Рнк нуклеиновые кислоты: Нуклеиновые кислоты (статья) | Макромолекулы

Исследования нуклеиновых кислот являются одной из самых «горячих точек» в биологии. Благодаря уникальным свойствам РНК находят все более широкое применение в медицине и технике. Но знает об этом пока лишь узкий круг специалистов.

Рибонуклеиновой кислоте, иначе – РНК – не повезло. Она не пользуется такой широкой известностью, как ее близкий «родственник» – ДНК, несмотря на большое химическое сходство. Однако открытия последних двадцати лет радикально поменяли наши взгляды на роль и функции этих, как выяснилось, очень «умелых» молекул. Плодом этих открытий стала принципиально новая идея о том, что современной жизни предшествовал совершенно самодостаточный древний «мир РНК».

Как это обычно бывает, новое знание, расширяя горизонт, породило и массу новых вопросов. Каковы были механизмы «эволюции» в мире РНК? Зачем, откуда и как появились ДНК и белки? Как произошел переход от «мира РНК» к современному миру? О поисках, которые ведутся в этом направлении, читателям рассказывают академик Валентин Викторович Власов и его сын, кандидат химических наук, Александр Власов.

Прежде чем отправиться к «началу начал», давайте запасемся необходимыми знаниями о строении нуклеи-новых кислот — ДНК (дезоксирибонуклеиновой) и РНК (рибонуклеиновой). По своему химическому составу РНК является двойняшкой, хотя и не полным близнецом, ДНК, основного хранителя генетической информации в живой клетке. Нуклеиновые кислоты представляют собой полимерные макромолекулы, состоящие из отдельных звеньев — нуклеотидов. Скелетом макромолекулы являются молекулы пятиуглеродного сахара, соединенные остатками фосфорной кислоты. К каждой молекуле сахара присоединяется одно азотистое основание. Нуклеотиды, которые различаются между собою только разными азотистыми основаниями, обозначаются буквами A, U, G, C (в РНК) и A, T, G, C (в ДНК).

Честно говоря, насчет РНК никто не задумывался долгие годы. Существовала догма, что вот есть клетка, есть хромосомы, в которых есть ДНК — хранитель генетической информации.
В конце концов, на рибосомах синтезируются белки. А РНК — она где-то в промежутке, переносчик информации от ДНК — и только. А потом посыпались открытия, которые заставили совершенно по-другому взглянуть на РНКГлавное отличие нуклеиновых кислот заключается в их углеводной компоненте. В РНК сахар — рибоза, а в ДНК — дезоксирибоза: там, где у ДНК имеется атом водорода (Н), у РНК стоит оксигруппа (ОН). Результаты таких незна­чительных, на неискушенный взгляд, различий поражают. Так, ДНК существуют в основном в форме всем известных жестких спиралей, в которых две цепи ДНК удерживаются вместе за счет образования водородных связей между комплементарными нуклеотидами.

РНК также могут формировать спирали из двух цепочек, похожие на спирали ДНК, однако в большинстве случаев РНК существуют в виде сложных структур-клубков. Структуры эти формируются не только за счет образования упомянутых водородных связей между разными участками РНК, но и благодаря оксигруппе рибозы, которая может образовывать дополнительные водородные связи и взаимодействовать с фосфорной кислотой и ионами металлов. Глобулярные структуры РНК не только внешне напоминают белковые структуры, но и приближаются к ним по свойствам: они могут взаимодействовать с самыми разными молекулами, как маленькими, так и полимерными.

Кого Считать «Живым»?

Поскольку над проблемой происхождения жизни работают ученые из разных областей, каждый оперирует терминами близкой ему науки. Химики обязательно вспомнят слово «катализатор», математики — «информация». Биологи будут считать живой систему, содержащую вещество (генетическую программу), которое может копироваться (или, по-простому, размножаться). При этом необходимо, чтобы в ходе такого копирования могли происходить некоторые изменения наследственной информации и возникать новые варианты систем, т. е. должна существовать возможность эволюции. Еще биологи обязательно заметят, что такие системы должны быть пространственно обособлены. Иначе возникшие более прогрессивные системы не смогут воспользоваться своими преимуществами, поскольку их более эффективные катализаторы и другие продукты будут беспрепятственно «уплывать» в окружающую среду.

Каким же образом первые молекулярные системы были обособлены от окружающей среды? Колонии молекул могли, например, удерживаться вместе за счет адсорбции на какой-нибудь минеральной поверхности или пылевых частицах. Однако возможно, что уже самые примитивные системы располагали, подобно современным живым клеткам, настоящей мембранной оболочкой. Дело в том, что такая «протоклетка» с липидной мембраной может образоваться очень про­сто. Многие молекулы с заряженными группами (напри­мер, жирные кислоты) в водной среде образуют микроскопические пузырьки — липосомы. Это слово должно быть хорошо известно прекрасной половине наших читателей: липосомы широко используются в косметических кремах — крохотные жировые капсулы начиняются витаминами и другими биологически активными веществами. А вот чем были наполнены древние «протоклетки»? Оказалось, что на роль «начинки» претендуют именно РНК.

РНК умеет все?

Рассмотрим давно известные функции РНК, связанные с работой (экспрессией) гена в клетке. При включении гена сначала происхо­дит локальное расплетение ДНК и синтези­руется РНК-копия генетической программы. В результате сложных обработок ее специальными белками получается матричная РНК (мРНК), которая и явля-ется программой для синтеза белка. Эта РНК переносится из яд­ра в цитоплазму клетки, где она связывается со специальными клеточными структурами — рибосомами, настоящими молекулярными «машинами» для синтеза белка. Белок син­тезируется из активированных аминокислот, присо­единенных к особым транспортным РНК (тРНК), причем каждая из аминокислот присоединена к своей специфической тРНК. Благодаря тРНК аминокислота фиксируется в каталитическом центре рибосомы, где она «пришивается» к синтезируемой белковой цепи. Из рассмотренной последовательности событий видно, что молекулы РНК играют ключевую роль в декодировании генетической информации и биосинтезе белка.

Чем больше углублялись в изучение различных био­синтетических процессов, тем чаще обнаруживали ранее неизвестные функции РНК. Оказалось, что кроме процесса транскрипции (синтеза РНК путем копирования участка ДНК) в ряде случаев, наоборот, может происходить синтез ДНК на РНК-матрицах. Этот процесс, названный обратной транскрипцией, используют в ходе своего развития многие вирусы, в том числе печально известные онкогенные вирусы и ВИЧ-1, вызывающий СПИД.

Таким образом, выяснилось, что поток генетической информации не является, как первоначально считалось, однонаправленным — от ДНК к РНК. Роль ДНК как изначально главного носителя генетической информации стала подвергаться сомнению. Тем более что многие вирусы (гриппа, клещевого энцефалита и другие) вообще не используют ДНК в качестве генетического материала, их геном построен исключительно из РНК. А далее посыпались одно за другим открытия, которые заставили совершенно по-другому взглянуть на РНК.

На Все «Молекулы» Мастер

Окончательная уверенность в том, что «мир РНК» действительно существовал, наступила после выявления деталей строения кристаллов рибосом методом рентгеноструктурного анализа. Ученые рассчитывали обнаружить там белок, катализирующий сшивание аминокислот в белковую последовательность. Каково же было их удивление, когда выяснилось, что в каталитическом центре рибосом белковых структур нет совсем, что он полностью построен из РНК! Оказалось, что все ключевые стадии биосинтеза белка осуществляются молекулами РНК. Точка в дискуссии о возможности существования «мира РНК» как особой стадии биологической эволюции была поставлена.

Конечно, полную картину еще предстоит реконструировать — осталось много нерешенных вопросов. Например, в современной клетке активацию аминокислот и их присоединение к соответствующим тРНК осуществляют специфичные белки-ферменты. Возникают вопросы: могла ли эта реакция осуществляться без участия белков, только с помощью РНК? Могли ли сами РНК катализировать синтез РНК из нуклеотидов или присоединение азоти­стых оснований к сахару? В общем-то, после открытия рибозимов такие потенциальные способности РНК уже не вызывали особых сомнений. Но наука требует, чтобы гипотезы экспериментально подтверждались.

Дарвиновская Эволюция в Пробирке

При методе ПЦР в пробирку с ДНК вносят смесь активированных нуклеотидов, фермент ДНК-полимеразу и так называемые праймеры — олигонуклеотиды, комплементарные концам размножаемой ДНК. При нагре­вании раствора цепи ДНК расходятся. Затем, при охлаждении, с ними связываются праймеры, образуя короткие фрагменты спиральных структур. Фермент при­соединяет к праймерам нуклеотиды и собирает цепочку, комплементарную цепочке исходной ДНК. В результате реакции из одной двуцепочечной ДНК получается две. Если повторить процесс, получится четыре цепочки, а после n повторений — 2ⁿ молекул ДНК. Все очень просто.

Изобретение ПЦР и разработка методов химического синтеза ДНК позволили создать потрясающую технологию молекулярной селекции. Принцип молекулярной селекции тоже прост: сначала синтезируется множество молекул, обладающих разными свойствами (так называемая молекулярная библиотека), а затем из этой смеси отбираются молекулы с желаемым свойством.

Библиотеки нуклеиновых кислот — это смеси молекул, имеющих одинаковую длину, но отличающихся последовательностью нуклеотидов. Получить их мож­но в том случае, если при химическом синтезе на авто-матическом синтезаторе добавлять на каждой стадии удлинения нуклеотидной последовательности одно-временно все четыре нуклеотида. Каждый из них будет включаться в растущую нуклеиновую кислоту с рав­ной вероятностью, в результате чего на каждом этапе присоединения будет получаться 4 варианта последо­вательностей. Если таким образом синтезировать нуклеиновую кислоту длиной в n звеньев, то разнообра­зие полученных молекул составит 4 в степени n. Поскольку обычно используются участки длиной 30—60 мономеров, то в результате синтеза получается от 4³⁰ до 4⁶⁰ разных молекул! Цифры, привычные разве что для астрономов.

Так как в зависимости от состава нуклеиновые кислоты сворачиваются в разные пространственные струк­туры, синтез статистических последовательностей дает огромное множество молекул, различающихся по свойствам. С образовавшихся ДНК — с помощью фермента РНК-полимеразы — считывается РНК. В результате получается библиотека уже одноцепочечных РНК. Далее производится процедура отбора: раствор РНК пропускается через колонку, в которой находится нерастворимый носитель с химически присо­единенными молекулами-мишенями, чтобы «выловить» так называемый будущий аптамер, т. е. РНК, способную связывать определенные молекулы. Затем колонку промывают для удаления несвязав­шихся РНК, а затем смывают РНК, задержавшиеся на колон­ке за счет связывания с целевыми молекулами (это мож­но сделать, например, нагревая колонку).

С выделенных РНК с помощью обратной транскрип­ции делают ДНК-копии и получают из них обычные двуцепочечные молекулы ДНК. С последних же можно считывать искомые РНК-аптамеры, а затем — размножать их методом ПЦР в неограниченных количествах. Конечно, так происходит в идеальном случае, на практике все получается сложнее. Обычно исходный препарат РНК содержит огромный избыток «по-сторонних» молекул, избавиться от которого трудно. Поэтому полученную РНК вновь и вновь пропу­скают через колонку, чтобы выделить РНК, образующие самые прочные комплексы с целевыми молекулами.

С помощью такого метода были получены тысячи разных РНК-аптамеров, которые образуют специфические комплексы с различными органическими соединениями и молекулами.

Рассмотренная схема молекулярной селекции может быть применена для получения молекул с любыми свойствами. Например, были получены РНК, способные катализировать реакции синтеза РНК и бел­ков: присоединение азоти­стых оснований к рибозе, полимеризацию активированных нуклеотидов на цепочках РНК, присоединение аминокислот к РНК. Эти исследования еще раз подтвердили, что в условиях предбиологической эволюции из слу­чайных полимеров могли возникать молекулы РНК
со специфическими структурами и функциями.

Делайте Ваш Заказ!

Древние рибоциты должны были поглощать «питательные» вещества из окружающей среды, удалять продукты метаболизма и делиться в ходе размножения.
И все эти процессы требуют управления проницаемостью мембран. Поскольку мы полагаем, что никаких других функциональных молекул, кроме РНК, в рибоцитах не было, какие-то РНК обязательно должны были взаимодействовать с мембранами. Однако с химической точки зрения они совершенно не подходят для роли регуляторов проницаемости мембран.

Мембраны современных клеток и липосом, построенные из жирных кислот, несут отрицательный заряд. Поскольку РНК также заряжены отрицательно, то по закону Кулона они должны отталкиваться от липидной поверхности и тем более не могут проникать в глубь липидного слоя. Един­ственный известный способ взаимодей­ствия нукле­иновых кислот с поверхностью мембран — через двухзарядные ионы металлов. Эти положительно заряженные ионы могут играть роль мостиков, располагаясь между отрицательно заряженными группами на поверхности мембраны и фосфатными группами нуклеиновой кислоты. По­скольку такие мостиковые взаимодействия достаточно слабые, с мембраной может связаться только очень большая нуклеиновая кислота благодаря множеству слабых связей с поверхностью мембраны. Так маленькие враги привязали Гулливера к земле множеством тоненьких веревок.

Тут и помог исследователям метод молекулярной селекции. Из библиотеки РНК удалось выделить не-сколько молекул, которые очень успешно связывались с мембранами, а при достаточно высокой концентрации — даже разрывали их! Эти РНК обладали необычными свойствами. Они как бы помогали друг другу: смесь молекул разных сортов связывалась с мембранами гораздо лучше, чем молекулы одного сорта. Все стало ясным после изучения вторичных структур этих РНК. Оказалось, что в них имеются петли с комплементарными участка­ми. За счет этих участков «мембран­ные» РНК могут формировать комплексы-сообщества, которые способны образовывать множественные контакты с мембраной и делать то, что одной молекуле РНК не под силу.

Этот селекционный эксперимент подсказал, что у РНК есть дополни­тельный способ приобретения новых свойств путем образования сложных надмолекулярных комплексов. Этот механизм мог использоваться и для удерживания эволюционирующих систем РНК в виде колоний на поверхностях еще до того, как эти системы обзавелись изолирующей мембраной.

«Мир РНК»: Был, Есть и Будет!

Вполне возможно, что древние РНК значительно отличались от современных. К сожалению, следов этих древних РНК экспериментально обнаружить нельзя, речь идет о временах, удаленных от нас на миллиарды лет. Даже скалы тех времен давно «рассыпались в песок». Поэтому речь может идти только об экспериментальном моделировании процессов, которые могли протекать на самых ранних стадиях молекулярной эволюции.

Почему произошел переход от «мира РНК» к современному миру? Белки, располагающие гораздо большим набором химических групп, чем РНК, являются лучшими катализаторами и структурными элементами. По-видимому, некоторые древние РНК стали использовать белковые молекулы в качестве «орудий труда». Такие РНК, способные к тому же синтезировать для своих целей полезные молекулы из окружающей среды, получали преимущества в размножении. Есте­ственным путем отбирались соответ­ствующие аптамеры и рибозимы.
А затем эволюция сделала свое дело: возник аппарат трансляции, и постепенно ответственность за катализ перешла к белкам. Орудия ока­зались столь удобными, что вытеснили своих «хозяев» из многих сфер деятельности.

Читатель вправе спросить: а зачем вообще нужно исследовать эволюцию РНК, ведь древний «мир РНК» исчез? Неужели только ради «чистого искусства», удовлетворения интересов фанатичных исследователей? Однако, не зная прошлого, нельзя понять настоящее. Изучение эволюции и возможностей РНК может подсказать новые направления поиска процессов, протекающих в современных живых клетках. Например, совсем недавно были обнаружены мощные системы регуляции активности генов с участием двуцепочечных РНК, с помощью которых клетка защищает себя от вирусных инфекций. Эта древняя система клеточной защиты, вероятно, скоро найдет применение в терапии.

Поэтому неудивительно, что в наше время исследования нуклеиновых кислот продолжают оставаться одной из самых «горячих точек» в молекулярной биологии. Благодаря уникальным свойствам РНК находят все более широкое приме­нение в медицине и технике. Возникший в незапамятные времена «мир РНК» будет не только продолжать незримо существовать
в наших клетках, но и возрождаться в виде новых биотехнологий.

Редакция благодарит сотрудников Института химической биологии и фундаментальной медицины
СО РАН к. х. н. В. В. Коваля, к. х. н. С. Д. Мызину и к. х. н. А. А. Бондаря за помощь в подготовке статьи

В течение пары недель, для определения коронавируса, больницы начнут использовать более быстрые тесты

В ближайшие недели, в девяти больницах Эстонии, при госпитализации пациентов, в отделениях экстренной медицины, появится возможность использовать более быстрые тесты для определения заражения COVID-19, которые показывают результат в течение часа. Использовать быстрые тесты в домашних условиях Департамент здоровья по-прежнему не рекомендует, так как они при определении заражения не дают достоверный результат.

Согласно имеющейся на данный момент информации и технологии, единственная достоверная методика для ранней диагностики COVID-19 и диагностирования случаев заражения коронавирусом, это анализ на выявление РНК (нуклеиновой кислоты), для которого тампоном берется мазок с носоглотки. Диагностику на основе выявления РНК делают крупные лаборатории, а также SYNLAB и лаборатория Департамента здоровья. Проблема этого метода – медленность, которая ставит в сложное положение именно лаборатории больниц, которые делают срочные анализы в критических ситуациях. В лабораториях девяти больниц Эстонии имеется так называемое РОСТ (Point-of-Care Testing) оборудование для определения вируса по РНК, которое позволяют анализировать пробы в маленьких объемах, но получать результат в течение часа. Тесты доставят в больницы через пару недель.

«Быстрые тесты РНК подходят для использования в больницах для тестирования пациентов отделения экстренной помощи (ЕМО) в ходе триажа, для того чтобы определить, является ли человек носителем возбудителя болезни. Таким образом, при госпитализации возможно быстро распределять пациентов с позитивными и негативными результатами теста на COVID-19. При первой возможности тесты будут взяты в использование в больницах, где для этого имеется возможность», сказала заместитель главного директора Департамента здоровья Елена Томассова. «Подчеркиваю, что быстрые тесты предназначены только для использования в больницах, и люди не могут использовать их в домашних условиях».

По данным Департамента здоровья, необходимое для быстрых анализов оборудование имеется в Северо-Эстонской Региональной больнице, Клиникуме Тартуского Университета, Курессаареской больнице, Пярнуской больнице, Ида-Таллиннской центральной больнице, Ида-Вируской центральной больнице, Нарвской больнице, Таллиннской детской больнице и Раквереской больнице.

По словам руководителя лаборатории Северо-Эстонской Региональной больницы доктора Марге Кютт, в Региональной больнице для проведения быстрых тестов имеется оборудование Cepheid GeneXpert Systems, которое можно использовать для молекулярного определения возбудителя SARS-Co-V-2 методом RT-PCR. «Преимущество этого оборудования и предлагаемого метода перед имеющимся методом в том, что короче время получения результата по сравнению с тем методом, который используется сейчас, примерно 1 час вместо нынешних 4 часов», сказала доктор Марге Кютт. «Тесты от производителя Cepheid мы ожидаем примерно через 2 недели».

Другие имеющиеся сейчас на рынке так называемые серологические тесты быстрые тесты, предназначенные для использования в домашних условиях, которые основываются на определении в крови антигенов или антител, не являются достоверными и не позволяют оценить насколько пациент может быть заразен. Согласно последним исследованиям, ранние антитела к коронавирусу возникают через 5-10 дней после появления симптомов заболевания. Поэтому их не рекомендуется использовать не в медицинских учреждениях, в центрах семейных врачей, в том числе и дома. «Так как в Эстонии достаточно возможности предлагать достоверное тестирование на коронавирус РНК, то на данный момент отсутствует необходимость внедрять в использование нерекомендуемые различными международными профессиональными организациями (быстрые) тесты», добавила Елена Томассова. «Этой же точки зрения придерживаются также ученые и специалисты из Эстонского общества лабораторной медицины».

По заверениям руководителя Северо-Европейского региона SYNLAB Райнара Аамисепп, в соответствии с необходимостью и согласованным с Департаментом здоровья порядком, SYNLAB продолжит в лаборатории Таллинна тестировать на коронавирус пациентов по направлению семейного врача, людей в домах призрения и работников первой линии. В лаборатории методом PCR для диагностирования вируса SARS-CoV-2 при взятии пробы с носоглотки определяется наличие РНК, что является для выявления случаев заражения самым надежным методом. «Используемое в больницах решение РОСТ, основанное на определении РНК, идеально подходит для отделений экстренной помощи (ЕМО) и при госпитализации в больницы, так как этот метод дает быстрый ответ. Мы ежедневно делаем уже до 2000 тестов на коронавирус по аналогичному методу, но используя для этого аппаратуру, обеспечивающую большую пропускную способность. Также у нас при сотрудничестве с Medicum, Qvalitase и другими компаниями частной медицины, обеспечена достаточная способность для проведения тестирования и логистика, для того чтобы при необходимости покрыть лабораторную диагностику COVID-19 по всей Эстонии. По решению Департамента здоровья мы увеличиваем возможности тестирования в Эстонии», сказал Райнар Аамисепп.

Коротко о различных типах имеющихся тестов для диагностирования коронавируса:

• тесты на нуклеиновые кислоты вируса, то есть на определение РНК в лаборатории

Определение РНК вируса является первичным средством диагностики на COVID-19 и для определения случаев заражения как в Эстонии, так и по всему миру. Это единственная достоверная методика, которую на данный момент акцептирует как Всемирная организация здоровья (ВОЗ), так и Европейский центр профилактики и контроля заболеваний (ECDC). Тест позволяет определить вирус на ранней стадии, чтобы можно было сразу ввести карантин. РНК вируса возможно определить с помощью классического метода real-time PCR (Polymerase chain reaction), для которого используют специальную аппаратуру, обученных специалистов и адаптированный процесс работы лаборатории. Этот метод используется как в лабораториях департамента здоровья, в SYNLAB, так и в лабораториях больниц. Результат теста является достоверным и, таким образом, можно проводить тестирование в довольно большом объеме. Определение РНК в лаборатории на данный момент занимает 4-6 часов.

• более быстрые тесты на нуклеиновые кислоты вируса, то есть определение РНК в лаборатории

РНК вируса можно определить и более быстрыми методами, с помощью специальной аппаратуры, которая есть в лабораториях различных больниц. Мощность этой аппаратуры меньше, но ответ можно получить в течение часа. Это позволяет пациента, у которого проба на COVID-19 оказалась положительной, сразу отделить от других пациентов. По данным Департамента здоровья, необходимое оборудование для взятия проб есть в Северо-Эстонской региональной больнице, Клиникуме Тартуского университета, Курессаареской больнице, Пярнусской больнице, Восточно-Таллиннской центральной больнице, центральной больнице Ида-Вирумаа, Нарвской больнице, Таллиннской детской больнице и Ракверской больнице. 20 марта тест получил специальное разрешение на использование от Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, и в больницах Эстонии ожидают поставку реагентов через две недели.

• быстрые тесты на определение антигенов вируса в домашних условиях

Предлагаемые (быстрые) тесты на определение антигенов коронавируса показали очень низкую чувствительность и дают много ложноотрицательных результатов, по сравнению с тестом на определение РНК, из-за чего пациенты с COVID-19 могут прекратить карантин. Это значит, что тесты нужно перепроверять в лабораториях с помощью тестов РНК. Поэтому на данный момент, ВОЗ не советует использовать тест на антигены для клинический диагностики.

• серологические тесты в лаборатории на определение возникающих в организме антител, или ELISA тесты

ELISA используют для определения наличия противовирусных антител в пробе, обычно в крови. Метод основывается на специфичной химической реакции между антигеном вируса и специфичными для вируса антителами. Тест можно сделать только в лабораторных условиях. Пока антитела возникнут в организме в ответ на заболевание, пройдет, по некоторым данным 5-10 с момента появления симптомов. Это означает, что для ранней диагностики и принятия решения о карантине, тест на наличие антител не подходит. Как ВОЗ, так и ECDC считают, что определение антител может оказаться полезным для дальнейших сероэпидемиологических исследований, чтобы определить иммунитет населения.

• cерололгичсеские быстрые тесты на определение противовирусных антител в организме в домашних условиях

(Быстрые) тесты на антитела COVID-19, которые сейчас чаще всего предлагают в качестве быстрых тестов, определяют ответную реакцию организма на вирус, для формирования которой нужно время. Согласно последним исследованиям на возникновение антител к коронавирусу уходит от 5 до 10 дней после появления симптомов. Поскольку все это время пациент является высоко заразным, данный тест не подходит для ранней диагностики и принятия решения о карантине. Такие быстрые тесты дают много ложноотрицательных результатов, поэтому ВОЗ и ECDC на данный момент их не рекомендуют. Сейчас на международном рынке много подделок, и данные о качестве таких тестов отсутствуют.

Топ-5 современных методик выделения нуклеиновых кислот

Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. В данной статье рассматриваются самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.

Выделение фенол-хлороформом

Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статье 1967 года ¹, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот.

Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе ² (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК.

Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками.

Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени ³. 

Выделение на спин-колонках

Рис.2. Схема протокола выделения на спин-колонках.

Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году ⁴. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё (Рис.2). Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.

Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено ⁵.

Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. 

На рынке этот метод представлен большим разнообразием наборов от таких производителей, как Qiagen, Analytik Jena, NEB, ThermoFisher и других. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.

Выделение на магнитных частицах

Рис.3. Схема протокола выделения на магнитных частицах.

Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах ⁶. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют ⁷ (Рис.3).

Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга). Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике ³. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.

Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena,  ThermoFisher и другие.

Умное выделение (Smart Extraction)

Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry ⁸.

Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью ⁹. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы. Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот.

Ферментативное температурно-зависимое выделение

Рис.5. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM. * — несмотря на невысокую степень очистки, образец отлично подходит для дальнейшего использования в ПЦР, секвенировании и STR.

Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

Специалисты из новозеландской компании MicroGEM (ранее известной как ZyGEM) ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами ¹⁰.

Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. После этого пробирку нагревают до 75°C, что активирует работу протеиназы EA1, которая разрушает все белки и высвобождает нуклеиновые кислоты. Последующее нагревание до 95°C дезактивирует EA1, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5). Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов.

Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.

Обзор подготовлен при поддержке компании SkyGen — официального дистрибьютора продукции Analytik Jena, MicroGEM, Qiagen, NEB и других производителей.

1. Rae, P. M. M., Barnett, T. R. & Babbitt, D. G. Factors influencing the yield of satellite DNA in extractions from Drosophila virilis and Drosophila melanogaster adults and embryos. BBA Sect. Nucleic Acids Protein Synth. (1976) doi:10.1016/0005-2787(76)90157-X.

2. Patrinos, G. P., Danielson, P. B. & Ansorge, W. J. Molecular Diagnostics: Past, Present, and Future. in Molecular Diagnostics: Third Edition (2016). doi:10.1016/B978-0-12-802971-8.00001-8.

3. Ali, N., Rampazzo, R. D. C. P., Costa, A. Di. T. & Krieger, M. A. Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics. BioMed Research International (2017) doi:10.1155/2017/9306564.

4. Vogelstein, B. & Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1979) doi:10.1073/pnas.76.2.615.

5. Green, M. R. & Sambrook, J. Molecular Cloning, 3-Volume Set : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press (2012).

6. Trevor Hawkins. DNA PURIFICATION AND ISOLATION USNG MAGNETIC PARTICLES. United States Pat. (#5,705,628 ) 9, 2989–2997 (1998).

7. Tan, S. C. & Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: The past and the present. Journal of Biomedicine and Biotechnology (2009) doi:10.1155/2009/574398.

8. http://www.dual-chemistry.com/

9. https://www.analytik-jena.com/products/kits-assays-reagents/extraction-technology/

10. https://microgembio.com/pdqex/

против РНК — 5 ключевых отличий и сравнение

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК), возможно, являются наиболее важными молекулами в клеточной биологии, ответственными за хранение и считывание генетической информации, лежащей в основе всей жизни. Оба они представляют собой линейные полимеры, состоящие из сахаров, фосфатов и оснований, но есть некоторые ключевые различия, которые разделяют эти два типа ¹ . Эти различия позволяют двум молекулам работать вместе и выполнять свои основные роли.Здесь мы рассмотрим 5 ключевых различий между ДНК и РНК. Прежде чем мы углубимся в различия, мы рассмотрим эти две нуклеиновые кислоты бок о бок.

Сравнение спирали и основной структуры РНК и ДНК

ДНК и РНК — Сравнительная таблица

Каковы основные различия между ДНК и РНК?

Функция

Какие три типа РНК?

• Информационная РНК ( мРНК ) копирует части генетического кода, процесс, называемый транскрипцией, и переносит эти копии в рибосомы, являющиеся клеточными фабриками, которые способствуют производству белков из этого кода.
• РНК переноса ( тРНК ) отвечает за доставку аминокислот, основных строительных блоков белка, на эти белковые фабрики в ответ на закодированные инструкции, вводимые мРНК. Этот процесс построения белка называется трансляцией.
• Наконец, рибосомная РНК ( рРНК ) является компонентом самой фабрики рибосом, без которой производство белка не могло бы происходить ³ .

Сахар

И ДНК, и РНК построены на основе сахара, но в то время как сахар в ДНК называется дезоксирибозой (слева на изображении), сахар в РНК называется просто рибозой (справа на изображении).Префикс «дезокси» означает, что, хотя РНК имеет две гидроксильные (-ОН) группы, присоединенные к ее углеродной основной цепи, ДНК имеет только одну и вместо нее присоединен одинокий атом водорода. Дополнительная гидроксильная группа РНК оказывается полезной в процессе преобразования генетического кода в мРНК, которые могут быть превращены в белки, в то время как сахар дезоксирибозы придает ДНК большую стабильность ⁴ .

Химическая структура дезоксирибозы (слева) и рибозы (справа) Сахаров

Основания

Азотистые основания в ДНК являются основными единицами генетического кода, и их правильное упорядочение и объединение в пары имеют важное значение для биологической функции.Четыре основания, составляющие этот код, — это аденин (A), тимин (T), гуанин (G) и цитозин (C). Основания объединяются в пару в структуру двойной спирали, эти пары представляют собой A и T, а также C и G. РНК не содержит тиминовых оснований, заменяя их основаниями урацила (U), которые соединяются с аденином ¹ .

Структура

Расположение

Эукариотические клетки, включая все клетки животных и растений, содержат большую часть своей ДНК в ядре, где она существует в сильно сжатой форме, называемой хромосомой ⁵ .Этот сжатый формат означает, что ДНК можно легко хранить и переносить. Помимо ядерной ДНК, часть ДНК присутствует в митохондриях, производящих энергию, небольших органеллах, свободно плавающих в цитоплазме, области клетки за пределами ядра.

Три типа РНК находятся в разных местах. мРНК образуется в ядре, причем каждый фрагмент мРНК копируется из соответствующего участка ДНК перед тем, как покинуть ядро ​​и попасть в цитоплазму. Затем фрагменты перемещаются по клетке по мере необходимости, перемещаясь с помощью внутренней транспортной системы клетки, цитоскелета.тРНК, как и мРНК, представляет собой свободно перемещающуюся молекулу, которая перемещается по цитоплазме. Если он получает правильный сигнал от рибосомы, он затем будет выслеживать аминокислотные субъединицы в цитоплазме и переносить их на рибосому для встраивания в белки ⁵ . рРНК, как упоминалось ранее, находится в составе рибосом. Рибосомы образуются в области ядра, называемой ядрышком, перед тем как экспортироваться в цитоплазму, где некоторые рибосомы свободно плавают. Другие цитоплазматические рибосомы связаны с эндоплазматическим ретикулумом, мембранной структурой, которая помогает обрабатывать белки и экспортировать их из клетки ⁶ .

Ссылки

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21154/
2. https://ghr.nlm.nih.gov/primer/basics/dna
3. https: // www.rnasociety.org/about/what-is-rna/
4. https://www.nature.com/scitable/topicpage/chemical-structure-of-rna-348
5. https://www.genome.gov / 25520880 / deoxyribonucleic acid-dna-fact-sheet / # al-2
6. http://jcs.biologies.org/content/126/21/4815

ДНК и РНК | Введение в химию

Цель обучения

• Опишите структуру нуклеиновых кислот и типы молекул, которые их содержат

Ключевые моменты

• Двумя основными типами нуклеиновых кислот являются ДНК и РНК.
• И ДНК, и РНК состоят из нуклеотидов, каждый из которых содержит сахарный скелет из пяти атомов углерода, фосфатную группу и азотистое основание.
ДНК
• обеспечивает код активности клетки, в то время как РНК преобразует этот код в белки для выполнения клеточных функций.
• Последовательность азотистых оснований (A, T, C, G) в ДНК — это то, что формирует признаки организма.
• Азотистые основания A и T (или U в РНК) всегда идут вместе, а C и G всегда идут вместе, образуя 5′-3′-фосфодиэфирную связь, обнаруженную в молекулах нуклеиновых кислот.

Условия

• геномет: полная генетическая информация клетки, упакованная в виде двухцепочечной молекулы ДНК
• нуклеотид — мономер, содержащий молекулы ДНК или РНК; состоит из азотистого гетероциклического основания, которое может быть пурином или пиримидином, пятиуглеродным пентозным сахаром и фосфатной группой
Мономер
• : относительно небольшая молекула, которая может быть ковалентно связана с другими мономерами с образованием полимера.

Типы нуклеиновых кислот

Двумя основными типами нуклеиновых кислот являются дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК).ДНК — это генетический материал, содержащийся во всех живых организмах, от одноклеточных бактерий до многоклеточных млекопитающих. Он находится в ядре эукариот, в хлоропластах и ​​митохондриях. У прокариот ДНК не заключена в мембранную оболочку, а свободно плавает в цитоплазме.

Все генетическое содержимое клетки известно как ее геном, а изучение геномов — это геномика. В эукариотических клетках, но не в прокариотах, ДНК образует комплекс с гистоновыми белками с образованием хроматина, вещества эукариотических хромосом.Хромосома может содержать десятки тысяч генов. Многие гены содержат информацию для производства белковых продуктов; другие гены кодируют продукты РНК. ДНК контролирует всю клеточную активность, «включая» или «выключая» гены. ”

Другой тип нуклеиновой кислоты, РНК, в основном участвует в синтезе белка. У эукариот молекулы ДНК никогда не покидают ядро, а вместо этого используют посредника для связи с остальной частью клетки. Этим посредником является информационная РНК (мРНК). Другие типы РНК, такие как рРНК, тРНК и микроРНК, участвуют в синтезе белка и его регуляции.

Нуклеотиды

ДНК и РНК состоят из мономеров, известных как нуклеотиды. Нуклеотиды соединяются друг с другом, образуя полинуклеотид: ДНК или РНК. Каждый нуклеотид состоит из трех компонентов:

1. азотистое основание
2. пентозный (пятиуглеродный) сахар
3. фосфатная группа

Каждое азотистое основание в нуклеотиде присоединено к молекуле сахара, которая присоединена к одной или нескольким фосфатным группам.

Основание азотистое

Азотистые основания представляют собой органические молекулы и названы так потому, что содержат углерод и азот. Они являются основаниями, потому что содержат аминогруппу, которая может связывать дополнительный водород и, таким образом, уменьшать концентрацию ионов водорода в окружающей среде, делая его более основным.Каждый нуклеотид в ДНК содержит одно из четырех возможных азотистых оснований: аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) и тимин (T).

Аденин и гуанин относятся к пуринам. Первичная структура пурина состоит из двух углеродно-азотных колец. Цитозин, тимин и урацил классифицируются как пиримидины, которые имеют одно углеродно-азотное кольцо в качестве первичной структуры. К каждому из этих основных углеродно-азотных колец присоединены разные функциональные группы. В сокращении молекулярной биологии азотистые основания обозначаются просто символами A, T, G, C и U.ДНК содержит A, T, G и C, тогда как РНК содержит A, U, G и C.

Пятиуглеродный сахар

Пентозный сахар в ДНК — дезоксирибоза, а в РНК — рибоза. Разница между сахарами заключается в наличии гидроксильной группы на втором углероде рибозы и водорода на втором углероде дезоксирибозы. Атомы углерода молекулы сахара пронумерованы как 1 ‘, 2’, 3 ‘, 4’ и 5 ‘(1’ читается как «один штрих»).

Фосфатная группа

Фосфатный остаток присоединен к гидроксильной группе 5′-углерода одного сахара и гидроксильной группе 3′-углерода сахара следующего нуклеотида, которая образует 5’3 ‘фосфодиэфирную связь.Фосфодиэфирная связь не образуется простой реакцией дегидратации, как другие связи, соединяющие мономеры в макромолекулах: ее образование включает удаление двух фосфатных групп. Полинуклеотид может иметь тысячи таких фосфодиэфирных связей.

Boundless проверяет и курирует высококачественный контент с открытой лицензией из Интернета. Этот конкретный ресурс использовал следующие источники:

Что такое нуклеиновая кислота?

Нуклеиновые кислоты необходимы для всех форм жизни, и они обнаружены во всех клетках.Нуклеиновые кислоты бывают двух естественных форм, называемых дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) и рибонуклеиновой кислотой (РНК).

Изображение предоставлено: Кристоф Бургштедт / Shutterstock.com

Нуклеиновые кислоты состоят из биополимеров, которые представляют собой встречающиеся в природе повторяющиеся наборы мономеров (образующие полимеры), которые затем создают нуклеотиды, которые образуют нуклеиновые кислоты.

Чтобы понять структуру нуклеиновой кислоты, важно понять структуру нуклеотидов, составляющих нуклеиновую кислоту.

Строение нуклеиновой кислоты

Нуклеотид состоит из трех частей, связанных связями. Эти три части представляют собой фосфатную группу, 5-углеродный сахар и азотное основание.

Фосфатная группа

Фосфатная группа состоит из атома фосфора с присоединенными к нему четырьмя отрицательно заряженными атомами кислорода.

5-углеродный сахар

5-углеродный сахар (известный как пентоза) включает рибозу и дезоксирибозу, которые присутствуют в нуклеиновой кислоте.И рибоза, и дезоксирибоза имеют пять атомов углерода и один атом кислорода. К атомам углерода присоединены атомы водорода и гидроксильные группы.

В сахаре рибозы гидроксильные группы присоединены ко второму и третьему атомам углерода. В сахаре дезоксирибозы к третьему атому углерода присоединена гидроксильная группа, но ко второму атому углерода присоединен только атом водорода.

Основа азота

Молекула азота действует как основание в нуклеиновой кислоте, потому что она может отдавать электроны другим молекулам и создавать новые молекулы посредством этого процесса.Он может связываться с молекулами углерода, водорода и кислорода, создавая кольцевые структуры.

Кольцевые структуры бывают одинарными (пиримидины) и двойными кольцами (пурины). Пиримидины включают тимин, цитозин и урацил. Пурины включают аденин и гуанин. Пурины крупнее пиримидинов, и различия в их размерах помогают определить их пары в цепях ДНК.

Связи нуклеиновых кислот

Связи, которые удерживают вместе молекулы фосфора, сахара и азота, называются гликозидными связями и сложноэфирными связями.

Гликозидные связи образуются между первым атомом углерода в 5-углеродном сахаре и девятым атомом азота в азотистом основании.

Сложноэфирные связи образуются между пятым атомом углерода в 5-углеродном сахаре и фосфатной группой.

Эти связи не только удерживают вместе один нуклеотид, но они также удерживают вместе цепи нуклеотидов, которые образуют полинуклеотиды, которые образуют дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК).

Чтобы создать эти цепи, фосфатная группа, которая связана с пятым атомом углерода в 5-углеродном сахаре, будет связываться с третьим углеродным атомом в следующем 5-углеродном сахаре.Это будет повторяться, чтобы создать цепь, удерживаемую сахарно-фосфатным остовом.

Если сахар в этой цепи является сахаром рибозы, будет создана цепь РНК.

Для создания ДНК цепь РНК связывается с полинуклеотидом, который имеет аналогичную, но антипараллельную структуру, со связями, называемыми водородными связями. Эти водородные связи связывают пиримидины и пурины в азотистых основаниях вместе. В процессе, называемом комплементарным спариванием оснований, гуанин связывается с цитозином, а аденин — с тимином.Это увеличивает энергоэффективность пар оснований, и они всегда будут присутствовать в этом шаблоне.

Кредит изображения: миллиард фотографий / Shutterstock.com

Функция нуклеиновой кислоты

Каждый тип нуклеиновой кислоты выполняет различную функцию в клетках всех живых существ.

ДНК

отвечает за хранение и кодирование генетической информации в организме. Структура ДНК позволяет детям унаследовать генетическую информацию от родителей.

Поскольку нуклеотиды аденин, тимин, гуанин и цитозин в ДНК будут спариваться только в определенной последовательности (аденин с тимином и гуанин с цитозином), каждый раз, когда клетка дублирует цепь ДНК, можно указать последовательность, в которой должны находиться нуклеотиды. скопировать. Таким образом, можно создавать точные копии ДНК и передавать их из поколения в поколение.

Внутри ДНК хранятся инструкции для всех белков, которые будет производить организм.

РНК

играет важную роль в синтезе белков и регулирует экспрессию информации, хранящейся в ДНК для создания этих белков.Это также то, как генетическая информация передается в некоторых вирусах.

• Различные функции РНК включают:
• Создание новых клеток в теле
• Трансляция ДНК в белки
• Действует как посредник между ДНК и рибосомами
• Помогает рибосомам выбирать правильные аминокислоты для создания новых белков в организме.

Эти функции выполняет РНК с разными названиями. Эти имена включают:

• Трансферная РНК (тРНК)
• Рибосомная РНК (рРНК)
• Информационная РНК (мРНК).

ATP

Однако не все нуклеиновые кислоты участвуют в обработке информации, хранящейся в клетках. Аденозинтрифосфат нуклеиновой кислоты (АТФ), состоящий из азотистого основания аденина, 5-углеродного рибозного сахара и трех фосфатных групп, участвует в выработке энергии для клеточных процессов.

Связи между тремя фосфатными группами представляют собой высокоэнергетические связи и снабжают клетку энергией. Все живые клетки используют АТФ для получения энергии, позволяющей им выполнять свои функции.

Для обеспечения энергией последняя фосфатная группа в цепи удаляется, что высвобождает энергию. Этот процесс превращает АТФ в аденозиндифосфат (АДФ). Удаление двух фосфатных групп из АТФ генерирует энергию, необходимую для создания аденозинмонофосфата (АМФ).

АТФ может быть снова создан посредством процесса рециркуляции в митохондриях, который перезаряжает фосфатные группы и добавляет их обратно в цепочку.

АТФ участвует в транспортировке белков и липидов внутрь и из клеток, известной как эндоцитоз и экзоцитоз соответственно.АТФ также важен для поддержания общей структуры клетки, поскольку он помогает создать цитоскелетные свойства клетки.

Что касается специфических функций организма, АТФ играет важную роль в сокращении мышц. Сюда входят сокращения, производимые сердцем во время биения, а также движения более крупных групп мышц.

Сводка

Нуклеиновая кислота является неотъемлемой частью всего живого и является строительным блоком как для ДНК, так и для РНК. Он обнаружен во всех клетках, а также в некоторых вирусах.Нуклеиновые кислоты имеют очень разнообразный набор функций, таких как создание клеток, хранение и обработка генетической информации, построение белков и выработка энергетических клеток.

Хотя их функции могут различаться, структуры ДНК и РНК очень похожи, и только несколько фундаментальных различий в их молекулярном составе различают их.

Nucleic Acids — обзор

1 ВВЕДЕНИЕ

Молекулы нуклеиновых кислот являются структурной опорой генетического материала и, следовательно, ключевыми факторами во многих жизненно важных клеточных процессах.Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК) кодируют биологическую информацию через свою линейную последовательность нуклеотидов, чтобы определить состав белков, и через их форму, чтобы контролировать их сборку с другими клеточными макромолекулами [1].

ДНК — биополимер и важнейший компонент ядра клетки. Это носитель наследственной информации. Он состоит из нуклеотидов, которые представляют собой отдельные единицы нуклеиновых кислот. Нуклеотиды содержат три основных компонента: фосфатную группу, сахар и основание.Сахар представляет собой дезоксирибозу, пентозу с одной гидроксильной группой меньше, чем у рибозы. Основание — любое из четырех азотистых оснований — гетероциклические соединения аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) и тимин (T). Аденин и гуанин — пурины; тимин и цитозин — пиримидины. Нуклеотиды соединены фосфатной группой и дезоксирибозой с образованием непрерывной цепи. Эта цепь соединяется со второй цепью через боковые основания, образуя двойную спираль. Эти две цепи не идентичны, но имеют взаимодополняющие отношения.Пары оснований всегда представляют собой аденин-тимин (AT) и цитозин-гуанин (CG), связанные водородными связями.

Молекулярная биология и генная инженерия основаны на ДНК. Таким образом, белки образуются, когда двойная спираль расщепляется, чтобы выявить генетический код. Процесс передачи информации называется транскрипцией, результатом которой является соответствующая РНК, цепочка, в которой рибоза заменяет дезоксирибозу, а основание урацил (U) заменяет тимин. Тимин и урацил различаются метильной группой.РНК, входящая в состав ДНК, выходит из ядра и попадает в рибосомы в протоплазме, где происходит синтез белка. Поскольку РНК действует как посредник между источником информации (ДНК) и местом синтеза, ее называют информационной РНК или мРНК. Трансферные РНК направляют аминокислоты на место во время синтеза белка и обозначаются тРНК. ДНК находится в хромосомах, а РНК — в ядре и цитоплазме.

Для исследователей очень важно изучить секреты жизни, разработать новые функциональные лекарства для лечения различных заболеваний.В последние десятилетия исследования механизма реакции между небольшими молекулами и нуклеиновыми кислотами и разработка быстрых и удобных тестов на нуклеиновые кислоты являются активной областью биоаналитических химических исследований [2].

Прямое использование собственной флуоресценции [3,4] и поглощения ультрафиолетового излучения [5,6] нуклеиновых кислот для их определения и структурного исследования было серьезно ограничено низкой чувствительностью и серьезным вмешательством биологических образцов. Поэтому многие методы, основанные на взаимодействии между нуклеиновыми кислотами и внешними реагентами (зондами или метками), были разработаны для исследований, связанных с нуклеиновыми кислотами, такие как спектрофотометрические, флуориметрические и радиоактивные методы мечения [7].Однако радиоактивные зонды имеют короткий срок хранения, что опасно для человека, и требует больших затрат на утилизацию. Кроме того, они могут быть нестабильными. Таким образом, обширные усилия по разработке альтернативных методов мечения привели к форматам спектрофотометрического, флуоресцентного, резонансного светорассеяния и хемилюминесцентного анализа.

Как правило, взаимодействие малых молекул с нуклеиновыми кислотами включает четыре режима, а именно интеркаляционное связывание, связывание с бороздками [8], электростатическое связывание [9] и сборку на больших расстояниях на молекулярной поверхности нуклеиновых кислот, которая не участвует в интеркаляционном связывании. или канавка [10].

Флуоресцентные методы имеют более высокую чувствительность, чем абсорбционные, поэтому их часто используют для изучения нуклеиновых кислот. Отмечалось, что естественная интенсивность флуоресценции нуклеиновых кислот настолько мала [3], что их флуоресцентные свойства нельзя использовать непосредственно в структурном и количественном анализе [11], и для изучения нуклеиновых кислот необходимо ввести внешний флуоресцентный зонд [12]. Если небольшой молекулярный зонд внедряется в пары оснований нуклеиновой кислоты, спектр флуоресценции зонда смещается в красную область и поляризация флуоресценции увеличивается.Согласно различным типам люминесцентных молекул, флуоресцентные зонды нуклеиновых кислот бывают пяти типов: органические красители, ионы редкоземельных элементов, комплексы ионов металлов, фотохимические флуоресцентные вещества и зонды молекулярных маяков.

Исследования связывания органических красителей с ДНК очень важны для создания новых и более эффективных лекарств, нацеленных на ДНК [13, 14], а также для изучения биологической функции нуклеиновых кислот и механизма взаимодействия некоторых лекарств.

Интеркалирующие красители, как правило, представляют собой ароматические катионы с плоской структурой, которые вставляются между сложенными парами оснований на дуплексе ДНК, что обеспечивает экологически зависимое усиление флуоресценции для молекул красителя и создает большое увеличение сигнала флуоресценции по сравнению с свободным красителем в растворе. .Усиление сигнала обеспечивает пропорциональную реакцию, что позволяет проводить прямые количественные измерения ДНК. Наиболее распространенными интеркалирующими агентами являются бромид этидия [15], акридиновый оранжевый [16], профлавин [17], а также катионный цианиновый краситель тиазоловый оранжевый (TO) и его аналоги [18], такие как TOMEHE.

Акридиновый оранжевый (схема 1) взаимодействует с РНК и ДНК путем интеркаляции или электростатического притяжения. Обычно этот катионный краситель флуоресцирует с максимумом излучения при 525 нм при связывании с ДНК, но при ассоциации с РНК он показывает красную флуоресценцию около 650 нм [19].

Схема 1. Акридиновый оранжевый.

Бисбензимидазольные красители (схема 2) — Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580 представляют собой проницаемые для клеточной мембраны вещества, связывающие малые бороздки, флуоресцирующие ярко-синим цветом при связывании с ДНК [20]. Эти красители можно возбуждать УФ-источниками света и проявлять относительно большие стоксовы сдвиги — возбуждение на длине волны 350 нм и испускание на длине волны 460 нм. Они связываются с ДНК с предпочтением AT.

Схема 2. Структуры красителей Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580.

Этидийбромид (EtBr) и пропидий-йодид (PI) из интеркалоторных фенантридиния (схема 3) обычно являются непроницаемыми клеточными мембранами с небольшим предпочтением последовательности или без нее.

Схема 3. Структуры EtBr, иодида гексидия и PI.

Флуоресценция усиливается в 20-30 раз и демонстрирует большие стоксовы сдвиги при связывании с нуклеиновыми кислотами, но эти красители имеют относительно низкую молярную поглощающую способность. Их можно возбуждать в УФ-диапазоне и аргоновым лазером на 488 нм.Бромид этидия по-прежнему является наиболее распространенным красителем геля нуклеиновой кислоты.

Другой фенантридиновый краситель — иодид гексидия (схема 3) — умеренно липофильный и проницаемый для молекулярных клеток. Этот краситель избирательно окрашивает почти все грамположительные бактерии в присутствии грамотрицательных бактерий [19].

4,6′-Диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (Схема 4) представляет собой связующее с малыми бороздками, флуоресцирующее синим цветом. Его можно возбуждать УФ-источниками света, и он проявляет предпочтение AT с 20-кратным усилением флуоресценции.Комплекс DAPI – РНК демонстрирует более длинноволновое флуоресцентное излучение, чем комплекс DAPI – дцДНК (при 460 нм) [19].

Схема 4. 4,6′-Диамино-2-фенилиндол (DAPI).

Ниже мы обсуждаем в основном получение цианиновых красителей и их применение в качестве флуоресцентных нековалентных меток для исследования нуклеиновых кислот.

Нуклеиновые кислоты — функции, примеры и мономеры

Нуклеиновые кислоты — это молекулы, которые позволяют организмам передавать генетическую информацию от одного поколения к другому.Эти макромолекулы хранят генетическую информацию, которая определяет признаки и делает возможным синтез белка.

Ключевые выводы: нуклеиновые кислоты

• Нуклеиновые кислоты — это макромолекулы, которые хранят генетическую информацию и обеспечивают производство белка.
• Нуклеиновые кислоты включают ДНК и РНК. Эти молекулы состоят из длинных цепей нуклеотидов.
• Нуклеотиды состоят из азотистого основания, пятиуглеродного сахара и фосфатной группы.
ДНК
• состоит из фосфат-дезоксирибозной сахарной основы и азотистых оснований аденина (A), гуанина (G), цитозина (C) и тимина (T).
РНК
• содержит сахар рибозу и азотистые основания A, G, C и урацил (U).

Два примера нуклеиновых кислот включают дезоксирибонуклеиновую кислоту (более известную как ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (более известную как РНК). Эти молекулы состоят из длинных цепей нуклеотидов, скрепленных ковалентными связями. Нуклеиновые кислоты можно найти в ядре и цитоплазме наших клеток.

Мономеры нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты состоят из нуклеотидных мономеров , связанных вместе. Нуклеотиды состоят из трех частей:

• Азотистая основа
• Пятиуглеродный (пентозный) сахар
• Фосфатная группа

Азотистые основания включают молекулы пурина (аденин и гуанин) и молекулы пиримидина (цитозин, тимин и урацил). В ДНК пятиуглеродным сахаром является дезоксирибоза, а рибоза — пентозный сахар в РНК.Нуклеотиды связаны вместе с образованием полинуклеотидных цепей.

Они связаны друг с другом ковалентными связями между фосфатом одного и сахаром другого. Эти связи называются фосфодиэфирными связями. Фосфодиэфирные связи образуют сахарно-фосфатный остов как ДНК, так и РНК.

Подобно тому, что происходит с белковыми и углеводными мономерами, нуклеотиды связываются вместе посредством синтеза дегидратации. В синтезе дегидратации нуклеиновых кислот азотистые основания соединяются вместе, и при этом теряется молекула воды.

Интересно, что некоторые нуклеотиды выполняют важные клеточные функции как «отдельные» молекулы, наиболее распространенным примером является аденозинтрифосфат или АТФ, который обеспечивает энергию для многих функций клетки.

Структура ДНК

ДНК — это клеточная молекула, которая содержит инструкции для выполнения всех функций клетки.Когда клетка делится, ее ДНК копируется и передается от одного поколения клеток к другому.

ДНК организована в хромосомы и находится в ядре наших клеток. Он содержит «программные инструкции» для клеточной активности. Когда организмы производят потомство, эти инструкции передаются через ДНК.

ДНК обычно существует в виде двухцепочечной молекулы со скрученной формой двойной спирали. ДНК состоит из фосфатно-дезоксирибозной сахарной основы и четырех азотистых оснований:

• аденин (А)
• гуанин (G)
• цитозин (C)
• тимин (Т)

В двухцепочечной ДНК аденин соединяется с тимином (A-T), а пары гуанина — с цитозином (G-C).

Структура РНК

РНК необходима для синтеза белков. Информация, содержащаяся в генетическом коде, обычно передается от ДНК к РНК к полученным в результате белкам. Есть несколько типов РНК.

• Информационная РНК (мРНК) — это РНК-транскрипт или РНК-копия сообщения ДНК, полученная во время транскрипции ДНК.Информационная РНК транслируется с образованием белков.
• Трансферная РНК (тРНК) имеет трехмерную форму и необходима для трансляции мРНК при синтезе белка.
• Рибосомная РНК (рРНК ) является компонентом рибосом и также участвует в синтезе белка.
• МикроРНК (miRNA ) представляют собой небольшие РНК, которые помогают регулировать экспрессию генов.

РНК чаще всего существует в виде одноцепочечной молекулы, состоящей из фосфатно-рибозного сахарного остова и азотистых оснований аденина, гуанина, цитозина и урацила (U).Когда ДНК транскрибируется в транскрипт РНК во время транскрипции ДНК, гуанин соединяется с цитозином (G-C), а аденин — с урацилом (A-U).

Состав ДНК и РНК

ДНК и РНК нуклеиновых кислот различаются по составу и структуре. Различия перечислены ниже:

ДНК

• Азотистые основания: Аденин, гуанин, цитозин и тимин
• Пятиуглеродный сахар: Дезоксирибоза
• Структура: Двухцепочечный

ДНК обычно имеет трехмерную форму двойной спирали.Эта закрученная структура позволяет ДНК раскручиваться для репликации ДНК и синтеза белка.

РНК

• Азотистые основания: Аденин, гуанин, цитозин и урацил
• Пятиуглеродный сахар: Рибоза
• Структура: Одноцепочечный

Хотя РНК не принимает форму двойной спирали, как ДНК, эта молекула способна образовывать сложные трехмерные формы. Это возможно, потому что основания РНК образуют комплементарные пары с другими основаниями на той же цепи РНК.Спаривание оснований заставляет РНК складываться, образуя различные формы.

Больше макромолекул

• Биологические полимеры: макромолекулы, образованные путем соединения небольших органических молекул.
• Углеводы: включают сахариды или сахара и их производные.
• Белки: макромолекулы, образованные из мономеров аминокислот.
• Липиды: органические соединения, в том числе жиры, фосфолипиды, стероиды и воски.

Пептидные нуклеиновые кислоты, а не РНК, могли быть первой генетической молекулой

Abstract

Существует множество проблем с нынешним представлением о РНК как о первом генетическом материале.Пока не было продемонстрировано никаких вероятных пребиотических процессов для производства нуклеозидов или нуклеотидов или для эффективной двусторонней неферментативной репликации. Пептидная нуклеиновая кислота (ПНК) является многообещающим предшественником РНК, состоящей из N — (2-аминоэтил) глицина (AEG) и аденина, урацила, гуанина и цитозин- N -уксусных кислот. Однако пока не было продемонстрировано, что ПНК является пребиотиком. Мы показываем здесь, что AEG образуется непосредственно в реакциях электрического разряда из CH ₄ , N ₂ , NH ₃ и H ₂ O.Электрические разряды также производят этилендиамин, как и полимеризация NH ₄ CN. AEG производится путем надежного синтеза Strecker с этилендиамином. Полимеризация NH ₄ CN в присутствии глицина приводит к получению аденина и гуанина- N ⁹ -уксусных кислот, а цитозин и урацил- N ¹ -уксусных кислот получают с высоким выходом из реакция цианоацетальдегида с гидантоевой кислотой, а не с мочевиной. Предварительные эксперименты предполагают, что AEG может быстро полимеризоваться при 100 ° C с образованием полипептидного скелета PNA.Легкость синтеза компонентов PNA и возможность полимеризации AEG усиливают возможность того, что PNA могла быть первым генетическим материалом.

Открытие каталитической активности РНК (1, 2) принесло широкое признание концепции мира РНК (3-7). Однако нестабильность рибозы и других сахаров (8), большая сложность пребиотического синтеза гликозидных связей необходимых нуклеотидов (9, 10) и невозможность достичь двусторонней неферментативной матричной полимеризации (11, 12). ) подняли серьезные вопросы о том, могла ли РНК быть первым генетическим материалом (13), хотя существуют различные мнения (6, 14).Мир пре-РНК, в котором скелет первого генетического материала отличался бы от рибозофосфата, кажется более вероятным, но природа этого скелета неизвестна. Одно предложение предлагает пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) в качестве возможного предшественника РНК (15), потому что ПНК связывает ДНК и образует двойные и тройные спиральные структуры, которые связаны со спиралью Уотсона-Крика (16–18).

Основа PNA представляет собой полимер N — (2-аминоэтил) глицин (AEG), который иногда называют этилендиаминмоноуксусной кислотой.Интересно отметить, что Вестхаймер перечислил AEG как один из множества возможных скелетов для замены рибозофосфата (19). Это было за четыре года до изобретения пептидных нуклеиновых кислот. Основания присоединены к основной цепи с помощью замещенного основаниями ацетильного звена, как показано на рис. 1. Простота компонентов PNA предполагает, что синтез пребиотиков может быть осуществим. Поэтому мы исследовали ряд пребиотических синтезов, включая электрические разряды и полимеризацию NH ₄ CN для этилендиамина (ED) и AEG, а также аденина и гуанина- N ⁹ -уксусных кислот и цитозина и урацила. N ¹ -уксусные кислоты.Мы показываем здесь, что компоненты ПНК синтезируются в потенциально пребиотических условиях. Это открытие делает правдоподобный аргумент в пользу того, что ПНК могла быть первым генетическим материалом.

В пептидных нуклеиновых кислотах рибозофосфатный остов заменен полиамидным остовом из N — (2-аминоэтил) глицин (моноуксусная кислота AEG или ED), и четыре основания связаны через линкер уксусной кислоты.

Материалы и методы

Материалы.

Все химические вещества и растворители были получены от Aldrich, Fisher или Sigma. Чистоту образца оценивали с помощью ВЭЖХ, и продукты идентифицировали по температуре плавления, УФ-спектрам поглощения и спектрам ^–1 H ЯМР. Анализ ВЭЖХ выполняли с использованием колонки YMC (Kyoto) ODS-AQ (4,5 × 250 мм) и двух насосов Beckman 110B с УФ-детектированием детектором с переменной длиной волны Kratos Spectroflow 757, установленным на 260 нм, или с детектированием флуоресценции с помощью Gilman Spectra / glo. детектор флуоресценции фильтра.

АЭГ был синтезирован из этилендиамина и хлоруксусной кислоты (20). Аденин- N ⁹ -уксусная кислота была синтезирована из аденина и метилбромацетата (21). Цитозин и урацил- N ¹ -уксусные кислоты были синтезированы из пиримидиновых оснований и хлоруксусной кислоты (22, 23). Цитозин- N ³ -уксусная кислота была синтезирована из цитозина и ангидрида хлоруксусной кислоты (24) с последующей очисткой до гомогенности обращенно-фазовой ВЭЖХ.Температура плавления, УФ-спектры поглощения и спектры ЯМР ^–1 H каждого соединения соответствовали литературным значениям.

Синтез гуанин- N ⁹ -уксусной кислоты проводили из 2-амино-6-хлорпурина и бромуксусной кислоты в сухом диметилформамиде по N ₂ (25). Окрашенный продукт суспендировали в 10,5 М NaOH и гидролизовали при комнатной температуре в течение 96 часов с получением модифицированного гуанина. Производное азотистых оснований очищали подкислением реакционной смеси для осаждения продукта с последующей очисткой с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой до гомогенности.Модифицированный гуанин охарактеризован с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, УФ-спектров поглощения и спектров ЯМР ^–1H.

Цианоацетальдегид получали реакцией изоксазола с метоксидом натрия (26). Концентрация была определена по молярной поглощающей способности 15 200 M ^-1 см ^-1 при 248 нм для натриевой соли.

Реакция.

Реакции искрового разряда с использованием CH ₄ , NH ₃ , N ₂ и H ₂ O проводили, как описано ранее (27, 28).Реакционную смесь 8,3 M NH ₄ CN получали из твердого KCN и NH ₄ Cl и нагревали в круглодонной колбе с обратным холодильником при 72 ° C в течение 20 часов. Полимер центрифугировали и надосадочную жидкость гидролизовали в 6 М HCl в течение 25 часов. Реакцию 8,3 M NH ₄ CN с 0,8 M H ₂ CO нагревали в запаянной стеклянной ампуле при 81 ° C в течение 18 часов с последующим гидролизом супернатанта в 6 M HCl в течение 20 часов. Реакция 10 M HCN, 7,5 M NH ₄ OH и 2,5 M глицина была получена из глицина, NH ₄ OH и газообразного HCN с добавлением 2.5 мл 10 М NaOH, чтобы довести pH до 9,8. Эту реакционную смесь нагревали при 80 ° C в течение 18 часов с последующим гидролизом надосадочной жидкости в 6 M HCl в течение 25 часов.

Синтез Strecker с ED и реакции с азотистыми основаниями проводили в запаянных стеклянных ампулах при 25 ° C и анализировали после кислотного гидролиза с HCl при 100 ° C в течение 20 часов. Азотистые основания (1 мМ) реагировали с 30 мМ NaCN и 70 мМ H ₂ CO или 70 мМ NaCN и 30 мМ H ₂ CO при pH 9,6 в течение 1 года. Реакцию азотистых оснований (1 мМ) с глиоксалем (1 мМ) проводили при 25 ° C и pH 8 в течение 1 месяца.

Реакцию цианоацетальдегида (1 мМ) с гидантоевой кислотой (2 М) и мочевиной (2 М) проводили в запаянных стеклянных ампулах, нагретых до 100 ° C в течение различного времени до 30 дней. Первоначально pH составлял 7 (1 мМ фосфат натрия), но в ходе реакции он снижался до 9.

Идентификация.

Выход и идентичность ED, AEG, 2,3-диаминопропионовой кислоты и глицина из образцов искрового разряда и полимеризации NH ₄ CN определяли хроматографией на колонке Dowex 50 (H ⁺ ) (29).Затем фракции, собранные с этой колонки, анализировали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Перед анализом образцы дериватизировали флуоресцентными метками OPA-NAC (30) или дансилхлоридом (31). Производные дансила изократически элюировали 0,1 М фосфатом натрия (pH 4,8), содержащим 70% метанола. Элюент для дансилглицина и всех производных OPA-NAC представлял собой 0,1 М фосфат натрия (pH 4,8), содержащий 45% метанола.

Выход и идентичность пурин- N ⁹ -уксусных кислот и пиримидин- N ¹ -уксусных кислот определяли хроматографией на колонке Dowex 50 (H ⁺ ) с использованием 4 M HCl в качестве элюент.Фракции, собранные с этой колонки, анализировали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (26). Для анализа гуанин- N ⁹ -уксусной кислоты элюент представлял собой 0,1% трифторуксусную кислоту (об. / Об.) В воде с УФ-детектированием при 254 нм. Идентификация была основана на времени элюирования, соэлюции с известным образцом и УФ-спектром поглощения.

Результаты и обсуждение

Мы использовали как высокотемпературный прибор, использованный в первых экспериментах с электрическим разрядом (27), так и прибор при комнатной температуре (28), который дает большее разнообразие аминокислот.Урожайность приведена в таблице 1.

Процентный выход глицина, АЭГ и ЭД от электрического разряда и полимеризации цианида аммония

Кроме того, мы также исследовали полимеризацию NH ₄ CN, которая дает как аденин (32), так и аминокислоты, в основном глицин (33). Реакция дала 0,03% аденина, 2,1% глицина и 4,4 × 10 ^-5 % ED, но без AEG (<1 × 10 ^-5 %). Хотя эти выходы ED и AEG низкие, они могут быть достаточными из-за высокой растворимости моногидрохлорида AEG (11.5 моль / кг H ₂ O при 25 ° C) позволит сконцентрировать его на высыхающих пляжах и лагунах.

Однако казалось вероятным, что более эффективный синтез AEG будет возможен при полимеризации NH ₄ CN в присутствии H ₂ CO, который является катализатором олигомеризации HCN до аденина (34). Полимеризация 8,3 M NH ₄ CN в присутствии 0,8 M H ₂ CO дала удовлетворительные выходы ED (0,05%) вместе с 9,5% глицина, 0.1% 2,3-диаминопропионовой кислоты и 0,041% аденина. Такие высокие концентрации NH ₄ CN и H ₂ CO могли быть достигнуты на примитивной земле путем замораживания разбавленных растворов NH ₃ , HCN и H ₂ CO, образованных электрическими разрядами (35) или фотохимическими процессами. (36–38). На рис. 2 показан возможный механизм получения ЭД и диаминопропионовой кислоты из цианида аммония и тримера HCN (39).

Предлагаемый механизм производства ED и 2,3-диаминопропионовой кислоты из тримеров NH ₄ CN и HCN с последующим образованием цианогена из высших олигомеров HCN.

Мы не смогли обнаружить AEG в реакции NH ₄ CN-H ₂ CO. Однако ED почти эквивалентен AEG, потому что AEG производится с помощью синтеза Strecker:

Эта реакция является довольно устойчивой и эффективной при высоком разбавлении, как показано на основе выходов в таблице 2 и на рис. 3. Мы обнаружили, что AEG быстро циклизуется при 100 ° C и нейтральном pH с образованием лактама, монокетопиперазина, с равновесным состоянием. константа 5,1 и период полураспада 2.5 ч. (K.E.N. и S.L.M., неопубликованные результаты).

Процентный выход AEG от данной концентрации ED, HCN и H ₂ CO

Выход AEG в зависимости от времени для реакции от 10 ^-1 до 10 ^-4 M ED, HCN и H ₂ CO при 25 ° C и pH 7 после кислотного гидролиза. Выходы AEG снижаются через 5 дней из-за образования этилендиаминдиуксусной кислоты.

На примитивной земле могло быть значительно больше АЭГ, чем показывают реакции электрического разряда или цианидной олигомеризации.Относительно низкий выход АЭГ в эксперименте по электрическому разряду, по-видимому, объясняется низкими выходами ЭД. На примитивной земле эту проблему можно было бы преодолеть, если бы в пребиотическом процессе учитывать ультрафиолетовый свет. Ogura et al. (40) показал, что УФ-свет, воздействующий на смеси CH ₄ , NH ₃ и воды, дает высокие выходы ED (33%), причем наиболее распространенным продуктом является метиламин (66%). Поскольку существуют эффективные УФ-синтезы H ₂ CO (36, 37) и HCN (38), пребиотический синтез AEG, возможно, был намного более благоприятным, чем показали эксперименты с электрическим разрядом, из-за производства ED посредством процесса Ogura.Таким образом, фотохимическая лабильность CH ₄ и NH ₃ , которая, как утверждается, делает непригодной для жизни сильно восстановительную атмосферу (41), могла быть доминирующим источником ED и AEG.

Аденин и гуанин-

Следующим шагом в пребиотическом синтезе компонентов ПНК является образование N ⁹ -уксусных производных аденина и гуанина и N ¹ -уксусных производных урацила и цитозина.Многообещающая реакция — это реакция формальдегида и цианистого водорода со свободными основаниями, как показано ниже, с аденином:

Использование 1 мМ частей каждого основания и 30–70 мМ HCN и H ₂ CO дало неутешительный выход в диапазоне от 0,04% до 0,15%. Попытки внутренней перегруппировки Канниццаро ​​с использованием 1 мМ глиоксаля и 1 мМ каждого основания дали аналогичные выходы (0,01–0,18%). Поскольку эти реакции протекали в благоприятных условиях, результаты показывают, что для модифицированных оснований необходим новый подход.

Одной из возможностей является синтез модифицированных оснований в процессе полимеризации цианидов в присутствии глицина. Эти растворы возникли бы в результате атмосферного синтеза NH ₃ и HCN, растворенных в океанской воде, содержащей глицин, в результате предыдущих синтезов электрического разряда или из внеземных источников. Разбавленные растворы можно концентрировать путем замораживания. Таким образом, нагревание смесей 2,5 М глицина, 7,5 М NH ₄ OH и 10 М NaCN дало 0.0062% аденин- N ⁹ -уксусная кислота, 0,0013% аденин- N ⁶ -уксусная кислота и 0,0051% аденин. В той же смеси гуанин- N ⁹ -уксусная кислота была получена с выходом 0,011% вместе с 5 × 10 ^-4 % гуанина. Эти выходы намного более обнадеживают, чем результаты синтеза Штрекера с основаниями, поскольку пурин- N -уксусные кислоты были выделены из сложной смеси продуктов полимеризации NH ₄ CN-глицина с выходами, сравнимыми с выходами аденина и гуанин.Эффективный синтез аденина и гуанина был продемонстрирован ранее с использованием модели замороженного океана (42, 43). На рис. 4 показан предлагаемый механизм (39) производства аденина и гуанин- N ⁹ -уксусных кислот из тетрамера HCN и глицина. Такой механизм мог бы применяться в отсутствие УФ-света из-за рассеяния или поглощения поверхностным льдом, что исключает фотохимические перестройки во время синтеза аденина (44).

Предлагаемый механизм производства пуриновой N ⁹ -уксусной кислоты из HCN и глицина.

Цитозин и урацил-

Пиримидин N ¹ -уксусные кислоты были получены путем модификации эффективного пребиотического синтеза пиримидиновых оснований в условиях сухого пляжа в результате реакции цианоацетальдегида и высоких концентраций мочевины (26). Схема реакции показана здесь:

Гидантоин, циклическая форма гидантоевой кислоты, был идентифицирован как компонент метеорита Мерчисон (45) и как продукт полимеризации HCN (46).В реакции 1 мМ цианоацетальдегида с 2 М гидантоевой кислоты наблюдались выходы до 18% для цитозина- N ¹ -уксусной кислоты и 1,8% для урацила- N ¹ -уксусной кислоты на основе цианоацетальдегида. при 100 ° С. Также было произведено около 14% цитозин- N ³ -уксусной кислоты. Мы также исследовали эту реакцию в присутствии конкурирующего нуклеофила. Использование 2 М мочевины в дополнение к 2 М гидантоевой кислоте дает цитозин и цитозин- N ¹ -уксусную кислоту в соотношении 8: 1.

Полимеризуемость и пригодность в качестве первого генетического материала.

Приведенные выше результаты показывают, что компоненты PNA, вероятно, являются пребиотическими соединениями и при благоприятных условиях могут быть основными составляющими примитивной среды. Еще предстоит разработать пребиотический синтез мономеров и механизмы их полимеризации, но пребиотическая полимеризация создает проблемы для любой потенциальной ранней генетической системы (11, 12, 47).Наши предварительные эксперименты показывают, что AEG легко полимеризуется при 100 ° C с образованием олигомеров AEG и делает это намного эффективнее, чем смеси α -аминокислот при более высоких температурах (48). Хотя ПНК также имеет собственные проблемы со стабильностью (49), они сильно зависят от последовательности и могут быть устранены путем блокирования или ацетилирования N-конца. Существует также более сложная проблема репликации ПНК, которая может осложняться циклизацией мономеров. Тем не менее, эта демонстрация того, что компоненты ПНК являются пребиотиками, предполагает возможность того, что ПНК или подобные молекулы могли быть первым генетическим материалом.Однако необходимо рассмотреть другие возможности, потому что могут быть другие скелеты и основания, которые были более многочисленными и более эффективными для репликации пребиотиков.

Благодарности

Мы благодарим Джима Кливза за подготовку образцов и технические обсуждения, а также Джеффа Бада, Джона Эйша, Чарльза Салерно и Джейсона Дворкина за полезные комментарии. Мы также хотим поблагодарить Специализированный центр исследований и обучения НАСА за стипендии (для K.E.N. и M.L.) и грантовую поддержку (для S.Л.М.).

Сноски

• ↵ * Текущий адрес: Департамент молекулярной биологии, Техасский университет, Остин, Техас 78712.

• ↵ † Кому следует обращаться с запросами на перепечатку. Электронная почта: smiller {at} ucsd.edu.

Сокращения

PNA,

пептидная нуклеиновая кислота;

AEG,

N — (2-аминоэтил) глицин;

ED,

этилендиамин

• Принята к печати 2 февраля 2000 г.

• Авторские права © 2000, Национальная академия наук

Нуклеиновые кислоты — Биология 2e

Цели обучения

К концу этого раздела вы сможете делать следующее:

• Описать структуру нуклеиновых кислот и определить два типа нуклеиновых кислот
• Объясните структуру и роль ДНК
• Объясните структуру и роль РНК

Нуклеиновые кислоты — самые важные макромолекулы для продолжения жизни.Они несут в себе генетический план клетки и несут инструкции по ее функционированию.

ДНК и РНК

Двумя основными типами нуклеиновых кислот являются дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК). ДНК — это генетический материал всех живых организмов, от одноклеточных бактерий до многоклеточных млекопитающих. Он находится в ядре эукариот, органеллах, хлоропластах и ​​митохондриях. У прокариот ДНК не заключена в мембранную оболочку.

Все генетическое содержание клетки — это ее геном, а изучение геномов — это геномика.В эукариотических клетках, но не в прокариотах, ДНК образует комплекс с гистоновыми белками с образованием хроматина, вещества эукариотических хромосом. Хромосома может содержать десятки тысяч генов. Многие гены содержат информацию для производства белковых продуктов. Другие гены кодируют продукты РНК. ДНК контролирует всю клеточную активность, «включая» или «выключая» гены.

Другой тип нуклеиновой кислоты, РНК, в основном участвует в синтезе белка. Молекулы ДНК никогда не покидают ядро, а вместо этого используют посредника для связи с остальной частью клетки.Этим посредником является информационная РНК (мРНК). Другие типы РНК, такие как рРНК, тРНК и микроРНК, участвуют в синтезе белка и его регуляции.

ДНК и РНК состоят из мономеров, которые ученые называют нуклеотидами. Нуклеотиды объединяются друг с другом с образованием полинуклеотида, ДНК или РНК. Каждый нуклеотид состоит из трех компонентов: азотистого основания, пентозного (пятиуглеродного) сахара и фосфатной группы ((рисунок)). Каждое азотистое основание в нуклеотиде присоединено к молекуле сахара, которая присоединена к одной или нескольким фосфатным группам.

Три компонента содержат нуклеотид: азотистое основание, пентозный сахар и одну или несколько фосфатных групп. Остатки углерода в пентозе пронумерованы от 1 ‘до 5’ (штрих отличает эти остатки от остатков в основании, которые пронумерованы без использования штрихового обозначения). Основание прикреплено к положению 1 ‘рибозы, а фосфат присоединено к положению 5’. Когда образуется полинуклеотид, 5′-фосфат поступающего нуклеотида присоединяется к 3′-гидроксильной группе в конце растущей цепи.Два типа пентозы находятся в нуклеотидах: дезоксирибоза (содержится в ДНК) и рибоза (содержится в РНК). Дезоксирибоза похожа по структуре на рибозу, но имеет H вместо OH в положении 2 ‘. Мы можем разделить основания на две категории: пурины и пиримидины. Пурины имеют двойную кольцевую структуру, а пиримидины — одинарное кольцо.

Азотистые основания, важные компоненты нуклеотидов, представляют собой органические молекулы и названы так потому, что содержат углерод и азот.Они являются основаниями, потому что содержат аминогруппу, которая может связывать дополнительный водород и, таким образом, уменьшать концентрацию ионов водорода в окружающей среде, делая его более основным. Каждый нуклеотид в ДНК содержит одно из четырех возможных азотистых оснований: аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) и тимин (T).

Ученые классифицируют аденин и гуанин как пурины. Первичная структура пурина состоит из двух углеродно-азотных колец. Ученые классифицируют цитозин, тимин и урацил как пиримидины, которые имеют одно углеродно-азотное кольцо в качестве первичной структуры ((рисунок)).К каждому из этих основных углеродно-азотных колец присоединены разные функциональные группы. В сокращении молекулярной биологии мы знаем азотистые основания по их символам A, T, G, C и U. ДНК содержит A, T, G и C; тогда как РНК содержит A, U, G и C.

Пентозный сахар в ДНК — дезоксирибоза, а в РНК — рибоза ((рисунок)). Разница между сахарами заключается в наличии гидроксильной группы на втором углероде рибозы и водорода на втором углероде дезоксирибозы.Атомы углерода молекулы сахара пронумерованы как 1 ‘, 2’, 3 ‘, 4’ и 5 ‘(1′ читается как «один штрих»). Фосфатный остаток присоединяется к гидроксильной группе 5′-углерода одного сахара и гидроксильной группе 3′-углерода сахара следующего нуклеотида, что образует 5′-3’-фосфодиэфирную связь. Простая реакция дегидратации, как и другие связи, соединяющие мономеры в макромолекулах, не образуют фосфодиэфирную связь. Его формирование предполагает удаление двух фосфатных групп. Полинуклеотид может иметь тысячи таких фосфодиэфирных связей.

Структура двойной спирали ДНК

имеет структуру двойной спирали ((рисунок)). Сахар и фосфат находятся на внешней стороне спирали, образуя основу ДНК. Азотистые основания уложены в интерьере, как пара ступенек лестницы. Водородные связи связывают пары друг с другом. Каждая пара оснований в двойной спирали отделена от следующей пары оснований на 0,34 нм. Две нити спирали движутся в противоположных направлениях, а это означает, что 5 ‘углеродный конец одной нити будет обращен к 3-х стороннему углеродному концу соответствующей нити.(Ученые называют это антипараллельной ориентацией и важно для репликации ДНК и во многих взаимодействиях нуклеиновых кислот.)

Нативная ДНК представляет собой антипараллельную двойную спираль. Фосфатный каркас (обозначен изогнутыми линиями) находится снаружи, а основания — внутри. Каждое основание одной нити взаимодействует посредством водородной связи с основанием противоположной нити. (Источник: Джером Уокер / Деннис Митс)

Разрешены только определенные типы пары оснований.Например, определенный пурин может сочетаться только с определенным пиримидином. Это означает, что A может соединяться с T, а G может соединяться с C, как показано (рисунок). Это базовое дополнительное правило. Другими словами, нити ДНК комплементарны друг другу. Если последовательность одной цепи представляет собой AATTGGCC, комплементарная цепь будет иметь последовательность TTAACCGG. Во время репликации ДНК каждая цепь копирует себя, в результате чего образуется двойная спираль дочерней ДНК, содержащая одну родительскую цепь ДНК и вновь синтезированную цепь.

Визуальное соединение

В двухцепочечной молекуле ДНК две цепи идут антипараллельно друг другу, так что одна цепь проходит от 5 ‘к 3’, а другая — от 3 ‘к 5’. Фосфатный остов расположен снаружи, а основания — посередине. Аденин образует водородные связи (или пары оснований) с тимином, а пары оснований гуанина — с цитозином.

Происходит мутация, и аденин заменяет цитозин. Как вы думаете, какое влияние это окажет на структуру ДНК?

РНК

Рибонуклеиновая кислота, или РНК, в основном участвует в процессе синтеза белка под руководством ДНК.РНК обычно одноцепочечная и состоит из рибонуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями. Рибонуклеотид в цепи РНК содержит рибозу (пентозный сахар), одно из четырех азотистых оснований (A, U, G и C) и фосфатную группу.

Существует четыре основных типа РНК: информационная РНК (мРНК), рибосомная РНК (рРНК), транспортная РНК (тРНК) и микроРНК (миРНК). Первая, мРНК, несет информацию от ДНК, которая контролирует всю клеточную активность в клетке. Если клетке требуется синтез определенного белка, ген этого продукта «включается», и информационная РНК синтезируется в ядре.Последовательность оснований РНК комплементарна кодирующей последовательности ДНК, с которой она была скопирована. Однако в РНК основание T отсутствует, а вместо него присутствует U. Если цепь ДНК имеет последовательность AATTGCGC, последовательность комплементарной РНК — UUAACGCG. В цитоплазме мРНК взаимодействует с рибосомами и другими клеточными механизмами ((рисунок)).

Рибосома состоит из двух частей: большой субъединицы и малой субъединицы. МРНК находится между двумя субъединицами. Молекула тРНК распознает кодон на мРНК, связывается с ним путем комплементарного спаривания оснований и добавляет правильную аминокислоту к растущей пептидной цепи.

мРНК читается в наборах из трех оснований, известных как кодоны. Каждый кодон кодирует одну аминокислоту. Таким образом, мРНК считывается и производится белковый продукт. Рибосомная РНК (рРНК) является основным компонентом рибосом, с которыми связывается мРНК. РРНК обеспечивает правильное выравнивание мРНК и рибосом. РРНК рибосомы также обладает ферментативной активностью (пептидилтрансфераза) и катализирует образование пептидной связи между двумя выровненными аминокислотами. Трансферная РНК (тРНК) — одна из самых маленьких из четырех типов РНК, обычно длиной 70–90 нуклеотидов.Он доставляет нужную аминокислоту к месту синтеза белка. Это спаривание оснований между тРНК и мРНК, которое позволяет правильной аминокислоте встраиваться в полипептидную цепь. МикроРНК представляют собой самые маленькие молекулы РНК, и их роль заключается в регулировании экспрессии генов путем вмешательства в экспрессию определенных сообщений мРНК. (Рисунок) суммирует характеристики ДНК и РНК.

Несмотря на то, что РНК является одноцепочечной, большинство типов РНК демонстрируют обширное внутримолекулярное спаривание оснований между комплементарными последовательностями, создавая предсказуемую трехмерную структуру, необходимую для их функции.

Как вы узнали, поток информации в организме идет от ДНК к РНК и белку. ДНК диктует структуру мРНК в процессе, который ученые называют транскрипцией, а РНК диктует структуру белка в процессе, который ученые называют трансляцией. Это центральная догма жизни, которая верна для всех организмов; однако исключения из правил случаются в связи с вирусными инфекциями.

Сводка раздела

Нуклеиновые кислоты — это молекулы, состоящие из нуклеотидов, которые направляют клеточную активность, такую ​​как деление клеток и синтез белка.Пентозный сахар, азотистое основание и фосфатная группа составляют каждый нуклеотид. Есть два типа нуклеиновых кислот: ДНК и РНК. ДНК несет генетический план клетки и передает его от родителей к потомству (в форме хромосом). Он имеет двойную спиральную структуру, в которой две нити, идущие в противоположных направлениях, соединены водородными связями и дополняют друг друга. РНК представляет собой одноцепочечный полимер, состоящий из связанных нуклеотидов, состоящих из пентозного сахара (рибозы), азотистого основания и фосфатной группы.РНК участвует в синтезе белка и его регуляции. Информационная РНК (мРНК) копируется из ДНК, экспортируется из ядра в цитоплазму и содержит информацию для построения белков. Рибосомная РНК (рРНК) является частью рибосом в месте синтеза белка; тогда как транспортная РНК (тРНК) переносит аминокислоту к месту синтеза белка. МикроРНК регулирует синтез белка с помощью мРНК.

Вопросы о визуальном подключении

(Рисунок) Происходит мутация, и цитозин заменяется аденином.Как вы думаете, какое влияние это окажет на структуру ДНК?

(Рисунок) Аденин больше цитозина и не сможет правильно образовать пару оснований с гуанином на противоположной цепи. Это вызовет вздутие ДНК. Ферменты репарации ДНК могут распознать выпуклость и заменить неправильный нуклеотид.

Обзорные вопросы

Нуклеотид ДНК может содержать ________.

1. рибоза, урацил и фосфатная группа
2. дезоксирибоза, урацил и фосфатная группа
3. дезоксирибоза, тимин и фосфатная группа
4. рибоза, тимин и фосфатная группа

Строительными блоками нуклеиновых кислот являются ________.

1. сахара
2. азотистые основания
3. пептиды
4. нуклеотид

Как структура двойной спирали ДНК поддерживает ее роль в кодировании генома?

1. Сахарно-фосфатный остов обеспечивает матрицу для репликации ДНК.
Спаривание
2. тРНК с цепью-шаблоном создает белки, кодируемые геномом.
3. Спаривание комплементарных оснований создает очень стабильную структуру.
4. Комплементарное спаривание оснований позволяет легко редактировать обе цепи ДНК.

Вопросы о критическом мышлении

Каковы структурные различия между РНК и ДНК?

имеет структуру двойной спирали. Сахар и фосфат находятся снаружи спирали, а азотистые основания — внутри. Мономеры ДНК — это нуклеотиды, содержащие дезоксирибозу, одно из четырех азотистых оснований (A, T, G и C) и фосфатную группу. РНК обычно одноцепочечная и состоит из рибонуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.Рибонуклеотид содержит рибозу (пентозный сахар), одно из четырех азотистых оснований (A, U, G и C) и фосфатную группу.

Какие четыре типа РНК и как они функционируют?

Четыре типа РНК: информационная РНК, рибосомная РНК, транспортная РНК и микроРНК. Информационная РНК несет информацию от ДНК, которая контролирует всю клеточную деятельность. МРНК связывается с рибосомами, состоящими из белков и рРНК, и тРНК переносит правильную аминокислоту в место синтеза белка.микроРНК регулирует доступность мРНК для трансляции.

Глоссарий

дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)

двухспиральная молекула, несущая наследственную информацию клетки

матричная РНК (мРНК)

РНК, несущая информацию от ДНК к рибосомам во время синтеза белка

нуклеиновая кислота

биологическая макромолекула, несущая генетический план клетки и инструкции для функционирования клетки

нуклеотид

мономера нуклеиновых кислот; содержит пентозный сахар, одну или несколько фосфатных групп и азотистое основание

фосфодиэфир

связь ковалентная химическая связь, которая удерживает вместе полинуклеотидные цепи с фосфатной группой, связывающей два пентозных сахара соседних нуклеотидов

полинуклеотид

длинная цепь нуклеотидов

пурин

тип азотистого основания в ДНК и РНК; аденин и гуанин — пурины

пиримидин

тип азотистого основания в ДНК и РНК; цитозин, тимин и урацил — пиримидины

рибонуклеиновая кислота (РНК)

Одноцепочечная молекула, часто спаренная по внутренним основаниям, которая участвует в синтезе белка

рибосомная РНК (рРНК)

РНК, которая обеспечивает правильное выравнивание мРНК и рибосом во время синтеза белка и катализирует образование пептидной связи

транскрипция

процесс, посредством которого матричная РНК формируется на матрице ДНК

транспортная РНК (тРНК)

РНК, несущая активированные аминокислоты к месту синтеза белка на рибосоме

перевод

процесс, посредством которого РНК управляет образованием белка