Схема развития половых клеток: Образование половых клеток — урок. Биология, Общие биологические закономерности (9–11 класс). - Управленческое образование

Содержание

Образование половых клеток — урок. Биология, Общие биологические закономерности (9–11 класс).

Гаметогенез — процесс образования и развития половых клеток.

У многоклеточных водорослей, многих грибов и споровых растений гаметы образуются в специальных органах полового размножения: женские — в архегониях, мужские — в антеридиях.

У большинства животных образование гамет происходит в половых железах: сперматозоиды формируются в семенниках, а яйцеклетки — в яичниках.

Существуют раздельнополые и обоеполые виды. Раздельнополые организмы продуцируют только один вид гамет, обоеполые — оба вида.

Гермафродиты — обоеполые организмы, способные образовывать и мужские, и женские половые клетки.

Гермафродитизм возник как приспособление к сидячему, малоподвижному или паразитическому образу жизни. Он встречается у кишечнополостных, плоских и кольчатых червей, моллюсков и у большинства растений.

Преимуществом гермафродитизма является возможность самооплодотворения при наличии только одной особи. Но у большинства гермафродитных организмов происходит перекрёстное оплодотворение между разными особями.

Гаметогенез у высших животных

Сперматогенез происходит в семенниках. В них имеются семенные канальцы, в которых образуются и развиваются сперматозоиды.

В процессе образования сперматозоидов выделяют четыре периода (стадии): размножение, рост, созревание и формирование.

В период размножения первичные половые клетки (сперматогонии) многократно делятся митозом. При этом сохраняется диплоидный набор хромосом \(2n2c\).

Затем наступает период роста: образовавшиеся клетки несколько увеличиваются в размерах, в них удваиваются молекулы ДНК. Сперматогонии превращаются в сперматоциты первого порядка с хромосомным набором \(2n4c\).

В период созревания происходят два деления мейоза. После первого деления из одного сперматоцита первого порядка образуются два сперматоцита второго порядка (\(1n2c\)), а после второго — четыре сперматида (\(1n1c\)).

В период формирования сперматиды преобразуются в сперматозоиды.

Рис. \(1\). Сперматогенез

Обрати внимание!

При сперматогенезе из одной первичной половой клетки образуются четыре сперматозоида.

Оогенез (овогенез) происходит в яичниках и в отличие от сперматогенеза начинается ещё до рождения женского организма.

В процессе образования яйцеклеток выделяют три периода (стадии): размножение, рост и созревание.

В период размножения первичные половые клетки (оогонии) делятся митозом. При этом диплоидный набор хромосом \(2n2c\) сохраняется, но клеток образуется значительно меньше, чем при сперматогенезе. Период размножения заканчивается до рождения женской особи. К этому времени образуется около \(30\) тысяч первичных половых клеток.

У половозрелой женской особи периодически начинается дальнейшее развитие отдельных оогоний. В период роста объём клетки значительно увеличивается за счёт синтеза и накопления веществ. Происходит удвоение ДНК. Образуется ооцит первого порядка (\(2n4c\)).

В период созревания происходит два деления мейоза. После первого деления из одного ооцита первого порядка образуются одна крупная гаплоидная клетка (ооцит второго порядка (\(1n2c\))) и одна маленькая (полярное, или направительное, тельце).

Образовавшийся ооцит выходит из яичника в брюшную полость и попадает в маточную трубу — происходит овуляция.

В маточной трубе клетка совершает второе мейотическое деление, в результате которого ооцит образует яйцеклетку (\(1n1c\)) и ещё одно полярное тельце. Первое полярное тельце, как правило, тоже делится.

Рис. \(2\). Оогенез

Обрати внимание!

При оогенезе из одной первичной половой клетки образуются одна яйцеклетка и три полярные тельца, которые вскоре разрушаются.

Источники:

Рис. 1. Сперматогенез.

Рис. 2. Оогенез.

Развитие половых клеток. Двойное оплодотворение

Гаметогенез – созревание гамет в половых железах. Специализированные диплоидные соматические клетки, из которых образуются гаметы, называются сперматогониями и овогониями. Гаметогенез включает несколько стадий.

1. Стадия размножения – ряд последовательных митотических делений клеток, их количество существенно возрастает.

2. Стадия роста – увеличение размеров клетки и превращение в сперматоциты и овоциты 1 порядка, накопление питательных веществ и энергии для деления, редупликация ДНК.

3. Стадия созревания – два последовательных деления, редукционное и эквационное, которые вместе составляют мейоз. После первого деления – сперматоциты и овоциты 2 порядка, после второго – сперматиды, зрелая яйцеклетка и редукционные (полярные) тельца.

4. Стадия формирования (только у мужских гамет) – изменения в строении сперматид (ядро уплотняется, появляется жгутик, у основания концентрируются митохондрии, перераспределение цитоплазмы), образуется сперматозоид.

Сперматогенез – образование мужских половых клеток у животных и человека. Сперматогенез начинается с того, что незрелая половая клетка увеличивается в размерах и приступает к первому делению мейоза. Из исходной образуются две клетки, которые претерпевают второе деление мейоза. В результате двух мейотических делений из каждой незрелой мужской половой клетки образуются четыре зрелые клетки с гаплоидным набором хромосом (n). Превращение этих клеток в сперматозоиды связано со сложными процессами роста, но не сопровождается клеточным делением.

Овогенез – образование женских половых гамет. Как при первом, так и при втором делениях мейоза в результате неравномерного распределения цитоплазмы только в одной клетке оказывается большой запас питательных веществ, необходимых для развития будущего зародыша. Следовательно, образуется только одна зрелая яйцеклетка с гаплоидным набором хромосом (n) и три маленькие клеточки (направительные тельца), которые впоследствии погибают. При овогенезе наряду с мейозом происходит так называемое созревание яйцеклетки, во время которого значительно увеличивается ее объем. Различие сперматогенеза и овогенеза способствует образованию во много раз большего числа сперматозоидов по сравнению с яйцеклетками. Это необходимо для обеспечения оплодотворения наибольшего числа яйцеклеток и, следовательно, для сохранения вида.

Процесс оплодотворения состоит из нескольких этапов: проникновения сперматозоида в яйцо, слияния гаплоидных ядер обеих гамет с образованием диплоидной зиготы, активации ее дробления и дальнейшего развития. У некоторых животных в яйцеклетку проникают два или несколько сперматозоидов, но в оплодотворении принимает участие лишь один, остальные погибают. В результате образуется зигота, содержащая уже двойной, диплоидный, набор хромосом, с обновленным генетическим материалом. В процессе оплодотворения сперматозоид доставляет в яйцеклетку центриоль, а яйцеклетка для развития будущего организма предоставляет материалы ядра и цитоплазмы.

строение, образование, деление и хромосомы

Время чтения 4 мин.Просмотры 2.8k.Обновлено 2020-03-14

Организмы, которые размножаются половым путем, производят половые клетки, также называемые гаметами. Эти клетки значительно отличаются у мужчин и женщин. У мужчин половые клетки или сперматозоиды имеют хвостоподобные выросты (жгутики) и являются относительно подвижными. Женские половые клетки, называемые яйцеклетками, не подвижны и намного больше относительно мужских гамет. Когда эти клетки сливаются в процессе, называемом оплодотворением, результирующая клетка (зигота) содержит смесь унаследованных генов от отца и матери. Половые клетки человека производятся органами репродуктивной системы – гонадами. Гонады продуцируют половые гормоны, необходимые для роста и развития первичных и вторичных репродуктивных органов и структур.

Строение половых клеток человека

Мужские и женские половые клетки сильно отличаются друг от друга по размеру и форме. Мужские сперматозоиды напоминают длинные, подвижные снаряды. Это небольшие клетки, которые состоят из головки, средней и хвостовой частей. Головка содержит колпачковое покрытие, называемое акросомой. Акросома включает ферменты, которые помогают клетке спермы проникать в наружную оболочку яйцеклетки. Ядро расположено в головке сперматозоида. ДНК в ядре плотно упаковано и клетка не содержит много цитоплазмы. Средняя часть включает несколько митохондрий, обеспечивающих энергию для движения клетки. Хвостовая часть состоит из длинного выроста, называемого жгутиком, который помогает в клеточной локомоции.

Женские яйцеклетки являются одними из самых крупных клеток в организме и имеют округлую форму. Они вырабатываются в женских яичниках и состоят из ядра, большой цитоплазматической области, зоны пеллюциды (zona pellucida) и лучистого венца. Zona pellucida – это мембранное покрытие, которое окружает плазматическую мембрану яйцеклетки. Она связывает клетки спермы и помогает в оплодотворении. Лучистый венец является внешним защитным слоем фолликулярных клеток, окружающий zona pellucida.

Образование половых клеток

Половые клетки человека продуцируются посредством двухэтапного процесса деления клеток, называемого мейозом. Через серию последовательных событий, реплицированный генетический материал в родительской клетке распределяется между четырьмя дочерними клетками. Поскольку эти клетки имеют половину числа хромосом от родительской клетки, они являются гаплоидными клетками. Половые клетки человека содержат один набор из 23 хромосом.

Существуют два этапа мейоза: мейоз I и мейоз II. До мейоза хромосомы реплицируются и существуют в виде сестринских хроматид. В конце мейоза I образуется две дочерние клетки. Сестринские хроматиды каждой хромосомы в дочерних клетках все еще связаны центромерой. В конце мейоза II образуются сестринские хроматиды и четыре дочерние клетки. Каждая клетка содержит половину хромосом от родительской клетки.

Мейоз подобен процессу деления неполовых клеток, известному как митоз. Митоз продуцирует две дочерние клетки, которые генетически идентичны и содержат такое же количество хромосом, как и родительская клетка. Эти клетки являются диплоидными, потому что включают два набора хромосом. Человеческие диплоидные клетки включают 23 пары или 46 хромосом. Когда половые клетки объединяются во время оплодотворения, гаплоидные клетки становятся диплоидной клеткой.

Производство сперматозоидов известно как сперматогенез. Этот процесс происходит непрерывно внутри мужских яичек. Сотни миллионов сперматозоидов должны быть выпущены, чтобы произошло оплодотворение. Подавляющее большинство сперматозоидов не доходят до яйцеклетки. При оогенезе или развитии яйцеклеток, дочерние клетки делятся неравномерно в мейозе. Такой асимметричный цитокинез приводит к образованию одной большой яйцеклетки (ооцита) и меньших клеток, называемых полярными телами, которые деградируют и не оплодотворяются. После мейоза I, яйцеклетка называется вторичным ооцитом. Вторичный ооцит завершит вторую стадию мейоза, если начнется процесс оплодотворения. Как только завершится мейоз II, клетка становится яйцеклеткой и может сливаться с клеткой спермы. Когда оплодотворение завершено, объединенная сперма и яйцеклетка становятся зиготой.

Половые хромосомы

Мужские сперматозоиды у человека и других млекопитающих являются гетерогаметическими и содержат один из двух типов половых хромосом: Х или Y. Однако женские яйцеклетки содержат только X-хромосому и поэтому гомогаметичны. Сперматозоид определяет пол индивидуума. Если клетка спермы, содержащая Х-хромосому, оплодотворяет яйцеклетку, результирующая зигота будет XX или женский пол. Если клетка спермы содержит Y-хромосому, тогда результирующая зигота будет XY или мужской пол.

Гугломаг

Спрашивай! Не стесняйся!

Задать вопрос

Мне нравитсяНе нравится

Не все нашли? Используйте поиск по сайту ↓

Сравнение развития половых клеток у растений и животных.

Практическая работа (профиль 10 класс)

Тема: Сравнение развития половых клеток у растений и животных.

Цель: Рассмотреть развитие половых клеток у растений и животных и процессы оплодотворения.

Оборудование: Плакаты, таблицы

Ход работы:

1. Изучить теоретический материал по теме

2. Заполнить таблицу

3. Сделать вывод

Краткие теоретические сведения

Гаметогенез — это процесс образования зрелых половых клеток.

I Развитие половых клеток

у растений.

Образованием мужских половых клеток — микрогаметогенезом (от греч. микрос — маленький)

2.Развитие женских половых клеток у растений называется мегагаметогенезом (от греч. мегас — большой).

II Развитие половых клеток у животных.

У животных различают два процесса образования половых клеток —

1.Сперматогенез — это процесс образования зрелых мужских половых клеток — сперматозоидов.

2.Овогенез — это процесс образования зрелых женских половых клеток — яйцеклеток.

Результатом сперматогенеза является образование сперматозоидов.

Сперматозоиды — очень мелкие подвижные мужские половые клетки, имеющие головку, шейку и хвостик (рис. 2.58).

В головке, кроме ядра (3), находится акросома (4) — видоизмененный комплекс Гольджи, обеспечивающий растворение оболочек яйцеклетки в процессе оплодотворения. В

шейке находятся центриоли клеточного центра (2), а основу хвостика образуют микротрубочки (1), непосредственно обеспечивающие движение сперматозоида. В нем также расположены митохондрии, обеспечивающие сперматозоид энергией АТФ для движения.

Результатом овогенеза является образование яйцеклетки. Яйцеклетка — крупная женская половая клетка, которая несет не только гаплоидный набор хромосом, но и значительный запас питательных веществ для последующего развития зародыша (рис. 2.59).

Схема гаметогенеза

Оплодотворение у растений.

Рассмотрим на примере цветковых растений.

Этот процесс получил название двойного оплодотворения и был открыт великим русским ботаником, академиком Сергеем Гавриловичем Навашиным в 1898 году.

Оплодотворение у животных.

Типы оплодотворения:

Внешнее (низшие)
Внутреннее (высшие)

Процесс оплодотворения у животных можно разделить на следующие фазы:

а) Фаза сближения. В основе этой фазы лежит выделение половыми клетками специальных веществ. Одни из этих веществ активизируют движение сперматозоидов, другие – наоборот способствует их склеиванию, а также растворению оболочки яйцеклетки, что в целом сказывается на регулировании проникновения сперматозоида в яйцеклетку.

б) Фаза активации. Эта фаза начинается с того, что сперматозоид либо прикрепляется к любой точке поверхности яйца, либо проникает в нее.

в) Фаза проникновения в яйцо одного или нескольких сперматозоидов (полиспермия). Проникший сперматозоид «готовится» к слиянию с женским ядром, а затем сливается с ним.

Практическая работа (профиль 10 класс)

Тема: Сравнение развития половых клеток у растений и животных.

Цель: Рассмотреть развитие половых клеток у растений и животных и процессы оплодотворения.

Оборудование: Плакаты, таблицы

Ход работы:

1. Изучить теоретический материал по теме

2. Заполнить таблицу

3. Сделать вывод

Сравнение гаметогенеза у растений и животных

1. Где протекает гаметогенез?

2. Из каких стадий состоит?

3. В результате каких процессов образуются гаметы?

4. Какой набор хромосом имеют гаметы?

5. Как называются женские гаметы? мужские?

6. Особенности строения мужских гамет.

7. Особенности строения женских гамет

8. Сколько полноценных женских гамет образуется?

9. Сколько мужских гамет участвует затем в оплодотворении?

Сделать вывод о значении гаметогенеза для организмов:

Развитие половых клеток. Мейоз | План-конспект урока биологии (10 класс) по теме:

Урок биологии по теме

«Развитие половых клеток. Мейоз.»

Попова Елена Игоревна,

учитель химии и биологии высшей категории.

Цель:

— познакомить с процессом развития половых клеток

Задачи.

Обучающие:

-изучить этапы гаметогенеза

-изучить различия в сперматогенезе и оогенезе

-изучить этапы мейоза

Развивающие:

— показать в сравнении этапы сперматогенеза и оогенеза

— подвести к пониманию биологического значения полового размножения для эволюции

Воспитывающие:

— воспитание здорового образа жизни и формирование ответственности перед своими будущими детьми за их здоровье на основе знаний о своих физиологических особенностях

Время проведения: 16 декабря 2008г., 5-й урок, кабинет №12 (химии и биологии).

Оборудование: таблицы «Митоз», «Мейоз», «Гаметогенез», магнитная доска, элементы динамической модели «Редупликация ДНК», карточки с тестовыми заданиями

Использованы учебные пособия:

Каменский А.А., Криксунов Е.А., Пасечник В.В. Биология. Введение в общую биологию и экологию: Учеб.для 9 кл. общеобразоват. Учеб. заведений – 3-е изд., стереотип. – М.: Дрофа, 2002.

Пасечник В.В. Биология. Введение в общую биологию: Рабочая тетерадь. 9 класс. – М.: Дрофа, 2003.

Богданова Т.Л., Солодова Е.А. Биология: справочник для старшеклассников и поступающих в вузы – М.: АСТ-ПРЕСС ШКОЛА, 2008.

Открытая биология. Электронное учебное издание – М.: ООО «Физикон», ООО «Дрофа», 2005г.

Энциклопедия для детей. Том 18. Человек. Ч.1. Происхождение и природа человека. Как работает тело. Искусство быть здоровым / Глав. Ред. В.А. Володин. – М.: Аванта+, 2001.

Ход урока (основные этапы)

№пп	Этапы	Ключевые моменты	Используемые методы работы	Компоненты здоровьесбережения
1	Организационный	1. Взаимное приветствие 2. Проверка готовности к уроку.	— визуальный контроль	-оценка эмоционального состояния учащихся (обзорно каждого и класса вцелом)
2	Подготовка к восприятию новой темы	1.Проверка усвоения темы «Размножение. Митоз» 2.Промежуточная оценка работы учащихся	— устный опрос (определение терминов, объяснение по схеме, логические цепочки) — активные формы (работа в парах по составлению и объяснению динамической модели «Редупликация ДНК»)	-«плавное вхождение в тему» -индивидуальный выбор способа действия -пробуждение интереса к изучаемому материалу
3	Изучение новой темы	1.Постановка проблемы (как вариант – в Приложении 1) 2.Определение темы, цели и задач урока 3. Объяснение нового учебного материала (схема представлена в Приложении 2):	— эвристический, проблемный методы (использование технологии «подкидная доска»)	-вопросы, связанные со здоровьем и здоровым образом жизни -демонстрация, прослеживание связей между здоровым образом жизни и индивидуальным здоровьем -формирование отношения к своему здоровью как ценности -выработка понимания сущности здорового образа жизни -формирование потребности в здоровье -выработка индивидуального способа безопасного поведения -сообщение информации о возможных последствиях нарушения нормального гаметогенеза у человека -смена видов деятельности при изучении нового материала
		— часть 1	-словесные -наглядно-иллюстративный (рисование объясняемого материала в режиме «on-line»)
		— часть 2	-работа с текстом учебника
		— часть 3	-лекция с элементами беседы и использованием опорной схемы (Приложение 3)
		— часть 4 (Приложение 3)	-объяснение по схеме -работа учащихся по заполнению таблицы в рабочей тетради на печатной основе
		— часть 5	-ИКТ (просмотр и объяснение динамической модели «Мейоз»)
4	Закрепление изученного	1. Опрос по понятиям темы	— фронтальный опрос — индивидуальные ответы — самостоятельная (возможно, коллективная в малых группах) работа в тестовых технологиях	-выбор способа действия учащимися -индивидуальная двигательная активность
5	Подведение итогов работы на уроке	1. Само- и взаимопроверка выполнения теста, анализ допущенных ошибок (Приложение 4) 2. Оценивание работы учащихся на уроке. 3. Постановка учебных и жизненных задач по дальнейшему изучению темы.	— поощрение, — поучение	-спокойное завершение урока
6	Домашнее задание	1. Обсуждение домашнего задания. 2. Запись в дневниках	— самостоятельная работа в тестовых технологиях, — творческие задания	-комментирование домашних упражнений -прощание с учащимися

Приложения.

Приложение 1 Некоторые исторические сведения, используемые на уроке.

*Кажется, насколько проще происходил бы процесс зарождения новой жизни, если бы для этого не требовалось участи двух разнополых организмов! Кстати, некоторые примитивные существа, например, амёбы, воспроизводятся делением… Что ж, легко и удобно, однако в результате потомки всегда слишком похожи на родителя, а, значит, путь совершенствования на стезе естественного отбора при бесполом размножении закрыт. Не потому ли амёба за миллионы лет так и осталась амёбой?..

При половом же размножении гены, существующие в популяции, перемешиваются без ограничений, образуя, как в калейдоскопе, бесчисленные сочетания признаков.

Природа выбирает среди них полезные и закрепляет у потомков. Тема нашего урока – «Развитие половых клеток».

* Первым увидел сперматозоиды нидерландский естествоиспытатель Антони ван Левенгук. Когда он их разглядел в свой микроскоп, он принял их за непонятных двигающихся зверьков… И лишь усовершенствование оптики позволило разглядеть мужские половые клетки получше.

* Первую яйцеклетку в окуляр микроскопа посчастливилось «поймать» академику Петербургской академии наук Карлу Максимовичу Бэру. Произошло это в 1827 году. В память об открытии на медали, посвящённой 50-летию научной деятельности Бэра, быфло начертано: «Ortus ab ovo hominem homini ostendit», что в переводе с благородной латыни означает: «Начав с яйца, он показал человек челоека».

Приложение 2 Предлагаемая схема содержит терминологический аппарат по изучаемой теме. Часть понятий учащимся уже известна, часть – вводится первые. Линиями показаны взаимосвязи между понятиями, это позволяет учащимся понять целостность темы.

Такую схему можно подготовить в виде презентации, можно (я использую именно такой вариант) записать термины заранее на доске, а во время работы на уроке соединять термины по мере объяснения их значения.

На этапе закрепления знаний можно предложить учащимся составить ответ по схеме.

Приложение 3. Схема для объяснения процессов гаметогенеза. Демонстрация возможна и через проектор, и как таблица, вывешиваемая на доску.

Мейоз I

Мейоз II

Мейоз I

Мейоз II

Приложение 4 Вариант карточки для итогового повторения.

1.На рисунке изображена схема

А)митоза б)мейоза в)сперматогенеза г)оогенеза

2.Под цифрой 2 на рисунке обозначена зона

А)роста б)созревания в)размножения г)формирования

3.На рисунке изображена схема образования

А)спор б)гамет в)яйцеклетки г)сперматозоида

4.На рисунке в зоне под номером 3 происходит

А)размножение б)деление митозом в)деление мейозом г)неравномерное дробление

5.Мейозом делятся

А)только яйцеклетки б)только сперматозоиды в)споры г)все половые клетки

МАТЕРИАЛЫ КОНГРЕССОВ И КОНФЕРЕНЦИЙ: VI РОССИЙСКАЯ ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

VI РОССИЙСКАЯ ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

ПОРОКИ РАЗВИТИЯ И ОПУХОЛИ ЯИЧНИКОВ У ДЕТЕЙ

Нечушкина И.В., Козлова В.М.

ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва

Злокачественные опухоли половых органов составляют от 3% до 4% от числа злокачественных новообразований детского возраста. Большинство опухолей половых органов у детей характерны для детского возраста, сочетаются с пороками развития, и сами являются пороками развития.

Эмбриогенез мочеполовой системы человека очень сложен. Развитие мочевой и половой систем идет неразрывно и совместно. На ранней стадии эмбрион обладает потенцией развития как в мужскую, так и в женскую особь. Генетический пол эмбриона детерминируется при оплодотворении и зависит от генотипа зиготы (ХХ или ХY). Генетический пол определяет становление гонадного пола (формирование мужских или женских половых желез), а гонадный пол определяет становление фенотипического пола. Становление фенотипического пола — это формирование половых протоков и наружных половых органов по мужскому или по женскому типу. Половая дифференцировка может быть нарушена на любом этапе. Нарушения могут быть вызваны изменением числа хромосом, мозаицизмом (часть клеток имеет нормальный кариотип, другая — нарушенный), аберрациями половых хромосом (изменение структуры хромосомы: разрывы, делеции, транслокации), мутациями генов, участвующих в становлении гонадного и фенотипического пола, а также негенетическими причинами (прием различных медикаментов во время беременности и т.д.).

Первичные половые клетки, предшественники оогониев и сперматогониев, возникают на 3 неделе эмбриогенеза в стенке желточного мешка и на 5-6 неделях внутриутробного развития начинают мигрировать в развивающийся эмбрион, а именно в урогенитальный гребень, который затем делится на генитальную и нефрогенную части. Миграция идет по кровеносным сосудам и мезенхиме брыжейки задней кишки (рис. 1).

Половые тяжи появляются на 4 неделе в виде утолщения на медиальных поверхностях первичных почек. Это зачатки половых желез, состоящие из мезенхимных клеток первичной почки и покрытые целомическим эпителием. Первоначально половые тяжи у эмбрионов мужского и женского пола не различаются (индифферентные половые железы). Половые тяжи затем формируют гонады, а герминогенные клетки — половые клетки. Так начинается становление гонадного пола. На этапе миграции первичных половых клеток могут возникать различные аномалии: несовпадение кариотипов первичных половых (46, XX) и соматических клеток (46, XY) половых тяжей; индуцирование

Рис. 1. Схема развития внезародышевых органов у млекопитающих.

генов первичными половыми клетками 46, ХY, направляющими дифференцировку соматических клеток 46, XX в половых тяжах по пути формирования яичка; дедифференцировка яичника в соединительно-тканные тяжевидные образования. Причинами дедифференцировки яичника, возможно, являются отсутствие образования из оогониев ооцитов I порядка, невозможность деления ооцитов I порядка, отсутствие формирования фолликулов вокруг ооцитов. Таким образом, для формирования яичника необходимо не только наличие нормальных X-хромосом в клетках половых тяжей, но и наличие нормальных ооцитов I порядка.

Внутренние половые органы дифференцируются на 10-12 неделе внутриутробного развития. В процессе своего развития половые органы все более изолируются от мочевой системы и смещаются в малый таз. Установлено, что дифференцировка половых желез справа и слева происходит независимо, поэтому их гистологическое строение может различаться, в половом тяже могут одновременно формироваться разные половые железы.

Превращение половых тяжей в яички определяется геном SRY (sex-determining region Y), локализованным на Y-хромосоме. Установлена возможность транслокации гена SRY на X-хромосому или аутосому. Предполагается также наличие и других генов, направляющих дифференцировку половых тяжей в яички, а не яичники. К 9 неделе эмбриогенеза клетки Сертоли начинают секретировать фактор регрессии мюллеровых протоков, а клетки Лейдига — тестостерон. Под действием тестостерона из вольфова протока формируется придаток яичка, семявыносящий проток, семенной пузырек и семявыбрасывающий проток. Тестостерон не диффундирует на противоположную сторону зародыша и поэтому действует только на ближний к яичку вольфов проток. Если рядом с вольфовым протоком находится яичник или если яичко не секретирует тестостерон, вольфов проток дегенерирует. Неполноценность эмбрионального яичка (дисгенезия) в этом периоде способствует нарушению половой дифференцировки. Дисгенетичные яички не обеспечивают регрессию мюллеровых протоков, что способствует развитию дериватов мюллеровых протоков (матки, маточных труб и верхней трети влагалища) и бисексуальных гениталий. Яичники не участвуют в дифференцировке мюллеровых протоков, поэтому при дисгенезии яичников не нарушено формирование производных этих протоков. Нарушение этого сложного процесса становления генетического и гонадного пола обуславливает частоту пороков развития (неопущение яичка, неполное или полное удвоение органов — почки, мочеточников, матки и влагалища и т.д.) и опухолей репродуктивных органов (опухоли яичников, яичка, влагалища). Единый эмбриогенез половой гонады через стадию индифферентной гонады объясняет причину развития опухолей, одинаковых по морфологическому строению, как у мальчиков, так и у девочек (рис. 2).

Рис. 2. Схема дифференциации половых органов.

У детей сложно на раннем периоде установить нарушения в процессе полового созревания, но любое указание на интерсексуальное состояние требует тщательного обследования как у эндокринологов, так и детских онкологов. У больных, в гонадах которых есть линия клеток, содержащих Y-хромосому, повышена частота опухолей половых желез. Для больных, у которых наружные половые органы скорее мужские или сомнительные, повышен риск развития опухоли гонады. Опухоли половых желез чаще развиваются у больных с чистой ХY дисгенезией гонад, наследуемой рецессивно, сцепленно с Х-хромосомой. По данным разных авторов, этот риск составляет от 20% до 30%. Наилучшая тактика в отношении интерсексульных состояний состоит в профилактическом удалении расположенных внутриабдоминально половых желез или их остатков у всех больных, у которых обнаруживают Y-хромосому, или если имеются основания полагать, что она есть. Больные с синдромом Тернера, у которых есть хотя бы минимальные признаки вирилизации, и больные с чистой XY дисгенезией гонад относятся к этой группе. При чистой ХY дисгенезии гонад описаны опухоли уже в возрасте 7 лет, поэтому у больных этой группы удаление гонад следует делать, как только поставлен диагноз. К сожалению, не все эндокринологии разделяют данную точку зрения.

Следует обращать внимание на течение беременности у матери, наличие в анамнезе у родственников наследственных синдромов, пороков развития, частоту прерывания беременности, особенно, на ранних сроках или рождение мертворожденных с уродствами, наличие у больного ребенка признаков нарушения половой дифференцировки или пороков развития любой локализации. Консультация врача-генетика обязательна для всех детей с опухолями половых органов.

Злокачественные опухоли половых органов девочек поражают преимущественно яичники (86%), на втором месте по частоте поражения — опухоли влагалища и шейки матки (13%). Очень редко отмечается поражение вульвы и наружного отверстия мочеиспускательного канала. Злокачественные опухоли половых органов у девочек встречаются в любом возрасте от периода новорожденности до 15 лет.

Из всех морфологических типов у детей наиболее часто встречаются герминогенные опухоли яичников (82%) и опухоли стромы полового тяжа (9%).

Герминогенные опухоли — новообразования, типичные для детского возраста, составляют до 3% всех злокачественных опухолей у детей. Эти опухоли чрезвычайно разнообразны по своему морфологическому строению, клиническому течению и прогнозу.

Герминогенные опухоли встречаются в 2 раза чаще у девочек. Имеются два пика заболеваемости герминогенными опухолями в детском возрасте: у детей до 2 лет со снижением к 6 годам и в возрасте 13-14 лет. Пик заболеваемости герминогенными опухолями подростков 13-14 лет обусловлен, в основном, поражением яичников.

В клинической картине новообразований яичника ведущими симптомами являются боли в животе, увеличение размеров живота и наличие «уплотнения» в брюшной полости. Наиболее часто среди жалоб отмечается наличие болевого синдрома. Боли имеют разнообразный характер и интенсивность.

Жалобы на увеличение размеров живота или определение пальпируемого образования в брюшной полости очень часто появляются при значительных размерах опухоли. К сожалению, дети попадают к детскому онкологу, когда опухоль яичника выполняет практически всю брюшную полость, и данные пальпации весьма ограничены. Однако умеренная подвижность образования, округлые и четкие контуры, неоднородная плотность при пальпации позволяют предположить наличие опухоли яичника у ребенка. Как правило, у детей увеличение размеров живота определяется размерами опухоли. Асцитическая жидкость в большом количестве определяется редко и в основном при прогрессировании заболевания.

Нередко больные с опухолями яичника госпитализируются в хирургические стационары с картиной «острого живота», которая обусловлена перекрутом ножки опухоли или ее разрывом. Только при диссеминации процесса появляются симптомы интоксикации: вялость, бледность кожных покровов, снижение аппетита, похудание и т.д. Специфических симптомов у герминогенных опухолей нет, однако имеются существенные различия в клинической картине в зависимости от сопутствующих заболеваний, на фоне которых возникла опухоль. Установлено, что «чистая» дисгерминома яичников возникает, в большинстве случаев, в дисгенетичной гонаде. Как правило, если опухоль представлена несколькими опухолями, включая дисгерминому, дисгенезии гонад не бывает. Это очень важно при планировании лечения и формировании прогноза на будущее, так как эти дети после лечения правильно развиваются и полностью восстанавливают не только менструальную, но и детородную функции. При дисгерминоме яичников этого чаще всего не наблюдается. Клинически постановить диагноз дисгенезии гонад у девочек до полового созревания очень сложно и практически невозможно. Необходимо учитывать тот факт, что дисгерминома может быть и не при дисгенезии гонад, так как, в отличие от яичка, яичники могут дедифференцироваться и превращаться в соединительнотканные тяжевидные образования. Процесс этот в каждом яичнике идет автономно. В этих случаях не исключено нормальное развитие другого яичника и нормальное половое развитие ребенка в последующем.

При подозрении на герминогенную опухоль любой локализации необходима постановка реакции на ?-фетопротеин (АФП). Стойкое и интенсивное повышение титра АФП характерно для герминогенных опухолей. Кроме того, для хориокарциномы характерно повышение титра хорионического гормона (ХГ). Проведение указанных реакций позволяет уточнить диагноз и следить за эффективностью проводимого лечения, так как уровни АФП и ХГ в сыворотке коррелируют с объемом опухолевых масс. Отсутствие повышенных титров этих маркеров указывает в большинстве случаев на отсутствие герминогенной опухоли. Однако следует знать, что при «чистой» дисгерминоме и незрелой тератоме опухолевые маркеры тоже не определяются (табл. 1). В этом случае необходимо обращать внимание на развитие половых органов, вторичных половых признаков. Определение кариотипа поможет в тактике оперативного вмешательства, во время которого необходимо тщательно осмотреть строение внутренних половых органов, расположение и размеры непораженной гонады. При кариотипе 46, XY и женском фенотипе ребенка следует убрать и другую гонаду. В случае определения кариотипа 46, XX показано тщательное динамическое наблюдение. Сводные данные по клиническим симптомам у детей с герминогенными опухолями представлены в табл. 1.

Таблица 1.
Клинические симптомы, наблюдаемые при герминогенных опухолях.

Герминогенные опухоли	Дисгерминома («чистая»)
АФП(+)	АФП(-)
Менархе(+)	Менархе(+/-)
Половые признаки развиты правильно	Развитие половых признаков(+/-)
Менструальный цикл(+)	Менструальный цикл(+/-)

Опухоли стромы полового тяжа являются преимущественно гормонально-активными, так как клеточные элементы опухоли продуцируют гормоны. Может развиваться картина ложного преждевременного созревания, когда появляются отдельные признаки полового созревания, однако не соблюдается очередность развития этих признаков. Развитие признаков очень разное. Для клинической картины опухолей этой группы характерно развитие одних признаков при почти полном отсутствии других. Никогда не отмечается «скачка» роста, как это наблюдается при нормальном половом развитии. Данные признаки более характерны для андробластом. Гранулезоклеточные опухоли у детей чаще не имеют признаков гормональной активности или она слабо выражена.

При обследовании больных данной группы никогда не определяются повышенные титры АФП или ХГ. Могут быть пороки развития. Клинические симптомы, наблюдаемые при опухолях стромы полового тяжа, представлены в табл. 2.

Таблица 2.
Клинические симптомы, наблюдаемые при опухолях стромы полового тяжа.

Гранулезоклеточные опухоли	Андробластомы
АФП(-)	АФП(-)
Менархе(+)	Менархе(+/-)
Половые признаки развиты правильно	Половые признаки могут быть развиты неправильно
Пороки развития(-)	Пороки развития(+)

Гонадобластома — опухоль, при обнаружении которой необходимо обязательное определение кариотипа. Клиническая картина заболевания яркая. Дети, страдающие данной опухолью, резко отличаются от своих сверстников. Чаще отмечаются пороки развития и гипоплазия половых органов, вторичные половые признаки не развиты. Опухоль может встречаться как самостоятельно, так и в сочетании с другими опухолями. При «чистой» форме маркеры АФП и ХГ не повышены. Правильная диспансеризация таких больных может своевременно поставить диагноз и возможно предупредить развитие опухоли.

Прогноз у больных с опухолью яичников определяется возможностью радикального удаления опухоли. Как правило, при опухолях яичников на первом этапе лечения выполняется оперативное вмешательство. Оперативное лечение заключается в удалении придатков матки на стороне поражения и резекции большого сальника, так как на большом клиническом материале установлено, что поражение злокачественной опухолью яичника носит односторонний характер. В случае развития опухолевого поражения одного яичника на фоне дисгенезии гонад необходимо удаление другого, так как риск поражения другой гонады резко возрастает.

Все опухоли чувствительны к химиотерапии, поэтому даже при распространенном опухолевом процессе или после нерадикального удаления опухоли можно получить хорошие результаты лечения. При прогрессировании процесса, иногда установленного только по данным повышения титра опухолевых маркеров, необходима своевременная смена схемы лечения.

Химиотерапия является обязательным компонентом комплексного лечения у детей. Большинство новообразований детского возраста высоко чувствительны к химиотерапии, особенно это относится к герминогенным опухолям.

Лучевая терапия при опухолях яичников практически не применяется, за исключением лечения дисгерминомы яичников. В случаях нерадикальной операции или лечении метастазов следует проводить лучевую терапию на очаг поражения в СОД 30-45 Гр. Дисгерминома высоко чувствительна к лучевому лечению, что позволяет получить хорошие результаты даже при распространенном опухолевом процессе.

Результаты лечения полностью определяются своевременностью начала лечения и радикальностью оперативного вмешательства. Использование современных схем и комбинаций химиопрепаратов с соблюдением данных принципов лечения позволило получить 5-летнюю выживаемость у 87,9 % больных. Отдаленные результаты лечения показали, что у девочек сохраняется не только менструальная, но и детородная функция.

Сперматогенез и овогенез, подготовка к ЕГЭ по биологии

Гаметогенез (греч. gamete– жена, gametes – муж + genesis – зарождение)

Гаметогенезом называют процесс образования половых клеток (гамет). Этот процесс происходит у мужских и женских особей в гонадах (половых железах), представленных семенниками (яичками) и яичниками.

Гаметы (n) образуются в результате мейоза из клеток-предшественников (2n, как у соматических клеток). Половые клетки гаплоидны, то есть имеют в два раза меньшее число хромосом, чем клетки-предшественники. Мужская (n) и женская (n) гаметы, сливаясь друг с другом в процессе оплодотворения, образуют зиготу (2n).

Таким образом, за счет гаплоидности гамет (в результате мейоза) поддерживается постоянное количество хромосом в ряду поколений, не происходит их удвоения.

Процессы сперматогенеза и овогенеза (оогенеза) требуют нашего более детального изучения.

Сперматогенез (греч. sperma – семя + genesis – зарождение)

Сперматогенезом называют процесс формирования мужских гамет (половых клеток) — сперматозоидов. Он начинается в период полового созревания (под влиянием мужских половых гормонов) и длится практически до конца жизни. Сперматогенез складывается из четырех фаз (периодов):

Фаза размножения

В ходе фазы размножения диплоидные сперматогенные клетки (2n2c) многократно делятся митозом, в результате образуются сперматогонии (2n2c) — стволовые клетки. Часть сперматогоний вступает в последующее митотическое деление, образуя такие же сперматогонии (2n2c).

Фаза роста

Половые клетки в этой фазе называются сперматоцитами I порядка, они теряют способность к митотическому делению.

В этот период клетка растет, увеличивается количество органоидов и цитоплазмы. Происходит подготовка к мейозу, который начинается в следующей фазе — созревания.

На фазу роста приходится S-период: происходит удвоение ДНК, в результате чего набор хромосом сперматоцита I порядка становится (2n4c).

Фаза созревания

Происходит первое деление мейоза (мейоз I). В результате из сперматоцитов I порядка (2n4c) образуются сперматоциты II порядка (n2c). Между мейозом I и мейозом II практически отсутствует интерфаза, поэтому сперматоциты II порядка (n2c) сразу же вступают в мейоз II, в результате которого образуются сперматиды (nc).

Итак, в фазу созревания происходят первое и второе деления мейоза, которые приводят к тому, что образовавшаяся клетка — сперматида — имеет гаплоидный набор хромосом (nc).

Формирования

В этой фазе у каждой сперматиды отрастает жгутик, после чего они получают полное право называться сперматозоидами. У основания жгутика концентрируются митохондрии — «энергетические станции клетки», которые всегда будут готовы предоставить АТФ для его активной работы.

Овогенез, или оогенез (греч. ōón — яйцо + genesis – зарождение)

Оогенезом называют процесс формирования женских гамет (половых клеток) — яйцеклеток. Он активируется в женском организме в период полового созревания (под действием женских половых гормонов) и длится до менопаузы (45-55 лет).

Оогенез протекает по очень похожей со сперматогенезом схеме, однако вы увидите некоторые отличия. Например, фаза формирования, характерная для сперматогенеза, здесь отсутствует, поэтому овогенез складывается из трех фаз:

Фаза размножения

В результате многократных делений клеток яичника образуются стволовые клетки — овогонии (2n2c).

Фаза роста

Половые клетки в этой фазе называются ооцитами I порядка, они теряют способность к митотическому делению.

В овогенезе эта фаза отличается более длительной продолжительностью, по сравнению с такой же фазой в сперматогенезе. Клетки накапливают большой запас питательных веществ. В этот период происходит удвоение ДНК в S-периоде — набор хромосом и ДНК ооцитов I порядка становится 2n4c.

Фаза созревания

Ооциты I порядка (2n4c) вступают в первое деление мейоза, в результате которого образуются ооциты II порядка (n2c) и первое полярное (направительное) тельце, которое не несет большой функциональной значимости и подвергается дегенерации.

Второе деление мейоза начинается только после взаимодействия овоцита II порядка (n2c) со сперматозоидом. В результате этого образуется яйцеклетка (nc) и второе полярное тельце, которое также подвергается дегенерации.

Строго говоря, при овуляции из яичников выходит не «яйцеклетка», а ооцит II порядка, который ждет встречи со сперматозоидом для продолжения деления и развития будущего зародыша. Если такого взаимодействия не происходит, то яйцеклетка подвергается дегенерации.

Оплодотворение

Оплодотворение — ключевой процесс полового размножения, обусловленный слиянием сперматозоида и яйцеклетки. После оплодотворения в результате ряда стадий образуется эмбрион.

Сперматозоид (nc) обладает положительным химическим таксисом к яйцеклетке (nc). Оплодотворение — слияние сперматозоида с яйцеклеткой и образование зиготы (2n2c).

При внутреннем оплодотворении сперматозоид сливается с яйцеклеткой в женских половых путях, куда самец вводит семенную жидкость со сперматозоидами.

При внешнем оплодотворении сперматозоид сливается с яйцеклеткой вне половых путей самки, например, у двустворчатых моллюсков оплодотворение происходит в мантийной полости самки.

Внешнее оплодотворение характерно для рыб, земноводных, моллюсков. Внутреннее — для пресмыкающихся, птиц и млекопитающих.

Данная статья написана Беллевичем Юрием Сергеевичем и является его интеллектуальной собственностью. Копирование, распространение (в том числе путем копирования на другие сайты и ресурсы в Интернете) или любое иное использование информации и объектов без предварительного согласия правообладателя преследуется по закону. Для получения материалов статьи и разрешения их использования, обратитесь, пожалуйста, к Беллевичу Юрию.

Принципы раннего развития человека и программы зародышевых клеток на основе консервативных модельных систем

Тан В. В., Кобаяши Т., Ирие Н., Дитманн С. и Сурани М. А. Спецификация и эпигенетическое программирование зародышевой линии человека. Nat. Преподобный Жене. 17 , 585–600 (2016)

CAS Статья Google ученый

Sugawa, F. et al. Коммитирование первичных зародышевых клеток человека in vitro связано с уникальным профилем экспрессии PRDM14. EMBO J. 34 , 1009–1024 (2015)

CAS Статья Google ученый

Sasaki, K. et al. Надежная in vitro индукция судеб человеческих половых клеток из плюрипотентных стволовых клеток. Стволовые клетки 17 , 178–194 (2015)

CAS Статья Google ученый

Ири, Н. и др. SOX17 является критическим спецификатором судьбы первичных зародышевых клеток человека. Ячейка 160 , 253–268 (2015)

CAS Статья Google ученый

Хаяси, К., Охта, Х., Куримото, К., Арамаки, С. и Сайту, М. Восстановление пути спецификации зародышевых клеток мыши в культуре с помощью плюрипотентных стволовых клеток. Ячейка 146 , 519–532 (2011)

CAS Статья Google ученый

Ву, Дж.& Изписуа Бельмонте, Дж. С. Стволовые клетки: возрождение биологических исследований человека. Ячейка 165 , 1572–1585 (2016)

CAS Статья Google ученый

Россант, Дж. Мышиные и человеческие стволовые клетки, полученные из бластоцист: различия между живыми организмами. Разработка 142 , 9–12 (2015)

CAS Статья Google ученый

Дэвидсон, К.К., Мейсон, Э. А. и Пера, М. Ф. Плюрипотентное состояние у мышей и человека. Разработка 142 , 3090–3099 (2015)

CAS Статья Google ученый

Tang, W. W. et al. Уникальная сеть регуляции генов перезапускает эпигеном зародышевой линии человека для развития. Ячейка 161 , 1453–1467 (2015)

CAS Статья Google ученый

Гуо, Ф.и другие. Транскриптом и ДНК-метиломные пейзажи первичных половых клеток человека. Ячейка 161 , 1437–1452 (2015)

CAS Статья Google ученый

Gkountela, S. et al. Динамика деметилирования ДНК в пренатальной зародышевой линии человека. Ячейка 161 , 1425–1436 (2015)

CAS Статья Google ученый

Клиш, К.и другие. Sda / GM2-гликан является углеводным маркером первичных половых клеток свиней и субпопуляции сперматогониев крупного рогатого скота, свиней, лошадей и лам. Репродукция 142 , 667–674 (2011)

CAS Статья Google ученый

Seki, Y. et al. Клеточная динамика, связанная с эпигенетическим репрограммированием всего генома в мигрирующих примордиальных половых клетках мышей. Разработка 134 , 2627–2638 (2007)

CAS Статья Google ученый

Хайкова, П.и другие. Эпигенетическое репрограммирование в первичных половых клетках мышей. мех. Dev. 117 , 15–23 (2002)

CAS Статья Google ученый

Вальдес Магана, Г., Родригес, А., Чжан, Х., Уэбб, Р. и Альберио, Р. Паракринные эффекты полученных из эмбриона FGF4 и BMP4 во время удлинения трофобласта свиньи. Dev. Биол. 387 , 15–27 (2014)

Артикул Google ученый

Ёсида, М.и другие. Консервативные и дивергентные паттерны экспрессии маркеров осевого развития у здоровых млекопитающих. Dev. Дин. 245 , 67–86 (2016)

CAS Статья Google ученый

Aramaki, S. et al. Мезодермальный фактор, Т, определяет судьбу зародышевых клеток мыши путем непосредственной активации детерминант зародышевой линии. Dev. Ячейка 27 , 516–529 (2013)

CAS Статья Google ученый

Ло, К.M. et al. Эффективная индукция энтодермы плюрипотентными стволовыми клетками человека путем логического направления сигналов, контролирующих бифуркации клонов. Стволовые клетки 14 , 237–252 (2014)

CAS Статья Google ученый

D’Amour, K. A. et al. Эффективная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в дефинитивную энтодерму. Nat. Biotechnol. 23 , 1534–1541 (2005)

Артикул Google ученый

Марри, К.Э. и Келлер, Г. Дифференциация эмбриональных стволовых клеток для клинически значимых популяций: уроки эмбрионального развития. Ячейка 132 , 661–680 (2008)

CAS Статья Google ученый

Накамура Т. и др. Координата развития плюрипотентности мышей, обезьян и людей. Природа 537 , 57–62 (2016)

ADS CAS Статья Google ученый

Лим, Дж.И Тиери, Дж. П. Эпителиально-мезенхимальные переходы: выводы из развития. Разработка 139 , 3471–3486 (2012)

CAS Статья Google ученый

Sasaki, K. et al. Судьба зародышевых клеток яванских макак уточняется в формирующемся амнионе. Dev. Ячейка 39 , 169–185 (2016)

CAS Статья Google ученый

Кукенберг, П., Kubaczka, C. & Schorle, H. Роль фактора транскрипции Tcfap2c / TFAP2C в развитии трофэктодермы. Репродукция. Биомед. Онлайн 25 , 12–20 (2012)

CAS Статья Google ученый

Робертсон, Э. Дж. И др. Blimp1 регулирует развитие задней передней конечности, каудальных глоточных дуг, сердца и сенсорных вибрисс у мышей. Разработка 134 , 4335–4345 (2007)

CAS Статья Google ученый

Картер, А.М. и Эндерс, А. С. Плацентация у млекопитающих: дефинитивная плацента, желточный мешок и параплацента. Териогенология 86 , 278–287 (2016)

CAS Статья Google ученый

Виотти, М., Новотчин, С. и Хаджантонакис, А. К. SOX17 связывает морфогенез энтодермы кишечника и сегрегацию зародышевого листка. Nat. Cell Biol. 16 , 1146–1156 (2014)

CAS Статья Google ученый

Мураками, К.и другие. Один только NANOG индуцирует зародышевые клетки в примированном эпибласте in vitro путем активации энхансеров. Природа 529 , 403–407 (2016)

ADS CAS Статья Google ученый

Yamaji, M. et al. Критическая функция Prdm14 для создания линии зародышевых клеток у мышей. Nat. Genet. 40 , 1016–1022 (2008)

CAS Статья Google ученый

Линь, И.Y. et al. Подавление нейрального эффекторного гена SOX2 с помощью PRDM1 способствует судьбе человеческих половых клеток в эмбриональных стволовых клетках. Отчеты о стволовых клетках 2 , 189–204 (2014)

CAS Статья Google ученый

Alberio, R., Croxall, N. & Allegrucci, C. Стволовые клетки эпибласта свиней зависят от активин / узловой передачи сигналов для плюрипотентности и самообновления. Stem Cells Dev. 19 , 1627–1636 (2010)

CAS Статья Google ученый

Чен, Г.и другие. Химически определенные условия для получения и культивирования ИПСК человека. Nat. Методы 8 , 424–429 (2011)

CAS Статья Google ученый

Gafni, O. et al. Получение новых наивных плюрипотентных стволовых клеток человека в основном состоянии. Природа 504 , 282–286 (2013)

ADS CAS Статья Google ученый

Ван Х., Луо, X., Яо, Л., Леман, Д. М. и Ван, П. Повышение выживаемости клеток во время дифференцировки дефинитивной энтодермы плюрипотентных стволовых клеток человека. Stem Cells Dev. 24 , 2536–2546 (2015)

CAS Статья Google ученый

Loh, K. M. et al. Картирование попарного выбора, ведущего от плюрипотентности к человеческим костям, сердцу и другим типам клеток мезодермы. Ячейка 166 , 451–467 (2016)

CAS Статья Google ученый

Ng, E.С., Дэвис, Р., Стэнли, Э. Г. и Элефанти, А. Г. Протокол, описывающий использование среды без продуктов животного происхождения (APEL) на основе рекомбинантного белка для дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в виде спиновых эмбриоидных телец. Nat. Протоколы 3 , 768–776 (2008)

CAS Статья Google ученый

Кобаяши, Т., Альберио, Р. И Сурани, М. А. Моделирование развития гаструляции и судьбы половых клеток in vitro с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека и обезьяны. Protoc. Exch. (2017)

Magnúsdóttir, E. et al. Трехсторонняя сеть факторов транскрипции регулирует спецификацию первичных зародышевых клеток у мышей. Nat. Cell Biol. 15 , 905–915 (2013)

Артикул Google ученый

Grabole, N. et al. Prdm14 способствует судьбе зародышевой линии и наивной плюрипотентности путем репрессии передачи сигналов FGF и метилирования ДНК. Представитель EMBO 14 , 629–637 (2013)

CAS Статья Google ученый

Модели развития половых клеток и их применение для определения токсичности изучает

Environ Mol Mutagen.Авторская рукопись; доступно в PMC 2016 1 октября.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC4586303

NIHMSID: NIHMS670534

Институт общества и генетики; Науки о гигиене окружающей среды, университет Калифорнии, Лос-Анджелес. Лос Анджелес, Калифорния.

См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Зародышевые клетки уникальны своей способностью передавать генетическую информацию и признаки из поколения в поколение.Таким образом, правильное развитие половых клеток и целостность их генома имеет первостепенное значение для здоровья организмов и выживания разновидность. Зародышевые клетки также чрезвычайно чувствительны к воздействиям окружающей среды, хотя испытания токсичности половых клеток, особенно у женщин, особенно доказали испытывающий. В этом обзоре мы сначала описываем замечательную одиссею половых клеток в млекопитающих, с акцентом на женскую зародышевую линию, от их первоначальной спецификации во время от эмбриогенеза до образования зрелых гамет у взрослых.Мы также описываем текущие методы, используемые в тестировании токсичности зародышевых клеток, и их ограничения при исследовании комплекса особенности развития половых клеток млекопитающих. Чтобы обойти эти проблемы, мы предлагаем использование альтернативных модельных систем, таких как Saccharomyces cerevisiae , Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans и в vitro методы на зародышевых клетках, которые имеют явные преимущества перед традиционными моделями токсичности. Мы обсудить преимущества и ограничения каждого подхода, их применение к зародышевым клеткам исследования токсичности, а также необходимость в вычислительных подходах для максимизации полезности эти модели.Вместе включение этих альтернативных моделей токсичности для зародышевых клеток будет быть неоценимым для исследования стадий, труднодоступных у млекопитающих, а также крупномасштабное высокопроизводительное исследование токсичности половых клеток.

Ключевые слова: зародышевые линии, зародышевые клетки, мейоз, токсичность, дрожжи, дрозофила, C. elegans, стволовые клетки

Введение

Линия зародышевых клеток уникальна, поскольку это единственный тип клеток, который связывает поколения. Половые клетки проходят сложный путь развития, который зависит от взаимодействие нескольких типов клеток, которое длится от нескольких месяцев до многих лет у млекопитающих виды [Lesch and Page 2012].По этим причинам повторение событий дифференцировки зародышевых клеток в системах культур клеток исторически оказалось трудным [Susiarjo et al. 2009]. Это для по тем же причинам, по которым тестирование на токсичность зародышевых клеток в основном ограничивалось: женские половые клетки поздних (неэмбриональных) стадий дифференцировки или мужские половые клетки где доступ облегчается непрерывной мейотической дифференцировкой [Susiarjo et al. 2009]. В настоящем обзоре мы сначала резюмируем основные события спецификации и дифференцировки зародышевых клеток млекопитающих и идентифицировать текущие проблемы тестирования токсичности в половых клетках, особенно в женской зародышевой линии.Мы тогда обсудить полезность нескольких модельных организмов и подходов, которые могут обойти некоторые из трудности, присущие изучению половых клеток. Особо подчеркиваем преимущества использования фенотипических анализов в каждой модельной системе, которые охватывают как генотоксичность, так и репродуктивная токсичность, поскольку эти аспекты токсичности для половых клеток во многом совпадают и механически связаны.

Развитие зародышевых клеток млекопитающих, краткий обзор

У млекопитающих можно распознать несколько ключевых фаз развития зародышевых клеток.В течение в фазе спецификации у мышей половые клетки появляются примерно на эмбриональный день E6 в эпибласт, ближайший к экстраэмбриональной эктодерме [Chiquoine 1954]. Эти клетки возникают за счет индукции передачи сигналов BMP (BMP-4 и BMP-8b) из внеэмбриональной эктодерме, а также посредством канонической передачи сигналов WNT в форме WNT3 от висцеральная энтодерма, прилегающая к эпибласту (обзор см. [Magnusdottir and Surani 2014]). Примерно к E7.25 небольшое количество половые клетки (~ 40) четко различимы по экспрессии маркеров, таких как Blimp1 и Prdm14 [Nakaki et al.2013].

После второй фазы (миграция к генитальному гребню около E10,5), женские первичные половые клетки завершают несколько раундов митотических делений до E13.5, перед арестом. В то время как мужские половые клетки возобновляют дифференцировку только в период полового созревания, женские зародыши клетки непосредственно инициируют третью фазу: мейотическую дифференцировку [Lesch and Page 2012]. Эти клетки претерпевают серию стереотипных, эволюционно консервативные ступени, присущие мейотической дифференцировке. На хромосомном На уровне инициации мейоза в первую очередь отмечается умеренная конденсация хроматина. в «треки» ДНК, которые, хотя и не напоминают метафазные хромосомы, облегчают взаимодействие гомологов во время первых шагов профазы I [Pawlowski and Cande 2005].Хромосомные взаимодействия инициировать выравнивание и спаривание гомологов, опосредованное привязкой, или ограничение концов хромосом на одну сторону ядра зародышевой клетки и скоординированное движение хромосом [Scherthan et al. 1996]. Когда два гомологи находятся в непосредственной близости друг от друга, они инициируют процесс спаривания. Спаривание различается у разных видов, но обычно включает поиск гомологии на основе последовательностей и временное установление гомологичной пары хромосом [Klutstein, Cooper 2014].Эти гомологические пары затем стабилизируются создание сложной белковой структуры, напоминающей лестницу, названной синаптонемный комплекс (SC), который физически фиксирует гомологичные хромосомы на месте [Heyting 1996]. Мейотическая рекомбинация накладывается на Сборка СК. Рекомбинация инициируется запрограммированным двухцепочечным разрывом ДНК. осуществляется с помощью родственного топоизомеразе белка SPO-11 [Romanienko and Camerini-Otero 1999; Романиенко и Camerini-Otero 2000]. Ремонт двунитевых разрывов в соматических клетках может быть осуществляется несколькими путями, включая негомологичное соединение концов или одиночную нить отжиг [Андерсен, Секельский, 2010].Тем не мение, мейотические клетки в основном используют путь гомологичной рекомбинации, чтобы создают минимум одно событие кроссовера на хромосому [Andersen and Sekelsky 2010]. Создание кроссовера зависит от на репарацию двухцепочечного разрыва с использованием гомологичной хромосомной последовательности в качестве шаблон [Лю и Хуанг 2014]. Важно отметить, что ремонт хотя бы одного прорыва в переходном пути необходим для замены информация между гомологичными хромосомами, а также для правильного выравнивания и расщепление хромосом в метафазе и анафазе I [Roeder 1997].

В половых клетках самок млекопитающих мейоз останавливается в конце профазы I, стадия диплотены и возобновляется только в период полового созревания с процессом овуляции [Feng et al. 2014]. Женские половые клетки, т.е. ооциты, в первую очередь сегрегация рекомбинированных гомологичных хромосом во время Мейоза I с последующей сегрегацией сестринских хроматид во время Мейоза II. Ооциты самок снова задерживаются на Метафазе II до тех пор, пока оплодотворение спермой, которое вызывает возобновление мейоза и активацию эмбрионального программа.

Как отмечалось ранее, многие важные события, которые определяют спецификацию зародышевых клеток и раннюю дифференцировка в женских половых клетках млекопитающих происходит на эмбриональных стадиях, которые, из-за небольшого размера гонад и небольшого количества клеток оказывает их изолированность и учеба трудна [Susiarjo et al. 2009]. Рано мейотическая дифференцировка у млекопитающих особенно трудно исследовать, так как мейотическая дифференцировка процесс разворачивается в течение эмбриогенеза, и конкретная мейотическая стадия остается только присутствуют на данном этапе эмбриогенеза.Эти аспекты половых клеток млекопитающих сложно согласовать с необходимостью оценки токсичности большого количества химических веществ на многих этапах дифференцировки зародышевых клеток. По этим причинам использование альтернативные модели для изучения токсичности зародышевых клеток особенно привлекательны. Ниже мы проанализировать текущие тесты на репродуктивную токсичность и генотоксичность зародышевых клеток и выделить их преимущества, а также некоторые из их текущих ограничений.

Современный ландшафт тестирования токсичности половых клеток

Текущие методологии репродуктивного токсикологического тестирования фармацевтических препаратов, as рекомендовано Международной конференцией по гармонизации (ICH; директива S5: R2), использовать стратегии дозирования, которые начинают за четыре недели до спаривания у самцов мышей и за две недели в самки.Эти временные рамки обеспечивают созревание сперматоцитов и овуляцию. в период воздействия. В зависимости от дизайна исследования и конечных точек лечение мать продолжает, по крайней мере, через имплантацию, но может продолжаться и после родов через отлучение от груди. Такие исследования направлены на выявление влияния на фертильность родителей, а также на раннее Эмбриональное развитие через репродуктивное созревание поколения F1. Однако эти эксперименты не в состоянии изучить ранние митотические и мейотические события как ооцитов, так и сперматозоидов. напрямую, вместо этого полагаясь на такие конечные точки, как летальность потомства и низкая масса тела.Принимая во внимание, что в этих исследованиях обычно используется от 16 до 20 пар спаривания, аномалии, возникающие с низкой частотой в развивающихся сперматозоидах или ооцитах, могут не обнаруживаться измеряя плодовитость.

Проблема захвата низкочастотных событий также относится к проверенным временем доминантный летальный тест (DLT), который используется для определения способности химических веществ вызывать хромосомные аномалии и мутации у потомства, проявляющиеся в эмбриональной летальности [Эпштейн 1973]. Мужчин лечат от различных периоды до полного цикла сперматогенеза и спаривания.Спарившихся самок приносят в жертву во время беременности оценивается количество эмбрионов, имплантатов и овулировавших яиц. Один подход, который может решить проблему низкой частоты, является более чувствительным методом флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), которую можно использовать для исследования хромосомных аномалий и измерить их частоту в большом количестве сперматозоидов [Shi and Martin 2000; Tempest et al. 2004; Pereira et al. 2014]. Однако экспертиза многочисленные различные типы перегруппировок через FISH утомительны и также не выявлять тонкие изменения в геноме, такие как небольшие INDEL или точечные мутации.

В исследованиях трансгенераций наблюдения за потомством обычно заканчиваются на F2. поколения, и как таковые служат только для выявления эффектов прямого и в utero , что не позволяет устранить потенциальные дефекты F3 потомство эпигенетическим путем. Это представляет собой существенный недостаток нынешних подход, учитывая глубокое эпигенетическое ремоделирование эмбриональных половых клеток и их потенциальная восприимчивость к факторам окружающей среды на этих этапах. Со всем геномом и эпигеном, методы, уменьшающиеся в стоимости и увеличивающиеся в скорости, будет уместно исследовать одно или два поколения помимо тех, кто подвергся воздействию в утробе матери на предмет доказательств геномной нестабильности (например,грамм. мутации, CNV) и изменения в паттернах метилирования ДНК по геному.

Необходимость различать генотоксичность половых клеток и соматических клеток также становится все более важным, как подчеркивается в отчете с Международной конференции 2013 г. Семинар по тестированию на генотоксичность [Yauk et al. 2015]. Поскольку мужские и женские зародышевые линии уникальны для передачи генетического материала. от одного поколения к другому, любая специфичность мутагена на зародышевой линии (при условии, что токсикант достигает гонад в достаточной концентрации), вызывающей беспокойство, независимо от того, он проявляет мутагенный потенциал в соматических клетках.Текущие рекомендации ICH не решить эти проблемы. Руководящие принципы ICH по генотоксичности рекомендуют тест на ген мутация в бактериях (обычно тест Эймса) и оценка соматических тканей грызунов (директива S2: R1). Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA), фармацевтика и медицинское оборудование Агентство (PMDA) и Федеральное управление по лекарствам (FDA) следуют рекомендациям ICH, указывает на то, что лекарства, находящиеся в настоящее время в разработке на международном уровне, не могут быть проверены напрямую для мутагенеза зародышевых клеток, если это специально не попросят спонсора.Половые клетки показывают дифференциальная восприимчивость к токсикантам по сравнению с соматическими клетками [Ramos-Morales and Rodriguez-Arnaiz 1995; Witt et al. 2003]. Кроме того, есть также четкое доказательства половой специфичности чувствительности зародышевой линии, как время развития зародышевых клеток, дифференцировка и эпигенетическое программирование, а также механизмы репарации ДНК. различаются оогенезом и сперматогенезом [Ashwood-Smith and Эдвардс 1996; Olsen et al. 2005; Кубова и др. 2006; Leitch et al. 2013].Таким образом, точная идентификация химических веществ, вызывающих токсичность зародышевых клеток требует проведения анализов, специфичных для пола, для выявления мутагенов, которые одна из зародышевых клеток родословная (мужская или женская) может быть в первую очередь восприимчивой. Это создает проблемы в виды млекопитающих, особенно у самок, у которых сбор ооцитов трудоемок и дает низкое количество половых клеток. В результате доступно гораздо больше анализов и разработка для анализа спермы, чем для анализа женских половых клеток [Yauk et al.2015].

В настоящее время существует несколько многообещающих достижений в области альтернативных модельных систем, которые может устранить некоторые из этих пробелов в тестировании репродуктивной токсичности. Эти альтернативные модели имеют явные преимущества перед моделями млекопитающих, предлагая конечные точки, которые не только трудно наблюдать в традиционных моделях, но также позволяет проводить анализ таким образом, чтобы высокая пропускная способность и рентабельность, факторы, которые делают их интеграцию в текущую батарея тестов на токсичность выгодна. Ниже мы представляем несколько мощных генетических моделей. системы, которые исторически пролили свет на наше понимание дифференцировки половых клеток и функция: дрожжи, Drosophila, и C.elegans. Автор в отличие от других моделей, таких как рыба данио, которая не использовалась в значительной степени в изучение биологии зародышевых клеток [Tzung et al. 2015], эти организмов предоставили широкий спектр генетических, молекулярных и цитологических инструментов для изучение половых клеток в поддержку их широкого признания и применения в зародышевых клетках тестирование на токсичность. Мы кратко опишем каждую модель и выделим некоторые из их использования в токсикология. Мы также представляем новые разработки в области стволовых клеток и компьютерной токсикологии. это может значительно улучшить наше понимание процессов зародышевой линии и их дисрегуляции. после химического воздействия.Мы предлагаем читателю найти описание этих моделей и краткое изложение их сильных и слабых сторон.

Развитие зародышевых клеток и мейотическая дифференцировка в нескольких модельных системах

a. Мейотическая дифференцировка дрожжей ( S. cerevisiae ) . В течение 6 часов индуцированные диплоидные клетки проходят последний раунд премейотической S перед инициированием мейоза. Во время профазы I происходят события синапсиса и рекомбинации. перед гомологичной сегрегацией хромосом в Анафазе I. г. Модель C. elegans зародышевой линии . У нематод ядерная дифференцировка зародышевой линии непрерывный. По мере того, как ядра движутся по гонаде, они одновременно проходят через различные стадии профазы I, начиная с Leptotene (Lept) и Zygotene в наиболее дистальный отдел к диакинезу в наиболее проксимальном отделе. Ооциты (оранжевая заливка) оплодотворяется путем прохождения сперматека (Sp) для образования эмбрионов. г. Drosophila оогенез . Стволовые клетки зародышевой линии, находящиеся в germarium подвергается делению, чтобы дать начало другой стволовой клетке или клетке, которая подвергается мейоз.Камеры для яиц, каждая из которых содержит по одному ооциту (оранжевый цвет) и питательные клетки. затем прогрессируют через мейоз, продвигаясь вперед через яичник. К 9 этапу оогенез, ооциты завершили профазу I. d. Поколение мышей in vitro PGCs . ES-клетки в культуре сначала индуцируются в эпибластоподобное состояние посредством применение в питательной среде нескольких факторов, включая FGF, Activin и Knock-out Замена сыворотки (KSR). С этой стадии PGC-подобные клетки (PGCLC) индуцируются применение комбинации BMP4 / 8b, FGF и KSR.

Таблица I

Сильные и слабые стороны моделей развития зародышевых клеток

9049 Дифференцировка зародышевых клеток млекопитающих

Рассматриваемая модельная система	Преимущества	Ограничения
Saccharomyces 90 cerevisiae 02 Сохранение мейотических процессов у млекопитающих Формирование Spo11-зависимых СК (как у млекопитающих) Быстрая дифференциация Недорогой, легко культивируемый Большое количество доступных генетических мутантов и делеций Высокая производительность Поддается биохимическому анализу Возможно прямое наблюдение за динамикой хромосом	Временная дифференциация требует анализа временного ряда Параметры токсикокинетики, вероятно, отличаются от параметров млекопитающих Одноклеточный организм
Drosophila melanogaster		Сложная морфология хромосомы для наблюдения зародышевые линии Эволюционно далеки от млекопитающих Параметры токсикокинетики, вероятно, отличаются от параметров токсикокинетики млекопитающих Spo-11 -независимое образование SC
мейотических процессов у млекопитающих Доступно огромное количество генетических мутантов Доступ к полной кинетике мейотической дифференцировки в каждой гонаде Возможность прямого наблюдения за морфологией и динамикой хромосом Высокая производительность	Эволюционно далек от млекопитающих Токсикокинетические параметры, вероятно, отличаются от параметров млекопитающих Spo-11 -независимое образование SC
Более высокая актуальность для людей по сравнению с другими моделями Подходит для наблюдения за эпигенетическими изменениями PGC Потенциал для высокопроизводительного скрининга	пропускная способность (пока) Трудно исследовать мейотическую дифференцировку Дороже для культивирования, чем другие модельные организмы

Почкующиеся дрожжи

Saccharomyces cerevisiae cerevisiae может нет можно рассматривать как зародышевую клетку как таковую , тем не менее она использовалась широко в качестве модели для изучения клеточного аппарата, который направляет программу клеточного деление как во время митоза, так и во время мейоза [Szybalski 2001].Жизненный цикл зарождающихся дрожжей включает как гаплоид, так и диплоид. фаза. В нормальных условиях гаплоидные дрожжи размножаются путем митотического деления. Когда в непосредственной близости друг к другу гаплоидные дрожжевые клетки двух разных типов спаривания (а или α) могут реагировать и притягивать друг друга, чтобы инициировать слияние и амфимиксис, или слияние их гаплоидного генома с образованием диплоидной клетки [Herskowitz 1988]. Опять же, в нормальных условиях эти диплоидные клетки, предпочтительные состояние почкующихся дрожжей, растут и делятся посредством митоза.Однако в стрессовых условиях таких как голодание, клетки инициируют мейоз, чтобы произвести набор из четырех гаплоидов и стрессоустойчивые споры (феномен споруляции) [Herskowitz 1988]. Это позволяет синхронизировать дрожжевые клетки путем переключения их в бедные питательными веществами среды, чтобы инициировать мейоз. Тогда клетки относительно равномерно завершите один раунд премейотической S-фазы, а затем продолжите мейоз. Прогресс через мейоз происходит быстро и завершение профазы I, включающей синапсис и рекомбинация происходит в течение 4 часов после переключения среды [Brar et al.2012]. Таким образом, собирая образцы в различные моменты времени, клетки можно наблюдать биохимически, молекулярно и цитологически через различные фазы мейотическая прогрессия.

На цитологическом уровне хромосомная динамика дрожжей во время мейоза может быть визуализируется с помощью различных методов, используемых в других системах, таких как FISH, иммунофлуоресценция и флуоресцентное маркирование хромосом [Straight et al. 1996]. Последний особенно привлекателен, так как позволяет проводить исследования in vivo в реальном времени. визуализация хромосомных взаимодействий во время мейоза без необходимости хромосомы подготовка или распространение.Хотя существует несколько способов создания хромосомы с меткой GFP, один популярной техникой является создание штамма, несущего несколько копий одного lac O последовательность. Эта последовательность может быть связана с Lac репрессор ( lac I), который в данном случае экспрессируется как слитый белок с GFP. Таким образом, вставляя последовательности lac O в определенный хромосомный сайт, можно отслеживать взаимодействие двух хромосомных участков (по одному на гомолог).Этот и аналогичные подходы широко использовались для изучения кинетики хромосомного спаривание во время мейоза и его генетические потребности [Brown et al. al. 2011; Ли и др. 2012].

Важно отметить, что молекулярные и клеточные события, лежащие в основе мейоза при почковании дрожжи эволюционно консервативны, что делает почкующиеся дрожжи подходящей моделью для исследования мейотической программы. Например, в то время как компоненты синаптонемного комплекса мало гомология первичной последовательности по типам, общая организация SC заметно аналогичный [Hawley 2011].Таким образом, как и другие такие виды, как Mus musculus , Drosophila и C. elegans, СК дрожжей состоит из двух боковых элементов, расположенных против осей гомологичных хромосом и центрального элемента, который соединяет эти два боковых элемента [Dobson et al. 1994; Линн и другие. 2002]. Роль SC и его регуляция также хорошо сохранены. В самом деле, как и у млекопитающих, правильная сборка SC вдоль хромосомных осей зависит от создания двухцепочечных разрывов, о чем свидетельствует отсутствие надлежащего SC в spo-11 мутантный фон [Giroux et al.1989; Bhuiyan and Schmekel 2004]. За структурная консервация SC, путь рекомбинации также показывает замечательные эволюционное сохранение. Как указано в Youds and Boulton [Youds and Boulton 2011], большое количество генов вовлечено в различные аспекты мейотическая рекомбинация, такая как образование двухцепочечного разрыва, резекция, перекрестное образование и разрешающая способность и антикроссинговая активность высококонсервативны между дрожжами, C. elegans , Drosophila и позвоночных, включая млекопитающих.Ближайший универсальная зависимость от одного и того же набора факторов, направляющая гомологичную рекомбинацию, следовательно позволяет изучать эти процессы под воздействием пагубных воздействий такие как мутации или химическое воздействие.

Консервация в аппарате репарации ДНК у дрожжей была использована для разработать новые методы оценки химической токсичности. Например, Шистль и его коллеги. разработали тест задержки, в котором используется способность штамма дрожжей, который не растет при минимальных затратах. среды, чтобы вернуться к генетическому состоянию, в котором они могут расти (положительный отбор) [Schiestl 1989; Бреннан и Schiestl 2004].Del-анализ основан на штамме, содержащем две копии Ген HIS3, который был частично удален, один на 5 ’конце гена и один на 3 ’конец гена. Разделение этих двух частично удаленных генов HIS3 является промежуточная последовательность ДНК. Когда штамм подвергается воздействию мутагенов, канцерогенов или clastogens, создается большое количество разрывов, которые при попытке исправить разрыв рекомбинации, приводит к удалению промежуточной последовательности и воссозданию функциональный ген HIS3, позволяющий дрожжам расти на средах с дефицитом гистина [Brennan and Schiestl 2004].Этот анализ адаптирован для высокопроизводительного грохочения, а также использовался для проведения химических грохотов для дифференциальная чувствительность к радиации [Hafer et al. 2010]. Таким образом, этот экран имеет возможность определять химические вещества, которые мешают консервативные пути репарации ДНК. Хотя вышеупомянутое исследование не рассматривало модуляция репарации ДНК в контексте мейоза, это ясно подчеркивает потенциал эта модель для быстрого и надежного исследования двух важнейших процессов зародышевой клетки дифференциация: образование и поддержание SC и гомологичная рекомбинация.

Муха

Drosophila melanogaster

Drosophila — одна из канонических моделей современной генетики и фундаментальные открытия, связанные с его использованием, пролили свет на наше понимание многие области, включая геномику, передачу сигналов, формирование эмбрионального паттерна и биологию рака [Рубин и Льюис 2000]. Преимущества системы короткое время генерации около 10 дней, низкая стоимость выращивания и содержания, а также большая коллекция генетических мутантов, репортерных штаммов и методов, которые могут быть применены к изучение развития половых клеток и токсичности [Ashburner et al. al.2005].

Формирование зародышевой линии у Drosophila начинается рано во время эмбриогенез путем преждевременной клеточности части цитоплазмы, получившей название полюс плазмы на заднем конце синцитиального эмбриона [Williamson and Lehmann 1996]. Полюсная плазма содержит множество факторов, мРНК и белок, которые важны для организации плазмы функционального полюса, которая генерирует половые клетки [Williamson and Lehmann 1996]. Такие хорошо охарактеризованные факторы, как vasa и nanos (гомологи человеческих генов VASA и NANOS1 соответственно), эволюционно консервативны, а также функционируют в производстве ранних зародышевых клеток млекопитающих [Fujiwara et al.1994; Субраманиам и Сейду, 1999; Castrillon et al. 2000; Ярузельская и др. 2003]. Это Удивительно, поскольку зародышевые клетки у млекопитающих и у мух возникают по-разному: они индуцируются у мышей и предопределены в Drosophila (а также in C. elegans ) [Lesch and Page 2012]. Тем не менее, мышиные мутанты по гомологу vasa мыши (Mvh) обнаруживают задержку и гибель PGC на стадии зиготены [Tanaka et al. 2000], тогда как мутанты Nanos2 не могут полностью войти в мейоз [Suzuki et al.2007]. После образования полюса / половых клеток, эти клетки интернализуются во время гаструляции, а затем активно мигрируют через несколько слои тканей, чтобы достичь задней мезодермы, где, окруженные мезодермальными клетками, половые клетки образуют эмбриональную гонаду, а затем яичник (см. обзор [Williamson and Lehmann 1996]).

Взрослая самка мухи содержит два яичника, каждый из которых попадает в яйцевод, который со временем сливается в общий яйцевод. Каждый яичник состоит из 16 овариол, которые напоминают бусины на нитке.Яичники представляют собой цепочку яичных камер на разных стадиях развития. развитию, которому предшествует зародышевый слой на самом переднем конце, где стволовые клетки зародышевой линии проживать. Внутри каждой яичной камеры комплекс из 16 половых клеток формирует кластер клеток. соединены между собой цитоплазматическими мостиками (см. обзор [Williamson and Lehmann 1996]). Одна из этих ячеек, самая большая количество цитоплазматических соединений, дифференцируется в ооцит, в то время как остальные становятся полиплоид и берут на себя роль медсестры. Клетки-медсестры предоставляют мРНК, белки и питательные вещества для ооцит через цитоплазматический поток.В конце концов, камеры медсестры опустошают все свое содержимое. в ооциты и исчезают в результате апоптоза, оставляя один ооцит окруженным клетками фолликула которые также обеспечивают поддержку и факторы, управляющие формированием паттерна ооцитов [Rongo and Lehmann 1996]. Накладывается на дифференциацию ооцит, также протекает мейоз. Мейоз инициируется в гермарии и прогрессирует по мере его развития. ооцит движется вниз по яичнику. Следовательно, ооциты на разных стадиях мейоза могут быть идентифицированы по длине овариолы.Например, половые клетки на стадии зиготены обнаружены в гермарии и камерах для яиц на стадии 1, в то время как клетки пахитена находятся в яичные камеры стадии 5 [Davring and Sunner 1973]. Этот значительно облегчает изучение мейотической прогрессии, так как яичники могут быть рассечены и окрашивают на мРНК или представляющие интерес белки, выявляя кинетику экспрессии этих факторы при мейозе.

Хотя по внешнему виду формирование зародышевой линии и дифференцировка зародышевых клеток отличаются от у млекопитающих существует высокий уровень эволюционной консервации процессов половых клеток между видами.Во-первых, как описано выше, для образование зародышевых клеток у Drosophila , а также необходимы для правильного зародыша функция клеток у млекопитающих. Во-вторых, также сохраняется эпигенетический контроль половых клеток. А общей чертой раннего развития зародышевых клеток является установление общей транскрипционно неактивное состояние, при котором соматические гены репрессируются [Seydoux and Braun 2006]. Частично это достигается за счет создания репрессивное состояние хроматина, где добавляются репрессивные метки, такие как h4K9me3 и h4K27me3 и активные метки, такие как гистон h4K4me2, удаляются [Rangan и другие.2011]. Установление и поддержание этих знаков особенно важно. важно в C. elegans и Drosophila , поскольку они не выполняют или полагаются на метилирование ДНК для достижения репрессивного состояния зародышевых клеток [Regev et al. 1998]. Наконец, как описано в предыдущем секции, наблюдается высокая степень сохранности ключевых мейотических процессов, в том числе сестринских слипание хроматид, сборка и регуляция SC и гомологичная рекомбинация. Фактически, один из небольшое различие между моделями, по-видимому, является требованием рекомбинации для правильного SC. сборка: дрожжи и млекопитающие требуют рекомбинации для успешной сборки SC, в то время как Drosophila и C.elegans нет (обзор [McKim et al. 2002]). Интересно, что половые клетки самцы мух не подвергаются рекомбинации во время мейоза; Таким образом, изучение консервативных мейотические события ограничиваются самками мух.

Drosophila — историческая модель для обнаружения индуцированных мутации в половых клетках с момента характеристики мутагенности половых клеток рентгеновскими лучами Мюллером в конце 1920-х [Мюллер 1930]. В всестороннее применение этого анализа для скрининга химических веществ на мутагенность было позже сообщалось в 1980-х годах [Lee et al.1983]. Первичный тест, названный рецессивным летальным тестом, связанным с полом, использует преимущества некоторых особенностей генетики у мух: наличие балансирующих хромосом, использование распространенные нелетальные маркерные мутации, такие как белые глаза и глаза в форме полос, чтобы отмечать и следовать балансирующая хромосома и быстрое время генерации, которое позволяет тесту запускать более двух поколения. Вкратце, самцы мух XY WT сначала подвергаются действию представляющего интерес химического вещества. В затем подвергшихся воздействию самцов спаривают с самками мух ХХ, гомозиготными по белому и белому цвету. полосчатые глаза — рецессивные мутации.Поколению F1 разрешено скрещиваться для создания популяция F2. В нормальной ситуации популяция F2 состоит из самцов XY с красным круглые глаза и белые полосковые глаза и самки с красными и белыми полосатыми глазами. В то время как мутации происходят на всех хромосомах, мутации в основных генах на Х-хромосоме особенно невыгоден мужчинам, поскольку у них нет второй Х-хромосомы (гемизиготность). В контексте летального теста, связанного с полом, мутировавшие Х-хромосомы являются в F2 в их гемизиготном состоянии обнаруживаются только у самцов с круглыми и красными глазами.Следовательно, подсчитав долю мужчин в F2 с красными / круглыми глазами по сравнению с белыми / полосатыми глазами, Мутагенность соединений на зародышевые клетки может быть определена количественно [Adler и другие. 1985]. Сравнение с другими моделями показало, что тест очень высок. специфичен, но, к сожалению, не так чувствителен по сравнению с другими моделями мутагенности [Foureman et al. 1994]. Испытание с тех пор упало не в пользу, вытеснен использованием модели Muta ™ Mouse для мутации зародышевых клеток [Myhr 1991; Tinwell и другие. 1997]. Однако использование мыши Muta ™ Mouse не позволяет тестирование химических веществ на крупномасштабной платформе и имеет те же ограничения, что и в модели млекопитающих в естественных условиях.Следовательно, произошло возрождение Drosophila . модель, которая позволяет как комплексное, так и крупномасштабное исследование изменения рекомбинации частоты после воздействия или других воздействий на половые клетки, такие как хромосомы ошибки сегрегации или эпигенетические изменения [Szabad et al. 2012].

Нематода

Caenorhabditis elegans

C. elegans предлагает несколько преимуществ для изучения половых клеток. которые закреплены в биологии организма.Во-первых, C. elegans имеет короткий жизненный цикл (~ 4 дня при 20 ° C), что способствует не только поддержание червей, а также изучение фертильности и влияния нескольких поколений [Бреннер 1974]. Во-вторых, нематода содержит большое количество, несколько сотен, половых клеток, составляющих около 50% всех клеток в взрослый червь. Кроме того, черви прозрачные, что значительно облегчает наблюдение за ядрами и хромосомами интактных зародышевых клеток, поскольку они дифференцируются без необходимость сложной подготовки или вскрытия.Наконец, C. elegans отображает пространственно-временной градиент мейотической дифференцировки [Zetka and Rose 1995]. Это означает, что по мере продвижения ядер зародышевой линии по длине удлиненные гонады, они одновременно проходят разные стадии мейоза. Это контрастирует с зародышевыми клетками млекопитающих, где зародышевые клетки остаются на месте в эмбриональные гонады при прогрессировании мейоза. У нематоды это приводит к цепочечное сопоставление половых клеток на всех стадиях мейоза.В сочетании с прозрачность организма, эта функция позволяет наблюдать за морфологией и хромосомная динамика ядер зародышевой линии кинетическим образом [Zetka and Rose 1995; Зетка 2009].

В нескольких исследованиях были применены эти особенности C. elegans . изучить влияние химического воздействия на процесс дифференцировки половых клеток. В В одном исследовании было протестировано действие бисфенола А (BPA), известного разрушителя мейоза у млекопитающих. in C. elegans [Allard and Colaiacovo 2010; Аллард, Колайаково, 2011].У мышей Воздействие BPA у взрослых приводит к отказу от конгресса или неправильному выравниванию хромосом. на метафазной пластинке во время мейоза [Hunt et al. 2003]. In utero воздействие BPA, с другой стороны, привело к образование анеуплоидных ооцитов и эмбрионов, вероятно, происходящих из измененных синапсов и рекомбинация во время профазы I [Susiarjo et al. 2007]. Таким образом, C. elegans использовался не только для проверки того, Модель нематод воспроизводит особенности воздействия бисфенола А на зародышевые клетки млекопитающих, но также чтобы предоставить некоторую механистическую информацию о его влиянии на мейотический аппарат [Allard and Colaiacovo 2010].Воздействие BPA привело к наличие мейотических аберраций у нематод, напоминающих фенотипы мыши включая гомологичный синапс и дефекты сегрегации хромосом. При вступлении в мейоз казался нормальным, кинетика прогрессии через рекомбинацию казалась измененной, как доказательством этого является отсроченное удаление маркера инвазии цепи RAD-51 и активация Машины контрольно-пропускных пунктов ремонта ДНК. Эти наблюдения предлагают модель, в которой BPA ухудшает оборот двухцепочечных разрывов и репарация посредством гомологичной рекомбинации.Эта учеба Таким образом подчеркивается преимущество использования генетически и цитологически поддающейся лечению модели. для быстрого анализа влияния химического воздействия на дифференцировку половых клеток.

В другом исследовании использовались преимущества как небольшого размера червя, так и генетические инструменты, которые уже существуют для изучения функции зародышевой линии [Allard et al. 2013]. Целью исследования было разработать тест, который может точно обнаруживать хромосомные аномалии после химического воздействия. Объединив зеленый флуоресцентный репортерный анализ для представления событий анеуплоидии с высокой пропускной способностью методологий, большое количество химических веществ может быть проверено на их способность генерировать эмбриональная анеуплоидия.Группы из 100–200 червей подвергались воздействию 50 химических веществ в каждой. 100 мкМ в течение 24 часов и 65 часов в многолуночных планшетах в трех экземплярах. В оба раза указывает на ряд явных положительных результатов, которые были легко идентифицированы по экспрессии GFP в эмбрионах визуализируется флуоресцентной микроскопией. Последующие исследования подтвердили наличие анеуплоидии. а также исследовали, возникли ли эти дефекты из-за нарушения мейотической программы. а не от эмбриональных митозов. Важно отметить, что анализ имеет отношение к моделям млекопитающих. как сравнение данных нематод с конечными точками репродуктивной токсичности для этих 50 химикаты из ToxRef dabatase Агентства по охране окружающей среды США выявили Соответствие 69% (сбалансированная точность).Следовательно, это C. elegans анализ обеспечивает быструю стратегию для первоначальной оценки химического воздействия на зародышевую линию функция. Такой анализ может сопровождаться целевым механистическим анализом некоторых из соединения, идентифицированные на экране, как выделено в недавней публикации, описывающей мейотические пути, измененные несколькими попаданиями на экран анеуплоидии, в том числе пестициды Манеб, Диазинон и Фенаримол [Parodi et al. 2015].

Таким образом, C. elegans предлагает явные преимущества для изучения функция половых клеток, включая возможность наблюдать неизменную хромосомную динамику, а также кинетика мейотической прогрессии.Кроме того, генетическая податливость модели облегчает разработку инструментов скрининга для оценки химического воздействия на микроб клетки. Некоторые предостережения модели включают эволюционное расстояние между червями и млекопитающих, что неизбежно приводит к различиям в некоторых аспектах мейоза. Например, в C. elegans , а также Drosophila , синапс в основном не зависит от рекомбинации, но зависит от активности SPO-11 в других моделях включая мышей [Dernburg et al.1998]. Следовательно, это важно исследовать эволюционно консервативные процессы и дополнить C. elegans механистический или крупномасштабный анализ с последующим наблюдением на млекопитающих, который в настоящее время стало проще благодаря недавним разработкам в системах культивирования зародышевых клеток in vitro (см. ниже).

Половые клетки млекопитающих in vitro: потенциал для новых применений токсичности

Благодаря недавним достижениям в биологии стволовых клеток и зародышевых клеток, несколько групп установленные методы in vitro дифференциации клеток зародышевой линии из эмбрионального ствола клетки (ЭСК) [Hayashi and Saitou 2014; Магнусдоттир и Сурани 2014].Эти методы сильно зависят от на наше понимание эмбриональных сигналов, которые приводят к спецификации PGC и дифференциации и стремиться воспроизвести эмбриональную среду в контексте in vitro. Например, культивируемые ЭСК необходимо сначала последовательно дифференцировать на эпибластоподобные. клетки (EpiLCs) комбинацией лигандов активина и BMP с последующим добавлением BMP4 / 8b, Фактор стволовых клеток (SCF) и EGF еще несколько дней. Примечательно, что в результате полученный PGC-подобный генерируемые клетки экспрессируют маркеры возникающих PGC, таких как Blimp-1 и Prdm-14.В качестве общее количество таких клеток остается низким в смешанной агрегированной популяции, это метод культивирования сочетается с инструментами репортера, такими как линии ESC, называемые BVSC, которые расшифровывается как Blimp1-Venus и Флуоресцентный белок Stella-Cyan (CFP) [Hayashi et al. 2012; Хаяши и Сайто, 2013]. Таким образом, путем сортировки ячеек по их положительному статусу для Венеры и CFP можно быстро и легко идентифицировать и изолировать клетки, у которых есть характеристики первичных половых клеток. Эти клетки называются Изначальная зародышевая клетка Подобные клетки (PGCLC).

Помимо экспрессии маркеров, PGCLC также воспроизводят события, происходящие в зародыше. клетки на ранних стадиях развития [Hayashi et al. 2011]. Например, динамические изменения метилирования и ацетилирования гистонов, и Метилирование ДНК наблюдают в формирующейся популяции PGCLC in vitro. Гистон h4K9 моно и метки диметилирования и ацетилирование гистонов обнаруживаются на низких уровнях на хроматине PGCLC. на всех стадиях дифференцировки, в то время как метилирование h4K27 обогащается первыми четырьмя дни культуры [Nakaki et al.2013]. Метилирование ДНК обнаруживается в ДНК PGCLC на 1 день, а затем быстро теряется из большей части хроматина между 2-4 днями дифференцировки с небольшими дискретными участками генома сохраняя метилирование [Vincent et al. 2011; Hayashi et al. 2012; Хаяши и Сайто 2013; Leitch et al. 2013; Винсент и др. 2013]. Таким образом, этот метод позволяет изучать эпигенетические изменения, происходящие в половых клетках на их ранних стадиях. стадии дифференциации. Хаяши и его коллеги продемонстрировали, что PGCLC могут быть продвигается дальше по пути дифференцировки in vitro [Hayashi et al.2012]. Путем комбинирования PGCLC с соматическими клетками самки E12.5 гонады, образованные агрегаты показывают присутствие половых клеток, которые инициировали мейотический запрограммировать и отобразить свидетельство синапсиса, эквивалентное E15.5 PGCs. Следующий при трансплантации в яичник хозяина эти агрегаты дают живое потомство, что указывает на что PGCLC представляют собой жизнеспособную клеточную популяцию, способную полностью воспроизводить мейотическая программа, оплодотворение и раннее развитие [Hayashi et al. 2012].

Эти подходы к созданию зародышевых клеток млекопитающих in vitro еще не применяться для испытаний на токсичность.Кроме того, выход клеток, образующихся при производстве половых клеток млекопитающих in vitro все еще остается низким, особенно если необходимы мейотические половые клетки [Винсент и др. 2011]. Таким образом, вышеупомянутые методы должны быть доработаны, если они будут применяться для проверки химических веществ. Тем не мение, ясно, что создание зародышевых клеток млекопитающих in vitro демонстрирует большой потенциал для исследование токсичности зародышевых клеток, в соответствии с увеличением использования анализов на основе ES-клеток в тестирование на токсичность [Hong and Jeung 2013].

Внедрение достижений вычислительной токсикологии

Каждая описанная выше модель демонстрирует как сильные, так и слабые стороны присущие его биологии и используемой модельной системе (). Например, в то время как все стадии профазы I можно легко изучить в C. elegans и включенных в крупномасштабные анализы, эволюционное расхождение этого Модель от млекопитающих требует вторичной проверки на млекопитающем. Наоборот, модели млекопитающих in vitro демонстрируют большую актуальность, но все еще в основном ограничиваются изучением премейотические половые клетки и, таким образом, наиболее подходят для исследования эпигенетических ремоделирование.Следовательно, существует необходимость в скоординированном тестировании химических веществ в разных регионах. несколько модельных систем.

Удивительно, но в настоящее время нет опубликованных работ, в которых используются несколько системы генетических моделей (например, дрожжи, Drosophila и C. elegans в сочетании), чтобы изучить их предсказуемость в отношении зародышевых клеток млекопитающих. токсичность. В идеальном сценарии список соединений с четко определенными зародышевыми клетками млекопитающих токсичность, положительная или отрицательная, будет проверяться во всех описанных модельных системах. выше.Данные, полученные в этих моделях, затем будут сравниваться с данными по млекопитающим и будет установлено количество истинных и ложных положительных и отрицательных результатов в каждой модели. А Ограничением этого сценария является необходимость тестирования большого количества химикатов для получения статистическая мощность. Однако, хотя есть опубликованные данные о зародышевых клетках млекопитающих токсиканты [Hales and Robaire 2001], в качестве области исследования мы далеки от того, чтобы составить исчерпывающий список химических веществ с очевидной зародышевой линией токсичен или явно лишен такой активности.Одна из возможностей обойти это предостережение — использовать базу данных ToxRef Агентства по охране окружающей среды США, которая собирает большой набор данных о конечных точках in vivo, включая многопоколенческие и репродуктивные конечные точки [Martin et al. 2009; Knudsen et al. 2013]. Хотя ToxRef не токсичен для зародышевых клеток конечные точки, он включает конечные точки, которые могут использоваться в качестве прокси (например, морфология яичников дефекты или снижение фертильности). Сравнение с базой данных ToxRef использовалось для рассчитать предсказуемость вышеупомянутого C.elegans анеуплоидия тест на репродуктивную токсичность крыс. Хотя сравниваемые конечные точки различны, они тем не менее механически связаны, поскольку дисфункция зародышевой линии приводит к усилению анеуплоидии и снижение фертильности [Hassold and Hunt 2001; Хант и Хассольд 2008].

Как прогностическая ценность половых клеток млекопитающих или конечных точек репродуктивной токсичности вероятно, будет различаться между моделями, идея исследования предсказуемости моделей в сочетание особенно привлекательно.Следовательно, надежная статистическая модель, охватывающая Следует установить несколько альтернативных организмов и подходов. Чтобы построить такую модель, мы предлагаем подход, аналогичный описанному выше. Небольшое количество химикатов следует выбираться из базы данных Toxref и тестироваться на каждом модельном организме, уделяя в первую очередь хромосомные ошибки, которые легче всего проверить во всех описанных выше моделях. В прогностическая ценность каждой модели должна рассчитываться независимо от репродуктивной конечные точки токсичности, содержащиеся в базе данных Toxref, включая снижение фертильности, помет размер и общая репродуктивная способность.После этого различные комбинации моделей должны использоваться, и их комбинированная прогностическая ценность в отношении конечных точек для млекопитающих будет рассчитано. Для такого анализа используется интерсекциональный подход (во всех отношениях положительный модели) или дополнительный подход (все соединения положительны по крайней мере в одной модели) должны оба быть на рассмотрении. Следует также включить взвешенный анализ, при котором одна модельная система может имеют больший вес для анализа прогнозируемости, чем другие, в зависимости от конечной точки. Вместе эта работа позволит установить минимальное количество (или самых простых / наименее дорогих) тестов. это необходимо будет выполнить для достижения максимальной предсказуемости в отношении млекопитающих. репродуктивные конечные точки.

Наконец, подходы компьютерной токсикологии имеют решающее значение для интерпретации множество данных геномики, которые могут быть получены в каждой модели. Хотя этот обзор в основном сосредоточены на фенотипических анализах, достижениях в области геномики и эпигеномики означают что мы можем соотнести мощные фенотипические индикаторы с анализом всего генома для выявление корня фенотипов. Этому особенно способствует использование модельные организмы, обсуждаемые в этом обзоре, поскольку они изогены.Таким образом, при невысокой стоимости, охват и скорость мутаций секвенирования экзома или всего генома можно легко определить. У людей текущий проект 1000 геномов выявил 38 миллионов одиночных нуклеотидов. полиморфизмы среди 1092 культурно разнородных индивидуумов [Genomes Project et al. 2012]. Такие полногеномные подходы с высоким разрешением имеют также использовались для изучения 78 троек исландских семей для оценки скорости и типы мутаций зародышевой линии de novo . Частота мутаций оценивалась как 1.20 × 10 ⁻⁸ на нуклеотид на поколение с резким обогащением переходных мутаций и внутри сайтов CpG и значительный эффект от отцовского возраста [Kong et al. 2012]. Используя аналогичную стратегию В предлагаемых нами моделях половых клеток возникает токсикологическая дихотомия: не только целые данные секвенирования генома выявляют мутации, вызванные химическим воздействием, а также могут потенциально идентифицировать генетические различия между моделями, которые приводят к уникальной чувствительности или устойчивость к воздействию (фактор, который следует учитывать с нашей предлагаемой взвешенной предсказуемостью) подход).Таким образом, генетическая однородность этих моделей может использоваться как сила, когда в сочетании с методами полногеномного секвенирования и секвенирования нового поколения. Точно так же крупномасштабные анализ негеномных эффектов, таких как воздействие окружающей среды на метилом, может быть быстро выполняются в этих моделях. Например, иммунопреципитация метилированной ДНК-следующая секвенирование поколений (MeDIP-seq) недавно было использовано для определения эпигенетических изменений в легкое после воздействия раздражителей [Cheng et al. 2014]. Подобный анализ MeDIP-seq был бы особенно полезен в зародышевых клетках. исследования токсичности с целью прогнозирования межпоколенческих изменений.

Следствием сбора огромного количества геномной информации является необходимость анализировать эти большие наборы данных и интерпретировать их в токсикологическом контексте. Сделать это, различные вычислительные модели разрабатываются для прогнозирования биологических реакций на основе данные микрочипов [Thomas et al. 2013]. Например, в для анализа токсикогеномных данных из базы данных TG-GATEs в биологически релевантной Кстати, Нагата и его коллеги использовали алгоритм классификации на основе ассоциации (CBA).Разработанный авторами классификатор CBA был использован для успешного прогнозирования специфические соединения увеличивали вес печени у крыс после 14-дневного периода лечения. Кроме того, анализ путей для наборов генов, выбранных квалификатором, выявил три отдельные кластеры генов, связанные с увеличением веса печени: метаболизм лекарств, гистидин пути деградации и глюконеогенеза [Nagata et al. 2014]. Применение таких подходов к изучению токсичности половых клеток могло бы открывают огромные возможности.Подобные методы позволили бы исследователям идентифицировать ген сигнатуры нарушенных путей, которые приводят к интересующим конечным точкам, таким как анеуплоидия. В заключение, сочетая актуальные, рентабельные и альтернативные модели с высокой пропускной способностью с помощью перспективных, чувствительных методов, прогностическая ценность тестов токсичности зародышевых клеток увидит большой скачок вперед.

Резюме и перспективы

Хотя некоторые из описанных выше моделей еще не применимы к вопросу токсичность для зародышевых клеток, их использование было бы очень полезно для этой области.Действительно, эти модели позволяют (1) исследовать стадии развития зародышевых клеток, которые недоступны в млекопитающие (особенно раннее развитие женской зародышевой линии), (2) исследование токсичность зародышевых клеток на крупномасштабной высокопроизводительной платформе и (3) простой механистический вскрытие измененных процессов, которые эволюционно законсервированы. В настоящее время международные стандарты основаны на методах старения для проверки токсичности зародышевых клеток, несмотря на разработку более передовые технологии и мощные альтернативные модели.По мере развития поля более чувствительный анализы и конечные точки на токсичность зародышевых клеток должны быть реализованы в соответствии с рекомендациями Тестирование на токсичность в парадигме 21 века [Национальная Исследовательский совет 2007]. Вопросы дозировки и актуальности являются неотъемлемой частью использования модели. системы и не обязательно умаляют выгоды от использования того, что эти модели предлагают. По мере развития области тщательный сравнительный анализ этих моделей необходимо будет выполнить, чтобы прочно утвердить эти модельные системы в качестве полезных зародышей. инструменты клеточной токсичности.

Благодарности

D.W.F. поддерживается грантом на обучение NIH T32 ES015457. П.А. исследование поддержано грантом NIH ES020353 и финансированием Центра Джонса Хопкинса. к альтернативам исследованиям на животных (CAAT).

Сноски

Взносы

D.F. и П.А. исследовал и написал рукопись.

Конфликт интересов

Конфликт интересов, о котором следует заявлять, отсутствует.

Ссылка

Adler ID, Cole J, Danford N, Ehling U, Parry M, Roderick R, Venitt S, Vogel W., Waters R.Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных веществ химикаты. 1985 [Google Scholar]
Allard P, Colaiacovo MP. Бисфенол А ухудшает работу механизма восстановления двунитевых разрывов в зародышевой линии и вызывает хромосомные аномалии. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2010; 107 (47): 20405–204 10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Allard P, Colaiacovo MP. Механическое понимание действия бисфенола А на зародышевую линию с использованием C. elegans. Клеточный цикл. 2011; 10 (2): 183–184.[PubMed] [Google Scholar]
Allard P, Kleinstreuer NC, Knudsen TB, Colaiacovo MP. Платформа для быстрой оценки химического разрушения Функция зародышевой линии. Перспектива здоровья окружающей среды. 2013 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Andersen SL, Sekelsky J. Мейотическая рекомбинация против митотической рекомбинации: два разных пути для репарация двухцепочечных разрывов: различные функции репарации мейотических и митотических DSB отражаются в использовании разных путей и разных исходах.Биологические исследования. 2010. 32 (12): 1058–1066. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Ashburner M, Golic KG, Hawley RS. Дрозофила: лабораторный справочник. 2-е издание. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор; 2005. с. 1409. xxviii. [Google Scholar]
Эшвуд-Смит MJ, Edwards RG. Ремонт ДНК ооцитами. Мол Хум Репрод. 1996. 2 (1): 46–51. [PubMed] [Google Scholar]
Bhuiyan H, Schmekel K. Синапс мейотических хромосом в дрожжах может происходить без Spo11-индуцированной ДНК двухниточные разрывы.Генетика. 2004. 168 (2): 775–783. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Брар Г.А., Яссур М., Фридман Н., Регев А., Инголия Н.Т., Вайсман Дж. С.. Вид в высоком разрешении мейотической программы дрожжей, выявленной рибосомой профилирование. Наука. 2012. 335 (6068): 552–557. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Brennan RJ, Schiestl RH. Обнаружение канцерогенов с помощью теста DEL для дрожжей. Методы Мол биол. 2004. 262: 111–124. [PubMed] [Google Scholar]
Бреннер С. Генетика Caenorhabditis elegans.Генетика. 1974. 77 (1): 71–94. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Brown MS, Zanders S, Alani E. Устойчивые и быстрые хромосомные движения имеют решающее значение для хромосом Спаривание и мейотическая прогрессия у бутонизированных дрожжей. Генетика. 2011; 188 (1): U21 – U47. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Castrillon DH, Quade BJ, Wang TY, Quigley C, Crum CP. Ген VASA человека специфически экспрессируется в зародышевой клетке. происхождение. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97 (17): 9585–9590. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Cheng RY, Shang Y, Limjunyawong N, Dao T, Das S, Rabold R, Sham JS, Mitzner W, Tang WY.Изменения метилома легких в дыхательных путях, вызывающих аллергию гиперчувствительность. Environ Mol Mutagen. 2014; 55 (3): 244–255. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Chiquoine AD. Идентификация, происхождение и миграция первичных половых клеток в эмбрион мыши. Анат Рек. 1954. 118 (2): 135–146. [PubMed] [Google Scholar]
Дэринг Л., Саннер М. Женский мейоз и эмбриональный митоз у Drosophila melanogaster. I. Мейоз и оплодотворение. Наследие. 1973; 73 (1): 51–64. [PubMed] [Google Scholar]
Dernburg AF, McDonald K, Moulder G, Barstead R, Dresser M, Villeneuve AM.Мейотическая рекомбинация у C. elegans инициируется консервативным механизмом и незаменим для гомологичных синапсов хромосом. Клетка. 1998. 94 (3): 387–398. [PubMed] [Google Scholar]
Добсон М.Дж., Перлман Р.Э., Караискакис А., Спиропулос Б., Моэнс ПБ. Синаптонемные комплексные белки — возникновение, картирование эпитопа и хромосома Дизъюнкция. J Cell Sci. 1994; 107: 2749–2760. [PubMed] [Google Scholar]
Эпштейн СС. Использование доминантно-летального теста для выявления генетической активности окружающей среды. химикаты.Перспектива здоровья окружающей среды. 1973; 6: 23–26. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Feng CW, Bowles J, Koopman P. Контроль входа зародышевых клеток млекопитающих в мейоз. Mol Cell Endocrinol. 2014. 382 (1): 488–497. [PubMed] [Google Scholar]
Фуреман П., Мейсон Дж. М., Валенсия Р., Циммеринг С. Тестирование химического мутагенеза у дрозофилы. X. Результаты 70 закодированных химические вещества протестированы для Национальной токсикологической программы. Environ Mol Mutagen. 1994. 23 (3): 208–227. [PubMed] [Google Scholar]
Fujiwara Y, Komiya T., Kawabata H, Sato M, Fujimoto H, Furusawa M, Noce T.Выделение гена белка семейства DEAD, кодирующего мышиный гомолог Drosophila vasa и ее специфическая экспрессия в клонах зародышевых клеток. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1994; 91 (25): 12258–12262. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Genomes Project C, Abecasis GR, Auton A, Brooks LD, DePristo MA, Durbin RM, Handsaker RE, Kang HM, Marth GT, McVean GA. Интегрированная карта генетических вариаций от 1092 человека геномы. Природа. 2012. 491 (7422): 56–65. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Giroux CN, Dresser ME, Tiano HF.Ген Spo11 необходим специально для хромосомного синапсиса во время Дрожжевой мейоз. Генетика. 1989; 122 (2): S35 – S35. [Google Scholar]
Hafer K, Rivina Y, Schiestl RH. Тест DEL для дрожжей обнаруживает защиту от радиационно-индуцированной цитотоксичности и генотоксичность: адаптация версии микротитровального планшета. Радиационные исследования. 2010. 174 (6): 719–726. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Hales BF, Robaire B. Review — Отцовское воздействие лекарств и химических веществ в окружающей среде: влияние на потомство исход.Дж. Андрол. 2001. 22 (6): 927–936. [PubMed] [Google Scholar]
Хассольд Т., Хант П. Ошибаться (мейотически) — это человек: происхождение человека анеуплоидия. Nat Rev Genet. 2001. 2 (4): 280–291. [PubMed] [Google Scholar]
Hawley RS. Решение головоломки Meiotic LEGO®: поперечные волокна и сборка синаптонемный комплекс у Caenorhabditis elegans. Генетика. 2011. 189 (2): 405–409. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Hayashi K, Ogushi S, Kurimoto K, Shimamoto S, Ohta H, Saitou M.Потомство от ооцитов, полученных из первичных зародышевых клеток in vitro. клетки у мышей. Наука. 2012. 338 (6109): 971–975. [PubMed] [Google Scholar]
Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K, Aramaki S, Saitou M. Восстановление пути спецификации зародышевых клеток мыши в культуре с помощью плюрипотентные стволовые клетки. Клетка. 2011. 146 (4): 519–532. [PubMed] [Google Scholar]
Hayashi K, Saitou M. Генерация яиц из эмбриональных стволовых клеток мыши и индуцированная плюрипотентность стволовые клетки. Nat Protoc. 2013. 8 (8): 1513–1524.[PubMed] [Google Scholar]
Хаяши К., Сайтоу М. Перспективы развития зародышевых клеток у млекопитающих in vitro. Anim Sci J. 2014; 85 (6): 617–626. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Herskowitz I. Жизненный цикл почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev.1988; 52 (4): 536–553. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Гейтинг К. Синаптонемные комплексы: структура и функции. Curr Opin Cell Biol. 1996. 8 (3): 389–396. [PubMed] [Google Scholar]
Hong EJ, Jeung EB.Оценка токсикантов развития с использованием ствола эмбриона человека Ячейки. Toxicol Res. 2013. 29 (4): 221–227. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Hunt PA, Hassold TJ. Женский мейоз человека: что делает плохое яйцо? Тенденции Genet. 2008. 24 (2): 86–93. [PubMed] [Google Scholar]
Hunt PA, Koehler KE, Susiarjo M, Hodges CA, Ilagan A, Voigt RC, Thomas S, Thomas BF, Hassold TJ. Воздействие бисфенола А вызывает мейотическую анеуплоидию у женщин. мышь. Curr Biol. 2003. 13 (7): 546–553.[PubMed] [Google Scholar]
Ярузельска Дж., Котецки М., Куш К., Спик А., Фирпо М., Рейо Пера Р.А. Сохранение комплекса Pumilio-Nanos из зародышевой плазмы дрозофилы в человека стволовые клетки. Dev Genes Evol. 2003. 213 (3): 120–126. [PubMed] [Google Scholar]
Klutstein M, Cooper JP. Спаривание хромосомного танца и гомолога в раннем мейоз. Curr Opin Cell Biol. 2014; 26: 123–131. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Knudsen T, Martin M, Chandler K, Kleinstreuer N, Judson R, Sipes N.Прогностические модели и вычислительная токсикология. Методы Мол биол. 2013; 947: 343–374. [PubMed] [Google Scholar]
Kong A, Frigge ML, Masson G, Besenbacher S, Sulem P, Magnusson G, Gudjonsson SA, Sigurdsson A, Jonasdottir A, Jonasdottir A, Wong WS, Sigurdsson G, Walters GB, Steinberg S , Helgason H, Thorleifsson G, Gudbjartsson DF, Helgason A, Magnusson OT, Thorsteinsdottir U, Stefansson K. Частота мутаций de novo и важность возраста отца для риск заболевания. Природа. 2012. 488 (7412): 471–475.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Koubova J, Menke DB, Zhou Q, Capel B, Griswold MD, Page DC. Ретиноевая кислота регулирует время инициации мейоза в зависимости от пола. мышей. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103 (8): 2474–2479. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Lee CY, Conrad MN, Dresser ME. Спаривание мейотических хромосом стимулируется теломерно-управляемыми хромосомными движениями Независимо от формирования букета. PLoS Genet. 2012; 8 (5) [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Lee WR, Abrahamson S, Valencia R, von Halle ES, Wurgler FE, Zimmering S.Связанный с полом рецессивный летальный тест на мутагенез у дрозофилы меланогастер. Отчет Агентства по охране окружающей среды США Gene-Tox Программа. Mutat Res. 1983; 123 (2): 183–279. [PubMed] [Google Scholar]
Leitch HG, Tang WW, Surani MA. Первичное развитие зародышевых клеток и эпигенетическое репрограммирование в млекопитающие. Curr Top Dev Biol. 2013; 104: 149–187. [PubMed] [Google Scholar]
Lesch BJ, Page DC. Генетика развития половых клеток. Nat Rev Genet. 2012. 13 (11): 781–794. [PubMed] [Google Scholar]
Лю Т., Хуанг Дж.Контроль качества гомологичной рекомбинации. Клеточные и молекулярные науки о жизни. 2014. 71 (19): 3779–3797. [PubMed] [Google Scholar]
Lynn A, Koehler KE, Judis L., Chan ER, Cherry JP, Schwartz S, Seftel A, Hunt PA, Hassold TJ. Ковариация длины синаптонемного комплекса и мейотического обмена у млекопитающих ставки. Наука. 2002. 296 (5576): 2222–2225. [PubMed] [Google Scholar]
Магнусдоттир Э., Сурани Массачусетс. Как сделать изначальную зародышевую клетку. Разработка. 2014. 141 (2): 245–252. [PubMed] [Google Scholar]
Мартин М.Т., Мендес Э., Корум Д.Г., Джадсон Р.С., Кавлок Р.Дж., Ротрофф Д.М., Дикс Д.Дж.Профилирование репродуктивной токсичности химических веществ из разных поколений исследования в справочной базе данных токсичности. Toxicol Sci. 2009. 110 (1): 181–190. [PubMed] [Google Scholar]
McKim KS, Jang JK, Manheim EA. Мейотическая рекомбинация и сегрегация хромосом у дрозофилы самки. Ежегодный обзор генетики. 2002; 36: 205–232. [PubMed] [Google Scholar]
Muller HJ. Типы видимых изменений, вызванных рентгеновскими лучами у дрозофилы. Журнал генетики. 1930; 22 (3): U299 – U297. [Google Scholar]
Myhr BC.Валидационные исследования с Muta Mouse: модель трансгенных мышей для обнаружения мутации in vivo. Environ Mol Mutagen. 1991. 18 (4): 308–315. [PubMed] [Google Scholar]
Nagata K, Washio T, Kawahara Y, Unamia A. Прогнозирование токсичности на основе токсикогеномных данных на основе правила ассоциации классов добыча полезных ископаемых. Отчеты токсикологии. 2014; 1: 1133–1142. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Nakaki F, Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K, Yabuta Y, Saitou M. Индукция судьбы зародышевых клеток мыши с помощью факторов транскрипции в пробирка.Природа. 2013. 501 (7466): 222–226. [PubMed] [Google Scholar]
Национальный исследовательский совет. Тестирование на токсичность в 21 веке: видение и стратегия. Пресса национальных академий; 2007. [Google Scholar]
Олсен А.К., Линдеман Б., Вигер Р., Дуале Н., Брунборг Г. Как мужские половые клетки справляются с повреждением ДНК? Toxicol Appl Pharmacol. 2005; 207 (2 доп.): 521–531. [PubMed] [Google Scholar]
Parodi DA, Sjarif J, Chen Y, Allard P. Репродуктивная токсичность и мейотическая дисфункция после воздействия пестициды Манеб, Диазинон и Фенаримол.Токсикологические исследования. 2015 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Pawlowski WP, Cande WZ. Координация событий профазы мейоза. Trends Cell Biol. 2005. 15 (12): 674–681. [PubMed] [Google Scholar]
Pereira CS, Juchniuk de Vozzi MS, Dos Santos SA, Vasconcelos MA, de Paz CC, Squire JA, Martelli L. Аномалии хромосомной сегрегации, вызванные курением, выявленные FISH анализ спермы. Mol Cytogenet. 2014; 7 (1): 58. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Рамос-Моралес П., Родригес-Арнаис Р.Генотоксичность двух соединений мышьяка в половых клетках и соматических клетках Drosophila melanogaster. Environ Mol Mutagen. 1995. 25 (4): 288–299. [PubMed] [Google Scholar]
Rangan P, Malone CD, Navarro C, Newbold SP, Hayes PS, Sachidanandam R, Hannon GJ, Lehmann R. Производство пиРНК требует образования гетерохроматина в Дрозофила. Curr Biol. 2011. 21 (16): 1373–1379. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Regev A, Lamb MJ, Jablonka E. Роль метилирования ДНК у беспозвоночных: регуляция развития или защита генома? Молекулярная биология и эволюция.1998. 15 (7): 880–891. [Google Scholar]
Roeder GS. Мейотические хромосомы: для танго нужны двое. Genes Dev. 1997. 11 (20): 2600–2621. [PubMed] [Google Scholar]
Романиенко П.Дж., Камерини-Отеро Р.Д. Клонирование, характеристика и локализация мыши и человека SPO11. Геномика. 1999. 61 (2): 156–169. [PubMed] [Google Scholar]
Романиенко П.Дж., Камерини-Отеро Р.Д. Ген Spo11 мыши необходим для мейотической хромосомы синапсис. Mol Cell. 2000. 6 (5): 975–987. [PubMed] [Google Scholar]
Ронго К., Леманн Р.Регулируемый синтез, транспорт и сборка зародыша дрозофилы плазма. Тенденции Genet. 1996. 12 (3): 102–109. [PubMed] [Google Scholar]
Рубин Г.М., Льюис Э.Б. Краткая история вклада дрозофилы в геном исследовать. Наука. 2000. 287 (5461): 2216–2218. [PubMed] [Google Scholar]
Scherthan H, Weich S, Schwegler H, Heyting C, Harle M, Cremer T. Движения центромер и теломер во время ранней профазы мейоза мыши и человек связаны с началом спаривания хромосом.J Cell Biol. 1996. 134 (5): 1109–1125. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Schiestl RH. Немутагенные канцерогены вызывают внутрихромосомную рекомбинацию в Дрожжи. Природа. 1989. 337 (6204): 285–288. [PubMed] [Google Scholar]
Сейду Г., Браун RE. Путь к тотипотенции: уроки половых клеток. Клетка. 2006; 127 (5): 891–904. [PubMed] [Google Scholar]
Ши К., Мартин Р.Х. Анеуплоидия в сперме человека: обзор частоты и распределения анеуплоидия, влияние возраста донора и факторов образа жизни.Cytogenet Cell Genet. 2000. 90 (3–4): 219–226. [PubMed] [Google Scholar]
Straight AF, Belmont AS, Robinett CC, Murray AW. GFP-тегирование хромосом почкующихся дрожжей показывает, что белок-белок взаимодействия могут опосредовать сцепление сестринских хроматид. Текущая биология. 1996. 6 (12): 1599–1608. [PubMed] [Google Scholar]
Subramaniam K, Seydoux G. nos-1 и nos-2, два гена, родственные nanos дрозофилы, регулируют первичный развитие и выживаемость половых клеток у Caenorhabditis elegans. Разработка.1999. 126 (21): 4861–4871. [PubMed] [Google Scholar]
Susiarjo M, Hassold TJ, Freeman E, Hunt PA. Воздействие бисфенола А в утробе матери нарушает ранний оогенез в мышь. PLoS Genet. 2007; 3 (1): e5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Susiarjo M, Rubio C, Hunt P. Анализ мейоза самок млекопитающих. Методы Мол биол. 2009; 558: 339–354. [PubMed] [Google Scholar]
Suzuki A, Tsuda M, Saga Y. Функциональная избыточность среди белков Nanos и особая роль Nanos2 во время развития мужских половых клеток.Разработка. 2007. 134 (1): 77–83. [PubMed] [Google Scholar]
Szabad J, Bellen HJ, Venken KJ. Анализ для обнаружения потери Y-хромосомы in vivo в крыловых дисках дрозофилы клетки. G3 (Bethesda) 2012; 2 (9): 1095–1102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Шибальский В. Мой путь к Ойвинду Винджу, отцу генетики дрожжей. Генетика. 2001. 158 (1): 1–6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Tanaka SS, Toyooka Y, Akasu R, Katoh-Fukui Y, Nakahara Y, Suzuki R, Yokoyama M, Noce T.Гомолог Drosophila Vasa мыши необходим для развития мужские половые клетки. Genes Dev. 2000. 14 (7): 841–853. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Tempest HG, Homa ST, Dalakiouridou M, Christopikou D, Wright D, Zhai XP, Griffin DK. Связь между мужским бесплодием и дисомией сперматозоидов: доказательства различия в уровнях дисомии среди людей и корреляция между конкретным семенем параметры и дисомия конкретных пар хромосом. Репрод Биол Эндокринол. 2004; 2: 82.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Thomas R, Thomas RS, Auerbach SS, Portier CJ. Биологические сети для прогнозирования химической гепатоканцерогенности с использованием данные об экспрессии генов от обработанных мышей и актуальность для человека и крысы разновидность. PLoS One. 2013; 8 (5): e63308. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Tinwell H, Lefevre P, Williams CV, Ashby J. Активность ENU, iPMS и MMS в половых клетках самцов мышей с использованием Muta Анализ трансгенных мутаций с положительным отбором на мышах.Mutat Res. 1997. 388 (2–3): 179–185. [PubMed] [Google Scholar]
Tzung KW, Goto R, Saju JM, Sreenivasan R, Saito T, Arai K, Yamaha E, Hossain MS, Calvert ME, Orban L. Раннее истощение первичных половых клеток у рыбок данио способствует развитию семенников формирование. Отчеты о стволовых клетках. 2015; 4 (1): 61–73. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Vincent JJ, Huang Y, Chen PY, Feng S, Calvopina JH, Nee K, Lee SA, Le T, Yoon AJ, Faull K, Fan G, Rao A, Якобсен С.Е., Пеллегрини М., Кларк А.Т. Этап-специфическая роль tet1 и tet2 в деметилировании ДНК у первобытных стволовые клетки.Стволовая клетка. 2013. 12 (4): 470–478. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Винсент Дж. Дж., Ли З, Ли С. А., Лю X, Эттер МО, Диас-Перес С. В., Тейлор С. К., Гкунтела С., Линдгрен А. Г., Кларк А. Т.. Анализ отдельных клеток облегчает стадирование Blimp1-зависимой первичной половые клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши. PLoS One. 2011; 6 (12): e28960. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Уильямсон А., Леманн Р. Развитие зародышевых клеток у дрозофилы. Annu Rev Cell Dev Biol. 1996; 12: 365–391.[PubMed] [Google Scholar]
Витт К.Л., Хьюз Л.А., Бурка Л.Т., МакФи А.Ф., Мэтьюз Дж. М., Блэк С. Л., Бишоп Дж. Б.. Результаты теста на микронуклеусы костного мозга мыши не позволяют предсказать зародышевые клетки мутагенность N-гидроксиметилакриламида у мышей с доминирующим летальным исходом. проба. Environ Mol Mutagen. 2003. 41 (2): 111–120. [PubMed] [Google Scholar]
Яук К.Л., Аардемаб М.Дж., ван Бентем Дж., Бишоп Дж. Б., Дирфилд К.Л., Демарини Д.М., Дуброва Ю.Е., Хонма М., Лупски Дж. Р., Маркетти Ф., Мейстрих М.Л., Пакьеротти Ф., Стюартл Дж., Уотерс Доктор медицины, Дуглас Г.Р.Подходы к идентификации мутагенов зародышевых клеток: отчет IWGT 2013 г. семинар по тестам на половые клетки. Мутационные исследования / Генетическая токсикология и мутагенез в окружающей среде. 2015 [PubMed] [Google Scholar]
Youds JL, Boulton SJ. Выбор в мейозе — определение факторов, влияющих на кроссовер или некроссовер образование. J Cell Sci. 2011; 124 (4): 501–513. [PubMed] [Google Scholar]
Зетка М. Спаривание, рекомбинация и сегрегация гомологов при Caenorhabditis elegans. Genome Dyn.2009; 5: 43–55. [PubMed] [Google Scholar]
Зетка М., Роуз А. Генетика мейоза у Caenorhabditis elegans. Тенденции Genet. 1995. 11 (1): 27–31. [PubMed] [Google Scholar]

Зародышевые клетки — обзор

Выделение и очистка зародышевых клеток (Bellvé, 1979 с изменениями)

Зародышевые клетки на разных стадиях сперматогенеза могут быть изолированы в зависимости от возраста животного, используемого для подготовка. Но особенно у млекопитающих сложно выращивать зародышевые клетки в культуре сами по себе, за исключением сперматогониальных стволовых клеток.Клетки Сертоли необходимы для структурной поддержки и паракринного контроля (например, с помощью тестостерона и ФСГ) половых клеток во время сперматогенеза. Поэтому клетки Сертоли часто используются в совместном культивировании с зародышевыми клетками для изучения стадий и регуляции сперматогенеза. Тем не менее, трудно достичь полного сперматогенеза в культуре клеток, но это можно сделать в культурах органов с использованием фрагментов семенников, как описано ниже в разделе Культура органов семенников.

Выделение фракций зародышевых клеток, по существу, происходит по тому же протоколу ферментативного расщепления, который используется для соматических клеток семенников.Первоначальный ферментативный гидролиз с трипсином или коллагеназой высвободит интерстициальные клетки и большинство перитубулярных клеток, которые останутся в супернатанте во время гравитационного осаждения и могут быть выброшены, в то время как фрагменты канальцев и кластеры клеток Сертоли / зародышевых клеток будут находиться в осадке. Дальнейшее ферментативное расщепление трипсином / ЭДТА и ДНКазой полностью диссоциирует семенные канальцы и высвободит клетки Сертоли и половые клетки.

Фракцию зародышевых клеток можно выделить разными способами. Пэннинг — это эффективный метод грубого отделения половых клеток от клеток Сертоли, основанный на том факте, что клетки Сертоли будут прилипать к культуральной пластине, а половые клетки — нет.Таким образом, после посева и 2–3-дневной инкубации половые клетки можно удалить с верхней части чашки, оставив клетки Сертоли. Затем зародышевые клетки могут быть дополнительно очищены на основе их плотности с использованием градиента, сделанного с BSA (бычьим сывороточным альбумином) или перколлом. Другой подход заключается в удалении кластеров клеток Сертоли с помощью сетчатого фильтра, в результате чего в фильтрате образуется одна фракция зародышевых клеток. Опять же, эта фракция может быть дополнительно очищена с использованием градиента.

Иногда необходимо выделить половые клетки на определенной стадии развития, и это можно сделать с помощью Sta-put (Romrell et al., 1976; McCarrey et al., 1992), который представляет собой сепаратор ячеек для скоростного осаждения, позволяющий изолировать фракции клеток на основе их различий в скорости осаждения под действием силы тяжести. Зародышевые клетки на разных стадиях развития имеют разную скорость оседания.

Клеточная культура зародышевых клеток может быть достигнута путем совместного культивирования с питающими клетками, такими как клетки Сертоли. Это совместное культивирование можно улучшить, выращивая клетки на определенных субстратах, таких как матригель, коллаген или в культуре мягкого агара.Кроме того, рост в системах трехмерной культуры, обеспечивающих «каркас» для зародышевых клеток, показал многообещающие результаты в улучшении жизнеспособности и роста зародышевых клеток (Hunter et al., 2012; Stukenborg et al., 2009).

Первичные зародышевые клетки: современные знания и перспективы

Бесплодие — это состояние, которое возникает очень часто, и понимание того, что определяет нормальную фертильность, имеет решающее значение для оказания помощи пациентам. Причины бесплодия многочисленны, и лечение часто не приводит к желаемой беременности, особенно при недостатке функциональных гамет.У человека первичная половая клетка (PGC) является первичным недифференцированным типом стволовых клеток, которые дифференцируются по направлению к гаметам: сперматозоидам или ооцитам. С развитием биологии стволовых клеток и протоколов дифференцировки PGC можно получить из плюрипотентных стволовых клеток, что дает новую терапевтическую возможность для лечения бесплодных пар. Недавние исследования показали, что жизнеспособные детеныши мыши могут быть получены из дифференцированных стволовых клеток in vitro из , что позволяет предположить, что перевод этих результатов на человека ближе.Таким образом, целью данного обзора является обобщение текущих знаний о PGC с указанием перспективы их использования как в исследованиях, так и в медицине для лечения бесплодия.

1. Введение

Сегодня, во втором десятилетии этого тысячелетия, бесплодие остается глобальным заболеванием с высокой распространенностью [1, 2]. Boivin et al. [3] показали, что показатель распространенности через 12 месяцев колеблется от 3,5% до 16,7% в более развитых странах и от 6,9% до 9,3% в менее развитых странах при средней распространенности 9%.Диагноз бесплодия может стать причиной жизненного кризиса у многих пар, поэтому необходимо разработать механизмы преодоления временной или постоянной потери фертильности и возможности иметь биологического ребенка [1]. Для бесплодных пар, которые не могут иметь ребенка с помощью других методов лечения, искусственные репродуктивные техники (ВРТ) и возможность получения гамет из стволовых клеток предлагают потенциальные репродуктивные стратегии для людей, бесплодных из-за травм, воздействия токсичных веществ или иммуносупрессивных средств. лечения и страдают гонадной недостаточностью из-за преждевременной недостаточности яичников или азооспермии, репродуктивного старения и идиопатических случаев плохого качества гамет [4, 5].

В большинстве многоклеточных организмов половые клетки являются источником новых организмов, которые обеспечивают наследование генетической и эпигенетической информации в следующих поколениях [6]. Линия зародышевых клеток является источником тотипотентности, обеспечивая создание новых организмов [7]. В 19 веке Август Вейсманн опубликовал гипотезу, согласно которой наличие предварительно сформированных детерминант половых клеток (зародышевой плазмы) наследуется только через половые клетки, обеспечивая тотипотентность и непрерывность зародышевой линии [8].Это было продемонстрировано у беспозвоночных и низших позвоночных, у которых зародышевая плазма необходима для образования зародышевых клеток, тогда как у млекопитающих этот процесс включает эпигенетические механизмы, а не преформацию. Это регулируемое событие, в котором некоторые влияния окружающей среды играют решающую роль, а тотипотентность сохраняется через зародышевую линию, обеспечивая дальнейшее развитие в следующем поколении.

Зародышевые клетки проходят две существенно разные фазы развития [9]. Первая фаза происходит во время раннего эмбриогенеза, когда первичные половые клетки (PGCs) формируются и активно мигрируют к гребню гонад [10, 11].На второй фазе половые клетки получают соответствующие сигналы из окружающей среды и запускают одну из двух различных программ контролируемого деления клеток, мейоза и дифференцировки-оогенеза или сперматогенеза с образованием гамет. Молекулярные основы обоих процессов и раннего развития зародышевых клеток очень хорошо изучены у двух видов, Drosophila и Caenorhabditis elegans , где систематические генетические обзоры идентифицировали многие из генов, необходимых для этого процесса [12-15].PGCs у людей интенсивно не исследовались из-за технических и этических препятствий на пути получения таких клеток из ранних эмбрионов [16]. Большая часть наших знаний о спецификации PGC млекопитающих была получена из исследований с использованием ранних эмбрионов мышей, в которых судьба зародышевых клеток индуцируется в плюрипотентных проксимальных клетках эпибласта вскоре после имплантации в стенку матки [17].

В этом обзоре мы обобщаем текущие знания о PGC млекопитающих и указываем перспективы их использования в исследованиях и для создания зрелых гамет, которые могут быть использованы при лечении бесплодия человека.

2. Происхождение и развитие первичных зародышевых клеток

У млекопитающих происхождение линии зародышевых клеток в эмбриогенезе было первоначально неясным из-за отсутствия характерной зародышевой плазмы, присутствующей в яйце, как это наблюдается у других организмов, таких как X. laevis и D. melanogaster [17]. PGCs были впервые идентифицированы у млекопитающих Chiquoine в 1954 г. [18]. Он обнаружил популяцию клеток линии зародышевых клеток, способных генерировать как ооциты, так и сперматозоиды в основании появляющегося аллантоиса на E7.25 в энтодерме желточного мешка эмбрионов мыши, непосредственно под первичной полоской, идентифицированной по высокой активности щелочной фосфатазы (ЩФ). Хотя этические ограничения ограничивают наши знания о спецификации PGC человека, ясно, что общие сигнальные пути действуют у млекопитающих и, возможно, у всех позвоночных [19]. Основываясь на окрашивании AP, различные исследования предложили различные сайты происхождения PGC, включая заднюю примитивную полосу (rev. [20]). Популяция основателей половых клеток немногочисленна и глубока, что вызывает большие трудности в изучении генетической основы спецификации клонов зародышевых клеток [8].Половые клетки вскоре после ограничения их происхождения приобретают морфологию, которая отражала бы лежащие в основе уникальные молекулярные особенности. Saitou et al. создали систему для идентификации ключевых факторов, которые определяют судьбу зародышевых клеток у мышей, и для понимания отличительных особенностей, которые зародышевые клетки приобретают на молекулярных уровнях [21]. Они вырезали эмбриональную область примерно с 300 клетками, которые содержали зародышевые клетки-основатели на E7.5 (стадия EB), и диссоциировали ее на отдельные клетки. Эти клетки морфологически схожи, но делятся на два класса, различающиеся по дифференциальной экспрессии двух генов, специфичных для зародышевых клеток: Stella и Fragilis [8].Кластер из 300 клеток демонстрирует универсальную экспрессию Fragilis , но экспрессия Stella ограничена подмножеством клеток в центре кластера. Следовательно, оба гена, по-видимому, играют важную роль в развитии зародышевых клеток и их способности дифференцироваться [21]. Stella является первым геном, который экспрессируется в популяции клеток, которые считаются зародышевыми клетками с ограниченным клонированием [8], которые также демонстрируют высокую экспрессию тканевого неспецифического AP ( Tnap ), гена AP-активности PGC [22] .

Мигрирующие половые клетки продолжают демонстрировать сильную и специфическую экспрессию Stella , но демонстрируют сильную репрессию всех исследованных генов гомеобокса ( Hoxb1 , Hoxa1 , Evx1 и Lim1 ), несмотря на высокие уровни экспрессии. этих генов в соседних соматических клетках [8]. Поскольку роль генов гомеобокса состоит в том, чтобы определять региональную идентичность клеток вдоль оси тела или индуцировать дифференцировку клеток в направлении определенных линий соматических клеток, это предполагает, что зародышевые клетки-основатели приобретают способность избегать соматической спецификации, предотвращая или подавляя экспрессию гена гомеобокса. .Это может быть одной из ключевых особенностей половых клеток млекопитающих, которая позволяет им поддерживать или восстанавливать тотипотентность и отличаться от других окружающих клеток в нише. Эта концепция подтверждается продолжающейся экспрессией Oct4 и других генов плюрипотентности в половых клетках [23].

У мышей спецификация зародышевой линии начинается примерно на E6.25 в проксимальном эпибласте в небольшой популяции клеток, идентифицированной по экспрессии Blimp1 (индуцированный B-лимфоцитами белок созревания 1) / Prdm1 (Pr-домен, содержащий белок 1) [24] и Prdm14 [25].Интересно, что Blimp1 и Prdm14 обладают разными паттернами связывания относительно промоторов [26], а Blimp1 играет доминирующую роль в спецификации PGC. Blimp1 важен для репрессии почти всех генов, которые обычно подавляются в PGC по отношению к их соматическим соседям, а также для восстановления плюрипотентности и эпигенетического репрограммирования. Напротив, Prdm14 регулирует восстановление плюрипотентности и эпигенетическое репрограммирование независимо от Blimp1 и определяет новый генетический путь со строгой специфичностью к клону зародышевых клеток [27].Экспрессия этих двух факторов начинается независимо в небольшом количестве клеток проксимального отдела заднего эпибласта в начале стадии ранней полоски [28]. Эти клетки увеличиваются в количестве и образуют PGC с активностью AP и экспрессией Stella (также известной как Dppa3 или Pgc7 ) [21, 29]. PGCs у мышей индуцируются во время гаструляции с помощью передачи сигналов костного морфогенетического белка (BMP) и еще не идентифицированного сигнала (ов) от внеэмбриональной эктодермы и висцеральной энтодермы к лежащим в основе плюрипотентным клеткам эпибласта на E6.5 [30]. Эта индукция приводит к опосредованной Blimp1 / Prdm1 регуляции транскрипции клеток эпибласта, которая способствует экспрессии PGC-специфических генов, таких как Stella , и подавляет экспрессию генов соматических клеток, таких как члены гена Hox . семья [24, 31]. Пока неизвестно, активируют ли Smads транскрипцию Blimp1 и Prdm14 прямо или косвенно [7]. Определение элемента (ов), ответственного за экспрессию Blimp1 в эпибласте в ответ на BMP4, и изучение того, связываются ли Smads напрямую и контролируют Blimp1, будет иметь решающее значение для получения окончательного ответа на этот вопрос.Для индукции PGC, по-видимому, требуется только BMP4 или BMP8b или их комбинация, что указывает на то, что передача сигналов для различных BMP происходит через отдельные рецепторы. У мышей ряд других факторов, которые участвуют в спецификации и поддержании PGC, встречаются примерно на E6.25, отмеченном последовательной экспрессией двух факторов транскрипции Blimp1 / Prdm1 и Prdm14 в ответ на BMP [ 32]. Blimp1 , Prdm14 и Stella -позитивные PGC интегрируют ключевые события для репрессии программы соматической мезодермальной дифференцировки в PGC [7].Передача сигналов WNT также важна для судьбы PGC, что возможно благодаря посттранскрипционному взаимодействию с предположением, что передача сигналов WNT может действовать посттранскрипционно на компоненты передачи сигналов BMP [7]. Передача сигналов WNT может стабилизировать Smad1 путем ингибирования GSK3-опосредованного фосфорилирования его линкерной области, тем самым предотвращая его деградацию [33], но c-kit рецептора тирозинкиназы и его лиганд, фактор стволовых клеток, необходимы для поддержания PGC у обоих полов [33] 19].

3. Миграция первичных зародышевых клеток

В отличие от D.melanogaster и рыбок данио мало что известно о миграции PGC и инициации этого процесса у мышей [33]. Вскоре после спецификации клетки начинают проявлять поляризованную морфологию и цитоплазматические расширения и инициируют миграцию через примитивную полоску в соседнюю заднюю эмбриональную энтодерму, внеэмбриональную энтодерму и аллантоис [20]. Первым шагом в миграции PGC мышей является перемещение клеток от задней примитивной полоски к энтодерме на E7.5. Между E8.5 и E13.5, Tnap -положительные PGC пролиферируют и мигрируют через энтодерму задней кишки и брыжейку с последующей двусторонней миграцией к генитальным гребням, после чего они могут вступать в мейоз у самок или митотическую остановку у самцов и инициировать дифференцировку в ооциты или сперматозоиды. [16, 34]. Во время миграции время удвоения популяции PGC довольно равномерно и составляет около 16 часов между 8,5 и 13,5 днями. Эмбрионы мышей E13.5 должны иметь около 24000 PGCs в своих генитальных гребнях [35].В этой фазе миграции PGCs подвергаются обширному репрограммированию генома и изменению эпигенетической информации, такой как паттерны метилирования ДНК и модификации гистонов, а также стирание импринтинга генов, что может быть важным для восстановления тотипотентности клонов зародышевых клеток [16].

В настоящее время нет доказательств полоспецифических различий во время миграции PGC в каком-либо организме. Подмножество половых клеток в гонаде приобретает способность функционировать как стволовые клетки зародышевой линии, которые подвергаются мейозу с образованием сперматозоидов и яйцеклеток и способствуют следующему поколению эмбрионального развития и миграции PGC.Белок Vasa является важным компонентом зародышевой плазмы и представляет собой плохо изученный комплекс РНК и белков, необходимый для определения зародышевых клеток. Нулевые мутации приводят к бесплодию у самок мышей в результате серьезных дефектов оогенеза [10]. У человека экспрессия VASA начинается в конце мигрирующей фазы развития PGC [9]. Тилгнер и др. сгенерировал и охарактеризовал линии эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) с помощью конструкции, в которой экспрессия гена pEGFP-1 управлялась последовательностью ДНК, представляющей репортер VASA [36].Они продемонстрировали, что hESC можно использовать в качестве системы модели разработки для спецификации PGC в условиях in vitro . Кроме того, они смогли установить небольшое количество предполагаемых женских PGC, выделенных на основе флуоресценции GFP, управляемой промотором VASA . Эти результаты и тот факт, что специфическая экспрессия Vasa в линии зародышевых клеток во время колонизации гонадного гребня предполагает, что Vasa требуется для поддержания функциональности половых клеток.Например, самцы мышей, гомозиготные по целевой мутации мыши Vasa , ортолог Mvh , стерильны и демонстрируют серьезные дефекты сперматогенеза, в то время как гомозиготные самки фертильны [37, 38]. Другими сигналами (Рис. 1), участвующими в регуляции миграции и колонизации PGC, являются молекула адгезии E-cadherin [39] и молекула внеклеточного матрикса интегрин β 1 [40, 41]. К сожалению, точная функция этих факторов и сигнальных путей еще предстоит объяснить.

Мигрирующие PGC поддерживают геномную программу, связанную с плюрипотентностью. Они экспрессируют основные гены плюрипотентности ( Oct4 , Nanog и Sox2 ) и способны образовывать тератомы после инъекции в постнатальные семенники мыши [6, 42, 43]. Помимо этого, мигрирующие PGCs экспрессируют стадийно-специфический эмбриональный антиген 1 (SSEA1) [16]. По прибытии в гонаду, специфичный для зародышевых клеток связывающий РНК белок DAZL (удаленный при азооспермии) необходим для развития PGC [44].Многие исследования показали, что DAZL функционирует как усилитель трансляции [45–47]. Нокаут для партнеров по связыванию целевой мРНК DAZL (Mvh, Scp3 и Tex19.1) приводит к серьезным фенотипическим изменениям [48-50], подтверждая, что DAZL может играть дополнительные роли во время стадии PGC гаметогенеза млекопитающих. DAZL также является привратником апоптоза в PGC и регулирует экспрессию ключевых каспаз, действуя как элегантный отказоустойчивый механизм, который предотвращает образование тератом и устраняет аберрантные PGC [51].В отсутствие DAZL зародышевые клетки не могут развиваться после стадии PGC, о чем свидетельствует продолжающаяся экспрессия маркеров плюрипотентности. Эти данные предполагают, что DAZL является «лицензирующим фактором», необходимым для половой дифференциации PGC [52]. Гены, участвующие в развитии PGC, приведены в таблице 1.
9 Ссылки 9
Полное имя Альтернативные имена Время экспрессии Местоположение кодированного белка Ссылки
Тканевый неспецифический AP (Tnap) E7.25-14 На поверхности клетки, связан с клеточной мембраной через гликановую связь фосфатидилинозитол [22]
Stella или Dppotencya 9 Pgc7 E7.5 Белок, который может перемещаться между ядром и цитоплазмой [8, 21]
Fragilis .5 Трансмембранный белок [8, 21]
Белок 1 созревания, индуцированный B-лимфоцитами ( Blimp1 ) Pr-домен, содержащий белок 1 () Prdm496 25 Цитоплазматический репрессор транскрипции [24]
Prdm14 Pr-домен, содержащий белок 14 E6.25 Регулятор транскрипции
Мышь Ортолог Vasa ( Mvh ) E13.5 (10,5) конец миграционной фазы развития PGC Цитоплазма [9]
Удалено в азооспермии-подобной (DAZL) E1249plas (11,5 белок [44–52]
Постмиграционные PGC, отмеченные экспрессией нескольких связывающих РНК белков, таких как MVH, DAZL и NANOS3, подвергаются половому диморфному развитию [46–53] .У мышей женские половые клетки быстро инициируют мейоз и останавливаются на стадии мейоза I, в то время как мужские половые клетки митотически делятся в течение нескольких раундов, а затем переходят в стадию покоя, известную как гоноциты. В частности, PGCs активируют набор генов, которые позволяют им подвергаться половой дифференциации и гаметогенезу, подавляя свою программу плюрипотентности [54]. У женского эмбриона XX PGCs продолжают пролиферировать и впоследствии входят в профазу I мейотических делений [35].В дальнейшем они задерживаются на диплотеновой стадии профазы I мейоза. После рождения гоноциты окружены клетками коркового интерстициального слоя и становятся первичными ооцитами в примордиальных фолликулах, тем самым прекращая пролиферативный потенциал предшественников и останавливая процесс их развития до полового созревания. После полового созревания гормональная стимуляция во время овуляции вызывает созревание и высвобождение ооцитов из яичника в яйцевод с последующим завершением первого мейотического деления с сопутствующей экструзией первого полярного тельца.При оплодотворении гаплоидным сперматозоидом ооцит завершает второе мейотическое деление и вытесняет второе полярное тельце [6, 55, 56].
В отличие от таковых у самок, XY PGCs вступают в митотическую остановку при входе в генитальные гребни и остаются неподвижными в фазе клеточного цикла в течение оставшегося эмбрионального периода в качестве просперматогониума, сохраняя при этом потенциал пролиферативного предшественника [57] . Примерно на 5 день после родов многие из просперматогоний возобновляют активную пролиферацию, в то время как некоторые мигрируют к базальной мембране семенных канальцев и образуют плотные соединения с клетками Сертоли, тем самым формируя сперматогониальные стволовые клетки (SSC), встроенные в соответствующие ниши.Таким образом, по сравнению с очень ограниченным размером пулов ооцитов, сперматозоиды могут быть получены путем дифференцировки SSC. В культуре стволовые клетки зародышевой линии, обладающие способностью к длительной пролиферации и сперматогенезу при трансплантации в семенники, устанавливаются в присутствии GDNF (нейротрофический фактор глиальных клеток), наиболее легко из неонатальных семенников [6, 55, 56].
4. Получение PGC из плюрипотентных клеток
PGC можно выделить из целых эмбрионов мыши на E6.0 в условиях отсутствия сыворотки и кормления в суспензии [7]. В таких условиях фактор ингибирования лейкемии обладает активностью по подавлению индукции гусекоида, маркера мезэндодермы, что предполагает, что экспрессия Blimp1 в бессывороточной среде может отражать дифференцировку клеток эпибласта в мезэндодермальный клон. Данные показывают, что по существу все клетки эпибласта на E6.0, если они отделены от висцеральной энтодермы, являющейся источником тормозных сигналов, способны экспрессировать Blimp1 в ответ только на BMP4 (Рисунок 1).До сих пор были представлены доказательства того, что изолированные эпибласты могут быть индуцированы с образованием Blimp1 , Prdm14 и AP-позитивных PGC-подобных клеток через 36 часов в бессывороточной культуре с BMP4 [58].
Между тем дифференцировка hESC в PGC имеет значительный потенциал как метод изучения механизмов нормального и аномального развития зародышевой линии человека. Чтобы получить большее количество PGC человека из hESC Tilgner et al. [16] разработали систему роста in vitro , которая демонстрирует полезность SSEA1 для обогащения популяции предполагаемых PGC.SSEA1-положительные клетки имеют много общих характеристик с ex vivo PGC, таких как экспрессия ключевых генов ( VASA , OCT4 и STELLA ), но их статус клеточного цикла отличается от предыдущих наблюдений на эмбриональных мышах. , указывая на то, что PGCs из E9.0 были в значительной степени арестованы в G2 / M, тогда как SSEA1-положительная популяция в основном находится в S-фазе, что указывает на то, что большинство клеток все еще может находиться в фазе их митотической экспансии. Следовательно, нацеленная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека (PSC) предлагает прекрасную возможность исследовать механизмы, участвующие в созревании PGC.Однако ограниченное количество публикаций указывает на то, что получение половых клеток из ПСХ все еще является незрелой технологией [59–61]. Первое опубликованное исследование индукции половых клеток мышей из ПСХ было проведено Hübner et al. [60], но Hayashi et al. [62] были первыми, кто описал высокоэффективную двухэтапную процедуру получения PGC-подобных клеток (PGCLC) из ESC и iPSC мыши. В этой процедуре ESC и iPSC были сначала индуцированы в эпибластоподобные клетки, которые впоследствии были индуцированы до PGCLC [62], а позже ESC могли дифференцироваться в направлении половых клеток [63].Chuma et al. [42] трансплантировали PGC в семенники и получили зрелые сперматозоиды, тогда как Matoba и Ogura [64] сообщили, что PGC, выделенные из плода мужского пола E12.5 под капсулой почки, дают сперматиды (рис. 2). Вехой этих исследований является рождение здорового потомства. Подобно Матобе и Огуре Хашимото и др. [65] сообщили, что PGCs, выделенные из плода женского пола при трансплантации под сумку яичника или капсулу почки, приводят к функциональным ооцитам. Таким образом, мы на шаг ближе к получению человеческих гамет из in vitro PGC, продуцированных с использованием ESC или iPSC [62, 66, 67], но у человека остаются некоторые препятствия: (i) как заставить PGC преобразоваться в зрелый ооцит без трансплантация и (ii) как повторить работу мыши на людях для производства PGC для лечения бесплодия.Тем не менее, преимуществом использования чЭСК и индивидуальных ИПСК для пациентов является возможность расшифровать механизмы, участвующие в дифференцировке и созревании человеческих гамет с целью полной трансляции профилей экспрессии генов этих клеток. Это может быть подтверждено предыдущей публикацией [68] с четкими доказательствами того, что SOX17 является ключевым регулятором судьбы PGC человека. Исследование показало, что Blimp1 находится ниже SOX17 и репрессирует энтодермальные и другие соматические гены во время спецификации PGC человека, что было неожиданным, поскольку Sox17 не играет роли в спецификации PGC мыши.Как только мы получим протокол для дифференциации человеческих ИПСК в сторону функциональных гамет, мы сможем производить специфичные для пациента ооциты и сперматозоиды в контролируемых условиях in vitro .

5. Заключение
Возможность генерации зрелых гамет из PGC представляет собой область исследований, которая обеспечивает более глубокое понимание сигнальных путей гаметогенеза и репродуктивной дисфункции у людей. Недавний прогресс в работе с целевой дифференциацией ИПСК предлагает индивидуализированные / персонализированные методы лечения ИПСК также для лечения азооспермии у мужчин или первичной недостаточности яичников у женщин [69–73].Однако проблемы с образованием сперматозоидов и ооцитов в условиях in vitro у человека остаются: дифференцировка половых клеток зависит от соматической среды, а не от содержания половых хромосом в зародышевой клетке. Таким образом, демонстрация гаметогенеза на культурах дифференцирующихся ЭСК и ИПСК мыши предполагает, что таким образом могут быть получены «искусственные» гаметы человека, а живорождение детенышей мыши предполагает, что человеческие клетки также могут быть функциональными, хотя успешная демонстрация об образовании человеческих гамет таким образом все еще ожидается, но уже за ним последовали многочисленные этические дискуссии.Тем не менее, получение жизнеспособных сперматозоидов и ооцитов человека в условиях in vitro , несомненно, откроет в репродуктивной медицине новые горизонты для новой формы лечения бесплодия.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации данной статьи.
Благодарности
Это исследование было поддержано Министерством науки Сербии (гранты ON175069, ON175103 и ON 175061). Авторы признательны и признательны за щедрую помощь Жасмин Нуркович и Дзенан Хайрович, которые внесли свой вклад в создание рисунков в этой статье.
Bmp4 необходим для образования примордиальных половых клеток в эмбрионе мыши
Кирсти А. Лоусон,
Н. Рэй Данн,
Бернард А.Дж. Релен,
Лаура М. Зейнстра,
Анджела М. Дэвис,
Кристофер В.Э. Райт,
Jeroen P.W.F.M. Корвинг и
Бригид Л.М. Хоган

Лаборатория Хубрехта, Нидерландский институт биологии развития, 3584 Коннектикут, Утрехт, Нидерланды; Медицинский институт Говарда Хьюза и Отделение клеточной биологии, Медицинский центр Университета Вандербильта, Нэшвилл, Теннесси 37232-2175 США
Аннотация
У многих организмов выделение первичных половых клеток (PGC) определяется наследованием материнских факторов, депонированных в яйце.Однако у млекопитающих индуктивные клеточные взаимодействия необходимы во время гаструляции для создания зародышевой линии. Здесь мы показываем, что Bmp4 гомозиготных нулевых эмбрионов не содержат PGC. У них также отсутствует аллантоис, экстраэмбриональная мезодермальная ткань, такая как PGC из предшественников в проксимальном эпибласте. Гетерозиготы имеют меньше PGC, чем обычно, из-за уменьшения размера населения-учредителя и не повлияет на его последующее расширение.Анализ активности β-галактозидазы в эмбрионах Bmp4 ^lacZneo показывает, что до гаструляции Bmp4 экспрессируется во внеэмбриональной эктодерме. Позже Bmp4 экспрессируется во внеэмбриональной мезодерме, но не в PGCs. Химерный анализ показывает, что именно экспрессия Bmp4 во внеэмбриональной эктодерме регулирует образование аллантоиса и предшественников первичных зародышевых клеток, и размер популяции-учредителя PGC.Таким образом, инициация зародышевой линии у мышей зависит от секретируемого сигнал от ранее обособленной внеэмбриональной линии трофэктодермы.
Сноски
↵Авторы-корреспонденты.
ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА brigid.hogan {at} mcmail.vanderbilt.edu; ФАКС (615) 343-2033.
ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА lawson {at} niob.knaw.nl; ФАКС 31 (30) 2516464.
Поступило 23.11.1998 г.
Принята к печати 7 января 1999 г.
Лабораторный пресс в Колд-Спринг-Харбор
Еще один шаг ближе к раскрытию спецификации первичных зародышевых клеток — Хэнкок
Первичные зародышевые клетки (PGC) являются предшественниками гамет и отвечают за передачу генетической и эпигенетической информации от одного поколения к другому. Они определяются примерно во время имплантации развивающегося эмбриона в стенку матки и в конечном итоге мигрируют к генитальному гребню, где они дифференцируются и подвергаются мейозу в зависимости от пола, чтобы стать зрелыми яйцеклетками и сперматозоидами (1-3). .Хотя мышь была надежной моделью развития PGC у млекопитающих, существуют заметные различия в развитии и молекулярном уровне по сравнению с человеком. Наиболее очевидно, что эмбрион мыши формируется в виде цилиндра яйца, а человеческий — в виде биламинарного диска (1). Недавние модели in vitro для развития PGC человека, созданные Irie et al. , 2015 и Sasaki et al. в 2015 году привели к ряду исследований, указывающих на транскрипционные различия спецификации PGC между мышами и людьми (4,5).У мышей считается, что Prdm14, Blimp1 (также Prdm1) и Tfap2c образуют трехчастную транскрипционную сеть для спецификации PGC (6). Однако исследования на людях подчеркнули важность TFAP2C, BLIMP1 и, что удивительно, SOX17 и EOMES в развитии PGC (4,5,7,8). Эти видовые различия требуют изучения спецификации PGC у человека, а не просто экстраполяции знаний от мыши.
Хотя модель прямой дифференцировки in vitro из плюрипотентных стволовых клеток человека оказалась полезной при изучении факторов транскрипции, определяющих судьбу клеток во время развития PGC, она предлагает ограниченное понимание одного из самых больших вопросов, оставшихся без ответа, относительно PGC: когда и где в человеческий эмбрион указаны PGCs? Исследования на мышах показывают, что PGCs возникают в эмбриональный день (E) 6.25 в заднем эпибласте (9). Однако этические и технологические ограничения не позволяют ответить на этот вопрос непосредственно во время развития человеческого эмбриона. Вместо этого исследования видов, которые более тесно связаны с человеком в эволюционном плане, чем с мышами, служат альтернативной стратегией для выяснения происхождения PGCs. В 2016 году Sasaki et al. опубликовал очень неожиданное исследование, предполагающее, что PGCs впервые были обнаружены в амнионе вокруг E11 у обезьян cynomolgus macaque (10). В начале жизни оплодотворенная яйцеклетка делится, чтобы сформировать кластер клеток, чтобы начать первое драматическое разделение клеточной судьбы: внутреннюю клеточную массу (ICM), которая сформирует собственно эмбрион, и внешнюю трофэктодерму, которая сформирует экстраэмбриональные ткани, соединяющие развивающийся эмбрион до стенки матки матери.Затем ICM скоро начнет второе решение клеточной судьбы с образованием эпибласта и гипобласта (также называемых примитивной энтодермой) (11). В процессе развития амнион происходит из эпибласта и образует мембрану, покрывающую развивающийся эмбрион. После заполнения околоплодными водами он становится амниотическим мешком, обеспечивающим защитную среду для развивающегося эмбриона и, в конечном итоге, для плода. Это открытие, что PGC обезьян указаны в амнионе, усложняет ключевой вопрос, касающийся местоположения спецификации PGC человека.Является ли происхождение амниона специфичным для обезьян или общим механизмом для приматов, включая человека?
PGC-подобные клетки человека (PGCLC), in vitro аналог PGC in vivo , были успешно получены из плюрипотентных стволовых клеток, включая эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) (4, 5,7,12). Учитывая, что мало что известно о молекулярной природе амниона, неясно, образуются ли PGCLC через амнионоподобный промежуточный продукт во время индукции от hESCs или hiPSCs.Следовательно, важно тщательно изучить спецификацию PGCs от дополнительных видов. Недавнее исследование Kobayashi et al. , озаглавленный «Принципы раннего развития человека и программы зародышевых клеток на основе консервативных модельных систем», дает проницательные точки зрения на клеточное происхождение PGCs (13).
Используя эмбрион свиньи, который развивается как биламинарный диск подобно человеческому, Kobayashi et al. показали, что PGCs специфицируются в заднем эпибласте на E11, индуцированном передачей сигналов WNT и BMP, клеточного механизма, очень напоминающего спецификацию PGC мыши (13).Во-первых, они идентифицировали PGC свиней, используя четко определенные маркеры PGC у человека и обезьяны, такие как SOX17 и TFAP2C, и обнаружили, что E11 — это самый ранний момент, когда PGCs четко определены. Затем они проследили развитие PGC свиней и обнаружили консервативные факторы транскрипции и репрограммирование эпигенома при сравнении эмбрионов свиньи с эмбрионами обезьяны и человека. Таким образом, PGCs свиней могут служить подходящей моделью для изучения спецификации PGCs из развивающихся эпибластов. Во время эмбрионального развития эпибласт инициирует новую волну разделения клеточных судеб с образованием эктодермы и мезендодермы (предшественника мезодермы и энтодермы) примерно на стадии примитивной полоски.Чтобы функционально проанализировать моменты времени, когда в процессе развития эпибласты приобретают и теряют способность определять судьбу PGC, Kobayashi et al. создал систему ex vivo путем культивирования отделенных эпибластов от гипобласта и трофэктодермы на различных эмбриональных стадиях. Затем они проверили способность эпибластов образовывать PGC с необходимыми цитокинами в культуральной среде. Этот анализ ограничивал компетентные эпибласты для судьбы PGC до E10 / 11, который представляет собой предшественника судеб мезендодермы (пре-мезендодермы) клеток.Следовательно, у свиней PGCs, скорее всего, происходят из пре-мезэндодермальных клеток эпибластов. Основываясь на этих выводах, Kobayashi et al. тестировали, можно ли индуцировать PGC-подобные клетки человека и обезьяны из пре-мезэндодермальных клеток in vitro . Интересно, что 12 часов дифференцировки пре-мезендодермы от ESCs достаточно для индукции PGCLC как в системе человека, так и в системе обезьян, подтверждая возможное происхождение судьбы PGC из клеток пре-мезендодермы. Более короткая пре-мезендодермальная дифференцировка (<12 часов) недостаточна для индукции судьбы зародышевых клеток, в то время как более длительная дифференцировка способствует усыновлению судьбы энтодермы и / или мезодермы и потере судьбы PGC, что согласуется с открытием, что только развивающиеся эпибласты на стадии пре-мезендодермы дифференцировки приобретают компетентность в отношении судьбы PGC.
Наконец, авт. Исследовали факторы транскрипции, определяющие судьбу PGC человека. Они сосредоточились на SOX17, TFAP2C и BLIMP1, каждый из которых участвует в PGC человека / обезьяны / свиньи, и мутанты этих факторов транскрипции приводят к потере способности формировать PGCLC из hESC / hiPSC (4,5,7,8). Кобаяши и др. сверхэкспрессировал либо одиночные, либо комбинаторные факторы транскрипции в течение 12-часового периода пре-мезэндодермальной дифференцировки и проверил их роль в индукции PGCLC.Этот анализ установил, что SOX17 и BLIMP1 вместе специфицируют PGCLC человека эффективно даже в отсутствие BMP4, подтверждая, что SOX17 и / или BLIMP1, вероятно, являются наиболее важными нижестоящими мишенями передачи сигналов BMP во время спецификации PGCs.
Таким образом, Kobayashi et al. проследил развитие PGC в эмбрионах свиней и сузил время спецификации PGC до E10 / 11, примерно в то время, когда эпибласты инициируют дифференцировку мезэндодермы, и подтвердил это открытие системой культивирования ex vivo с использованием эмбрионов свиньи и in vitro система культивирования с использованием ЭСК человека и обезьяны.Следовательно, у человека, обезьяны и свиньи судьба PGC, вероятно, устанавливается из пре-мезэндодермальных клеток во время дифференцировки эпибластов примерно во время имплантации. Так, Kobayashi et al. установили эволюционно консервативный путь спецификации PGC у разных организмов (13).
Примечательно, что амнион образуется на более поздней стадии эмбриогенеза свиней (после стадии примитивной полоски) по сравнению с таковой у человека и обезьяны (перед стадией примитивной полоски) (14).Следовательно, клетки заднего эпибласта пре-мезендодермы, вероятно, являются единственными PGC-компетентными клетками в эмбрионах свиней. Однако это не исключает возможности того, что PGCs специфицируются в амнионе эмбрионов обезьян. Как упоминалось в их статье, Kobayashi et al. подтвердил идею, что PGC человека и обезьяны могут быть специфицированы как в пре-мезэндодерме, так и в амнионе, возможно двойное происхождение (13). Система культивирования ex vivo , созданная Kobayashi et al. в этом исследовании будет подходящей стратегией для проверки возможности двойного происхождения PGCs у обезьян. В частности, развивающиеся эмбрионы обезьян можно разделить на амнион, эпибласты, гипобласты и трофэктодерму на разных стадиях, чтобы проверить их способность определять судьбу PGC. Это также может быть применено к человеческим эмбрионам, поскольку человеческие эмбрионы могут культивироваться в системе прикрепления in vitro в течение до 14 дней (15,16). Кроме того, если бы мы могли разработать более устойчивые и надежные модели и маркеры для амниона приматов и экстраэмбриональной ткани in vitro , мы могли бы опросить эти клетки как промежуточные звенья для проверки их способности к индукции судеб PGC.Эти анализы предоставят важную информацию о клеточном происхождении PGCs человека и расширят знания о происхождении заднего, пре-мезендодермы эпибласта, представленные в этом исследовании.
Благодарности
Нет.
Конфликт интересов : Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Список литературы
Leitch HG, Tang WW, Surani MA. Первичное развитие зародышевых клеток и эпигенетическое перепрограммирование у млекопитающих. Curr Top Dev Biol 2013; 104: 149-87. [Crossref] [PubMed]
Тан В.В., Кобаяши Т., Ирие Н. и др. Спецификация и эпигенетическое программирование зародышевой линии человека. Нат Рев Генет 2016; 17: 585-600. [Crossref] [PubMed]
Чен Д., Гелл Дж. Дж., Тао Ю. и др.Моделирование человеческого бесплодия с помощью плюрипотентных стволовых клеток. Stem Cell Res 2017; 21: 187-92. [Crossref] [PubMed]
Ирие Н., Вайнбергер Л., Тан В.В. и др. SOX17 является критическим спецификатором судьбы первичных зародышевых клеток человека. Cell 2015; 160: 253-68. [Crossref] [PubMed]
Сасаки К., Йокобаяши С., Накамура Т. и др. Надежная индукция in vitro судьбы зародышевых клеток человека из плюрипотентных стволовых клеток. Стволовая клетка клетки 2015; 17: 178-94. [Crossref] [PubMed]
Magnúsdóttir E, Surani MA.Как сделать изначальную зародышевую клетку. Развитие 2014; 141: 245-52. [Crossref] [PubMed]
Чен Д., Лю В., Лукьянчиков А. и др. Компетенция зародышевой линии эмбриональных стволовых клеток человека зависит от EOMESODERMIN. Биол Репрод 2017; 97: 850-61. [Crossref] [PubMed]
Кодзима Ю., Сасаки К., Йокобаяши С. и др. Эволюционно отличительные программы транскрипции и передачи сигналов определяют спецификацию клонов зародышевых клеток человека из плюрипотентных стволовых клеток. Стволовая клетка клетки 2017; 21: 517-532.e5. [Crossref] [PubMed]
Охината Y, плательщик B, O’Carroll D и др. Blimp1 является критическим детерминантом клонов зародышевых клеток у мышей. Природа 2005; 436: 207-13. [Crossref] [PubMed]
Сасаки К., Накамура Т., Окамото И. и др. Судьба зародышевой клетки обезьян Cynomolgus уточняется в зарождающемся амнионе. Dev Cell 2016; 39: 169-85. [Crossref] [PubMed]
Zernicka-Goetz M, Morris SA, Bruce AW. Принятие твердого решения: многогранная регуляция судьбы клеток раннего эмбриона мыши.Нат Рев Генет 2009; 10: 467-77. [Crossref] [PubMed]
Йокобаяси С., Окита К., Накагава М. и др. Клональные вариации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток для индукции в судьбу зародышевых клеток. Биол Репрод 2017; 96: 1154-66. [Crossref] [PubMed]
Кобаяши Т., Чжан Х., Тан WWC и др. Принципы раннего развития человека и программы половых клеток из консервативных модельных систем. Природа 2017; 546: 416-20. [Crossref] [PubMed]
Паттен БМ.Эмбриология свиньи. Торонто: The Blakiston Company, 1951.
Deglincerti A, Croft GF, Pietila LN, et al. Самоорганизация прикрепленного in vitro эмбриона человека. Природа 2016; 533: 251-4. [Crossref] [PubMed]
Шахбази М.Н., Джедрусик А., Вуористо С. и др. Самоорганизация человеческого эмбриона при отсутствии материнских тканей. Nat Cell Biol 2016; 18: 700-8. [Crossref] [PubMed]
doi: 10.21037 / amj.2018.04.06
Цитируйте эту статью как: Hancock G, Chen D.Еще один шаг ближе к раскрытию спецификации первичных половых клеток. AME Med J 2018; 3: 64.
Добавка витамина С способствует ранней спецификации зародышевых клеток из эмбриональных стволовых клеток человека | Исследования и терапия стволовых клеток
Культура hESC
h2 hESC поддерживали в условиях отсутствия питателя в среде TeSR-E8 (Stem Cell Technologies, 05990) на планшетах для культивирования клеток, покрытых Matrigel (Corning, 356234). Культуры пассировали в соотношении от 1:10 до 1:20 каждые 4–6 дней с использованием 0.5 мМ EDTA / PBS (Thermo Fisher, AM9260G). Десять микромолярный ингибитор Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) Y-27632 (Selleck Chemicals, S1049) добавляли в культуральную среду при пассировании или оттаивании клеток.
Создание линий hESC, нокаутирующих BLIMP1-mkate.
гРНК CRISPR (дополнительный файл 1: таблицы) были разработаны для нацеливания на геномные последовательности, соответствующие стоп-кодону локуса BLIMP1, и клонированы в плазмиду px330. Плечи гомологии донорской конструкции амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров из Дополнительного файла 1: Таблицы.Фрагмент T2A-mkate2 с кассетой hEF1a-Neo, фланкированной сайтами loxP, амплифицировали с помощью ПЦР и вставляли в рамку на 3-первичных концах кодирующих последовательностей BLIMP1 субклонированного вектора, содержащего плечи гомологии, с использованием смеси Gibson Assembly Master Mix ( NEB, E2611). Донорные векторы (0,5 мкг) и плазмиды Cas9 (0,5 мкг) трансфицировали в ЭСК h2 (2 × 10 ⁵ клеток на лунку 6-луночного планшета) 3 мкл FuGENE 6 (Promega, E2691). После отбора с использованием 100 мкг / мл G418 в течение 10 дней, hESC были диссоциированы на отдельные клетки и высеяны из расчета ~ 800 клеток на 10-см чашку.Клеткам давали возможность расти до тех пор, пока не стали видны колонии из отдельных клеток (~ 8-10 дней). На этом этапе вручную отбирали отдельные колонии и высевали по отдельности в 96-луночные планшеты. Целевые и случайные интеграции оценивали с помощью ПЦР на экстрагированной геномной ДНК с использованием пар праймеров, перечисленных в Дополнительном файле 1: Таблицы. Целевые аллели были дополнительно проверены секвенированием по Сэнгеру для исключения мутаций indel (дополнительный файл 2: рисунок S1C). Линии, несущие нацеленную вставку в локусы BLIMP1, трансфицировали плазмидой, экспрессирующей рекомбиназу Cre, для удаления кассет hEF1a-Neo-pA.
Индукция hPGCLC
Для предварительной индукции hESC были диссоциированы с 0,5 мМ EDTA / PBS и 3 × 10 ⁵ клеток на лунку высевали на покрытые Matrigel 12-луночные планшеты в среде GK15 (G-MEM [ Thermo Fisher, 11710-035], 15% KSR [Thermo Fisher, 10828-028], 0,1 мМ NEAA [Thermo Fisher, 11140-050], 2 мМ l-глутамин [Thermo Fisher, 35050-061], 1 мМ пируват натрия. [Thermo Fisher, 11360-070], 0,1 мМ 2-меркаптоэтанол [Sigma, M3148]) или среда aRB27 (Advanced RPMI 1640 [Thermo Fisher, 12633-012], 1% добавка B-27 [Thermo Fisher, 17504-044] , 0.1 мМ NEAA, 2 мМ l-глутамин) с 3 мкМ CHIR (Selleck Chemicals, S2745), 40 нг / мл активина A (PEPRO TECH, 120-14E) и 10 мкМ ингибитора ROCK. После 2 дней предварительной индукции клетки диссоциировали с помощью Accutase (Thermo Fisher, A1110501) и помещали в 96-луночные планшеты с U-образным дном со сверхнизким прикреплением клеток (Corning, 7007) при плотности 2000-4000 клеток на лунку. для образования эмбриоидных тел в 200 мкл индукционной среды PGC (среда GK15 или среда aRB27, содержащая 200 ~ 500 нг / мл BMP4 (R&D Systems, 314-BP-050), 10 нг / мл ~ 1 мкг / мл LIF человека (R&D Systems) , 7734-LF-100), 100 нг / мл SCF (R&D Systems, 255-SC-050), 50 нг / мл EGF (R&D Systems, 236-EG-200) и 10 мкМ ингибитор ROCK).
Проточная цитометрия
Плавающие агрегаты диссоциировали с 0,05% трипсин-ЭДТА / PBS в течение 15 минут при 37 ° C. После промывания PBS суспензию клеток фильтровали через сетчатый фильтр для удаления скоплений клеток и затем подвергали центрифугированию. Для анализа hPGCLC или hiPSC с маркерами клеточной поверхности диссоциированные клетки окрашивали PE-конъюгированными антителами против CD326 человека (EpCAM), FITC-конъюгированными антителами против CD49f человека / мыши (INTEGRINα6), PE-конъюгированными антителами против TRA-1-60. , или FITC-конъюгированные анти-SSEA-4.Внутриклеточное окрашивание выполняли с использованием набора BD (BD, 560589) в соответствии с инструкциями производителя с PerCP-Cy ™ 5.5 Mouse anti-Oct3 / 4, PE Mouse anti-human Nanog или Alexa Fluor® 647 Mouse anti-Sox2. Первичные антитела, использованные в этом исследовании, перечислены в Дополнительном файле 1: Таблицы. Окрашенные клетки ресуспендировали в PBS и анализировали с помощью проточного цитометра (Beckman, DxFLEX).
Количественная ОТ-ПЦР
Общую РНК экстрагировали с использованием регента TRIzol (Thermo Fisher, AM9738), а кДНК синтезировали с использованием набора для обратной транскрипции (Takara, RR047A).

Образование половых клеток — урок. Биология, Общие биологические закономерности (9–11 класс).

Развитие половых клеток. Двойное оплодотворение

строение, образование, деление и хромосомы

Строение половых клеток человека

Образование половых клеток

Половые хромосомы

Сравнение развития половых клеток у растений и животных.

Развитие половых клеток. Мейоз | План-конспект урока биологии (10 класс) по теме:

МАТЕРИАЛЫ КОНГРЕССОВ И КОНФЕРЕНЦИЙ: VI РОССИЙСКАЯ ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

VI РОССИЙСКАЯ ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

Сперматогенез и овогенез, подготовка к ЕГЭ по биологии

Гаметогенез (греч. gamete– жена, gametes – муж + genesis – зарождение)

Сперматогенез (греч. sperma – семя + genesis – зарождение)

Овогенез, или оогенез (греч. ōón — яйцо + genesis – зарождение)

Оплодотворение

Принципы раннего развития человека и программы зародышевых клеток на основе консервативных модельных систем

Модели развития половых клеток и их применение для определения токсичности изучает

Abstract

Введение

Развитие зародышевых клеток млекопитающих, краткий обзор

Современный ландшафт тестирования токсичности половых клеток

Таблица I

Почкующиеся дрожжи

Муха

Нематода

Половые клетки млекопитающих in vitro: потенциал для новых применений токсичности

Внедрение достижений вычислительной токсикологии

Резюме и перспективы

Благодарности

Сноски

Ссылка

Зародышевые клетки — обзор

Выделение и очистка зародышевых клеток (Bellvé, 1979 с изменениями)

Первичные зародышевые клетки: современные знания и перспективы

1. Введение

2. Происхождение и развитие первичных зародышевых клеток

3. Миграция первичных зародышевых клеток

4. Получение PGC из плюрипотентных клеток

5. Заключение

Конфликт интересов

Благодарности

Bmp4 необходим для образования примордиальных половых клеток в эмбрионе мыши

Аннотация

Сноски

Еще один шаг ближе к раскрытию спецификации первичных зародышевых клеток — Хэнкок

Благодарности

Список литературы

Добавка витамина С способствует ранней спецификации зародышевых клеток из эмбриональных стволовых клеток человека | Исследования и терапия стволовых клеток

Культура hESC

Создание линий hESC, нокаутирующих BLIMP1-mkate.

Индукция hPGCLC

Проточная цитометрия

Количественная ОТ-ПЦР

Author: alexxlab

Добавить комментарий Отменить ответ

Рубрики