Таблица название органоида и функции: таблица:название органоида клетки,функции — Школьные Знания.com

Содержание

Тема 2.7. Эукариотическая клетка. Цитоплазма. Органоиды.

1. Рассмотрите рисунок 24 на с. 54—55 учебника. Запомните названия, местоположение и особенности функционирования органоидов.

2. Заполните кластер «Основные компоненты эукариотической клетки».

3. На основании каких основных признаков клетку считают эукариотической?
В клетках эукариот имеется хорошо оформленное ядро. Эукариотические клетки крупные, сложно устроенные по сравнению с клетками прокариот.

4. Изобразите схематично строение клеточной мембраны и подпишите её элементы.

5. Подпишите на рисунке животную и растительную клетки и обозначьте их основные органоиды.

6. Заполните кластер «Основные функции наружной клеточной мембраны».
Функции мембраны:
Барьерная
Транспортная
Взаимодействие клетки с окружающей средой и другими клетками.

7. Составьте синквейн к термину «мембрана».
Мембрана.
Избирательно-проницаемая, двухслойная.
Транспортирует, ограждает, сигнализирует.
Эластическая молекулярная структура, состоящая из белков и липидов.
Оболочка.

8. Почему явления фагоцитоза и пиноцитоза очень распространены у животных клеток и практически отсутствуют в растительных клетках и клетках грибов?
В клетках растений и грибов есть клеточная стенка, которая у животных отсутствует. Это позволяет цитоплазматической мембране всасывать воду с минеральными солями (пиноцитоз) ввиду большей эластичности. За счет этого свойства осуществляется и процесс фагоцитоза – захвата твердых частиц.

9. Заполните кластер «Органоиды эукариотической клетки».
Органоиды: мембранные и немембранные.
Мембранные: одномембранные и двумембранные.

10. Установите соответствие между группами и отдельными органоидами.
Органоиды
1. Митохондрии

2. ЭПС
3. Клеточный центр
4. Вакуоль
5. Аппарат Гольджи
6. Лизосомы
7. Рибосомы
8. Пластиды
Группы
A. Одномембранные
Б. Двумембранные
B. Немембранные 

11. Заполните таблицу.

Строение и функции органоидов клетки

12. Заполните таблицу.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТИТЕЛЬНОЙ И ЖИВОТНОЙ КЛЕТОК

13. Выберите название любого органоида и составьте с этим термином три типа предложений: повествовательное, вопросительное, восклицательное.
Вакуоль представляет собой крупный мембранный пузырек, заполненный клеточным соком.
Вакуоль – обязательная принадлежность растительной клетки!
Какие функции, кроме накопления запасных веществ, выполняет вакуоль?

14. Дайте определения понятий.
Включения — это необязательные компоненты клетки, появляющиеся и исчезающие в зависимости от интенсивности и характера обмена веществ в клетке и от условий существования организма.    

Органоиды — постоянные специализированные структуры в клетках живых организмов.

15. Выберите правильный ответ.
Тест 1.
За образование лизосом, накопление, модификацию и вывод веществ из клетки отвечает:
2) комплекс Гольджи;  

Тест 2.
Гидрофобную основу клеточной мембраны составляют:
3) фосфолипиды;

Тест 3.
Одномембранные органоиды клетки:
2) лизосомы;

16. Объясните происхождение и общее значение слова (термина), опираясь на значение корней, его составляющих.

17. Выберите термин и объясните, насколько его современное значение соответствует первоначальному значению его корней.


Выбранный термин – экзоцитоз.
Соответствие, термин соответствует, но стал ясен и уточнен механизм. Это клеточный процесс, при котором мембранные пузырьки сливаются с внешней клеточной мембраной. При экзоцитозе содержимое секреторных пузырьков выделяется наружу, а их мембрана сливается с клеточной мембраной. 

18. Сформулируйте и запишите основные идеи § 2.7.
Клетка состоит из трех главных компонентов: ядра, цитоплазмы и клеточной мембраны.
В цитоплазме имеются органоиды, включения и гиалоплазма (основное вещество). Органоиды бывают одномембранные (ЭПС, комплекс Гольджи, лизосомы и др.), двумембранные (митохондрии, пластиды) и немембранные (рибосомы, клеточный центр). Растительная клетка отличается от животной тем, что в ней имеются дополнительные структуры: вакуоль, пластиды, клеточная стенка, и отсутствуют центриоли в клеточном центре. Все органоиды и компоненты клетки составляют слаженный комплекс, работающий как единое целое.


Органоиды клетки — биообразование

«Органоиды клетки»

ПЛАН УРОКА

ТЕМА

  • Органоиды клетки. (Обучающий урок)

ЦЕЛИ

  • Повторение материала и оценка знаний учащихся по теме “Цитоплазма. Клеточная оболочка”.
  • Продолжение изучения клеточного уровня жизни и формирование знаний о строении и выполняемых функций одномембранных, двухмембранных и немембранных органоидов клетки.

ОБОРУДОВАНИЕ

ЭТАПЫ ЦЕЛЬ ЭТАПА ЗАДАНИЕ ВИД ДЕЯТЕЛЬНОСТИ
Клеточная оболочка Организация урока   Подготовка кабинета к работе.
Проверка и оценка знаний. 1 Компьютерное тестирование и работа с карточками.
Органоиды клетки Актуализация   Опрос с демонстрацией слайдов.
Изучение и закрепление нового материала

Одномембранные

Органоиды

2 Рассказы учеников с демонстрацией слайдов.

Заполнение таблицы.

Двухмембранные органоиды 3 Рассказы учеников с демонстрацией слайдов.

Заполнение таблицы.

Немембранные органоиды 4 Рассказы учеников с демонстрацией слайдов.

Заполнение таблицы.

Взаимосвязь органоидов в клетке
Заключение
1. Подведение итогов.
2. Выставление оценок.
3. Домашнее задание.
5 Устная работа со слайдом.

 ХОД УРОКА

1. Повторение. Компьютерное тестирование.

2. Актуализация знаний.

  • Каково строение клеточной оболочки?
  • Чем отличается клеточная оболочка растительной клетки от оболочки животной клетки?
  • Каким образом различные вещества попадают в клетку?

3. Изучение нового материала.

Органоиды (органеллы) — постоянные клеточные структуры, обеспечивающие выполнение клеткой специфических функций. Каждый органоид имеет определенное строение и выполняет определенные функции.

Различают:

1. Мембранные органоиды:

А) Одномембранные.

Б) Двухмембранные.

2. Немембранные органоиды.

На этом уроке мы должны не только систематизировать уже имеющиеся у нас знания об органоидах клетки, но установить взаимосвязь между ними.

 На этом этапе урока ребята представляют свои работы об органоидах клетки, подготовленные в виде презентаций.

ОДНОМЕМБРАННЫЕ ОРГАНОИДЫ

1. Э.П.Р.

Система мембранных цистерн и каналы, организующие пространство.

А). Шероховатый.

Б). Гладкий.

Обеспечивает связь с наружной цитоплазматической мембраной и оболочкой ядерной мембраны.

Синтез белка. Синтез и расщепление углеводов и липидов.

2. Аппарат Гольджи.

Стопка уплощенных цистерн с пузырьками.

Выведение из клеток секретов ( ферментов, гормонов).

Синтез сложных углеводов. Созревание белков.

Образование лизосом.

3. Лизосомы.

Мелкие пузырьки, содержащие ферменты, активные в слабощелочной среде.

Расщепление веществ с помощью ферментов.

ДВУХМЕМБРАННЫЕ ОРГАНОИДЫ

1. Митохондрии.

Наружная мембрана-гладкая Внутренняя мембрана-складчатая Выросты-кристы, внутри-матрикс, в нем.

Кольцевая ДНК и рибосомы.

Кислородное расщепление органических веществ.

С образованием АТФ.

Синтез митохондриальных белков.

Полуавтономная структура.

2. Пластиды. (Характерны для растительных клеток)

Хлоропласты.

Двояковыпуклая линза.

Наружная мембрана-гладкая,

Внутренняя-складчатая, в ней система ламелл и тилакоидов. Внутренняя среда-строма, содржит ДНК и рибосомы.

Фотосинтез. На матриксе-реакции световой фазы, в строме-реакции темновой фазы.

 НЕМЕМБРАННЫЕ ОРГАНОИДЫ

1. Рибосомы.

Структуры грибовидной формы. Очень мелкие.

Состоят из малой и большой субъединиц.

Субъединицы рибосом образуются в ядрышках.

Синтез белка.

2. Клеточный центр.

Образован центриолями и уплотненной цитоплазмой-центросферой.

Образует веретено деления в клетке.

 После выступлений учащихся ребята в три этапа заполняют таблицу самостоятельно.

Название таблицы
Структура
Функции
1. Одномембранные
Эндоплазматический ретикулум Э.Р. Система мембран формирующих цистерны и канальца.

А) Шероховатый

Б) Гладкий

Организует пространство, осуществляет связь с наружной и ядерной мембранами.

Синтез и транспорт белка.

Синтез и расщепление углеводов и липидов.

Аппарат Гольджи Стопка уплощенных цистерн с пузырьками. Выведение из клеток секретов (ферментов, гормонов), синтез сложных углеводов, созревание белков.

Образование лизосом.

Лизосомы Сферические мембранные мешочки, заполненные ферментами.

Активны в слабощелочной среде.

Расщепление веществ с помощью ферментов.

Автолиз – саморазрушение клетки.

“Орудие самоубийств”.

2. Двухмембранные
Митохондрии Наружная мембрана – гладкая, внутренняя – складчатая. Складки – кристы, внутри – матрикс, в нем кольцевая ДНК и рибосомы.

Полуавтономные структуры.

Кислородное расщепление органических веществ с образованием АТФ.

Синтез митохондриальных белков.

Пластиды Хлоропласты.

Продолговатой формы, внутри – строма с гранами, образованными мембранными структурами тилакоидами. Имеются ДНК, РНК, рибосомы.

Полуавтономные структуры.

Фотосинтез.

На мембранах – световая фаза.

В строме – реакции темповой фазы.

3. Немембранные
Рибосомы Самые мелкие структуры грибовидной формы. Состоят из двух субъединиц (большой, малой). Образуются в ядрышке. Обеспечивают синтез белка.
Клеточный центр Состоит из двух центриолей и центросферы. Образует веретено деления в клетке. После деления удваивается.

4. Заключение. (Заполняем таблицу «Взаимосвязь органоидов клетки.»)

ЛИТЕРАТУРА

  1. Биология. Грин Н, Стаут У, Тейлор Д.
  2. Общая биология. А.О. Рувинский. 10,11 кл.
  3. Уроки биологии. Пименов А. В. 10, 11 кл.

ИНФОРМАЦИОННАЯ БАЗА

  1. Биология. Весь школьный курс. 1С:Репетитор.
  2. Уроки биологии. Общая биология. Кирилл и Мефодий. 10, 11 кл.

Мультимедийный урок «Органоиды клетки»

ПЛАН УРОКА

ТЕМА

  • Органоиды клетки. (Обучающий урок)

ЦЕЛИ

  • Повторение материала и оценка знаний учащихся по теме “Цитоплазма. Клеточная оболочка”.
  • Продолжение изучения клеточного уровня жизни и формирование знаний о строении и выполняемых функций одномембранных, двухмембранных и немембранных органоидов клетки.

ОБОРУДОВАНИЕ

ЭТАПЫ ЦЕЛЬ ЭТАПА ЗАДАНИЕ ВИД ДЕЯТЕЛЬНОСТИ
Клеточная оболочка Организация урока   Подготовка кабинета к работе.
Проверка и оценка знаний. 1 Компьютерное тестирование и работа с карточками.
Органоиды клетки Актуализация   Опрос с демонстрацией слайдов.
Изучение и закрепление нового материала

Одномембранные

Органоиды

2 Рассказы учеников с демонстрацией слайдов.

Заполнение таблицы.

Двухмембранные органоиды 3 Рассказы учеников с демонстрацией слайдов.

Заполнение таблицы.

Немембранные органоиды 4 Рассказы учеников с демонстрацией слайдов.

Заполнение таблицы.

Взаимосвязь органоидов в клетке Заключение
1. Подведение итогов.
2. Выставление оценок.
3. Домашнее задание.
5 Устная работа со слайдом.

 ХОД УРОКА

1. Повторение. Компьютерное тестирование.

2. Актуализация знаний.

  • Каково строение клеточной оболочки?
  • Чем отличается клеточная оболочка растительной клетки от оболочки животной клетки?
  • Каким образом различные вещества попадают в клетку?

3. Изучение нового материала.

Органоиды (органеллы) — постоянные клеточные структуры, обеспечивающие выполнение клеткой специфических функций. Каждый органоид имеет определенное строение и выполняет определенные функции.

Различают:

1. Мембранные органоиды:

А) Одномембранные.

Б) Двухмембранные.

2. Немембранные органоиды.

На этом уроке мы должны не только систематизировать уже имеющиеся у нас знания об органоидах клетки, но установить взаимосвязь между ними.

 На этом этапе урока ребята представляют свои работы об органоидах клетки, подготовленные в виде презентаций.

ОДНОМЕМБРАННЫЕ ОРГАНОИДЫ

1. Э.П.Р.

Система мембранных цистерн и каналы, организующие пространство.

А). Шероховатый.

Б). Гладкий.

Обеспечивает связь с наружной цитоплазматической мембраной и оболочкой ядерной мембраны.

Синтез белка. Синтез и расщепление углеводов и липидов.

2. Аппарат Гольджи.

Стопка уплощенных цистерн с пузырьками.

Выведение из клеток секретов ( ферментов, гормонов).

Синтез сложных углеводов. Созревание белков.

Образование лизосом.

3. Лизосомы.

Мелкие пузырьки, содержащие ферменты, активные в слабощелочной среде.

Расщепление веществ с помощью ферментов.

ДВУХМЕМБРАННЫЕ ОРГАНОИДЫ

1. Митохондрии.

Наружная мембрана-гладкая Внутренняя мембрана-складчатая Выросты-кристы, внутри-матрикс, в нем.

Кольцевая ДНК и рибосомы.

Кислородное расщепление органических веществ.

С образованием АТФ.

Синтез митохондриальных белков.

Полуавтономная структура.

2. Пластиды. (Характерны для растительных клеток)

Хлоропласты.

Двояковыпуклая линза.

Наружная мембрана-гладкая,

Внутренняя-складчатая, в ней система ламелл и тилакоидов. Внутренняя среда-строма, содржит ДНК и рибосомы.

Фотосинтез. На матриксе-реакции световой фазы, в строме-реакции темновой фазы.

 НЕМЕМБРАННЫЕ ОРГАНОИДЫ

1. Рибосомы.

Структуры грибовидной формы. Очень мелкие.

Состоят из малой и большой субъединиц.

Субъединицы рибосом образуются в ядрышках.

Синтез белка.

2. Клеточный центр.

Образован центриолями и уплотненной цитоплазмой-центросферой.

Образует веретено деления в клетке.

 После выступлений учащихся ребята в три этапа заполняют таблицу самостоятельно.

Название таблицы Структура Функции
1. Одномембранные
Эндоплазматический ретикулум Э.Р. Система мембран формирующих цистерны и канальца.

А) Шероховатый

Б) Гладкий

Организует пространство, осуществляет связь с наружной и ядерной мембранами.

Синтез и транспорт белка.

Синтез и расщепление углеводов и липидов.

Аппарат Гольджи Стопка уплощенных цистерн с пузырьками. Выведение из клеток секретов (ферментов, гормонов), синтез сложных углеводов, созревание белков.

Образование лизосом.

Лизосомы Сферические мембранные мешочки, заполненные ферментами.

Активны в слабощелочной среде.

Расщепление веществ с помощью ферментов.

Автолиз – саморазрушение клетки.

“Орудие самоубийств”.

2. Двухмембранные
Митохондрии Наружная мембрана – гладкая, внутренняя – складчатая. Складки – кристы, внутри – матрикс, в нем кольцевая ДНК и рибосомы.

Полуавтономные структуры.

Кислородное расщепление органических веществ с образованием АТФ.

Синтез митохондриальных белков.

Пластиды Хлоропласты.

Продолговатой формы, внутри – строма с гранами, образованными мембранными структурами тилакоидами. Имеются ДНК, РНК, рибосомы.

Полуавтономные структуры.

Фотосинтез.

На мембранах – световая фаза.

В строме – реакции темповой фазы.

3. Немембранные
Рибосомы Самые мелкие структуры грибовидной формы. Состоят из двух субъединиц (большой, малой). Образуются в ядрышке. Обеспечивают синтез белка.
Клеточный центр Состоит из двух центриолей и центросферы. Образует веретено деления в клетке. После деления удваивается.

4. Заключение. (Заполняем таблицу «Взаимосвязь органоидов клетки.»)

ЛИТЕРАТУРА

  1. Биология. Грин Н, Стаут У, Тейлор Д.
  2. Общая биология. А.О. Рувинский. 10,11 кл.
  3. Уроки биологии. Пименов А. В. 10, 11 кл.

ИНФОРМАЦИОННАЯ БАЗА

  1. Биология. Весь школьный курс. 1С:Репетитор.
  2. Уроки биологии. Общая биология. Кирилл и Мефодий. 10, 11 кл.

Органеллы клетки и их функции

Основные группы органелл. Органеллы — постоянные внутриклеточные структуры, имеющие определенное строение и выполняющие соответствующие функции. Органеллы делятся на две группы: мембранные и немембранные. Мембранные органеллы представлены двумя вариантами: двумембранным и одномем-бранным. Двумембранными компонентами являются пластиды, митохондрии и клеточное ядро. К одномембранным относятся органеллы вакуолярной системы — эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, лизосомы, вакуоли растительных и грибных клеток, пульсирующие вакуоли и др. К немембранным органеллам принадлежат рибосомы и клеточный центр, постоянно присутствующие в клетке. Выраженность элементов цитоскелета (постоянного компонента клетки) может значительно меняться в течение клеточного цикла — от полного исчезновения одного компонента (например, цитоплазматических трубочек во время деления клетки) до появления новых структур (веретена деления).

Общим свойством мембранных органелл является то, что все они построены из липопротеидных пленок (биологических мембран), замыкающихся сами на себя так, что образуются замкнутые полости, или отсеки. Внутреннее содержимое этих отсеков всегда отличается от гиалоплазмы.

Двумембранные органеллы. К двумебранным органеллам относятся пластиды и митохондрии. Пластиды —характерные органеллы клеток автотрофных эукариотических организмов. Их окраска, форма и размеры весьма разнообразны. Различают хло-ропласты, хромопласты и лейкопласты.

Хлоропласты имеют зеленый цвет, обусловленный присутствием основного пигмента — хлорофилла. Хлоропласты содержат также вспомогательные пигменты — каротиноиды (оранжевого цвета). По форме хлоропласты — это овальные линзовидные тельца размером (5—10) х (2—4) мкм. В одной клетке листа может находиться 15—20 и более хлоропластов, а у некоторых водорослей — лишь 1 -2 гигантских хлоропласта (хроматофора) различной формы.

Хлоропласты ограничены двумя мембранами — наружной и внутренней (рис. 1.8).

Рис. 1.8. Схема строения хлоропласта: Iнаружная мембрана; 2рибосомы; 3пластоглобулы; 4 — граны; 5 — тилакоиды; 6матрице; 7ДНК; 8 — внутренняя мембрана; 9межмембранное пространство.

Наружная мембрана отграничивает жидкую внутреннюю гомогенную среду хлоропласта — строму (матрикс). В строме содержатся белки, липиды, ДНК (кольцевая молекула), РНК, рибосомы и запасные вещества (липиды, крахмальные и белковые зерна) а также ферменты, участвующие в фиксации углекислого газа.

Внутренняя мембрана хлоропласта образует впячивания внутрь стромы —тилакоиды, или ламеллы, которые имеют форму уплощенных мешочков (цистерн). Несколько таких тилакои-дов, лежащих друг над другом, образуют грану, и в этом случае они называются тилакоидами граны. Именно в мембранах тила-коидов локализованы светочувствительные пигменты, а также переносчики электронов и протонов, которые участвуют в поглощении и преобразовании энергии света.

Хлоропласты в клетке осуществляют процесс фотосинтеза.

Лейкопласты — мелкие бесцветные пластиды различной формы. Они бывают шаровидными, эллипсоидными, гантелевид-ными, чашевидными и т. д. По сравнению с хлоропластами у них слабо развита внутренняя мембранная система.

Лейкопласты в основном встречаются в клетках органов, скрытых от солнечного света (корней, корневищ, клубней, семян). Они осуществляют вторичный синтез и накопление запасных питательных веществ — крахмала, реже жиров и белков.

Хромопласты отличаются от других пластид своеобразной формой (дисковидной, зубчатой, серповидной, треугольной, ром-

бической и др.) и окраской (оранжевые, желтые, красные). Хромопласты лишены хлорофилла и поэтому не способны к фотосинтезу. Внутренняя мембранная структура их слабо выражена.

Хромопласты присутствуют в клетках лепестков многих растений (лютиков, калужниц, нарциссов, одуванчиков и др.), зрелых плодов (томаты, рябина, ландыш, шиповник) и корнеплодов (морковь, свекла), а также листьев в осеннюю пору. Яркий цвет этих органов обусловлен различными пигментами, относящимися к группе каргиноидов, которые сосредоточены в хромопластах.

Все типы пластид генетически родственны друг другу, и одни их виды могут превращаться в другие:

Таким образом, весь процесс взаимопревращений пластид можно представить в виде ряда изменений, идущих в одном направлении — от пропластид до хромопластов.

Митохондрии—неотъемлемые компоненты всех эукариоти-ческих клеток. Они представляют собой гранулярные или нитепо-добные структуры толщиной 0,5 мкм и длиной до 7—10 мкм.

Митохондрии ограничены двумя мембранами — наружной и внутренней (рис. 1.9). Между внешней и внутренней мембранами имеется так называемое перимитохондриалъное пространство, которое является местом скопления ионов водорода Н+Наружная митохондриальная мембрана отделяет ее от гиало-плазмы. Внутренняя мембрана образует множество впячиваний внутрь митохондрий — так называемых крист. На мембране крист или внутри нее располагаются ферменты, в том числе переносчики электронов и ионов водорода Н+, которые участвуют в кислородном дыхании. Наружная мембрана отличается высокой проницаемостью, и многие соединения легко проходят через нее. Внутренняя мембрана менее проницаема. Ограниченное ею внутреннее содержимое митохондрии {матрикс) по составу близко к цитоплазме. Матрикс содержит различные белки, в том числе ферменты, ДНК (кольцевая молекула), все типы РНК, аминокислоты, рибосомы, ряд витаминов. ДНК обеспечивает некоторую генетическую автономность митохондрий, хотя в целом их работа координируется ДНК ядра.

Рис. 1.9. Схема строения митохондрии: а — продольный разрез; 6схема трехмерного строения; 1внешняя мембрана; 2матрикс; 3межмембранное пространство; 4гранула; 5ДНК; 6внутренняя мембрана; 7рибосомы.

В митохондриях осуществляется кислородный этап клеточного дыхания.

Одномембранные органеллы. В клетке синтезируется огромное количество различных веществ. Часть из них потребляется на собственные нужды (синтез АТФ, построение органелл, накопление питательных веществ), часть выводится из клетки и используется на построение оболочки (клетки растений и грибов), глико-каликса (животные клетки). Клеточными секретами являются также ферменты, гормоны, коллаген, кератин и т. д. Накопление этих веществ и перемещение их из одной части клетки в другую либо выведение за ее пределы происходит в системе замкнутых цитоплазматических мембран — эндоплазматической сети, или эндоплазматическом ретикулуме, и комплексе Гольджи, составляющих транспортную систему клеток.

Эндоплазматический ретикулум был открыт с помощью электронного микроскопа в 1945 г. Он представляет собой систему разветвленных каналов, цистерн (вакуолей), пузырьков, создающих подобие рыхлой сети в цитоплазме (рис. 1.10). Стенки каналов и полостей образованы элементарными мембранами.

В клетке существует два типа эндоплазматического ретикулу-ма: гранулярный (шероховатый) и агранулярный (гладкий). Гранулярный эндоплазматический ретикулум густо усеян рибосомами, на которых осуществляется биосинтез белка. Синтезируемые белки проходят через мембрану в каналы и полости эндоплазматического ретикулума, изолируются от цитоплазмы, накапливаются там, дозревают и перемещаются в другие части клетки либо в комплекс Гольджи в специальных мембранных пузырьках, которые отшнуровываются от цистерн эндоплазмати-ческого ретикулума.

Рис. 1.10. Схема строения шероховатого (1) и гладкого (2) эндоплазматического ретикулума.

Функции эндоплазматического ретикулума следующие:

  1. В мембранах гранулярного эндоплазматического ретикулума накапливаются и изолируются белки, которые после их синтеза могли оказаться вредными для клетки. Например, синтез гидролитических ферментов и их свободный выход в цитоплазму привел бы к самоперевариванию клетки и ее гибели. Однако этого не происходит, потому что подобные белки надежно изолированы в полостях эндоплазматического ретикулума.
  2. На рибосомах гранулярного эндоплазматического ретикулума синтезируются также интегральные и периферические белки мембран клетки и некоторая часть белков цитоплазмы.
  3. Цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума связаны с ядерной оболочкой, причем некоторые из них являются прямым продолжением последней. Считается, что после деления клетки оболочки новых ядер образуются из цистерн эндоплазматического ретикулума.
  4. На мембранах гладкого эндоплазматического ретикулума протекают процессы синтеза липидов и некоторых углеводов (например, гликогена).

Комплекс (аппарат) Голъджи открыт в 1898 г. итальянским ученым К. Гольджи. Он представляет собой систему плоских дисковидных замкнутых цистерн, которые располагаются одна над другой в виде стопки и образуют диктиосому. От цистерн отходят во все стороны мембранные трубочки и пузырьки (рис. 1.11). Число диктиосом в клетках варьирует от одной до нескольких десятков в зависимости от типа клеток и фазы их развития.

Рис 1.11. Схема строения аппарата Голъджи: 1пузырьки; 2цистерны.

К комплексу Гольджи доставляются вещества, синтезируемые в эндоплазматическом ретикулуме. От цистерн эндоплазматического ретикулума отшнуровываются пузырьки, которые соединяются с цистернами комплекса Гольджи, где эти вещества модифицируются и дозревают.

Пузырьки комплекса Гольджи участвуют в формировании цитоплазматической мембраны и стенок клеток растений после деления, а также в образовании вакуолей и первичных лизосом.

Зрелые цистерны диктиосомы отшнуровывают пузырьки или вакуоли Гольджи, заполненные секретом. Содержимое таких пузырьков либо используется самой клеткой, либо выводится за ее пределы. В последнем случае пузырьки Гольджи подходят к плазматической мембране, соединяются с ней и изливают свое содержимое наружу, а их мембрана включается в плазматическую мембрану и таким образом происходит ее обновление.

Цистерны комплекса Гольджи активно извлекают моносахариды из цитоплазмы и синтезируют из них более сложные олиго- и полисахариды. У растений в результате этого образуются пектиновые вещества, гемицеллюлоза и целлюлоза, используемые для построения клеточной стенки, слизь корневого чехлика. У животных подобным образом синтезируются гликопротеины и гликолипиды гликокаликса, вырабатываются секрет поджелудочной железы, амилаза слюны, пептидные гормоны гипофиза, коллаген.

Комплекс Гольджи участвует в образовании лизосом, белков молока в молочных железах, желчи в печени, веществ хрусталика, зубной эмали и г. п.

Комплекс Гольджи и эндоплазматический ретикулум тесно связаны между собой; их совместная деятельность обеспечивает синтез и преобразование веществ в клетке, их изоляцию, накопление и транспорт.

Лизосомы — это мембранные пузырьки величиной до 2 мкм. Внутри лизосом содержатся гидролитические ферменты, способные переваривать белки, липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты. Лизосомы образуются из пузырьков, отделяющихся от комплекса Гольджи, причем предварительно на шероховатом эн до плазматическом ретикулуме синтезируются гидролитические ферменты.

Сливаясь с эндоцитозными пузырьками, лизосомы образуют пищеварительную вакуоль (вторичная лизосома), где происходит расщепление органических веществ до составляющих их мономеров. Последние через мембрану пищеварительной вакуоли поступают в цитоплазму клетки. Именно так происходит, например, обезвреживание бактерий в клетках крови — нейтрофилах.

Вторичные лизосомы, в которых закончился процесс переваривания, практически не содержат ферментов. В них находятся лишь непереваренные остатки, т. е. негидролизуемый материал, который либо выводится за пределы клетки, либо накапливается в цитоплазме.

Расщепление лизосомами чужеродного, поступившего путем эндоцитоза материала называетсягетерофагией. Лизосомы участвуют также в разрушении материалов клетки, например запасных питательных веществ, а также макромолекул и целых орга-нелл, утративших функциональную активность (аутофагия). При патологических изменениях в клетке или ее старении мембраны лизосом могут разрушаться: ферменты выходят в цитоплазму, и осуществляется самопереваривание клетки —автолиз. Иногда с помощью лизосом уничтожаются целые комплексы клеток и органы. Например, когда головастик превращается в лягушку, лизосомы, находящиеся в клетках хвоста, переваривают его: хвост исчезает, а образовавшиеся во время этого процесса вещества всасываются и используются другими клетками тела.

Вакуоли — крупные мембранные пузырьки или полости в цитоплазме, заполненные клеточным соком. Вакуоли образуются в клетках растений и грибов из пузыревидных расширений эндоплазматического ретикулума или из пузырьков комплекса Гольджи. В меристематических клетках растений вначале возникает много мелких вакуолей. Увеличиваясь, они сливаются в центральную вакуоль, которая занимает до 70—90% объема клетки и может быть пронизана тяжами цитоплазмы (рис. 1.12).

Рис. 1.12. Вакуоль в растительной клетке: 1вакуоль; 2цитопяаз-матические тяжи; 3ядро; 4хлоропласты.

Содержимое вакуолей —клеточный сок. Он представляет собой водный раствор различных неорганических и органических веществ. Большинство из них являются продуктами метаболизма протопласта, которые могут появляться и исчезать в различные периоды жизни клетки. Химический состав и концентрация клеточного сока очень изменчивы и зависят от вида растений, органа, ткани и состояния клетки. В клеточном соке содержатся соли, сахара (прежде всего сахароза, глюкоза, фруктоза), органические кислоты (яблочная, лимонная, щавелевая, уксусная и др.), аминокислоты, белки. Эти вещества являются промежуточными продуктами метаболизма, временно выведенными из обмена веществ клетки в вакуоль. Они являются запасными веществами клетки.

Помимо запасных веществ, которые могут вторично использоваться в метаболизме, клеточный сок содержит фенолы, танины (дубильные вещества), алкалоиды, антоцианы, которые выводятся из обмена в вакуоль и таким путем изолируются от цитоплазмы.

Танины особенно часто встречаются в клеточном соке (а также в цитоплазме и оболочках) клеток листьев, коры, древесины, незрелых плодов и семенных оболочек. Алкалоиды присутствуют, например, в семенах кофе (кофеин), плодах мака (морфин) и белены (атропин), стеблях и листьях люпина (люпинин) и др. Считается, что танины с их вяжущим вкусом, алкалоиды и токсичные полифенолы выполняют защитную функцию: их ядовитый (чаще горький) вкус и неприятный запах отталкивают растительноядных животных, что предотвращает поедание этих растений.

В вакуолях также часто накапливаются конечные продукты жизнедеятельности клеток (отходы). Таким веществом для клеток растений является щавелевокислый кальций, который откладывается в вакуолях в виде кристаллов различной формы.

В клеточном соке многих растений содержатся пигменты, придающие клеточному соку разнообразную окраску. Пигменты и определяют окраску венчиков цветков, плодов, почек и листьев, а также корнеплодов некоторых растений (например, свеклы).

Клеточный сок некоторых растений содержит физиологически активные вещества — фитогормоны (регуляторы роста), фитонциды, ферменты. В последнем случае вакуоли действуют как лизосомы. После гибели клетки мембрана вакуоли теряет избирательную проницаемость, и ферменты, высвобождаясь из нее, вызывают автолиз клетки.

Функции вакуолей следующие:

  1. Вакуоли играют главную роль в поглощении воды растительными клетками. Вода путем осмоса через ее мембрану поступает в вакуоль, клеточный сок которой является более концентрированным, чем цитоплазма, и оказывает давление на цитоплазму, а следовательно, и на оболочку клетки. В результате в клетке развивается тургорное давление, определяющее относительную жесткость растительных клеток и обусловливающее растяжение клеток во время их роста.
  2. В запасающих тканях растений вместо одной центральной часто бывает несколько вакуолей, в которых скапливаются запасные питательные вещества (жиры, белки). Сократительные (пульсирующие) вакуоли служат для осмотической регуляции, прежде всего, у пресноводных простейших, так как в их клетки путем осмоса непрерывно поступает вода из окружающего гипотонического раствора (концентрация веществ в речной или озерной воде значительно ниже, чем концентрация веществ в клетках простейших). Сократительные вакуоли поглощают избыток воды и затем выводят ее наружу путем сокращений.

Немембранные органеллы. Клеточный центр. В клетках большинства животных, а также некоторых грибов, водорослей, мхов и папоротников имеются центриоли. Расположены они обычно в центре клетки, что и определило их название (рис .1.13).

Центриоли представляют собой полые цилиндры длиной не более 0,5 мкм. Они располагаются парами перпендикулярно одна к другой (рис. 1.14). Каждая центриоль построена из девяти триплетов микротрубочек.

Основная функция центриолей — организация микротрубочек веретена деления клетки.

Центриолям по структуре идентичны базальные тельца, которые всегда обнаруживаются в основании жгутиков и ресничек. По всей вероятности, базальные тельца образуются путем удвоения цен-триолей. Базальные тельца, как и центриоли, являются центрами организации микротрубочек, входящих в состав жгутиков и ресничек.

Жгутики и реснички — органеллы движения у клеток многих видов живых существ. Они представляют собой подвижные цитоплазм этические отростки, служащие либо для передвижения всего организма (многие бактерии, простейшие, ресничные черви) или репродуктивных клеток (сперматозоидов, зооспор), либо для транспорта частиц и жидкостей (например, реснички мерцательных клеток слизистой оболочки носовых полостей и трахеи, яйцеводов и т. д.).

Жгутики эукариотических клеток по всей длине содержат 20 микротрубочек: 9 периферических дуплетов и 2 центральные одиночные. У основания жгутика в цитоплазме располагается ба-зальное тельце.

Жгутики имеют длину около 100 мкм и более. Короткие жгутики (10—20 мкм), которых бывает много на одной клетке, называются ресничками.

Скольжение микротрубочек, входящих в состав жгутиков или ресничек, вызывает их биение, что обеспечивает перемещение клетки либо продвижение частиц.

Рибосомы — это мельчайшие сферические гранулы диаметром 15—35 нм, являющиеся местом синтеза белка из аминокислот. Они обнаружены в клетках всех организмов, в том числе про-кариотических. В отличие от других органелл цитоплазмы (пластид, митохондрий, клеточного центра и др.) рибосомы представлены в клетке огромным числом: за клеточный цикл их образуется около 10 млн. штук.

В состав рибосом входит множество молекул различных белков и несколько молекул рРНК. Полная работающая рибосома состоит из двух неравных субъединиц (рис. 1.15). Малая субъедин ица имеет палочковидную форму с несколькими выступами. Большая субь-единица похожа на полусферу с тремя торчащими выступами. При объединении в рибосому малая субъединица ложится одним концом на один из выступов большой субъединицы. В состав малой субъединицы входит одна молекула РНК, в состав большой — три.

Рис. 1.15, Схема строения рибосомы: 1малая субъединица; 2иРНК; 3тРИК; 4аминокислота; 5большая субьединица; бмембрана эндоплазматической сети; 7синтезируемая полипептид-ная цепь.

В цитоплазме десятки тысяч рибосом расположены свободно (поодиночке или группами) или прикреплены к нитям микротрабекуляр-ной системы, наружной поверхности мембраны ядра и эндоплазматической сети. Они имеются также в митохондриях и хлоропластах.

В процессе синтеза белка рибосома защищает синтезируемый белок от разрушающего действия клеточных ферментов. Механизм защитного действия заключается в том, что часть вновь синтезируемого белка находится в каналоподобной структуре большой субъединицы.

Источник : Н.А. Лемеза Л.В.Камлюк Н.Д. Лисов «Пособие по биологии для поступающих в ВУЗы»

Органоиды человека: модельные системы для биологии и медицины человека

  • 1.

    Росси Г., Манфрин А. и Лутольф М. П. Прогресс и потенциал исследований органоидов. Nat. Преподобный Жене. 19 , 671–687 (2018).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 2.

    Sato, T. et al. Единичные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинки in vitro без мезенхимальной ниши. Природа 459 , 262–265 (2009). Sato et al. представляют первый пример органоидов, полученных из AdSC, выделенных из кишечника мыши .

    CAS Статья Google ученый

  • 3.

    Sato, T. et al. Длительное распространение эпителиальных органоидов из толстой кишки, аденомы, аденокарциномы и эпителия Барретта человека. Гастроэнтерология 141 , 1762–1772 (2011).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 4.

    Fujii, M. et al. Органоиды кишечника человека поддерживают способность к самообновлению и клеточное разнообразие в условиях культуры, основанной на нишах. Cell Stem Cell 23 , 787–793 (2018).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 5.

    Lancaster, M.A. et al. Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Природа 501 , 373–379 (2013). Lancaster et al.сообщают, что сложность развития человеческого мозга может быть смоделирована с помощью органоидов , полученных из PSC человека.

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 6.

    Takasato, M. et al. Органоиды почек из iPS-клеток человека содержат множество клонов и моделируют нефрогенез человека. Природа 526 , 564–568 (2015).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 7.

    Hu, H. et al. Долгосрочное расширение функциональных гепатоцитов мыши и человека в виде трехмерных органоидов. Cell 175 , 1591–1606 (2018).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 8.

    Turco, M. Y. et al. Долгосрочные гормонально-чувствительные органоидные культуры эндометрия человека в среде с определенным химическим составом. Nat. Cell Biol. 19 , 568–577 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 9.

    Хуч, М. и Ку, Б. К. Моделирование развития мыши и человека с использованием органоидных культур. Девелопмент 142 , 3113–3125 (2015). В этом обзоре Хуч и Ку обобщают развитие различных систем культивирования органоидов и сравнивают системы мыши и человека .

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 10.

    Симиан, М. и Бисселл, М. Дж. Органоиды: историческая перспектива мышления в трех измерениях. J. Cell Biol. 216 , 31–40 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 11.

    Ланкастер, М. А. и Кноблич, Дж. А. Органогенез в чашке: моделирование развития и болезни с использованием органоидных технологий. Наука 345 , 1247125 (2014).

    PubMed Статья CAS PubMed Central Google ученый

  • 12.

    Келава, И. и Ланкастер, М. А. Выделение мини-мозга: текущий прогресс и будущие перспективы в исследованиях органоидов мозга. Dev. Биол. 420 , 199–209 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 13.

    Kretzschmar, K. & Clevers, H. Органоиды: моделирование развития и ниши стволовых клеток в чашке. Dev. Ячейка 38 , 590–600 (2016).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 14.

    Клеверс, Х. Моделирование развития и заболеваний с помощью органоидов. Cell 165 , 1586–1597 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 15.

    Тириак, Х., Пленкер, Д., Бейкер, Л. А. и Тувесон, Д. А. Модели органоидов для трансляционных исследований рака поджелудочной железы. Curr. Opin. Genet. Dev. 54 , 7–11 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 16.

    Фатехулла А., Тан С. Х. и Баркер Н. Органоиды как модель развития человека и болезней in vitro. Nat. Cell Biol. 18 , 246–254 (2016).

    PubMed Статья CAS PubMed Central Google ученый

  • 17.

    Келава И. и Ланкастер М. А. Модели стволовых клеток в развитии человеческого мозга. Cell Stem Cell 18 , 736–748 (2016).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 18.

    Салстон, Дж. Э., Ширенберг, Э., Уайт, Дж. Г. и Томсон, Дж. Н. Линия эмбриональных клеток нематоды Caenorhabditis elegans . Dev. Биол. 100 , 64–119 (1983).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 19.

    Маллинз М.С., Хаммершмидт М., Хаффтер П. и Нусслейн-Волхард К. Крупномасштабный мутагенез у рыбок данио: в поисках генов, контролирующих развитие позвоночных. Curr. Биол. 4 , 189–202 (1994).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 20.

    Хаффтер П. и Нусслейн-Фольхард К. Крупномасштабная генетика мелких позвоночных рыбок данио. Внутр. J. Dev. Биол. 40 , 221–227 (1996).

    CAS PubMed Google ученый

  • 21.

    Нусслейн-Фольхард, К. Проблема развития рыбок данио. Развитие 139 , 4099–4103 (2012).

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 22.

    Бреннер С. Генетика Caenorhabditis elegans . Генетика 77 , 71–94 (1974).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 23.

    Takebe, T. et al. Васкуляризация и функциональная печень человека после трансплантации зачатка органа, полученного из ИПСК. Природа 499 , 481–484 (2013). Это первое сообщение о формировании зачатка органа путем самоконденсации клеток из разных линий .

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 24.

    Spence, J. R. et al. Направленная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в ткань кишечника in vitro. Природа 470 , 105–109 (2011). Spence et al. идентифицировать пошаговую процедуру для создания органоидов кишечника человека, полученных из PSCs .

    PubMed Статья CAS Google ученый

  • 25.

    Harris, T. W. et al. WormBase: многовидовой ресурс по биологии и геномике нематод. Nucleic Acids Res. 32 , D411 – D417 (2004).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 26.

    Baumeister, R. & Ge, L. Червь в нас — Caenorhabditis elegans как модель человеческого заболевания. Trends Biotechnol. 20 , 147–148 (2002).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 27.

    Poulin, G., Nandakumar, R. & Ahringer, J. Скрининг РНКи всего генома в Caenorhabditis elegans : влияние на исследования рака. Онкоген 23 , 8340–8345 (2004).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 28.

    Луи, Дж. Х., Хансен, Д. В. и Кригштейн, А. Р. Развитие и эволюция неокортекса человека. Cell 146 , 18–36 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 29.

    Kuzawa, C. W. et al. Метаболические затраты и эволюционные последствия развития человеческого мозга. Proc. Natl Acad. Sci. США 111 , 13010–13015 (2014).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 30.

    Sanoh, S. et al. Прогнозируемость метаболизма ибупрофена и напроксена с использованием химерных мышей с гепатоцитами человека. Препарат. Метаб. Dispos. 40 , 2267–2272 (2012).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 31.

    Inoue, T. et al. Катализируемый CYP2C9 метаболизм S-варфарина в 7-гидроксиварфарин in vivo и in vitro у химерных мышей с гуманизированной печенью. Препарат. Метаб. Dispos. 36 , 2429–2433 (2008).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 32.

    McCauley, H. A. & Wells, J.М. Органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток: использование принципов биологии развития для выращивания тканей человека в чашке. Развитие 144 , 958–962 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 33.

    Takahashi, K. et al. Индукция плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов взрослого человека определенными факторами. Cell 131 , 861–872 (2007).

    CAS Статья Google ученый

  • 34.

    Yu, J. et al. Индуцированные линии плюрипотентных стволовых клеток, полученные из соматических клеток человека. Наука 318 , 1917–1920 (2007).

    CAS Статья Google ученый

  • 35.

    Фаулер, Дж. Л., Энг, Л. Т. и Ло, К. М. Критический обзор: проблемы дифференциации плюрипотентных стволовых клеток человека в желаемые типы клеток и органоиды. Wiley междисциплинарный. Rev. Dev. Биол. 9 , e368 (2019).

    PubMed Google ученый

  • 36.

    Dutta, D., Heo, I. & Clevers, H. Моделирование заболеваний в трехмерных органоидных системах, полученных из стволовых клеток. Trends Mol. Med. 23 , 393–410 (2017).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 37.

    Мартон, Р. М. и Пашка, С. П. Органоидные и ассемблоидные технологии для исследования межклеточных помех в развитии человеческого мозга и заболеваниях. Trends Cell Biol. 15 , 133–143 (2020).

    Артикул CAS Google ученый

  • 38.

    Нишинакамура, Р. Органоиды почек человека: прогресс и нерешенные проблемы. Nat. Преподобный Нефрол. 15 , 613–624 (2019).

    PubMed Статья Google ученый

  • 39.

    Прайор, Н., Инасио, П. и Хуч, М. Органоиды печени: от фундаментальных исследований до терапевтического применения. Кишечник 68 , 2228–2237 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 40.

    Ланкастер, М., Хуч, М. Моделирование заболеваний органоидами человека. Дис. Модель Mech. 12 , dmm039347 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 41.

    Sachs, N.и другие. Органоиды дыхательных путей человека с долгосрочным расширением для моделирования заболеваний. EMBO J. 38 , e100300 (2019).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 42.

    Осакада, Ф., Икеда, Х., Сасай, Ю. и Такахаши, М. Пошаговая дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки сетчатки. Nat. Protoc. 4 , 811–824 (2009).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 43.

    McCracken, K. W. et al. Моделирование человеческого развития и заболеваний в органоидах желудка, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Природа 516 , 400–404 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 44.

    Thomson, J. A. et al. Линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из бластоцист человека. Science 282 , 1145–1147 (1998).

    CAS Статья Google ученый

  • 45.

    Эванс, М. Дж. И Кауфман, М. Х. Создание в культуре плюрипотенциальных клеток из эмбрионов мыши. Nature 292 , 154–156 (1981).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 46.

    Мартин, Г. Р. Выделение линии плюрипотентных клеток из ранних эмбрионов мыши, культивированных в среде, кондиционированной стволовыми клетками тератокарциномы. Proc. Natl Acad. Sci. США 78 , 7634–7638 (1981).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 47.

    Wert, G. & Mummery, C. Человеческие эмбриональные стволовые клетки: исследования, этика и политика. Hum. Репродукция. 18 , 672–682 (2003).

    PubMed Статья Google ученый

  • 48.

    Huang, C. Y. et al. Человеческий iPSC-банкинг: барьеры и возможности. J. Biomed. Sci. 26 , 87 (2019).

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 49.

    Лю Г., Дэвид Б. Т., Травчински М. и Фесслер Р. Г. Достижения плюрипотентных стволовых клеток: история, механизмы, технологии и приложения. Stem Cell Rev. Rep. 16 , 3–32 (2020).

    PubMed Статья Google ученый

  • 50.

    Soldner, F. & Jaenisch, R.Стволовые клетки, редактирование генома и путь к трансляционной медицине. Cell 175 , 615–632 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 51.

    Авиор Ю., Саги И. и Бенвенисти Н. Плюрипотентные стволовые клетки в моделировании болезней и открытии лекарств. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 , 170–182 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 52.

    Lancaster, M.A. et al. Управляемая самоорганизация и формирование корковой пластинки органоидов головного мозга человека. Nat. Biotechnol. 35 , 659–666 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 53.

    Takebe, T. et al. Создание васкуляризованной и функциональной печени человека из трансплантата зачатка органа, полученного из ИПСК. Nat. Protoc. 9 , 396–409 (2014).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 54.

    Zhang, Y. et al. Трехмерное моделирование развития пищевода с использованием базальных предшественников PSC человека показывает критическую роль передачи сигналов notch. Cell Stem Cell 23 , 516–529 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 55.

    Trisno, S. L. et al. Органоиды пищевода из плюрипотентных стволовых клеток человека определяют функции Sox2 во время спецификации пищевода. Cell Stem Cell 23 , 501–515 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 56.

    McCracken, K. W. et al. Wnt / бета-катенин способствует спецификации дна желудка у мышей и людей. Природа 541 , 182–187 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 57.

    Краситель, Б. Р. и др. Получение in vitro органоидов легких, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека. eLife 4 , e05098 (2015).

    PubMed Central Статья Google ученый

  • 58.

    Баркер, Н., ван де Ветеринг, М. и Клеверс, Х. Кишечные стволовые клетки. Genes Dev. 22 , 1856–1864 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 59.

    Barker, N. et al. Идентификация стволовых клеток тонкой и толстой кишки по маркерному гену Lgr5. Природа 449 , 1003–1007 (2007).

    CAS Статья Google ученый

  • 60.

    Stange, D. E. et al.Дифференцированные главные клетки Troy + действуют как резервные стволовые клетки, генерируя все клоны эпителия желудка. Cell 155 , 357–368 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 61.

    Barker, N. et al. Lgr5 + ve стволовые клетки стимулируют самообновление в желудке и создают долгоживущие желудочные единицы in vitro. Cell Stem Cell 6 , 25–36 (2010).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 62.

    Huch, M. et al. Экспансия in vitro единичных стволовых клеток печени Lgr5 + , индуцированная регенерацией, управляемой Wnt. Природа 494 , 247–250 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 63.

    Huch, M. et al. Неограниченное распространение in vitro биопотентных предшественников поджелудочной железы у взрослых через ось Lgr5 / R-спондина. EMBO J. 32 , 2708–2721 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 64.

    Bartfeld, S. et al. Экспансия in vitro эпителиальных стволовых клеток желудка человека и их ответы на бактериальную инфекцию. Гастроэнтерология 148 , 126–136 (2015).

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 65.

    Schlaermann, P. et al. Новая система первичной культуры клеток желудка человека для моделирования инфекции Helicobacter pylori in vitro. Кишечник 65 , 202–213 (2016).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 66.

    Huch, M. et al. Долгосрочная культура геном-стабильных бипотентных стволовых клеток печени взрослого человека. Cell 160 , 299–312 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 67.

    Loomans, C.J. M. et al. Расширение ткани поджелудочной железы взрослого человека дает органоиды, содержащие клетки-предшественники с потенциалом эндокринной дифференцировки. Stem Cell Rep. 10 , 712–724 (2018).

    CAS Статья Google ученый

  • 68.

    Lee, S.H. et al. Эволюция опухоли и лекарственный ответ на органоидных моделях рака мочевого пузыря, полученных от пациентов. Cell 173 , 515–528 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 69.

    Rock, J. R. et al. Базальные клетки как стволовые клетки трахеи мыши и эпителия дыхательных путей человека. Proc. Natl Acad. Sci. США 106 , 12771–12775 (2009).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 70.

    Sampaziotis, F. et al. Реконструкция внепеченочного билиарного дерева мыши с использованием органоидов первичных внепеченочных холангиоцитов человека. Nat. Med. 23 , 954–963 (2017).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 71.

    Boretto, M. et al. Разработка органоидов из эндометрия мышей и человека, демонстрирующая физиологию эпителия эндометрия и возможность долгосрочного расширения. Девелопмент 144 , 1775–1786 (2017).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 72.

    Linnemann, J. R. et al. Количественная оценка регенеративного потенциала первичных эпителиальных клеток молочной железы человека. Разработка 142 , 3239–3251 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 73.

    Karthaus, W. R. et al. Идентификация мультипотентных клеток-предшественников просвета в культурах органоидов предстательной железы человека. Cell 159 , 163–175 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 74.

    Chua, C. W. et al. Единичные просветные эпителиальные предшественники могут генерировать органоиды простаты в культуре. Nat. Cell Biol. 16 , 951–961 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 75.

    Kessler, M. et al. Пути Notch и Wnt регулируют стволовость и дифференциацию органоидов фаллопиевых труб человека. Nat. Commun. 6 , 8989 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 76.

    Баркович, А. Дж., Геррини, Р., Кузнеки, Р. И., Джексон, Г. Д. и Добинс, В. Б. Онтогенетическая и генетическая классификация пороков развития коры головного мозга: обновление 2012 г. Мозг 135 , 1348–1369 (2012).

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 77.

    Heymann, D. L. et al. Вирус Зика и микроцефалия: почему эта ситуация является ЧСЗМЗ? Ланцет 387 , 719–721 (2016).

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 78.

    Calvet, G. et al. Обнаружение и секвенирование вируса Зика из околоплодных вод плодов с микроцефалией в Бразилии: тематическое исследование. Ланцетная инфекция. Дис. 16 , 653–660 (2016).

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 79.

    Mlakar, J. et al.Вирус Зика, связанный с микроцефалией. N. Engl. J. Med. 374 , 951–958 (2016).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 80.

    Dang, J. et al. Вирус Зика истощает нейральные предшественники в органоидах головного мозга человека за счет активации рецептора врожденного иммунитета TLR3. Cell Stem Cell 19 , 258–265 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 81.

    Garcez, P. P. et al. Вирус Зика нарушает рост нейросфер человека и органоидов головного мозга. Наука 352 , 816–818 (2016). Garcez et al. показать полезность сложных органоидов головного мозга для трансляционных исследований вируса Зика .

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 82.

    Cugola, F. R. et al. Бразильский штамм вируса Зика вызывает врожденные дефекты в экспериментальных моделях. Природа 534 , 267–271 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 83.

    Yoon, K. J. et al. NS2A, кодируемый вирусом Зика, нарушает нейрогенез коры головного мозга млекопитающих, разрушая белки слипчивых соединений. Cell Stem Cell 21 , 349–358 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 84.

    Xu, M. et al. Идентификация низкомолекулярных ингибиторов вирусной инфекции Зика и индуцированной гибели нервных клеток посредством скрининга перепрофилирования лекарств. Nat. Med. 22 , 1101–1107 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 85.

    Рамани С., Атмар Р. Л. и Эстес М. К. Эпидемиология норовирусов человека и обновленная информация о разработке вакцин. Curr. Opin. Гастроэнтерол. 30 , 25–33 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 86.

    Ettayebi, K. et al. Репликация норовирусов человека в энтероидах человека, полученных из стволовых клеток. Наука 353 , 1387–1393 (2016). Ettayebi et al. продемонстрировать, что системы культивирования органоидов могут поддерживать исследования сложных патогенов, которые ранее нельзя было культивировать .

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 87.

    Ротавирусные вакцины. Документ с изложением позиции ВОЗ — январь 2013 г. Wkly. Эпидемиол. Рек. 88 , 49–64 (2013).

    Google ученый

  • 88.

    Saxena, K. et al. Кишечные энтероиды человека: новая модель для изучения ротавирусной инфекции человека, ограничения хозяина и патофизиологии. J. Virol. 90 , 43–56 (2016).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 89.

    Yin, Y. et al. Моделирование ротавирусной инфекции и противовирусная терапия с использованием первичных кишечных органоидов. Антивирь. Res. 123 , 120–131 (2015).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 90.

    То, К. К., Чан, Дж. Ф., Чен, Х., Ли, Л. и Юэн, К. Ю. Появление гриппа A H7N9 у людей через 16 лет после гриппа A H5N1: история двух городов. Ланцетная инфекция. Дис. 13 , 809–821 (2013).

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 91.

    Zhou, J. et al. Дифференцированные органоиды дыхательных путей человека для оценки инфекционности появляющегося вируса гриппа. Proc. Natl Acad. Sci. США 115 , 6822–6827 (2018).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 92.

    Кленк, Х. Д. Вирусы гриппа на пути от птиц к человеку. Cell Host Microbe 15 , 653–654 (2014).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 93.

    МакАули, Дж. Л., Гилбертсон, Б. П., Трифкович, С., Браун, Л. Е. и МакКимм-Брешкин, Дж. Л. Структура и функции нейраминидазы вируса гриппа. Фронт. Microbiol. 10 , 39 (2019).

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 94.

    Бартфельд, С. Моделирование инфекционных заболеваний и взаимодействий между хозяином и микробом в органоидах желудочно-кишечного тракта. Dev. Биол. 420 , 262–270 (2016).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 95.

    Leslie, J. L. et al. Стойкость и выработка токсинов Clostridium difficile в органоидах кишечника человека приводит к нарушению параклеточной барьерной функции эпителия. Заражение. Иммун. 83 , 138–145 (2015).

    PubMed Статья CAS PubMed Central Google ученый

  • 96.

    Heo, I. et al. Моделирование инфекции Cryptosporidium в органоидах тонкой кишки и легких человека. Nat. Microbiol. 3 , 814–823 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 97.

    Rusnati, M. et al. Последние стратегические достижения в открытии лекарств CFTR: обзор. Внутр. J. Mol. Sci. 21 , 2407 (2020).

    CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 98.

    Dekkers, J. F. et al. Функциональный анализ CFTR с использованием кишечных органоидов первичного муковисцидоза. Nat. Med. 19 , 939–945 (2013). Dekkers et al. сообщают об использовании органоидов в прецизионной медицине для пациентов с муковисцидозом .

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 99.

    Dekkers, J. F. et al. Характеристика ответов на препараты, модулирующие CFTR, с использованием ректальных органоидов, полученных от субъектов с муковисцидозом. Sci. Пер. Med. 8 , 344ra384 (2016).

    Артикул CAS Google ученый

  • 100.

    Berkers, G. et al. Органоиды прямой кишки позволяют индивидуально лечить муковисцидоз. Cell Rep. 26 , 1701–1708 (2019).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 101.

    van de Wetering, M. et al. Перспективное создание биобанка живых органоидов больных колоректальным раком. Cell 161 , 933–945 (2015). В этом отчете описан первый онкологический биобанк на основе органоидной системы .

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 102.

    Fujii, M. et al. Библиотека органоидов колоректальной опухоли демонстрирует прогрессирующую потерю потребности в нишевом факторе во время туморогенеза. Cell Stem Cell 18 , 827–838 (2016).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 103.

    Weeber, F. et al. Сохранение генетического разнообразия органоидов, культивированных из биоптатов метастазов колоректального рака человека. Proc. Natl Acad. Sci. США 112 , 13308–13311 (2015).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 104.

    Engel, R.M. et al. Органоиды колоректального рака, полученные от пациентов, активируют гены-маркеры возрождающихся стволовых клеток после химиотерапевтического лечения. J. Clin. Med. 9 , 128 (2020).

    CAS PubMed Central Статья PubMed Google ученый

  • 105.

    Ooft, S. N. et al.Органоиды, полученные от пациентов, могут предсказать ответ на химиотерапию у пациентов с метастатическим колоректальным раком. Sci. Пер. Med. 11 , eaay2574 (2019).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 106.

    Jacob, F. et al. Созданная пациентом органоидная модель глиобластомы и биобанк резюмируют меж- и внутриопухолевую гетерогенность. Cell 180 , 188–204 (2020).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 107.

    Fusco, P. et al. Органоиды, полученные от пациентов (PDO), как новая модель опухолей нейробластомы in vitro. BMC Cancer 19 , 970 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 108.

    Gao, D. et al. Культуры органоидов, полученные от пациентов с распространенным раком простаты. Cell 159 , 176–187 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 109.

    Boj, S. F. et al. Органоидные модели протокового рака поджелудочной железы человека и мыши. Cell 160 , 324–338 (2015).

    CAS Статья Google ученый

  • 110.

    Driehuis, E. et al. Органоиды рака поджелудочной железы повторяют болезнь и позволяют проводить индивидуальный скрининг лекарств. Proc. Natl. Акад. Sci. США 116 , 26580–26590 (2019).

    CAS Статья Google ученый

  • 111.

    Seino, T. et al. Органоиды опухоли поджелудочной железы человека обнаруживают потерю зависимости от фактора ниши стволовых клеток во время прогрессирования заболевания. Cell Stem Cell 22 , 454–467 (2018).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 112.

    Broutier, L. et al. Культуры органоидов, полученных из первичного рака печени человека, для моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Nat. Med. 23 , 1424–1435 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 113.

    Sachs, N. et al. Живой биобанк органоидов рака груди фиксирует неоднородность заболевания. Cell 172 , 373–386 (2018).

    CAS Статья Google ученый

  • 114.

    Seidlitz, T. et al. Моделирование рака желудка человека с использованием органоидов. Кишечник 68 , 207–217 (2019).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 115.

    Yan, H.H. N. et al. Комплексный биобанк органоидов рака желудка человека фиксирует неоднородность подтипов опухоли и позволяет проводить терапевтический скрининг. Cell Stem Cell 23 , 882–897 (2018).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 116.

    Nanki, K. et al. Дивергентные пути к независимости ниш Wnt и R-спондина во время желудочного канцерогенеза у человека. Cell 174 , 856–869 (2018).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 117.

    Li, X. et al. Культуры органоидов повторяют гетерогенность аденокарциномы пищевода, обеспечивая модель для исследований клональности и прецизионной терапии. Nat. Commun. 9 , 2983 (2018).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 118.

    Boretto, M. et al. Органоиды, полученные от пациентов при заболевании эндометрия, отражают клиническую неоднородность и поддаются скринингу на лекарства. Nat. Cell Biol. 21 , 1041–1051 (2019).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 119.

    Kim, M. et al. Органоиды рака легких, полученные от пациентов, как модели рака in vitro для терапевтического скрининга. Nat. Commun. 10 , 3991 (2019).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 120.

    Vlachogiannis, G. et al. Органоиды, полученные от пациентов, моделируют терапевтический ответ метастатического рака желудочно-кишечного тракта. Наука 359 , 920–926 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 121.

    Ganesh, K. et al. Платформа органоидов рака прямой кишки для изучения индивидуальных ответов на химиолучевую терапию. Nat. Med. 25 , 1607–1614 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 122.

    Yao, Y. et al. Органоиды, полученные от пациентов, позволяют прогнозировать химиолучевую реакцию при местнораспространенном раке прямой кишки. Cell Stem Cell 26 , 17–26 (2020).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 123.

    Thomas, K. R. & Capecchi, M. R. Сайт-направленный мутагенез путем нацеливания на ген в стволовых клетках, полученных из эмбрионов мыши. Cell 51 , 503–512 (1987).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 124.

    Hockemeyer, D. & Jaenisch, R. Нацеливание на гены в плюрипотентных клетках человека. Колд Спринг Харб. Symp. Quant. Биол. 75 , 201–209 (2010).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 125.

    Porteus, M. H. & Baltimore, D. Химерные нуклеазы стимулируют нацеливание генов в клетках человека. Наука 300 , 763 (2003).

    PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 126.

    Бибикова М., Боймер К., Траутман Дж. К. и Кэрролл Д. Усиление нацеливания на гены с помощью сконструированных нуклеаз цинкового пальца. Наука 300 , 764 (2003).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 127.

    Miller, J.C. et al. Архитектура нуклеазы TALE для эффективного редактирования генома. Nat. Biotechnol. 29 , 143–148 (2011).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 128.

    Виденхефт, Б., Штернберг, С. Х. и Дудна, Дж. А. РНК-управляемые системы генетического сайленсинга у бактерий и архей. Природа 482 , 331–338 (2012).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 129.

    Cong, L. et al. Мультиплексная геномная инженерия с использованием систем CRISPR / Cas. Наука 339 , 819–823 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 130.

    Mali, P. et al. РНК-управляемая инженерия генома человека с помощью Cas9. Наука 339 , 823–826 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 131.

    Чо, С. В., Ким, С., Ким, Дж. М. и Ким, Дж. С. Целенаправленная геномная инженерия в человеческих клетках с помощью РНК-управляемой эндонуклеазы Cas9. Nat. Biotechnol. 31 , 230–232 (2013).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 132.

    Pickar-Oliver, A. & Gersbach, C.A. Новое поколение технологий и приложений CRISPR – Cas. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20 , 490–507 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 133.

    Schwank, G. et al. Функциональная репарация CFTR с помощью CRISPR / Cas9 в органоидах кишечных стволовых клеток пациентов с муковисцидозом. Cell Stem Cell 13 , 653–658 (2013). Schwank et al. сообщают о первом исследовании по применению генной коррекции на основе CRISPR – Cas9 в органоидной системе .

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 134.

    Drost, J. et al. Последовательные мутации рака в культивируемых стволовых клетках кишечника человека. Природа 521 , 43–47 (2015).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 135.

    Matano, M. et al. Моделирование рака прямой кишки с использованием CRISPR – Cas9-опосредованной инженерии органоидов кишечника человека. Nat. Med. 21 , 256–262 (2015).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 136.

    Andersson-Rolf, A. et al. Одношаговая генерация условных и обратимых нокаутов генов. Nat. Методы 14 , 287–289 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 137.

    Merenda, A. et al. Протокол для нокаута нескольких генов органоидов тонкого кишечника мышей с использованием CRISPR-конкатемера. J. Vis. Exp. 125 , e55916 (2017).

    Google ученый

  • 138.

    Andersson-Rolf, A. et al. Одновременный нокаут паралогов с использованием CRISPR-конкатемера в органоидах тонкого кишечника мышей. Dev. Биол. 420 , 271–277 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 139.

    Michels, B.E. et al. Объединенный скрининг CRISPR-Cas9 in vitro и in vivo позволяет идентифицировать опухолевые супрессоры в органоидах толстой кишки человека. Cell Stem Cell 26 , 782–792 (2020).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 140.

    Ringel, T. et al. Скрининг CRISPR на уровне генома в органоидах кишечника человека определяет факторы устойчивости к TGF-бета. Cell Stem Cell 26 , e438 (2020).

    Артикул CAS Google ученый

  • 141.

    Dotti, I. et al. Изменения в компартменте эпителиальных стволовых клеток могут способствовать необратимым изменениям слизистой оболочки пациентов с язвенным колитом. Кишечник 66 , 2069–2079 (2017).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 142.

    Kraiczy, J. et al. Метилирование ДНК определяет региональную идентичность органоидов кишечного эпителия человека и претерпевает динамические изменения в процессе развития. Кишечник 68 , 49–61 (2019).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 143.

    Suzuki, K. et al. Анализ отдельных клеток органоидов тонкой кишки, полученных от пациентов при болезни Крона, выявляет изменение свойств стволовых клеток, зависящее от активности заболевания. J. Gastroenterol. 53 , 1035–1047 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 144.

    Howell, K. J. et al. Паттерны метилирования ДНК и транскрипции в эпителиальных клетках кишечника педиатрических пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника позволяют дифференцировать подтипы заболевания и связаны с исходом. Гастроэнтерология 154 , 585–598 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 145.

    Дрост, Дж. И Клеверс, Х. Органоиды в исследованиях рака. Nat. Rev. Cancer 18 , 407–418 (2018).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 146.

    Нанки, К.и другие. Соматические воспалительные генные мутации в эпителии язвенного колита человека. Природа 577 , 254–259 (2020).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 147.

    Wang, H. et al. Одношаговое создание мышей, несущих мутации в нескольких генах, с помощью CRISPR / Cas-опосредованной геномной инженерии. Cell 153 , 910–918 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 148.

    Yang, H., Wang, H. & Jaenisch, R. Создание генетически модифицированных мышей с использованием CRISPR / Cas-опосредованной геномной инженерии. Nat. Protoc. 9 , 1956–1968 (2014).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 149.

    Yang, H. et al. Одношаговое создание мышей, несущих репортерные и условные аллели, с помощью CRISPR / Cas-опосредованной геномной инженерии. Cell 154 , 1370–1379 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 150.

    Kostic, A. D., Howitt, M. R. & Garrett, W. S. Изучение взаимодействий микробиоты хозяина на животных моделях и на людях. Гены. Дев 27 , 701–718 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 151.

    Takebe, T. et al. Васкуляризованные и сложные зачатки органов из различных тканей посредством конденсации, управляемой мезенхимальными клетками. Cell Stem Cell 16 , 556–565 (2015).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 152.

    Wimmer, R.A. et al. Органоиды кровеносных сосудов человека как модель диабетической васкулопатии. Nature 565 , 505–510 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 153.

    Бар-Эфраим, Ю. Э., Кречмар, К. и Клеверс, Х. Органоиды в иммунологических исследованиях. Nat. Ред. Иммунол . (2019).

  • 154.

    Ким, Дж., Ку, Б. К. и Юн, К. Дж. Моделирование взаимодействий вирус-хозяин при вирусных инфекционных заболеваниях с использованием систем на основе стволовых клеток и технологии CRISPR / Cas9. Вирусов 11 , 124 (2019).

    CAS PubMed Central Статья Google ученый

  • 155.

    Schreurs, R. et al. Плодные TNF-альфа-цитокин человека продуцируют CD4 + эффекторные Т-клетки памяти, способствующие развитию кишечника и опосредуют воспаление в раннем возрасте. Иммунитет 50 , 462–476 (2019).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 156.

    Neal, J. T. et al. Органоидное моделирование иммунного микроокружения опухоли. Cell 175 , 1972–1988 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 157.

    Dijkstra, K. K. et al. Генерация опухолевых Т-клеток путем совместного культивирования лимфоцитов периферической крови и органоидов опухоли. Cell 174 , 1586–1598 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 158.

    Шнальцгер Т.E. et al. 3D-модель CAR-опосредованной цитотоксичности с использованием органоидов колоректального рака, полученных от пациентов. EMBO J. 38 , e100928 (2019).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 159.

    Nozaki, K. et al. Совместное культивирование с органоидами кишечного эпителия позволяет эффективно анализировать рост и подвижность интраэпителиальных лимфоцитов. J. Gastroenterol. 51 , 206–213 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 160.

    Noel, G. et al. Первичная модель совместного культивирования человеческих макрофагов и энтероидов для исследования физиологии слизистой оболочки кишечника и взаимодействий между хозяином и патогеном. Sci. Отчет 7 , 45270 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 161.

    Leeman, K.Т., Пессина, П., Ли, Дж. Х. и Ким, С. Ф. Мезенхимальные стволовые клетки увеличивают альвеолярную дифференцировку в культурах органоидов-предшественников легких. Sci. Отчетность 9 , 6479 (2019).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 162.

    Lee, J.H. et al. Анатомически и функционально различные популяции мезенхимы легких, отмеченные Lgr5 и Lgr6. Cell 170 , 1149–1163 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 163.

    Koike, H. et al. Моделирование органогенеза печени, желчевыводящих путей и поджелудочной железы человека на границе передней и средней кишки. Nature 574 , 112–116 (2019).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 164.

    Бэгли, Дж. А., Рейман, Д., Биан, С., Леви-Стросс, Дж. И Кноблих, Дж. А. Слитые церебральные органоиды моделируют взаимодействия между областями мозга. Nat. Методы 14 , 743–751 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 165.

    Xiang, Y. et al. Слияние органоидов, происходящих из локально определенных hPSC, моделирует развитие человеческого мозга и миграцию интернейронов. Cell Stem Cell 21 , 383–398 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 166.

    Birey, F. et al. Сборка функционально интегрированных сфероидов переднего мозга человека. Природа 545 , 54–59 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 167.

    Adhya, D. et al. Понимание роли стероидов в типичном и атипичном развитии мозга: преимущества использования подхода «мозг в блюде». J. Neuroendocrinol. 30 , e12547 (2018).

    PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 168.

    Чжан, Ч., Чжао, З., Абдул Рахим, Н. А., Ван Ноорт, Д. и Ю, Х. На пути к человеку на чипе: культивирование нескольких типов клеток на чипе с разделенными на части микросредами. Lab. Чип 9 , 3185–3192 (2009).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 169.

    Zhang, Y. S. et al. Интегрированная с мультисенсором платформа органов на чипах для автоматического и непрерывного мониторинга поведения органоидов на месте. Proc. Natl Acad. Sci. США 114 , E2293 – E2302 (2017).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 170.

    Giobbe, G.G. et al. Гидрогель внеклеточного матрикса, полученный из децеллюляризованных тканей, позволяет культивировать энтодермальные органоиды. Nat.Commun. 10 , 5658 (2019).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 171.

    Jee, J.H. et al. Разработка трехмерной матрицы на основе коллагена для культуры органоидов желудочно-кишечного тракта. Stem Cell Int. 2019 , 8472712 (2019).

    Google ученый

  • 172.

    Cruz-Acuna, R. et al. Гидрогели PEG-4MAL для создания, культивирования и доставки органоидов человека in vivo. Nat. Protoc. 13 , 2102–2119 (2018).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 173.

    Ng, S., Tan, W. J., Pek, M. M. X., Tan, M. H. & Kurisawa, M. Определенные механически и химически гидрогелевые матрицы для культивирования органоидов колоректальной опухоли пациента. Биоматериалы 219 , 119400 (2019).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 174.

    Gjorevski, N. et al. Дизайнерские матрицы для кишечных стволовых клеток и органоидов. Природа 539 , 560–564 (2016).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 175.

    Broguiere, N. et al. Рост эпителиальных органоидов в определенном гидрогеле. Adv. Матер. 30 , e1801621 (2018).

    PubMed Статья CAS PubMed Central Google ученый

  • 176.

    Smith, A. G. et al. Ингибирование плюрипотенциальной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток очищенными полипептидами. Nature 336 , 688–690 (1988).

    CAS Статья Google ученый

  • 177.

    Williams, R. L. et al. Фактор ингибирования миелоидного лейкоза поддерживает потенциал развития эмбриональных стволовых клеток. Nature 336 , 684–687 (1988).

    CAS Статья Google ученый

  • 178.

    Ying, Q. L. et al. Основное состояние самообновления эмбриональных стволовых клеток. Природа 453 , 519–523 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 179.

    Nichols, J. et al. Подтвержденные компетентные к зародышевой линии линии эмбриональных стволовых клеток от мышей, не страдающих ожирением, диабетом. Nat. Med. 15 , 814–818 (2009).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 180.

    Tesar, P.J. et al. Новые клеточные линии эпибласта мыши имеют общие черты с эмбриональными стволовыми клетками человека. Природа 448 , 196–199 (2007).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 181.

    Brons, I.G. et al. Получение плюрипотентных стволовых клеток эпибласта из эмбрионов млекопитающих. Природа 448 , 191–195 (2007).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 182.

    Gafni, O. et al. Получение новых наивных плюрипотентных стволовых клеток человека в основном состоянии. Природа 504 , 282–286 (2013).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 183.

    Chan, Y. S. et al. Индукция плюрипотентного состояния человека с отчетливой регуляторной схемой, напоминающей доимплантационный эпибласт. Cell Stem Cell 13 , 663–675 (2013).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 184.

    Ware, C. B. et al. Получение наивных эмбриональных стволовых клеток человека. Proc. Natl Acad. Sci. США 111 , 4484–4489 (2014).

    CAS PubMed Статья PubMed Central Google ученый

  • 185.

    Theunissen, T. W. et al. Систематическая идентификация условий культивирования для индукции и поддержания наивной плюрипотентности человека. Cell Stem Cell 15 , 524–526 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 186.

    Guo, G. et al. Эпигенетическая перезагрузка плюрипотентности человека. Развитие 144 , 2748–2763 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 187.

    Guo, G. et al. Наивные плюрипотентные стволовые клетки получены непосредственно из изолированных клеток внутренней клеточной массы человека. Stem Cell Rep. 6 , 437–446 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 188.

    Takashima, Y. et al. Сброс схемы управления факторами транскрипции в сторону плюрипотентности в основном состоянии у человека. Cell 158 , 1254–1269 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 189.

    Theunissen, T. W. et al. Систематическая идентификация условий культивирования для индукции и поддержания наивной плюрипотентности человека. Cell Stem Cell 15 , 471–487 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 190.

    Van der Jeught, M. et al. Применение малых молекул, способствующих наивной плюрипотентности при получении эмбриональных стволовых клеток человека. Перепрограммирование клеток. 17 , 170–180 (2015).

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 191.

    Хуанг, К.и другие. Клинические особенности пациентов, инфицированных новым коронавирусом 2019 г., в Ухане, Китай. Ланцет 395 , 497–506 (2020).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 192.

    Исследовательская группа Coronaviridae Международного комитета по таксономии вирусов. Коронавирус, связанный с тяжелым острым респираторным синдромом: классификация 2019-nCoV и присвоение ему названия SARS-CoV-2. Nat.Microbiol. 5 , 536–544 (2020).

    Артикул CAS Google ученый

  • 193.

    Zhao, B. et al. Резюме инфекции SARS-CoV-2 и повреждения холангиоцитов органоидами протоков печени человека. Protein Cell https://doi.org/10.1007/s13238-020-00718-6 (2020).

  • 194.

    Monteil, V. et al. Ингибирование инфекций SARS-CoV-2 в тканях человека с использованием растворимого человеческого ACE2 клинического уровня. Cell 181 , 905–913 (2020).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 195.

    Lamers, M. M. et al. SARS-CoV-2 продуктивно инфицирует энтероциты кишечника человека. Наука https://doi.org/10.1126/science.abc1669 (2020).

    Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

  • 196.

    Чжоу, П.и другие. Вспышка пневмонии, связанная с новым коронавирусом, вероятно, происхождения летучих мышей. Природа 579 , 270–273 (2020).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 197.

    Sungnak, W. et al. Факторы проникновения SARS-CoV-2 высоко экспрессируются в эпителиальных клетках носа вместе с генами врожденного иммунитета. Nat. Med. 26 , 681–687 (2020).

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 198.

    Li, W. et al. Ангиотензин-превращающий фермент 2 является функциональным рецептором коронавируса SARS. Природа 426 , 450–454 (2003).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 199.

    Hoffmann, M. et al. Вход в клетки SARS-CoV-2 зависит от ACE2 и TMPRSS2 и блокируется клинически доказанным ингибитором протеазы. Cell 181 , 271–280 (2020).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 200.

    Walls, A.C. et al. Структура, функция и антигенность гликопротеина шипа SARS-CoV-2. Cell 181 , 281–292 (2020).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 201.

    Yan, R. et al. Структурная основа распознавания SARS-CoV-2 полноразмерным человеческим ACE2. Наука 367 , 1444–1448 (2020).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 202.

    Shang, J. et al. Структурные основы распознавания рецепторов SARS-CoV-2. Природа 581 , 221–224 (2020).

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • Границы | Моделирование неврологических заболеваний с помощью органоидов человеческого мозга

    Введение

    Заболевания центральной нервной системы (ЦНС) обычно имеют сложную и разнообразную этиологию и могут дополнительно осложняться различными генетическими, эпигенетическими факторами и факторами окружающей среды, которые различаются у разных людей.Одним из основных ограничений в изучении этих заболеваний является отсутствие системы in vitro , которая точно воспроизводит сложность и хрупкость человеческого мозга. С момента изобретения метода создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток был достигнут огромный прогресс в разработке протоколов дифференциации ИПСК человека в различные типы клеток, включая нервные клетки. ИПСК, полученные от пациентов, в настоящее время широко используются при моделировании заболеваний (Takahashi and Yamanaka, 2006; Yu et al., 2007; Ван и Деринг, 2012; Shi et al., 2017). Однако традиционные двумерные (2D) культуры все еще ограничены в использовании ИПСК для моделирования процессов заболевания, особенно в отношении неврологических заболеваний.

    Трехмерные (3D) модели культур более физиологически важны с точки зрения пространственной организации тканей, межклеточных и межклеточных связей. Теперь возможно дифференцировать плюрипотентные стволовые клетки (ПСК), включая как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), так и ИПСК, в трехмерные органоподобные ткани, названные органоидами (Lancaster and Knoblich, 2014a; Clevers, 2016).В последние годы были разработаны протоколы, которые используют PSC для генерации органоидов мозга (Kadoshima et al., 2013; Lancaster and Knoblich, 2014b; Dyer, 2016; Di Lullo and Kriegstein, 2017; Giandomenico and Lancaster, 2017; Li Y. et al. др., 2017; Сатклифф, Ланкастер, 2017). Кроме того, появляются доказательства, указывающие на то, что эти органоиды могут продуцироваться из нервных стволовых клеток, судьба которых в большей степени ограничена (Clevers, 2016; Monzel et al., 2017). Потенциал органоидов человеческого мозга для создания более динамичной и биологической системы для изучения биологии человеческого мозга и болезней вызывает огромный интерес и волнение в исследовательских сообществах.

    В этой обзорной статье будут представлены общие сведения о последних достижениях в моделях органоидов головного мозга человека и их применении в моделировании заболеваний нервной системы и нейродегенеративных заболеваний. Также будет подчеркнуто влияние органоидной системы человеческого мозга на наше понимание нейробиологии и заболеваний, а также обсуждены текущие проблемы и будущие перспективы этой модельной системы.

    Поколение органоидов человеческого мозга

    С развитием технологий культивирования, человеческие PSCs теперь могут быть дифференцированы в ряд нейронных идентичностей в 3D-культурах.К настоящему времени представленные 3D-модели in vitro человеческого мозга включают бессывороточную плавающую культуру эмбриоидных тел (ЭБ) — подобных агрегатов с быстрой повторной агрегацией (SFEBq; Eiraku et al., 2008), кортикальной сфероиды (Paşca et al., 2015), церебральные органоиды (Lancaster et al., 2013), органоиды переднего мозга (Kadoshima et al., 2013) и другие органоиды, специфичные для области мозга. Органоиды головного мозга не только более разнородны и сложны, чем двумерные нервные розетки; 3D-нейроэпителий также более сплошной, может развивать идентичность различных областей мозга и, таким образом, лучше воспроизводить сложное взаимодействие и связь между областями и структурами мозга.С тех пор, как впервые было сообщено о создании органоидов мозга, в последние несколько лет в этой области произошел взрывной рост и инновации (Lancaster et al., 2013; Lancaster and Knoblich, 2014a; Di Lullo and Kriegstein, 2017; Giandomenico and Lancaster, 2017). ; Ланкастер, 2018; Пашка, 2018).

    Был разработан ряд протоколов для получения органоидов мозга из человеческих PSC. PSCs, культивируемые в соответствующих условиях, могут превращаться в трехмерные органоиды. В качестве типичного протокола метод получения церебральных органоидов, который зависит от внутренней способности PSCs самоорганизовываться при точно рассчитанном манипулировании условиями культивирования без внешних факторов роста или других молекул, был хорошо задокументирован (Lancaster and Knoblich, 2014b; Сатклифф и Ланкастер, 2017).Вкратце, PSC in vitro могут развиваться в агрегаты, так называемые EB, которые демонстрируют дифференциацию трех зародышевых листков. При переносе EB в минимальную среду эктодерма (самый внешний слой) приобретает больше нейронных свойств и дифференцируется в нейроэпителий, который позже является источником нейральных предшественников. Одним из ключевых достижений здесь является объединение подхода плавающих трехмерных агрегатов с матригелем, компонентами внеклеточного матрикса (ЕСМ), путем встраивания растущих EB в матригель (Lancaster et al., 2013). Каркас Matrigel поддерживает самоорганизацию нейроэпителия в трехмерном контексте и индуцирует сигнал правильной полярности для формирования апикобазально поляризованного нейроэпителиального зачатка. Далее нейроэпителий превращается в структуры, очень похожие на развивающийся человеческий мозг. Поддержка Matrigel, по-видимому, имеет решающее значение для построения структур мозга in vitro . Более позднее перемешивание, обеспечиваемое биореакторами в плавающих культурах, способствует образованию гораздо более крупных церебральных органоидов с полостями, заполненными жидкостью, которые напоминают желудочки.Поскольку индуктивных сигналов нет, органоиды демонстрируют различные особенности областей мозга ЦНС, которые обычно представляют собой задний мозг, средний мозг, передний мозг и даже ткани сетчатки (Lancaster and Knoblich, 2014b; Camp et al., 2015; Sutcliffe and Lancaster, 2017).

    Органоиды головного мозга человека демонстрируют другие сложные трехмерные структуры, такие как определенные пролиферативные зоны, гомологичные желудочковой зоне (VZ), внутренней субвентрикулярной зоне (iSVZ) и внешней SVZ (oSVZ), напоминающие многослойную зону-предшественницу. организация человеческого мозга (Lancaster et al., 2013; Qian et al., 2016). Значительным улучшением является генерация нейронов с идентичностями неокортикальных слоев (Kadoshima et al., 2013; Lancaster and Knoblich, 2014b) с различными типами нейронов всех шести корковых слоев, наблюдаемыми в органоидах переднего мозга (Qian et al., 2016). Органоиды мозга имитируют многие другие особенности развития мозга, такие как создание дискретных областей мозга, а также радиальная и тангенциальная миграция популяций корковых нейронов. Поскольку органоиды мозга не образуются внешне добавленными факторами роста или морфогенами, их развитие зависит исключительно от самоорганизации.Недавнее исследование успешно проиллюстрировало формирование паттернов, управляющих самоорганизацией во время развития и дифференциации церебральных органоидов (Renner et al., 2017). Присутствуют различные отдельные вентральные и дорсальные области, и многие из этих областей взаимосвязаны в областях переднего мозга, указывая тем самым на то, что ряд дорсовентральных идентичностей может генерироваться в церебральных органоидах; органоиды содержат центры организации переднего мозга, секретирующие факторы роста, которые могут участвовать в формировании дорсо-вентрального паттерна.Более того, в органоидах действительно существует синхронизированная генерация нейронов со зрелой морфологией, а также последующая генерация астроцитов и олигодендроцитов (Renner et al., 2017). Это классическое фенотипическое исследование показывает, что органоиды мозга могут воспроизводить пространственные и временные паттерны, которые управляют развитием человеческого мозга (Renner et al., 2017). Поскольку органоиды мозга могут поддерживаться в течение длительных периодов времени, они потенциально могут моделировать более поздние события, такие как выживание нейронов, созревание и дегенерация за пределами стадии развития мозга (Lancaster and Knoblich, 2014b; Quadrato et al., 2017).

    Примечательно, что органоиды мозга не просто точно отражают структурные и цитоархитектурные аспекты человеческого мозга, их общие эпигеномные и транскрипционные программы могут близко имитировать программы человеческого мозга (Luo et al., 2016; Xiang et al., 2017). Транскриптомы корковых клеток в органоидах хорошо совпадают с транскриптомами апикальных предшественников, промежуточных предшественников и кортикальных нейронов в головном мозге in vivo на разных стадиях дифференцировки. И органоиды, и кора плода содержат клетки, транскриптомы которых указывают на то, что они находятся в переходном состоянии между стадиями, что позволяет предположить, что дифференцировка является непрерывным процессом (Camp et al., 2015). Органоиды головного мозга устанавливают эпигеномные и транскрипционные программы, необходимые для развития мозга. Органоиды повторяют многие эпигеномные и транскрипционные особенности мозга плода человека (Luo et al., 2016; Qian et al., 2016). В соответствии с результатами исследования органоидов на ранних стадиях, клетки органоидов мозга, развивающиеся в течение длительного периода (более 9 месяцев), также демонстрируют транскрипционный профиль, который тесно связан с их эндогенными аналогами (Quadrato et al., 2017).Также были исследованы физиологические свойства нейронов и нейронных сетей органоидов головного мозга человека (Lancaster et al., 2013; Paşca et al., 2015; Quadrato et al., 2017). Нейроны церебральных органоидов человека после 75 дней культивирования демонстрируют спонтанные выбросы Ca 2+ , которые хорошо реагируют на глутамат, что указывает на существование электрически функциональных глутаматергических клеток (Lancaster et al., 2013; Lancaster and Knoblich, 2014b). Интересно, что высвобождение глутамата органоидами мозга можно измерить с помощью биосенсора (ферментно-модифицированные микроэлектроды; Nasr et al., 2018). Органоиды головного мозга могут развиваться дальше в культуре, прошедшей раннюю стадию развития, что позволяет не только формировать разнообразие клеток, но и созревать нейроны. Функциональные синапсы проявляются в органоидах после 6 месяцев культивирования (Paşca et al., 2015). Органоиды головного мозга в культуре более 9 месяцев проходят существенное нейрональное созревание, включая образование дендритных шипов и создание спонтанно активных нейронных сетей. Нейроны внутри органоидов реагируют на световую стимуляцию светочувствительных клеток, что позволяет предположить, что, помимо раннего развития мозга, органоиды мозга могут потенциально использоваться для изучения дисфункций нервных цепей, связанных с неврологическими заболеваниями (Quadrato et al., 2017). Примечательно, что существование зрелых астроцитов было также подтверждено транскриптомным, протеомным и функциональным анализом органоидов головного мозга человека (Dezonne et al., 2017; Sloan et al., 2017). Важно отметить, что астроциты органоидов мозга функционально идентичны астроцитам, выделенным из мозга взрослого человека (Dezonne et al., 2017). Молекулярное, клеточное и физиологическое сходство между органоидами головного мозга человека и in vivo головным мозгом указывает на то, что органоиды мозга потенциально могут быть использованы для изучения биологии и болезней человеческого мозга.

    Протоколы по органоидам мозга были сформулированы так, чтобы давать начало определенным областям мозга. Добавление факторов формирования паттерна позволяет генерировать органоиды различных региональных подтипов головного мозга (Kelava and Lancaster, 2016a; Di Lullo and Kriegstein, 2017). Процедуры генерации органоидов головного мозга человека в различных областях мозга, включая кору головного мозга (Kadoshima et al., 2013; Lancaster et al., 2013; Xiang et al., 2017), мозжечок (Muguruma et al., 2015), средний мозг ( Jo et al., 2016; Qian et al., 2016, 2018; Monzel et al., 2017), передний мозг (Qian et al., 2016, 2018), гипоталамус (Qian et al., 2016, 2018), гиппокамп (Sakaguchi et al., 2015) и даже медиальное ганглиозное возвышение (MGE; Bagley et al., 2017; Xiang et al., 2017), критический вентральный домен мозга, продуцирующий корковые интернейроны. Эти органоиды служат доказательством того, что человеческие ПСК могут дифференцироваться в разные типы клеток и самоорганизовываться в определенные трехмерные структуры, таким образом повторяя основные особенности человеческого мозга.Органоиды, специфичные для области мозга, будут особенно важны для изучения неврологических состояний, при которых определенные области мозга поражены специфически или более серьезно.

    Изолированная региональная идентичность действительно ограничивает способность органоидов мозга воспроизводить определенные взаимодействия и связи между областями и структурами мозга. Важным достижением в недавних исследованиях является то, что органоиды из разных областей мозга могут быть объединены в культуре для анализа миграции нейронов, нейронных связей и сетей (Mich et al., 2017). В ходе исследований был разработан метод сокультивирования для слияния органоидов двух смежных структур головного мозга, дорсального (возбуждающего) и вентрального (тормозного) переднего мозга, в одной органоидной ткани (Bagley et al., 2017; Birey et al., 2017; Xiang et al. , 2017). Когда дорсальный и вентральный органоиды переднего мозга сливаются, образуется дорсально-вентральная ось, и миграция ГАМКергических интернейронов из вентрального в дорсальный передний мозг, напоминающая миграцию in vivo кортикальных интернейронов , может наблюдаться с помощью покадровой визуализации, демонстрируя, что слияние церебральных органоидов культуры могут быть потенциально применены для моделирования сложных взаимодействий между различными областями мозга (Bagley et al., 2017). Точно так же Xiang et al. Успешно создали MGE- и кортекс-специфические органоиды, происходящие из PSC человека, которые повторяют развитие своих in vivo аналогов и продуцируют функциональные нейроны и нейронные связи. После слияния органоидов, специфичных для MGE и коры, миграцию и интеграцию интернейронов человека можно было визуализировать с помощью визуализации в реальном времени (Xiang et al., 2017). Интересно, что миграция интернейронов может быть заблокирована ингибированием CXCR4 (Bagley et al., 2017) и миозина II (Xiang et al., 2017), предполагая, что для миграции необходимы эти молекулы, которые, как известно, участвуют в in vivo миграции интернейронов. Важно отметить, что мигрировавшие тормозящие нейроны физиологически активны и могут быть синаптически интегрированы с возбуждающими нейронами (Xiang et al., 2017). Таким образом, эти исследования представляют собой значительное развитие технологии органоидов мозга. Технология слияния органоидов может предложить исследователям новую возможность для изучения динамики клеток мозга и нейронных схем и может быть применима для моделирования неврологических заболеваний.

    Моделирование неврологических заболеваний с помощью органоидов

    Поскольку видовые различия ограничивают сходство моделей на животных с биологией человека, органоиды человеческого мозга особенно подходят для решения биологических проблем или вопросов, которые могут быть полезны при использовании модельных систем человека. Например, органоиды головного мозга использовались для изучения ориентации деления клеток в радиальных глиальных клетках человека (Lancaster et al., 2013) и размножения кортикальных предшественников человека (Otani et al., 2016) — процессов, которые могут регулироваться у человека уникальным образом по сравнению с другие виды.Хотя животные модели были мощным инструментом для понимания роли идентифицированных мутировавших генов в заболеваниях, многие когнитивные или психические расстройства, такие как аутизм и шизофрения, имеют полигенную этиологию и их трудно изучать с помощью имеющихся в настоящее время животных моделей. Органоиды головного мозга человека представляют беспрецедентную возможность моделировать сложные полигенные неврологические расстройства, в том числе с неустановленными генетическими дефектами, и изучать эпигенетические изменения, которые связывают гены и окружающую среду, лежащие в основе нейробиологии заболеваний (Luo et al., 2016; Форсберг и др., 2018; Janssens et al., 2018).

    Органоидная система мозга имеет множество преимуществ перед моделями на животных, обещая изучить по крайней мере некоторые ключевые особенности заболеваний в условиях 3D in vitro . Модели органоидов особенно полезны для исследований, которые требуют живых и функциональных тканей, таких как электрофизиологический анализ и визуализация динамического поведения клеток в реальном времени. Кроме того, возможности использования моделей органоидов головного мозга расширяются с развитием инструментов редактирования генома, которые позволяют точно нацеливать мутации или целенаправленную репарацию генов, тем самым стимулируя дальнейший интерес к методам работы с органоидами мозга.Органоиды человеческого мозга предоставляют новый инструмент для исследования механизмов неврологических заболеваний, которые в противном случае было бы невозможно исследовать на животных моделях (Di Lullo and Kriegstein, 2017; Paşca, 2018). В настоящее время различные неврологические расстройства можно моделировать с помощью органоидов головного мозга человека; различные стратегии и подходы использовались при моделировании болезней, последующем анализе и применении (Рисунки 1, 2).

    Рисунок 1 . Моделирование органоидов мозга человека при неврологических заболеваниях.Модели органоидов мозга могут быть созданы с использованием ИПСК, полученных от пациентов, или путем введения в здоровые органоиды мозга лекарств или вирусов при их образовании. Альтернативно, генные мутации могут быть введены в непораженные ПСХ человека путем редактирования генома (CRISPR-Cas9) для создания органоидов мозга с относительными генетическими дефектами. Органоиды головного мозга пациента также могут быть генетически восстановлены для создания изогенных контролей. Перечисленные здесь болезни и ссылки являются репрезентативными, но неисчерпаемыми.Сокращения: ИПСК — индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; ПСК, плюрипотентные стволовые клетки.

    Рисунок 2 . Последующий анализ и применение моделей органоидов человеческого мозга при неврологических заболеваниях. Обычные методы, используемые в нейробиологии, могут быть не в состоянии использовать нейронную активность и сетевое взаимодействие в трехмерной архитектуре органоидов мозга. Комбинация передовых многоуровневых и высокопроизводительных методов обнаружения, которые позволяют анализировать органоиды целого или неповрежденного мозга, значительно улучшит фенотипическое профилирование моделей органоидов человеческого мозга и может помочь в дальнейшем раскрытии механизмов патогенеза заболевания (Mariani et al., 2015; Луо и др., 2016; Qian et al., 2016; Quadrato et al., 2016; Берштейн и др., 2017; Хартли и Бреннанд, 2017; Реннер и др., 2017; Xiang et al., 2017; Paşca, 2018). Модели органоидов мозга могут быть потенциально использованы для тестирования или скрининга лекарственных средств, идентификации новых биомаркеров или разработки инновационных методов диагностики и лечения. Органоиды головного мозга, полученные от пациентов, вместе с тестированием на наркотики, диагностическими или терапевтическими подходами могут в конечном итоге привести к персонализированной медицине для людей (Kelava and Lancaster, 2016a; Qian et al., 2016; Quadrato et al., 2016; Ди Лулло и Кригштейн, 2017; Квадрато и Арлотта, 2017). Сокращения: ATAC-seq, анализ доступного для транспозаз хроматина с высокопроизводительным секвенированием; ChIP-seq, иммунопреципитация хроматина и секвенирование; MethylC-seq, MethylC-секвенирование; qPCR, количественная ПЦР; RNA-seq, РНК-секвенирование.

    Микроцефалия

    Микроцефалия — это состояние, при котором у пациентов с врожденными заболеваниями размер мозга значительно уменьшается для их возраста. Мутации в гене CDK5RAP2 могут повлиять на неокортикальные клетки-предшественники и описаны у пациентов с микроцефалией (Bond et al., 2005; Buchman et al., 2010). Однако мышиные модели не смогли воспроизвести симптомы микроцефалии у людей. Интересно, что церебральные органоиды, происходящие от пациентов с микроцефалией с усекающей мутацией в CDK5RAP2 , обнаруживают преждевременную нейральную дифференцировку, дефект, который отражает фенотип заболевания (Lancaster et al., 2013). Соответственно, уровни CDK5RAP2, по крайней мере, частично ответственны за наблюдаемую гипоплазию, поскольку РНК-интерференция (РНКи) в контрольных органоидах была способна воспроизвести фенотип, в то время как сверхэкспрессия CDK5RAP2 смогла частично спасти его (Lancaster et al., 2013). Исследование во-первых демонстрирует, что органоидная система мозга применима для моделирования заболеваний. Синдром Секкеля с микроцефалией вызван мутацией центросомно-P4.1-ассоциированного белка ( CPAP ), который может уменьшить популяцию нейральных клеток-предшественников во время развития мозга (McIntyre et al., 2012; Garcez et al., 2015). Габриэль и др. (2016) сообщили, что CPAP может негативно регулировать длину ресничек, которые играют роль в поддержании нервных клеток-предшественников как в 2D культурах, так и в 3D органоидах.В то время как CPAP обычно обеспечивает каркас для комплекса разборки ресничек (CDC), мутировавший не может этого сделать, что приводит к неэффективному привлечению CDC, замедлению разборки ресничек, длинным ресничкам и задержке повторного входа в клеточный цикл, что приводит к преждевременной дифференцировке. нейральных клеток-предшественников, полученных из ИПСК пациента. Важно отметить, что аберрантная функция CDC является причиной преждевременной дифференцировки нейральных клеток-предшественников в органоидах головного мозга пациента с синдромом Секкеля (Gabriel et al., 2016). Это исследование раскрывает новый механизм микроцефалии, вызванной мутацией CPAP . Способность органоидов человеческого мозга воспроизводить развитие мозга и микроцефалию с высокой точностью дополнительно подтверждается недавним исследованием моделирования микроцефалии, вызванной мутацией гена Aspm (Li R. et al., 2017).

    Макроцефалия

    Органоиды человеческого мозга также использовались для моделирования макроцефалии. В качестве факторов роста каскад фосфатаза и гомолог тензина (PTEN) -белковая киназа B (PKB / AKT) регулирует кортикальное образование человека (Lee et al., 2012; Мирзаа и др., 2013). Гетерозиготные мутации потери функции PTEN были обнаружены у пациентов с макроцефалией (Butler et al., 2005; Marchese et al., 2014). В своей церебральной органоидной системе Li Y. et al. (2017) обнаружили, что делеция гена PTEN с помощью CRISPR / Cas9-опосредованного редактирования генома увеличивает активность AKT в нейральных предшественниках человека, способствует повторному входу в клеточный цикл и временно задерживает дифференцировку нейронов, что приводит к выраженному разрастанию радиальной глии и промежуточные клетки-предшественники.Органоиды человека и мыши, в которых отсутствует PTEN, демонстрируют значительное увеличение в размерах, но только органоиды человека демонстрируют существенную складчатость поверхности (Li Y. et al., 2017). Фенотипические различия здесь могут отражать присущие видам различия в регуляции передачи сигналов, клеточном ответе или анатомической организации. Таким образом, это исследование дает новое понимание механизмов, регулирующих развитие коры головного мозга человека. Это подтверждает, что органоиды человеческого мозга могут быть использованы для изучения человеческих специфических фенотипов и основных механизмов.

    Аутизм и другие психические расстройства

    Расстройства аутистического спектра (РАС) — это группа нервно-психических расстройств, характеризующихся языковым дефицитом, трудностями социальной коммуникации и повторяющимся поведением, которые наблюдаются у пациентов в детстве (Wang and Doering, 2015; Mullins et al., 2016; Sztainberg и Зогби, 2016). Органоиды человеческого мозга воспроизводят ранние события развития мозга и могут быть неоценимыми для изучения нейробиологии РАС.По сравнению с их контролем церебральные органоиды, полученные от пациентов с идиопатическим аутизмом, демонстрировали аномальную пролиферацию нервных клеток-предшественников и увеличенную популяцию ингибирующих ГАМКергических нейронов (Mariani et al., 2015), что подтверждает гипотезу о дисбалансе возбуждающего / тормозящего в аутическом мозге. (Рубинштейн, 2010). Транскриптомный анализ показал, что фактор транскрипции FOXG1 активируется в органоидах ASD. Было подтверждено, что сверхэкспрессия FOXG1 ответственна за сверхпродуцирование ГАМКергических нейронов с использованием РНКи, предполагая, что смещение судьбы ГАМКергических нейронов из-за активации FOXG1 может быть потенциальным молекулярным механизмом при РАС (Mariani et al., 2015). Это исследование показывает, что измененное равновесие пролиферации / нейрогенеза на раннем этапе развития мозга может быть основным признаком, по крайней мере, в подгруппе РАС.

    Хромодомен-геликаза ДНК-связывающий белок 8 ( CHD8 ), причинный ген ASD, кодирует члена семейства CHD АТФ-зависимых факторов ремоделирования хроматина (Krumm et al., 2014). Мутации этого гена также связаны с умственной отсталостью и шизофренией (McCarthy et al., 2014). Для исследования функции CHD8 в головном мозге человека CHD8 +/- церебральных органоидов были созданы с помощью редактирования генов ИПСК CRISPR-Cas9 (Wang et al., 2017). В ходе обширного транскриптомного анализа генов-мишеней CHD8 в CHD8 +/- церебральных органоидах и их изогенных контролях выявленные дифференциально экспрессируемые гены (ДЭГ) не только соответствовали многим из генов, обнаруженных при анализе в нейральных клетках-предшественниках, но и культуры нейронов, но они также значительно перекрываются с ДЭГ, ранее идентифицированными при идиопатических РАС (Wang et al., 2017). Интересно, что DLX6-AS1, длинная некодирующая антисмысловая РНК, которая регулирует развитие ГАМКергических интернейронов, занимает первое место в обоих наборах данных (Wang et al., 2017). Общая нижестоящая сигнальная молекула DLX6-AS1 среди различных генетических вариантов, вызывающих аутизм, может быть особенно важной при разработке потенциальных терапевтических средств для лечения РАС.

    Известно, что мутации прерванной шизофрении 1 (DISC1) связаны с серьезными психическими расстройствами, такими как шизофрения, аутизм, биполярное расстройство и депрессия (Porteous et al., 2011; Нараян и др., 2013; Прыткова, Бреннанд, 2017). Хотя были идентифицированы сотни DISC1-связывающих белков, мало что известно о том, как DISC1 взаимодействует с этими белками, влияя на развитие мозга человека (Porteous et al., 2011; Bradshaw and Porteous, 2012; Lipina and Roder, 2014). Получив информацию о структуре DISC1 в комплексе с его связывающим доменом Ndel1, о чем сообщалось в их недавней статье, Ye et al. (2017) элегантно продемонстрировали, что DISC1 может регулировать прикрепление кинетохор Ndel1, но не локализацию его центросомы во время митоза; нарушение образования комплекса DISC1 / Ndel1 продлевает митоз, влияет на развитие клеточного цикла в клетках человека и вызывает дефицит клеточного цикла радиальных глиальных клеток как в эмбриональной коре мышей, так и в органоидах переднего мозга человека.Что еще интереснее, эти дефициты могут быть подтверждены в органоидах, полученных от пациента с шизофренией с мутацией DISC1, которая нарушает его взаимодействие с Ndel1 (Ye et al., 2017). Таким образом, это исследование раскрывает новый механизм для DISC1 как основного белка-концентратора на перекрестке нейро-развития, нейрональной передачи сигналов и психических расстройств.

    Синдром Ретта

    Синдром Ретта (СРТ) — это Х-сцепленное расстройство нервного развития с ранним началом, которое преимущественно вызвано мутациями гена -метил-CpG-связывающего белка 2 ( MECP2 ), который кодирует многофункциональный эпигенетический регулятор (Amir et al. ., 1999; Castro et al., 2013). Функция MeCP2 интенсивно изучалась на различных моделях. Однако его роль в раннем развитии мозга мало изучена. Поскольку микроРНК (миРНК) играют важную роль в нейрогенезе и, как известно, являются нижележащими мишенями для MeCP2 (Szulwach et al., 2010; Wu et al., 2010), Mellios et al. (2018b) использовали RTT-ИПСК, полученные от пациентов, и подходы MeCP2 RNAi для идентификации новых MeCP2-нацеленных miRNA во время развития нейронов. Они обнаружили, что miR-199 и miR-214 активируются во время раннего развития мозга и дифференциально модулируют киназу, регулируемую внеклеточными сигналами (ERK) / митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK), и путь передачи сигналов AKT.Между тем, дефекты нейрогенеза, дифференцировки и миграции нейронов были обнаружены как в MeCP2-дефицитных, так и в органоидах головного мозга, полученных от пациентов (Mellios et al., 2018a, b). Ингибирование экспрессии miR-199 или miR-214 в MeCP2-дефицитных клетках-предшественниках нейронов восстанавливает связанный сигнальный путь и улучшает нарушения дифференцировки нейронов (Mellios et al., 2018b). Таким образом, это исследование описывает новый сигнальный путь, опосредованный миРНК, нацеленными на MeCP2, который может влиять на нейрогенез и раннее развитие мозга.

    Синдром Миллера-Дикера

    Синдром Миллера-Дикера (МДС), врожденная форма лизэнцефалии, вызывается гетерозиготной делецией хромосомы 17p13.3, приводящей к порокам развития коры головного мозга (Matarese and Renaud, 2009; Nagamani et al., 2009). Предыдущая информация об этом заболевании в основном была получена из ограниченного анализа посмертных человеческих мозгов и моделей мышей. Однако у моделей мышей есть недостаток в том, что они от природы лиссэнцефалические. Таким образом, органоиды человеческого мозга в последнее время используются для исследования того, как МДС влияет на подтипы предшественников человека (клетки внешней радиальной глии), которые контролируют выход нейронов и влияют на топологию мозга.Анализируя церебральные органоиды, полученные из контроля и МДС-ИПСК, Bershteyn et al. (2017) наблюдали дефект миграции клеток, который можно было исправить путем коррекции хромосомной делеции, и тяжелый апоптоз нейроэпителиальных стволовых клеток-основателей, сопровождающийся повышенным горизонтальным делением клеток. Они также идентифицировали митотический дефект в наружной радиальной глии, подтипе предшественника, который в значительной степени отсутствует у лиссэнцефальных грызунов, но имеет решающее значение для расширения неокортекса человека (Bershteyn et al., 2017). Аналогичным образом Иефремова и соавт. (2017) использовали органоиды переднего мозга конкретных пациентов для исследования патологических изменений, связанных с МДС. Они обнаружили, что органоиды, полученные от пациентов, уменьшаются в размерах, и это изменение сопровождается переключением от симметричного к асимметричному делению клеток радиальной глии VZ; ось передачи сигналов N-кадгерин / β-катенин нарушена; восстановление активной передачи сигналов β-catenin спасает режимы деления и уменьшает дефекты роста органоидов (Iefremova et al., 2017). Хотя органоиды человеческого мозга не могут хорошо воспроизводить гирификацию, они могут иметь соответствующие типы клеток, клеточные или молекулярные механизмы, необходимые для формирования болезни.Таким образом, исследования дают представление о клеточном патогенезе лиссэнцефалии и расширяют возможности органоидов мозга для моделирования нарушений развития нервной системы человека.

    Болезнь Сандхоффа

    Болезнь Сандхоффа — аутосомно-рецессивное заболевание, вызванное мутацией β-субъединицы бета-гексозаминидазы (HEXB), которая приводит к потере активности бета-гексозаминидазы и последующему накоплению в лизосомах ее субстрата, ганглиозида GM2 (Cordeiro et al., 2000; Ferreira and Гал, 2017).Это лизосомное нарушение накопления характеризуется катастрофическими невропатиями и смертью в раннем детстве. Однако в значительной степени неизвестно, как накопление ганглиозидов в лизосомах может влиять на развитие мозга. Чтобы создать модель развития нервной системы для болезни Сандхоффа, Allende et al. (2018) разработали церебральные органоиды с ИПСК, полученными из фибробластов младенца с болезнью Сандхоффа; они также создали изогенные (скорректированные HEXB) элементы управления путем редактирования генома с использованием технологии CRISPR / Cas9.Как и ожидалось, органоиды болезни Сандхоффа, но не контрольные органоиды, показали накопленный ганглиозид GM2. Больные органоиды также демонстрировали увеличенный размер и клеточную пролиферацию по сравнению с их изогенными контролями. Как показал транскриптомный анализ, эти органоиды при болезни Сандхоффа нарушались (Allende et al., 2018). Это исследование предполагает, что измененная дифференцировка нейронов может быть ранним событием в развитии болезни Сандхоффа.

    Пренатальное воздействие лекарств

    Предыдущие исследования показали, что пренатальное воздействие кокаина на крыс вызывает изменения цитоархитектуры и связанные с ними сигнальные изменения в неокортексе эмбриона (Lee et al., 2008, 2011). Однако видовые различия в развитии мозга и метаболизме ограничивают передачу этих результатов людям. Органоиды человеческого мозга предлагают более подходящие модели для изучения влияния пренатального воздействия лекарств на мозг плода человека. Используя неокортикальные органоиды, Lee et al. (2017) продемонстрировали, что воздействие кокаина может подавлять пролиферацию клеток-предшественников неокортекса, вызывать преждевременную дифференцировку нейронов и прерывать развитие нервных тканей. Эти эффекты, вероятно, опосредованы CYP3A5-индуцированной генерацией активных форм кислорода, поскольку нокдаун CYP3A5 обращает вспять индуцированные кокаином патологии в органоидах мозга, что позволяет предположить, что CYP3A5 может быть терапевтической мишенью для лечения нарушений развития нервной системы, связанных с пренатальным воздействием кокаина (Lee et al. ., 2017). Исследование также указывает на то, что органоиды человеческого мозга предоставляют платформу для изучения воздействия злоупотребляемых веществ или наркотиков на ЦНС.

    ЗИКА Вирусная инфекция

    Вирус

    ZIKA (ZIKV) — патоген, вызывающий врожденную микроцефалию и неврологические расстройства. С его вспышкой в ​​Америке органоиды головного мозга человека становятся мощным инструментом для изучения воздействия ZIKV на развитие мозга, помогая установить причинно-следственную связь между инфекцией ZIKV и избирательно направленным разрушением нейральных клеток-предшественников (Garcez et al., 2016; Ming et al., 2016). Было обнаружено, что ZIKV напрямую заражает корковые нейральные предшественники в различных экспериментальных моделях, включая нейронные предшественники, полученные из ИПСК человека, в монослое, трехмерных нейросферах и органоидах головного мозга (Garcez et al., 2016; Li et al., 2016; Ming et al., 2016; Qian et al., 2017). Исследования органоидов переднего мозга выявили клеточно-специфический вирусный тропизм; а именно, ZIKV избирательно влияет на пролиферацию нейральных клеток-предшественников (Qian et al., 2016). Продуктивная инфекция нервных клеток-предшественников ZIKV задерживает развитие клеточного цикла и увеличивает гибель клеток, вызывая уменьшение размера органоидов, напоминающее микроцефалию (Dang et al., 2016; Ming et al., 2016). На молекулярном уровне инфекция ZIKV приводит к нарушению регуляции множественных сигнальных путей (Wen et al., 2017). Toll-подобный рецептор 3 (TLR3) рецептора врожденного иммунитета активируется после заражения ZIKV; ингибирование TLR3 частично устраняет фенотипический эффект ZIKV в органоидах головного мозга человека (Dang et al., 2016). Дальнейший анализ экспрессии генов во время активации TLR3 выявил гены, связанные с развитием нейронов, что позволило предположить молекулярные механизмы, лежащие в основе нарушения нейрогенеза (Dang et al., 2016). Интересно, что недавнее исследование продемонстрировало, что инфекция ZIKV может вызывать едва заметные (эпигенетические) изменения в головном мозге, поскольку инфекция органоидов мозга изменяет метилирование ДНК в нескольких типах клеток (нейронные предшественники, астроциты и нейроны) в генах, которые связаны с различными нервно-психическими расстройствами. расстройства, что свидетельствует о том, что пренатальная инфекция ZIKV может потенциально вызывать заболевания мозга в более позднем возрасте (Janssens et al., 2018).

    Как ZIKV может напрямую взаимодействовать с клетками, чтобы влиять на нейрогенез? Геном ZIKV состоит из одноцепочечной РНК с положительным смыслом, которая кодирует одну открытую рамку считывания (ORF; White et al., 2016). Трансляция ORF генерирует большой полипротеин из более чем 3000 аминокислотных остатков, который может быть дополнительно расщеплен с образованием трех структурных белков (C, prM и E) и семи неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5; White et al., 2016). Было обнаружено, что ZIIKV-NS4A и NS4B ингибируют AKT-мишень рапамицина (mTOR) у млекопитающих, что приводит к дефектам нейрогенеза и аномальной активации аутофагии (Liang et al., 2016). Недавнее исследование показало, что ZIKV-NS2A, но не вирус Денге (DENV) -NS2A, вызывает снижение пролиферации и преждевременной дифференцировки радиальных глиальных клеток и аберрантное положение новорожденных нейронов.Механически ZIKA-NS2A, но не DENV-NS2A, взаимодействует с комплексом adherens junction (AJ) и дестабилизирует комплекс, что приводит к нарушению образования комплекса AJ и аберрации каркаса радиальных глиальных волокон в коре головного мозга эмбрионов мыши. Точно так же ZIKA-NS2A, но не DENV-NS2A, снижает пролиферацию радиальных глиальных клеток и вызывает дефицит AJ в органоидах переднего мозга человека (Yoon et al., 2017). Таким образом, эти исследования выявляют молекулярные и клеточные компоненты, участвующие в инфекции ZIKV во время развития мозга млекопитающих.

    В настоящее время существует несколько возможных вариантов лечения разрушительной инфекции ZIKV. Препараты на химической основе могут стать средством первой помощи. Нейронные предшественники и органоиды головного мозга человека, происходящие из PSC, служат платформой для тестирования и валидации лекарств. Чжоу и др. (2017) сообщили о высоком содержании химического скрининга с использованием клеток-предшественников корковых нейральных клеток, происходящих из PSC человека. Они обнаружили, что гидробромид гиппеастрина (HH) и дегидрат дигидрохлорида амодиахина (AQ) могут ингибировать инфекцию ZIKV в клетках-предшественниках нейронов.Дальнейшая проверка показала, что HH также устраняет индуцированные ZIKV дефекты роста и дифференцировки в нейральных клетках-предшественниках и органоидах переднего мозга, подобных плоду человека. Кроме того, HH и AQ ингибируют инфекцию ZIKV в мозге взрослой мыши in vivo ; HH также подавляет распространение вируса у взрослых мышей с активной инфекцией ZIKV, подчеркивая его терапевтический потенциал. Однако AQ проявляет высокую цитотоксичность в культурах органоидов головного мозга, что вызывает опасения по поводу безопасности при использовании препарата во время беременности (Zhou et al., 2017). Watanabe et al. (2017) разработали усовершенствованные методы органоидов для моделирования ZIKV-ассоциированной микроцефалии; они идентифицировали больше рецепторов потенциальной восприимчивости (другие трансмембранные рецепторы семейства TAM / TIM, включая TYRO3, MER и TIM1) для проникновения ZIKV в нейральные предшественники и соединения (ивермектин и дурамицин), которые могут смягчать ZIKV-индуцированную цитопатию. В совокупности исследования демонстрируют силу органоидов мозга в выявлении мишеней или кандидатов на лекарства для дальнейшего тестирования.

    Поскольку существует несоответствие в архитектуре тканей и составе типов клеток между органоидами головного мозга человека и in vivo головного мозга , результаты, касающиеся инфекционности клеточного типа в органоидах мозга и их значения для инфицирования ZIKV человека, должны быть тщательно интерпретированы. Высокая инфекционность нервных клеток-предшественников была обнаружена как в органоидах, так и в первичной ткани. Однако инфекция астроцитов лишь изредка наблюдалась в органоидах (Qian et al., 2016), но в больших количествах присутствовала в первичной ткани (Retallack et al., 2016). Это может быть связано либо с более низким процентом астроцитов в органоидах мозга, либо с присущими им различиями между in vitro — и in vivo -производными клетками. Уязвимость микроглии к инфекции ZIKV наблюдалась в первичных тканях (Retallack et al., 2016), тогда как этот тип клеток обычно отсутствует в органоидах мозга, что следует учитывать при изучении механизмов проникновения вируса. AXL, также известный как рецептор тирозин-протеинкиназы UFO, был идентифицирован как кандидатный рецептор проникновения вируса в первичных тканях человека и высоко экспрессируется в клетках радиальной глии органоидов головного мозга (Nowakowski et al., 2016). Однако генетическое устранение AXL не влияло на проникновение ZIKV или опосредованную ZIKV гибель клеток в нейральных клетках-предшественниках, происходящих от iPSC человека, или церебральных органоидах на ранних стадиях (Wells et al., 2016). К счастью, очевидное противоречие в этих выводах можно предварительно объяснить другим исследованием, в котором документально подтверждено, что AXL важен для инфицирования глиальных клеток человека (астроцитов и микроглии), но не для клеток-предшественников нервных клеток человека (Meertens et al., 2017). Значение AXL или других сигнальных молекул, вовлеченных в глиальную ZIKV-инфекцию, и восприимчивость глиальных клеток к инфекции, возможно, не были реализованы только с помощью моделей органоидов мозга, что позволяет предположить, что для лучшего моделирования требуется оптимизация органоидов мозга или их комбинация с другими модельными системами. инфекция ZIKV человека (Di Lullo and Kriegstein, 2017).

    Нейродегенеративные заболевания

    Разработка моделей нейродегенеративных заболеваний с поздним началом на основе ИПСК человека была сложной задачей из-за незрелости нейронов, полученных in vitro . Исследования показали, что органоиды головного мозга могут быть подходящими моделями для нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА), наиболее распространенный тип деменции, который в основном характеризуется внеклеточным отложением неправильно свернутого амилоида-β (Aβ), содержащего бляшки и внутриклеточные нейрофибриллярные клубки ( NFT; Hardy and Selkoe, 2002; van der Zee et al., 2008; Querfurth and LaFerla, 2010). Поскольку 2D-модели культивирования не имеют сложной внеклеточной среды, необходимой для агрегации внеклеточных белков, условия 3D-культивирования более перспективны для моделирования патологий Aβ и тау-белка и тестирования лекарственных препаратов-кандидатов (Choi et al., 2014; Lee et al., 2016). Raja et al. (2016) разработали метод культивирования без каркасов для создания органоидов головного мозга с использованием ИПСК, полученных от пациентов с семейной БА (ФАД). Эти органоиды могут воспроизводить AD-подобные патологии, включая агрегацию амилоида, гиперфосфорилированный тау-белок и аномалии эндосом.Эти патологии могут зависеть от возраста, что наблюдается в органоидах нескольких пациентов. Кроме того, когда эти органоиды пациентов лечились ингибиторами β- и γ-секретазы, патология Aβ и тау была значительно снижена (Raja et al., 2016). Примечательно, что эти результаты особенно важны, поскольку фенотипы никогда не сообщались на моделях мышей с мутациями FAD. В этом исследовании впервые использовались органоиды человеческого мозга для изучения возрастной нейродегенерации, демонстрируя потенциал органоидов человеческого мозга в повышении переносимости доклинических открытий лекарств при БА.Увеличение p25, протеолитического фрагмента регуляторной субъединицы p35, аберрантно активирует циклин-зависимую киназу 5 (Cdk5), которая, как известно, участвует в нейродегенеративных расстройствах, включая AD. p25 / Cdk5 играет роль в таупатии, поскольку недавнее исследование показало, что блокирование генерации p25 путем замены эндогенного p35 на нерасщепляемый мутант p35 (Deltap35) снижает фосфорилирование тау и его посевную активность в мозге мышей, сверхэкспрессирующих мутантный тау человека (P301S). ) и, таким образом, уменьшили потерю синапсов и нарушение LTP в области CA3 гиппокампа этих мышей (Seo et al., 2017). При проверке роли p25 / Cdk5 в таупатии авторы получили ИПСК от пациента с лобно-височной деменцией с мутацией Tau P301L, сгенерировали изогенные линии ИПСК P301L: Deltap35KI с использованием редактирования генома CRISPR / Cas9, а затем создали церебральные органоиды из изогенных ИПСК. Они обнаружили, что блокада поколения p25 снижает фосфорилирование тау и увеличивает уровень синаптического маркера синаптофизина в органоидах (Seo et al., 2017). Данные демонстрируют, что p25 / Cdk5 опосредует тау-ассоциированную патологию.Модели органоидов человеческого мозга важны для подтверждения результатов, полученных на моделях мышей. Вместе эти исследования показывают, что органоиды человеческого мозга, как мы надеемся, обеспечивают терапевтическую платформу для открытия нейродегенеративных заболеваний.

    Существует множество других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, которые потенциально могут быть изучены с использованием органоидов человеческого мозга. Создание функциональных органоидов, подобных среднему мозгу человека (содержащих дофаминергические нейроны), из человеческих PSC или других нервных стволовых клеток, судьба которых ограничена, предполагает, что органоиды человеческого мозга могут в конечном итоге оказаться ценными для моделирования возрастных неврологических заболеваний, таких как болезнь Паркинсона (Jo et al., 2016; Monzel et al., 2017).

    Хотя не каждый аспект заболевания мозга можно смоделировать с помощью органоидов, более ранние события прогрессирования заболевания, которые с большей вероятностью будут обобщены и изучены, могут иметь общие молекулярные и клеточные механизмы с проявлениями заболевания на более поздних стадиях. Несомненно, необходимы рациональные подходы к фенотипическому профилированию моделей органоидов мозга и оптимизации культур органоидов мозга (рис. 2, 3). Будущие исследования смогут основываться на вышеупомянутых основах для развития методов органоидов головного мозга для моделирования как нейроразвивающих, так и нейродегенеративных заболеваний, а также для выяснения новых аспектов патогенеза заболеваний.

    Рисунок 3 . Стратегии и подходы к оптимизации моделей органоидов человеческого мозга. Для создания следующего поколения моделей органоидов человеческого мозга потребуется сочетание биоматериалов, биоинженерных подходов с улучшенными методами трехмерного культивирования (Kelava and Lancaster, 2016a, b; Qian et al., 2016; Yin et al., 2016; Bagley et al. ., 2017; Lancaster et al., 2017; Paşca, 2018). Хотя стандартизованные протоколы и общие методологии могут быть полезны для исследовательского сообщества, комбинация различных органоидных методов должна быть рационализирована в отдельных исследованиях, чтобы лучше моделировать человеческий мозг.

    Ограничения, проблемы и направления на будущее

    В то время как in vitro органоидов, разработанных без присутствия нормального эмбрионального окружения, обладают преимуществами для визуализации и манипулирования клеточными процессами в тканях, им не хватает сигналов развития и формирования паттерна, которые необходимы для развития органов. Из-за отсутствия окружающих поддерживающих тканей и осей тела органоиды мозга не организуются в ту же форму или структуру, что и мозг in vivo , хотя они действительно развивают отдельные области мозга (Lancaster et al., 2013; Келава и Ланкастер, 2016а). Сигналы формирования осевого паттерна, которые, в свою очередь, влияют на формирование различных областей мозга, могут быть применены к органоидам путем имитации эндогенных сигнальных градиентов развития с использованием контролируемых высвобождающих сигнал шариков или путем культивирования органоидов на каркасах, покрытых сигнальными молекулами (Hartley and Brennand, 2017). ). Кроме того, большинство протоколов в основном зависят от способности стволовых клеток самоорганизовываться в отдельные структуры мозга. Это спонтанное приобретение клеточной идентичности может вызвать несогласованность в производстве желаемых тканей, что приводит к гетерогенности или «пакетным эффектам», которые могут охватывать реальные фенотипы, если разные партии органоидов значительно различаются по качеству и областям мозга, которые они генерируют.В настоящее время существует острая необходимость в гомогенных органоидах мозга для последовательного воспроизведения относительных фенотипов неврологических заболеваний (Quadrato et al., 2016). Поскольку ПСК демонстрируют значительную вариабельность, которая зависит от клеточных линий, пассажей и даже свойств колоний или клеток в колонии, при разработке нового органоида следует учитывать тщательный отбор клеточных линий и методы перепрограммирования в ИПСК и культивирования клеток. протоколы. Между тем, область органоидов выиграет от стандартизованных протоколов и общих методологий в разных лабораториях (Lancaster and Knoblich, 2014b; Kelava and Lancaster, 2016a, b; Prytkova and Brennand, 2017), поскольку будут разработаны и сосуществовать все больше различных протоколов по органоидам, чтобы предоставить варианты. для исследований в зависимости от силы конкретного протокола и вопросов, которые необходимо решить.

    Отсутствие васкуляризации ограничивает поступление кислорода и питательных веществ в органоиды. Развитие мозга, особенно на поздних стадиях, сильно зависит от васкуляризации SVZ, так как близость к кровеносным сосудам необходима для дифференциации нейрональных клеток-предшественников, а также для выживания и созревания нейронов (Kelava and Lancaster, 2016a). Отсутствие васкуляризации, вероятно, является причиной нехватки популяций предшественников и потенциально затрудняет воспроизведение правильного формирования кортикальных пластинок в органоидах головного мозга; он также вызывает некроз в центре органоидов, когда объем органоидов превышает предел перфузии.Эти недостатки сильно ограничивают потенциал развития или созревания, которое может быть смоделировано системой (Джандоменико и Ланкастер, 2017). Чтобы точно смоделировать мозг in vivo , усилия были сосредоточены на доставке кислорода, питательных веществ или сигнальных молекул глубже в органоиды с помощью модификаций культур или инженерных подходов. Одним из вариантов преодоления отсутствия васкуляризации может быть использование биореакторов или микрофлюидики, чтобы помочь управлять потоком среды и распределить питательные вещества между органоидами.Такие методы помогают генерировать более крупные и зрелые органоиды (Kelava and Lancaster, 2016a; Qian et al., 2016). Искусственные ткани можно использовать для имитации сосудистых сетей. Другим вариантом может стать выращивание органоидов непосредственно на микрофлюидном канале с эндотелиальными клетками или носителями сигнальных молекул для облегчения ангиогенеза (Kelava and Lancaster, 2016b; Yin et al., 2016). Примечательно, что комбинация тканеспецифических клеток с мезенхимальными клетками для обеспечения васкуляризации при трансплантации зачатка органа может представлять собой вариант усовершенствования протоколов для создания васкуляризированных органоидов (Takebe et al., 2015). Для дальнейшего преодоления ограничений систем in vitro в недавнем исследовании был разработан метод трансплантации органоидов человеческого мозга в мозг взрослой мыши (Mansour et al., 2018). Привитые органоиды показали прогрессирующую дифференцировку и созревание нейронов, образование и интеграцию глиальных клеток и рост аксонов в головном мозге хозяина. Интересно, что функциональная активность нейронной сети внутри трансплантата и синаптическая связь между трансплантатом и хозяином были сформированы, и в трансплантатах можно было обнаружить кровеносные сосуды (Mansour et al., 2018). Таким образом, это исследование предоставляет модель in vivo функциональных и васкуляризированных органоидов головного мозга. Васкуляризованные органоиды головного мозга станут мощным инструментом для моделирования гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и исследования транспорта лекарств через ГЭБ. Важно отметить, что васкуляризованные органоиды, которые более точно имитируют анатомию и физиологию мозга in vivo , могут облегчить моделирование заболеваний мозга, а также представляют собой идеальную платформу для тестирования лекарств (Kelava and Lancaster, 2016a; Lancaster, 2018).

    Похоже, что большинство современных протоколов по органоидам или составов сред отдают предпочтение клеткам-предшественникам и могут плохо поддерживать образование дендритных шипов и зрелых синапсов для нейронов в органоидах головного мозга. Хотя нейроны в органоидах мозга образуют функциональные синапсы, необходимо сделать гораздо больше, чтобы выяснить условия, наиболее подходящие для создания нейронных цепей и нейрофизиологической активности (Kelava and Lancaster, 2016a). Для улучшения условий в протоколах генерации органоидов необходимо будет рассмотреть вопрос о происхождении и / или интеграции ненейрональных клеток, таких как астроциты, олигодендроциты, микроглия, менингеальные клетки или клетки сосудистой сети.Присутствие астроцитов и олигодендроцитов в церебральных органоидах имеет решающее значение с учетом той роли, которую клетки играют в синаптогенезе, миелинизации, созревании цепи и инициации / прогрессировании заболевания (Qian et al., 2016; Hartley and Brennand, 2017; Micu et al., 2018 ; Paşca, 2018). Микроглия, резидентные клетки врожденного иммунитета ЦНС, активно участвуют в развитии, созревании и гомеостазе нейронов. Из-за того, что микроглия возникла вне ЦНС, микроглия отсутствует в органоидах головного мозга человека, происходящих из PSC, и интеграция микроглии или их предшественников в органоиды будет сложной задачей (Muffat et al., 2016а). Необязательно, происходящие из PSC клетки разных типов могут быть дифференцированы отдельно, а затем интегрированы в органоиды. Эффективная генерация микроглии из человеческих PSCs может указывать на возможность включения микроглии в органоиды мозга во время развития этих органоидов (Muffat et al., 2016b; Pandya et al., 2017). Интересно, что нейронные предшественники, происходящие из ПСК человека, мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные клетки и предшественники микроглии могут быть объединены на химически сконструированных гидрогелях для образования трехмерных нейронных культур с микроглией и сосудистой сетью (Schwartz et al., 2015). Исследование является предварительным, но подтверждает возможность интеграции ненейрональных клеток или тканей в органоиды мозга для улучшения созревания нейронов и формирования цепей. Это особенно важно для исследования дисфункций синапсов и цепей, которые являются признаком многих неврологических заболеваний.

    Обнадеживает тот факт, что биоматериалы и биоинженерия предоставляют ценные инструменты для исследования органоидов мозга путем введения молекулярных, клеточных и структурных особенностей, которые обычно присутствуют в человеческом мозге (Wan, 2016; Yin et al., 2016). Органоиды полагались на самоорганизующиеся свойства клеток млекопитающих или биоинженерных каркасов для организации клеток в органо-подобную конфигурацию (Lancaster and Knoblich, 2014a; Clevers, 2016; Giandomenico and Lancaster, 2017). В то время как самоорганизующиеся органоиды хорошо воспроизводят раннее развитие органов, биоинженерные конструкции могут последовательно создавать желаемую архитектуру тканей. Одно исследование объединило эти два подхода для создания ткани переднего мозга человека с использованием микрофиламентов из сополимерных волокон поли (лактид-гликолид) в качестве плавающего каркаса для получения удлиненных EB, при сохранении самоорганизующейся способности органоидов (Lancaster et al., 2017). Эти сконструированные органоиды головного мозга показывают улучшение как в формировании нейроэктодермы, так и в развитии коры головного мозга. Кроме того, реконструированная базальная мембрана приводит к характерной корковой структуре, включая пространственную организацию поляризованной кортикальной пластинки и радиальных единиц. Таким образом, биоинженерные органоиды мозга воспроизводят характерную архитектуру коры головного мозга и будут полезны для изучения коркового развития, демонстрируя, что сочетание трехмерной культуры с биоинженерией может улучшить организацию тканей и повысить воспроизводимость органоидов мозга (Lancaster et al., 2017). Совершенно необходимо комбинировать биоинженерию с различными подходами к органоидам, чтобы найти идеальную комбинацию методов, которая в конечном итоге могла бы произвести новое поколение органоидов мозга, наиболее точно отражающих человеческий мозг (Koch and Ladewig, 2017; Lancaster et al., 2017; Рисунок 3).

    Дальнейшее совершенствование протоколов органоидов с развитием технологий поможет исследовать более сложные взаимодействия в мозге, такие как взаимодействия нейронов и глии и нейронные схемы.Важно отметить, что это позволит моделировать более широкий спектр неврологических расстройств, включая расстройства развивающегося, взрослого и стареющего мозга, и даже фенотипическое профилирование или терапевтический скрининг на высокопроизводительных уровнях (Kelava and Lancaster, 2016a; Quadrato et al., 2016 ; Ди Лулло, Кригштейн, 2017). Успешное использование органоидов для моделирования заболеваний указывает на потенциал их применения при разработке диагностических и терапевтических подходов или стратегий. С точки зрения персонализированной медицины органоиды мозга, полученные из ИПСК пациентов, вместе с тестированием на наркотики, диагностическими или терапевтическими подходами, представляют собой многообещающее направление для технологии органоидов (Wen et al., 2016; Ди Лулло и Кригштейн, 2017; Хартли и Бреннанд, 2017). После того, как будут установлены надежные протоколы по органоидам головного мозга, можно будет применить ряд методов для исследования нерешенных вопросов, касающихся биологии человеческого мозга, болезней и терапии. В частности, в сочетании с другими подходами молекулярной и клеточной биологии, транскриптомный анализ органоидов мозга в масштабе всего генома с использованием секвенирования одноклеточной РНК (RNA-Seq), который был продемонстрирован как мощный инструмент для анализа клеточного разнообразия и определения траекторий развития различных клеток. типы органоидов головного мозга человека и развивающегося мозга (Camp et al., 2015; Quadrato et al., 2017; Xiang et al., 2017; Zhong et al., 2018), позволяют глубоко охарактеризовать модели органоидов человеческого мозга и исследовать фундаментальные механизмы неврологических заболеваний. Транскриптомное профилирование множества отдельных клеток органоидов головного мозга, полученных от пациентов, также может помочь найти новые биомаркеры и разработать индивидуальную стратегию лечения (Kelava and Lancaster, 2016a; Di Lullo and Kriegstein, 2017; Zhong et al., 2018). С помощью подходов к редактированию генома, таких как CRISPR-Cas9, органоиды головного мозга могут быть созданы, чтобы иметь те же генетические дефекты, что и пациенты, и в дальнейшем применяться для определения функции мутировавших генов.Кроме того, органоиды головного мозга пациента могут быть восстановлены генетически; Восстановленные органоиды могут служить в качестве изогенного контроля и могут иметь потенциал для заместительной терапии (Muffat et al., 2016a; Li Y. et al., 2017; Seo et al., 2017; Wang et al., 2017). С развитием новой автоматизации и других методов биоинженерии, таких как напечатанный на 3D-принтере масштабируемый набор мини-биореакторов под названием SpinΩ или биоинженерные каркасы, которые позволяют воспроизводимое и параллельное производство органоидов, органоиды головного мозга, полученные от пациентов, могут быть выращены на высоком уровне. шкала пропускной способности для тестирования большого набора лекарств и поиска наиболее полезных для пациентов (Kelava and Lancaster, 2016a; Qian et al., 2016; Quadrato et al., 2016; Ланкастер и др., 2017; Рисунки 2, 3).

    Заключение

    Неспособность потенциальных нейротерапевтических средств транслироваться с животных моделей на пациентов подчеркивает необходимость в улучшенных прогностических доклинических моделях (Bradshaw and Porteous, 2012; Hagerman et al., 2014; Wang et al., 2015; Wen et al., 2017). Органоиды головного мозга, полученные от человека, обещают лучшее понимание человеческого мозга и болезней, чем модели на животных, и могут помочь преодолеть разрыв между модельными системами и пациентами (Clevers, 2016; Mason and Price, 2016; Di Lullo and Kriegstein, 2017; Giandomenico and Ланкастер, 2017).Хотя в культуре органоидов мозга достигнуты огромные успехи, очевидно, что технологии органоидов не лишены своих недостатков и ограничений. Кроме того, существуют некоторые этические проблемы, особенно в отношении источников клеток, которые используются для генерации органоидов, и потенциального применения этих органоидов в организме человека (Bredenoord et al., 2017; Giandomenico and Lancaster, 2017; Paşca, 2018). Несмотря на то, что существует еще много проблем, мы можем ожидать, что исследования органоидов могут привести к более глубокому познанию механизмов заболевания и индивидуальному лечению заболеваний мозга в будущем.Будет интересно наблюдать, как далеко могут быть продвинуты современные технологии органоидов мозга. Несомненно, для полной реализации потенциала органоидов мозга для моделирования биологии и болезней человеческого мозга требуется больше усилий со стороны ученых из разных секторов, включая нейробиологию, биологию стволовых клеток, неврологию, биоинженерию и биоматериалы.

    Авторские взносы

    HW задумал, написал и отредактировал рукопись.

    Заявление о конфликте интересов

    Автор заявляет, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Рукопись была подготовлена ​​как вступительная статья по приглашению редакционной группы Frontiers in Synaptic Neuroscience. Эта статья посвящена моей жене Сяоцин Ван за ее любовь и поддержку на протяжении всей моей жизни.

    Список литературы

    Альенде, М.Л., Кук, Э.К., Ларман, Б.С., Ньюджент, А., Брэди, Дж. М., Голебиовски, Д. и др. (2018). Церебральные органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, вызванных болезнью Сандхоффа, обнаруживают нарушение нейродифференцировки. J. Lipid Res. 59, 550–563. DOI: 10.1194 / младший M081323

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Амир Р. Э., Ван ден Вейвер И. Б., Ван М., Тран К. К., Франк У. и Зогби Х. Ю. (1999). Синдром Ретта вызывается мутациями в X-сцепленном MECP2, кодирующем метил-CpG-связывающий белок 2. Nat. Genet. 23, 185–188. DOI: 10.1038 / 13810

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бэгли, Дж. А., Рейман Д., Биан, С., Леви-Стросс, Дж., И Кноблих, Дж. А. (2017). Слитые церебральные органоиды моделируют взаимодействия между областями мозга. Nat. Методы 14, 743–751. DOI: 10.1038 / nmeth.4304

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Берштейн, М., Новаковски, Т. Дж., Пыльца, А. А., Ди Лулло, Э., Нене, А., Виншоу-Борис, А., и др. (2017). Церебральные органоиды, полученные из ИПСК человека, моделируют клеточные особенности лиссэнцефалии и выявляют длительный митоз наружной радиальной глии. Cell Stem Cell 20, 435.e4–449.e4. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.12.007

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бирей, Ф., Андерсен, Дж., Макинсон, К. Д., Ислам, С., Вей, В., Хубер, Н. и др. (2017). Сборка функционально интегрированных сфероидов переднего мозга человека. Природа 545, 54–59. DOI: 10.1038 / природа22330

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бонд, Дж., Робертс, Э., Спрингелл, К., Лизаррага, С.Б., Скотт, С., Хиггинс, Дж. И др. (2005). Центросомный механизм с участием CDK5RAP2 и CENPJ контролирует размер мозга. Nat. Genet. 37, 353–355. DOI: 10.1038 / ng1539

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Брэдшоу, Н. Дж., И Портеус, Д. Дж. (2012). DISC1-связывающие белки в нервном развитии, передаче сигналов и шизофрении. Нейрофармакология 62, 1230–1241. DOI: 10.1016 / j.neuropharm.2010.12.027

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бреденоорд, А.Л., Кливерс, Х., Кноблич, Дж. А. (2017). Человеческие ткани в блюде: исследования и этические последствия органоидной технологии. Наука 355: eaaf9414. DOI: 10.1126 / science.aaf9414

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бухман, Дж. Дж., Ценг, Х. К., Чжоу, Ю., Франк, К. Л., Се, З., и Цай, Л. Х. (2010). Cdk5rap2 взаимодействует с перицентрином, чтобы поддерживать пул нейральных предшественников в развивающемся неокортексе. Нейрон 66, 386–402.DOI: 10.1016 / j.neuron.2010.03.036

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Батлер, М. Г., Дасуки, М. Дж., Чжоу, X. П., Талебизаде, З., Браун, М., Такахаши, Т. Н. и др. (2005). Подгруппа людей с расстройствами аутистического спектра и крайней макроцефалией, связанными с мутациями гена супрессора опухоли PTEN зародышевой линии. J. Med. Genet. 42, 318–321. DOI: 10.1136 / jmg.2004.024646

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кэмп, J.Г., Бадша, Ф., Флорио, М., Кантон, С., Гербер, Т., Вильш-Бройнингер, М. и др. (2015). Органоиды головного мозга человека повторяют программы экспрессии генов развития неокортекса плода. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 112, 15672–15677. DOI: 10.1073 / pnas.1520760112

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кастро Дж., Меллиос Н. и Сур М. (2013). Механизмы и терапевтические проблемы при расстройствах аутистического спектра: выводы из синдрома Ретта. Curr. Opin. Neurol. 26, 154–159. DOI: 10.1097 / WCO.0b013e32835f19a7

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чой, С.Х., Ким, Ю.Х., Хебиш, М., Сливински, К., Ли, С., Д’Аванзо, К., и др. (2014). Трехмерная модель культуры нервных клеток человека болезни Альцгеймера. Природа 515, 274–278. DOI: 10.1038 / природа13800

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кордейро, П., Хехтман, П.и Каплан Ф. (2000). Базы данных ганглиозидозов GM2: аллельные вариации в локусах генов HEXA, HEXB и GM2A. Genet. Med. 2, 319–327. DOI: 10.1097 / 00125817-200011000-00003

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Данг, Дж., Тивари, С. К., Личинчи, Г., Цинь, Ю., Патил, В. С., Ерошкин, А. М., и др. (2016). Вирус Зика истощает нейральные предшественники в органоидах головного мозга человека за счет активации рецептора врожденного иммунитета TLR3. Cell Stem Cell 19, 258–265.DOI: 10.1016 / j.stem.2016.04.014

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Дезонн, Р. С., Сарторе, Р. К., Насименто, Дж. М., Сайя-Середа, В. М., Ромао, Л. Ф., Алвес-Леон, С. В. и др. (2017). Получение функциональных астроцитов человека из церебральных органоидов. Sci. Реп. 7: 45091. DOI: 10.1038 / srep45091

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эйраку, М., Ватанабе, К., Мацуо-Такасаки, М., Кавада, М., Йонемура С., Мацумура М. и др. (2008). Самоорганизованное образование поляризованных корковых тканей из ЭСК и его активное манипулирование внешними сигналами. Cell Stem Cell 3, 519–532. DOI: 10.1016 / j.stem.2008.09.002

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Форсберг, С. Л., Илиева, М., и Мария Мишель, Т. (2018). Эпигенетика и церебральные органоиды: перспективные направления при расстройствах аутистического спектра. Пер. Психиатрия 8:14.DOI: 10.1038 / s41398-017-0062-x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Габриэль Э., Вейсон А., Рамани А., Гуи Л. М., Келлер П., Позняковский А. и др. (2016). CPAP способствует своевременной разборке ресничек для поддержания пула нейральных предшественников. EMBO J. 35, 803–819. DOI: 10.15252 / embj.2015

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гарсес, П. П., Диас-Алонсо, Дж., Креспо-Энрикес, И., Кастро, Д., Белл, Д., и Guillemot, F. (2015). Cenpj / CPAP регулирует деления предшественников и миграцию нейронов в коре головного мозга ниже Ascl1. Nat. Commun. 6: 6474. DOI: 10.1038 / ncomms7474

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гарсес, П. П., Лойола, Э. К., Мадейру да Коста, Р., Хига, Л. М., Триндади, П., Дельвеккио, Р. и др. (2016). Вирус Зика нарушает рост нейросфер человека и органоидов головного мозга. Наука 352, 816–818. DOI: 10.1126 / science.aaf6116

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

    Хагерман, Р. Дж., Дез-Порт, В., Гаспарини, Ф., Жакмонт, С., и Гомес-Мансилла, Б. (2014). Перевод молекулярных достижений в лечении синдрома ломкой Х-хромосомы в терапию: обзор. J. Clin. Психиатрия 75, e294 – e307. DOI: 10.4088 / JCP.13r08714

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Харди Дж. И Селкое Д. Дж. (2002). Амилоидная гипотеза болезни Альцгеймера: прогресс и проблемы на пути к терапии. Наука 297, 353–356. DOI: 10.1126 / science.1072994

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хартли, Б. Дж., И Бреннанд, К. Дж. (2017). Нервные органоиды для фенотипирования заболеваний, скрининга лекарств и исследований биологии развития. Neurochem. Int. 106, 85–93. DOI: 10.1016 / j.neuint.2016.10.004

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ефремова, В., Маникакис, Г., Креффт, О., Джабали, А., Вейнанс, К., Wilkens, R., et al. (2017). Модель коркового развития на основе органоидов выявляет не автономные клетки дефекты передачи сигналов wnt, способствующие развитию синдрома Миллера-Дикера. Cell Rep. 19, 50–59. DOI: 10.1016 / j.celrep.2017.03.047

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Янссенс, С., Шотсарт, М., Карник, Р., Баласубраманиам, В., Дехосес, М., Мейснер, А., и др. (2018). Вирус Зика изменяет метилирование ДНК нервных генов в органоидной модели развивающегося человеческого мозга. mSystems 3: e00219-17. DOI: 10.1128 / msystems.00219-17

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Джо, Дж., Сяо, Ю., Сан, А. X., Чукуроглу, Э., Тран, Х. Д., Гёке, Дж. И др. (2016). Органоиды, подобные среднему мозгу, из плюрипотентных стволовых клеток человека содержат функциональные дофаминергические и нейромеланин-продуцирующие нейроны. Cell Stem Cell 19, 248–257. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.07.005

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кадосима, Т., Сакагути, Х., Накано, Т., Соен, М., Андо, С., Эйраку, М., и др. (2013). Самоорганизация осевой полярности, структуры вывернутого слоя и видоспецифической динамики предшественников в неокортексе, происходящем из ES-клеток человека. Proc. Natl. Акад. Sci. США 110, 20284–20289. DOI: 10.1073 / pnas.1315710110

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Келава И. и Ланкастер М. А. (2016a). Разбивка мини-мозгов: текущий прогресс и будущие перспективы в исследованиях органоидов мозга. Dev. Биол. 420, 199–209. DOI: 10.1016 / j.ydbio.2016.06.037

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Крумм, Н., О’Роак, Б. Дж., Шендуре, Дж., И Эйхлер, Э. Э. (2014). de novo конвергенция генетики аутизма и молекулярной нейробиологии. Trends Neurosci. 37, 95–105. DOI: 10.1016 / j.tins.2013.11.005

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ланкастер, М.А., Корсини, Н.С., Wolfinger, S., Gustafson, E.H., Phillips, A.W., Burkard, T.R., et al. (2017). Управляемая самоорганизация и формирование корковой пластинки органоидов головного мозга человека. Nat. Biotechnol. 35, 659–666. DOI: 10.1038 / NBT.3906

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ланкастер, М.А., Кноблих, Дж. А. (2014a). Органогенез в блюде: моделирование развития и заболевания с помощью органоидных технологий. Наука 345: 1247125. DOI: 10.1126 / наука.1247125

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ланкастер, М. А., Реннер, М., Мартин, К. А., Венцель, Д., Бикнелл, Л. С., Херлз, М. Е. и др. (2013). Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Природа 501, 373–379. DOI: 10.1038 / природа12517

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, К. Т., Чен, Дж., Хаяши, Т., Цай, С. Ю., Санчес, Дж. Ф., Эррико, С. Л. и др. (2008).Механизм подавления кокаином пролиферации нервных клеток-предшественников. PLoS Med. 5: e117. DOI: 10.1371 / journal.pmed.0050117

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, К. Т., Чен, Дж., Киндберг, А. А., Бендрим, Р. М., Спивак, К. Э., Уильямс, М. П. и др. (2017). CYP3A5 опосредует эффекты кокаина на неокортикогенез человека: исследования с использованием in vitro 3D самоорганизующейся модели hPSC с одной кортикальной единицей. Нейропсихофармакология 42, 774–784.DOI: 10.1038 / npp.2016.156

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, К. Т., Чен, Дж., Уорден, Л. Т., и Фрид, В. Дж. (2011). Кокаин вызывает дефицит радиальной миграции и изменяет распределение глутамата и ГАМК нейронов в развивающейся коре головного мозга крысы. Synapse 65, 21–34. DOI: 10.1002 / syn.20814

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, Дж. Х., Хюин, М., Силхави, Дж. Л., Ким, С., Диксон-Салазар, Т., Heiberg, A., et al. (2012). De novo соматические мутации в компонентах пути PI3K-AKT3-mTOR вызывают гемимегалэнцефалию. Nat. Genet. 44, 941–945. DOI: 10,1038 / нг.2329

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, Х. К., Веласкес Санчес, К., Чен, М., Морин, П. Дж., Уэллс, Дж. М., Хэнлон, Э. Б. и др. (2016). Трехмерная нейросфероидная модель болезни Альцгеймера человека на основе дифференцированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. PLoS One 11: e0163072. DOI: 10.1371 / journal.pone.0163072

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли Ю., Маффат Дж., Омер А., Бош И., Ланкастер М. А., Сур М. и др. (2017). Индукция расширения и складывания органоидов головного мозга человека. Cell Stem Cell 20, 385.e3–396.e3. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.11.017

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, Р., Сунь, Л., Фанг, А., Ли, П., Ву, К., и Ван, X. (2017). Повторение развития коры с помощью органоидной культуры in vitro и моделирование аномальной веретенообразной (первичной, связанной с ASPM) болезни микроцефалии. Protein Cell 8, 823–833. DOI: 10.1007 / s13238-017-0479-2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Liang, Q., Luo, Z., Zeng, J., Chen, W., Foo, S. S., Lee, S.A., et al. (2016). Белки NS4A и NS4B вируса Зика нарушают регуляцию передачи сигналов Akt-mTOR в нервных стволовых клетках плода человека, подавляя нейрогенез и вызывая аутофагию. Cell Stem Cell 19, 663–671. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.07.019

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Липина Т.В., Родер Дж. К. (2014). Нарушенный-в-шизофрении-1 (DISC1) интерактом и психические расстройства: влияние мышиных моделей. Neurosci. Biobehav. Ред. 45, 271–294. DOI: 10.1016 / j.neubiorev.2014.07.001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Луо, К., Ланкастер, М.А., Кастанон, Р., Нери, Дж. Р., Кноблич, Дж. А., и Эккер, Дж. Р. (2016). Церебральные органоиды воспроизводят эпигеномные сигнатуры головного мозга человека. Cell Rep. 17, 3369–3384. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.12.001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мансур, А.А., Гонсалвес, Дж. Т., Блойд, К. У., Ли, Х., Фернандес, С., Куанг, Д., и др. (2018). Модель in vivo функциональных и васкуляризированных органоидов головного мозга человека. Nat. Biotechnol. 36, 432–441.DOI: 10.1038 / NBT.4127

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Марчезе М., Конти В., Валво Г., Моро Ф., Муратори Ф., Танкреди Р. и др. (2014). Фенотип аутизма-эпилепсии с макроцефалией предполагает генетический скрининг с помощью PTEN, но не GLIALCAM. BMC Med. Genet. 15:26. DOI: 10.1186 / 1471-2350-15-26

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мариани Дж., Коппола Г., Чжан П., Абызов А., Провини Л., Tomasini, L., et al. (2015). FOXG1-зависимая дисрегуляция дифференцировки ГАМК / глутаматных нейронов при расстройствах аутистического спектра. Ячейка 162, 375–390. DOI: 10.1016 / j.cell.2015.06.034

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мейсон, Дж. О., и Прайс, Д. Дж. (2016). Создание мозга в чашке: перспективы выращивания церебральных органоидов из стволовых клеток. Неврология 334, 105–118. DOI: 10.1016 / j.neuroscience.2016.07.048

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Матарезе, К.А., и Рено, Д. Л. (2009). Классическая (тип I) лиссэнцефалия и синдром Миллера-Дикера. Pediatr. Neurol. 40, 324–325. DOI: 10.1016 / j.pediatrneurol.2008.11.008

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

    Маккарти, С. Е., Гиллис, Дж., Крамер, М., Лихм, Дж., Юн, С., Берштейн, Ю. и др. (2014). De novo Мутации при шизофрении связаны с ремоделированием хроматина и поддерживают генетическое совпадение с аутизмом и умственной отсталостью. Мол. Психиатрия 19, 652–658.DOI: 10.1038 / mp.2014.29

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Макинтайр, Р. Э., Лакшминарасимхан Чавали, П., Исмаил, О., Каррагер, Д. М., Санчес-Андраде, Г., Формент, Дж. В. и др. (2012). Нарушение мышиного Cenpj, регулятора биогенеза центриолей, фенокопия, синдром Секкеля. PLoS Genet. 8: e1003022. DOI: 10.1371 / journal.pgen.1003022

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Меертенс, Л., Лабо, А., Dejarnac, O., Cipriani, S., Sinigaglia, L., Bonnet-Madin, L., et al. (2017). Axl опосредует проникновение вируса ZIKA в глиальные клетки человека и модулирует врожденные иммунные ответы. Cell Rep. 18, 324–333. DOI: 10.1016 / j.celrep.2016.12.045

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Меллиос, Н., Фельдман, Д. А., Шеридан, С. Д., Ип, Дж. П. К., Квок, С., Амоа, С. К. и др. (2018a). Органоиды головного мозга человека обнаруживают дефицит нейрогенеза и миграции нейронов в нейронных предшественниках, дефицитных по MeCP2. Мол. Психиатрия 23: 791. DOI: 10.1038 / mp.2018.5

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Меллиос, Н., Фельдман, Д. А., Шеридан, С. Д., Ип, Дж. П. К., Квок, С., Амоа, С. К. и др. (2018b). Регулируемые MeCP2 miRNA контролируют ранний нейрогенез человека посредством различных эффектов на передачу сигналов ERK и AKT. Мол. Психиатрия 23, 1051–1065. DOI: 10.1038 / mp.2017.86

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мику, И., Племель, Дж. Р., Капрариелло, А. В., Нейв, К. А., и Стис, П. К. (2018). Аксомиелиновая нейротрансмиссия: новый способ передачи сигналов в центральной нервной системе. Nat. Rev. Neurosci. 19, 49–58. DOI: 10.1038 / номер 2017.128

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мин, Г. Л., Тан, Х., Сонг, Х. (2016). Достижения в исследованиях вируса Зика: модели стволовых клеток, проблемы и возможности. Cell Stem Cell 19, 690–702. DOI: 10.1016 / j.стержень.2016.11.014

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мирзаа, Г. М., Ривьер, Дж. Б., и Добинс, В. Б. (2013). Синдромы мегалэнцефалии и активирующие мутации в пути PI3K-AKT: MPPH и MCAP. г. J. Med. Genet. C Семин. Med. Genet. 163C, 122–130. DOI: 10.1002 / ajmg.c.31361

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Монцель, А.С., Смитс, Л.М., Хеммер, К., Хачи, С., Морено, Э.Л., ван Вуэллен, Т., и другие. (2017). Получение органоидов среднего мозга человека из нейроэпителиальных стволовых клеток. Stem Cell Reports 8, 1144–1154. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2017.03.010

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Muffat, J., Li, Y., and Jaenisch, R. (2016a). Модели заболеваний ЦНС с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека в эпоху CRISPR. Curr. Opin. Cell Biol. 43, 96–103. DOI: 10.1016 / j.ceb.2016.10.001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Muffat, J., Ли, Ю., Юань, Б., Миталипова, М., Омер, А., Коркоран, С., и др. (2016b). Эффективное получение микроглиеподобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека. Nat. Med. 22, 1358–1367. DOI: 10,1038 / нм 4189

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мугурума К., Нишияма А., Каваками Х., Хашимото К. и Сасай Ю. (2015). Самоорганизация поляризованной ткани мозжечка в 3D-культуре плюрипотентных стволовых клеток человека. Cell Rep. 10, 537–550.DOI: 10.1016 / j.celrep.2014.12.051

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Маллинз К., Фишелл Г. и Цзянь Р. У. (2016). Объединение взглядов на расстройства аутистического спектра: рассмотрение петель авторегуляторной обратной связи. Neuron 89, 1131–1156. DOI: 10.1016 / j.neuron.2016.02.017

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Нагамани, С. К., Чжан, Ф., Щелочков, О. А., Би, В., Оу, З., Скаглиа, Ф., и др.(2009). Микроделеции, включая YWHAE, в области синдрома Миллера-Дикера на хромосоме 17p13.3 приводят к лицевому дисморфизму, ограничению роста и когнитивным нарушениям. J. Med. Genet. 46, 825–833. DOI: 10.1136 / jmg.2009.067637

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Нараян, С., Накадзима, К., Сава, А. (2013). DISC1: ключевое направление в изучении развития коры головного мозга и связанных с ним заболеваний головного мозга. Невролог 19, 451–464.DOI: 10.1177 / 1073858412470168

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Наср Б., Чаттертон Р., Йонг, Дж. Х. М., Джамшиди, П., Д’Абако, Г. М., Бьоркстен, А. Р. и др. (2018). Самоорганизующийся наноструктурный модифицированный микроэлектрод для чувствительного электрохимического обнаружения глутамата в органоидах головного мозга, полученных из стволовых клеток. Биосенсоры 8: E14. DOI: 10.3390 / bios8010014

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Новаковский, Т.Дж., Пыльца, А. А., Ди Лулло, Э., Сандовал-Эспиноза, К., Берштейн, М., и Кригштейн, А. Р. (2016). Анализ экспрессии подчеркивает, что AXL является кандидатом рецептора проникновения вируса Зика в нервные стволовые клетки. Cell Stem Cell 18, 591–596. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.03.012

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Отани Т., Маркетто М. К., Гейдж Ф. Х., Саймонс Б. Д. и Ливси Ф. Дж. (2016). 2D и 3D модели стволовых клеток коркового развития приматов выявляют видоспецифические различия в поведении предков, влияющих на размер мозга. Cell Stem Cell 18, 467–480. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.03.003

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Пандья, Х., Шен, М. Дж., Итикава, Д. М., Седлок, А. Б., Чой, Ю., Джонсон, К. Р. и др. (2017). Дифференциация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и мыши до микроглиеподобных клеток. Nat. Neurosci. 20, 753–759. DOI: 10.1038 / nn.4534

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Paşca, A.М., Слоан, С. А., Кларк, Л. Е., Тиан, Ю., Макинсон, К. Д., Хубер, Н. и др. (2015). Функциональные нейроны коры и астроциты из плюрипотентных стволовых клеток человека в 3D-культуре. Nat. Методы 12, 671–678. DOI: 10.1038 / nmeth.3415

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Портеус Д. Дж., Миллар Дж. К., Брэндон Н. Дж. И Сава А. (2011). DISC1 в 10: соединение психиатрической генетики и нейробиологии. Trends Mol. Med. 17, 699–706.DOI: 10.1016 / j.molmed.2011.09.002

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Приткова И., Бреннанд К. Дж. (2017). Перспективы моделирования аномальной нейрональной функции при шизофрении с использованием индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Фронт. Клетка. Neurosci. 11: 360. DOI: 10.3389 / fncel.2017.00360

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

    Цянь, X., Джейкоб, Ф., Сонг, М. М., Нгуен, Х. Н., Сонг, Х. и Мин, Г. Л. (2018). Генерация органоидов, специфичных для области человеческого мозга, с использованием миниатюрного вращающегося биореактора. Nat. Protoc. 13, 565–580. DOI: 10.1038 / nprot.2017.152

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Цянь, X., Нгуен, Х. Н., Джейкоб, Ф., Сонг, Х., и Мин, Г. Л. (2017). Использование органоидов мозга для понимания микроцефалии, вызванной вирусом Зика. Развитие 144, 952–957. DOI: 10.1242 / dev.140707

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Цянь, X., Нгуен, Х. Н., Сонг, М. М., Хадионо, К., Огден, С. К., Hammack, C., et al. (2016). Органоиды, специфичные для области мозга, с использованием мини-биореакторов для моделирования воздействия ZIKV. Cell 165, 1238–1254. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.04.032

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Квадрато, Дж., Браун, Дж., И Арлотта, П. (2016). Перспективы и проблемы органоидов головного мозга человека как модели нервно-психического заболевания. Nat. Med. 22, 1220–1228. DOI: 10,1038 / нм.4214

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Quadrato, G., Нгуен, Т., Макоско, Э.З., Шервуд, Дж. Л., Мин Янг, С., Бергер, Д. Р. и др. (2017). Разнообразие клеток и сетевая динамика в светочувствительных органоидах головного мозга человека. Природа 545, 48–53. DOI: 10.1038 / nature22047

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Raja, W. K., Mungenast, A. E., Lin, Y. T., Ko, T., Abdurrob, F., Seo, J., et al. (2016). Самоорганизующаяся трехмерная нервная ткань человека, полученная из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, воспроизводит фенотипы болезни Альцгеймера. PLoS One 11: e0161969. DOI: 10.1371 / journal.pone.0161969

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Реннер, М., Ланкастер, М.А., Биан, С., Чой, Х., Ку, Т., Пир, А. и др. (2017). Самоорганизованное формирование паттернов развития и дифференциация церебральных органоидов. EMBO J. 36, 1316–1329. DOI: 10.15252 / embj.201694700

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Реталлак, Х., Ди Лулло, Э., Ариас, К., Кнопп К. А., Лори М. Т., Сандовал-Эспиноза К. и др. (2016). Тропизм клеток вируса Зика в развивающемся мозге человека и ингибирование азитромицином. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 113, 14408–14413. DOI: 10.1073 / pnas.1618029113

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Рубенштейн, Дж. Л. (2010). Три гипотезы о дефектах развития, которые могут лежать в основе некоторых форм расстройства аутистического спектра. Curr. Opin. Neurol. 23, 118–123.DOI: 10.1097 / WCO.0b013e328336eb13

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сакагучи, Х., Кадосима, Т., Соен, М., Нари, Н., Исида, Ю., Огуши, М., и др. (2015). Генерация функциональных нейронов гиппокампа из самоорганизующихся человеческих эмбриональных стволовых клеток, полученных из дорсомедиальной телэнцефальной ткани. Nat. Commun. 6: 8896. DOI: 10.1038 / ncomms9896

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шварц, М. П., Hou, Z., Propson, N.E., Zhang, J., Engstrom, C.J., Santos Costa, V., et al. (2015). Нейронные конструкции, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, для прогнозирования нервной токсичности. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 112, 12516–12521. DOI: 10.1073 / pnas.1516645112

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Seo, J., Kritskiy, O., Watson, L.A., Barker, S.J., Dey, D., Raja, W.K., et al. (2017). Ингибирование p25 / Cdk5 ослабляет таупатию у мышей и моделей лобно-височной деменции на мышах и ИПСК. J. Neurosci. 37, 9917–9924. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.0621-17.2017

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ши Ю., Иноуэ Х., Ву Дж. К. и Яманака С. (2017). Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток: десятилетие прогресса. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115–130. DOI: 10.1038 / nrd.2016.245

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Слоун, С.А., Дарманис, С., Хубер, Н., Хан, Т.А., Бирей, Ф., Caneda, C., et al. (2017). Созревание астроцитов человека зафиксировано в трехмерных сфероидах коры головного мозга, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Neuron 95, 779.e6–790.e6. DOI: 10.1016 / j.neuron.2017.07.035

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сатклифф М. и Ланкастер М. А. (2017). Простой метод создания трехмерных органоидов мозга с использованием стандартного лабораторного оборудования. Methods Mol. Биол. doi: 10.1007 / 7651_2017_2 [Epub перед печатью].

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Szulwach, K. E., Li, X., Smrt, R. D., Li, Y., Luo, Y., Lin, L., et al. (2010). Перекрестный разговор между микроРНК и эпигенетической регуляцией в нейрогенезе у взрослых. J. Cell Biol. 189, 127–141. DOI: 10.1083 / jcb.200

    1

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Такахаши К. и Яманака С. (2006). Индукция плюрипотентных стволовых клеток из культур эмбриональных и взрослых фибробластов мыши с помощью определенных факторов. Cell 126, 663–676. DOI: 10.1016 / j.cell.2006.07.024

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Takebe, T., Enomura, M., Yoshizawa, E., Kimura, M., Koike, H., Ueno, Y., et al. (2015). Васкуляризованные и сложные зачатки органов из различных тканей посредством конденсации, управляемой мезенхимальными клетками. Cell Stem Cell 16, 556–565. DOI: 10.1016 / j.stem.2015.03.004

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    ван дер Зее, Дж., Слегерс, К., и Ван Брокховен, К. (2008). Приглашенная статья: болезнь Альцгеймера — лобно-височная долевая дегенерация. Неврология 71, 1191–1197. DOI: 10.1212 / 01.wnl.0000327523.52537.86

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ван, А.С.А. (2016). Повторение межклеточных взаимодействий для построения органоидов — можно ли обойтись без биоматериалов? Trends Biotechnol. 34, 711–721. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2016.02.015

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ван, П., Mokhtari, R., Pedrosa, E., Kirschenbaum, M., Bayrak, C., Zheng, D., et al. (2017). CRISPR / Cas9-опосредованный гетерозиготный нокаут гена аутизма CHD8 и характеристика его транскрипционных сетей в церебральных органоидах, полученных из iPS-клеток. Мол. Аутизм 8:11. DOI: 10.1186 / s13229-017-0124-1

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ван Х., Пати С., Поццо-Миллер Л. и Деринг Л. К. (2015). Целенаправленное фармакологическое лечение расстройств аутистического спектра: синдром ломкой Х-хромосомы и синдром Ретта. Фронт. Клетка. Neurosci. 9:55. DOI: 10.3389 / fncel.2015.00055

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ватанабе, М., Бут, Дж. Э., Вишлаги, Н., де ла Торре-Убьета, Л., Таксидис, Дж., Кхах, Б. С. и др. (2017). Самоорганизующиеся церебральные органоиды со специфическими особенностями человека позволяют предположить, что эффективные препараты для борьбы с инфекцией вируса Зика. Cell Rep. 21, 517–532. DOI: 10.1016 / j.celrep.2017.09.047

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Уэллс, м.Ф., Салик, М. Р., Вискоу, О., Хо, Д. Дж., Уоррингер, К. А., Ихри, Р. Дж. И др. (2016). Генетическое удаление AXL не защищает человеческие нейральные клетки-предшественники и церебральные органоиды от инфекции вирусом Зика. Cell Stem Cell 19, 703–708. DOI: 10.1016 / j.stem.2016.11.011

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Вэнь, З., Кристиан, К. М., Сонг, Х., Мин, Г. Л. (2016). Моделирование психических расстройств с помощью ИПСК пациента. Curr. Opin.Neurobiol. 36, 118–127. DOI: 10.1016 / j.conb.2015.11.003

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Уайт, М. К., Воллебо, Х. С., Дэвид Бекхэм, Дж., Тайлер, К. Л., и Халили, К. (2016). Вирус Зика: новый невропатологический агент. Ann. Neurol. 80, 479–489. DOI: 10.1002 / ana.24748

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Wu, H., Tao, J., Chen, P.J., Shahab, A., Ge, W., Hart, R.P., et al.(2010). Полногеномный анализ выявляет зависимую от метил-CpG-связывающего белка 2 регуляцию микроРНК на мышиной модели синдрома Ретта. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 107, 18161–18166. DOI: 10.1073 / pnas.1005595107

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Xiang, Y., Tanaka, Y., Patterson, B., Kang, Y.J., Govindaiah, G., Roselaar, N., et al. (2017). Слияние органоидов, происходящих из локально определенных hpsc, моделирует развитие человеческого мозга и миграцию интернейронов. Cell Stem Cell 21, 383.e7–398.e7. DOI: 10.1016 / j.stem.2017.07.007

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ye, F., Kang, E., Yu, C., Qian, X., Jacob, F., Mao, M., et al. (2017). DISC1 регулирует нейрогенез посредством модуляции прикрепления кинетохор Ndel1 / Nde1 во время митоза. Нейрон 96: 1204. DOI: 10.1016 / j.neuron.2017.11.034

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Инь, X., Мид, Б. Э., Сафеи, Х., Лангер, Р., Карп, Дж. М., и Леви, О. (2016). Конструирование органоидов стволовых клеток. Cell Stem Cell 18, 25–38. DOI: 10.1016 / j.stem.2015.12.005

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Юн, К. Дж., Сон, Г., Цянь, X., Пан, Дж., Сюй, Д., Ро, Х. С. и др. (2017). NS2A, кодируемый вирусом Зика, нарушает нейрогенез коры головного мозга млекопитающих, разрушая белки слипчивых соединений. Cell Stem Cell 21, 349.e6–358.e6. DOI: 10.1016 / j.stem.2017.07.014

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Yu, J., Vodyanik, M.A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J.L., Tian, ​​S., et al. (2007). Индуцированные линии плюрипотентных стволовых клеток, полученные из соматических клеток человека. Наука 318, 1917–1920. DOI: 10.1126 / science.1151526

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чжун, С., Чжан, С., Фань, X., Ву, К., Янь, Л., Донг, Дж. И др. (2018). Одноклеточный РНК-seq обзор ландшафта развития префронтальной коры головного мозга человека. Природа 555, 524–528. DOI: 10.1038 / природа25980

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Zhou, T., Tan, L., Cederquist, G.Y., Fan, Y., Hartley, B.J., Mukherjee, S., et al. (2017). Скрининг с высоким содержанием нейральных предшественников hPSC выявляет лекарственные препараты-кандидаты, которые ингибируют инфицирование вирусом Зика в органоидах, подобных плоду, и в мозге взрослого человека. Cell Stem Cell 21, 274.e5–283.e5. DOI: 10.1016 / j.stem.2017.06.017

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Стратификация младенцев с муковисцидозом по степени тяжести заболевания с использованием набухания органоидов кишечника в качестве биомаркера функции CFTR

    Реферат

    Отек органоидов кишечника, индуцированный форсколином (FIS), у лиц с муковисцидозом (CF) измеряет функцию трансмембранной проводимости муковисцидоза регулятор (CFTR), белок, мутировавший в CF.

    Мы исследовали, соответствует ли FIS параметрам клинического исхода и биомаркерам функции CFTR у 34 детей с диагнозом CF. Взаимосвязь с FIS изучалась на предмет выявления заболеваний легких и желудочно-кишечного тракта.

    Дети с низким уровнем FIS имели более высокий уровень иммунореактивного трипсиногена (p = 0,030) и белка, ассоциированного с панкреатитом (p = 0,039), чаще имели недостаточность поджелудочной железы (p <0,001), имели больше отклонений при компьютерной томографии грудной клетки (p = 0,049). ) и имел более низкие z-баллы для максимального потока выдоха при функциональной остаточной емкости (p = 0.033) по сравнению с детьми с высокими значениями FIS. FIS достоверно коррелировал с концентрацией хлорида пота (SCC) и измерением кишечного тока (ICM) (r = -0,82 и r = 0,70, соответственно; оба p <0,001). Индивидуальная оценка SCC, ICM и FIS показала, что FIS может помочь классифицировать индивидуальную тяжесть заболевания.

    Таким образом, стратификация с помощью FIS выявила подгруппы, которые различались по параметрам легочного и желудочно-кишечного тракта. FIS кишечных органоидов хорошо коррелировал с установленными CFTR-зависимыми биомаркерами, такими как SCC и ICM, и адекватно выполнялся на групповом и индивидуальном уровне в этом проверочном исследовании.

    Abstract

    Мини-кишки, выращенные в лаборатории, информируют об индивидуальных характеристиках заболевания младенцев с муковисцидозом http://ow.ly/J19W30ldzTH

    Введение

    Тесты in vitro с использованием культур устойчивых живых тканей пациентов из биобанки могут предоставить удобную для пациента и экономичную альтернативу тестированию in vivo в клинических условиях. Наша идентификация LGR5 (рецептор 5, связанный с G-белком, содержащий богатые лейцином повторы) в качестве маркера стволовых клеток привела к созданию культур органоидов на основе стволовых клеток и хранению такой ткани в живых биобанках [1–4 ].Значение этих ресурсов для индивидуальной клинической помощи остается неясным, поскольку прямые исследования, сравнивающие in vitro результатов таких культур, полученных из стволовых клеток, с индивидуальными клиническими характеристиками отсутствуют.

    Здесь мы изучали, можно ли использовать культуры органоидов кишечника для получения информации об индивидуальных характеристиках заболевания людей с муковисцидозом (МВ), моногенетическим сокращающим продолжительность жизни редким заболеванием, вызванным мутациями гена трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза ( CFTR ). [5–7].Органоиды кишечника — это , культивируемые in vitro, , многоклеточные трехмерные эпителиальные структуры, которые имитируют in vivo кишечного эпителия, включая самообновление стволовых клеток, дифференцировку нескольких линий и полярность клеток, и могут храниться в живом биобанке [2 , 8]. Недавно мы разработали тест с использованием кишечных органоидов для количественной оценки функции CFTR [9]. Белок CFTR функционирует как анионный канал на многих поверхностях слизистых оболочек и является важным регулятором ионного и жидкостного гомеостаза [10].Активация CFTR форсколином вызывает секрецию люминальной жидкости и быстрое набухание органоидов, которое отсутствует или сильно снижено в органоидах у субъектов с CF. Текущие данные показывают, что форсколин-индуцированный отек (FIS) является CFTR-зависимым считыванием и позволяет быстрое, надежное и точное типирование остаточной функции CFTR in vitro , как было продемонстрировано ранее [9, 11].

    CF представляет собой прогрессирующую полиорганную дисфункцию, характеризующуюся накоплением вязкой слизи в легочных и желудочно-кишечных трактах, что приводит к бактериальным инфекциям, хроническим воспалениям и недоеданию.Между субъектами с МВ существует высокая степень вариабельности дисфункции органов и выживаемости, что может быть вызвано вариациями самого гена CFTR , поскольку в базе данных мутаций кистозного фиброза (www .genet) было зарегистрировано более 2000 вариантов CFTR . .sickkids.on.ca / cftr / app), а также дополнительными генетическими факторами и факторами окружающей среды [12]. Следовательно, врачи сталкиваются с большими трудностями при прогнозировании клинического течения отдельного пациента на основе генотипа CFTR, особенно для субъектов, несущих редкие варианты CFTR [13].Проект «Клиническая и функциональная трактовка CFTR2» (www.CFTR2.org) направлен на предоставление функциональной и клинической информации о мутациях CFTR.

    Отдельные биомаркеры функции CFTR играют важную роль в диагностике CF или других заболеваний, связанных с CFTR [14]. In vivo измерения концентрации хлорида пота (SCC) и измерение кишечного тока (ICM) на ex vivo ректальных биоптатах являются установленными диагностическими биомаркерами функции CFTR. Эти биомаркеры были подтверждены в клинических исследованиях, что привело к установлению пороговых значений для диагностики МВ и классификации тяжести заболевания.Эти исследования продемонстрировали, что остаточная функция CFTR ассоциируется с генотипом CFTR и тяжестью заболевания на групповом уровне [13, 15–25]. Однако эти биомаркеры также связаны со значительной технической и не зависящей от CFTR биологической вариабельностью, которая может ограничивать их способность точно оценивать индивидуальную функцию CFTR и, следовательно, может снижать их способность индивидуально информировать о тяжести заболевания [20, 26–28].

    FIS предлагает чувствительное и точное определение индивидуальной функции CFTR, а также смещение, зависящее от культуры, и до сих пор никогда не оценивалось в контексте клинической картины CFTR.Целью этого исследования было определить взаимосвязь между FIS в органоидах кишечника и параметрами клинического исхода в когорте последовательно впервые диагностированных младенцев с CF. Мы также сравнили, как FIS органоидов коррелирует с SCC и ICM и как они влияют на параметры клинического исхода на индивидуальном уровне.

    Материалы и методы

    Младенцы с МВ, выявленные при скрининге новорожденных и проходящие лечение в клиниках МВ при Университетском медицинском центре Утрехта или Медицинском центре Эразмус в Роттердаме (оба находятся в Нидерландах), участвовали в стандартизированном протоколе мониторинга, адаптированном из протокола Австралийская группа респираторного раннего надзора за кистозным фиброзом (AREST-CF) [29, 30].Голландский протокол скрининга новорожденных на МВ включает измерение иммунореактивного трипсиногена (IRT) и белка, связанного с панкреатитом (PAP), в крови укола пятки [31]. Протокол мониторинга включает тест SCC и генотипирование CFTR после рождения, а также посев на бактериальные дыхательные пути при каждом регулярном амбулаторном посещении. В возрасте 1 года пациенты прошли общую анестезию для компьютерной томографии грудной клетки (КТ), бронхоскопию с забором жидкости из бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и ректальную аспирационную биопсию для ICM и органоидных культур.Пациенты из Роттердама также провели тестирование функции легких у младенцев (ILFT). Подробное описание протокола мониторинга см. В дополнительном материале S1. Комитеты по этике Университетского медицинского центра Утрехта и медицинского центра Эразмус в Роттердаме одобрили использование остаточного материала ректальной биопсии для культивирования органоидов и использования клинических данных. Информированное согласие было получено от всех родителей и опекунов участвующих субъектов.

    Измерения SCC проводились в соответствии со стандартной операционной процедурой Европейской сети клинических испытаний общества по муковисцидозу (ECFS-CTN), и Утрехт и Роттердам являются сертифицированными центрами для проведения тестов на пот [18, 32].ILFT, КТ грудной клетки, бронхоскопия и БАЛ выполнялись в соответствии со стандартными процедурами [33–35]. Для ILFT использовались измерения форсированного выдоха с использованием техники быстрой торако-абдоминальной компрессии и техники принудительного выдувания. Процедуры КТ см. В дополнительном материале S2. Тяжесть заболевания дыхательных путей (% заболевания) оценивалась в случайном порядке без учета идентификаторов пациентов с использованием метода оценки КТ с аннотированной сеткой Перта – Роттердама для оценки CF (PRAGMA-CF). Процент заболевания отражает процент от общего объема легких, показывающий бронхоэктазы, утолщение бронхов или закупорку слизью [36].Бронхоскопия проводилась под общим наркозом. БАЛ проводился с тремя аликвотами 1 мл · кг -1 0,9% NaCl каждая в правой средней доле и одной аликвотой в наиболее пораженной доле. ICM при ректальной биопсии выполняли с использованием стандартизированного протокола [19, 37] (подробное описание см. В дополнительном материале S3). Для анализа использовали совокупный ответ на карбахол, форсколин и гистамин.

    Методы получения кишечных органоидов и измерения FIS были немного адаптированы из протоколов, описанных ранее [9, 11, 38].Дополнительная информация об этих методах представлена ​​в дополнительном материале S4.

    Различные аналитики выполнили потовые тесты, тесты ICM и FIS, а аналитики были не в курсе результатов других биомаркеров функции CFTR и наблюдений in vivo .

    Клинические данные были собраны из файлов пациентов ретроспективно с первого года жизни, начиная с момента постановки диагноза путем скрининга новорожденных.

    Статистический анализ

    Во-первых, описательная статистика клинических параметров была использована для описания исследуемой популяции.Затем мы оценили, можно ли разделить исследуемую популяцию на отдельные субпопуляции на основе результатов FIS по концентрациям форсколина. Для этого результаты FIS были преобразованы для получения стандартных нормальных распределений, а затем использовалась агломеративная иерархическая кластеризация Уорда с евклидовым расстоянием. Мы определили количество кластеров, очевидно присутствующих в данных, на основе большинства голосов 30 различных кластерных индексов [39], а затем оценили, могут ли результаты FIS при одной концентрации форсколина идентифицировать результирующие кластеры пациентов FIS.

    Затем мы сравнили клинические параметры между идентифицированными кластерами пациентов FIS, отчетными медианами и межквартильным размахом и выполнили U-тесты Манна – Уитни для ненормально распределенных непрерывных данных, средних значений и стандартного отклонения и выполнили t-тесты для нормально распределенных непрерывных данных. а также числа и проценты с точными тестами Фишера для категориальных данных. Аналогичным образом сравнивались клинические параметры между группами пациентов в соответствии с SCC и установленными пороговыми значениями этого биомаркера.

    Мы также напрямую сравнили непрерывные результаты FIS с непрерывными результатами SCC и ICM, используя диаграммы рассеяния, оценивая коэффициент корреляции Пирсона и используя линейную регрессию.

    R 3.2.1 для Mac (R Project; www.r-project.org) использовался для всех анализов, и p-значения были представлены на основе двусторонних тестов.

    Результаты

    С мая 2011 г. по январь 2015 г. было зарегистрировано 34 новорожденных. В таблице 1 представлены клинические характеристики исследуемой популяции в течение первого года жизни.ICM были доступны от субъектов из Роттердама (n = 23), но не могли быть определены для пациентов из Утрехта по техническим причинам. Значения всех доступных и технически надежных ответов ICM показаны в дополнительном материале S5.

    ТАБЛИЦА 1

    Клинические характеристики исследуемой популяции в возрасте 1 года

    Форсколин дозозависимо индуцировал набухание органоидов в зависимости от пациента и генотипа CFTR (рисунки 1 и 2). В общей сложности мы измерили 1552 точки данных и подвергли цензуре девять точек, поскольку они были квалифицированы как экстремальные выбросы (разница> 6 sd от среднего экспериментальных повторов).Только концентрации форсколина ≥0,128 мкМ вызывали заметное набухание органоидов, которое было наибольшим при 5 мкМ. Кластерный анализ, основанный на значениях FIS для всех концентраций форсколина от 0,128 до 5 мкМ, надежно идентифицировал две разные группы (высокий FIS n = 9, низкий FIS n = 25; рисунок 3). Эти две группы также могут быть точно идентифицированы на рисунке 1 при концентрациях форсколина ≥0,8 мкМ с порогом площади под кривой (AUC), равным 1000.

    РИСУНОК 1

    Форсколин-индуцированное набухание органоидов (FIS) у всех пациентов с различными мутациями, выражается как абсолютная площадь под кривой (AUC) при t = 60 мин, представлена ​​как среднее ± стандартное отклонение.Красная пунктирная линия показывает значения FIS при 0,8 мкМ форсколина (см. Основной текст).

    РИСУНОК 2

    Репрезентативные изображения конфокальной микроскопии органоидов, меченных кальцеиновым зеленым, трех субъектов с муковисцидозом с различными мутациями до и через 60 минут после стимуляции 0,8 мкМ форсколина. Масштабная линейка = 100 мкм.

    РИСУНОК 3

    Кластерный анализ реакций форсколин-индуцированного набухания (FIS) всех различных концентраций форсколина у всех пациентов. В качестве переменных использовались концентрации форсколина 0,128–5,0 мкМ.Были идентифицированы две разные группы: с высоким FIS (n = 9) и с низким FIS (n = 25).

    Клинические параметры сравнивали между группами с высоким и низким FIS (таблица 2). Субъекты с низким FIS (FIS <1000 AUC при 0,8 мкМ форсколина) по сравнению с субъектами с высоким FIS имели более высокий IRT (160 против 123 мкг · мл -1 ; p = 0,030) и концентрации PAP (5,9 против 3,0). мкг · мл -1 ; p = 0,039), чаще наблюдалась панкреатическая недостаточность (19 из 25 против у двух из девяти пациентов; p <0.001), имели более высокие баллы PRAGMA-CF CT для% заболевания (3,6 против 1,8; p = 0,049) и более низкие z-баллы для максимального потока выдоха при функциональной остаточной емкости (-1,9 против -0,2; p = 0,033) . Эти данные демонстрируют, что FIS является важным индикатором соответствующих клинических параметров в течение первого года жизни.

    ТАБЛИЦА 2

    Сравнение клинических параметров между группами при разделении на высокие или низкие значения # форсколин-индуцированного отека (FIS) и концентрации хлорида пота (SCC)

    При 0.Форсколин 8 мкМ, FIS органоидов от всех отдельных пациентов достоверно коррелировал с парным in vivo SCC (r = -0,82, 95% ДИ -0,91-0,68; p = 1,97 × 10 -9 ; рисунок 4a) и с ex vivo ICM (r = 0,70 (95% ДИ 0,41–0,86; p = 1,93 × 10 −4 ; рисунок 4b). Из этого мы делаем вывод, что значения FIS значительно коррелируют с текущими клинически установленными in vivo и ex vivo CFTR-зависимые биомаркеры.

    РИСУНОК 4

    Корреляции Пирсона а) концентрации хлорида пота (SCC; n = 34) и б) измерения кишечного тока (ICM; совокупное изменение тока короткого замыкания из-за карбахола, цАМФ / форсколин и гистамин; n = 23) против отека, индуцированного форсколином (FIS) при 0.8 мкМ форсколина. Каждая точка представляет собой одного человека. AUC: площадь под кривой.

    Затем мы сравнили клинические параметры между группами с высокими и низкими значениями FIS и SCC (таблица 2). Мы не сравнивали значения ICM с клиническими параметрами, так как значительно меньшее количество наблюдений может привести к предвзятой интерпретации. Чтобы разделить группы с высокими и низкими значениями SCC на тяжелые или более легкие фенотипы CF, мы использовали общепринятую границу SCC 60 ммоль · л -1 [18, 40, 41].Пациенты с высокими значениями SCC (> 60 ммоль · л -1 ) по сравнению с пациентами с низкими значениями SCC имели более высокие концентрации IRT (160 против 109 мкг · мл -1 ; p = 0,012), чаще имели панкреатический недостаточность (20 из 26 против у одного из восьми пациентов; p <0,001) и имели более высокие баллы PRAGMA-CF CT для% заболевания (3,7 против 1,3; p = 0,007). Подгруппы, идентифицированные по высоким или низким значениям FIS или SCC, различались на трех человек (номера 13, 26 и 27) в этой когорте.В заключение, подгруппы на основе FIS связаны с пятью из девяти изученных клинических конечных точек в течение первого года жизни по сравнению с тремя подгруппами на основе SCC.

    Эти групповые ассоциации с клинической тяжестью заболевания предполагают, что FIS может иметь дополнительную ценность для интерпретации отдельного клинического заболевания. Мы сравнили отдельные измерения FIS, SCC и ICM, чтобы различать низкую или высокую остаточную функцию CFTR (для FIS) или легкий или тяжелый фенотип МВ (для SCC и ICM, используя 60 ммоль · л -1 и 10 мкА · см −2 в качестве порогов соответственно) [19].FIS показывает четкое дихотомическое распределение данных (рисунок 5a), в отличие от более постепенно разбросанных значений SCC и ICM (рисунок 5b и c). В целом низкие значения FIS соответствовали SCC> 60 ммоль · л -1 и значениям ICM <10 мкА · см -2 , но наблюдались некоторые расхождения. Например, индивидуум номер 4 с клинически тяжелым фенотипом (недостаточность поджелудочной железы и необходимость в профилактике антибиотиками в возрасте до 6 месяцев) показал низкие значения FIS и, соответственно, высокие значения SCC, но неожиданно очень высокое значение ICM.Один человек с очень низким FIS (пациент номер 13) был типирован с промежуточным SCC и низким ICM. Клинические данные этого человека предполагали фенотип тяжелого заболевания, основанный на генотипе CFTR (согласно CFTR2), недостаточность поджелудочной железы (фекальная эластаза <15 мкг · г -1 ) и необходимость восьми курсов лечения антибиотиками из-за легочных симптомов в течение первого года. жизни. Два других человека с SCC> 60 ммоль · л -1 (номера 26 и 27) показали высокие уровни FIS (ICM также был высоким для номера 27 и недоступен для номера 26).Эти субъекты также демонстрировали более мягкий фенотип, о чем свидетельствует недостаточность поджелудочной железы (фекальная эластаза> 500 мкг · г -1 ) у обоих пациентов и отсутствие каких-либо легочных симптомов. В заключение, данные предполагают, что FIS, возможно, имел дополнительную ценность для оценки индивидуальных характеристик заболевания наряду с SCC и ICM.

    РИСУНОК 5

    Результаты различных измерений биоанализа с помощью регулятора трансмембранной проводимости (CFTR) при муковисцидозе для каждого человека. а) Форсколин-индуцированное набухание органоидов при 0.8 мкМ форсколина. AUC: площадь под кривой. б) Концентрация хлорида пота (SCC). c) Измерение кишечного тока (ICM), совокупное изменение тока короткого замыкания из-за карбахола, цАМФ / форсколина и гистамина (n = 23). Пунктирными линиями обозначены границы между а) высокими и низкими значениями или б, в) положительными и промежуточными уровнями (см. Раздел результатов). : не определено.

    Обсуждение

    В этом исследовании изучалась эффективность биомаркера in vitro в культивируемых взрослых стволовых клетках для выявления клинически различных подгрупп у годовалых детей с МВ.Мы обнаружили, что стратификация органоидов кишечника с помощью FIS выявила подгруппы, которые различались по параметрам клинических исходов со стороны легких и желудочно-кишечного тракта. FIS хорошо коррелировал с установленными в настоящее время CFTR-зависимыми биомаркерами, такими как SCC и ICM, и адекватно выполнялся на групповом и индивидуальном уровне, чтобы информировать о соответствующих фенотипах легочных и желудочно-кишечных заболеваний. Мера FIS объединяет влияние как мутаций CFTR, так и других специфичных для пациента генов-модификаторов, экспрессируемых в культурах клеток кишечника, которые действуют на функцию CFTR.Вероятно, что сильная зависимость FIS от CFTR, а также оптимальная чувствительность и точность благодаря повторным измерениям позволяют точно оценить остаточную функцию in vivo CFTR, тем самым облегчая привязку к характеристикам заболевания.

    Наш кластерный анализ, основанный на значениях FIS для концентраций форсколина> 0,128 мкМ, убедительно разделил эту последовательную группу пациентов с МВ младенческого возраста на две отдельные группы. FIS в концентрации 0,8 мкМ форсколина точно идентифицирует эти два кластера, и поэтому кажется достаточным измерить значения FIS при меньших концентрациях форсколина для определения остаточной функции CFTR.Впечатляет то, что кластерный анализ данных FIS только для небольшого числа субъектов позволил выделить отдельные подгруппы, которые были четко связаны с показателями тяжести клинического заболевания, по существу дав аналогичные данные, когда когорта была разделена на подгруппы с использованием критериев на основе SCC, ранее установленных в более крупных исследованиях [ 40, 41].

    Наиболее важным результатом этого исследования является то, что функция CFTR, измеренная FIS, была продемонстрирована как индикатор соответствующих клинических параметров (таблица 2).Заболевание МВ вызывается мутациями CFTR, другими генами-модификаторами и факторами окружающей среды, и влияние этих переменных изменяется в зависимости от конкретных проявлений заболевания и возраста. В то время как функция CFTR является первичной детерминантой экзокринной дисфункции поджелудочной железы [12], а измерения функции CFTR будут очень информативными, вариации обструкции дыхательных путей и легочной инфекции сильно изменяются другими генетическими модификаторами и факторами окружающей среды [12]. Сосредоточив внимание на ранних характеристиках заболевания у младенцев младшего возраста, мы могли бы изучить клинические фенотипы, которые более напрямую связаны с дисфункцией МВТР, поскольку воздействие окружающей среды ограничено по сравнению с субъектами старшего возраста.Исследования в различных возрастных группах необходимы для изучения того, насколько хорошо измерения функции CFTR с помощью FIS остаются связанными с клиническими фенотипами и могут привести к лучшему пониманию влияния остаточной функции CFTR и не зависимых от CFTR путей на характеристики прогрессирующего заболевания.

    Точные пороговые значения FIS, позволяющие различать клинически значимые различия в остаточной функции CFTR, еще предстоит определить в последующих исследованиях. Распределение данных группы с более тяжелым заболеванием по SCC показало, что среднее значение группы SCC (106 ммоль · л -1 ) было разделено на 2.5 sd от порога 60 ммоль · л -1 , что согласуется с литературными данными [13]. Соответствующая группа, идентифицированная FIS как имеющая более тяжелое заболевание, показала среднее значение 68,3 единицы набухания AUC, которое было отделено 11,3 единицей стандартного отклонения от определенного порогового значения 1000 AUC. Распределение данных из групп, идентифицированных с более легкой формой заболевания, показало аналогичное распределение и взаимосвязь с использованными пороговыми значениями как для SCC, так и для FIS (среднее значение SCC 37,4 ммоль · л -1 и 1,5 sd на 60 ммоль · л -1 ; Среднее значение FIS 2702 AUC и 1.От 7 SD до 1000 AUC). Это говорит о том, что дальнейшее уточнение остаточной функции CFTR может быть возможно с помощью FIS, что может расширить текущую классификацию мутаций CFTR как имеющих значительную остаточную функцию или не до системы, в которой распознается функция не-минимальной, низкой или высокой остаточной. .

    Для ICM мы использовали утвержденный протокол Роттердам – Ганновер и референсные значения (> 10 мкА · см –2 ), определяющие различия между пациентами с недостаточностью и недостаточностью поджелудочной железы, как опубликовано ранее [19].Протоколы ICM могут несколько отличаться между лабораториями по типу камеры Уссинга (перфузируемая или рециркуляционная) или фармакологическим манипуляциям с биопсией [17, 19, 20, 23, 24]. Эти исследования обычно выявляют взаимосвязь между ICM и клиническим фенотипом при CF, в основном в контексте диагностики и недостаточности (недостаточности) поджелудочной железы. Новая европейская стандартная операционная процедура для ICM также находится в стадии разработки, поэтому пороговые значения, используемые для ICM в этом исследовании, могут различаться между площадками и отличаться от будущих пороговых значений для новой стандартной операционной процедуры.Поскольку органоидная технология является новой и зависит от многих (местных) факторов среды, органоидов требуется дополнительная многоцентровая проверка, чтобы изучить воспроизводимость от участка к месту и согласованность пороговых значений. Исследование было разработано не для сравнения эффективности трех CFTR-зависимых биомаркеров для прогнозирования отдельного клинического заболевания, а как обсервационное исследование для выявления взаимосвязи между FIS и клиническими наблюдениями у маленьких детей с CF. В большинстве случаев три биомаркера функции CFTR были согласованы на индивидуальном уровне, чтобы определить людей как классические или тяжелые формы CF или более легкие формы CF.Интересно, что FIS, по-видимому, согласуется с индивидуальным клиническим фенотипом и общей подверженностью заболеваниям генотипов в CFTR2, когда ICM и SCC не совпадают (пациенты 2, 4, 13, 17 и 27). Следует отметить, что пациенты 2 и 17 показали лишь незначительно более высокий уровень, чем использованное здесь пороговое значение ICM, предполагая, что небольшое увеличение порога ICM могло бы лучше квалифицировать пациентов в текущем исследовании. Субъект 13 показал концентрацию хлорида в 55 ммоль · л -1 , что близко к порогу SCC 60 ммоль · л -1 , что несовместимо с ICM, FIS, генотипом (гомозиготный по F508del) и клиническим фенотипом.Вероятно, что повторное измерение SCC для субъекта 13 приведет к реклассификации этого пациента (SCC> 60 ммоль · л -1 ). Такие повторные измерения могли также привести к несколько более низкому значению SCC для субъекта 12 (160 ммоль · л -1 ), что выходит за пределы физиологических пределов человека и опубликованных данных [27]. На данный момент наши данные показывают, что FIS представляется информативным для классификации отдельных заболеваний в контексте пограничного SCC и ICM или когда SCC и ICM расходятся во мнениях, но дальнейшая валидация остается необходимой для большей группы пациентов.

    ICM обеспечивает быстрое и чувствительное измерение функции CFTR в свежевыделенной нативной ткани пациентов с МВ, которое объединяет индивидуальный генотип CFTR и другие гены, которые влияют на перенос ионов, а также факторы окружающей среды, такие как модуляторы CFTR, которые могут влиять на функцию CFTR. [42, 43]. Для пациентов 4 и 12 мы наблюдали относительно высокие ответы ICM, которые, по-видимому, не соответствовали клиническому фенотипу и другим биомаркерам функции CFTR и значительно превышали значения, обнаруженные у других младенцев, гомозиготных по F508del (см. Исходные записи в дополнительном материале S6. ).В исследованиях с участием пожилых групп пациентов о таких высоких ICM не сообщалось при использовании перфузионных систем [44–46], и лишь изредка в образцах пациентов, использующих рециркулирующие камеры Уссинга [47]. Неожиданно высокие ответы в ICM для двух образцов пациентов могут быть связаны с возрастом или быть результатом воздействия окружающей среды на ткань кишечника, такого как пищевые или воспалительные компоненты. Специфические для пациента механизмы, которые контролируют созревание белка F508del и апикальный транспорт, которые не поддерживаются в культуре органоидов, также могут вносить свой вклад [46], как и влияние сигнальных путей, стимулированных cAMP / Ca 2+ , на хлорид, не связанный с CFTR. каналы [48].Поскольку условия культивирования органоидов обогащают эпителиальный компартмент секреторных стволовых клеток на основе крипт эпителия кишечника, а не весь эпителий кишечника, наблюдения на основе ICM могут быть результатом токов, вызываемых кишечными клетками, которые восстанавливаются в культурах органоидов, например как бокаловидные клетки [49]. Очевидно, что для понимания этих интересных результатов необходимы дополнительные исследования, выходящие за рамки настоящего исследования.

    Ограничения этого исследования включают относительно небольшую когорту пациентов и ограниченное время клинического наблюдения.Более того, отсутствовало относительно большое количество значений ICM. Кроме того, набухание органоидов сильно зависит от CFTR, но не является прямым показателем функции CFTR; он основан на взаимодействии CFTR-зависимого переноса ионов с переносом жидкости. Хотя анализ относительно прост и надежен по сравнению с другими показаниями in vitro, , на что указывают девять технических исключений из 1552 измерений, измерения органоидов требуют значительного местного опыта и дорогостоящего оборудования.Кроме того, различные условия анализа органоидов используются для изучения функции CFTR по отношению к CFTR дикого типа [11]. Точная типизация очень низкой остаточной функции CFTR также требует другой экспериментальной установки по сравнению с протоколом, который мы использовали здесь, , например. путем более длительной стимуляции форсколином или путем измерения увеличения объема просвета [50]. Что наиболее важно, достоверность этого биомаркера для прогнозирования долгосрочных результатов еще предстоит продемонстрировать.

    FIS также предлагает дополнительные преимущества по сравнению с другими биомаркерами функции CFTR.Ректальные биопсии могут быть отправлены в специализированные центры для централизованного и стандартизованного анализа. FIS также может измерять ответ на терапию, модулирующую CFTR, в предварительном исследовании, что особенно актуально для субъектов с редкими или неизвестными генотипами CFTR или сомнительным заболеванием [11]. Ранние индикаторы для пациентов с риском тяжелых отдаленных исходов могут помочь решить, когда начинать терапию, модулирующую CFTR. Несколько тематических исследований показали, что ex vivo и in vivo ответы на терапию, регулирующую CFTR, четко коррелируют [11, 43, 51, 52], что указывает на то, что анализ FIS может играть роль в определении как времени, так и эффективности лекарственного средства. лечение у отдельных пациентов.Кроме того, кишечные органоиды могут быть использованы на доклинической стадии разработки модулятора CFTR [53], и после измерения остаточной функции CFTR и ответа на модуляторы CFTR клетки могут быть сохранены в биобанках для будущих анализов без необходимости дальнейшего отбора проб и дискомфорта пациента [54].

    В заключение, стратификация кишечных органоидов методом FIS позволила выявить подгруппы, которые различались по параметрам клинических исходов со стороны легких и желудочно-кишечного тракта. FIS хорошо коррелировал с установленными в настоящее время CFTR-зависимыми биомаркерами SCC и ICM.FIS оказался информативным, когда значения SCC и ICM были сомнительными и не согласовывались с клиническим фенотипом или данными реестра генотипа CFTR (CFTR2). Результаты этого исследования подтверждают идею о том, что FIS в органоидах кишечника является клинически значимым биомаркером тяжести заболевания CF, и показывают, что ресурсы стволовых клеток, полученные от пациентов, могут иметь значение для определения индивидуального типа заболевания в условиях клинической помощи.

    Сноски

    • В этой статье есть дополнительные материалы, доступные на сайте erj.ersjournals.com

    • Конфликт интересов: J.M. Beekman сообщает о лицензированном патенте, номер CA2859614 A1, на быстрый количественный анализ для измерения функции CFTR в модели первичной кишечной культуры.

    • Конфликт интересов: J.F. Dekkers сообщает о лицензированном патенте, номер CA2859614 A1, на быстрый количественный анализ для измерения функции CFTR в модели первичной кишечной культуры.

    • Конфликт интересов: Р. Фрис сообщает о поддержке Vertex для скрининга лекарств и от CZ для разработки диагностики, помимо представленных работ.

    • Конфликт интересов: H.A.W.M. Тидденс сообщает о гонорарах / грантах от Roche для отраслевого симпозиума по лечению CF, от Novartis для лекций и консультативных советов, от CFF для анализа легких, от Vertex для анализа легких и консультативных советов, от Gilead для лекций и консультативных советов и от Chiesi для исследования, инициированного исследователем, все за пределами представленной работы. Он также сообщает о лицензированном комбинированном патенте от Vectura на конкретное нацеливание с помощью ДНКазы и о выданном патенте от оценочной системы PRAGMA-CF.Он возглавляет базовую лабораторию анализа легких в Медицинском центре Эразмус / Софийской детской больнице.

    • Конфликт интересов: K.M. де Винтер-де Гроот нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: H.M. Янссенсу нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: R.T. Ван Ууму нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: Г. Беркерс нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: A.Вонку нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: Э. Круиссельбринку нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: Х. Оппелаару нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: Х. Клеверсу нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: R.H.J. Хоувен нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: Дж. К. Эшеру нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: S.Г. Элиасу нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: Х.Р. де Йонге нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: Ю. де Рийке нечего раскрывать.

    • Конфликт интересов: C.K. Ван дер Энту нечего раскрывать.

    • Заявление о поддержке: Финансирование было получено от Нидерландского фонда кистозного фиброза (Nederlandse Cystic Fibrosis Stichting; программа HIT-CF). Информация о финансировании для этой статьи была депонирована в реестре Crossref Funder.

    • Получено 6 декабря 2017 г.
    • Принято 20 июля 2018 г.

    IntestiCult ™ Среда для роста кишечных органоидов (человек)

    Среда для культивирования клеток для создания и поддержания органоидов кишечника человека

    Вы можете заметить, что упаковка вашего реагента немного отличается от изображений, представленных здесь, или от предыдущих заказов. Из-за нехватки пластиковой посуды из-за пандемии мы временно используем альтернативные бутылки для этого продукта.Будьте уверены, что сами продукты и способы их использования не изменились.

    Обзор

    Смоделируйте ключевые характеристики эпителия кишечника взрослых с использованием органоидов кишечника, установленных и поддерживаемых с помощью этого полного состава среды и оптимизированного протокола. Используя простой и надежный протокол, вы можете получить органоиды из крипт кишечника человека за одну неделю; Рост органоидов в донорских образцах, включая те, которые иначе трудно вырастить, обеспечивается за счет обогащенной популяции стволовых клеток.

    Органоиды, выращенные в среде для выращивания органоидов IntestiCult ™ (человек), включают функциональный просвет, окруженный поляризованным слоем эпителиальных клеток кишечника, и для универсальных приложений моделирования могут быть дополнительно дифференцированы в 3D или 2D как погруженные монослои или поверхность раздела воздух-жидкость (ALI ) культур с использованием среды для дифференциации органоидов IntestiCult ™ (человек; № по каталогу 100-0214).

    Применение культур органоидов кишечника включает изучение развития и функции кишечного эпителия, моделирование кишечных заболеваний и скрининг молекул на эффективность и токсичность на модели кишечника.Культуры кишечных органоидов также можно использовать для исследования свойств взрослых стволовых клеток и для подходов к регенеративной терапии.

    • Удобная система in vitro, которая воспроизводит многие ключевые характеристики взрослого кишечного эпителия, включая внутри- и межклеточную передачу сигналов, нишу самораспространяющихся стволовых клеток и функциональный транспорт в просвет и из просвета
    • Полноценный средний состав, обеспечивающий стабильные результаты
    • Обеспечивает образование кишечных органоидов за одну неделю
    • Простой в использовании формат и оптимизированный протокол

    • IntestiCult ™ OGM Базальная среда для человека, 50 мл
  • Добавка с органоидами, 50 мл
  • Культура клеток, дифференциация, расширение, поддержание, культура органоидов

    Моделирование заболеваний, открытие лекарств и тестирование на токсичность, биология эпителиальных клеток, биология стволовых клеток

    Научные ресурсы

    Учебные материалы (44)

    Брошюра

    Каталог тренингов по клеточным культурам 2019-2020

    Брошюра

    Органоиды кишечника

    Брошюра

    Органоиды

    Технический бюллетень

    Культивирование органоидов, полученных из рака, с использованием среды для выращивания органоидов IntestiCult ™ (человек)

    Технический бюллетень

    Вызванное форсколином отек кишечных органоидов человека, выращенных в IntestiCult ™

    Протокол

    Проведение иммуноцитохимического окрашивания эпителиальных органоидов

    Протокол

    CRISPR-Cas9 Редактирование генома органоидов кишечника человека

    Протокол

    Как создать монослои, полученные из органоидов кишечника мыши, используя IntestiCult ™

    Настенная диаграмма

    SnapShot: выращивание органоидов из стволовых клеток

    Настенная диаграмма

    Снимок: Кишечный склеп

    Настенная диаграмма

    Снимок: Развитие желудочно-кишечного тракта

    Видео

    1:18

    Рост органоидов печени в культуральной среде HepatiCult ™: под микроскопом

    Видео

    1:09

    Как подсчитать кишечные крипты для культур органоидов мышей

    Видео

    3:19

    Зачем культивировать кишечные органоиды с помощью ростовой среды для органоидов IntestiCult ™

    Видео

    3:36

    Сотрудничество для ускорения исследований COVID-19

    Видео

    1:07

    Рост органоидов поджелудочной железы мыши в культуральной среде PancreaCult ™: под микроскопом

    Вебинар

    41:47

    Проблемы перевода технологии ИПСК

    Вебинар

    52:35

    Группа экспертов по органоидам

    Вебинар

    56:31

    Моделирование развития и заболеваний желудочно-кишечного тракта человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток

    Вебинар

    17:20

    Круглый стол по исследованиям природы: Органоиды как технология, способствующая прецизионному лечению рака

    Вебинар

    4:47

    Круглый стол по исследованиям природы: Моделирование органоидов стволовых клеток и болезнетворных микроокружений

    Вебинар

    9:36

    Круглый стол по исследованию природы: Прогресс и проблемы в области органоидных моделей развития человеческого мозга

    Вебинар

    24:56

    Органоиды желудочно-кишечного тракта: использование передовых моделей тканей для исследования абсорбции и регуляции

    Вебинар

    Взгляд на органоиды: Группа экспертов

    Вебинар

    50:25

    Органоиды, полученные от пациентов, для скрининга и разработки лекарств

    Вебинар

    1:10:09

    Мини-симпозиум

    HUB & STEMCELL Органоиды как модели инфекционных заболеваний

    Вебинар

    15:15

    Круглый стол по исследованиям природы: Моделирование врожденной детской диареи при кишечных энтероидах

    Вебинар

    11:52

    Круглый стол по исследованию природы: Самоорганизация и нарушение симметрии в развитии кишечных органоидов

    Вебинар

    15:10

    Круглый стол по исследованию природы: Органоиды как модели болезней человека

    Вебинар

    16:31

    Моделирование взаимодействий микробов и хозяев с использованием органоидов кишечника человека

    Вебинар

    50:59

    Добавление органоидов печени в ваше исследование

    Вебинар

    59:52

    Витрина инноваций ISSCR: применение органоидных и органотипических культур при инфекционных заболеваниях, нефротоксичности и высокорелевантном клеточном анализе

    Вебинар

    17:17

    Круглый стол по исследованиям природы: перспективы органоидной медицины

    Вебинар

    12:57

    Круглый стол по исследованиям природы: Органоиды печени для изучения регенерации и заболеваний печени

    Вебинар

    10:17

    Круглый стол по исследованию природы: Моделирование развития кишечника in vivo и in vitro

    Мини-обзор

    Культура кишечных органоидов

    Научный плакат

    Высокоэффективная дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека в органоиды «мини-кишечника» с длительным сроком роста

    Научный плакат

    Моделирование рака поджелудочной железы с помощью экзокринных органоидов поджелудочной железы с использованием бессывороточной среды PancreaCult ™

    Научный плакат

    Эффективное создание и долгосрочное поддержание трехмерных органоидов тонкой и толстой кишки человека с использованием новой среды для роста органоидов IntestiCult ™ (человек)

    Интервью

    Кэролайн Линдеманс, MD, PhD

    Интервью

    Луиджи Алоиа, доктор философии

    Интервью

    Джейсон Спенс

    Интервью

    Хизер Макколи, доктор философии

    Интервью

    Тамара Зиетек, PhD

    Загрузить больше учебных материалов

    Приложения продукта

    Этот продукт разработан для использования в следующих областях исследований как часть выделенного этапа (этапов) рабочего процесса.Изучите эти рабочие процессы, чтобы узнать больше о других продуктах, которые мы предлагаем для поддержки каждой области исследований.

    Область исследования

    Этапы рабочего процесса

    Данные и публикации

    Данные

    Рисунок 1. Первичные органоиды, выращенные в среде роста органоидов IntestiCult ™ (человек), полностью созревают после 10-14 дней культивирования

    Первичные органоиды культивировали из образцов биопсии толстой кишки человека и выращивали в среде для выращивания органоидов IntestiCult (человек). Органоиды были визуализированы после (A) двух дней, (B) шести дней, (C) восьми дней и (D) десяти дней роста.

    Рисунок 2. Органоиды, выращенные в среде роста органоидов IntestiCult ™ (человека), отображают маркеры эпителиальных клеток кишечника человека

    Иммунофлуоресценция органоидов, выращенных в среде роста органоидов IntestiCult ™ (человек), демонстрирующая совместную локализацию (A) DAPI, (B) EPCAM и (C) Ki67.(D) Объединенное изображение показывает положение активно пролиферирующих (Ki67 +) кишечных стволовых клеток в эпителиальном слое (EPCAM +).

    Рис. 3. Вызванное форсколином набухание органоидов, выращенных в среде для роста органоидов IntestiCult ™ (человек)

    Органоиды обрабатывали (А) 5 мкМ форсколином или (В) ДМСО и измеряли площадь органоидов через 0 минут и 120 минут. (C) Органоиды, обработанные форсколином, увеличились в размере на 33,5 ± 3,8% по сравнению с 7.5 ± 0,8% для органоидов, обработанных ДМСО.

    Публикации (18)

    ОКС инфекционные болезни 2020 май Полимеры фукоза-галактоза ингибируют связывание холерного токсина с фукозилированными структурами и галактозозависимую интоксикацию энтероидов человека.J. Cervin et al.

    Аннотация

    Многообещающая стратегия ограничения тяжести холеры включает блокаторы, имитирующие канонический лиганд холерного токсина (CT) ганглиозид GM1.Однако на сегодняшний день эффективность большинства этих блокаторов была оценена в неклеточных системах, в которых отсутствуют лиганды, отличные от GM1. Важно отметить, что субъединица CT B (CTB) имеет неканонический сайт, который связывает фукозилированные структуры, которые в отличие от GM1 высоко экспрессируются в кишечнике человека. Здесь мы оцениваем способность норборненовых полимеров, демонстрирующих галактозу и / или фукозу, блокировать связывание CTB с иммобилизованными белково-связанными гликановыми структурами, а также с первичными эпителиальными клетками тонкого кишечника человека и мыши (SI EC).Мы показываем, что связывание CTB с ECs SI человека в значительной степени зависит от неканонического сайта связывания, а вмешательство в канонический сайт имеет ограниченный эффект, в то время как противоположное наблюдается с ECs SI мыши. Полимер галактоза-фукоза блокирует связывание с фукозилированными гликанами, но не с GM1. Однако предварительная инкубация CT с полимером галактоза-фукоза только частично блокирует токсическое действие на культивируемые энтероидные клетки человека, в то время как преинкубация с GM1 полностью блокирует CT-опосредованную секрецию.Наши результаты подтверждают модель, согласно которой связывание фукозы с неканоническим сайтом помещает CT в непосредственной близости от едва экспрессируемых рецепторов галактозы, таких как GM1, чтобы обеспечить связывание через канонический сайт, ведущее к интернализации CT и интоксикации. Наше открытие также подчеркивает важность дополнения исследований связывания СТВ исследованиями функциональной интоксикации при оценке эффективности ингибиторов СТ.

    Nature Communications 2020 май TNFAIP8 контролирует гомеостаз и регенерацию кишечных стволовых клеток мышей путем регулирования индуцированной микробиомом передачи сигналов Akt.J. R. Goldsmith et al.

    Аннотация

    Кишечник — это высокодинамичная среда, которая требует жесткого контроля над различными входными данными для поддержания гомеостаза и обеспечения надлежащей реакции на травмы.Недавно было обнаружено, что ниша стволовых клеток и эпителий регенерируются после повреждения дедифференцированными взрослыми клетками посредством процесса, который дает начало Sca1 + эмбрионоподобным клеткам и управляется временной популяцией возрождающихся стволовых клеток Clu + (revSC). Однако молекулярные механизмы, регулирующие этот динамический процесс, полностью не определены. Здесь мы показываем, что TNFAIP8 (также известный как TIPE0) является регулятором гомеостаза кишечника, который жизненно важен для правильной регенерации. TIPE0 функционирует посредством ингибирования базальной активации Akt комменсальной микробиотой посредством модуляции количества мембранных фосфолипидов.Потеря TIPE0 у мышей приводит к образованию устойчивых к травмам энтероцитов, которые являются гиперпролиферативными, но имеют регенеративный дефицит и смещаются в сторону де-дифференцированного состояния. Энтероциты Tipe0 — / — демонстрируют базальную индукцию программы регенерации Clu + и сигнатуру экспрессии гена плода, отмеченную Sca1, но при повреждении не могут генерировать Sca-1 + / Clu + revSC и не могут регенерировать эпителий. Эта работа демонстрирует роль TIPE0 в регуляции динамической передачи сигналов, которая определяет реакцию на повреждение и обеспечивает регенеративную пластичность кишечных эпителиальных клеток.

    Токсикология in vitro: международный журнал, опубликованный совместно с BIBRA 2020 jul Модель органоидов подвздошной кишки человека повторяет клиническую частоту диареи, связанной с низкомолекулярными препаратами.D. G. Belair et al.

    Аннотация

    Желудочно-кишечная токсичность (ЖКТ), вызванная лекарственными средствами, является распространенным побочным эффектом, возникающим при лечении, который может негативно повлиять на дозировку, тем самым ограничивая эффективность и варианты лечения для пациентов.Анализ ЖКТ in vitro необходим для изучения изменчивости пациента, имитации микрофизиологии кишечника и точного прогнозирования желудочно-кишечного тракта, вызванного лекарствами. Первичные органоиды подвздошной кишки человека (называемые «энтероидами») оказались полезными для стимуляции пролиферации и дифференцировки кишечных стволовых клеток в несколько типов клеток, присутствующих в эпителии кишечника. Энтероиды позволили охарактеризовать биологию кишечника и передачу сигналов, участвующих в патогенезе заболевания. Здесь энтероиды были дифференцированы от четырех здоровых доноров-людей и оценены на предмет зависимого от продолжительности культивирования статуса дифференцировки путем иммуноокрашивания на маркеры эпителия кишечника лизоцим, хромогранин А, муцин и сахарозную изомальтазу.Дифференцированные энтероиды были оценены с помощью контрольного набора из 31 препарата, демонстрирующего различную степень клинической частоты диареи, распространенного проявления ЖКТ, которое может быть вызвано лекарственным истончением эпителия кишечника. Анализ жизнеспособности энтероидов в ответ на медикаментозное лечение продемонстрировал точность 90 {\%} для повторения случаев лекарственной диареи. Разработанный здесь анализ жизнеспособности энтероидов человека представляет собой многообещающую модель in vitro для оценки лекарственной диареи.

    Журнал клинических исследований 2020 янв Апелин управляет дифференцировкой эндотелиальных клеток и восстановлением сосудов после иммуноопосредованного повреждения.A. G. Masoud et al.

    Аннотация

    Устойчивое, вялотекущее иммунное повреждение сосудистой сети сердечного трансплантата ограничивает долгосрочную выживаемость трансплантата и реципиента.Это повреждение смягчается плохо охарактеризованной неадаптивной восстановительной реакцией. Эндотелиальные клетки сосудов отвечают на проангиогенные сигналы эмбриона дифференцировкой по специализированным фенотипам, связанным с экспрессией апелина. У взрослых роль проангиогенных сигналов развития в восстановлении сформировавшейся сосудистой сети в значительной степени неизвестна. Мы обнаружили, что аллотрансплантаты сердца человека и второстепенных донорских мышей, несоответствующих по гистосовместимости, с аллоиммунно-опосредованной васкулопатией усиливали экспрессию апелина в артериях и микрососудах миокарда.In vivo потеря экспрессии апелина в донорском сердце способствовала инфильтрации трансплантата иммунными клетками, притуплению восстановления сосудов и ухудшению окклюзионной васкулопатии у мышей. In vitro аналог агониста рецептора апелина вызывал активацию эндотелиальной синтазы оксида азота, способствуя заживлению эндотелиальной монослойной раны и уменьшая адгезию иммунных клеток. Таким образом, апелин действует как аутокринный сигнал роста, поддерживая восстановление сосудов и смягчая последствия иммунного повреждения. Установлено, что лечение агонистом рецепторов апелина после васкулопатии заметно снижает прогрессирование артериальной окклюзии у мышей.Вместе эти исходные данные идентифицируют проангиогенный апелин как ключевой медиатор восстановления коронарных сосудов и фармакотерапевтическую мишень для иммуноопосредованного повреждения коронарной сосудистой сети.

    Журнал зоотехники 2020 фев Оценка энтероидов свиней как моделей in vitro инфекции Lawsonia intracellularis1,2.T. P. Resende et al.

    Аннотация

    Кишечный патоген Lawsonia intracellularis является одной из основных причин диареи и снижения веса свиней во всем мире.Традиционные культуры клеточных линий были использованы для изучения патогенеза L. intracellularis. Однако эти системы не могут воспроизвести эпителиальные изменения, наблюдаемые в кишечнике свиней, инфицированных L. intracellularis, в частности, изменения в строении кишечных клеток и экспрессии генов. Более физиологически точная и современная модель обеспечивается энтероидами свиней, полученными из крипт, содержащих стволовые клетки, от здоровых свиней. Целью этого исследования было проверить возможность использования двумерных энтероидов свиней в качестве моделей in vitro для L.intracellularis инфекция. Мы создали как трехмерные, так и двумерные культуры энтероидов свиней, полученные из кишечных крипт. Двумерные энтероиды свиней были инфицированы L. intracellularis в четырех независимых экспериментах. Образцы, инфицированные энтероидом, собирали через 3 и 7 дней после заражения для анализа с использованием количественной ПЦР в реальном времени и иммуногистохимии L. intracellularis. В этом исследовании мы показываем, что L. intracellularis способна инфицировать и реплицироваться внутриклеточно в двумерных энтероидах свиней, полученных из подвздошной кишки.

    Границы клеточной и инфекционной микробиологии 2020 Человеческая 2D модель первичного органоида эпителиального монослоя для изучения взаимодействия хозяина и патогена в тонком кишечнике.T. Roodsant et al.

    Аннотация

    Органоиды кишечника представляют собой трехмерные модели кишечного эпителия, полученные из стволовых клеток, которые полезны для изучения взаимодействий между кишечными патогенами и их хозяином.Хотя модель органоида использовалась как для бактериальных, так и для вирусных инфекций, это закрытая система с недоступной просветной стороной без микроинъекции или нарушения поляризации органоида. Чтобы преодолеть это и упростить их применение для трансэпителиальных исследований, необходимы монослойные подходы на основе проницаемых мембран. В этой статье мы демонстрируем метод создания однослойной модели кишечного поляризованного эпителия плода человека, которая полностью охарактеризована и подтверждена.Проксимальные и дистальные органоиды тонкой кишки использовали для создания 2D монослойных культур, которые были охарактеризованы в отношении типов эпителиальных клеток, поляризации, барьерной функции и экспрессии генов. Кроме того, оценивали репликацию вируса и бактериальную транслокацию после апикальной инфекции кишечными патогенами Enterovirus A71 и Listeria monocytogenes с последующим мониторингом провоспалительного ответа хозяина. Эта двухмерная модель кишечного монослоя плода человека станет ценным инструментом для изучения взаимодействий между хозяином и патогеном и потенциально уменьшит использование животных в исследованиях.

    Просмотреть все публикации

    Юридическое заявление:

    Этот продукт был разработан по лицензии интеллектуальной собственности, принадлежащей Hubrecht Organoid Technology (HUB). Этот продукт продается только для исследовательских целей. Покупка этого продукта не дает права использовать этот продукт для выращивания органоидов для проверки на наркотики с целью получения коммерческой выгоды или для других коммерческих целей.Покупатели, желающие использовать продукт в целях, отличных от исследовательских, должны связаться с HUB для получения дополнительной лицензии («Лицензия на выращивание органоидов»). Покупатели могут подать заявку на получение лицензии на выращивание органоидов от HUB, и HUB не будет необоснованно отказать в такой лицензии.

    Заявление о качестве:

    ПРОДУКТЫ ПРЕДНАЗНАЧЕНЫ ТОЛЬКО ДЛЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕНЫ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ИЛИ ЖИВОТНЫХ ДИАГНОСТИКИ ИЛИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ, ЕСЛИ НЕ УКАЗАНО ИНОЕ. ДОПОЛНИТЕЛЬНУЮ ИНФОРМАЦИЮ О КАЧЕСТВЕ В STEMCELL, ОБРАТИТЕСЬ В WWW.STEMCELL.COM/COMPLIANCE.

    % PDF-1.7 % 140 0 объект > эндобдж 190 0 объект > поток 2021-09-16T11: 42: 33-07: 002021-09-16T11: 42: 33-07: 002021-09-16T11: 42: 33-07: 00uuid: cb42be0a-1dd1-11b2-0a00-bbd7200uuid: cb42be0e- 1dd1-11b2-0a00-880000000000application / pdf конечный поток эндобдж 141 0 объект > эндобдж 142 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 0 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 143 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 2 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 144 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 3 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 145 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 4 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 146 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 5 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 147 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 6 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 148 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 7 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 149 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 8 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 150 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 9 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 151 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 10 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 152 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 11 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 153 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 12 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 154 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 13 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 155 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 14 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 156 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 15 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 157 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 16 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 158 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 17 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 159 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 18 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 160 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 19 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Тип / Страница >> эндобдж 161 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 20 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 162 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 21 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 163 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 22 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 164 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 23 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 165 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 24 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 166 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 25 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 167 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 26 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 168 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 27 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 169 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 28 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 170 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 29 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 171 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 31 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 172 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 32 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 173 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 33 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 174 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 34 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 175 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 35 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 176 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 36 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 177 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 37 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 178 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 38 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 179 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 39 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 180 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 40 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 181 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 41 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 182 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / Rotate 0 / StructParents 42 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Type / Страница >> эндобдж 183 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / StructParents 0 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Тип / Страница >> эндобдж 184 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / StructParents 1 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Тип / Страница >> эндобдж 185 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / StructParents 2 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Тип / Страница >> эндобдж 186 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / StructParents 3 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Тип / Страница >> эндобдж 187 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / StructParents 4 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Тип / Страница >> эндобдж 188 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / StructParents 5 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Тип / Страница >> эндобдж 189 0 объект > / MediaBox [0 0 612 792] / Parent 141 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Rotate 0 / StructParents 6 / Tabs / S / TrimBox [0 0 612 792] / Тип / Страница >> эндобдж 327 0 объект [329 0 R] эндобдж 328 0 объект > поток HT [o0 ~ pI5m0BJҋZ «a48! Wi: $ c | mmb6oar = rG0 б.: KʹJS>% uů = — & x3 * ev (N հ \ 96ˀ3 TdT Wʋ 筩? 2or9xT ~ 0

    Самоорганизация органоидов из клеток, происходящих из энтодермы

  • 1.

    Eiraku M, Watanabe K, Matsuo-Takasaki M, Kawada M , Yonemura S, Matsumura M, Wataya T, Nishiyama A, Muguruma K, Sasai Y (2008) Самоорганизованное формирование поляризованных кортикальных тканей из ESCs и его активное манипулирование внешними сигналами. Cell Stem Cell 3 (5): 519–532

    CAS PubMed Google ученый

  • 2.

    Sato T, Vries RG, Snippert HJ, van de Wetering M, Barker N, Stange DE, van Es JH, Abo A, Kujala P, Peters PJ, Clevers H (2009) Одиночные стволовые клетки Lgr5 создают структуры крипта-ворсинка in vitro без мезенхимальной ниши. Nature 459 (7244): 262–265

    CAS PubMed Google ученый

  • 3.

    Rock JR, Onaitis MW, Rawlins EL, Lu Y, Clark CP, Xue Y, Randell SH, Hogan BL (2009) Базальные клетки как стволовые клетки трахеи мыши и эпителия дыхательных путей человека.Proc Natl Acad Sci U S A 106 (31): 12771–12775

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 4.

    McQualter JL, Yuen K, Williams B, Bertoncello I (2010) Доказательства иерархии эпителиальных стволовых / предшественников в легких взрослых мышей. Proc Natl Acad Sci U S A 107 (4): 1414–1419

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 5.

    Lee JH, Bhang DH, Beede A, Huang TL, Stripp BR, Bloch KD, Wagers AJ, Tseng YH, Ryeom S, Kim CF (2014) Дифференцировка стволовых клеток легких у мышей направляется эндотелиальными клетками через Ось BMP4-NFATc1-тромбоспондин-1.Ячейка 156 (3): 440–455

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 6.

    Nikolic MZ, Caritg O, Jeng Q, Johnson JA, Sun D, ​​Howell KJ, Brady JL, Laresgoiti U, Allen G, Butler R, Zilbauer M, Giangreco A, Rawlins EL (2017) Эмбриональное легкое человека кончики эпителия являются мультипотентными предшественниками, которые могут быть расширены in vitro в виде длительно самообновляющихся органоидов. Элиф 6: 6

    Google ученый

  • 7.

    Seiji Y, Ito T, Nakamura Y, Nakaishi-Fukuchi Y, Matsuo A, Sato N, Nogawa H (2019) Альвеолоидный органоид из изолированного эпителия кончика легкого эмбриональной мыши. Hum Cell 32 (2): 103–113

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 8.

    Sachs N, Papaspyropoulos A, Zomer-van Ommen DD, Heo I, Bottinger L, Klay D. Weeber F, Huelsz-Prince G, Iakobachvili N, Amatngalim GD, de Ligt J, van Hoeck A, Proost N, Viveen MC, Любимова A, Teeven L, Derakhshan S, Korving J, Begthel H, Dekkers JF, Kumawat K, Ramos E, van Oosterhout MF, Offerhaus GJ, Wiener DJ, Olimpio EP, Dijkstra KK, Smit EF, van der Linden M, Jaksani S, van de Ven M, Jonkers J, Rios AC, Voest EE, van Moorsel CH, van der Ent CK, Cuppen E, van Oudenaarden A, Coenjaerts FE, Meyaard L, Bont LJ, Peters PJ, Tans SJ , van Zon JS, Boj SF, Vries RG, Beekman JM, Clevers H (2019) Долгосрочное расширение органоидов дыхательных путей человека для моделирования заболеваний.EMBO J 38 (4). https://doi.org/10.15252/embj.2018100300

  • 9.

    Miller AJ, Yu Q, Czerwinski M, Tsai YH, Conway RF, Wu A, Holloway EM, Walker T, Glass IA, Treutlein B, Camp JG, Spence JR (2020) Развитие дыхательных путей человека in vitro и in vivo при одноклеточном разрешении. Dev Cell 53 (1): 117–128 e116

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 10.

    Миллер А.Дж., Краситель Б.Р., Феррер-Торрес Д., Хилл Д.Р., Оверим А.В., Ши Л.Д., Спенс Дж.Р. (2019) Получение легочных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека in vitro.Nat Protoc 14 (2): 518–540

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 11.

    Хуч М., Гехарт Х., ван Бокстель Р., Хамер К., Блокзейл Ф., Верстеген М.М., Эллис Э., ван Венум М., Фукс С.А., де Лигт Дж., Ван де Ветеринг М., Сасаки Н., Бурс С.Дж., Kemperman H, de Jonge J, Ijzermans JN, Nieuwenhuis EE, Hoekstra R, Strom S, Vries RR, van der Laan LJ, Cuppen E, Clevers H (2015) Долгосрочная культура геном-стабильных бипотентных стволовых клеток из печени взрослого человека .Ячейка 160 (1-2): 299-312

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 12.

    Хуч М., Доррелл К., Бодж С.Ф., ван Эс Дж.Х., Ли В.С., ван де Ветеринг М., Сато Т., Хамер К., Сасаки Н., Файнголд М.Дж., Хафт А., Фрис Р.Г., Громпе М., Клеверс Х. (2013) Экспансия in vitro единичных Lgr5 + стволовых клеток печени, индуцированная регенерацией, управляемой Wnt. Nature 494 (7436): 247–250

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 13.

    Camp JG, Sekine K, Gerber T, Loeffler-Wirth H, Binder H, Gac M, Kanton S, Kageyama J, Damm G, Seehofer D, Belicova L, Bickle M, Barsacchi R, Okuda R, Yoshizawa E, Kimura M , Ayabe H, Taniguchi H, Takebe T, Treutlein B (2017) Многолинейная коммуникация регулирует развитие зачатка печени человека от плюрипотентности. Nature 546 (7659): 533–538

    CAS PubMed Google ученый

  • 14.

    Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, Zhang RR, Ueno Y, Zheng YW, Koike N, Aoyama S, Adachi Y, Taniguchi H (2013) с васкуляризацией и функциональностью печень человека из трансплантата зачатка органа, полученного из ИПСК.Nature 499 (7459): 481–484

    CAS PubMed Google ученый

  • 15.

    Ху Х, Гехарт Х, Артегиани Б., Лопес-Иглесиас С., Деккерс Ф, Басак О, ван Эс Дж., Чува де Соуза Лопес С.М., Бегтель Х, Корвинг Дж., Ван ден Борн М., Зоу С., Quirk C, Chiriboga L, Rice CM, Ma S, Rios A, Peters PJ, de Jong YP, Clevers H (2018) Долгосрочное расширение функциональных гепатоцитов мыши и человека в виде трехмерных органоидов. Ячейка 175 (6): 1591–1606 e1519

    CAS PubMed Google ученый

  • 16.

    Peng WC, Logan CY, Fish M, Anbarchian T, Aguisanda F, Alvarez-Varela A, Wu P, Jin Y, Zhu J, Li B, Grompe M, Wang B, Nusse R (2018) Воспалительный цитокин TNFalpha способствует длительному -временная экспансия первичных гепатоцитов в 3D-культуре. Ячейка 175 (6): 1607–1619 e1615

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 17.

    Broutier L, Andersson-Rolf A, Hindley CJ, Boj SF, Clevers H, Koo BK, Huch M (2016) Культура и создание самообновляющихся трехмерных органоидов печени и поджелудочной железы человека и мыши и их генетические особенности. манипуляция.Nat Protoc 11 (9): 1724–1743

    CAS PubMed Google ученый

  • 18.

    Tanimizu N, Miyajima A, Mostov KE (2007) Клетки-предшественники печени развивают эпителиальную полярность типа холангиоцитов в трехмерной культуре. Mol Biol Cell 18 (4): 1472–1479

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 19.

    Огава М., Огава С., Медведь С.Е., Ахмади С., Чин С., Ли Б., Громпе М., Келлер Г., Камат Б.М., Ганекар А. (2015) Направленная дифференцировка холангиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток человека.Nat Biotechnol 33 (8): 853–861

    CAS PubMed Google ученый

  • 20.

    Sampaziotis F, Justin AW, Tysoe OC, Sawiak S, Godfrey EM, Upponi SS, Gieseck RL 3rd, de Brito MC, Berntsen NL, Gomez-Vazquez MJ, Ortmann D, Yiangou L, Ross A, Bargehr J, Бертеро А., Зонневельд MCF, Педерсен М.Т., Павловски М., Валестранд Л., Мадригал П., Георгакопулос Н., Пирмаджид Н., Скелдон Г.М., Кейси Дж., Шу В., Матерек П.М., Снайдерс К.Э., Браун С.Е., Римланд Калифорния, Симоник И., Davies SE, Jensen KB, Zilbauer M, Gelson WTH, Alexander GJ, Sinha S, Hannan NRF, Wynn TA, Karlsen TH, Melum E, Markaki AE, Saeb-Parsy K, Vallier L (2017) Реконструкция внепеченочного желчного дерева мыши с использованием первичных органоидов внепеченочных холангиоцитов человека.Nat Med 23 (8): 954–963

    CAS PubMed Google ученый

  • 21.

    Sampaziotis F, de Brito MC, Madrigal P, Bertero A, Saeb-Parsy K, Soares FAC, Schrumpf E, Melum E, Karlsen TH, Bradley JA, Gelson WT, Davies S, Baker A, Kaser A , Alexander GJ, Hannan NRF, Vallier L (2015) Холангиоциты, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для моделирования заболеваний и валидации лекарств. Nat Biotechnol 33 (8): 845–852

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 22.

    Greggio C, De Franceschi F, Figueiredo-Larsen M, Gobaa S, Ranga A, Semb H, Lutolf M, Grapin-Botton A (2013) Искусственные трехмерные ниши разрушают развитие поджелудочной железы in vitro. Разработка 140 (21): 4452–4462

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 23.

    Хуч М., Бонфанти П., Бодж С.Ф., Сато Т., Луманс С.Дж., ван де Ветеринг М., Соджуди М., Ли В.С., Шуйерс Дж., Граканин А., Рингнальда Ф., Бегтель Х., Хамер К., Малдер Дж., van Es JH, de Koning E, Vries RG, Heimberg H, Clevers H (2013) Неограниченное расширение in vitro биопотентных предшественников поджелудочной железы у взрослых через ось Lgr5 / R-спондина.EMBO J 32 (20): 2708–2721

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 24.

    Георгакопулос Н., Приор Н., Ангрес Б., Мастрогиованни Г., Каган А., Харрисон Д., Хиндли С.Дж., Арнес-Бенито Р., Лиау С.С., Творог А., Слоновая кость Н., Саймонс Б.Д., Мартинкорена И., Вурст Н., Saeb-Parsy K, Huch M (2020) Долгосрочное расширение, геномная стабильность и безопасность органоидов поджелудочной железы взрослого человека in vivo. BMC Dev Biol 20 (1): 4

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 25.

    Loomans CJM, Williams Giuliani N, Balak J, Ringnalda F, van Gurp L, Huch M, Boj SF, Sato T., Kester L, de Sousa Lopes SMC, Roost MS, Bonner-Weir S, Engelse MA, Rabelink TJ, Heimberg H, Vries RGJ, van Oudenaarden A, Carlotti F, Clevers H, de Koning EJP (2018) Расширение ткани поджелудочной железы взрослого человека дает органоиды, содержащие клетки-предшественники с потенциалом эндокринной дифференцировки. Представитель стволовых клеток 10 (3): 712–724

    CAS Google ученый

  • 26.

    Hohwieler M, Illing A, Hermann PC, Mayer T, Stockmann M, Perkhofer L, Eiseler T, Antony JS, Muller M, Renz S, Kuo CC, Lin Q, Sendler M, Breunig M, Kleiderman SM, Lechel A, Zenker M, Leichsenring M, Rosendahl J, Zenke M, Sainz B Jr, Mayerle J, Costa IG, Seufferlein T, Kormann M, Wagner M, Liebau S, Kleger A (2017) Ацинарные / протоковые органоиды человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, генерируют человеческие поджелудочная железа после ортотопической трансплантации и позволяет моделировать заболевание. Кишечник 66 (3): 473–486

    CAS PubMed Google ученый

  • 27.

    Mithal A, Capilla A, Heinze D, Berical A, Villacorta-Martin C, Vedaie M, Jacob A, Abo K, Szymaniak A, Peasley M, Stuffer A, Mahoney J, Kotton DN, Hawkins F, Mostoslavsky G (2020) Генерация кишечных органоидов, свободных от мезенхимы, из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Nat Commun 11 (1): 215

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 28.

    Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, Van Es JH, Van den Brink S, Van Houdt WJ, Pronk A, Van Gorp J, Siersema PD, Clevers H (2011) Долгосрочное расширение эпителиальных органоидов из толстой кишки человека, аденомы, аденокарциномы и эпителия Барретта.Гастроэнтерология 141 (5): 1762–1772

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 29.

    Sato T, van Es JH, Snippert HJ, Stange DE, Vries RG, van den Born M, Barker N, Shroyer NF, van de Wetering M, Clevers H (2011) Ячейки Панета составляют нишу для Lgr5 стволовые клетки в криптах кишечника. Nature 469 (7330): 415–418

    CAS PubMed Google ученый

  • 30.

    Spence JR, Mayhew CN, Rankin SA, Kuhar MF, Vallance JE, Tolle K, Hoskins EE, Kalinichenko VV, Wells SI, Zorn AM, Shroyer NF, Wells JM (2011) Направленная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в ткань кишечника в пробирка. Nature 470 (7332): 105–109

    PubMed Google ученый

  • 31.

    Ootani A, Li X, Sangiorgi E, Ho QT, Ueno H, Toda S, Sugihara H, Fujimoto K, Weissman IL, Capecchi MR, Kuo CJ (2009) Поддерживаемая in vitro культура кишечного эпителия в Wnt -зависимая ниша стволовых клеток.Nat Med 15 (6): 701–706

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 32.

    Jung P, Sato T, Merlos-Suarez A, Barriga FM, Iglesias M, Rossell D, Auer H, Gallardo M, Blasco MA, Sancho E, Clevers H, Batlle E (2011) Изоляция и in vitro экспансия стволовых клеток толстой кишки человека. Nat Med 17 (10): 1225–1227

    CAS PubMed Google ученый

  • 33.

    Trisno SL, Philo KED, McCracken KW, Cata EM, Ruiz-Torres S, Rankin SA, Han L, Nasr T., Chaturvedi P, Rothenberg ME, Mandegar MA, Wells SI, Zorn AM, Wells JM ( 2018) Органоиды пищевода из плюрипотентных стволовых клеток человека определяют функции Sox2 во время спецификации пищевода.Стволовые клетки клеток 23 (4): 501–515 e507

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 34.

    Zhang Y, Yang Y, Jiang M, Huang SX, Zhang W, Al Alam D, Danopoulos S, Mori M, Chen YW, Balasubramanian R, Chuva de Sousa Lopes SM, Serra C, Bialecka M, Kim E, Lin S, Toste de Carvalho ALR, Riccio PN, Cardoso WV, Zhang X, Snoeck HW, Que J (2018) Трехмерное моделирование развития пищевода с использованием базальных предшественников PSC человека показывает критическую роль передачи сигналов notch.Стволовые клетки клетки 23 (4): 516–529 e515

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 35.

    Kasagi Y, Chandramouleeswaran PM, Whelan KA, Tanaka K, Giroux V, Sharma M, Wang J, Benitez AJ, DeMarshall M, Tobias JW, Hamilton KE, Falk GW, Spergel JM, Klein-Szanto AJ, Rustgi AK, Muir AB, Nakagawa H (2018) Органоидная система пищевода обнаруживает функциональное взаимодействие между выемкой и цитокинами в реактивных эпителиальных изменениях.Cell Mol Gastroenterol Hepatol 5 (3): 333–352

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 36.

    McCracken KW, Aihara E, Martin B, Crawford CM, Broda T, Treguier J, Zhang X, Shannon JM, Montrose MH, Wells JM (2017) Wnt / бета-катенин способствует спецификации дна желудка у мышей и люди. Nature 541 (7636): 182–187

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 37.

    Bartfeld S, Bayram T., van de Wetering M, Huch M, Begthel H, Kujala P, Vries R, Peters PJ, Clevers H (2015) Расширение in vitro эпителиальных стволовых клеток желудка человека и их ответы на бактериальную инфекцию. Гастроэнтерология 148 (1): 126–136 e126

    PubMed Google ученый

  • 38.

    McCracken KW, Cata EM, Crawford CM, Sinagoga KL, Schumacher M, Rockich BE, Tsai YH, Mayhew CN, Spence JR, Zavros Y, Wells JM (2014) Моделирование человеческого развития и болезней в плюрипотентной основе- органоиды желудка клеточного происхождения.Nature 516 (7531): 400–404

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 39.

    Stange DE, Koo BK, Huch M, Sibbel G, Basak O, Lyubimova A, Kujala P, Bartfeld S, Koster J, Geahlen JH, Peters PJ, van Es JH, van de Wetering M, Mills JC , Clevers H (2013) Дифференцированные главные клетки Troy + действуют как резервные стволовые клетки, генерируя все клоны эпителия желудка. Ячейка 155 (2): 357–368

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 40.

    Баркер Н., Хуч М., Куяла П., ван де Ветеринг М., Снапперт Х. Дж., Ван Эс Дж. Х., Сато Т., Штанге, Д. Э., Бегтель Х, ван ден Борн М., Даненберг Э, ван ден Бринк С., Корвинг Дж., Або А, Peters PJ, Wright N, Poulsom R, Clevers H (2010) Lgr5 (+ ve) стволовые клетки стимулируют самообновление в желудке и создают долгоживущие желудочные единицы in vitro. Стволовая клетка 6 (1): 25–36

    CAS PubMed Google ученый

  • 41.

    Hepburn AC, Curry EL, Moad M, Steele RE, Franco OE, Wilson L, Singh P, Buskin A, Crawford SE, Gaughan L, Mills IG, Hayward SW, Robson CN, Heer R (2020) Размножение ткани предстательной железы человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.Стволовые клетки Transl Med 9: 734–745

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 42.

    Drost J, Karthaus WR, Gao D, Driehuis E, Sawyers CL, Chen Y, Clevers H (2016) Системы органоидных культур для эпителиальной и раковой ткани простаты. Nat Protoc 11 (2): 347–358

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 43.

    Karthaus WR, Iaquinta PJ, Drost J, Gracanin A, van Boxtel R, Wongvipat J, Dowling CM, Gao D, Begthel H, Sachs N, Vries RGJ, Cuppen E, Chen Y, Sawyers CL, Clevers HC (2014) Идентификация мультипотентных клеток-предшественников просвета в культурах органоидов предстательной железы человека.Ячейка 159 (1): 163–175

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 44.

    Hofner T, Eisen C, Klein C, Rigo-Watermeier T, Goeppinger SM, Jauch A, Schoell B, Vogel V, Noll E, Weichert W, Baccelli I, Schillert A, Wagner S, Pahernik S, Sprick MR, Trumpp A (2015) Определенные условия для выделения и размножения базальных клеток-предшественников простаты мыши и человека. Репродукция стволовых клеток 4 (3): 503–518

    Google ученый

  • 45.

    Chua CW, Shibata M, Lei M, Toivanen R, Barlow LJ, Bergren SK, Badani KK, McKiernan JM, Benson MC, Hibshoosh H, Shen MM (2014) Предшественники одиночного просветного эпителия могут генерировать органоиды простаты в культуре. Nat Cell Biol 16 (10): 951–961, 951-954

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 46.

    Garraway IP, Sun W, Tran CP, Perner S, Zhang B, Goldstein AS, Hahm SA, Haider M, Head CS, Reiter RE, Rubin MA, Witte ON (2010) Сферические клетки простаты человека представляют собой подмножество базальных эпителиальных клеток, способных к регенерации желез in vivo.Простата 70 (5): 491–501

    PubMed Google ученый

  • 47.

    Xin L, Lukacs RU, Lawson DA, Cheng D, Witte ON (2007) Самообновление и многолинейная дифференцировка in vitro из мышиных стволовых клеток простаты. Стволовые клетки 25 (11): 2760–2769

    CAS PubMed Google ученый

  • 48.

    Хоссейни З.Ф., Нельсон Д.А., Москва Н., Ларсен М. (2019) Создание эмбриональных органоидов слюнных желез.Curr Protoc Cell Biol 83 (1): e76. https://doi.org/10.1002/cpcb.76

    Статья PubMed Google ученый

  • 49.

    Pringle S, Maimets M, van der Zwaag M, Stokman MA, van Gosliga D, Zwart E, Witjes MJ, de Haan G, van Os R, Coppes RP (2016) Функциональное восстановление стволовых клеток слюнных желез человека радиационно поврежденные слюнные железы. Стволовые клетки 34 (3): 640–652

    CAS PubMed Google ученый

  • 50.

    Maimets M, Rocchi C, Bron R, Pringle S, Kuipers J, Giepmans BN, Vries RG, Clevers H, de Haan G, van Os R, Coppes RP (2016) Долгосрочная экспансия стволовых клеток слюнных желез in vitro. по сигналам Wnt. Представитель стволовых клеток 6 (1): 150–162

    CAS Google ученый

  • 51.

    Мария О.М., Зейтуни А., Гологан О., Тран С.Д. (2011) Матригель улучшает функциональные свойства первичных клеток слюнных желез человека. Tissue Eng A 17 (9–10): 1229–1238

    CAS Google ученый

  • 52.

    Feng J, van der Zwaag M, Stokman MA, van Os R, Coppes RP (2009) Выделение и характеристика клеток слюнных желез человека для трансплантации стволовых клеток с целью уменьшения гипосаливации, вызванной радиацией. Radiother Oncol 92 (3): 466–471

    CAS PubMed Google ученый

  • 53.

    Lombaert IM, Brunsting JF, Wierenga PK, Faber H, Stokman MA, Kok T, Visser WH, Kampinga HH, de Haan G, Coppes RP (2008) Восстановление функции слюнных желез после трансплантации стволовых клеток в облученных железы.PLoS One 3 (4): e2063. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002063

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 54.

    Wei C, Larsen M, Hoffman MP, Yamada KM (2007) Самоорганизация и морфогенез ветвления первичных эпителиальных клеток слюны. Tissue Eng 13 (4): 721–735

    CAS PubMed Google ученый

  • 55.

    Shin K, Lee J, Guo N, Kim J, Lim A, Qu L, Mysorekar IU, Beachy PA (2011) Обратная связь Hedgehog / Wnt поддерживает регенеративную пролиферацию эпителиальных стволовых клеток в мочевом пузыре.Nature 472 (7341): 110–114

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 56.

    Сайто Й, Ониси Н., Таками Х, Сейшима Р., Иноуэ Х, Хирата Й, Камеяма К., Цучихаси К., Сугихара Е., Утино С., Ито К., Кавакубо Х, Такеучи Х, Китагава Й, Сая Х. , Nagano O (2018) Разработка функциональной модели щитовидной железы на основе системы культивирования органоидов. Biochem Biophys Res Commun 497 (2): 783–789

    CAS PubMed Google ученый

  • 57.

    Курманн А.А., Серра М., Хокинс Ф., Ранкин С.А., Мори М., Астапова И., Уллас С., Лин С., Билодо М., Россант Дж., Жан Дж. К., Икономоу Л., Детердинг Р. Р., Шеннон Дж. М., Цорн А. М., Холленберг А. Н., Коттон DN (2015) Восстановление функции щитовидной железы путем трансплантации дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток. Клеточная стволовая клетка 17 (5): 527–542

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 58.

    Антоника Ф., Каспрзик Д.Ф., Опиц Р., Яковино М., Ляо XH, Думитреску А.М., Рефетофф С., Переманс К., Манто М., Киба М., Костальола С. (2012) Создание функциональной щитовидной железы из эмбриональных стволовых клеток.Nature 491 (7422): 66–71

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 59.

    Хакен Х (2008) Самоорганизация. Scholarpedia 3. https://doi.org/10.4249/scholarpedia.1401

  • 60.

    Heylighen F (2001) Наука о самоорганизации и адаптивности. Энциклопедия систем жизнеобеспечения 5 (3): 253–280

  • 61.

    Gjorevski N, Sachs N, Manfrin A, Giger S, Bragina ME, Ordonez-Moran P, Clevers H, Lutolf MP (2016) Дизайнерские матрицы для кишечных стволовых клеток и органоидов.Nature 539 (7630): 560–564

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 62.

    Cruz-Acuna R, Quiros M, Farkas AE, Dedhia PH, Huang S, Siuda D, Garcia-Hernandez V, Miller AJ, Spence JR, Nusrat A, Garcia AJ (2017) Синтетические гидрогели для кишечника человека образование органоидов и заживление ран толстой кишки. Nat Cell Biol 19 (11): 1326–1335

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 63.

    Koike H, Iwasawa K, Ouchi R, Maezawa M, Giesbrecht K, Saiki N, Ferguson A, Kimura M, Thompson WL, Wells JM, Zorn AM, Takebe T (2019) Моделирование гепато-билиарного-панкреатического органогенеза человека из передней кишки граница средней кишки. Nature 574 (7776): 112–116

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 64.

    Wang D, Wang J, Bai L, Pan H, Feng H, Clevers H, Zeng YA (2020) Долгосрочная экспансия органоидов островков поджелудочной железы от резидентных предшественников Procr (+).Ячейка 180 (6): 1198–1211 e1119

    CAS PubMed Google ученый

  • 65.

    Джораку А., Салливан Калифорния, Ю Дж, Атала А. (2007) Восстановление трехмерных структур ткани слюнной железы человека in vitro. Дифференциация 75 (4): 318–324

    CAS PubMed Google ученый

  • 66.

    Serra D, Mayr U, Boni A, Lukonin I, Rempfler M, Challet Meylan L, Stadler MB, Strnad P, Papasaikas P, Vischi D, Waldt A, Roma G, Liberali P (2019) Self- нарушение организации и симметрии в развитии органоидов кишечника.Nature 569 (7754): 66–72

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 67.

    Aloia L, McKie MA, Vernaz G, Cordero-Espinoza L, Aleksieva N, van den Ameele J, Antonica F, Font-Cunill B, Raven A, Aiese Cigliano R, Belenguer G, Mort RL, Brand AH, Zernicka-Goetz M, Forbes SJ, Miska EA, Huch M (2019) Эпигенетическое ремоделирование лицензирует взрослые холангиоциты для образования органоидов и регенерации печени. Nat Cell Biol 21 (11): 1321–1333

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 68.

    Yui S, Azzolin L, Maimets M, Pedersen MT, Fordham RP, Hansen SL, Larsen HL, Guiu J, Alves MRP, Rundsten CF, Johansen JV, Li Y, Madsen CD, Nakamura T, Watanabe M, Nielsen OH, Schweiger PJ, Piccolo S, Jensen KB (2018) YAP / TAZ-зависимое перепрограммирование эпителия толстой кишки связывает ремоделирование ECM с регенерацией ткани. Клеточная стволовая клетка 22 (1): 35–49 e37

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 69.

    Boj SF, Hwang CI, Baker LA, Chio II, Engle DD, Corbo V, Jager M, Ponz-Sarvise M, Tiriac H, Spector MS, Gracanin A, Oni T., Yu KH, van Boxtel R , Huch M, Rivera KD, Wilson JP, Feigin ME, Ohlund D, Handly-Santana A, Ardito-Abraham CM, Ludwig M, Elyada E, Alagesan B, Biffi G, Yordanov GN, Delcuze B, Creighton B, Wright K, Park Y, Morsink FH, Molenaar IQ, Borel Rinkes IH, Cuppen E, Hao Y, Jin Y, Nijman IJ, Iacobuzio-Donahue C, Leach SD, Pappin DJ, Hammell M, Klimstra DS, Basturk O, Hruban RH, Offerhaus GJ , Vries RG, Clevers H, Tuveson DA (2015) Органоидные модели протокового рака поджелудочной железы человека и мыши.Ячейка 160 (1-2): 324–338

    CAS PubMed Google ученый

  • 70.

    Fordham RP, Yui S, Hannan NR, Soendergaard C, Madgwick A, Schweiger PJ, Nielsen OH, Vallier L, Pedersen RA, Nakamura T, Watanabe M, Jensen KB (2013) Трансплантация предшественников расширенного кишечника плода способствует регенерации толстой кишки после травм. Стволовая клетка 13 (6): 734–744

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 71.

    Prior N, Hindley CJ, Rost F, Melendez E, Lau WWY, Gottgens B, Rulands S, Simons BD, Huch M (2019) Стволовые клетки Lgr5 (+) и клетки-предшественники находятся на вершине гетерогенного эмбрионального пула гепатобластов. Разработка 146 (12): dev174557

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 72.

    Guiu J, Hannezo E, Yui S, Demharter S, Ulyanchenko S, Maimets M, Jorgensen A, Perlman S, Lundvall L, Mamsen LS, Larsen A, Olesen RH, Andersen CY, Thuesen LL, Hare KJ , Pers TH, Khodosevich K, Simons BD, Jensen KB (2019) Отслеживание происхождения стволовых клеток кишечника взрослых.Nature 570 (7759): 107–111

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 73.

    Li X, Ootani A, Kuo C (2016) Система культивирования интерфейса воздух-жидкость для трехмерной культуры органоидов различных первичных тканей желудочно-кишечного тракта. Методы Mol Biol 1422: 33–40

    CAS PubMed Google ученый

  • 74.

    Хокинс Ф., Крамер П., Джейкоб А., Драйвер И., Томас Д. К., Макколи К. Б., Сквир Н., Крейн А. М., Курманн А. А., Холленберг А. Н., Нгуен С., Вонг Б. Г., Халил А. С., Хуанг С. X., Гуттентаг С. , Rock JR, Shannon JM, Davis BR, Kotton DN (2017) Предполагаемое выделение экспрессирующих NKX2-1 предшественников легких человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток.J Clin Invest 127 (6): 2277–2294

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 75.

    Джейкоб А., Морли М., Хокинс Ф., МакКоули К. Б., Джин Дж. К., Хайнс Х., Na CL, Уивер Т. Е., Ведай М., Херли К., Хайндс А., Руссо С. Дж., Кук С., Захариас В., Очс М. , Traber K, Quinton LJ, Crane A, Davis BR, White FV, Wambach J, Whitsett JA, Cole FS, Morrisey EE, Guttentag SH, Beers MF, Kotton DN (2017) Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека в функциональный альвеолярный эпителиальный слой легких клетки.Стволовая клетка 21 (4): 472–488 e410

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 76.

    Цорн А.М., Уэллс Дж.М. (2009) Развитие эндодермы позвоночных и формирование органов. Annu Rev Cell Dev Biol 25: 221–251

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 77.

    Munera JO, Sundaram N, Rankin SA, Hill D, Watson C, Mahe M, Vallance JE, Shroyer NF, Sinagoga KL, Zarzoso-Lacoste A, Hudson JR, Howell JC, Chatuvedi P, Spence JR, Shannon JM, Zorn AM, Helmrath MA, Wells JM (2017) Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека в органоиды толстой кишки посредством временной активации передачи сигналов BMP.Стволовая клетка 21 (1): 51–64 e56

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 78.

    Dye BR, Hill DR, Ferguson MA, Tsai YH, Nagy MS, Dyal R, Wells JM, Mayhew CN, Nattiv R, Klein OD, White ES, Deutsch GH, Spence JR (2015) Создание in vitro органоидов легких, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека. Элиф 4: 4

    Google ученый

  • 79.

    Huang L, Holtzinger A, Jagan I, BeGora M, Lohse I, Ngai N, Nostro C, Wang R, Muthuswamy LB, Crawford HC, Arrowsmith C, Kalloger SE, Renouf DJ, Connor AA, Cleary S , Schaeffer DF, Roehrl M, Tsao MS, Gallinger S, Keller G, Muthuswamy SK (2015) Моделирование протокового рака поджелудочной железы и скрининг лекарств с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток и опухолевых органоидов, полученных от пациентов.Nat Med 21 (11): 1364–1371

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 80.

    Bakhti M, Scheibner K, Tritschler S, Bastidas-Ponce A, Tarquis-Medina M, Theis FJ, Lickert H (2019) Создание системы трехмерного моделирования высокого разрешения для изучения биологии эпителиальных клеток поджелудочной железы in vitro . Мол Метаб 30: 16–29

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 81.

    Co JY, Margalef-Catala M, Li X, Mah AT, Kuo CJ, Monack DM, Amieva MR (2019) Контроль полярности эпителия: человеческая энтероидная модель взаимодействий хозяин-патоген. Cell Rep 26 (9): 2509–2520 e2504

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 82.

    Sampaziotis F, de Brito MC, Geti I, Bertero A, Hannan NR, Vallier L (2017) Направленная дифференцировка индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в функциональные холангиоцитоподобные клетки.Nat Protoc 12 (4): 814–827

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 83.

    Dahl-Jensen SB, Yennek S, Flasse L, Larsen HL, Sever D, Karremore G, Novak I, Sneppen K, Grapin-Botton A (2018) Деконструкция принципов формирования сети протоков в поджелудочной железе. PLoS Biol 16 (7): e2002842. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002842

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 84.

    Dahl-Jensen SB, Figueiredo-Larsen M, Grapin-Botton A, Sneppen K (2016) Короткодействующие сигналы подавления роста от эпителия могут управлять нестереотипным ветвлением в поджелудочной железе. Phys Biol 13 (1): 016007. https://doi.org/10.1088/1478-3975/13/1/016007

    Статья PubMed Google ученый

  • 85.

    Tallinen T, Chung JY, Biggins JS, Mahadevan L (2014) Гирификация от ограниченного кортикального расширения. Proc Natl Acad Sci U S A 111 (35): 12667–12672

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 86.

    Beccari L, Moris N, Girgin M, Turner DA, Baillie-Johnson P, Cossy AC, Lutolf MP, Duboule D, Arias AM (2018) Многоосные свойства самоорганизации эмбриональных стволовых клеток мыши в гаструлоиды. Nature 562 (7726): 272–276

    CAS PubMed Google ученый

  • 87.

    Nitschke G, Schut M, Eiben A (2008) Эмерджентная специализация в биологически вдохновленных системах коллективного поведения. В кн .: Интеллектуальные сложные адаптивные системы.IGI Global, pp 215–253

  • 88.

    Duarte A, Pen I, Keller L, Weissing FJ (2012) Эволюция самоорганизованного разделения труда в модели порога реакции. Behav Ecol Sociobiol 66 (6): 947–957

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 89.

    Duarte A, Weissing FJ, Pen I, Keller L (2011) Эволюционная перспектива самоорганизованного разделения труда у социальных насекомых. Annu Rev Ecol Evol Syst 42: 91–110

    Google ученый

  • 90.

    Yin X, Farin HF, van Es JH, Clevers H, Langer R, Karp JM (2014) Ниши-независимые высокочистые культуры Lgr5 + кишечных стволовых клеток и их потомков. Nat Methods 11 (1): 106–112

    CAS PubMed Google ученый

  • 91.

    McCauley KB, Hawkins F, Serra M, Thomas DC, Jacob A, Kotton DN (2017) Эффективное получение функционального эпителия дыхательных путей человека из плюрипотентных стволовых клеток посредством временной регуляции передачи сигналов Wnt.Cell Stem Cell 20 (6): 844–857 e846

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 92.

    Miller AJ, Hill DR, Nagy MS, Aoki Y, Dye BR, Chin AM, Huang S, Zhu F, White ES, Lama V, Spence JR (2018) Индукция in vitro и приживление легкого in vivo клетки-предшественники кончика почки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека. Представитель стволовых клеток 10 (1): 101–119

    CAS Google ученый

  • 93.

    Nusse YM, Savage AK, Marangoni P, Rosendahl-Huber AKM, Landman TA, de Sauvage FJ, Locksley RM, Klein OD (2018) Паразитические гельминты вызывают реверсию плода в нише стволовых клеток кишечника. Nature 559 (7712): 109–113

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 94.

    Mead BE, Ordovas-Montanes J, Braun AP, Levy LE, Bhargava P, Szucs MJ, Ammendolia DA, MacMullan MA, Yin X, Hughes TK, Wadsworth MH 2nd, Ahmad R, Rakoff-Nahoum S, Карр С.А., Лангер Р., Коллинз Дж. Дж., Шалек А. К., Карп Дж. М. (2018) Использование одноклеточной геномики для улучшения физиологической верности типов клеток, полученных из органоидов.BMC Biol 16 (1): 62

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 95.

    Srinivasan T, Than EB, Bu P, Tung KL, Chen KY, Augenlicht L, Lipkin SM, Shen X (2016) Передача сигналов Notch регулирует асимметричное деление и взаимное преобразование между lgr5 и bmi1, экспрессирующими кишечные стволовые клетки. Научный представитель 6: 26069

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 96.

    Yan KS, Janda CY, Chang J, Zheng GXY, Larkin KA, Luca VC, Chia LA, Mah AT, Han A, Terry JM, Ootani A, Roelf K, Lee M, Yuan J, Li X, Bolen CR, Wilhelmy J, Davies PS, Ueno H, von Furstenberg RJ, Belgrader P, Ziraldo SB, Ordonez H, Henning SJ, Wong MH, Snyder MP, Weissman IL, Hsueh AJ, Mikkelsen TS, Garcia KC, Kuo CJ (2017) Неэквивалентность лигандов Wnt и R-спондина во время самообновления Lgr5 (+) кишечных стволовых клеток. Nature 545 (7653): 238–242

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 97.

    Shoshkes-Carmel M, Wang YJ, Wangensteen KJ, Toth B, Kondo A, Massasa EE, Itzkovitz S, Kaestner KH (2018) Субэпителиальные телоциты являются важным источником Wnts, которые поддерживают кишечные крипты. Nature 557 (7704): 242–246

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 98.

    Ueo T, Imayoshi I, Kobayashi T, Ohtsuka T, Seno H, Nakase H, Chiba T, Kageyama R (2012) Роль генов Hes в развитии кишечника, гомеостазе и образовании опухолей.Разработка 139 (6): 1071–1082

    CAS PubMed Google ученый

  • 99.

    Танигучи К., Ву Л.В., Гривенников С.И., де Йонг П.Р., Лиан И., Юй FX, Ван К., Хо С.Б., Боланд Б.С., Чанг Дж. A, Zucman-Rossi J, Guan KL, Karin M (2015) Модуль gp130-Src-YAP связывает воспаление с регенерацией эпителия. Nature 519 (7541): 57–62

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 100.

    Panciera T, Azzolin L, Fujimura A, Di Biagio D, Frasson C, Bresolin S, Soligo S, Basso G, Bicciato S, Rosato A, Cordenonsi M, Piccolo S (2016) Индукция расширяющихся тканеспецифичных стволовых клеток / клеток-предшественников через временную экспрессию YAP / TAZ. Клеточная стволовая клетка 19 (6): 725–737

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 101.

    Bailey DD, Zhang Y, van Soldt BJ, Jiang M, Suresh S, Nakagawa H, Rustgi AK, Aceves SS, Cardoso WV, Que J (2019) Использование трехмерных органоидов, полученных из hPSC, и генетики мышей для определить роль YAP в развитии пищевода.Разработка 146 (23): dev178855

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 102.

    Yimlamai D, Christodoulou C, Galli GG, Yanger K, Pepe-Mooney B, Gurung B, Shrestha K, Cahan P, Stanger BZ, Camargo FD (2014) Активность пути бегемота влияет на судьбу клеток печени. Ячейка 157 (6): 1324–1338

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 103.

    Buchmann B, Meixner LK, Fernandez P, Hutterer FP, Raich MK, Scheel CH, Bausch AR (2019) Механическая пластичность ECM направляет морфогенез инвазивного ветвления в органоидах молочной железы человека.bioRxiv 860015. https://doi.org/10.1101/860015

  • 104.

    Ян Кью, Сюэ С.Л., Чан СиДжей, Ремпфлер М., Виски Д., Гутьеррес Ф.М., Хиираги Т., Ханнезо Э., Либерали П (2020) Ячейка судьба координирует механоосмотические силы в морфогенезе кишечных крипт. bioRxiv 2020.2005.2013.0. https://doi.org/10.1101/2020.05.13.0

  • 105.

    Couzin ID (2018) Синхронизация: залог эффективного общения в коллективах животных. Trends Cogn Sci 22 (10): 844–846

    PubMed Google ученый

  • 106.

    Paperin G, Green DG, Sadedin S (2011) Двухфазная эволюция в сложных адаптивных системах. Интерфейс J R Soc 8 (58): 609–629

    PubMed Google ученый

  • 107.

    Rosenthal SB, Twomey CR, Hartnett AT, Wu HS, Couzin ID (2015) Выявление скрытых сетей взаимодействия в группах мобильных животных позволяет прогнозировать сложную поведенческую инфекцию. Proc Natl Acad Sci U S A 112 (15): 4690–4695

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 108.

    Linnemann JR, Meixner LK, Miura H, Scheel CH (2017) Органотипический 3D-анализ первичных эпителиальных клеток молочной железы человека, который повторяет морфогенез ветвления. Методы Mol Biol 1612: 125–137

    CAS PubMed Google ученый

  • 109.

    Gjorevski N, Lutolf MP (2017) Синтез и характеристика четко определенных гидрогелевых матриц и их применение в культуре кишечных стволовых клеток и органоидов. Nat Protoc 12 (11): 2263–2274

    CAS PubMed Google ученый

  • 110.

    Cruz-Acuna R, Quiros M, Huang S, Siuda D, Spence JR, Nusrat A, Garcia AJ (2018) Гидрогели PEG-4MAL для создания органоидов человека, культивирования и доставки in vivo. Nat Protoc 13 (9): 2102–2119

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 111.

    Broguiere N, Isenmann L, Hirt C, Ringel T, Placzek S, Cavalli E, Ringnalda F, Villiger L, Zullig R, Lehmann R, Rogler G, Heim MH, Schuler J, Zenobi-Wong M, Schwank G (2018) Рост эпителиальных органоидов в определенном гидрогеле.Adv Mater 30 (43): e1801621. https://doi.org/10.1002/adma.201801621

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 112.

    Capeling MM, Czerwinski M, Huang S, Tsai YH, Wu A, Nagy MS, Juliar B, Sundaram N, Song Y, Han WM, Takayama S, Alsberg E, Garcia AJ, Helmrath M, Putnam AJ , Spence JR (2019) Неадгезивные альгинатные гидрогели поддерживают рост кишечных органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Представитель стволовых клеток 12 (2): 381–394

    CAS Google ученый

  • 113.

    Blondel D, Lutolf MP (2019) Биоинспирированные гидрогели для трехмерной культуры органоидов. Чимиа (Аарау) 73 (1): 81–85

    Google ученый

  • 114.

    Takebe T, Zhang B, Radisic M (2017) Синергетическая инженерия: органоиды встречаются «органы на кристалле». Стволовая клетка 21 (3): 297–300

    CAS PubMed Google ученый

  • 115.

    Чжан Б., Radisic M (2017) Выход на рынок устройств «орган-на-кристалле».Лабораторный чип 17 (14): 2395–2420

    CAS PubMed Google ученый

  • Моделирование рака желудка человека с использованием органоидов

    Введение

    Рак желудка занимает пятое место по распространенности злокачественных новообразований и вторую ведущую причину смерти от рака во всем мире.1 Кроме того, аденокарциномы пищеводно-желудочного перехода (AEG) представляют собой единое целое. с растущими показателями заболеваемости и гистологическим совпадением с раком желудка.2 3 Можно выделить несколько гистологических подтипов рака желудка, из которых более 90% составляют аденокарциномы. В то время как ВОЗ классифицирует четыре различных основных типа аденокарциномы желудка 4, критерии Лорена как наиболее широко используемая классификация делятся на кишечную, диффузную и смешанную типы.5 Исследовательская сеть Атласа генома рака (TCGA) охарактеризовала аденокарциному желудка на четыре различные молекулярные подгруппы6 : положительные по вирусу Эпштейна-Барра (EBV) с частыми мутациями PIK3CA и подавлением CDKN2A , подтип микросателлитной нестабильной (MSI) с фенотипом гипермутации, геномически стабильный (GS) подтип с диффузной гистологией и частым CDh2 и мутации RHOA и подтип хромосомной нестабильности (CIN), демонстрирующий анеуплоидию и частую мутацию TP53 , а также активацию пути рецепторная тирозинкиназа (RTK) -RAS.Молекулярная характеристика AEG показала их высокое сходство с подтипом CIN рака желудка.

    Прогноз рака желудка часто плохой. Часто отсутствие клинических признаков приводит к поздней постановке диагноза: у трех четвертей пациентов неизлечимое прогрессирующее заболевание.8 Хирургическое лечение является единственным вариантом лечения. Кроме того, междисциплинарные подходы, включая неоадъювантную и адъювантную химиотерапию, привели к повышению показателей выживаемости.9 10 Наиболее часто используемыми химиотерапевтическими препаратами для лечения рака желудка являются фторпиримидины (например, 5-фторурацил (5-FU), капецитабин, S-1), платина. соединения (например, цисплатин, оксалиплатин), доцетаксел и эпирубицин.9–11 Помимо классической химиотерапии, генетические изменения представляют собой молекулярные мишени для новых вариантов лечения. На данный момент единственными одобренными таргетными препаратами являются трастузумаб, моноклональные антитела, ингибирующие передачу сигналов рецептора эпидермального фактора роста (HER) -2, и рамуцирумаб, антитело против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Антитела к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) цетуксимаб и панитумумаб или антитело против VEGF бевацизумаб не смогли улучшить показатели выживаемости.Одной из причин может быть отсутствие соответствующих биомаркеров для направления таргетной терапии нужным пациентам.

    Недавно разработанная трехмерная (3D) система культивирования, названная «органоидами», открывает новые возможности в доклиническом тестировании индивидуальной терапии. Первоначально разработанные на основе потребностей роста стволовых клеток тонкого кишечника, органоиды к настоящему времени были разработаны для нескольких органов, включая стволовые клетки привратника желудка и тела.14-17 Органоиды точно воспроизводят многие аспекты ткани, из которой они получены, например способность к дифференцировке. тканеспецифические клоны, а также самообновление стволовых клеток.18 19 Органоиды желудка человека оказались ценным инструментом для изучения патогенных инфекций. 20 21 На основе методов культивирования нормальных тканей были разработаны успешные протоколы для нескольких видов рака у человека. 22–24 Преимущества культивирования органоидов заключаются в коротком времени. рамки для создания по сравнению с моделями ксенотрансплантата и простота манипуляции.25 26 Большие коллекции органоидов индивидуальных образцов пациентов функционируют как живые биобанки человека. Их полезность была продемонстрирована, например, для биобанка рака прямой и прямой кишки, который подвергался проверке на лекарства для индивидуализации лечения пациента и поиска новых терапевтических средств.27 Помимо первичных органоидов, происходящих от рака, возможно образование органоидов ЖКТ из метастатических поражений, и лечение этими органоидами повторяет клиническую реакцию соответствующих пациентов.

    В этом исследовании мы усовершенствовали протокол культивирования органоидов рака желудка человека, классифицировали образцы в соответствии с их молекулярным профилем, оценили их химиотерапевтический ответ и провели целевое лечение в соответствии с конкретными мутациями, вызываемыми лекарственными препаратами.

    Результаты

    Культура органоидов рака желудка человека

    Ткань с гистологически диагностированной аденокарциномой желудка или пищевода получали из образцов хирургической резекции (рисунок 1A).Культуры были инициированы с использованием той же органоидной среды, что и для нормальной ткани желудка.20 Чтобы повысить успешное инициирование культур органоидов и свести к минимуму возникновение переноса по нормальным желудочным железам, были оптимизированы метод и время переваривания ткани, а также обработка изолированных участков опухоли ( описанных в дополнительных онлайн-методах). Всего удалось инициировать 20 культур органоидов рака желудка. Мы выбрали четыре линии органоидов для дальнейшего анализа на основе их высокой скорости роста с соотношением расщепления 1: 2/1: 3 два раза в неделю.Эти линии органоидов показали разные морфологические фенотипы, указывающие на разные молекулярные генотипы (рисунок 1B). DD107 (происходящий из карциномы тела) имел кистозную структуру с утолщенным эпителием. DD109 (AEG I) продемонстрировал некогерентный характер роста винограда. DD191 (AEG II) и DD282 (карцинома антрального отдела) имели компактную морфологию без просвета, при этом DD282 был чрезвычайно устойчив к диссоциации. Нормальные органоиды желудка (DD320N, DD379N, DD392N, DD399N) представляют собой однослойный эпителий и кистообразную структуру.Все линии органоидов непрерывно культивировались более 1 года без изменения поведения роста или морфологического фенотипа. Кроме того, циклы замораживания и оттаивания не влияли и не изменяли эти характеристики роста (данные не показаны). Органоиды рака желудка размножались с разной скоростью, но все с более высоким процентом, чем нормальные органоиды (рисунок 1C). Чтобы охарактеризовать зависимость от факторов роста, мы пропустили по очереди каждое соответствующее соединение среды для нормального роста органоидов (рисунок 1D). В целом, реакция между линиями органоидов заметно различалась.Нормальные органоиды действительно растут долго только на полной среде. Отсутствие A38-01, Fgf10 и Wnt не оказало фенотипического воздействия на линии рака. Noggin, Egf и комбинация Wnt плюс Rspondin были важны в разной степени. Размещение органоидов в 2D в пластиковых колбах привело к прикреплению клеток, но дальнейшее пассирование путем механической диссоциации или ферментативного расщепления было невозможно (данные не показаны). В эксперименте по трансплантации ксенотрансплантата линии раковых органоидов вводили подкожно в задние лапы мышей.Рост опухоли наблюдался для всех линий органоидов у каждой мыши (фигура 1E). Человеческое происхождение ксенотрансплантатов было доказано окрашиванием антинуклеолами (дополнительный рисунок 1 онлайн). Линия органоидов, показывающая самую низкую скорость пролиферации in vitro (DD191), также показала самый медленный рост in vivo.

    Рисунок 1

    Культуры органоидов рака желудка человека размножаются in vitro. (A) Схема создания культуры раковых органоидов и проведенных анализов. (B) Репрезентативные изображения четырех различных линий раковых органоидов и одной нормальной линии (масштабная линейка 100 мкм).(C) Скорость пролиферации органоидов желудка, оцененная с помощью анализа пролиферации EdU. (D) Истощение медиа-компонентов. Каждый аннотированный компонент был исключен из полной среды, а органоиды отслеживались в течение 5 недель. (E) Кривая роста ксенотрансплантатов органоидов (n = 3 для каждой линии органоидов).

    Чтобы проанализировать, сохраняют ли органоиды в культуре характеристики, сходные с характеристиками рака, из которого они были получены, мы провели различные иммуногистохимические реакции для типичных маркеров рака желудка, а именно цитокератина 7, кадгерина 17, карциноэмбрионального антигена и периодической кислотной реакции Шиффа (рис. 2A– D).Эти реакции сравнивали с первичной тканью, а также с опухолями ксенотрансплантата. Линии органоидов, а также полученные из них ксенотрансплантаты достоверно и постоянно воспроизводили иммуногистохимические характеристики соответствующих им первичных раков.

    Рисунок 2

    Органоиды рака желудка человека сохраняют характеристики первичной опухоли. Иммуногистохимия (A) DD107, (B) DD109, (C) DD191 и (D) DD282 с использованием HE, карциноэмбрионального антигена (CEA), цитокератина 7 (CK7), кадгерина 17 (Cadh27) и периодической кислотной реакции Шиффа (PAS) первичный рак, органоиды и опухоли ксенотрансплантата, происходящие из органоидов (шкала 50 мкм).

    Дивергентный ответ органоидов рака желудка на обычные химиотерапевтические препараты

    Пациенты с раком желудка, получавшие неоадъювантное лечение обычными химиотерапевтическими средствами, реагируют в различной степени, что подтверждается степенью их гистологической регрессии.32 Чтобы исследовать, отражают ли органоиды рака желудка эту дивергентную реакцию, мы лечили линии органоидов с обычными химиотерапевтическими средствами, обычно используемыми при лечении рака желудка, то есть 5-ФУ, оксалиплатином, иринотеканом, эпирубицином и доцетакселом.Анализы жизнеспособности клеток документировали различные ответы на лечение (рис. 3A – E). Ответ четырех линий варьировал в широких пределах, особенно в отношении 5-ФУ, иринотекана и эпирубицина. В соответствии с результатами анализа жизнеспособности реагирующие органоиды стали темными и начали дезагрегировать (онлайн-дополнительные рисунки 3A – E). Дивергентный ответ на обработку 5-ФУ был дополнительно проанализирован с помощью проточной цитометрии аннексина V / пропидия иодида в двух линиях, показывающих наибольшее различие в их ответе (пример эксперимента на фиг. 3F).Менее чувствительная линия DD109 в анализе жизнеспособности показала в нормальных условиях в среднем 64,0% живых клеток, которые немного сдвинулись до 61,7% при обработке 1 мкМ 5-ФУ. С другой стороны, в ответной линии DD282 окрашивание аннексина V увеличивалось в среднем с 11,6% до 41,7% для клеток с ранним апоптозом и с 6,5% до 16,4% для клеток с поздним апоптозом после обработки. Лишь в среднем 30,0% клеток не были затронуты обработкой, что соответствует результатам определения жизнеспособности клеток, документально подтверждающим чувствительность DD282 к 5-ФУ.В целом, можно было задокументировать паттерны устойчивости, например, DD109 был относительно устойчив к 5-ФУ и эпирубицину, тогда как DD191 хорошо реагировал на те же препараты. В то же время DD109 хорошо реагировал на лечение иринотеканом, тогда как DD107 показал ответ только при более высоких концентрациях. Нормальные органоиды реагировали на химиотерапевтические препараты в том же диапазоне, что и раковые органоиды, и особенно проявлялись в отношении 5-ФУ и оксалиплатина дифференциальными ответами между линиями органоидов (онлайн-дополнительные рисунок 2 и таблица 2).Для сравнения, ответ на химиотерапию был дополнительно проанализирован для нескольких классических 2D клеточных линий рака желудка (например, AGS, KatoIII, Snu1 и Snu5) (дополнительный рисунок 4 онлайн). Тенденция к более высоким значениям IC50 и, следовательно, к большей устойчивости наблюдалась у линий органоидов, особенно для оксалиплатина и иринотекана (онлайн-дополнительная таблица 2). Взятые вместе, по крайней мере, для лечения in vitro, активное обычное химиотерапевтическое лекарство может быть определено для каждой линии рака, а также для потенциальных образцов резистентности.

    Рисунок 3

    Органоиды рака желудка человека показывают дивергентную терапевтическую реакцию на обычные химиотерапевтические препараты. (A – E) Анализ жизнеспособности клеток после обработки 5-фторурацилом (5-FU), оксалиплатином, иринотеканом, эпирубицином и доцетакселом в различных концентрациях. Анализ на оксалиплатин, иринотекан, эпирубицин и доцетаксел проводили через 24 часа. Органоиды, обработанные 5-FU, анализировали через 72 часа после обработки. Значения были нормализованы к необработанным контрольным органоидам того же пациента.(F) Анализ апоптоза с использованием проточной цитометрии аннексина V / пропидия иодида (PI) (показан один пример из трех независимых экспериментов).

    Мутационный ландшафт органоидов рака желудка

    Геномная ДНК из органоидов и соответствующей нормальной ткани (лейкоцитов), а также органоидная РНК были подвергнуты подробному геномному и транскриптомному анализу. Кроме того, первичные опухоли были секвенированы для проверки мутаций в исходной ткани. Полногеномное секвенирование выявило широкий спектр мутаций с признаками, соответствующими DD191 и DD282 ранее описанному подтипу MSI, DD107 — подтипу GS и DD109 — подтипу CIN (рис. 4).6 В линиях органоидов не было обнаружено генетических следов ВЭБ. Скорость мутаций на мегабазную пару (Mb) варьировалась между образцами, показывая низкие скорости мутаций в DD107 и DD109 (32 и 42 Mut / Mb соответственно), а также высокую скорость мутаций в DD191 (445 Mut / Mb) и DD282 (297 Mut / Mb). / Мб). Аналогичная картина была обнаружена в общем количестве соматических мутаций: 191 и 175 экзонных мутаций или мутаций сайта сплайсинга в DD107 и DD109, соответственно, и 2401 и 1814 мутаций экзонного сайта или сайта сплайсинга в DD191 и DD282, соответственно (дополнительная таблица 3 в Интернете).Эти значения были сопоставимы со средними значениями, наблюдаемыми для подтипов TCGA GS, CIN и MSI с 163, 123 и 1312 мутациями, соответственно (рисунок 4).

    Рисунок 4

    Молекулярные характеристики органоидов рака желудка по сравнению с когортой из Атласа генома рака (TCGA). Линии раковых органоидов были отнесены к подтипам микросателлитной нестабильной (MSI), геномной стабильной (GS) и хромосомной нестабильной (CIN). Представлены аберрации числа соматических копий (SCNA), статус микросателлитной нестабильности (MSI), статус вируса Эпштейна-Барра (EBV), выдающиеся гены и мутационные особенности.Статусы обозначаются как высокий (красный), низкий (оранжевый) и стабильный (светло-серый), а наличие или отсутствие функций — черным или белым цветом соответственно. * DD282 несет мутацию MSH6 , передающую микросателлитную нестабильность.

    В нашей когорте были обнаружены часто мутирующие гены рака желудка. MLh2 и MSH6 Замалчивание , оба критических гена в репарации ошибочного спаривания ДНК, связанной с микросателлитной нестабильностью, присутствовали как мутация Lys435fs в DD191 и Arg248fs в DD282, соответственно. Утрата CDKN2A , присутствующая в большинстве случаев GS, была обнаружена как двуаллельная делеция в DD109 с последующей значительной активацией нижестоящих мишеней CDK4 / 6-E2F BRCA1 и MYB (дополнительная таблица 3 онлайн) .33 34 TP53 , по существу мутировавший в случаях CIN, обнаруживал стоп-мутацию Arg280 * в DD109. Активирующая гетерозиготная мутация Glu542Lys PIK3CA , также присутствующая в подтипах TCGA EBV, MSI и GS, была обнаружена в DD107, а три активирующие гетерозиготные мутации, а именно Arg88Gln, Cys378Arg и Asp805Asn, были обнаружены в DD282.Основная амплификация ERBB2 , а также активирующая мутация Ser310Phe была обнаружена в DD109 и DD107 соответственно. Чтобы оценить, действительно ли эти два различных изменения приводят к активации пути RTK-RAS, были проанализированы данные RNASeq ERBB2 генов-мишеней. Как амплификация ERBB2 , так и мутация Ser280Phe значительно повлияли на опосредованную c-MYC экспрессию генов-мишеней CCND2 , CDKN1A и THBS1 (дополнительная таблица 3 онлайн).35 36 Дальнейшие мутации, связанные с раком, включали миссенс-мутации в CDK10, (Gly249Arg), HRAS, (Gly13Asp), FGFR2, (Glu201Lys) и SUFU (Asp182Asn) в DD107 (онлайн-дополнительная таблица). DD109 показал одну гетерозиготную стоп-мутацию в ARID1A (Gln1365 *), тогда как DD282 обнаружил две гетерозиготные мутации (Gln1614 * и Leu1816fs). Мутационная сигнатура показывала преимущественно обмены оснований C> T и A> G в DD191 и DD282, C> T, A> C и в меньшей степени обмены оснований A> G в DD107, тогда как DD109 имел равное распределение всех видов оснований. обмены.Аналогичное распределение было обнаружено в образцах TCGA (рисунок 4).

    Рисунок 5

    Графики Circos общих генетических и хромосомных характеристик органоидов рака желудка. Представлены DD107 (A), DD191 (B), DD109 (C) и DD282 (D). Снаружи внутрь: известные онкогены (зеленый: бессмысленный, черный: бессмысленный, красный: амплификации, синий: делеции), хромосомы, варианты кодирования, представленные в виде маленьких квадратов (зеленый: бессмысленный, черный: остановка или сайт сплайсинга, красный : сдвиг кадра), вариации числа копий (CNV) в виде диаграммы рассеяния и в виде полученных (красный) или потерянных (синий) регионов, а также межхромосомных (красный) и внутрихромосомных (синий) перестроек размером более 1 Мб.CIN — хромосомная нестабильность; GS, геномно стабильный; MSI, микроспутник нестабильный.

    Аберрации числа соматических копий (SCNA) присутствовали во всех случаях. DD107 показал небольшие хромосомные перестройки, в то время как геном DD109 был сильно перестроен (онлайн-дополнительная фигура 5A), демонстрируя, таким образом, типичные черты подтипа GS и CIN, соответственно. В частности, хромосомы 9, 11 и 17 DD109 показали сильные внутрихромосомные перестройки, в то время как транслокации были обнаружены между различными другими хромосомами его генома.DD191 и DD282 не имели какой-либо межхромосомной перестройки, но демонстрировали высокую микросателлитную нестабильность (рис. 5C, D), которая отсутствовала в двух других случаях.

    В совокупности DD191 и DD282 были отнесены к подтипу MSI из-за наличия мутаций MLh2 и MSH6 и микросателлитной нестабильности. Геномная стабильность, мутации PIK3CA , а также ERBB2 соответствовали DD107 подтипу GS. Сильно реаранжированный геном DD109 плюс мутация TP53 и амплификация ERBB2 считались признаками, соответствующими этой линии органоидов подтипу CIN.Все линии органоидов культивировали с одной и той же питательной средой, что указывает на то, что метод культивирования не исключает определенные молекулярные подтипы. Секвенирование первичных опухолей продемонстрировало сохранение водительских мутаций и аберраций числа копий в органоидах (онлайн-дополнительные рисунки 5B, C и таблица 3).

    Тестирование целевой терапии органоидов рака желудка

    Персонализированное противоопухолевое лечение открывает большие перспективы для будущего онкологии.37 Тем не менее, многие подходы к нацеливанию на специфические сигнальные пути при раке желудка, включая EGFR, фактор роста гепатоцитов / MET или рецептор фактора роста фибробластов (FGFR) путь потерпел неудачу; Одна из причин — отсутствие прогнозирующих биомаркеров ответа на терапию.38 Чтобы изучить потенциальное использование органоидов желудка в качестве живых биомаркеров терапевтического ответа, были определены активированные пути, основанные на паттерне мутаций отдельных линий органоидов (онлайн-дополнительная таблица 4). Мы наблюдали известную активирующую мутацию рецептора HER2 (Ser310Phe) в DD107 и вариант неизвестного значения (VUS; Gly201Asp) в DD282. Мутация Ser310Phe расположена во внеклеточном домене рецептора и является чувствительной к лекарствам.6 39 Кроме того, мы обнаружили амплификацию рецептора ERBB2 в DD109, что могло быть подтверждено иммуногистохимическим анализом (рис. 6А).Обработка анти-HER2 с использованием антитела трастузумаба привела к снижению жизнеспособности до 70,6% для DD107, до 79,2% для DD109 и до 85,6% для DD282 (рисунок 6B). Таким образом, VUS в DD282 действительно может представлять собой активирующую мутацию. Чтобы изучить возможность тестирования комбинаций комбинаторного лечения, две линии, несущие известные изменения, активирующие рецептор Her2 (DD107 и DD109), были обработаны трастузумабом плюс 5-FU.13 Можно было наблюдать аддитивный эффект трастузумаба по сравнению с одним только 5-FU. в обеих линиях органоидов с полной гибелью при наивысшей концентрации, тогда как только 5-FU мог привести к снижению жизнеспособности максимум до 40% (онлайн-дополнительная диаграмма 6).Чтобы дополнительно охарактеризовать эффект лечения трастузумабом, мы проанализировали уровень фосфорилирования киназы 1/2, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK1 / 2), нижестоящего члена сигнального каскада RAS / RAF. В то время как для DD107 и DD282 никаких изменений обнаружено не было, DD109 подавлял уровень фосфорилирования ERK1 / 2 на 55% (рисунок 6C, D). По-видимому, DD107, который показал самый высокий ответ на лечение трастузумабом и несет активирующую мутацию Her2, передает сигнал через RAS / RAF-независимый путь, в то время как DD109 с классической амплификацией подавляет сигнальный каскад RAS / RAF.

    Рисунок 6

    Нацеливание на мутировавшие пути в органоидах рака желудка человека. (A) Иммуногистохимия для ERBB2, подтверждающая геномную амплификацию в DD109 (масштабная шкала 50 мкм). (B) Измерение жизнеспособности клеток через 72 часа 0,1 мкМ трастузумаба. T-критерий Стьюдента, получавших лечение, по сравнению с необработанными; ** <0,01; *** <0,001. Вестерн-блоттинг (C) и денситометрический анализ (D) для ERK1 / 2 и фосфо-ERK1 / 2 через 72 часа 0,1 мкМ трастузумаба. (E) Вестерн-блоттинг фосфо-c-KIT через 24 часа после обработки 100 мкМ иматинибом DD109 (стр.Мутация Glu142Asp c-KIT ). (F) Нацеливание на CDK4 / 6 в DD109 (двуаллельная потеря CDKN2A ) и DD191 (без изменения CDKN2A), а также DD320N (нормальный контроль) с использованием 5 мкМ палбоциклиба. Пролиферацию анализировали через 24 часа обработки с использованием анализа EdU. (G) Длительное лечение (11 дней, два разделения) с использованием 10 мкМ палбоциклиба привело к потере культуры DD191 и DD320N (масштабная линейка 100 мкм).

    Линия органоидов DD109 несла мутацию в гене рецептора фактора роста стволовых клеток ( c-KIT ).Мутация была локализована в экзоне 3 (p.Glu142Asp), который кодирует часть внеклеточного домена рецептора. Насколько нам известно, мутация в этой аминокислоте c-KIT ранее не описывалась; поэтому влияние этой мутации на передачу сигналов c-KIT неизвестно. Обработка 100 мкМ иматиниба, ингибитора тирозинкиназы, который блокирует активацию c-KIT, приводила к дефосфорилированию рецептора (фигура 6E).

    Кроме того, DD109 несёт двуаллельную потерю ДНК в локусе CDKN2A . CDKN2A кодирует опухолевый супрессор p16, который играет важную роль в регуляции клеточного цикла посредством ингибирования циклин-зависимой киназы 4/6 (CDK4 / 6). Мы обработали органоиды DD109, DD191 (без мутации в CDKN2A) и DD320N (нормальный контроль) пальбоциклибом, мощным ингибитором CDK4 / 6. Полный блок пролиферации был обнаружен для DD191, а также для нормального DD320N в анализе пролиферации EdU, в то время как DD109 показал сильное снижение с 2% клеток, все еще циркулирующих (рис. 6F).Длительное лечение палбоциклибом, включая двукратное пассирование, привело к потере культур DD191 и DD320N, что указывает на полное ингибирование пролиферации. Органоиды DD109 все еще присутствовали и фенотипически не были повреждены (рис. 6G), в то время как их рост, измеренный по скорости разделения, а также в анализе EdU, был подавлен. Мы пришли к выводу, что потеря p16 в DD109 привела к выживанию линии из-за недостаточной блокады CDK4 / 6 пальбоциклибом.

    Органоиды мышей позволяют моделировать рак желудка с определенным спектром мутаций.

    Органоиды рака желудка человека позволяют проводить подробный анализ влияния на активированный путь у отдельного пациента.Из-за большого общего числа мутаций (в среднем 140 в подтипах GS и CIN) эффекты целевых препаратов всегда необходимо интерпретировать в контексте полного спектра мутаций, присутствующих в конкретной линии органоидов. Чтобы создать модели для углубленного анализа интерференции путей в определенном спектре мутаций, мы решили объединить индуцибельные аллели, часто мутирующие в подтипах CIN и GS, в модели на мышах. Подтип CIN характеризуется мутациями TP53 и активной передачей сигналов RTK-RAS.Основываясь на собственных расчетах общедоступных данных из набора данных TCGA, 6 мутации присутствуют в 80% и 57% случаев соответственно, а в комбинации затрагивают 48% случаев CIN. Чтобы смоделировать подтип CIN рака желудка, были объединены индуцибельные мутированные аллели двух наиболее характерных мутаций, а именно Kras G12D и Tp53 R172H (модель CIN) .6 40 41 GS подтип несет мутации в генах клеточной подвижности CDh2 и RHOA в 45% случаев.Для моделирования подтипа GS использовали floxed аллель Cdh2 . Кроме того, злокачественные опухоли GS часто содержат мутации онкогенных драйверов в трансформирующем бета-факторе роста ( TGF-β), (33%), RTK / RAS (31%) и пути WNT (24%). 6 Мы выбрали для моделирования активированный путь Wnt с использованием floxed аллеля Apc (модель GS-WNT) .42 Поскольку желудочно-специфическая индукция in vivo в настоящее время невозможна из-за отсутствия специфической для желудка линии Cre мышей, индуцибельные аллели были рекомбинированы в пробирка.После установления нормальных органоидов желудка из тела желудка мышей, рекомбинацию индуцировали с использованием аденовируса, экспрессирующего Cre-GFP, и подтверждали генотипированием (дополнительный рисунок 7 онлайн).

    Рисунок 7

    Моделирование опухоли с использованием органоидов тела мыши, моделирующих подтипы хромосомно-нестабильного (CIN) и геномно-стабильного (GS) подтипа рака желудка. (A – H) Установленные органоиды опухоли были проанализированы на предмет наличия мутаций и сравнены с нормальными органоидами. (A – B, E – F) Репрезентативные изображения органоидов показали различия в морфологии.Опухоли CIN показали гладкий слоистый эпителий по сравнению с нормальными органоидами. Органоиды опухоли GS-WNT имели структуру типа винограда. (C, G) Иммуногистохимия нормальных органоидов по сравнению с опухолевыми. Органоиды CIN показали накопление Tp53 в ядре. Органоиды GS-WNT показали накопление β-катенина в ядре, тогда как нормальные органоиды показали мембранную экспрессию. (D) Kras-путь органоидов CIN количественно оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Органоиды опухоли увеличивали фосфорилирование Erk1 / 2 по сравнению с нормальными органоидами.(H) Количественные эксперименты с RT-PCR органоидов GS-Wnt. Опухоли показали повышенную передачу сигналов Wnt, как измеряли уровни экспрессии Axin2 и Cyclin D1 по сравнению с нормальными органоидами. Обработка 5 мМ кальфостином C уменьшала активность пути (шкала A – G 100 мкм, t-критерий Стьюдента, обработанный по сравнению с необработанным * <0,05; ** <0,01). (I) Выпуск медиа-компонента. Каждый указанный компонент среды был исключен из всей среды один за другим, и органоиды пассировали два раза в неделю в соотношении 1: 2.(J) Покрытие отдельных клеток органоидов. На лунку высевали 100 отдельных клеток и через 7 дней подсчитывали исходные органоиды. Опухоль t-критерия Стьюдента по сравнению с контролем (* <0,05).

    Модель CIN показала утолщенный неправильный эпителий, который был частично многослойным, что фенотипически отличалось от гомогенных однослойных нормальных органоидов желудка (рис. 7A, B). Мутация Tp53 привела к накоплению в ядре соответствующего белка (рисунок 7C). Активированная передача сигналов Rtk / Ras была подтверждена сильным фосфорилированием Erk1 / 2 (фигура 7D).Таким образом, модель воспроизводит ключевые особенности рака CIN: мутацию Tp53 и активацию пути Rtk / Ras.

    Мутация Cdh2 в модели GS-WNT привела к полному структурному изменению в сторону виноградоподобной формы по сравнению с нормальными органоидами, вызванным потерей опосредованных Cdh2 / E-кадгерином межклеточных связей (рисунок 7E, F). Потеря Apc привела к аберрантной передаче сигналов Wnt, наблюдаемой по накоплению в ядре бета-катенина (Ctnnb1), и увеличению экспрессии генов сигнатуры Wnt Axin2 и CyclinD1 (Ccnd1) (фигура 7G, H).Обработка модели GS-WNT кальфостином С, мощным ингибитором комплекса β-катенин / TCF, снижала экспрессию гена-мишени Wnt ниже по течению (фигура 7H). Линия органоидов GS-WNT, таким образом, представляет собой модельную систему для тестирования действия целевых препаратов на рак GS, активируемый Wnt.

    Для дальнейшей характеристики трансформации органоидов после вирусной инфекции мы освободили Noggin, Wnt, Wnt плюс Rspondin, Fgf10 и Egf из среды и сравнили модели CIN и GS-WNT с нормальными органоидами (рисунок 7I).Органоиды опухоли не были затронуты, тогда как нормальная линия органоидов была потеряна в разные моменты времени после отмены фактора роста. Чтобы проверить способность разных линий инициировать органоиды из отдельных клеток, мы высевали 100 отдельных клеток на лунку и подсчитывали образовавшиеся органоиды после 7-дневного культивирования (фигура 7J). Увеличение эффективности образования органоидов может быть документально подтверждено для опухолевых линий, особенно в модели GS-WNT. Подобно линиям органоидов человека, линии органоидов опухоли мышей невозможно культивировать в пластиковых колбах в течение более длительного периода времени (данные не показаны).Взятые вместе, изменения только двух генов рака на модель привели к устойчивой трансформации линий органоидов, моделирующих молекулярные подтипы рака желудка.

    Обсуждение

    Здесь мы демонстрируем полезность органоидов рака желудка у мышей и человека для изучения паттернов молекулярных мутаций и их влияния на чувствительность к лекарствам. Органоиды рака мыши с определенными генетическими изменениями позволяют обойти классическую проблему работы с линиями раковых клеток со сложным мутационным ландшафтом, который трудно интерпретировать.Эти модели позволяют детально анализировать влияние отдельных путей в определенных условиях. С другой стороны, линии органоидов человека, полученные из первичного рака, являются моделями для проверки действия определенного целевого лекарственного средства на отдельного пациента. Используя биоинформатику, можно делать прогнозы относительно потенциальной эффективности данного лекарства в отношении конкретной мутации, но часто сильно измененный генетический фон у отдельного пациента с раком затрудняет точные прогнозы, поскольку различные активированные или деактивированные пути могут мешать друг другу.Линии органоидов рака человека позволяют проводить испытания лекарств в живой системе, при этом реакция или устойчивость являются результатом совпадения всех существующих мутаций отдельного пациента. Следует иметь в виду, что органоиды состоят только из эпителиального слоя без окружающей мезенхимы, кровеносных сосудов или иммунных клеток. Таким образом, нельзя оценивать препараты, воздействующие на микросреду рака.

    В этом исследовании мы проиллюстрировали возможность создания более крупных биобанков органоидов также для рака желудка, аналогично тому, что было показано для колоректального рака, рака простаты и рака поджелудочной железы.22 24 27 Сосредоточившись на четырех линиях органоидов рака желудка с различными фенотипами, касающимися их характера роста (рис. 1), мы сначала проанализировали их фенотип с помощью иммуногистохимического окрашивания, которое обычно проводится для патологической характеристики рака желудка. Органоиды, а также их ксенотрансплантаты, таким образом, фенокопировали архитектуру первичного рака, от которого они произошли (рис. 2). Затем мы приступили к анализу реакции этих линий органоидов на классическую химиотерапию. Используемые препараты были отобраны на основе применяемых в настоящее время схем клинического лечения.9–11 органоидов подвергались воздействию 5-ФУ, оксалиплатина, иринотекана, доцетаксела и эпирубицина, и для каждого препарата можно было задокументировать различные ответы (рис. 3). Например, DD109 показал ответ на 5-FU только при высокой концентрации, в то время как DD191 и DD282 ответили уже на низкие дозы (рисунок 3A). Для каждой линии органоидов можно определить активное химиотерапевтическое лекарство: например, DD109 показал устойчивость к большинству применяемых лекарств, кроме иринотекана (рисунок 3C). Для отдельного пациента столь же важно, как и определение «действующего» лекарства, является определение лекарств, для которых присутствует врожденная резистентность, что, скорее всего, вызывает только побочные эффекты и слабый терапевтический ответ.

    Полногеномное секвенирование позволило нам сопоставить проанализированные линии органоидов с недавно описанными молекулярными подтипами рака желудка 6, то есть DD107 сопоставили с GS, DD109 с CIN и DD191, а также DD282 с подтипом MSI, принимая во внимание соматические мутации и структурные вариации, включая SCNA (рисунки 4 и 5). Данные RNASeq предоставили дополнительную информацию о последующих активациях гена-мишени и путей. Выявление мутаций в известных онкогенах или генах-супрессорах опухолей позволило нам протестировать подходы к таргетной терапии на наших линиях органоидов (дополнительная таблица 4 онлайн).DD107 несет известную активирующую мутацию, а DD282 — неизвестный вариант, тогда как DD109 демонстрирует амплификацию гена в гене ERBB2 (HER2 / neu). Амплификации ERBB2 обнаруживаются при раке желудка в 22% случаев и могут быть успешно нацелены с помощью трастузумаба, антитела, связывающегося с рецептором HER2, что демонстрирует значительный общий выигрыш в выживаемости в клинических условиях.13 Интересно, что мы обнаружили: ответ на лечение трастузумабом как в усиленной, так и в мутированной линии органоидов ERBB2 (фигура 6А).Кроме того, сочетание трастузумаба с лечением 5-ФУ привело к аддитивному лечебному эффекту (дополнительный рисунок 6 онлайн). Путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK), измеренный по фосфорилированию ERK1 / 2, подавлялся только в амплифицированной линии органоида ERBB2 DD109 (фигура 6C, D). Механизм действия на мутированные линии остается неясным, поскольку ERBB2 передает сигналы через разнообразный набор нижестоящих сигнальных путей. Ранее было показано, что обработка клеточных линий с мутациями ERBB2 приводит к смешанному ответу, при этом некоторые мутации реагируют на трастузумаб, а другие — нет.39 Таким образом, с помощью органоидов эффективность таргетной терапии мутаций может быть проверена специально для каждого пациента.

    CDKN2A кодирует важный опухолевый супрессор p16, играющий ключевую роль в контроле клеточного цикла, и часто мутирует при раке желудка.6 DD109 содержит двуаллельную потерю CDKN2A , и мы обработали линию органоидов пальбоциклибом, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов одобренный ингибитор CDK4 / 6. Рост органоидов был остановлен в двух контрольных линиях с функциональной CDKN2A , что привело к гибели, в то время как DD109 продолжал демонстрировать минимальную пролиферацию в 2% клеток, что было достаточно для поддержания жизни линии (фигура 6F, G).Возможное объяснение — двойное ингибирование клеточного цикла палбоциклибом и функциональным CDK4 / 6 в контрольных линиях, в то время как в DD109 потеря CDKN2A привела к неполному подавлению клеточного цикла.43

    Линия DD109 несла неизвестную мутацию в экзоне 3 рецептора c-KIT. Другие известные мутации, также влияющие на внеклеточный домен, активируют нижестоящий сигнальный путь. Это предположение было подтверждено сильным фосфорилированием Tyr719 c-KIT, что указывает на активную передачу сигналов (фигура 6E).Лечение иматинибом приводило к дефосфорилированию рецептора. Таким образом, органоиды можно также использовать для определения эффекта лечения на неизвестные мутации.

    Как обсуждалось выше, на анализ помех в конкретном сигнальном пути могут влиять перекрестные помехи от других аберрантно активированных сигнальных путей. Чтобы обеспечить беспристрастное тестирование терапевтических вмешательств, мы создали две модели органоидов мышей для молекулярных подтипов CIN и GS с определенной мутационной нагрузкой.Были созданы органоиды, несущие мутацию горячей точки Tp53 R172H , которая приводит к накоплению усеченного белка p53 в ядре, а также мутацию горячей точки Kras G12D , активирующую сигнальный путь MAPK, моделирующую подтип CIN. Активация мутаций привела к фенотипическому изменению органоидов в сторону многослойного атипичного эпителия с повышенным фосфорилированием Erk1 / 2, что указывает на активную передачу сигналов MAPK (фигура 7D).Аналогичные наблюдения были сделаны Ли и др. с использованием воздушно-жидкостной модели клеток новорожденных мышей на основе коллагена, непосредственно трансформированных аденовирусом Cre при инициировании культивирования.44 Органоиды, моделирующие подтип GS-WNT, показали структуру, подобную винограду, ведущую к диффузная морфология из-за потери межклеточных связей, напоминающая также классический диффузный тип рака желудка по классификации Лорена. Сопутствующая потеря Apc привела к повышенной экспрессии генов-мишеней Wnt, которая могла быть частично обращена лечением кальфостином C (фигура 7H).Обе модели опухолей могут служить в будущем для тестирования терапевтических вмешательств на определенном генетическом фоне.

    Таким образом, мы получили органоиды рака человека и мыши, представляющие типичные характеристики и измененные пути развития рака желудка человека.

    Author: alexxlab

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *