Строение клетки органоид строение функции таблица: Таблица по биологии «Строение и функции органоидов клетки» скачать

Напротив, активация двойных регуляторов SMAD, а также передача сигналов WNT, по-видимому, имеют решающее значение для начальной приверженности мезэндодермы, что приводит к Brachyury ⁺ (T) / EOMES ⁺ / MIXL1 ⁺ клетки [118, 119].После индукции мезендодермы, манипулируя уровнями T и EOMES, может быть специфицирована дальнейшая дифференцировка в сторону мезодермы или энтодермы (Рис. 4) [120]. Действие T, по-видимому, важно для судьбы мезодермы, подавляя энтодермальную дифференцировку [120]. С другой стороны, высокие уровни EOMES необходимы для экспрессии маркеров энтодермы (FOXA2 и SOX17) [121]. В то время как активин ведет к развитию популяции с более высокой экспрессией FOXA2, что приводит к спецификации энтодермы, активация WNT генерирует клетки с более низкой экспрессией FOXA2, важной для судьбы мезодермы [122].Интересно, что хотя BMP не требуется для мезендодермы, сам по себе он способен индуцировать развитие популяции с низкой экспрессией FOXA2 [119, 123]. В спецификации мезодермы сигналы WNT и BMP вызывают бифуркацию двух подтипов мезодермы, параксиальной и латеральной мезодермы, соответственно [124]. В то время как WNT, по-видимому, важен для спецификации мезодермы и дальнейшей генерации хондроцитов, ингибирование передачи сигналов WNT важно для содействия сердечной дифференцировке [124–126].

С другой стороны, после установления индуцированной активином дефинитивной энтодермы могут возникать различные популяции клеток, такие как гепатоциты и клетки поджелудочной железы. Пути передачи сигналов BMP и WNT играют важную роль в генерации клонов поджелудочной железы, тогда как спецификация продуцирующих инсулин клеток может быть достигнута с помощью передачи сигналов FGF [127, 128]. Комбинация передачи сигналов FGF и BMP4 связана со спецификацией печеночной судьбы [129].

Основываясь на манипуляциях с ранее описанными сигнальными путями, а также на способности стволовых клеток к «самоорганизации», были произведены органоиды различных линий, включая мозг, почки, печень, поджелудочную железу, легкие и кишечник [ 3, 130–134].Eiraku et al. были первыми, кто продемонстрировал способность PSCs самоорганизовываться в корковой ткани и повторять развитие эмбрионального мозга [135]. Позже Ланкастер и др. смогли направить дифференцировку ПСХ человека в различные области коры головного мозга и применить эту технику для моделирования заболеваний [3]. Позже было сообщено о множестве хорошо организованных органоидов нейронов, включая структуры переднего, среднего мозга, гипоталамуса и мозжечка [136–139]. В дополнение к органоидам мозга, направляя PSC к промежуточной мезодерме, были также образованы органоиды, которые воспроизводят первый триместр почек человеческого плода.Эти органоиды представляют собой отдельные нефроноподобные структуры, сегментированные на дистальные и проксимальные канальцы, окруженные эндотелием и почечным интерстицием, демонстрируя хорошо организованную структуру [133]. Это некоторые примеры способности воспроизводить человеческий органогенез in vitro из PSCs путем добавления лишь нескольких сигнальных сигналов. Тем не менее, различия между органоидами, происходящими из нативных органов и происходящих из ПСХ, все же можно наблюдать. Это может быть результатом неправильного выбора сигналов микросреды или статической передачи сигналов как в пространстве, так и во времени.Следовательно, требуется более высокий пространственно-временной контроль для достижения большего сходства с естественной микросредой.

4.1. Биоинженерные подходы к пространственно-временному контролю механических сигналов

Как было продемонстрировано ранее, механические свойства клеточного микроокружения сильно влияют на дифференцировку клеток, а также клеточную пролиферацию и апоптоз [60, 140, 141]. Кроме того, такие механические свойства специфичны для разных органов или даже внутри одного и того же органа, разные компоненты обладают разными механическими свойствами, позволяя модулировать клеточное поведение и способствовать многокомпонентному органогенезу [142, 143].Следовательно, для образования органоидов пространственная модуляция механических свойств является критической проблемой, которая может быть достигнута путем создания композитных гидрогелей. Например, функционализация традиционных гидрогелей, таких как матригель или коллаген, синтетическими аналогами ECM позволяет управлять механическими свойствами [144, 145]. Включение адгезионных пептидов позволяет управлять подвижностью, поскольку длинные пептидные привязки приводят к прикреплению и распространению клеток, тогда как короткие пептидные привязки вызывают сопротивление клеточной адгезии, что приводит к кластеризации клеток [146].Кроме того, включение пептидных субстратов, чувствительных к ферментативному расщеплению, также может модулировать расщепление гидрогеля клетками и, следовательно, способствовать миграции клеток [147]. Модульная конструкция пористых каркасов на основе протеина шелка также использовалась для производства комбинированных гидрогелей, воссоздающих шестислойную архитектуру коры головного мозга человека. Описанный подход заключался в сборке концентрических элементов без использования клея для создания модульных структур на основе процесса резки, подобного мозаике.Таким образом, разные слои были заселены разными типами нейронов, и была достигнута функциональная трехмерная конструкция кортикальной ткани [148]. Альтернативный способ создания сложных структур из композитных гидрогелей — это ДНК-управляемая сборка блоков с контролируемой формой. Этот метод представляет собой тот же принцип, что и ранее описанный для сборки клеток, состоящий в обогащении различных блоков «клеями» кольцевых цепей ДНК. На основе комплементарности каждого блока ДНК может быть достигнута программируемая сборка сложных структур макроуровня [149].

В дополнение к заявленным технологиям, которые позволяют пространственную модуляцию механических элементов, дальнейшее временное руководство может быть создано с помощью светопосредованного формирования рисунка. Образование фотодеградируемых гидрогелей путем включения фотолабильных фрагментов в сетчатый каркас гидрогеля, такого как полиэтиленгликоль, делает возможным манипулирование физическими характеристиками ЕСМ с использованием света с разными длинами волн. Под воздействием света плотность поперечных связей локальной сети уменьшается, и гидрогель расщепляется, что приводит к изменениям физических свойств, включая жесткость, содержание воды, диффузию или полную эрозию, даже в присутствии клеток [150].В отличие от этого местного размягчения, присутствие фотоинициатора вызывает дополнительное сшивание после воздействия ультрафиолетового света, обеспечивая местное уплотнение [151].

В дополнение к формированию светового рисунка были применены другие подходы для настройки жесткости гидрогелей с использованием комбинации pH-чувствительного поли (2- (диизопропиламино) этилметакрилата) (PDPA) и биосовместимого поли (2- (метакрилоилокси) ) этилфосфорилхолин) (ПМФХ) [152]. При тщательном регулировании pH эластичность гидрогелевой пленки может быть обратимо модулирована, обеспечивая повышение жесткости или размягчение материала и временное динамическое манипулирование адгезией / отслоением клеток [152].Эта обратимо регулируемая жесткость также может быть достигнута в нагруженных клетками гидрогелях на основе супрамолекулярных взаимодействий «хозяин-гость». В этом методе, о котором сообщается, жесткость регулируется нековалентными и обратимыми взаимодействиями хозяин-гость между боковыми мотивами «хозяин», которые присутствуют в первичной сети гидрогеля и растворимых полимерах. Таким образом, когда эти растворимые полимеры добавляются, образуются дополнительные физические поперечные связи, что приводит к увеличению плотности поперечного сшивания гидрогеля и модуля упругости [153].Гидрогели также могут быть динамически усилены с помощью ферментативных реакций, в которых создается пептидный линкер с дополнительными аминокислотными остатками, которые чувствительны к специфической ферментативной катализации. После воздействия фермента достигается образование специфического димера, ведущее к дополнительным сшивкам и окончательному упрочнению нагруженного клетками гидрогеля [154].

Следовательно, на основе этих методов легко достигается пространственно-временное построение механических элементов. И, манипулируя жесткостью матрикса, рост соседних тканей и, следовательно, механическое ограничение, как видно in vivo, можно имитировать в органоидном микроокружении [155].

4.2. Биоинженерные подходы к пространственно-временному контролю диффузии морфогенов

Морфогены — это молекулы, которые способны координировать рост органов и формирование паттерна, устанавливая ступенчатое распределение концентраций и вызывая различные клеточные ответы в зависимости от дозы. Они могут быть либо цитоплазматическими белками, способными стимулировать градиент диффузии внутри клетки, либо секретируемыми сигнальными молекулами [156]. Градиент этих сигнальных молекул, по-видимому, направляет формирование паттерна ткани во время эмбриогенеза [157, 158].Формирование специфических структур может быть индуцировано градиентами сигнальных молекул, продуцируемых соседними клетками и приводящих к дифференциальной экспрессии генов, формированию паттерна ткани и морфогенезу [159]. In vitro , различные морфогены, включая небольшие молекулы, факторы роста и гормоны, были использованы для регуляции судьбы клеток в органоидах. Более того, достижения в области биоинженерии позволили пространственно-временному контролю градиентов морфогенов внутри органоида, давая возможность управлять правильным морфогенезом.

Как уже упоминалось выше, подходы к формированию паттерна с помощью света представляют также многообещающее приложение для контроля морфогенных сигналов как в пространстве, так и во времени. Биомолекулы могут быть введены в гидрогель в желаемом месте, защищенном фоторазлагаемым фрагментом [160, 161]. В нужное время воздействие света приводит к определенному фото-высвобождению биомолекулы. Помимо пространственного и временного контроля доставки, для данного светового воздействия можно предсказать количество высвобождаемой биомолекулы [161].Кроме того, использование микрофлюидных систем или микро / наночастиц позволяет эффективно управлять пространственно-временным контролем градиентов морфогенов. Литографические методы могут использоваться для создания каналов для создания функциональных микрофлюидных структур внутри гидрогелей. Учитывая гидродинамические свойства микроканалов, следуя начальному однородному распределению биомолекул внутри каналов, градиент концентрации формируется путем регулирования скорости потока. Доставленные биомолекулы могут изменяться с течением времени внутри каркаса, и временная модуляция этих молекул может быть достигнута по всей сети пространственно однородным образом [162].Эти микрофлюидные устройства уже были успешно использованы для модуляции паттерна нервной трубки in vitro . Узел и др. сообщили о микрожидкостном дизайне для создания ортогональных линейных градиентов в трехмерном каркасе, встроенном в клетки [163]. Авторы использовали описанное устройство для создания градиентов ретиноевой кислоты (RA) и SAG, агониста sonic hedgehog (SHH) [164], через 3D гидрогель коллагена с агрегатами, полученными из ESC мыши [163]. Поскольку RA оказывает каудализирующий эффект на нейроэпителий, а SHH секретируется в наиболее вентральной части нервной трубки [165, 166], комбинаторный эффект этих двух морфогенов определяет каудальные и вентральные идентичности клеток-предшественников, что приводит к последующему формированию вентральной части. нейроны спинного мозга [163].Похожий подход также использовали Demers et al. В дополнение к передаче сигналов RA и SHH они ввели градиент BMP4 в микрофлюидное устройство, способное имитировать формирование дорсального паттерна нейроэпителия [167]. Во время нейральной дифференцировки дорсально-вентральная идентичность достигается установлением противоположных градиентов SHH и BMP, тогда как ортогональная доставка градиента RA позволяет генерировать рострально-каудальную ось [167]. Эти два разных исследования продемонстрировали способность генерировать контролируемые во времени градиенты морфогенов, которые делают возможным формирование пространственного паттерна в трехмерных структурах, происходящих из стволовых клеток.

Таким образом, использование микрофлюидики может обеспечить градиент трансорганоидных морфогенов наряду с иммобилизацией биомолекул в биоматериале для пространственного контроля [168]. Фактически, прямая интеграция биомолекул в каркас позволяет манипулировать прикреплением, миграцией и судьбой клеток, но в сочетании с средством доставки, таким как микро / наночастицы, возможно контролируемое высвобождение биомолекул, что позволяет создавать пространственные градиенты [169]. ]. Махони и Зальцман были первыми, кто собрал клетки с контролируемым высвобождением полимерных микрочастиц для разработки тканей с программируемым синтетическим внеклеточным микроокружением [170].Позднее эта технология была применена для обеспечения контролируемого высвобождения морфогенов внутри органоидов [171]. Разлагаемые микросферы PLGA, содержащие RA, были включены в агрегаты, полученные из ESC, для достижения контролируемой презентации морфогена и образования кистозного сфероида [171]. Была продемонстрирована эффективная клеточная дифференцировка и морфогенез за счет генерации структур, которые напоминают ранние эмбрионы мыши (E6.75), с внешней висцеральной энтодермой, охватывающей эпибластоподобный слой [171].Более того, комбинация микрочастиц, которые представляют разные кинетические высвобождения, обеспечивает контролируемую и последовательную презентацию морфогена и, следовательно, предопределяет временной ход доставки и обеспечивает эффективную индукцию [172]. Эти подходы представляют собой универсальный инструмент для создания градиентов морфогенов, которые обеспечивают точную пространственно-временную регуляцию, будучи способными вызывать нарушение симметрии, необходимое для правильного морфогенеза органоидов.

5. Увеличение производства органоидов

Для образования органоидов следует учитывать другие параметры, помимо биохимических сигналов и физических свойств ECM, включая достаточное поступление питательных веществ и кислорода.Размер органоида увеличивается по мере усложнения генерируемых структур и может составлять от 200 мкм до мкм до 4 мм [14]. Органоиды большего размера обычно имеют диффузионные ограничения, затрудняющие имитацию некоторых особенностей развития [173]. Основываясь на физике диффузии, плотности клеток и более низком диапазоне сообщаемых показателей метаболического потребления кислорода, церебральные органоиды могут достигать максимального диаметра 1,4 мм без проявления центрального некроза [174]. Однако прогнозируемый диаметр основан только на низкой метаболической активности органоидов, поскольку спонтанная нервная активность встречается нечасто [174].Использование динамической системы, такой как вращающийся биореактор, способно поддерживать рост органоидов за счет эффективного переноса питательных веществ и диффузии кислорода, что позволяет поддерживать органоиды большого размера, около 4 мм, которые эффективно воспроизводят структуру мозга [ 3]. Фактически, биореакторы широко применялись для расширения и дифференциации PSCs в направлении мезодермальных, энтодермальных и эктодермальных клонов, без структурной клеточной компоновки внутри трехмерных агрегатов, происходящих из стволовых клеток [175–179].Протоколы генерации органоидов с использованием биореакторов обычно включают первоначальную фиксацию в статических условиях и дальнейшее встраивание органоидов в гидрогель с последующим переносом органоидов в биореактор [3, 180–182]. Эта методология ограничивает потенциальное расширение масштабов и применение органоидной культуры в высокопроизводительных процессах для открытия лекарств и токсикологических исследований. Недавно было сообщено о новой платформе, которая позволяет производить капсулы посредством электрораспыления с использованием ядра Matrigel, что дает прочные капсулы с поддержкой микроокружения и ростом органоидов за счет образования внешней альгинатной оболочки, которая защищает ядро ​​клетки-матригеля [183].Однако создание агрегатов контролируемого размера и дальнейшая дифференциация в хорошо организованные органоиды с использованием биореакторов в непрерывном процессе остается проблемой. Более того, как конструкция биореактора может повлиять на организацию и морфогенез органоида, все еще плохо изучено.

6. Выводы и будущие задачи

Мощная способность PSCs к самоорганизации была продемонстрирована в поколении in vitro различных мини-органоподобных структур, только путем предоставления некоторых важных сигналов.Таким образом, повторение морфогенеза in vitro может дать важную информацию для применения в регенеративной медицине, моделировании заболеваний и скрининге лекарств. Однако неконтролируемый органогенез может приводить к несовместимой анатомии органоидов и вариабельному клеточному составу, в котором могут отсутствовать некоторые типы клеток, а также функциональные особенности. Применение инженерных методологий для обучения организации органоидов позволяет лучше имитировать морфогенез человека. В этом обзоре мы сосредоточились на различных подходах к биоинженерии для достижения высоких уровней клеточной организации в органоидах, происходящих из PSC, путем контроля начального положения клеток, пространственно-временной клеточной стадии и ремоделирования сгенерированной ткани.

Трехмерное повторение человеческих тканей дает возможность лучше понять биологические системы, являясь необходимым надежным анализом органоидов с полной характеристикой структуры и функции. Однако только несколько методологий позволяют идентифицировать фенотип и морфогенез без разрушения трехмерной организации органоида с использованием передовых подходов к микроскопии. Например, используя метод очистки, можно уменьшить рассеяние тканей и структуру сделать более прозрачной, улучшая проникновение света в ткани и визуализацию глубоких структур [184].Фактически, при световой микроскопии трехмерное изображение создается путем сканирования образца в плоскости за плоскостью, что обеспечивает более глубокую визуализацию тканей с высоким пространственно-временным разрешением [185]. В дополнение к методам визуализации следует разработать надежные методы оценки функциональности созданных трехмерных структур. Например, электрофизиология используется для характеристики функции кардиомиоцитов и нейронов, поскольку они электрически возбудимы. Тем не менее, эти методы позволяют использовать только отдельные ячейки (патч-зажим) и монослои (массивы микроэлектродов).Некоторые приспособления были сделаны для записи физиологических параметров в трехмерные конструкции. Чтобы оценить функциональность сгенерированной нейронной сети в интактной системе, на срезах органоидов был проведен патч-зажим [139, 186]. Однако необходимы более совершенные методики оценки функциональных свойств цельных органоидов.

В дополнение к описанным проблемам в оценке функции и структуры органоидов, наша способность генерировать органоиды из PSCs также подвергалась некоторым ограничениям [187].Во-первых, необходимо производить значительное количество органоидов для использования в высокопроизводительных приложениях, а также требуются более крупные органоиды, чтобы лучше воспроизводить анатомию, наблюдаемую в тканях человека. Во-вторых, поскольку органоиды, происходящие из PSC, имеют тенденцию к формированию тканей, напоминающих эмбриональное развитие человека, также существует потребность в усилении функциональности генерируемых тканей для производства более зрелых органоидов. Были предприняты попытки преодолеть эти проблемы, и органоиды по-прежнему имеют большой потенциал для использования в биологических и терапевтических исследованиях, направленных на лучшее понимание человеческого развития и проявлений заболеваний, а также на обеспечение критического понимания эффективных методов лечения некоторых расстройств.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации этой статьи.

Благодарности

Т.П. Сильва и J.P. Cotovio выражают признательность FundaÇão para a Ciência e a Tecnologia (FCT; Португалия, http://www.fct.pt) за финансовую поддержку в виде индивидуальных грантов: SFRH / BD / 105773/2014 и PD / BD135500 / 2018, соответственно. Финансирование также было получено от FCT в виде гранта: UID / BIO / 04565/2013. Финансирование было получено от проектов, совместно финансируемых FEDER (POR Lisboa 2020 — Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) и FCT через грант PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 и CEREBEX Generation of Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBO-Research. -0145-ФЕДЕР-029298.Финансирование было также получено от программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения № 739572 — Центр открытий регенеративной и точной медицины h3020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

Моделирование развития эндодермальных органов и заболеваний с использованием органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека | Журнал молекулярной клеточной биологии

Аннотация

Недавние успехи в разработке протоколов направленной дифференциации от плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC) до определенных клонов в сочетании с технологией 3D органоидов облегчили создание различных органоидов, происходящих из энтодермы, для моделирование развития желудочно-кишечного тракта человека и in vitro. сопутствующие заболевания.В этом обзоре мы обсуждаем современные стратегии создания энтодермальных органоидов на основе hPSC, включая органоиды желудка, печени, поджелудочной железы, тонкой кишки и толстой кишки. Мы также рассматриваем преимущества использования этой системы для моделирования различных заболеваний человека и оцениваем недостатки этой технологии. Наконец, мы подчеркиваем, как другие технологии, такие как редактирование генома и биоинженерия, могут быть включены в 3D-модели hPSC-органоидов для создания еще более надежных и мощных платформ для понимания развития человеческих органов и моделирования заболеваний.

Введение

За последние 10 лет усовершенствованные методы культивирования органоидов и обращения с ними привели к резкому увеличению количества исследований с использованием этой модельной системы для изучения эмбрионального развития человека и прогрессирования заболевания in vitro , дополняющих существующие модели культур животных и 2D-клеток. . Органоид — это мини-орган, образованный in vitro в 3D-культуре из одной клетки или группы клеток, который обладает способностью к самоорганизации, самообновлению и дифференцировке в разные типы клеток, связанных с его соответствующим органом, в ответ. к соответствующим сигналам.В 1950-х и 1960-х годах в некоторых исследованиях органоиды назывались «внутриклеточными органеллами», и этот термин сейчас устарел (Duryee and Doherty, 1954). Другие использовали слово органоиды для описания опухолей (Годиенко, 1964) или аномальных клеточных разрастаний (Wolter, 1967). Таким образом, определение органоидов варьируется в зависимости от области исследований в зависимости от происхождения органоидов и методов выделения (Shamir and Ewald, 2014; Simian and Bissell, 2016). Недавняя литература документально подтверждает, что органоиды могут быть получены из любого из нескольких источников: (i) плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSC), включая эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), которые могут генерировать органоиды, представляющие различные органы в теле; (ii) взрослые органоспецифические стволовые клетки, которые сохраняют идентичность органа и обладают способностью генерировать различные типы клеток, присутствующие в этом органе; (iii) клетки-предшественники / нормальные клетки органов, в которых отсутствуют популяции стволовых клеток, таких как поджелудочная железа и печень; (iv) зрелые дифференцированные типы клеток органа; и (v) первичные эксплантаты, полученные из нормальных тканей или опухолей (Stange et al., 2013; Шамир и Эвальд, 2014; Ланкастер и Кноблих, 2014; Мур и др., 2015; Умные 2016; Fatehullah et al., 2016; Дрост и Клеверс, 2017). Органоиды, представляющие различные органы тела, были разработаны для различных применений, включая, помимо прочего, изучение основных биологических процессов и процессов развития, моделирование заболеваний и скрининг лекарств.

Краткая история происхождения органоидов

В то время как интерес к органоидам резко возрос за последнее десятилетие, на самом деле исследования на основе органоидов длились гораздо дольше, чем предполагают самые последние обзоры.О первой попытке создания органоидов сообщил Уилсон (1910) в начале 1900-х годов, в котором он показал, что отдельные диссоциированные клетки губки способны реагировать и реорганизовываться с образованием совершенно новой жизнеспособной губки без каких-либо внешних сигналов. В последующие десятилетия несколько лабораторий использовали один и тот же метод диссоциации и реагрегации, чтобы продемонстрировать, что клетки, выделенные из разных органов более сложных организмов, включая кишечнополостные (De Morgan and Drew, 1914), земноводные (Holtfreter, 1948) и цыплят (Moscona and Drew, 1914). Moscona, 1952) также обладают способностью к самоорганизации и восстановлению структурного паттерна исходной ткани во время суспензионной культуры.

Появление современных исследований органоидов началось с открытия и выделения различных компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ), которые позволили исследователям культивировать дифференцированные клетки в 3D. По сравнению с 2D-культурой, 3D-культура играет важную роль в поддержании роста клеток, структурированной дифференцировке клеток и развитии более сложных органо-подобных структур in vitro . Коллаген был первой молекулой ЕСМ, которая была выделена и протестирована для воздействия на жизнеспособность клеток; Было показано, что слой коллагена увеличивает выживаемость клеток, культивируемых в 2D (Huzella, 1932; Ehrmann and Gey, 1956).Тем не менее, клетки, культивируемые в этих условиях, имеют тенденцию терять способность к дифференцировке через несколько дней. Два десятилетия спустя было показано, что когда первичным гепатоцитам (Michalopoulos and Pitot, 1975) или эпителиальным клеткам молочной железы (Emerman and Pitelka, 1977) позволяли плавать в среде на коллагеновых гелях, эти типы клеток сохраняли свой статус дифференцировки. Хотя механизм не был понят в то время, это предполагало, что устранение контакта с твердым пластиком при плавании в коллагеновом геле обеспечивает благоприятную среду для дифференцировки клеток.

Между 1963 и 1977 годами трое ученых выделили студенистую базальную мембрану во время изучения опухоли хрондросаркомы, которая вырабатывала чрезмерный ECM, и которая впоследствии была названа в их честь саркомой Engrelbreth Horm Swarm (EHS). ЕСМ, генерируемый саркомой EHS, теперь известен как матригель, который обогащен ламинином, коллагеном IV и фибронектином. С открытием этих отдельных компонентов ECM, многочисленные группы независимо продемонстрировали важность ECM в регуляции экспрессии генов в различных первичных типах клеток и, следовательно, в контроле состояний дифференцировки и функций этих первичных клеток.В 1991 году Streuli et al. (1991) показали, что в клетках молочных желез взаимодействие интегрина с богатым ламинином ECM необходимо для экспрессии молочного белка β-казеина, предоставив первое механистическое доказательство того, что ECM регулирует экспрессию генов, управляя функцией ткани и морфогенезом.

С прогрессирующим пониманием важности взаимодействия между факторами роста, морфогенами и ECM в морфогенезе в сочетании с достижениями в области выделения стволовых клеток и стратегий дифференцировки, были разработаны различные методы для 3D-культуры клеток из разных органов.Впервые опубликованные в 2008 году, Сасай и его коллеги продемонстрировали самоорганизующиеся и поляризованные кортикальные ткани, полученные в результате направленной дифференцировки ЭСК мыши или человека, с использованием протокола трехмерной агрегационной культуры под названием SFEBq (бессывороточная культура быстрых агрегатов, подобных эмбриоидным телам) (Eiraku et al. др., 2008). В следующем году в новаторском исследовании Sato et al. (2009) сообщили, что при культивировании в матригеле одиночная кишечная стволовая клетка LGR5 ⁺ , выделенная из кишечного крипты взрослой мыши, способна образовывать сложную структуру, подобную in vivo- , состоящую из различных типов кишечных клеток.Менее чем за десять лет ученые успешно создали органоиды, имитирующие мозг, сетчатку, почки, печень, желудок, поджелудочную железу, кишечник и некоторые другие органы. Для получения подробной информации об истории развития и использования органоидов читатели могут обратиться к всеобъемлющему обзору, написанному Симианом и Бисселлом (2016).

Плюрипотентные стволовые клетки в моделировании болезней: 2D vs. 3D

Выделение hESC и создание hiPSC, известных под общим названием hPSC, подогрели интерес к развитию клеточной регенеративной терапии.За последние два десятилетия были описаны надежные протоколы для направленной дифференцировки hESCs и hiPSCs в различные типы клеток в 2D-монослойных системах культивирования клеток. Однако двухмерная система культивирования имеет несколько ограничений. Во-первых, эта система не может точно имитировать естественную структуру тканей или опухолей и, следовательно, неспособна точно воспроизводить сложные морфогенетические процессы, лежащие в основе эмбрионального развития, клеточной дифференциации, регенерации тканей и образования опухолей.Более того, формирование паттерна, полярность и способ деления клеток также изменяются в 2D-культуре, что приводит к изменениям в экспрессии генов и функции клеток (Duval et al., 2017; Ho et al., 2018).

Поиск лучшей модельной системы стимулировал развитие трехмерной культуры органоидов для более точного повторения условий in vivo . Действительно, было показано, что органоидная система превосходит по нескольким параметрам двумерную культуру, потому что органоиды обладают способностью самоорганизовываться в замечательную тканеподобную архитектуру и претерпевают многолинейную дифференцировку, содержащую гетерогенные популяции клеток.Система трехмерного культивирования органоидов также позволяет фундаментальным процессам, таким как клеточная миграция и сегрегация, пространственно ограниченная фиксация клонов и клеточная организация, происходить в более физиологически релевантной микросреде. Благодаря управляемости и масштабируемости методов культивирования, был достигнут значительный прогресс в создании трехмерных органоидов in vitro из hPSC с использованием знаний, полученных за годы многих исследований биологии развития на мышах и людях.

После направленной дифференцировки hPSCs в определенные зародышевые листы — эктодерму, мезодерму или энтодерму — предшественники различных клонов, представляющих конкретный зародышевый листок, могут возникать в трехмерных агрегатах, чтобы позволить дальнейшую дифференцировку в различные представляющие интерес ткани. Такие методы привели к созданию множества типов органоидов, которые моделируют различные ткани / органы, полученные из hPSC, включая тонкий кишечник (Spence et al., 2011), толстую кишку (Crespo et al., 2017; Munera et al., 2017) , сетчатка (Eiraku et al., 2008; Накано и др., 2012; Kuwahara et al., 2015), мозг (Lancaster et al., 2013), печень (Takebe et al., 2013), желудок (McCracken et al., 2014), легкое (Dye et al., 2015), поджелудочная железа ( Hohwieler et al., 2017) и почки (Forbes et al., 2018). Моделирование заболеваний с использованием культур органоидов головного мозга, сетчатки, легких и почек, полученных из hESC / hiPSC, подробно рассматривалось в других работах (Sasai, 2013; Lancaster and Knoblich, 2014; Barkaukas et al., 2017; Nishinakamura, 2019). В этом обзоре мы сосредоточены на разработке органоидов энтодермального клона, происходящих из hPSC, включая желудок, печень, поджелудочную железу, тонкий кишечник и толстую кишку (Таблица 1).Мы обсуждаем последние достижения в разработке этих органоидов и подчеркиваем их многообещающий потенциал в биомедицинских приложениях и прецизионной медицине.

Сводка энтодермальных органоидов, полученных из hPSC, используемых для моделирования развития и заболевания желудочно-кишечного тракта человека.

Сводка по энтодермальным органоидам, полученным из hPSC, используемых для моделирования развития и заболеваний желудочно-кишечного тракта человека.

Органоиды желудка

Во время развития эпителий желудка образует инвагинации в собственной пластинке, известные как желудочные единицы, которые подразделяются на ямку и железу (Wilson and Stevenson, 2019).Зрелый желудок человека разделен на две отдельные функциональные области: проксимальное дно / тело желудка и дистальный отдел антрального отдела привратника.

Знания, полученные в результате исследований формирования паттерна передней энтодермы и развития желудка на животных моделях, в том числе на мышах, сыграли важную роль в создании первых органоидов желудка человека посредством направленной дифференцировки чЭСК, впервые предложенной лабораторией Уэллса (McCracken et al., 2014; Table). 1). Вкратце, протокол дифференцировки включает дифференцировку чЭСК сначала в направлении дефинитивной энтодермы (ДЭ) путем обработки активином А.Затем формируется паттерн DE для принятия судьбы задней энтодермы передней кишки с использованием комбинации WNT3A, FGF4, Noggin и ретиноевой кислоты (RA). На этом этапе органоиды задней части передней кишки, которые появляются из 2D-культуры, внедряются в матригель и обрабатываются RA, Noggin и EGF в течение следующих 72 часов, чтобы вызвать спецификацию желудка. Органоиды сохраняются в среде, содержащей высокую концентрацию EGF, до 34 дней, чтобы способствовать морфогенезу и дифференцировке в различные типы клеток желудка (рис. 1).С помощью этого протокола McCracken et al. (2014) получили органоиды желудка, содержащие типы клеток с антральными характеристиками желудка. Гланды глазного дна не были указаны, и возможные протоколы для достижения этой цели требовали знаний о развитии глазного дна желудка.

Рисунок 1

Схема, показывающая протоколы дифференцировки hPSC в разные энтодермальные клоны, включая органоиды желудка, гепатоцитов, холангиоцитов, поджелудочной железы, тонкой кишки и толстой кишки.

Рисунок 1

Схема, показывающая протоколы дифференцировки hPSC в направлении различных энтодермальных клонов, включая органоиды желудка, гепатоцитов, холангиоцитов, поджелудочной железы, тонкой кишки и толстой кишки.

Используя полученные из hESC антральные органоиды желудка, эти исследователи идентифицировали новые сигнальные механизмы, которые регулируют формирование паттерна ранней энтодермы и дифференцировку энтероэндокринных клеток желудка выше NEUROG3, главного регулятора эндокринной дифференцировки. Три года спустя та же группа сообщила о получении из чЭСК органоидов желудка с характеристиками дна желудка (McCracken et al., 2017; Таблица 1) с использованием модифицированного протокола, специфичного для органоидов антрального отдела желудка.В сочетании с исследованиями in vivo на мышах они обнаружили, что каноническая передача сигналов Wnt необходима для спецификации дна желудка. Т.о., длительная активация передачи сигналов Wnt после стадии задней энтодермы передней кишки способна продуцировать органоиды дна желудка с разными типами клеток желудка, специфичными для глазного дна, включая главные клетки, клетки поверхности и слизистой шеи и энтероэндокринные клетки (Рис. 1). Они также обнаружили, что ингибирование MEK / ERK и активация передачи сигналов BMP необходимы для дифференцировки секретирующих кислоту париетальных клеток в этих органоидах желудка.Эти органоидные системы желудка можно использовать для изучения физиологических взаимодействий желудочных клеток человека в нормальных и болезненных состояниях, инициации и прогрессирования рака желудка хронической инфекцией Helicobacter pylori и ответов на фармакологическое лечение.

Органоиды печени

Создание протокола для создания органоидов гепатоцитов

О направленной дифференцировке hESC и hiPSC в гепатоцитоподобные клетки сообщили более десяти лет назад несколько исследовательских групп (Baharvand et al., 2006; Agarwal et al., 2008; Si-Tayeb et al., 2010). Общий протокол дифференцировки гепатоцитов включает генерирование DE из hPSC с помощью обработки активином A с последующей спецификацией гепатобластов с использованием BMP4 и FGF2. Гепатобласты далее дифференцируются в незрелые гепатоциты обработкой HGF, а созревание гепатоцитов достигается путем культивирования в среде, содержащей Онкостатин М (рис. 1). Варианты этого протокола были рассмотрены в другом месте (Safinia and Minger, 2009). Однако эти протоколы дифференцировки генерируют гепатоцитоподобные клетки в 2D-культуре, которые не могут проявлять важные функциональные свойства, наблюдаемые в сложных тканях.

Ранний морфогенез и спецификация формирующегося зачатка печени сильно зависят от взаимодействия передачи сигналов между клетками энтодермы печени с соседними мезенхимальными и эндотелиальными предшественниками (Zhao and Duncan, 2005). Основываясь на этих знаниях биологии развития и в сочетании с эффективным протоколом дифференцировки гепатоцитов, установленным Дунканом и его коллегами (Si-Tayeb et al., 2010), Takebe et al. (2013) создали первые васкуляризованные органоиды печени, полученные из hiPSC (более подходящее моделирование зачатков печени), путем совместного культивирования энтодермальных клеток печени, полученных из hiPSC, с эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) и мезенхимальными стволовыми клетками человека (hMSC).Вклад hMSCs в этом контексте заключается в дифференцировке в периваскулярные клетки, которые стабилизируют сосудистую сеть. Примечательно, что хотя эти клетки изначально были посеяны в 2D-условиях, система совместного культивирования позволила гепатоцитам, полученным из hiPSC, самоорганизоваться в 3D-кластеры, напоминающие зачатки печени. При трансплантации in vivo мышам с иммунодефицитом интерлейкин-2Rγ-нуль (NSG) сосудистая сеть органоидов зачатков печени, полученных из hiPSC, эффективно соединяется с сосудами хозяина, образуя функциональную сосудистую сеть, способную индуцировать дальнейшее функциональное созревание гепатоцитов, полученных из hiPSC.Органоиды печени, полученные из hiPSC, спасли и улучшили выживаемость у мышей с острой печеночной недостаточностью (ОПН). Этот метод совместного культивирования подчеркивает важность многоклеточных взаимодействий во время развития печени и обеспечивает весьма успешный доказательный подход, который, вероятно, применим к другим системам органов. Тем не менее, основное предостережение этого исследования состоит в том, что HUVECs и hMSCs представляют собой установленные клеточные линии, которые не были получены из одних и тех же hiPSCs, и без дальнейших модификаций этот тип конструкции может запускать отторжение трансплантата при трансплантации.

Чтобы преодолеть эту серьезную проблему, Nie et al. (2018) совместно культивировали энтодермальные клетки печени, полученные из hiPSC, с эндотелиальными клетками и мезенхимальными клетками, которые были получены из пуповины одного донора на платформе 3D-микролунок, чтобы обеспечить самоорганизацию и образование органоидов печени. Этот подход генерировал органоиды печени с повышенной печеночной емкостью по сравнению с использованием одних гепатоцитоподобных клеток, полученных из hiPSC. После трансплантации в почечные капсулы мышиной модели ALF гепатоциты, полученные из hiPSC, быстро восстановили функцию печени и улучшили выживаемость.Хотя это представляет собой улучшенный вариант по сравнению с исходной стратегией, описанной Takebe et al. (2013), получение эндотелиальных и мезенхимальных клеток из пуповины занимает много времени и требует оптимизированных протоколов.

Альтернативный подход, описанный Wu et al. (2019) заключалась в создании гепатобилиарных органоидов, содержащих эндотелиальные и мезенхимальные клетки, в одной чашке, исключая необходимость отдельно дифференцировать эндотелиальные и мезенхимальные клетки. Это было достигнуто за счет сохранения 25% поддерживающей плюрипотентности среды, mTESR, в протоколе дифференцировки на стадии спецификации печени.Полученные гепатобилиарные органоиды, полученные с помощью этого протокола, содержат гепатоциты, холангиоциты и эндотелиоподобные клетки. Используя этот протокол, они также показали, что спецификация судьбы желчных путей требует передачи сигналов Notch на холангиоцитах, которая активируется фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) из эндотелиоподобных клеток и трансформирующим фактором роста-β (TGF-β), присутствующим в среде mTESR. .

Моделирование жировой болезни печени с использованием органоидов печени

Стеатогепатит — это тип жировой болезни печени, характеризующийся воспалением печени с одновременным накоплением жира (стеатозом).Основываясь на успешном создании кишечных органоидов, содержащих как энтодермальные, так и мезодермальные клоны (Spence et al., 2011; McCracken et al., 2017), группа Takebe приняла эти протоколы для совместной дифференциации гепатоцитов с другими поддерживающими типами стромальных клеток, такими как печеночные звездчатые клетки и клетки Купфера в 3D-культурах (Ouchi et al., 2019; Таблица 1). При обработке свободной жирной кислотой эти органоиды печени проявляли характерный стеатоз и вызывали воспалительную реакцию, приводящую к образованию фиброзных органоидов, жесткость которых измеряли с помощью атомно-силовой микроскопии.Затем эту новую платформу использовали для моделирования болезни Вольмана, патологии, вызванной дефектной активностью липазы лизосомальной кислоты (LAL). В гепатоцитах пациентов с болезнью Вольмана наблюдается массивное накопление липидов, сопровождающееся обширным фиброзом и летальным стеатогепатитом. Органоиды печени, полученные из hiPSC Wolman, также показали значительное увеличение накопления липидов, которое можно было устранить обработкой рекомбинантной КЛЛ. Это исследование дополнительно продемонстрировало клинический аспект трансляции этой модели, показав, что обетихолевая кислота, агонист рецептора фарнезоида X, способна стимулировать экспрессию FGF19 в подвздошной кишке.FGF19, в свою очередь, оказывает прямое действие на печень, подавляя накопление липидов, тем самым облегчая стеатогепатит в органоидах печени, полученных от hiPSC, от пациентов Wolman (рис. 2). Эта платформа может быть использована для моделирования других хронических заболеваний печени, таких как врожденная ошибка метаболизма в печени и болезни альфа-1-антитрипсина (A1AT).

Рисунок 2

Схематическое обобщение энтодермальных органоидов, полученных из hPSC, используемых для моделирования развития и заболевания желудочно-кишечного тракта человека.

Рисунок 2

Схема, обобщающая энтодермальные органоиды, производные hPSC, используемые для моделирования развития и заболевания желудочно-кишечного тракта человека.

Органоидная модель патогенеза хронической вирусной инфекции печени

Печень является органом-мишенью для многих вирусов, включая гепатит B (HBV) и C (HCV). Данные свидетельствуют о том, что генетический фон хозяина может объяснять гетерогенный исход этих инфекций (Burgner et al., 2006). Поскольку исследования взаимодействий между хозяином и патогеном с использованием установленных линий клеток рака печени или гуманизированных моделей мышей не отражают индивидуальный генетический фон хозяина, это ограничивает их применение для понимания потенциала генетики хозяина для воздействия на вирусный патогенез.Сообщалось о моделях инфекции ВГС с использованием двумерных культур гепатоцитов, полученных из hESC и hiPSC (Roelandt et al., 2012; Schwartz et al., 2012; Таблица 1), и моделей инфекции HBV с использованием трехмерных органоидов печени (Nie et al., 2018). . Эти исследования продемонстрировали, что гепатоциты, полученные из ПСХ, способны поддерживать весь жизненный цикл этих вирусов, включая повторение естественного проникновения HBV и HCV, передачу клетка-клетка и способность вызывать воспалительный ответ гепатоцита на инфекцию (рис. 2). .Nie et al. (2018) далее показали, что органоиды печени, полученные из PSC, более восприимчивы к инфекции HBV и лучше моделируют последующую дисфункцию печени по сравнению с hPSC-гепатоцитами, культивируемыми в 2D-условиях. Вопрос о том, можно ли использовать такие модели для масштабного производства вирусов в исследовательских целях и для скрининга противовирусных препаратов, специфичных для пациентов, требует дальнейшего изучения.

Органоиды холангиоцитов для моделирования синдрома Алажиля и муковисцидоза

Холангиоциты представляют собой эпителиальные клетки, которые образуют систему желчных протоков взрослого человека, которая регулирует гомеостаз желчи и модулирует воспалительные реакции, а также участвует в восстановлении повреждений печени.Сообщалось о нескольких протоколах дифференциации холангиоцитов от hPSC; каждый использовал аналогичные начальные этапы дифференцировки для создания гепатобластов, а затем использовали вариации для определения и созревания холангиоцитов (Dianat et al., 2014; Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015, 2017). Dianat et al. (2014) сообщили об использовании гормона роста, EGF, интерлейкина-6 и таурохолата натрия в культуре на коллагене I для дифференциации и созревания холангиоцитов. Этот протокол позволил получить субпопуляцию холангиоцитов, известных как небольшие холангиоциты, подобные тем, которые обычно расположены в канале Геринга (Sampaziotis et al., 2017). Посредством совместного культивирования гепатобластов со стромальными клетками костного мозга мыши OP-9 в присутствии EGF, HGF и TGF-β и в ECM, состоящем из коллагена типа 1 и Matrigel, Ogawa et al. (2015) смогли генерировать зрелые органоиды холангиоцитов с характеристиками крупных холангиоцитов. Стромальные клетки OP-9, вероятно, поддерживают спецификацию и созревание органоидов холангиоцитов, предоставляя нишевые факторы, такие как JAG1, который активирует передачу сигналов Notch, необходимую для развития холангиоцитов.Этот метод, однако, имеет значительные ограничения для механистических исследований развития желчных путей, поскольку дополнительные неизвестные факторы могут секретироваться клетками OP-9. Чтобы преодолеть это предостережение, группа Валлиера разработала другую стратегию, в которой спецификация предшественников холангиоцитов из гепатобластов индуцировалась FGF10, RA и активином A с последующей индукцией созревания холангиоцитов в 3D с использованием Matrigel и среды, содержащей EGF (Sampaziotis et al. , 2015, 2017; рисунок 1). Используя этот более определенный метод, они смогли создать органоиды холангиоцитов с функциональными характеристиками больших холангиоцитов, аналогичными тем, которые были получены Ogawa et al.(2015).

После успешного создания функционально зрелых органоидов холангиоцитов эти платформы были использованы для моделирования детского билиарного расстройства синдром Алагилля, который характеризуется нехваткой желчных протоков, вызванной мутациями в JAG1 или NOTCh3 (Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al. , 2015; Таблица 1; Рисунок 2). Путем блокирования передачи сигналов Notch в органоидах холангиоцитов с помощью ингибиторов γ-секретазы ингибировалось образование органоидов и морфогенез ветвления протоков органоидов холангиоцитов.Эти находки подтверждают предыдущие наблюдения на моделях мышей и демонстрируют важность передачи сигналов Notch в спецификации холангиоцитов человека.

Муковисцидоз — аутосомно-рецессивное заболевание, вызванное мутацией гена трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза ( CFTR) , который кодирует транспортер хлорида натрия. Потеря или дисфункция белка CFTR в холангиоцитах приводит к снижению внутрипросветной секреции хлоридов, увеличению вязкости желчи и обструкции желчных путей, вызывая билиарный фиброз и цирроз печени (Colombo, 2007; Staufer et al., 2014). Органоиды холангиоцитов, полученные из hiPSC, были использованы для моделирования поликистозных и связанных с муковисцидозом холангиопатий (Ogawa et al., 2015; Sampaziotis et al., 2015; Рисунок 2; Таблица 1). Органоиды холангиоцитов, происходящие из CF-hiPSC, воспроизводили основные фенотипы холангиопатий, связанных с муковисцидозом, и использовались для определения новых специфичных для пациента терапевтических агентов, которые потенциально могли бы облегчить симптомы, связанные с холангиопатией, у этих пациентов.

Органоиды поджелудочной железы для моделирования рака поджелудочной железы, муковисцидоза и диабета

Поджелудочная железа происходит от задней энтодермы передней кишки и состоит из эндокринного и экзокринного отделов.Эндокринный компартмент состоит из пяти основных типов клеток, секретирующих гормоны, и участвует в регуляции гомеостаза глюкозы. Двумя основными типами клеток экзокринного компартмента являются ацинарные клетки, вырабатывающие пищеварительные ферменты, и протоковые клетки, которые выделяют слизь и раствор бикарбоната для доставки пищеварительных ферментов в кишечник (Pan and Wright, 2011).

Сообщалось о различных установленных протоколах дифференцировки поджелудочной железы (Rezania et al., 2014; Pagliuca et al., 2014; Русс и др., 2015; Газизаде и др., 2017; Amin et al., 2018) и подробно рассмотрен в другом месте (Hohwieler et al., 2019). Эти протоколы в основном сосредоточены на создании β-клеток поджелудочной железы в 2D-культуре для моделирования диабета (Zeng et al., 2016; Guo et al., 2017; Zhou et al., 2018; Рисунок 2). Каждый из протоколов включает распределение DE в судьбе задней кишки с использованием FGF7. Стадии 2 и 3 дифференцировки включают спецификацию задней кишечной трубки до задней энтодермы передней кишки и, впоследствии, предшественников поджелудочной железы, индуцируемых несколькими сигнальными молекулами, включая FGF7, RA, витамин C и агонист протеинкиназы C, при ингибировании передачи сигналов BMP и Shh.Адаптируя аналогичные протоколы дифференцировки для создания предшественников поджелудочной железы, органоиды поджелудочной железы также были созданы из hPSC для моделирования рака поджелудочной железы и муковисцидоза (Huang et al., 2015; Hohwieler et al., 2017; Таблица 1).

Хуанг и др. (2015) использовали двухэтапный протокол для дифференциации производных hPSC предшественников поджелудочной железы в сторону экзокринной судьбы путем ингибирования передачи сигналов TGF-β и Notch и получили органоиды поджелудочной железы, экспрессирующие низкие уровни протоковых и ацинарных маркеров.Эти органоиды поджелудочной железы подверглись дальнейшему морфогенезу и дифференцировке в зрелые протоки и ацинусы после трансплантации in vivo в жировую подушку молочной железы мыши. Эта органоидная платформа в дальнейшем была использована для моделирования инициации и образования протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) (рис. 2). Отличительным признаком прогрессирования PDAC является активирующая мутация KRAS в сочетании с потерей нескольких опухолевых супрессоров, таких как TP53, CDKN2A и SMAD4. Хуанг и др. (2015) генерировали органоиды поджелудочной железы, несущие либо единственную KRAS-активирующую мутацию, либо доминантно-отрицательную мутацию p53 ^R172H .Эти органоиды образовывали кистозные структуры с морфологией, сходной с очагами интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы (PanIN), как in vitro , так и in vivo . Примечательно, что эти органоиды PanIN не были способны расширяться с образованием более крупных повреждений PanIN или прогрессировать до стадии опухоли PDAC после трансплантации in vivo в жировую подушку мыши. Остается неизвестным, как эти органоиды будут вести себя, если их ортотопически трансплантировать в их естественную среду. Интересным подходом было бы создание органоидов поджелудочной железы, происходящих из hPSC, содержащих комбинации различных мутаций драйвера, для моделирования прогрессирования и метастазирования PDAC.

Поджелудочная железа — один из органов, наиболее серьезно пораженных муковисцидозом. Белок CFTR высоко экспрессируется в эпителиальных клетках протоков поджелудочной железы, которые прямо или косвенно связаны с транспортом бикарбоната. В поджелудочной железе пациентов с муковисцидозом нарушение секреции бикарбоната приводит к увеличению вязкости слизи, гиперконцентрации пищеварительных ферментов и, как следствие, обструкции протокового эпителия, что может привести к панкреатиту, сахарному диабету, связанному с муковисцидозом, и, в конечном итоге, разрушению всего органа ( Раскрой, 2015).Hohwieler et al. (2017) адаптировали протокол дифференцировки, в котором органоиды поджелудочной железы со зрелыми протоковыми и ацинарными клетками генерировались in vitro без необходимости созревания in vivo (Рисунок 1). С помощью этого протокола органоиды поджелудочной железы были созданы с использованием hiPSC от пациентов с муковисцидозом и использовались для идентификации соединений, которые могут улучшить клеточную обработку и стробирующую функцию белка CFTR. Кроме того, эта платформа облегчила тестирование новой стратегии скрининга панели химически модифицированных мРНК (cmRNAs) на предмет комплементации путем трансфекции органоидов CF-hiPSC-поджелудочной железы для идентификации cmRNA, которая может дополнять функцию гена CFTR .Эта стратегия в будущем может быть применена к другим органоидам, используемым для моделирования муковисцидоза, включая органоиды холангиоцитов, легких и толстой кишки.

Как упоминалось выше, большинство исследований с использованием дифференцировки β-клеток, полученных из hPSC, использовалось для моделирования диабета с использованием 2D-культур. Два исследования продемонстрировали, что агрегация дифференцированных типов гормональных клеток, производных чЭСК, с образованием островковидных структур приводит к усиленной секреции инсулина, что указывает на то, что агрегация улучшает функцию β-клеток (Shim et al., 2015; Ким и др., 2016; Таблица 1). Стоит упомянуть, что недавнее исследование показало, что перепрограммирование протоковых клеток на основе фактора транскрипции в β-клетки in vitro было значительно улучшено при использовании протоковых органоидов мышей по сравнению с двумерными линиями протоковых клеток человека (Azzarelli et al., 2019). Будет ли достигнуто такое эффективное перепрограммирование в органоидах поджелудочной железы, происходящих из hPSC, еще предстоит изучить.

Органоиды тонкой и толстой кишки

Зрелый кишечник — это орган с высокой степенью компартментализации с отдельными областями, которые выполняют различные функции, включая пищеварение, абсорбцию, метаболизм и иммунитет.Тонкая кишка, которая играет важную роль в пищеварении и всасывании питательных веществ, состоит из проксимального отдела двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и дистального отдела подвздошной кишки. Толстый кишечник, который отвечает за образование кала, а также за всасывание воды, электролитов и витаминов, вырабатываемых кишечными бактериями, состоит из слепой кишки, толстой кишки, прямой кишки и заднего прохода. Нарушение регуляции развития или функции кишечника, а также патогенная инфекция могут вызывать ряд кишечных заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника, синдром короткой кишки, инфекционно-ассоциированный энтерит и колоректальный рак.До разработки кишечных органоидов эти кишечные заболевания моделировались с использованием клеточных линий и эксплантированных тканей, которые имеют значительные ограничения, включая отсутствие сложной трехмерной архитектуры и клеточной гетерогенности.

В 2011 году группа Уэллса создала первые кишечные органоиды, полученные из hPSC, на основе знаний о биологии развития, полученных от различных модельных организмов, включая Xenopus , рыбок данио и мышей (Spence et al., 2011; McCracken et al., 2011). Во время развития тонкий и толстый кишечник происходят из DE, который специфицируется в энтодерме среднего и заднего кишечника (Zorn and Wells, 2007). Следовательно, для образования органоидов кишечника hPSC сначала были дифференцированы в DE путем обработки активином A с последующим формированием паттерна DE в CDX2 ⁺ средней и задней кишки с использованием высокой концентрации WNT3A и FGF4 в течение 4 дней. Во время этой стадии формирования паттерна монослойный эпителий подвергается морфогенезу и сворачиванию, чтобы генерировать 3D сфероиды, которые в конечном итоге отпочковываются от 2D эпителия.Эти трехмерные сфероиды были дополнительно культивированы в Matrigel с использованием минимальной про-кишечной среды дифференцировки, содержащей нишевые факторы, включая EGF, Noggin и WNT3A (рис. 1). Этот протокол генерировал органоиды со сложной трехмерной архитектурой, содержащие как эпителиальные, так и мезенхимальные компоненты тонкой кишки. Эпителиальный компонент органоидов состоит из энтероцитов, которые образуют ворсиноподобные структуры, расположенные в крипте LGR5 ⁺ транзитно-амплифицирующие (ТА) и стволовые клетки, энтероэндокринные клетки, клетки Панета и бокаловидные клетки.Spence et al. (2011) показали возможность использования этой кишечной органоидной платформы для исследований развития путем нокаута или сверхэкспрессии NEUROG3, главного регулятора эндокринной судьбы (Table 1). Тем не менее, региональная идентичность этих кишечных органоидов оставалась неуловимой. Последующее исследование Tsai et al. (2017) продемонстрировали, что региональная спецификация этих органоидов тонкого кишечника может быть достигнута путем воздействия на DE высоких концентраций WNT3A и FGF4 в течение разного времени.Более короткое время воздействия привело к судьбе двенадцатиперстной кишки, в то время как более длительное время воздействия привело к образованию органоидов с характеристиками подвздошной кишки. Однако длительное воздействие FGF4 на предшественники средней / задней кишки ингибирует дифференцировку и созревание органоидов кишечника (Tamminen et al., 2015; Table 1). В то время как WNT3A и FGF4 необходимы для спецификации тонкого кишечника, временной активации передачи сигналов BMP2 достаточно для того, чтобы управлять судьбой кишечной трубки, полученной из hPSC, в толстую кишку, поскольку для развития задней части кишечной трубки и толстой кишки требуются высокие уровни передачи сигналов BMP (Munera et al. ., 2017; Фигура 1). Взятые вместе, эти исследования показали, что дифференцировка кишечных органоидов in vitro может в значительной степени повторять развитие in vivo человека, что позволяет использовать эту систему для изучения генетических заболеваний, связанных с развитием кишечника человека (рис. 2).

С момента первой публикации протокола дифференцировки кишечных органоидов на основе hPSC, сообщалось о различных модификациях. В одной стратегии Forster et al. (2014) трансплантировали мышам hESC, содержащие репортерный ген LGR5-GFP, для создания тератом, которые содержат предполагаемые кишечные клетки LGR5 ⁺ , которые были выделены и культивированы в 3D для образования органоидов кишечника.Органоиды кишечника, полученные с помощью этого метода, содержат типы зрелых кишечных клеток, в том числе взрослые стволовые клетки кишечника LGR5 ⁺ . Однако частота и эффективность образования тератомы, содержащей клетки кишечника LGR5 ⁺ , неизвестны, что ограничивает практическое применение. Takahashi et al. (2018) сообщили, что добавление WNT3A и FGF2 вместе с активином A увеличивало эффективность дифференцировки DE, что впоследствии увеличивало частоту образования сфероидов на стадии формирования паттерна средней / задней кишки.В том же исследовании был разработан протокол на основе суспензии без матригеля для культивирования кишечных органоидов с использованием коммерчески доступной среды под названием Happy Cell ASM 3D Culture Medium. Использование таких суспензионных культур органоидов без использования каркаса могло бы облегчить извлечение органоидов для различных анализов, в частности для скрининга лекарств, и важно для будущего перевода в клинические приложения.

В другом исследовании энтеросферы, содержащие передние предшественники NKX2.1 ⁺ легких и задние предшественники CDX2 ⁺ среднего / заднего кишечника, были получены из DE, полученного с использованием ранее установленного 11-дневного протокола дифференцировки в монослой (Nadkarni et al., 2017). Легкие-предшественники постепенно истощались, и большинство клеток в энтеросфере превратились в кишечные клетки CDX2 ⁺ при культивировании в среде 3D Matrigel и MTEC, типе среды, подходящей для выращивания большинства типов клеток. Это исследование также подчеркнуло важность различных факторов роста в культуральной среде для индукции дифференцировки в отношении различных типов кишечных клеток или поддержания популяций стволовых клеток в энтеросфере. В то время как комбинация WNT3A, EGF, Noggin и R-спондина достаточна для дифференцировки энтероцитов, энтероэндокринных клеток и клеток Панета, ингибирование передачи сигналов Notch резко индуцировало спецификацию бокаловидных клеток.Кроме того, популяция стволовых клеток LGR5 ⁺ значительно обогащается за счет увеличения среды гастрином и никотинамидом вместе с ингибированием передачи сигналов TGF-β и p38 MAPK, что делает возможным долгосрочное размножение энтеросфер (Nadkarni et al., 2017). .

Большинство исследований показали, что созревание кишечных органоидов, происходящих из hPSC, может быть достигнуто только трансплантацией in vivo под капсулу почки мышей NSG (Watson et al., 2014; Finkbeiner et al., 2015; Мунера и др., 2017; Цай и др., 2017). Используя стратегию трансплантации in vivo , был выяснен процесс созревания органоидов кишечника человека во время перехода от плода к взрослому (Finkbeiner et al., 2015; Таблица 1). Более того, такие методы можно использовать для идентификации системных гуморальных сигналов во время повреждения или регенерации, которые способствуют созреванию и разрастанию типов кишечных клеток (Watson et al., 2014). Одно заслуживающее внимания наблюдение состоит в том, что мезенхимальный компартмент органоидов кишечника играет важную роль в расширении и приживлении этих органоидов, поскольку органоиды без мезенхимы не смогли размножить in vitro или приживить in vivo (Watson et al., 2014; Надкарни и др., 2017).

Моделирование рака прямой кишки с использованием органоидов кишечника

Колоректальный рак — вторая ведущая причина смерти от рака во всем мире. Мутация гена adenomatous polypopsis coli ( APC ) является основной причиной колоректального рака, обнаруживаемой в ~ 85% случаев. Последние достижения в технологии редактирования генов в сочетании с протоколами для органоидов кишечника, полученных из hPSC, позволили моделировать колоректальный рак с отдельными мутациями-драйверами с особым акцентом на инициирующих событиях этого заболевания.Crespo et al. (2017) сгенерировали органоиды толстой кишки с использованием hiPSC, полученного от пациентов с семейным аденоматозным полипопсисом (FAP), несущих мутации зародышевой линии гена APC , для моделирования патогенеза FAP in vitro (Таблица 1). Органоиды толстой кишки FAP-hiPSC проявляли повышенную сигнальную активность Wnt и демонстрировали повышенную пролиферацию эпителия. Затем эту платформу использовали для скрининга лекарств, которые могут ингибировать активность Wnt и восстанавливать нормальную пролиферацию органоидов FAP.В другом исследовании изогенные кишечные органоиды, полученные из ИПСК, содержащие мутации АРС, были использованы, чтобы показать, что гетерозиготность АРС в этих органоидах достаточна для индукции изменений полярности и идентичности клеток, паттернов экспрессии генов, а также хромосомных аберраций (признак колоректального рака). , предоставляя новое понимание самых ранних событий инициации APC-опосредованного опухолегенеза колоректального рака (Sommer et al., 2018; Рисунок 2; Таблица 1). В будущем использование этой органоидной платформы толстой кишки, полученной из hPSC, будет способствовать пониманию того, как другие основные мутации способствуют прогрессированию и метастазированию колоректального рака.

hPSC-кишечные органоиды для моделирования желудочно-кишечных бактериальных и вирусных инфекций

Желудочно-кишечные инфекции, вызванные бактериями, вирусами и паразитами, вызывают гастроэнтерит с такими симптомами, как диарея, рвота и боль в животе. Способность полностью понять, как эти патогены взаимодействуют с клетками кишечника человека, чтобы вызвать заболевание, была затруднена из-за неспособности эффективно изолировать, культивировать и размножать патогены in vitro , особенно для энтеросолюбильных вирусов.Органоиды кишечника человека, полученные либо из чПСК, либо из взрослых стволовых клеток, недавно были использованы для изучения патогенеза некоторых инфекционных патогенов, которые было трудно вырастить в 2D-клеточных линиях. Первое сообщение об использовании кишечных органоидов, полученных из hPSC, для моделирования вирусных желудочно-кишечных инфекций было сделано группой Estes (Finkbeiner et al., 2012; Таблица 1), которая показала, что эти органоиды способны поддерживать репликацию клинически изолированных ротавирусов и образование инфекционных заболеваний. потомство вируса.Удивительно, но этот вирус способен инфицировать как эпителиальные, так и мезенхимальные компоненты органоидов кишечника, что указывает на то, что это многообещающая платформа для моделирования не только ротавирусной инфекции, но и других связанных с вирусами причин гастроэнтерита (рис. 2).

Кишечные бактериальные желудочно-кишечные инфекции, особенно вызываемые патогенными видами Salmonella , вызывают более 90 миллионов случаев гастроэнтерита и 20 миллионов случаев брюшного тифа в год (Mather, 2013).Мышиные модели обычно используются для изучения патогенеза гастроэнтерита, связанного с Salmonella , но болезнь и симптомы различаются у мышей и людей, что вызывает необходимость в лучшей модели этой инфекции (Mather, 2013). Путем инъекции Salmonella enterica серовара Typhimurium в просвет hPSC-кишечных органоидов Forbester et al. (2015) показали, что в инфицированных органоидах бактерии способны проникать в эпителий кишечника, образовывать внутриклеточные вакуоли, содержащие Salmonella , и индуцировать экспрессию генов цитокинов (Таблица 1).Хотя культивировать и изучать патогенные механизмы аэробных бактерий in vitro относительно просто, выращивание анаэробных бактерий в клеточных линиях было сложной задачей, поскольку для роста кишечных клеток требуется кислород. Лесли и др. (2015) показали, что Clostridium difficle , анаэроб и частая причина инфекционной нокосомиальной диареи, может выжить до 12 часов при введении в просвет органоидов кишечника, полученных из hPSC, что позволяет бактериям взаимодействовать с эпителием хозяина. учился.После заражения эта бактерия вызвала нарушение кишечного эпителия, что привело к потере параклеточной барьерной функции, которая в основном опосредована токсином TcdA. Эти исследования подчеркивают перспективность этой платформы для понимания механизмов заболеваний, вызывающих другие бактериальные и простейшие гастроэнтериты, как аэробные, так и анаэробные, которые ранее не исследовались на других моделях. Эту платформу также можно использовать для поиска лучших методов лечения с помощью скрининга лекарств для нацеливания на патогены, для которых нет эффективных терапевтических агентов.

Преимущества органоидов на основе hPSC для изучения болезней человека

Мы выделили некоторые преимущества использования платформы энтодермальных органоидов для моделирования развития и заболевания. Здесь мы кратко резюмируем общие преимущества этой системы. Очевидно, что энтодермальные органоиды, происходящие из hPSC, обладают несколькими значительными преимуществами по сравнению с 2D системами культивирования в отношении различных аспектов биологии развития кишечника человека, включая спецификацию клональной судьбы и формирование регионального паттерна органов.Поскольку процесс дифференцировки hPSC в органоид в значительной степени напоминает развитие in vivo , органоиды, полученные из hPSC, обеспечивают уникальную модель для изучения механизмов, лежащих в основе эмбриональных дефектов и заболеваний, которые связаны с этими дефектами. Вместе с достижениями в технологии редактирования генов, целевые мутации или коррекция мутировавших генов могут выполняться относительно эффективно на уровне hPSC перед дифференцировкой в ​​разные клоны и на уровне органоидов до аутотрансплантации.

Кроме того, основным преимуществом этой системы является неограниченный запас исходных материалов, из которых могут быть получены эти органоиды, благодаря способности hPSCs самообновляться и дифференцироваться. Это впоследствии позволяет производить крупномасштабные органоиды для различных анализов, включая скрининг лекарств и трансплантацию in vivo . Скрининг лекарств и проверка производных лекарств на животных моделях не только дорогостоящи, но и сопряжены с неопределенностью эффективности из-за фундаментальных различий в физиологии между моделями человека и мыши.Таким образом, органоиды, полученные из hPSC, предлагают экономичный и надежный подход для преодоления этих ограничений.

Ограничение органоидов, производных чПСК

Система чПСК-органоид не лишена ограничений. В то время как некоторые из описанных моделей hPSC-органоидов совместно развивают поддерживающую мезенхиму в процессе дифференцировки, в системе по-прежнему отсутствуют некоторые стромальные компоненты, такие как сосудистая сеть, нейроны, лимфатические и иммунные клетки, которые не позволяют моделировать заболевания, при которых эти стромальные компоненты играют важную роль в развитии болезни.Кроме того, приживление органоидов in vivo сильно усиливается за счет присутствия мезенхимальных клеток (Watson et al., 2014; Nadkarni et al., 2017) или совместного культивирования органоидов с эндотелиальными клетками перед трансплантацией (Takebe et al. ., 2013). Таким образом, представляется весьма вероятным, что для достоверного моделирования микроокружения болезни потребуется оптимизация методологий совместного культивирования органоидов с различными стромальными компонентами, например, как показано недавно опубликованными культурами на границе раздела воздух-жидкость для органоидов опухоли (Li et al. ., 2016; Neal et al., 2018).

Большинство исследований основано на приживлении in vivo для достижения созревания органоидов (Finkbeiner et al., 2015; Huang et al., 2015; Nadkarni et al., 2017). Основываясь на идее о том, что эпителий кишечника взрослого человека взаимодействует с иммунными клетками слизистой оболочки кишечника для поддержания гомеостаза кишечника и иммунитета слизистых оболочек, и что иммунные клетки могут играть важную роль в созревании кишечных клеток, в последнее время были предприняты попытки генерировать зрелые клетки, производные от hPSC. кишечные органоиды in vitro путем совместного культивирования с Т-клетками Jurkat (Jung et al., 2018). Интерлейкин-2, секретируемый Т-клетками Jurkat, активировал передачу сигналов STAT3 и отвечал за созревание органоидов кишечника, производных hPSC. Было бы интересно узнать, могут ли сходные принципы применяться для ускорения созревания др. Происходящих из hPSC энтодермальных органоидов.

Матригель и коллаген I типа являются двумя обычно используемыми компонентами внеклеточного матрикса, которые используются для поддержки роста трехмерных органоидных культур in vitro . Есть несколько недостатков, связанных с использованием этих компонентов ECM.Во-первых, они производятся линиями клеток животных, что исключает их использование в клинических испытаниях на людях. Кроме того, существуют вариации факторов роста и концентрации ЕСМ от партии к партии во время производства, особенно при производстве Матригеля. Хотя доступны версии Матригеля с пониженным содержанием фактора роста, плохо определенные концентрации ЕСМ могут также повлиять на жесткость и пористость полимеризованного Матригеля. Это может привести к отсутствию согласованности в дифференцировке органоидов, поскольку образование стволовых клеток и клеток-предшественников и дифференцировка различных типов клеток требует разной жесткости поддержки ECM (Gjorevski et al., 2016). Кроме того, методы извлечения органоидов из каркасов ЕСМ для последующей обработки относительно сложны и могут повлиять на последующий анализ (Takahashi et al., 2018). Таким образом, требуются альтернативные методы культивирования органоидов человека. Долгосрочное культивирование и клиническое применение гарантируют переход к более определенному и механически динамическому ECM, чтобы в полной мере использовать потенциал технологии hPSC-органоидов. Гибридный гидрогелевый каркас из ПЭГ, не содержащий животных, для культивирования кишечных органоидов был описан Gjorevski et al.(2016) и Cruz-Acuna et al. (2017), в которых жесткость матрицы может регулироваться динамически. Такие дизайнерские матрицы с настраиваемыми структурами каркасов могут стать матрицами следующего поколения, которые расширят применимость органоидов в исследованиях на людях.

Перспективы

Биоинженерные технологии соответствуют технологии hPSC-органоидов

Возможность создания культур органоидов человека, которые напоминают определенные органы, происходящие из энтодермы, открыла огромные возможности для использования органоидов не только для моделирования заболеваний, но и в качестве источника для терапии замещения клеток или даже трансплантации целых органов.В следующие 5-10 лет мы предвидим гораздо более глубокое понимание влияния различных типов стромальных клеток на рост и созревание органоидов, происходящих из hPSC. Культивирование различных типов стромальных клеток часто требует разного состава и жесткости ВКМ для оптимального роста органоидов. Таким образом, будет сложно найти оптимальные условия для совместного культивирования этих типов клеток с органоидами. Дополнительные исследования, посвященные интеграции биоинженерных технологий с органоидами, полученными из hPSC, могут способствовать открытию таких идеальных условий совместного культивирования.Это потребует разработки усовершенствованного синтетического ECM, в котором механические характеристики, такие как жесткость, могут модулироваться пространственно и временно. Некоторые из этих регулируемых синтетических ECM были использованы для изучения миграции клеток (Raeber et al., 2005; Kloxin et al., 2009; Guvendiren and Burdick, 2012). Сюда входят фоторазлагаемые гидрогели, содержащие фотолабильные (Kloxin et al., 2009) или фотоинициаторные (Guvendiren and Burdick, 2012) фрагменты в сетевом каркасе гидрогеля, позволяющие пространственное и временное смягчение или повышение жесткости ECM с использованием различных длин волн света.В дополнение к модуляции светом, точная настройка жесткости ECM также может быть достигнута с помощью регулировки pH путем включения комбинации pH-чувствительного поли (2- (диизопропиламино) этилметакрилата) (PDPA) и биосовместимого поли (2- (метакрилоилокси) этилфосфорилхолин) (PMPC) в основные цепи гидрогеля. Варианты и применение этих синтетических каркасов были подробно рассмотрены Silva et al. (2019). В будущем эти регулируемые синтетические каркасы не только позволят оптимальное совместное культивирование различных типов клеток с органоидами, но также могут быть использованы для установления градиентов факторов роста в культуре как в пространстве, так и во времени, что позволит точно определять дифференцировку и функциональные состояния. контролируется.

Способность генерировать естественный бесклеточный тканевый каркас, который мог бы поддерживать частичный или даже рост целого органа in vitro , резко сместил бы область в сторону трансплантации всего органа. Китано и др. (2017) показали, что децеллюляризованный матрикс кишечника крысы, состоящий только из ECM кишечника, может быть повторно заселен органоидами кишечника, производными hPSC, которые затем дифференцируются в монослой поляризованного кишечного эпителия. Однако, когда каркас был повторно заселен как эндотелиальными клетками человека, так и органоидами, полученными из hPSC, архитектура кишечника с криптоподобными и ворсиноподобными структурами была усилена обширной функциональной сосудистой сетью.Эта стратегия была успешно применена к децеллюляризованному матриксу кишечника свиней (Kitano et al., 2017). С возможностью включения других типов поддерживающих кишечных клеток такие имплантируемые биоинженерные трансплантаты кишечника, полученные из органоидов, полученных от пациентов, могли бы обеспечить альтернативную стратегию лечения пациентов, страдающих синдромом короткой кишки или даже колоректальным раком.

Точное моделирование болезни in vivo с использованием гуманизированных моделей мышей

Другой областью, требующей внимания, является разработка улучшенной платформы in vivo для точного приживления, которая может точно моделировать развитие органов, а также патогенез и прогрессирование заболевания.В настоящее время большая часть созревания и оценки органоидной функции, полученной из hPSC, и мутантного фенотипа осуществляется путем трансплантации in vivo иммунодефицитным мышам NSG, у которых отсутствует компетентная иммунная среда. Это ограничивает использование этих моделей для изучения взаимодействия эпителиальных клеток с иммунной системой при некоторых воспалительных заболеваниях. Недавняя разработка гуманизированных моделей мышей может преодолеть это ограничение, позволяя более точно моделировать патологию этих заболеваний.Модель гуманизированной мыши представляет собой мышь с иммунодефицитом, прививаемую человеческими гемопоэтическими стволовыми клетками, которые могут давать начало множеству иммунных клеток человека на протяжении всей жизни животного (Lan et al., 2006; Kalscheuer et al., 2012; Lavender et al. др., 2013). Из-за наличия интактной иммунной системы человека такие гуманизированные мышиные модели особенно ценны для моделирования патологии заболевания в качестве мощной доклинической модели для оценки новых терапевтических средств в условиях in vivo , не подвергая пациентов риску.В будущем тандемное использование этой платформы с технологией органоидов на основе hPSC обеспечит более строгий и целостный подход к моделированию множества типов сложных заболеваний человека, таких как воспалительное заболевание кишечника, инфекционные заболевания и различные виды рака.

Редактирование генома и органоиды, полученные из чПСК

Достижения в технологиях редактирования генома, таких как CRISPR-Cas9, открывают возможности для коррекции генов или изучения конкретных мутаций в процессе развития и болезни.Редактирование генов в органоидах, полученных из hPSC, уже может применяться для определения патогенности специфических для пациента мутаций и для тестирования потенциальных новых методов лечения для точной медицины. Остается еще много проблем, прежде чем отредактированные геном органоиды, полученные из hPSC, смогут быть привиты человеку для лечения заболеваний; к ним относятся относительно низкая эффективность редактирования гена с одним основанием и нецелевые эффекты, вызываемые Cas9. С установлением эффективного редактирования генов в органоидах редактирование органоидов, полученных из hPSC, теперь может выполняться на любой из двух стадий: стадии плюрипотентных стволовых клеток или стадии органоида, что позволяет изучать специфичные для стадии функции генов на обоих уровнях.В ближайшем будущем эти технологии должны быть использованы для создания моделей индуцибельного нокаута или сверхэкспрессии генов, которые позволят анализировать пространственно-временные воздействия, вызванные конкретными мутациями, особенно для генов, которые имеют многофазные функции. Кроме того, разработка дополнительных репортеров, специфичных к типу клеток, будет способствовать мониторингу эффективности дифференцировки, для отслеживания клонов in vivo при приживлении или для выделения определенных типов клеток после трансплантации in vivo для последующего анализа.

Конфликт интересов: Не объявлен.

Список литературы

Agarwal

S.

Holton

K.L.

Lanza

R.

2008

Эффективная дифференциация функциональных гепатоцитов от эмбриональных стволовых клеток человека

Стволовые клетки

26

1117

1127

Амин

С.

Повар

Б.

Чжоу

Т.

2018

Открытие кандидата на лекарство от GLIS3-ассоциированного диабета

Нац. Коммуна

9

4815

Azzarelli

R.

Руландс

S.

Nestorowa

S.

2019

Фосфорилирование нейрогенина 3 контролирует эффективность репрограммирования органоидов протоков поджелудочной железы в эндокринные клетки

Sci. Представитель

8

15374

Бахарванд

Х.

Хашеми

S.M.

Каземи Аштиани

S.

2006

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток человека в гепатоциты в системах культивирования 2D и 3D

Внутр. J. Dev. Биол

50

645

652

Баркаукас

C.E.

Chung

M.I.

Fioret

B.

2017

Органоиды легких: использование в настоящее время и перспективы на будущее

Девелопмент

144

986

997

Бургнер

Д.

Jamieson

S.E.

Блэквелл

J.M.

2006

Генетическая предрасположенность к инфекционным заболеваниям: большой — красивый, а крупный — еще лучше?

Ланцетная инфекция.Дис.

6

653

663

Кливерс

H.

2016

Моделирование развития и болезней с помощью органоидов

Ячейка

165

1586

1597

Коломбо

К.

2007

Болезнь печени при муковисцидозе

Curr. Opin. Pulm. Мед

13

529

536

Креспо

М.

Вилар

E.

Цай

С.Ю.

2017

Органоиды толстой кишки, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для моделирования колоректального рака и тестирования лекарств

Нац. Мед

23

878

884

Крус-Акуна

р.

Quirós

M.

Фаркас

А.E.

2017

Синтетические гидрогели для образования органоидов кишечника человека и заживления ран толстой кишки

Нац. Ячейка Биол

19

1326

1335

Резка

G.R.

2015

Генетика муковисцидоза: от молекулярного понимания к клиническому применению

Нац. Ред. Genet

16

45

56

Де Морган

W.

Дрю

г.

1914

Исследование реституционных масс, образованных диссоциированными клетками гидроидов Antennularia ramosa и A. антеннина

J. Mar. Biol. Доц. Великобритания

10

440

463

Дианат

Н.

Dubois-Pot-Schneider

H.

Steichen

C.

2014

Получение функциональных холангиоцитоподобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и клеток HepaRG

Гепатология

60

700–7

14

Дрост

Дж.

Клеверс

Х.

2017

Трансляционные приложения органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток

Девелопмент

144

968

975

Дурье

W.R.

Доэрти

J.K.

1954

Ядерные и цитоплазматические органоиды в живой клетке

Ann. NY Acad. Sci

58

1210

1231

Дюваль

К.

Grover

H.

Хан

L.H.

2017

Моделирование физиологических событий в 2D vs.3D клеточная культура

Физиология

32

266

277

Краситель

Б.Р.

Hill

D.R.

Фергюсон

MA

2015

Получение in vitro органоидов легких, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека

eLife

4

e05098

Ehrmann

R.L.

Гей

г.О.

1956

Рост клеток на прозрачном геле из восстановленного коллагена крысиного хвоста

J. Natl Cancer Inst.

16

1375

1403

Эйраку

М.

Ватанабэ

К.

Мацуо-Такасаки

М.

2008

Самоорганизованное образование поляризованных корковых тканей из ЭСК и его активное манипулирование внешними сигналами

3

519

532

Emerman

J.T.

Пителка

D.R.

1977

Поддержание и индукция морфологической дифференциации диссоциированного эпителия молочных желез на плавающих коллагеновых мембранах

In Vitro

13

316

328

Фатехуллах

A.

Тан

S.H.

Баркер

Н.

2016

Органоиды как модель развития человека и болезней in vitro

Нац. Ячейка Биол

18

246

254

Финкбайнер

S.R.

Freeman

J.J.

Вик

М.

2015

Создание тканевой инженерии тонкого кишечника с использованием кишечных органоидов человека, полученных из эмбриональных стволовых клеток

Biol. Открыть

4

1462–14

72

Финкбайнер

S.R.

Цзэн

X.L.

Утама

Б.

2012

Органические кишечные органоиды человека, полученные из стволовых клеток, как модель инфекции ротавирусов

мБио

3

e00159

12

Forbes

T.A.

Howden

S.E.

Лоулор

К.

2018

Почечные органоиды, полученные от пациентов с ИПСК, демонстрируют функциональное подтверждение цилиопатического почечного фенотипа и выявляют лежащие в основе патогенетические механизмы

Am. J. Hum. Genet

102

816

831

Форбестер

J.L.

Гулдинг

Д.

Vallier

L.

2015

Взаимодействие Salmonella enterica serovar typhimurium с кишечными органоидами, полученными из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Заражение. Иммун

83

2926

2934

Форстер

р.

Чиба

К.

Schaeffer

L.

2014

Кишечная ткань человека со свойствами взрослых стволовых клеток, полученная из плюрипотентных стволовых клеток

Репродукция стволовых клеток

2

838

852

Газизаде

З.

Kao

D.I.

Амин

С.

2017

Ингибирование ROCKII способствует созреванию β-подобных клеток поджелудочной железы человека

Нац. Коммуна

8

298

Gjorevski

N.

Sachs

N.

Манфрин

А.

2016

Конструктор матриц для культуры кишечных стволовых клеток и органоидов

Природа

539

560

564

Годиенко

С.М.

1964

Органоидная тератома носа у младенца

Вестн. Оториноларингол

26

92

94

Guo

M.

Чжан

Т.

Донг

X.

2017

Использование hESC для исследования взаимодействия генов CDKAL1 и MT1E, связанных с диабетом

Cell Rep

19

1512

1521

Guvendiren

M.

Burdick

J.A.

2012

Придание жесткости гидрогелям для исследования краткосрочных и долгосрочных клеточных реакций на динамическую механику

Нац. Коммуна

3

792

Ho

B.X.

Pek

N.M.Q.

Soh

B.S.

2018

Моделирование заболеваний с использованием трехмерных органоидов, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Внутр. J. Mol. Sci

19

936

Hohwieler

M.

Иллингм

А.

Герман

П.С.

2017

Ацинарные / протоковые органоиды, происходящие из плюрипотентных стволовых клеток человека, образуют поджелудочную железу человека при ортотопической трансплантации и позволяют моделировать заболевание

Кишечник

66

473

486

Hohwieler

M.

Мюллер

М.

Frappart

P.O.

2019

Предшественники и органоиды поджелудочной железы как предпосылка для моделирования заболеваний и рака поджелудочной железы

Stem Cells Int. 2019

82

Holtfreter

J.

1948

17

49

Хуан

Л.

Holtzinger

A.

Джаган

I.

2015

Моделирование протокового рака поджелудочной железы и скрининг лекарств с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток и опухолевых органоидов, полученных от пациентов

Нац. Мед

21

1364

1371

Huzella

T.

1932

Ориентация круассанов культур тканей на основе искусственных волокон коагуляции раствора коллагена

SAC r. Soc. Биол. Париж

109

515

Юнг

К.Б.

Ли

Х.

Сын

Ю.С.

2018

Интерлейкин-2 индуцирует созревание in vitro кишечных органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека

Нац. Коммуна

9

3039

Кальшойер

H.

Danzl

N.

Оноэ

Т.

2012

Модель для персонализированного анализа иммунной реакции человека in vivo

Sci. Пер. Мед

4

125

130

Ким

Ю.

Ким

Х.

Ко

U.H.

2016

Островковидные органоиды, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, эффективно влияют на чувствительность к глюкозе , in vitro и

Sci. Репу

6

35145

Китано

К.

Schwartz

D.M.

Чжоу

H.

2017

Биоинженерия функциональных кишечных трансплантатов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, индуцированных человеком

Нац. Коммуна

8

765

Клоксин

A.M.

Каско

А.М.

Salinas

C.N.

2009

Фоторазлагаемые гидрогели для динамической настройки физико-химических свойств

Наука

324

59

63

Кувахара

A.

Озон

C.

Накано

т.

2015

Образование ниши стволовых клеток, подобных краю ресничек, из самоорганизующейся ткани сетчатки глаза человека

Нац. Commun.

6

6286

Lan

P.

Тономура

Н.

Симидзу

A.

2006

Восстановление функциональной иммунной системы человека у мышей с иммунодефицитом посредством комбинированной трансплантации тимуса / желчного пузыря плода человека и клеток CD34 ⁺

Кровь

108

487

492

Ланкастер

МА

Кноблич

J.A.

2014

Органогенез в чашке: моделирование развития и заболевания с использованием органоидных технологий

Наука

345

1247

1251

Ланкастер

М.А.

Реннер

м.

Мартин

C.A.

2013

Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию

Природа

501

373

379

Лаванда

K.J.

Панг

W.W.

Мессер

R.J.

2013

BLT-гуманизированные мыши C57BL / 6 Rag2 ^{— / —} γc ^{— / —} CD47 ^{— / —} Мыши устойчивы к GVHD и развивают B- и T-клеточный иммунитет к ВИЧ-инфекции

Кровь

122

4013

4020

Лесли

J.L.

Хуанг

С.

Opp

J.S.

2015

Стойкость и выработка токсинов Clostridium difficile в органоидах кишечника человека приводят к нарушению параклеточной барьерной функции эпителия

Заражение. Иммун

83

138

145

Li

X.

Отани

A.

Куо

К.

2016

Система культивирования на границе раздела воздух-жидкость для трехмерного культивирования органоидов различных первичных тканей желудочно-кишечного тракта

Methods Mol. Биол

1422

33

40

Mather

A.E.

2013

Исследование подчеркивает различия в популяциях Salmonella животных и человека

Вет. Рек.

173

233

McCracken

K.W.

Айхара

E.

Мартин

Б.

2017

Wnt / β-catenin способствует спецификации дна желудка у мышей и людей

Природа

541

182

187

McCracken

K.W.

Catá

E.M.

Crawford

C.M.

2014

Моделирование человеческого развития и болезней с помощью органоидов желудка, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

Природа

516

400

404

McCracken

K.W.

Хауэлл

J.C.

Wells

J.M.

2011

Создание ткани кишечника человека из плюрипотентных стволовых клеток

Нац. Протокол

6

1920

1928

Михалопулос

г.

Пито

H.C.

1975

Первичная культура паренхиматозных клеток печени на коллагеновых мембранах.Морфологические и биохимические наблюдения

Exp. Ячейка Res

94

70

78

Мур

B.D.

Джин

р.

Осаки

Л.

2015

Идентификация аланиламинопептидазы (CD13) в качестве поверхностного маркера для выделения зрелых главных ферментных клеток желудка

Am. J. Physiol. Гастроинтест. Liver Physiol

309

G955 – G9

64

Москона

A.

Москона

H.

1952

Диссоциация и агрегация клеток зачатков органов раннего куриного эмбриона

J. Anat.

86

287

301

Мунера

J.O.

Сундарам

Н.

Ранкин

S.A.

2017

Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека в органоиды толстой кишки посредством временной активации передачи сигналов BMP

21

51

64.e6

Надкарни

Р.Р.

Abed

S.

Cox

B.J.

2017

Функциональные энтеросферы, полученные in vitro из плюрипотентных стволовых клеток человека

Репродукция стволовых клеток

9

897

912

Накано

т.

Ando

S.

Таката

Н.

2012

Самообразование глазных бокалов и хранимой стратифицированной нервной сетчатки из человеческих ЭСК

10

771

785

Нил

Дж. Т.

Li

X.

Чжу

Дж.

2018

Органоидное моделирование иммунного микроокружения опухоли

Ячейка

175

1972

1988

Nie

Y.Z.

Чжэн

Ю.В.

Огава

М.

2018

Органоиды печени человека, полученные с помощью нескольких клеток, полученных от одного донора, спасают мышей от острой печеночной недостаточности

Stem Cell Res. Ther

9

5

Нишинакамура

р.

2019

Органоиды почек человека: прогресс и нерешенные проблемы

Нац. Преподобный Нефрол

15

613

624

Огава

М.

Огава

S.

Медведь

н.э.

2015

Направленная дифференцировка холангиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток человека

Нац. Биотехнология

33

853

861

Оучи

р.

Того

S.

Кимура

м.

2019

Моделирование стеатогепатита у людей с помощью органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

Ячейка Метаб

30

374

384.e6

Pagliuca

F.W.

Millman

J.Р.

Gürtler

M.

2014

Создание функциональных β-клеток поджелудочной железы человека

Ячейка

159

428

439

Поддон

F.C.

Райт

К.

2011

Органогенез поджелудочной железы: от зачатка до сплетения и железы

Dev. Dyn

240

530

565

Рэбер

Г.П.

Лутольф

М.П.

Hubbell

J.A.

2005

Молекулярно сконструированные гидрогели ПЭГ: новая модельная система протеолитически опосредованной миграции клеток

Biophys. J

89

1374

1388

Резания

A.

Bruin

J.E.

Арора

П.

2014

Лечение диабета инсулин-продуцирующими клетками, полученными in vitro из плюрипотентных стволовых клеток человека

Нац. Биотехнология

32

1121

1133

Roelandt

P.

Обейд

S.

Paeshuyse

J.

2012

Гепатоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, поддерживают полную репликацию вируса гепатита С

Дж. Гепатол

57

246–2

51

Русь

Х.А.

Материнская

A.V.

Ринглер

J.J.

2015

Контролируемая индукция предшественников поджелудочной железы человека продуцирует функциональные β-подобные клетки in vitro

EMBO J

34

1759

1772

Сафиния

Н.

Мингер

С.Л.

2009

Получение гепатоцитов из эмбриональных стволовых клеток человека

Methods Mol. Биол

481

169

180

Sampaziotis

F.

de Brito

M.C.

Geti

I.

2017

Направленная дифференцировка индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в функциональные холангиоцитоподобные клетки

Нац. Протокол

12

814

827

Sampaziotis

F.

de Brito

M.C.

Мадригал

P.

2015

Холангиоциты, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, для моделирования заболеваний и проверки лекарственных средств

Нац. Биотехнология

33

845

852

Сасаи

Ю.

2013

Регенеративная медицина нового поколения: органогенез стволовых клеток в 3D-культуре

12

520

530

Сато

Т.

Vries

R.G.

Snippert

H.J.

2009

Одиночные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинка in vitro без мезенхимальной ниши

Природа

459

262

265

Schwartz

R.E.

Трехан

К.

Андрус

Л.

2012

Моделирование инфицирования вирусом гепатита С с использованием индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Proc. Natl Acad. Sci. США

109

2544

2548

Шамир

E.R.

Эвальд

А.J.

2014

Трехмерная органотипическая культура: экспериментальные модели биологии и болезней млекопитающих

Нац. Rev. Mol. Ячейка Биол

15

647

664

Прокладка

J.H.

Ким

Дж.

Хан

Дж.

2015

Панкреатические островковые трехмерные агрегаты, полученные из человеческих эмбриональных стволовых клеток, уменьшают гипергликемию у мышей с индуцированным стрептозотоцином диабетом

Трансплантация клеток

24

2155

2168

Силва

Т.П.

Котовио

J.P.

Бекмана

Е.

2019

Принципы конструирования органоидов на основе плюрипотентных стволовых клеток

Stem Cell Int. 2019

4508470

обезьяна

м.

Бисселл

М.J.

2016

Органоиды: историческая перспектива мышления в трех измерениях

J. Cell Biol

216

31

40

Си-Тайеб

К.

Noto

F.K.

Нагаока

М.

2010

Высокоэффективное создание гепатоцитоподобных клеток человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Гепатология

51

297

305

Sommer

C.A.

Capilla

A.

Молина-Эстевес

F.J.

2018

Моделирование мутагенеза APC и семейного аденоматозного полипоза с использованием человеческих iPS-клеток

PLoS One

13

e0200657

Спенс

J.R.

Мэйхью

C.№

Ранкин

S.A.

2011

Направленная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в ткань кишечника

Природа

470

105

109

Штанге

D.E.

Коо

Б.К.

Хуч

м.

2013

Дифференцированные главные клетки Troy ⁺ действуют как резервные стволовые клетки, генерируя все клоны эпителия желудка

Ячейка

155

357

368

Staufer

K.

Halilbasic

E.

Траунер

м.

2014

Заболевание печени, связанное с муковисцидозом — еще один черный ящик в гепатологии

Внутр. J. Mol. Sci

15

13529

13549

Streuli

C.H.

Бейли

Н.

Bissell

M.J.

1991

Контроль дифференцировки эпителия молочных желез: базальная мембрана индуцирует тканеспецифическую экспрессию генов в отсутствие межклеточного взаимодействия и морфологической полярности

J. Cell Biol

115

1383

1395

Такахаши

Ю.

Сато

С.

Курашима

Ю.

2018

Усовершенствованная система культивирования для индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток кишечных эпителиальных органоидов

Репродукция стволовых клеток

10

314

328

Takebe

Т.

Секин

к.

Эномура

м.

2013

Васкуляризованная и функциональная печень человека из трансплантата зачатка органа, полученного из ИПСК

Природа

499

481

484

Тамминен

К.

Бальбоа

D.

Тойвонен

S.

2015

Взаимодействие в кишечнике и созревание плюрипотентных стволовых клеток человека не зависит от экзогенных FGF4 и R-spondin1

PLoS One

10

e0134551

Цай

Y.H.

Наттив

р.

Dedhia

P.H.

2017

Формирование паттерна кишечника, полученного из плюрипотентных стволовых клеток in vitro, повторяет развитие человека in vivo

Девелопмент

144

1045

1055

Watson

C.L.

Mahe

M.M.

Múnera

J.

2014

Модель тонкого кишечника человека in vivo с использованием плюрипотентных стволовых клеток

Нац. Мед

20

1310

1314

Wilson

H.V.

1910

Развитие губок из диссоциированных тканевых клеток

Бык. Бюро рыболовства США

30

1

30

Уилсон

Р.Л.

Стивенсон

н.э.

2019

634

646

Вольтер

J.R.

1967

Пролиферирующий пигментный эпителий. Создание простой органоидной структуры в субрентинальном пространстве человеческого глаза

Arch. Офтальмол

77

651

654

Wu

F.

Wu

D.

Ren

Y.

2019

Получение гепатобилиарных органоидов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Дж. Гепатол

70

1145

1158

Цзэн

H.

Guo

M.

Чжоу

Т.

2016

Изогенная платформа ESC человека для функциональной оценки генов диабета, выявленных в рамках общегеномных ассоциаций, и открытия лекарств

19

326

340

Чжао

р.

Дункан

S.A.

2005

Эмбриональное развитие печени

Гепатология

41

956

967

Чжоу

Т.

Kim

T.W.

Чонг

C.N.

2018

Платформа на основе hPSC для обнаружения взаимодействий генов и окружающей среды, которые влияют на выживаемость человеческих β-клеток и дофаминовых нейронов

Нац. Коммуна

9

4815

Zorn

A.M.

Wells

J.M.

2007

Молекулярные основы развития энтодермы позвоночных

Внутр. Ред. Cytol

259

49

111

© Автор (ы) (2020).Опубликовано Oxford University Press от имени Journal of Molecular Cell Biology , IBCB, SIBS, CAS.

моделей органоидов и их применение в биомедицинских исследованиях — FullText — Nephron 2015, Vol.130, № 3

Аннотация

Последние технические достижения в области стволовых клеток позволили создать in vitro сложные структуры, напоминающие целые органы, называемые органоидами. В большинстве этих подходов используются трехмерные (3D) системы культивирования, которые позволяют клеткам-предшественникам стволовых клеток или тканям самоорганизовываться в трехмерные структуры. Эти системы эволюционировали, методологически и концептуально, из классических экспериментов по реагрегации, показывающих, что диссоциированные клетки эмбриональных органов могут реагировать и воссоздавать первоначальную архитектуру органов.Поскольку органоиды можно выращивать из стволовых клеток человека и из индуцированных пациентами плюрипотентных стволовых клеток, они создают значительные перспективы для моделирования развития и заболеваний, для токсикологических исследований и исследований по открытию лекарств, а также в области регенеративной медицины. Здесь мы описываем исторические достижения в этой области и описываем некоторые из основных недавних достижений в области формирования трехмерных органоидов человека. Наконец, мы подчеркиваем существующие ограничения и выделяем примеры того, как органоидные технологии могут быть применены в биомедицинских исследованиях.

© 2015 S. Karger AG, Базель

Введение

Стволовые клетки (СК) открывают чрезвычайно многообещающие перспективы для исследований и терапии. Сегодня несколько типов клеток могут быть созданы in vitro благодаря удивительному прогрессу, достигнутому в выделении и работе с клетками из различных тканей [1,2], и, что еще более важно, благодаря способности изменять идентичность клеток путем перепрограммирования [3 ] и повторно дифференцирующиеся соматические клетки.Однако, поскольку органы и ткани трехмерны (3D), важные аспекты, влияющие на органогенез, отсутствуют в обычных двумерных (2D) культурах. Эта проблема привела к разработке трехмерных систем, которые позволяют создавать и выращивать in vitro миниатюрные органы, называемые органоидами, способные к органотипическому развитию и выполнять органоспецифические функции.

Органоиды обычно образуются из клеток-предшественников (ПК), которые либо выделяются из эмбрионов, либо происходят из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) (рис.1). Эти подходы представляют собой концептуальную эволюцию традиционных экспериментов по реагрегации с эмбриональными тканями, демонстрируя, что агрегаты клеток-предшественников могут дифференцироваться и самоорганизовываться в трехмерные структуры, типичные для раннего органогенеза [4,5]. Большинство современных технологий включают формирование паттерна экзогенной ткани с использованием факторов роста, которые определяют идентичность клеток, и внедрение геля внеклеточного матрикса (ЕСМ) с последующей реакгрегацией для стимуляции движения клеток и создания самоорганизующейся трехмерной ткани.

Рис. 1

Схематическое изображение образования органоидов из PSCs. Для каждого класса органоидов на этом рисунке показан зародышевый слой происхождения и основные характеристики клеток-предшественников или эпителий, которые могут быть получены из PSC с использованием протоколов дифференцировки in vitro. Эти протоколы резюмируют условия развития с точки зрения ECM и молекулярной среды, которым ESC обычно подвергаются во время органогенеза in vivo. Более подробно стратегии дифференцировки ПСХ, условия культивирования и факторы роста, используемые для получения органоспецифичных клеток-предшественников, описаны в тексте.

Таким образом, в отличие от двумерных культур клеток, органоидные системы обеспечивают трехмерный рост, движение и дифференциацию клеток, что делает эту технологию эффективной моделью для понимания развития органов, морфогенеза тканей и генетических или молекулярных основ заболеваний. В будущем они также могут быть использованы в исследованиях по тестированию на наркотики и заместительной терапии тканей.

Ниже мы описываем основные последние достижения в технологии органоидов.

Органоиды кишечника

Пищеварительный тракт позвоночных состоит из множества органов, которые возникают из общей примитивной кишечной трубки, которая простирается от рта до заднего прохода.Кишечная трубка образована складкой энтодермального слоя [6], которая подразделяется на три области: переднюю, среднюю и заднюю кишки, каждая из которых формирует определенные органы в заданное время во время эмбрионального развития. Передняя кишка дает начало глотке, пищеводу, желудку, печени, поджелудочной железе, легким и части двенадцатиперстной кишки. Средняя кишка формирует оставшуюся часть двенадцатиперстной кишки, тощую кишку, подвздошную кишку и части толстой кишки. Задняя кишка развивается в остальную часть толстой кишки, за исключением части анального канала [7].

Группа Клеверса [8,9] впервые продемонстрировала образование трехмерных органоидов кишечника из LGR5-экспрессирующих кишечных СК мыши, которые росли с образованием структур крипта-ворсинки и всех основных типов клеток кишечника в матригеле, богатом ламинином, с добавлением EGF. Агонист Wnt (R-спондин-1) и Noggin (ингибитор BMP). Интересно, что технология кишечных органоидов уже использовалась в качестве потенциальной платформы для персонализированных подходов к медицине, как продемонстрировал анализ человеческого органоида, вызванного форсколином, который позволяет анализировать индивидуальные реакции на лекарства при муковисцидозе [10].Снова используя LGR-5-экспрессирующие SC, на этот раз изолированные из толстой кишки, Sato et al. Вырастили аналогичные органоиды толстой кишки человека и мыши [11]. Эти органоиды взрослых мышей также были способны интегрироваться в поверхностно поврежденную толстую кишку мыши, чтобы воссоздать однослойный эпителий с самообновляющимися, функциональными и гистологически нормальными криптами [12].

Подобные принципы недавно были применены для получения кишечных органоидов из ПСХ человеческого происхождения. Spence et al. направил монослои как человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC), так и индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) на формирование дефинитивной энтодермы с использованием Activin A с последующим образованием трехмерного сфероида задней кишки в присутствии FGF4 и Wnt3a [13].Впоследствии эти сфероиды, полученные из PSC, были дополнительно культивированы в проинтестинальной культуральной системе, как описано Sato et al. [9] с образованием органоидов, состоящих из поляризованного столбчатого эпителия, который был сформирован в ворсиноподобные структуры и крипто-подобные пролиферативные зоны, содержащие LGR5-экспрессирующие SCs, функциональные энтероциты, а также бокаловидные клетки, клетки Панета и энтероэндокринные клетки. Примечательно, что эти производные PSC кишечные органоиды также развивают мезенхимальный слой и кишечные субэпителиальные миофибробласты, а также гладкомышечные клетки и фибробласты на более поздних стадиях.Таким образом, одновременное развитие кишечного эпителия и мезенхимы указывает на высоко скоординированное взаимодействие между разными зародышевыми листками в морфогенезе органоидов [13].

Используя эту систему культивирования в качестве модели для изучения развития кишечника человека, авт. Дополнительно документально подтвердили, что комбинированная активность Wnt3a и FGF4 необходима для спецификации задней кишки, тогда как одного FGF4 достаточно для стимулирования морфогенеза задней кишки. Более того, эта система была применена для исследования мутаций потери функции в NEURG3, которые лежат в основе врожденной мальабсорбционной диареи, предположительно из-за отсутствия кишечных энтероэндокринных клеток [14].Действительно, эксперименты с аденовирусной сверхэкспрессией и shRNA-опосредованным нокдауном NEURG3 продемонстрировали, что развитие кишечных энтероэндокринных клеток сильно зависит от экспрессии NEURG3 [13].

Совсем недавно эти органоиды были трансплантированы мышам с ослабленным иммунитетом для развития зрелого эпителия и мезенхимы, которые содержали дифференцированные клоны кишечных клеток, функциональные ферменты щеточной каймы, а также субэпителиальный и гладкомышечный слои. Пересаженные ткани кишечника также продемонстрировали пищеварительную функцию, как показали исследования проницаемости и поглощения пептидов, и были способны реагировать на системные сигналы от мыши-хозяина после илеоцекальной резекции [15].

Недавно McCracken et al. [16] сообщили о первом поколении трехмерных желудочных органоидов человека посредством направленной in vitro дифференцировки hESCs и hiPSCs. Авт. Повторили развитие желудка человека in vivo, индуцируя сначала PSCs с образованием дефинитивных сфероидов энтодермы, которые впоследствии стимулировались ретиноевой кислотой для образования передней кишки. Для обеспечения трехмерного роста и дальнейшей дифференцировки сфероиды были перенесены в культуру Matrigel, дополненную ретиноевой кислотой, что привело к образованию доменов со слизистой желудка и эндокринными клетками и LGR5-экспрессирующими SC.Примечательно, что для изучения этиологии заболевания, опосредованного Helicobacter pylori, они вводили бактерию непосредственно в просвет органоидов и наблюдали, что фактор вирулентности CagA связывает и активирует рецептор c-Met, вызывая пролиферацию эпителия. Этот патофизиологический ответ эпителия делает органоиды многообещающей моделью желудочного заболевания человека.

Органоиды печени

Печень имеет энтодермальное происхождение, возникая из выроста вентральной стенки передней кишки, которая развивается в структуру зачатка печени [17].Клетки энтодермы печени, известные как гепатобласты, отделяются от этого зачатка, вторгаются в окружающую мезенхиму и дают начало как гепатоцитам, так и клеткам желчных протоков, тогда как мезенхима обеспечивает фибробласты, звездчатые клетки печени и синусоидальные эндотелиальные клетки [18]. Образование зачатка печени сопровождается развитием сосудистой сети печени, которая формируется в результате комбинации ангиогенеза и васкулогенеза и в конечном итоге становится основным кроветворным органом плода. Таким образом, развитие печени зависит от тонкой оркестровки сигналов между энтодермальными эпителиальными, мезенхимальными и эндотелиальными предшественниками до перфузии крови.

Ранние исследования развития продемонстрировали, что диссоциированные клетки эмбриональной печени кур могут реагировать и организовываться в секреторные единицы, типичные для печени и соответствующие образованию функциональных желчных протоков. В паренхиме реконструированных тканей также присутствовали гемопоэтические островки, которые продуцировали различные типы клеток крови [19]. Недавние достижения показали, что популяция ПК мышей, которая появляется возле желчных протоков после повреждения печени, может клонально увеличиваться в виде органоидов в 3D-культурах в течение нескольких месяцев.Эти клональные органоиды также можно заставить дифференцироваться in vitro и генерировать функциональные гепатоциты при трансплантации мышам Fah ^{— / —} (модель тирозинемии типа I заболевания печени) [20], улучшая выживаемость животных. Точно так же клетки желчных протоков человека могут быть размножены in vitro как бипотентные клетки-предшественники в трехмерные органоиды и преобразованы в функциональные клетки гепатоцитов либо in vitro, либо после трансплантации. Примечательно, что эти органоиды могут быть расширены у пациентов с дефицитом α-1-антитрипсина и синдромом Алажиля и имитировать патологию in vivo, создавая значительные возможности для моделирования заболеваний и индивидуальных медицинских исследований [21].

Начиная с PSCs, Takebe и его коллеги недавно создали ткани, напоминающие зачатки печени человека [22]. Чтобы повторить ранний органогенез, авт. Культивировали энтодермальные клетки, происходящие из hiPSC, с эндотелиальными клетками пупочной вены человека и мезенхимальными стволовыми клетками человека в Matrigel для создания трехмерных зачатков печени с паттернами экспрессии генов, очень похожими на таковые в печени первичного плода. Примечательно, что вскоре после трансплантации мышиной модели черепного окна зачатки печени, соединенные с сосудистой сетью хозяина, созрели в ткани печени, подобные взрослым, и выполняли специфические для печени функции, такие как производство сывороточного альбумина и специфический для человека метаболизм лекарств.Наконец, трансплантация почек печени человека улучшила выживаемость мышей после лекарственной печеночной недостаточности.

Хотя остаются без ответа несколько вопросов, например, прямой или косвенный механизм лежит в основе наблюдаемого терапевтического эффекта, эта трансплантация зачатка печени кажется легко переводимым подходом для лечения печеночной недостаточности в конечном итоге.

Органоиды почек

Метанефрическая почка имеет мезодермальное происхождение и развивается в самой задней части ствола [23,24,25].Его органогенез начинается со спецификации промежуточной мезодермы (IM) ткани-предшественника почек, которая постепенно расширяется в рострально-каудальном направлении и дает начало как эпителию нефрального протока (ND), так и метанефрической мезенхиме (MM) [26]. . Мочеточниковый зачаток (UB) отходит от ND в виде эпителиального выроста, который вторгается в соседний MM и взаимодействует с ним, образуя разветвленную систему собирательных протоков. В то же время зрелые нефроны и другие производные MM развиваются посредством прогрессивной конденсации, эпителизации и дифференцировки MM, регулируемых ветвлением UB и передачей сигналов [26].

Как было показано ранее для других органов, доказательства того, что ткань почек может быть способной к самоорганизации, получены из ранних экспериментов по реагрегации. Новаторские исследования Auerbach и Grobstein продемонстрировали, что путем повторной агрегации клеточных суспензий из MM и эмбрионального дорсального спинного мозга, мощного индуктора канальцев, можно генерировать ткани, содержащие рудиментарные нефроноподобные трубчатые структуры [4]. Значительный прогресс в этой области был достигнут благодаря разработке метода, который позволяет простой суспензии эмбриональных клеток почек самоорганизовываться in vitro в «ткань», содержащую незрелые нефроны и UB, без использования какой-либо экзогенной ткани [27].Однако короткое время выживания культур органов in vitro и, что наиболее важно, недостаточность этих систем для поддержки развития васкуляризированных клубочков (фильтрующая единица почек) не позволяли достичь дальнейшего созревания до состояния, напоминающего почки взрослых. Основываясь на этом методе, оптимизированная система реагрегации позволила почечным органоидам созреть in vivo с использованием суспензий эмбриональных клеток почек [28]. При трансплантации под почечную капсулу бестимусных крыс эти ткани становились васкуляризованными, продолжали расти и выполняли специфические для почек функции, включая фильтрацию крови и канальцевую реабсорбцию макромолекул, а также выработку эритропоэтина.Объединив анализ электронной микроскопии и эксперименты по отслеживанию макромолекул, авторы дополнительно документально подтвердили, что органоиды могут воспроизводить, in vivo, сложную трехмерную фильтрующую структуру клубочковых щелей и осуществлять избирательную клубочковую фильтрацию [29]. Более того, эта технология была применена для создания трехмерных химерных органоидов из стволовых клеток амниотической жидкости человека и эмбриональных клеток почек мыши, которые прижились in vivo и выросли с образованием васкуляризированных клубочков и канальцевых структур [30].

Вышеупомянутые исследования могут предполагать, что, если PC почек или зрелые типы клеток могут быть получены из PSC и подвергнуты определенным условиям, они могут впоследствии пространственно самоорганизоваться с целью создания трехмерных почечных тканей.

Xia et al. недавно описали эффективный и быстрый протокол для направленной дифференцировки hESCs и hiPSCs в клетки, подобные предшественникам UB, за четыре дня [31]. В первые 2 дня кластеры PSC, культивируемые на матригеле, подвергались воздействию сигналов BMP4 и FGF2, чтобы вызвать мезодермальную фиксацию, тогда как в следующие 2 дня клетки индуцировали приобретение позднего IM / UB-подобного фенотипа в присутствии BMP2, ретиноевого кислота и активин А.Чтобы обеспечить дальнейшее созревание, дифференцированные клетки культивировали совместно с клетками эмбриональных почек мыши с образованием трехмерных химерных органоидов, в которых они демонстрировали интеграцию в развивающиеся химерные структуры UB. Соответственно, учитывая отсутствие экспрессии маркера MM, эти клетки не обнаруживали какой-либо интеграции в компартмент MM [31].

Taguchi et al. получены MM клетки [25] как из мышиных ESCs (mESCs), так и из hiPSCs, сначала определяя как спецификацию IM, так и MM и UB онтогенетическое происхождение, а затем имитируя их in vitro.Первоначально они обнаружили посредством анализа клонов, что brachyury (T) -положительная задняя мезодерма дает начало MM, тогда как T-отрицательная передняя мезодерма дает начало UB. Затем они оптимизировали протокол дифференцировки для индукции предшественников MM из hPSC. Первоначально EB были индуцированы активином A с последующим воздействием BMP4 и сигнального агониста Wnt CHIR99021, что привело к дифференцировке задней мезодермы. Наконец, нанесение ретиноевой кислоты, а затем FGF9 стимулировало клетки к приобретению идентичности MM.При совместном культивировании с эмбриональным спинным мозгом предшественники MM в индуцированных EB показали способность к дальнейшей дифференцировке и развитию проксимальных и дистальных канальцев и клубочковых структур, содержащих клетки, положительные по маркерам подоцитов и отростков стопы. Когда индуцированные мышиные EB совместно трансплантировали спинной мозг под капсулу почки, у них развивались васкуляризированные клубочки, содержащие эритроциты, демонстрируя связь с кровообращением хозяина.

Практически одновременно с этими исследованиями Takasato et al.разработали протокол дифференциации для ступенчатой ​​синхронной индукции как UB, так и MM, начиная с hESCs, выращенных в 2D и подвергнутых химически определенным условиям, которые повторяют условия нормального органогенеза почек [32]. Во-первых, hESC были дифференцированы в примитивную полоску, популяцию предшественников как для мезодермы, так и для энтодермы, с помощью стимуляции активином A / BMP4 или, альтернативно, CHIR99021. Поскольку IM обычно возникает из задней примитивной полоски, они индуцировали дифференцировку IM посредством воздействия FGF9.Впоследствии IM-клетки подвергали обработке FGF9 / BMP7 / ретиноевой кислотой или лишали каких-либо факторов роста, что давало предшественники UB и MM в обеих применяемых стратегиях. Повторная агрегация после диссоциации исходных монослойных культур после связывания UB и MM позволила образовать небольшие самоорганизованные органоиды почек. Наконец, когда почечные предшественники реагировали с диссоциированными эмбриональными почками мыши, они генерировали химерные органоиды, в которых почечные предшественники интегрировались во все развивающиеся почечные структуры, включая эпителий мочеточника, почечные пузырьки, мезенхиму предшественников нефронов и почечную строму.

Значительные будущие успехи в инженерии почечной ткани могут стать возможными благодаря рекомбинации клеток-предшественников UB из группы Бельмонте с предшественниками ММ из группы Нишинакамура, чтобы проверить, можно ли начинать с высокочистых популяций почечных ПК, полученных из различных типов PSC могут управлять органогенезом in vitro.

Органоиды головного мозга

Нервная система происходит от нервной эктодермы [33], которая образует нервную пластинку, плоскую пластинку эктодермальных клеток, расположенных дорсально в эмбрионе, которая постепенно образует цилиндрическую эпителиальную структуру, известную как нервная трубка.Вдоль вентрально-дорсальной и рострально-каудальной осей строгий пространственно-временной градиент морфогенов позволяет эпителиальной трубке разделиться на четыре основные области: передний мозг (передний мозг), средний мозг (средний мозг) и ромбовидный мозг (задний мозг) и спинной мозг. шнур. Вторичные пузырьки, выходящие из переднего мозга, дают начало конечному мозгу (полушарии головного мозга) и промежуточному мозгу (таламус и гипоталамус).

Нейроны и глия ЦНС генерируются из мультипотентных нервных стволовых клеток (НСК), которые располагаются ростро-каудально в нервной трубке [34].Посредством серии изначально симметричных, а затем асимметричных делений NSCs дают начало самообновляющимся предшественникам и более дифференцированным типам клеток, включая нейроны и промежуточные предшественники. Эти более дифференцированные клетки затем мигрируют наружу из доменов нативных NSC, чтобы развить многослойные структуры, такие как продолговатый мозг, покров зрительного нерва и кора головного мозга.

Новаторские исследования реагрегации с использованием клеток, диссоциированных из мозга куриных эмбрионов E6-9, продемонстрировали, что этот орган сохраняет внутреннюю способность к самоорганизации [35].При обнаружении на более ранних стадиях развития мозга нейральные предшественники цыплят самоорганизуются с образованием кластеров нейроэпителиальных клеток, расположенных радиально вокруг просвета, напоминающего нервную трубку. Эти классические эксперименты показали, что если нейроэпителий может быть получен из PSCs, то, скорее всего, произойдет спонтанная самоорганизация в трехмерные структуры.

Направленная in vitro дифференцировка PSCs по направлению к кортикальному нейрону показала, что эти клетки проявляют «стандартную» склонность к нейральной дифференцировке при поддержании в минимальных условиях культивирования.Во-первых, Watanabe et al. достигли дифференциации плавающих агрегатов mESC в предшественники телэнцефала, используя бессывороточную культуру, известную как SFEB (бессывороточная плавающая культура агрегатов, подобных эмбриоидным тельцам), в сочетании с 5-дневным воздействием антагонистов Wnt и Nodal [36] . Затем, оптимизируя эту систему культивирования SFEB, та же группа получила человеческие предшественники телэнцефала, которые самоорганизовались в розеточные структуры, напоминающие раннее развитие коры головного мозга [37]. Ключевой конфигурацией в этих экспериментах была быстрая агрегация hESC, чтобы составить культуру SFEB в среде, содержащей компоненты ECM, что дало поляризованный нейроэпителий с апикально-базальной полярностью, который далее подразделялся на характерные желудочковые и субвентрикулярные PC зоны.Эти ПК генерировали разные классы корковых нейронов в соответствующем временном порядке, напоминающем тот, который наблюдается в коре головного мозга мышей E11.5. Кроме того, эти нейроны демонстрировали явные признаки созревания, включая быстроволновые колебания Ca ²⁺ [37]. Этот метод был дополнительно усовершенствован в более позднем исследовании [38], описывающем многослойную структуру, включающую зоны нейронов и предшественников в правильном апикально-базальном порядке, как это видно в коре человеческого плода в начале второго триместра.

Другие области мозга также могут быть созданы путем имитации эндогенного паттерна с факторами роста. Ранее для получения различных областей ЦНС из mESCs использовались различные условия среды, включая формирование субпаллиального паттерна [39] и аденогипофиза [40], которые также могут вскоре реплицироваться с использованием источников hPSC. Таким образом, стимуляция нейроэктодермы через стадию БЭ с последующим применением определенных факторов роста может генерировать органоиды для различных отдельных областей мозга.

Недавно исследователи разработали метод, который позволяет развивать разные области мозга в одном органоиде [41].Этот подход начался с EB, но не было добавлено никаких факторов роста, определяющих идентичность определенных областей мозга. На этот метод повлиял протокол кишечных органоидов, то есть путем встраивания EB в 3D ECM. ECM способствует росту крупных зачатков нейроэпителия, которые затем расширяются и развиваются в различные области мозга, включая передний мозг, задний мозг, спинную кору, префронтальную кору, гиппокамп, затылочную долю сосудистого сплетения и сетчатку, что приводит к термин «мини-мозги».Чтобы смоделировать тяжелую микроцефалию с ранним началом в головном мозге, авторы использовали ИПСК пациента с усекающей мутацией в CDK5RAP2 — гене, решающем для поддержания состояния ПК во время развития. Эти трехмерные органоиды, полученные из hiPSC, демонстрировали редкие нейроэпителиальные зоны ПК и большие домены дифференцированных и зрелых нейронов, что позволяет предположить, что преждевременная дифференцировка вызывает формирование больного фенотипа in vivo. органоидное развитие.

В совокупности эти результаты обеспечивают доступ к широкому спектру структур ЦНС человека для функциональных исследований и выяснения путей развития мозга. Кроме того, органоиды головного мозга из полученных от пациентов или генетически модифицированных hiPSC могут быть мощным инструментом для моделирования заболеваний ЦНС.

Органоиды сетчатки

Сетчатка — это светочувствительная область глаза, происходящая от нервной эктодермы. Зачатки сетчатки возникают из промежуточного мозга и эвагинируют латерально, образуя псевдостратифицированный нейроэпителий, называемый зрительными пузырьками (OVs) [42].Дистальная часть каждого OV становится сенсорной нервной сетчаткой (NR; сенсорная ткань), тогда как проксимальная часть дает начало однослойной ткани, пигментному эпителию сетчатки, продуцирующему меланин (RPE; поддерживающая ткань NR) [43]. Затем OVs подвергаются инвагинации в своей дистальной части [44], чтобы сформировать глазной бокал (OC) с NR и RPE в качестве его внутренней и внешней стенок, соответственно [42]. NR содержит PCs, которые дифференцируются в ганглиозные клетки, фоторецепторы (палочки и колбочки) и поддерживающие типы клеток, все они пространственно организованы в отдельные слои, формирующие характерную многослойную сетчатку [42].

Сетчатка позвоночных всегда считалась одной из самых мощных моделей реагрегации в исследованиях тканевой инженерии для изучения основ развития нервного слоя [45]. Множество экспериментов на куриных эмбрионах документально подтвердили, что сетчатка имеет замечательную способность воссоздавать различные типы сфер с почти полным расположением слоев сетчатки [46,47], и, как и в других подходах к органоидам, это заложило основу для развития Органоиды сетчатки, происходящие из ПСХ.

Первое исследование, проведенное с ПСХ для образования органоидов сетчатки, было проведено Eiraku et al. [48], документально подтверждая, что эпителий сетчатки может быть эффективно сгенерирован с помощью трехмерных плавающих EB-подобных агрегатов из mESCs, культивируемых в средах с низким содержанием сыворотки, и компонентов ECM. В этих условиях агрегаты спонтанно формируют полусферические полые везикулы — подобные OVs — из которых проксимальная часть дифференцируется в пигментный эпителий, тогда как дистальная часть постепенно загибается внутрь, формируя форму, напоминающую эмбриональный ОК.Эти ОК-органоиды демонстрировали правильные маркеры NR и RPE и стратификацию сетчатки с надлежащей апикально-базальной полярностью и претерпевали морфологические изменения формы ткани, которые имитируют ступенчатую эвагинацию и инвагинацию ОК in vivo.

Удивительно, но когда были сформированы органоиды человека, размер ОК был больше, чем в культурах мышей, что отражает межвидовые различия и указывает на то, что масштабирование ткани является внутренним свойством клеток глазного поля мыши и человека [49]. Более того, органоиды сетчатки, происходящие из hESC, имели более толстый NR, который спонтанно изгибался апикально выпуклым образом, не наблюдаемым в культурах mESC, и демонстрировал апикальное ядерное позиционирование.Ткани сетчатки человеческого происхождения требовали больше времени для развития; нервный эпителий был многослойным и состоял из множества дифференцированных палочек и колбочек, тогда как дифференцировка колбочек не наблюдалась в культурах mESC. Это различие согласуется с различными визуальными навыками двух видов из-за их привычек: в сетчатке мышей in vivo колбочек мало, потому что мыши по существу ведут ночной образ жизни, тогда как в сетчатке человека их много, потому что они имеют решающее значение для цветового зрения во время дневное время [50].

Совсем недавно Assawachananont et al. [51] оптимизировали описанный выше протокол [48], добавив антагонист рецепторов ретиноевой кислоты и увеличив процент нокаута в сыворотке для получения большего количества ткани NR для трансплантации. 3D-листы сетчатки, полученные из ESC или iPSC мыши, дифференцировались в различные типы клеток сетчатки и зрелые фоторецепторы, которые формировали внешний ядерный слой сетчатки (светочувствительная часть глаза) в субретинальном пространстве сильно дегенерирующей сетчатки мыши-хозяина. потенциально предлагая новую терапию трансплантации ткани сетчатки для запущенных дегенеративных заболеваний сетчатки.

Используя другой подход, Zhu et al. индуцировали образование поляризованных нейроэпителиальных кист путем встраивания небольших кластеров чЭСК в матригель, поддерживающий образование трехмерных эпителиальных кист в присутствии среды нейральной индукции N2B27 [52]. В отсутствие факторов роста эти цисты приобрели подобие глаза, которое было способно генерировать NR при нанесении на фильтры Transwell, тогда как в ответ на активин A они дифференцировались в RPE.

Таким образом, трехмерные ткани сетчатки, полученные из PSC, воспроизводят основные аспекты развития сетчатки, предоставляя возможность генерировать ткани для медицинских приложений, а также являются ценным инструментом для выяснения поведения и механизмов клеток во время морфогенеза сетчатки.

Выводы

Трехмерные методологии культивирования, включая поставку ECM вместе с методами реагрегации и идентификацию индуктивных факторов, которые могут направлять hPSCs вдоль определенной линии, являются высокоэффективными средствами для повторения раннего развития in vitro с целью создания органоидов. Описанные здесь органоидные технологии, несомненно, могут быть ценным инструментом для исследования развития органов и морфогенеза тканей [13,41,49], для моделирования заболеваний [13,16,41], тестирования эффективности и токсичности лекарственных соединений [10] и надеюсь, когда-нибудь создадут ткани для аутотрансплантации [15,20,22,51].Более того, помимо подходов, проанализированных в этом обзоре, разработка «раковых органоидов» [53] создает значительные перспективы для персонализации и оптимизации существующих методов лечения. В будущем исследователи могут также разработать больше человеческих органоидов для щитовидной железы, легких, поджелудочной железы, сердца [54,55,56,57,58] и сенсорного эпителия внутреннего уха [59], используя уже применяемые технологии. успешно у мышей.

Хотя очевидно, что органоидные технологии обладают огромным потенциалом, все же существуют важные ограничения, которые необходимо преодолеть.В частности, технологии органоидов, разработанные до сих пор, еще не были систематически охарактеризованы с точки зрения того, насколько точно они могут воспроизводить развитие in vivo. Напр., В то время как органоиды сетчатки демонстрируют типичную ламинарную организацию, внешние сегменты не формируются, а фоторецепторы не созревают полностью, чтобы стать светочувствительными [48,49]. Сходным образом церебральные органоиды воспроизводят довольно ранние события в развитии мозга, но типичная слоистая структура зрелой корковой пластинки не может сформироваться полностью [41].

Проблема созревания является общей проблемой для органоидных технологий и может существенно повлиять на будущие исследования и терапевтический потенциал. Хотя органоиды печени выполняли специфические для печени функции in vivo, такие как выработка белка и специфический для человека метаболизм лекарств, человеческие гепатоциты не были полностью дифференцированы, о чем свидетельствует более низкая секреция альбумина и более низкая экспрессия гепатоцит-специфических ферментов CYP450, чем ранее сообщалось для первичных человеческих гепатоциты [60].

С другой стороны, трансплантированные кишечные органоиды человека продемонстрировали характеристики зрелого кишечника, такие как поглощение пептидов, но терапевтическое применение потребует дополнительных функций, таких как способность выполнять перистальтические движения, необходимые для перехода пищевого болюса по пищеварительному тракту [15 ].Сходным образом, хотя органоиды почек человека обладают незрелыми нефрон- [25] и UB-подобными [31] структурами, правильное формирование паттерна ткани посредством последовательных поколений ветвления UB все еще необходимо, и возникающие нефроны д. Связываться с единой дренирующей собирающей системой.

Наиболее важно то, что бессосудистая среда in vitro по-прежнему является серьезным препятствием для органоидов на пути созревания до состояния, напоминающего состояние взрослых органов. В связи с этим будущие исследования будут сосредоточены на разработке биореакторов, которые могут обеспечить лучший обмен питательными веществами [41] или совместное культивирование с эндотелиальными клетками [22].Наиболее многообещающим решением остается трансплантация этих тканей, как это было сделано с зачатками печени [22] и органоидами почек [25,28], которые стимулируют инвазию из сосудистой сети хозяина.

В будущем органоидные технологии, несомненно, предоставят методологическое окно, которое позволит нам глубже понять человеческое развитие и болезни, а также позволит персонализировать лечение.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Ракель Родригес Диез за помощь с иллюстрацией, Керстин Миерке за вычитку и редактирование и Мануэлу Пассера за техническую помощь.

Исследование авторов поддержано Associazione per la Ricerca sul Diabete — Italia и грантом ERC-2010-AdG-268632 RESET. Авторы благодарят Bellco Srl за продолжающуюся финансовую поддержку.

Заявление о раскрытии информации

C.X. является соучредителем и управляющим директором ООО «Биореново»; однако он не получил компенсации за эту роль и получил финансирование исследований от Bellco.

Список литературы

1. ван Бейнум Дж. Р., Руш М., Кастерманс К., ван дер Линден Э., Гриффиоен А. В.: Изоляция эндотелиальных клеток из свежих тканей.Нат Протокол 2008; 3: 1085-1091.
2. Сагринати К., Нетти Г.С., Маззинги Б., Лазцери Э, Лиотта Ф, Фросали Ф, Ронкони Э, Мейни К., Гаччи М., Скекко Р., Карини М., Джезуальдо Л., Францини Ф, Магги Е., Аннунциато Ф, Ласаньи Л., Серио М. , Romagnani S, Romagnani P: Выделение и характеристика мультипотентных клеток-предшественников из капсулы Боумена почек взрослого человека.J Am Soc Nephrol 2006; 17: 2443-2456.
3. Такахаши К., Яманака С. Индукция плюрипотентных стволовых клеток из культур эмбриональных и взрослых фибробластов мыши с помощью определенных факторов. Cell 2006; 126: 663-676.
4. Auerbach R, Grobstein C: Индуктивное взаимодействие эмбриональных тканей после диссоциации и реагрегации.Exp Cell Res 1958; 15: 384-397.
5. Москона А, Москона Х: Диссоциация и агрегация клеток из зачатков органов раннего куриного эмбриона. Дж. Анат 1952; 86: 287-301.
6. Льюис С.Л., Там П.П.: Окончательная энтодерма эмбриона мыши: формирование, судьба клеток и морфогенетическая функция.Дев Дин 2006; 235: 2315-2329.
7. Рубин Д.К .: Морфогенез кишечника. Курр Опин Гастроэнтерол 2007; 23: 111-114.
8. Sato T, Vries RG, Snippert HJ, van de Wetering M, Barker N, Stange DE, van Es JH, Abo A, Kujala P, Peters PJ, Clevers H: одиночные стволовые клетки Lgr5 создают структуры крипта-ворсинка in vitro без мезенхимальных клеток. ниша.Природа 2009; 459: 262-265.
9. Sato T, van Es JH, Snippert HJ, Stange DE, Vries RG, van den Born M, Barker N, Shroyer NF, van de Wetering M, Clevers H: клетки Панета составляют нишу для стволовых клеток Lgr5 в кишечных криптах. Природа 2011; 469: 415-418.
10. Dekkers JF, Wiegerinck CL, de Jonge HR, Bronsveld I, Janssens HM, de Winter-de Groot KM, Brandsma AM, de Jong NW, Bijvelds MJ, Scholte BJ, Nieuwenhuis EE, van den Brink S, Clevers H, van der Ent CK, Middendorp S, Beekman JM: функциональный анализ CFTR с использованием кишечных органоидов первичного муковисцидоза.Нат Мед 2013; 19: 939-945.
11. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, Van Es JH, Van den Brink S, Van Houdt WJ, Pronk A, Van Gorp J, Siersema PD, Clevers H: Долгосрочное распространение эпителиальных органоидов из толстой кишки человека, аденомы , аденокарцинома и эпителий Барретта. Гастроэнтерология 2011; 141: 1762-1772.
12. Yui S, Nakamura T, Sato T, Nemoto Y, Mizutani T, Zheng X, Ichinose S, Nagaishi T, Okamoto R, Tsuchiya K, Clevers H, Watanabe M: функциональное приживление эпителия толстой кишки, расширенное in vitro от одного взрослого Lgr5 ⁺ стволовая клетка. Нат Мед 2012; 18: 618-623.
13. Спенс Дж. Р., Мэйхью С. Н., Рэнкин С. А., Кухар М. Ф., Валланс Дж. Э., Толле К., Хоскинс Е. Е., Калиниченко В. В., Уэллс С. И., Зорн А. М., Шройер Н. Ф., Веллс Дж. М.: Направленная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в ткань кишечника in vitro.Природа 2011; 470: 105-109.
14. Wang J, Cortina G, Wu SV, Tran R, Cho JH, Tsai MJ, Bailey TJ, Jamrich M, Ament ME, Treem WR, Hill ID, Vargas JH, Gershman G, Farmer DG, Reyen L, Martin MG: мутантный нейрогенин -3 при врожденной диарее с нарушением всасывания. N Engl J Med 2006; 355: 270-280.
15. Watson CL, Mahe MM, Múnera J, Howell JC, Sundaram N, Poling HM, Schweitzer JI, Vallance JE, Mayhew CN, Sun Y, Grabowski G, Finkbeiner SR, Spence JR, Shroyer NF, Wells JM, Helmrath MA: An in vivo модель тонкого кишечника человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток. Нат Мед 2014; 20: 1310-1314.
16. McCracken KW, Catá EM, Crawford CM, Sinagoga KL, Schumacher M, Rockich BE, Tsai YH, Mayhew CN, Spence JR, Zavros Y, Wells JM: Моделирование человеческого развития и заболеваний в органоидах желудка, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Природа 2014; 516: 400-404.
17. Зарет К.С.: Регуляторные фазы раннего развития печени: парадигмы органогенеза.Нат Рев Генет 2002; 3: 499-512.
18. Чжао Р., Дункан С.А.: Эмбриональное развитие печени. Гепатология 2005; 41: 956-967.
19. Weiss P, Taylor AC: Восстановление полных органов из одноклеточных суспензий куриных эмбрионов на поздних стадиях дифференцировки.Proc Natl Acad Sci U S A 1960; 46: 1177-1185.
20. Huch M, Dorrell C, Boj SF, van Es JH, Li VS, van de Wetering M, Sato T, Hamer K, Sasaki N, Finegold MJ, Haft A, Vries RG, Grompe M, Clevers H: расширение сингла in vitro Lgr5 + стволовые клетки печени, индуцированные регенерацией, управляемой Wnt.Природа 2013; 494: 247-250.
21. Huch M, Gehart H, van Boxtel R, Hamer K, Blokzijl F, Verstegen MM, Ellis E, van Wenum M, Fuchs SA, de Ligt J, van de Wetering M, Sasaki N, Boers SJ, Kemperman H, de Jonge J , Ijzermans JN, Nieuwenhuis EE, Hoekstra R, Strom S, Vries RR, van der Laan LJ, Cuppen E, Clevers H: Долгосрочная культура геном-стабильных бипотентных стволовых клеток из печени взрослого человека.Cell 2015; 160: 299-312.
22. Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, Zhang RR, Ueno Y, Zheng YW, Koike N, Aoyama S, Adachi Y, Taniguchi H: васкуляризованная и функциональная печень человека из органа, полученного с помощью ИПСК. пересадка бутонов. Природа 2013; 499: 481-484.
23. Saxen L: Органогенез почек.Нью-Йорк, издательство Кембриджского университета, 1987.
24. Дресслер Г.Р .: Успехи в ранней спецификации, развитии и формировании паттерна почек. Разработка 2009; 136: 3863-3874.
25. Тагучи А., Каку Й., Омори Т., Шармин С., Огава М., Сасаки Х., Нишинакамура Р.: Новое определение происхождения метанефрических предшественников нефронов in vivo позволяет создавать сложные структуры почек из плюрипотентных стволовых клеток.Стволовая клетка клетки 2014; 14: 53-67.
26. Little MH, McMahon AP: Развитие почек млекопитающих: принципы, прогресс и прогнозы. Cold Spring Harb Perspect Biol 2012; pii: a008300.
27. Unbekandt M, Davies JA: Диссоциация эмбриональных почек с последующей реакгрегацией позволяет формировать почечные ткани.Kidney Int 2010; 77: 407-416.
28. Xinaris C, Benedetti V, Rizzo P, Abbate M, Corna D, Azzollini N, Conti S, Unbekandt M, Davies JA, Morigi M, Benigni A, Remuzzi G: Созревание in vivo функциональных почечных органоидов, образованных из суспензий эмбриональных клеток. J Am Soc Nephrol 2012; 23: 1857-1868.
29. Xinaris C, Benedetti V, Abbate M, Conti S, Rizzo P, Novelli R, Corna D, Cavallotti D, Morigi M, Benigni A, Remuzzi G: Создание фильтрующей структуры из суспензии эмбриональных клеток почек. J Am Soc Nephrol 2014; 25: 170A.
30. Бенедетти В., Ксинарис С., Томасони С., Риццо П., Новелли Р., Корна Д., Йоку Т., Мориджи М., Бенигни А., Ремуцци Г. Разработка трансплантируемой трехмерной почечной ткани из суспензии стволовых клеток околоплодных вод и метанефрических клеток мыши.J Am Soc Nephrol 2014; 25: 167A.
31. Xia Y, Nivet E, Sancho-Martinez I, Gallegos T, Suzuki K, Okamura D, Wu MZ, Dubova I, Esteban CR, Montserrat N, Campistol JM, Izpisua Belmonte JC: Направленная дифференцировка плюрипотентных клеток человека в предшественник почек мочеточника -подобные клетки.Nat Cell Biol 2013; 15: 1507-1515.
32. Takasato M, Er PX, Becroft M, Vanslambrouck JM, Stanley EG, Elefanty AG, Little MH: Направление дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в почечную линию приводит к образованию самоорганизующейся почки. Nat Cell Biol 2014; 16: 118-126.
33. Гилберт СФ: Биология развития, изд 6.Сандерленд, Массачусетс, Sinauer Associates, 2000.
34. Götz M, Huttner WB: клеточная биология нейрогенеза. Нат Рев Мол Cell Biol 2005; 6: 777-788.
35. Ishii K: Реконструкция диссоциированных клеток головного мозга цыплят в культуре, опосредованной вращением.Cytologia (Tokyo) 1966; 31: 89-98.
36. Ватанабе К., Камия Д., Нишияма А., Катаяма Т., Нодзаки С., Кавасаки Н., Ватанабе Ю., Мидзуэки К., Сасай Ю.: Направленная дифференцировка предшественников телэнцефала из эмбриональных стволовых клеток. Нат Neurosci 2005; 8: 288-296.
37. Eiraku M, Watanabe K, Matsuo-Takasaki M, Kawada M, Yonemura S, Matsumura M, Wataya T., Nishiyama A, Muguruma K, Sasai Y: Самоорганизованное формирование поляризованных корковых тканей из ESC и его активное манипулирование внешними сигналами.Cell Stem Cell 2008; 3: 519-532.
38. Кадосима Т., Сакагути Х., Накано Т., Соен М., Андо С., Эйраку М., Сасай Ю.: Самоорганизация осевой полярности, структуры вывернутого слоя и видоспецифической динамики предшественников в неокортексе, полученном из ES-клеток человека. Proc Natl Acad Sci U S A 2013; 110: 20284-20289.
39. Данджо Т., Эйраку М., Мугурума К., Ватанабе К., Кавада М., Янагава Ю., Рубенштейн Дж. Л., Сасай Ю.: Субрегиональная спецификация вентральных телэнцефальных тканей, полученных из эмбриональных стволовых клеток, с помощью синхронизированной и комбинированной обработки внешними сигналами. Журнал Neurosci 2011; 31: 1919-1933.
40. Суга Х, Кадосима Т, Минагучи М, Огуши М, Соен М, Накано Т, Таката Н, Ватая Т, Мугурума К., Миёси Х, Йонемура С., Оисо Й, Сасай Й: Самообразование функционального аденогипофиза в трехмерной культуре .Природа 2011; 480: 57-62.
41. Lancaster MA, Renner M, Martin CA, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA: Церебральные органоиды моделируют развитие человеческого мозга и микроцефалию. Природа 2013; 501: 373-379.
42. Fuhrmann S: Морфогенез глаза и формирование паттерна зрительного пузыря.Curr Top Dev Biol 2010; 93: 61-84.
43. Бок Д: Пигментный эпителий сетчатки: универсальный партнер в зрении. J Cell Sci Suppl 1993; 17: 189-195.
44. Brady RC, Hilfer SR: Формирование оптического стакана: процесс, регулируемый кальцием.Proc Natl Acad Sci U S. A 1982; 79: 5587-5591.
45. Layer PG, Robitzki A, Rothermel A, Willbold E: Из слоев и сфер: реаггрегатный подход в тканевой инженерии. Trends Neurosci 2002; 25: 131-134.
46. Стефанелли А., Заккей А.М., Чекерини В. Восстановление сетчатки in vitro после дезагрегации эмбриональных куриных глаз.Acta Embryol Morphol Exper 1961; 4: 47-55.
47. Rothermel A, Willbold E, Degrip WJ, Layer PG: Пигментированный эпителий вызывает полное восстановление сетчатки из диспергированных эмбриональных сетчаток цыплят в реагрегационной культуре. Proc Biol Sci 1997; 264: 1293-1302.
48. Eiraku M, Takata N, Ishibashi H, Kawada M, Sakakura E, Okuda S, Sekiguchi K, Adachi T., Sasai Y: самоорганизующийся морфогенез глазного бокала в трехмерной культуре.Природа 2011; 472: 51-56.
49. Накано Т., Андо С., Таката Н., Кавада М., Мугурума К., Секигути К., Сайто К., Йонемура С., Эйраку М., Сасай Ю. Стволовая клетка клетки 2012; 10: 771-785.
50. Sasai Y: Регенеративная медицина следующего поколения: органогенез из стволовых клеток в 3D-культуре.Cell Stem Cell 2013; 12: 520-530.
51. Assawachananont J, Mandai M, Okamoto S, Yamada C, Eiraku M, Yonemura S, Sasai Y, Takahashi M: Трансплантация трехмерных листов сетчатки, полученных из эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, мышам с дегенеративной дегенерацией сетчатки. Отчеты о стволовых клетках 2014; 2: 662-674.
52. Zhu Y, Carido M, Meinhardt A, Kurth T., Karl MO, Ader M, Tanaka EM: Трехмерная нейроэпителиальная культура из человеческих эмбриональных стволовых клеток и ее использование для количественного преобразования в пигментный эпителий сетчатки. PLoS One 2013; 8: e54552.
53. Гао Д., Вела I, Сбонер А., Яквинта П.Дж., Картхаус В.Р., Гопалан А., Даулинг С., Ванджала Д.Н., Ундвалл Е.А., Арора В.К., Вонгвипат Дж., Коссай М., Рамазаноглу С., Барбоза Л.П., Ди В, Цао З., Чжан К.Ф. , Сирота I, Ран Л., Макдональд Т.Ю., Белтран Х., Москера Дж. М., Туиджер К. А., Скардино П. Т., Лаудон В. П., Кертис К. Р., Раткопф Д. Е., Моррис М. Дж., Данила Д. К., Словин С. Ф., Соломон С. Б., Истхэм Дж. А., Чи П, Карвер Б., Рубин М.А., Шер Х.И., Клеверс Х., Сойерс К.Л., Чен Й .: Культуры органоидов, полученные от пациентов с распространенным раком простаты.Cell 2014; 159: 176-187.
54. Антоника Ф, Каспршик Д.Ф., Опиц Р., Яковино М., Ляо XH, Думитреску А.М., Рефетов С., Переманс К., Манто М., Киба М., Костаглиола С. Создание функциональной щитовидной железы из эмбриональных стволовых клеток. Природа 2012; 491: 66-71.
55. Lee JH, Bhang DH, Beede A, Huang TL, Stripp BR, Bloch KD, Wagers AJ, Tseng YH, Ryeom S, Kim CF: дифференцировка стволовых клеток легких у мышей направляется эндотелиальными клетками через ось BMP4-NFATc1-тромбоспондин-1 .Cell 2014; 156: 440-455.
56. Greggio C, De Franceschi F, Figueiredo-Larsen M, Gobaa S, Ranga A, Semb H, Lutolf M, Grapin-Botton A: Искусственные трехмерные ниши разрушают развитие поджелудочной железы in vitro. Развитие 2013; 140: 4452-4462.
57. Lee EJ, Kim do E, Azeloglu EU, Costa KD: Спроектированные камеры органоидов сердца: к функциональной биологической модели желудочка.Tissue Eng Часть A 2008; 14: 215-225.
58. Мондринос М.Дж., Джонс П.Л., Финк С.М., Лелкес П.И.: Разработка de novo сборки легочных органоидов плода. Tissue Eng Часть A 2014; 20: 2892-2907.
59. Келер К.Р., Микош А.М., Молош А.И., Патель Д., Хашино Э.: Создание сенсорного эпителия внутреннего уха из плюрипотентных стволовых клеток в трехмерной культуре.Природа 2013; 500: 217-221.
60. Адзума Х., Полк Н., Ранаде А., Доррелл С., Аль-Далими М., Эллис Э., Стром С., Кей М.А., Файнголд М., Громпе М.: Устойчивое распространение гепатоцитов человека в Fah — / — / Rag2 — / — / Il2rg- /- мышей. Nat Biotechnol 2007; 25: 903-910.

Автор Контакты

Доктор.Christodoulos Xinaris

Отделение молекулярной медицины, лаборатория клеточной биологии и регенеративной медицины, IRCCS — Istituto di Ricerche Farmacologiche ‘Mario Negri’, Centro Anna Maria Astori, Научно-технологический парк Kilometro Rosso

Via Stezzano, 87, IT-24126 Bergamo (Италия), электронная почта [email protected]

Подробности статьи / публикации

Предварительный просмотр первой страницы

Получено: 26 марта 2015 г.
Принято: 25 мая 2015 г.
Опубликовано в Интернете: 25 июня 2015 г.
Дата выпуска: июль 2015 г.

Количество страниц для печати: 9
Количество рисунков: 1
Количество столов: 0

ISSN: 1660-8151 (печатный)
eISSN: 2235-3186 (онлайн)

Для дополнительной информации: https: // www.karger.com/NEF

Авторские права / Дозировка препарата / Заявление об ограничении ответственности

Авторские права: Все права защищены. Никакая часть данной публикации не может быть переведена на другие языки, воспроизведена или использована в любой форме и любыми средствами, электронными или механическими, включая фотокопирование, запись, микрокопирование, или какой-либо системой хранения и поиска информации, без письменного разрешения издателя. .
Дозировка лекарств: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор и дозировка лекарств, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Тем не менее, ввиду продолжающихся исследований, изменений в правительственных постановлениях и постоянного потока информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на них, читателю рекомендуется проверять листок-вкладыш для каждого препарата на предмет любых изменений показаний и дозировки, а также дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендованным агентом является новый и / или редко применяемый препарат.
Отказ от ответственности: утверждения, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и соавторам, а не издателям и редакторам.Появление в публикации рекламы и / или ссылок на продукты не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор (-ы) не несут ответственности за любой ущерб, причиненный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в контенте или рекламе.

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Использование органоидов, полученных из стволовых клеток, в моделировании заболеваний: обновление

4.1.2. Модели органоидов нормальных и больных тканей человека на основе ASC

Органоидов: новое окно в болезни, разработки и открытия

Ученые нашли способы культивирования органоспецифичных тканей из стволовых клеток, которые могут изменить методы изучения и лечения заболеваний.

Хавьер Барбузано

Представьте себе возможность создания индивидуальных, сложных коллекций клеток, которые имеют сходство с собственными тканями пациента.Эта технология — способность выращивать органоиды — становится реальностью и каждый день находит новое применение, отчасти благодаря работе ученых из Гарвардского института стволовых клеток.

Органоиды — это крошечные самоорганизующиеся трехмерные тканевые культуры, полученные из стволовых клеток. Такие культуры могут быть созданы для воспроизведения большей части сложности органа или для выражения отдельных его аспектов, таких как производство только определенных типов клеток.

Органоиды растут из стволовых клеток — клеток, которые могут бесконечно делиться и производить различные типы клеток как часть своего потомства.Ученые узнали, как создать правильную среду для стволовых клеток, чтобы они могли следовать своим собственным генетическим инструкциям для самоорганизации, образуя крошечные структуры, напоминающие миниатюрные органы, состоящие из многих типов клеток. Органоиды могут иметь размер от менее ширины волоса до пяти миллиметров.

Потенциально существует столько же типов органоидов, сколько различных тканей и органов в теле. На сегодняшний день исследователям удалось получить органоиды, которые напоминают мозг, почки, легкие, кишечник, желудок и печень, и многие другие вещества находятся в процессе разработки.

Такой способ культивирования тканей даст ученым подробное представление о том, как формируются и растут органы, предоставит им новое понимание человеческого развития и болезней, а также даст им возможность увидеть, как лекарства взаимодействуют с этими «мини-органами», потенциально революционизируя область открытия лекарств и открытия новых подходов к персонализированной медицине.

Некоторые из этих применений описаны ниже в работе четырех лабораторий HSCI.

Понимание самих себя и моделирование болезни

Большая часть того, что мы знаем об эмбриональном развитии, мы узнали путем экстраполяции на биологию человека того, что наблюдается на мышах и других моделях животных.Теперь, благодаря органоидам, у исследователей есть возможность культивировать крошечные версии каждой ткани с использованием человеческих клеток.

В случае человеческого мозга эта технология открывает окно для наблюдения за некоторыми из самых неуловимых аспектов нашей собственной биологии. Это становится особенно важным при изучении сложных, присущих человеку характеристик или болезней. «Некоторые из наиболее известных нервно-психических заболеваний или заболеваний нервной системы нашего времени, такие как шизофрения или расстройство аутистического спектра, являются исключительно человеческими заболеваниями, которые влияют на весь геном человека», — объясняет исследователь HSCI Паола Арлотта, доктор философии.

Лаборатория Арлотты разработала протоколы, которые позволяют органоидам расти в течение длительных периодов времени, достигая большей сложности и зрелости, чем раньше. Эти органоиды содержат тысячи клеток и несколько типов клеток мозга, которые взаимодействуют друг с другом сложным образом, что делает их отличными моделями для изучения того, как нейропсихиатрические патологии или патологии нервного развития влияют на то, как клетки мозга разговаривают друг с другом.

Исследователи уже смогли использовать органоиды, полученные от пациентов с аутизмом, чтобы показать нарушения в регуляции генов, участвующих в пролиферации клеток.Другие исследователи использовали органоиды, чтобы наблюдать, как вирус Зика связан с микроцефалией на раннем этапе развития эмбриона, когда он препятствует нормальному развитию мозга, вызывая преждевременную дифференцировку клеток, продуцирующих нейроны. А другие смотрят на то, как эти органоиды, как «нормальные», так и «больные», реагируют на определенные раздражители.

Органоиды головного мозга также позволят понять, как мозг формируется на раннем этапе развития, что изучается более века и до сих пор вызывает недоумение у ученых.«Настоящая цель прямо сейчас — использовать органоиды в качестве моделей болезней, но по ходу дела я предсказываю, что мы узнаем много нового о том, как формируется мозг», — сказал Арлотта.

Изучение болезней стволовых клеток и персонализированной медицины

Стволовые клетки имеют большие перспективы в качестве терапевтических инструментов из-за их неограниченной способности делить и восстанавливать ткани. Но исследователи также понимают, что многие заболевания могут быть вызваны аномалиями самих стволовых клеток или того, как другие клетки общаются с ними.

Такие исследователи, как доктор философии Карла Ким, используют органоиды, чтобы определить роль стволовых клеток в регенерации, поддержании и функционировании тканей, а также понять, как эти клетки взаимодействуют друг с другом.

Ким и ее группа были первыми учеными, которые вырастили органоиды легких, имитирующие две отдельные части легкого: дыхательные пути и альвеолярные мешочки, где происходит газообмен. Они сделали это с помощью специальной установки для культивирования, которая позволяла клеткам контактировать как с воздухом, так и с жидкостью, имитируя среду легких.Их культура также включала клетки-помощники, полученные из кровеносных сосудов, для стимуляции роста стволовых клеток.

«Мы хотим знать, как стволовая клетка узнает, какой тип специализированных клеток она должна производить», — сказал Ким. Органоиды помогают ответить на этот вопрос. «Мы спрашиваем, какие факторы и соединения должны присутствовать, чтобы сообщить стволовым клеткам, что им нужно для роста».

Ким использует аналогичный подход, чтобы изучить обратный вопрос: что происходит при заболеваниях, когда стволовые клетки либо не справляются со своей работой, либо создают дефектные клетки?

«Многие заболевания легких кажутся нам неспособностью стволовых клеток восстанавливать повреждения, — сказал Ким.«Долгое время считалось, что такие заболевания, как эмфизема, могут быть вызваны дефектами стволовых клеток, но проверить эту идею было невозможно. Теперь мы можем создавать органоиды из больных клеток и проводить эксперименты, чтобы выяснить, являются ли стволовые клетки или вспомогательные клетки, которые с ними общаются, причиной заболевания легких. Если мы сможем понять, что идет не так на уровне стволовых клеток, может появиться совершенно новый тип клеток, который может стать мишенью для лекарств ».

Органоиды также можно использовать для непосредственного скрининга лекарств, которые могут способствовать образованию особого типа клеток.Это может помочь найти лечение таких заболеваний, как кистозный фиброз, при котором реснитчатые клетки, которые обычно удаляют слизь из легких, не работают должным образом.

«Мы можем создавать органоиды из реснитчатых клеток, полученных от пациентов, а затем тестировать их на лекарства, которые могут улучшить работу этих реснитчатых клеток», — сказал Ким. «Мы можем сделать органоиды из ИПСК, полученных из крови пациента, и испытать эти специфичные для пациента клетки легких, даже не взяв биопсию. Возможности органоидов безграничны.Это очень интересное время для изучения легких ».

Органоиды как терапевтические инструменты

Несколько команд в Гарварде и других странах пытаются придумать способы трансформации и трансплантации клеток или даже тканей, которые могли бы служить лекарством или лечением определенных заболеваний.

Так обстоит дело с ученым HSCI Дэвидом Бро, доктором медицинских наук, который вместе с другим исследователем HSCI, доктором философии Цяо Чжоу, добился революционных успехов в превращении кишечных клеток в бета-клетки, продуцирующие инсулин.Их подход может привести к лечению диабета, большой проблемы общественного здравоохранения.

Диабет — это нарушение обмена веществ, связанное с инсулином, гормоном, вырабатываемым поджелудочной железой, который позволяет нашим клеткам поглощать глюкозу из кровотока. Существует два типа диабета: тип 1, при котором иммунная система атакует бета-клетки, производящие инсулин; и тип 2, при котором клетки становятся устойчивыми к инсулину, поэтому снабжение организма недостаточным для контроля уровня глюкозы в крови.

Бро и Чжоу разработали метод трансформации эпителиальных клеток кишечника в бета-клетки, продуцирующие инсулин, и протестировали этот метод на органоидах кишечника.Эта трансформация возможна, потому что эти клетки происходят из одного и того же региона во время развития и имеют много общих характеристик.

Они также смогли показать, что могут имплантировать матрицу, наполненную этими модифицированными инсулин-продуцирующими клетками, диабетической мыши, которая затем успешно регулирует уровень сахара в крови.

Бреолт идет еще дальше и намекает на возможность получения органоидов из полученных от пациентов iPS-клеток, которые могут быть преобразованы в продуцирующие инсулин бета-подобные клетки.

«Способность создавать специфичные для пациента клетки-предшественники, которые можно было бы преобразовать, возможно, в один или два этапа в бета-клетки, может представлять собой значительный прогресс в лечении диабета», — сказал Бро.

Революция в открытии лекарств

Не на все вопросы исследования нужно ответить, используя сложные тканеподобные культуры, состоящие из разнообразных клеток.

Некоторым ученым нужны только определенные типы клеток, которые похожи друг на друга.Одним из примеров является процесс открытия лекарств, когда необходимо протестировать множество веществ на клетках, чтобы увидеть, как они работают.

На сегодняшний день для проведения таких тестов фармацевтическая промышленность полагалась на модели животных и линии клеток человека, которые мало похожи на нормальную или больную ткань. По словам члена Исполнительного комитета ИСКЧ Ли Рубина, доктора философии, это может быть одной из причин большого количества неудач в клинических испытаниях, а также высокой стоимости открытия лекарств — в среднем 2 миллиарда долларов на каждое новое лекарство, поступающее в аптеку.

Рубин считает, что использование человеческих клеток, а не животных моделей может ускорить и повысить эффективность процесса открытия и разработки лекарств.

Лаборатория Рубина работает над сфероидами мозга, плотно заселенными клубками нейронов, которые последовательно производят один или несколько типов клеток в больших количествах. Этот метод производит больше клеток и с лучшим качеством, чем традиционные плоские культуры на чашке. Это похоже на массовое производство и экономичный подход к культивированию клеток.

Помимо развития из эмбриональных клеток, сфероиды также могут быть получены из собственных клеток пациента и депонированы в биобанк специфичных для пациента клеток. Комбинируя такие биобанки с клиническими и геномными данными, можно было бы разработать и протестировать индивидуальные планы лечения для каждого пациента. Этот подход также может позволить идентифицировать группы пациентов, которые могут лучше реагировать на одни виды лечения, чем на другие.

Возможность получения неограниченного количества тканей от каждого пациента также будет чрезвычайно полезна для изучения и лечения редких заболеваний, когда количество пациентов, на которых можно проводить исследования и тестировать лечение, ограничено.Это позволит исследователям проводить свои исследования в более широком масштабе, ускоряя прогресс в этих часто недостаточно изученных заболеваниях.