Таблица органоид строение функция 9 класс: Таблица по биологии «Строение и функции органоидов клетки» скачать

Содержание

Таблица по биологии 9 класс Эндоплазматическая сеть Рибосомы Комплекс Гольджи

Мембрана Строение мембраны у всех клеток одинаковое. Толщина составляет 8 нм. Основу мембраны составляет двойной слой молекул липидов, в котором расположены многочисленные молекулы белков Клеточная мембрана, окружая каждую клетку, отделает её от внешней среды. Наружная мембрана защищает внутреннее содержимое клетки от повреждений, поддерживает постоянную форму клетки, обеспечивает связь клеток между собой, избирательно пропускает внутрь клетки необходимые вещества и выводит из клетки продукты обмена
Ядро Чаще всего имеет шарообразную или овальную форму. От цитоплазмы ядро отделено оболочкой, состоящей из двух мембран (внутренняя – гладкая, наружная имеет многочисленные выступы). Внутреннее содержимое ядра получило название «кариоплазма» или «ядерный сок». В ядерном соке расположены хроматин и ядрышки. Хроматин представляет собой нити ДНК. Ядрышко представляет собой плотное округлое тело, взвешенное в ядерном соке. Обычно в ядре клетки их бывает от 1 до 7 Важнейшая часть клетки содержит ДНК – вещество наследственности, в котором зашифрованы все свойства клетки и поэтому необходимо для осуществления двух важнейших функций. Во-первых, ядро регулирует все процессы белкового синтеза, обмена веществ и энергии, идущие в клетке. Если клетка начинает делиться, то клетки хроматина плотно накручиваются на спиралью на особые белки, как нити на катушку. Такие плотные образования называются хромосомами. Функция ядрышек – синтез РНК и белков, из которых формируются особые органоиды – рибосомы.
ЭПС Вся цитоплазма пронизана каналами. Их стенки образованы мембраной. Эти каналы могут ветвиться, соединяться друг с другом; возникает ЭПС. Каналы ЭПС занимают до 50% внутреннего объёма клетки. Часть мембран сети покрыта рибосомами; она называется шероховатой, другая часть ЭПС, не покрытая рибосомами – гладкая Основная функция шероховатой ЭПС – синтез белков в рибосоме. Гладкая часть ЭПС выполняет транспортную функцию
Рибосомы Небольшие шарообразные органоиды, диаметр – 10-30 нм. Образованы рибонуклеиновыми кислотами и белками. Каждая рибосома состоит из нескольких частей. Рибосомы формируются в ядрышках ядра, далее входят в цитоплазму. В цитоплазме чаще всего расположена на шероховатой ЭПС. Реже они свободно взвешены в цитоплазме клетки В цитоплазме они выполняют синтез белка
Комплекс Гольджи Значительная часть синтезируемых клеткой веществ по каналам ЭПС поступает в особые полости, отграниченные от цитоплазмы мембраной. Эти полости, уложенные стопками, «цистернами», получили название комплекса, или аппарата Гольджи. Чаще всего расположены вблизи от ядра Вещества, необходимые клетке, «упаковываются» в мембранные пузырьки, отпочковываются и разносятся по цитоплазме. Здесь также накапливаются вещества, которые клетка синтезирует для нужд всего организма
Лизосомы
Маленькие пузырьки диаметром 0,5 – 1,0 мкм, содержащие в себе ферменты, способные разрушить пищевые вещества. Они окружены мембраной, способной выдержать воздействие ферментов. Формируются в комплексе Гольджи
Переваривание веществ, саморазрушение отмерших клеток
Митохондрии Энергетические органоиды клеток. Форма различна, диаметр около 1 мкм, длина до 7-10 мкм. Покрыты двумя мембранами: наружная – гладкая, внутренняя имеет многочисленные складки Синтез АТФ
Пластиды Органоиды растительных клеток имеют двухмембранное строение. Лейкопласты бесцветны, находятся в неосвещаемых частях растений. На свету образуется зелёный (цвет) пигмент хлорофилл. Хлоропласты – зелёные пластиды, по форме напоминают линзу; под наружной гладкой мембраной есть складчатая внутренняя мембрана. Между складками мембран находятся стопки связанных с ней пузырьков. Каждая стопка называется граной. Хромопласты – пигменты красного, оранжевого, фиолетового, жёлтого цветов Синтез крахмала, образование в ней зелёные вещества; фотосинтез. Обуславливают яркую краску
Клеточный центр Находится в цитоплазме всех клеток вблизи от ядра. У животных и низших растений клеточный центр образован двумя центриолями. Микротрубочки расположены по окружности центриолей по три, а ещё две микротрубочки лежат по оси каждой из двух центриолей. Центриоли располагаются в цитоплазме под прямым углом друг к другу. Очень велика роль клеточного центра при делении клеток, когда центриоли расходятся по полюсам делящейся клетки и образуют веретено деления. У высших растений клеточный центр устроен по-другому и центриолей не имеет Играет важную роль в формировании внутреннего скелета клетки – цитоскелета. Из области клеточного центра расходятся многочисленные микротрубочки, поддерживающие форму клетки и играющие роль своеобразных рельсов для движения органоидов по цитоплазме
Органоиды движения
Инфузория туфелька, эвглена зелёная, амёбы – некоторые из них двигаются при помощи особых органоидов движения – ресничек и жгутиков. Жгутики имеют относительно большую длину, например, у сперматозоидов млекопитающих она достигает 100 мкм. Реснички гораздо короче – около 10-15 мкм. Внутреннее строение ресничек и жгутиков одинаково: они образованы такими же микротрубочками, как центриоли клеточного центра. Движение жгутиков и ресничек вызвано скольжением микротрубочек друг относительно друга, в результате чего эти органоиды изгибаются. В основании каждой реснички или жгутика лежит базальное тельце. На работу жгутиков и ресничек расходуется энергия АТФ
Многие клетки способны к движению

Разработка урока по биологии в 10 классе по теме «Органоиды цитоплазмы, их строение и функции»

Разработка урока по биологии в 10 классе

по теме «Органоиды цитоплазмы, их строение и функции»

Цель: создать общее представление о строении эукариотической клетки на основе раскрытия мембранного принципа; сформировать знания о строении и функциях главных частей клетки; объяснить особенности строения мембранных и немембранных компонентов клетки.

Задачи:

  • знать и уметь сравнивать основные компоненты клеток;

  • давать определения ключевым понятиям;

  • уметь распознавать органоиды на рисунках и электронно-микроскопических фотографиях;

  • устанавливать взаимосвязи строения и функций органоидов.

Тип: урок изучения и первичного закрепления новых знаний.

Оборудование: компьютер, интерактивная доска.

Средства обучения: Основной учебник: Захаров В.Б., Мамонтов С.Г., Сонин Н.И. Общая биология. 10 кл. Профильный уровень. Ч.1/Под ред. проф. В.Б.Захарова. – М.: Дрофа, 2007; Дополнительный учебник: Общая биология: Учеб. для 10-11 кл. с углубл. изучением биологии в шк. /Л. В. Высоцкая, СМ. Глаголев, Г.М. Дымшиц и др.; под ред. В.К. Шумного и др. — М.: Просвещение, 2006; Интерактивный курс для школьников «Биология. 10-11 класс». ЗАО «Образование -Медиа», 2008. Изд-во «Просвещение», 2008.

Ход урока

  1. Актуализация знаний учащихся о прокариотических организмах.

  1. Фронтальная работа с классом. Беседа об особенностях строения клеток прокариот по вопросам и рисунку на доске (презентация «Органоиды цитоплазмы, их строение и функции» Слайд 3).

  1. Объяснение нового материала.

Рассказ учителя о строении и функциях различных структур эукариотических клеток, начиная с внешнего строения (с использованием авторской презентации «Органоиды цитоплазмы, их строение и функции» ).

  1. Самостоятельная работа учащихся с учебниками:

  • Захаров В.Б., Мамонтов С.Г., Сонин Н.И. Общая биология. 10 кл. Профильный уровень. Ч.1/Под ред. проф. В.Б.Захарова. – М.: Дрофа, 2007 – п. 5.2.

  • Общая биология: Учеб. для 10-11 кл. с углубл. изучением биологии в шк. /Л. В. Высоцкая, СМ. Глаголев, Г.М. Дымшиц и др.; под ред. В.К. Шумного и др. — М.: Просвещение, 2006 — § 9.

Задание: заполните в тетрадях таблицу «Органоиды клетки и их функции»

Органоиды клетки и их функции

Цитоплазма и органоиды

  1. Закрепление изученного материала.

  1. Проверка правильности заполнения таблицы «Органоиды клетки и их функции».

  2. Вопросы для повторения и задания (основной учебник стр. )

  3. Работа с терминологией (основной учебник, стр. 156).

  4. Решить «магический квадрат» (Приложение 1).

  1. Рефлексия. Домашнее задание: п. 5.2. Подготовиться к проверочной работе по теме «Органоиды клетки и их функции».

Особенности строения органоида

Функции

Конспект урока биологии в 9 классе «Строение клетки» | План-конспект урока по биологии (9 класс):

     Кользяева Ольга Александровна

      МБОУ Одинцовская   средняя общеобразовательная      школа №  1»

УМК Сухоруковой Л.Н.

Предмет: биология

Класс: 9

Тема «Строение клетки»

Тип урока: комбинированный

Цель урока: 

Образовательная

  • изучение особенностей клеток растений, животных выявление  общих структур в их строении.
  • углубить знания о  клеточном  строении организмов;
  • закрепить знания о строении прокариотических и эукариотических клеток

Развивающая:

  • Способствовать формированию умений сопоставлять факты и делать выводы, развитию логического мышления,
  • продолжить выработку навыков самостоятельно работы, содействовать развитию мыслительных операций: анализ, синтез, сравнение, обобщение;

Воспитательная:

  • Совершенствовать системное представление об организации живых существ;
  • Развивать самостоятельность в учебной деятельности;
  • Воспитывать чувства само и взаимоуважение в условиях работы в парах.

Задачи:

  • обеспечить в ходе урока усвоение, повторение,  закрепление  знаний о клеточном строении организмов;
  • создать условия для отработки навыков анализа ,обобщения, сравнения.
  • актуализировать знания о клеточном строении;
  • расширить общий и биологический  кругозор учащихся

Материально- техническое обеспечение урока

Компьютер, проектор, компьютерная презентация,   карты урока

Методы обучения и технологии :

  • Словесные (объяснение, эвристическая беседа, работа с книгой),
  • Практические: выполнение учебные задач,  работа с тесты, заполнение таблицы.
  • Наглядные: таблицы, презентация, опорный конспект

Педагогические технологии, используемые на уроке

-ИКТ;

-игровые технологии;

-развивающее обучение.

ХОД УРОКА:

1 Психологический настрой на урок. 1 мин

Приветствие. Проверка готовности учащихся к уроку.

Положительный настрой

2.Проверка домашнего задания   (15 мин).

Задание 1. «Выбери правильное» Посмотрите на рисунок и давайте вспомним, чем отличается растительная и животная клетки. Выполните тест

1. Клетки растений содержат:

А)вакуоли;

Б)целлюлозную оболочку;

В)мембрану

2. В грибных клетках содержится:

А)хитин;

Б)ядерное вещество;

В)целлюлозная оболочка

3. Клетки бактериий:

А)ядерное вещество;

Б)хитин

В)вакуоли

1. «Подумайте и дайте ответ»  

1.Как было открыто клеточное строение клетки?

2.В чем сходство и различие одноклеточных и многоклеточных организмов?

3.Какова роль клеточной теории для развития биологии, понимания научной картины мира?

4.Перечислите основные положения клеточной теории

5. Каким образом клеточная теория доказывает единство происхождения жизни на Земле?

6. Как понять утверждение: «Любая болезнь» -это поражение каких-либо клеток?»

3.Изучение нового материала.

— Ребята, мы вспомнили как происходило развития знания о клетке.

Каких тайн клеточного строения организмов, мы еще не коснулись на уроках?

Почему важно изучать строение клеток?

Итак, какая тема нашего урока сегодня?:

Правильно «Строение клетки»

(запись темы урока в тетрадь)

-Ребята, а какая цель нашего урока?

(Дети формулируют цель)

-Сейчас нельзя  с полной уверенностью сказать, когда и как возникла жизнь на Земле, какими были первые живые организмы.

Но в настоящее время на нашей планете сосуществуют представители разных царств живой природы: растений, грибов, животных.  

И в строении клеток этих организмов имеется  много общего, как вы думаете, почему?

Уч-ся  (Имеют единое происхождение).

Уч-ль -Но они абсолютно сходны, или нет?  (нет)

-Правильно! В их строении есть и различия.

—  А чем мы можем объяснить различия в строении клеток эукариотов?

Учащеся. (разная среда, условия существования, питание)

Уч-ль. В процессе эволюции, в связи с неодинаковыми условиями существования в строении клеток различных царств живой природы возникло множество отличий.

-Объясните, почему вы так считаете?

(-Правильно это клетки растений и животных)

Групповая работа.

Я предлагаю радзелиться на 6 групп – по рядам.

Используя информацию  рабочих карт, необходимо  изучить материал своей группы и далее защитить его.

В рабочей карте приведена информация по различным органоидам клетки.

Ученики делают сообщения о строении и функциях органоидов клетки с демонстрацией презентации.

Результаты работы оформляются в виде таблицы.

Органоид

Строение

Функции

 

А сейчас ребята, я предлагая вам немного отдохнуть и посмотреть слайд-шоу  «Волшебная река» — минутка релаксации

Закрепление материала:

Уч-ль: Мы выяснили некоторые различия в строении клеток различных царств животных и растений, а вот  в чем их сходство?

Для того, чтобы более полно ответить на этот вопрос вы должны вспомнить положения клеточной теории. (Беседа с учащимися, в ходе которой выявляются черты сходства клеток)

Сходство:

1.Общий план строения

2. Сходный химический состав

3. Сходство процессов обмена веществ

4.Одинаковое кодирование наследственной информации,  с помощью нуклеотидов.

5. Сходство процессов деления клеток.

Материал  урока поможет вам справиться с заданиями развернутого типа  из контрольно- материалов ЕГЭ. Давайте ответим на некоторые из них.

А) Почему Эвглену зеленую ботаники относят к растениям, а зоологи к животным. Укажите не менее 3 причин. (слайд )

Б) Прочитайте текст, найдите предложения, в которых допущены ошибки и исправьте их. (В рабочих картах дети маркером выделяют номера предложений,  в которых допущены ошибки, следующий человек подчеркивает слова, которые неверны, а третий человек исправляет их)

Уч-ль: Сегодня  у двух учащихся вашего класса было задание  оценить вашу и свою работу на уроке, им мы и предоставим слово.  Учащиеся оглашают выставленные ими отметки, аргументируют их.

-Поднимите руки, кто согласен с выставленными отметками?  Кто не согласен?   Объясните, почему и оцените себя сами.

Я думаю, что наш урок прошел плодотворно, и вы расширили свои знания о клетке.

Рефлексия        

Продолжите предложение

Меня удивило…    

    У меня получилось…

            Было трудно…      

                     Было интересно…

5.Домашнее задание

1.уровень электронный ресурс, ответить на вопросы

2. уровень составить  кроссворд по теме «Клеточное строение организмов»

Приложение 1

Рабочая карта

Текст 1 группы

 Клеточная мембрана

Подавляющее большинство клеток имеет оформленное ядро, обладающее особой оболочкой.

Такие клетки называются эукариотическими.

Любые клетки ограничены от окружающей среды биологической мембранной, называемой клеточной мембраной. Строение этой мембраны одинаково у всех клеток. В основе её строения лежит двойной слой фосфолипидов (жироподобные вещества), в этом слое лежат молекулы белков, выполняющих различные функции.

Растительные клетки поверх клеточной мембраны покрыты клеточной стенкой, состоящей из целлюлозы, а у животных клеток белки наружной мембраны могут содержать цепочки углеводов.

Текст группы 2

Клеточное ядро – один из важнейших компонентов эукариотической клетки. Оно находится в центральной части клетки и ограничено от внутреннего содержимого клетки – цитоплазмы – оболочкой, состоящей из двух мембран. В этой оболочке есть поры, которые обеспечивают перенос веществ из ядра в цитоплазму и в обратном направлении.

В ядре находится ядерный сок, а также хроматин и ядрышки

Хроматин – важнейший компонент ядра, состоящий из ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) и белков. Хроматин виден только в неделящейся клетке. Но когда наступает пора делиться, нити хроматина укладываются в плотные, хорошо видимые под микроскопом структуры – хромосомы.

Ядрышки —  плотные шарообразные тельца, состоящие из рибонуклеиновой кислоты (РНК) и белков. Они образуются в определенных местах хроматина. Ядрышки необходимы для формирования важных клеточных органоидов, на которых синтезируются белки,- рибосом.

Текст группы 3

 Цитоплазма

Внутренняя среда клетки, — цитоплазма.

На электронных микрофотографиях видно, что цитоплазма пронизана огромным количеством белковых нитей и трубочек, образующих цитоскелет.

Цитоскелет поддерживает форму клетки, обеспечивает перемещение органоидов в цитоплазме клетки, активный внутриклеточный транспорт, а также участвует в расхождении нитей хроматина к полюсам клетки при делении.

Текст группы 4  

Эндоплазматическая сеть (ЭПС) – это целая сеть канальцев и уплощенных цистерн, пронизывающих цитоплазму клетки.

СМ. слайд

Эта сеть построена из мембран.

В клетке два вида ЭПС – гладкая и шероховатая (гранулированная). На шероховатой расположено много рибосом, которые синтезируют белки.

В канальцах гладкой ЭПС – синтезируются углеводы и липиды.

Кроме функции синтеза, ЭПС выполняет функцию транспорта веществ по клетке.

Рибосомы – мелкие органоиды, различимые только с помощью электр. Микроскопа.

Они образованы двумя субъединицами, каждая из которых состоит из РНК и белков.

Функция рибосом – синтез белка.

Обе субъединицы рибосом синтезируются в ядре, а затем выходят в цитоплазму

Каждая состоит из двух

Текст группы  5

Аппарат Гольджи — сеть полостей и цистерн. АГ находится рядом с ядром.

В нем вещества, синтезируемые клеткой, накапливаются и упаковываются в мембранные пузыркьи, которые могут выделиться из клетки.

Так, например, из клеток желез внутренней секреции выводятся  гормоны.

АГ – своеобразный цех по сортировке, упаковке и транспортировке различных веществ.

Лизосомы – небольшие пузырьки, ограниченные мембраной. Они содержат ферменты, которые расщепляют БЖУ. Пищевые частица попадают в клетку и образуют пищеварительные вакуоли, с которыми сливаются лизосомы.  Переварившиеся вещества попадают в цитоплазму, а непереварившиеся —  выбрасываются из клетки. Формируются лизосомы в аппарате Гольджи.

Текст группы 6

Митохондрии  — небольшие органоиды с двумя мембранами – наружной гладкой и внутренней складчатой.

Складки и выступы внутренней мембраны называют кристами.

В митохондриях идет окисление органических веществ при участии кислорода., а высвобождающаяся энергия запасается  в виде АТФ. Процесс синтеза АТФ требует участия многих ферментов, которые располагаются на кристах.

Митохондрии содержат собственную ДНК и способны размножаться.

Пластиды – органоиды растительных клеток. Наиболее  распространены  — хлоропласты.

Хлоропласты и митохондрии, образованы двумя мембранами, причем внутренняявдается в полость хлоропласта, формируя плоские мешочки – тилакоиды.

Хлоропласты, как и митохондрии, содержат ДНК и могут размножаться.

 

Разработка урока «Одномембранные органоиды клетки». 9-й класс

Цель урока: создать условия для усвоения знаний об особенностях строения и функционировании основных компонентов клетки.

Обучающие задачи: Выявить согласованность работы одномембранных органоидов клетки;

Развивающие задачи: Продолжить формирование умения анализировать и обобщать полученные знания, выделять главное в изученном материале;

Воспитывающие задачи: Формировать познавательный интерес к предмету, развивать коммуникативность учащихся через совместную работу.

Методы:

1. Словесно-наглядный;
2. Проблемный;
3. Частично поисковый.

Формы проведения урока: урок презентация

Оборудование: компьютер, мультимедийный проектор, таблицы по общей биологии, карточки для проверки усвоения задания.

Использованная литература: Поурочные разработки по биологии для 10 класса, журналы “Биология в школе” и “Магариф”.

Ход урока

I. Организационный момент.

1. Приветствие.

2. Актуализация знаний.

Учитель. На прошлом уроке мы говорили о строении клеточной мембраны и транспорте через неё.

– Рассмотрите слайд. Какая часть клетки изображена на слайде?

(рисунок 1)

– Каковы функции клеточной мембраны?

– Посмотрите на экран и выполните следующее задание. Какие процессы изображены на рисунках А, Б, В.

а) диффузия; б) осмос; в) активный транспорт; г) эндоцитоз; д) экзоцитоз

А

Б

В

(рисунок 2)

Демонстрируется слайд “Сказочные цифры”

– Объясните, что означает эти цифры?

а) 1665; б) 1838; в) 1858; г) 1831.

II. Мотивация.

На прошлом уроке мы рассмотрели строение клеточной мембраны и особенности транспорта через клеточную мембрану. Сегодня мы должны выяснить, что происходит с поступившими в клетку веществами и синтезируемыми в самой клетке. Какие органоиды клетки принимают участие в судьбе этих веществ? Этими органоидами являются одномембранные клеточные структуры.

III.

Сообщение темы, целей и задач урока.

Тема нашего урока “Одномембранные структуры клетки и их взаимодействие” (записываем).

IV. Изучение нового материала.

Учитель. Органоиды (органеллы)– постоянные клеточные структуры, обеспечивающие выполнение клеткой специфических функций.

К одномембранным органоидам клетки относят:

– Эндоплазматическую сеть.

– Комплекс Гольджи.

– Лизосомы.

Для удобства в работе мы используем таблицу.

Строение и функции клеточных органоидов.

Органоиды клетки

Строение

Функции

Дополнит. сведения

ЭПС

     

Комплекс Гольджи

     

Лизосомы

     

Изучение строения ЭПС. Рассказ учителя об особенностях строения и функциях ЭПС и заполнения таблицы.

Гранулярная ЭПС                           Гладкая ЭПС

(рисунок 3)

Эндоплазматическая сеть – это сложная система мембран, образующих трубочки, канальцы, цистерны, пузырьки. Открыта в 1945 году английским ученым К. Портером. Её можно наблюдать только при помощи электронного микроскопа. Различают два вида ЭПС: гладкую и гранулярную.

Гладкая ЭПС имеет вид трубочек, стенки которых представляют собой мембраны, сходные по своей структуре с плазматической мембраной. В ней осуществляется синтез липидов и углеводов. Преобладает в клетках сальных желез, печени, в клетках богатых запасными питательными веществами, например, в семенах растений.

На мембранах каналов и полостей шероховатой ЭПС расположено множество рибосом, основная функция которых синтез белков. Особенно много шероховатой ЭПС в клетках желез и нервных клетках.

– А теперь давайте проверим, что записано у вас в таблице?

– Какое строение имеет ЭПС?

– Какие функции она выполняет? (Учащиеся заполняют таблицу)

Следующий органоид комплекс Гольджи

(рисунок 4)  

Аппарат Гольджи присутствует во всех эукариотических клетках. Он был открыт итальянским ученым К. Гольджи в 1898 г. в нервных клетках. Структурно – функциональная единица аппарата Гольджи – диктиосома.

Комплекс Гольджи представляет собой стопку мембранных мешочков (цистерн) и связанную с ними систему пузырьков.

Он особенно развит в клетках, вырабатывающих белковый секрет, а также в нейронах и овоцитах.

Функции комплекса Гольджи:

  1. транспорт и химическая модификация веществ.
  2. синтез полисахаридов.
  3. участие в построении клеточной стенки.
  4. секреторная.
  5. образование лизосом.

Проверяем запись в тетради и записываем новые слова в словарь.

Изучение строения Лизосомы

(рисунок 5)

Лизосомы открыты в 1955 году с помощью электронного микроскопа. Они представляют собой сферические мембранные мешочки, наполненные пищеварительными ферментами. В одной лизосоме могут находиться 30-50 различных ферментов. Особенно лизосом много в животных клетках.

Лизосомы расщепляют питательные вещества, переваривают попавшие в клетку бактерии, выделяют ферменты, удаляют путем переваривания ненужные части клеток.

У растений растворяются органеллы при образовании пробковой ткани, сосудов древесины.

(Учащиеся заполняют таблицу)

V. Повторение изученного.

1. Ученикам рекомендуется сравнить таблицу, сделать необходимые дополнения.

2. Работа с учебником Сонина Н.И., Захарова В.Б., Мамонтова С.Г.

VI. Закрепление.

А теперь обобщим полученные знания (ученики выполняют задания в виде теста).

1. Органоиды, расположенные на гранулярной ЭПС и участвующие в биосинтезе белка,– это:

А. Лизосомы; б. Митохондрии; в. Рибосомы; г. Хлоропласты.

2. Органоид ограниченный от цитоплазмы одной мембраной, содержащий множество ферментов:

А. Митохондрии; б. Аппарат гольджи; в.рибосома; г. Лизосома.

3.Лизосомы в клетки образуются в:

А. Эндоплазматической сети; б. Митохондриях;  В. Клеточном центре; г.комплексе гольджи.

4. Функции шероховатой ЭПС:

А. Транспорт веществ и синтез белков; Б. Переваривание органических веществ; В. Участие в межклеточных контактах; Г. Образование рибосом.

5.ЭПС имеется в цитоплазме:

А. Всех клеток; б. Только животных клеток; в.только растительных клеток; г.всех клеток, за исключением клеток прокариот.

VII. Задание на дом.

  1. Прочитать стр. 35-37 учебника.

  2. Подготовить ответы на вопросы №2, 3,4.

  3. Составить тест по теме “Функции органоидов клетки”.

VIII. Подведение итогов.

Презентация

$4. Органоиды клетки | 8 класс Учебник «Биология» «Атамура»

Органоиды это части клетки, имеющие постоянное строение и выполняющие определенные функции. Содержатся они в цитоплаз­ме (см. рис. 8). Функции клетки выполняются только с помощью ор­ганоидов.

Эндоплазматическая сеть (ЭПС) — образование, состоящее из тес­но прилегающих друг к другу канальцев и цистерн, отделенных от Цитоплазмы мембраной. Канальцы и цистерны ЭПС обеспечивают взаимосвязь между различными органоидами клетки. Различают гладкую и шероховатую ЭПС. На шероховатой ЭПС находятся рибо­сомы. Там образуются белки. Гладкая ЭПС участвует в синтезе жи­ров и полисахаридов.

Рибосомы — мелкие, зерновидные органоиды, свободно располага­ющиеся в цитоплазме или на шероховатой ЭПС. Они осуществляют синтез белка.

Митохондрии присутствуют во всех живых клетках. По форме они могут быть округлыми, овальными, удлиненными, палочковид­ными или нитевидными. В клетке бывают десятки, тысячи митохон­дрий. Каждая из них состоит из двух мембран. Наружная мембрана гладкая, внутренняя имеет выросты.

Митохондрии высвобождают энергию, которая образуется при сжигании (окислении) питательных вешеств при их взаимодействии с кислородом в процессе клеточного дыхания. Кроме того, в них синте- зиРУются некоторые жирные кислоты.

Лиэосомы — мелкие теля округлой и овальной формы, окруженные

мембраной. Содержат до 40 ферментов, иод воздействием которых пе­ревариваются различные вещества или уничтожаются бактерии.

Центрио.ш — два маленьких тела цилиндрической формы, распо­ложенные вблизи ядра. При делении клетки в начальной фазе две центриоли расходятся друг от друга к двум полюсам клетки. Между ними появляются веретеновидные нити. Принимая участие в деле­нии клетки, центриоли отвечают за равномерное распределение хро­мосом по дочерним клеткам.

Комплекс (аппарат) Голъджи — сложная сеть «канальцев*, распо­ложенных вокруг ядра. Обеспечивает транспорт веществ в клетке, вывод из клетки конечных продуктов.

Различия растительной и животной клетки:

1.   В животной клетке имеются центриоли. В клетке высших рас­тений центриолей не бывает.

2.   В животной клетке не бывает пластид, потому что животные питаются готовыми органическими веществами. Растения же в про­цессе фотосинтеза с помощью пластид образуют органические веще­ства из углекислого газа и воды за счет энергии света.

3.  Плотная целлюлозная оболочка бывает только у растений. Она препятствует изменению формы растительных клеток. Оболочка жи­вотной клетки — только подвижная и упругая мембрана. Из гладкой она может вдруг стать шершавой или пузырчатой. У мышечных кле­ток изменяется длина.

4.  У растений бывают крупные вакуоли, а у животных они встре­чаются только у простейших организмов, например, сократительная вакуоль.

К основным жизненным свойствам клетки, как и организма в целом, относятся обмен веществ, раздражимость (возбудимость), рост, развитие и размножение. Жизненные свойства обеспечивают посто­янство состава внутренней среды.

К внутренней среде организма относятся кровь, лимфа и меж­клеточная (тканевая) жидкость. Из этой среды через мембрану в клет­ку всасываются все необходимые вещества, и через нее же удаляются продукты распада.

Обмен веществ — непрерывный контакт и обмен между клеткой и окружающей средой через дыхание, питание, выделение. В клетку поступают питательные вещества и кислород, а из клетки в окружа­ющую среду выводятся продукты распада.

Наш орпшизм может «строить» собственные вещества из компонен­тов белков, жиров и углеводов, поглощенных с пищей. То есть превра­щать их в наши собственные белки, жиры и углеводы. Из этого строи­тельного материала образуются новые клетки и органы. Процесс «стро­ительства * собственных органических веществ называется Гшоси/ипемм.

Кислород окисляет белки, жиры и углеводы. При этом выделяет­ся энергия, которая используется для обеспечения жизнедеятельное-

ти клетки. Соединение кислорода с веществами клетки называется клеточным дыханием.

Разд/хгжимость (возбудимость) — возбуждение клетки под влия­нием разных раздражителей окружающей среды. Раздражителями являются холод, жара, механические воздействия, например при­косновение, химические вещества и др.

Размножение обеспечивается делением клетки. Вначале делит­ся ядро, затем цитоплазма. Перед каждым делением удваивается число хромосом. Примерно поровну делятся и все клеточные орга­ноиды. Размножение — основа сохранения жизни, т. к. позволяет осуществлять обновление клеток, которые постепенно изнашива­ются и гибнут.

Рост клеток осуществляется за счет процессов биосинтеза.

Каждая из образовавшихся при делении дочерних клеток рас­тет и достигает размеров материнской клетки. Продолжительность жизни клеток различна. Так, клетки кожи обновляются через 1-2 недели. А нервные и мышечные клетки живут долго, иногда более 100 лет.

Клетки и окружающие их вещества в организме объединяются в ткани, органы, системы органов и целостный организм.

1. Назовите органоиды клетки.

2.   Какую функцию выполняют лизосомы и рибосомы?

3.   В чем заключается назначение эндоплазматической сети (ЭПС)?

2.   Каковы отличия растительной и животной клеток?

3.   Назовите основные жизненные свойства клетки.

3.   Расскажите об основных жизненных свойствах клетки.

границ | Органоиды среднего мозга: новый инструмент для исследования болезни Паркинсона

Введение

Развитие методологии органоидов сегодня считается крупным технологическим прорывом в исследованиях стволовых клеток. Он позволил добиться огромных успехов в применении индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) и даже был отмечен как «Метод года» в 2017 году («Lancaster et al., 2013»).

Церебральные органоиды

Первые эксперименты по самоорганизации ЦПС в трехмерных условиях были выполнены более 10 лет назад.Тем не менее, именно открытия Ланкастера и др. Фактически открыли новую эру в исследованиях человеческого мозга, представив в 2013 году «церебральные органоиды» (Lancaster et al., 2013; Kelava and Lancaster, 2016b). Подтверждая выводы первоначальных экспериментов с трехмерной культурой, Lancaster et al. воспользовались внутренней самоорганизацией PSCs и получили нейроэпителий в трехмерных условиях (Kadoshima et al., 2013). Чтобы избежать ограничений на идентичность конкретных областей мозга, они не добавляли паттернирующие факторы роста.Вместо этого после агрегации клетки были встроены в Matrigel, суррогатный матрикс, который ранее был введен для генерации органоидов кишечника (Sato et al., 2009). Это служит структурной поддержкой, вызывая стимул правильной полярности, способствующий сложному разрастанию крупных апикобазальных нейроэпителиальных зачатков (Lancaster and Knoblich, 2014a; Wang X. et al., 2018). Эти зачатки расширяются в ходе культивирования и приобретают не только различные особенности мозга, но и заполненные жидкостью просветы, напоминающие желудочки мозга.Для улучшения снабжения питательными веществами и кислородного обмена плавающие церебральные органоиды культивировали во вращающихся биореакторах или на орбитальных шейкерах, что позволяло органоидам расти до 4 мм в диаметре (Lancaster and Knoblich, 2014a; Kelava and Lancaster, 2016b). Эти оптимизированные условия роста в сочетании с присущими ПСХ способностями к самоорганизации привели к формированию множества областей мозга в пределах одного органоида, включая задний мозг, средний мозг, передний мозг и даже ткани сетчатки (Lancaster et al., 2013; Ланкастер и Кноблих, 2014b; Реннер и др., 2017; Wang X. et al., 2018). Примечательно, что подробное исследование событий формирования паттернов в ходе развития и дифференциации церебральных органоидов показывает, что пространственные и временные паттерны напоминают те, которые определяют развитие человеческого мозга (Renner et al., 2017).

Модификация церебральных органоидов

Классический протокол церебральных органоидов, описывающий генерацию общих органоидов всего мозга, был изменен многими исследовательскими группами в последние годы и привел к образованию более регионально специфичных трехмерных клеточных культур (Lancaster and Knoblich, 2014a; Lancaster et al. al., 2016). В исследовании Paşca et al., 2015) пути передачи сигналов как костного морфогенетического белка (BMP), так и трансформирующего фактора роста β (TGF-β) ингибировались небольшими молекулами дорсоморфина (DM) и SB-431542 (SB) для достижения эффективная нейронная индукция. Это двойное ингибирование SMAD в сочетании с фактором роста фибробластов (FGF) 2, эпидермальным фактором роста (EGF) и отсутствием внеклеточного каркаса привело к появлению нейральных предшественников, экспрессирующих дорсальные маркеры теленцефалии, парный белок 6 (PAX6) и вилкохед-бокс. белок G1 (FOXG1).Дальнейшей дифференцировке нейронов способствовала замена FGF2 и EGF нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF) и нейротрофическим фактором 3 (NT3), что привело к формированию различных нейронных и глиальных идентичностей дорсальной коры внутри каждого сфероида, включая поверхностный и глубокий кортикальный слой. слой нейронов (Paşca et al., 2015; Kelava, Lancaster, 2016b). При этом Paşca et al. описал метод, который привел к созданию трехмерной культуры, специфичной для подобласти мозга; культура, которая показала меньшее количество эктодермальных производных по сравнению с исходным протоколом церебральных органоидов.Аналогичный подход к использованию двойного ингибирования SMAD был опубликован Qian et al. (2016). Поддерживая основы протокола LANCASTER , такие как встраивание и перемешивание матригеля, они продемонстрировали, что можно культивировать органоиды в миниатюрных биореакторах, напечатанных на 3D-принтере, что делает возможным более осуществимое и масштабное производство нейронных 3D-культур (Qian et al. ., 2016). Еще одним преимуществом многолуночного прядильного устройства собственной разработки является возможность параллельного сравнения множества различных условий культивирования.Paşca et al. направлен на снижение тканевой неоднородности органоидов головного мозга и, следовательно, предварительно сформировал рисунок эмбриоидных тел (EB) для получения определенных областей мозга. Ингибирование передачи сигналов TGF-β с помощью SB и активация передачи сигналов Wnt ингибитором гликоген-синтазы киназы 3 (GSK-3β) CHIR-99021 (CHIR) в течение первых 2 недель культивирования привело к образованию органоидов переднего мозга в виде определенных, многослойных зоны-предшественники, включая гомологи желудочковой зоны (VZ), внутренней и внешней субвентрикулярной зон (SVZ).Более того, типы нейронов всех шести корковых слоев могут быть обнаружены внутри этих органоидов, специфичных для переднего мозга. С помощью мини-биореакторов Qian et al. (2016) также разработали метод получения органоидов, специфичных для гипоталамуса. После двойного ингибирования SMAD с помощью SB и LDN-1 (LDN) они сформировали паттерн нейроэктодермальных клеток по гипоталамической судьбе, активируя передачу сигналов Wnt и sonic hedgehog (SHH), применяя WNT3a, SHH и пурморфамин (PMA) в культуре. Через 40 дней эти органоиды содержали популяции клеток, экспрессирующие маркеры, специфичные для клонов нейронов гипоталамуса (Qian et al., 2016).

Моделирование заболеваний с помощью органоидов головного мозга

Схожие характеристики на молекулярной, клеточной и физиологической основе органоидов человеческого мозга и реального человеческого мозга оправдывают их все более широкое применение в изучении биологии мозга и моделировании неврологических расстройств (Wang Y. et al., 2018). Уже Ланкастер и др. (2013) открыли потенциал церебральных органоидов в качестве модели для обнаружения нарушений нервного развития и получили органоиды, несущие мутацию, вызывающую микроцефалию.Было также высказано предположение, что инфекция, вызванная вирусом Зика (ZIKV), вызывала микроцефалию у новорожденных. В 2016 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила ZIKV и связанные с ним осложнения чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения (Qian et al., 2016; Dutta et al., 2017). Эта активизация глобального исследовательского сообщества привела к ускоренной разработке вакцин и методов лечения, при этом многие исследования были основаны на церебральных органоидах, которые смогли воспроизвести особенности коркового развития человека in vitro (Cugola et al., 2016; Dang et al., 2016; Garcez et al., 2016; Шахтер и алмаз, 2016; Новаковски и др., 2016; Qian et al., 2016; Wells et al., 2016; Сюй и др., 2016). Результаты этих исследований показывают, что инфекция ZIKV влияет на нейрогенез, разрушает корковые слои органоидов и аналогичным образом вызывает микроцефалический дефицит коркового развития (Dutta et al., 2017). Из-за специфического эмбрионального формирования человеческого мозга только специфическая для человека трехмерная модель клеточной культуры, демонстрирующая расширенные организационные особенности, могла привести к описанным открытиям.Ни мышиная, ни 2D-культура клеток не смогли выявить потенциальную связь между ZIKV и микроцефалией (Qian et al., 2016; Dutta et al., 2017; Setia and Muotri, 2019). В дополнение к этому успешному применению органоиды мозга оказались полезными для изучения других неврологических расстройств. Недавно были установлены так называемые «тумроиды» из глиобластомы человека, наиболее распространенного и агрессивного рака мозга (Dutta et al., 2017). Гипоксические градиенты и гетерогенность стволовых клеток, обнаруженные в этих опухолях, не могут быть воссозданы с помощью обычных методов культивирования.Таким образом, органоиды глиобластомы открывают уникальные возможности для их применения в диагностике и лечении рака мозга (Hubert et al., 2016; Dutta et al., 2017; Bian et al., 2018). Кроме того, сообщалось о двух различных подходах с использованием трехмерных систем культивирования нервных клеток человека для повторения фенотипов болезни Альцгеймера (БА) in vitro (Choi et al., 2014; Raja et al., 2016). Эти 3D-культуры обеспечивают среду, которая способствует образованию бляшек амилоида-β (Aβ) и нейрофибриллярных клубков (NFT), патологических событий, которые ранее не могли быть последовательно связаны с использованием культивированных 2D-нейронов человека (Choi et al., 2014, 2016; D’Avanzo et al., 2015; Raja et al., 2016). Это подтверждает, что развивающаяся методология органоидов мозга способствует разработке более точных клеточных моделей человека, которые могут поддержать исследования нейродегенеративных расстройств. Технология более сложных систем трехмерных культур клеток не только устраняет разрыв между традиционными экспериментами 2D in vitro и in vivo на животных моделях , но также обращается к процессам, которые невозможно воспроизвести с помощью этих традиционных моделей.Например, неэффективность лекарственного средства или непредвиденные побочные эффекты при трансляции в организм человека могут быть результатом различного метаболизма людей и животных. Таким образом, человеческие органоиды дают возможность раскрыть сложные биологические процессы, такие как развитие человеческого мозга, где обычные модели не оказались успешными. Создание органоидов головного мозга, полученных из стволовых клеток, позволяет моделировать ключевые аспекты развития человеческого мозга in vitro , используя огромный потенциал дифференцировки ПСХ и их способность к самоорганизации с определенной пространственной ориентацией.В целом, эта новая технология обеспечивает физиологически релевантный контекст, такой как взаимодействие между клетками глии и нейронами в пространственно организованной микросреде, что имеет большой потенциал для ее применения при моделировании неврологических заболеваний.

Обсуждение

Отсутствие передовых экспериментальных моделей in vitro , которые действительно повторяют сложность человеческого мозга, является одним из основных ограничений в нейробиологии и в области моделирования заболеваний. Текущие подходы in vitro к моделированию физиологии и патологии человеческих нейронов в первую очередь основаны на культурах нейронов, выращенных в 2D-условиях.Хотя полученные однослойные культуры клеток оказались полезными в качестве инструмента для изучения механизмов заболевания и выявления потенциальных нейрозащитных соединений (Nguyen et al., 2011; Cooper et al., 2012; Sánchez-Danés et al., 2012; Reinhardt et al. , 2013b; Ryan et al., 2013; Qing et al., 2017; Spathis et al., 2017), эти условия культивирования не моделируют некоторые характеристики, относящиеся к человеческому мозгу. Такие особенности, как межклеточные взаимодействия и цитоархитектура, могут иметь решающее значение для прогнозирования эффективности in vitro протестированных соединений в клинических испытаниях (Abe-Fukasawa et al., 2018). В этом случае технология органоидов человеческого мозга in vitro и является ценным инструментом, она дает возможность понять сложную биологию в физиологически релевантном контексте, а также способствует развитию трансляционных приложений (Fatehullah et al., 2016). Первоначально подходы к изучению органоидов мозга основывались на эндогенной способности PSCs самоорганизовываться в трехмерных условиях, по сути следуя ранним этапам развития мозга (Arlotta, 2018). Эти подходы привели к появлению эктодермальных производных со сложной цитоархитектурой, превышающей то, что возможно с производными 2D PSC (Kadoshima et al., 2013; Ланкастер и др., 2013; Paşca et al., 2015). Поскольку нейроны образуют функциональные сети с другими нейронами и ненейронными клетками мозга, важно расширить исследования нейродегенеративных заболеваний, используя 3D-модели, которые способны воспроизводить эти взаимодействия. В целом, трехмерные условия способны более точно имитировать среду in vivo и и, следовательно, обеспечивают ускоренную дифференцировку нейронов и формирование сети in vitro (Haycock, 2011; D’Avanzo et al., 2015). Более того, было показано, что нейроны, развившиеся в трехмерной среде, экспрессируют более представительный диапазон нейрональных генов, чем нейроны, полученные в двумерных условиях (Seidel et al., 2012). Монослой нейронов не может обеспечить столько связей между отдельными клетками, как трехмерная нейрональная культура, а меньшие синаптические расстояния в трехмерной нейронной сети способствуют передаче функционального сигнала (Cullen et al., 2012; D’Avanzo et al., 2015). Создавая третье измерение, нейроны развиваются в среде, которая ближе к природе и действительно соответствует физиологии человека, в результате чего приобретают морфологические и физиологические свойства, аналогичные свойствам in vivo .

В частности, создание и характеристика новой системы трехмерных культур клеток среднего мозга обеспечивает расширенную модель in vitro для изучения процессов развития нервной системы, а также нейродегенеративных заболеваний среднего мозга человека. Чтобы достичь образования этих высокоспециализированных структур, отчетливо напоминающих средний мозг человека, органоиды были получены из нейральных стволовых клеток (NSC) с региональной структурой. Эта конкретная исходная популяция, уже преданная судьбе вентральной нервной трубки среднего мозга с дальнейшим применением пространственно-временной специфической передачи сигналов в условиях 3D-культивирования, привела к созданию новых человеческих органоидов, специфичных для среднего мозга (hMO).Здесь мы сравниваем и оцениваем недавно разработанные методы hMO, которые создают мощный инструмент для моделирования заболеваний in vitro и неврологических расстройств, специфичных для человека.

Получение органоидов, специфичных для среднего мозга

Для получения in vitro производного среднего мозга человека требуются дополнительные стимулы определенных путей наряду с 3D-культурой PSC. На сегодняшний день различными исследовательскими группами было опубликовано шесть подходов к 3D-культуре клеток для получения ткани, напоминающей особенности среднего мозга человека (Tieng et al., 2014; Jo et al., 2016; Qian et al., 2016; Monzel et al., 2017; Ким и др., 2019; Smits et al., 2019b). Все эти подходы можно отнести к предыдущим экспериментам на 2D клеточных культурах, в которых изучались фундаментальные принципы генерации и характеристики судьбеспецифических клеток среднего мозга, полученных из PSC посредством экзогенных сигналов формирования паттерна (Kriks et al., 2011; Kirkeby et al. , 2012; Reinhardt et al., 2013a). Например, Qian et al. были вдохновлены 2D-экспериментами, проведенными Kriks et al.(2011), а также первоначальные эксперименты с тканями среднего мозга, о которых сообщили Tieng et al. (2014) и (Qian et al., 2016). В том же году был опубликован другой протокол, описывающий генерацию чМО (Jo et al., 2016). Jo et al. (2016), а позже Kim et al. (2019) основали свой вывод на выводах Chambers et al. (2009). Кроме того, протоколы hMO, описанные Monzel et al. (2017) и Smits et al. (2019b) основаны на 2D-экспериментах Рейнхардта и др. (2013a).

Начальным этапом образования hMO является образование EB и индукция нейроэктодермы посредством двойного ингибирования SMAD.Во всех сравниваемых здесь протоколах hMO SB использовался для ингибирования сигнального пути Activin / TGF-β (Таблица 1). Комбинация с ингибиторами пути BMP обеспечивает полную нейронную конверсию PSC. Использование антагонистов BMP Noggin, LDN и DM было показано в 2D (Chambers et al., 2009; Kriks et al., 2011; Reinhardt et al., 2013a) и применено в трехмерных культурах стволовых клеток (Таблица 1). Чтобы контролировать спецификацию нервных клеток-предшественников, CHIR, мощный химический ингибитор GSK-3β, был использован для дозозависимой активации сигнального пути WNT (Kirkeby et al., 2012). Окончательное формирование паттерна в отношении предшественников пластин дна среднего мозга требует обработки низкомолекулярными активаторами сигнального пути SHH, такими как рекомбинантный SHH, PMA или сглаженный агонист (SAG) (Kriks et al., 2011; Smits et al., 2019b) . Такой состав экзогенных сигналов формирования паттерна приводит к появлению нейральных предшественников, которые могут дать начало аутентичным, специфичным для среднего мозга дофаминергическим нейронам (мДАН) (Kriks et al., 2011; Kirkeby et al., 2012; Doi et al., 2014; Nolbrant et al. ., 2017).

Таблица 1. Сравнение протоколов получения hMO: Обзор применяемых соединений для получения нейроэлектодермы, специфичной для среднего мозга, путем нейрональной индукции.

Дальнейшее развитие этих протоколов позволило получить трехмерную культивированную hMO. В отличие от 2D однослойных культур, hMOs могут воспроизводить сложные взаимодействия mDAN с другими типами клеток центральной нервной системы (ЦНС) в трехмерной среде. Кластерный анализ, сравнивающий дифференциально экспрессируемые гены hMO, 2D-культивируемые mDAN и пренатальные образцы среднего мозга человека, показал, что hMOs имеют общие черты профилей экспрессии генов пренатального среднего мозга, которые не могут быть воссозданы с помощью обычного метода 2D-деривации для mDAN (Jo et al. al., 2016). Это демонстрирует, что специфическая клеточная структура и гетерогенность культур органоидов, специфичных для среднего мозга, позволяют моделировать биологические аспекты, которые не могут быть воспроизведены с помощью современных 2D культур стволовых клеток. Кроме того, огромное количество мДАН, относящихся к заболеванию, может быть произведено быстрым и воспроизводимым способом, что требуется для моделирования заболеваний и открытия лекарств в области болезни Паркинсона (БП). Многочисленные опубликованные протоколы описывают получение вентральных мДАН из человеческих ПСК в 2D путем репликации mDAN in vivo — спецификации in vitro (Kriks et al., 2011; Киркеби и др., 2012; Doi et al., 2014; Нолбрант и др., 2017). Хотя текущие протоколы основаны на генерации LMX1A / FOXA2-положительных предшественников донных пластинок среднего мозга, дифференциация, начинающаяся с PSCs, занимает много времени и обычно приводит к культурам, содержащим различные нейрональные идентичности (Hargus et al., 2010; Kriks et al., 2011; Kirkeby et al., 2012; Grealish et al., 2014). Как правило, органоиды головного мозга генерируются из ПСХ путем использования процессов развития (Lancaster et al., 2013; Clevers, 2016) или создавая среду, благоприятствующую конкретным нишам стволовых клеток (Tieng et al., 2014; Jo et al., 2016; Qian et al., 2016; Kim et al., 2019). Однако использование NSC в качестве исходной популяции для hMO имеет то преимущество, что уже сформированные клетки более эффективно дифференцируются в желаемые структуры. Другие культуры органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток, были созданы, например, для создания органоидов кишечника или легких. Они содержат типы клеток, которые присутствуют в органе, из которого они были получены, и воспроизводят некоторую степень его пространственной организации (Clevers, 2013; Huch and Koo, 2015; Drost and Clevers, 2017).Точно так же присутствие ниш стволовых клеток среднего мозга и кластеров мДАН было показано в модели чМО, полученной из NSC, и сообщалось о подходах к эффективной дифференцировке мДАН в чМО, начиная с расширяемых нервных клеток-предшественников (NPC) (Monzel et al., 2017; Smits et al., 2019a, b; таблицы 2, 3). В этих подходах использовались NPC, которые уже получили некоторый паттерн в направлении среднего мозга. Обе модели hMO уже использовались в других исследованиях (Berger et al., 2018; Jan et al., 2018; Jarazo et al., 2019). Среди опубликованных протоколов hMO были представлены различные подходы для оценки количества мДАН, которые возникают во время развития органоидов (таблица 2). Tieng et al. (2014) диссоциировали свои трехмерные структуры и культивировали полученные одиночные клетки как монослой (Qian et al., 2016). Их количественная оценка дала более 60% TH-положительных клеток в 21-дневных культурах (Tieng et al., 2014) и около 55% TH-положительных клеток через 65 дней (Qian et al., 2016). Более простой метод количественной оценки популяции mDAN — это проточная цитометрия с помощью сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), которая также требует диссоциированных hMOs.Таким образом, было показано, что после 61 дня культивирования около 64% ​​клеток были трижды положительными по маркерам mDAN TH, LMX1A и FOXA2 (Monzel et al., 2017). Удивительно, но тем же методом Jo et al. (2016) идентифицировали только около 22% MAP2-позитивных нейронов, коэкспрессирующих TH в своих чМО после 60 дней культивирования. Третий подход к оценке процента мДАН в чМО был описан недавно (Bolognin et al., 2019; Smits et al., 2019b). Здесь алгоритмы анализа изображений позволили автоматизировать сегментацию ядер и нейронов, при этом было определено около 62% TH-положительных клеток через 35 дней и около 54% ​​TH-положительных клеток после 70 дней 3D-культивирования.Применение анализа изображений с высоким содержанием позволяет исследовать целые срезы органоидов, а не отдельные диссоциированные клетки, что сохраняет исходную морфологию и межклеточные взаимодействия мДАН. TH — это маркер, обычно используемый для обнаружения мДАН, поскольку это фермент, ограничивающий скорость биосинтеза DA. Однако он также экспрессируется в других типах катехоламинергических клеток и не является уникальным маркером, специфичным для мДАН, как, например, в случае переносчика дофамина (DAT) или фактического присутствия нейромедиатора DA (Abeliovich and Hammond, 2007). .Об экспрессии DAT сообщалось почти в каждой модели hMO (Jo et al., 2016; Qian et al., 2016; Monzel et al., 2017; Kim et al., 2019; Smits et al., 2019b; Таблица 2).

Tieng et al. (2014) не показали присутствия ДАТ в их сконструированных нервных тканях (ЛОР), но они смогли доказать синтез ДА с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) после лизиса клеток. Также Jo et al. (2016) и Kim et al. (2019) также применили тот же метод для оценки содержания DA в hMOs.Чтобы убедиться, что мДАН не только способны продуцировать DA, но и действительно могут высвобождать нейромедиатор, супернатант трехмерных культур можно проанализировать с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). СМИЦ и др. обнаружили высвобождение DA, которое увеличивается по мере созревания hMO (Smits et al., 2019b). Об интересном наблюдении впервые сообщили JO et al., Где они обнаружили нерастворимые темные отложения в своих hMO примерно через 60 дней (Jo et al., 2016). Используя окрашивание по Фонтана-Массон, они подтвердили, что эти гранулы были нейромеланином (NM), который является побочным продуктом биосинтеза DA и накапливается постнатально в nigra pars compacta (SNc) человеческого мозга (Zecca et al., 2003; Паска, 2018; Ким и др., 2019). Другие протоколы культивирования hMO также стимулировали производство NM (Monzel et al., 2017; Smits et al., 2019b; Таблица 2). Наличие NM — уникальная особенность мозга приматов (Pasca, 2018). Он не проявляется ни в мозге мышей, ни в органоидах, специфичных для среднего мозга (Fedorow et al., 2005; Доусон и др., 2010; Jo et al., 2016; Мартон и Пашка, 2016). MDAN дикого типа, полученные и культивируемые в монослойных условиях, продуцируют NM только после искусственной индукции экспрессии прогерина, которая связана с преждевременным старением (Miller et al., 2013; Sterneckert et al., 2014). Связанные с мембраной плотные пигментированные НМ были также обнаружены в долгосрочных культурах гомозиготных мутантных DJ-1 и идиопатических мДАН, полученных от пациентов с БП (Burbulla et al., 2017). В настоящее время неизвестно, оказывает ли NM защитный или повреждающий эффект на выживаемость клеток, однако доказано, что NM-содержащие mDAN из SNc особенно уязвимы во время протекания БП (Zecca et al., 2003; Jo et al., 2016; Мартон и Пашка, 2016). Следовательно, NM, содержащие hMOs, имеют большой потенциал для использования для моделирования in vitro PD, возможно, для выявления специфических фенотипов, которые не присутствуют в 2D-культурах дикого типа или мышиных моделях. Более того, hMOs обеспечивают основу для будущих исследований роли NM в PD (Marton and Paşca, 2016; Michel et al., 2016). Поскольку mDAN необходимы для моделирования среднего мозга человека, исследования hMO до сих пор были сосредоточены в основном на этом конкретном типе нейронов.Тем не менее, подробные исследования in vivo описали, что высвобожденный DA диффундирует в синаптические области глутаматергических и ГАМКергических синапсов и напрямую влияет на другие типы стриатальных клеток, включая нейроны, образующие островной / стриосомный путь ГАМК, холинергические интернейроны полосатого тела и полосатая ГАМК. интернейроны, обладающие рецепторами DA (Calabresi et al., 2014; Borroto-Escuela et al., 2018). Более того, дофаминергических нейронов черной субстанции, (SN) напрямую контролируются ГАМКергическим входом (Tepper and Lee, 2007).Данные этих исследований показывают, что наличие других подтипов нейронов важно для моделирования многофакторного заболевания, такого как БП. Первая транскрипционная характеристика hMO была проведена Jo et al. (2016), показав, что аспекты пренатальных профилей экспрессии генов среднего мозга были обнаружены в органоидах в отличие от традиционных мДАН, полученных из 2D (Консорциум GTEx, 2015; Lin et al., 2016). Для дальнейшей проверки профиля генетической экспрессии в ходе развития hMO они предложили провести анализ одноклеточного транскриптома, как это было показано ранее для церебральных органоидов (Camp et al., 2015; Kageyama et al., 2018). В недавнем исследовании одноклеточные транскриптомные данные hMO продемонстрировали повышенную экспрессию специфичных для нейронов и стволовых клеток генов через 35 дней по сравнению с 70-дневными hMO, в то время как корреляции только между генами и генами увеличивались. -специфические гены значительно увеличились на 70-е сутки (Smits et al., 2019a). Это означает возрастающую приверженность клеток судьбе нейрональных клеток в ходе развития органоидов и дополнительно поддерживает открытие прогрессивного созревания постмитотических нейронов.Идентификация этих нейрон-специфичных генов показала, что гены, активируемые в более ранний момент времени, особенно важны в процессах нейрогенеза, миграции и дифференцировки нейронов [например, ранний фактор В-клеток 3 (EBF3) (Гарсия-Домингес) , 2003) и молекула адгезии клеток L1 (L1CAM) (Patzke et al., 2016)], тогда как активированные гены в более поздний момент времени были вовлечены in vivo в модулирующий вклад в расширение нейритов [например, молекула с отталкивающим наведением B (RGMB), Ma et al., 2011]. Это указывает на более высокую приверженность клеток их предполагаемой судьбе и прогрессирующее созревание постмитотических нейронов внутри hMOs. Поскольку наличие нейрональных подтипов, глутаматергических и ГАМКергических нейронов в hMO уже сообщалось (Tieng et al., 2014; Jo et al., 2016), место жительства определенных нейрональных подтипов было рассмотрено с помощью одноклеточного метода высокого разрешения. анализ (Smits et al., 2019a). Экспрессия генов, типичных для дофаминергических, глутаматергических, ГАМКергических и серотонинергических нейронов, была исследована, и их присутствие дополнительно подтверждено иммуногистохимическим окрашиванием соответствующих нейротрансмиттеров.Это позволяет надежно обнаруживать дофаминергические, глутаматергические и ГАМКергические нейроны, а также несколько серотонинергических нейронов внутри чМО (таблица 2). До сих пор не проводился подробный анализ функции нейронального подтипа и их взаимодействия. Однако, что касается того факта, что mDAN физиологически синапсы в полосатом теле, а не в среднем мозге in vivo , hMOs потенциально ограничены в качестве модели in vitro в этом случае.

Помимо подробной характеристики нейрональной популяции, анализ астроглии и дифференцировки олигодендроцитов также имеет решающее значение для точного моделирования среднего мозга человека.Присутствие астроцитов необходимо для формирования синапсов и регулярной нейрональной активности (Chung et al., 2015). Астроциты определяются позже, чем нейроны во время развития, и их иммунореактивность определяется только в hMOs после 35 дней культивирования (Molofsky et al., 2012; Chaboub and Deneen, 2013; Monzel et al., 2017; Таблица 2). Быстрая передача информации между нейронами зависит от миелинизации аксонов, которая достигается олигодендроцитами в ЦНС. В большинстве протоколов дифференцировки на основе стволовых клеток дифференцировка в олигодендроциты крайне неэффективна (Jablonska et al., 2010; Bunk et al., 2016). Однако дифференцировка в олигодендроциты и обнаруженная миелинизация недофаминергических нейронов была достигнута в hMOs (Monzel et al., 2017). Некоторые нейриты в этих hMOs были заключены в оболочку с помощью олигодендроцитов, и даже стали очевидными структуры, такие как узлы Ранвье, которые имеют решающее значение для электрохимической передачи сигналов в аксонах (Faivre-Sarrailh and Devaux, 2013). Особенность немиелинизированных или тонко миелинизированных нейронов особенно хорошо описана для мДАН SNc и объясняет, почему только около 30% перекрывающихся клеток βIII тубулина (TUJ1) и основного белка миелина (MBP) были количественно определены в системе hMO (Braak and Del Tredici , 2004; Orimo et al., 2011; Зульцер и Сюрмайер, 2013; Monzel et al., 2017). Чтобы обеспечить возможность будущего применения и улучшить влияние чМО в патофизиологических и фармакологических исследованиях, была проведена оценка электрической активности и функциональной зрелости трехмерных культур, специфичных для среднего мозга. Присутствие или, скорее, совместная локализация пресинаптического маркера SYNAPTOPHYSIN и постсинаптического маркера PSD95 указывает на прямой контакт между пре- и постсинапсом (Monzel et al., 2017). Точная морфология синапсов, происходящих из hMO, до сих пор не рассматривалась подробно, хотя другие органоиды головного мозга, полученные из hPSC, уже отражают многие аспекты формирования и функционирования синапсов человека (Wilson and Newell-Litwa, 2018).Запись участков целых клеток выполнялась с нарезанными срезами hMO (Jo et al., 2016) или с нейронами, полученными из hMO (Smits et al., 2019b). Это установленный, но инвазивный метод, который позволяет идентифицировать и анализировать определенные нейрональные подтипы, однако, непрерывное развитие отдельного органоида еще не может быть отслежено с такими подробностями. Альтернативно, неинвазивные записи потенциалов внеклеточного поля могут быть достигнуты с помощью систем MEA и позволяют получить представление о физиологических свойствах культур in vitro и хронологический анализ (Luhmann et al., 2016). Tieng et al. (2014) обнаружили у своих ЛОР спонтанную и вызванную электрофизиологическую активность. Кроме того, в исследовании Monzel et al. (2017) были обнаружены спайки близко по времени на нескольких электродах, что указывает на синхронность нейронной сети. Чтобы конкретно определить активность различных нейронных рецепторов в органоиде, можно исследовать реакцию на химические соединения. Функциональность рецепторов DA проверялась с применением квинпирола, специфического агониста рецепторов D2 / D3.Важно отметить, что мДАН экспрессируют ауторецепторы D2. Ранее это использовалось в нескольких исследованиях и показало, что эффективно подавляет возбуждение в hMOs (Jo et al., 2016; Monzel et al., 2017; Smits et al., 2019a). Вместе с сообщениями о продукции и высвобождении DA это убедительно свидетельствует о том, что TH-положительные нейроны, развивающиеся в hMOs, проявляют электрофизиологические и биохимические свойства зрелых мДАН и экспрессируют функциональные, чувствительные к хинпиролу, рецепторы DA. Для дальнейшего выделения и приписывания записанных сигналов подтипам нейронов тормозная и возбуждающая коммуникации дополнительно блокировались специфическими лекарствами в соответствии с установленным экспериментальным планом Illes et al.(2014). Были использованы такие препараты, как габазин, антагонист ГАМК-рецепторов, которые приводят к растормаживанию целевых нейронов ГАМКергических нейронов, а также антагонисты NMDA-рецепторов и AMPA / каинатных рецепторов, ингибирующие глутаматергическую возбуждающую коммуникацию (Illes et al., 2014). Вместе с характерными признаками образования синапсов, состоящими из прямого контакта между пре- и постсинапсами и составляющими предпосылку для функционирования электрофизиологической и нейрональной сети, эти эксперименты подтвердили наличие функциональных ГАМКергических и глутаматергических нейронов внутри hMO в дополнение к присутствующим функциональным рецепторам DA. .Хотя нейроны не существуют изолированно в ЦНС, а образуют функциональные сети с другими нейронами и ненейронными клетками, важно расширить наши исследования нейродегенеративных заболеваний с помощью трехмерных моделей, которые способны воспроизводить как автономные, так и неклеточные клетки. автономные аспекты. Использование трехмерных моделей культур клеток, которые включают множество нейрональных подтипов, может привести к новому пониманию избирательной уязвимости, которая наблюдается при нейродегенерации. Данные свидетельствуют о том, что специфическая регуляция возбудимости мДАН другими подтипами нейронов среднего мозга может объяснять их избирательную уязвимость при БП (Короткова и др., 2004; Calabresi et al., 2014; Калабрези и Ди Филиппо, 2015). Это подчеркивает важность и огромный потенциал будущих моделей заболеваний, в которых используются hMO, поскольку они содержат функционально связанные гетерогенные популяции нейронов.

Моделирование заболеваний органоидов, специфичных для среднего мозга

Органоиды, в частности моделирующие средний мозг человека, открывают большие перспективы для изучения развития человеческого мозга и моделирования нейродегенеративного расстройства БП. БП является вторым по распространенности дегенеративным неврологическим заболеванием после БА и определяется избирательной потерей мДАН в SNc среднего мозга человека.Интересно, что после десятилетий исследований БП молекулярные механизмы, лежащие в основе инициирования и прогрессирования нейродегенеративного заболевания, обычно протекающего как идиопатическая форма, не были полностью раскрыты и остаются в значительной степени неуловимыми (Roybon et al., 2004). Таким образом, создание органоидов головного мозга, специфичных для регионов, открывает новые возможности для изучения нейрональных заболеваний, которые связаны с определенной частью человеческого мозга, например с БП. Нейродегенеративные расстройства, такие как БП, обычно считаются возрастными заболеваниями (Sepe et al., 2016; Сюй и др., 2016). Однако накапливаются доказательства того, что БП имеет сильный компонент развития нервной системы, который, вероятно, определяет предрасположенность к развитию болезни (Garcia-Reitboeck et al., 2013; Le Grand et al., 2015; Schwamborn, 2018). Это открытие подтверждает важность моделей развития человеческого мозга для исследования механизмов, лежащих в основе заболевания. Недавняя публикация представляет собой доказательство принципа исследования, в котором либо полученные от пациентов, либо генетически модифицированные hMO, несущие ассоциированную с заболеванием мутацию G2019S в гене LRRK2 , демонстрируют фенотипы, относящиеся к PD, включая уменьшенное количество mDAN (Smits et al., 2019b). Путем оценки количества связей (ветвления) и узлов (точек бифуркации дендритов) мДАН, развивающихся в разных группах чМО, было выявлено значительное снижение сложности дофаминергической сети в полученных от пациента TH-положительных нейронах, что также известно встречаются в головном мозге пациентов с БП (Bernheimer et al., 1973; Kordower et al., 2013; Smits et al., 2019b). Основываясь на другом опубликованном протоколе hMO, Kim et al. (2019) также получили органоиды, несущие мутацию LRRK2 -G2019S (Jo et al., 2016). В соответствии с выводами Smits et al. (2019b) и Ким и др. (2019) обнаружили, что mDAN в органоидах LRRK2 -G2019S обнаруживают уменьшенную длину нейритов по сравнению с mDAN в контрольных органоидах. Они также оценили общий сниженный уровень экспрессии специфичных для mDAN маркеров, таких как TH, декарбоксилаза ароматической 1-аминокислоты (AADC) и DAT, в их созданных hMO LRRK2 -G2019S (Kim et al., 2019). Они достигли частичного восстановления уровней экспрессии этих генов после обработки мутантных органоидов LRRK2 -G2019S ингибитором киназы LRRK2 GSK2578215A.Это ингибирование LRRK2 предполагает положительное влияние на гибель клеток mDAN и дополнительно доказывает, что эта трехмерная система культивирования клеток восприимчива к исследованию терапевтических стратегий против БП (Kim et al., 2019). Kim et al. (2019) также определили, что hMOs, несущие мутацию LRRK2 -G2019S, демонстрируют аномальную локализацию α-синуклеина, который фосфорилируется по серину 129 (pS129). Они утверждают, что pS129-α-синуклеин аберрантно экспрессируется в мутированных hMO, и они обнаружили зависимое от мутации LRRK2 -G2019S увеличение тиофлавин-T-положительных отложений в TH-положительных нейронах с течением времени, даже несмотря на то, что общая экспрессия α-синуклеина не увеличивается (Kim et al., 2019). Удивительно, но эти обнаруженные тиофлавин Т-положительные отложения оказались внеклеточными и явно не перекрывались с сигналом TH. Вопрос о том, можно ли воспроизвести эти результаты с помощью другого аналитического метода, еще предстоит изучить. Тем не менее, оценка патологий, связанных с БП, таких как синуклеинопатии, в специфичных для человека моделях передовых культур клеток имеет решающее значение из-за присущих различий между уязвимостью mDAN человека и мыши, а также из-за того, что существующие мышиные трансгенные модели не были эффективны для разработки точных моделей. представление механизмов основного заболевания (Byers et al., 2012; Бурбулла и др., 2017; Хеммер и др., 2018; Koh et al., 2018). В исследовании Smits et al. (2019b) было продемонстрировано значительное увеличение FOXA2-положительных клеток-предшественников в органоидах, специфичных для пациента. Поскольку FOXA2 необходим для генерации мДАН, предполагается, что это может быть компенсаторным ответом на нарушение спецификации мДАН, вызванное мутантным геном LRRK2 (Sasaki et al., 1997), кроме того, это может быть результатом снижение потенциала дифференцировки клеток-предшественников.Подобные компенсаторные механизмы были описаны при БП ранее и могут представлять собой попытку противодействовать дефектам развития нервной системы, вызванным специфическими для БП мутациями (Blesa et al., 2017). При введении также изогенных контрольных hMO было подтверждено, что введение мутации LRRK2 -G2019S оказало вредное воздействие на сложность mDAN в пределах здорового фона. Напротив, коррекции гена LRRK2 -G2019S на фоне пациента с БП недостаточно для устранения этого эффекта.Поскольку LRRK2 -G2019S не является полностью пенетрантным и вероятность развития БП индивидуально варьируется среди носителей, предполагается, что его патологическая функция включает дополнительные пути (Smith et al., 2006; Goldwurm et al., 2007). В этом контексте разрешительный генетический фон из-за кумулятивных генетических вариантов может опосредовать и либо усиливать, либо уменьшать нейродегенерацию, индуцированную LRRK2 (Bolognin et al., 2019). Примечательно, что при анализе всех изученных признаков линии, полученные от пациентов с БП, группируются вместе, независимо от наличия или отсутствия мутации (Smits et al., 2019b). Это указывает на то, что генетический фон пациентов с БП, независимо от редактирования генов, составляет большую часть различий между исследуемыми клеточными линиями и, по-видимому, является основным отличительным фактором. Таким образом, не мутация LRRK2 -G2019S, а генетический фон пациентов вносит наибольший вклад в фенотипы и поддерживает гипотезу о том, что генетический фон пациентов с БП может влиять на дегенерацию мДАН (Bolognin et al., 2019) .Эти результаты показывают, что 3D hMO и соответствующие mDAN представляют собой новые мощные инструменты для моделирования in vitro болезни . Важно отметить, что у пациентов с PD в среднем мозге в основном поражается SN, в то время как соседняя область, вентральная тегментальная область, которая также содержит DN, в значительной степени не затрагивается. Текущие модели hMO до сих пор не устраняли эту уязвимость в достаточной степени. Однако это ограничение, безусловно, будет исследовано в будущем.

Получив дополнительные hMO, которые несут дефекты в генах, которые, как известно, вызывают БП, мы могли бы расширить понимание связанных с заболеванием аномалий и контекста, в котором они возникают (Benson and Huntley, 2019).Индивидуальный характер этих моделей также открывает многообещающие возможности для будущих подходов к персонализированной медицине (Bu et al., 2016; Hillje and Schwamborn, 2016; Smits et al., 2019b).

Перспективы

Создание и характеристика протоколов органоидов, специфичных для среднего мозга, и тем самым предоставление сложных моделей in vitro для изучения процессов развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний среднего мозга человека привели к новым открытиям в области усовершенствованных клеток 3D in vitro системы культивирования.Кроме того, сообщенные PD-релевантные фенотипы в чМО, полученных от пациентов с БП, доказали, что эти методы являются мощным инструментом для моделирования заболеваний in vitro и неврологических расстройств, специфичных для человека.

Для таких применений модель органоида должна быть воспроизводимой и стабильной для расширенного культивирования и манипуляций. Несмотря на то, что технология органоидов является мощным активом в области исследований мозга, модели hMO демонстрируют существенные недостатки и ограничения (Berger et al., 2018; Wang Y. et al., 2018). Отсутствие естественной оси тела или поддерживающей ткани препятствует организации органоида, идентичной структуре человеческого мозга in vivo (Lancaster et al., 2013; Kelava and Lancaster, 2016a; Wang Y. et al., 2018 ). Идентификация конкретных областей мозга, а также воспроизводимость могут быть несовершенными, тем не менее, маловероятно создание точных условий культивирования, обнаруженных в человеческом мозге in utero (Trujillo and Muotri, 2018).Основным ограничением представленных здесь hMOs, а также других опубликованных систем органоидов головного мозга является отсутствие сосудистой сети, которая ограничивает снабжение кислородом и питательными веществами, особенно во внутренней части органоидов (Kelava and Lancaster, 2016a; Wang Y . et al., 2018). Это также может ограничивать рост органоидов сверх определенного размера и увеличивать появление мертвых клеток в центре органоидов (Giandomenico and Lancaster, 2017; Monzel et al., 2017; Berger et al., 2018). Число клеток и, следовательно, плотность клеток в органоиде, по-видимому, играют важную роль и могут быть целью для улучшения.Выбор суррогатной матрицы, отправная точка и продолжительность дифференциации — это дополнительные аспекты, которые могут повлиять на точность 3D-культуры. Недавно органоиды головного мозга были успешно трансплантированы в мозг мыши, и в трансплантатах можно было обнаружить мышиные кровеносные сосуды (Mansour et al., 2018). Несмотря на то, что трансплантированный органоид более точно имитировал анатомию мозга in vivo , этот метод имеет недостаток в виде ксеноконтаминации (Trujillo and Muotri, 2018; Wang Y.и др., 2018). Отсутствие микроглии, резидентных врожденных иммунных клеток ЦНС, является еще одним серьезным недостатком для моделирования заболеваний, поскольку они активно участвуют в развитии и созревании нейронов. В случае церебральных органоидов недавно была опубликована адаптация модели органоидов, содержащих микроглию (Ormel et al., 2018). Поскольку некоторые hMO происходят из нейроэктодермы, а микроглия в процессе развития происходит из мезодермы, существует только возможность интегрировать извне микроглию или их предшественников в развивающуюся hMO (Muffat et al., 2016; Abud et al., 2017; Haenseler et al., 2017; Трухильо и Муотри, 2018; Wang Y. et al., 2018).

Будущее развитие технологий клеточных культур будет способствовать дальнейшему совершенствованию моделей органоидов, специфичных для мозга, и будет поддерживать как исследование более сложных взаимодействий в человеческом мозге, так и моделирование более широкого спектра неврологических расстройств (Di Lullo and Kriegstein, 2017; Wang Y. и др., 2018). Несмотря на текущие ограничения, мы можем сделать вывод, что система hMO, представленная здесь, наряду с другими моделями, может быть первым шагом к более ориентированной на человека пациенту, возможно, даже персонализированной эре передового моделирования заболеваний и развития терапии.

Авторские взносы

LS и JS совместно написали и отредактировали этот обзор.

Финансирование

Лаборатория JS поддерживается Национальным фондом исследований (FNR) (программа проверки концепции PoC15 / 11180855 и PoC16 / 11559169). Это проект Совместной программы ЕС и исследования нейродегенеративных заболеваний (JPND) (INTER / JPND / 15/110) и проект M-ERA.NET (INTER / M-ERA.NET / 17/11760144). Работа выполнена при финансовой поддержке проекта FET Proactive CONNECT (грант №824070). LS поддерживается стипендиями Aides la Formation-Recherche от FNR.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Грэма Робертсона за конструктивную критику рукописи.

Список литературы

Абе-Фукасава, Н., Оцука, К., Aihara, A., Itasaki, N., and Nishino, T. (2018). Новый метод трехмерной жидкой культуры клеток для независимого от закрепления роста клеток, визуализации клеток и автоматизированного скрининга лекарств. Sci. Отчет 8: 3627. DOI: 10.1038 / s41598-018-21950-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Абуд, Э. М., Рамирес, Р. Н., Мартинес, Э. С., Карсон, М. Дж., Пун, В. В., Блартон-Джонс, М., и др. (2017). ИПСК-производные человеческие микроглиеподобные клетки для изучения неврологических заболеваний. Нейрон 94, 278–293.e9. DOI: 10.1016 / j.neuron.2017.03.042

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бергер, Э., Мальяро, К., Пациа, Н., Монцель, А.С., Антоний, П., Линстер, К. Л. и др. (2018). Millifluidic культура улучшает жизнеспособность и дифференциацию органоидов среднего мозга человека. Lab. Чип 18, 3172–3183. DOI: 10.1039 / c8lc00206a

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бернхеймер, Х., Биркмайер, В., Хорникевич, О., Еллингер, К.и Зейтельбергер Ф. (1973). Дофамин мозга и синдромы Паркинсона и Хантингтона, клинические, морфологические и нейрохимические корреляции. J. Neurol. Sci. 20, 415–455. DOI: 10.1016 / 0022-510X (73)

-5

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Биан, С., Репик, М., Го, З., Кавираяни, А., Буркард, Т., Бэгли, Дж. А. и др. (2018). Генно-инженерные церебральные органоиды моделируют образование опухоли головного мозга. Nat. Методы 15, 631–639. DOI: 10.1038 / s41592-018-0070-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Блеса, J., Триго-Дамас, И., Дилеоне, М., дель Рей, Н. Л. Г., Эрнандес, Л. Ф., и Обесо, Дж. А. (2017). Компенсаторные механизмы при болезни Паркинсона: адаптация цепей и роль в модификации болезни. Exp. Neurol. 298, 148–161. DOI: 10.1016 / j.expneurol.2017.10.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Болоньен, С., Фоссепре, М., Цин, X., Яразо, Дж., Щанчар, Дж., Морено, Э. Л. и др. (2019). 3D-культуры дофаминергических нейронов, специфичных для болезни Паркинсона, для фенотипирования с высоким содержанием и тестирования лекарств. Adv. Sci. 6: 1800927. DOI: 10.1002 / advs.201800927

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Боррото-Эскуэла, Д. О., Перес де ла Мора, М., Мангер, П., Нарваес, М., Беджиато, С., Креспо-Рамирес, М. и др. (2018). Передача дофамина в мозге при здоровье и болезни Паркинсона: модуляция синаптической передачи и пластичности посредством объемной передачи и гетерорецепторов дофамина. Фронт. Synaptic Neurosci. 10:20. DOI: 10.3389 / fnsyn.2018.00020

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Браак, Х., и Дель Тредичи, К. (2004). Плохая и длительная миелинизация как фактор, способствующий нейродегенеративным расстройствам. Neurobiol. Старение 25, 19–23. DOI: 10.1016 / j.neurobiolaging.2003.04.001

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bu, L.-L., Yang, K., Xiong, W.-X., Liu, F.-T., Anderson, B., Wang, Y., et al. (2016). К точной медицине при болезни Паркинсона. Ann. Пер. Med. 4:26. DOI: 10.3978 / j.issn.2305-5839.2016.01.21

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бункер, Е.К., Эртайлан, Г., Ортега, Ф., Павлу, М. А., Гонсалес Кано, Л., Стергиопулос, А. и др. (2016). Prox1 необходим для идентификации клеток олигодендроцитов во взрослых нейральных стволовых клетках субвентрикулярной зоны. Стволовые клетки 34, 2115–2129. DOI: 10.1002 / стержень.2374

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бурбулла, Л. Ф., Сонг, П., Мацзулли, Дж. Р., Зампезе, Э., Вонг, Ю. К., Чон, С., и др. (2017). Окисление дофамина опосредует митохондриальную и лизосомную дисфункцию при болезни Паркинсона. Наука 357, 1255–1261. DOI: 10.1126 / science.aam9080

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Байерс, Б., Ли, Х. и Рейхо Пера, Р. (2012). Моделирование болезни Паркинсона с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 237–242. DOI: 10.1007 / s11910-012-0270-y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Калабрези, П., и Ди Филиппо, М. (2015). Меняющееся дерево при болезни Паркинсона. Nat. Neurosci. 18, 1196–1198. DOI: 10.1038 / nn.4092

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Калабрези П., Пиккони Б., Тоцци А., Гильери В. и Ди Филиппо М. (2014). Прямые и непрямые пути базальных ганглиев: критическая переоценка. Nat. Neurosci. 17, 1022–1030. DOI: 10.1038 / nn.3743

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кэмп, Дж. Г., Бадша, Ф., Флорио, М., Кантон, С., Гербер, Т., Вильш-Бройнингер, М., и др.(2015). Органоиды головного мозга человека повторяют программы экспрессии генов развития неокортекса плода. Proc. Natl. Акад. Sci. США 112, 15672–15677. DOI: 10.1073 / pnas.1520760112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чемберс, С. М., Фазано, К. А., Папапетру, Э. П., Томишима, М., Саделайн, М., и Студер, Л. (2009). Высокоэффективное нейронное преобразование человеческих ES- и iPS-клеток за счет двойного ингибирования передачи сигналов SMAD. Nat. Biotechnol. 27, 275–280. DOI: 10.1038 / NBT.1529

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чой, С. Х., Ким, Ю. Х., Хебиш, М., Сливински, К., Ли, С., Д’Аванзо, К., и др. (2014). Трехмерная модель культуры нервных клеток человека болезни Альцгеймера. Природа 515, 274–278. DOI: 10.1038 / природа13800

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чой, С. Х., Ким, Ю. Х., Квинти, Л., Танзи, Р. Э., и Ким, Д. Ю.(2016). Трехмерные культуральные модели болезни Альцгеймера: дорожная карта к «лекарству в виде блюда». Мол. Neurodegener. 11:75. DOI: 10.1186 / s13024-016-0139-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чанг, В.-С., Уэлш, К.А., Баррес, Б.А., и Стивенс, Б. (2015). Управляет ли глия синаптическими и когнитивными нарушениями при болезни? Nat. Neurosci. 18, 1539–1545. DOI: 10.1038 / nn.4142

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Купер, О., Seo, H., Andrabi, S., Guardia-Laguarta, C., Graziotto, J., Sundberg, M., et al. (2012). Фармакологическое восстановление митохондриальных дефицитов в нервных клетках, происходящих от ИПСК, у пациентов с семейной болезнью Паркинсона. Sci. Пер. Med. 4: 141ra90. DOI: 10.1126 / scitranslmed.3003985

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кугола, Ф. Р., Фернандес, И. Р., Руссо, Ф. Б., Фрейтас, Б. К., Диас, Дж. Л. М., Гимарайнш, К. П. и др. (2016). Бразильский штамм вируса Зика вызывает врожденные дефекты в экспериментальных моделях. Природа 534, 267–271. DOI: 10.1038 / природа18296

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каллен, Д. К., Вольф, Дж. А., Вернекар, В. Н., Вукасинович, Дж., И ЛаПлака, М. К. (2012). Инженерия нервных тканей и биогибридизированные микросистемы для нейробиологических исследований in vitro (Часть 1). Crit. Преподобный Биомед. Англ. 39, 201–240. DOI: 10.1615 / critrevbiomedeng.v39.i3.30

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Данг, Дж., Тивари, С. К., Личинчи, Г., Цинь, Ю., Патил, В. С., Ерошкин, А. М. (2016). Вирус Зика истощает нейральные предшественники в органоидах головного мозга человека за счет активации рецептора врожденного иммунитета TLR3. Стволовая клетка 19, 258–265. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.04.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Д’Аванзо, К., Аронсон, Дж., Ким, Ю. Х., Чой, С. Х., Танзи, Р. Э., и Ким, Д. Ю. (2015). Болезнь Альцгеймера в 3D-культуре: проблемы и перспективы. Bioessays 37, 1139–1148. DOI: 10.1002 / bies.201500063

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Доусон, Т. М., Ко, Х. С., и Доусон, В. Л. (2010). Генетические животные модели болезни Паркинсона. Нейрон 66, 646–661. DOI: 10.1016 / j.neuron.2010.04.034

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ди Лулло, Э., Кригштейн, А. Р. (2017). Использование органоидов головного мозга для исследования развития нервной системы и болезней. Nat. Rev. Neurosci. 18, 573–584. DOI: 10.1038 / номер 2017.107

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дои, Д., Самата, Б., Кацукава, М., Кикучи, Т., Моризане, А., Оно, Ю. и др. (2014). Выделение индуцированных человеком дофаминергических предшественников плюрипотентных стволовых клеток путем сортировки клеток для успешной трансплантации. Stem Cell Rep. 2, 337–350. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2014.01.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Faivre-Sarrailh, C., и Дево, Дж. Дж. (2013). Нейроглиальные взаимодействия в узлах Ранвье: значение для здоровья и болезней. Фронт. Клетка. Neurosci. 7: 196. DOI: 10.3389 / fncel.2013.00196

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Федоров, Х., Трибл, Ф., Холлидей, Г., Герлах, М., Ридерер, П., и Дабл, К. Л. (2005). Нейромеланин в дофаминовых нейронах человека: сравнение с периферическими меланинами и отношение к болезни Паркинсона. Прог. Neurobiol. 75, 109–124. DOI: 10.1016 / j.pneurobio.2005.02.001

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарсес, П. П., Лойола, Э. К., Да Коста, Р. М., Хига, Л. М., Триндади, П., Дельвеккио, Р. и др. (2016). Вирус Зика нарушает рост нейросфер человека и органоидов головного мозга. Наука 352, 816–818. DOI: 10.1126 / science.aaf6116

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарсия-Райтбок, П., Аниччик, О., Далли, Дж. У., Нинкина, Н., Тофарис, Г. К., Бухман, В. Л. и др. (2013). Эндогенный альфа-синуклеин влияет на количество дофаминергических нейронов в черной субстанции мышей. Exp. Neurol. 248, 541–545. DOI: 10.1016 / J.EXPNEUROL.2013.07.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Goldwurm, S., Zini, M., Mariani, L., Tesei, S., Miceli, R., Sironi, F., et al. (2007). Оценка пенетрантности LRRK2 G2019S: актуальность для генетического консультирования при болезни Паркинсона. Неврология 68, 1141–1143.DOI: 10.1212 / 01.wnl.0000254483.19854.ef

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грилиш, С., Дигет, Э., Пармар, М., Бджо, А., Грилиш, С., Дигет, Э. и др. (2014). Дофаминовые нейроны, производные от ESC человека, демонстрируют доклиническую эффективность и активность, аналогичную фетальным нейронам, когда они привиты на крысиной модели клинического прогресса Паркинсона. Дофаминовые нейроны, производные от ESC человека, демонстрируют такую ​​же доклиническую эффективность и активность, что и нейроны плода. Стволовые клетки клетки 15, 653–665.DOI: 10.1016 / j.stem.2014.09.017

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Haenseler, W., Zambon, F., Lee, H., Vowles, J., Rinaldi, F., Duggal, G., et al. (2017). Избыток α-синуклеина нарушает фагоцитоз в макрофагах, происходящих от ИПСК. Sci. Отчет 7: 9003. DOI: 10.1038 / s41598-017-09362-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харгус Г., Купер О., Делейди М., Леви А., Ли К., Марлоу Э. и др. (2010). Дифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные пациентами с болезнью Паркинсона, растут в мозге взрослых грызунов и снижают моторную асимметрию у крыс с паркинсонизмом. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 15921–15926. DOI: 10.1073 / pnas.1010209107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хейкок, Дж. У. (2011). 3D-культура клеток: обзор современных подходов и методов. Methods Mol. Биол. Биол. 695, 1–5. DOI: 10.1007 / 978-1-60761-984-0_1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хеммер К., Смитс Л. М., Болоньин С. и Швамборн Дж. К. (2018). Фенотипирование in vivo стволовых клеток, специфичных для болезни Паркинсона, несущих мутацию LRRK2-G2019S, выявляет повышенные уровни α-синуклеина, но отсутствие распространения. Opera Med. Physiol. 4, 71–77. DOI: 10.20388 / omp2018.001.0057

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hillje, A.-L., и Schwamborn, J.C. (2016). Использование стволовых клеток для моделирования болезни Паркинсона — текущее состояние и будущие задачи. Future Neurol. 11, 171–186. DOI: 10.2217 / fnl.16.7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hubert, C.G., Rivera, M., Spangler, L.C., Wu, Q., Mack, S.C., Prager, B.C., et al. (2016).Трехмерная система культивирования органоидов, полученная из глиобластом человека, воспроизводит градиенты гипоксии и гетерогенность раковых стволовых клеток опухолей, обнаруженных in vivo. Cancer Res. 76, 2465–2477. DOI: 10.1158 / 0008-5472.can-15-2402

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуч, М., и Ку, Б. (2015). Моделирование развития мыши и человека с использованием органоидных культур. Разработка 142, 3113–3125. DOI: 10.1242 / dev.118570

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ильес, С., Jakab, M., Beyer, F., Gelfert, R., Couillard-Despres, S., Schnitzler, A., et al. (2014). Внутренне активные нейроны и нейроны-стимуляторы в популяциях нейронов, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток. Stem Cell Rep. 2, 323–336. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2014.01.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Яблонска Б., Агирре А., Раймонд М., Сабо Г., Китабатаке Ю., Сейлор К. А. и др. (2010). Хордин-индуцированная клональная пластичность взрослых SVZ-нейробластов после демиелинизации. Nat. Neurosci. 13, 541–550. DOI: 10.1038 / nn.2536

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ян А., Янсониус Б., Делаиделли А., Бханшали Ф., Ан Ю. А., Феррейра Н. и др. (2018). Активность регулятора трансляции киназы эукариотического фактора элонгации-2 повышается в мозге при болезни Паркинсона, и ее ингибирование снижает токсичность альфа-синуклеина. Acta Neuropathol. Commun. 6:54. DOI: 10.1186 / s40478-018-0554-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харасо, Дж., Barmpa, K., Rosety, I., Smits, L.M, Arias-Fuenzalida, J., Walter, J., et al. (2019). Фенотипы болезни Паркинсона в органоидах головного мозга, специфичных для пациентов, улучшаются лечением HP-β-CD. BioRxiv [Препринт] doi: 10.1101 / 813089

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джо, Дж., Сяо, Ю., Сюян Сунь, А., Кинг Тан, Э., Шон Дже, Х., Нг, Х. и др. (2016). Органоиды, подобные среднему мозгу, из плюрипотентных стволовых клеток человека содержат функциональные дофаминергические и нейромеланин-продуцирующие нейроны. Стволовые клетки клетки 19, 248–257. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.07.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кадосима Т., Сакагути Х., Накано Т., Соен М., Андо С. и Эйраку М. (2013). Самоорганизация осевой полярности, структуры вывернутого слоя и видоспецифической динамики предшественников в неокортексе, происходящем из ES-клеток человека. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110, 20284–20289. DOI: 10.1073 / pnas.1315710110

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кагеяма, Дж., Волльни Д., Трейтлейн Б. и Кэмп Дж. Г. (2018). ShinyCortex: исследование данных транскриптома отдельных клеток развивающейся коры головного мозга человека. Фронт. Neurosci. 12: 315. DOI: 10.3389 / fnins.2018.00315

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Келава И. и Ланкастер М. А. (2016a). Разбивка мини-мозгов: текущий прогресс и будущие перспективы в исследованиях органоидов мозга. Dev. Биол. 420, 199–209. DOI: 10.1016 / j.ydbio.2016.06.037

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ким, Х., Park, H.J., Choi, H., Chang, Y., Park, H., Shin, J., et al. (2019). Моделирование спорадической болезни Паркинсона G2019S-LRRK2 в трехмерных органоидах среднего мозга. Stem Cell Rep. 12, 518–531. DOI: 10.1016 / J.STEMCR.2019.01.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Киркеби А., Грилиш С., Вольф Д. А., Неландер Дж., Вуд Дж., Лундблад М. и др. (2012). Создание регионально определенных нейральных предшественников и функциональных нейронов из человеческих эмбриональных стволовых клеток при определенных условиях. Cell Rep. 1, 703–714. DOI: 10.1016 / j.celrep.2012.04.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ко, Ю. Х., Тан, Л. Ю., и Нг, С. (2018). Плюрипотентные стволовые клетки и органоиды, полученные от пациентов, для моделирования распространения альфа-синуклеина при болезни Паркинсона. Фронт. Клетка. Neurosci. 12: 413. DOI: 10.3389 / fncel.2018.00413

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кордовер, Дж. Х., Оланов, К. В., Додия, Х.Б., Чу, Ю., Бич, Т. Г., Адлер, К. Х. и др. (2013). Длительность заболевания и целостность нигростриатальной системы при болезни Паркинсона. Мозг 136, 2419–2431. DOI: 10,1093 / мозг / awt192

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Короткова Т. М., Пономаренко А. А., Браун Р. Э., Хаас Х. Л. (2004). Функциональное разнообразие дофамина и ГАМКергических нейронов вентральной части среднего мозга. Мол. Neurobiol. 29, 243–259. DOI: 10.1385 / MN: 29: 3: 243

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Крикс, С., Shim, J.-W., Piao, J., Ganat, Y.M., Wakeman, D.R., Xie, Z., et al. (2011). Дофаминовые нейроны, полученные из человеческих ES-клеток, эффективно приживаются в моделях болезни Паркинсона на животных. Природа 480, 547–551. DOI: 10.1038 / nature10648

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланкастер, М. А., Корсини, Н. С., Буркард, Т. Р., и Кноблих, Дж. А. (2016). Управляемая самоорганизация воспроизводит архитектуру тканей в биоинженерной модели органоидов мозга. BioRxiv [Препринт] doi: 10.1101/049346

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланкастер, М. А., Кноблих, Дж. А. (2014a). Генерация церебральных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Nat. Protoc. 9: 2329. DOI: 10.1038 / nprot.2014.158

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланкастер, М. А., Кноблих, Дж. А. (2014b). Органогенез в блюде: моделирование развития и заболевания с помощью органоидных технологий. Наука 345: 1247125. DOI: 10.1126 / наука.1247125

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ланкастер, М.А., Реннер, М., Мартин, К.-А., Венцель, Д., Бикнелл, Л.С., Херлз, М.Э., и др. (2013). Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Природа 501, 373–379. DOI: 10.1038 / природа12517

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ле Гран, Дж. Н., Гонсалес-Кано, Л., Павлу, М. А., и Швамборн, Дж. К. (2015). Нервные стволовые клетки при болезни Паркинсона: роль дефектов нейрогенеза в возникновении и прогрессировании. Cell. Мол. Life Sci. 72, 773–797. DOI: 10.1007 / s00018-014-1774-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лин, Л., Гёке, Дж., Чукуроглу, Э., Драниас, М. Р., ВанДонген, А. М. Дж. И Стэнтон, Л. В. (2016). Молекулярные особенности, лежащие в основе нейродегенерации, выявленные посредством моделирования in vitro генетически разнообразных пациентов с болезнью Паркинсона. Cell Rep. 15, 2411–2426. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.05.022

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Луман, Х.Дж., Синнинг, А., Янг, Дж., И Рейес-пуэрта, В. (2016). Спонтанная нейронная активность в развитии неокортикальных сетей: от отдельных клеток до крупномасштабных взаимодействий. Фронт. Neural Circ. 10:40. DOI: 10.3389 / fncir.2016.00040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ма, К. Х., Бреннер, Г. Дж., Омура, Т., Самад, О. А., Костиган, М., Инквимберт, П. и др. (2011). Корецептор BMP RGMb способствует, в то время как эндогенный антагонист BMP ноггин снижает рост нейритов и регенерацию периферических нервов, модулируя передачу сигналов BMP. J Neurosci. 31, 18391–18400. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.4550-11.2011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мансур, А.А., Гонсалвес, Дж. Т., Блойд, К. В., Ли, Х., Фернандес, С., Куанг, Д., и др. (2018). Модель in vivo функциональных и васкуляризированных органоидов головного мозга человека. Nat. Biotechnol. 36, 432–441. DOI: 10.1038 / NBT.4127

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Миллер Дж. Д., Ганат Ю. М., Кишиневский С., Bowman, R. L., Liu, B., Tu, E. Y. и др. (2013). Моделирование позднего начала болезни на основе ИПСК человека через старение, индуцированное прогерином. Стволовые клетки клетки 13, 691–705. DOI: 10.1016 / j.stem.2013.11.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Молофски, А.В., Кренчик, Р., Креник, Р., Уллиан, Э.М., Уллиан, Э., Цай, Х. и др. (2012). Астроциты и болезни: перспектива развития нервной системы. Genes Dev. 26, 891–907. DOI: 10.1101 / gad.188326.112

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Monzel, A. S., Smits, L. M., Hemmer, K., Hachi, S., Moreno, E. L., van Wuellen, T., et al. (2017). Получение органоидов среднего мозга человека из нейроэпителиальных стволовых клеток. Stem Cell Rep. 8, 1–11. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2017.03.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Muffat, J., Li, Y., Yuan, B., Mitalipova, M., Omer, A., Corcoran, S., et al. (2016).Эффективное получение микроглиеподобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека. Nat. Med. 22, 1358–1367. DOI: 10,1038 / нм 4189

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нгуен, Х. Н., Байерс, Б., Корд, Б., Щегловитов, А., Бирн, Дж., Гуджар, П. и др. (2011). ДА нейроны, полученные из мутантных ИПСК LRRK2, демонстрируют повышенную восприимчивость к окислительному стрессу. Cell Stem Cell 8, 267–280. DOI: 10.1016 / j.stem.2011.01.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нольбрант, С., Хойер, А., Пармар, М., и Киркеби, А. (2017). Создание высокочистых дофаминергических предшественников вентрального среднего мозга человека для созревания in vitro и интрацеребральной трансплантации. Nat. Protoc. 12, 1962–1979. DOI: 10.1038 / nprot.2017.078

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Новаковски, Т. Дж., Пыльца, А. А., Ди Лулло, Э., Сандовал-Эспиноза, К., Берштейн, М., Кригштейн, А. Р. (2016). Анализ экспрессии подчеркивает, что AXL является кандидатом рецептора проникновения вируса Зика в нервные стволовые клетки. Стволовые клетки клетки 18, 591–596. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.03.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Оримо, С., Учихара, Т., Канадзава, Т., Ито, Ю., Вакабаяси, К., Какита, А., и др. (2011). Немиелинизированные аксоны более уязвимы к дегенерации, чем миелинизированные аксоны сердечного нерва при болезни Паркинсона. Neuropathol. Прил. Neurobiol. 37, 791–802. DOI: 10.1111 / j.1365-2990.2011.01194.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ормель, П.Р., Виейра де Са, Р., Хол, Э. М., Пастеркамп, Р. Дж., Виейра де Са, Р., ван Бодегравен, Э. Дж. И др. (2018). Микроглия врожденно развивается внутри церебральных органоидов. Nat. Commun. 9: 4167. DOI: 10.1038 / s41467-018-06684-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Paşca, A.M., Sloan, S.A., Clarke, L.E., Tian, ​​Y., Makinson, C.D., Huber, N., et al. (2015). Функциональные нейроны коры и астроциты из плюрипотентных стволовых клеток человека в 3D-культуре. Nat. Методы 12, 671–678. DOI: 10.1038 / nmeth.3415

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пацке К., Акуна К., Гиам Л. Р., Верниг М. и Зюдхоф Т. К. (2016). Условная делеция L1CAM в нейронах человека нарушает разветвление аксонов и дендритов и генерацию потенциала действия. J. Exp. Med. 213, 499–515. DOI: 10.1084 / jem.20150951

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цянь, X., Нгуен, Х. Н., Сонг, М. М., Хадионо, К., Огден, С. К., Хаммак, К. и др. (2016). Органоиды, специфичные для области мозга, с использованием мини-биореакторов для моделирования воздействия ZIKV. Cell 165, 1238–1254. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.04.032

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цин, X., Вальтер, Дж., Харазо, Дж., Ариас-Фуэнзалида, Дж., Хиллье, А. Л., и Швамборн, Дж. К. (2017). CRISPR / Cas9 и piggyBac-опосредованная нокаутация LRRK2-G2019S без следа выявляет фенотипы нейрональной сложности и модуляцию α-синуклеина в дофаминергических нейронах. Stem Cell Res. 24, 44–50. DOI: 10.1016 / j.scr.2017.08.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Raja, W. K., Mungenast, A. E., Lin, Y., Ko, T., Abdurrob, F., Seo, J., et al. (2016). Самоорганизующаяся трехмерная нервная ткань человека, полученная из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, воспроизводит фенотипы болезни Альцгеймера. PLoS One 11: e0161969. DOI: 10.1371 / journal.pone.0161969

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейнхардт, П., Glatza, M., Hemmer, K., Tsytsyura, Y., Thiel, C. S., Hoing, S., et al. (2013a). Получение и распространение с использованием только небольших молекул нейральных предшественников человека для моделирования нейродегенеративных заболеваний. PLoS One 8: e59252. DOI: 10.1371 / journal.pone.0059252

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рейнхардт П., Шмид Б., Бурбулла Л. Ф., Шёндорф Д. К., Вагнер Л., Глатца М. и др. (2013b). Генетическая коррекция мутации lrrk2 в ИПСК человека связывает паркинсоническую нейродегенерацию с ERK-зависимыми изменениями экспрессии генов. Стволовые клетки клетки 12, 354–367. DOI: 10.1016 / j.stem.2013.01.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Реннер, М., Ланкастер, М.А., Биан, С., Чой, Х., Ку, Т., Пир, А. и др. (2017). Самоорганизованное формирование паттернов развития и дифференциация церебральных органоидов. EMBO J. 36, 1316–1329. DOI: 10.15252 / embj.2016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ройбон, Л., Кристоферсен, Н.S., Brundin, P., и Li, J.-Y. (2004). Терапия стволовыми клетками при болезни Паркинсона: где мы находимся? Cell Tissue Res. 318, 261–273. DOI: 10.1007 / s00441-004-0946-y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Райан С. Д., Долатабади Н., Чан С. Ф., Чжан Х., Ахтар М. В., Паркер Дж. И др. (2013). Модель изогенного ИПСК человека Паркинсона демонстрирует индуцированную нитрозативным стрессом дисфункцию транскрипции MEF2-PGC1α. Ячейка 155, 1351–1364. DOI: 10.1016 / j.ячейка.2013.11.009

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Санчес-Данес, А., Ришо-Патен, Ю., Карбальо-Карбахаль, И., Хименес-Дельгадо, С., Кайг, К., Мора, С. и др. (2012). Заболевания-специфические фенотипы в дофаминовых нейронах на основе моделей генетической и спорадической болезни Паркинсона на основе iPS человека. EMBO Mol. Med. 4, 380–395. DOI: 10.1002 / emmm.201200215

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сасаки, Х., Хуэй, К., Накафуку, М., и Кондо, Х.(1997). Сайт связывания белков Gli необходим для активности усилителя донной пластины HNF-3beta у трансгенных животных и может отвечать на Shh in vitro. Разработка 124, 1313–1322.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Sato, T., Vries, R.G., Snippert, H.J., van de Wetering, M., Barker, N., Stange, D.E., et al. (2009). Единичные стволовые клетки Lgr5 строят структуры криптвилл in vitro без мезенхимальной ниши. Природа 459, 262–265. DOI: 10.1038 / nature07935

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Швамборн, Дж.С. (2018). Является ли болезнь Паркинсона расстройством психического развития и помогут ли органоиды мозга нам это понять? Stem Cells Dev. 27, 968–975. DOI: 10.1089 / scd.2017.0289

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зайдель Д., Кринке Д., Янке Х. Г., Хирче А., Клосс Д., Мак Т. Г. А. и др. (2012). Индуцированная таупатия в новой модели 3D-культуры опосредует нейродегенеративные процессы: исследование биочипов в реальном времени. PLoS One 7: e49150.DOI: 10.1371 / journal.pone.0049150

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сепе, С., Миланезе, К., Габриэлс, С., Деркс, К. В. Дж., Паян-Гомес, К., ван Айкен, В. Ф. Дж. И др. (2016). Неэффективное восстановление ДНК является модификатором болезни Паркинсона, связанной со старением. Cell Rep. 15, 1866–1875. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.04.071

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сетия, Х., Муотри, А. Р. (2019). Органоиды головного мозга как модельная система развития нервной системы и болезней человека. Семин. Cell Dev. Биол. 95, 93–97. DOI: 10.1016 / j.semcdb.2019.03.002

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смит, В. В., Пей, З., Цзян, Х., Доусон, В. Л., Доусон, Т. М., и Росс, К. А. (2006). Киназная активность мутанта LRRK2 опосредует нейрональную токсичность. Nat. Neurosci. 9, 1231–1233. DOI: 10.1038 / nn1776

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смитс, Л. М., Магни, С., Гржиб, К., Энтони, П. М., Крюгер, Р., Скупин А. и др. (2019a). Одноклеточная транскриптомика выявляет множественные типы нейрональных клеток в органоидах, специфичных для среднего мозга человека. BioRxiv [Препринт] doi: 10.1101 / 589598

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смитс, Л. М., Рейнхард, Л., Рейнхард, П., Глатца, М., Монцель, А. С., Стансловски, Н. и др. (2019b). Моделирование болезни Паркинсона в органоидах, подобных среднему мозгу. NPJ Parkinson Dis. 5: 5. DOI: 10.1038 / s41531-019-0078-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Спатис, А.D., Asvos, X., Ziavra, D., Karampelas, T., Topouzis, S., Cournia, Z., et al. (2017). Nurr1: активация гетеродимера RXRα в качестве монотерапии болезни Паркинсона. Proc. Natl. Акад. Sci. США 114, 3999–4004. DOI: 10.1073 / pnas.1616874114

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зульцер Д., Сюрмайер Д. Дж. (2013). Уязвимость нейронов, патогенез и болезнь Паркинсона. Mov. Disord. 28, 41–50. DOI: 10.1002 / mds.25095

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиенг, В., Стоппини, Л., Вилли, С., Фати, М., Дюбуа-Дофин, М., и Краузе, К.-Х. (2014). Конструирование органоидов среднего мозга, содержащих долгоживущие дофаминергические нейроны. Stem Cells Dev. 23, 1–32. DOI: 10.1089 / scd.2013.0442

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Трухильо, К. А., Муотри, А. Р. (2018). Органоиды головного мозга и изучение развития нервной системы. Trends Mol. Med. 24, 982–990. DOI: 10.1016 / j.molmed.2018.09.005

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, X., Аллен, В. Э., Райт, М. А., Силвестрак, Э. Л., Самусик, Н., Везуна, С. и др. (2018). Трехмерное секвенирование интактных тканей транскрипционных состояний отдельных клеток. Наука 361, 1–9. DOI: 10.1126 / science.aat5691

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, Ю., Чжу, Ю., и Цинь, Дж. (2018). Органоид на чипе человеческого мозга для моделирования пренатального воздействия никотина. Lab. Чип 18, 851–860. DOI: 10.1039 / C7LC01084B

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уэллс, М.Ф., Салик, М. Р., Вискоу, О., Хо, Д. Дж., Уоррингер, К. А., Ихри, Р. Дж. И др. (2016). Генетическое удаление AXL не защищает человеческие нейральные клетки-предшественники и церебральные органоиды от инфекции вирусом Зика. Стволовые клетки клетки 19, 703–708. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.11.011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уилсон, Э. С., и Ньюэлл-Литва, К. (2018). Модели стволовых клеток развития и дегенерации синапсов человека. Мол. Биол. Cell 29, 2913–2921.DOI: 10.1091 / mbc.E18-04-0222

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сюй, Ю., Ян, Дж., И Шан, Х. (2016). Мета-анализ факторов риска деменции при болезни Паркинсона. Пер. Neurodegener. 5:11. DOI: 10.1186 / s40035-016-0058-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., and Sulzer, D. (2003). Нейромеланин черной субстанции: нейрональная черная дыра с защитными и токсическими характеристиками. Trends Neurosci. 26, 578–580. DOI: 10.1016 / j.tins.2003.08.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Органоид — обзор | Темы ScienceDirect

Подходы на основе синтетических каркасов с использованием органоидных единиц

Использование органоидных единиц, которые сохраняют важные эпителиально-мезенхимальные взаимодействия между клетками при восстановлении кишечной ткани, представляет собой крупный прогресс в инженерии тонкого кишечника. Эти уникальные кластеры клеток, получившие название эпителиальных органоидов , были впервые описаны Эвансом и Поттеном в начале 1990-х годов в попытке установить первичные культуры кишечных клеток (Evans et al., 1992). В своем первоначальном исследовании исследователи обнаружили, что ограниченное ферментативное переваривание кишечника новорожденных крыс с использованием неочищенной смеси коллагеназы XI и диспазы приводит к образованию многоклеточных агрегатов в ядре ворсинок, состоящих из функциональных эпителиальных клеток, мезенхимальной ткани и, возможно, стволовых клеток кишечника (рис. 46.1). Приблизительно 50 000 единиц органоида, каждая приблизительно 100–200 микрон в диаметре, может быть выделено в кишечнике новорожденных крыс. In vitro культура этих органоидов была продемонстрирована в течение до 14 дней.

РИС. 46.1. Поперечный срез изолированных органоидных единиц эпителия тонкой кишки, полученных от новорожденных крыс после окрашивания гематоксилином и эозином (столбик, 35 мкм). Целостность между компартментом эпителиальных клеток и лежащим под ним стромальным ядром собственной пластинки сохраняется. Из Tait et al. (1994a), стр. 94.

В последующих экспериментах эти органоидные единицы тонкого кишечника использовали для регенерации структур, подобных тонкому кишечнику, in vivo, , в отсутствие биоразлагаемых каркасов.Это было впервые продемонстрировано, когда органоидные единицы были имплантированы подкожно модели грызунов (Tait et al. , 1994a). Затем Таит и Эванс показали, что эти органоидные единицы могут быть использованы для регенерации новообразования с типичной морфологией тонкого кишечника и активностью пищеварительных ферментов при посеве на мукозэктомированную толстую кишку взрослых крыс (Tait et al. , 1994b, 1995). Напротив, контрольная толстая кишка, подвергшаяся мукозэктомии без имплантации органоида, не показала повторного роста эпителия.Совсем недавно, в попытке разработать лечение мальабсорбции желчных кислот, Стельцнер и его коллеги трансплантировали органоидные единицы, полученные из подвздошной кишки крысы, на оголенные сегменты тощей кишки и показали повышенное поглощение желчных кислот, а также повышенную экспрессию белка-транспортера желчных кислот в подвздошной кишке. неоилеальный сегмент (Avansino et al. , 2005).

Успешный посев органоидных единиц тонкой кишки на биоразлагаемые каркасы был впервые продемонстрирован Чой в нашей лаборатории.В ее первоначальной работе органоидные единицы, полученные из кишечника новорожденных крыс, были засеяны на нетканые пробирки из PGA. Каждая пробирка была высокопористой (например, 95%) и имела средний размер пор 250 микрон, чтобы соответствовать размеру этих кластеров клеток (Choi and Vacanti, 1997). На внешнюю поверхность каркаса напыляли 5% поли-L-молочной кислоты, чтобы помочь повысить устойчивость к силам сжатия, которые в противном случае привели бы к коллапсу просвета после имплантации. На заключительном этапе процесса изготовления каркаса трубки были покрыты коллагеном I типа для улучшения прикрепления органоидных единиц (рис.46.2). Затем засеянные конструкции имплантировали в сальник сингенных взрослых крыс, чтобы обеспечить прорастание сосудов. Уже через две недели после имплантации собранные конструкции напоминали кисты, выстланные новообразованием, состоящим из столбчатого эпителия с бокаловидными клетками и клетками Панета (рис. 46.3). Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание на альфа-актин гладких мышц было положительным в строме, прилегающей к неомукозе, что указывает на соответствующее восстановление слоя гладких мышц кишечника (рис.46,4). Используя краситель S100, в этих конструкциях также были обнаружены нейрональные клетки. Иммунофлуоресцентное окрашивание новой слизистой оболочки выявило апикальную экспрессию ферментов щеточной каймы, а также базолатеральное окрашивание ламинина (Choi et al., 1998). Исследования сконструированных конструкций с помощью камеры Уссинга показали аналогичное снижение активного трансэпителиального сопротивления по сравнению с естественным тонким кишечником, что соответствует основным функциональным критериям кишечного эпителия. Таким образом, впервые в этих исследованиях был установлен надежный подход к созданию ткани на биоразлагаемом каркасе, которая имела поразительное сходство с нативной полнослойной слизистой оболочкой тонкой кишки.

РИС. 46.2. ( A ) Общий вид трубчатого каркаса, состоящего из полигликолевой кислоты (PGA) и обработанного 5% полимолочной кислоты. Сканирующая электронная микрофотография полимера-PGA до ( B ) и после ( C ) покрытия коллагеном типа I (исходное увеличение, × 100). Черная стрелка отмечает коллаген, покрывающий полимер и заполняющий промежутки между волокнами. Из Choi et al. (1998), стр. 993.

РИС. 46.3. Общий вид типичной тканевой кисты тонкой кишки, взятой из сальника взрослой крысы через четыре недели.Из Grikscheit et al. (2004), стр. 751.

РИС. 46.4. Микрофотография окрашенной гематоксилином и эозином ткани тонкого кишечника крысы через 10 недель после резекции тонкой кишки и анастомоза из стороны в сторону (исходное увеличение × 80). L — просвет кисты; SM, гладкая мускулатура. Из Kim et al. (1999b), стр. 11.

В последующие годы наша лаборатория детально исследовала органоидный подход к конструированию кист тонкого кишечника. Продолжительное культивирование in vitro этих клеток в течение нескольких дней или недель не привело к лучшим результатам по сравнению с имплантацией в течение нескольких часов после выделения органоидных единиц.Тем не менее, другие модификации этого протокола оказались успешными в создании более прочной новой слизистой оболочки кишечника. Например, анастомоз «бок в бок» и «конец в конец» инженерной кишки с нативной тощей кишкой улучшает гистологию этих кист, когда собирают грызунов в срок до 10 недель после операции (рис. 46.5) (Kaihara et al. , 1999a , 1999b; Kim et al. , 1999). Повышенные регенеративные стимулы, вызванные резекцией тонкой кишки и, в меньшей степени, портокавальным шунтированием, также показали, что при морфометрическом анализе усиливают формирование тканевой инженерии кишечника.Эти результаты предполагают возможную роль трофических факторов, таких как фактор роста гепатоцитов (HGF) и эпидермальный фактор роста (EGF), в росте новообразований (Kim et al. , 1999). Прорастание этих искусственно созданных кишечных трансплантатов сохраняется до 36 недель (Kaihara et al. , 2000). Благодаря продолжающемуся сотрудничеству с Вангом и его коллегами мы смогли дополнительно охарактеризовать степень ангиогенеза и лимфангиогенеза в этих тканевых трансплантатах (Gardner-Thorpe et al., 2003; Даксбери и др. , 2004).

РИС. 46,5. (A) Общий вид тонкой кишки крысы с тканевой инженерией после анастомоза из стороны в сторону с естественной тонкой кишкой во время сбора урожая (черная стрелка обозначает тканевую тонкую кишку). ( B ) Поперечное сечение открытого анастомоза между тканеинженерной конструкцией и нативной тонкой кишкой (столбик, 5 мм). Из Kim et al. (1999b), стр. 9.

Используя небольшую модификацию протокола выделения органоидных единиц, наша лаборатория недавно показала, что эти кишечные кисты, когда анастомозируют бок в бок с нативным кишечником после 85% энтерэктомии реципиента, могут замедлять время прохождения кишечника. и улучшить набор веса по сравнению с крысами, которым была выполнена энтерэктомия без тканевой замены (Grikscheit et al., 2004). Эти данные свидетельствуют о том, что тканевые кишечные кисты размером всего 10% от длины нативного тонкого кишечника могут быть достаточными для обеспечения адекватной абсорбционной функции в модели на крысах. В свете этих многообещающих результатов мы начали некоторые исследования на крупных животных с использованием подхода органоидных единиц, и с тех пор продемонстрировали успешное создание тканевой инженерии тонкой кишки на модели молодых свиней (рис. 46.6, ранее не публиковавшееся).

РИС. 46.6. Микрофотография окрашенной гематоксилином и эозином тонкой кишки с тканевой инженерией, полученной из сальника через семь недель в модели молодых свиней (исходное увеличение, × 200).Неопубликованные данные любезно предоставлены Трейси С. Грикшайт и Эрин Р. Очоа.

Сконструированные кишечные кисты также предоставили уникальную экспериментальную модельную систему для изучения морфогенеза кишечника. Например, в анастомозированных тканевых кистах тонкой кишки, собранных через 20 недель, плотность и топографическое распределение субпопуляций иммунных клеток, а именно Т-клеток, В-клеток и NK-клеток, были идентичны таковым в нормальной тощей кишке. (Перес и др. , 2002). Более того, эти плотности популяции иммуноцитов были только рудиментарными в неанастомозированных кистах.Эти данные предполагают, что воздействие просветных стимулов может иметь решающее значение для формирования иммунной системы слизистой оболочки.

Также было показано, что анастомоз кишечных кист с нативным кишечником усиливает экспрессию натрийзависимого переносчика глюкозы, SGLT1 (Tavakkolizadeh et al. , 2003). Рост слизистой оболочки и экспрессия SGLT1 также могут быть увеличены в этой модели, если крысам вводят глюкогоноподобный пептид 2 (GLP-2), эндогенный регуляторный пептид, который обладает мощной трофической активностью, специфичной для слизистой оболочки кишечника (Ramsanahie et al., 2003). Биоматериалы третьего поколения, которые могут быть разработаны для контролируемого высвобождения веществ, встроенных в биоразлагаемый каркас, использовались в других приложениях тканевой инженерии и могут быть подходом для создания более устойчивого роста новообразований кишечника в нашей модели (Kent Leach et al. др. , 2006).

Хотя органоидные единицы оказались весьма успешными в восстановлении свойств нативной слизистой оболочки тонкого кишечника, важно осознавать ограничения этой стратегии в том виде, в каком она выполняется в настоящее время.Например, несмотря на использование трубчатых каркасов на основе PGA, эти кишечные конструкции образуют не цилиндрические трубки, а, скорее, сплюснутые сфероиды, напоминающие кисты удвоения кишечника. Это явление происходит, по крайней мере частично, из-за повышенного внутрипросветного давления, когда кишечная слизистая оболочка регенерируется и вырабатывает секреты. Кроме того, очевидно, что PGA не обладает достаточной механической прочностью, чтобы выдерживать повышенное внутрипросветное давление, несмотря на время разложения примерно шесть недель.Несмотря на это, результирующая сплюснутая сфероидная архитектура предполагает, что значимая и скоординированная перистальтика внутри значительной конструкции маловероятна, даже при наличии иннервируемого слоя гладких мышц. Способы декомпрессии просвета в процессе регенерации кишечного эпителия могут быть полезны для создания более желательной архитектуры. Кроме того, использование новых биоматериалов, которые имеют более благоприятные механические характеристики и характеристики разложения, может позволить лучше контролировать трехмерную геометрию неоинтестина.Исследования с использованием альтернативных каркасов, таких как поли (эпсилонкапролактон) (PCL) и поли (сложноэфирный уретан) мочевина (PEUU), продолжаются в нашей лаборатории, и первые данные являются многообещающими.

Другим ограничением подхода органоидных единиц к созданию тканевой инженерии тонкой кишки является неспособность последовательно увеличивать эти кластеры клеток ex vivo , как было первоначально описано Evans et al. В настоящее время для создания кишечной конструкции с использованием сальника в качестве биореактора in vivo требуется относительно большое количество органоидных единиц (приблизительно 15000 см 2 ).К сожалению, нам не удалось культивировать нормальные органоидные единицы более недели in vitro. Трансформированные линии эпителиальных клеток технически могут быть использованы для тканевой инженерии тонкого кишечника, но это нежелательно, поскольку они не являются ни аутологичными, ни нормальными эпителиальными клетками.

Об интригующей вариации подхода органоидных единиц к инженерии ткани тонкого кишечника недавно сообщил Ллойд и его группа в Великобритании (Lloyd et al. , 2006). В этом исследовании они имплантировали крысам подкожно трубчатые вспененные каркасы из полилактид-гликолида (PGLA).PLGA имел толщину 2 мм и поддерживался внутренней силиконовой трубкой. Через пять недель силиконовая трубка была удалена, и просвет был заполнен органоидными единицами кишечника, суспендированными в гидрогеле, содержащем HGF. Все конструкции, которые были исследованы через четыре недели, выявили сфероидные кисты с признаками слизистой оболочки кишечника в просвете. Потенциальным преимуществом этого подхода является очевидная эффективность, с помощью которой новообразование может быть получено из данного образца донорской ткани. Тем не менее, существует ряд сбивающих с толку факторов (например,g., гидрогель, введение фактора роста), что также может объяснить положительные результаты в этом исследовании. Остается неясным, присутствовали ли какие-либо гладкие мышцы в этих конструкциях при сборе урожая. Кроме того, как мы уже обсуждали, общая сферическая архитектура этих инженерных кишечных трансплантатов остается далеко не идеальной.

Персонализированная медицина на основе органоидов: от кабинета до постели больного | Cell Regeneration

  • Adli M. Набор инструментов CRISPR для редактирования генома и не только.Nat Commun. 2018; 9 (1): 1911.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • Андерссон Э. Р., Чивукула И. В., Ханкеова С., Сьёквист М., Цой Ю. Л., Рамскельд Д., Масек Дж., Эльмансури А., Хугендорн А., Васкес Е. и др. Мышиная модель синдрома Алажиля и механизмы миссенс-мутаций Jagged1. Гастроэнтерология. 2018; 154 (4): 1080–95.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Бэ Дж. М., Ким Дж. Х.Канг Г. Х. Молекулярные подтипы колоректального рака и их клинико-патологические особенности, с акцентом на зазубренный путь неоплазии. Arch Pathol Lab Med. 2016; 140 (5): 406–12.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Бэгли Дж. А., Рейман Д., Биан С., Леви-Стросс Дж. Кноблих Дж. А. Взаимодействия модели слитых церебральных органоидов между областями мозга. Природные методы. 2017; 14 (7): 743–51.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Баркер Н., Хуч М., Куяла П., ван де Ветеринг М., Снапперт Х. Дж., Ван Эс Дж. Х., Сато Т., Штанге Д. Е., Бегтель Х., ван ден Борн М. и др.Стволовые клетки Lgr5 (+ ve) стимулируют самообновление в желудке и создают долгоживущие желудочные единицы in vitro. Стволовая клетка клетки. 2010. 6 (1): 25–36.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Баркер Н., ван Эс Дж. Х., Койперс Дж., Куяла П., ван ден Борн М., Козейнсен М., Хэгебарт А., Корвинг Дж., Бегтель Х., Петерс П. Дж. И др. Идентификация стволовых клеток тонкой и толстой кишки по маркерному гену Lgr5. Природа. 2007. 449 (7165): 1003–7.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Бартфельд С., Байрам Т., ван де Ветеринг М., Хуч М., Бегтель Х., Куяла П., Фрис Р., Петерс П.Дж., Клеверс Х.Экспансия in vitro эпителиальных стволовых клеток желудка человека и их ответы на бактериальную инфекцию. Гастроэнтерология. 2015; 148 (1): 126–36.e6.

    PubMed Статья Google ученый

  • Basak O, Beumer J, Wiebrands K, Seno H, van Oudenaarden A, Clevers H. Индуцированное покой Lgr5 + стволовых клеток в органоидах кишечника позволяет дифференцировать гормон-продуцирующие энтероэндокринные клетки. Стволовая клетка клетки. 2017; 20 (2): 177–90.e4.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Беркерс Г., ван Моурик П., Вонк А.М., Круиссельбринк Э., Деккерс Дж. Ф., де Винтер-де Гроот К.М., Аретс HGM, дер Уилт РЭП М.В., Дейкема Дж.С., Вандершурен М.М. и др. Органоиды прямой кишки позволяют индивидуально лечить муковисцидоз. Cell Rep. 2019; 26 (7): 1701–1708.e3.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Берштейн М., Новаковски Т.Дж., Пыльца А.А., Ди Лулло Э., Нене А., Виншоу-Борис А., Кригштейн А.Р.Церебральные органоиды, полученные из ИПСК человека, моделируют клеточные особенности лиссэнцефалии и выявляют длительный митоз наружной радиальной глии. Стволовая клетка клетки. 2017; 20 (4): 435–449.e4.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Бьюмер Дж., Артегиани Б., Пост Y, Рейманн Ф., Гриббл Ф., Нгуен Т.Н., Зенг Х., Ван ден Борн М., Ван Эс Дж. Х. Энтероэндокринные клетки Clevers H переключают экспрессию гормона по сигнальному градиенту BMP от крипты к ворсинкам.Nat Cell Biol. 2018; 20 (8): 909–16.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Бьюмер Дж., Пушхоф Дж., Бауза-Мартинес Дж., Мартинес-Сильгадо А., Эльментайте Р., Джеймс К. Р., Росс А., Хендрикс Д., Артегиани Б., Бюсслингер Г. А. и др. Атлас мРНК высокого разрешения и секретома энтероэндокринных клеток человека. Клетка. 2020; 181 (6): 1291–306.e19.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Бигорн А.Е., Фарин Х.Ф., Лемуан Р., Махлауи Н., Ламберт Н., Гил М., Шульц А., Филиппет П., Шлессер П., Абрахамсен Т.Г. и др.Мутации TTC7A нарушают апикобазальную полярность кишечного эпителия. J Clin Invest. 2014. 124 (1): 328–37.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Бирей Ф., Андерсен Дж., Макинсон С.Д., Ислам С., Вей В., Хубер Н., Фан Х.С., Мецлер КРК, Панайотакос Дж., Том Н. и др. Сборка функционально интегрированных сфероидов переднего мозга человека. Природа. 2017; 545 (7652): 54–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Blokzijl F, de Ligt J, Jager M, Sasselli V, Roerink S, Sasaki N, Huch M, Boymans S, Kuijk E, Prins P, et al.Накопление тканеспецифических мутаций в стволовых клетках взрослого человека в течение жизни. Природа. 2016; 538 (7624): 260–4.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Boers SN, van Delden JJM. Бреденоорд А.Л. Широкое согласие — это согласие на управление. Am J Bioeth. 2015; 15 (9): 53–5.

    PubMed Статья Google ученый

  • Бол Д.Л., Бреннан округ Колумбия.BK-вирусная нефропатия и трансплантация почки. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2 (Приложение 1): S36–46.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Boj SF, Hwang C-I, Baker LA, Chio IIC, Engle DD, Corbo V, Jager M, Ponz-Sarvise M, Tiriac H, Spector MS и др. Органоидные модели протокового рака поджелудочной железы человека и мыши. Клетка. 2015; 160 (1-2): 324–38.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Bredenoord AL, Clevers H, Knoblich JA.Человеческие ткани в блюде: исследования и этические последствия органоидной технологии. Наука. 2017; 355 (6322): eaaf9414.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Broutier L, Mastrogiovanni G, Verstegen MM, Francies HE, Gavarró LM, Bradshaw CR, Allen GE, Arnes-Benito R, Sidorova O, Gaspersz MP, et al. Культуры органоидов, полученных из первичного рака печени человека, для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Nat Med. 2017; 23 (12): 1424–35.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Бирн А.Т., Альферес Д.Г., Амант Ф., Аннибали Д., Аррибас Дж., Бианкин А.В., Бруна А., Будинска Е., Калдас С., Чанг Д.К. и др. Изучение открытых вопросов точной медицины рака с использованием ксенотрансплантатов, полученных от пациентов. Нат Рев Рак. 2017; 17 (4): 254–68.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Атлас генома рака Research N.Комплексная молекулярная характеристика аденокарциномы желудка. Природа. 2014. 513 (7517): 202–9.

    Артикул CAS Google ученый

  • Checkley W., White AC Jr, Jaganath D, Arrowood MJ, Chalmers RM, Chen X-M, Fayer R, Griffiths JK, Guerrant RL, Hedstrom L, et al. Обзор глобального бремени, новых диагностических средств, терапевтических средств и целей вакцины против криптоспоридиума. Lancet Infect Dis. 2015; 15 (1): 85–94.

    PubMed Статья Google ученый

  • Чен К.Г., Мэллон Б.С., Маккей РДГ.Роби П.Г. Культура плюрипотентных стволовых клеток человека: рекомендации по поддержанию, распространению и терапии. Стволовая клетка клетки. 2014. 14 (1): 13–26.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Chen Y-W, Huang SX, de Carvalho ALRT, Ho S-H, Islam MN, Volpi S, Notarangelo LD, Ciancanelli M, Casanova J-L, Bhattacharya J, et al. Трехмерная модель развития легких человека и заболевания на основе плюрипотентных стволовых клеток.Nat Cell Biol. 2017; 19 (5): 542–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Вишня ABC. Дейли Г. К. Репрограммирование идентичности клеток для регенеративной медицины. Клетка. 2012. 148 (6): 1110–22.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Chio IIC, Jafarnejad SM, Ponz-Sarvise M, Park Y, Rivera K, Palm W, Wilson J, Sangar V, Hao Y, Öhlund D, et al.NRF2 способствует поддержанию опухоли путем модуляции трансляции мРНК при раке поджелудочной железы. Клетка. 2016; 166 (4): 963–76.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Chua ACY, Ananthanarayanan A, Ong JJY, Wong JY, Yip A, Singh NH, Qu Y, Dembele L, McMillian M, Ubalee R, et al. Сфероиды печени используются в качестве модели in vitro для изучения рецидива малярии. Биоматериалы. 2019; 216: 119221.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Чуа С.В., Шибата М., Лей М., Тойванен Р., Барлоу Л.Дж., Бергрен С.К., Бадани К.К., Маккирнан Дж.М., Бенсон М.С., Хибшош Х. и др.Единичные просветные эпителиальные предшественники могут генерировать органоиды простаты в культуре. Nat Cell Biol. 2014; 16 (10): 951–4.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Клеверс Х. Кишечный крипта, прототип стволовых клеток. Клетка. 2013. 154 (2): 274–84.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Клеверс Х. Моделирование развития и болезней с органоидами.Клетка. 2016; 165 (7): 1586–97.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Creff J, Courson R, Mangeat T, Foncy J, Souleille S, Thibault C, Besson A, Malaquin L. Изготовление трехмерных каркасов, воспроизводящих топографию кишечного эпителия с помощью трехмерной стереолитографии высокого разрешения. Биоматериалы. 2019; 221: 119404.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Cruz NM, Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, Winston K, Tran LM, Diaz MA, Fu H, et al.Органоидный цистогенез показывает критическую роль микросреды в поликистозе почек человека. Nat Mater. 2017; 16 (11): 1112–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Cugola FR, Fernandes IR, Russo FB, Freitas BC, Dias JLM, Guimarães KP, Benazzato C, Almeida N, Pignatari GC, Romero S, et al. Бразильский штамм вируса Зика вызывает врожденные дефекты в экспериментальных моделях. Природа. 2016; 534 (7606): 267–71.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Раскрой GR. Генетика муковисцидоза: от молекулярного понимания до клинического применения. Nat Rev Genet. 2015; 16 (1): 45–56.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Данг Дж., Тивари С.К., Личинчи Г., Цинь Ю, Патил В.С., Ерошкин А.М. Вирус Зика Rana TM истощает нервные клетки-предшественники в церебральных органоидах человека посредством активации врожденного иммунного рецептора TLR3.Стволовая клетка клетки. 2016; 19 (2): 258–65.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • де Соуза и Мело Ф., Куртова А.В., Харносс Дж. М., Клявин Н., Хук Дж. Д., Хунг Дж., Андерсон Дж. Э., Сторм Е. Е., Модрусан З, Кеппен Х и др. Особая роль стволовых клеток Lgr5 (+) в первичном и метастатическом раке толстой кишки. Природа. 2017; 543 (7647): 676–80.

    Артикул CAS Google ученый

  • Деккерс Дж. Ф., Беркерс Дж., Круиссельбринк Э., Вонк А., де Йонге Х. Р., Янссенс Х. М., Бронсвельд I, ван де Грааф Э. А., Ньювенхуис Э.С., Хаувен Р. Х. Дж. И др.Характеристика ответов на препараты, модулирующие CFTR, с использованием ректальных органоидов, полученных от субъектов с муковисцидозом. Sci Transl Med. 2016; 8 (344): 344ra84.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Dekkers JF, Whittle JR, Vaillant F, Chen H-R, Dawson C, Liu K, Geurts M, Herold MJ, Clevers H, Lindeman GJ, et al. Моделирование рака груди с использованием CRISPR / Cas9-опосредованной инженерии органоидов груди человека. J Natl Cancer Inst.2019. https://doi.org/10.1093/jnci/djz196.

  • Dekkers JF, Wiegerinck CL, de Jonge HR, Bronsveld I, Janssens HM, de Winter-de Groot KM, Brandsma AM, de Jong NWM, Bijvelds MJC, Scholte BJ, et al. Функциональный анализ CFTR с использованием кишечных органоидов первичного муковисцидоза. Nat Med. 2013. 19 (7): 939–45.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Дейкстра К.К., Каттанео С.М., Вебер Ф., Чалаби М., ван де Хаар Дж., Фанчи Л.Ф., Слагтер М., ван дер Фельден Д.Л., Кайнг С., Келдерман С. и др.Генерация опухолевых Т-клеток путем совместного культивирования лимфоцитов периферической крови и органоидов опухоли. Клетка. 2018; 174 (6): 1586–98.e12.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • ДиМарко Р.Л., Су Дж., Ян К.С., Деви Р., Куо С.Дж. Хейлшорн С.К. Разработка трехмерной микросреды для стимулирования сократительного поведения первичных органоидов кишечника. Интегр Биол (Камб). 2014; 6 (2): 127–42.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Дриехуис Э.Clevers H CRISPR-индуцированные слияния генов TMPRSS2-ERG в органоидах простаты мышей. JSM Biotechnol Biomed Eng. 2017; 4 (1): 1076.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • Дриехуис Э., Колдерс С., Спелье С., Лыхмуссаар К., Виллемс С.М., Девриезе Л.А., де Бри Р., де Руйтер Э. Дж., Корвинг Дж., Бегтель Х. и др. Органоиды слизистой оболочки полости рта как потенциальная платформа для персонализированной терапии рака. Рак Discov. 2019a; 9 (7): 852–71.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Driehuis E, Spelier S, Beltrán Hernández I, de Bree R, Willems SM, Clevers H, Oliveira S.Органоиды рака головы и шеи, полученные от пациентов, воспроизводят уровни экспрессии egfr в ​​соответствующих тканях и реагируют на фотодинамическую терапию, направленную на egfr. J Clin Med. 2019б; 8 (11): 1880.

    CAS PubMed Central Статья PubMed Google ученый

  • Driehuis E, van Hoeck A, Moore K, Kolders S, Francies HE, Gulersonmez MC, Stigter ECA, Burgering B, Geurts V, Gracanin A, et al. Органоиды рака поджелудочной железы повторяют болезнь и позволяют проводить индивидуальный скрининг лекарств.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2019c; 116 (52): 26580–90.

    CAS PubMed Central Статья PubMed Google ученый

  • Дрост Дж. Клеверс Х. Органоиды в исследованиях рака. Нат Рев Рак. 2018; 18 (7): 407–18.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Drost J, van Boxtel R, Blokzijl F, Mizutani T, Sasaki N, Sasselli V, de Ligt J, Behjati S, Grolleman JE, van Wezel T, et al.Использование CRISPR-модифицированных органоидов стволовых клеток человека для изучения происхождения мутационных сигнатур при раке. Наука. 2017; 358 (6360): 234–8.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Drost J, van Jaarsveld RH, Ponsioen B, Zimberlin C, van Boxtel R, Buijs A, Sachs N, Overmeer RM, Offerhaus GJ, Begthel H, et al. Последовательные мутации рака в культивируемых стволовых клетках кишечника человека. Природа. 2015; 521 (7550): 43–7.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Эйраку М. Сасай Ю. Самообразование слоистых нервных структур в трехмерной культуре ES-клеток. Curr Opin Neurobiol. 2012; 22 (5): 768–77.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Eiraku M, Watanabe K, Matsuo-Takasaki M, Kawada M, Yonemura S, Matsumura M, Wataya T, Nishiyama A, Muguruma K.Sasai Y. Самоорганизованное формирование поляризованных корковых тканей из ЭСК и его активное манипулирование внешними сигналами. Стволовая клетка клетки. 2008. 3 (5): 519–32.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Энгевик М.А., Энгевик К.А., Яцишин М.Б., Ван Дж., Хассетт Д.Д., Дариен Б., Яцишин Б.Р. Worrell RT Инфекция человека Clostridium difficile: ингибирование NHE3 и профиля микробиоты. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2015; 308 (6): G497–509.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Ettayebi K, Crawford SE, Murakami K, Broughman JR, Karandikar U, Tenge VR, Neill FH, Blutt SE, Zeng X-L, Qu L, et al. Репликация норовирусов человека в энтероидах человека, полученных из стволовых клеток. Наука. 2016; 353 (6306): 1387–93.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ферколь Т. Шрауфнагель D Глобальное бремя респираторных заболеваний.Ann Am Thorac Soc. 2014. 11 (3): 404–6.

    PubMed Статья Google ученый

  • Фесслер Э., Дрост Дж., Ван Хофф С.Р., Линнекамп Дж.Ф., Ван Х, Янсен М., Де Соуза Э. Мело Ф., Прасетянти П.Р., Айспеерт Дж.Э., Франица М. и др. Передача сигналов TGFβ направляет зубчатые аденомы к подтипу мезенхимального колоректального рака. EMBO Mol Med. 2016; 8 (7): 745–60.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Finkbeiner SR, Zeng X-L, Utama B, Atmar RL, Shroyer NF, Estes MK.Органические кишечные органоиды человека, полученные из стволовых клеток, как модель инфекции ротавирусов. mBio. 2012; 3 (4): e00159.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ферт А.Л., Менон Т., Паркер Г.С., Куоллс С.Дж., Льюис Б.М., Ке Э., Даргиц К.Т., Райт Р., Ханна А., Гейдж Ф.Х. и др. Функциональная коррекция генов кистозного фиброза в эпителиальных клетках легких, полученных из ИПСК пациентов. Cell Rep. 2015; 12 (9): 1385–90.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Форбестер Дж. Л., Гулдинг Д., Валлье Л., Ханнан Н., Хейл С., Пикард Д., Мухопадхьяй С.Дуган Г. Взаимодействие Salmonella enterica Serovar Typhimurium с кишечными органоидами, полученными из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Заражение иммунной. 2015; 83 (7): 2926–34.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, Saad AF, Li MK, Hughes MR, Werff RV и др. Моделирование заболевания почек с помощью CRISPR-мутантных почечных органоидов, полученных из плюрипотентных сфероидов эпибласта человека.Nat Commun. 2015; 6: 8715.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Fujii M, Shimokawa M, Date S, Takano A, Matano M, Nanki K, Ohta Y, Toshimitsu K, Nakazato Y, Kawasaki K и др. Библиотека органоидов колоректальной опухоли демонстрирует прогрессирующую потерю потребности в факторах ниши во время онкогенеза. Стволовая клетка клетки. 2016; 18 (6): 827–38.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Fulcher ML, Gabriel S, Burns KA, Yankaskas JR, Randell SH.Хорошо дифференцированные культуры эпителиальных клеток дыхательных путей человека. Методы Mol Med. 2005; 107: 183–206.

    CAS PubMed Google ученый

  • Fumagalli A, Drost J, Suijkerbuijk SJE, van Boxtel R, de Ligt J, Offerhaus GJ, Begthel H, Beerling E, Tan EH, Sansom OJ и др. Генетическое вскрытие прогрессирования колоректального рака путем ортотопической трансплантации сконструированных органоидов рака. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2017; 114 (12): E2357 – E64.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Габриэль Э, Рамани А., Каров Ю., Готтардо М., Натараджан К., Гуи Л. М., Горанчи-Бужала Г., Крут О., Петерс Ф., Николич М. и др. Последние изоляты вируса Зика вызывают преждевременную дифференцировку нейральных предшественников в органоидах головного мозга человека. Стволовая клетка клетки. 2017; 20 (3): 397–406..e5.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Ganesh K, Wu C, O’Rourke KP, Szeglin BC, Zheng Y, Sauvé C-EG, Adileh M, Wasserman I, Marco MR, Kim AS, et al.Платформа органоидов рака прямой кишки для изучения индивидуальных ответов на химиолучевую терапию. Nat Med. 2019; 25 (10): 1607–14.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Гао Д., Вела I, Сбонер А., Яквинта П.Дж., Картхаус В.Р., Гопалан А., Даулинг С., Ванджала Д.Н., Ундвалл Е.А., Арора В.К. и др. Культуры органоидов, полученные от пациентов с распространенным раком простаты. Клетка. 2014. 159 (1): 176–87.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Garcez PP, Loiola EC, Madeiro da Costa R, Higa LM, Trindade P, Delvecchio R, Nascimento JM, Brindeiro R, Tanuri A, Rehen SK.Вирус Зика нарушает рост нейросфер человека и органоидов головного мозга. Наука. 2016; 352 (6287): 816–8.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Giandomenico SL, Mierau SB, Gibbons GM, Wenger LMD, Masullo L, Sit T, Sutcliffe M, Boulanger J. Tripodi M Церебральные органоиды на границе раздела воздух-жидкость генерируют разнообразные нервные пути с функциональной отдачей. Nat Neurosci. 2019; 22 (4): 669–79.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Gjorevski N, Sachs N, Manfrin A, Giger S, Bragina ME, Ordóñez-Morán P, Clevers H.Lutolf MP Конструктор матриц для культивирования кишечных стволовых клеток и органоидов. Природа. 2016; 539 (7630): 560–4.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Гуань И, Сюй Д., Гарфин П.М., Эхмер У, Гурвиц М., Эннс Дж., Мичи С., Ву М., Чжэн М., Нишимура Т. и др. Органоиды печени человека для анализа генетических заболеваний человека. JCI Insight. 2017; 2 (17): e

    .

    PubMed Central Статья PubMed Google ученый

  • Heo I, Dutta D, Schaefer DA, Iakobachvili N, Artegiani B, Sachs N, Boonekamp KE, Bowden G, Hendrickx APA, Willems RJL, et al.Моделирование инфекции Cryptosporidium в органоидах тонкой кишки и легких человека. Nat Microbiol. 2018; 3 (7): 814–23.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Hill SJ, Decker B, Roberts EA, Horowitz NS, Muto MG, Worley MJ Jr, Feltmate CM, Nucci MR, Swisher EM, Nguyen H, et al. Прогнозирование ответа ингибитора репарации ДНК в органоидах рака яичников, полученных в краткосрочном периоде у пациентов. Рак Discov. 2018; 8 (11): 1404–21.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Hirsch HH, Brennan DC, Drachenberg CB, Ginevri F, Gordon J, Limaye AP, Mihatsch MJ, Nickeleit V, Ramos E, Randhawa P, et al. Полиомавирусная нефропатия при трансплантации почки: междисциплинарный анализ и рекомендации. Трансплантация. 2005. 79 (10): 1277–86.

    PubMed Статья Google ученый

  • Homan KA, Gupta N, Kroll KT.Васкуляризация и созревание органоидов почек in vitro с усилением потока. Нат методы. 2019; 16 (3): 255–62.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ху Х, Гехарт Х, Артегиани Б., Лопес-Иглесиас С., Деккерс Ф, Басак О, ван Эс Дж., Чува де Соуза Лопес С. М., Бегтель Х, Корвинг Дж. И др. Долгосрочное расширение функциональных гепатоцитов мыши и человека в виде трехмерных органоидов. Клетка. 2018; 175 (6): 1591–606.e19.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Хуанг Дж.Й., Суини Э.Г., Сигал М, Чжан Х.С., Ремингтон С.Дж., Кантрелл М.А., Куо С.Дж., Гийемин К.Амиева М.Р. Хемодетекция и разрушение мочевины хозяина позволяет Helicobacter pylori обнаруживать эпителий. Клеточный микроб-хозяин. 2015a; 18 (2): 147–56.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Хуанг Л., Хольцингер А., Джаган I, Бегора М., Лозе I, Нгаи Н., Ностро С., Ван Р., Мутусвами Л. Б., Кроуфорд Х. С. и др. Моделирование протокового рака поджелудочной железы и скрининг лекарств с использованием опухолевых органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека и пациентов.Nat Med. 2015b; 21 (11): 1364–71.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Hubert CG, Rivera M, Spangler LC, Wu Q, Mack SC, Prager BC, Couce M, McLendon RE, Sloan AE. Rich JN. Трехмерная система культивирования органоидов, полученная из глиобластом человека, воспроизводит гипоксические градиенты и гетерогенность раковых стволовых клеток опухолей, обнаруженных in vivo. Cancer Res. 2016; 76 (8): 2465–77.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Хуч М., Доррелл С., Бодж С.Ф., ван Эс Дж. Х., Ли ВМЗ, ван де Ветеринг М., Сато Т., Хамер К., Сасаки Н., Finegold MJ и др.Экспансия in vitro единичных Lgr5 + стволовых клеток печени, индуцированная регенерацией, управляемой Wnt. Природа. 2013. 494 (7436): 247–50.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Huch M, Gehart H, van Boxtel R, Hamer K, Blokzijl F, Verstegen MMA, Ellis E, van Wenum M, Fuchs SA, de Ligt J, et al. Долгосрочная культура геном-стабильных бипотентных стволовых клеток печени взрослого человека. Клетка. 2015; 160 (1-2): 299–312.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Хуэй КПЙ, Чинг РХХ, Чан СКХ, Николлс Дж. М., Сакс Н., Клеверс Х, Пейрис Дж. С. М..Chan MCW Тропизм, репликационная способность и врожденные иммунные ответы вируса гриппа: анализ органоидов дыхательных путей человека и культур бронхов ex vivo. Ланцет Респир Мед. 2018; 6 (11): 846–54.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Джейкоб Ф., Салинас Р.Д., Чжан Д.Й., PTT N, Шнолл Дж. Г., СЗХ В., Тхокала Р., Шейх С., Саксена Д., Прокоп С. и др. Созданная пациентом модель органоида глиобластомы и биобанк резюмируют меж- и внутриопухолевую гетерогенность.Клетка. 2020; 180 (1): 188–204.e22 ..

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Jaffe A, Mack SA, Lin Y, Mao WL, Neaton JB, Karunadasa HI. Высокая проводимость при сжатии в слоистом перовските Cu-Br. Angew Chem Int Ed Engl. 2019. https://doi.org/10.1002/anie.201

  • 5.

  • Джон Т., Колер Д., Пинтили М., Янагава Н., Фам Н.-А, Ли М., Панчал Д., Хуэй Ф., Мэн Ф., Шеперд Ф.А. и др. Способность формировать ксенотрансплантаты первичной опухоли позволяет прогнозировать повышенный риск рецидива заболевания при немелкоклеточном раке легкого на ранней стадии.Clin Cancer Res. 2011. 17 (1): 134–41.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Июнь CH. Sadelain M. Терапия с химерными антигенными рецепторами. N Engl J Med. 2018; 379 (1): 64–73.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Юнг П., Сато Т., Мерлос-Суарес А., Баррига Ф.М., Иглесиас М., Росселл Д., Ауэр Х., Галлардо М., Бласко М.А., Санчо Э. и др.Выделение и размножение стволовых клеток толстой кишки человека in vitro. Nat Med. 2011; 17 (10): 1225–7.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Канда М., Маттеи Х., Ву Дж., Хонг С.М., Ю Дж., Борхес М., Хрубан Р.Х., Майтра А., Кинзлер К., Фогельштейн Б. и др. Наличие соматических мутаций в большинстве ранних стадий интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы. Гастроэнтерология. 2012. 142 (4): 730–3.e9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Karthaus WR, Iaquinta PJ, Drost J, Gracanin A, van Boxtel R, Wongvipat J, Dowling CM, Gao D, Begthel H, Sachs N, et al.Идентификация мультипотентных клеток-предшественников просвета в культурах органоидов предстательной железы человека. Клетка. 2014. 159 (1): 163–75.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Kawasaki K, Fujii M, Sugimoto S, Ishikawa K, Matano M, Ohta Y, Toshimitsu K, Takahashi S, Hosoe N, Sekine S и др. Хромосомная инженерия органоидов, полученных из толстой кишки человека, для разработки модели традиционной зубчатой ​​аденомы. Гастроэнтерология.2020; 158 (3): 638–51.e8.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Kessler M, Hoffmann K, Brinkmann V, Thieck O, Jackisch S, Toelle B, Berger H, Mollenkopf H-J, Mangler M, Sehouli J, et al. Пути Notch и Wnt регулируют стволовость и дифференциацию органоидов фаллопиевых труб человека. Nat Commun. 2015; 6: 8989.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ким Ю.К., Рафаэли И., Брукс С.Р., Цзин П., Гулиева Р.Э., Хьюз М.Р., Круз Н.М., Лю Ю., Черчилль А.Дж., Ван Ю.и др.Отредактированные генами органоиды почек человека раскрывают механизмы заболевания в развитии подоцитов. Стволовые клетки. 2017; 35 (12): 2366–78.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Клаус Дж., Кантон С., Кироуси С., Айо-Мартин А.С., Ди Джаймо Р., Ризенберг С., О’Нил А.С., Кэмп Дж. Г., Токко С. Измененные траектории миграции нейронов в церебральных органоидах человека, полученные от людей с нейрональной гетеротопией . Nat Med.2019; 25 (4): 561–8.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Koike H, Iwasawa K, Ouchi R, Maezawa M, Giesbrecht K, Saiki N, Ferguson A, Kimura M, Thompson WL, Wells JM, et al. Моделирование органогенеза печени, желчевыводящих путей и поджелудочной железы человека на границе передней и средней кишки. Природа. 2019; 574 (7776): 112–6.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Komor AC, Badran AH.Лю Д.Р. Технологии на основе CRISPR для манипулирования геномами эукариот. Клетка. 2017; 168 (1-2): 20–36.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Kopper O, de Witte CJ, Lõhmussaar K, Valle-Inclan JE, Hami N, Kester L, Balgobind AV, Korving J, Proost N, Begthel H, et al. Платформа органоидов для рака яичников отражает неоднородность внутри и между пациентами. Nat Med. 2019; 25 (5): 838–49.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Курманн А.А., Серра М., Хокинс Ф., Ранкин С.А., Мори М., Астапова И., Уллас С., Лин С., Билодо М., Россант Дж. И др.Восстановление функции щитовидной железы путем трансплантации дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток. Стволовая клетка клетки. 2015; 17 (5): 527–42.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ламерс М.М., Бьюмер Дж. SARS-CoV-2 продуктивно инфицирует энтероциты кишечника человека. Наука. 2020; 369 (6499): 50–4.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Ланкастер, Массачусетс, Реннер М., Мартин С.А., Венцель Д., Бикнелл Л.С., Хёрлс М.Э., Хомфрей Т., Пеннингер Дж.М., Джексон А.П.Кноблич Ю.А. Церебральные органоиды моделируют развитие мозга человека и микроцефалию. Природа. 2013. 501 (7467): 373–9.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Lannagan TRM, Lee YK, Wang T, Roper J, Bettington ML, Fennell L, Vrbanac L, Jonavicius L, Somashekar R, Gieniec K, et al. Генетическое редактирование органоидов толстой кишки обеспечивает молекулярно отличную и ортотопическую доклиническую модель зубчатого канцерогенеза. Кишечник. 2019; 68 (4): 684–92.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Ли Дж., Снайдер Э.Р., Лю Й., Гу Х, Ван Дж., Флауэрс Б.М., Ким Й.Дж., Парк С., Сзот Г.Л., Хрубан Р.Х. и др. Восстановление развития интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы из первичных клеток протока поджелудочной железы человека. Nat Commun. 2017; 8: 14686.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ли С.Х., Ху В., Матулай Дж. Т., Сильва М. В., Овцарек Т. Б., Ким К., Чуа С. В., Барлоу Л. Дж., Кандот С., Уильямс А. Б. и др.Эволюция опухоли и лекарственный ответ на органоидных моделях рака мочевого пузыря, полученных от пациентов. Клетка. 2018; 173 (2): 515–28.e17.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Лесли Дж. Л., Хуанг С., Опп Дж. С., Надь М. С., Кобаяши М., Янг В. Б.. Спенс Дж. Р. Устойчивость и выработка токсинов Clostridium difficile в органоидах кишечника человека приводят к нарушению параклеточной барьерной функции эпителия. Заражение иммунной.2015; 83 (1): 138–45.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Li ML, Aggeler J, Farson DA, Hatier C, Hassell J. Bissell MJ Влияние воссозданной базальной мембраны и ее компонентов на экспрессию гена казеина и секрецию в эпителиальных клетках молочной железы мышей. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1987; 84 (1): 136–40.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Li X, Nadauld L, Ootani A, Corney DC, Pai RK, Gevaert O, Cantrell MA, Rack PG, Neal JT, Chan CWM, et al.Онкогенная трансформация различных тканей желудочно-кишечного тракта в первичной культуре органоидов. Nat Med. 2014; 20 (7): 769–77.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ли И, Лю И, Лю Б., Ван Дж, Вэй С, Ци З, Ван С, Фу В, Чен Ю. Система культивирования без факторов роста подчеркивает координацию между передачей сигналов Wnt и BMP в поддержании Lgr5 (+) стволовых клеток кишечника. Cell Discov. 2018; 4: 49.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • Li Y, Muffat J, Omer A, Bosch I, Lancaster MA, Sur M, Gehrke L, Knoblich JA, Jaenisch R.Индукция расширения и складывания органоидов головного мозга человека. Стволовая клетка клетки. 2017; 20 (3): 385–96.e3.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Li Y, Wang R, Huang D, Ma X, Mo S, Guo Q, Fu G, Li Y, Xu X, Hu X и ​​др. Новая линия органоидов карциномы клеток толстой кишки и кольцевых клеток толстой кишки человека: создание, характеристика и применение. Канцерогенез. 2019; 41 (7): 993–1004.

    Артикул Google ученый

  • Lindeboom RG, van Voorthuijsen L, Oost KC, Rodríguez-Colman MJ, Luna-Velez MV, Furlan C, Baraille F, Jansen PW, Ribeiro A, Burgering BM, et al.Интегративный многопрофильный анализ дифференцировки органоидов кишечника. Mol Syst Biol. 2018; 14 (6): e8227.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • Мариани Дж., Коппола Дж., Чжан П., Абызов А., Провини Л., Томасини Л., Амендуни М., Секели А., Палеев Д., Уилсон М. и др. FOXG1-зависимая дисрегуляция ГАМК / глутаматной дифференцировки нейронов при расстройствах аутистического спектра. Клетка. 2015; 162 (2): 375–90.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Matano M, Date S, Shimokawa M, Takano A, Fujii M, Ohta Y, Watanabe T, Kanai T, Sato T.Моделирование колоректального рака с использованием CRISPR-Cas9-опосредованной инженерии органоидов кишечника человека. Nat Med. 2015. 21 (3): 256–62.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • McCracken KW, Catá EM, Crawford CM, Sinagoga KL, Schumacher M, Rockich BE, Tsai Y-H, Mayhew CN, Spence JR, Zavros Y, et al. Моделирование человеческого развития и болезней в органоидах желудка, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Природа. 2014. 516 (7531): 400–4.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • McCracken KW, Howell JC, Wells JM, Spence JR.Создание ткани кишечника человека из плюрипотентных стволовых клеток in vitro. Nat Protoc. 2011; 6 (12): 1920–8.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Mellin R, Boddey JA. Органоиды для исследования малярии на стадии печени. Trends Parasitol. 2020; 36 (2): 158–69.

    PubMed Статья Google ученый

  • Mellman I, Coukos G. Dranoff G Иммунотерапия рака достигает совершеннолетия.Природа. 2011; 480 (7378): 480–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Monteil V, Kwon H, Prado P, Hagelkrüys A, Wimmer RA, Stahl M, Leopoldi A, Garreta E, Hurtado Del Pozo C, Prosper F и др. Ингибирование инфекций SARS-CoV-2 в тканях человека с использованием растворимого человеческого ACE2 клинического уровня. Клетка. 2020; 181 (4): 905–13.e7.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Моррис JP, Ван SC.Hebrok M KRAS, Hedgehog, Wnt и запутанная биология развития протоковой аденокарциномы поджелудочной железы. Нат Рев Рак. 2010. 10 (10): 683–95.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Мюллер, Нью-Джерси, Куваки К., Кносалла С., Дор FJMF, Голлакнер Б., Уилкинсон Р.А., Арн С., Сакс Д.Х., Купер Д.К. Фишман Ю.А. Ранний отъем поросят не позволяет исключить лимфотропный вирус герпеса свиней. Ксенотрансплантация. 2005. 12 (1): 59–62.

    PubMed Статья Google ученый

  • Наир Х., Нокес Д.Д., Гесснер Б.Д., Дхерани М., Мадхи С.А., Синглтон Р.Дж., О’Брайен К.Л., Рока А., Райт П.Ф., Брюс Н. и др. Глобальное бремя острых респираторных инфекций нижних дыхательных путей, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом у детей раннего возраста: систематический обзор и метаанализ. Ланцет. 2010. 375 (9725): 1545–55.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Накано Т., Андо С., Таката Н., Кавада М., Мугурума К., Секигучи К., Сайто К., Йонемура С., Эйраку М.Sasai Y Самоформирование глазных бокалов и хранимой стратифицированной нервной сетчатки из человеческих ESCs. Стволовая клетка клетки. 2012. 10 (6): 771–85.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Nanduri LSY, Baanstra M, Faber H, Rocchi C., Zwart E, de Haan G, van Os R. Coppes RP Очистка и экспансия ex vivo полнофункциональных стволовых клеток слюнных желез. Отчеты о стволовых клетках. 2014. 3 (6): 957–64.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Nanki K, Toshimitsu K, Takano A, Fujii M, Shimokawa M, Ohta Y, Matano M, Seino T, Nishikori S, Ishikawa K и др.Дивергентные пути к независимости ниш Wnt и R-спондина во время желудочного канцерогенеза. Клетка. 2018; 174 (4): 856–69.e17.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Нил Дж. Т., Куо Си Джей. Органоиды как модели неопластической трансформации. Анну Рев Патол. 2016; 11: 199–220.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Neal JT, Li X, Zhu J, Giangarra V, Grzeskowiak CL, Ju J, Liu IH, Chiou S.H., Salahudeen AA, Smith AR, et al.Органоидное моделирование опухоли. Иммунное микроокружение. Клетка. 2018; 175 (7): 1972–88.e16.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ng S, Schwartz RE, March S, Galstian A, Gural N, Shan J, Prabhu M, Mota MM. Bhatia SN Гепатоцитоподобные клетки, полученные из ИПСК человека, поддерживают инфекцию на стадии печени Plasmodium in vitro. Отчеты о стволовых клетках. 2015; 4 (3): 348–59.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Nie Y-Z, Zheng Y-W, Miyakawa K, Murata S, Zhang R-R, Sekine K, Ueno Y, Takebe T, Wakita T, Ryo A, et al.Повторение взаимодействий вируса гепатита В с хозяином в органоидах печени из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. EBioMedicine. 2018; 35: 114–23.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Нигро Дж., Росси Р., Коммер П. Х., Джей П., Сансонетти П. Дж. Цитозольный бактериальный датчик пептидогликана Nod2 обеспечивает защиту стволовых клеток и связывает микробы с регенерацией эпителия кишечника. Клеточный микроб-хозяин. 2014. 15 (6): 792–8.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Nuciforo S, Fofana I, Matter MS, Blumer T, Calabrese D, Boldanova T, Piscuoglio S, Wieland S, Ringnalda F, Schwank G и др. Органоидные модели рака печени человека, полученные при биопсии опухолевой иглой. Cell Rep.2018; 24 (5): 1363–76.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Нуссе Р.Clevers H Wnt / β-Catenin Сигнализация, заболевание и новые терапевтические методы. Клетка. 2017; 169 (6): 985–99.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Оливье М., Холлштейн М., Эно П. Мутации TP53 при раке человека: происхождение, последствия и клиническое использование. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010; 2 (1): а001008.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • Ooft SN, Weeber F, Dijkstra KK, McLean CM, Kaing S, van Werkhoven E, Schipper L, Hoes L, Vis DJ, van de Haar J, et al.Органоиды, полученные от пациентов, могут предсказать ответ на химиотерапию у пациентов с метастатическим колоректальным раком. Sci Transl Med. 2019; 11 (513): eaay2574.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Ootani A, Li X, Sangiorgi E, Ho QT, Ueno H, Toda S, Sugihara H, Fujimoto K, Weissman IL, Capecchi MR, et al. Устойчивая культура кишечного эпителия in vitro в нише Wnt-зависимых стволовых клеток. Nat Med. 2009. 15 (6): 701–6.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Паули С., Хопкинс Б.Д., Пранди Д., Шоу Р., Федриззи Т., Сбонер А., Сайлер В., Аугелло М., Пука Л., Розати Р. и др.In VitroПерсонализированные модели и модели рака для руководства точной медициной. Рак Discov. 2017a; 7 (5): 462–77 ..

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Паули С., Хопкинс Б.Д., Пранди Д., Шоу Р., Федриззи Т., Сбонер А., Сайлер В., Аугелло М., Пука Л., Розати Р. и др. Персонализированные модели рака in vitro и in vivo для руководства прецизионной медициной. Рак Discov. 2017b; 7 (5): 462–77.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Peng WC, Logan CY, Fish M, Anbarchian T., Aguisanda F, Álvarez-Varela A, Wu P, Jin Y, Zhu J, Li B, et al.Воспалительный цитокин TNFα способствует долгосрочному увеличению первичных гепатоцитов в 3D-культуре. Клетка. 2018; 175 (6): 1607–19.e15.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Persson BD, Jaffe AB, Fearns R, Danahay H. Респираторно-синцитиальный вирус может инфицировать базальные клетки и изменять эпителиальную дифференцировку дыхательных путей человека. PLoS One. 2014; 9 (7): e102368.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Qian X, Nguyen HN, Song MM, Hadiono C, Ogden SC, Hammack C, Yao B, Hamersky GR, Jacob F, Zhong C и др.Органоиды, специфичные для области мозга, с использованием мини-биореакторов для моделирования воздействия ZIKV. Клетка. 2016; 165 (5): 1238–54.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Qian X, Su Y, Adam CD, Deutschmann AU, Pather SR, Goldberg EM, Su K, Li S, Lu L, Jacob F, et al. Нарезанные кортикальные органоиды человека для моделирования формирования четкого кортикального слоя. Стволовая клетка клетки. 2020; 26 (5): 766–81.e9.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Рамани С., Атмар Р.Л.Эстес М.К. Эпидемиология норовирусов человека и обновленная информация о разработке вакцин. Курр Опин Гастроэнтерол. 2014; 30 (1): 25–33.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ren W, Lewandowski BC, Watson J, Aihara E, Iwatsuki K, Bachmanov AA, Margolskee RF. Jiang P Единичные Lgr5- или Lgr6-экспрессирующие вкусовые стволовые клетки / клетки-предшественники генерируют клетки вкусовых луковиц ex vivo. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014; 111 (46): 16401–6.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ringel T, Frey N, Ringnalda F, Janjuha S, Cherkaoui S, Butz S, Srivatsa S, Pirkl M, Russo G, Villiger L, et al. Скрининг CRISPR в масштабе генома в органоидах кишечника человека определяет факторы устойчивости к TGF-β. Стволовая клетка клетки. 2020; 26 (3): 431–40.e8.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Roe J-S, Hwang C-I, Somerville TDD, Milazzo JP, Lee EJ, Da Silva B, Maiorino L, Tiriac H, Young CM, Miyabayashi K, et al.Перепрограммирование энхансера способствует метастазированию рака поджелудочной железы. Клетка. 2017; 170 (5): 875–88.e20.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Rookmaaker MB, Schutgens F, Verhaar MC, Clevers H. Разработка и применение органоидов взрослых стволовых клеток или клеток-предшественников человека. Нат Рев Нефрол. 2015; 11 (9): 546–54.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Roper J, Tammela T, Cetinbas NM, Akkad A, Roghanian A, Rickelt S, Almeqdadi M, Wu K, Oberli MA, Sánchez-Rivera FJ, et al.Редактирование генома in vivo и модели трансплантации органоидов колоректального рака и метастазов. Nat Biotechnol. 2017; 35 (6): 569–76.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Розенберг С.А. Restifo NP Перенос адоптивных клеток как персонализированная иммунотерапия рака человека. Наука. 2015; 348 (6230): 62–8.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Sachs N, Clevers H.Органоидные культуры для анализа фенотипов рака. Curr Opin Genet Dev. 2014; 24: 68–73.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Sachs N, de Ligt J, Kopper O, Gogola E, Bounova G, Weeber F, Balgobind AV, Wind K, Gracanin A, Begthel H, et al. Живой биобанк органоидов рака груди фиксирует неоднородность заболевания. Клетка. 2018; 172 (1-2): 373–86.e10.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Sachs N, Papaspyropoulos A, Zomer-van Ommen DD, Heo I, Böttinger L, Klay D, Weeber F, Huelsz-Prince G, Iakobachvili N, Amatngalim GD, et al.Органоиды дыхательных путей человека с долгосрочным расширением для моделирования заболеваний. EMBO J. 2019; 38 (4): e100300.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • Сайто Й, Мурамацу Т., Канаи Й, Одзима Х, Сукеда А, Хираока Н., Араи Э, Сугияма Й, Мацудзаки Дж, Учида Р. и др. Создание органоидов, полученных от пациентов, и скрининг лекарств для выявления рака желчных путей. Cell Rep. 2019; 27 (4): 1265–76.e4.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Сайто Й., Ониси Н., Таками Х., Сейшима Р., Иноуэ Х., Хирата Й., Камеяма К., Цучихаси К., Сугихара Е., Учино С. и др.Разработка функциональной модели щитовидной железы на основе системы культивирования органоидов. Biochem Biophys Res Commun. 2018; 497 (2): 783–9.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Салама Н.Р., Хартунг М.Л. Мюллер А. Жизнь в желудке человека: стратегии сохранения бактериального патогена Helicobacter pylori. Nat Rev Microbiol. 2013; 11 (6): 385–99.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Sampaziotis F, de Brito MC, Madrigal P, Bertero A, Saeb-Parsy K, Soares FAC, Schrumpf E, Melum E, Karlsen TH, Bradley JA и др.Холангиоциты, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для моделирования заболеваний и валидации лекарств. Nat Biotechnol. 2015; 33 (8): 845–52.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RGJ, Van Es JH, Van den Brink S, Van Houdt WJ, Pronk A, Van Gorp J, Siersema PD и др. Длительное распространение эпителиальных органоидов из толстой кишки, аденомы, аденокарциномы и эпителия Барретта человека.Гастроэнтерология. 2011; 141 (5): 1762–72.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Сато Т., Фрис Р.Г., Снапперт Х.Дж., ван де Ветеринг М., Баркер Н., Штанге Д.Е., ван Эс Дж.Х., Або А, Куяла П., Петерс П.Дж. и др. Одиночные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинки in vitro без мезенхимальной ниши. Природа. 2009. 459 (7244): 262–5.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Scanu T, Spaapen RM, Bakker JM, Pratap CB, Wu L-E, Hofland I, Broeks A, Shukla VK, Kumar M, Janssen H, et al.Манипуляции сальмонеллами сигнальных путей хозяина вызывают клеточную трансформацию, связанную с карциномой желчного пузыря. Клеточный микроб-хозяин. 2015; 17 (6): 763–74.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Schlaermann P, Toelle B, Berger H, Schmidt SC, Glanemann M, Ordemann J, Bartfeld S, Mollenkopf HJ, Meyer TF. Новая система первичной культуры клеток желудка человека для моделирования инфекции Helicobacter pylori in vitro.Кишечник. 2016; 65 (2): 202–13.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Schnalzger TE, de Groot MH, Zhang C, Mosa MH, Michels BE, Röder J, Darvishi T., Wels WS. Трехмерная модель Фарина HF для CAR-опосредованной цитотоксичности с использованием органоидов колоректального рака, полученных от пациента. EMBO J. 2019; 38 (12): e100928.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • Schutgens F, Rookmaaker MB, Margaritis T, Rios A, Ammerlaan C, Jansen J, Gijzen L, Vormann M, Vonk A, Viveen M, et al.Тубулоиды, полученные из почек и мочи взрослого человека, для персонализированного моделирования заболеваний. Nat Biotechnol. 2019; 37 (3): 303–13.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Schütte M, Risch T., Abdavi-Azar N, Boehnke K, Schumacher D, Keil M, Yildiriman R, Jandrasits C, Borodina T, Amstislavskiy V, et al. Молекулярное рассечение колоректального рака на доклинических моделях позволяет выявить биомаркеры, предсказывающие чувствительность к ингибиторам EGFR.Nat Commun. 2017; 8: 14262.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • Schwank G, Koo B-K, Sasselli V, Dekkers JF, Heo I, Demircan T, Sasaki N, Boymans S, Cuppen E, van der Ent CK и др. Функциональная репарация CFTR с помощью CRISPR / Cas9 в органоидах кишечных стволовых клеток пациентов с муковисцидозом. Стволовая клетка клетки. 2013. 13 (6): 653–8.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Зейдлитц Т., Меркер С.Р., Роте А., Закшевски Ф., фон Нойбек С., Грюцманн К., Зоммер Ю., Швайцер С., Шёльх С., Улеманн Х и др.Моделирование рака желудка человека с использованием органоидов. Кишечник. 2019; 68 (2): 207–17.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Seino T, Kawasaki S, Shimokawa M, Tamagawa H, Toshimitsu K, Fujii M, Ohta Y, Matano M, Nanki K, Kawasaki K и др. Органоиды опухоли поджелудочной железы человека обнаруживают потерю зависимости от фактора ниши стволовых клеток во время прогрессирования заболевания. Стволовая клетка клетки. 2018; 22 (3): 454–67.e6.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Seshagiri S, Stawiski EW, Durinck S, Modrusan Z, Storm EE, Conboy CB, Chaudhuri S, Guan Y, Janakiraman V, Jaiswal BS и др.Рецидивирующие слияния R-спондинов при раке толстой кишки. Природа. 2012. 488 (7413): 660–4.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Шеннон Дж. М., Мейсон Р. Дж., Дженнингс С. Д.. Функциональная дифференциация эпителиальных клеток альвеолярного типа II in vitro: влияние формы клеток, межклеточные взаимодействия и межклеточные взаимодействия. Biochimica et Biophysica Acta. 1987. 931 (2): 143–56.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Симокава М., Охта Й, Нишикори С., Матано М., Такано А., Фуджи М., Дате С., Сугимото С., Канаи Т.Sato T Визуализация и нацеливание на стволовые клетки рака толстой кишки человека LGR5 (+). Природа. 2017; 545 (7653): 187–92.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Шукла В.К., Сингх Х., Пандей М., Упадхьяй С.К., Нат Дж. Карцинома желчного пузыря — это продолжение брюшного тифа? Dig Dis Sci. 2000. 45 (5): 900–3.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Simsek S, Zhou T, Robinson CL, Tsai S-Y, Crespo M, Amin S, Lin X, Hon J, Evans T, Chen S.Моделирование муковисцидоза с использованием эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Стволовые клетки Transl Med. 2016; 5 (5): 572–9.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Sondo E, Caci E, Galietta LJV. Хлоридный канал TMEM16A как альтернативная терапевтическая мишень при муковисцидозе. Int J Biochem Cell Biol. 2014; 52: 73–6.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Спенс Дж. Р., Мэйхью С. Н., Ранкин С. А., Кухар М. Ф., Валланс Дж. Э., Толле К., Хоскинс Е. Е., Калиниченко В. В., Уэллс С. И., Цорн А. М. и др.Направленная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в ткань кишечника in vitro. Природа. 2011. 470 (7332): 105–9.

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • Штанге Д.Е., Ку Б.К., Хуч М., Сиббел Дж., Басак О., Любимова А., Куяла П., Бартфельд С., Костер Дж., Гелен Дж. Х. и др. Дифференцированные главные клетки Troy + действуют как резервные стволовые клетки, генерируя все клоны эпителия желудка. Клетка. 2013. 155 (2): 357–68.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Такасато М., Эр П.Х., Чиу Х.С., Майер Б., Бэйли Г.Дж., Фергюсон К., Партон Р.Г., Вольветанг Э.Дж., Руст М.С.Чува де Соуза Лопес С.М. и др. Органоиды почек из iPS-клеток человека содержат множество клонов и моделируют нефрогенез человека. Природа. 2015; 526 (7574): 564–8.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, Zhang R-R, Ueno Y, Zheng Y-W, Koike N, et al. Васкуляризованная и функциональная печень человека после трансплантации зачатка органа, полученного из ИПСК. Природа. 2013. 499 (7459): 481–4.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Thomas CA, Tejwani L, Trujillo CA, Negraes PD, Herai RH, Mesci P, Macia A, Crow YJ, Muotri AR. Моделирование TREX1-зависимого аутоиммунного заболевания с использованием человеческих стволовых клеток подчеркивает накопление L1 как источник нейровоспаления. Стволовая клетка клетки. 2017; 21 (3): 319–31.e8.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Tiriac H, Belleau P, Engle DD, Plenker D, Deschênes A, Somerville TDD, Froeling FEM, Burkhart RA, Denroche RE, Jang G-H и др.Профилирование органоидов позволяет выявить наиболее частых ответчиков на химиотерапию при раке поджелудочной железы. Рак Discov. 2018; 8 (9): 1112–29.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Tomlins SA, Rhodes DR, Perner S, Dhanasekaran SM, Mehra R, Sun X-W, Varambally S, Cao X, Tchinda J, Kuefer R, et al. Рекуррентное слияние генов факторов транскрипции TMPRSS2 и ETS при раке простаты. Наука. 2005. 310 (5748): 644–8.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Toolan HW.Рост опухолей человека у лабораторных животных, получавших кортизон: возможность получения постоянно трансплантируемых опухолей человека. Cancer Res. 1953; 13 (4-5): 389–94.

    CAS PubMed Google ученый

  • Turco MY, Gardner L, Hughes J, Cindrova-Davies T., Gomez MJ, Farrell L, Hollinshead M, Marsh SGE, Brosens JJ, Critchley HO, et al. Долгосрочные гормонально-чувствительные органоидные культуры эндометрия человека в среде с определенным химическим составом.Nat Cell Biol. 2017; 19 (5): 568–77.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • van de Wetering M, Francies HE, Francis JM, Bounova G, Iorio F, Pronk A, van Houdt W., van Gorp J, Taylor-Weiner A, Kester L, et al. Перспективное создание биобанка живых органоидов больных колоректальным раком. Клетка. 2015; 161 (4): 933–45.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • van der Sanden SMG, Sachs N, Koekkoek SM, Koen G, Pajkrt D, Clevers H, Wolthers KC.Инфекция энтеровирусом 71 органоидов дыхательных путей человека обнаруживает VP1-145 в качестве детерминанты вирусной инфекционности. Emerg Microbes Infect. 2018; 7 (1): 84.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • Vlachogiannis G, Hedayat S, Vatsiou A, Jamin Y, Fernández-Mateos J, Khan K, Lampis A, Eason K, Huntingford I, Burke R, et al. Органоиды, полученные от пациентов, моделируют терапевтический ответ метастатического рака желудочно-кишечного тракта. Наука. 2018; 359 (6378): 920–6.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • фон Furstenberg RJ, Gulati AS, Baxi A, Doherty JM, Stappenbeck TS, Gracz AD, Magness ST. Henning SJ. Сортировка эпителиальных клеток тощей кишки мышей с CD24 дает популяцию с характеристиками кишечных стволовых клеток. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011; 300 (3): G409 – G17.

    Артикул CAS Google ученый

  • Ван Ф., Сковилл Д., Хе Х. С., Маэ М. М., Вставка А, Перри Дж. М., Смит Н. Р., Лей Нью-Йорк, Дэвис П. С., Фуллер М. К. и др.Выделение и характеристика кишечных стволовых клеток на основе комбинаций поверхностных маркеров и анализа образования колоний. Гастроэнтерология. 2013; 145 (2): 383–95.e1-21.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Weeber F, van de Wetering M, Hoogstraat M, Dijkstra KK, Krijgsman O, Kuilman T., Gadellaa-van Hooijdonk CGM, van der Velden DL, Peeper DS, Cuppen EPJG, et al. Сохранение генетического разнообразия органоидов, культивированных из биоптатов метастазов колоректального рака человека.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2015; 112 (43): 13308–11.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Wells MF, Salick MR, Wiskow O, Ho DJ, Worringer KA, Ihry RJ, Kommineni S, Bilican B, Klim JR, Hill EJ, et al. Генетическая абляция AXL не защищает клетки-предшественники нейронов человека и церебральные органоиды от заражения вирусом Зика. Стволовая клетка клетки. 2016; 19 (6): 703–8.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Wiegerinck CL, Janecke AR, Schneeberger K, Vogel GF, van Haaften-Visser DY, Escher JC, Adam R, Thöni CE, Pfaller K, Jordan AJ, et al.Утрата синтаксина 3 вызывает вариантную болезнь включения микроворсинок. Гастроэнтерология. 2014; 147 (1): 65–8.e10.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Xiang Y, Tanaka Y, Cakir B, Patterson B, Kim KY, Sun P, Kang YJ, Zhong M, Liu X, Patra P и др. Таламические органоиды, производные чЭСК, образуют взаимные проекции при слиянии с кортикальными органоидами. Стволовая клетка клетки. 2019; 24 (3): 487–97.e7.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Xiang Y, Tanaka Y, Patterson B, Kang YJ, Govindaiah G, Roselaar N, Cakir B., Kim KY, Lombroso AP, Hwang SM, et al.Слияние органоидов, полученных из hPSC, моделирует развитие человеческого мозга и миграцию интернейронов. Стволовая клетка клетки. 2017; 21 (3): 383–98.e7.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Сяо Д., Дэн К. Получение самоорганизующихся органоидов сенсорных ганглиев и ганглиозных клеток сетчатки из фибробластов. 2020; 6 (22): eaaz5858.

  • Xu M, Lee EM, Wen Z, Cheng Y, Huang W-K, Qian X, Tcw J, Kouznetsova J, Ogden SC, Hammack C, et al.Идентификация низкомолекулярных ингибиторов вирусной инфекции Зика и индуцированной гибели нервных клеток посредством скрининга перепрофилирования лекарств. Nat Med. 2016; 22 (10): 1101–7.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Xu R, Brawner AT, Li S, Liu JJ, Kim H, Xue H, Pang ZP, Kim WY, Hart RP, Liu Y и др. OLIG2 Управляет фенотипами аномального развития нервной системы в человеческих органоидных моделях и химерных мышах, основанных на ipsc, с синдромом Дауна.Стволовая клетка клетки. 2019; 24 (6): 908–26.e8.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Ян ХХН, Сиу Х.С., Ло С., Хо С.Л., Юэ ССК, Цуй Вайоминг, Чан Д., Чан А.С., Ма С., Лам К.О. и др. Комплексный биобанк органоидов рака желудка человека фиксирует неоднородность подтипов опухоли и позволяет проводить терапевтический скрининг. Стволовая клетка клетки. 2018; 23 (6): 882–97.e11.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Яо И, Сюй Х, Ян Л., Чжу Дж, Ван Дж, Шен Л., Ся Ф, Фу Г, Дэн Й, Пан М. и др.Органоиды, полученные от пациентов, позволяют прогнозировать химиолучевую реакцию при местнораспространенном раке прямой кишки. Стволовая клетка клетки. 2020; 26 (1): 17–26.e6.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Инь Х, Фарин Х.Ф., ван Эс Дж. Х., Клеверс Х., Лангер Р., Карп Дж. М.. Независимые от ниши высокочистые культуры кишечных стволовых клеток Lgr5 + и их потомства. Нат методы. 2014; 11 (1): 106–12.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Yin Y, Bijvelds M, Dang W., Xu L, van der Eijk AA, Knipping K, Tuysuz N, Dekkers JF, Wang Y, de Jonge J, et al.Моделирование ротавирусной инфекции и противовирусная терапия с использованием первичных кишечных органоидов. Antiviral Res. 2015; 123: 120–31.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Йошихара Э., О’Коннор С. Иммуно-ускользающие человеческие островковые органоиды улучшают диабет; 2020.

    Google ученый

  • Yui S, Nakamura T, Sato T, Nemoto Y, Mizutani T, Zheng X, Ichinose S, Nagaishi T, Okamoto R, Tsuchiya K и др.Функциональное приживление эпителия толстой кишки увеличивалось in vitro из одной взрослой стволовой клетки Lgr5 + . Nat Med. 2012; 18 (4): 618–23.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Zhang B, He Y, Xu Y, Mo F, Mi T, Shen QS, Li C, Li Y, Liu J, Wu Y и др. Дифференциальный противовирусный иммунитет к вирусу японского энцефалита в развивающихся корковых органоидах. Cell Death Dis. 2018; 9 (7): 719.

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • Zhang Y-G, Wu S, Xia Y.Sun J Система культивирования кишечных органоидов, инфицированных сальмонеллой, полученных из крипт, для взаимодействия между хозяином и бактериями. Physiol Rep.2014; 2 (9): e12147.

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Zhang YS, Arneri A, Bersini S, Shin SR, Zhu K, Goli-Malekabadi Z, Aleman J, Colosi C, Busignani F, Dell’Erba V, et al. Биопечать 3D микроволоконных каркасов для инженерии эндотелиализированного миокарда и сердца на чипе. Биоматериалы.2016; 110: 45–59.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Чжэн Д.П., Андо Т., Фанкхаузер Р.Л., Борода Р.С., Гласс Р.И. Monroe SS Классификация норовирусов и предлагаемая номенклатура штаммов. Вирусология. 2006. 346 (2): 312–23.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Чжоу Дж., Ли Ц., Лю Х, Чиу М.С. Заражение органоидов кишечника летучих мышей и человека SARS-CoV-2.Nat Med. 2020; 26 (7): 1077–83.

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • Чжоу Дж., Ли К., Сакс Н., Чиу М.К., Вонг БХ-И, Чу Х, Пун ВК-М, Ван Д., Чжао Х, Вэнь Л. и др. Дифференцированные органоиды дыхательных путей человека для оценки инфекционности появляющегося вируса гриппа. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2018; 115 (26): 6822–7.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Прогресс органоидов печени человека | Журнал молекулярной клеточной биологии

    Аннотация

    Понимание развития, регенерации и нарушений печени является основной целью биологии печени.Современные механистические знания о печени человека в значительной степени были получены на моделях мышей и клеточных линиях, которые не сумели воспроизвести особенности клеток печени человека или структуры и функции печени человека. Органоиды как система in vitro обещают создать органоподобные ткани в чашке. Последние достижения в области органоидов печени человека также облегчают понимание биологии и болезней этого сложного органа. Здесь мы рассматриваем прогресс в области органоидов печени человека, уделяя основное внимание методам получения органоидов печени, их применению и возможным направлениям в будущем.

    Органоиды в целом

    Органоиды теперь используются для обозначения миниатюрных органоподобных культур в трехмерных культурах (Lancaster and Knoblich, 2014). В отличие от клеток в 2D-культурах, органоиды образуются в результате самоорганизации групп клеток, включая стволовые клетки, предшественники тканей взрослого человека и различные типы зрелых клеток из органа, в пространственной структуре, аналогичной тканям-аналогам in vivo . Еще в прошлые века ученые продемонстрировали способность диссоциированных клеток восстанавливать тканеподобную ассоциацию in vitro (Moscona and Moscona, 1952; Weiss and Taylor, 1960).Тем не менее, бум этой новой области должен подождать до последних десятилетий, когда будут достигнуты успехи в понимании морфогенеза, разработки технологий стволовых клеток и приготовления надлежащих внеклеточных матриц (ECM) (Simian and Bissell, 2017). Фактически, за последние 10 лет в большом количестве исследований сообщалось о генерации органоидов в различных органах, таких как мозг, сетчатка, почки, легкие, кишечник и печень (Willyard, 2015).

    Органоиды — это легкодоступная модель in vitro, , которая воспроизводит определенные структуры и функции их аналогичных органов in vivo, , которые не наблюдаются в отдельных клетках или культивируемых 2D клеточных листах, и, как таковые, значительно расширяют наши исследования объемы.Интересно, что органоиды не только вносят структурные и функциональные изменения в клетку, но также приносят другие недооцененные особенности ткани. Например, неожиданно было показано, что стабилизированная архитектура ткани может поддерживать улучшенную точность хромосом, вероятно, за счет опосредованного интегрином установления полярности клеток (Knouse et al., 2018). Органоиды зарекомендовали себя как мощный инструмент для изучения развития и регенерации, а также как потенциальную модель для понимания человеческих заболеваний и изучения методов лечения болезней (Clevers, 2016).Органоиды головного мозга, полученные путем дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток (PSC), применялись для моделирования развития коры головного мозга, эволюции мозга и нервных расстройств, включая аутизм, болезнь Альцгеймера и инфекцию, вызванную вирусом Зика (ZIKV) (Qian et al., 2019). Было обнаружено, что кишечные органоиды, полученные из единичных стволовых клеток Lgr5 + , создают структуры крипта-ворсинка с многослойным эпителием, представляя основные типы клеток в кишечнике (Sato et al., 2009), и такие кишечные органоиды использовались для имитации регенерация тканей и развитие рака (Nakamura and Sato, 2018).

    Помимо этого, органоиды предоставляют новые инструменты для трансляционных исследований и альтернативных методов заместительной терапии в клиниках. Раковые органоиды, полученные с помощью генной инженерии нормальных клеток или из первичных опухолевых тканей, открывают перспективы для разработки лекарств и персонализированного лечения рака (Tuveson and Clevers, 2019). Сконструированные органоиды путем последовательного введения онкогенных мутаций использовались при моделировании процесса инициации и развития различных типов рака, таких как рак протоков поджелудочной железы (Huang et al., 2015) и колоректального рака (Crespo et al., 2017). Более того, биобанки органоидов (PDO), полученных от пациентов, при раке простаты (Gao et al., 2014), раке груди (Sachs et al., 2018), колоректальном раке (van de Wetering et al., 2015) , яичников рак (Kopper et al., 2019) и рак мочевого пузыря (Lee et al., 2018) стали бесценными ресурсами для точной медицины. Кроме того, пилотные исследования продемонстрировали применение органоидов в регенеративной медицине. Например, толстая кишка (Yui et al., 2012) и органоиды печени (Huch et al., 2013; Takebe et al., 2013), дифференцированные из стволовых клеток, показали некоторые терапевтические эффекты у мышей.

    В связи с быстрым развитием и широким спросом на технологии органоидов, традиционные 3D-культуры столкнулись с проблемами, чтобы добиться точного контроля образования органоидов и реализовать сложную микросреду данного органа. Как следствие, это открывает новые границы исследований в области воспроизводимости органоидной культуры, включения клеток из других функциональных линий и альянса с редактированием генов для приобретения сложных органоидов (Park et al., 2019). Отличительной чертой этой тенденции является разработка отдельных органоидов головного мозга, содержащих различные типы клеток коры головного мозга человека, была достигнута путем адаптации и оптимизации нескольких протоколов (Velasco et al., 2019). Другие исследователи занимаются созданием сложных органоидов, чтобы лучше имитировать статус заболевания in vivo , включая инженерные сосудистые системы (Cakir et al., 2019; Homan et al., 2019; Wimmer et al., 2019), а также нервную систему. (Workman et al., 2017) и сборку различных частей ткани вместе (Harrison et al., 2017).

    Печень как самый большой висцеральный орган важна для многих важных жизненно важных функций, таких как метаболизм углеводов и липидов, детоксикация лекарств, секреция желчи и выработка белков плазмы. В последние годы он привлек большой интерес к разработке органоидов печени. Полученные таким образом органоиды печени обеспечивают структурные и функциональные преимущества для понимания развития печени и возникновения заболеваний печени in vitro . Здесь мы суммируем недавний прогресс в создании органоидов печени и их потенциальное применение.

    Строение печени

    Печень состоит из тысяч основных структурных и функциональных единиц, называемых дольками печени, которые эволюционно консервативны между видами у позвоночных (Si-Tayeb et al., 2010a; Miyajima et al., 2014; Shiojiri et al., 2018). Долька печени состоит из паренхимных клеток, в основном гепатоцитов, и непаренхимальных клеток, включая холангиоциты, синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSEC), звездчатые клетки печени (HSC) и иммунные клетки.Интересно, что исследования секвенирования отдельных клеток недавно предложили новые типы клеток в долях печени человека, которые, однако, потребуют функционального подтверждения в будущем (MacParland et al., 2018; Aizarani et al., 2019). Гепатоциты и холангиоциты — это два типа эпителиальных клеток, дифференцированных от гепатобластов, клеток-предшественников эмбриональной печени, во время органогенеза. Различные типы клеток печени расположены в определенных положениях вдоль дольки, которые необходимы для их собственных функций, а также для других типов клеток (Si-Tayeb et al., 2010a; Miyajima et al., 2014). Гепатоциты, играющие важную роль в функциях печени, расположены в виде тяжей, идущих вдоль синусоидов печени от центральных вен к воротным венам. Гепатоциты представляют собой поляризованные эпителиальные клетки с плотными контактами на боковых мембранах, тогда как базальные мембраны обращены к LSEC. Уникальные структуры полярности необходимы для функций гепатоцитов. Сосудистые системы приносят кислород и питание из воротной вены и печеночной артерии, выстланной в перипортальной области, в центральную вену, создавая таким образом зональную среду в дольке.Каналы желчи закрыты плотными контактами на боковой мембране между соседними гепатоцитами, функционируя для сбора желчи, секретируемой гепатоцитами. Желчь, выделяемая из желчных каналов, течет в противоположных направлениях крови и выводится из печени из желчных протоков (рис. 1).

    Рисунок 1

    Схематическая диаграмма доли печени и сохранение между видами. Долька печени, содержащая две проточные системы, билиарную и сосудистую, является фундаментальной и консервативной структурой печени между видами.Кислородная кровь и пища поступают в печень от воротной вены и печеночной артерии в перицентральной области к центральным венам в перицентральной области. Желчь, выделяемая гепатоцитами, собирается в желчный проток, который течет в противоположных направлениях. Портальная вена, печеночная артерия и желчный проток составляют структуру портальной триады. Пластинки гепатоцитов выстраиваются вдоль синусоидальных капилляров печени в радиальном направлении от перицентральной области к перицентральной области. LSEC, клетки Купфера и другие резидентные макрофаги расположены на просветной стороне синусоидов, тогда как HSC расположены снаружи.

    Рисунок 1

    Схематическая диаграмма доли печени и сохранение между видами. Долька печени, содержащая две проточные системы, билиарную и сосудистую, является фундаментальной и консервативной структурой печени между видами. Кислородная кровь и пища поступают в печень от воротной вены и печеночной артерии в перицентральной области к центральным венам в перицентральной области. Желчь, выделяемая гепатоцитами, собирается в желчный проток, который течет в противоположных направлениях.Портальная вена, печеночная артерия и желчный проток составляют структуру портальной триады. Пластинки гепатоцитов выстраиваются вдоль синусоидальных капилляров печени в радиальном направлении от перицентральной области к перицентральной области. LSEC, клетки Купфера и другие резидентные макрофаги расположены на просветной стороне синусоидов, тогда как HSC расположены снаружи.

    Учитывая такую ​​сложную структуру, очевидно, трудно создать организованную структуру долек, несущую множество функций печени in vitro .Вдобавок ко всему, культивирование и размножение первичных гепатоцитов (PH), которые поддерживают функции печени, долгое время были узким местом в этой области (Bhatia et al., 2014). Только в последние годы с развитием технологий стволовых клеток стало возможным культивировать и расширять функциональные гепатоциты и холангиоциты в лаборатории. На основе этого прогресса, таким образом, появилось много захватывающих достижений, начиная от культивирования простых органоидов, которые были созданы из одного типа клеток, до сложных органоидов, собирающихся с различными типами клеток (Таблица 1).

    Таблица 1

    Последние достижения в создании органоидов печени in vitro.

    2018 и др.
    Категория . Личность . Содержание . ECM или методы . Список литературы .
    Простые органоиды Дифференцировка PSC Гепатоциты человека Чашки со сверхнизкими кластерами Ogawa et al., 2013
    Холангиоциты человека Matrigel Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015
    Трансдифференцировка Гепатоциты человека Пластины со сверхнизким сцеплением Sun et al., 2019
    Гепатоциты мыши Пластины Yamoto со сверхнизким сцеплением
    Первичные клетки PH плода / взрослого человека Matrigel Hu et al., 2018
    Пролиферированный человеческий PH Пластины со сверхнизким сцеплением Zhang et al., 2018; Fu et al., 2019
    Mouse Lgr5 + клеток печени Matrigel Huch et al., 2013
    Human EpCAM + холангиоцитов Matrigel
    PHs мыши Matrigel Hu et al., 2018; Peng et al., 2018
    Mouse Lgr5 + гепатобластов Matrigel Prior et al., 2019
    Комплексные органоиды Гепатобилиарный органоид ПСК человека – гепатоциты / холангиоциты Matrigel Guan et al., 2017; Wu et al., 2019
    Васкуляризованный органоид
    Человеческие PSC – энтодермальные клетки, PSC – эндотелиальные клетки / HUVEC, MSC Сверхнизкие адгезивные пластины / Matrigel Takebe et al., 2013, 2018
    Человеческие PH, МСК, структурированные HUVEC Коллаген и фибрин Stevens et al., 2017
    2018 и др.
    Категория . Личность . Содержание . ECM или методы . Список литературы .
    Простые органоиды Дифференцировка PSC Гепатоциты человека Чашки со сверхнизкими кластерами Ogawa et al., 2013
    Холангиоциты человека Matrigel Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015
    Трансдифференцировка Гепатоциты человека Пластины со сверхнизким сцеплением Sun et al., 2019
    Гепатоциты мыши Пластины Yamoto со сверхнизким сцеплением
    Первичные клетки PH плода / взрослого человека Matrigel Hu et al., 2018
    Пролиферированный человеческий PH Пластины со сверхнизким сцеплением Zhang et al., 2018; Fu et al., 2019
    Mouse Lgr5 + клеток печени Matrigel Huch et al., 2013
    Human EpCAM + холангиоцитов Matrigel
    PHs мыши Matrigel Hu et al., 2018; Peng et al., 2018
    Mouse Lgr5 + гепатобластов Matrigel Prior et al., 2019
    Комплексные органоиды Гепатобилиарный органоид ПСК человека – гепатоциты / холангиоциты Matrigel Guan et al., 2017; Wu et al., 2019
    Васкуляризованный органоид
    Человеческие PSC – энтодермальные клетки, PSC – эндотелиальные клетки / HUVEC, MSC Сверхнизкие адгезивные пластины / Matrigel Takebe et al., 2013, 2018
    Человеческие PH, МСК, структурированные HUVEC Коллаген и фибрин Stevens et al., 2017
    Таблица 1

    Последние достижения в области создания органоидов печени in vitro.

    2018 и др.
    Категория . Личность . Содержание . ECM или методы . Список литературы .
    Простые органоиды Дифференцировка PSC Гепатоциты человека Чашки со сверхнизкими кластерами Ogawa et al., 2013
    Холангиоциты человека Matrigel Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015
    Трансдифференцировка Гепатоциты человека Пластины со сверхнизким сцеплением Sun et al., 2019
    Гепатоциты мыши Пластины Yamoto со сверхнизким сцеплением
    Первичные клетки PH плода / взрослого человека Matrigel Hu et al., 2018
    Пролиферированный человеческий PH Пластины со сверхнизким сцеплением Zhang et al., 2018; Fu et al., 2019
    Mouse Lgr5 + клеток печени Matrigel Huch et al., 2013
    Human EpCAM + холангиоцитов Matrigel
    PHs мыши Matrigel Hu et al., 2018; Peng et al., 2018
    Mouse Lgr5 + гепатобластов Matrigel Prior et al., 2019
    Комплексные органоиды Гепатобилиарный органоид ПСК человека – гепатоциты / холангиоциты Matrigel Guan et al., 2017; Wu et al., 2019
    Васкуляризованный органоид
    Человеческие PSC – энтодермальные клетки, PSC – эндотелиальные клетки / HUVEC, MSC Сверхнизкие адгезивные пластины / Matrigel Takebe et al., 2013, 2018
    Человеческие PH, МСК, структурированные HUVEC Коллаген и фибрин Stevens et al., 2017
    2018 и др.
    Категория . Личность . Содержание . ECM или методы . Список литературы .
    Простые органоиды Дифференцировка PSC Гепатоциты человека Чашки со сверхнизкими кластерами Ogawa et al., 2013
    Холангиоциты человека Matrigel Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015
    Трансдифференцировка Гепатоциты человека Пластины со сверхнизким сцеплением Sun et al., 2019
    Гепатоциты мыши Пластины Yamoto со сверхнизким сцеплением
    Первичные клетки PH плода / взрослого человека Matrigel Hu et al., 2018
    Пролиферированный человеческий PH Пластины со сверхнизким сцеплением Zhang et al., 2018; Fu et al., 2019
    Mouse Lgr5 + клеток печени Matrigel Huch et al., 2013
    Human EpCAM + холангиоцитов Matrigel
    PHs мыши Matrigel Hu et al., 2018; Peng et al., 2018
    Mouse Lgr5 + гепатобластов Matrigel Prior et al., 2019
    Комплексные органоиды Гепатобилиарный органоид ПСК человека – гепатоциты / холангиоциты Matrigel Guan et al., 2017; Wu et al., 2019
    Васкуляризованный органоид
    Человеческие PSC – энтодермальные клетки, PSC – эндотелиальные клетки / HUVEC, MSC Сверхнизкие адгезивные пластины / Matrigel Takebe et al., 2013, 2018
    Человеческие PH, МСК, структурированные HUVEC Коллаген и фибрин Stevens et al., 2017

    Простые органоиды печени

    Гепатоциты и холангиоциты — два основных типа функциональных клеток печени. Недавний прогресс в области простых органоидов печени сосредоточился на методах генерации органоидов с помощью гепатоцитов или холангиоцитов. Органоиды гепатоцитов демонстрировали твердые скопления хорошо структурированных гепатоцитов, что сопровождалось усилением полярности и улучшением функции печени. Органоиды холангиоцитов часто проявляли кистозные полые структуры и осуществляли транспортировку жидкости и набухание кисты.Здесь мы опишем методологию генерации, а также структурные и функциональные особенности этих органоидов.

    Дифференциация PSC

    Дифференциация и репрограммирование in vitro доказали свою эффективность как успешные стратегии создания функциональных гепатоцитов и холангиоцитов в культуре. Было разработано несколько протоколов для дифференциации ПСК в гепатоцитоподобные клетки и холангиоцитоподобные клетки после ступенчатой ​​дифференцировки с добавлением факторов роста и химических ингибиторов в соответствии с эмбриональным развитием (Song et al., 2009; Си-Тайеб и др., 2010b; Дианат и др., 2014; Szkolnicka et al., 2014; Огава и др., 2015; Сампазиотис и др., 2015). Гепатоциты, дифференцированные с помощью PSC, становятся более зрелыми после сборки в 3D органоиды с поразительным улучшением экспрессии генов, связанных с функциями печени, таких как гены альбумина, TAT и CYP450, а также поверхностный маркер зрелых гепатоцитов ASGR1 (Ogawa et al., 2013) . Когда ПСХ дифференцировались в холангиоциты в виде агрегатов, они представляли протоковые структуры с морфологией трубчатых или полых кист.Примечательно, что они приобрели апикобазальную полярность с экспрессией маркеров, ограниченной апикальной стороной, и присутствием первичных ресничек, важных сенсорных органелл, контролирующих функции холангиоцитов (Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015).

    Самостоятельная сборка перепрограммированных клеток печени

    Помимо генерации органоидов из агрегатов PSC, самосборка дифференцированных зрелых клеток в сфероиды представляет собой другую стратегию. Принудительная активация транскрипционных факторов печени напрямую превращает фибробласты в гепатоцитоподобные клетки, этот процесс также называется трансдифференцировкой (Huang et al., 2011, 2014; Секия и Сузуки, 2011 г .; Du et al., 2014). Примечательно, что гепатоциты, полученные в результате дифференцировки или трансдифференцировки ПСХ, показали сравнимые функции во многих аспектах (Gao et al., 2017). Трансдифференцированные гепатоциты могут самоорганизовываться в органоиды с улучшенными функциями гепатоцитов в пластинах со сверхнизким сцеплением (Yamamoto et al., 2018; Sun et al., 2019). Важно отметить, что гепатоциты в органоидах имели многоугольную форму и имели овальные ядра и структуры желчных канальцев, что указывает на усиление полярности печени.Более того, органоиды гепатоцитов продемонстрировали улучшенную экспрессию генов гепатоцитов и функции в секреции альбумина, хранении гликогена, метаболизме лекарств и транспортировке липидов (Sun et al., 2019). Механистически активация передачи сигналов Hippo, как предполагается, является критической для созревания печени в самоорганизующихся органоидах печени. Пониженные ядерные уровни Yap, которые, возможно, опосредованы внутриклеточной реорганизацией актина, способствовали остановке роста и функциональной дифференцировке этих трансдифференцированных органоидов гепатоцитов (Yamamoto et al., 2018).

    Самоорганизация первичных клеток печени

    Первичные клетки, выделенные из печени взрослых в физиологических или патологических условиях, также обладают способностью расти в виде органоидов. Гепатобласты эмбриональной мыши Lgr5 + или индуцированные повреждением клетки печени взрослой мыши Lgr5 + могут размножаться как бипотентные органоиды-предшественники in vitr o, которые демонстрируют способность дифференцироваться в функциональные гепатоциты (Huch et al., 2013; Prior et al. al., 2019). Недавно PH, выделенные от мышей, были способны интенсивно пролиферировать in vitro в виде органоидов или бипотентных клеток-предшественников под действием агонистов Wnt, ингибиторов TGFβ или вызванного повреждением воспалительного цитокина TNFα различными группами (Katsuda et al., 2017; Hu et al., 2018; Peng et al., 2018). Примечательно, что органоиды гепатоцитов мыши могут размножаться в течение 2–3 месяцев in vitro, с индукцией маркеров желчных путей и маркеров клеток-предшественников под руководством агонистов Wnt (Hu et al., 2018), тогда как для TNFα-индуцированных клеток можно было пассировать в течение ~ 6 месяцев без экспрессии этих маркеров желчных путей или предшественников (Peng et al., 2018). В целом, пролиферирующие органоиды гепатоцитов мышей воспроизводили паттерны экспрессии генов пролиферации гепатоцитов после частичной гепатэктомии (PHx) in vivo .

    Важно отметить, что несколько групп сообщили об условиях культивирования для долгосрочной экспансии гепатоцитов взрослого человека в виде бифенотипических или печеночных клеток-предшественников in vitro .Поразительно, что когда эти разросшиеся бифенотипические клетки были агрегированы и далее культивированы как органоиды, они повторно дифференцировались в зрелые гепатоциты с резким улучшением функции печени и значительной потерей свойств предшественников (Zhang et al., 2018; Fu et al. , 2019). Важно отметить, что в этих органоидах были обнаружены двухъядерные клетки, что было отличительной чертой зрелых гепатоцитов (Zhang et al., 2018). Помимо гепатоцитов взрослых, гепатоциты, выделенные из печени плода человека, были установлены в органоидах, которые поддерживали важные функции и структуры печени в течение нескольких месяцев (Hu et al., 2018). Также стоит упомянуть, что первичные протоковые клетки человека EpCAM + можно было легко размножить как бипотентные клетки-предшественники в определенных условиях 3D-культивирования. Стабильные по геному клональные культуры могли даже инициироваться из одноклеточных клеток, и все органоиды проявляли типичный протоковый фенотип (Huch et al., 2015).

    Комплекс органоидов печени

    Сложные органоиды печени, состоящие из нескольких типов клеток, были созданы в нескольких лабораториях с упором на развитие сосудистой или желчевыводящей систем.Формирование сосудистой сети эндотелиальными клетками имеет фундаментальное значение для питания и доставки кислорода в орган. Для создания васкуляризованных органоидов печени человеческие эндотелиальные клетки, полученные из эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) или дифференцировки PSC, мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и клетки печеночной энтодермы, полученные из PSC, культивировали вместе в пластинах со сверхнизким сцеплением. Эти клетки образовывали агрегаты и генерировали зачатки печени человека через 1-2 дня (Takebe et al., 2013, 2017). Факторы, зависимые от стромальных клеток, участвовали в формировании зачатков печени.Эндотелиальная сеть была однородно распределена в органоидах. Примечательно, что после трансплантации in vivo зачатки печени, соединенные с сосудами хозяина, и кровеносные сосуды стали беспрепятственными и имели ту же плотность и морфологию, что и сосуды печени взрослых (Takebe et al., 2013). Однако различные типы клеток в зачатках печени не показали четких признаков организованных структур при гистологическом анализе. В другом исследовании семена ткани печени человека были сконструированы путем конструирования человеческих PH, эндотелиальных клеток и стромальных клеток по заранее подготовленному образцу, основанному на клеточных сигнальных сетях в процессе регенерации.После транзиторной культуры in vitro они были приживлены мышам с печеночной недостаточностью, что позволяет лучше размножать искусственные органоиды печени в ответ на регенеративные сигналы по сравнению со случайно организованными клетками (Stevens et al., 2017).

    Для билиарной системы холангиоциты проходят вдоль желчных протоков для транспортировки желчи, выделяемой гепатоцитами, из печени. В отличие от васкуляризованных органоидов, генерируемых сборкой нескольких типов клеток, гепатобилиарные органоиды в основном генерировались протоколами, использующими ко-дифференцировку гепатоцитов и холангиоцитов из PSCs, которые повторяли несколько ключевых аспектов органогенеза печени in vivo .Гепатоциты были плотно собраны в органоидах гепатобилиарной системы, в то время как холангиоциты имели кистозные структуры. Хотя обе клетки представляли структуры, аналогичные гепатоцитам и холангиоцитам in vivo , они не были организованы по схеме зонирования, соответствующей структурам печени in vivo , и не выполняли экзокринные функции (Guan et al., 2017; Wu et al., 2019 ). Будущие попытки усилить структуры и клеточные взаимодействия в печени необходимы для создания сложных органоидов печени (Таблица 1).

    Применение органоидов печени

    Появление органоидов обогащает инструментарий моделирования эмбрионального развития, регенерации тканей взрослых и заболеваний, а также способствует развитию регенеративной медицины будущего. Что касается органоидов печени, для их применения было разработано множество протоколов (рис. 2).

    Рисунок 2

    Текущие применения органоидов печени. Органоиды печени, полученные от здоровых доноров, представляют собой идеальные модели для понимания фундаментальных биологических процессов в печени, включая эмбриональное развитие и регенерацию.Они также показывают потенциал в моделировании заболеваний печени. Органоиды, полученные из образцов больных, включая органоиды рака, воспроизводят оригинальные черты пациентов. Более того, редактирование генов, вирусные инфекции и введение лекарств в органоиды печени могут моделировать возникновение и процессы развития заболеваний, включая возникновение рака печени и хронические или наследственные заболевания. Будем надеяться, что здоровые органоиды печени можно будет применить в регенеративной медицине. Они являются идеальными моделями для проверки различных лекарств и трансляционных исследований в клинике.

    Рисунок 2

    Текущие применения органоидов печени. Органоиды печени, полученные от здоровых доноров, представляют собой идеальные модели для понимания фундаментальных биологических процессов в печени, включая эмбриональное развитие и регенерацию. Они также показывают потенциал в моделировании заболеваний печени. Органоиды, полученные из образцов больных, включая органоиды рака, воспроизводят оригинальные черты пациентов. Более того, редактирование генов, вирусные инфекции и введение лекарств в органоиды печени могут моделировать возникновение и процессы развития заболеваний, включая возникновение рака печени и хронические или наследственные заболевания.Будем надеяться, что здоровые органоиды печени можно будет применить в регенеративной медицине. Они являются идеальными моделями для проверки различных лекарств и трансляционных исследований в клинике.

    Развитие и регенерация печени

    Развитие эмбриональной печени и регенерация печени у взрослых зависят от согласованного взаимодействия множественных сигнальных путей. Однако функции этих сигнальных путей остаются в значительной степени нерешенными. Органоиды печени, происходящие из PSC, представляют собой модель для изучения фундаментальных процессов во время развития печени.Органоиды печени, которые дифференцируются от ПСХ, включая органоиды гепатоцитов, органоиды холангиоцитов и органоиды гепатобилиарной системы, проходят ступенчатую дифференцировку и до некоторой степени повторяют развитие печени in vivo . Используя преимущества органоидов печени, было обнаружено, что паракринные сигналы, полученные от мезенхимальных или эндотелиальных клеток, способствуют созреванию органоидов печени из PSCs, что, по-видимому, является моделью для повторения взаимодействий между стромальными и эпителиальными клетками в развитии печени (Asai et al. ., 2017; Кэмп и др., 2017).

    Более того, органоиды печени, полученные из клеток с унаследованными мутациями, предоставляют новые модели для анализа аномалий развития, вызванных этими мутациями. Путь Notch важен для образования желчных путей, а мутации JAG1, одного из лигандов Notch, вызывают синдром Аладжиля (ALGS), аутосомно-доминантное генетическое заболевание. Действительно, органоиды печени, генерированные клетками пациентов с ALGS, показали нарушение образования холангиоцитов, что представляет собой модель для исследования пути Notch в развитии желчных протоков (Guan et al., 2017).

    Печень обладает замечательной регенеративной способностью. Терминально дифференцированные гепатоциты и холангиоциты пластичны для регенерации печени при состояниях повреждения либо посредством саморепликации, либо путем преобразования клонов (Li et al., 2016). Гепатоцит-зависимая пролиферация восстанавливает потерянную массу печени после PHx. Интересно, что растущие органоиды мышиных гепатоцитов in vitro показали сходные профили транскрипции с профилями пролиферирующих гепатоцитов после PHx, предполагая повторение регенерации in vitro (Hu et al., 2018). После хронического повреждения печени или желчных протоков гепатоциты, как было установлено, подвергаются репрограммированию в клетки, подобные предшественникам, для регенерации, и передача сигналов Hippo-Yap, по-видимому, играет существенную роль (Li et al., 2019). В самом деле, активация YAP в органоидах, происходящих из перфузированных гепатоцитов, индуцирует экспрессию эндогенных генов предшественников печени и демонстрирует сильную клоногенную способность, подтверждая, что передача сигналов Hippo может контролировать судьбу клеток печени (Yimlamai et al., 2014). Резидентные взрослые холангиоциты также могут регенерировать печень после хронического повреждения (Raven et al., 2017; Deng et al., 2018; Manco et al., 2019; Russell et al., 2019). Было показано, что органоиды холангиоцитов KRT19 + конвертируются в гепатоциты с экспрессией альбумина, но не KRT19, при трансплантации в CCl 4 -реторсин-индуцированное острое повреждение печени (Huch et al., 2015). Путем сравнения транскриптомных и эпигенетических регуляторов органоидов холангиоцитов с холангиоцитами в печени, поврежденной гепатотоксином 3,5-диэтоксикарбонил-1,4-дигидроколлидин (DDC), были выявлены аналогичные изменения во всем геноме, которые были лицензированы посредством TET1-опосредованного гидроксиметилирования. которые также подтвердили, что органоид печени является моделью для изучения регенерации тканей при повреждениях печени (Aloia et al., 2019).

    Органоиды печени также могут имитировать регенерацию гепатоцитов во время гомеостаза печени. Недавнее исследование показало, что Wnt-чувствительные клетки посредством мечения Axin2 действуют как предшественники во время физиологических условий (Wang et al., 2015). Путем выделения Lgr5 + Wnt-чувствительных клеток в CCl 4 -поврежденной печени было обнаружено, что клетки Lgr5 + широко размножаются в культуре органоидов (Huch et al., 2013). Клональные органоиды экспрессировали множественные маркеры клонов гепатоцитов, что указывает на возможную популяцию Wnt-чувствительных предшественников в печени.Роль клеток-предшественников Axin2 + или Lgr5 + , однако, оставалась спорной, поскольку другие независимые эксперименты показали ограниченный вклад этих клеток в регенерацию печени (Planas-Paz et al., 2016; Ang et al., 2019; Chen et al., 2020; Sun et al., 2020). Тем не менее органоиды печени предлагают удобный способ изучить процесс регенерации и могут дать представление о том, как управлять процессом регенерации.

    Моделирование рака печени

    Рак печени занимает шестое место по распространенности и четвертое место среди злокачественных новообразований во всем мире (Bray et al., 2018). Поздняя диагностика и неоднородность опухоли способствуют высокой смертности пациентов с раком печени (Marquardt et al., 2015). Генная инженерия органоидов гепатоцитов или холангиоцитов с потенциальными онкогенами-драйверами обеспечивает управляемую и выполнимую систему для моделирования инициации рака печени. Также возможно изучить структурные и функциональные изменения во время канцерогенеза в сконструированных органоидах.

    Путем введения c-MYC, важного онкогена гепатоцеллюлярной карциномы человека (ГЦК), в органоиды, полученные из трансдифференцированных гепатоцитов, Sun et al.(2020) наблюдали чрезмерные контакты между митохондриями и мембранами эндоплазматического ретикулума, что оказалось нераспознанным онкогенным событием в канцерогенезе печени (Sun et al., 2019). Более того, отслеживая процесс индуцированного RAS канцерогенеза в органоидах гепатоцитов, гепатоциты постепенно экспрессировали маркеры холангиоцитов, такие как CK7, CK19, SOX9 и SPP1, и начали обладать внутриклеточными полостями, заполненными микроворсинками, отличительной ультраструктурой внутрипеченочной холангиокарциномы (ICC ) клетки (Sun et al., 2019). Это была первая документация о превращении гепатоцитов человека в клетки ICC, поэтому подтверждается, что гепатоциты могут быть клеткой происхождения для ICC. Другие распространенные гены рака также были проанализированы в органоидах гепатоцитов и холангиоцитов. Мутации, влияющие на предложенный эпигенетический регулятор BAP1, деубиквитинирующий фермент, участвуют в ICCs (Jiao et al., 2013). Утрата функции BAP1 органоидами холангиоцитов человека нарушает организацию эпителия и полярность клеток. Геномный анализ показал, что дефицит BAP1 в органоидах холангиоцитов человека влияет на доступность хроматина, связанного с соединительными и цитоскелетными генами, что, по-видимому, имеет решающее значение для приобретения злокачественных признаков в ICC человека (Таблица 2; Artegiani et al., 2019).

    Таблица 2

    Моделирование заболеваний печени с помощью органоидов .

    0 CC , 2019 3 9215 жир18 3 9215 жир18 Органоиды печени, полученные из PSC + МСК печени плода
    Вид заболеваний . Название болезней . Особенности болезней . Содержание органоидов печени . Список литературы .
    Рак печени HCC PDO Игловая биопсия Nuciforo et al., 2018
    Образцы опухолей Broutier et al., 2017
    HCC с мутацией c-MYC Репрограммированные органоиды, полученные из гепатоцитов Sun et al., 2019
    Игловая биопсия Nuciforo et al., 2018
    Образцы опухолей Broutier et al., 2017
    ICC с мутацией RAS Репрограммированные органоиды, полученные из гепатоцитов 3 Sun et al.
    CC с мутацией BAP1 Первичные холангиоциты Artegiani et al., 2019
    CHC PDOs Образцы опухоли Broutier
  • 0 и др.
  • Вирусная инфекция Инфекция HBV Органоиды, производные от PH Fu et al., 2019
    Васкуляризованные органоиды печени (производные от PSC) Nie et al., 2018
    Жировая болезнь печени Стеатогепатит Органоиды печени, полученные из PSC (гепатоциты, холангиоциты, звездчатые клетки и клетки типа Купфера) Ouchi et al., 2019
    Wang et al., 2019
    Фиброз Фиброз, вызванный лекарственными средствами HSCs + HepaRG Coll et al., 2018; Leite et al., 2016
    Пороки развития печени Генетические нарушения Дефицит A1AT Органоиды холангиоцитов, полученные от пациентов Huch et al., 2015
    ALGS PSC-производные , 2017
    Муковисцидоз с мутацией CFTR Органоиды холангиоцитов, происходящие из PSC Ogawa et al., 2015; Сампазиотис и др., 2015
    3 fatty183 PSC fatty183 -производные органоиды печени + МСК печени плода
    Тип заболеваний . Название болезней . Особенности болезней . Содержание органоидов печени . Список литературы .
    Рак печени HCC PDO Игловая биопсия Nuciforo et al., 2018
    Образцы опухоли 80 Broutier4 92 -183 с мутацией 9СС Репрограммированные органоиды, полученные из гепатоцитов Sun et al., 2019
    CC POD Игловая биопсия Nuciforo et al., 2018
    Образцы опухоли Broutier et al., 2017
    мутация, полученная с помощью гена ICC органоиды Sun et al., 2019
    CC с мутацией BAP1 Первичные холангиоциты Artegiani et al., 2019
    CHC PDOs , 2017
    Хронические заболевания печени Вирусная инфекция ВГВ Органоиды, производные от PH Fu et al., 2019
    Васкуляризированные органоиды печени (производные от PSC) Nie et al., 2018
    Жировая болезнь печени Стеатогепатит Органоиды печени, полученные из PSC (гепатоциты, холангиоциты, звездчатые клетки и клетки типа Купфера) Ouchi et al., 2019
    Wang et al., 2019
    Фиброз Фиброз, вызванный лекарствами HSCs + HepaRG Coll et al., 2018; Leite et al., 2016
    Заболевания печени, связанные с развитием Генетические нарушения Дефицит A1AT Органоиды холангиоцитов, полученные от пациентов Huch et al., 2015
    ALGS Органоиды, производные от ALGS Guan et al., 2017
    Муковисцидоз с мутацией CFTR Органоиды холангиоцитов, происходящие из PSC Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015
    Таблица 2

    Моделирование заболеваний печени с помощью органоидов .

    0 CC , 2019 3 9215 жир18 3 9215 жир18 Органоиды печени, полученные из PSC + МСК печени плода
    Вид заболеваний . Название болезней . Особенности болезней . Содержание органоидов печени . Список литературы .
    Рак печени HCC PDO Игловая биопсия Nuciforo et al., 2018
    Образцы опухолей Broutier et al., 2017
    HCC с мутацией c-MYC Репрограммированные органоиды, полученные из гепатоцитов Sun et al., 2019
    Игловая биопсия Nuciforo et al., 2018
    Образцы опухолей Broutier et al., 2017
    ICC с мутацией RAS Репрограммированные органоиды, полученные из гепатоцитов 3 Sun et al.
    CC с мутацией BAP1 Первичные холангиоциты Artegiani et al., 2019
    CHC PDOs Образцы опухоли Broutier
  • 0 и др.
  • Вирусная инфекция Инфекция HBV Органоиды, производные от PH Fu et al., 2019
    Васкуляризованные органоиды печени (производные от PSC) Nie et al., 2018
    Жировая болезнь печени Стеатогепатит Органоиды печени, полученные из PSC (гепатоциты, холангиоциты, звездчатые клетки и клетки типа Купфера) Ouchi et al., 2019
    Wang et al., 2019
    Фиброз Фиброз, вызванный лекарственными средствами HSCs + HepaRG Coll et al., 2018; Leite et al., 2016
    Пороки развития печени Генетические нарушения Дефицит A1AT Органоиды холангиоцитов, полученные от пациентов Huch et al., 2015
    ALGS PSC-производные , 2017
    Муковисцидоз с мутацией CFTR Органоиды холангиоцитов, происходящие из PSC Ogawa et al., 2015; Сампазиотис и др., 2015
    3 fatty183 PSC fatty183 -производные органоиды печени + МСК печени плода
    Тип заболеваний . Название болезней . Особенности болезней . Содержание органоидов печени . Список литературы .
    Рак печени HCC PDO Игловая биопсия Nuciforo et al., 2018
    Образцы опухоли 80 Broutier4 92 -183 с мутацией 9СС Репрограммированные органоиды, полученные из гепатоцитов Sun et al., 2019
    CC POD Игловая биопсия Nuciforo et al., 2018
    Образцы опухоли Broutier et al., 2017
    мутация, полученная с помощью гена ICC органоиды Sun et al., 2019
    CC с мутацией BAP1 Первичные холангиоциты Artegiani et al., 2019
    CHC PDOs , 2017
    Хронические заболевания печени Вирусная инфекция ВГВ Органоиды, производные от PH Fu et al., 2019
    Васкуляризированные органоиды печени (производные от PSC) Nie et al., 2018
    Жировая болезнь печени Стеатогепатит Органоиды печени, полученные из PSC (гепатоциты, холангиоциты, звездчатые клетки и клетки типа Купфера) Ouchi et al., 2019
    Wang et al., 2019
    Фиброз Фиброз, вызванный лекарствами HSCs + HepaRG Coll et al., 2018; Leite et al., 2016
    Заболевания печени, связанные с развитием Генетические нарушения Дефицит A1AT Органоиды холангиоцитов, полученные от пациентов Huch et al., 2015
    ALGS Органоиды, производные от ALGS Guan et al., 2017
    Муковисцидоз с мутацией CFTR Органоиды холангиоцитов, происходящие из PSC Ogawa et al., 2015; Сампазиотис и др., 2015

    Рисунок 3

    Будущие возможности органоидов печени. Будущие усилия будут сосредоточены на использовании преимуществ различных технологий, включая биоинженерию, запрограммированную самосборку и т. Д., Для сборки различных типов клеток печени в организованные и сложные органоиды печени. Мы могли бы представить себе создание крупномасштабной единицы печени или даже приобретение различных функциональных единиц органов для изучения связи между органами.

    Рисунок 3

    Будущие возможности органоидов печени. Будущие усилия будут сосредоточены на использовании преимуществ различных технологий, включая биоинженерию, запрограммированную самосборку и т. Д., Для сборки различных типов клеток печени в организованные и сложные органоиды печени. Мы могли бы представить себе создание крупномасштабной единицы печени или даже приобретение различных функциональных единиц органов для изучения связи между органами.

    PDO — еще одна полезная система для исследований рака.Они воспроизводят особенности первичного рака и позволяют анализировать рак на злокачественной стадии. PDO рака печени были установлены несколькими группами даже с использованием образцов, проколотых иглой. PDO рака печени были в основном получены из низкодифференцированных опухолей, с общей эффективностью 37,5% для резецированных образцов и 26% для образцов биопсии (Broutier et al., 2017; Nuciforo et al., 2018). PDO рака печени продемонстрировали гистологическую архитектуру и геномный ландшафт первичного рака печени и, что важно, смогли отразить внутриопухолевую гетерогенность (Nuciforo et al., 2018). Таким образом, PDO позволили выявить индивидуальную лекарственную чувствительность пациента и создать платформу для информирования о разработке лекарств. При тестировании in vitro PDO рака печени показали способность проявлять различную реакцию на сорафениб, препарат с ограниченным ответом у пациентов с ГЦК. Кроме того, скрининг лекарств в PDO рака печени выявил чувствительность к ингибитору ERK SCH772984, что указывает на ERK как потенциальную мишень для лечения рака печени (Таблица 2; Broutier et al., 2017).

    Моделирование других заболеваний печени

    Другие хронические заболевания печени были смоделированы органоидами печени, включая инфекцию вируса гепатита B (HBV), стеатоз и фиброз, которые являются обычными явлениями и не требуют соответствующей терапии. 3D-дифференцированные органоиды гепатоцитов, полученные из пролиферированных ЛГ или образцов печени, были использованы при вирусных инфекциях хозяина (Fu et al., 2019). NTCP, рецептор входа HBV, экспрессировался после образования органоидов гепатоцитов. После инфицирования HBV эти органоиды гепатоцитов продуцировали основной транскрипт HBV 3.5 т.п.н. и матричная кзкДНК вирусной транскрипции, что предполагает репликацию HBV в органоидах гепатоцитов (Fu et al., 2019). Сложные органоиды печени, образующиеся в результате самосборки гепатоцитов, происходящих из PSC, MSC и HUVEC, послужили еще одной моделью для исследований HBV (Nie et al., 2018). NTCP экспрессировался на еще более высоком уровне в органоидах после сокультивирования с MSC и HUVEC. Более того, этот сложный органоид печени может поддерживать долгосрочное распространение HBV, сопровождающееся печеночной дисфункцией и измененной ультраструктурой печени (Таблица 2; Nie et al., 2018).

    Факторы риска многих хронических заболеваний печени влияют как на гепатоциты, так и на другие типы клеток. Сложные органоиды разработаны для моделирования сложных межклеточных взаимодействий при стеатогепатите. Человеческие PSC были дифференцированы до органоидов, содержащих гепатоцитоподобные клетки, HSC, холангиоциты и клетки Купфера. Примечательно, что после лечения свободными жирными кислотами такие органоиды печени становились стеатозными, фиброзными и инфильтрировались иммунными клетками, что было ключевой особенностью пациентов со стеатогепатитом (Ouchi et al., 2019). Органоиды печени, полученные в результате совместного культивирования клеток hepaRG и HSC, использовали для оценки фиброгенеза. Воздействие на органоиды TGFβ и тиоацетамида индуцировало экспрессию маркера фиброза и секрецию проколлагена типа I. Эти органоиды также показали ответ на токсичность, опосредованную гепатоцитами, что указывает на подходящую модель для изучения фиброза, вызванного лекарственными средствами (Leite et al., 2016; Coll et al., 2018). Другие сокультивировали органоиды печени, полученные из PSC, с МСК, и эти органоиды реагировали на этанол и демонстрировали патологические изменения, связанные с алкогольными заболеваниями печени (Таблица 2; Wang et al., 2019).

    Существуют исследования, в которых гепатоциты и холангиоциты, полученные от пациентов, используются для создания органоидов при моделировании генетических заболеваний. С этой целью органоиды пациентов с дефицитом A1AT (Huch et al., 2015), ALGS (Guan et al., 2017), муковисцидозом (Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015) и болезнью Вулмана (Ouchi et al., 2019), как сообщается, резюмируют развитие этих заболеваний и служат платформой для изучения реакции на лекарства (таблица 2).

    Трансляционные исследования в регенеративной медицине

    Трансплантация печени — единственное эффективное средство лечения пациентов с терминальными заболеваниями печени.Однако отсутствие надлежащих доноров ограничивает применение трансплантации печени. Одна из целей применения органоидов — служить альтернативным решением для трансплантации органов печени. Было показано, что фетальные органоиды, производные от PH, прививают и повторно заселяют поврежденную печень у мышей с дефицитом фумарилацетоацетатгидролазы (FAH), модели фатального метаболического заболевания печени (Hu et al., 2018). Примечательно, что трансплантат органоида быстро рос через 1 месяц, а повторно заселенные клетки продолжали экспрессировать печеночные маркеры в течение продолжительного периода 2–3 месяцев.Между тем, клетки в трансплантатах органоидов стали более зрелыми и практически не экспрессировали фетальный маркер гепатоцитов AFP (Hu et al., 2018). Васкуляризированные зачатки печени также трансплантировали мышам с печеночной недостаточностью. Действительно, трансплантация зачатков печени, содержащих клетки печени энтодермы, полученные из PSC, стромальные клетки и эндотелиальные клетки, улучшила выживаемость мышей TK-NOG, у которых развилась печеночная недостаточность после лечения ганцикловиром (Takebe et al., 2013). В сыворотке мышей были обнаружены более высокие уровни секреции человеческого альбумина, а также улучшенная способность специфичного для человека метаболизма диклофенака (Takebe et al., 2017).

    Массовое производство органоидов печени с воспроизводимостью прольет свет на их использование в клиниках. Криоконсервированные человеческие PH могут быть увеличены до 10000 раз после нескольких пассажей, которые могут быть трансплантированы и могут быть в дальнейшем разработаны для трансляционных исследований (Zhang et al., 2018). Человеческие клетки LGR5 + могли подвергаться крупномасштабной экспрессии и дифференцировке во вращающихся колбах. Через 6 недель было приобретено всего 10 10 –10 12 клеток с начальным количеством 10 6 клеток (Schneeberger et al., 2020). Расширение васкуляризованных зачатков печени человека, происходящих из PSC, на платформе для омнилуночных массивов культур обеспечивает способ получения> 10 8 органоидов с воспроизводимыми функциями печени и терапевтическими преимуществами при лечении животных с печеночной недостаточностью (Takebe et al., 2017). Действительно, чтобы ускорить применение органоидов в клинической практике, в настоящее время в Японии создается центр по трансплантации васкуляризированных зачатков печени для исследований на крупных животных и лечения метаболических заболеваний печени у детей (Takebe et al., 2018).

    Перспективы

    Органоиды печени представляют собой полезный инструмент для исследований развития и регенерации печени. Благодаря включению клеток и среды обитания, органоиды печени могут также широко применяться для моделирования хронических заболеваний печени, гепатита, заболеваний желчевыводящих путей, метаболических заболеваний, сосудистых нарушений и рака печени, чтобы понять основные патологические механизмы и найти потенциальные методы лечения. Помимо моделирования заболеваний печени у взрослых, будущие усилия позволят создать органоиды гепатоцитов плода или органоиды гепатобластомы для изучения детских заболеваний печени, таких как атрезия желчных путей, ALGS, болезнь Вильсона и, в частности, гепатобластома, наиболее распространенный рак печени плода.

    В частности, из-за своей специфической способности к метаболизму органоиды печени открывают большие перспективы для тестирования лекарств в клинике. Были созданы биобанки клеточных линий и органоидов печени человека, которые будут расширены с высокими ожиданиями в отношении тестирования эффективности и токсичности лекарств в клинических исследованиях и персонализированной медицине, поскольку они дают возможность отражать особенности тканей печени человека, включая основные функции и определенные неоднородности (Qiu et al., 2019). В качестве альтернативы, сконструированные органоиды рака печени могут быть в дальнейшем применены при моделировании и изучении инициации рака печени с дополнительных точек зрения для профилактической терапии.Обладая преимуществами улавливания молекулярных и структурных отклонений от введенных онкогенов, он представляет собой управляемую модель in vitro для понимания онкогенных процессов во время развития рака человека. Помимо генов-драйверов, раковые клетки микросреды играют важную роль во время прогрессирования и метастазирования рака печени. В будущем возможно и не менее важно включить другие типы клеток, такие как стромальные компоненты и иммунные клетки, для анализа клеточных взаимодействий и передачи сигналов во время канцерогенеза (Tuveson and Clevers, 2019).Более того, это была бы правдоподобная человеческая модель для изучения гормонов в зависимости от пола в развитии рака печени, который представлен с заметным преобладанием мужчин (Li et al., 2012).

    Несмотря на простоту и управляемость, современные органоиды печени все же несколько отличаются от сложных структур и функций их аналогов in vivo . Позиционные клеточные контакты и региональные сигнальные трансдукции, обеспечиваемые организованной структурой печени, также ответственны за лучшее моделирование развития, регенерации и заболеваний печени.Генерация органоидов со сложной и организованной структурой является первоочередной задачей в этой области, не ограничиваясь печенью. Наряду с другими родственными методами можно создавать сложные органоиды из нескольких типов тканей. Недавний прогресс в области анализа генома, сфокусированного на экспрессии генов и клеточных взаимодействиях, значительно расширил понимание развития органов in vivo, , что, по-видимому, принесет пользу развитию сложных органоидов in vitro за счет самоорганизации (MacParland et al., 2018; Aizarani et al., 2019). В самом деле, гепатобилиарно-панкреатические органоиды были недавно разработаны (Koike et al., 2019).

    Хотя самосборка дифференцированных клеток позволила развить сложные органоиды печени, такой процесс оказался спонтанным и не полностью контролируемым. Усовершенствованная инженерия, позволяющая точно контролировать питание и расположение клеток, может способствовать точности конструирования органоидов. Было показано, что создание сигнального центра с помощью генной инженерии часть клеток индуцирует сигнальные градиенты в органоидах мозга (Cederquist et al., 2019), что может помочь уточнить позиционную идентичность клеток органоидов печени. Синтетические элементы, такие как Notch и его лиганды, также могут быть разработаны и введены в органоиды для обеспечения специфического межклеточного контакта для программирования индивидуальной самосборки (Toda et al., 2018). В дополнение к этим инструментам, управляющим клеточной передачей сигналов, органоидные чипы обеспечивали точный контроль позиционных сигналов и среды ниши. Принцип конструирования органоидных чипов состоит в том, чтобы подготовить различные группы клеток с конкретными инструкциями по распределению и множественными условиями культивирования, аналогичными микроокружению in vivo , таким образом управляя формированием надлежащих структур (Park et al., 2019).

    В настоящее время органоиды печени имеют размер ∼100–500 мкм, что намного меньше размера реального органа. Человеческая печень находится в сантиметровом масштабе, с кровоснабжаемой сосудистой и билиарной системами. Увеличение количества органоидов печени потребуется для нескольких применений. Изготовление каркаса, который поддерживает упорядоченную сборку сети сосудов и печеночных клеток, окружающих перфузируемую сеть микроканалов, предоставило идею масштабируемого производства тканей миллиметрового размера (Zhang et al., 2016). Перфузионная сосудистая система in vitro может способствовать проникновению кислорода и питательных веществ, когда размер органоидов печени составляет> 200 мкм. Таким образом, кислород и питание будут поступать в открытый капилляр органоидов печени и соединяться с внешними сосудами. Недавно устойчивая перфузия реваскуляризованных каркасов печени была достигнута путем включения HUVEC в децеллюляризованную свиную печень (Shaheen et al., 2020). В перспективе мы ожидаем трансплантации печени в сантиметровом масштабе с прямым хирургическим анастомозом с сосудами пациента и установлением немедленной перфузии крови (рис. 3).

    Благодарности

    Мы благодарны докторам Люди Чжан, Кун Чжан, Чжэнтао Чжан и Цян Хэ из нашей лаборатории, а также доктору Юнвен Чжэн из Университета Цукуба, Япония, за их критическое прочтение рукописи и ценные предложения.

    Финансирование

    Это исследование проводится при поддержке Академии наук Китая (XDA16020201 и XDA12050104) и Национального научно-технического проекта «Программа создания и производства ключевых новых лекарств» (2018ZX0

    02-009).

    Конфликт интересов: Не объявлен.

    Список литературы

    Aizarani

    ,

    N.

    ,

    Saviano

    ,

    A.

    ,

    Sagar

    , et al. (

    2019

    ).

    Атлас клеток печени человека обнаруживает гетерогенность и эпителиальные предшественники

    .

    Природа

    572

    ,

    199

    204

    .

    Aloia

    ,

    L.

    ,

    McKie

    ,

    M.A.

    ,

    Vernaz

    ,

    G.

    и др. (

    2019

    ).

    Эпигенетическое ремоделирование лицензирует взрослые холангиоциты для образования органоидов и регенерации печени

    .

    Nat. Cell Biol.

    21

    ,

    1321

    1333

    .

    Ang

    ,

    C.H.

    ,

    Hsu

    ,

    S.H.

    ,

    Guo

    ,

    F.

    и др. (

    2019

    ).

    Lgr5 + перицентральные гепатоциты самоподдерживаются при нормальной регенерации печени и чувствительны к гепатоканцерогенезу

    .

    Proc. Natl Acad. Sci. США

    116

    ,

    19530

    19540

    .

    Artegiani

    ,

    B.

    ,

    van Voorthuijsen

    ,

    L.

    ,

    Lindeboom

    ,

    R.G.H.

    и др. (

    2019

    ).

    Исследование опухолевой супрессорной функции BAP1 в органоидах печени человека, созданных с помощью CRISPR

    . Стволовая клетка

    24

    ,

    927

    943.e6

    .

    Асаи

    ,

    А.

    ,

    Aihara

    ,

    E.

    ,

    Watson

    ,

    C.

    и др. (

    2017

    ).

    Паракринные сигналы регулируют созревание органоидов печени человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

    .

    Девелопмент

    144

    ,

    1056

    1064

    .

    Bhatia

    ,

    S.N.

    ,

    Андерхилл

    ,

    G.H.

    ,

    Зарет

    ,

    К.С.

    и др. (

    2014

    ).

    Клеточная и тканевая инженерия при заболеваниях печени

    .

    Sci. Пер. Med.

    6

    ,

    245ср2

    .

    Bray

    ,

    F.

    ,

    Ferlay

    ,

    J.

    ,

    Soerjomataram

    ,

    I.

    и др. (

    2018

    ).

    Глобальная статистика рака 2018: оценки GLOBOCAN заболеваемости и смертности от 36 раковых заболеваний в 185 странах во всем мире

    .

    CA Cancer J. Clin.

    68

    ,

    394

    424

    .

    Брутье

    ,

    Л.

    ,

    Mastrogiovanni

    ,

    G.

    ,

    Verstegen

    ,

    M.M.

    и др. (

    2017

    ).

    Культуры органоидов, полученных из первичного рака печени человека, для моделирования заболеваний и скрининга лекарственных средств

    .

    Nat. Med.

    23

    ,

    1424

    1435

    .

    Cakir

    ,

    B.

    ,

    Xiang

    ,

    Y.

    ,

    Tanaka

    ,

    Y.

    и др. (

    2019

    ).

    Разработка органоидов головного мозга человека с функциональной сосудистой системой

    .

    Nat. Методы

    16

    ,

    1169

    1175

    .

    Лагерь

    ,

    J.G.

    ,

    Sekine

    ,

    K.

    ,

    Gerber

    ,

    T.

    и др. (

    2017

    ).

    Многолинейная коммуникация регулирует развитие зачатка печени человека с плюрипотентностью

    .

    Природа

    546

    ,

    533

    538

    .

    Cederquist

    ,

    G.Y.

    ,

    Asciolla

    ,

    J.J.

    ,

    Tchieu

    ,

    J.

    и др. (

    2019

    ).

    Спецификация позиционной идентичности органоидов переднего мозга

    .

    Nat. Biotechnol.

    37

    ,

    436

    444

    .

    Chen

    ,

    F.

    ,

    Jimenez

    ,

    R.J.

    ,

    Шарма

    ,

    К.

    и др. (

    2020

    ).

    Широкое распространение пролиферации гепатоцитов в гомеостазе и регенерации печени

    .Стволовая клетка

    26

    ,

    27

    33.e4

    .

    Clevers

    ,

    H.

    (

    2016

    ).

    Моделирование развития и болезней с помощью органоидов

    .

    Ячейка

    165

    ,

    1586

    1597

    .

    Coll

    ,

    M.

    ,

    Perea

    ,

    L.

    ,

    Boon

    ,

    R.

    и др. (

    2018

    ).

    Создание звездчатых клеток печени из плюрипотентных стволовых клеток человека позволяет моделировать фиброз печени in vitro

    .Стволовая клетка

    23

    ,

    101

    113.e7

    .

    Crespo

    ,

    M.

    ,

    Vilar

    ,

    E.

    ,

    Tsai

    ,

    S.Y.

    и др. (

    2017

    ).

    Органоиды толстой кишки, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для моделирования колоректального рака и тестирования лекарств

    .

    Nat. Med.

    23

    ,

    878

    884

    .

    Дэн

    ,

    X.

    ,

    Zhang

    ,

    X.

    ,

    Li

    ,

    W.

    и др. (

    2018

    ).

    Хроническое повреждение печени вызывает превращение эпителиальных клеток желчных путей в гепатоциты

    .

    Стволовая клетка

    23

    ,

    114

    122.e3

    .

    Dianat

    ,

    N.

    ,

    Dubois-Pot-Schneider

    ,

    H.

    ,

    Steichen

    ,

    C.

    и др. (

    2014

    ).

    Получение функциональных холангиоцитоподобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и клеток HepaRG

    .

    Гепатология

    60

    ,

    700

    714

    .

    Du

    ,

    Y.

    ,

    Wang

    ,

    J.

    ,

    Jia

    ,

    J.

    и др. (

    2014

    ).

    Человеческие гепатоциты с лекарственной метаболической функцией, индуцированной из фибробластов путем перепрограммирования клонов

    . Стволовые клетки

    14

    ,

    394

    403

    .

    Fu

    ,

    G.B.

    ,

    Хуан

    ,

    Вт.J.

    ,

    Zeng

    ,

    M.

    и др. (

    2019

    ).

    Расширение и дифференциация клеток-предшественников печени, происходящих из гепатоцитов человека, и их использование для изучения гепатотропных патогенов

    .

    Cell Res.

    29

    ,

    8

    22

    .

    Gao

    ,

    D.

    ,

    Vela

    ,

    I.

    ,

    Sboner

    ,

    A.

    и др. (

    2014

    ).

    Органоидные культуры, полученные от пациентов с распространенным раком простаты

    .

    Ячейка

    159

    ,

    176

    187

    .

    Гао

    ,

    Ю.М.

    ,

    Чжан

    ,

    X.R.

    ,

    Zhang

    ,

    L.D.

    и др. (

    2017

    ).

    Различная экспрессия генов и эпигенетические сигнатуры в гепатоцитоподобных клетках, продуцируемых разными стратегиями от одного и того же донора

    .

    Stem Cell Rep.

    9

    ,

    1813

    1824

    .

    Гуань

    ,

    г.

    ,

    Xu

    ,

    D.

    ,

    Garfin

    ,

    P.M.

    и др. (

    2017

    ).

    Органоиды печени человека для анализа генетических заболеваний человека

    .

    JCI Insight

    2

    ,

    pii:

    .

    Харрисон

    ,

    S.E.

    ,

    Созен

    ,

    Б.

    ,

    Христодулу

    ,

    Н.

    и др. (

    2017

    ).

    Сборка эмбриональных и внеэмбриональных стволовых клеток для имитации эмбриогенеза in vitro

    .

    Наука

    356

    ,

    pii: eaal1810

    .

    Homan

    ,

    K.A.

    ,

    Gupta

    ,

    N.

    ,

    Kroll

    ,

    K.T.

    и др. (

    2019

    ).

    Васкуляризация и созревание органоидов почек с усилением потока in vitro

    .

    Nat. Методы

    16

    ,

    255

    262

    .

    Hu

    ,

    H.L.

    ,

    Gehart

    ,

    H.

    ,

    Artegiani

    ,

    B.

    и др. (

    2018

    ).

    Долгосрочное распространение функциональных гепатоцитов мыши и человека в виде трехмерных органоидов

    .

    Ячейка

    175

    ,

    1591

    1606.e19

    .

    Huang

    ,

    L.

    ,

    Holtzinger

    ,

    A.

    ,

    Jagan

    ,

    I.

    и др. (

    2015

    ).

    Моделирование протокового рака поджелудочной железы и скрининг лекарств с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток и опухолевых органоидов, полученных от пациентов

    .

    Nat. Med.

    21

    ,

    1364

    1371

    .

    Хуан

    ,

    P.Y.

    ,

    He

    ,

    Z.Y.

    ,

    Ji

    ,

    S.Y.

    и др. (

    2011

    ).

    Индукция функциональных гепатоцитоподобных клеток из фибробластов мыши определенными факторами

    .

    Природа

    475

    ,

    386

    389

    .

    Хуан

    ,

    P.Y.

    ,

    Чжан

    ,

    Л.Д.

    ,

    Гао

    ,

    Ю.М.

    и др. (

    2014

    ).

    Прямое перепрограммирование человеческих фибробластов в функциональные и расширяемые гепатоциты

    . Стволовые клетки

    14

    ,

    370

    384

    .

    Huch

    ,

    M.

    ,

    Dorrell

    ,

    C.

    ,

    Boj

    ,

    S.F.

    и др. (

    2013

    ).

    Экспансия in vitro единичных стволовых клеток печени Lgr5 + , индуцированная регенерацией, управляемой Wnt

    .

    Природа

    494

    ,

    247

    250

    .

    Huch

    ,

    M.

    ,

    Gehart

    ,

    H.

    ,

    van Boxtel

    ,

    R.

    и др. (

    2015

    ).

    Долгосрочная культура геном-стабильных бипотентных стволовых клеток из печени взрослого человека

    .

    Ячейка

    160

    ,

    299

    312

    .

    Jiao

    ,

    Y.

    ,

    Pawlik

    ,

    T.M.

    ,

    Андерс

    ,

    Р.A.

    и др. (

    2013

    ).

    Секвенирование экзома выявляет частые инактивирующие мутации в BAP1, ARID1A и PBRM1 во внутрипеченочных холангиокарциномах

    .

    Nat. Genet.

    45

    ,

    1470

    1473

    .

    Katsuda

    ,

    T.

    ,

    Kawamata

    ,

    M.

    ,

    Hagiwara

    ,

    K.

    и др. (

    2017

    ).

    Конверсия окончательно коммитированных гепатоцитов в культивируемые бипотентные клетки-предшественники с регенеративной способностью

    .Стволовые клетки

    20

    ,

    41

    55

    .

    Knouse

    ,

    K.A.

    ,

    Lopez

    ,

    K.E.

    ,

    Bachofner

    ,

    M.

    и др. (

    2018

    ).

    Для точности сегрегации хромосом в эпителии требуется архитектура ткани

    .

    Ячейка

    175

    ,

    200

    211.e13

    .

    Koike

    ,

    H.

    ,

    Iwasawa

    ,

    K.

    ,

    Ouchi

    ,

    R.

    и др. (

    2019

    ).

    Моделирование органогенеза печени, желчевыводящих путей и поджелудочной железы человека на границе передней и средней кишки

    .

    Природа

    574

    ,

    112

    116

    .

    Kopper

    ,

    O.

    ,

    de Witte

    ,

    C.J.

    ,

    Lõhmussaar

    ,

    K.

    , et al. (

    2019

    ).

    Органоидная платформа для рака яичников фиксирует неоднородность внутри и между пациентами

    .

    Nat. Med.

    25

    ,

    838

    849

    .

    Lancaster

    ,

    MA

    и

    Knoblich

    ,

    J.A.

    (

    2014

    ).

    Органогенез в чашке: моделирование развития и заболевания с использованием органоидных технологий

    .

    Наука

    345

    ,

    1247125

    .

    Ли

    ,

    S.H.

    ,

    Hu

    ,

    W.

    ,

    Matulay

    ,

    J.T.

    и др.(

    2018

    ).

    Развитие опухоли и лекарственный ответ на органоидных моделях рака мочевого пузыря, полученных от пациентов

    .

    Ячейка

    173

    ,

    515

    528.e17

    .

    Лейте

    ,

    S.B.

    ,

    Roosens

    ,

    T.

    ,

    El Taghdouini

    ,

    A.

    и др. (

    2016

    ).

    Новая модель органоида печени человека позволяет тестировать лекарственный фиброз печени in vitro

    .

    Биоматериалы

    78

    ,

    1

    10

    .

    Li

    ,

    D.

    ,

    Li

    ,

    W.

    и

    Hui

    ,

    L.

    (

    2016

    ).

    Гибридный гепатоцит: недавно идентифицированный игрок для регенерации при повреждениях печени

    .

    Гепатология

    64

    ,

    2244

    2246

    .

    Li

    ,

    W.

    ,

    Yang

    ,

    L.

    ,

    He

    ,

    Q.

    и др. (

    2019

    ).

    Гомеостатическое Arid1a-зависимое состояние пермиссивного хроматина лицензирует реактивность гепатоцитов на передачу сигналов YAP, связанных с повреждением печени

    .

    Стволовая клетка

    25

    ,

    54

    68.e5

    .

    Li

    ,

    Z.

    ,

    Tuteja

    ,

    G.

    ,

    Schug

    ,

    J.

    и др. (

    2012

    ).

    Foxa1 и Foxa2 необходимы для полового диморфизма при раке печени

    .

    Ячейка

    148

    ,

    72

    83

    .

    MacParland

    ,

    S.A.

    ,

    Liu

    ,

    J.C.

    ,

    Ma

    ,

    X.-З.

    и др. (

    2018

    ).

    Секвенирование одноклеточной РНК печени человека выявляет отдельные популяции внутрипеченочных макрофагов

    .

    Nat. Commun.

    9

    ,

    4383

    .

    Manco

    ,

    R.

    ,

    Clerbaux

    ,

    L.-A.

    ,

    Verhulst

    ,

    S.

    и др. (

    2019

    ).

    Реактивные холангиоциты дифференцируются в пролиферативные гепатоциты с эффективным восстановлением ДНК у мышей с хроническим повреждением печени

    .

    J. Hepatol.

    70

    ,

    1180

    1191

    .

    Marquardt

    ,

    J.U.

    ,

    Andersen

    ,

    J.B.

    и

    Thorgeirsson

    ,

    S.S.

    (

    2015

    ).

    Функциональная и генетическая деконструкция клеточного происхождения при раке печени

    .

    Nat. Rev. Cancer

    15

    ,

    653

    667

    .

    Миядзима

    ,

    А.

    ,

    Танака

    ,

    М.

    и

    Itoh

    ,

    T.

    (

    2014

    ).

    Стволовые клетки / клетки-предшественники в развитии, гомеостазе, регенерации и перепрограммировании печени

    . Стволовые клетки

    14

    ,

    561

    574

    .

    Moscona

    ,

    A.

    и

    Moscona

    ,

    H.

    (

    1952

    ).

    Диссоциация и агрегация клеток зачатков органов раннего куриного эмбриона

    .

    Дж.Анат.

    86

    ,

    287

    301

    .

    Накамура

    ,

    Т.

    и

    Сато

    ,

    Т.

    (

    2018

    ).

    Продвижение технологии кишечных органоидов в регенеративную медицину

    .

    Ячейка. Мол. Гастроэнтерол. Гепатол.

    5

    ,

    51

    60

    .

    Nie

    ,

    Y.Z.

    ,

    Zheng

    ,

    Y.W.

    ,

    Miyakawa

    ,

    K.

    и др.(

    2018

    ).

    Повторение взаимодействий вируса гепатита В с хозяином в органоидах печени из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

    .

    EBioMedicine

    35

    ,

    114

    123

    .

    Nuciforo

    ,

    S.

    ,

    Fofana

    ,

    I.

    ,

    Matter

    ,

    M.S.

    и др. (

    2018

    ).

    Органоидные модели рака печени человека, полученные на основе биопсии опухолевой иглы

    .

    Cell Rep.

    24

    ,

    1363

    1376

    .

    Ogawa

    ,

    M.

    ,

    Ogawa

    ,

    S.

    ,

    Bear

    ,

    C.E.

    и др. (

    2015

    ).

    Направленная дифференцировка холангиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток человека

    .

    Nat. Biotechnol.

    33

    ,

    853

    861

    .

    Огава

    ,

    S.

    ,

    Surapisitchat

    ,

    J.

    ,

    Виртанен

    ,

    C.

    и др. (

    2013

    ).

    Трехмерная культура и передача сигналов цАМФ способствуют созреванию гепатоцитов, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток человека

    .

    Девелопмент

    140

    ,

    3285

    3296

    .

    Оучи

    ,

    Р.

    ,

    Того

    ,

    С.

    ,

    Кимура

    ,

    М.

    и др. (

    2019

    ).

    Моделирование стеатогепатита у людей с помощью органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

    .

    Cell Metab.

    30

    ,

    374

    384.e6.

    Park

    ,

    S.E.

    ,

    Georgescu

    ,

    A.

    и

    Huh

    ,

    D.

    (

    2019

    ).

    Органоиды на чипе

    .

    Наука

    364

    ,

    960

    965

    .

    Peng

    ,

    W.C.

    ,

    Logan

    ,

    C.Y.

    ,

    Fish

    ,

    M.

    и др. (

    2018

    ).

    Воспалительный цитокин TNFα способствует долгосрочному размножению первичных гепатоцитов в 3D-культуре

    .

    Ячейка

    175

    ,

    1607

    1619.e15

    .

    Планас-Пас

    ,

    Л.

    ,

    Орсини

    ,

    В.

    ,

    Боултер

    ,

    Л.

    и др. (

    2016

    ).

    Модуль RSPO – LGR4 / 5 – ZNRF3 / RNF43 контролирует зонирование печени и размер

    .

    Nat. Cell Biol.

    18

    ,

    467

    479

    .

    Prior

    ,

    N.

    ,

    Hindley

    ,

    C.J.

    ,

    Rost

    ,

    F.

    и др. (

    2019

    ).

    Lgr5 + стволовые клетки и клетки-предшественники располагаются на вершине гетерогенного эмбрионального пула гепатобластов

    .

    Разработка

    146

    ,

    pii: dev174557

    .

    Qian

    ,

    X.

    ,

    Song

    ,

    H.

    и

    Ming

    ,

    G.L.

    (

    2019

    ).

    Органоиды мозга: достижения, применения и проблемы

    .

    Разработка

    146

    ,

    pii: dev166074

    .

    Qiu

    ,

    Z.

    ,

    Li

    ,

    H.

    ,

    Zhang

    ,

    Z.

    и др. (

    2019

    ).

    Фармакогеномный ландшафт рака печени человека

    .

    Cancer Cell

    36

    ,

    179

    193.e11

    .

    Raven

    ,

    A.

    ,

    Lu

    ,

    W.Y.

    ,

    Man

    ,

    T.Y.

    и др. (

    2017

    ).

    Холангиоциты действуют как факультативные стволовые клетки печени при нарушении регенерации гепатоцитов

    .

    Природа

    547

    ,

    350

    354

    .

    Рассел

    ,

    J.O.

    ,

    Лю

    ,

    W.Y.

    ,

    Okabe

    ,

    H.

    и др. (

    2019

    ).

    Гепатоцит-специфическая делеция β-катенина при тяжелом поражении печени провоцирует дифференцировку холангиоцитов в гепатоциты

    .

    Гепатология

    69

    ,

    742

    759

    .

    Sachs

    ,

    N.

    ,

    de Ligt

    ,

    J.

    ,

    Kopper

    ,

    O.

    и др. (

    2018

    ).

    Живой биобанк органоидов рака груди фиксирует неоднородность болезни

    .

    Ячейка

    172

    ,

    373

    386.e10

    .

    Sampaziotis

    ,

    F.

    ,

    de Brito

    ,

    M.С.

    ,

    Мадригал

    ,

    П.

    и др. (

    2015

    ).

    Холангиоциты, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для моделирования заболеваний и проверки лекарственных средств

    .

    Nat. Biotechnol.

    33

    ,

    845

    852

    .

    Sato

    ,

    T.

    ,

    Vries

    ,

    R.G.

    ,

    Snippert

    ,

    H.J.

    и др. (

    2009

    ).

    Одиночные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинка in vitro без мезенхимальной ниши

    .

    Природа

    459

    ,

    262

    265

    .

    Schneeberger

    ,

    K.

    ,

    Sanchez-Romero

    ,

    N.

    ,

    Ye

    ,

    S.

    и др. (

    2020

    ).

    Крупномасштабное производство LGR5-положительных бипотенциальных стволовых клеток печени человека

    .

    Гепатология

    72

    ,

    257

    270

    .

    Sekiya

    ,

    S.

    и

    Suzuki

    ,

    A.

    (

    2011

    ).

    Прямое преобразование фибробластов мыши в гепатоцитоподобные клетки определенными факторами

    .

    Природа

    475

    ,

    390

    393

    .

    Шахин

    ,

    М.Ф.

    ,

    Joo

    ,

    D.

    ,

    Ross

    ,

    J.J.

    и др. (

    2020

    ).

    Устойчивая перфузия реваскуляризованной биоинженерной печени, гетеротопически трансплантированной свиньям с подавленным иммунитетом

    .

    Nat. Биомед. Англ.

    4

    ,

    437

    445

    .

    Сиодзири

    ,

    N.

    ,

    Kametani

    ,

    H.

    ,

    Ota

    ,

    N.

    и др. (

    2018

    ).

    Филогенетический анализ архитектуры печени позвоночных

    .

    J. Anat.

    232

    ,

    200

    213

    .

    Simian

    ,

    M.

    и

    Bissell

    ,

    M.J.

    (

    2017

    ).

    Органоиды: историческая перспектива мышления в трех измерениях

    .

    J. Cell Biol.

    216

    ,

    31

    40

    .

    Си-Тайеб

    ,

    K.

    ,

    Lemaigre

    ,

    F.P.

    и

    Duncan

    ,

    S.A.

    (

    2010a

    ).

    Органогенез и развитие печени

    .

    Dev. Ячейка

    18

    ,

    175

    189

    .

    Си-Тайеб

    ,

    К.

    ,

    Ното

    ,

    F.K.

    ,

    Nagaoka

    ,

    M.

    и др. (

    2010b

    ).

    Высокоэффективное создание гепатоцитоподобных клеток человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

    .

    Гепатология

    51

    ,

    297

    305

    .

    Song

    ,

    Z.

    ,

    Cai

    ,

    J.

    ,

    Liu

    ,

    Y.

    и др. (

    2009

    ).

    Эффективное образование гепатоцитоподобных клеток из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

    .

    Cell Res.

    19

    ,

    1233

    1242

    .

    Стивенс

    ,

    K.R.

    ,

    Scull

    ,

    M.A.

    ,

    Ramanan

    ,

    V.

    и др. (

    2017

    ).

    Расширение искусственно созданной ткани печени человека in situ на мышиной модели хронического заболевания печени

    .

    Sci. Пер. Med.

    9

    ,

    eaah5505

    .

    Sun

    ,

    L.

    ,

    Wang

    ,

    Y.

    ,

    Cen

    ,

    J.

    и др. (

    2019

    ).

    Моделирование инициации рака печени с помощью органоидов, полученных из напрямую перепрограммированных гепатоцитов человека

    .

    Nat. Cell Biol.

    21

    ,

    1015

    1026

    .

    Sun

    ,

    T.

    ,

    Pikiolek

    ,

    M.

    ,

    Orsini

    ,

    V.

    и др. (

    2020

    ).

    AXIN2 + перицентральные гепатоциты имеют ограниченный вклад в гомеостаз и регенерацию печени

    .

    Cell Stem Cell

    26

    ,

    97

    107.e6

    .

    Szkolnicka

    ,

    D.

    ,

    Farnworth

    ,

    S.L.

    ,

    Lucendo-Villarin

    ,

    B.

    и др. (

    2014

    ).

    Получение функциональных гепатоцитов из плюрипотентных стволовых клеток

    .

    Curr. Protoc. Stem Cell Biol.

    30

    ,

    1G.5.1

    1G.5.12

    .

    Takebe

    ,

    T.

    ,

    Sekine

    ,

    K.

    ,

    Enomura

    ,

    M.

    и др. (

    2013

    ).

    Васкуляризованная и функциональная печень человека из трансплантата зачатка органа, полученного с помощью ИПСК

    .

    Природа

    499

    ,

    481

    484

    .

    Takebe

    ,

    T.

    ,

    Sekine

    ,

    K.

    ,

    Kimura

    ,

    M.

    и др. (

    2017

    ).

    Массивное и воспроизводимое производство зачатков печени полностью из плюрипотентных стволовых клеток человека

    .

    Cell Rep.

    21

    ,

    2661

    2670

    .

    Takebe

    ,

    T.

    ,

    Wells

    ,

    J.M.

    ,

    Helmrath

    ,

    MA

    и др. (

    2018

    ).

    Стратегии центра органоидов для ускорения клинического перевода

    . Стволовые клетки

    22

    ,

    806

    809

    .

    Toda

    ,

    S.

    ,

    Blauch

    ,

    L.R.

    ,

    Тан

    ,

    S.K.Y.

    и др. (

    2018

    ).

    Программирование самоорганизующихся многоклеточных структур с синтетической межклеточной сигнализацией

    .

    Наука

    361

    ,

    156

    162

    .

    Tuveson

    ,

    D.

    и

    Clevers

    ,

    H.

    (

    2019

    ).

    Моделирование рака соответствует технологии органоидов человека

    .

    Наука

    364

    ,

    952

    955

    .

    Velasco

    ,

    S.

    ,

    Kedaigle

    ,

    A.J.

    ,

    Simmons

    ,

    S.K.

    и др. (

    2019

    ).

    Отдельные органоиды головного мозга воспроизводимо образуют клеточное разнообразие коры головного мозга человека

    .

    Природа

    570

    ,

    523

    527

    .

    Ван

    ,

    Б.

    ,

    Чжао

    ,

    Л.

    ,

    Fish

    ,

    M.

    и др. (

    2015

    ).

    Самовосстанавливающиеся диплоидные клетки Axin2 + способствуют гомеостатическому обновлению печени

    .

    Природа

    524

    ,

    180

    185

    .

    Wang

    ,

    S.

    ,

    Wang

    ,

    X.

    ,

    Tan

    ,

    Z.

    и др. (

    2019

    ).

    Расширяемые печеночные органоиды, полученные из ЭСК человека, обеспечивают терапевтическую репопуляцию печени и патофизиологическое моделирование алкогольного поражения печени

    .

    Cell Res.

    29

    , 1009–1026.

    Weiss

    ,

    P.

    и

    Taylor

    ,

    A.C.

    (

    1960

    ).

    Восстановление полных органов из одноклеточных суспензий куриных эмбрионов на поздних стадиях дифференцировки

    .

    Proc. Natl Acad. Sci. США

    46

    ,

    1177

    1185

    .

    van de Wetering

    ,

    M.

    ,

    Francies

    ,

    H.E.

    ,

    Фрэнсис

    ,

    Дж.М.

    и др. (

    2015

    ).

    Перспективное создание биобанка живых органоидов больных колоректальным раком

    .

    Ячейка

    161

    ,

    933

    945

    .

    Willyard

    ,

    C.

    (

    2015

    ).

    Восстание органоидов

    .

    Природа

    523

    ,

    520

    522

    .

    Виммер

    ,

    Р.А.

    ,

    Leopoldi

    ,

    A.

    ,

    Aichinger

    ,

    M.

    и др. (

    2019

    ).

    Органоиды кровеносных сосудов человека как модель диабетической васкулопатии

    .

    Природа

    565

    ,

    505

    510

    .

    Workman

    ,

    M.J.

    ,

    Mahe

    ,

    M.M.

    ,

    Trisno

    ,

    S.

    и др. (

    2017

    ).

    Сконструированные кишечные ткани, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, с функциональной кишечной нервной системой

    .

    Nat.Med.

    23

    ,

    49

    59

    .

    Wu

    ,

    F.

    ,

    Wu

    ,

    D.

    ,

    Ren

    ,

    Y.

    и др. (

    2019

    ).

    Получение гепатобилиарных органоидов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

    .

    J. Hepatol.

    70

    ,

    1145

    1158

    .

    Ямамото

    ,

    J.

    ,

    Удоно

    ,

    M.

    ,

    Miura

    ,

    S.

    и др. (

    2018

    ).

    Культура агрегации клеток индуцирует функциональную дифференцировку индуцированных гепатоцитоподобных клеток посредством активации передачи сигналов Hippo

    .

    Cell Rep.

    25

    ,

    183

    198

    .

    Yimlamai

    ,

    D.

    ,

    Christodoulou

    ,

    C.

    ,

    Galli

    ,

    G.G.

    и др. (

    2014

    ).

    Активность пути бегемота влияет на судьбу клеток печени

    .

    Ячейка

    157

    ,

    1324

    1338

    .

    Yui

    ,

    S.

    ,

    Nakamura

    ,

    T.

    ,

    Sato

    ,

    T.

    и др. (

    2012

    ).

    Функциональное приживление эпителия толстой кишки увеличивалось in vitro из одной взрослой стволовой клетки Lgr5 +

    .

    Nat. Med.

    18

    ,

    618

    623

    .

    Чжан

    ,

    Б.

    ,

    Монтгомери

    ,

    М.

    ,

    Чемберлен

    ,

    M.D.

    и др. (

    2016

    ).

    Биоразлагаемый каркас со встроенной сосудистой сетью для инженерии «орган на чипе» и прямого хирургического анастомоза

    .

    Nat. Матер.

    15

    ,

    669

    678

    .

    Zhang

    ,

    K.

    ,

    Zhang

    ,

    L.

    ,

    Liu

    ,

    W.

    и др. (

    2018

    ).

    Размножение первичных гепатоцитов человека in vitro с эффективной способностью к репопуляции печени

    .

    Cell Stem Cell

    23

    ,

    806

    819.e4

    .

    © Автор (ы) (2020). Опубликовано Oxford University Press от имени Journal of Molecular Cell Biology , IBCB, SIBS, CAS.

    Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.

    Полностью автоматизированный высокопроизводительный рабочий процесс для трехмерного химического скрининга органоидов среднего мозга человека

    Существенных изменений:

    1) В соответствии с общими требованиями к статье «Инструменты и ресурсы», поскольку это не полностью новая технология, а, скорее, усовершенствование HTS нейронных органоидов, новый метод следует должным образом сравнить и сравнить с существующими методами, используемыми в данной области. Рецензенты сочли, что в текущей рукописи отсутствуют прямые сравнения (что означает, что разные протоколы сравниваются бок о бок в одной лаборатории / партии).Это слабое место, особенно с учетом того, что в статье сделан сильный акцент на преимуществах этого метода над другими. Таким образом, требуется прямое сравнение этого протокола с опубликованным протоколом нервных сфероидов / органоидов. Это может включать протокол iPS-to-нейрон или, альтернативно, простой нейронный протокол (например, Sirenko et al., 2019). Последнее может быть наиболее подходящим, поскольку вопрос в том, чем эти новые органоиды лучше существующих нейрональных сфероидов, например для исследований токсичности. В идеале сравнения между протоколами должны включать измерения как функциональных данных, так и данных экспрессии генов, взятые бок о бок (не загруженные из наборов литературных данных, поскольку могут быть существенные различия от библиотеки к библиотеке и от лаборатории к лаборатории) и количественно выраженные в HTS- порядке, соответствующем.

    Мы ценим потребность рецензентов в дополнительном тщательном сравнении и провели обширные дополнительные эксперименты с более чем 10 000 органоидов. Для проведения строгого и справедливого сравнения мы выдвинули ряд требований:

    1) Мы хотели сравнить протоколы с использованием одних и тех же исходных клеточных линий, так как результаты дифференцировки могут широко варьироваться между разными клеточными линиями, как отмечали сами составители обзора.

    2) Чтобы учесть опасения, поднятые рецензентами относительно лабораторной вариабельности, мы хотели автоматизировать протокол сравнения на нашей платформе внутри компании, чтобы различия в вариабельности были присущи протоколу, а не проистекали из других факторов, включая ручные. обработка, оттаивание, пассирование и т. д.

    3) В идеале, протокол сравнения не использует матригель, поскольку известно, что он вызывает высокую вариабельность (Hughes et al., 2010, Proteomics; Jabaji et al., 2014, PLoS One; Tong et al., 2018). Мы чувствовали, что было бы проще сравнить другие протоколы без ECM с нашим для наиболее консервативного сравнения.

    Эти требования исключают использование кортикальных сфероидов, используемых Сиренко и др., Поскольку они использовали коммерчески доступные сфероиды, которые можно купить только в уже агрегированном состоянии / как готовый к использованию продукт.Компания, продающая эти сфероиды, не делает свои протоколы общедоступными, что не позволяет нам воспроизвести их работу в домашних условиях и использовать те же исходные клеточные линии для справедливого сравнения. С технической точки зрения сфероиды Сиренко и др. не обладают какой-либо заметной самоорганизацией, а представляют собой просто 2D-дифференцированные, повторно агрегированные нейронные культуры. Наши AMO значительно сложнее этого, демонстрируя отличную самоорганизованную архитектуру, которая приближает их к органоидным, а не сфероидным протоколам.

    Таким образом, мы решили сравнить наши AMO с другим широко используемым и принятым протоколом органоидов из лаборатории Pasca (Sloan et al., 2018), который имеет несколько преимуществ:

    1) Мы можем использовать ту же исходную клеточную линию, которая дала начало нашим AMO.

    2) Органоиды Pasca не требуют добавления матригеля для правильного созревания.

    3) Нам удалось полностью автоматизировать всю генерацию и анализ органоидов Паска в доме, используя ту же платформу, что и наши органоиды.

    В соответствии с запросами рецензентов, мы затем сравнили этот установленный протокол с нашим протоколом бок о бок с точки зрения:

    — экспрессия гена (рисунок 3 — приложение к рисунку 1)

    — функциональность / вариативность:

    > общая морфология и размер (рис. 7A, B, E и G)

    > жизнеспособность отдельных органоидов («CellTiterGlo3D», рис. 7F и H)

    > клеточная архитектура / структура и количественная экспрессия маркеров с помощью анализа изображений с высоким содержанием (Рисунок 7C, D, I и J, а также Рисунок 7 — приложение к рисунку 1)

    > электрическая активность (Рисунок 8H, I и J)

    — пригодность для испытаний на токсичность (рисунок 8 — приложение к рисунку 1).

    Мы можем количественно продемонстрировать, что широко принятый протокол по органоидам на основе hPSC, разработанный Sloan et al. имеет значительно большую степень изменчивости, чем наш протокол AMO, даже когда он полностью стандартизирован и автоматизирован.

    Мы хотели бы отметить, что адаптация протокола Sloan et al. в свободно масштабируемый рабочий процесс является значительным достижением, о котором, насколько нам известно, в литературе не сообщалось.

    2) Поскольку скрининг лекарственных средств является заявленной целью разработки такой автоматизированной платформы анализа на основе органоидов, было бы более информативным, если бы авторы включили данные для демонстрации% популяций зрелых клеток и более функциональную проверку на основе механизмов с конкретными фармакологическими исследованиями. инструменты (например,грамм. антагонисты дофаминового рецептора), в различных удобных для HTS считываниях, в дополнение к сигналу флуоресценции кальция и MEA, например, секреция дофамина (поскольку это органоиды среднего мозга с дофаминергическими нейронами) и жизнеспособность клеток (например, CellTiterGlo3D). Нейронные клетки-предшественники / предшественники, нейроны и астроциты в AMO очень хорошо охарактеризованы, как насчет олигодендроцитов? Можно ли предпринять шаги для обеспечения репрезентативного сочетания типов клеток ЦНС в AMOs?

    Мы согласны с рецензентами, что наша рукопись выигрывает от дополнительной функциональной характеристики наших AMO.Мы провели ряд дополнительных анализов, чтобы укрепить этот аспект нашей рукописи.

    — Мы количественно определили количество зрелых клеток в наших органоидах для двух отдельных клеточных линий и трех независимо размороженных и культивированных партий каждой (рис. 8D).

    — Мы продемонстрировали функциональные характеристики идентичности среднего мозга с использованием фармакологических агонистов и антагонистов для различных субпопуляций нейронов (рис. 8E-K).

    — Мы демонстрируем высвобождение дофамина в супернатант с помощью ELISA с уровнями, которые соответствуют или превышают уровни, обнаруженные в спинномозговой жидкости in vivo (рис. 8C).

    — Мы количественно оценили жизнеспособность клеток с помощью CellTiterGlo3D, продемонстрировав превосходную гомогенность по сравнению с органоидами, полученными из hIPSC (рис. 7F).

    — Мы отдельно количественно оценили выживаемость дофаминергических нейронов и других нервных популяций после специфической фармакологической абляции дофаминергических клеток. Это ясно подчеркивает актуальность и пригодность нашей модельной системы для настройки экранов на болезнь Паркинсона, например (см. Рис. 8A и B).

    Олигодендроциты возникают очень поздно в нервном развитии, и другие протоколы демонстрируют присутствие олигодендроцитов после 100 дней дифференцировки или более (например, см. Marton et al., 2019). Эти длительные временные рамки не очень привлекательны для разработки стратегий скрининга. Хотя наши smNPC способны эффективно генерировать олигодендроциты, как было опубликовано нашими коллегами (Reinhardt et al., 2013; Ehrlich et al., 2017), этого не произойдет в течение 30-50-дневного периода созревания, рекомендованного для скрининга от Наша сторона. Вместо этого мы отдаем предпочтение стратегиям, которые эктопически добавляют известное количество олигодендроцитов к нашим AMO и таким образом достигают состояния скрининга намного раньше (см. Наш раздел «Обсуждение») в системе с сингенными, но эктопически добавленными олигодендроцитами.

    3) Более глубокая оценка вариабельности от линии к линии и от партии к партии, с более подробным анализом контроля качества и оценкой клеток при большем увеличении и лучшей количественной оценке, была бы полезной для демонстрации однородности и качества структур. Авторы должны прокомментировать% лунок, продуцирующих органоиды, которые проходят QC, а затем% автоматизированного переноса AMO из планшета для очистки / визуализации, и какой% лунок в планшете для визуализации не проходят QC из-за высокого сигнала флуоресценции.Авторы должны лучше охарактеризовать воспроизводимость между AMO из независимых клеточных линий. На рис. 2 — дополнение к рисунку 2 протокол описывается в независимой строке, но просто характеризуется морфологией. Поскольку хорошо известно, что разные линии плюрипотентных стволовых клеток, особенно hiPSC, по своей сути обладают разными способностями к дифференцировке, количественная оценка маркеров нервных и нейрональных клеток также должна быть предоставлена, чтобы показать, что органоиды из независимых линий можно напрямую сравнивать с точки зрения клеточных ответов.Анализ qPCR, аналогичный тому, что представлен на рисунке 3, должен выполняться для AMO из независимой линии.

    Благодарим рецензентов и добавили запрашиваемую информацию:

    — Данные контроля качества с подробной информацией об эффективности различных этапов рабочего процесса теперь можно найти на Рисунке 1D. Наш рабочий процесс претерпел множество итераций по оптимизации, и в целом мы достигли уровня удержания образца 90% от начала (засева органоидов) до конца (вывод данных из визуализации высокого содержания).Мы довольно строго сообщали о неэффективности, поскольку 4,2% образцов, потерянных при переносе органоидов из культуры в планшеты для визуализации, можно практически исключить, просто повторив протокол автоматического переноса, чтобы поймать небольшое количество оставшихся «отставших».

    — Мы добавили количественный анализ высокого содержания для второй независимой клеточной линии и другого протокола, полученного из hiPSC, и сравнили их бок о бок на Рисунке 7. Данные подтверждают наше заявление о более высокой гомогенности и воспроизводимости даже между клеточными линиями.

    — Мы также количественно сравнили различные клеточные линии и протоколы с помощью кПЦР и представили данные рядом (см. Рисунок 3 — приложение к рисунку 1).

    Мы не уверены, что означает запрос «оценка клеток при большем увеличении». Мы демонстрируем разрешение отдельных клеток в настройках с высоким содержанием (рис. 6B и C) и, как правило, предоставляем данные флуоресценции, которые обеспечивают как обзорные изображения целых органоидов (что редко делается в литературе по органоидам из-за большого разброса структур), так и предоставляем увеличенные изображения, которые облегчают понимание клеточных идентичностей и подробные морфологии на уровне одной клетки, где это возможно (Рисунок 2B, D, F, G; Рисунок 2 — дополнение к рисунку 1; Рисунок 2 — приложение к рисунку 2B-G; Рисунок 2 — дополнение рисунка 3E-I; Рисунок 7— приложение к рисунку 1B, F и I и рисунок 8 — приложение к рисунку 1A, видео 1).Если мы сможем предоставить дополнительные изображения с высоким разрешением, укажите, и мы их предоставим.

    4) В тексте должно быть подробное объяснение и признание ограничений нового протокола. Другие сообщали об использовании нейральных клеток-предшественников для производства нейральных сфероидов с кортикальными нейронами и астроцитами, спонтанными синхронными кальциевыми волнами и потенциалами действия, а также с хорошей воспроизводимостью, позволяющей создавать HTS. Таким образом, описанная здесь стратегия использования NPC для получения более воспроизводимых нейронных агрегатов не является полностью новой, хотя, используя smNPC и описанный протокол дифференцировки, авторы получают агрегаты, которые включают зрелые нейроны (например.грамм. дофамин, другие?), нейральные предшественники и астроциты (по данным ИГХ и КПЦР) с организованным распределением клеток в различных концентрических зонах и с клеточной ориентацией, включая радиальное расположение, что, таким образом, классифицирует их как органоиды, хотя и не такие сложные, как те. ранее описано, начиная с ИПСК. Авторы называют это агрегаты автоматическими органоидами среднего мозга (AMO). Авторы должны признать жертву сложностью, которая обычно достигается в нейронных органоидах, происходящих из iPSC, в результате диссоциации и отсутствия микроглии.Исходя из smNPCs, можно предположить, что AMOs почти полностью происходят из нервной эктодермы. Это исключает некоторые важные типы нервных клеток, такие как микроглия, которые происходят из мезодермальных / гематопоэтических клонов. Могут ли авторы прокомментировать, является ли это недостатком их протокола, если представлены не все типы клеток ЦНС? Или прокомментируйте, можно ли включить модифицированный автоматизированный протокол, начинающийся с плюрипотентных стволовых клеток и включающий в себя этап управления кроветворными клетками-предшественниками?

    По запросу рецензентов мы внесли поправки в текст в нескольких местах, включая обсуждение, чтобы признать ранее опубликованные протоколы на основе NPC, а также относительную жертву сложности по сравнению с опубликованными органоидами ИПСК.Мы добавили целый раздел, описывающий влияние воспроизводимости на фенотипический скрининг в области 3D-культуры, и указали на отсутствие олигодендроцитов и микроглии в нашем протоколе.

    Хотя другие протоколы органоидов теоретически допускают образование микроглии «in situ» (Ormel et al., 2018), на практике они встречаются нечасто (Marton et al., 2019; Velasco et al., 2019). Поскольку спонтанная генерация микроглии в органоидах настолько редка, вариабельна и неэффективна, другие лаборатории прибегают к эктопическому добавлению их к своим органоидам (Abud et al., 2017; Lin et al., 2018; Muffat et al., 2019). Этот подход абсолютно возможен для нас, но исследование эктопического добавления других типов клеток может выходить за рамки этой рукописи. Мы добавили краткое обсуждение использования нашей воспроизводимой платформы в качестве клеточного каркаса для систематического добавления других представляющих интерес типов клеток, включая микроглию и олигодендроциты.

    Мы не уверены, что подразумевается под «… в результате диссоциации». Наш протокол не включает никаких шагов диссоциации, кроме создания суспензий отдельных клеток для начальной агрегации органоидов, которые являются общими для всех протоколов органоидов.

    5) Спонтанные синхронизированные кальциевые волны были обнаружены в AMO, показывающих функциональное соединение нейронов. Функциональная сетевая активность также отображается в AMO с использованием измерений MEA. По крайней мере, пара публикаций показала спонтанную синхронизированную кальциевую волну и сигнал MEA от нервных сфероидов и органоидов. (например, Cleber et al., 2019 и Sirenko et al., 2019), поэтому мы не считаем, что это первый раз, когда колебательные волны наблюдались в нервных агрегатах, как утверждают авторы.Как правило, авторы должны отозвать требования о приоритете («это было сделано впервые»).

    Мы благодарим рецензентов за указание на это. Претензия удалена.

    [Примечание редакции: до принятия были предложены дальнейшие исправления, как описано ниже.]

    Рецензенты также определили ряд областей, которые требуют доработки. В частности, очень важно, чтобы авторы смягчили некоторые из формулировок, описанных в их оценке протокола, по сравнению с другими протоколами и подходами в этой области.

    Мы смягчили язык некоторых отрывков в тексте, убрав утверждения о более высокой оценке нашего протокола по сравнению с другими протоколами.

    Рецензенты не полностью убеждены в том, что протокол дифференцировки органоидов лаборатории Паска был успешно принят и расширен, и это может повлиять на сравнения.

    См. Подробное обсуждение ниже.

    В рукописи также есть множество мелких ошибок, требующих внимания.

    Ниже приводится краткий список важных изменений. Обращение к ним значительно улучшит рукопись и сделает ее более подходящей для рассмотрения в качестве опубликованной рукописи.

    1) На рис. 4A-D, F-G необходимо включить единицы измерения по оси y.

    Спасибо — мы добавили недостающие ярлыки.

    2) Рисунок 8E-J, как показано, невозможно различить какие-либо эффекты от обработок на любой из панелей; возможно, следует отобразить преобразование Фурье, чтобы лучше проиллюстрировать эффекты обработок, и отображаемые в настоящее время кривые следует перенести на дополнительный рисунок.

    Мы согласны с рецензентами в том, что изменения в трассировках MEA было трудно различить. Мы последовали рекомендациям рецензентов и изменили графики на БПФ, что, к сожалению, также привело к таким же нечетким цифрам. Таким образом, мы решили представить данные MEA таким образом, чтобы визуально лучше разделять различные варианты лечения агонистами / антагонистами и в то же время лучше отображать временные отношения между различными частями экспериментальной процедуры.После регистрации базовой активности электрического поля для данного органоида мы сначала добавили агонист, а после регистрации сигнала под влиянием агониста — ингибитор к тому же образцу в той же чашке. В течение этого времени мы продолжали регистрировать напряженность электрического поля и сравнивали полученные изменения после кратковременного уравновешивания. Представляя эти графики на одной и той же оси координат во временной последовательности слева направо, мы надеемся прояснить, что эти измерения происходят из одного и того же образца и связаны во времени, устраняя при этом перекрывающиеся предыдущие графики.Наша цель со следами на рис. 8E-J состоит в том, чтобы передать прямое впечатление о необработанной активности электрического поля органоидов в качестве репрезентативного графика; для количественного сравнения кривых MEA мы включили все доступные повторные измерения MEA и нанесли абсолютные изменения напряженности электрического поля на рис. 8K.

    Следует отметить, что напряженность электрического поля зависит от расстояния до записывающего электрода. Органоиды, по сути, представляют собой свободно и случайно прикрепленные сферы на нижележащем массиве фиксированных 2D-электродов, и их случайное расположение вносит сильное изменение сигнала электрического поля от образца к образцу только в силу характера их размещения.Следовательно, для достижения количественных и сопоставимых измерений нам пришлось нормализовать любые потенциальные изменения активности к исходной базовой записи того же образца в том же месте чашки MEA, проявляя максимальную осторожность, чтобы не сместить органоид при введении жидкости.

    Мы также измерили эти органоиды после короткого периода прикрепления, так что они сохранили свою сферическую геометрию. Этот курс экспериментов является нашим лучшим приближением к достижению этой цели. Мы надеемся, что наш новый рисунок 8E-J теперь лучше отражает это.

    3) На рисунке 8K должно быть указано, какое измерение MEA использовалось в качестве «суммарного абсолютного сигнала», и должно быть хорошо включать столбцы ошибок и индикацию статистической значимости между условиями.

    Спасибо, что указали на это. Точный характер количественной оценки рисунка 8K действительно не был ясен. На рисунке показана сумма абсолютных колебаний потенциала электрического поля за 15 секунд времени. Обоснование этого состоит в том, что это позволит обнаруживать как изменения частоты, так и амплитуды колебательного сигнала.Таким образом, даже небольшие изменения должны четко проявляться при суммировании сигнала. На исходном рисунке 8K изображен только один репрезентативный набор данных, изображенный на рисунке 8E-J; однако новая версия теперь включает все n для всех условий, включая планки ошибок. С этой целью мы отредактировали текст и легенду рисунка.

    Мы также внесли поправки в соответствующий раздел «Материалы и методы», чтобы прояснить детали экспериментов MEA и их анализа.

    4) Рисунок 2 — в приложении 2 к рисунку необходимо включить единицы концентрации в графики зависимости от дозы: log (концентрация) в мкг / мл?

    Спасибо, что указали на это.Мы добавили соответствующие ярлыки.

    5) Приятно иметь, но не обязательно. На Рисунке 2 — приложение к рисунку 2: Для HTS для токсических эффектов важно установить надежные, быстрые и поддающиеся скринингу показания; CellTiterGlo является одним из них, и было бы также интересно посмотреть, вызывает ли G418 уменьшение размера сфероидов, измеренное с помощью светлопольной микроскопии?

    Размеры, безусловно, интересный, простой и надежный вариант для считывания в настройках HTS.Мы добавили измерения размеров органоидов для экспериментов по реакции на дозу на рис. 8 — приложение к рисунку 1, как предлагается. Процедура очистки делает органоиды почти полностью прозрачными, так что они больше не могут быть обнаружены на изображениях в светлом поле. Однако мы обычно измеряем размер органоидов с помощью флуоресцентной микроскопии как часть нашего стандартного процесса оптического анализа для последующей нормализации сигнала. Здесь мы получили эти данные.

    В этой конкретной экспериментальной установке, с нашей биологической системой и в проверенных временных рамках и концентрациях, мы не увидели каких-либо заметных изменений в размере органоидов.

    6) Анализ и сравнение между другими, обычно используемыми протоколами по органоидам мозга стали более ясными, чем раньше. Однако Sloan et al. протокольная часть вызывает ряд серьезных вопросов. Насколько эффективен был этот протокол?

    Автоматизированная генерация органоидов на основе ИПСК оказалась высокоэффективной; мы потеряли один органоид из 12 96-луночных планшетов за 30 дней культивирования (см. также раздел «Результаты»).

    Из 126 кортикальных органоидов, происходящих из ИПСК, подвергнутых высокому иммуноокрашиванию, 120 правильно дифференцировались по нервной судьбе, подтвержденной экспрессией MAP2 (см. Фиг. 7J).Один органоид был потерян во время обработки, 5 не прошли контроль качества изображения, и окрашивание MAP2 не могло быть подтверждено.

    На уровне РНК мы подтвердили экспрессию ряда релевантных ранних и поздних нейральных и глиальных маркеров с течением времени, включая в общей сложности 168 органоидов, расположенных в разных временных точках и партиях (подробности см. На рисунке 3 — приложение к рисунку 1). Следует отметить, что эти органоиды не подвергались никакому отбору перед анализом и представляют собой беспристрастную выборку.

    Более подробный анализ экспрессии белков подтвердил ожидаемые корковые маркеры, включая

    FoxG1, Ctip2, TBR1 и TBR2, Satb2 на 30, 40 и 50 день после агрегации (рисунок 7 — приложение к рисунку 2).На этом рисунке показан один репрезентативный образец, выбранный из n = 3 иммуноокрашенных образцов, все из которых были случайным образом взяты из 96-луночных планшетов. Все образцы показали экспрессию маркеров, как показано на рисунке 7 — приложение к рисунку 2.

    Мы показываем очень ранние временные точки для корковых органоидов на основе ИПСК. Когда мы сравниваем наши структуры (здесь 40-й день) с некоторыми из самых ранних изображений, доступных из оригинальной публикации Pasca et al., 2015, наши морфологии напоминают те, что показаны на 52-й день (см. Рисунок 7 — приложение к рисунку 2B).

    Говорят, что он был выполнен с модификациями. Пытались ли авторы использовать исходный немодифицированный протокол в качестве положительного контроля? Насколько я понимаю, некоторые различия включают:

    a) Фидер для выращивания клеток для начала бесплатный, а не на MEF (это так?)

    b) Сбор с использованием аккутазы вместо диспазы, что приводит к диссоциации iPS-клеток вместо образования структур, подобных эмбриоидным телам (это большая разница!).

    c) Не использовать среду нейронной индукции, описанную в этом документе

    Как пишет Sloan et al., производительность протокола представлена ​​как доказательство утверждения авторов о том, что их протокол является улучшением по сравнению с другими протоколами, это действительно должно быть тщательно указано. Лучше всего было бы четко обозначить внесенные изменения по сравнению с исходным протоколом, например, на дополнительном рисунке. Авторы также должны смягчить свои выводы и указать, что изменения могли повлиять на другой протокол.

    Все это очень важные моменты, и мы благодарим рецензентов за то, что они предложили более внимательный и дифференцированный подход к нашим сравнениям.

    Мы последовали рекомендациям рецензентов и включили новый дополнительный рисунок (рисунок 7 — рисунок в приложении 1), в котором подробно описаны изменения в исходных публикациях лаборатории Паска. Мы внесли поправки в текст, чтобы детализировать эти изменения и их потенциальное влияние на полученные органоиды. Мы смягчили формулировки, относящиеся к прямым сравнениям, и четко заявили, что изменения могут повлиять на биологический результат (см. Изменения в разделах «Результаты» и «Обсуждение»).

    Мы бы предпочли сравнить наш автоматизированный протокол с оригиналом; однако автоматизировать исходный протокол без поправок не представлялось возможным. Например, как правильно отметили обозреватели, мы использовали одноклеточные растворы из культуры без фидера вместо колоний из фидерных культур. Мы признаем, что использование суспензии отдельных клеток, а не колоний, изменяет биологию исходных условий и может повлиять на результат. Однако в автоматизированных системах с переваренными колониями сложно обращаться, поскольку они имеют тенденцию быстро оседать под действием силы тяжести, и невозможно с высокой степенью уверенности поместить одну колонию в лунку.С одноклеточными растворами мы могли легко гомогенизировать начальные условия для каждой лунки. Мы считали важным производить оба вида органоидов беспристрастным, автоматизированным и механически стандартизированным способом, чтобы четко отнести все различия к биологическим различиям, а не вручную. Мы внесли эти изменения не в пользу нашего протокола, а чтобы протестировать его самым строгим из доступных нам способов и в формате, который позволяет приложениям с высокой пропускной способностью, что является центральным принципом этой рукописи.

    Одно отличие заключается в стадии отделения культур — в Sloan et al. протокол, это на стадии iPS-клетки, тогда как в текущей рукописи шаг отсоединения / диссоциации находится на стадии нейрального предшественника. Это, вероятно, улучшит однородность структур / культур, но также может привести к более простым структурам, чем выполнение всего протокола от начала до конца с одной и той же чашкой с iPS-клетками. Было бы целесообразно указать на это в статье и признать ограничение начала с гомогенизированной культуры нейральных предшественников.В целом это не умалит данных авторов, но сделает их выводы более точными.

    Спасибо за отзыв, мы реализовали этот пункт в разделе «Обсуждение».

    7) Уточнение партий и сравнение с независимой линией клеток помогает сделать вывод о том, что это хорошо воспроизводимый протокол. Но у нас есть опасения по поводу того, что эффективность будет указана в процентах без каких-либо ошибок. Авторы не объясняют, откуда берутся эти числа и что они означают, и как они были рассчитаны.Если существует набор воспроизводимых данных для их подтверждения, он должен быть предоставлен, в противном случае цифры должны быть четко описаны как эксперимент с одной репрезентативной выборкой, а не как общая оценка.

    Приносим извинения за то, что не включили эту информацию ранее. Теперь он является частью как основного текста, так и рисунка 1. В интересах прозрачности данных мы также перечисляем полные номера исходных данных, приводящие к этим выводам, в качестве нового Дополнительного файла 1.

    Несколько комментариев к количеству n в этой таблице данных:

    a) Мы регулярно проверяем эффективность посева (удержание образца во время посева, смены среды и фиксации), поэтому на этом этапе у нас имеется много данных.

    b) Эффективность этапа переноса из планшета для культивирования с v-образным дном в планшет для визуализации с плоским дном обычно не критична для нас, поскольку мы просто дважды запускаем протокол переноса, чтобы получить 100% эффективность переноса и уловить всех отставших. Здесь мы один раз пропустили несколько планшетов через этап переноса с явной целью генерации «однократных» номеров переноса, поэтому здесь меньше n. С тех пор мы выполнили дополнительные переводы и обновили соответствующие номера в рукописи.

    У нас самые низкие n для визуализации, так как большая часть наших образцов используется для множества других анализов, например анализ клеточного титра glo, РНК, кальция или МЭА.

    8) Ссылки на рисунки и панели в тексте должны указываться по порядку (например, первая ссылка в разделе результатов в настоящее время относится к рисунку 7, что является странным способом начать). Пожалуйста, убедитесь, что это соблюдается на протяжении всего документа, так как здесь много данных, и в противном случае они могут ввести в заблуждение.

    Мы изменили текст по запросу.

    9) «Известно, что добавление эктопических матриц, в том числе Matrigel, вносит большую вариативность». Авторы предполагают, что Матригель привносит изменчивость, но не приводят никаких данных, подтверждающих это. Также не был полностью устранен матригель, так как iPS-клетки должны начинаться с матрицы. Поскольку Матригель является широко используемым ингредиентом, заявления о его эффектах необходимо тщательно контролировать, а не полагаться на цитаты из литературы. Авторы должны смягчить утверждения о вариабельности, вызванной матригелем, для этой статьи и просто сказать, что они провели сравнение с другим протоколом, который не использует матригель, аналогичным тому, который они разработали.

    Мы внесли поправки в текст по запросу.

    10) В легенде к рисунку 4K:

    «k) Быстрое преобразование Фурье (БПФ) на основе данных, показанных в k.» Я считаю, что это основано на данных, показанных в j, а не k.

    Спасибо за внимательное рассмотрение — мы соответствующим образом изменили текст.

    https://doi.org/10.7554/eLife.52904.sa2

    Органоиды: новый метод моделирования заболеваний

  • 1.

    Хуч М., Кноблич Дж. А., Лутольф М. П. и др. (2017) Надежда и шумиха исследований органоидов.Развитие (Кембридж, Англия) 144 (6): 938–941. https://doi.org/10.1242/dev.150201

    Статья Google ученый

  • 2.

    Heydari Z, Najimi M, Mirzaei H et al (2020) Тканевая инженерия в регенеративной медицине печени: понимание новых трансляционных технологий. Ячейки 9 (2): 304. https://doi.org/10.3390/cells04

    Статья Google ученый

  • 3.

    Lehmann R, Lee CM, Shugart EC et al (2019) Органоиды человека: новое измерение в клеточной биологии.Mol Biol Cell 30 (10): 1129–1137. https://doi.org/10.1091/mbc.E19-03-0135

    Статья Google ученый

  • 4.

    Smith E, Cochrane WJ (1946) Кистозная органоидная тератома: (отчет о случае). Can Med Assoc J 55 (2): 151–152

    Google ученый

  • 5.

    Clevers H (2016) Моделирование развития и болезней с органоидами. Cell 165 (7): 1586–1597. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.082

    Артикул Google ученый

  • 6.

    Нобахт Лахруд Ф., Сахели М., Фарзане З. и др. (2020) Создание трансплантируемого трехмерного печеночного пластыря для улучшения функциональности печеночных клеток in vitro и in vivo. Стволовые клетки Dev 29 (5): 301–313. https://doi.org/10.1089/scd.2019.0130

    Статья Google ученый

  • 7.

    Кондо Дж., Иноуэ М. (2019) Применение модели органоидов рака для скрининга лекарств и персонализированной терапии.Ячейки 8 (5): 470. https://doi.org/10.3390/cells8050470

    Статья Google ученый

  • 8.

    Dutta D, Heo I, Clevers H (2017) Моделирование заболеваний в трехмерных органоидных системах, полученных из стволовых клеток. Trends Mol Med 23 (5): 393–410. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2017.02.007

    Статья Google ученый

  • 9.

    Ланкастер М.А., Хуч М. (2019) Моделирование заболеваний органоидами человека.Dis Model Mech 12 (7): 39347. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2017.02.007

    Статья Google ученый

  • 10.

    Es HA, Montazeri L, Aref AR et al (2018) Персонализированная медицина рака: органоидный подход. Тенденции биотехнологии 36 (4): 358–371. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2017.12.005

    Статья Google ученый

  • 11.

    Ким Дж., Ку Б. К., Кноблич Дж. А. (2020) Органоиды человека: модельные системы для биологии и медицины человека.Nat Rev Mol Cell Biol 21 (10): 571–584. https://doi.org/10.1038/s41580-020-0259-3

    Статья Google ученый

  • 12.

    Каньядас I, Барби Д.А. (2017) Культура органоидов: приложения в развитии и раке. Ex vivo инженерия микросреды опухоли. Springer, Berlin, стр. 41–54. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.08.016

    Забронировать Google ученый

  • 13.

    Gao D, Vela I, Sboner A et al (2014) Культуры органоидов, полученные от пациентов с распространенным раком простаты.Ячейка 159 (1): 176–187. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.08.016

    Статья Google ученый

  • 14.

    van de Wetering M, Francies HE, Francis JM et al (2015) Перспективное создание биобанка живых органоидов пациентов с колоректальным раком. Ячейка 161 (4): 933–945. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.03.053

    Статья Google ученый

  • 15.

    Fujii M, Shimokawa M, Date S. et al (2016) Библиотека органоидов колоректальной опухоли демонстрирует прогрессирующую потерю потребности в нишевом факторе во время туморогенеза.Стволовая клетка 18 (6): 827–838. https://doi.org/10.1016/j.stem.2016.04.003

    Статья Google ученый

  • 16.

    Weeber F, van de Wetering M, Hoogstraat M et al (2015) Сохраненное генетическое разнообразие органоидов, культивируемых из биопсий метастазов колоректального рака человека. Proc Natl Acad Sci USA 112 (43): 13308–13311. https://doi.org/10.1073/pnas.1516689112

    Статья Google ученый

  • 17.

    Engel RM, Chan WH, Nickless D et al (2020) Органоиды колоректального рака, полученные от пациентов, активируют гены-маркеры возрождающихся стволовых клеток после химиотерапевтического лечения. Дж. Клин Мед 9 (1): 128. https://doi.org/10.3390/jcm28

    Статья Google ученый

  • 18.

    Ooft SN, Weeber F, Dijkstra KK et al (2019) Органоиды, полученные от пациентов, могут предсказать ответ на химиотерапию у пациентов с метастатическим колоректальным раком. Sci Transl Med 11 (513): eaay2574.https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aay2574

    Статья Google ученый

  • 19.

    Li X, Francies HE, Secrier M et al (2018) Культуры органоидов повторяют гетерогенность аденокарциномы пищевода, обеспечивая модель для исследований клональности и прецизионной терапии. Nat Commun 9 (1): 1–13. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05190-9

    Статья Google ученый

  • 20.

    Зейдлитц Т., Меркер С.Р., Роте А. и др. (2019) Моделирование рака желудка человека с использованием органоидов. Кишечник 68 (2): 207–217. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2017-314549

    Статья Google ученый

  • 21.

    Yan HH, Siu HC, Law S. et al (2018) Комплексный биобанк органоидов рака желудка человека фиксирует гетерогенность подтипа опухоли и позволяет проводить терапевтический скрининг. Стволовая клетка 23 (6): 882–897. https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.09.016

    Артикул Google ученый

  • 22.

    Nanki K, Toshimitsu K, Takano A et al (2018) Дивергентные пути к независимости ниш Wnt и R-спондина во время желудочного канцерогенеза у человека. Ячейка 174 (4): 856–869. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.07.027

    Статья Google ученый

  • 23.

    Jacob F, Salinas RD, Zhang DY et al (2020) Созданная пациентом органоидная модель глиобластомы и биобанк резюмируют межопухолевую и внутриопухолевую гетерогенность.Cell 180 (1): 188–204. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.036

    Статья Google ученый

  • 24.

    Fusco P, Parisatto B, Rampazzo E et al (2019) Органоиды, полученные от пациентов (PDO), как новая модель in vitro для опухолей нейробластомы. BMC Рак 19 (1): 1–11. https://doi.org/10.1186/s12885-019-6149-4

    Статья Google ученый

  • 25.

    Boj SF, Hwang C-I, Baker LA et al (2015) Органоидные модели протокового рака поджелудочной железы человека и мыши.Ячейка 160 (1-2): 324–338. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.12.021

    Статья Google ученый

  • 26.

    Driehuis E, van Hoeck A, Moore K et al (2019) Органоиды рака поджелудочной железы повторяют болезнь и позволяют проводить персонализированный скрининг лекарств. Proc Natl Acad Sci USA 116 (52): 26580–26590. https://doi.org/10.1073/pnas.1

  • 3116

    Статья Google ученый

  • 27.

    Сейно Т., Кавасаки С., Шимокава М. и др. (2018) Органоиды опухоли поджелудочной железы человека обнаруживают потерю зависимости от фактора ниши стволовых клеток во время прогрессирования заболевания.Стволовая клетка 22 (3): 454–467. https://doi.org/10.1016/j.stem.2017.12.009

    Статья Google ученый

  • 28.

    Broutier L, Mastrogiovanni G, Verstegen MM et al (2017) Культуры органоидов, полученные из первичного рака печени человека, для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Нат Мед 23 (12): 1424. https://doi.org/10.1038/nm.4438

    Статья Google ученый

  • 29.

    Sachs N, de Ligt J, Kopper O et al (2018) Живой биобанк органоидов рака молочной железы отражает неоднородность заболевания.Ячейка 172 (1-2): 373–386. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.11.010

    Статья Google ученый

  • 30.

    Lee SH, Hu W, Matulay JT et al (2018) Эволюция опухоли и лекарственная реакция на органоидных моделях рака мочевого пузыря, полученных от пациентов. Ячейка 173 (2): 515–528. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.017

    Статья Google ученый

  • 31.

    Boretto M, Maenhoudt N, Luo X et al (2019) Органоиды, полученные от пациентов в результате заболевания эндометрия, отражают клиническую неоднородность и поддаются скринингу на лекарства.Nat Cell Biol. 21 (8): 1041–1051. https://doi.org/10.1038/s41556-019-0360-z

    Статья Google ученый

  • 32.

    Kim M, Mun H, Sung CO et al (2019) Органоиды рака легких, полученные от пациентов, как модели рака in vitro для терапевтического скрининга. Nat Commun 10 (1): 1–15. https://doi.org/10.1038/s41467-019-11867-6

    Статья Google ученый

  • 33.

    Sachs N, Papaspyropoulos A, Zomer-van Ommen DD et al (2019) Долгосрочное расширение органоидов дыхательных путей человека для моделирования заболеваний.EMBO J 38 (4): e100300. https://doi.org/10.15252/embj.2018100300

    Статья Google ученый

  • 34.

    Vlachogiannis G, Hedayat S, Vatsiou A et al (2018) Органические органоиды, полученные от пациентов, моделируют реакцию на лечение метастатического рака желудочно-кишечного тракта. Наука 359 (6378): 920–926. https://doi.org/10.1126/science.aao2774

    Статья Google ученый

  • 35.

    Li M, Izpisua Belmonte JC (2019) Органоиды — доклинические модели болезней человека.N Engl J Med 380 (6): 569–579. https://doi.org/10.1056/NEJMra1806175

    Статья Google ученый

  • 36.

    Шпичка А., Бикмулина П., Пешкова М. и др. (2020) Разработка модели для изучения вирусных инфекций: биопечати, микрофлюидики и органоидов для борьбы с коронавирусной болезнью 2019 (COVID-19). Инт Дж. Биопринт 6 (4): 302. https://doi.org/10.18063/ijb.v6i4.302

    Статья Google ученый

  • 37.

    Hossein-Khannazer N, Shokoohian B, Shpichka A. et al (2021) Обновление «новых терапевтических подходов к лечению COVID-19». J Mol Med 99 (2): 303–310. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02027-1

    Статья Google ученый

  • 38.

    Monteil V, Kwon H, Prado P et al (2020) Ингибирование инфекций SARS-CoV-2 в тканях человека с использованием растворимого человеческого ACE2 клинического уровня. Ячейка 181 (4): 905–913. https://doi.org/10.1016/j.ячейка.2020.04.004

    Артикул Google ученый

  • 39.

    Zhao B, Ni C, Gao R et al (2020) Резюме инфекции SARS-CoV-2 и повреждения холангиоцитов органоидами протоков печени человека. Белковая клетка 11: 1–5. https://doi.org/10.1007/s13238-020-00718-6

    Статья Google ученый

  • 40.

    Duan X, Han Y, Yang L et al (2020) Идентификация лекарств, блокирующих инфекцию SARS-CoV-2, с использованием органоидов толстой кишки, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека.bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.05.02.073320

  • 41.

    Qi F, Qian S, Zhang S. et al (2020) Communications br. Секвенирование одноклеточной РНК 13 тканей человека позволяет идентифицировать типы клеток и рецепторы коронавирусов человека. Biochem Biophys Res Commun 526 (1): 135–140. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.03.044

  • 42.

    Хоссейн-Ханназер Н., Шокухян Б., Шпичка А. и др. (2020) Новые терапевтические подходы к лечению COVID-19. J Mol Med (Berl) 98 (6): 789–803.https://doi.org/10.1007/s00109-020-01927-6

    Статья Google ученый

  • 43.

    Zhao Y, Zhao Z, Wang Y et al (2020) Профилирование экспрессии одноклеточной РНК ACE2, предполагаемого рецептора Wuhan 2019-nCov. Am J Respir Crit Care Med 202 (5): 756–759. https://doi.org/10.1164/rccm.202001-0179LE

  • 44.

    Lamers MM, Beumer J, van der Vaart J et al (2020) SARS-CoV-2 продуктивно инфицирует энтероциты кишечника человека. Наука 369: 50–54.https://doi.org/10.1126/science.abc1669

    Статья Google ученый

  • 45.

    Zhang SC, Wernig M, Duncan ID et al (2001) Дифференциация трансплантируемых нервных предшественников из человеческих эмбриональных стволовых клеток in vitro. Nat Biotechnol 19 (12): 1129–1133. https://doi.org/10.1038/nbt1201-1129

    Статья Google ученый

  • 46.

    Бахарванд Х., Мехрьярди Н.З., Хатами М. и др. (2007) Нейронная дифференцировка от человеческих эмбриональных стволовых клеток в определенных условиях прикрепленной культуры.Int J Dev Biol 51 (5): 371–378. https://doi.org/10.1387/ijdb.72280hb

    Статья Google ученый

  • 47.

    Eiraku M, Watanabe K, Matsuo-Takasaki M et al (2008) Самоорганизованное образование поляризованных кортикальных тканей из ESCs и его активное манипулирование внешними сигналами. Стволовая клетка клетки 3 (5): 519–532. https://doi.org/10.1016/j.stem.2008.09.002

    Статья Google ученый

  • 48.

    Мариани Дж., Симонини М.В., Палеев Д. и др. (2012) Моделирование коркового развития человека in vitro с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Proc Natl Acad Sci 109 (31): 12770–12775. https://doi.org/10.1073/pnas.1202

    9

    Статья Google ученый

  • 49.

    Edri R, Yaffe Y, Ziller MJ et al (2015) Анализ онтогенеза нервных стволовых клеток человека путем последовательного выделения активных нейральных предшественников Notch. Нац Коммуна 6: 6500. https: // doi.org / 10.1038 / ncomms7500

    Статья Google ученый

  • 50.

    Ши Й, Кирван П., Смит Дж. И др. (2012) Развитие коры головного мозга человека от плюрипотентных стволовых клеток до функциональных возбуждающих синапсов. Нат Neurosci 15 (3): 477. https://doi.org/10.1038/nn.3041

    Статья Google ученый

  • 51.

    Hatami M, Mehrjardi NZ, Kiani S. et al (2009) Трансплантаты нервных предшественников, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток, в коллагеновых каркасах способствуют восстановлению поврежденного спинного мозга крысы.Цитотерапия 11 (5): 618–630. https://doi.org/10.1080/146532405802

    Статья Google ученый

  • 52.

    Zare-Mehrjardi N, Khorasani MT, Hemmesi K et al (2011) Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в нервные клетки на 3D-каркасах поли (D, L-молочной кислоты) по сравнению с 2D-культурами. Int J Artif Organs 34 (10): 1012–1023. https://doi.org/10.5301/ijao.5000002

    Статья Google ученый

  • 53.

    Lancaster MA, Renner M, Martin C-A et al (2013) Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Nature 501 (7467): 373. https://doi.org/10.1038/nature12517

    Статья Google ученый

  • 54.

    Gabriel E, Wason A, Ramani A et al (2016) CPAP способствует своевременной разборке ресничек для поддержания пула нейральных предшественников. EMBO J 35 (8): 803–819. https://doi.org/10.15252/embj.2015

    Статья Google ученый

  • 55.

    Li R, Sun L, Fang A et al (2017) Повторение кортикального развития с помощью культуры органоидов in vitro и моделирование аномальной веретенообразной (первичной, связанной с ASPM) болезни микроцефалии. Protein Cell 8 (11): 823–833. https://doi.org/10.1007/s13238-017-0479-2

    Статья Google ученый

  • 56.

    Li Y, Muffat J, Omer A et al (2017) Индукция расширения и складывания органоидов головного мозга человека. Стволовая клетка 20 (3): 385–396. https: // doi.org / 10.1016 / j.stem.2016.11.017

    Статья Google ученый

  • 57.

    Мариани Дж., Коппола Дж., Чжан П. и др. (2015) FOXG1-зависимая дисрегуляция дифференцировки ГАМК / глутаматных нейронов при расстройствах аутистического спектра. Ячейка 162 (2): 375–390. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.06.034

    Статья Google ученый

  • 58.

    Wang P, Mokhtari R, Pedrosa E et al (2017) CRISPR / Cas9-опосредованный гетерозиготный нокаут гена аутизма CHD8 и характеристика его транскрипционных сетей в церебральных органоидах, полученных из iPS-клеток.Молочный аутизм 8 (1): 11. https://doi.org/10.1186/s13229-017-0124-1

    Статья Google ученый

  • 59.

    Ye F, Kang E, Yu C et al (2017) DISC1 регулирует нейрогенез посредством модуляции прикрепления кинетохор Ndel1 / Nde1 во время митоза. Нейрон 96 (5): 1041–1054. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2017.10.010

    Статья Google ученый

  • 60.

    Mellios N, Feldman DA, Sheridan SD et al (2018) Регулируемые MeCP2 миРНК контролируют ранний нейрогенез человека посредством различных эффектов на передачу сигналов ERK и AKT.Мол Психиатрия 23 (4): 1051–1065. https://doi.org/10.1038/mp.2017.86

    Статья Google ученый

  • 61.

    Allende ML, Cook EK, Larman BC et al (2018) Церебральные органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, вызванных болезнью Сандхоффа, демонстрируют нарушение нейродифференцировки. J. Lipid Res 59 (3): 550–563. https://doi.org/10.1194/jlr.M081323

    Статья Google ученый

  • 62.

    Bershteyn M, Nowakowski TJ, Pollen AA et al (2017) Церебральные органоиды, полученные из ИПСК человека, моделируют клеточные особенности лиссэнцефалии и выявляют длительный митоз наружной радиальной глии. Стволовые клетки 20 (4): 435–449. https://doi.org/10.1016/j.stem.2016.12.007

    Статья Google ученый

  • 63.

    Iefremova V, Manikakis G, Krefft O et al (2017) Основанная на органоидах модель коркового развития идентифицирует не клеточно-автономные дефекты в передаче сигналов Wnt, способствующие развитию синдрома Миллера-Дикера.Cell Rep 19 (1): 50–59. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.03.047

    Статья Google ученый

  • 64.

    Cugola FR, Fernandes IR, Russo FB et al (2016) Бразильский штамм вируса Зика вызывает врожденные дефекты в экспериментальных моделях. Nature 534 (7606): 267–271. https://doi.org/10.1038/nature18296

    Статья Google ученый

  • 65.

    Garcez PP, Loiola EC, da Costa RM et al (2016) Вирус Зика нарушает рост нейросфер человека и органоидов мозга.Наука 352 (6287): 816–818. https://doi.org/10.1126/science.aaf6116

    Статья Google ученый

  • 66.

    Qian X, Nguyen HN, Song MM et al (2016) Органоиды, специфичные для области мозга, с использованием мини-биореакторов для моделирования воздействия ZIKV. Ячейка 165 (5): 1238–1254. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.04.032

    Статья Google ученый

  • 67.

    Dang J, Tiwari SK, Lichinchi G et al (2016) Вирус Зика истощает нейральные предшественники в органоидах головного мозга человека посредством активации рецептора врожденного иммунитета TLR3.Стволовая клетка клетки 19 (2): 258–265. https://doi.org/10.1016/j.stem.2016.04.014

    Статья Google ученый

  • 68.

    Janssens S, Schotsaert M, Karnik R et al (2018) Вирус Зика изменяет метилирование ДНК нервных генов в органоидной модели развивающегося человеческого мозга. MSystems 3 (1): e00219. https://doi.org/10.1128/mSystems.00219-17

    Статья Google ученый

  • 69.

    Zhou T, Tan L, Cederquist GY et al (2017) Высококачественный скрининг hPSC-нейронных предшественников выявляет лекарственные препараты-кандидаты, которые ингибируют инфицирование вирусом Зика в органоподобных плодах и мозге взрослого человека. Стволовая клетка 21 (2): 274–283. https://doi.org/10.1016/j.stem.2017.06.017

    Статья Google ученый

  • 70.

    Watanabe M, Buth JE, Vishlaghi N. et al (2017) Самоорганизующиеся церебральные органоиды со специфическими для человека особенностями предсказывают эффективные лекарства для борьбы с инфекцией вируса Зика.Cell Rep 21 (2): 517–532. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.09.047

    Статья Google ученый

  • 71.

    Sacramento CQ, De Melo GR, De Freitas CS et al (2017) Клинически одобренный противовирусный препарат софосбувир подавляет репликацию вируса Зика. Sci Rep 7: 40920. https://doi.org/10.1038/srep40920

    Статья Google ученый

  • 72.

    Xu M, Lee EM, Wen Z et al (2016) Идентификация низкомолекулярных ингибиторов инфекции вируса Зика и индуцированной гибели нервных клеток с помощью скрининга перепрофилирования лекарств.Нат Мед 22 (10): 1101–1107. https://doi.org/10.1038/nm.4184

    Статья Google ученый

  • 73.

    Li C, Deng Y-Q, Wang S. et al (2017) 25-гидроксихолестерин защищает хозяина от вирусной инфекции Зика и связанной с ней микроцефалии на мышиной модели. Иммунитет 46 (3): 446–456. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2017.02.012

    Статья Google ученый

  • 74.

    Retallack H, Di Lullo E, Arias C et al (2016) Тропизм клеток вируса Зика в развивающемся мозге человека и ингибирование азитромицином.Proc Natl Acad Sci 113 (50): 14408–14413. https://doi.org/10.1073/pnas.1618029113

    Статья Google ученый

  • 75.

    Nowakowski TJ, Pollen AA, Di Lullo E et al (2016) Анализ экспрессии выдвигает на первый план AXL как кандидат на рецептор проникновения вируса Зика в нервные стволовые клетки. Стволовая клетка 18 (5): 591–596. https://doi.org/10.1016/j.stem.2016.03.012

    Статья Google ученый

  • 76.

    Wells MF, Salick MR, Wiskow O et al (2016) Генетическое удаление AXL не защищает человеческие нейральные клетки-предшественники и церебральные органоиды от заражения вирусом Зика. Стволовая клетка клетки 19 (6): 703–708. https://doi.org/10.1016/j.stem.2016.11.011

    Статья Google ученый

  • 77.

    Meertens L, Labeau A, Dejarnac O et al (2017) Axl опосредует проникновение вируса ZIKA в глиальные клетки человека и модулирует врожденные иммунные ответы. Cell Rep 18 (2): 324–333.https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.12.045

    Статья Google ученый

  • 78.

    Di Lullo E, Kriegstein AR (2017) Использование органоидов мозга для исследования нервного развития и заболеваний. Нат Рев Neurosci 18 (10): 573. https://doi.org/10.1038/nrn.2017.107

    Статья Google ученый

  • 79.

    Raja WK, Mungenast AE, Lin Y-T et al (2016) Самоорганизующаяся трехмерная нервная ткань человека, полученная из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, повторяет фенотипы болезни Альцгеймера.PLoS ONE 11 (9): e0161969. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0161969

    Статья Google ученый

  • 80.

    Seo J, Kritskiy O, Watson LA et al (2017) Ингибирование p25 / Cdk5 ослабляет таупатию в моделях лобно-височной деменции на мышах и iPSC. J Neurosci 37 (41): 9917–9924. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0621-17.2017

    Статья Google ученый

  • 81.

    Gonzalez C, Armijo E, Bravo-Alegria J et al (2018) Моделирование патологии бета- и тау-амилоидов в органоидах головного мозга человека.Mol Psychiatry 23 (12): 2363–2374. https://doi.org/10.1038/s41380-018-0229-8

    Статья Google ученый

  • 82.

    Park J, Wetzel I, Marriott I et al (2018) 3D-система трикультуры человека, моделирующая нейродегенерацию и нейровоспаление при болезни Альцгеймера. Nat Neurosci 21 (7): 941–951. https://doi.org/10.1038/s41593-018-0175-4

    Статья Google ученый

  • 83.

    Kim H, Park HJ, Choi H et al (2019) Моделирование спорадической болезни Паркинсона G2019S-LRRK2 в трехмерных органоидах среднего мозга. Stem Cell Rep 12 (3): 518–531. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2019.01.020

    Статья Google ученый

  • 84.

    Смитс Л.М., Рейнхардт Л., Рейнхардт П. и др. (2019) Моделирование болезни Паркинсона в органоидах, подобных среднему мозгу. NPJ Parkinson’s Dis 5 (1): 1–8. https://doi.org/10.1038/s41531-019-0078-4

    Статья Google ученый

  • 85.

    Chlebanowska P, Tejchman A, Sułkowski M et al (2020) Использование трехмерных органоидов в качестве модели для изучения идиопатической формы болезни Паркинсона. Международный журнал научных исследований, 21 (3): 694. https://doi.org/10.3390/ijms21030694

    Статья Google ученый

  • 86.

    Kwak TH, Kang JH, Hali S. et al (2020) Создание гомогенных органоидов среднего мозга с клеточным составом, подобным in vivo, облегчает моделирование болезни Паркинсона на основе нейротоксинов. Стволовые клетки 38 (6): 727–740.https://doi.org/10.1002/stem.3163

    Статья Google ученый

  • 87.

    Лим Р., Брихта AM (2016) Анатомическое и физиологическое развитие внутреннего уха человека. Послушайте Res 338: 9–21. https://doi.org/10.1016/j.heares.2016.02.004

    Статья Google ученый

  • 88.

    Wu DK, Kelley MW (2012) Молекулярные механизмы развития внутреннего уха. Колд-Спринг-Харбор Perspect Biol 4 (8): a008409.https://doi.org/10.1101/cshperspect.a008409

    Статья Google ученый

  • 89.

    Келер К.Р., Микош А.М., Молош А.И. и др. (2013) Создание сенсорного эпителия внутреннего уха из плюрипотентных стволовых клеток в 3D-культуре. Nature 500 (7461): 217–221. https://doi.org/10.1038/nature12298

    Статья Google ученый

  • 90.

    Tang PC, Alex AL, Nie J et al (2019) Дегенерация волосковых клеток, связанная с Tmprss3, в органоидах внутреннего уха.Репродукция стволовых клеток 13 (1): 147–162. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2019.05.014

    Статья Google ученый

  • 91.

    Fligor CM, Langer KB, Sridhar A et al (2018) Трехмерные органоиды сетчатки облегчают исследование развития, организации ганглиозных клеток сетчатки и роста нейритов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Sci Rep 8 (1): 1–14. https://doi.org/10.1038/s41598-018-32871-8

    Статья Google ученый

  • 92.

    Eiraku M, Takata N, Ishibashi H et al (2011) Самоорганизующийся морфогенез глазного бокала в трехмерной культуре. Nature 472 (7341): 51–56. https://doi.org/10.1038/nature09941

    Статья Google ученый

  • 93.

    Накано Т., Андо С., Таката Н. и др. (2012) Самообразование глазных бокалов и хранимой стратифицированной нервной сетчатки из человеческих ЭСК. Стволовая клетка клетки 10 (6): 771–785. https://doi.org/10.1016/j.stem.2012.05.009

    Статья Google ученый

  • 94.

    Parfitt DA, Lane A, Ramsden CM et al (2016) Идентификация и коррекция механизмов, лежащих в основе наследственной слепоты в оптических чашечках, полученных с помощью ИПСК человека. Стволовая клетка клетки 18 (6): 769–781. https://doi.org/10.1016/j.stem.2016.03.021

    Статья Google ученый

  • 95.

    Deng W-L, Gao M-L, Lei X-L et al (2018) Генная коррекция обращает вспять цилиопатию и потерю фоторецепторов в органоидах сетчатки, полученных из ИПСК, у пациентов с пигментным ретинитом.Репродукция стволовых клеток 10 (4): 1267–1281. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2018.02.003

    Статья Google ученый

  • 96.

    Schwarz N, Lane A, Jovanovic K et al (2017) Arl3 и RP2 регулируют перемещение кинезинов кончиков ресничек. Hum Mol Genet 26 (13): 2480–2492. https://doi.org/10.1093/hmg/ddx143

    Статья Google ученый

  • 97.

    Gao M-L, Lei X-L, Han F et al (2020) Органоиды сетчатки, специфичные для пациента, повторяют болезненные особенности пигментного ретинита с поздним началом.Front Cell Dev Biol 8: 128. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00128

    Статья Google ученый

  • 98.

    Kim JW, Kim Y, Kim J et al (2018) AB0189 3D кожный органоид, имитирующий системный склероз, вызванный индуцированными пациентом плюрипотентными стволовыми клетками: «болезнь в чашке» и разработка модели на животных. BMJ Publishing Group Ltd. https://doi.org/10.1136/annrheumdis-2018-eular.4502

  • 99.

    Элиас М.С., Райт С.К., Николсон В.В. и др. (2019) Функциональный и протеомный анализ филаггрина полной толщины -дефектная модель органоида кожи.Wellcome Open Res 4: 134. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.15405.2

    Статья Google ученый

  • 100.

    Ван Г., Маккейн М.Л., Ян Л. и др. (2014) Моделирование митохондриальной кардиомиопатии при синдроме Барта с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и технологий «сердце на чипе». Нат Мед 20 (6): 616–623. https://doi.org/10.1038/nm.3545

    Статья Google ученый

  • 101.

    Хинсон Дж. Т., Чопра А., Нафисси Н. и др. (2015) БОЛЕЗНЬ СЕРДЦА. Мутации тайтина в iPS-клетках определяют саркомерную недостаточность как причину дилатационной кардиомиопатии. Science (Нью-Йорк, Нью-Йорк) 349 (6251): 982–986. https://doi.org/10.1126/science.aaa5458

    Статья Google ученый

  • 102.

    Cashman TJ, Josowitz R, Johnson BV et al (2016) Сконструированные человеком сердечные ткани, созданные с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, демонстрируют функциональные характеристики BRAF-опосредованной гипертрофической кардиомиопатии.PLoS ONE 11 (1): e0146697. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146697

    Статья Google ученый

  • 103.

    Hinson JT, Chopra A, Lowe A. et al (2016) Интегративный анализ iPS кардиомиопатии PRKAG2 и моделей микротканей определяет AMPK как регулятор метаболизма, выживаемости и фиброза. Cell Rep 17 (12): 3292–3304. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.11.066

    Статья Google ученый

  • 104.

    Voges HK, Mills RJ, Elliott DA et al (2017) Разработка модели повреждения органоидов сердца человека раскрывает врожденный регенеративный потенциал. Развитие 144 (6): 1118–1127. https://doi.org/10.1242/dev.143966

    Статья Google ученый

  • 105.

    Long C, Li H, Tiburcy M et al (2018) Коррекция различных мутаций мышечной дистрофии в сердечной мышце, сконструированной человеком, путем редактирования генома на одном участке. Научный совет 4 (1): eaap9004. https: // doi.org / 10.1126 / sciadv.aap9004

    Статья Google ученый

  • 106.

    Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ et al (2015) Моделирование заболевания почек с помощью CRISPR-мутантных органоидов почек, полученных из сфероидов плюрипотентного эпибласта человека. Нац Коммуна 6: 8715. https://doi.org/10.1038/ncomms9715

    Статья Google ученый

  • 107.

    Ким Ю.К., Рафаэли И., Брукс С.Р. и др. (2017) Генно-редактируемые органоиды почек человека раскрывают механизмы заболевания в развитии подоцитов.Стволовые клетки (Дейтон, Огайо) 35 (12): 2366–2378. https://doi.org/10.1002/stem.2707

    Статья Google ученый

  • 108.

    Cruz NM, Song X, Czerniecki SM et al (2017) Органоидный цистогенез показывает критическую роль микросреды в поликистозной болезни почек человека. Nat Mater 16 (11): 1112–1119. https://doi.org/10.1038/nmat4994

    Статья Google ученый

  • 109.

    Hale LJ, Howden SE, Phipson B et al (2018) Трехмерные органоидные клубочки человека для персонализированного моделирования заболеваний подоцитов и скрининга лекарств. Nat Commun 9 (1): 1–17. https://doi.org/10.1038/s41467-018-07594-z

    Статья Google ученый

  • 110.

    Low JH, Li P, Chew EGY et al (2019) Получение органоидов почек человека, происходящих из PSC, с узорчатыми сегментами нефронов и сосудистой сетью de novo. Стволовые клетки клеток 25 (3): 373–387.https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.06.009

    Статья Google ученый

  • 111.

    Tanigawa S, Islam M, Sharmin S et al (2018) Органоиды ИПСК, вызванных нефротическим заболеванием, выявляют нарушенную локализацию НЕФРИНА и образование щелевой диафрагмы в подоцитах почек. Stem Cell Rep 11 (3): 727–740. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2018.08.003

    Статья Google ученый

  • 112.

    Forbes TA, Howden SE, Lawlor K et al (2018) Органоиды почек, полученные от пациентов с ИПСК, демонстрируют функциональную валидацию цилиопатического почечного фенотипа и выявляют лежащие в основе патогенетические механизмы. Am J Hum Genet 102 (5): 816–831. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2018.03.014

    Статья Google ученый

  • 113.

    Hinson JT, Chopra A, Nafissi N et al (2015) Мутации титина в iPS-клетках определяют недостаточность саркомера как причину дилатационной кардиомиопатии.Наука 349 (6251): 982–986. https://doi.org/10.1126/science.aaa5458

    Статья Google ученый

  • 114.

    Kim YK, Refaeli I, Brooks CR et al (2017) Генно-редактируемые органоиды почек человека раскрывают механизмы развития подоцитов. Стволовые клетки 35 (12): 2366–2378. https://doi.org/10.1002/stem.2707

    Статья Google ученый

  • 115.

    Монтейл В., Квон Х., Прадо П. и др. (2020) Ингибирование инфекций SARS-CoV-2 в тканях человека с использованием растворимого человеческого ACE2 клинического уровня.Ячейка 181: 905–913. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.004

    Статья Google ученый

  • 116.

    Миллер А.Дж., краситель Б.Р., Феррер-Торрес Д. и др. (2019) Получение органоидов легких из плюрипотентных стволовых клеток человека in vitro. Nat Protoc 14 (2): 518–540. https://doi.org/10.1038/s41596-018-0104-8

    Статья Google ученый

  • 117.

    McQualter JL, Yuen K, Williams B. et al (2010) Доказательства иерархии эпителиальных стволовых клеток / клеток-предшественников в легких взрослых мышей.Proc Natl Acad Sci USA 107 (4): 1414–1419. https://doi.org/10.1073/pnas.0

    7107

    Статья Google ученый

  • 118.

    Wilkinson DC, Alva-Ornelas JA, Sucre JM et al (2017) Разработка трехмерной биоинженерной технологии для создания легочной ткани для персонализированного моделирования заболеваний. Стволовые клетки Transl Med 6 (2): 622–633. https://doi.org/10.5966/sctm.2016-0192

    Статья Google ученый

  • 119.

    Стрикудис А., Цеслак А., Лоффредо Л. и др. (2019) Моделирование фиброзного заболевания легких с использованием трехмерных органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека. Cell Rep 27 (12): 3709–3723. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.05.077

    Статья Google ученый

  • 120.

    Surolia R, Li FJ, Wang Z et al (2019) Сборка промежуточных филаментов Vimentin регулирует инвазию фибробластов при фиброгенном повреждении легких. JCI Insight 4 (7): e123253. https: // doi.org / 10.1172 / jci.insight.123253

    Статья Google ученый

  • 121.

    Рамани С., Кроуфорд С.Е., Блатт С.Е. и др. (2018) Культуры органоидов человека: новые инструменты для изучения вирусов человека. Curr Opin Virol 29: 79–86. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2018.04.001

    Статья Google ученый

  • 122.

    Heo I, Dutta D, Schaefer DA et al (2018) Моделирование инфекции Cryptosporidium в органоидах тонкой кишки и легких человека.Nat Microbiol 3 (7): 814–823. https://doi.org/10.1038/s41564-018-0177-8

    Статья Google ученый

  • 123.

    Zhou J, Li C, Sachs N. et al (2018) Дифференцированные органоиды дыхательных путей человека для оценки инфекционности нового вируса гриппа. Proc Natl Acad Sci USA 115 (26): 6822–6827. https://doi.org/10.1073/pnas.1806308115

    Статья Google ученый

  • 124.

    Hui KP, Ching RH, Chan SK et al (2018) Тропизм, репликационная способность и врожденные иммунные ответы вируса гриппа: анализ органоидов дыхательных путей человека и культур бронхов ex vivo.Ланцет Респир Мед 6 (11): 846–854. https://doi.org/10.1016/S2213-2600(18)30236-4

    Статья Google ученый

  • 125.

    Поротто М., Феррен М., Чен И-В и др. (2019) Аутентичное моделирование респираторной вирусной инфекции человека в органоидах легких, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. MBio 10 (3): e00723-e819. https://doi.org/10.1128/mBio.00723-19

    Статья Google ученый

  • 126.

    Chen Y-W, Huang SX, De Carvalho ALRT et al (2017) Трехмерная модель развития легких и заболеваний человека с помощью плюрипотентных стволовых клеток. Nat Cell Biol 19 (5): 542–549. https://doi.org/10.1038/ncb3510

    Статья Google ученый

  • 127.

    Агарвал Т., Субраманиан Б., Маити Т.К. (2019) Инженерия ткани печени: проблемы и возможности. ACS Biomater Sci Eng 5 (9): 4167–4182. https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.9b00745

    Статья Google ученый

  • 128.

    Wu L-J, Chen Z-Y, Wang Y et al (2019) Органоиды болезней печени: от скамейки к постели. Мировой журнал J Gastroenterol 25 (16): 1913. https://doi.org/10.3748/wjg.v25.i16.1913

    Статья Google ученый

  • 129.

    Heydari Z, Vosough M (2017) Новые платформы для скрининга наркотиков и токсикологии: необходимость или необходимость? Mod Med Lab J 2 (1): 107–109. https://doi.org/10.30699/mmlj17.1.3.107

    Статья Google ученый

  • 130.

    Vosough M, Omidinia E, Kadivar M et al (2013) Создание функциональных гепатоцитоподобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека в масштабируемой суспензионной культуре. Стволовые клетки Dev 22 (20): 2693–2705. https://doi.org/10.1089/scd.2013.0088

    Статья Google ученый

  • 131.

    Sacchi M, Bansal R, Rouwkema J (2020) Биоинженерные 3D-модели для повторения фиброза тканей. Trends Biotechnol 38 (6): 623–636. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2019.12.010

    Артикул Google ученый

  • 132.

    Leite SB, Roosens T, El Taghdouini A et al (2016) Новая модель органоидов печени человека позволяет тестировать индуцированный лекарствами фиброз печени in vitro. Биоматериалы 78: 1–10. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.11.026

    Статья Google ученый

  • 133.

    Coll M, Perea L, Boon R et al (2018) Создание звездчатых клеток печени из плюрипотентных стволовых клеток человека позволяет моделировать фиброз печени in vitro.Стволовые клетки 23 (1): 101–113. https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.05.027

    Статья Google ученый

  • 134.

    Maepa SW, Ndlovu HJ (2020) Достижения в создании клеток печени из плюрипотентных стволовых клеток в качестве инструмента для моделирования заболеваний печени. Стволовые клетки 38: 606–612. https://doi.org/10.1002/stem.3154

    Статья Google ученый

  • 135.

    Kruitwagen HS, Oosterhoff LA, Vernooij IG et al (2017) Долгосрочные культуры органоидов печени взрослых кошек для моделирования стеатоза печени.Репродукция стволовых клеток 8 (4): 822–830. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2017.02.015

    Статья Google ученый

  • 136.

    Оучи Р., Того С., Кимура М. и др. (2019) Моделирование стеатогепатита у людей с помощью органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Cell Metab 30 (2): 374–384. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2019.05.007

    Статья Google ученый

  • 137.

    Pingitore P, Sasidharan K, Ekstrand M. et al (2019) Многолинейные трехмерные сфероиды человека как модель стеатоза и фиброза печени.Международный журнал научных исследований 20 (7): 1629. https://doi.org/10.3390/ijms20071629

    Статья Google ученый

  • 138.

    Wang S, Wang X, Tan Z et al (2019) Расширяемые органоиды печени, полученные из ЭСК человека, обеспечивают терапевтическую репопуляцию печени и патофизиологическое моделирование алкогольного поражения печени. Cell Res 29 (12): 1009–1026. https://doi.org/10.1038/s41422-019-0242-8

    Статья Google ученый

  • 139.

    Джеффрис М., Рауфф Б., Рашид Х. и др. (2018) Обновленная информация о глобальной эпидемиологии вирусного гепатита и стратегиях профилактики. Всемирный журнал клинических случаев 6 (13): 589–599. https://doi.org/10.12998/wjcc.v6.i13.589

    Статья Google ученый

  • 140.

    Galle PR, Hagelstein J, Kommerell B et al (1994) Экспериментальная инфекция первичных гепатоцитов человека вирусом гепатита B in vitro. Гастроэнтерология 106 (3): 664–673. https://doi.org/10.1016/0016-5085(94)

    -5

    Статья Google ученый

  • 141.

    Ruoß M, Vosough M, Königsrainer A et al (2020) На пути к улучшенным культурам гепатоцитов: прогресс и ограничения. Food Chem Toxicol 138: 111188. https://doi.org/10.1016/j.fct.2020.111188

    Статья Google ученый

  • 142.

    Fu G-B, Huang W-J, Zeng M. et al (2019) Расширение и дифференциация клеток-предшественников печени, полученных из гепатоцитов человека, и их использование для изучения гепатотропных патогенов. Ячейка Res 29 (1): 8–22.https://doi.org/10.1038/s41422-018-0103-x

    Статья Google ученый

  • 143.

    Nie Y-Z, Zheng Y-W, Miyakawa K et al (2018) Повторение взаимодействий вируса гепатита B с хозяином в органоидах печени из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. EBioMedicine 35: 114–123. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2018.08.014

    Статья Google ученый

  • 144.

    Scorza M, Elce A, Zarrilli F et al (2014) Генетические заболевания, предрасполагающие к раннему циррозу печени.Int J Hepatol 2014: 713754. https://doi.org/10.1155/2014/713754

    Статья Google ученый

  • 145.

    Huch M, Gehart H, Van Boxtel R et al (2015) Долгосрочная культура геном-стабильных бипотентных стволовых клеток из печени взрослого человека. Cell 160 (1-2): 299-312. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.11.050

    Статья Google ученый

  • 146.

    Guan Y, Xu D, Garfin PM et al (2017) Органоиды печени человека для анализа генетических заболеваний человека.JCI Insight 2 (17): e

    . https://doi.org/10.1172/jci.insight.

    Статья Google ученый

  • 147.

    Огава М., Огава С., Медведь CE и др. (2015) Направленная дифференцировка холангиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Нат Биотехнология 33 (8): 853. https://doi.org/10.1038/nbt.3294

    Статья Google ученый

  • 148.

    Hohwieler M, Müller M, Frappart P-O et al (2019) Предшественники поджелудочной железы и органоиды как предпосылка для моделирования заболеваний и рака поджелудочной железы.Стволовые клетки Int 2019: 82. https://doi.org/10.1155/2019/82

    Статья Google ученый

  • 149.

    Chen L, Magliano DJ, Zimmet PZ (2012) Всемирная эпидемиология сахарного диабета 2 типа — настоящие и будущие перспективы. Nat Rev Endocrinol 8 (4): 228–236. https://doi.org/10.1038/nrendo.2011.183

    Статья Google ученый

  • 150.

    Kim Y, Kim H, Ko UH et al (2016) Островковые органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, эффективно влияют на чувствительность к глюкозе in vitro и in vivo.Sci Rep 6: 35145. https://doi.org/10.1038/srep35145

    Статья Google ученый

  • 151.

    Cutting GR (2015) Генетика муковисцидоза: от молекулярного понимания до клинического применения. Нат Рев Генет 16 (1): 45–56. https://doi.org/10.1038/nrg3849

    Статья Google ученый

  • 152.

    Hohwieler M, Illing A, Hermann PC et al (2017) Ацинарные / протоковые органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, образуют поджелудочную железу человека при ортотопической трансплантации и позволяют моделировать заболевание.Кишечник 66 (3): 473–486. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2016-312423

    Статья Google ученый

  • 153.

    Вен С., Мосс С.Ф. (2009) Факторы вирулентности Helicobacter pylori в канцерогенезе желудка. Cancer Lett 282 (1): 1–8. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2008.11.016

    Статья Google ученый

  • 154.

    Barker N, Huch M, Kujala P et al (2010) Lgr5 + ve стволовые клетки стимулируют самообновление в желудке и создают долгоживущие желудочные единицы in vitro.Стволовые клетки клетки 6 (1): 25–36. https://doi.org/10.1016/j.stem.2009.11.013

    Статья Google ученый

  • 155.

    McCracken KW, Catá EM, Crawford CM et al (2014) Моделирование развития человека и заболеваний с помощью органоидов желудка, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Nature 516 (7531): 400–404. https://doi.org/10.1038/nature13863

    Статья Google ученый

  • 156.

    Бартфельд С., Байрам Т., ван де Ветеринг М. и др. (2015) Экспансия in vitro эпителиальных стволовых клеток желудка человека и их ответы на бактериальную инфекцию.Гастроэнтерология 148 (1): 126–136. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2014.09.042

    Статья Google ученый

  • 157.

    Bertaux-Skeirik N, Feng R, Schumacher MA et al (2015) CD44 играет функциональную роль в индуцированной Helicobacter pylori пролиферации эпителиальных клеток. PLoS Pathog 11 (2): e1004663. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004663

    Статья Google ученый

  • 158.

    Wroblewski LE, Piazuelo MB, Chaturvedi R et al (2015) Helicobacter pylori нацеливается на связанные с раком апикально-соединительные компоненты в гастроидах и эпителиальных клетках желудка. Кишечник 64 (5): 720–730. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2014-307650

    Статья Google ученый

  • 159.

    Holokai L, Chakrabarti J, Broda T. et al (2019) Повышенный лиганд запрограммированной смерти 1 — это ранний ответ эпителиальных клеток на инфекцию Helicobacter pylori.PLoS Pathog 15 (1): e1007468. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007468

    Статья Google ученый

  • 160.

    Себрелл Т.А., Хашими М., Сидар Б. и др. (2019) Новая модель совместного культивирования сфероидов желудка показывает хемокин-зависимое рекрутирование дендритных клеток человека в эпителий желудка. Cell Mol Gastroenterol Hepatol 8 (1): 157–171. https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2019.02.010

    Статья Google ученый

  • 161.

    Lancaster MA, Huch MJ (2019) Моделирование заболеваний органоидами человека. Модель Dis Mech 12 (7): dmm039347. https://doi.org/10.1242/dmm.039347

    Статья Google ученый

  • 162.

    Агарвал Т., Онесто В., Ламбони Л. и др. (2021) Разработка биомиметических топологических характеристик кишечника в трехмерных моделях тканей: ретроспективы и перспективы. Мануфактура биодизайна 4: 1–28. https://doi.org/10.1007/s42242-020-00120-5

    Статья Google ученый

  • 163.

    Van Der Flier LG, Clevers HJ (2009) Стволовые клетки, самообновление и дифференцировка в кишечном эпителии. Анну Рев Физиол 71: 241–260. https://doi.org/10.1146/annurev.physiol.010908.163145

    Статья Google ученый

  • 164.

    Ootani A, Li X, Sangiorgi E et al (2009) Поддерживаемая культура кишечного эпителия in vitro в нише Wnt-зависимых стволовых клеток. Нат Мед 15 (6): 701–706. https://doi.org/10.1038/nm.1951

    Статья Google ученый

  • 165.

    Sato T, Vries RG, Snippert HJ et al (2009) Единичные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинки in vitro без мезенхимальной ниши. Nature 459 (7244): 262–265. https://doi.org/10.1038/nature07935

    Статья Google ученый

  • 166.

    Workman MJ, Mahe MM, Trisno S. et al (2017) Сконструированы кишечные ткани, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, с функциональной кишечной нервной системой. Нат Мед 23 (1): 49–59. https://doi.org/10.1038 / нм.4233

    Артикул Google ученый

  • 167.

    Almeqdadi M, Mana MD, Roper J et al (2019) Органоиды кишечника: мини-ткани в культуре для изучения физиологии кишечника и заболеваний. Am J Physiol Cell Physiol 317 (3): C405 – C419. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00300.2017

    Статья Google ученый

  • 168.

    Foulke-Abel J, In J, Kovbasnjuk O et al (2014) Энтероиды человека как ex-vivo модель взаимодействий хозяин-патоген в желудочно-кишечном тракте.Exp Biol Med (Maywood) 239 (9): 1124–1134. https://doi.org/10.1177/1535370214529398

    Статья Google ученый

  • 169.

    Forbester JL, Goulding D, Vallier L. et al (2015) Взаимодействие Salmonella enterica serovar Typhimurium с кишечными органоидами, полученными из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Заражение иммунной 83 (7): 2926–2934. https://doi.org/10.1128/IAI.00161-15

    Статья Google ученый

  • 170.

    Карве С.С., Прадхан С., Уорд Д.В. и др. (2017) Органоиды кишечника моделируют реакцию человека на инфекцию комменсалом и токсином Шига, продуцирующим Escherichia coli . PLoS ONE 12 (6): e0178966. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178966

    Статья Google ученый

  • 171.

    Leslie JL, Huang S, Opp JS et al (2015) Стойкость и выработка токсинов Clostridium difficile в органоидах кишечника человека приводят к нарушению функции эпителиального параклеточного барьера.Заражение иммунной 83 (1): 138–145. https://doi.org/10.1128/IAI.02561-14

    Статья Google ученый

  • 172.

    Энгевик М.А., Яцишин М.Б., Энгевик К.А. и др. (2015) Инфекция человека Clostridium difficile: изменение продукции и состава слизи. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 308 (6): G510 – G524. https://doi.org/10.1152/ajpgi.00091.2014

    Статья Google ученый

  • 173.

    Schwank G, Koo B-K, Sasselli V et al (2013) Функциональное восстановление CFTR с помощью CRISPR / Cas9 в органоидах кишечных стволовых клеток пациентов с муковисцидозом. Стволовые клетки клетки 13 (6): 653–658. https://doi.org/10.1016/j.stem.2013.11.002

    Статья Google ученый

  • 174.

    Роданский Е.С., Джонсон Л.А., Хуанг С. и др. (2015) Органоиды кишечника: модель кишечного фиброза для оценки антифиброзных препаратов. Exp Mol Pathol 98 (3): 346–351.https://doi.org/10.1016/j.yexmp.2015.03.033

    Статья Google ученый

  • 175.

    Heuckeroth RO (2018) Болезнь Гиршпрунга — интеграция фундаментальной науки и клинической медицины для улучшения результатов. Нат Рев Гастроэнтерол Гепатол 15 (3): 152. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.149

    Статья Google ученый

  • 176.

    Takebe T, Sekine K, Enomura M et al (2013) Васкуляризация и функциональная печень человека из трансплантата зачатка органа, полученного с помощью ИПСК.Nature 499 (7459): 481–484. https://doi.org/10.1038/nature12271

    Статья Google ученый

  • 177.

    Koike H, Iwasawa K, Ouchi R et al (2019) Моделирование гепато-билиарного-панкреатического органогенеза человека на границе передней и средней кишки. Nature 574 (7776): 112–116. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1598-0

    Статья Google ученый

  • 178.

    Агарвал Т., Селиккин Н., Костантини М. и др. (2021) Последние достижения в области химически определенных и настраиваемых гидрогелевых платформ для культивирования органоидов.Производство, стр. 1–34. https://doi.org/10.1007/s42242-021-00126-7

  • 179.

    Zhang S, Wan Z, Kamm RD (2021) Васкуляризованные органоиды на чипе: стратегии создания органоидов с функциональной сосудистой сетью. Лабораторный чип 21 (3): 473–488. https://doi.org/10.1039/d0lc01186j

    Статья Google ученый

  • 180.

    Yu JJ (2020) Васкуляризованные органоиды: более полная модель. Стволовые клетки Int J 14: 127–137. https: // doi.org / 10.15283 / ijsc20143

    Статья Google ученый

  • 181.

    Хоман К.А., Гупта Н., Кролл К.Т. и др. (2019) Васкуляризация и созревание органоидов почек in vitro с усилением потока. Нат Методы 16 (3): 255–262. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0325-y

    Статья Google ученый

  • 182.

    Cakir B, Xiang Y, Tanaka Y et al (2019) Разработка органоидов человеческого мозга с функциональной сосудистой системой.Нат методы 16 (11): 1169–1175. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0586-5

    Статья Google ученый

  • Картирование структуры и биологических функций мезенхимальных тел с помощью микрофлюидики

    ВВЕДЕНИЕ

    В последние годы органоиды стали мощным инструментом для фундаментальных исследований, скрининга лекарств и тканевой инженерии. Органоиды, образованные in vitro, демонстрируют многие особенности структурной организации и функциональные признаки анатомических структур взрослых или эмбрионов ( 1 ).Кроме того, образование органоидов устраняет необходимость проведения исследований на животных и обеспечивает привлекательную платформу для надежных количественных исследований механизмов, регулирующих гомеостаз органов и восстановление тканей in vivo ( 1 ). Формирование органоидов обычно начинается с популяций стволовых клеток. Поэтому ожидается, что они будут гетерогенными, потому что плюрипотентные стволовые клетки [индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (pscs) или эмбриональные стволовые клетки], как было показано, динамически и стохастически колеблются от основного состояния к дифференцированному ( 2 ).Сообщается, что кишечные стволовые клетки LGR5 + содержат несколько отдельных популяций ( 3 ). Таким образом, образование органоидов включает в себя врожденную способность этих гетерогенных популяций самосортироваться и формировать самопрофилированную структуру, чтобы сформировать организованную трехмерную (3D) архитектуру ( 4 ). Однако правила, лежащие в основе образования органоидов, а также вклад внутренней гетерогенности популяции в самосборку органоидов остаются плохо понятыми ( 5 ).Следовательно, существует потребность в новых количественных подходах на уровне отдельных клеток, чтобы надежно понять механизмы пространственного формирования паттерна ткани в трехмерных органоидах, для которых хорошо подходят микрофлюидные методы и методы количественного анализа изображений. В этой работе мы используем мезенхимальные предшественники, альтернативно названные мезенхимальные стромальные клетки (МСК), которые составляют самообновляющуюся популяцию со способностью дифференцироваться в адипоциты, хондроциты и остеобласты ( 5 ). Хотя человеческие МСК (HMSC) экспрессируют высокие уровни маркеров недифференцировки (например,g., CD105, CD44, CD73), они составляют гетерогенную популяцию клеток, которые демонстрируют значительные различия в своих биофизических свойствах и эпигенетическом статусе, а также базовом уровне экспрессии генов, связанных с дифференцировкой, иммунорегуляцией и ангиогенезом ( 6 , 7 ). Тем не менее, их агрегация приводит к формированию высокосвязных трехмерных сферических структур [которые мы обозначаем в дальнейшем как мезенхимальные тела (МБ)] с улучшенной биологической активностью по сравнению с двумерными культурами ( 8 ).Однако мало что известно о том, как HMSC самоорганизуются и регулирует ли внутренняя гетерогенность популяции образование MB и функции отдельных клеток в 3D. Самоагрегирование HMSC в MB может повторять ранние стадии мезенхимальной конденсации, и это способствует секреция паракринных молекул, участвующих в процессе окостенения ( 9 ). Во время мезенхимальной конденсации in vivo мезенхимные предшественники самоагрегируются и образуют плотные межклеточные контакты, которые приводят к инициированию костного органогенеза посредством эндохондрального (что требует хондрогенного промежуточного соединения) и внутримембранного (прямая остеогенная дифференцировка) оссификации ( 10 ).Кроме того, образование этих 3D МБ in vivo связано с секрецией важных паракринных молекул, таких как простагландин E2 (PGE2) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), которые участвуют в рекрутировании эндогенных остеобластов, остеокластов и кровеносных сосудов. , приводящее к инициированию / восстановлению гомеостаза кости ( 11 , 12 ). В этих двух процессах окостенения индукция генов-мишеней ядерного фактора κB (NF-κB), таких как циклооксигеназа-2 (COX-2), и их последующих продуктов (например,g., PGE2 и VEGF) играет критическую роль в качестве онтогенетических регуляторов окостенения и заживления костей ( 13 ). Однако, хотя мезенхимальная конденсация имеет решающее значение для органогенеза кости, все еще существует ограниченное понимание того, как пространственная организация клеток в 3D MBs регулирует эндокринные функции отдельных клеток ( 14 ).

    В настоящей работе мы исследуем влияние фенотипической гетерогенности в популяции стволовых клеток на механизмы самосборки и формирования функционального паттерна внутри 3D органоидов с использованием HMSCs в качестве модели гетерогенной популяции клеток-предшественников.Это выполняется с использованием новой микрофлюидной платформы для образования менизенхимальных тел с высокой плотностью, в сочетании с анализом отдельных клеток путем количественного анализа изображений. Наше исследование показывает, что популяция клеток-предшественников самоорганизуется в иерархическом порядке развития. Мы также обнаружили, что структурная организация в мензенхимальных телах связана с функциональным формированием паттерна в 3D посредством модуляции активности регуляторной молекулярной передачи сигналов в локальном масштабе. Это исследование демонстрирует взаимодействие между размером клеток и статусом дифференцировки, которое опосредует пространственную перестройку клеток в 3D, что приводит к региональной активации уникальных биологических функций при формировании агрегатов.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Понимание механизмов формирования и пространственного тканевого паттерна внутри органоидов требует характеристики на уровне одной клетки в 3D. В этом исследовании мы использовали новую микрофлюидную и эпифлуоресцентную технологию визуализации для получения точного количественного картирования структуры, положения и связи с отдельными клеточными функциями внутри МБ. Анализ изображений предоставил количественные данные, которые были разрешены в масштабе отдельных ячеек, давая измерения на 700 000 ячеек in situ в пределах более 10 000 МБ.

    Хотя микрожидкостная технология, разработанная здесь, очень эффективна для формирования МБ с контролируемым размером с высокой плотностью, этот метод имеет некоторые ограничения. Главный из них, культивирование в каплях нанолитрового размера может привести к лишению клеток питательных веществ и накоплению побочных продуктов в статических условиях культивирования. Это ограничивает продолжительность культивирования до нескольких дней, в зависимости от типа клеток и размера капель. Чтобы преодолеть это ограничение, можно непрерывно перфузировать чип свежей культуральной средой после выполнения масляно-водного фазового обмена, как мы продемонстрировали ранее ( 16 ).В качестве альтернативы также возможно поддерживать клетки в жидких каплях (без использования гидрогеля), пополняя культуральную среду путем слияния дополнительных капель в более позднее время. Однако эта операция требует новой конструкции якорей и дополнительных микрофлюидных ступеней ( 21 ).

    Второй серьезный недостаток метода связан с большим расстоянием между МБ и объективом микроскопа, что требует использования объективов с очень большим рабочим расстоянием. Это усугубляет сложность применения различных конфокальных методов, ограничивая интенсивность флуоресценции изображений, что, в свою очередь, снижает производительность, когда требуются наборы трехмерных изображений.Хотя мы показали выше, что широкопольная визуализация может использоваться для получения пространственных отображений сфероидной структуры и функций клеток, истинные измерения отдельных клеток должны будут преодолеть ограничения на визуализацию в будущем.

    Сегментация Вороного использовалась для разделения клеток на концентрические слои, начиная от края МБ и заканчивая клетками в центральной области ( 22 ), что позволило нам измерить вариации структурной организации и белка. выражения на послойной основе в трехмерных культурах.Было обнаружено, что МБ организуются в центральную область недифференцированных клеток, окруженную оболочкой коммитированных клеток. Эта иерархическая организация является результатом пространственной сегрегации изначально гетерогенной популяции, как это обычно бывает в популяциях плюрипотентных и соматических стволовых клеток ( 2 , 3 , 33 ). Процесс агрегации HMSCs, полученных в течение нескольких часов, проходит через разные стадии (рис. 6G): первые шаги агрегации MB опосредуются взаимодействиями N-кадгерина.Параллельно активируется передача сигналов NF-κB, способствуя выживанию клеток, предотвращая аноикис суспендированных клеток ( 34 , 35 ). На более поздних стадиях образование полимеризованного F-актина и, в меньшей степени, стрессовых волокон опосредует уплотнение МБ, в основном на краю МБ, где клеточная фиксация помогает стабилизации слипчивых соединений. Формирование адгезивных соединений способствует сцеплению трехмерной структуры, вероятно, за счет повышенной доступности α- и β-катенинов в клетках CD146 dim / RUNX-2 + ( 36 , 37 , 38 ). ), которые рекрутируются в CCC-комплексы адгезивных соединений, чтобы способствовать стабильному связыванию F-актина с N-кадгерином ( 39 ), который становится более нерастворимым для Triton X-100, чем неограниченные N-кадгерины.Функциональный фенотип, который коррелирует с этой иерархической сегрегацией, представляет собой повышение эндокринной активности клеток, расположенных на границах МБ. Экспрессия СОХ-2 повышена во внешних слоях МБ, которые также содержат больше функциональных адгезивных соединений, а также устойчивую активность NF-κB в этой области. Промотор COX-2 содержит цис-действующие элементы RUNX-2 и NF-κB ( 40 ). Хотя RUNX-2 необходим для экспрессии СОХ-2 в мезенхимальных клетках, его уровень экспрессии не регулирует уровни СОХ-2 ( 40 ).Повышенная экспрессия ЦОГ-2, в свою очередь, является следствием разукрупненной формы F-актина (то есть более расслабленной формы актина по сравнению с плотными стресс-волокнами, наблюдаемыми в 2D) вблизи края МБ, которая была сообщили, что поддерживают активность NF-κB ( 41 ) и подавляют репрессоры транскрипции COX-2 ( 42 ). Таким образом, NF-κB обладает высокой активностью во внешних слоях МБ, где он локально способствует экспрессии ЦОГ-2. Эти результаты показывают, что формат 3D-культуры может дать некоторую информацию для понимания поведения мезенхимальных клеток in vivo, поскольку мы обнаружили что экспрессия ключевых регуляторных молекул костей пространственно регулируется как функция структурной организации МБ.Полученная здесь трехмерная структура напоминает некоторые из условий, обнаруженных на начальных этапах внутримембранного окостенения, которое происходит после мезенхимальной конденсации (т.е. в МБ не было обнаружено хондрогенного промежуточного продукта). В развивающемся своде черепа наиболее недифференцированные мезенхимные клетки (например, клетки Sca-1 + / RUNX-2 ) расположены во внутришовной мезенхиме, которая окружена остеогенным фронтом, содержащим больше коммитированных клеток (например, Sca -1 / RUNX-2 + ячеек) ( 43 , 44 ).Аналогичным образом, мы наблюдали, что недифференцированные HMSC (т.е. CD146 bright / RUNX-2 HMSC) были окружены остеогенно коммитированными клетками (т.е. CD146 dim / RUNX-2 + HMSC), которые также коэкспрессировали pro -остеогенные молекулы, а именно ЦОГ-2 и его нижележащие мишени, PGE2 и VEGF. Хотя связь между ЦОГ-2 и ПГЕ2 хорошо установлена, существуют также доказательства того, что ЦОГ-2 может индуцировать продукцию VEGF в различных типах клеток, например, в клетках рака толстой кишки ( 45 ), клетках рака простаты ( 46 ). ), саркома ( 47 ), раковые клетки поджелудочной железы ( 48 ), клетки Мюллера сетчатки ( 49 ), фибробласты желудка ( 50 ), фибробласты кожи или легких ( 51 ).В этих случаях считается, что механизм продукции VEGF посредством индукции ЦОГ-2 связан с ПГЕ-2 либо аутокринным / паракринным образом ( 52 ), либо внутрикринным образом ( 53 ). пространственная организация, связанная с уровнем дифференцировки и размером клеток, была документально подтверждена в растущих эмбриоидах и органоидах, при этом более коммитированные клетки располагаются во внешних слоях ( 54 , 55 , 56 ). Наши результаты показывают, что подобная иерархическая структура может быть также получена путем агрегации смешанной популяции взрослых предков.Это говорит о том, что сортировка клеток, основанная на размере и приверженности, играет доминирующую роль в организации агрегатов стволовых клеток. Этот управляемый данными подход комбинирования высокопроизводительной трехмерной культуры и многомасштабной цитометрии ( 16 ) на сложных биологических моделях может быть применен в дальнейшем для лучшего понимания равновесий, которые определяют структуру и функцию клеток в сфероидах многоклеточной опухоли. эмбриоидные тела или органоиды.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Культура MSC, полученная из UC человека

    HMSC, полученные из желе Уортона UC (HMSC) [Американская коллекция типовых культур (ATCC) PCS-500-010, LGC, Molsheim, France] были получены при пассаже 2.В этом исследовании использовались четыре различных партии HMSC (номера партий 60

    4, 63739206, 63516504 и 63739206). Хотя партии не были выбраны априори, мы обнаружили согласованные результаты для распределения COX-2 и CD146 в МБ. HMSC из разных партий были сертифицированы как положительные по CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и CD166 (более 98% населения положительны по этим маркерам) и как отрицательные по CD14, CD31, CD34 и CD45 (менее 0,6%). % населения положительны на эти маркеры) и дифференцироваться на адипоциты, хондроциты и остеоциты (ATCC, сертификаты анализа).HMSC поддерживали в колбах T175 см 2 (Corning, Франция) и культивировали в стандартном инкубаторе CO 2 (Binder, Tuttlingen, Германия). Культуральная среда состояла из α-модифицированной среды Игла (α-MEM) (Gibco, Life Technologies, Saint Aubin, Франция) с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Gibco) и 1% (об. / v) пеницилин-стрептомицин (Gibco). Клетки высевали при 5 × 10 3 клеток / см 2 , субкультивировали каждую неделю, и среду обновляли каждые 2 дня.HMSC на пассаже 2 сначала размножали до пассажа 4 [примерно для пяти-шести удвоений популяции (PD)], затем криоконсервировали в 90% (об. / Об.) FBS / 10% (об. / Об.) Диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили. в баллоне с жидким азотом. Эксперименты проводились с HMSC на пассажах с 4 по 11 (примерно от 24 до 35 PD после пассажа 2).

    Окрашивание поверхностных маркеров, анализ и сортировка с помощью проточной цитометрии

    HMSC собирали путем соскабливания или трипсинизации из колб T175 см 2 . Затем клетки инкубировали в буфере для окрашивания [2% FBS в фосфатно-солевом буфере (PBS)], окрашивали мышиным антителом против CD146 человека — Alexa Fluor 647 (клон P1-h22, BD Biosciences), мышиным антителом против человека. CD31-Alexa Fluor 488 (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния), мышиное антитело против человеческого CD105-Alexa Fluor 647 (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния), мышиное антитело против человеческого CD90-флуоресцеинизотиоцианата (FITC) и мышиный анти-человеческий CD73 – аллофикоцианин (APC) (Miltenyi Biotec, Германия), CD14-APC (Miltenyi Biotec), CD34-FITC (BioLegend) и HLA-DR – APC (BD Biosciences).

    Процентное содержание CD73-, CD90-, CD105-, CD146-, CD31-, CD34- и HLA-DR-положительных клеток анализировали с помощью FACS LSRFortessa (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) или ImageStream (Amnis ) проточный цитометр. Чтобы подтвердить специфичность окрашивания антител, распределение флуоресцентно меченых клеток сравнивали с клетками, окрашенными изотипическими контролями: мышиный иммуноглобулин G1 (IgG1), k-PE-Cy5 (клон MOPC-21, BD Biosciences) и мышиный IgG2a K контроль изотипа FITC (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).Альтернативно, HMSC были отсортированы на основе их уровня экспрессии CD146 или их размера [прямое рассеяние (FSC) и боковое рассеяние (SSC)] с использованием FACSAria III (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).

    Адипогенная, остеогенная и хондрогенная дифференцировка

    Для индукции адипогенной дифференцировки UC-HMSC засевали при концентрации 1 × 10 4 клеток / см 2 в культуральной среде. На следующий день культуральную среду заменили на среду StemPro Adipogenesis Differentiation (Life Technologies) с добавлением 10 мкМ розиглитазона (Sigma-Aldrich) в течение 2 недель.Для визуализации дифференцированных адипоцитов клетки окрашивали Oil Red O (Sigma-Aldrich). В качестве контроля UC-HMSC поддерживали в культуральной среде в течение 2 недель и окрашивали Oil Red O, как указано выше.

    Для индукции остеогенной дифференцировки UC-HMSC засевали при 5 × 10 3 клеток / см 2 в культуральной среде. На следующий день культуральную среду заменили на среду StemPro Osteogenesis Differentiation (Life Technologies) с добавлением 2-нм костного морфогенетического белка 2 (BMP-2) (Sigma-Aldrich) в течение 2 недель.Для визуализации дифференцированных остеобластов клетки окрашивали ализарином Red S (Sigma-Aldrich). В качестве контроля UC-HMSC поддерживали в культуральной среде в течение 2 недель и окрашивали ализарином Red S, как указано выше.

    Для индукции хондрогенной дифференцировки UC-HMSC засевали в концентрации 1 × 10 6 клеток / мл в коническую пробирку на 15 мл для стимулирования культивирования микромассы. Среда представляла собой среду для хондрогенной дифференцировки StemPro (Life Technologies). После 3 недель культивирования гранулы фиксировали и делали криосрезы, а затем окрашивали на Alcian Blue 8GX (Sigma-Aldrich).В качестве контроля UC-HMSC поддерживали в 2D с использованием культуральной среды в течение 3 недель и окрашивали альциановым синим, как указано выше.

    Цветные изображения были получены с помощью бинокля (SMZ18, Nikon), оснащенного камерой (D7500, Nikon).

    Microfabrication

    Стандартная мягкая литография на сухой пленке использовалась для изготовления устройства фокусировки потока (верхняя часть чипа), в то время как был разработан особый метод изготовления якорей (нижняя часть чипа). Для первой части до пяти слоев фоторезиста сухой пленки, состоящего из 50 мкм Eternal Laminar E8020, 33 мкм Eternal Laminar E8013 (Eternal Materials, Тайвань) и 15 мкм негатива Alpho NIT215 (Nichigo-Morton, Япония). пленки были последовательно ламинированы с использованием офисного ламинатора (PEAK pro PS320) при температуре 100 ° C до достижения желаемой высоты канала, 135, 150, 165 или 200 мкм.Затем пленка фоторезиста подвергалась воздействию ультрафиолета (Lightningcure, Хамамацу, Япония) через фотошаблон соединения, каналов и границ культуральной камеры. Мастера были выявлены после промывки в 1% (мас. / Мас.) Растворе K 2 CO 3 (Sigma-Aldrich). Для изготовления анкера формы были спроектированы с помощью программного обеспечения RhinoCAM (MecSoft Corporation, LA) и изготовлены путем микроплавления латунной пластины (CNCMini-Mill / GX, Minitech Machinery, Norcross). Топография форм и шаблонов была измерена с помощью оптического профилометра (Veeco Wyco NT1100, Veeco, Мангейм, Германия).

    Для изготовления верхней части чипа, поли (диметилсилоксан) [PDMS; SYLGARD 184, Dow Corning, соотношение отвердителя и сыпучего материала 1:10 (мас. / Мас.)] Заливали мастером и отверждали в течение 2 часов при 70 ° C. Для изготовления нижней части чипа формы для анкеров были покрыты PDMS. Затем предметное стекло было погружено в неотвержденный PDMS над анкерами. Затем форму нагревали на горячей плите при 180 ° C в течение 15 минут. После плазменной обработки верхняя и нижняя части чипа герметизировались (Harrick, Ithaca).Чипы трижды заполняли модификатором поверхности Novec ™ (3M, Париж, Франция), фторполимерным покрывающим агентом, в течение 30 мин при 110 ° C на горячей плите.

    Образование МБ на чипе

    HMSC собирали с TrypLE при 60-70% конфлюэнтности, и раствор, содержащий 6 × 10 5 клеток в 70 мкл среды, смешивали с 30 мкл 3% (мас. v) жидкий легкоплавкий раствор агарозы (т.е. хранящийся при 37 ° C) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Франция), разведенный в культуральной среде, содержащей гентамицин (50 мкг / мл; Sigma-Aldrich) (1: 3, v. / v), в результате чего получают 100 мкл раствора 6 × 10 6 клеток / мл в 0.9% (мас. / Об.) Агарозы.

    HMSC и агарозу загружали в стеклянный шприц на 100 мкл (SGE, Analytical Science, Франция), в то время как масло Fluorinert FC-40 (3M, Париж, Франция), содержащее 1% (мас. / Мас.) ПАВ ПЭГ-ди-Krytox ( RAN Biotechnologies, Beverly, USA) загружали в стеклянные шприцы объемом 1 и 2,5 мл (SGE, Analytical Science). Капельки агарозы клеточной жидкости были образованы в FC-40, содержащем PEG-di-Krytox, на стыке фокусировки потока, путем регулирования скорости потока с помощью шприцевых насосов (neMESYS Low-Pressure Syringe Pump, Cetoni GmbH, Korbussen, Germany). (таблица S1).После полной загрузки чипы погружали в PBS, и клеткам давали возможность осесть и организовать в течение ночи в инкубаторе CO 2 в виде МБ. Затем агарозу превращали в гель при 4 ° C в течение 30 минут, после чего PEG-ди-Krytox тщательно промывали промыванием чистого FC-40 в камере для культивирования. После промывки вводили среду для культивирования клеток для замены FC-40. Все значения расхода указаны в таблице S1. Дальнейшие операции были разрешены путем гелеобразования агарозы в каплях, так что полученные шарики удерживались в ловушках механически, а не за счет капиллярных сил (рис.2G). Этот этап позволил заменить масло, окружающее капли, на водный раствор, например, чтобы принести свежую среду для длительного культивирования, химические стимулы или различные растворы, необходимые для окрашивания клеток.

    Живой анализ образования МБ

    Для получения живого изображения образования МБ чипы погружали в PBS, а затем инкубировали в течение 24 часов в микроскопе-инкубаторе, оборудованном контроллерами температуры, CO 2 и гигрометрии (Okolab, Поццуоли, Италия).Клетки снимали каждые 20 мин.

    Иммуноцитохимия

    2D-культур или МБ промывали в PBS и инкубировали с 5 мкМ субстратом каспазы-3 NucView 488 (Interchim, Montluçon, Франция), разведенным в PBS. После промывки PBS HMSC фиксировали 4% (мас. / Об.) PFA (Alpha Aesar, Heysham, UK) в течение 30 минут и повышали проницаемость с помощью 0,2-0,5% (об. / Об.) Triton X-100 (Sigma-Aldrich). на 5 мин. Образцы блокировали 5% (об. / Об.) FBS в PBS в течение 30 мин и инкубировали с кроличьими поликлональными первичными антителами против COX-2 (ab15191, Abcam, Кембридж, Великобритания), разведенными 1: 100 в 1% (об. / v) FBS в течение 4 часов.После промывки PBS образцы инкубировали с конъюгированными с Alexa Fluor 594 козьими поликлональными вторичными антителами против кроличьего IgG (A-11012, Life Technologies, Saint Aubin, Франция), разведенными 1: 100 в 1% (об. / Об.) FBS на 90 мин. Наконец, клетки контрастировали с 0,2 мкМ DAPI в течение 5 мин (Sigma-Aldrich), а затем промывали PBS.

    Тот же протокол использовали для окрашивания клеток, экспрессирующих VEGF-A, с использованием кроличьего моноклонального антитела против VEGF-A человека (ab52917, Abcam, Кембридж, Великобритания), которое было выявлено с использованием того же вторичного антитела, что и выше.RUNX-2-положительные клетки окрашивали аналогичным образом с использованием мышиных моноклональных антител против RUNX-2 человека (ab76956, Abcam, Кембридж, Великобритания), которые выявляли с использованием вторичных антител козы против IgG2a мыши Alexa Fluor 488 (A-21131, Life Technologies, Saint Aubin, France), оба разбавлены 1: 100 в 1% (об. / Об.) FBS.

    Обнаружение гипоксии внутри МБ

    Для измерения потенциальной индукции гипоксии в ядре МБ клетки окрашивали реагентом Image-iT Red Hypoxia Reagent (Invitrogen) в течение 3 часов, а затем отображали с помощью флуоресцентного микроскопа.В качестве положительного контроля чипы, содержащие МБ, погружали в PBS, инкубировали в течение ночи в инкубаторе, установленном на 37 ° C в атмосфере 3% O 2 /5% CO 2 , и, наконец, получали изображения, как указано выше.

    Ингибирование молекулярных путей, регулирующих свойства HMSC в MB

    Для исследования вклада передачи сигналов, связанных с продукцией противовоспалительных молекул (COX-2 и NF-κB) или молекулярными путями, регулируемыми структурной организацией клетки (Notch, ROCK, и F-актин), в культуральную среду добавляли несколько небольших молекул, индуцирующих их ингибирование (таблица S1).Для всех условий конечная концентрация ДМСО была ниже 0,1% (об. / Об.) В культуральной среде.

    Анализ жизнеспособности

    Жизнеспособность клеток оценивали с использованием набора для окрашивания LIVE / DEAD (Molecular Probes, Life Technologies). МБ инкубировали в течение 30 мин в PBS, содержащем 1 мкМ кальцеина AM и 2 мкМ гомодимера этидия-1, промывая 100 мкл раствора. Затем образцы промывали PBS и отображали под моторизованным флуоресцентным микроскопом (Nikon, Франция).

    Иммуноокрашивание N-кадгеринов

    Для обнаружения функциональных форм N-кадгеринов (т.е.(например, N-кадгерины, тесно связанные с актиновой сетью, которые нерастворимы в PFA), MB фиксировали 4% (мас. / об.) PFA (Alpha Aesar, Heysham, UK) в течение 30 мин и проницаемостью от 0,2 до 0,5% (об. / Об.) Triton X-100 (Sigma-Aldrich) в течение 5 мин. В качестве альтернативы агрегаты инкубировали в течение 5 минут со 100% холодным метанолом, а затем в течение 1 минуты с холодным ацетоном для определения общего количества N-кадгеринов (т.е. растворимых в PFA и нерастворимых в PFA форм).

    Затем образцы блокировали 5% (об. / Об.) FBS в PBS в течение 30 мин и инкубировали с кроличьими поликлональными первичными антителами против N-кадгерина (ab18203, Abcam, Кембридж, Великобритания), разведенными в соотношении 1: 100 в 1% (об. / Об.) FBS в течение 4 часов.После промывки PBS образцы инкубировали с конъюгированными с Alexa Fluor 594 козьими поликлональными вторичными антителами против кроличьего IgG (A-11012, Life Technologies, Saint Aubin, Франция), разведенными 1: 100 в 1% (об. / Об.) FBS на 90 мин. Наконец, клетки контрастировали с 0,2 мкМ DAPI в течение 5 мин (Sigma-Aldrich), а затем промывали PBS.

    Окрашивание F-актина

    Для количественной оценки полимеризованной формы актина (F-актина) МБ сначала фиксировали 4% (мас. / Об.) PFA (Alpha Aesar, Heysham, UK) в течение 30 мин и проницаемость 0.От 2 до 0,5% (об. / Об.) Triton X-100 (Sigma-Aldrich) в течение 5 мин. Затем образцы блокировали 5% (об. / Об.) Раствором FBS и инкубировали в течение 90 мин в 1: 100 фаллоидин – Alexa Fluor 594 (Life Technologies), разведенном в 1% (об. / Об.) Растворе FBS. Затем клетки контрастно окрашивали 0,2 мкМ DAPI в течение 5 мин (Sigma-Aldrich), а затем промывали PBS.

    Проверка паттернов флуоресцентных сигналов

    Чтобы гарантировать специфичность антитела к ЦОГ-2 и N-кадгерину, контрольные UC-HMSC были проницаемы, фиксированы и инкубированы только с вторичным антителом (Alexa Fluor 594-конъюгированный козьи поликлональные антитела против кроличьего IgG), как указано выше.Отсутствие сигнала флуоресценции указывает на специфическое окрашивание внутриклеточного ЦОГ-2 и N-кадгерина.

    Затем, чтобы подтвердить, что распределение интенсивности флуоресценции не связано с каким-либо ограничением диффузии антител, МБ фиксировали и повышали проницаемость, как указано выше. Для этого анализа МБ не подвергали воздействию какого-либо блокирующего буфера. Клетки инкубировали в течение 90 мин с конъюгированным с Alexa Fluor 594 козьим поликлональным вторичным антителом против кроличьего IgG (A-11012, Life Technologies, Saint Aubin, Франция), разведенным 1: 100 в 1% (об. / Об.) FBS.Затем клетки контрастировали с DAPI, как указано выше. Наконец, МБ были собраны с чипа, нанесены на предметное стекло и отображены.

    Для анализа экспрессии СОХ-2 с помощью проточной цитометрии все МБ были извлечены с чипа. Затем МБ трипсинизировали и растирали с получением суспензии отдельных клеток. UC-HMSC окрашивали на COX-2, как указано выше. Процент COX-2-положительных клеток определяли количественно на 5 × 10 3 диссоциированных UC-HMSC с использованием проточного цитометра Guava easyCyte (Merck Millipore, Guyancourt, Франция).Результаты сравнивали с распределением интенсивности флуоресценции, полученным при анализе изображений.

    Очистка МБ, полученных из HMSC

    Чтобы исследовать влияние непрозрачности МБ в сигналах флуоресценции ЦОГ-2 и N-кадгерина, образцы обрабатывали методом Clear (T2) после иммуноокрашивания ( 57 ). Вкратце, МБ инкубировали в течение 10 минут в 25% (об. / Об.) Формамиде / 10% (мас. / Об.) Полиэтиленгликоле (PEG) (Sigma-Aldrich), затем в течение 5 минут в 50% (об. / Об.) Формамиде. / 20% (мас. / Об.) ПЭГ, и, наконец, в течение 60 мин в 50% (об. / Об.) Формамиде / 20% (мас. / Об.) ПЭГ перед визуализацией.Распределение сигнала флуоресценции сравнивали с неочищенными образцами.

    Криосрезы

    МБ были собраны с чипа и затем зафиксированы с помощью PFA, как указано выше. МБ инкубировали в течение ночи в 30% растворе сахарозы при 4 ° C. Затем раствор сахарозы заменяли на O.C.T. среды (оптимальная температура резки; Tissue-Tek) в формах для включения, которые медленно охлаждали с помощью сухого льда в этаноле. Затем формы помещали при -80 ° C. В день экспериментов О.C.T. блоки были вырезаны на 7 мкм с использованием криостата (CM3050 S, Leica). Криосрезы помещали на предметные стекла (SuperFrost Plus Adhesion, Thermo Fisher Scientific), сушили при 37 ° C и регидратировали с использованием PBS. Криосрезы сделали проницаемыми и окрашивали на СОХ-2, как указано выше. Наконец, предметные стекла помещали в монтажную среду, содержащую DAPI (Fluoromount-G, Invitrogen).

    Микроскопия

    Все изображения, используемые для количественного анализа, были получены с помощью моторизованного широкопольного микроскопа (Ti, Eclipse, Nikon), оснащенного камерой CMOS (комплементарный металл-оксидный полупроводник) (ORCA-Flash5.0, Hamamatsu) и флуоресцентный светодиодный источник (Spectra X, Lumencor). Изображения были получены с помощью объектива 10 × с рабочим расстоянием 4 мм (сверхбольшое рабочее расстояние) и числовой апертурой (NA) 0,45 (Plan Apo λ, Nikon).

    Для контрольных экспериментов изображения были получены с использованием моторизованного (Ti2, Nikon) конфокального микроскопа с вращающимся диском, оснащенного лазерами (W1, Yokogawa) и той же камерой и объективом, что и выше. В качестве альтернативы образцы были получены с помощью многофотонного микроскопа (TCS SP8 NLO, MP, Leica).В качестве объектива использовался HCX PL APO CS 10 ×, 0,40 NA, рабочее расстояние 2,2 мм (Leica).

    Все иммуноокрашенные образцы контрастировали с DAPI, и большинство изображений (например, для N-кадгерина, COX-2, VEGF-A и F-актина) были получены с использованием возбуждения красным светом, который, как известно, проникает глубже в 3D-объекты, чем красители, излучающие при меньшей длине веса (например, DAPI, FITC). Для широкопольной микроскопии фокальная плоскость была определена как область, содержащая максимальное количество ядер, окрашенных DAPI, покрывающих фокальную область, в то время как стеки z были взяты для всех сфокусированных плоскостей, содержащих ядра, окрашенные DAPI, с использованием вращающихся дисков. и двухфотонная конфокальная микроскопия.

    Широкопольное изображение чувствительно к излучению флуоресценции изнутри и вне фокальной плоскости (то есть из расфокусированных верхней и нижней плоскостей сфероидов) ( 58 ). Соответственно, больше сигнала DAPI от ядер испускается из ядра, чем на краях МБ, при использовании эпифлуоресцентной микроскопии (рис. S5I). Мы подтвердили, что наша интерпретация распределения сигнала из эпифлуоресцентных изображений согласуется с конфокальной и двухфотонной микроскопией, сравнив изображения, полученные из средней плоскости z и максимальной проекции z (рис.S5, с N на P).

    Следовательно, результаты однозначно демонстрируют, что даже если есть больше клеток в плоскости z средней области МБ, вклад расфокусированного сигнала от N-кадгерина, ЦОГ-2, VEGF-A , и окрашивание F-актина в этой области МБ минимально при использовании изображений с широким полем. Из-за более высокой пропускной способности широкоугольной микроскопии этот метод был выбран для количественного анализа распределения этих иммуномеченых белков в МБ.

    Конкурентный ELISA для PGE2

    Культуральные супернатанты шестилуночных планшетов собирали, в то время как общее содержание среды в чипе восстанавливали путем промывки культуральной камеры чистым маслом.Набор PGE2 для человеческого ELISA (ab133055, Abcam, Cambridge, UK) использовали для количественной оценки концентрации PGE2 в культуральном супернатанте, следуя инструкциям производителя. Вкратце, была построена полиномиальная стандартная кривая концентрации PGE2, полученная из серийного разбавления стандартного раствора PGE2 ( r 2 > 0,9). Оптическую плотность измеряли с помощью планшет-ридера (Chameleon, Hidex, Финляндия).

    ELISA для VEGF-A

    Набор VEGF-A для человеческого ELISA (Ab119566, Abcam, Cambridge, UK) использовали для количественной оценки концентрации VEGF-A в культуральном супернатанте 2D культур или с чипов.Была построена линейная стандартная кривая концентрации VEGF-A, полученная из серийных разведений стандартного раствора VEGF-A ( r 2 > 0,9). Оптическую плотность измеряли с помощью планшет-ридера (Chameleon, Hidex, Финляндия).

    Анализ RT-qPCR

    Все МБ за 3-дневный период культивирования собирали с чипов, как описано выше. Альтернативно, клетки, культивируемые на обычных шестилуночных планшетах, выделяли с использованием трипсина после того же времени культивирования; Выделенные клетки CD146 dim и CD146 bright сразу же обрабатывали для экстракции РНК после сортировки.Суммарную РНК 1 × 10 4 клеток экстрагировали и преобразовали в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием системы синтеза кДНК SuperScript III CellsDirect (18080200, Invitrogen, Life Technologies), следуя инструкциям производителя. После лизиса клеток сравнимое качество экстрагированной РНК наблюдали с использованием отбеливающего агарозного геля, и аналогичную чистоту РНК получали путем измерения оптической плотности при 260 и 280 нм с использованием спектрофотометра NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Уилмингтон, Делавэр) между препараты тотальной РНК из 2D и на чипе культур.

    кДНК амплифицировали с использованием мастер-смеси GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Charbonnieres, Франция) или FastStart Universal SYBR Green Master Mix (содержащей Rox) (Roche) и праймеров (Life Technologies, Saint Aubin, Франция или Eurofins Scientific, Франция). при указанной температуре плавления ( T м ) (таблица S2) с использованием термоциклера MiniOpticon (Bio-Rad) или QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific). В качестве отрицательного контроля вода и общая РНК служили матрицей для ПЦР. Чтобы подтвердить специфичность ПЦР, ампликоны анализировали с помощью кривой диссоциации и последующей загрузки на 2.5% (мас. / Об.) Агарозный гель и миграция при 100 В в течение 40 мин. Продукты ПЦР выявляли окрашиванием бромидом этидия (Sigma-Aldrich), и гели визуализировали с помощью трансиллюминатора. Анализ образцов, не подвергнутых обратной транскрипции (RT ), показал незначительное загрязнение геномной ДНК (т.е. <0,1%), в то время как для водной матрицы не наблюдалось сигнала амплификации (без контроля матрицы). Количество транскриптов TSG-6, COX-2, STC-1, VEGF-A, RUNX-2, CEBP-α и SOX-9 было нормализовано по эндогенному эталону [глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GADPH)], и относительное выражение для калибратора (2D культуры) было дано вычислением 2 — ΔΔ C t .По крайней мере, пять биологических повторов двумерных культур и культур на чипе были проанализированы, по крайней мере, двойными измерениями. Стандартные кривые для GADPH, TSG-6, COX-2 и STC-1 были выполнены с использованием пяти серийных разведений матриц кДНК и показали почти 100% эффективность ПЦР.

    Получение и анализ изображений

    Анализ изображений позволил нам выполнить многомасштабный анализ ( 16 ) МБ. Для каждого чипа отдельные изображения якорей были получены автоматически с помощью моторизованного предметного столика микроскопа.Анализ проводился на монтаже обнаруженных якорей с использованием специального кода MATLAB (r2016a, MathWorks, Natick, MA). Были использованы две различные процедуры: одна с детектированием светлого поля и одна для экспериментов по флуоресценции. Для детектирования светлого поля, описанного ранее ( 16 ), клетки детектировались в каждом якоре как пиксели с высокими значениями градиента интенсивности. Это позволило каждой совокупности ячеек вычислить морфологические параметры, такие как площадь проекции A и индекс формы SI, который количественно определяет округлость объекта, где P — периметр.Значения индекса формы варьируются от 0 до 1, где 1 соответствует идеальному диску. Детекция МБ с флуоресцентным окрашиванием (DAPI / Casp3 / COX-2, DAPI / фаллоидин, DAPI / N-кадгерин или LIVE / DEAD) выполнялась как описано ранее ( 16 ). Сначала были извлечены морфологические данные на уровне МБ, такие как эквивалентный диаметр МБ или индекс формы. Кроме того, средний сигнал флуоресценции каждого МБ определяли как вычитание локального фона из средней исходной интенсивности. На клеточном уровне использовались два разных метода, оба основывались на обнаружении ядерных центров с помощью сигнала флуоресценции DAPI.С одной стороны, местоположение каждой клетки может быть отнесено к нормализованному расстоянию от центра МБ ( r / R ) для корреляции сигнала ядерной флуоресценции с положением в МБ, как описано ранее ( 16 ). С другой стороны, форма ячеек внутри МБ была аппроксимирована путем построения диаграмм Вороного по обнаруженным центрам ядер. В основном края ячеек Вороного образованы срединными перпендикулярами сегментов между центрами соседних ячеек.Эти клетки Вороного использовали для количественной оценки клеточного цитоплазматического сигнала (СОХ-2, F-актин и N-кадгерин, VEGF и RUNX-2). Более подробно, чтобы учесть вариабельность цитоплазматического сигнала по всей клетке (включая ядро), сигнал флуоресценции отдельной клетки был определен как средний сигнал 10% самых высоких пикселей соответствующей клетки Вороного. используется для получения количественных данных по 2D-культурам, как описано ранее ( 16 ). Наконец, в этой статье были выбраны различные процедуры нормализации.

    Author: alexxlab

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.