Таблица органоид строение функция 9 класс: Таблица по биологии «Строение и функции органоидов клетки» скачать

Ход урока

I. Организационный момент.

II. Мотивация.

III.

IV. Изучение нового материала.

А теперь обобщим полученные знания (ученики выполняют задания в виде теста).

1. Органоиды, расположенные на гранулярной ЭПС и участвующие в биосинтезе белка,– это:

А. Лизосомы; б. Митохондрии; в. Рибосомы; г. Хлоропласты.

2. Органоид ограниченный от цитоплазмы одной мембраной, содержащий множество ферментов:

А. Митохондрии; б. Аппарат гольджи; в.рибосома; г. Лизосома.

3.Лизосомы в клетки образуются в:

А. Эндоплазматической сети; б. Митохондриях;  В. Клеточном центре; г.комплексе гольджи.

4. Функции шероховатой ЭПС:

А. Транспорт веществ и синтез белков; Б. Переваривание органических веществ; В. Участие в межклеточных контактах; Г. Образование рибосом.

5.ЭПС имеется в цитоплазме:

А. Всех клеток; б. Только животных клеток; в.только растительных клеток; г.всех клеток, за исключением клеток прокариот.

1. Прочитать стр. 35-37 учебника.

2. Подготовить ответы на вопросы №2, 3,4.

3. Составить тест по теме “Функции органоидов клетки”.

Презентация

$4. Органоиды клетки | 8 класс Учебник «Биология» «Атамура»

Органоиды это части клетки, имеющие постоянное строение и выполняющие определенные функции. Содержатся они в цитоплаз­ме (см. рис. 8). Функции клетки выполняются только с помощью ор­ганоидов.

Эндоплазматическая сеть (ЭПС) — образование, состоящее из тес­но прилегающих друг к другу канальцев и цистерн, отделенных от Цитоплазмы мембраной. Канальцы и цистерны ЭПС обеспечивают взаимосвязь между различными органоидами клетки. Различают гладкую и шероховатую ЭПС. На шероховатой ЭПС находятся рибо­сомы. Там образуются белки. Гладкая ЭПС участвует в синтезе жи­ров и полисахаридов.

Рибосомы — мелкие, зерновидные органоиды, свободно располага­ющиеся в цитоплазме или на шероховатой ЭПС. Они осуществляют синтез белка.

Митохондрии присутствуют во всех живых клетках. По форме они могут быть округлыми, овальными, удлиненными, палочковид­ными или нитевидными. В клетке бывают десятки, тысячи митохон­дрий. Каждая из них состоит из двух мембран. Наружная мембрана гладкая, внутренняя имеет выросты.

Митохондрии высвобождают энергию, которая образуется при сжигании (окислении) питательных вешеств при их взаимодействии с кислородом в процессе клеточного дыхания. Кроме того, в них синте- ^зиРУются некоторые жирные кислоты.

Лиэосомы — мелкие теля округлой и овальной формы, окруженные

мембраной. Содержат до 40 ферментов, иод воздействием которых пе­ревариваются различные вещества или уничтожаются бактерии.

Центрио.ш — два маленьких тела цилиндрической формы, распо­ложенные вблизи ядра. При делении клетки в начальной фазе две центриоли расходятся друг от друга к двум полюсам клетки. Между ними появляются веретеновидные нити. Принимая участие в деле­нии клетки, центриоли отвечают за равномерное распределение хро­мосом по дочерним клеткам.

Комплекс (аппарат) Голъджи — сложная сеть «канальцев*, распо­ложенных вокруг ядра. Обеспечивает транспорт веществ в клетке, вывод из клетки конечных продуктов.

Различия растительной и животной клетки:

1.   В животной клетке имеются центриоли. В клетке высших рас­тений центриолей не бывает.

2.   В животной клетке не бывает пластид, потому что животные питаются готовыми органическими веществами. Растения же в про­цессе фотосинтеза с помощью пластид образуют органические веще­ства из углекислого газа и воды за счет энергии света.

3.  Плотная целлюлозная оболочка бывает только у растений. Она препятствует изменению формы растительных клеток. Оболочка жи­вотной клетки — только подвижная и упругая мембрана. Из гладкой она может вдруг стать шершавой или пузырчатой. У мышечных кле­ток изменяется длина.

4.  У растений бывают крупные вакуоли, а у животных они встре­чаются только у простейших организмов, например, сократительная вакуоль.

К основным жизненным свойствам клетки, как и организма в целом, относятся обмен веществ, раздражимость (возбудимость), рост, развитие и размножение. Жизненные свойства обеспечивают посто­янство состава внутренней среды.

К внутренней среде организма относятся кровь, лимфа и меж­клеточная (тканевая) жидкость. Из этой среды через мембрану в клет­ку всасываются все необходимые вещества, и через нее же удаляются продукты распада.

Обмен веществ — непрерывный контакт и обмен между клеткой и окружающей средой через дыхание, питание, выделение. В клетку поступают питательные вещества и кислород, а из клетки в окружа­ющую среду выводятся продукты распада.

Наш орпшизм может «строить» собственные вещества из компонен­тов белков, жиров и углеводов, поглощенных с пищей. То есть превра­щать их в наши собственные белки, жиры и углеводы. Из этого строи­тельного материала образуются новые клетки и органы. Процесс «стро­ительства * собственных органических веществ называется Гшоси/ипемм.

Кислород окисляет белки, жиры и углеводы. При этом выделяет­ся энергия, которая используется для обеспечения жизнедеятельное-

ти клетки. Соединение кислорода с веществами клетки называется клеточным дыханием.

Разд/хгжимость (возбудимость) — возбуждение клетки под влия­нием разных раздражителей окружающей среды. Раздражителями являются холод, жара, механические воздействия, например при­косновение, химические вещества и др.

Размножение обеспечивается делением клетки. Вначале делит­ся ядро, затем цитоплазма. Перед каждым делением удваивается число хромосом. Примерно поровну делятся и все клеточные орга­ноиды. Размножение — основа сохранения жизни, т. к. позволяет осуществлять обновление клеток, которые постепенно изнашива­ются и гибнут.

Рост клеток осуществляется за счет процессов биосинтеза.

Каждая из образовавшихся при делении дочерних клеток рас­тет и достигает размеров материнской клетки. Продолжительность жизни клеток различна. Так, клетки кожи обновляются через 1-2 недели. А нервные и мышечные клетки живут долго, иногда более 100 лет.

Клетки и окружающие их вещества в организме объединяются в ткани, органы, системы органов и целостный организм.

1. Назовите органоиды клетки.

2.   Какую функцию выполняют лизосомы и рибосомы?

3.   В чем заключается назначение эндоплазматической сети (ЭПС)?

2.   Каковы отличия растительной и животной клеток?

3.   Назовите основные жизненные свойства клетки.

3.   Расскажите об основных жизненных свойствах клетки.

границ | Органоиды среднего мозга: новый инструмент для исследования болезни Паркинсона

Введение

Развитие методологии органоидов сегодня считается крупным технологическим прорывом в исследованиях стволовых клеток. Он позволил добиться огромных успехов в применении индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) и даже был отмечен как «Метод года» в 2017 году («Lancaster et al., 2013»).

Церебральные органоиды

Первые эксперименты по самоорганизации ЦПС в трехмерных условиях были выполнены более 10 лет назад.Тем не менее, именно открытия Ланкастера и др. Фактически открыли новую эру в исследованиях человеческого мозга, представив в 2013 году «церебральные органоиды» (Lancaster et al., 2013; Kelava and Lancaster, 2016b). Подтверждая выводы первоначальных экспериментов с трехмерной культурой, Lancaster et al. воспользовались внутренней самоорганизацией PSCs и получили нейроэпителий в трехмерных условиях (Kadoshima et al., 2013). Чтобы избежать ограничений на идентичность конкретных областей мозга, они не добавляли паттернирующие факторы роста.Вместо этого после агрегации клетки были встроены в Matrigel, суррогатный матрикс, который ранее был введен для генерации органоидов кишечника (Sato et al., 2009). Это служит структурной поддержкой, вызывая стимул правильной полярности, способствующий сложному разрастанию крупных апикобазальных нейроэпителиальных зачатков (Lancaster and Knoblich, 2014a; Wang X. et al., 2018). Эти зачатки расширяются в ходе культивирования и приобретают не только различные особенности мозга, но и заполненные жидкостью просветы, напоминающие желудочки мозга.Для улучшения снабжения питательными веществами и кислородного обмена плавающие церебральные органоиды культивировали во вращающихся биореакторах или на орбитальных шейкерах, что позволяло органоидам расти до 4 мм в диаметре (Lancaster and Knoblich, 2014a; Kelava and Lancaster, 2016b). Эти оптимизированные условия роста в сочетании с присущими ПСХ способностями к самоорганизации привели к формированию множества областей мозга в пределах одного органоида, включая задний мозг, средний мозг, передний мозг и даже ткани сетчатки (Lancaster et al., 2013; Ланкастер и Кноблих, 2014b; Реннер и др., 2017; Wang X. et al., 2018). Примечательно, что подробное исследование событий формирования паттернов в ходе развития и дифференциации церебральных органоидов показывает, что пространственные и временные паттерны напоминают те, которые определяют развитие человеческого мозга (Renner et al., 2017).

Модификация церебральных органоидов

Классический протокол церебральных органоидов, описывающий генерацию общих органоидов всего мозга, был изменен многими исследовательскими группами в последние годы и привел к образованию более регионально специфичных трехмерных клеточных культур (Lancaster and Knoblich, 2014a; Lancaster et al. al., 2016). В исследовании Paşca et al., 2015) пути передачи сигналов как костного морфогенетического белка (BMP), так и трансформирующего фактора роста β (TGF-β) ингибировались небольшими молекулами дорсоморфина (DM) и SB-431542 (SB) для достижения эффективная нейронная индукция. Это двойное ингибирование SMAD в сочетании с фактором роста фибробластов (FGF) 2, эпидермальным фактором роста (EGF) и отсутствием внеклеточного каркаса привело к появлению нейральных предшественников, экспрессирующих дорсальные маркеры теленцефалии, парный белок 6 (PAX6) и вилкохед-бокс. белок G1 (FOXG1).Дальнейшей дифференцировке нейронов способствовала замена FGF2 и EGF нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF) и нейротрофическим фактором 3 (NT3), что привело к формированию различных нейронных и глиальных идентичностей дорсальной коры внутри каждого сфероида, включая поверхностный и глубокий кортикальный слой. слой нейронов (Paşca et al., 2015; Kelava, Lancaster, 2016b). При этом Paşca et al. описал метод, который привел к созданию трехмерной культуры, специфичной для подобласти мозга; культура, которая показала меньшее количество эктодермальных производных по сравнению с исходным протоколом церебральных органоидов.Аналогичный подход к использованию двойного ингибирования SMAD был опубликован Qian et al. (2016). Поддерживая основы протокола LANCASTER , такие как встраивание и перемешивание матригеля, они продемонстрировали, что можно культивировать органоиды в миниатюрных биореакторах, напечатанных на 3D-принтере, что делает возможным более осуществимое и масштабное производство нейронных 3D-культур (Qian et al. ., 2016). Еще одним преимуществом многолуночного прядильного устройства собственной разработки является возможность параллельного сравнения множества различных условий культивирования.Paşca et al. направлен на снижение тканевой неоднородности органоидов головного мозга и, следовательно, предварительно сформировал рисунок эмбриоидных тел (EB) для получения определенных областей мозга. Ингибирование передачи сигналов TGF-β с помощью SB и активация передачи сигналов Wnt ингибитором гликоген-синтазы киназы 3 (GSK-3β) CHIR-99021 (CHIR) в течение первых 2 недель культивирования привело к образованию органоидов переднего мозга в виде определенных, многослойных зоны-предшественники, включая гомологи желудочковой зоны (VZ), внутренней и внешней субвентрикулярной зон (SVZ).Более того, типы нейронов всех шести корковых слоев могут быть обнаружены внутри этих органоидов, специфичных для переднего мозга. С помощью мини-биореакторов Qian et al. (2016) также разработали метод получения органоидов, специфичных для гипоталамуса. После двойного ингибирования SMAD с помощью SB и LDN-1 (LDN) они сформировали паттерн нейроэктодермальных клеток по гипоталамической судьбе, активируя передачу сигналов Wnt и sonic hedgehog (SHH), применяя WNT3a, SHH и пурморфамин (PMA) в культуре. Через 40 дней эти органоиды содержали популяции клеток, экспрессирующие маркеры, специфичные для клонов нейронов гипоталамуса (Qian et al., 2016).

Моделирование заболеваний с помощью органоидов головного мозга

Схожие характеристики на молекулярной, клеточной и физиологической основе органоидов человеческого мозга и реального человеческого мозга оправдывают их все более широкое применение в изучении биологии мозга и моделировании неврологических расстройств (Wang Y. et al., 2018). Уже Ланкастер и др. (2013) открыли потенциал церебральных органоидов в качестве модели для обнаружения нарушений нервного развития и получили органоиды, несущие мутацию, вызывающую микроцефалию.Было также высказано предположение, что инфекция, вызванная вирусом Зика (ZIKV), вызывала микроцефалию у новорожденных. В 2016 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила ZIKV и связанные с ним осложнения чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения (Qian et al., 2016; Dutta et al., 2017). Эта активизация глобального исследовательского сообщества привела к ускоренной разработке вакцин и методов лечения, при этом многие исследования были основаны на церебральных органоидах, которые смогли воспроизвести особенности коркового развития человека in vitro (Cugola et al., 2016; Dang et al., 2016; Garcez et al., 2016; Шахтер и алмаз, 2016; Новаковски и др., 2016; Qian et al., 2016; Wells et al., 2016; Сюй и др., 2016). Результаты этих исследований показывают, что инфекция ZIKV влияет на нейрогенез, разрушает корковые слои органоидов и аналогичным образом вызывает микроцефалический дефицит коркового развития (Dutta et al., 2017). Из-за специфического эмбрионального формирования человеческого мозга только специфическая для человека трехмерная модель клеточной культуры, демонстрирующая расширенные организационные особенности, могла привести к описанным открытиям.Ни мышиная, ни 2D-культура клеток не смогли выявить потенциальную связь между ZIKV и микроцефалией (Qian et al., 2016; Dutta et al., 2017; Setia and Muotri, 2019). В дополнение к этому успешному применению органоиды мозга оказались полезными для изучения других неврологических расстройств. Недавно были установлены так называемые «тумроиды» из глиобластомы человека, наиболее распространенного и агрессивного рака мозга (Dutta et al., 2017). Гипоксические градиенты и гетерогенность стволовых клеток, обнаруженные в этих опухолях, не могут быть воссозданы с помощью обычных методов культивирования.Таким образом, органоиды глиобластомы открывают уникальные возможности для их применения в диагностике и лечении рака мозга (Hubert et al., 2016; Dutta et al., 2017; Bian et al., 2018). Кроме того, сообщалось о двух различных подходах с использованием трехмерных систем культивирования нервных клеток человека для повторения фенотипов болезни Альцгеймера (БА) in vitro (Choi et al., 2014; Raja et al., 2016). Эти 3D-культуры обеспечивают среду, которая способствует образованию бляшек амилоида-β (Aβ) и нейрофибриллярных клубков (NFT), патологических событий, которые ранее не могли быть последовательно связаны с использованием культивированных 2D-нейронов человека (Choi et al., 2014, 2016; D’Avanzo et al., 2015; Raja et al., 2016). Это подтверждает, что развивающаяся методология органоидов мозга способствует разработке более точных клеточных моделей человека, которые могут поддержать исследования нейродегенеративных расстройств. Технология более сложных систем трехмерных культур клеток не только устраняет разрыв между традиционными экспериментами 2D in vitro и in vivo на животных моделях , но также обращается к процессам, которые невозможно воспроизвести с помощью этих традиционных моделей.Например, неэффективность лекарственного средства или непредвиденные побочные эффекты при трансляции в организм человека могут быть результатом различного метаболизма людей и животных. Таким образом, человеческие органоиды дают возможность раскрыть сложные биологические процессы, такие как развитие человеческого мозга, где обычные модели не оказались успешными. Создание органоидов головного мозга, полученных из стволовых клеток, позволяет моделировать ключевые аспекты развития человеческого мозга in vitro , используя огромный потенциал дифференцировки ПСХ и их способность к самоорганизации с определенной пространственной ориентацией.В целом, эта новая технология обеспечивает физиологически релевантный контекст, такой как взаимодействие между клетками глии и нейронами в пространственно организованной микросреде, что имеет большой потенциал для ее применения при моделировании неврологических заболеваний.

Обсуждение

Отсутствие передовых экспериментальных моделей in vitro , которые действительно повторяют сложность человеческого мозга, является одним из основных ограничений в нейробиологии и в области моделирования заболеваний. Текущие подходы in vitro к моделированию физиологии и патологии человеческих нейронов в первую очередь основаны на культурах нейронов, выращенных в 2D-условиях.Хотя полученные однослойные культуры клеток оказались полезными в качестве инструмента для изучения механизмов заболевания и выявления потенциальных нейрозащитных соединений (Nguyen et al., 2011; Cooper et al., 2012; Sánchez-Danés et al., 2012; Reinhardt et al. , 2013b; Ryan et al., 2013; Qing et al., 2017; Spathis et al., 2017), эти условия культивирования не моделируют некоторые характеристики, относящиеся к человеческому мозгу. Такие особенности, как межклеточные взаимодействия и цитоархитектура, могут иметь решающее значение для прогнозирования эффективности in vitro протестированных соединений в клинических испытаниях (Abe-Fukasawa et al., 2018). В этом случае технология органоидов человеческого мозга in vitro и является ценным инструментом, она дает возможность понять сложную биологию в физиологически релевантном контексте, а также способствует развитию трансляционных приложений (Fatehullah et al., 2016). Первоначально подходы к изучению органоидов мозга основывались на эндогенной способности PSCs самоорганизовываться в трехмерных условиях, по сути следуя ранним этапам развития мозга (Arlotta, 2018). Эти подходы привели к появлению эктодермальных производных со сложной цитоархитектурой, превышающей то, что возможно с производными 2D PSC (Kadoshima et al., 2013; Ланкастер и др., 2013; Paşca et al., 2015). Поскольку нейроны образуют функциональные сети с другими нейронами и ненейронными клетками мозга, важно расширить исследования нейродегенеративных заболеваний, используя 3D-модели, которые способны воспроизводить эти взаимодействия. В целом, трехмерные условия способны более точно имитировать среду in vivo и и, следовательно, обеспечивают ускоренную дифференцировку нейронов и формирование сети in vitro (Haycock, 2011; D’Avanzo et al., 2015). Более того, было показано, что нейроны, развившиеся в трехмерной среде, экспрессируют более представительный диапазон нейрональных генов, чем нейроны, полученные в двумерных условиях (Seidel et al., 2012). Монослой нейронов не может обеспечить столько связей между отдельными клетками, как трехмерная нейрональная культура, а меньшие синаптические расстояния в трехмерной нейронной сети способствуют передаче функционального сигнала (Cullen et al., 2012; D’Avanzo et al., 2015). Создавая третье измерение, нейроны развиваются в среде, которая ближе к природе и действительно соответствует физиологии человека, в результате чего приобретают морфологические и физиологические свойства, аналогичные свойствам in vivo .

В частности, создание и характеристика новой системы трехмерных культур клеток среднего мозга обеспечивает расширенную модель in vitro для изучения процессов развития нервной системы, а также нейродегенеративных заболеваний среднего мозга человека. Чтобы достичь образования этих высокоспециализированных структур, отчетливо напоминающих средний мозг человека, органоиды были получены из нейральных стволовых клеток (NSC) с региональной структурой. Эта конкретная исходная популяция, уже преданная судьбе вентральной нервной трубки среднего мозга с дальнейшим применением пространственно-временной специфической передачи сигналов в условиях 3D-культивирования, привела к созданию новых человеческих органоидов, специфичных для среднего мозга (hMO).Здесь мы сравниваем и оцениваем недавно разработанные методы hMO, которые создают мощный инструмент для моделирования заболеваний in vitro и неврологических расстройств, специфичных для человека.

Получение органоидов, специфичных для среднего мозга

Для получения in vitro производного среднего мозга человека требуются дополнительные стимулы определенных путей наряду с 3D-культурой PSC. На сегодняшний день различными исследовательскими группами было опубликовано шесть подходов к 3D-культуре клеток для получения ткани, напоминающей особенности среднего мозга человека (Tieng et al., 2014; Jo et al., 2016; Qian et al., 2016; Monzel et al., 2017; Ким и др., 2019; Smits et al., 2019b). Все эти подходы можно отнести к предыдущим экспериментам на 2D клеточных культурах, в которых изучались фундаментальные принципы генерации и характеристики судьбеспецифических клеток среднего мозга, полученных из PSC посредством экзогенных сигналов формирования паттерна (Kriks et al., 2011; Kirkeby et al. , 2012; Reinhardt et al., 2013a). Например, Qian et al. были вдохновлены 2D-экспериментами, проведенными Kriks et al.(2011), а также первоначальные эксперименты с тканями среднего мозга, о которых сообщили Tieng et al. (2014) и (Qian et al., 2016). В том же году был опубликован другой протокол, описывающий генерацию чМО (Jo et al., 2016). Jo et al. (2016), а позже Kim et al. (2019) основали свой вывод на выводах Chambers et al. (2009). Кроме того, протоколы hMO, описанные Monzel et al. (2017) и Smits et al. (2019b) основаны на 2D-экспериментах Рейнхардта и др. (2013a).

Начальным этапом образования hMO является образование EB и индукция нейроэктодермы посредством двойного ингибирования SMAD.Во всех сравниваемых здесь протоколах hMO SB использовался для ингибирования сигнального пути Activin / TGF-β (Таблица 1). Комбинация с ингибиторами пути BMP обеспечивает полную нейронную конверсию PSC. Использование антагонистов BMP Noggin, LDN и DM было показано в 2D (Chambers et al., 2009; Kriks et al., 2011; Reinhardt et al., 2013a) и применено в трехмерных культурах стволовых клеток (Таблица 1). Чтобы контролировать спецификацию нервных клеток-предшественников, CHIR, мощный химический ингибитор GSK-3β, был использован для дозозависимой активации сигнального пути WNT (Kirkeby et al., 2012). Окончательное формирование паттерна в отношении предшественников пластин дна среднего мозга требует обработки низкомолекулярными активаторами сигнального пути SHH, такими как рекомбинантный SHH, PMA или сглаженный агонист (SAG) (Kriks et al., 2011; Smits et al., 2019b) . Такой состав экзогенных сигналов формирования паттерна приводит к появлению нейральных предшественников, которые могут дать начало аутентичным, специфичным для среднего мозга дофаминергическим нейронам (мДАН) (Kriks et al., 2011; Kirkeby et al., 2012; Doi et al., 2014; Nolbrant et al. ., 2017).

Таблица 1. Сравнение протоколов получения hMO: Обзор применяемых соединений для получения нейроэлектодермы, специфичной для среднего мозга, путем нейрональной индукции.

Дальнейшее развитие этих протоколов позволило получить трехмерную культивированную hMO. В отличие от 2D однослойных культур, hMOs могут воспроизводить сложные взаимодействия mDAN с другими типами клеток центральной нервной системы (ЦНС) в трехмерной среде. Кластерный анализ, сравнивающий дифференциально экспрессируемые гены hMO, 2D-культивируемые mDAN и пренатальные образцы среднего мозга человека, показал, что hMOs имеют общие черты профилей экспрессии генов пренатального среднего мозга, которые не могут быть воссозданы с помощью обычного метода 2D-деривации для mDAN (Jo et al. al., 2016). Это демонстрирует, что специфическая клеточная структура и гетерогенность культур органоидов, специфичных для среднего мозга, позволяют моделировать биологические аспекты, которые не могут быть воспроизведены с помощью современных 2D культур стволовых клеток. Кроме того, огромное количество мДАН, относящихся к заболеванию, может быть произведено быстрым и воспроизводимым способом, что требуется для моделирования заболеваний и открытия лекарств в области болезни Паркинсона (БП). Многочисленные опубликованные протоколы описывают получение вентральных мДАН из человеческих ПСК в 2D путем репликации mDAN in vivo — спецификации in vitro (Kriks et al., 2011; Киркеби и др., 2012; Doi et al., 2014; Нолбрант и др., 2017). Хотя текущие протоколы основаны на генерации LMX1A / FOXA2-положительных предшественников донных пластинок среднего мозга, дифференциация, начинающаяся с PSCs, занимает много времени и обычно приводит к культурам, содержащим различные нейрональные идентичности (Hargus et al., 2010; Kriks et al., 2011; Kirkeby et al., 2012; Grealish et al., 2014). Как правило, органоиды головного мозга генерируются из ПСХ путем использования процессов развития (Lancaster et al., 2013; Clevers, 2016) или создавая среду, благоприятствующую конкретным нишам стволовых клеток (Tieng et al., 2014; Jo et al., 2016; Qian et al., 2016; Kim et al., 2019). Однако использование NSC в качестве исходной популяции для hMO имеет то преимущество, что уже сформированные клетки более эффективно дифференцируются в желаемые структуры. Другие культуры органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток, были созданы, например, для создания органоидов кишечника или легких. Они содержат типы клеток, которые присутствуют в органе, из которого они были получены, и воспроизводят некоторую степень его пространственной организации (Clevers, 2013; Huch and Koo, 2015; Drost and Clevers, 2017).Точно так же присутствие ниш стволовых клеток среднего мозга и кластеров мДАН было показано в модели чМО, полученной из NSC, и сообщалось о подходах к эффективной дифференцировке мДАН в чМО, начиная с расширяемых нервных клеток-предшественников (NPC) (Monzel et al., 2017; Smits et al., 2019a, b; таблицы 2, 3). В этих подходах использовались NPC, которые уже получили некоторый паттерн в направлении среднего мозга. Обе модели hMO уже использовались в других исследованиях (Berger et al., 2018; Jan et al., 2018; Jarazo et al., 2019). Среди опубликованных протоколов hMO были представлены различные подходы для оценки количества мДАН, которые возникают во время развития органоидов (таблица 2). Tieng et al. (2014) диссоциировали свои трехмерные структуры и культивировали полученные одиночные клетки как монослой (Qian et al., 2016). Их количественная оценка дала более 60% TH-положительных клеток в 21-дневных культурах (Tieng et al., 2014) и около 55% TH-положительных клеток через 65 дней (Qian et al., 2016). Более простой метод количественной оценки популяции mDAN — это проточная цитометрия с помощью сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), которая также требует диссоциированных hMOs.Таким образом, было показано, что после 61 дня культивирования около 64% ​​клеток были трижды положительными по маркерам mDAN TH, LMX1A и FOXA2 (Monzel et al., 2017). Удивительно, но тем же методом Jo et al. (2016) идентифицировали только около 22% MAP2-позитивных нейронов, коэкспрессирующих TH в своих чМО после 60 дней культивирования. Третий подход к оценке процента мДАН в чМО был описан недавно (Bolognin et al., 2019; Smits et al., 2019b). Здесь алгоритмы анализа изображений позволили автоматизировать сегментацию ядер и нейронов, при этом было определено около 62% TH-положительных клеток через 35 дней и около 54% ​​TH-положительных клеток после 70 дней 3D-культивирования.Применение анализа изображений с высоким содержанием позволяет исследовать целые срезы органоидов, а не отдельные диссоциированные клетки, что сохраняет исходную морфологию и межклеточные взаимодействия мДАН. TH — это маркер, обычно используемый для обнаружения мДАН, поскольку это фермент, ограничивающий скорость биосинтеза DA. Однако он также экспрессируется в других типах катехоламинергических клеток и не является уникальным маркером, специфичным для мДАН, как, например, в случае переносчика дофамина (DAT) или фактического присутствия нейромедиатора DA (Abeliovich and Hammond, 2007). .Об экспрессии DAT сообщалось почти в каждой модели hMO (Jo et al., 2016; Qian et al., 2016; Monzel et al., 2017; Kim et al., 2019; Smits et al., 2019b; Таблица 2).

Tieng et al. (2014) не показали присутствия ДАТ в их сконструированных нервных тканях (ЛОР), но они смогли доказать синтез ДА с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) после лизиса клеток. Также Jo et al. (2016) и Kim et al. (2019) также применили тот же метод для оценки содержания DA в hMOs.Чтобы убедиться, что мДАН не только способны продуцировать DA, но и действительно могут высвобождать нейромедиатор, супернатант трехмерных культур можно проанализировать с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). СМИЦ и др. обнаружили высвобождение DA, которое увеличивается по мере созревания hMO (Smits et al., 2019b). Об интересном наблюдении впервые сообщили JO et al., Где они обнаружили нерастворимые темные отложения в своих hMO примерно через 60 дней (Jo et al., 2016). Используя окрашивание по Фонтана-Массон, они подтвердили, что эти гранулы были нейромеланином (NM), который является побочным продуктом биосинтеза DA и накапливается постнатально в nigra pars compacta (SNc) человеческого мозга (Zecca et al., 2003; Паска, 2018; Ким и др., 2019). Другие протоколы культивирования hMO также стимулировали производство NM (Monzel et al., 2017; Smits et al., 2019b; Таблица 2). Наличие NM — уникальная особенность мозга приматов (Pasca, 2018). Он не проявляется ни в мозге мышей, ни в органоидах, специфичных для среднего мозга (Fedorow et al., 2005; Доусон и др., 2010; Jo et al., 2016; Мартон и Пашка, 2016). MDAN дикого типа, полученные и культивируемые в монослойных условиях, продуцируют NM только после искусственной индукции экспрессии прогерина, которая связана с преждевременным старением (Miller et al., 2013; Sterneckert et al., 2014). Связанные с мембраной плотные пигментированные НМ были также обнаружены в долгосрочных культурах гомозиготных мутантных DJ-1 и идиопатических мДАН, полученных от пациентов с БП (Burbulla et al., 2017). В настоящее время неизвестно, оказывает ли NM защитный или повреждающий эффект на выживаемость клеток, однако доказано, что NM-содержащие mDAN из SNc особенно уязвимы во время протекания БП (Zecca et al., 2003; Jo et al., 2016; Мартон и Пашка, 2016). Следовательно, NM, содержащие hMOs, имеют большой потенциал для использования для моделирования in vitro PD, возможно, для выявления специфических фенотипов, которые не присутствуют в 2D-культурах дикого типа или мышиных моделях. Более того, hMOs обеспечивают основу для будущих исследований роли NM в PD (Marton and Paşca, 2016; Michel et al., 2016). Поскольку mDAN необходимы для моделирования среднего мозга человека, исследования hMO до сих пор были сосредоточены в основном на этом конкретном типе нейронов.Тем не менее, подробные исследования in vivo описали, что высвобожденный DA диффундирует в синаптические области глутаматергических и ГАМКергических синапсов и напрямую влияет на другие типы стриатальных клеток, включая нейроны, образующие островной / стриосомный путь ГАМК, холинергические интернейроны полосатого тела и полосатая ГАМК. интернейроны, обладающие рецепторами DA (Calabresi et al., 2014; Borroto-Escuela et al., 2018). Более того, дофаминергических нейронов черной субстанции, (SN) напрямую контролируются ГАМКергическим входом (Tepper and Lee, 2007).Данные этих исследований показывают, что наличие других подтипов нейронов важно для моделирования многофакторного заболевания, такого как БП. Первая транскрипционная характеристика hMO была проведена Jo et al. (2016), показав, что аспекты пренатальных профилей экспрессии генов среднего мозга были обнаружены в органоидах в отличие от традиционных мДАН, полученных из 2D (Консорциум GTEx, 2015; Lin et al., 2016). Для дальнейшей проверки профиля генетической экспрессии в ходе развития hMO они предложили провести анализ одноклеточного транскриптома, как это было показано ранее для церебральных органоидов (Camp et al., 2015; Kageyama et al., 2018). В недавнем исследовании одноклеточные транскриптомные данные hMO продемонстрировали повышенную экспрессию специфичных для нейронов и стволовых клеток генов через 35 дней по сравнению с 70-дневными hMO, в то время как корреляции только между генами и генами увеличивались. -специфические гены значительно увеличились на 70-е сутки (Smits et al., 2019a). Это означает возрастающую приверженность клеток судьбе нейрональных клеток в ходе развития органоидов и дополнительно поддерживает открытие прогрессивного созревания постмитотических нейронов.Идентификация этих нейрон-специфичных генов показала, что гены, активируемые в более ранний момент времени, особенно важны в процессах нейрогенеза, миграции и дифференцировки нейронов [например, ранний фактор В-клеток 3 (EBF3) (Гарсия-Домингес) , 2003) и молекула адгезии клеток L1 (L1CAM) (Patzke et al., 2016)], тогда как активированные гены в более поздний момент времени были вовлечены in vivo в модулирующий вклад в расширение нейритов [например, молекула с отталкивающим наведением B (RGMB), Ma et al., 2011]. Это указывает на более высокую приверженность клеток их предполагаемой судьбе и прогрессирующее созревание постмитотических нейронов внутри hMOs. Поскольку наличие нейрональных подтипов, глутаматергических и ГАМКергических нейронов в hMO уже сообщалось (Tieng et al., 2014; Jo et al., 2016), место жительства определенных нейрональных подтипов было рассмотрено с помощью одноклеточного метода высокого разрешения. анализ (Smits et al., 2019a). Экспрессия генов, типичных для дофаминергических, глутаматергических, ГАМКергических и серотонинергических нейронов, была исследована, и их присутствие дополнительно подтверждено иммуногистохимическим окрашиванием соответствующих нейротрансмиттеров.Это позволяет надежно обнаруживать дофаминергические, глутаматергические и ГАМКергические нейроны, а также несколько серотонинергических нейронов внутри чМО (таблица 2). До сих пор не проводился подробный анализ функции нейронального подтипа и их взаимодействия. Однако, что касается того факта, что mDAN физиологически синапсы в полосатом теле, а не в среднем мозге in vivo , hMOs потенциально ограничены в качестве модели in vitro в этом случае.

Помимо подробной характеристики нейрональной популяции, анализ астроглии и дифференцировки олигодендроцитов также имеет решающее значение для точного моделирования среднего мозга человека.Присутствие астроцитов необходимо для формирования синапсов и регулярной нейрональной активности (Chung et al., 2015). Астроциты определяются позже, чем нейроны во время развития, и их иммунореактивность определяется только в hMOs после 35 дней культивирования (Molofsky et al., 2012; Chaboub and Deneen, 2013; Monzel et al., 2017; Таблица 2). Быстрая передача информации между нейронами зависит от миелинизации аксонов, которая достигается олигодендроцитами в ЦНС. В большинстве протоколов дифференцировки на основе стволовых клеток дифференцировка в олигодендроциты крайне неэффективна (Jablonska et al., 2010; Bunk et al., 2016). Однако дифференцировка в олигодендроциты и обнаруженная миелинизация недофаминергических нейронов была достигнута в hMOs (Monzel et al., 2017). Некоторые нейриты в этих hMOs были заключены в оболочку с помощью олигодендроцитов, и даже стали очевидными структуры, такие как узлы Ранвье, которые имеют решающее значение для электрохимической передачи сигналов в аксонах (Faivre-Sarrailh and Devaux, 2013). Особенность немиелинизированных или тонко миелинизированных нейронов особенно хорошо описана для мДАН SNc и объясняет, почему только около 30% перекрывающихся клеток βIII тубулина (TUJ1) и основного белка миелина (MBP) были количественно определены в системе hMO (Braak and Del Tredici , 2004; Orimo et al., 2011; Зульцер и Сюрмайер, 2013; Monzel et al., 2017). Чтобы обеспечить возможность будущего применения и улучшить влияние чМО в патофизиологических и фармакологических исследованиях, была проведена оценка электрической активности и функциональной зрелости трехмерных культур, специфичных для среднего мозга. Присутствие или, скорее, совместная локализация пресинаптического маркера SYNAPTOPHYSIN и постсинаптического маркера PSD95 указывает на прямой контакт между пре- и постсинапсом (Monzel et al., 2017). Точная морфология синапсов, происходящих из hMO, до сих пор не рассматривалась подробно, хотя другие органоиды головного мозга, полученные из hPSC, уже отражают многие аспекты формирования и функционирования синапсов человека (Wilson and Newell-Litwa, 2018).Запись участков целых клеток выполнялась с нарезанными срезами hMO (Jo et al., 2016) или с нейронами, полученными из hMO (Smits et al., 2019b). Это установленный, но инвазивный метод, который позволяет идентифицировать и анализировать определенные нейрональные подтипы, однако, непрерывное развитие отдельного органоида еще не может быть отслежено с такими подробностями. Альтернативно, неинвазивные записи потенциалов внеклеточного поля могут быть достигнуты с помощью систем MEA и позволяют получить представление о физиологических свойствах культур in vitro и хронологический анализ (Luhmann et al., 2016). Tieng et al. (2014) обнаружили у своих ЛОР спонтанную и вызванную электрофизиологическую активность. Кроме того, в исследовании Monzel et al. (2017) были обнаружены спайки близко по времени на нескольких электродах, что указывает на синхронность нейронной сети. Чтобы конкретно определить активность различных нейронных рецепторов в органоиде, можно исследовать реакцию на химические соединения. Функциональность рецепторов DA проверялась с применением квинпирола, специфического агониста рецепторов D2 / D3.Важно отметить, что мДАН экспрессируют ауторецепторы D2. Ранее это использовалось в нескольких исследованиях и показало, что эффективно подавляет возбуждение в hMOs (Jo et al., 2016; Monzel et al., 2017; Smits et al., 2019a). Вместе с сообщениями о продукции и высвобождении DA это убедительно свидетельствует о том, что TH-положительные нейроны, развивающиеся в hMOs, проявляют электрофизиологические и биохимические свойства зрелых мДАН и экспрессируют функциональные, чувствительные к хинпиролу, рецепторы DA. Для дальнейшего выделения и приписывания записанных сигналов подтипам нейронов тормозная и возбуждающая коммуникации дополнительно блокировались специфическими лекарствами в соответствии с установленным экспериментальным планом Illes et al.(2014). Были использованы такие препараты, как габазин, антагонист ГАМК-рецепторов, которые приводят к растормаживанию целевых нейронов ГАМКергических нейронов, а также антагонисты NMDA-рецепторов и AMPA / каинатных рецепторов, ингибирующие глутаматергическую возбуждающую коммуникацию (Illes et al., 2014). Вместе с характерными признаками образования синапсов, состоящими из прямого контакта между пре- и постсинапсами и составляющими предпосылку для функционирования электрофизиологической и нейрональной сети, эти эксперименты подтвердили наличие функциональных ГАМКергических и глутаматергических нейронов внутри hMO в дополнение к присутствующим функциональным рецепторам DA. .Хотя нейроны не существуют изолированно в ЦНС, а образуют функциональные сети с другими нейронами и ненейронными клетками, важно расширить наши исследования нейродегенеративных заболеваний с помощью трехмерных моделей, которые способны воспроизводить как автономные, так и неклеточные клетки. автономные аспекты. Использование трехмерных моделей культур клеток, которые включают множество нейрональных подтипов, может привести к новому пониманию избирательной уязвимости, которая наблюдается при нейродегенерации. Данные свидетельствуют о том, что специфическая регуляция возбудимости мДАН другими подтипами нейронов среднего мозга может объяснять их избирательную уязвимость при БП (Короткова и др., 2004; Calabresi et al., 2014; Калабрези и Ди Филиппо, 2015). Это подчеркивает важность и огромный потенциал будущих моделей заболеваний, в которых используются hMO, поскольку они содержат функционально связанные гетерогенные популяции нейронов.

Моделирование заболеваний органоидов, специфичных для среднего мозга

Органоиды, в частности моделирующие средний мозг человека, открывают большие перспективы для изучения развития человеческого мозга и моделирования нейродегенеративного расстройства БП. БП является вторым по распространенности дегенеративным неврологическим заболеванием после БА и определяется избирательной потерей мДАН в SNc среднего мозга человека.Интересно, что после десятилетий исследований БП молекулярные механизмы, лежащие в основе инициирования и прогрессирования нейродегенеративного заболевания, обычно протекающего как идиопатическая форма, не были полностью раскрыты и остаются в значительной степени неуловимыми (Roybon et al., 2004). Таким образом, создание органоидов головного мозга, специфичных для регионов, открывает новые возможности для изучения нейрональных заболеваний, которые связаны с определенной частью человеческого мозга, например с БП. Нейродегенеративные расстройства, такие как БП, обычно считаются возрастными заболеваниями (Sepe et al., 2016; Сюй и др., 2016). Однако накапливаются доказательства того, что БП имеет сильный компонент развития нервной системы, который, вероятно, определяет предрасположенность к развитию болезни (Garcia-Reitboeck et al., 2013; Le Grand et al., 2015; Schwamborn, 2018). Это открытие подтверждает важность моделей развития человеческого мозга для исследования механизмов, лежащих в основе заболевания. Недавняя публикация представляет собой доказательство принципа исследования, в котором либо полученные от пациентов, либо генетически модифицированные hMO, несущие ассоциированную с заболеванием мутацию G2019S в гене LRRK2 , демонстрируют фенотипы, относящиеся к PD, включая уменьшенное количество mDAN (Smits et al., 2019b). Путем оценки количества связей (ветвления) и узлов (точек бифуркации дендритов) мДАН, развивающихся в разных группах чМО, было выявлено значительное снижение сложности дофаминергической сети в полученных от пациента TH-положительных нейронах, что также известно встречаются в головном мозге пациентов с БП (Bernheimer et al., 1973; Kordower et al., 2013; Smits et al., 2019b). Основываясь на другом опубликованном протоколе hMO, Kim et al. (2019) также получили органоиды, несущие мутацию LRRK2 -G2019S (Jo et al., 2016). В соответствии с выводами Smits et al. (2019b) и Ким и др. (2019) обнаружили, что mDAN в органоидах LRRK2 -G2019S обнаруживают уменьшенную длину нейритов по сравнению с mDAN в контрольных органоидах. Они также оценили общий сниженный уровень экспрессии специфичных для mDAN маркеров, таких как TH, декарбоксилаза ароматической 1-аминокислоты (AADC) и DAT, в их созданных hMO LRRK2 -G2019S (Kim et al., 2019). Они достигли частичного восстановления уровней экспрессии этих генов после обработки мутантных органоидов LRRK2 -G2019S ингибитором киназы LRRK2 GSK2578215A.Это ингибирование LRRK2 предполагает положительное влияние на гибель клеток mDAN и дополнительно доказывает, что эта трехмерная система культивирования клеток восприимчива к исследованию терапевтических стратегий против БП (Kim et al., 2019). Kim et al. (2019) также определили, что hMOs, несущие мутацию LRRK2 -G2019S, демонстрируют аномальную локализацию α-синуклеина, который фосфорилируется по серину 129 (pS129). Они утверждают, что pS129-α-синуклеин аберрантно экспрессируется в мутированных hMO, и они обнаружили зависимое от мутации LRRK2 -G2019S увеличение тиофлавин-T-положительных отложений в TH-положительных нейронах с течением времени, даже несмотря на то, что общая экспрессия α-синуклеина не увеличивается (Kim et al., 2019). Удивительно, но эти обнаруженные тиофлавин Т-положительные отложения оказались внеклеточными и явно не перекрывались с сигналом TH. Вопрос о том, можно ли воспроизвести эти результаты с помощью другого аналитического метода, еще предстоит изучить. Тем не менее, оценка патологий, связанных с БП, таких как синуклеинопатии, в специфичных для человека моделях передовых культур клеток имеет решающее значение из-за присущих различий между уязвимостью mDAN человека и мыши, а также из-за того, что существующие мышиные трансгенные модели не были эффективны для разработки точных моделей. представление механизмов основного заболевания (Byers et al., 2012; Бурбулла и др., 2017; Хеммер и др., 2018; Koh et al., 2018). В исследовании Smits et al. (2019b) было продемонстрировано значительное увеличение FOXA2-положительных клеток-предшественников в органоидах, специфичных для пациента. Поскольку FOXA2 необходим для генерации мДАН, предполагается, что это может быть компенсаторным ответом на нарушение спецификации мДАН, вызванное мутантным геном LRRK2 (Sasaki et al., 1997), кроме того, это может быть результатом снижение потенциала дифференцировки клеток-предшественников.Подобные компенсаторные механизмы были описаны при БП ранее и могут представлять собой попытку противодействовать дефектам развития нервной системы, вызванным специфическими для БП мутациями (Blesa et al., 2017). При введении также изогенных контрольных hMO было подтверждено, что введение мутации LRRK2 -G2019S оказало вредное воздействие на сложность mDAN в пределах здорового фона. Напротив, коррекции гена LRRK2 -G2019S на фоне пациента с БП недостаточно для устранения этого эффекта.Поскольку LRRK2 -G2019S не является полностью пенетрантным и вероятность развития БП индивидуально варьируется среди носителей, предполагается, что его патологическая функция включает дополнительные пути (Smith et al., 2006; Goldwurm et al., 2007). В этом контексте разрешительный генетический фон из-за кумулятивных генетических вариантов может опосредовать и либо усиливать, либо уменьшать нейродегенерацию, индуцированную LRRK2 (Bolognin et al., 2019). Примечательно, что при анализе всех изученных признаков линии, полученные от пациентов с БП, группируются вместе, независимо от наличия или отсутствия мутации (Smits et al., 2019b). Это указывает на то, что генетический фон пациентов с БП, независимо от редактирования генов, составляет большую часть различий между исследуемыми клеточными линиями и, по-видимому, является основным отличительным фактором. Таким образом, не мутация LRRK2 -G2019S, а генетический фон пациентов вносит наибольший вклад в фенотипы и поддерживает гипотезу о том, что генетический фон пациентов с БП может влиять на дегенерацию мДАН (Bolognin et al., 2019) .Эти результаты показывают, что 3D hMO и соответствующие mDAN представляют собой новые мощные инструменты для моделирования in vitro болезни . Важно отметить, что у пациентов с PD в среднем мозге в основном поражается SN, в то время как соседняя область, вентральная тегментальная область, которая также содержит DN, в значительной степени не затрагивается. Текущие модели hMO до сих пор не устраняли эту уязвимость в достаточной степени. Однако это ограничение, безусловно, будет исследовано в будущем.

Получив дополнительные hMO, которые несут дефекты в генах, которые, как известно, вызывают БП, мы могли бы расширить понимание связанных с заболеванием аномалий и контекста, в котором они возникают (Benson and Huntley, 2019).Индивидуальный характер этих моделей также открывает многообещающие возможности для будущих подходов к персонализированной медицине (Bu et al., 2016; Hillje and Schwamborn, 2016; Smits et al., 2019b).

Перспективы

Создание и характеристика протоколов органоидов, специфичных для среднего мозга, и тем самым предоставление сложных моделей in vitro для изучения процессов развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний среднего мозга человека привели к новым открытиям в области усовершенствованных клеток 3D in vitro системы культивирования.Кроме того, сообщенные PD-релевантные фенотипы в чМО, полученных от пациентов с БП, доказали, что эти методы являются мощным инструментом для моделирования заболеваний in vitro и неврологических расстройств, специфичных для человека.

Для таких применений модель органоида должна быть воспроизводимой и стабильной для расширенного культивирования и манипуляций. Несмотря на то, что технология органоидов является мощным активом в области исследований мозга, модели hMO демонстрируют существенные недостатки и ограничения (Berger et al., 2018; Wang Y. et al., 2018). Отсутствие естественной оси тела или поддерживающей ткани препятствует организации органоида, идентичной структуре человеческого мозга in vivo (Lancaster et al., 2013; Kelava and Lancaster, 2016a; Wang Y. et al., 2018 ). Идентификация конкретных областей мозга, а также воспроизводимость могут быть несовершенными, тем не менее, маловероятно создание точных условий культивирования, обнаруженных в человеческом мозге in utero (Trujillo and Muotri, 2018).Основным ограничением представленных здесь hMOs, а также других опубликованных систем органоидов головного мозга является отсутствие сосудистой сети, которая ограничивает снабжение кислородом и питательными веществами, особенно во внутренней части органоидов (Kelava and Lancaster, 2016a; Wang Y . et al., 2018). Это также может ограничивать рост органоидов сверх определенного размера и увеличивать появление мертвых клеток в центре органоидов (Giandomenico and Lancaster, 2017; Monzel et al., 2017; Berger et al., 2018). Число клеток и, следовательно, плотность клеток в органоиде, по-видимому, играют важную роль и могут быть целью для улучшения.Выбор суррогатной матрицы, отправная точка и продолжительность дифференциации — это дополнительные аспекты, которые могут повлиять на точность 3D-культуры. Недавно органоиды головного мозга были успешно трансплантированы в мозг мыши, и в трансплантатах можно было обнаружить мышиные кровеносные сосуды (Mansour et al., 2018). Несмотря на то, что трансплантированный органоид более точно имитировал анатомию мозга in vivo , этот метод имеет недостаток в виде ксеноконтаминации (Trujillo and Muotri, 2018; Wang Y.и др., 2018). Отсутствие микроглии, резидентных врожденных иммунных клеток ЦНС, является еще одним серьезным недостатком для моделирования заболеваний, поскольку они активно участвуют в развитии и созревании нейронов. В случае церебральных органоидов недавно была опубликована адаптация модели органоидов, содержащих микроглию (Ormel et al., 2018). Поскольку некоторые hMO происходят из нейроэктодермы, а микроглия в процессе развития происходит из мезодермы, существует только возможность интегрировать извне микроглию или их предшественников в развивающуюся hMO (Muffat et al., 2016; Abud et al., 2017; Haenseler et al., 2017; Трухильо и Муотри, 2018; Wang Y. et al., 2018).

Будущее развитие технологий клеточных культур будет способствовать дальнейшему совершенствованию моделей органоидов, специфичных для мозга, и будет поддерживать как исследование более сложных взаимодействий в человеческом мозге, так и моделирование более широкого спектра неврологических расстройств (Di Lullo and Kriegstein, 2017; Wang Y. и др., 2018). Несмотря на текущие ограничения, мы можем сделать вывод, что система hMO, представленная здесь, наряду с другими моделями, может быть первым шагом к более ориентированной на человека пациенту, возможно, даже персонализированной эре передового моделирования заболеваний и развития терапии.

Авторские взносы

LS и JS совместно написали и отредактировали этот обзор.

Финансирование

Лаборатория JS поддерживается Национальным фондом исследований (FNR) (программа проверки концепции PoC15 / 11180855 и PoC16 / 11559169). Это проект Совместной программы ЕС и исследования нейродегенеративных заболеваний (JPND) (INTER / JPND / 15/110) и проект M-ERA.NET (INTER / M-ERA.NET / 17/11760144). Работа выполнена при финансовой поддержке проекта FET Proactive CONNECT (грант №824070). LS поддерживается стипендиями Aides la Formation-Recherche от FNR.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Грэма Робертсона за конструктивную критику рукописи.

Список литературы

Абе-Фукасава, Н., Оцука, К., Aihara, A., Itasaki, N., and Nishino, T. (2018). Новый метод трехмерной жидкой культуры клеток для независимого от закрепления роста клеток, визуализации клеток и автоматизированного скрининга лекарств. Sci. Отчет 8: 3627. DOI: 10.1038 / s41598-018-21950-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Абуд, Э. М., Рамирес, Р. Н., Мартинес, Э. С., Карсон, М. Дж., Пун, В. В., Блартон-Джонс, М., и др. (2017). ИПСК-производные человеческие микроглиеподобные клетки для изучения неврологических заболеваний. Нейрон 94, 278–293.e9. DOI: 10.1016 / j.neuron.2017.03.042

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бергер, Э., Мальяро, К., Пациа, Н., Монцель, А.С., Антоний, П., Линстер, К. Л. и др. (2018). Millifluidic культура улучшает жизнеспособность и дифференциацию органоидов среднего мозга человека. Lab. Чип 18, 3172–3183. DOI: 10.1039 / c8lc00206a

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бернхеймер, Х., Биркмайер, В., Хорникевич, О., Еллингер, К.и Зейтельбергер Ф. (1973). Дофамин мозга и синдромы Паркинсона и Хантингтона, клинические, морфологические и нейрохимические корреляции. J. Neurol. Sci. 20, 415–455. DOI: 10.1016 / 0022-510X (73)

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Биан, С., Репик, М., Го, З., Кавираяни, А., Буркард, Т., Бэгли, Дж. А. и др. (2018). Генно-инженерные церебральные органоиды моделируют образование опухоли головного мозга. Nat. Методы 15, 631–639. DOI: 10.1038 / s41592-018-0070-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Блеса, J., Триго-Дамас, И., Дилеоне, М., дель Рей, Н. Л. Г., Эрнандес, Л. Ф., и Обесо, Дж. А. (2017). Компенсаторные механизмы при болезни Паркинсона: адаптация цепей и роль в модификации болезни. Exp. Neurol. 298, 148–161. DOI: 10.1016 / j.expneurol.2017.10.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Болоньен, С., Фоссепре, М., Цин, X., Яразо, Дж., Щанчар, Дж., Морено, Э. Л. и др. (2019). 3D-культуры дофаминергических нейронов, специфичных для болезни Паркинсона, для фенотипирования с высоким содержанием и тестирования лекарств. Adv. Sci. 6: 1800927. DOI: 10.1002 / advs.201800927

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Боррото-Эскуэла, Д. О., Перес де ла Мора, М., Мангер, П., Нарваес, М., Беджиато, С., Креспо-Рамирес, М. и др. (2018). Передача дофамина в мозге при здоровье и болезни Паркинсона: модуляция синаптической передачи и пластичности посредством объемной передачи и гетерорецепторов дофамина. Фронт. Synaptic Neurosci. 10:20. DOI: 10.3389 / fnsyn.2018.00020

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Браак, Х., и Дель Тредичи, К. (2004). Плохая и длительная миелинизация как фактор, способствующий нейродегенеративным расстройствам. Neurobiol. Старение 25, 19–23. DOI: 10.1016 / j.neurobiolaging.2003.04.001

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bu, L.-L., Yang, K., Xiong, W.-X., Liu, F.-T., Anderson, B., Wang, Y., et al. (2016). К точной медицине при болезни Паркинсона. Ann. Пер. Med. 4:26. DOI: 10.3978 / j.issn.2305-5839.2016.01.21

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бункер, Е.К., Эртайлан, Г., Ортега, Ф., Павлу, М. А., Гонсалес Кано, Л., Стергиопулос, А. и др. (2016). Prox1 необходим для идентификации клеток олигодендроцитов во взрослых нейральных стволовых клетках субвентрикулярной зоны. Стволовые клетки 34, 2115–2129. DOI: 10.1002 / стержень.2374

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бурбулла, Л. Ф., Сонг, П., Мацзулли, Дж. Р., Зампезе, Э., Вонг, Ю. К., Чон, С., и др. (2017). Окисление дофамина опосредует митохондриальную и лизосомную дисфункцию при болезни Паркинсона. Наука 357, 1255–1261. DOI: 10.1126 / science.aam9080

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Байерс, Б., Ли, Х. и Рейхо Пера, Р. (2012). Моделирование болезни Паркинсона с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 237–242. DOI: 10.1007 / s11910-012-0270-y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Калабрези, П., и Ди Филиппо, М. (2015). Меняющееся дерево при болезни Паркинсона. Nat. Neurosci. 18, 1196–1198. DOI: 10.1038 / nn.4092

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Калабрези П., Пиккони Б., Тоцци А., Гильери В. и Ди Филиппо М. (2014). Прямые и непрямые пути базальных ганглиев: критическая переоценка. Nat. Neurosci. 17, 1022–1030. DOI: 10.1038 / nn.3743

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кэмп, Дж. Г., Бадша, Ф., Флорио, М., Кантон, С., Гербер, Т., Вильш-Бройнингер, М., и др.(2015). Органоиды головного мозга человека повторяют программы экспрессии генов развития неокортекса плода. Proc. Natl. Акад. Sci. США 112, 15672–15677. DOI: 10.1073 / pnas.1520760112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чемберс, С. М., Фазано, К. А., Папапетру, Э. П., Томишима, М., Саделайн, М., и Студер, Л. (2009). Высокоэффективное нейронное преобразование человеческих ES- и iPS-клеток за счет двойного ингибирования передачи сигналов SMAD. Nat. Biotechnol. 27, 275–280. DOI: 10.1038 / NBT.1529

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чой, С. Х., Ким, Ю. Х., Хебиш, М., Сливински, К., Ли, С., Д’Аванзо, К., и др. (2014). Трехмерная модель культуры нервных клеток человека болезни Альцгеймера. Природа 515, 274–278. DOI: 10.1038 / природа13800

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чой, С. Х., Ким, Ю. Х., Квинти, Л., Танзи, Р. Э., и Ким, Д. Ю.(2016). Трехмерные культуральные модели болезни Альцгеймера: дорожная карта к «лекарству в виде блюда». Мол. Neurodegener. 11:75. DOI: 10.1186 / s13024-016-0139-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чанг, В.-С., Уэлш, К.А., Баррес, Б.А., и Стивенс, Б. (2015). Управляет ли глия синаптическими и когнитивными нарушениями при болезни? Nat. Neurosci. 18, 1539–1545. DOI: 10.1038 / nn.4142

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Купер, О., Seo, H., Andrabi, S., Guardia-Laguarta, C., Graziotto, J., Sundberg, M., et al. (2012). Фармакологическое восстановление митохондриальных дефицитов в нервных клетках, происходящих от ИПСК, у пациентов с семейной болезнью Паркинсона. Sci. Пер. Med. 4: 141ra90. DOI: 10.1126 / scitranslmed.3003985

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кугола, Ф. Р., Фернандес, И. Р., Руссо, Ф. Б., Фрейтас, Б. К., Диас, Дж. Л. М., Гимарайнш, К. П. и др. (2016). Бразильский штамм вируса Зика вызывает врожденные дефекты в экспериментальных моделях. Природа 534, 267–271. DOI: 10.1038 / природа18296

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каллен, Д. К., Вольф, Дж. А., Вернекар, В. Н., Вукасинович, Дж., И ЛаПлака, М. К. (2012). Инженерия нервных тканей и биогибридизированные микросистемы для нейробиологических исследований in vitro (Часть 1). Crit. Преподобный Биомед. Англ. 39, 201–240. DOI: 10.1615 / critrevbiomedeng.v39.i3.30

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Данг, Дж., Тивари, С. К., Личинчи, Г., Цинь, Ю., Патил, В. С., Ерошкин, А. М. (2016). Вирус Зика истощает нейральные предшественники в органоидах головного мозга человека за счет активации рецептора врожденного иммунитета TLR3. Стволовая клетка 19, 258–265. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.04.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Д’Аванзо, К., Аронсон, Дж., Ким, Ю. Х., Чой, С. Х., Танзи, Р. Э., и Ким, Д. Ю. (2015). Болезнь Альцгеймера в 3D-культуре: проблемы и перспективы. Bioessays 37, 1139–1148. DOI: 10.1002 / bies.201500063

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Доусон, Т. М., Ко, Х. С., и Доусон, В. Л. (2010). Генетические животные модели болезни Паркинсона. Нейрон 66, 646–661. DOI: 10.1016 / j.neuron.2010.04.034

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ди Лулло, Э., Кригштейн, А. Р. (2017). Использование органоидов головного мозга для исследования развития нервной системы и болезней. Nat. Rev. Neurosci. 18, 573–584. DOI: 10.1038 / номер 2017.107

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дои, Д., Самата, Б., Кацукава, М., Кикучи, Т., Моризане, А., Оно, Ю. и др. (2014). Выделение индуцированных человеком дофаминергических предшественников плюрипотентных стволовых клеток путем сортировки клеток для успешной трансплантации. Stem Cell Rep. 2, 337–350. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2014.01.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Faivre-Sarrailh, C., и Дево, Дж. Дж. (2013). Нейроглиальные взаимодействия в узлах Ранвье: значение для здоровья и болезней. Фронт. Клетка. Neurosci. 7: 196. DOI: 10.3389 / fncel.2013.00196

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Федоров, Х., Трибл, Ф., Холлидей, Г., Герлах, М., Ридерер, П., и Дабл, К. Л. (2005). Нейромеланин в дофаминовых нейронах человека: сравнение с периферическими меланинами и отношение к болезни Паркинсона. Прог. Neurobiol. 75, 109–124. DOI: 10.1016 / j.pneurobio.2005.02.001

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарсес, П. П., Лойола, Э. К., Да Коста, Р. М., Хига, Л. М., Триндади, П., Дельвеккио, Р. и др. (2016). Вирус Зика нарушает рост нейросфер человека и органоидов головного мозга. Наука 352, 816–818. DOI: 10.1126 / science.aaf6116

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарсия-Райтбок, П., Аниччик, О., Далли, Дж. У., Нинкина, Н., Тофарис, Г. К., Бухман, В. Л. и др. (2013). Эндогенный альфа-синуклеин влияет на количество дофаминергических нейронов в черной субстанции мышей. Exp. Neurol. 248, 541–545. DOI: 10.1016 / J.EXPNEUROL.2013.07.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Goldwurm, S., Zini, M., Mariani, L., Tesei, S., Miceli, R., Sironi, F., et al. (2007). Оценка пенетрантности LRRK2 G2019S: актуальность для генетического консультирования при болезни Паркинсона. Неврология 68, 1141–1143.DOI: 10.1212 / 01.wnl.0000254483.19854.ef

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грилиш, С., Дигет, Э., Пармар, М., Бджо, А., Грилиш, С., Дигет, Э. и др. (2014). Дофаминовые нейроны, производные от ESC человека, демонстрируют доклиническую эффективность и активность, аналогичную фетальным нейронам, когда они привиты на крысиной модели клинического прогресса Паркинсона. Дофаминовые нейроны, производные от ESC человека, демонстрируют такую ​​же доклиническую эффективность и активность, что и нейроны плода. Стволовые клетки клетки 15, 653–665.DOI: 10.1016 / j.stem.2014.09.017

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Haenseler, W., Zambon, F., Lee, H., Vowles, J., Rinaldi, F., Duggal, G., et al. (2017). Избыток α-синуклеина нарушает фагоцитоз в макрофагах, происходящих от ИПСК. Sci. Отчет 7: 9003. DOI: 10.1038 / s41598-017-09362-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харгус Г., Купер О., Делейди М., Леви А., Ли К., Марлоу Э. и др. (2010). Дифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные пациентами с болезнью Паркинсона, растут в мозге взрослых грызунов и снижают моторную асимметрию у крыс с паркинсонизмом. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 15921–15926. DOI: 10.1073 / pnas.1010209107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хейкок, Дж. У. (2011). 3D-культура клеток: обзор современных подходов и методов. Methods Mol. Биол. Биол. 695, 1–5. DOI: 10.1007 / 978-1-60761-984-0_1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хеммер К., Смитс Л. М., Болоньин С. и Швамборн Дж. К. (2018). Фенотипирование in vivo стволовых клеток, специфичных для болезни Паркинсона, несущих мутацию LRRK2-G2019S, выявляет повышенные уровни α-синуклеина, но отсутствие распространения. Opera Med. Physiol. 4, 71–77. DOI: 10.20388 / omp2018.001.0057

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hillje, A.-L., и Schwamborn, J.C. (2016). Использование стволовых клеток для моделирования болезни Паркинсона — текущее состояние и будущие задачи. Future Neurol. 11, 171–186. DOI: 10.2217 / fnl.16.7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hubert, C.G., Rivera, M., Spangler, L.C., Wu, Q., Mack, S.C., Prager, B.C., et al. (2016).Трехмерная система культивирования органоидов, полученная из глиобластом человека, воспроизводит градиенты гипоксии и гетерогенность раковых стволовых клеток опухолей, обнаруженных in vivo. Cancer Res. 76, 2465–2477. DOI: 10.1158 / 0008-5472.can-15-2402

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуч, М., и Ку, Б. (2015). Моделирование развития мыши и человека с использованием органоидных культур. Разработка 142, 3113–3125. DOI: 10.1242 / dev.118570

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ильес, С., Jakab, M., Beyer, F., Gelfert, R., Couillard-Despres, S., Schnitzler, A., et al. (2014). Внутренне активные нейроны и нейроны-стимуляторы в популяциях нейронов, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток. Stem Cell Rep. 2, 323–336. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2014.01.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Яблонска Б., Агирре А., Раймонд М., Сабо Г., Китабатаке Ю., Сейлор К. А. и др. (2010). Хордин-индуцированная клональная пластичность взрослых SVZ-нейробластов после демиелинизации. Nat. Neurosci. 13, 541–550. DOI: 10.1038 / nn.2536

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ян А., Янсониус Б., Делаиделли А., Бханшали Ф., Ан Ю. А., Феррейра Н. и др. (2018). Активность регулятора трансляции киназы эукариотического фактора элонгации-2 повышается в мозге при болезни Паркинсона, и ее ингибирование снижает токсичность альфа-синуклеина. Acta Neuropathol. Commun. 6:54. DOI: 10.1186 / s40478-018-0554-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харасо, Дж., Barmpa, K., Rosety, I., Smits, L.M, Arias-Fuenzalida, J., Walter, J., et al. (2019). Фенотипы болезни Паркинсона в органоидах головного мозга, специфичных для пациентов, улучшаются лечением HP-β-CD. BioRxiv [Препринт] doi: 10.1101 / 813089

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джо, Дж., Сяо, Ю., Сюян Сунь, А., Кинг Тан, Э., Шон Дже, Х., Нг, Х. и др. (2016). Органоиды, подобные среднему мозгу, из плюрипотентных стволовых клеток человека содержат функциональные дофаминергические и нейромеланин-продуцирующие нейроны. Стволовые клетки клетки 19, 248–257. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.07.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кадосима Т., Сакагути Х., Накано Т., Соен М., Андо С. и Эйраку М. (2013). Самоорганизация осевой полярности, структуры вывернутого слоя и видоспецифической динамики предшественников в неокортексе, происходящем из ES-клеток человека. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110, 20284–20289. DOI: 10.1073 / pnas.1315710110

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кагеяма, Дж., Волльни Д., Трейтлейн Б. и Кэмп Дж. Г. (2018). ShinyCortex: исследование данных транскриптома отдельных клеток развивающейся коры головного мозга человека. Фронт. Neurosci. 12: 315. DOI: 10.3389 / fnins.2018.00315

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Келава И. и Ланкастер М. А. (2016a). Разбивка мини-мозгов: текущий прогресс и будущие перспективы в исследованиях органоидов мозга. Dev. Биол. 420, 199–209. DOI: 10.1016 / j.ydbio.2016.06.037

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Х., Park, H.J., Choi, H., Chang, Y., Park, H., Shin, J., et al. (2019). Моделирование спорадической болезни Паркинсона G2019S-LRRK2 в трехмерных органоидах среднего мозга. Stem Cell Rep. 12, 518–531. DOI: 10.1016 / J.STEMCR.2019.01.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Киркеби А., Грилиш С., Вольф Д. А., Неландер Дж., Вуд Дж., Лундблад М. и др. (2012). Создание регионально определенных нейральных предшественников и функциональных нейронов из человеческих эмбриональных стволовых клеток при определенных условиях. Cell Rep. 1, 703–714. DOI: 10.1016 / j.celrep.2012.04.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ко, Ю. Х., Тан, Л. Ю., и Нг, С. (2018). Плюрипотентные стволовые клетки и органоиды, полученные от пациентов, для моделирования распространения альфа-синуклеина при болезни Паркинсона. Фронт. Клетка. Neurosci. 12: 413. DOI: 10.3389 / fncel.2018.00413

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кордовер, Дж. Х., Оланов, К. В., Додия, Х.Б., Чу, Ю., Бич, Т. Г., Адлер, К. Х. и др. (2013). Длительность заболевания и целостность нигростриатальной системы при болезни Паркинсона. Мозг 136, 2419–2431. DOI: 10,1093 / мозг / awt192

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Короткова Т. М., Пономаренко А. А., Браун Р. Э., Хаас Х. Л. (2004). Функциональное разнообразие дофамина и ГАМКергических нейронов вентральной части среднего мозга. Мол. Neurobiol. 29, 243–259. DOI: 10.1385 / MN: 29: 3: 243

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Крикс, С., Shim, J.-W., Piao, J., Ganat, Y.M., Wakeman, D.R., Xie, Z., et al. (2011). Дофаминовые нейроны, полученные из человеческих ES-клеток, эффективно приживаются в моделях болезни Паркинсона на животных. Природа 480, 547–551. DOI: 10.1038 / nature10648

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланкастер, М. А., Корсини, Н. С., Буркард, Т. Р., и Кноблих, Дж. А. (2016). Управляемая самоорганизация воспроизводит архитектуру тканей в биоинженерной модели органоидов мозга. BioRxiv [Препринт] doi: 10.1101/049346

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланкастер, М. А., Кноблих, Дж. А. (2014a). Генерация церебральных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Nat. Protoc. 9: 2329. DOI: 10.1038 / nprot.2014.158

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланкастер, М. А., Кноблих, Дж. А. (2014b). Органогенез в блюде: моделирование развития и заболевания с помощью органоидных технологий. Наука 345: 1247125. DOI: 10.1126 / наука.1247125

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланкастер, М.А., Реннер, М., Мартин, К.-А., Венцель, Д., Бикнелл, Л.С., Херлз, М.Э., и др. (2013). Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Природа 501, 373–379. DOI: 10.1038 / природа12517

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ле Гран, Дж. Н., Гонсалес-Кано, Л., Павлу, М. А., и Швамборн, Дж. К. (2015). Нервные стволовые клетки при болезни Паркинсона: роль дефектов нейрогенеза в возникновении и прогрессировании. Cell. Мол. Life Sci. 72, 773–797. DOI: 10.1007 / s00018-014-1774-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лин, Л., Гёке, Дж., Чукуроглу, Э., Драниас, М. Р., ВанДонген, А. М. Дж. И Стэнтон, Л. В. (2016). Молекулярные особенности, лежащие в основе нейродегенерации, выявленные посредством моделирования in vitro генетически разнообразных пациентов с болезнью Паркинсона. Cell Rep. 15, 2411–2426. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.05.022

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Луман, Х.Дж., Синнинг, А., Янг, Дж., И Рейес-пуэрта, В. (2016). Спонтанная нейронная активность в развитии неокортикальных сетей: от отдельных клеток до крупномасштабных взаимодействий. Фронт. Neural Circ. 10:40. DOI: 10.3389 / fncir.2016.00040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ма, К. Х., Бреннер, Г. Дж., Омура, Т., Самад, О. А., Костиган, М., Инквимберт, П. и др. (2011). Корецептор BMP RGMb способствует, в то время как эндогенный антагонист BMP ноггин снижает рост нейритов и регенерацию периферических нервов, модулируя передачу сигналов BMP. J Neurosci. 31, 18391–18400. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.4550-11.2011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мансур, А.А., Гонсалвес, Дж. Т., Блойд, К. В., Ли, Х., Фернандес, С., Куанг, Д., и др. (2018). Модель in vivo функциональных и васкуляризированных органоидов головного мозга человека. Nat. Biotechnol. 36, 432–441. DOI: 10.1038 / NBT.4127

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Миллер Дж. Д., Ганат Ю. М., Кишиневский С., Bowman, R. L., Liu, B., Tu, E. Y. и др. (2013). Моделирование позднего начала болезни на основе ИПСК человека через старение, индуцированное прогерином. Стволовые клетки клетки 13, 691–705. DOI: 10.1016 / j.stem.2013.11.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Молофски, А.В., Кренчик, Р., Креник, Р., Уллиан, Э.М., Уллиан, Э., Цай, Х. и др. (2012). Астроциты и болезни: перспектива развития нервной системы. Genes Dev. 26, 891–907. DOI: 10.1101 / gad.188326.112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Monzel, A. S., Smits, L. M., Hemmer, K., Hachi, S., Moreno, E. L., van Wuellen, T., et al. (2017). Получение органоидов среднего мозга человека из нейроэпителиальных стволовых клеток. Stem Cell Rep. 8, 1–11. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2017.03.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Muffat, J., Li, Y., Yuan, B., Mitalipova, M., Omer, A., Corcoran, S., et al. (2016).Эффективное получение микроглиеподобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека. Nat. Med. 22, 1358–1367. DOI: 10,1038 / нм 4189

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нгуен, Х. Н., Байерс, Б., Корд, Б., Щегловитов, А., Бирн, Дж., Гуджар, П. и др. (2011). ДА нейроны, полученные из мутантных ИПСК LRRK2, демонстрируют повышенную восприимчивость к окислительному стрессу. Cell Stem Cell 8, 267–280. DOI: 10.1016 / j.stem.2011.01.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нольбрант, С., Хойер, А., Пармар, М., и Киркеби, А. (2017). Создание высокочистых дофаминергических предшественников вентрального среднего мозга человека для созревания in vitro и интрацеребральной трансплантации. Nat. Protoc. 12, 1962–1979. DOI: 10.1038 / nprot.2017.078

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Новаковски, Т. Дж., Пыльца, А. А., Ди Лулло, Э., Сандовал-Эспиноза, К., Берштейн, М., Кригштейн, А. Р. (2016). Анализ экспрессии подчеркивает, что AXL является кандидатом рецептора проникновения вируса Зика в нервные стволовые клетки. Стволовые клетки клетки 18, 591–596. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.03.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Оримо, С., Учихара, Т., Канадзава, Т., Ито, Ю., Вакабаяси, К., Какита, А., и др. (2011). Немиелинизированные аксоны более уязвимы к дегенерации, чем миелинизированные аксоны сердечного нерва при болезни Паркинсона. Neuropathol. Прил. Neurobiol. 37, 791–802. DOI: 10.1111 / j.1365-2990.2011.01194.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ормель, П.Р., Виейра де Са, Р., Хол, Э. М., Пастеркамп, Р. Дж., Виейра де Са, Р., ван Бодегравен, Э. Дж. И др. (2018). Микроглия врожденно развивается внутри церебральных органоидов. Nat. Commun. 9: 4167. DOI: 10.1038 / s41467-018-06684-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Paşca, A.M., Sloan, S.A., Clarke, L.E., Tian, ​​Y., Makinson, C.D., Huber, N., et al. (2015). Функциональные нейроны коры и астроциты из плюрипотентных стволовых клеток человека в 3D-культуре. Nat. Методы 12, 671–678. DOI: 10.1038 / nmeth.3415

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пацке К., Акуна К., Гиам Л. Р., Верниг М. и Зюдхоф Т. К. (2016). Условная делеция L1CAM в нейронах человека нарушает разветвление аксонов и дендритов и генерацию потенциала действия. J. Exp. Med. 213, 499–515. DOI: 10.1084 / jem.20150951

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цянь, X., Нгуен, Х. Н., Сонг, М. М., Хадионо, К., Огден, С. К., Хаммак, К. и др. (2016). Органоиды, специфичные для области мозга, с использованием мини-биореакторов для моделирования воздействия ZIKV. Cell 165, 1238–1254. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.04.032

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цин, X., Вальтер, Дж., Харазо, Дж., Ариас-Фуэнзалида, Дж., Хиллье, А. Л., и Швамборн, Дж. К. (2017). CRISPR / Cas9 и piggyBac-опосредованная нокаутация LRRK2-G2019S без следа выявляет фенотипы нейрональной сложности и модуляцию α-синуклеина в дофаминергических нейронах. Stem Cell Res. 24, 44–50. DOI: 10.1016 / j.scr.2017.08.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Raja, W. K., Mungenast, A. E., Lin, Y., Ko, T., Abdurrob, F., Seo, J., et al. (2016). Самоорганизующаяся трехмерная нервная ткань человека, полученная из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, воспроизводит фенотипы болезни Альцгеймера. PLoS One 11: e0161969. DOI: 10.1371 / journal.pone.0161969

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейнхардт, П., Glatza, M., Hemmer, K., Tsytsyura, Y., Thiel, C. S., Hoing, S., et al. (2013a). Получение и распространение с использованием только небольших молекул нейральных предшественников человека для моделирования нейродегенеративных заболеваний. PLoS One 8: e59252. DOI: 10.1371 / journal.pone.0059252

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейнхардт П., Шмид Б., Бурбулла Л. Ф., Шёндорф Д. К., Вагнер Л., Глатца М. и др. (2013b). Генетическая коррекция мутации lrrk2 в ИПСК человека связывает паркинсоническую нейродегенерацию с ERK-зависимыми изменениями экспрессии генов. Стволовые клетки клетки 12, 354–367. DOI: 10.1016 / j.stem.2013.01.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Реннер, М., Ланкастер, М.А., Биан, С., Чой, Х., Ку, Т., Пир, А. и др. (2017). Самоорганизованное формирование паттернов развития и дифференциация церебральных органоидов. EMBO J. 36, 1316–1329. DOI: 10.15252 / embj.2016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ройбон, Л., Кристоферсен, Н.S., Brundin, P., и Li, J.-Y. (2004). Терапия стволовыми клетками при болезни Паркинсона: где мы находимся? Cell Tissue Res. 318, 261–273. DOI: 10.1007 / s00441-004-0946-y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Райан С. Д., Долатабади Н., Чан С. Ф., Чжан Х., Ахтар М. В., Паркер Дж. И др. (2013). Модель изогенного ИПСК человека Паркинсона демонстрирует индуцированную нитрозативным стрессом дисфункцию транскрипции MEF2-PGC1α. Ячейка 155, 1351–1364. DOI: 10.1016 / j.ячейка.2013.11.009

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Санчес-Данес, А., Ришо-Патен, Ю., Карбальо-Карбахаль, И., Хименес-Дельгадо, С., Кайг, К., Мора, С. и др. (2012). Заболевания-специфические фенотипы в дофаминовых нейронах на основе моделей генетической и спорадической болезни Паркинсона на основе iPS человека. EMBO Mol. Med. 4, 380–395. DOI: 10.1002 / emmm.201200215

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сасаки, Х., Хуэй, К., Накафуку, М., и Кондо, Х.(1997). Сайт связывания белков Gli необходим для активности усилителя донной пластины HNF-3beta у трансгенных животных и может отвечать на Shh in vitro. Разработка 124, 1313–1322.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Sato, T., Vries, R.G., Snippert, H.J., van de Wetering, M., Barker, N., Stange, D.E., et al. (2009). Единичные стволовые клетки Lgr5 строят структуры криптвилл in vitro без мезенхимальной ниши. Природа 459, 262–265. DOI: 10.1038 / nature07935

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Швамборн, Дж.С. (2018). Является ли болезнь Паркинсона расстройством психического развития и помогут ли органоиды мозга нам это понять? Stem Cells Dev. 27, 968–975. DOI: 10.1089 / scd.2017.0289

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зайдель Д., Кринке Д., Янке Х. Г., Хирче А., Клосс Д., Мак Т. Г. А. и др. (2012). Индуцированная таупатия в новой модели 3D-культуры опосредует нейродегенеративные процессы: исследование биочипов в реальном времени. PLoS One 7: e49150.DOI: 10.1371 / journal.pone.0049150

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сепе, С., Миланезе, К., Габриэлс, С., Деркс, К. В. Дж., Паян-Гомес, К., ван Айкен, В. Ф. Дж. И др. (2016). Неэффективное восстановление ДНК является модификатором болезни Паркинсона, связанной со старением. Cell Rep. 15, 1866–1875. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.04.071

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сетия, Х., Муотри, А. Р. (2019). Органоиды головного мозга как модельная система развития нервной системы и болезней человека. Семин. Cell Dev. Биол. 95, 93–97. DOI: 10.1016 / j.semcdb.2019.03.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смит, В. В., Пей, З., Цзян, Х., Доусон, В. Л., Доусон, Т. М., и Росс, К. А. (2006). Киназная активность мутанта LRRK2 опосредует нейрональную токсичность. Nat. Neurosci. 9, 1231–1233. DOI: 10.1038 / nn1776

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смитс, Л. М., Магни, С., Гржиб, К., Энтони, П. М., Крюгер, Р., Скупин А. и др. (2019a). Одноклеточная транскриптомика выявляет множественные типы нейрональных клеток в органоидах, специфичных для среднего мозга человека. BioRxiv [Препринт] doi: 10.1101 / 589598

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смитс, Л. М., Рейнхард, Л., Рейнхард, П., Глатца, М., Монцель, А. С., Стансловски, Н. и др. (2019b). Моделирование болезни Паркинсона в органоидах, подобных среднему мозгу. NPJ Parkinson Dis. 5: 5. DOI: 10.1038 / s41531-019-0078-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Спатис, А.D., Asvos, X., Ziavra, D., Karampelas, T., Topouzis, S., Cournia, Z., et al. (2017). Nurr1: активация гетеродимера RXRα в качестве монотерапии болезни Паркинсона. Proc. Natl. Акад. Sci. США 114, 3999–4004. DOI: 10.1073 / pnas.1616874114

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зульцер Д., Сюрмайер Д. Дж. (2013). Уязвимость нейронов, патогенез и болезнь Паркинсона. Mov. Disord. 28, 41–50. DOI: 10.1002 / mds.25095

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиенг, В., Стоппини, Л., Вилли, С., Фати, М., Дюбуа-Дофин, М., и Краузе, К.-Х. (2014). Конструирование органоидов среднего мозга, содержащих долгоживущие дофаминергические нейроны. Stem Cells Dev. 23, 1–32. DOI: 10.1089 / scd.2013.0442

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Трухильо, К. А., Муотри, А. Р. (2018). Органоиды головного мозга и изучение развития нервной системы. Trends Mol. Med. 24, 982–990. DOI: 10.1016 / j.molmed.2018.09.005

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, X., Аллен, В. Э., Райт, М. А., Силвестрак, Э. Л., Самусик, Н., Везуна, С. и др. (2018). Трехмерное секвенирование интактных тканей транскрипционных состояний отдельных клеток. Наука 361, 1–9. DOI: 10.1126 / science.aat5691

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, Ю., Чжу, Ю., и Цинь, Дж. (2018). Органоид на чипе человеческого мозга для моделирования пренатального воздействия никотина. Lab. Чип 18, 851–860. DOI: 10.1039 / C7LC01084B

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уэллс, М.Ф., Салик, М. Р., Вискоу, О., Хо, Д. Дж., Уоррингер, К. А., Ихри, Р. Дж. И др. (2016). Генетическое удаление AXL не защищает человеческие нейральные клетки-предшественники и церебральные органоиды от инфекции вирусом Зика. Стволовые клетки клетки 19, 703–708. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.11.011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уилсон, Э. С., и Ньюэлл-Литва, К. (2018). Модели стволовых клеток развития и дегенерации синапсов человека. Мол. Биол. Cell 29, 2913–2921.DOI: 10.1091 / mbc.E18-04-0222

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сюй, Ю., Ян, Дж., И Шан, Х. (2016). Мета-анализ факторов риска деменции при болезни Паркинсона. Пер. Neurodegener. 5:11. DOI: 10.1186 / s40035-016-0058-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., and Sulzer, D. (2003). Нейромеланин черной субстанции: нейрональная черная дыра с защитными и токсическими характеристиками. Trends Neurosci. 26, 578–580. DOI: 10.1016 / j.tins.2003.08.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Органоид — обзор | Темы ScienceDirect

Подходы на основе синтетических каркасов с использованием органоидных единиц

Использование органоидных единиц, которые сохраняют важные эпителиально-мезенхимальные взаимодействия между клетками при восстановлении кишечной ткани, представляет собой крупный прогресс в инженерии тонкого кишечника. Эти уникальные кластеры клеток, получившие название эпителиальных органоидов , были впервые описаны Эвансом и Поттеном в начале 1990-х годов в попытке установить первичные культуры кишечных клеток (Evans et al., 1992). В своем первоначальном исследовании исследователи обнаружили, что ограниченное ферментативное переваривание кишечника новорожденных крыс с использованием неочищенной смеси коллагеназы XI и диспазы приводит к образованию многоклеточных агрегатов в ядре ворсинок, состоящих из функциональных эпителиальных клеток, мезенхимальной ткани и, возможно, стволовых клеток кишечника (рис. 46.1). Приблизительно 50 000 единиц органоида, каждая приблизительно 100–200 микрон в диаметре, может быть выделено в кишечнике новорожденных крыс. In vitro культура этих органоидов была продемонстрирована в течение до 14 дней.

РИС. 46.1. Поперечный срез изолированных органоидных единиц эпителия тонкой кишки, полученных от новорожденных крыс после окрашивания гематоксилином и эозином (столбик, 35 мкм). Целостность между компартментом эпителиальных клеток и лежащим под ним стромальным ядром собственной пластинки сохраняется. Из Tait et al. (1994a), стр. 94.

В последующих экспериментах эти органоидные единицы тонкого кишечника использовали для регенерации структур, подобных тонкому кишечнику, in vivo, , в отсутствие биоразлагаемых каркасов.Это было впервые продемонстрировано, когда органоидные единицы были имплантированы подкожно модели грызунов (Tait et al. , 1994a). Затем Таит и Эванс показали, что эти органоидные единицы могут быть использованы для регенерации новообразования с типичной морфологией тонкого кишечника и активностью пищеварительных ферментов при посеве на мукозэктомированную толстую кишку взрослых крыс (Tait et al. , 1994b, 1995). Напротив, контрольная толстая кишка, подвергшаяся мукозэктомии без имплантации органоида, не показала повторного роста эпителия.Совсем недавно, в попытке разработать лечение мальабсорбции желчных кислот, Стельцнер и его коллеги трансплантировали органоидные единицы, полученные из подвздошной кишки крысы, на оголенные сегменты тощей кишки и показали повышенное поглощение желчных кислот, а также повышенную экспрессию белка-транспортера желчных кислот в подвздошной кишке. неоилеальный сегмент (Avansino et al. , 2005).

Успешный посев органоидных единиц тонкой кишки на биоразлагаемые каркасы был впервые продемонстрирован Чой в нашей лаборатории.В ее первоначальной работе органоидные единицы, полученные из кишечника новорожденных крыс, были засеяны на нетканые пробирки из PGA. Каждая пробирка была высокопористой (например, 95%) и имела средний размер пор 250 микрон, чтобы соответствовать размеру этих кластеров клеток (Choi and Vacanti, 1997). На внешнюю поверхность каркаса напыляли 5% поли-L-молочной кислоты, чтобы помочь повысить устойчивость к силам сжатия, которые в противном случае привели бы к коллапсу просвета после имплантации. На заключительном этапе процесса изготовления каркаса трубки были покрыты коллагеном I типа для улучшения прикрепления органоидных единиц (рис.46.2). Затем засеянные конструкции имплантировали в сальник сингенных взрослых крыс, чтобы обеспечить прорастание сосудов. Уже через две недели после имплантации собранные конструкции напоминали кисты, выстланные новообразованием, состоящим из столбчатого эпителия с бокаловидными клетками и клетками Панета (рис. 46.3). Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание на альфа-актин гладких мышц было положительным в строме, прилегающей к неомукозе, что указывает на соответствующее восстановление слоя гладких мышц кишечника (рис.46,4). Используя краситель S100, в этих конструкциях также были обнаружены нейрональные клетки. Иммунофлуоресцентное окрашивание новой слизистой оболочки выявило апикальную экспрессию ферментов щеточной каймы, а также базолатеральное окрашивание ламинина (Choi et al., 1998). Исследования сконструированных конструкций с помощью камеры Уссинга показали аналогичное снижение активного трансэпителиального сопротивления по сравнению с естественным тонким кишечником, что соответствует основным функциональным критериям кишечного эпителия. Таким образом, впервые в этих исследованиях был установлен надежный подход к созданию ткани на биоразлагаемом каркасе, которая имела поразительное сходство с нативной полнослойной слизистой оболочкой тонкой кишки.

РИС. 46.2. ( A ) Общий вид трубчатого каркаса, состоящего из полигликолевой кислоты (PGA) и обработанного 5% полимолочной кислоты. Сканирующая электронная микрофотография полимера-PGA до ( B ) и после ( C ) покрытия коллагеном типа I (исходное увеличение, × 100). Черная стрелка отмечает коллаген, покрывающий полимер и заполняющий промежутки между волокнами. Из Choi et al. (1998), стр. 993.

РИС. 46.3. Общий вид типичной тканевой кисты тонкой кишки, взятой из сальника взрослой крысы через четыре недели.Из Grikscheit et al. (2004), стр. 751.

РИС. 46.4. Микрофотография окрашенной гематоксилином и эозином ткани тонкого кишечника крысы через 10 недель после резекции тонкой кишки и анастомоза из стороны в сторону (исходное увеличение × 80). L — просвет кисты; SM, гладкая мускулатура. Из Kim et al. (1999b), стр. 11.

В последующие годы наша лаборатория детально исследовала органоидный подход к конструированию кист тонкого кишечника. Продолжительное культивирование in vitro этих клеток в течение нескольких дней или недель не привело к лучшим результатам по сравнению с имплантацией в течение нескольких часов после выделения органоидных единиц.Тем не менее, другие модификации этого протокола оказались успешными в создании более прочной новой слизистой оболочки кишечника. Например, анастомоз «бок в бок» и «конец в конец» инженерной кишки с нативной тощей кишкой улучшает гистологию этих кист, когда собирают грызунов в срок до 10 недель после операции (рис. 46.5) (Kaihara et al. , 1999a , 1999b; Kim et al. , 1999). Повышенные регенеративные стимулы, вызванные резекцией тонкой кишки и, в меньшей степени, портокавальным шунтированием, также показали, что при морфометрическом анализе усиливают формирование тканевой инженерии кишечника.Эти результаты предполагают возможную роль трофических факторов, таких как фактор роста гепатоцитов (HGF) и эпидермальный фактор роста (EGF), в росте новообразований (Kim et al. , 1999). Прорастание этих искусственно созданных кишечных трансплантатов сохраняется до 36 недель (Kaihara et al. , 2000). Благодаря продолжающемуся сотрудничеству с Вангом и его коллегами мы смогли дополнительно охарактеризовать степень ангиогенеза и лимфангиогенеза в этих тканевых трансплантатах (Gardner-Thorpe et al., 2003; Даксбери и др. , 2004).

РИС. 46,5. (A) Общий вид тонкой кишки крысы с тканевой инженерией после анастомоза из стороны в сторону с естественной тонкой кишкой во время сбора урожая (черная стрелка обозначает тканевую тонкую кишку). ( B ) Поперечное сечение открытого анастомоза между тканеинженерной конструкцией и нативной тонкой кишкой (столбик, 5 мм). Из Kim et al. (1999b), стр. 9.

Используя небольшую модификацию протокола выделения органоидных единиц, наша лаборатория недавно показала, что эти кишечные кисты, когда анастомозируют бок в бок с нативным кишечником после 85% энтерэктомии реципиента, могут замедлять время прохождения кишечника. и улучшить набор веса по сравнению с крысами, которым была выполнена энтерэктомия без тканевой замены (Grikscheit et al., 2004). Эти данные свидетельствуют о том, что тканевые кишечные кисты размером всего 10% от длины нативного тонкого кишечника могут быть достаточными для обеспечения адекватной абсорбционной функции в модели на крысах. В свете этих многообещающих результатов мы начали некоторые исследования на крупных животных с использованием подхода органоидных единиц, и с тех пор продемонстрировали успешное создание тканевой инженерии тонкой кишки на модели молодых свиней (рис. 46.6, ранее не публиковавшееся).

РИС. 46.6. Микрофотография окрашенной гематоксилином и эозином тонкой кишки с тканевой инженерией, полученной из сальника через семь недель в модели молодых свиней (исходное увеличение, × 200).Неопубликованные данные любезно предоставлены Трейси С. Грикшайт и Эрин Р. Очоа.

Сконструированные кишечные кисты также предоставили уникальную экспериментальную модельную систему для изучения морфогенеза кишечника. Например, в анастомозированных тканевых кистах тонкой кишки, собранных через 20 недель, плотность и топографическое распределение субпопуляций иммунных клеток, а именно Т-клеток, В-клеток и NK-клеток, были идентичны таковым в нормальной тощей кишке. (Перес и др. , 2002). Более того, эти плотности популяции иммуноцитов были только рудиментарными в неанастомозированных кистах.Эти данные предполагают, что воздействие просветных стимулов может иметь решающее значение для формирования иммунной системы слизистой оболочки.

Также было показано, что анастомоз кишечных кист с нативным кишечником усиливает экспрессию натрийзависимого переносчика глюкозы, SGLT1 (Tavakkolizadeh et al. , 2003). Рост слизистой оболочки и экспрессия SGLT1 также могут быть увеличены в этой модели, если крысам вводят глюкогоноподобный пептид 2 (GLP-2), эндогенный регуляторный пептид, который обладает мощной трофической активностью, специфичной для слизистой оболочки кишечника (Ramsanahie et al., 2003). Биоматериалы третьего поколения, которые могут быть разработаны для контролируемого высвобождения веществ, встроенных в биоразлагаемый каркас, использовались в других приложениях тканевой инженерии и могут быть подходом для создания более устойчивого роста новообразований кишечника в нашей модели (Kent Leach et al. др. , 2006).

Хотя органоидные единицы оказались весьма успешными в восстановлении свойств нативной слизистой оболочки тонкого кишечника, важно осознавать ограничения этой стратегии в том виде, в каком она выполняется в настоящее время.Например, несмотря на использование трубчатых каркасов на основе PGA, эти кишечные конструкции образуют не цилиндрические трубки, а, скорее, сплюснутые сфероиды, напоминающие кисты удвоения кишечника. Это явление происходит, по крайней мере частично, из-за повышенного внутрипросветного давления, когда кишечная слизистая оболочка регенерируется и вырабатывает секреты. Кроме того, очевидно, что PGA не обладает достаточной механической прочностью, чтобы выдерживать повышенное внутрипросветное давление, несмотря на время разложения примерно шесть недель.Несмотря на это, результирующая сплюснутая сфероидная архитектура предполагает, что значимая и скоординированная перистальтика внутри значительной конструкции маловероятна, даже при наличии иннервируемого слоя гладких мышц. Способы декомпрессии просвета в процессе регенерации кишечного эпителия могут быть полезны для создания более желательной архитектуры. Кроме того, использование новых биоматериалов, которые имеют более благоприятные механические характеристики и характеристики разложения, может позволить лучше контролировать трехмерную геометрию неоинтестина.Исследования с использованием альтернативных каркасов, таких как поли (эпсилонкапролактон) (PCL) и поли (сложноэфирный уретан) мочевина (PEUU), продолжаются в нашей лаборатории, и первые данные являются многообещающими.

Другим ограничением подхода органоидных единиц к созданию тканевой инженерии тонкой кишки является неспособность последовательно увеличивать эти кластеры клеток ex vivo , как было первоначально описано Evans et al. В настоящее время для создания кишечной конструкции с использованием сальника в качестве биореактора in vivo требуется относительно большое количество органоидных единиц (приблизительно 15000 см ² ).К сожалению, нам не удалось культивировать нормальные органоидные единицы более недели in vitro. Трансформированные линии эпителиальных клеток технически могут быть использованы для тканевой инженерии тонкого кишечника, но это нежелательно, поскольку они не являются ни аутологичными, ни нормальными эпителиальными клетками.

Об интригующей вариации подхода органоидных единиц к инженерии ткани тонкого кишечника недавно сообщил Ллойд и его группа в Великобритании (Lloyd et al. , 2006). В этом исследовании они имплантировали крысам подкожно трубчатые вспененные каркасы из полилактид-гликолида (PGLA).PLGA имел толщину 2 мм и поддерживался внутренней силиконовой трубкой. Через пять недель силиконовая трубка была удалена, и просвет был заполнен органоидными единицами кишечника, суспендированными в гидрогеле, содержащем HGF. Все конструкции, которые были исследованы через четыре недели, выявили сфероидные кисты с признаками слизистой оболочки кишечника в просвете. Потенциальным преимуществом этого подхода является очевидная эффективность, с помощью которой новообразование может быть получено из данного образца донорской ткани. Тем не менее, существует ряд сбивающих с толку факторов (например,g., гидрогель, введение фактора роста), что также может объяснить положительные результаты в этом исследовании. Остается неясным, присутствовали ли какие-либо гладкие мышцы в этих конструкциях при сборе урожая. Кроме того, как мы уже обсуждали, общая сферическая архитектура этих инженерных кишечных трансплантатов остается далеко не идеальной.

Персонализированная медицина на основе органоидов: от кабинета до постели больного | Cell Regeneration

Прогресс органоидов печени человека | Журнал молекулярной клеточной биологии

Аннотация

Понимание развития, регенерации и нарушений печени является основной целью биологии печени.Современные механистические знания о печени человека в значительной степени были получены на моделях мышей и клеточных линиях, которые не сумели воспроизвести особенности клеток печени человека или структуры и функции печени человека. Органоиды как система in vitro обещают создать органоподобные ткани в чашке. Последние достижения в области органоидов печени человека также облегчают понимание биологии и болезней этого сложного органа. Здесь мы рассматриваем прогресс в области органоидов печени человека, уделяя основное внимание методам получения органоидов печени, их применению и возможным направлениям в будущем.

Органоиды в целом

Органоиды теперь используются для обозначения миниатюрных органоподобных культур в трехмерных культурах (Lancaster and Knoblich, 2014). В отличие от клеток в 2D-культурах, органоиды образуются в результате самоорганизации групп клеток, включая стволовые клетки, предшественники тканей взрослого человека и различные типы зрелых клеток из органа, в пространственной структуре, аналогичной тканям-аналогам in vivo . Еще в прошлые века ученые продемонстрировали способность диссоциированных клеток восстанавливать тканеподобную ассоциацию in vitro (Moscona and Moscona, 1952; Weiss and Taylor, 1960).Тем не менее, бум этой новой области должен подождать до последних десятилетий, когда будут достигнуты успехи в понимании морфогенеза, разработки технологий стволовых клеток и приготовления надлежащих внеклеточных матриц (ECM) (Simian and Bissell, 2017). Фактически, за последние 10 лет в большом количестве исследований сообщалось о генерации органоидов в различных органах, таких как мозг, сетчатка, почки, легкие, кишечник и печень (Willyard, 2015).

Органоиды — это легкодоступная модель in vitro, , которая воспроизводит определенные структуры и функции их аналогичных органов in vivo, , которые не наблюдаются в отдельных клетках или культивируемых 2D клеточных листах, и, как таковые, значительно расширяют наши исследования объемы.Интересно, что органоиды не только вносят структурные и функциональные изменения в клетку, но также приносят другие недооцененные особенности ткани. Например, неожиданно было показано, что стабилизированная архитектура ткани может поддерживать улучшенную точность хромосом, вероятно, за счет опосредованного интегрином установления полярности клеток (Knouse et al., 2018). Органоиды зарекомендовали себя как мощный инструмент для изучения развития и регенерации, а также как потенциальную модель для понимания человеческих заболеваний и изучения методов лечения болезней (Clevers, 2016).Органоиды головного мозга, полученные путем дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток (PSC), применялись для моделирования развития коры головного мозга, эволюции мозга и нервных расстройств, включая аутизм, болезнь Альцгеймера и инфекцию, вызванную вирусом Зика (ZIKV) (Qian et al., 2019). Было обнаружено, что кишечные органоиды, полученные из единичных стволовых клеток Lgr5 ⁺ , создают структуры крипта-ворсинка с многослойным эпителием, представляя основные типы клеток в кишечнике (Sato et al., 2009), и такие кишечные органоиды использовались для имитации регенерация тканей и развитие рака (Nakamura and Sato, 2018).

Помимо этого, органоиды предоставляют новые инструменты для трансляционных исследований и альтернативных методов заместительной терапии в клиниках. Раковые органоиды, полученные с помощью генной инженерии нормальных клеток или из первичных опухолевых тканей, открывают перспективы для разработки лекарств и персонализированного лечения рака (Tuveson and Clevers, 2019). Сконструированные органоиды путем последовательного введения онкогенных мутаций использовались при моделировании процесса инициации и развития различных типов рака, таких как рак протоков поджелудочной железы (Huang et al., 2015) и колоректального рака (Crespo et al., 2017). Более того, биобанки органоидов (PDO), полученных от пациентов, при раке простаты (Gao et al., 2014), раке груди (Sachs et al., 2018), колоректальном раке (van de Wetering et al., 2015) , яичников рак (Kopper et al., 2019) и рак мочевого пузыря (Lee et al., 2018) стали бесценными ресурсами для точной медицины. Кроме того, пилотные исследования продемонстрировали применение органоидов в регенеративной медицине. Например, толстая кишка (Yui et al., 2012) и органоиды печени (Huch et al., 2013; Takebe et al., 2013), дифференцированные из стволовых клеток, показали некоторые терапевтические эффекты у мышей.

В связи с быстрым развитием и широким спросом на технологии органоидов, традиционные 3D-культуры столкнулись с проблемами, чтобы добиться точного контроля образования органоидов и реализовать сложную микросреду данного органа. Как следствие, это открывает новые границы исследований в области воспроизводимости органоидной культуры, включения клеток из других функциональных линий и альянса с редактированием генов для приобретения сложных органоидов (Park et al., 2019). Отличительной чертой этой тенденции является разработка отдельных органоидов головного мозга, содержащих различные типы клеток коры головного мозга человека, была достигнута путем адаптации и оптимизации нескольких протоколов (Velasco et al., 2019). Другие исследователи занимаются созданием сложных органоидов, чтобы лучше имитировать статус заболевания in vivo , включая инженерные сосудистые системы (Cakir et al., 2019; Homan et al., 2019; Wimmer et al., 2019), а также нервную систему. (Workman et al., 2017) и сборку различных частей ткани вместе (Harrison et al., 2017).

Печень как самый большой висцеральный орган важна для многих важных жизненно важных функций, таких как метаболизм углеводов и липидов, детоксикация лекарств, секреция желчи и выработка белков плазмы. В последние годы он привлек большой интерес к разработке органоидов печени. Полученные таким образом органоиды печени обеспечивают структурные и функциональные преимущества для понимания развития печени и возникновения заболеваний печени in vitro . Здесь мы суммируем недавний прогресс в создании органоидов печени и их потенциальное применение.

Строение печени

Печень состоит из тысяч основных структурных и функциональных единиц, называемых дольками печени, которые эволюционно консервативны между видами у позвоночных (Si-Tayeb et al., 2010a; Miyajima et al., 2014; Shiojiri et al., 2018). Долька печени состоит из паренхимных клеток, в основном гепатоцитов, и непаренхимальных клеток, включая холангиоциты, синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSEC), звездчатые клетки печени (HSC) и иммунные клетки.Интересно, что исследования секвенирования отдельных клеток недавно предложили новые типы клеток в долях печени человека, которые, однако, потребуют функционального подтверждения в будущем (MacParland et al., 2018; Aizarani et al., 2019). Гепатоциты и холангиоциты — это два типа эпителиальных клеток, дифференцированных от гепатобластов, клеток-предшественников эмбриональной печени, во время органогенеза. Различные типы клеток печени расположены в определенных положениях вдоль дольки, которые необходимы для их собственных функций, а также для других типов клеток (Si-Tayeb et al., 2010a; Miyajima et al., 2014). Гепатоциты, играющие важную роль в функциях печени, расположены в виде тяжей, идущих вдоль синусоидов печени от центральных вен к воротным венам. Гепатоциты представляют собой поляризованные эпителиальные клетки с плотными контактами на боковых мембранах, тогда как базальные мембраны обращены к LSEC. Уникальные структуры полярности необходимы для функций гепатоцитов. Сосудистые системы приносят кислород и питание из воротной вены и печеночной артерии, выстланной в перипортальной области, в центральную вену, создавая таким образом зональную среду в дольке.Каналы желчи закрыты плотными контактами на боковой мембране между соседними гепатоцитами, функционируя для сбора желчи, секретируемой гепатоцитами. Желчь, выделяемая из желчных каналов, течет в противоположных направлениях крови и выводится из печени из желчных протоков (рис. 1).

Рисунок 1

Схематическая диаграмма доли печени и сохранение между видами. Долька печени, содержащая две проточные системы, билиарную и сосудистую, является фундаментальной и консервативной структурой печени между видами.Кислородная кровь и пища поступают в печень от воротной вены и печеночной артерии в перицентральной области к центральным венам в перицентральной области. Желчь, выделяемая гепатоцитами, собирается в желчный проток, который течет в противоположных направлениях. Портальная вена, печеночная артерия и желчный проток составляют структуру портальной триады. Пластинки гепатоцитов выстраиваются вдоль синусоидальных капилляров печени в радиальном направлении от перицентральной области к перицентральной области. LSEC, клетки Купфера и другие резидентные макрофаги расположены на просветной стороне синусоидов, тогда как HSC расположены снаружи.

Рисунок 1

Схематическая диаграмма доли печени и сохранение между видами. Долька печени, содержащая две проточные системы, билиарную и сосудистую, является фундаментальной и консервативной структурой печени между видами. Кислородная кровь и пища поступают в печень от воротной вены и печеночной артерии в перицентральной области к центральным венам в перицентральной области. Желчь, выделяемая гепатоцитами, собирается в желчный проток, который течет в противоположных направлениях.Портальная вена, печеночная артерия и желчный проток составляют структуру портальной триады. Пластинки гепатоцитов выстраиваются вдоль синусоидальных капилляров печени в радиальном направлении от перицентральной области к перицентральной области. LSEC, клетки Купфера и другие резидентные макрофаги расположены на просветной стороне синусоидов, тогда как HSC расположены снаружи.

Учитывая такую ​​сложную структуру, очевидно, трудно создать организованную структуру долек, несущую множество функций печени in vitro .Вдобавок ко всему, культивирование и размножение первичных гепатоцитов (PH), которые поддерживают функции печени, долгое время были узким местом в этой области (Bhatia et al., 2014). Только в последние годы с развитием технологий стволовых клеток стало возможным культивировать и расширять функциональные гепатоциты и холангиоциты в лаборатории. На основе этого прогресса, таким образом, появилось много захватывающих достижений, начиная от культивирования простых органоидов, которые были созданы из одного типа клеток, до сложных органоидов, собирающихся с различными типами клеток (Таблица 1).

Последние достижения в создании органоидов печени in vitro.

Последние достижения в области создания органоидов печени in vitro.

Простые органоиды печени

Гепатоциты и холангиоциты — два основных типа функциональных клеток печени. Недавний прогресс в области простых органоидов печени сосредоточился на методах генерации органоидов с помощью гепатоцитов или холангиоцитов. Органоиды гепатоцитов демонстрировали твердые скопления хорошо структурированных гепатоцитов, что сопровождалось усилением полярности и улучшением функции печени. Органоиды холангиоцитов часто проявляли кистозные полые структуры и осуществляли транспортировку жидкости и набухание кисты.Здесь мы опишем методологию генерации, а также структурные и функциональные особенности этих органоидов.

Дифференциация PSC

Дифференциация и репрограммирование in vitro доказали свою эффективность как успешные стратегии создания функциональных гепатоцитов и холангиоцитов в культуре. Было разработано несколько протоколов для дифференциации ПСК в гепатоцитоподобные клетки и холангиоцитоподобные клетки после ступенчатой ​​дифференцировки с добавлением факторов роста и химических ингибиторов в соответствии с эмбриональным развитием (Song et al., 2009; Си-Тайеб и др., 2010b; Дианат и др., 2014; Szkolnicka et al., 2014; Огава и др., 2015; Сампазиотис и др., 2015). Гепатоциты, дифференцированные с помощью PSC, становятся более зрелыми после сборки в 3D органоиды с поразительным улучшением экспрессии генов, связанных с функциями печени, таких как гены альбумина, TAT и CYP450, а также поверхностный маркер зрелых гепатоцитов ASGR1 (Ogawa et al., 2013) . Когда ПСХ дифференцировались в холангиоциты в виде агрегатов, они представляли протоковые структуры с морфологией трубчатых или полых кист.Примечательно, что они приобрели апикобазальную полярность с экспрессией маркеров, ограниченной апикальной стороной, и присутствием первичных ресничек, важных сенсорных органелл, контролирующих функции холангиоцитов (Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015).

Самостоятельная сборка перепрограммированных клеток печени

Помимо генерации органоидов из агрегатов PSC, самосборка дифференцированных зрелых клеток в сфероиды представляет собой другую стратегию. Принудительная активация транскрипционных факторов печени напрямую превращает фибробласты в гепатоцитоподобные клетки, этот процесс также называется трансдифференцировкой (Huang et al., 2011, 2014; Секия и Сузуки, 2011 г .; Du et al., 2014). Примечательно, что гепатоциты, полученные в результате дифференцировки или трансдифференцировки ПСХ, показали сравнимые функции во многих аспектах (Gao et al., 2017). Трансдифференцированные гепатоциты могут самоорганизовываться в органоиды с улучшенными функциями гепатоцитов в пластинах со сверхнизким сцеплением (Yamamoto et al., 2018; Sun et al., 2019). Важно отметить, что гепатоциты в органоидах имели многоугольную форму и имели овальные ядра и структуры желчных канальцев, что указывает на усиление полярности печени.Более того, органоиды гепатоцитов продемонстрировали улучшенную экспрессию генов гепатоцитов и функции в секреции альбумина, хранении гликогена, метаболизме лекарств и транспортировке липидов (Sun et al., 2019). Механистически активация передачи сигналов Hippo, как предполагается, является критической для созревания печени в самоорганизующихся органоидах печени. Пониженные ядерные уровни Yap, которые, возможно, опосредованы внутриклеточной реорганизацией актина, способствовали остановке роста и функциональной дифференцировке этих трансдифференцированных органоидов гепатоцитов (Yamamoto et al., 2018).

Самоорганизация первичных клеток печени

Первичные клетки, выделенные из печени взрослых в физиологических или патологических условиях, также обладают способностью расти в виде органоидов. Гепатобласты эмбриональной мыши Lgr5 ⁺ или индуцированные повреждением клетки печени взрослой мыши Lgr5 ⁺ могут размножаться как бипотентные органоиды-предшественники in vitr o, которые демонстрируют способность дифференцироваться в функциональные гепатоциты (Huch et al., 2013; Prior et al. al., 2019). Недавно PH, выделенные от мышей, были способны интенсивно пролиферировать in vitro в виде органоидов или бипотентных клеток-предшественников под действием агонистов Wnt, ингибиторов TGFβ или вызванного повреждением воспалительного цитокина TNFα различными группами (Katsuda et al., 2017; Hu et al., 2018; Peng et al., 2018). Примечательно, что органоиды гепатоцитов мыши могут размножаться в течение 2–3 месяцев in vitro, с индукцией маркеров желчных путей и маркеров клеток-предшественников под руководством агонистов Wnt (Hu et al., 2018), тогда как для TNFα-индуцированных клеток можно было пассировать в течение ~ 6 месяцев без экспрессии этих маркеров желчных путей или предшественников (Peng et al., 2018). В целом, пролиферирующие органоиды гепатоцитов мышей воспроизводили паттерны экспрессии генов пролиферации гепатоцитов после частичной гепатэктомии (PHx) in vivo .

Важно отметить, что несколько групп сообщили об условиях культивирования для долгосрочной экспансии гепатоцитов взрослого человека в виде бифенотипических или печеночных клеток-предшественников in vitro .Поразительно, что когда эти разросшиеся бифенотипические клетки были агрегированы и далее культивированы как органоиды, они повторно дифференцировались в зрелые гепатоциты с резким улучшением функции печени и значительной потерей свойств предшественников (Zhang et al., 2018; Fu et al. , 2019). Важно отметить, что в этих органоидах были обнаружены двухъядерные клетки, что было отличительной чертой зрелых гепатоцитов (Zhang et al., 2018). Помимо гепатоцитов взрослых, гепатоциты, выделенные из печени плода человека, были установлены в органоидах, которые поддерживали важные функции и структуры печени в течение нескольких месяцев (Hu et al., 2018). Также стоит упомянуть, что первичные протоковые клетки человека EpCAM ⁺ можно было легко размножить как бипотентные клетки-предшественники в определенных условиях 3D-культивирования. Стабильные по геному клональные культуры могли даже инициироваться из одноклеточных клеток, и все органоиды проявляли типичный протоковый фенотип (Huch et al., 2015).

Комплекс органоидов печени

Сложные органоиды печени, состоящие из нескольких типов клеток, были созданы в нескольких лабораториях с упором на развитие сосудистой или желчевыводящей систем.Формирование сосудистой сети эндотелиальными клетками имеет фундаментальное значение для питания и доставки кислорода в орган. Для создания васкуляризованных органоидов печени человеческие эндотелиальные клетки, полученные из эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) или дифференцировки PSC, мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и клетки печеночной энтодермы, полученные из PSC, культивировали вместе в пластинах со сверхнизким сцеплением. Эти клетки образовывали агрегаты и генерировали зачатки печени человека через 1-2 дня (Takebe et al., 2013, 2017). Факторы, зависимые от стромальных клеток, участвовали в формировании зачатков печени.Эндотелиальная сеть была однородно распределена в органоидах. Примечательно, что после трансплантации in vivo зачатки печени, соединенные с сосудами хозяина, и кровеносные сосуды стали беспрепятственными и имели ту же плотность и морфологию, что и сосуды печени взрослых (Takebe et al., 2013). Однако различные типы клеток в зачатках печени не показали четких признаков организованных структур при гистологическом анализе. В другом исследовании семена ткани печени человека были сконструированы путем конструирования человеческих PH, эндотелиальных клеток и стромальных клеток по заранее подготовленному образцу, основанному на клеточных сигнальных сетях в процессе регенерации.После транзиторной культуры in vitro они были приживлены мышам с печеночной недостаточностью, что позволяет лучше размножать искусственные органоиды печени в ответ на регенеративные сигналы по сравнению со случайно организованными клетками (Stevens et al., 2017).

Для билиарной системы холангиоциты проходят вдоль желчных протоков для транспортировки желчи, выделяемой гепатоцитами, из печени. В отличие от васкуляризованных органоидов, генерируемых сборкой нескольких типов клеток, гепатобилиарные органоиды в основном генерировались протоколами, использующими ко-дифференцировку гепатоцитов и холангиоцитов из PSCs, которые повторяли несколько ключевых аспектов органогенеза печени in vivo .Гепатоциты были плотно собраны в органоидах гепатобилиарной системы, в то время как холангиоциты имели кистозные структуры. Хотя обе клетки представляли структуры, аналогичные гепатоцитам и холангиоцитам in vivo , они не были организованы по схеме зонирования, соответствующей структурам печени in vivo , и не выполняли экзокринные функции (Guan et al., 2017; Wu et al., 2019 ). Будущие попытки усилить структуры и клеточные взаимодействия в печени необходимы для создания сложных органоидов печени (Таблица 1).

Применение органоидов печени

Появление органоидов обогащает инструментарий моделирования эмбрионального развития, регенерации тканей взрослых и заболеваний, а также способствует развитию регенеративной медицины будущего. Что касается органоидов печени, для их применения было разработано множество протоколов (рис. 2).

Рисунок 2

Текущие применения органоидов печени. Органоиды печени, полученные от здоровых доноров, представляют собой идеальные модели для понимания фундаментальных биологических процессов в печени, включая эмбриональное развитие и регенерацию.Они также показывают потенциал в моделировании заболеваний печени. Органоиды, полученные из образцов больных, включая органоиды рака, воспроизводят оригинальные черты пациентов. Более того, редактирование генов, вирусные инфекции и введение лекарств в органоиды печени могут моделировать возникновение и процессы развития заболеваний, включая возникновение рака печени и хронические или наследственные заболевания. Будем надеяться, что здоровые органоиды печени можно будет применить в регенеративной медицине. Они являются идеальными моделями для проверки различных лекарств и трансляционных исследований в клинике.

Рисунок 2

Текущие применения органоидов печени. Органоиды печени, полученные от здоровых доноров, представляют собой идеальные модели для понимания фундаментальных биологических процессов в печени, включая эмбриональное развитие и регенерацию. Они также показывают потенциал в моделировании заболеваний печени. Органоиды, полученные из образцов больных, включая органоиды рака, воспроизводят оригинальные черты пациентов. Более того, редактирование генов, вирусные инфекции и введение лекарств в органоиды печени могут моделировать возникновение и процессы развития заболеваний, включая возникновение рака печени и хронические или наследственные заболевания.Будем надеяться, что здоровые органоиды печени можно будет применить в регенеративной медицине. Они являются идеальными моделями для проверки различных лекарств и трансляционных исследований в клинике.

Развитие и регенерация печени

Развитие эмбриональной печени и регенерация печени у взрослых зависят от согласованного взаимодействия множественных сигнальных путей. Однако функции этих сигнальных путей остаются в значительной степени нерешенными. Органоиды печени, происходящие из PSC, представляют собой модель для изучения фундаментальных процессов во время развития печени.Органоиды печени, которые дифференцируются от ПСХ, включая органоиды гепатоцитов, органоиды холангиоцитов и органоиды гепатобилиарной системы, проходят ступенчатую дифференцировку и до некоторой степени повторяют развитие печени in vivo . Используя преимущества органоидов печени, было обнаружено, что паракринные сигналы, полученные от мезенхимальных или эндотелиальных клеток, способствуют созреванию органоидов печени из PSCs, что, по-видимому, является моделью для повторения взаимодействий между стромальными и эпителиальными клетками в развитии печени (Asai et al. ., 2017; Кэмп и др., 2017).

Более того, органоиды печени, полученные из клеток с унаследованными мутациями, предоставляют новые модели для анализа аномалий развития, вызванных этими мутациями. Путь Notch важен для образования желчных путей, а мутации JAG1, одного из лигандов Notch, вызывают синдром Аладжиля (ALGS), аутосомно-доминантное генетическое заболевание. Действительно, органоиды печени, генерированные клетками пациентов с ALGS, показали нарушение образования холангиоцитов, что представляет собой модель для исследования пути Notch в развитии желчных протоков (Guan et al., 2017).

Печень обладает замечательной регенеративной способностью. Терминально дифференцированные гепатоциты и холангиоциты пластичны для регенерации печени при состояниях повреждения либо посредством саморепликации, либо путем преобразования клонов (Li et al., 2016). Гепатоцит-зависимая пролиферация восстанавливает потерянную массу печени после PHx. Интересно, что растущие органоиды мышиных гепатоцитов in vitro показали сходные профили транскрипции с профилями пролиферирующих гепатоцитов после PHx, предполагая повторение регенерации in vitro (Hu et al., 2018). После хронического повреждения печени или желчных протоков гепатоциты, как было установлено, подвергаются репрограммированию в клетки, подобные предшественникам, для регенерации, и передача сигналов Hippo-Yap, по-видимому, играет существенную роль (Li et al., 2019). В самом деле, активация YAP в органоидах, происходящих из перфузированных гепатоцитов, индуцирует экспрессию эндогенных генов предшественников печени и демонстрирует сильную клоногенную способность, подтверждая, что передача сигналов Hippo может контролировать судьбу клеток печени (Yimlamai et al., 2014). Резидентные взрослые холангиоциты также могут регенерировать печень после хронического повреждения (Raven et al., 2017; Deng et al., 2018; Manco et al., 2019; Russell et al., 2019). Было показано, что органоиды холангиоцитов KRT19 ⁺ конвертируются в гепатоциты с экспрессией альбумина, но не KRT19, при трансплантации в CCl ₄ -реторсин-индуцированное острое повреждение печени (Huch et al., 2015). Путем сравнения транскриптомных и эпигенетических регуляторов органоидов холангиоцитов с холангиоцитами в печени, поврежденной гепатотоксином 3,5-диэтоксикарбонил-1,4-дигидроколлидин (DDC), были выявлены аналогичные изменения во всем геноме, которые были лицензированы посредством TET1-опосредованного гидроксиметилирования. которые также подтвердили, что органоид печени является моделью для изучения регенерации тканей при повреждениях печени (Aloia et al., 2019).

Органоиды печени также могут имитировать регенерацию гепатоцитов во время гомеостаза печени. Недавнее исследование показало, что Wnt-чувствительные клетки посредством мечения Axin2 действуют как предшественники во время физиологических условий (Wang et al., 2015). Путем выделения Lgr5 ⁺ Wnt-чувствительных клеток в CCl ₄ -поврежденной печени было обнаружено, что клетки Lgr5 ⁺ широко размножаются в культуре органоидов (Huch et al., 2013). Клональные органоиды экспрессировали множественные маркеры клонов гепатоцитов, что указывает на возможную популяцию Wnt-чувствительных предшественников в печени.Роль клеток-предшественников Axin2 ⁺ или Lgr5 ⁺ , однако, оставалась спорной, поскольку другие независимые эксперименты показали ограниченный вклад этих клеток в регенерацию печени (Planas-Paz et al., 2016; Ang et al., 2019; Chen et al., 2020; Sun et al., 2020). Тем не менее органоиды печени предлагают удобный способ изучить процесс регенерации и могут дать представление о том, как управлять процессом регенерации.

Моделирование рака печени

Рак печени занимает шестое место по распространенности и четвертое место среди злокачественных новообразований во всем мире (Bray et al., 2018). Поздняя диагностика и неоднородность опухоли способствуют высокой смертности пациентов с раком печени (Marquardt et al., 2015). Генная инженерия органоидов гепатоцитов или холангиоцитов с потенциальными онкогенами-драйверами обеспечивает управляемую и выполнимую систему для моделирования инициации рака печени. Также возможно изучить структурные и функциональные изменения во время канцерогенеза в сконструированных органоидах.

Путем введения c-MYC, важного онкогена гепатоцеллюлярной карциномы человека (ГЦК), в органоиды, полученные из трансдифференцированных гепатоцитов, Sun et al.(2020) наблюдали чрезмерные контакты между митохондриями и мембранами эндоплазматического ретикулума, что оказалось нераспознанным онкогенным событием в канцерогенезе печени (Sun et al., 2019). Более того, отслеживая процесс индуцированного RAS канцерогенеза в органоидах гепатоцитов, гепатоциты постепенно экспрессировали маркеры холангиоцитов, такие как CK7, CK19, SOX9 и SPP1, и начали обладать внутриклеточными полостями, заполненными микроворсинками, отличительной ультраструктурой внутрипеченочной холангиокарциномы (ICC ) клетки (Sun et al., 2019). Это была первая документация о превращении гепатоцитов человека в клетки ICC, поэтому подтверждается, что гепатоциты могут быть клеткой происхождения для ICC. Другие распространенные гены рака также были проанализированы в органоидах гепатоцитов и холангиоцитов. Мутации, влияющие на предложенный эпигенетический регулятор BAP1, деубиквитинирующий фермент, участвуют в ICCs (Jiao et al., 2013). Утрата функции BAP1 органоидами холангиоцитов человека нарушает организацию эпителия и полярность клеток. Геномный анализ показал, что дефицит BAP1 в органоидах холангиоцитов человека влияет на доступность хроматина, связанного с соединительными и цитоскелетными генами, что, по-видимому, имеет решающее значение для приобретения злокачественных признаков в ICC человека (Таблица 2; Artegiani et al., 2019).

Моделирование заболеваний печени с помощью органоидов .

Моделирование заболеваний печени с помощью органоидов .

Рисунок 3

Будущие возможности органоидов печени. Будущие усилия будут сосредоточены на использовании преимуществ различных технологий, включая биоинженерию, запрограммированную самосборку и т. Д., Для сборки различных типов клеток печени в организованные и сложные органоиды печени. Мы могли бы представить себе создание крупномасштабной единицы печени или даже приобретение различных функциональных единиц органов для изучения связи между органами.

Рисунок 3

Будущие возможности органоидов печени. Будущие усилия будут сосредоточены на использовании преимуществ различных технологий, включая биоинженерию, запрограммированную самосборку и т. Д., Для сборки различных типов клеток печени в организованные и сложные органоиды печени. Мы могли бы представить себе создание крупномасштабной единицы печени или даже приобретение различных функциональных единиц органов для изучения связи между органами.

PDO — еще одна полезная система для исследований рака.Они воспроизводят особенности первичного рака и позволяют анализировать рак на злокачественной стадии. PDO рака печени были установлены несколькими группами даже с использованием образцов, проколотых иглой. PDO рака печени были в основном получены из низкодифференцированных опухолей, с общей эффективностью 37,5% для резецированных образцов и 26% для образцов биопсии (Broutier et al., 2017; Nuciforo et al., 2018). PDO рака печени продемонстрировали гистологическую архитектуру и геномный ландшафт первичного рака печени и, что важно, смогли отразить внутриопухолевую гетерогенность (Nuciforo et al., 2018). Таким образом, PDO позволили выявить индивидуальную лекарственную чувствительность пациента и создать платформу для информирования о разработке лекарств. При тестировании in vitro PDO рака печени показали способность проявлять различную реакцию на сорафениб, препарат с ограниченным ответом у пациентов с ГЦК. Кроме того, скрининг лекарств в PDO рака печени выявил чувствительность к ингибитору ERK SCH772984, что указывает на ERK как потенциальную мишень для лечения рака печени (Таблица 2; Broutier et al., 2017).

Моделирование других заболеваний печени

Другие хронические заболевания печени были смоделированы органоидами печени, включая инфекцию вируса гепатита B (HBV), стеатоз и фиброз, которые являются обычными явлениями и не требуют соответствующей терапии. 3D-дифференцированные органоиды гепатоцитов, полученные из пролиферированных ЛГ или образцов печени, были использованы при вирусных инфекциях хозяина (Fu et al., 2019). NTCP, рецептор входа HBV, экспрессировался после образования органоидов гепатоцитов. После инфицирования HBV эти органоиды гепатоцитов продуцировали основной транскрипт HBV 3.5 т.п.н. и матричная кзкДНК вирусной транскрипции, что предполагает репликацию HBV в органоидах гепатоцитов (Fu et al., 2019). Сложные органоиды печени, образующиеся в результате самосборки гепатоцитов, происходящих из PSC, MSC и HUVEC, послужили еще одной моделью для исследований HBV (Nie et al., 2018). NTCP экспрессировался на еще более высоком уровне в органоидах после сокультивирования с MSC и HUVEC. Более того, этот сложный органоид печени может поддерживать долгосрочное распространение HBV, сопровождающееся печеночной дисфункцией и измененной ультраструктурой печени (Таблица 2; Nie et al., 2018).

Факторы риска многих хронических заболеваний печени влияют как на гепатоциты, так и на другие типы клеток. Сложные органоиды разработаны для моделирования сложных межклеточных взаимодействий при стеатогепатите. Человеческие PSC были дифференцированы до органоидов, содержащих гепатоцитоподобные клетки, HSC, холангиоциты и клетки Купфера. Примечательно, что после лечения свободными жирными кислотами такие органоиды печени становились стеатозными, фиброзными и инфильтрировались иммунными клетками, что было ключевой особенностью пациентов со стеатогепатитом (Ouchi et al., 2019). Органоиды печени, полученные в результате совместного культивирования клеток hepaRG и HSC, использовали для оценки фиброгенеза. Воздействие на органоиды TGFβ и тиоацетамида индуцировало экспрессию маркера фиброза и секрецию проколлагена типа I. Эти органоиды также показали ответ на токсичность, опосредованную гепатоцитами, что указывает на подходящую модель для изучения фиброза, вызванного лекарственными средствами (Leite et al., 2016; Coll et al., 2018). Другие сокультивировали органоиды печени, полученные из PSC, с МСК, и эти органоиды реагировали на этанол и демонстрировали патологические изменения, связанные с алкогольными заболеваниями печени (Таблица 2; Wang et al., 2019).

Существуют исследования, в которых гепатоциты и холангиоциты, полученные от пациентов, используются для создания органоидов при моделировании генетических заболеваний. С этой целью органоиды пациентов с дефицитом A1AT (Huch et al., 2015), ALGS (Guan et al., 2017), муковисцидозом (Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015) и болезнью Вулмана (Ouchi et al., 2019), как сообщается, резюмируют развитие этих заболеваний и служат платформой для изучения реакции на лекарства (таблица 2).

Трансляционные исследования в регенеративной медицине

Трансплантация печени — единственное эффективное средство лечения пациентов с терминальными заболеваниями печени.Однако отсутствие надлежащих доноров ограничивает применение трансплантации печени. Одна из целей применения органоидов — служить альтернативным решением для трансплантации органов печени. Было показано, что фетальные органоиды, производные от PH, прививают и повторно заселяют поврежденную печень у мышей с дефицитом фумарилацетоацетатгидролазы (FAH), модели фатального метаболического заболевания печени (Hu et al., 2018). Примечательно, что трансплантат органоида быстро рос через 1 месяц, а повторно заселенные клетки продолжали экспрессировать печеночные маркеры в течение продолжительного периода 2–3 месяцев.Между тем, клетки в трансплантатах органоидов стали более зрелыми и практически не экспрессировали фетальный маркер гепатоцитов AFP (Hu et al., 2018). Васкуляризированные зачатки печени также трансплантировали мышам с печеночной недостаточностью. Действительно, трансплантация зачатков печени, содержащих клетки печени энтодермы, полученные из PSC, стромальные клетки и эндотелиальные клетки, улучшила выживаемость мышей TK-NOG, у которых развилась печеночная недостаточность после лечения ганцикловиром (Takebe et al., 2013). В сыворотке мышей были обнаружены более высокие уровни секреции человеческого альбумина, а также улучшенная способность специфичного для человека метаболизма диклофенака (Takebe et al., 2017).

Массовое производство органоидов печени с воспроизводимостью прольет свет на их использование в клиниках. Криоконсервированные человеческие PH могут быть увеличены до 10000 раз после нескольких пассажей, которые могут быть трансплантированы и могут быть в дальнейшем разработаны для трансляционных исследований (Zhang et al., 2018). Человеческие клетки LGR5 ⁺ могли подвергаться крупномасштабной экспрессии и дифференцировке во вращающихся колбах. Через 6 недель было приобретено всего 10 ¹⁰ –10 ¹² клеток с начальным количеством 10 ⁶ клеток (Schneeberger et al., 2020). Расширение васкуляризованных зачатков печени человека, происходящих из PSC, на платформе для омнилуночных массивов культур обеспечивает способ получения> 10 ⁸ органоидов с воспроизводимыми функциями печени и терапевтическими преимуществами при лечении животных с печеночной недостаточностью (Takebe et al., 2017). Действительно, чтобы ускорить применение органоидов в клинической практике, в настоящее время в Японии создается центр по трансплантации васкуляризированных зачатков печени для исследований на крупных животных и лечения метаболических заболеваний печени у детей (Takebe et al., 2018).

Перспективы

Органоиды печени представляют собой полезный инструмент для исследований развития и регенерации печени. Благодаря включению клеток и среды обитания, органоиды печени могут также широко применяться для моделирования хронических заболеваний печени, гепатита, заболеваний желчевыводящих путей, метаболических заболеваний, сосудистых нарушений и рака печени, чтобы понять основные патологические механизмы и найти потенциальные методы лечения. Помимо моделирования заболеваний печени у взрослых, будущие усилия позволят создать органоиды гепатоцитов плода или органоиды гепатобластомы для изучения детских заболеваний печени, таких как атрезия желчных путей, ALGS, болезнь Вильсона и, в частности, гепатобластома, наиболее распространенный рак печени плода.

В частности, из-за своей специфической способности к метаболизму органоиды печени открывают большие перспективы для тестирования лекарств в клинике. Были созданы биобанки клеточных линий и органоидов печени человека, которые будут расширены с высокими ожиданиями в отношении тестирования эффективности и токсичности лекарств в клинических исследованиях и персонализированной медицине, поскольку они дают возможность отражать особенности тканей печени человека, включая основные функции и определенные неоднородности (Qiu et al., 2019). В качестве альтернативы, сконструированные органоиды рака печени могут быть в дальнейшем применены при моделировании и изучении инициации рака печени с дополнительных точек зрения для профилактической терапии.Обладая преимуществами улавливания молекулярных и структурных отклонений от введенных онкогенов, он представляет собой управляемую модель in vitro для понимания онкогенных процессов во время развития рака человека. Помимо генов-драйверов, раковые клетки микросреды играют важную роль во время прогрессирования и метастазирования рака печени. В будущем возможно и не менее важно включить другие типы клеток, такие как стромальные компоненты и иммунные клетки, для анализа клеточных взаимодействий и передачи сигналов во время канцерогенеза (Tuveson and Clevers, 2019).Более того, это была бы правдоподобная человеческая модель для изучения гормонов в зависимости от пола в развитии рака печени, который представлен с заметным преобладанием мужчин (Li et al., 2012).

Несмотря на простоту и управляемость, современные органоиды печени все же несколько отличаются от сложных структур и функций их аналогов in vivo . Позиционные клеточные контакты и региональные сигнальные трансдукции, обеспечиваемые организованной структурой печени, также ответственны за лучшее моделирование развития, регенерации и заболеваний печени.Генерация органоидов со сложной и организованной структурой является первоочередной задачей в этой области, не ограничиваясь печенью. Наряду с другими родственными методами можно создавать сложные органоиды из нескольких типов тканей. Недавний прогресс в области анализа генома, сфокусированного на экспрессии генов и клеточных взаимодействиях, значительно расширил понимание развития органов in vivo, , что, по-видимому, принесет пользу развитию сложных органоидов in vitro за счет самоорганизации (MacParland et al., 2018; Aizarani et al., 2019). В самом деле, гепатобилиарно-панкреатические органоиды были недавно разработаны (Koike et al., 2019).

Хотя самосборка дифференцированных клеток позволила развить сложные органоиды печени, такой процесс оказался спонтанным и не полностью контролируемым. Усовершенствованная инженерия, позволяющая точно контролировать питание и расположение клеток, может способствовать точности конструирования органоидов. Было показано, что создание сигнального центра с помощью генной инженерии часть клеток индуцирует сигнальные градиенты в органоидах мозга (Cederquist et al., 2019), что может помочь уточнить позиционную идентичность клеток органоидов печени. Синтетические элементы, такие как Notch и его лиганды, также могут быть разработаны и введены в органоиды для обеспечения специфического межклеточного контакта для программирования индивидуальной самосборки (Toda et al., 2018). В дополнение к этим инструментам, управляющим клеточной передачей сигналов, органоидные чипы обеспечивали точный контроль позиционных сигналов и среды ниши. Принцип конструирования органоидных чипов состоит в том, чтобы подготовить различные группы клеток с конкретными инструкциями по распределению и множественными условиями культивирования, аналогичными микроокружению in vivo , таким образом управляя формированием надлежащих структур (Park et al., 2019).

В настоящее время органоиды печени имеют размер ∼100–500 мкм, что намного меньше размера реального органа. Человеческая печень находится в сантиметровом масштабе, с кровоснабжаемой сосудистой и билиарной системами. Увеличение количества органоидов печени потребуется для нескольких применений. Изготовление каркаса, который поддерживает упорядоченную сборку сети сосудов и печеночных клеток, окружающих перфузируемую сеть микроканалов, предоставило идею масштабируемого производства тканей миллиметрового размера (Zhang et al., 2016). Перфузионная сосудистая система in vitro может способствовать проникновению кислорода и питательных веществ, когда размер органоидов печени составляет> 200 мкм. Таким образом, кислород и питание будут поступать в открытый капилляр органоидов печени и соединяться с внешними сосудами. Недавно устойчивая перфузия реваскуляризованных каркасов печени была достигнута путем включения HUVEC в децеллюляризованную свиную печень (Shaheen et al., 2020). В перспективе мы ожидаем трансплантации печени в сантиметровом масштабе с прямым хирургическим анастомозом с сосудами пациента и установлением немедленной перфузии крови (рис. 3).

Благодарности

Мы благодарны докторам Люди Чжан, Кун Чжан, Чжэнтао Чжан и Цян Хэ из нашей лаборатории, а также доктору Юнвен Чжэн из Университета Цукуба, Япония, за их критическое прочтение рукописи и ценные предложения.

Финансирование

Это исследование проводится при поддержке Академии наук Китая (XDA16020201 и XDA12050104) и Национального научно-технического проекта «Программа создания и производства ключевых новых лекарств» (2018ZX0

Конфликт интересов: Не объявлен.

Список литературы

Aizarani

N.

Saviano

A.

Sagar

2019

Атлас клеток печени человека обнаруживает гетерогенность и эпителиальные предшественники

Природа

572

199

204

Aloia

L.

McKie

M.A.

Vernaz

G.

2019

Эпигенетическое ремоделирование лицензирует взрослые холангиоциты для образования органоидов и регенерации печени

Nat. Cell Biol.

21

1321

1333

Ang

C.H.

Hsu

S.H.

Guo

F.

2019

Lgr5 ⁺ перицентральные гепатоциты самоподдерживаются при нормальной регенерации печени и чувствительны к гепатоканцерогенезу

Proc. Natl Acad. Sci. США

116

19530

19540

Artegiani

B.

van Voorthuijsen

L.

Lindeboom

R.G.H.

2019

Исследование опухолевой супрессорной функции BAP1 в органоидах печени человека, созданных с помощью CRISPR

24

927

943.e6

Асаи

А.

Aihara

E.

Watson

C.

2017

Паракринные сигналы регулируют созревание органоидов печени человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Девелопмент

144

1056

1064

Bhatia

S.N.

Андерхилл

G.H.

Зарет

К.С.

2014

Клеточная и тканевая инженерия при заболеваниях печени

Sci. Пер. Med.

6

245ср2

Bray

F.

Ferlay

J.

Soerjomataram

I.

2018

Глобальная статистика рака 2018: оценки GLOBOCAN заболеваемости и смертности от 36 раковых заболеваний в 185 странах во всем мире

CA Cancer J. Clin.

68

394

424

Брутье

Л.

Mastrogiovanni

G.

Verstegen

M.M.

2017

Культуры органоидов, полученных из первичного рака печени человека, для моделирования заболеваний и скрининга лекарственных средств

Nat. Med.

23

1424

1435

Cakir

B.

Xiang

Y.

Tanaka

Y.

2019

Разработка органоидов головного мозга человека с функциональной сосудистой системой

Nat. Методы

16

1169

1175

Лагерь

J.G.

Sekine

K.

Gerber

T.

2017

Многолинейная коммуникация регулирует развитие зачатка печени человека с плюрипотентностью

Природа

546

533

538

Cederquist

G.Y.

Asciolla

J.J.

Tchieu

J.

2019

Спецификация позиционной идентичности органоидов переднего мозга

Nat. Biotechnol.

37

436

444

Chen

F.

Jimenez

R.J.

Шарма

К.

2020

Широкое распространение пролиферации гепатоцитов в гомеостазе и регенерации печени

26

27

33.e4

Clevers

H.

2016

Моделирование развития и болезней с помощью органоидов

Ячейка

165

1586

1597

Coll

M.

Perea

L.

Boon

R.

2018

Создание звездчатых клеток печени из плюрипотентных стволовых клеток человека позволяет моделировать фиброз печени in vitro

23

101

113.e7

Crespo

M.

Vilar

E.

Tsai

S.Y.

2017

Органоиды толстой кишки, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для моделирования колоректального рака и тестирования лекарств

Nat. Med.

23

878

884

Дэн

X.

Zhang

X.

Li

W.

2018

Хроническое повреждение печени вызывает превращение эпителиальных клеток желчных путей в гепатоциты

Стволовая клетка

23

114

122.e3

Dianat

N.

Dubois-Pot-Schneider

H.

Steichen

C.

2014

Получение функциональных холангиоцитоподобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и клеток HepaRG

Гепатология

60

700

714

Du

Y.

Wang

J.

Jia

J.

2014

Человеческие гепатоциты с лекарственной метаболической функцией, индуцированной из фибробластов путем перепрограммирования клонов

14

394

403

Fu

G.B.

Хуан

Вт.J.

Zeng

M.

2019

Расширение и дифференциация клеток-предшественников печени, происходящих из гепатоцитов человека, и их использование для изучения гепатотропных патогенов

Cell Res.

29

8

22

Gao

D.

Vela

I.

Sboner

A.

2014

Органоидные культуры, полученные от пациентов с распространенным раком простаты

Ячейка

159

176

187

Гао

Ю.М.

Чжан

X.R.

Zhang

L.D.

2017

Различная экспрессия генов и эпигенетические сигнатуры в гепатоцитоподобных клетках, продуцируемых разными стратегиями от одного и того же донора

Stem Cell Rep.

9

1813

1824

Гуань

г.

Xu

D.

Garfin

P.M.

2017

Органоиды печени человека для анализа генетических заболеваний человека

JCI Insight

2

pii:

Харрисон

S.E.

Созен

Б.

Христодулу

Н.

2017

Сборка эмбриональных и внеэмбриональных стволовых клеток для имитации эмбриогенеза in vitro

Наука

356

pii: eaal1810

Homan

K.A.

Gupta

N.

Kroll

K.T.

2019

Васкуляризация и созревание органоидов почек с усилением потока in vitro

Nat. Методы

16

255

262

Hu

H.L.

Gehart

H.

Artegiani

B.

2018

Долгосрочное распространение функциональных гепатоцитов мыши и человека в виде трехмерных органоидов

Ячейка

175

1591

1606.e19

Huang

L.

Holtzinger

A.

Jagan

I.

2015

Моделирование протокового рака поджелудочной железы и скрининг лекарств с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток и опухолевых органоидов, полученных от пациентов

Nat. Med.

21

1364

1371

Хуан

P.Y.

He

Z.Y.

Ji

S.Y.

2011

Индукция функциональных гепатоцитоподобных клеток из фибробластов мыши определенными факторами

Природа

475

386

389

Хуан

P.Y.

Чжан

Л.Д.

Гао

Ю.М.

2014

Прямое перепрограммирование человеческих фибробластов в функциональные и расширяемые гепатоциты

14

370

384

Huch

M.

Dorrell

C.

Boj

S.F.

2013

Экспансия in vitro единичных стволовых клеток печени Lgr5 ⁺ , индуцированная регенерацией, управляемой Wnt

Природа

494

247

250

Huch

M.

Gehart

H.

van Boxtel

R.

2015

Долгосрочная культура геном-стабильных бипотентных стволовых клеток из печени взрослого человека

Ячейка

160

299

312

Jiao

Y.

Pawlik

T.M.

Андерс

Р.A.

2013

Секвенирование экзома выявляет частые инактивирующие мутации в BAP1, ARID1A и PBRM1 во внутрипеченочных холангиокарциномах

Nat. Genet.

45

1470

1473

Katsuda

T.

Kawamata

M.

Hagiwara

K.

2017

Конверсия окончательно коммитированных гепатоцитов в культивируемые бипотентные клетки-предшественники с регенеративной способностью

20

41

55

Knouse

K.A.

Lopez

K.E.

Bachofner

M.

2018

Для точности сегрегации хромосом в эпителии требуется архитектура ткани

Ячейка

175

200

211.e13

Koike

H.

Iwasawa

K.

Ouchi

R.

2019

Моделирование органогенеза печени, желчевыводящих путей и поджелудочной железы человека на границе передней и средней кишки

Природа

574

112

116

Kopper

O.

de Witte

C.J.

Lõhmussaar

K.

2019

Органоидная платформа для рака яичников фиксирует неоднородность внутри и между пациентами

Nat. Med.

25

838

849

Lancaster

MA

Knoblich

J.A.

2014

Органогенез в чашке: моделирование развития и заболевания с использованием органоидных технологий

Наука

345

1247125

Ли

S.H.

Hu

W.

Matulay

J.T.

2018

Развитие опухоли и лекарственный ответ на органоидных моделях рака мочевого пузыря, полученных от пациентов

Ячейка

173

515

528.e17

Лейте

S.B.

Roosens

T.

El Taghdouini

A.

2016

Новая модель органоида печени человека позволяет тестировать лекарственный фиброз печени in vitro

Биоматериалы

78

1

10

Li

D.

Li

W.

Hui

L.

2016

Гибридный гепатоцит: недавно идентифицированный игрок для регенерации при повреждениях печени

Гепатология

64

2244

2246

Li

W.

Yang

L.

He

Q.

2019

Гомеостатическое Arid1a-зависимое состояние пермиссивного хроматина лицензирует реактивность гепатоцитов на передачу сигналов YAP, связанных с повреждением печени

Стволовая клетка

25

54

68.e5

Li

Z.

Tuteja

G.

Schug

J.

2012

Foxa1 и Foxa2 необходимы для полового диморфизма при раке печени

Ячейка

148

72

83

MacParland

S.A.

Liu

J.C.

Ma

X.-З.

2018

Секвенирование одноклеточной РНК печени человека выявляет отдельные популяции внутрипеченочных макрофагов

Nat. Commun.

9

4383

Manco

R.

Clerbaux

L.-A.

Verhulst

S.

2019

Реактивные холангиоциты дифференцируются в пролиферативные гепатоциты с эффективным восстановлением ДНК у мышей с хроническим повреждением печени

J. Hepatol.

70

1180

1191

Marquardt

J.U.

Andersen

J.B.

Thorgeirsson

S.S.

2015

Функциональная и генетическая деконструкция клеточного происхождения при раке печени

Nat. Rev. Cancer

15

653

667

Миядзима

А.

Танака

М.

Itoh

T.

2014

Стволовые клетки / клетки-предшественники в развитии, гомеостазе, регенерации и перепрограммировании печени

14

561

574

Moscona

A.

Moscona

H.

1952

Диссоциация и агрегация клеток зачатков органов раннего куриного эмбриона

Дж.Анат.

86

287

301

Накамура

Т.

Сато

Т.

2018

Продвижение технологии кишечных органоидов в регенеративную медицину

Ячейка. Мол. Гастроэнтерол. Гепатол.

5

51

60

Nie

Y.Z.

Zheng

Y.W.

Miyakawa

K.

2018

Повторение взаимодействий вируса гепатита В с хозяином в органоидах печени из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

EBioMedicine

35

114

123

Nuciforo

S.

Fofana

I.

Matter

M.S.

2018

Органоидные модели рака печени человека, полученные на основе биопсии опухолевой иглы

Cell Rep.

24

1363

1376

Ogawa

M.

Ogawa

S.

Bear

C.E.

2015

Направленная дифференцировка холангиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток человека

Nat. Biotechnol.

33

853

861

Огава

S.

Surapisitchat

J.

Виртанен

C.

2013

Трехмерная культура и передача сигналов цАМФ способствуют созреванию гепатоцитов, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток человека

Девелопмент

140

3285

3296

Оучи

Р.

Того

С.

Кимура

М.

2019

Моделирование стеатогепатита у людей с помощью органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

Cell Metab.

30

374

384.e6.

Park

S.E.

Georgescu

A.

Huh

D.

2019

Органоиды на чипе

Наука

364

960

965

Peng

W.C.

Logan

C.Y.

Fish

M.

2018

Воспалительный цитокин TNFα способствует долгосрочному размножению первичных гепатоцитов в 3D-культуре

Ячейка

175

1607

1619.e15

Планас-Пас

Л.

Орсини

В.

Боултер

Л.

2016

Модуль RSPO – LGR4 / 5 – ZNRF3 / RNF43 контролирует зонирование печени и размер

Nat. Cell Biol.

18

467

479

Prior

N.

Hindley

C.J.

Rost

F.

2019

Lgr5 ⁺ стволовые клетки и клетки-предшественники располагаются на вершине гетерогенного эмбрионального пула гепатобластов

Разработка

146

pii: dev174557

Qian

X.

Song

H.

Ming

G.L.

2019

Органоиды мозга: достижения, применения и проблемы

Разработка

146

pii: dev166074

Qiu

Z.

Li

H.

Zhang

Z.

2019

Фармакогеномный ландшафт рака печени человека

Cancer Cell

36

179

193.e11

Raven

A.

Lu

W.Y.

Man

T.Y.

2017

Холангиоциты действуют как факультативные стволовые клетки печени при нарушении регенерации гепатоцитов

Природа

547

350

354

Рассел

J.O.

Лю

W.Y.

Okabe

H.

2019

Гепатоцит-специфическая делеция β-катенина при тяжелом поражении печени провоцирует дифференцировку холангиоцитов в гепатоциты

Гепатология

69

742

759

Sachs

N.

de Ligt

J.

Kopper

O.

2018

Живой биобанк органоидов рака груди фиксирует неоднородность болезни

Ячейка

172

373

386.e10

Sampaziotis

F.

de Brito

M.С.

Мадригал

П.

2015

Холангиоциты, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для моделирования заболеваний и проверки лекарственных средств

Nat. Biotechnol.

33

845

852

Sato

T.

Vries

R.G.

Snippert

H.J.

2009

Одиночные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинка in vitro без мезенхимальной ниши

Природа

459

262

265

Schneeberger

K.

Sanchez-Romero

N.

Ye

S.

2020

Крупномасштабное производство LGR5-положительных бипотенциальных стволовых клеток печени человека

Гепатология

72

257

270

Sekiya

S.

Suzuki

A.

2011

Прямое преобразование фибробластов мыши в гепатоцитоподобные клетки определенными факторами

Природа

475

390

393

Шахин

М.Ф.

Joo

D.

Ross

J.J.

2020

Устойчивая перфузия реваскуляризованной биоинженерной печени, гетеротопически трансплантированной свиньям с подавленным иммунитетом

Nat. Биомед. Англ.

4

437

445

Сиодзири

N.

Kametani

H.

Ota

N.

2018

Филогенетический анализ архитектуры печени позвоночных

J. Anat.

232

200

213

Simian

M.

Bissell

M.J.

2017

Органоиды: историческая перспектива мышления в трех измерениях

J. Cell Biol.

216

31

40

Си-Тайеб

K.

Lemaigre

F.P.

Duncan

S.A.

2010a

Органогенез и развитие печени

Dev. Ячейка

18

175

189

Си-Тайеб

К.

Ното

F.K.

Nagaoka

M.

2010b

Высокоэффективное создание гепатоцитоподобных клеток человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Гепатология

51

297

305

Song

Z.

Cai

J.

Liu

Y.

2009

Эффективное образование гепатоцитоподобных клеток из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Cell Res.

19

1233

1242

Стивенс

K.R.

Scull

M.A.

Ramanan

V.

2017

Расширение искусственно созданной ткани печени человека in situ на мышиной модели хронического заболевания печени

Sci. Пер. Med.

9

eaah5505

Sun

L.

Wang

Y.

Cen

J.

2019

Моделирование инициации рака печени с помощью органоидов, полученных из напрямую перепрограммированных гепатоцитов человека

Nat. Cell Biol.

21

1015

1026

Sun

T.

Pikiolek

M.

Orsini

V.

2020

AXIN2 ⁺ перицентральные гепатоциты имеют ограниченный вклад в гомеостаз и регенерацию печени

Cell Stem Cell

26

97

107.e6

Szkolnicka

D.

Farnworth

S.L.

Lucendo-Villarin

B.

2014

Получение функциональных гепатоцитов из плюрипотентных стволовых клеток

Curr. Protoc. Stem Cell Biol.

30

1G.5.1

1G.5.12

Takebe

T.

Sekine

K.

Enomura

M.

2013

Васкуляризованная и функциональная печень человека из трансплантата зачатка органа, полученного с помощью ИПСК

Природа

499

481

484

Takebe

T.

Sekine

K.

Kimura

M.

2017

Массивное и воспроизводимое производство зачатков печени полностью из плюрипотентных стволовых клеток человека

Cell Rep.

21

2661

2670

Takebe

T.

Wells

J.M.

Helmrath

MA

2018

Стратегии центра органоидов для ускорения клинического перевода

22

806

809

Toda

S.

Blauch

L.R.

Тан

S.K.Y.

2018

Программирование самоорганизующихся многоклеточных структур с синтетической межклеточной сигнализацией

Наука

361

156

162

Tuveson

D.

Clevers

H.

2019

Моделирование рака соответствует технологии органоидов человека

Наука

364

952

955

Velasco

S.

Kedaigle

A.J.

Simmons

S.K.

2019

Отдельные органоиды головного мозга воспроизводимо образуют клеточное разнообразие коры головного мозга человека

Природа

570

523

527

Ван

Б.

Чжао

Л.

Fish

M.

2015

Самовосстанавливающиеся диплоидные клетки Axin2 ⁺ способствуют гомеостатическому обновлению печени

Природа

524

180

185

Wang

S.

Wang

X.

Tan

Z.

2019

Расширяемые печеночные органоиды, полученные из ЭСК человека, обеспечивают терапевтическую репопуляцию печени и патофизиологическое моделирование алкогольного поражения печени

Cell Res.

29

Weiss

P.

Taylor

A.C.

1960

Восстановление полных органов из одноклеточных суспензий куриных эмбрионов на поздних стадиях дифференцировки

Proc. Natl Acad. Sci. США

46

1177

1185

van de Wetering

M.

Francies

H.E.

Фрэнсис

Дж.М.

2015

Перспективное создание биобанка живых органоидов больных колоректальным раком

Ячейка

161

933

945

Willyard

C.

2015

Восстание органоидов

Природа

523

520

522

Виммер

Р.А.

Leopoldi

A.

Aichinger

M.

2019

Органоиды кровеносных сосудов человека как модель диабетической васкулопатии

Природа

565

505

510

Workman

M.J.

Mahe

M.M.

Trisno

S.

2017

Сконструированные кишечные ткани, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, с функциональной кишечной нервной системой

Nat.Med.

23

49

59

Wu

F.

Wu

D.

Ren

Y.

2019

Получение гепатобилиарных органоидов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

J. Hepatol.

70

1145

1158

Ямамото

J.

Удоно

M.

Miura

S.

2018

Культура агрегации клеток индуцирует функциональную дифференцировку индуцированных гепатоцитоподобных клеток посредством активации передачи сигналов Hippo

Cell Rep.

25

183

198

Yimlamai

D.

Christodoulou

C.

Galli

G.G.

2014

Активность пути бегемота влияет на судьбу клеток печени

Ячейка

157

1324

1338

Yui

S.

Nakamura

T.

Sato

T.

2012

Функциональное приживление эпителия толстой кишки увеличивалось in vitro из одной взрослой стволовой клетки Lgr5 ⁺

Nat. Med.

18

618

623

Чжан

Б.

Монтгомери

М.

Чемберлен

M.D.

2016

Биоразлагаемый каркас со встроенной сосудистой сетью для инженерии «орган на чипе» и прямого хирургического анастомоза

Nat. Матер.

15

669

678

Zhang

K.

Zhang

L.

Liu

W.

2018

Размножение первичных гепатоцитов человека in vitro с эффективной способностью к репопуляции печени

Cell Stem Cell

23

806

819.e4

© Автор (ы) (2020). Опубликовано Oxford University Press от имени Journal of Molecular Cell Biology , IBCB, SIBS, CAS.

Полностью автоматизированный высокопроизводительный рабочий процесс для трехмерного химического скрининга органоидов среднего мозга человека

Существенных изменений:

1) В соответствии с общими требованиями к статье «Инструменты и ресурсы», поскольку это не полностью новая технология, а, скорее, усовершенствование HTS нейронных органоидов, новый метод следует должным образом сравнить и сравнить с существующими методами, используемыми в данной области. Рецензенты сочли, что в текущей рукописи отсутствуют прямые сравнения (что означает, что разные протоколы сравниваются бок о бок в одной лаборатории / партии).Это слабое место, особенно с учетом того, что в статье сделан сильный акцент на преимуществах этого метода над другими. Таким образом, требуется прямое сравнение этого протокола с опубликованным протоколом нервных сфероидов / органоидов. Это может включать протокол iPS-to-нейрон или, альтернативно, простой нейронный протокол (например, Sirenko et al., 2019). Последнее может быть наиболее подходящим, поскольку вопрос в том, чем эти новые органоиды лучше существующих нейрональных сфероидов, например для исследований токсичности. В идеале сравнения между протоколами должны включать измерения как функциональных данных, так и данных экспрессии генов, взятые бок о бок (не загруженные из наборов литературных данных, поскольку могут быть существенные различия от библиотеки к библиотеке и от лаборатории к лаборатории) и количественно выраженные в HTS- порядке, соответствующем.

Мы ценим потребность рецензентов в дополнительном тщательном сравнении и провели обширные дополнительные эксперименты с более чем 10 000 органоидов. Для проведения строгого и справедливого сравнения мы выдвинули ряд требований:

1) Мы хотели сравнить протоколы с использованием одних и тех же исходных клеточных линий, так как результаты дифференцировки могут широко варьироваться между разными клеточными линиями, как отмечали сами составители обзора.

2) Чтобы учесть опасения, поднятые рецензентами относительно лабораторной вариабельности, мы хотели автоматизировать протокол сравнения на нашей платформе внутри компании, чтобы различия в вариабельности были присущи протоколу, а не проистекали из других факторов, включая ручные. обработка, оттаивание, пассирование и т. д.

3) В идеале, протокол сравнения не использует матригель, поскольку известно, что он вызывает высокую вариабельность (Hughes et al., 2010, Proteomics; Jabaji et al., 2014, PLoS One; Tong et al., 2018). Мы чувствовали, что было бы проще сравнить другие протоколы без ECM с нашим для наиболее консервативного сравнения.

Эти требования исключают использование кортикальных сфероидов, используемых Сиренко и др., Поскольку они использовали коммерчески доступные сфероиды, которые можно купить только в уже агрегированном состоянии / как готовый к использованию продукт.Компания, продающая эти сфероиды, не делает свои протоколы общедоступными, что не позволяет нам воспроизвести их работу в домашних условиях и использовать те же исходные клеточные линии для справедливого сравнения. С технической точки зрения сфероиды Сиренко и др. не обладают какой-либо заметной самоорганизацией, а представляют собой просто 2D-дифференцированные, повторно агрегированные нейронные культуры. Наши AMO значительно сложнее этого, демонстрируя отличную самоорганизованную архитектуру, которая приближает их к органоидным, а не сфероидным протоколам.

Таким образом, мы решили сравнить наши AMO с другим широко используемым и принятым протоколом органоидов из лаборатории Pasca (Sloan et al., 2018), который имеет несколько преимуществ:

1) Мы можем использовать ту же исходную клеточную линию, которая дала начало нашим AMO.

2) Органоиды Pasca не требуют добавления матригеля для правильного созревания.

3) Нам удалось полностью автоматизировать всю генерацию и анализ органоидов Паска в доме, используя ту же платформу, что и наши органоиды.

В соответствии с запросами рецензентов, мы затем сравнили этот установленный протокол с нашим протоколом бок о бок с точки зрения:

— экспрессия гена (рисунок 3 — приложение к рисунку 1)

— функциональность / вариативность:

> общая морфология и размер (рис. 7A, B, E и G)

> жизнеспособность отдельных органоидов («CellTiterGlo3D», рис. 7F и H)

> клеточная архитектура / структура и количественная экспрессия маркеров с помощью анализа изображений с высоким содержанием (Рисунок 7C, D, I и J, а также Рисунок 7 — приложение к рисунку 1)

> электрическая активность (Рисунок 8H, I и J)

— пригодность для испытаний на токсичность (рисунок 8 — приложение к рисунку 1).

Мы можем количественно продемонстрировать, что широко принятый протокол по органоидам на основе hPSC, разработанный Sloan et al. имеет значительно большую степень изменчивости, чем наш протокол AMO, даже когда он полностью стандартизирован и автоматизирован.

Мы хотели бы отметить, что адаптация протокола Sloan et al. в свободно масштабируемый рабочий процесс является значительным достижением, о котором, насколько нам известно, в литературе не сообщалось.

2) Поскольку скрининг лекарственных средств является заявленной целью разработки такой автоматизированной платформы анализа на основе органоидов, было бы более информативным, если бы авторы включили данные для демонстрации% популяций зрелых клеток и более функциональную проверку на основе механизмов с конкретными фармакологическими исследованиями. инструменты (например,грамм. антагонисты дофаминового рецептора), в различных удобных для HTS считываниях, в дополнение к сигналу флуоресценции кальция и MEA, например, секреция дофамина (поскольку это органоиды среднего мозга с дофаминергическими нейронами) и жизнеспособность клеток (например, CellTiterGlo3D). Нейронные клетки-предшественники / предшественники, нейроны и астроциты в AMO очень хорошо охарактеризованы, как насчет олигодендроцитов? Можно ли предпринять шаги для обеспечения репрезентативного сочетания типов клеток ЦНС в AMOs?

Мы согласны с рецензентами, что наша рукопись выигрывает от дополнительной функциональной характеристики наших AMO.Мы провели ряд дополнительных анализов, чтобы укрепить этот аспект нашей рукописи.

— Мы количественно определили количество зрелых клеток в наших органоидах для двух отдельных клеточных линий и трех независимо размороженных и культивированных партий каждой (рис. 8D).

— Мы продемонстрировали функциональные характеристики идентичности среднего мозга с использованием фармакологических агонистов и антагонистов для различных субпопуляций нейронов (рис. 8E-K).

— Мы демонстрируем высвобождение дофамина в супернатант с помощью ELISA с уровнями, которые соответствуют или превышают уровни, обнаруженные в спинномозговой жидкости in vivo (рис. 8C).

— Мы количественно оценили жизнеспособность клеток с помощью CellTiterGlo3D, продемонстрировав превосходную гомогенность по сравнению с органоидами, полученными из hIPSC (рис. 7F).

— Мы отдельно количественно оценили выживаемость дофаминергических нейронов и других нервных популяций после специфической фармакологической абляции дофаминергических клеток. Это ясно подчеркивает актуальность и пригодность нашей модельной системы для настройки экранов на болезнь Паркинсона, например (см. Рис. 8A и B).

Олигодендроциты возникают очень поздно в нервном развитии, и другие протоколы демонстрируют присутствие олигодендроцитов после 100 дней дифференцировки или более (например, см. Marton et al., 2019). Эти длительные временные рамки не очень привлекательны для разработки стратегий скрининга. Хотя наши smNPC способны эффективно генерировать олигодендроциты, как было опубликовано нашими коллегами (Reinhardt et al., 2013; Ehrlich et al., 2017), этого не произойдет в течение 30-50-дневного периода созревания, рекомендованного для скрининга от Наша сторона. Вместо этого мы отдаем предпочтение стратегиям, которые эктопически добавляют известное количество олигодендроцитов к нашим AMO и таким образом достигают состояния скрининга намного раньше (см. Наш раздел «Обсуждение») в системе с сингенными, но эктопически добавленными олигодендроцитами.

3) Более глубокая оценка вариабельности от линии к линии и от партии к партии, с более подробным анализом контроля качества и оценкой клеток при большем увеличении и лучшей количественной оценке, была бы полезной для демонстрации однородности и качества структур. Авторы должны прокомментировать% лунок, продуцирующих органоиды, которые проходят QC, а затем% автоматизированного переноса AMO из планшета для очистки / визуализации, и какой% лунок в планшете для визуализации не проходят QC из-за высокого сигнала флуоресценции.Авторы должны лучше охарактеризовать воспроизводимость между AMO из независимых клеточных линий. На рис. 2 — дополнение к рисунку 2 протокол описывается в независимой строке, но просто характеризуется морфологией. Поскольку хорошо известно, что разные линии плюрипотентных стволовых клеток, особенно hiPSC, по своей сути обладают разными способностями к дифференцировке, количественная оценка маркеров нервных и нейрональных клеток также должна быть предоставлена, чтобы показать, что органоиды из независимых линий можно напрямую сравнивать с точки зрения клеточных ответов.Анализ qPCR, аналогичный тому, что представлен на рисунке 3, должен выполняться для AMO из независимой линии.

Благодарим рецензентов и добавили запрашиваемую информацию:

— Данные контроля качества с подробной информацией об эффективности различных этапов рабочего процесса теперь можно найти на Рисунке 1D. Наш рабочий процесс претерпел множество итераций по оптимизации, и в целом мы достигли уровня удержания образца 90% от начала (засева органоидов) до конца (вывод данных из визуализации высокого содержания).Мы довольно строго сообщали о неэффективности, поскольку 4,2% образцов, потерянных при переносе органоидов из культуры в планшеты для визуализации, можно практически исключить, просто повторив протокол автоматического переноса, чтобы поймать небольшое количество оставшихся «отставших».

— Мы добавили количественный анализ высокого содержания для второй независимой клеточной линии и другого протокола, полученного из hiPSC, и сравнили их бок о бок на Рисунке 7. Данные подтверждают наше заявление о более высокой гомогенности и воспроизводимости даже между клеточными линиями.

— Мы также количественно сравнили различные клеточные линии и протоколы с помощью кПЦР и представили данные рядом (см. Рисунок 3 — приложение к рисунку 1).

Мы не уверены, что означает запрос «оценка клеток при большем увеличении». Мы демонстрируем разрешение отдельных клеток в настройках с высоким содержанием (рис. 6B и C) и, как правило, предоставляем данные флуоресценции, которые обеспечивают как обзорные изображения целых органоидов (что редко делается в литературе по органоидам из-за большого разброса структур), так и предоставляем увеличенные изображения, которые облегчают понимание клеточных идентичностей и подробные морфологии на уровне одной клетки, где это возможно (Рисунок 2B, D, F, G; Рисунок 2 — дополнение к рисунку 1; Рисунок 2 — приложение к рисунку 2B-G; Рисунок 2 — дополнение рисунка 3E-I; Рисунок 7— приложение к рисунку 1B, F и I и рисунок 8 — приложение к рисунку 1A, видео 1).Если мы сможем предоставить дополнительные изображения с высоким разрешением, укажите, и мы их предоставим.

4) В тексте должно быть подробное объяснение и признание ограничений нового протокола. Другие сообщали об использовании нейральных клеток-предшественников для производства нейральных сфероидов с кортикальными нейронами и астроцитами, спонтанными синхронными кальциевыми волнами и потенциалами действия, а также с хорошей воспроизводимостью, позволяющей создавать HTS. Таким образом, описанная здесь стратегия использования NPC для получения более воспроизводимых нейронных агрегатов не является полностью новой, хотя, используя smNPC и описанный протокол дифференцировки, авторы получают агрегаты, которые включают зрелые нейроны (например.грамм. дофамин, другие?), нейральные предшественники и астроциты (по данным ИГХ и КПЦР) с организованным распределением клеток в различных концентрических зонах и с клеточной ориентацией, включая радиальное расположение, что, таким образом, классифицирует их как органоиды, хотя и не такие сложные, как те. ранее описано, начиная с ИПСК. Авторы называют это агрегаты автоматическими органоидами среднего мозга (AMO). Авторы должны признать жертву сложностью, которая обычно достигается в нейронных органоидах, происходящих из iPSC, в результате диссоциации и отсутствия микроглии.Исходя из smNPCs, можно предположить, что AMOs почти полностью происходят из нервной эктодермы. Это исключает некоторые важные типы нервных клеток, такие как микроглия, которые происходят из мезодермальных / гематопоэтических клонов. Могут ли авторы прокомментировать, является ли это недостатком их протокола, если представлены не все типы клеток ЦНС? Или прокомментируйте, можно ли включить модифицированный автоматизированный протокол, начинающийся с плюрипотентных стволовых клеток и включающий в себя этап управления кроветворными клетками-предшественниками?

По запросу рецензентов мы внесли поправки в текст в нескольких местах, включая обсуждение, чтобы признать ранее опубликованные протоколы на основе NPC, а также относительную жертву сложности по сравнению с опубликованными органоидами ИПСК.Мы добавили целый раздел, описывающий влияние воспроизводимости на фенотипический скрининг в области 3D-культуры, и указали на отсутствие олигодендроцитов и микроглии в нашем протоколе.

Хотя другие протоколы органоидов теоретически допускают образование микроглии «in situ» (Ormel et al., 2018), на практике они встречаются нечасто (Marton et al., 2019; Velasco et al., 2019). Поскольку спонтанная генерация микроглии в органоидах настолько редка, вариабельна и неэффективна, другие лаборатории прибегают к эктопическому добавлению их к своим органоидам (Abud et al., 2017; Lin et al., 2018; Muffat et al., 2019). Этот подход абсолютно возможен для нас, но исследование эктопического добавления других типов клеток может выходить за рамки этой рукописи. Мы добавили краткое обсуждение использования нашей воспроизводимой платформы в качестве клеточного каркаса для систематического добавления других представляющих интерес типов клеток, включая микроглию и олигодендроциты.

Мы не уверены, что подразумевается под «… в результате диссоциации». Наш протокол не включает никаких шагов диссоциации, кроме создания суспензий отдельных клеток для начальной агрегации органоидов, которые являются общими для всех протоколов органоидов.

5) Спонтанные синхронизированные кальциевые волны были обнаружены в AMO, показывающих функциональное соединение нейронов. Функциональная сетевая активность также отображается в AMO с использованием измерений MEA. По крайней мере, пара публикаций показала спонтанную синхронизированную кальциевую волну и сигнал MEA от нервных сфероидов и органоидов. (например, Cleber et al., 2019 и Sirenko et al., 2019), поэтому мы не считаем, что это первый раз, когда колебательные волны наблюдались в нервных агрегатах, как утверждают авторы.Как правило, авторы должны отозвать требования о приоритете («это было сделано впервые»).

Мы благодарим рецензентов за указание на это. Претензия удалена.

[Примечание редакции: до принятия были предложены дальнейшие исправления, как описано ниже.]

Рецензенты также определили ряд областей, которые требуют доработки. В частности, очень важно, чтобы авторы смягчили некоторые из формулировок, описанных в их оценке протокола, по сравнению с другими протоколами и подходами в этой области.

Мы смягчили язык некоторых отрывков в тексте, убрав утверждения о более высокой оценке нашего протокола по сравнению с другими протоколами.

Рецензенты не полностью убеждены в том, что протокол дифференцировки органоидов лаборатории Паска был успешно принят и расширен, и это может повлиять на сравнения.

См. Подробное обсуждение ниже.

В рукописи также есть множество мелких ошибок, требующих внимания.

Ниже приводится краткий список важных изменений. Обращение к ним значительно улучшит рукопись и сделает ее более подходящей для рассмотрения в качестве опубликованной рукописи.

1) На рис. 4A-D, F-G необходимо включить единицы измерения по оси y.

Спасибо — мы добавили недостающие ярлыки.

2) Рисунок 8E-J, как показано, невозможно различить какие-либо эффекты от обработок на любой из панелей; возможно, следует отобразить преобразование Фурье, чтобы лучше проиллюстрировать эффекты обработок, и отображаемые в настоящее время кривые следует перенести на дополнительный рисунок.

Мы согласны с рецензентами в том, что изменения в трассировках MEA было трудно различить. Мы последовали рекомендациям рецензентов и изменили графики на БПФ, что, к сожалению, также привело к таким же нечетким цифрам. Таким образом, мы решили представить данные MEA таким образом, чтобы визуально лучше разделять различные варианты лечения агонистами / антагонистами и в то же время лучше отображать временные отношения между различными частями экспериментальной процедуры.После регистрации базовой активности электрического поля для данного органоида мы сначала добавили агонист, а после регистрации сигнала под влиянием агониста — ингибитор к тому же образцу в той же чашке. В течение этого времени мы продолжали регистрировать напряженность электрического поля и сравнивали полученные изменения после кратковременного уравновешивания. Представляя эти графики на одной и той же оси координат во временной последовательности слева направо, мы надеемся прояснить, что эти измерения происходят из одного и того же образца и связаны во времени, устраняя при этом перекрывающиеся предыдущие графики.Наша цель со следами на рис. 8E-J состоит в том, чтобы передать прямое впечатление о необработанной активности электрического поля органоидов в качестве репрезентативного графика; для количественного сравнения кривых MEA мы включили все доступные повторные измерения MEA и нанесли абсолютные изменения напряженности электрического поля на рис. 8K.

Следует отметить, что напряженность электрического поля зависит от расстояния до записывающего электрода. Органоиды, по сути, представляют собой свободно и случайно прикрепленные сферы на нижележащем массиве фиксированных 2D-электродов, и их случайное расположение вносит сильное изменение сигнала электрического поля от образца к образцу только в силу характера их размещения.Следовательно, для достижения количественных и сопоставимых измерений нам пришлось нормализовать любые потенциальные изменения активности к исходной базовой записи того же образца в том же месте чашки MEA, проявляя максимальную осторожность, чтобы не сместить органоид при введении жидкости.

Мы также измерили эти органоиды после короткого периода прикрепления, так что они сохранили свою сферическую геометрию. Этот курс экспериментов является нашим лучшим приближением к достижению этой цели. Мы надеемся, что наш новый рисунок 8E-J теперь лучше отражает это.

3) На рисунке 8K должно быть указано, какое измерение MEA использовалось в качестве «суммарного абсолютного сигнала», и должно быть хорошо включать столбцы ошибок и индикацию статистической значимости между условиями.

Спасибо, что указали на это. Точный характер количественной оценки рисунка 8K действительно не был ясен. На рисунке показана сумма абсолютных колебаний потенциала электрического поля за 15 секунд времени. Обоснование этого состоит в том, что это позволит обнаруживать как изменения частоты, так и амплитуды колебательного сигнала.Таким образом, даже небольшие изменения должны четко проявляться при суммировании сигнала. На исходном рисунке 8K изображен только один репрезентативный набор данных, изображенный на рисунке 8E-J; однако новая версия теперь включает все n для всех условий, включая планки ошибок. С этой целью мы отредактировали текст и легенду рисунка.

Мы также внесли поправки в соответствующий раздел «Материалы и методы», чтобы прояснить детали экспериментов MEA и их анализа.

4) Рисунок 2 — в приложении 2 к рисунку необходимо включить единицы концентрации в графики зависимости от дозы: log (концентрация) в мкг / мл?

Спасибо, что указали на это.Мы добавили соответствующие ярлыки.

5) Приятно иметь, но не обязательно. На Рисунке 2 — приложение к рисунку 2: Для HTS для токсических эффектов важно установить надежные, быстрые и поддающиеся скринингу показания; CellTiterGlo является одним из них, и было бы также интересно посмотреть, вызывает ли G418 уменьшение размера сфероидов, измеренное с помощью светлопольной микроскопии?

Размеры, безусловно, интересный, простой и надежный вариант для считывания в настройках HTS.Мы добавили измерения размеров органоидов для экспериментов по реакции на дозу на рис. 8 — приложение к рисунку 1, как предлагается. Процедура очистки делает органоиды почти полностью прозрачными, так что они больше не могут быть обнаружены на изображениях в светлом поле. Однако мы обычно измеряем размер органоидов с помощью флуоресцентной микроскопии как часть нашего стандартного процесса оптического анализа для последующей нормализации сигнала. Здесь мы получили эти данные.

В этой конкретной экспериментальной установке, с нашей биологической системой и в проверенных временных рамках и концентрациях, мы не увидели каких-либо заметных изменений в размере органоидов.

6) Анализ и сравнение между другими, обычно используемыми протоколами по органоидам мозга стали более ясными, чем раньше. Однако Sloan et al. протокольная часть вызывает ряд серьезных вопросов. Насколько эффективен был этот протокол?

Автоматизированная генерация органоидов на основе ИПСК оказалась высокоэффективной; мы потеряли один органоид из 12 96-луночных планшетов за 30 дней культивирования (см. также раздел «Результаты»).

Из 126 кортикальных органоидов, происходящих из ИПСК, подвергнутых высокому иммуноокрашиванию, 120 правильно дифференцировались по нервной судьбе, подтвержденной экспрессией MAP2 (см. Фиг. 7J).Один органоид был потерян во время обработки, 5 не прошли контроль качества изображения, и окрашивание MAP2 не могло быть подтверждено.

На уровне РНК мы подтвердили экспрессию ряда релевантных ранних и поздних нейральных и глиальных маркеров с течением времени, включая в общей сложности 168 органоидов, расположенных в разных временных точках и партиях (подробности см. На рисунке 3 — приложение к рисунку 1). Следует отметить, что эти органоиды не подвергались никакому отбору перед анализом и представляют собой беспристрастную выборку.

Более подробный анализ экспрессии белков подтвердил ожидаемые корковые маркеры, включая

FoxG1, Ctip2, TBR1 и TBR2, Satb2 на 30, 40 и 50 день после агрегации (рисунок 7 — приложение к рисунку 2).На этом рисунке показан один репрезентативный образец, выбранный из n = 3 иммуноокрашенных образцов, все из которых были случайным образом взяты из 96-луночных планшетов. Все образцы показали экспрессию маркеров, как показано на рисунке 7 — приложение к рисунку 2.

Мы показываем очень ранние временные точки для корковых органоидов на основе ИПСК. Когда мы сравниваем наши структуры (здесь 40-й день) с некоторыми из самых ранних изображений, доступных из оригинальной публикации Pasca et al., 2015, наши морфологии напоминают те, что показаны на 52-й день (см. Рисунок 7 — приложение к рисунку 2B).

Говорят, что он был выполнен с модификациями. Пытались ли авторы использовать исходный немодифицированный протокол в качестве положительного контроля? Насколько я понимаю, некоторые различия включают:

a) Фидер для выращивания клеток для начала бесплатный, а не на MEF (это так?)

b) Сбор с использованием аккутазы вместо диспазы, что приводит к диссоциации iPS-клеток вместо образования структур, подобных эмбриоидным телам (это большая разница!).

c) Не использовать среду нейронной индукции, описанную в этом документе

Как пишет Sloan et al., производительность протокола представлена ​​как доказательство утверждения авторов о том, что их протокол является улучшением по сравнению с другими протоколами, это действительно должно быть тщательно указано. Лучше всего было бы четко обозначить внесенные изменения по сравнению с исходным протоколом, например, на дополнительном рисунке. Авторы также должны смягчить свои выводы и указать, что изменения могли повлиять на другой протокол.

Все это очень важные моменты, и мы благодарим рецензентов за то, что они предложили более внимательный и дифференцированный подход к нашим сравнениям.

Мы последовали рекомендациям рецензентов и включили новый дополнительный рисунок (рисунок 7 — рисунок в приложении 1), в котором подробно описаны изменения в исходных публикациях лаборатории Паска. Мы внесли поправки в текст, чтобы детализировать эти изменения и их потенциальное влияние на полученные органоиды. Мы смягчили формулировки, относящиеся к прямым сравнениям, и четко заявили, что изменения могут повлиять на биологический результат (см. Изменения в разделах «Результаты» и «Обсуждение»).

Мы бы предпочли сравнить наш автоматизированный протокол с оригиналом; однако автоматизировать исходный протокол без поправок не представлялось возможным. Например, как правильно отметили обозреватели, мы использовали одноклеточные растворы из культуры без фидера вместо колоний из фидерных культур. Мы признаем, что использование суспензии отдельных клеток, а не колоний, изменяет биологию исходных условий и может повлиять на результат. Однако в автоматизированных системах с переваренными колониями сложно обращаться, поскольку они имеют тенденцию быстро оседать под действием силы тяжести, и невозможно с высокой степенью уверенности поместить одну колонию в лунку.С одноклеточными растворами мы могли легко гомогенизировать начальные условия для каждой лунки. Мы считали важным производить оба вида органоидов беспристрастным, автоматизированным и механически стандартизированным способом, чтобы четко отнести все различия к биологическим различиям, а не вручную. Мы внесли эти изменения не в пользу нашего протокола, а чтобы протестировать его самым строгим из доступных нам способов и в формате, который позволяет приложениям с высокой пропускной способностью, что является центральным принципом этой рукописи.

Одно отличие заключается в стадии отделения культур — в Sloan et al. протокол, это на стадии iPS-клетки, тогда как в текущей рукописи шаг отсоединения / диссоциации находится на стадии нейрального предшественника. Это, вероятно, улучшит однородность структур / культур, но также может привести к более простым структурам, чем выполнение всего протокола от начала до конца с одной и той же чашкой с iPS-клетками. Было бы целесообразно указать на это в статье и признать ограничение начала с гомогенизированной культуры нейральных предшественников.В целом это не умалит данных авторов, но сделает их выводы более точными.

Спасибо за отзыв, мы реализовали этот пункт в разделе «Обсуждение».

7) Уточнение партий и сравнение с независимой линией клеток помогает сделать вывод о том, что это хорошо воспроизводимый протокол. Но у нас есть опасения по поводу того, что эффективность будет указана в процентах без каких-либо ошибок. Авторы не объясняют, откуда берутся эти числа и что они означают, и как они были рассчитаны.Если существует набор воспроизводимых данных для их подтверждения, он должен быть предоставлен, в противном случае цифры должны быть четко описаны как эксперимент с одной репрезентативной выборкой, а не как общая оценка.

Приносим извинения за то, что не включили эту информацию ранее. Теперь он является частью как основного текста, так и рисунка 1. В интересах прозрачности данных мы также перечисляем полные номера исходных данных, приводящие к этим выводам, в качестве нового Дополнительного файла 1.

Несколько комментариев к количеству n в этой таблице данных:

a) Мы регулярно проверяем эффективность посева (удержание образца во время посева, смены среды и фиксации), поэтому на этом этапе у нас имеется много данных.

b) Эффективность этапа переноса из планшета для культивирования с v-образным дном в планшет для визуализации с плоским дном обычно не критична для нас, поскольку мы просто дважды запускаем протокол переноса, чтобы получить 100% эффективность переноса и уловить всех отставших. Здесь мы один раз пропустили несколько планшетов через этап переноса с явной целью генерации «однократных» номеров переноса, поэтому здесь меньше n. С тех пор мы выполнили дополнительные переводы и обновили соответствующие номера в рукописи.

У нас самые низкие n для визуализации, так как большая часть наших образцов используется для множества других анализов, например анализ клеточного титра glo, РНК, кальция или МЭА.

8) Ссылки на рисунки и панели в тексте должны указываться по порядку (например, первая ссылка в разделе результатов в настоящее время относится к рисунку 7, что является странным способом начать). Пожалуйста, убедитесь, что это соблюдается на протяжении всего документа, так как здесь много данных, и в противном случае они могут ввести в заблуждение.

Мы изменили текст по запросу.

9) «Известно, что добавление эктопических матриц, в том числе Matrigel, вносит большую вариативность». Авторы предполагают, что Матригель привносит изменчивость, но не приводят никаких данных, подтверждающих это. Также не был полностью устранен матригель, так как iPS-клетки должны начинаться с матрицы. Поскольку Матригель является широко используемым ингредиентом, заявления о его эффектах необходимо тщательно контролировать, а не полагаться на цитаты из литературы. Авторы должны смягчить утверждения о вариабельности, вызванной матригелем, для этой статьи и просто сказать, что они провели сравнение с другим протоколом, который не использует матригель, аналогичным тому, который они разработали.

Мы внесли поправки в текст по запросу.

10) В легенде к рисунку 4K:

«k) Быстрое преобразование Фурье (БПФ) на основе данных, показанных в k.» Я считаю, что это основано на данных, показанных в j, а не k.

Спасибо за внимательное рассмотрение — мы соответствующим образом изменили текст.

Органоиды: новый метод моделирования заболеваний