия был расстрелян — участвовал в белогвардейском восстании в Курской губернии. Кирилл Александрович успел «завещать» Ксении Алексеевне, ее беременной жене, друга Марка Левенталя. Он усыновил Юрия, который только в зрелые годы узнал о том, кто его настоящий отец. Вскоре был репрессирован (сослан) и Марк Левенталь. Яков Рыкачев стал для Юрия Марковича вторым отчимом.Он был первым литературным учителем будущего писателя, пробудившим в нем вкус к словесному творчеству.

Образование, военные годы

Нагибин в 1938 году с отличием окончил школу, а затем продолжил обучение в Московском медицинском институте. Лечебное дело его не интересовало, и он решил поступать во ВГИК, на сценарный факультет. Однако институт закончить не удалось. ВГИК в начале войны был эвакуирован в Алма-Ату, а Юрия Нагибина призвали в армию.Осенью 1941 года его направили в политотдел Волховского фронта. Первые его рассказы появились в печати незадолго до войны. Это «Двойная ошибка» (1940) и «Кнут» (1941).

В 1942 году Юрий Маркович был на Воронежском фронте, был «инструктором-писателем». В том же году он был принят в Союз писателей СССР. В фронтовые обязанности Нагибина входили: радиопередачи, изготовление агитационных листовок, анализ вражеских документов. Дважды был контужен на фронте, а после выздоровления по состоянию здоровья вышел из строя.После этого Юрий Нагибин работал в газете «Труд» военным корреспондентом. Его фронтовой опыт отразился в рассказах, опубликованных в сборниках «Человек с фронта» в 1943 г., «Две силы» и «Большое сердце» в 1944 г., «Зерно жизни» в 1948 г.

Дружба с Андреем Платоновым

В конце 40-х — начале 50-х Юрий Нагибин подружился с Андреем Платоновым (годы жизни — 1899-1951). Как он потом вспоминал в своей автобиографии, вследствие этого целый период его литературных занятий был отмечен тем, что отчим вытравливал Платонова из его фраз.

Нагибин становится знаменитым

В начале 1950-х годов к Нагибину пришла авторская известность. Читатели обратили внимание на такие рассказы, как «Трубка» (1952), «Комаров» и «Зимний дуб» (оба написаны в 1953 году), «Четунов» (1954), «Ночной гость» (1955). А «Свет в окне» и «Хазарский орнамент», опубликованные в 1956 году в «Литературной Москве», вызвали гнев партийной печати (совместно с «Рычагом» А. Яшина). Но буквально через год рассказы, написанные по законам соцреализма, были опубликованы в Библиотеке Огонека, и писатель был «реабилитирован».Юрий Кувалдин отмечал, что Нагибину приходилось постоянно балансировать на грани православия и инакомыслия.

Циклы произведений Нагибина

Большинство рассказов Юрия Марковича, объединенных «сквозными» героями, общей темой и способом повествования, составляют циклы: историко-биографические, охотничьи, военные, серия путевых рассказов и др. автора многие годы рассматривали в основном как романиста, стремящегося в малом рассказать о большом.

Военный цикл

Военные рассказы Нагибина отмечены поиском индивидуально-авторского стиля.В последний 11-томный сборник сочинений автор включил лучшие из них, среди которых можно отметить следующие: «Связист Васильев» (впервые опубликован в 1942 г. в газете «Красная Звезда» под названием «Линия»), «На Хортице», «Переводчик» (1945), «Ваганов» (1946). Кроме того, военный материал использован Юрием Марковичем в следующих романах: 1957 г. «Путь на передовую», 1959 г. «Павлик» и 1964 г. «Вдали от войны». Раскрытие героизма простого солдата и военных будней становится более драматичным и психологически глубоким, появляется рельефность и тонкость в контурах персонажей.Среди произведений этой тематики особенно примечательна повесть «Павлик». Ее главный герой с помощью разума преодолевает страх смерти.

Цикл «Охота»

Цикл «Охота» развивался в течение десятилетия — с 1954 по 1964 год. В него вошли более двадцати рассказов. Своим рождением они обязаны пейзажам окрестностей Плещеева озера и Мещеры. В рассказах Юрия Нагибина заметно влияние классической традиции в литературе, восходящей к тургеневским «Запискам охотника».Повествование ведется от первого лица. Это такие произведения Юрия Нагибина, как «Погоня» и «Ночной гость» (1962), «Молодожены» и «Мещерская сторона» (1964). Здесь Нагибин тонкий художник мира природы и испытатель характеров людей в природной среде. В отношениях между природой и человеком рассматривается как экологическая сторона, так и социально-нравственный аспект.

Деревенская тема, первый сценарий к фильму

Эти истории подготовили развитие деревенской темы.В курсе использовались наблюдения и материалы послевоенных публицистических лет, создание очерков о колхозной жизни для Шмеина, «Социалистического земледелия», «Труда», «Правды». В результате в 1962 году появился роман «Страницы жизни Трубникова». Именно она стала основой сценария фильма «Председатель» режиссера А. Салтыкова в 1964 году. Этот фильм стал настоящим событием. За столкновениями Семена Силуянова и Егора Трубникова, людей, одержимых своими идеями, читалось столкновение двух противоположных систем взглядов, жизненных принципов — индивидуалистического и общественного.

Новый сценарий

Творчество Юрия Марковича органично вписывалось в тенденцию деревенской прозы, набиравшую силу в 1950-1960-е годы. Однако сразу же после выхода первой картины Юрий Нагибин попытался повторить кинематографический успех. Фильмы по его сценариям стали выходить один за другим. Юрий Маркович вскоре предложил проект новой картины «Режиссёр». Автор в заявлении прямо сообщал, что вступил в семью Ивана Лихачева, одного из основоположников автомобильной промышленности нашей страны, бывшего чекиста и матроса-революционера, партийного выдвиженца.Юрий Нагибин женился на дочери. Таким образом, в основу рассказа легла история жизни тестя Нагина, роман с женой, то есть со свекровью, Юрий Нагибин открыто расскажет позже.

Биография писателя интересует многих, особенно его личная жизнь, о которой следует сказать отдельно.

Личная жизнь Нагибина

Юрий Маркович был женат шесть раз. Одной из его супруг была Белла Ахмадулина. Юрий Маркович говорил, что с каждой женщиной он был счастлив по-своему.Каждый из них внес в его жизнь что-то особенное, как признался Юрий Нагибин. Жена Алла, переводчица, последняя жена писателя, прожила с ним дольше всех. Они были счастливы вместе почти 25 лет. Свою любовь к ней Нагибин выразил в романтической сказке под названием «История синей лягушки», о которой мы поговорим чуть позже.

Продолжаем работу над сценариями

Во время создания первой версии фильма «Режиссёр» погиб известный актёр Евгений Урбанский.Второй вариант, снятый после долгого перерыва, не очень запомнился. Тем не менее, Нагибин продолжал создавать прибыльные на тот момент сценарии. Акира Куросава, известный японский кинорежиссер, снял фильм «Дерсу Узала» по своему сценарию Владимира Арсеньева, который был удостоен премии «Оскар» (правда, за режиссерскую работу). В активе Юрия Нагибина было более тридцати картин: «Девушка и Эхо», «Индийское царство», «Чайковский», «Самый медленный поезд», «Красная палатка», «Тайна Кальмана» и др.

«Городские» циклы

Писатель Юрий Нагибин не ограничивался производственной и деревенской тематикой. Он также создал городские циклы, составившие следующие книги: «Чистые пруды» (1962 г.), «Книга детства» (годы создания — 1968-1975 гг.), «Переулки моего детства» (издана в 1971 г.). Здесь Юрий Нагибин обращается к истокам формирования характера Сергея Ракитина, его лирического героя, а также его поколения в целом.

Не только фоном, но и «героем» цикла становится сама Москва со своими городскими нравами и бытом.Во многих других публицистических статьях тема столицы развивалась. Они были собраны в книге 1987 года «Москва… Как много в этом звуке». Этот город он считал своей единственной привязанностью, хотя Нагибин объездил почти весь мир, кроме Южной Америки. В Москве он прожил почти всю жизнь. Юрий Маркович был прекрасным знатоком истории площадей, переулков и улиц столицы. Не случайно последней его книгой стал «Душевный звон» — произведение, посвященное родному городу.Успех произведений Нагибина 1960–1970-х годов обычно объясняется естественной искренностью интонаций, лирической исповедью, ясностью и легкостью слога, богатой метафоричностью, необычным ритмическим построением с финальным аккордом, в котором судили о рассказе с морально-этической точки зрения.

Тема творчества

В 1970-х годах Юрия Нагибина привлекала тема творчества на историко-культурном и современном материале. Это нашло отражение в цикле художественной микроэпопеи «Вечные спутники» (годы создания — 1972-1979).Их героями были Лермонтов, Пушкин, протопоп Аввакум, Чайковский, Тютчев, Анненский, Рахманинов и другие. Эти работы не отличаются особой оригинальностью. По словам самого автора, он не приближался, а лишь отталкивал полное знание материала от поставленной задачи. Творческий полет появился, когда память освободилась от фактов, сковывающих воображение. Для воссоздания «духовного пейзажа» необходимо было прежде всего опираться на «первовидение», на чувства и «память зрения».Отсюда и обвинения в авторском произволе и субъективизме.

Любовь в творчестве Нагибина

Среди постоянных тем творчества Нагибина, по-разному меняющихся в разное время, — многообразная и яркая любовь, а также драма утраченного или нереализованного счастья. Писал ли Нагибин сказку или реалистическую вещь, в отношениях между мужчиной и женщиной у него достаточно устойчивая система характера: он всегда беззащитен и уязвим, а она стабильнее и сильнее в этом мире.В начале 1980-х легкие, ностальгические мотивы прозы сменились большой остротой и злободневностью, трагической напряженностью, тенденцией к социально-философским отступлениям. Неожиданностью стала его сатира с пародией и фарсом, а также эротика. «Рассказы синей лягушки» представляют собой исповедь «лягушки с человеческой памятью и тоской», которая осталась у него от прежней жизни. А его возлюбленная в постчеловеческой жизни превратилась в грациозную косулю. Новая прозаическая критика Нагибина была осуждена за «отсутствие нравственной определенности.»

Последние работы

«Синяя лягушка» в последние годы жизни не только в очередной раз сменила кожу, но и вывернула себя наизнанку. Автор с демонстративным самовыражением, не без шутовского самолюбования, показал самые сокровенные страницы собственной биографии. Он решил воссоздать историю жизни отца и его отношения к этому человеку («Вставай и иди», 1987), вспомнил свою первую любовь в произведении 1994 года «Дафнис и Хлоя…». В том же году он описал свой роман со свекровью в книге «Моя золотая свекровь», а также оставил рассказ-завещание под названием «Тьма в конце тоннеля», крайне пессимистичный.«Дневник» 1995 года, изданный посмертно, полон предельной откровенности и беспристрастных оценок окружения писателя.

Смерть Нагибина

17 июня 1994 года в Москве скончался Юрий Маркович Нагибин. Биография его сегодня интересует многих. Популярностью среди наших современников продолжают пользоваться именно его последние произведения. Критики время от времени ломают копья, обсуждая книги Юрия Нагибина. В «нагибаноборчестве» были замечены, например, Александр Солженицын и Виктор Топоров.

Внеклеточные везикулы меланомы генерируют иммуносупрессивные миелоидные клетки путем усиления регуляции PD-L1 посредством передачи сигналов TLR4

Abstract

Внеклеточные везикулы, полученные из опухолевых клеток (EV), превращают нормальные миелоидные клетки в клетки-супрессоры миелоидного происхождения (MDSC), ингибируя противоопухолевый иммунный ответ. Здесь мы показываем, что EV из клеток меланомы мыши Ret повышает экспрессию лиганда 1 запрограммированной гибели клеток (PD-L1) на незрелых миелоидных клетках мыши (IMC), что приводит к подавлению активации Т-клеток.Экспрессия PD-L1 и иммуносупрессивный потенциал генерируемых EV MDSC зависели от экспрессии Toll-подобных рецепторов (TLR). IMC от мышей Tlr4 -/- не увеличивала экспрессию Т-клеточного PD-L1 и иммуносупрессию при лечении Ret-EV, и этот эффект зависел от белка теплового шока 86 (HSP86), поскольку клетки Ret с дефицитом HSP86 не могли стимулировать экспрессия PD-L1 на нормальном IMC; IMC от мышей Tlr2 -/- и Tlr7 -/- продемонстрировали аналогичные результаты, хотя и в меньшей степени. Ret-клетки с дефицитом HSP86 замедляли прогрессирование опухоли in vivo , связанное со снижением частоты инфильтрирующих опухоль PD-L1 + CD11b + Gr1 + MDSC. EV из клеток меланомы человека усиливал PD-L1 и иммуносупрессию нормальных моноцитов, зависимых от HSP86. Эти результаты подчеркивают новый опосредованный EV механизм образования MDSC из нормальных миелоидных клеток, что свидетельствует о важности нацеливания на EV для терапии опухолей.

Значимость: Эти результаты подтверждают важность передачи сигналов TLR4 в репрограммировании нормальных миелоидных клеток в функциональные клетки-супрессоры миелоидного происхождения.

Введение

Злокачественная меланома характеризуется быстрым прогрессированием, метастазированием в отдаленные органы и плохой выживаемостью пациентов (1). Несмотря на терапевтический успех, достигнутый ингибиторами иммунных контрольных точек, такими как антитела, нацеленные на белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4), и белок 1 программируемой гибели клеток (PD-1), большинство пациентов не реагируют на лечение (2). Одной из основных причин такой плохой реакции является развитие иммуносупрессивного микроокружения опухоли (TME), в котором решающую роль играют супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) (3–6).Они накапливаются в доклинических моделях меланомы на мышах и у пациентов с меланомой и сильно ингибируют противоопухолевые функции Т-клеток и естественных киллеров (NK), способствуя прогрессированию опухоли (4–8). MDSC представляют собой гетерогенную популяцию моноцитарных и полиморфноядерных клеток, происходящих из незрелых миелоидных клеток (IMC) и активируемых растворимыми воспалительными факторами, постоянно продуцируемыми опухолевыми клетками и клетками-хозяевами (3–8). Один из основных механизмов иммуносупрессии, опосредованной MDSC, связан с активацией лиганда 1 запрограммированной гибели клеток (PD-L1), взаимодействующего с его рецептором PD-1, экспрессируемым на инфильтрирующих опухоль Т-клетках (3–5, 9).

Недавно было продемонстрировано, что MDSC также могут быть получены из IMC или дифференцированных миелоидных клеток при воздействии внеклеточных везикул (EV), секретируемых опухолевыми клетками (10–14). Термин EV в настоящее время применяется для обозначения всех видов везикул, высвобождаемых различными типами клеток, включая эритроциты, тромбоциты, лейкоциты и раковые клетки (15). Процесс секреции ЭВ особенно активен в пролиферирующих клетках, таких как раковые клетки (16). Мелкие везикулы (50–150 нм) высвобождаются с клеточной поверхности (микровезикулы) или из эндосомальной системы (экзосомы).При слиянии поздних эндосом с плазматической мембраной экзосомы секретируются во внеклеточное пространство (17, 18). Напротив, апоптотические везикулы (тела) крупнее (1000–5000 нм) и могут быть отделены по размеру и плотности от более мелких везикул (17, 18). В зависимости от клеточного происхождения ЭВ содержат различные биологически активные молекулы, такие как белки, мРНК, микроРНК и липиды, и рассматриваются как медиаторы межклеточной коммуникации (14, 19, 20).

Хотя превращение IMC в иммуносупрессивные MDSC с помощью EV опухолевого происхождения уже было описано, молекулярный механизм, лежащий в основе индукции MDSC и участия EV в образовании TME, плохо изучен. Ранее мы предположили, что в этом процессе могут быть важны как EV-опосредованная передача сигналов через рецепторы миелоидных клеток, так и доставка биологически активных молекул EV (функция груза) (8, 20). Здесь мы исследовали молекулярные механизмы взаимодействия между нормальными миелоидными клетками (IMC и моноцитами) и EV, происходящими из меланомы, у мышей и людей, что приводит к образованию иммуносупрессивных MDSC. Мышиные EV были выделены из клеточной линии меланомы Ret (Ret-EV), которая была получена из меланом кожи, выделенных из трансгенных мышей RET (21).Эта модель очень напоминает меланому человека с точки зрения клинического развития и взаимодействия опухоль-строма (22). Мы обнаружили, что Ret-EV индуцирует повышенную регуляцию экспрессии PD-L1 на мышиных IMC, полученных из костного мозга (BM), и иммортализованной миелоидной супрессорной клеточной линии MSC-2 (23). Обработанные EV IMC сильно подавляли активацию CD8 + Т-клеток, которая восстанавливалась антителами против PD-L1, блокирующими ось PD-1/PD-L1. Важно отметить, что наблюдаемые эффекты были опосредованы передачей сигналов Toll-подобных рецепторов (TLR) (поскольку Ret-EV не индуцировал иммуносупрессивную способность IMC из Tlr4 -/- , Tlr2 -/- и Tlr7 -/- мышей), а также белком теплового шока 86 (HSP86), экспрессируемым на Ret-EV.Более того, нормальные человеческие моноциты CD14 + , подвергшиеся воздействию EV, продуцируемого клетками меланомы человека, также демонстрировали повышенную экспрессию PD-L1 зависимым от HSP86/TLR4 образом и приобретали сильную иммуносупрессивную способность, блокируя активацию Т-клеток. Наши результаты показывают, что EV-индуцированная экспрессия PD-L1 опосредует превращение нормальных миелоидных клеток в иммуносупрессивные MDSC у носителей опухоли посредством передачи сигналов TLR, что указывает на многообещающую мишень для иммунотерапии рака.

Материалы и методы

Мыши

Здоровые мыши C57BL/6 (6–8 недель) были приобретены у Charles River. Tlr4 -/- , Myd88 -/- и Myd88 -/- /Trif -/- 9011 мышей из Германии были доставлены из Eseny University из 9 мышей Cseny. Мыши Tlr2 -/- и Tlr7 -/- C57BL/6 были любезно предоставлены Beatrix Schumak (Боннский университет, Германия) и Stefan Bauer (Марбургский университет, Германия). Мышей содержали в условиях, свободных от патогенов, в виварии Университетского медицинского центра (Мангейм, Германия).Исследования на животных проводились в соответствии с Институциональным комитетом по уходу и использованию животных.

Культура клеток

Клеточная линия мышиной меланомы Ret была получена из меланом кожи, выделенных из трансгенных мышей RET (22) и культивированных в среде RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 10 % термоинактивированной FBS (Gibco) и 1 % пенициллина. /стрептомицин (Sigma-Aldrich). Линии клеток меланомы человека HT-144 и SK-MEL-28, полученные из ATCC, культивировали в среде DMEM с добавлением 0. 1 ммоль/л β-меркаптоэтанола (оба от Gibco), 10% инактивированного нагреванием FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Иммортализованные миелоидные супрессорные клеточные линии MSC-1 и -2 (23) были любезно предоставлены Стефано Угелем (Университет Вероны, Италия) и выращены в среде RPMI-1640 с добавлением 10 ммоль/л пирувата натрия (Gibco), 10% термоинактивированного FBS и 1% пенициллин/стрептомицин. Все клеточные линии поддерживали при 5% CO 2 при 37°C и регулярно тестировали на заражение Mycoplasma с использованием набора для обнаружения микоплазмы для обычной ПЦР (Minerva Biolabs).Клетки находились на пассажах не более семи между оттаиванием и использованием в описываемых экспериментах.

Реагенты и антитела

ДНК плазмиды лентивирусной кшРНК для стабильного нокдауна HSP86 и контрольной плазмиды Mission TRC pLKO.5-puro немлекопитающих кшРНК, а также KNK-437 (ингибитор индуцибельного HSP), актиномицина D, Bay11-7082 ( ингибитор NF-κB) и гидрохлорид 5-(N,N-диметил)амилорида (DMA) были приобретены у Sigma-Aldrich. Блокирующий реагент FcR был предоставлен BD Biosciences.Т-активатор CD3/CD28 Dynabeads для мыши и человека был получен от Thermo Fisher Scientific. Микрогранулы против CD14 человека и набор для выделения Т-клеток CD8 + были приобретены у Miltenyi Biotec. Антимышиные mAb CD9, PD-L1 и моноклональные антитела изотипического контроля (IgG2a) были получены от Thermo Fisher Scientific; CD81, p65, фосфо-p65 (S536), STAT3, p-STAT3 (Y705) и кальретикулин были предоставлены Cell Signaling Technology; Histon h4 и GAPDH были получены от Biolegend; ALIX были из компании Santa Cruz Biotechnology. Конъюгированные с флуорохромом мышиные моноклональные антитела CD11b-APC-Cy7, Gr1-PE-Cy7 и PD-L1-BV421 были приобретены компанией BD Biosciences.МкАТ против человека PD-L1 (405.9A11; Cell Signaling Technology) и ALIX были предоставлены Cell Signaling Technology; GAPDH и HSP90 были получены от Biolegend; CD9 были получены от BD Biosciences; CD81 от Invitrogen. Антитела к нейтрализующим TLR2 и TLR4 человека mAb и агонисты TLR (LPS, PAM3CSK4 и R848) были получены от InvivoGen. Конъюгированные с флуорохромом моноклональные антитела против человека CD14-FITC и PD-L1-PE-Cy7 были получены от BD Biosciences.

Выделение сердечных фибробластов мышей

Фибробласты получали, как описано ранее (24).Вкратце, мышиные сердца, очищенные от крови и механически разрушенные в холодном сбалансированном солевом растворе Хэнка, содержащем 100 ЕД/мл коллагеназы и 0,1% трипсина, добавляли с последующим постоянным встряхиванием при 37°С в течение 10 минут. После центрифугирования при 300 g, 4°C в течение 5 минут клетки ресуспендировали в среде DMEM/F12 (Gibco), содержащей 10% FBS и 1% пенициллин/стрептомицин, и высевали в чашки для культивирования клеток. Через два часа прикрепились только фибробласты, и среду заменили.

Выделение EV, секретируемого клетками меланомы мыши и человека, а также мышиными фибробластами

EV, секретируемого этими типами клеток, выделяли, как описано ранее (25, 26).Вкратце, бессывороточную кондиционированную среду из культивируемых опухолевых клеток или фибробластов подвергали стерильной фильтрации через 0,22 мкмоль/л Steritops (Merck Millipore) с последующей гель-фильтрацией через Amicon-Ultra-15, 100 кДа (Merck Millipore) при 3500 г в течение 30 минут. . EV осаждали из супернатантов ультрацентрифугированием при 100000 g в течение 90 минут (Sorvall Discovery) и ресуспендировали в стерильном PBS. Распределение количества/размера частиц анализировали с помощью NTA (Nanosight). Для этого готовили образцы ВВ в концентрации 5 нг/мл и измеряли частицы 5 раз по 1 минуте.Каждый препарат EV тестировали на наличие эндотоксинов с помощью анализа лизата амебоцитов limulus (Thermo Fisher Scientific).

Выделение EV у пациентов с меланомой

EV были выделены из плазмы пациентов после информированного письменного согласия (одобрение комитета по этике 2010-318M-MA), как описано (27). Вкратце, гепаринизированные образцы крови подвергали центрифугированию в градиенте плотности с использованием Biocoll (Biochrom). После удаления мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) плазму собирали, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.Для выделения ЭВ плазму оттаивали, разбавляли холодным PBS и фильтровали через шприцевой фильтр 0,22 мкм (Merck). Отфильтрованную плазму центрифугировали при 10 000 g в течение 30 минут для удаления дебриса, а затем осаждали ультрацентрифугированием при 100 000 g в течение 70 минут. Осадок ресуспендировали в стерильно отфильтрованном PBS и замораживали при -20°C до использования. В некоторых экспериментах плазму очищали от ВВ ультрацентрифугированием при 100 000 g.

Анализ клеточной пролиферации

Клетки меланомы Ret со стабильно нокаутированным HSP86 (shHSP86) или обработанные конструкцией кшРНК со скремблированной последовательностью (shSCR) высевали в 96-луночные планшеты (Gibco) при плотности 2500 клеток на лунку.После прикрепления клеток в течение 4 часов добавляли аламаровый синий (10% от объема культуральной среды) с последующим измерением флуоресценции при длине волны испускания 535 нмоль/л и длине волны возбуждения 590 нмоль/л с использованием считывателя микропланшетов SpectraMax M5 ( Текан Инфинит F200 PRO). Далее клетки инкубировали в течение 24, 48 и 72 часов; Аламаровый синий добавляли за 4 часа до окончания каждой временной точки и измеряли флуоресценцию.

Электронная микроскопия

Анализ проводили, как описано ранее (27).Вкратце, Ret-EV окрашивали mAb против CD81 (разведение 1:50) с последующей обработкой протеином A-Gold (10 нМ), любезно предоставленным Джорджем Постумой (Университетский медицинский центр Утрехта, Утрехт, Нидерланды). Изображения были получены с помощью электронного микроскопа EM910 (Carl Zeiss) при 80 кВ и зарегистрированы с помощью CCD-камеры (TRS-система, Tröndle) с использованием программного обеспечения производителя ImageSP.

Выделение и культивирование CD11b

+ Gr1 + IMC in vitro

CD11b + Gr1 + Клетки были выделены из КМ здоровых мышей в возрасте от 6 до 6 недель Набор MDSC Isolation (Miltenyi Biotec) с чистотой более 90%.Обратите внимание, что 10 6 клеток культивировали в RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, обедненного EV, 10 ммоль/л пирувата натрия (Gibco), 1% пенициллина/стрептомицина и 0,05 мкмоль/л β-меркаптоэтанола с EV или без него. (50 мкг/мл) в общем объеме 0,1 мл в течение 16 часов с последующими различными анализами.

Выделение и культивирование CD14 человека

+ моноцитов

Лейкоцитарные пленки, выделенные от здоровых доноров, были приобретены в Немецкой службе крови Красного Креста Баден-Вюртемберг-Гессен.РВМС выделяли центрифугированием в градиенте плотности с использованием Biocoll (Biochrom). Затем моноциты CD14 + сортировали с помощью микрошариков против CD14 человека в соответствии с протоколом производителя. Моноциты (2 × 10 5 ) культивировали в RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, обедненной EV, 10 ммоль/л пирувата натрия (Gibco), 1% пенициллина/стрептомицина и 0,05 мкмоль/л β-меркаптоэтанола с или без EV (15 мкг/мл) в общем объеме 0,1 мл в течение 16 часов с последующим анализом FACS.

Эксперименты по совместному культивированию

Эффекты EV, полученных из клеток меланомы Ret или сердечных фибробластов, оценивали с использованием системы Transwell. Обратите внимание, что 2 × 10 5 клеток инкубировали в течение 24 часов при 37°C с 15 мкмоль/л ДМА или без него. Через 24 часа IMC добавляли в верхнюю камеру поликарбонатной культуральной вставки Transwell (Costar) с размером пор 0,4 мкм (Sarstedt) и совместно культивировали еще 24 часа. Затем ИМК анализировали методом проточной цитометрии.

Проточная цитометрия

Клетки обрабатывали блокирующим реагентом FcR и окрашивали mAb в течение 30 минут при 4°C. Приобретение было выполнено с помощью многоцветной проточной цитометрии с использованием FACSCanto II с FACSDiva 6.0 (BD Biosciences). Исключение мертвых клеток было основано на профиле рассеяния. Компенсацию выполняли с помощью набора BD CompBeads (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Программное обеспечение FlowJo (Tree Star) использовалось для анализа не менее 100 000 событий.

Иммуноблоттинг

Мышиные IMC или иммортализованные миелоидные супрессорные клетки MSC-1 и -2 инкубировали с Ret-EV (50 мкг/мл) в течение 16 часов в общем объеме 0,1 мл. В некоторых экспериментах клетки МСК-2 обрабатывали Ret-EV в присутствии 1 мкг/мл актиномицина D или предварительно инкубировали в течение 3 часов с ингибитором NF-kB Bay (5 или 10 мкмоль/л).Затем осадок клеток солюбилизировали в течение 30 минут на льду в лизирующем буфере (250 ммоль/л NaCl, 50 ммоль/л HEPES, 0,5% NP-40, 10% глицерин, 2 ммоль/л ЭДТА, 10 ммоль/л NaF, 1 ммоль/л Na-ортованадата, 1 ммоль/л PMSF и по 10 мг/мл каждого лейпептина и апротинина) или буфер для анализа радиоиммунопреципитации (Merck), содержащий 1% ингибитора протеазы (Calbiochem). Лизаты очищали центрифугированием и кипятили с восстанавливающим или невосстанавливающим загрузочным буфером SDS. Концентрации белка определяли с использованием набора для анализа белка Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific).Образцы разделяли на гелях SDS-PAGE и переносили на поливинилиденфторидные мембраны с помощью iBlot2 (Thermo Fisher Scientific). После блокирования 3% BSA в Tween-20/TBS ​​мембраны обрабатывали первичными антителами, а затем вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, и детектированием ECL (Thermo Fisher Scientific).

In vitro CD8 + Анализ пролиферации Т-клеток и секреции IFNγ

Обратите внимание, что 10 5 CD11b + Gr1 + IMC мышей из костного мозга 50 мкг/мл EV в общем объеме 0.1 мл в течение 16 часов при 37°С. Затем клетки дважды промывали при 300 g в течение 5 минут для удаления остатка EV и обрабатывали PD-L1-нейтрализующими или контрольными по изотипу mAb в течение 15 минут с последующим центрифугированием при 300 g в течение 5 минут. Т-клетки CD8 + выделяли из селезенки здоровых мышей C57BL/6 с использованием набора для выделения наивных CD8 + Т-клеток (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя и метили 1 мкмоль/л карбоксифлуоресцеинсукцинимидилового эфира (CFSE).После отмывания CFSE центрифугированием при 300 g в течение 5 минут клетки стимулировали Dynabeads мышиным Т-активатором CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific) и инкубировали с клетками CD11b + Gr1 + при указанных соотношениях в течение 72 часов. Пролиферацию Т-клеток оценивали по разбавлению CFSE с помощью проточной цитометрии. Кроме того, секрецию IFNγ оценивали в супернатантах совместной культуры с использованием стандартного набора для ELISA MAX для мышиного IFN-γ (Biolegend) в соответствии с инструкциями производителя.

In vitro Анализ пролиферации Т-клеток человека

Обратите внимание, что 2 × 10 5 CD14 + моноцитов здоровых доноров обрабатывали 0,5–50 мкг/мл EV в общем объеме 0,2 мл в течение 16 часов. при 37°С. Затем клетки дважды промывали при 300 г в течение 5 минут для удаления остатка ЭВ. Т-клетки CD8 + были получены от здоровых доноров с использованием набора для выделения Т-клеток CD8 + , культивированы в бессывороточной среде X-VIVO 20 (Biozym) в течение 16 часов при 37°C и помечены 1 мкмоль/л CFSE. .После отмывания CFSE центрифугированием при 300 g в течение 5 минут Т-клетки CD8 + стимулировали Т-активатором CD3/CD28 человека Dynabeads (Thermo Fisher Scientific) и совместно культивировали с моноцитами CD14 + в указанных соотношениях в течение 72 часов. . Пролиферацию Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии.

Трансдукция лентивирусными частицами

Для получения лентивирусных частиц использовали клетки HEK293T. Для трансфекции плазмиду, содержащую соответствующую кшРНК (11 мкг), инкубировали с упаковочными плазмидами VSV-G (5.5 мкг) и pCMV-dR 8,91 (8,25 мкг) в растворе DMEM и X-treme GENE (Roche) в течение 30 минут и добавляли к клеткам-продуцентам HEK293T. После инкубации в течение 12 часов супернатант удаляли. При дальнейшем культивировании в течение 12, 24 и 36 часов супернатант собирали и вирусные частицы концентрировали ультрацентрифугированием. Затем клетки меланомы мыши Ret или человека SK-MEL-28 инкубировали с концентрированным вирусом в течение 24 часов. При первом заражении клетки Ret или SK-MEL-28 повторно инфицировали тем же вирусом в свежей среде и через 48 часов после трансдукции клетки дважды промывали PBS и культивировали.Для отбора трансдуцированных клеток добавляли 2 мкг/мл пуромицина на 3 дня. Использовали следующие плазмиды: плазмида кшРНК HSP86: KD 1: TRCN0000321086; КД 2: TRCN0000321084; КД 3: TRCN0000321007; КД 4: TRCN0000321085; KD 5: TRCN0000321083 и контрольная плазмида: контрольная плазмида Mission TRC pLKO.5-puro кшРНК немлекопитающих.

Рост опухоли

in vivo

Мышам C57BL/6 вводили подкожно. с 5 × 10 5 клеток Ret, трансдуцированных кшРНК HSP86 (shHSP86 Ret) или скремблированным контролем (shSCR Ret).Развитие опухоли контролировали ежедневно, измеряя диаметр опухоли.

Количественная ПЦР в реальном времени

Метод выполняли, как описано ранее (26). Вкратце, тотальную РНК выделяли с помощью Trizol и транскрибировали с помощью набора для синтеза кДНК SensiFast (Bioline) с последующим количественным определением с помощью спектрофотометра NanoDrop (ND-2000; Thermo Fisher Scientific). Праймеры были разработаны с использованием веб-инструмента Primer3 и произведены компанией Metabion. S18RNA применяли в качестве внутреннего стандарта. Используемые последовательности праймеров показаны в дополнительной таблице S1.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием GraphPad Prism (программное обеспечение GraphPad) по крайней мере в трех независимых экспериментах, если не указано иное. Данные анализировали с помощью одностороннего теста ANOVA для нескольких групп или непарного двустороннего теста Стьюдента t для двух групп. Значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

ЭВ из клеток мышиной меланомы Ret, обработанных IMC

Мы выделили ЭВ из супернатанта клеток мышиной меланомы Ret (Ret-EV) с использованием ультрафильтрации с последующим ультрацентрифугированием (25, 26).Анализ отслеживания наночастиц (NTA) показал, что размер Ret-EV составляет 99,1 нм ± 7,2 нм (рис. 1А). Более того, EV экспрессировал типичные маркеры, такие как CD9, CD81 и ALIX, но был отрицательным по кальретикулину, маркеру эндоплазматического ретикулума (ER; рис. 1B). Интересно, что иммуносупрессорная молекула PD-L1 была обнаружена в лизате Ret-клеток. Однако он был слабо обнаружен в Ret-EV (рис. 1Б). Кроме того, выделенные ЭВ визуализировали с помощью электронной микроскопии с использованием окрашивания иммунозолотом на CD81 в качестве маркера ЭВ (рис.1С). Чтобы исследовать поглощение миелоидными клетками, EV были помечены CFSE и инкубированы с иммортализованной миелоидной линией клеток-супрессоров MSC-1 (23). Анализ флуоресцентной микроскопии показал, что меченые Ret-EV были интернализованы и локализованы внутри клеток (рис. 1D). Кроме того, с помощью проточной цитометрии мы наблюдали поглощение CSFE-меченого Ret-EV клетками CD11b + Gr1 + IMC, выделенными из костного мозга мышей C57BL/6 (рис. 1E).

Рисунок 1.

Характеристика EV, полученного из клеток меланомы мыши Ret.ЭВ выделяли фильтрованием и ультрацентрифугированием. А, НТА Рет-ЭВ. B, Репрезентативный образец, показывающий экспрессию маркеров EV (CD9, CD81 и ALIX), а также PD-L1, обнаруженный вестерн-блоттингом. Маркер ER кальретикулин использовали в качестве отрицательного контроля. C, EV, маркер CD81, обнаруженный мечением иммунозолотом и электронной микроскопией. D и E, Ret-EV метили CFSE и инкубировали с мышиными клетками MSC-1 или IMC, полученными из BM, в течение 16 часов.Интернализация CFSE-EV клетками MSC-1 измерялась с помощью конфокальной микроскопии ( D ) и IMC с помощью проточной цитометрии ( E ).

EV из мышиных клеток меланомы Ret индуцируют экспрессию PD-L1 на мышиной IMC

Чтобы проверить влияние Ret-EV на миелоидные клетки in vitro , мы выделили мышиный BM-производный CD11b + Gr1 + IMC и подвергли их действию Ret-EV. В соответствии с предыдущими отчетами (10, 12, 26) мы наблюдали значительную активацию экспрессии воспалительных и иммунодепрессивных медиаторов, таких как IL1β, IL6, IL10, TNFα и циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), в IMC, измеренном с помощью RT. -ПЦР (фиг.2А). Важно отметить, что мы также обнаружили сильную активацию PD-L1 как на уровне мРНК, так и на уровне белка (рис. 2А и В). Чтобы исключить возможное загрязнение эндотоксинами, мы применили анализ лизата амебоцитов limulus и обнаружили, что образцы Ret-EV не содержат эндотоксина.

Рисунок 2.

EV-зависимая активация PD-L1 на мышиной IMC. IMC, выделенные из костного мозга мышей C57BL/6 дикого типа, обрабатывали Ret-EV в течение 3 часов (эксперименты с ОТ-ПЦР) или 16 часов (эксперименты с проточной цитометрией). Клетки, обработанные PBS, использовали в качестве контроля. A, Экспрессия различных цитокинов и PD-L1 в IMC, измеренная с помощью RT-PCR, представлена ​​как нормализованная к 18S РНК. B, Репрезентативный вестерн-блоттинг, показывающий экспрессию PD-L1 в IMC после обработки Ret-EV. C и D, Экспрессию PD-L1 на IMC, обработанном в течение 16 часов Ret-EV или EV, выделенным из сердечных фибробластов (Fibro-EV), оценивали с помощью проточной цитометрии. Данные представлены в виде процента PD-L1 + IMC от общего IMC ( C ) или уровня экспрессии PD-L1, измеренного как MFI ( D ; среднее ± SEM; n = 4). E и F, Клетки меланомы Ret или сердечные фибробласты совместно инкубировали с IMC в течение 24 часов в присутствии или в отсутствие ингибитора секреции EV, DMA (15 мкмоль/л), с использованием системы Transwell. Анализ экспрессии PD-L1 на IMC проводили методом проточной цитометрии. Данные представлены в виде процента PD-L1 + IMC среди общего IMC ( E ) или уровня экспрессии PD-L1 как MFI ( F ; среднее значение ± SEM; n = 4). Ret-клетки трансдуцировали экспрессирующим вектор CD81, связанным с GFP или контрольным вектором.Трансдуцированные клетки вводили мышам C57BL/6. Через 2 недели выделяли опухоли и оценивали MDSC с помощью проточной цитометрии. G, Показаны репрезентативные точечные диаграммы для экспрессии GFP в инфильтрирующих опухоль CD11b + Gr1 + . H, Экспрессия PD-L1 на GFP + и GFP опухолевых MDSC представлена ​​как MFI (среднее ± SEM; n = 3). *, Р < 0,05; **, P < 0,01; ***, Р < 0,001.

Используя проточную цитометрию, мы подтвердили опосредованное Ret-EV повышение частоты PD-L1, экспрессирующих IMC, и уровень его экспрессии, измеренный по средней интенсивности флуоресценции (MFI; рис. 2C и D). Параллельно CD11b + Gr1 + IMC обрабатывали EV, выделенным из нормальных сердечных фибробластов (Fibro-EV). Не наблюдалось значительного увеличения экспрессии PD-L1, что позволяет предположить, что эта модуляция PD-L1 была вызвана Ret-EV (рис. 2C и D).

Чтобы исключить возможные изменения в образцах ЭВ из-за процедуры выделения, мы установили систему совместного культивирования.Клетки меланомы Ret или фибробласты высевали в 24-луночные планшеты с последующей обработкой DMA, ингибитором протонной помпы H + , который, как известно, блокирует секрецию EV (12). Через 24 часа инкубации ИМК помещали в верхний отсек трансвелловых камер, чтобы исключить прямой межклеточный контакт. Экспрессию PD-L1 на IMC измеряли через 48 часов. Как показано на рис. 2E и F, клетки Ret, обработанные DMA, индуцировали значительно более низкое повышение экспрессии PD-L1, чем необработанные клетки Ret. Как и ожидалось, инкубация с сердечными фибробластами не изменила частоту ИМК, экспрессирующих PD-L1.

Затем мы исследовали, может ли EV опухолевого происхождения также стимулировать экспрессию PD-L1 на миелоидных клетках in vivo . С этой целью мы трансдуцировали Ret-клетки вектор-экспрессирующим маркером EV CD81, связанным с GFP, и вводили их сингенным мышам C57BL/6, чтобы следить за продукцией и поглощением EV in vivo . Четырнадцать дней спустя были приготовлены суспензии опухолевых одиночных клеток, и анализ проточной цитометрии показал присутствие CD11b + Gr1 + MDSC, экспрессирующих GFP, что позволяет предположить, что клетки CD11b + Gr1 + приобретали CD81-GFP посредством поглощения Рет-ЭВ (рис. 2Г). Важно отметить, что GFP + CD11b + Gr1 + MDSC показали тенденцию к более высокой интенсивности экспрессии PD-L1 по сравнению с их аналогами GFP (рис. 2H).

IMC, обработанные EV, приобрели иммуносупрессивную способность за счет активации PD-L1

Затем мы изучили возможность того, что EV-обработанные CD11b + Gr1 + IMC не только увеличивали экспрессию PD-L1, но также влияли на активацию Т-лимфоцитов . После инкубации с Ret-EV в течение 16 часов, IMC добавляли к очищенным аутологичным Т-клеткам CD8 + селезенки мыши, которые были помечены CFSE и активированы антителами против CD3/CD28.Мы наблюдали дозозависимое ингибирование пролиферации Т-клеток в присутствии EV-образованных IMC, измеренное с помощью проточной цитометрии (фиг. 3A). Важно отметить, что блокирование антител против PD-L1 может значительно предотвратить такое подавление пролиферации Т-клеток (рис. 3В). Кроме того, было обнаружено, что продукция IFNγ стимулированными Т-клетками восстанавливается в присутствии антител, блокирующих PD-L1 (рис. 3C). Эти результаты предполагают ключевую роль экспрессии PD-L1, индуцированной на миелоидных клетках, обработанных EV, в их ингибировании функций Т-лимфоцитов.Поскольку иммуносупрессорная способность представляет собой ключевую особенность MDSC, при котором экспрессия PD-L1 играет важную роль (3–5, 9), можно считать, что такие миелоидные клетки превращаются в MDSC (3, 4) под влиянием меланомы. -производный EV.

Рисунок 3.

ИМК, обработанные EV, демонстрируют иммуносупрессивную способность, опосредованную PD-L1. ИМК, выделенные из костного мозга мышей C57BL/6, инкубировали с Ret-EV в течение 16 часов. После отмывания остатка EV клетки обрабатывали PD-L1-нейтрализующими или контрольными по изотипу mAb (Iso) в течение 15 минут с последующей совместной инкубацией с нормальной селезенкой CD8 + Т-клеток, меченных CFSE и стимулированных анти-CD3. /CD28 Dynabeads на 72 часа.Пролиферацию Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии. A, Ингибирование пролиферации CD8 + Т-клеток с помощью EV-обработанных IMC при указанном соотношении IMC:T-клетки. Данные представлены в виде процента разделенных Т-клеток (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6). B и C, Пролиферация ( B ) и секреция IFNγ ( C ) стимулированных CD8 + T-клеток при блокировании PD-L1 на IMC (соотношение IMC:T-клетки = 1:1; среднее ± SEM; n = 3). *, P < 0.05; **, P < 0,01.

Активация PD-L1 индуцируется передачей сигналов NF-κB в клетках MSC-2

Мы наблюдали, что Ret-EV увеличивает in vitro экспрессию PD-L1 на мышиных клетках MSC-2, но не на клетках MSC-1 ( Дополнительный рис. S1A). Изучая механизм этой активизации, мы обнаружили, что такое повышение PD-L1 на иммортализованной миелоидной клеточной линии супрессоров MSC-2 было полностью аннулировано в присутствии актиномицина D, ингибитора синтеза мРНК (дополнительная рис.С1Б). Это наблюдение предполагает, что Ret-EV скорее запускает синтез PD-L1 de novo , чем доставляет этот белок в миелоидные клетки. Расшифровывая передачу сигналов, индуцированную Ret-EV, мы продемонстрировали сильную активацию фактора транскрипции NF-κB, обнаруженную путем фосфорилирования субъединицы p65 в клетках MSC-2, показанную с помощью вестерн-блоттинга (дополнительная рис. S1C). Затем клетки MSC-2 инкубировали с ингибитором NF-kB Bay11-7082. Мы заметили дозозависимое подавление индукции экспрессии PD-L1, что свидетельствует о критической роли передачи сигналов NF-κB в этой индукции, опосредованной Ret-EV (дополнительная фиг.С1Д).

Передача сигналов TLR вовлечена в опосредованную Ret-EV активацию PD-L1

Затем мы выделили IMC от мышей C57BL/6, дефицитных по экспрессии адаптерного белка миелоидной дифференцировки, первичного ответа 88 (MyD88), участвующего в TLR/NF- сигнализация κB. Кроме того, IMC были получены от мышей, дефицитных как по MyD88, так и по TIR-домен-содержащему адаптер-индуцирующему интерферону-β (TRIF), другому адаптерному белку, который участвует в передаче сигналов TLR/NF-κB. Как и ожидалось, лечение Ret-EV не смогло увеличить частоту PD-L1 + CD11b + Gr1 + IMC от обоих типов мышей с нокаутом (дополнительная рис.S1E), а также экспрессия PD-L1 на этих клетках, выраженная как MFI (дополнительный рисунок S1F).

Чтобы определить, какой TLR может быть вовлечен в активацию PD-L1, CD11b + Gr1 + IMC обрабатывали различными лигандами TLR, такими как Pam3/CSK4 (TLR2), LPS (TLR4) и R848 (TLR7/8). ). Мы обнаружили, что все три лиганда были способны индуцировать экспрессию PD-L1 на этих клетках (рис. 4А). Более того, IMC от мышей Tlr2 -/- , Tlr4 -/- или Tlr7 -/- продемонстрировали значительно более низкую активацию экспрессии PD-L1 при инкубации с Ret-L1. со своими аналогами от мышей дикого типа (рис.4Б). Однако самое сильное снижение после лечения наблюдалось в IMC от мышей Tlr4 -/- , почти не показывая повышения частоты клеток PD-L1 + и интенсивности экспрессии PD-L1 (рис. 4B). и С). В соответствии с данными по экспрессии белка, индукция мРНК PD-L1 с помощью Ret-EV также была полностью устранена в ИМК мышей Tlr4 -/- (рис. 4D) и в меньшей степени в клетках Tlr2. -/- и Tlr7 -/- мышей (дополнительная фиг.С2А). Важно отметить, что IMC от мышей Tlr4 -/- (в отличие от IMC от мышей дикого типа) не могли ингибировать пролиферацию Т-клеток при лечении Ret-EV (фиг. 4E). Аналогичные результаты были получены с использованием IMC от мышей Tlr2 -/- или Tlr7 -/- (дополнительный рисунок S2B), что позволяет предположить критическую роль TLR в индукции иммуносупрессивной активности миелоидных клеток опухолевыми клетками. производный EV.

Рисунок 4.

Ret-EV стимулирует активацию PD-L1 посредством передачи сигналов TLR в миелоидных клетках.ИМК выделяли из костного мозга мышей дикого типа и TLR-дефицитных мышей C57BL/6 и обрабатывали Ret-EV (50 мкг/мл) или 10 нг/мл Pam3/CSK4 (агонист TLR2) или 50 нг/мл LPS ( агонист TLR4) или 10 нг/мл R848 (агонист TLR7/8) в течение 16 часов с последующей проточной цитометрией. A–C, Экспрессия PD-L1 представлена ​​в виде процентной доли PD-L1 + IMC в общей IMC ( A и B ) или как уровень экспрессии PD-1 на IMC, измеренный как MFI ( C , среднее ± SEM, n = 4). D, Экспрессия PD-L1 в IMC от мышей дикого типа и Tlr4 -/- мышей, получавших Ret-EV, измеряли с помощью ОТ-ПЦР и нормализовали по экспрессии 18S РНК. E, Пролиферация Т-клеток CD8 + , инкубированных с IMC, которые были выделены из мышей дикого типа или Tlr4 -/- и обработаны Ret-EV (соотношение IMC:T-клетки = 1:1) . Данные представлены в виде процента разделенных Т-клеток (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6). *, P < 0.05; **, P < 0,01; ***, Р < 0,001.

Индукция PD-L1 опосредуется HSP86, экспрессируемым на Ret-EV

Некоторые HSP на EV ранее были описаны как мощные стимуляторы передачи сигналов TLR (12, 28–30). Мы исследовали различные препараты Ret-EV для экспрессии различных лигандов TLR, таких как HSP86, HSP72, HSP60 и HMGB1, с помощью вестерн-блоттинга. Только HSP86 постоянно наблюдался во всех образцах Ret-EV (фиг. 5А). Чтобы определить, экспрессируется ли HSP86 на поверхности EV, мы адсорбировали их на латексных шариках и окрашивали на HSP86 с последующей проточной цитометрией.Было обнаружено, что HSP86 экспрессируется на поверхности Ret-EV (фиг. 5B). Затем мы обработали клетки меланомы Ret KNK-437, мощным ингибитором синтеза индуцибельного HSP, и доказали дозозависимое снижение экспрессии HSP86 в этих клетках (рис. 5C). EV, выделенный из обработанных KNK-437 (KNK-EV) или контрольных (обработанных ДМСО) клеток Ret, инкубировали с CD11b + Gr1 + IMC, полученными от мышей дикого типа. Интересно, что KNK-EV индуцировал значительно более низкую активацию частоты клеток PD-L1 + (фиг.5D) и интенсивность экспрессии PD-L1 (фиг. 5E), чем EV, выделенный из контрольных клеток Ret. Важно отметить, что NTA не выявила различий между KNK-EV и контрольным Ret-EV в отношении концентрации и размера EV (рис. 5F).

Рисунок 5.

Hsp86 имеет решающее значение для опосредованной EV активации PD-L1 на IMC. A, Экспрессию HSP86, HSP72, HSP60 и HMGB1 в лизате Ret-клеток и различных препаратах Ret-EV измеряли вестерн-блоттингом. B, Ret-EV связывали с латексными шариками и анализировали с помощью проточной цитометрии.Результаты представляют окрашивание антителами против HSP86 (серый цвет) и контрольными антителами изотипа (черный цвет). C, клеток Ret обрабатывали указанными концентрациями KNK-437. Экспрессию HSP86 в клеточных лизатах анализировали вестерн-блоттингом. D и E, IMC обрабатывали EV, выделенным из обработанных KNK437 (KNK-EV) или необработанных Ret-клеток (Ret-EV). Экспрессию PD-L1 определяли с помощью проточной цитометрии и отображали как процент PD-L1 + IMC среди общего IMC ( D ) или как уровень экспрессии PD-1 как MFI ( E ; среднее значение ± стандартная ошибка среднего). н = 3). F, NTA KNK-EV и Ret-EV с указанием размера и концентрации EV. Клетки G и H, Ret трансдуцировали с помощью shHSP86 (shHSP86 Ret) или соответствующего скремблированного контроля (shSCR86 Ret). IMC совместно инкубировали с обоими типами клеток с использованием системы Transwell. Экспрессию PD-L1 оценивали с помощью проточной цитометрии и представляли как процент PD-L1 + IMC в общей IMC ( G ) и как уровень экспрессии PD-1 как MFI ( H ; среднее значение ± стандартная ошибка среднего). ; n = 4). I, IMC дикого типа обрабатывали EV, выделенным из клеток ShHSP86 (shHSP86 Ret-EV) и shSCR (shSCR Ret-EV). Затем к активированным CD8 + Т-клеткам добавляли обработанные ИМК (соотношение ИМК:Т-клетки = 1:1). Данные представлены в виде процента разделенных Т-клеток (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6). *, Р < 0,05; **, P < 0,01; ***, Р < 0,001.

В другом наборе экспериментов экспрессия HSP86 в Ret-клетках была стабильно подавлена ​​с помощью лентивирус-опосредованной доставки shRNA (shHSP86 Ret).Затем эти клетки культивировали в 24-луночных планшетах с последующим добавлением полученных из BM CD11b + Gr1 + IMC, как описано выше (см. рис. 2E). Совместное культивирование с клетками shHSP86 опосредовало лишь очень незначительное усиление экспрессии PD-L1 на IMC, которое было значительно ниже, чем индуцированное Ret-клетками, обработанными конструкцией shRNA со скремблированной последовательностью (shSCR Ret; Fig. 5G и H). Кроме того, IMC дикого типа обрабатывали EV, выделенным из клеток shHSP86 (shHSP86 Ret-EV) или shSCR (shSCR Ret-EV) Ret с последующей инкубацией IMC с активированными аутологичными CD8 + Т-клетками.Как показано на фиг. 5I, IMC, обработанные shHSP86 Ret-EV (в отличие от инкубированного IMC shSCR Ret-EV), не были способны ингибировать пролиферацию Т-клеток. В совокупности эти результаты показывают, что HSP86 представляет собой важный компонент для опосредованной TLR передачи сигналов, приводящей к повышению экспрессии PD-L1 на IMC, обработанных Ret-EV.

Истощение HSP86 в клетках меланомы Ret ухудшает рост опухоли и снижает экспрессию PD-L1 на MDSC

Для изучения влияния экспрессии HSP86 в опухолевых клетках на их рост in vivo мы вводили клетки shHSP86-Ret в C57BL/6 мышей.Было обнаружено, что рост опухоли задерживается по сравнению с мышами, инокулированными контрольными клетками shSCR-Ret (фиг. 6А). Мы также протестировали клетки shHSP86-Ret и shSCR-Ret на их способность к пролиферации in vitro и не обнаружили различий между двумя типами клеток (рис. 6B), что указывает на то, что ингибирование роста клеток shHSP86-Ret in vivo не было из-за нарушения клеточного деления. Однако мы наблюдали снижение частоты CD11b + Gr1 + MDSC, инфильтрирующих HSP86-дефицитные опухоли (рис.6С). Кроме того, частота PD-L1 + MDSC в общей популяции MDSC была значительно снижена по сравнению с инфильтрирующими MDSC контрольными опухолями Ret (рис. 6D). Аналогичное сильное снижение частоты PD-L1 + MDSC также наблюдалось среди всех MDSC в BM (рис. 6E).

Рисунок 6.

Снижение роста клеток Ret с дефицитом HSP86 in vivo . Клетки shHSP86 Ret или клетки shSCR Ret (скрембл-контроль) вводили подкожно. у мышей C57BL/6. A, Рост опухоли представлен в виде диаметра опухоли. Клетки B, shHSP86 Ret и клетки shSCR Ret инкубировали с аламаровым синим и метаболическую активность измеряли с помощью спектрометрии. C–E, На 14-й день суспензии одиночных клеток опухоли и костного мозга анализировали с помощью проточной цитометрии. C, Данные о инфильтрирующих опухоль MDSC представлены в виде процента этих клеток среди общего числа лейкоцитов. Экспрессия PD-L1 представлена ​​как процент PD-L1 + MDSC в опухолях ( D ) и в BM ( E ; среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 4).*, P < 0,05.

Эти данные позволяют предположить, что HSP86 из клеток меланомы Ret может экспрессироваться в Ret-EV и играть важную роль в образовании иммуносупрессивных MDSC у мышей с опухолями.

EV, полученные из меланомы человека, усиливают экспрессию PD-L1 и индуцируют иммуносупрессивные свойства в нормальных CD14 человека

+ моноцитов

Затем мы рассмотрели вопрос о том, может ли EV, полученный из меланомы человека, также индуцировать экспрессию PD-L1 на миелоидных клетках.Поэтому мы выделили EV из линии клеток меланомы человека HT-144 (HT-144-EV), используя протокол, описанный выше для клеток меланомы мыши Ret. HT144-EV характеризовались размером примерно 120 нм, измеренным с помощью NTA (дополнительная рис. S3A), экспрессией типичных маркеров EV и отсутствием маркера ER кальретикулина (дополнительная рис. S3B). Подобно мышиному EV, полученному из меланомы, человеческий HT-144-EV также индуцировал активацию нескольких воспалительных и иммуносупрессивных факторов, а также экспрессию PD-L1 в моноцитах CD14 + , выделенных от здоровых доноров, измеренных с помощью RT-PCR (фиг.7А). Важно отметить, что сильное увеличение частоты клеток PD-L1 + и интенсивности их экспрессии также было подтверждено на уровне белка (рис. 7B; дополнительная рис. S4A). Более того, мы обнаружили, что EV, выделенный из другой линии клеток меланомы человека SK-MEL-28 (SK-MEL-28-EV), индуцирует аналогичную активацию экспрессии PD-L1 на здоровых моноцитах (рис. 7B; дополнительная рис. S4A).

Рисунок 7.

Меланома человека EV индуцирует иммуносупрессивную активность нормальных моноцитов посредством активации PD-L1.ЭВ выделяли из клеток меланомы человека HT-144 (HT-144-EV) путем фильтрации и ультрацентрифугирования с последующей инкубацией с моноцитами CD14 + здоровых доноров в течение 16 часов. В качестве контроля использовали необработанные клетки. A, Экспрессию цитокинов и PD-L1 в моноцитах измеряли с помощью ОТ-ПЦР, и она выражена как нормализованная по отношению к β-актину. B и C, Экспрессия PD-L1 на моноцитах CD14 + , обработанных HT-144-EV и EV из клеток меланомы SK-MEL-28 (SK-MEL-28-EV), определяли с помощью проточной цитометрии.Результаты представлены в виде процентного отношения моноцитов PD-L1 + CD14 + к общему количеству моноцитов CD14 + ( B ; среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6). C, CD14 + моноцитов совместно культивировали с HT-144-EV в течение 16 часов с последующей инкубацией с Т-клетками, меченными CFSE, и стимулировали анти-CD3/CD28 Dynabeads в течение 72 часов. Ингибирование пролиферации Т-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии при указанном соотношении ИМК:Т-клетки. Данные представлены в виде процента разделенных Т-клеток (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6). D, Моноциты обрабатывали HT144-EV в течение 16 часов отдельно или в присутствии указанных моноклональных антител, блокирующих TLR, или антител против человеческого IgG (Iso). Экспрессию PD-L1 измеряли с помощью проточной цитометрии и выражали как процент моноцитов PD-L1 + в общем количестве моноцитов (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6). E, Репрезентативный вестерн-блоттинг, показывающий экспрессию HSP86 и PD-L1 в лизатах клеток HT-144 и SK-MEL-28, а также HT-144-EV и SK-MEL-28-EV. Клетки меланомы F, SK-MEL-28 трансдуцировали с помощью shHSP86 или соответствующего скремблированного контроля (shSCR86) с последующим выделением EV (shHSP86-EV и shSCR86-EV соответственно). Моноциты инкубировали с обоими типами EV в течение 16 часов с последующей оценкой экспрессии PD-L1 с помощью проточной цитометрии. Данные представлены в виде процентного содержания клеток PD-L1 + в общем количестве моноцитов (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6). G, обработанных EV моноцитов CD14 + инкубировали с активированными Т-клетками в течение 72 часов.Результаты представлены в виде процента пролиферирующих Т-клеток (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6). H, Нормальные моноциты CD14 + инкубировали с EV из плазмы нелеченых пациентов с меланомой IV стадии или с плазмой этих пациентов без EV. Данные представлены в виде процентного содержания моноцитов PD-L1 + CD14 + в общем количестве моноцитов (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; n = 6). *, Р < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0.001.

Затем мы исследовали, могут ли EV-образованные CD14 + моноциты приобретать иммуносупрессивный потенциал. С этой целью, как и в наших экспериментах на мышах, нормальные человеческие моноциты подвергали воздействию HT-144-EV с последующим сокультивированием с активированными человеческими CD8 + Т-клетками, меченными CFSE. Эти эксперименты подтвердили, что моноциты CD14 + , образованные EV меланомного происхождения, могут сильно ингибировать пролиферацию CD8 + Т-клеток, которая зависела от концентрации EV и соотношения между EV-образованными моноцитами и Т-клетками (фиг.7С).

Было обнаружено, что в мышиной системе TLR4 и (в меньшей степени) TLR2 являются основными триггерами EV-зависимой активации PD-L1 на миелоидных клетках. Чтобы проверить, были ли эти TLR также вовлечены в EV-зависимую активацию PD-L1 на моноцитах CD14 + человека, мы инкубировали их с блокирующими антителами против TLR4 и против TLR2 до лечения HT-144-EV. Как и в наших экспериментах на мышах, ингибирование передачи сигналов TLR4 приводило к сильнейшей отмене опосредованной EV стимуляции экспрессии PD-L1 на моноцитах (рис.7Д). Интересно, что оба лизата клеток меланомы HT-144 и EV, выделенные из этих клеток, демонстрировали очень слабую экспрессию PD-L1 (рис. 7E), предполагая, что наблюдаемая индукция PD-L1 была скорее результатом синтеза нового белка, опосредованного передачей сигналов TLR.

Затем мы изучили, может ли HSP играть роль в индуцированной EV активации PD-L1 в моноцитах человека. Клетки меланомы HT-144 и SK-MEL-28, а также HT-144-EV и SK-MEL-28-EV характеризовались экспрессией HSP86 (фиг. 7E).Подобно экспериментам на мышах, экспрессия HSP86 в клетках HT-144 была стабильно подавлена ​​с помощью доставки кшРНК, опосредованной лентивирусом, с последующим выделением EV из этих клеток (shHSP86 HT-144 EV). Важно отметить, что клеточный лизат и shHSP86 HT-144 EV показали резкое снижение экспрессии HSP86 (дополнительные рисунки S5A и S5B). Совместное культивирование моноцитов CD14 + с этими EV привело к значительно более низкому повышению частоты (рис. 7F) и интенсивности (дополнительный рис.S4B) экспрессии PD-L1 по сравнению с моноцитами, инкубированными с EV, выделенными из клеток HT-144, обработанных конструкцией shRNA со скремблированной последовательностью (shSCR HT-144 EV). Кроме того, моноциты, инкубированные с shHSP86 HT-144 EV, были значительно менее эффективны в ингибировании пролиферации Т-клеток, чем моноциты, обработанные shSCR HT-144 EV (фиг. 7G).

Для решения вопроса о том, может ли ЭВ, циркулирующий у пациентов с меланомой, вызывать такой же эффект на моноциты CD14 + здоровых доноров, ЭВ был очищен из плазмы пациентов с меланомой IV стадии с последующим их совместным культивированием с моноцитами.Мы обнаружили сильное увеличение частоты клеток PD-L1 + по сравнению с этими значениями в необработанных моноцитах (рис. 7З). Уровень экспрессии PD-L1 в этих условиях также был значительно повышен (дополнительная рис. S4C). Важно отметить, что моноциты, инкубированные с плазмой, лишенной EV (содержащей только растворимые факторы), значительно снижают усиление экспрессии PD-L1 (рис. 7H; дополнительная рис. S4C).

В совокупности наши результаты свидетельствуют о том, что взаимодействие EV меланомного происхождения с миелоидными клетками как в организме человека, так и в мышиной системе приводит к усилению экспрессии PD-L1 на этих клетках и к приобретению их способности ингибировать активность Т-клеток. .

Обсуждение

Хотя первоначальные сообщения показали, что ЭВ, высвобождаемый опухолевыми клетками, может быть уникальным источником опухолеассоциированных антигенов и стимулировать опосредованные Т-клетками противоопухолевые иммунные ответы (28, 29), многочисленные исследования за последнее десятилетие показали, что EV опухолевого происхождения играют значительную роль в прогрессировании опухоли (16, 17, 30, 31). Сообщалось, что ЭВ важен для подготовки метастатических ниш и для развития резистентности к терапии (13, 31, 32). Кроме того, внимание было уделено способности EV опухолевого происхождения ослаблять иммунные функции хозяина.В частности, было обнаружено, что опухолевые EV нарушают функцию Т-клеток и NK-клеток (19, 32, 33), индуцируют регуляторные Т-клетки (34) и превращают нормальные миелоидные клетки в сильнодействующие иммуносупрессивные MDSC (10, 12–14, 35).

Однако молекулярный механизм такого EV-опосредованного образования MDSC из нормальных миелоидных клеток до сих пор не ясен. Здесь мы обнаружили, что нормальный мышиный IMC сильно активировал PD-L1 и приобретал способность ингибировать функции Т-клеток при лечении EV, полученным из клеток меланомы Ret, что позволяет предположить, что эти EV-образованные клетки могут быть определены как MDSC (3).Кроме того, блокирование PD-L1 привело к существенному ослаблению их иммуносупрессивного потенциала, что указывает на важность индукции PD-L1 в превращении IMC в MDSC.

Было показано, что экспрессия PD-L1 участвует в опосредованном MDSC ингибировании Т-клеток посредством связывания с PD-1, экспрессируемым на эффекторных Т-клетках (3–5, 9). В нескольких недавних публикациях сообщалось, что EV, происходящие из опухоли, могут экспрессировать PD-L1 на поверхности и напрямую передавать сигналы Т-клеткам, тем самым подавляя их функции и опосредуя уклонение от иммунного ответа (33, 34, 36–38).Кроме того, сообщалось, что экспрессия PD-L1 на EV от пациентов с раком головы и шеи положительно коррелирует с прогрессированием заболевания (32, 39). Однако мы обнаружили слабую экспрессию PD-L1 в ЭВ, выделенных из клеток меланомы мыши и человека. Более того, Ret-EV может индуцировать сильную активацию PD-L1 на уровне белка и мРНК в клетках IMC и MSC-2, но не в клетках MSC-1. Кроме того, блокирование синтеза мРНК актиномицином D в клетках MSC-2 приводило к полной отмене экспрессии PD-L1. Все эти данные указывают на то, что в нашей системе PD-L1 скорее индуцировался de novo через рецепторы миелоидных клеток, но не переносился EV в эти клетки.

HSP известны как шапероны, контролирующие правильную укладку вновь синтезированных белков. Однако при определенных условиях, таких как стресс или рак, они могут высвобождаться и действовать как связанные с повреждением молекулярные паттерны, активируя иммунную систему посредством связывания с TLR (40). Ранее было описано, что HSP экспрессируются на EV (15, 16). Таким образом, было обнаружено, что EV-опосредованный HSP72 стимулирует функции MDSC посредством активации STAT3 и секреции цитокинов, опосредованной передачей сигналов TLR2 (12).Также сообщалось, что несколько других HSP, таких как HSP70, HSP90 или HSP105, связаны с EV и запускают TLR2 или TLR4 (41–43). Было продемонстрировано, что TLR2 может активироваться экзосомальным простагландином E2 (11). Кроме того, EV-индуцированная стимуляция экспрессии PD-L1 на моноцитах может быть опосредована передачей сигналов TLR7 (35). Здесь мы идентифицировали ось HSP86/TLR4 как основной фактор активации PD-L1, хотя нельзя было исключить вклад TLR2 или TLR7. В согласии с нашими данными Cheng и коллеги (44) сообщили, что EV, полученный из клеток гепатоцеллюлярной карциномы, индуцирует экспрессию PD-L1 в моноцитарной клеточной линии человека THP-1 и мышиной клеточной линии макрофагов RAW264. 7; однако авторы не обращались к механизму этой индукции. Поскольку они наблюдали снижение опосредованной EV стимуляции PD-L1 при обработке опухолевых клеток мелатонином, который, как ранее сообщалось, снижает индукцию нескольких HSP после окислительного стресса (45), мы полагаем, что HSP86 может стимулировать экспрессию PD-L1 также в их система. Кроме того, недавно было продемонстрировано, что ЭВ, выделенный из стволовых клеток глиобластомы, индуцирует PD-L1 на нормальных моноцитах человека посредством активации STAT3 (46).

Недавно мы сообщили, что четко определенный набор микроРНК, экспрессируемых в EV меланомного происхождения, может преобразовывать нормальные моноциты человека в MDSC (47). Поскольку ранее было продемонстрировано, что некоторые miRNAs активируют эндосомальные TLR, такие как TLR7 и TLR8 (48), возможно, что miRNA, описанная Huber et al. (47), может способствовать конверсии MDSC путем передачи сигналов через TLR. Таким образом, кажется, что разные молекулы (например, липиды, РНК, белки) могут стимулировать различные TLR, что приводит к индукции экспрессии PD-L1.

Изучая повышенную регуляцию PD-L1 на миелоидных клетках с помощью EV , полученного из меланомы, in vivo , мы инъецировали Ret-клетки, трансдуцированные вектором CD81-GFP, мышам дикого типа. Мы продемонстрировали присутствие CD11b + Gr1 + MDSC, экспрессирующих GFP, в TME, предполагая, что MDSC получили CD81-GFP, скорее всего, посредством поглощения Ret-EV. Изолированный ex vivo , GFP + MDSC показал тенденцию к более высокой интенсивности экспрессии PD-L1 по сравнению с их аналогами GFP .Хотя мы не можем исключить, что MDSC получают сигнал GFP посредством фагоцитоза, эти результаты согласуются с нашей предыдущей публикацией, в которой использовалась система Cre-Lox для отслеживания поглощения EV, секретируемого клетками карциномы легких Льюис (14), и предполагается, что индукция PD-L1 на MDSC также может происходить in vivo .

HSP при раке стали новыми терапевтическими мишенями. Недавно было продемонстрировано, что ингибирование HSP90 усиливает иммунотерапию рака за счет активации генов ответа на IFN (49). Кроме того, ингибирование HSP90 в клетках меланомы предотвращает индукцию функциональных MDSC, проявляя нарушенную способность ингибировать пролиферацию Т-клеток in vitro (50). В модели саркомы мыши MCA205 применение ингибитора HSP90 17-DMAG in vivo приводило к замедлению развития опухоли и снижению уровня MDSC в TME (51). Мы сообщили здесь, что ингибирование или нокдаун HSP86 в клетках Ret или клеточных линиях меланомы человека отменяет способность высвобожденного EV индуцировать активацию PD-L1.Хотя это наблюдение, скорее всего, связано с истощением HSP86 на поверхности EV, мы не можем исключить возможность того, что механизм HSP участвует в сортировке различных соединений в EV. Чтобы прояснить этот момент, необходимы будущие эксперименты.

В совокупности наши данные подчеркивают молекулярный механизм превращения нормальных миелоидных клеток мыши и человека в MDSC под действием EV, происходящих из меланомы. Он включает в себя запуск в основном TLR4 на миелоидных клетках с помощью индуцируемого HSP86 в EV, что приводит к активации NF-κB и усилению экспрессии PD-L1. Блокирование передачи сигналов TLR4 или прямая экспрессия PD-L1 приводили к отмене иммуносупрессивной способности миелоидных клеток, обученных EV, что указывает на критическую роль этого пути, индуцирующего PD-L1, в приобретении иммуносупрессивных свойств. Основываясь на характеристиках этих EV, таких как размер и экспрессия эндоцитарного маркера ALIX, вероятно, что экзосомы, а не микровезикулы, в основном ответственны за описанные эффекты. Наши данные предполагают возможность образования MDSC при раке не только за счет ингибирования дифференцировки IMC с помощью медиаторов воспаления (3–8), но также за счет перепрограммирования нормальных миелоидных клеток с помощью EV опухолевого происхождения, что может поддерживаться высокой пластичностью этих клеток в носители опухоли (52).

Раскрытие информации о потенциальном конфликте интересов

Дж. Утикал сообщает о получении гонораров от бюро докладчиков и является консультантом/членом консультативного совета по меланоме. Другие авторы не сообщили о потенциальных конфликтах интересов.

Авторский вклад

Концепция и дизайн: В. Флеминг, Х. Ху, П. Альтевогт, В. Уманский

Разработка методологии: В. Флеминг, X. Ху, Р. Вебер, К. Грот, В. Нагибин, П.Altevogt, V. Umansky

Сбор данных (предоставление животных, приобретение и лечение пациентов, предоставление помещений и т. д.): V. Fleming, X. Hu, C. Weller, R. Weber, C. Groth, Z. Riester, L. Hüser, V. Nagibin, C. Kirschning, V. Umansky

Анализ и интерпретация данных (например, статистический анализ, биостатистика, вычислительный анализ): V. Fleming, X. Hu, C. Weller, R. Weber, C. Groth, L. Hüser, V. Bronte, J. Utikal, P. Altevogt, V. Umansky

Написание, рецензирование и/или доработка рукописи: V.Fleming, X. Hu, R. Weber, C. Groth, Z. Riester, J. Utikal, P. Altevogt, V. Umansky

Административная, техническая или материальная поддержка (например, отчетность или организация данных, создание баз данных) : Q. Sun, J. Utikal, V. Umansky

Руководство исследованием: P. Altevogt, V. Umansky

Другое (точечное редактирование текста и ввод данных, специфичных для TLR): C. Kirschning

Благодарности

Авторы благодарят С. Улига за помощь в сортировке клеток и Е.Корделлу за помощь в подготовке статьи. Эта работа была поддержана, в частности, грантами Немецкого исследовательского совета (RTG2099 для Дж. Утикала и В. Уманского), DKFZ-MOST Colourship in Cancer Research (CA181 для В. Уманского) и Итальянской ассоциации исследований рака. (Грант IG 18603 и Специальная программа молекулярной клинической онкологии 5 промилле, 12182 В. Бронте).

Затраты на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страниц. Таким образом, эта статья должна быть помечена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Section 1734 исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

Сноски

  • Примечание: Дополнительные данные для этой статьи доступны на веб-сайте Cancer Research Online (http://cancerres.

Author: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.