Местонахождение в клетке рнк и днк: 1.Нахождение в клетке ДНК и РНК 2. Нахождение в ядре ДНК и РНК 3.Состав нуклеотида ДНК и - Управленческое образование

Содержание

Презентация к уроку биологии с использованием модульных технологий по теме «Органические вещества клетки. нуклеиновые кислоты»». | Презентация к уроку по биологии (9 класс) на тему:

Слайд 1

Выполнил: Сергеева Елена Александровна , учитель биологии Урок по теме «НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ» 2014 МБОУ Шварихинская СОШ

Слайд 2

Цель: познакомиться с особенностями строения нуклеиновых кислот, их ролью в клетке . Задачи: Образовательные : ввести понятие нуклеиновых кислот, познакомиться с их строением и функциями в клетке, выявить основные различия и общие элементы в строении ДНК и РНК. Развивающие : сформировать умения сравнивать, оценивать, составлять общую характеристику нуклеиновых кислот, пользуясь принципом комплементарности , осуществлять репликацию ДНК. Воспитательные : профориентация, воспитание духа соревнований, коллективизма, точности и быстроты ответов, воспитание правильного поведения на уроке.

Слайд 3

Учебный материал с указанием заданий Инструкции к выполнению и проверке задания Входной контроль. Цель: проверить исходный уровень знаний основных понятий. Задание 1 . Выберите один верный ответ. 1. Углерод как элемент входит в состав: а) белков и углеводов б) углеводов и нуклеиновых кислот в) углеводов и липидов г) всех органических соединений клетки 2 . Из названных химических соединений биополимером не является: а) белок; б) крахмал в) глюкоза г) целлюлоза 3 .Среди перечисленных функций выберите функцию, которую не выполняют липиды. а) транспортная; б) строительная; в) каталитическая; г) главный энергетический резервуар клетки. 4 . Способность верблюдов хорошо переносить жажду объясняется тем,что : а) жиры сохраняют воду в организме; б) жиры выделяют воду при окислении; в) жиры создают теплоизолирующий слой, уменьшающий испарение; г) организмы выработали привычку к обезвоживанию. 5 . В клетках растений запасным углеводом является: а) глюкоза; б) крахмал в) целлюлоза; г) гликоген. 6 . Из аминокислот не состоит: а) гемоглобин; б) инсулин; в) гликоген; г) альбумин. 7 . Среди перечисленных функций выберите функцию, которую не выполняют белки. а) защитная; б) каталитическая в) строительная; г) главный энергетический резервуар клетки. 8 . Уставшему марафонцу на дистанции для поддержания сил целесообразнее давать: а) кусочек сахара; в) немного сливочного масла; б) кусок мяса; г) немного минеральной воды. 9 . В клетках животных запасным углеводом является: а) целлюлоза; б) крахмал; в) глюкоза; г) гликоген. 10 . Наибольшее количество энергии выделяется при расщеплении одного грамма: а) жира; б) глюкозы; в) белка; г) целлюлозы Самостоятельная работа. 7 мин. Сверь с ключом на доске За каждый правильный ответ – 1 балл (макс.10 б.) УЭ -1

Слайд 4

Учебный материал с указанием заданий Инструкции к выполнению и проверке задания Входной контроль. Цель: проверить исходный уровень знаний основных понятий. Задание 1 . Выберите один верный ответ. 1. Углерод как элемент входит в состав: а) белков и углеводов б) углеводов и нуклеиновых кислот в) углеводов и липидов г) всех органических соединений клетки 2 . Из названных химических соединений биополимером не является: а) белок; б) крахмал в) глюкоза г) целлюлоза 3 .Среди перечисленных функций выберите функцию, которую не выполняют липиды. а) транспортная; б) строительная; в) каталитическая ; г) главный энергетический резервуар клетки. 4 . Способность верблюдов хорошо переносить жажду объясняется тем, что: а) жиры сохраняют воду в организме; б) жиры выделяют воду при окислении; в) жиры создают теплоизолирующий слой, уменьшающий испарение; г) организмы выработали привычку к обезвоживанию. 5 . В клетках растений запасным углеводом является: а) глюкоза; б) крахмал в) целлюлоза; г) гликоген. 6 . Из аминокислот не состоит: а) гемоглобин; б) инсулин; в) гликоген; г) альбумин. 7 . Среди перечисленных функций выберите функцию, которую не выполняют белки. а) защитная; б) каталитическая в) строительная; г) главный энергетический резервуар клетки. 8 . Уставшему марафонцу на дистанции для поддержания сил целесообразнее давать: а) кусочек сахара; в) немного сливочного масла; б) кусок мяса; г) немного минеральной воды. 9 . В клетках животных запасным углеводом является: а) целлюлоза; б) крахмал; в) глюкоза; г) гликоген. 10 . Наибольшее количество энергии выделяется при расщеплении одного грамма: а) жира; б) глюкозы; в) белка; г) целлюлозы Самостоятельная работа. 7 мин. Сверь с ключом на доске За каждый правильный ответ – 1 балл (макс.10 б.) УЭ -1 Ключ 1-г 2-в 3-в 4-б 5-б 6-в 7-г 8-а 9-г 10-а

Слайд 5

Учебный материал с указанием заданий Инструкции к выполнению и проверке задания Цель: познакомиться с особенностями строения нуклеиновых кислот и их биологической ролью в клетке Задание: 1. Используйте утверждения, чтобы сфокусироваться на основной идее презентации. 2. Познакомтесь с информацией мультимедийного приложения к учебнику 3.Прочитайте текст учебника стр. 111 – 112 Прочитайте внимательно цель УЭ Работайте самостоятельно (15 мин) УЭ -2 ДО УТВЕРЖДЕНИЯ ПОСЛЕ ДНК состоит из двух спирально закрученных цепей, является хранителем наследственной информации Нуклеиновые кислоты состоят из C , H , N , O , P . В состав нуклеотидов молекулы РНК входят: азотистые основания: А,Т,Г,Ц; углевод дезоксирибоза и фосфорная кислота Мономерами нуклеиновых кислот являются аминокислоты. Существуют два типа молекул нуклеиновых кислот: ДНК и РНК

Слайд 6

Учебный материал с указанием заданий Инструкции к выполнению и проверке задания 4.Заполните пропуски в тексте. В клетках имеется … типа нуклеиновых кислот … и … . Эти биополимеры состоят из … . Каждый … состоит, в свою очередь, из (1,2,3,4) компонентов, соединенных … связями. В состав ДНК входят следующие азотистые основания … . В состав РНК — … . Число цепочек в ДНК … , а в РНК — … 5. Из предложенных компонентов составь таблицу. Строение ДНК и РНК. Работаем в парах За полный конспект задания № 4 – 10 баллов Работаем в парах Заполните таблицу За полно заполненную таблицу 10 баллов Всего – 20 баллов УЭ -2 Виды НК Местонахождение в клетке Нуклеотиды Число цепочек углевод азотистое основание Фосфорная кислота

Слайд 7

Учебный материал с указанием заданий Инструкции к выполнению и проверке задания 4.Заполните пропуски в тексте. В клетках имеется два типа нуклеиновых кислот ДНК и РНК . Эти биополимеры состоят из нуклеотидов . Каждый нуклеотид состоит, в свою очередь, из 3 компонентов, соединенных . В состав ДНК входят следующие азотистые основания аденин , тимин , цитозин , гуанин . В состав РНК — аденин , уроцил , цитозин , гуанин . . Число цепочек в ДНК 2 , а в РНК – 1. 5. Из предложенных компонентов составь таблицу. Строение ДНК и РНК. Работаем в парах За полный конспект задания № 4 – 10 баллов Работаем в парах Заполните таблицу За полно заполненную таблицу 10 баллов Всего – 20 баллов УЭ -2 Виды НК Местонахождение в клетке Нуклеотиды Число цепочек углевод азотистое основание Фосфорная кислота ДНК Ядро, пластидымитохондрии дезоксирибоза аденин , тимин , цитозин , гуанин . 1 остаток 2 РНК Рибосомы, цитпазма рибоза аденин , уроцил , цитозин , гуанин 1 остаток 1

Слайд 8

Учебный материал с указанием заданий Инструкции к выполнению и проверке задания Цель: научиться решать микробиологические задачи. Задача 1: Одна из цепочек ДНК имеет последовательность нуклеотидов: АГТ АЦЦ ГАТ АЦТ ЦГА ТТТ АЦГ … Какую последовательность нуклеотидов имеет вторая цепочка той же молекулы? Задача 2: Исследования показали, что в и-РНК содержится 34% гуанина, 18% урацила , 28% цитозина , 20% аденина . Определите процентный состав азотистых оснований в участке ДНК, являющегося матрицей для данной и-РНК. Задача 3. Ген содержит 1500 нуклеотидов. В одной из цепей содержится 150 нуклеотидов А, 200 нуклеотидов Т, 250 нуклеотидов Г и 150 нуклеотидов Ц. Сколько нуклеотидов каждого вида будет в цепи ДНК, кодирующей белок? Сколько аминокислот будет закодировано данным фрагментом ДНК? Задача 4. Белок состоит из 100 аминокислот. Установите, во сколько раз молекулярная масса участка гена, кодирующего данный белок, превышает молекулярную массу белка, если средняя молекулярная масса аминокислоты – 110, а нуклеотида – 300. Ответ поясните. Работаем вместе с классом и учителем 15 минут УЭ -3

Слайд 9

Учебный материал с указанием заданий Инструкции к выполнению и проверке задания Выходной контроль. Цель: Проверить усвоение знаний по теме. Задание: Выполните тестовое задание. 1.В каком случае правильно указан состав нуклеотида ДНК? 1)рибоза , остаток фосфорной кислоты, тимин ; 2)фосфорная кислота, урацил , дезоксирибоза ; 3)остаток фосфорной кислоты, дезоксирибоза , аденин . 2.Мономерами нуклеиновых кислот является: 1) аминокислоты; 2) глюкоза; 3) глицерин и высшие жирные кислоты; 4) нуклеотиды 3. Соответствие А-Т, Г-Ц, А-У называется: а) транскрипцией б) редупликацией в) комплементарностью . 4. В клетке ДНК содержится в: 1)ядре и митохондриях; 2)только в ядре; 3) в ядре и цитоплазме. 5.Какова функция ДНК в клетке: 1) хранение и передача наследственных свойств; 2) перенос аминокислот на рибосомы; 3) ускорение химических реакций. Работаем самостоятельно 5 минут За каждый правильный ответ – 1 балл (макс.5 б.) УЭ -4

Слайд 10

Слайд 11

Оценки за урок и домашнее задание Баллы Отметка за урок Домашнее задание – повторить стр . 111 — 112 , составить кроссворд «Нуклеиновые кислоты» 32 — 35 5 Ты молодец! 25 — 31 4 Хорошо! Повтори параграф 18 — 24 3 Не унывай! У тебя все получится! Внимательно прочитай параграф и ответь на вопросы к параграфу. Меньше 18 Не все потеряно! Возьми модуль домой и сделай заново! Спасибо за урок!

Нуклеиновые кислоты. ДНК и РНК

Поурочное планирование по предмету общая биология.

Разработал: Кабиев Александр Владимирович.

Класс: 10

Дата проведения урока: 14.11.2019 г.

Предмет: общая биология.

Тема урока: Нуклеиновые кислоты. ДНК и РНК. Тип урока: комбинированный. Вид урока: изучение нового материала. Метод ведения: беседа с обучающимися, работа с учебником, наглядными материалами, проведение эксперимента

Цель урока: обобщение и углубление знаний учащихся о строении и функциях нуклеиновых кислот; рассмотреть эволюцию представлений о строении ДНК, РНК. Продолжить развитие познавательного интереса к биологии.

Задачи:

образовательные:

усвоить знания о строении, свойствах, структуре молекул нуклеиновых
кислот, как биополимеров, принципе комплементарности в ДНК, роли

План урока:

Ход урока

Деятельность учителя.

Деятельность учащихся.

1. Орг. момент.

(1 мин)

Проверка списочного состава учащихся. Довести до учащихся цели и задачи урока.

Рапорт.

2. Актуализация базовых знаний учащихся (5 мин.)

Учитель: Деятельность человека приводит к нарушению окружающей среды, исчезают виды растений и животных, развиваются генетические болезни, мутации, ухудшается наследственность.

Сегодня ученые всего мира заинтересованы в сохранении человечества. Поэтому развиваются такие науки как молекулярная биология, генная инженерия благодаря которым возможно создание новых лекарств, направленных на лечение болезней на генетическом уровне, а также новые методы, например, клонирование и выращивание новых органов. Эти науки сегодня позволяют исследовать и определять генофонд человечества.

Для анализа строения и свойств нуклеиновых кислот используются самые разнообразные методы исследования биологии, физики, медицины.

Учитель: Помимо окружающей среды, что может еще влиять на наследственность человека?

Учитель: Какой образ жизни мы должны вести для того, чтобы наше будущее поколение было здоровым?

Слово учителя: Наша с вами задача воспитывать здоровое, сильное молодое поколение для сохранения генофонда всего человечества. Сегодня люди обеспокоены сложившейся экологической обстановкой и заботятся о своем будущем.

Слово учителя: Сейчас мы с вами проведем эксперимент.

В наш воображаемый научно-исследовательский институт обратилась молодая семейная пара, у каждого из которых в ряду поколений наблюдались врожденные дефекты. Поэтому они хотели бы узнать родятся ли у них дети с подобными отклонениями.

Чтобы вы могли ответить на вопрос этой молодой пары, мы сейчас выясним механизм передачи врожденных дефектов.

Слово учителя: А, что отвечает за нашу наследственность? Где хранится генетическая информация?

Учащиеся слушают.

Ответы учащихся: Вредные привычки (курение, алкоголизм, наркомания).

Ответ учащихся: Здоровый образ жизни

Ответ учащихся: Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).

3. Изучение нового материала по теме: Нуклеиновые кислоты. ДНК и РНК.

(29 мин)

Слово учителя: Тема нашего исследования: нуклеиновые кислоты.

Рассказ учителя: Сегодня мы с вами рассмотрим определение нуклеиновых кислот и их типы, строение молекул ДНК и РНК, роль нуклеиновых кислот в хранении и передаче наследственной информации.

Вы, сегодня научные работники, проведя генетический анализ нуклеиновых кислот – ДНК и РНК, можете дать ответ этой паре.

Первая лаборатория занимается изучением ДНК, а вторая занимается изучением РНК.

Молодые люди сдали кровь на анализы, которая была направлена в лабораторию для выделения из нее ДНК и РНК. На сложном оборудовании был проведен первичный анализ этих нуклеиновых кислот и получены данные для дальнейшего изучения

Слово учителя: я раздаю каждой группе задания для исследования). Но для того, чтобы провести анализ ДНК и РНК мы должны изучить следующие вопросы:

Определение нуклеиновых кислот и их типы – ДНК и РНК.
Открытие нуклеиновых кислот.
Местонахождение ДНК в клетке.
Строение нуклеотида ДНК.
Строение молекулы ДНК.
Принцип комплементарности.
Репликация ДНК.
Местонахождение РНК в клетке.
Строение нуклеотида РНК.
Строение молекулы РНК.
Типы РНК.

Физминутка.

Слово учителя: А, теперь каждая лаборатория может приступить к исследованиям.

Исследование состава и структуры нуклеиновых кислот – ДНК и РНК.

Научный эксперимент №1.

Исследование структуры и состава ДНК (выполняет лаборатория №1) с отражением результатов работы в таблице.

Цель: изучить состав и структуру ДНК.

• Исследование 1. Заполните схему строения нуклеотида ДНК.

• Исследование 2. Используя принцип комплементарности, определить последовательность нуклеотидов второй цепи молекулы ДНК.

• Исследование 3. Заполните таблицу.

№

Признак

ДНК

Местонахождение в клетке

Азотистые основания

Углевод

Строение молекулы

Вывод. По результатам проведенных исследований сделайте выводы.

Если по изученным показателям имеются отклонения от нормы, то в данной семье могут быть дети с аномалиями, а если все показатели в норме, то потомство будет здоровым.

Научный эксперимент №2.

Исследование структуры и состава РНК (выполняет лаборатория №2) с отражением результатов работы в таблице.

Цель: изучить состав и структуру РНК.

• Исследование 1. Заполните схему строения нуклеотида РНК.

• Исследование 2. Используя принцип комплементарности, определить последовательность нуклеотидов второй цепи молекулы РНК.

• Исследование 3. Заполните таблицу.

№

Признак

РНК

Местонахождение в клетке

Азотистые основания

Углевод

Строение молекулы

Вывод. По результатам проведенных исследований сделайте выводы.

Учитель: По завершении экспериментов объявляется ученый совет, где заведующие лабораториями представляют отчет по результатам выполненной работы и делают выводы о возможности рождения детей с аномалиями в этой семье.

№

Признак

ДНК

РНК

Местонахождение в клетке

Ядро, митохондрии

Ядро, цитоплазма

Азотистые основания

А, Г, Ц, Т.

А, Г, Ц,У.

Углевод

дезоксирибоза

рибоза

Строение молекулы

Две полинуклеотидные нити

Одна полинуклеотидная нить

Учащиеся слушают.

1). Учащиеся, пользуясь текстом учебника, находят ответы на поставленные вопросы и поэтапно отвечают (время для подготовки каждого вопроса 1 минута).

2). Ответы учащихся:

1) Нуклеиновые кислоты и их типы.

Нуклеиновые кислоты–это высокомолекулярные биополимеры, мономерами, которых являются нуклеотиды. Впервые они были обнаружены в ядрах клеток, отсюда и получили название (нуклеус – ядро). Нуклеиновые кислоты содержат углерод, водород, кислород, фосфор и азот. Существует 2 типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК).

2) Открытие ДНК.

ДНК была открыта Иоганном Фридрихом Мишером в 1869 году. Структура двойной спирали ДНК была расшифрована Френсисом Криком и Джеймсом Уотсоном в 1953 году.

3) Местонахождение ДНК в клетке. ДНК находится в ядре клетки, кроме того, имеется в митохондриях и хлоропластах.

4) Строение нуклеотида ДНК.

В состав нуклеотида ДНК входят углевод дезоксирибоза, остаток фосфорной кислоты и азотистые основания четырех видов: аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц), тимин (Т). Нуклеотиды отличаются друг от друга только азотистыми основаниями.

Азотистое основание

Нуклеотид

Аденин

Адениловый

Гуанин

Гуаниловый

Цитозин

Цитидиловый

Тимин

Тимидиловый

5) Строение молекулы ДНК

Нуклеотиды соединяются между собой в цепочку путем образования ковалентных связей между дезоксирибозой одного и остатком фосфорной кислоты соседнего нуклеотида, образуя, таким образом, длинные полимерные нити. Две полимерные нити объединяются в одну молекулу водородными связями, возникающими между азотистыми основаниями разных цепочек, и образуют двойную спираль, состоящую из двух спирально закрученных нитей. Расстояние между нуклеотидами одной нити равно 0,34 нм. На один виток спирали приходится 10 нуклеотидов, следовательно, длина одного витка спирали составляет 3,4 нм.

6) Принцип комплементарности. Нуклеотиды соединяются между собой по принципу комплементарности: против аденина одной цепи располагается тимин другой цепи, против гуанина одной цепи располагается цитозин другой цепи, то есть аденин комплементарен тимину и между ними две водородные связи, а гуанин – цитозину и между ними три водородные связи. Например, фрагмент одной из цепей ДНК имеет следующий состав: Г–Г–Г–Ц–А–А–Т–Т–Ц–А, в соответствии с принципом комплементарности фрагмент второй цепи ДНК будет иметь следующий состав: Ц‒Ц‒Ц‒Г‒Т‒Т‒А‒А‒Г‒Т. Таким образом, последовательность нуклеотидов одной цепи определяет последовательность нуклеотидов другой цепи.

7) Репликация ДНК. Репликация – процесс синтеза ДНК. Причиной нарушения структуры ДНК может служить множество факторов внешней среды таких, как вредные привычки (курение, алкоголь, наркомания), воспитание, профессиональная деятельность, физическая активность, экологические факторы (радиация, химикаты, вирусы) и многих, многих других. 8) Местонахождение РНК в клетке. РНК содержится в цитоплазме и ядре клетки.

9) Строение нуклеотида РНК.

В состав нуклеотида РНК входят углевод рибоза, остаток фосфорной кислоты и азотистые основания четырех видов: аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц), урацил (У).

10) Строение молекулы РНК. РНК состоит из одной длинной цепи, образованной из последовательно соединенных нуклеотидов.

11) Типы РНК.

1. Рибосомальная РНК (рРНК) содержится в рибосомах.

2. Информационные (иРНК) переносят информацию о последовательности нуклеотидов в ДНК, хранящуюся в ядре, к месту синтеза белка. 3. Транспортные РНК (тРНК) доставляют аминокислоты к месту синтеза белка.

Учащиеся работают 2-х в группах.

Работает 1 группа.

Работает 2 группа.

Заведующие лабораториями озвучивают результаты работы, на интерактивной доске выводится сравнительная таблица ДНК и РНК.

4. Закрепление знаний и умений, полученных на уроке.

(7 мин)

Учитель задаёт вопросы:

На интерактивной доске выводятся вопросы (Фронтальный опрос).

1. Определение нуклеиновых кислот и их типы.

2. Строение молекул ДНК и РНК.

3. Роль нуклеиновых кислот в хранении и передаче наследственной информации.

5. Подведение итогов.

(2 мин)

Учитель: объявляет оценки учащихся, фиксируя их в классном журнале и дневниках учащихся.

Учащиеся подносят дневник учителю.

6. Домашнее задание.

(1 мин)

Изучить текст учебника, с. 106-117

Фиксируют в дневнике.

Литература:

1. Константинов В.М., Резанов А.Г. Биология. – М.: Академия, 2011;

2. Константинов В.М., Резанов А.Г., Фадеева Е.О. Общая биология. – М.:

Академия, 2010;

3. Мамонтов С.Г., Захаров В.Б. Общая биология. – М.: Высшая школа, 2010

4. Агафонова И.Б., Сивоглазов В.И., Биология. Общая биология. – М.: Просвещение,

2018.

5. Чебышев Н. Биология. – М.: Новая волна, 2010.

6. http://school-collection.edu.ru;

7. http://www.openclass.ru;

8. http://bio.1september.ru/index.php;

9. http://tana.ucoz.ru.

Биология — 9

Рибосомные РНК (р-РНК) являются составной частью рибосомы. Информационные РНК (и-РНК) переносят информацию о первичной структуре белка от ДНК к месту синтеза белка. Транспортные РНК (т-РНК) присоединяют к себе аминокислоты и транспортируют их к месту синтеза белка — рибосоме. Таким образом, все виды РНК участвуют в синтезе белка.

ПРИМЕНЕНИЕ И ПРОВЕРКА ПОЛУЧЕННЫХ ЗНАНИЙ

1. Заполните таблицу:

Признаки	ДНК	РНК
Местонахождение в клетке
Строение молекулы
Строение нуклеотида

1. Укажите последовательность нуклеотидов второй цепочки ДНК, если первая цепочка имеет следующую последовательность нуклеотидов:
  А-Г-Т-Ц-А-Г-Т-А-Ц-Ц-Г-Т-Г-Ц-Т
2. Найдите ошибки в структуре молекулы ДНК:

3. Заполните схему: 4. Решите задачи:

В молекуле ДНК 27% составляют цитозиновые (Ц)-нуклеотиды. Определите процентное соотношение остальных нуклеотидов.
В молекуле ДНК содержится 680 Г-нуклеотидов, что составляет 16% от общего числа нуклеотидов ДНК. Сколько содержится А-, Т-, Ц-нуклеотидов в отдельности в данной молекуле ДНК?

Наука: Наука и техника: Lenta.ru

Биологи из Калифорнийского университета в Сан-Диего и Сан-Франциско нашли доказательства того, что сложные живые организмы, включая человека, появились из-за вирусов. Ученые выяснили, что смертоносные для бактерий бактериофаги, попав внутрь микробов, создают структуры, аналогичные клеточному ядру в эукариотах. Статья исследователей опубликована в журнале Science.

Эукариоты — большая группа организмов, которые состоят из клеток, обладающих ядром. Эта органелла содержит генетическую информацию в виде молекул ДНК. Такая структура делает геном (совокупность генов и межгенных участков) более защищенным от различных процессов, происходящих в клетке, и позволяет ему быть более сложным. Появление ядра считается одной из причин возникновения многоклеточных растений и животных. Однако ни одна из существующих гипотез происхождения органеллы, в том числе та, что предполагает участие бактериофагов, не получила широкого признания среди ученых.

Ученые визуализировали размножение вирусных частиц внутри бактерии Pseudomonas chlororaphis. Для этого они выявили важные белки бактериофага, участвующие в этом процессе, и соединили их с зеленым флуоресцентным белком (GFP), чтобы по выделению света определить местонахождение молекул в клетке микроба. Оказалось, что одним из самых активных вирусных белков является gp105. Эти молекулы объединяются в защитную капсулу, окружающую ДНК бактериофага и позволяющую ей копироваться. Другой белок — PhuZ — формирует веретено, которое держит капсулу в центре микроба. Вся структура напоминает клеточное ядро, которое отсутствует у бактерий.

Исследователи пришли к выводу, что ДНК бактериофага должна участвовать в синтезе РНК-молекул, которые покидают капсулу и отправляются к рибосомам. Последние участвуют в сборке вирусных белков и формировании зрелых бактериофагов. Подобный процесс происходит и в клетках с ядром, где ДНК является матрицей для синтеза информационной РНК, обеспечивающей, в свою очередь, синтез закодированных в генах белков.

По мнению ученых, результаты исследования помогут понять, как простые живые организмы, например бактерии, могли эволюционировать в сложные многоклеточные существа, живущие на Земле в настоящее время.

Укажите различие между РНК и ДНК по составу главных и минорных оснований, характеру углевода, строению, молекулярной массе, локализации в клетке

Напишите мне в whatsapp, пришлите ссылку на эту страницу в чат, оплатите и получите файл!

Закажите у меня новую работу, просто написав мне в whatsapp!

Описание заказа и 38% решения ( + фото):

Укажите различие между РНК и ДНК по составу главных и минорных оснований, характеру углевода, строению, молекулярной массе, локализации в клетке и функциям. Определите структуру мРНК, транскрипция которой произошла с цепи ДНК, указанной ниже, и определите % содержание нуклеотидов в соответствующем отрезке мРНК. Структура ДНК % содержания нуклеотидов в соответствующем отрезке мРНК, транскрипция которой произошла: левая цепь правая цепь с левой цепи ДНК с правой цепи ДНК CATGGCGCT G–15

Ответ

Сравнение ДНК и РНК представим в виде таблицы. Признаки ДНК РНК Местонахождение в клетке Ядро, митохондрии, хлоропласты Ядро, рибосомы, цитоплазма, хлорпласты Местонахождение в ядре Хромосомы Ядрышко Строение макромолекулы Двойной, неразветвленный линейный полимер, свернутый правозакрученной спиралью Одинарная полинуклеотидная цепочка Состав нуклеотида Азотистое основание (аденин, гуанин, тимин, цитозин), дезоксирибоза (углевод), остаток фосфорной кислоты Азотистое основание (аденин, гуанин, урацин, цитозин) Функции Химическая основа хромосомного материала (гена), синтез ДНК, НК, информация о структуре белка. Информационная РНК (иРНК) передает код наследственной информации о первичной структуре белковой молекулы, рибосомальная РНК (рРНК) входит в состав рибосом, трнспортная РНК (тРНК) переносит к Левую цепь ДНК составили в соответствии с принципом комплементарности. Отрезок мРНК, транскрипция которого произошла с правой цепи ДНК, имеет структуру . В нем одинаковое содержание и нуклеотидов, т.е. по. Содержание адениловых нуклеотидов в раза больше, чем урациловых, поэтому (содержание урациловых нуклеотидов), – содержание адениловых нуклеотидов. Аналогичные рассуждения для фрагмента мРНК, транскрипция которого произошла из левой цепи ДНК, дали следующие результаты:

Похожие готовые решения по химии:

Фрагмент ДНК имеет молекулярную массу 34700 г/моль. Определите длину фрагмента ДНК и количество аминокислот, закодированных в нём
Предложите схему кислотно-основного анализа следующей смеси ионов: калия, магния, хрома, свинца, железа (2), кобальта, кадмия и сульфат-ионы. Укажите, какие
Рассчитайте растворимость SrCrO4 с учетом влияния ионной силы, создаваемой его ионами, и без нее
Определите рН раствора, полученного сливанием 20 мл 0,02 М раствора гидроксида магния и 40 мл 5∙10-3 М раствора соляной кислоты
Белок состоит из 270 аминокислот, определите количество нуклеотидов в мРНК, тРНК, ДНК. Какую длину имеет определяющий его ген? Сколько нуклеотидов
Из каких частей состоит нуклеотид? Используя буквенные обозначения, укажите состав нуклеотида. Чем отличается нуклеотид от нуклеозида? Сделайте
Опишите первичную структуру ДНК и сформулируйте правило Е.Чаргаффа. Объясните принцип комплементарности. Определите последовательность нуклеотидов
Какие связи характерны для формирования первичной и вторичной структуры нуклеиновых кислот? Какую роль играют водородные связи в строении НК? Какова

Сравнительная характеристика ДНК и РНК

6.7.2.4. В молекуле ДНК тимидиловый нуклеотид составляет 16% от общего количества нуклеотидов. Определите количество (в процентах) каждого из остальных видов нуклеотидов.

6.7.3. Контрольные вопросы:

6.7.3.1. Кем и как была впервые доказана роль ДНК как материальной основы наследственности?

6.7.3.2. Чем отличается строение ДНК от РНК? Каковы ее функции?

6.7.3.3. Каковы функции и-РНҚ, р-РНҚ и т-РНҚ?

6.7.3.4. Почему медицину ХХІ века называют молекулярной медициной?

Разработчик: Ст. преп. Нурпеисова И.К.

На русском языке	На казахском языке	На английском языке
Молекулярная биология – часть биологии, изучающая строение и функции нуклеиновых кислот.	Молекулалық биология–нуклеин қышқылдарының қызметі мен құрылысын зерттейтін биология бөлімі.	Molecular biology – part of biology studying structure and functions of nucleic acids.
Нуклеиновые кислоты – полинуклеотиды, выполняющие роль носителей генетической информации и участвующие в реализации наследственной информации.	Нуклеин қышқылдары– тұқым қуалау ақпаратын іске асыратын және генетикалық ақпаратты тасымалдау ролін атқаратын, полинуклеотидтер.	Nucleic acids – polinucleotides, carriers of genetic information taking part in realization of genetic information.
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) –cтруктура, состоящая из двух антипараллельных,комплементарных цепей, состояшая из 4 азотистых оснований: аденин, гуанин, тимин, цитозин, связанных между собой водородными связями (А-Т, Г-Ц), носитель наследственной информации.	Дезоксирибонуклеин қышқылы (ДНҚ) – тұқым қуалау ақпаратын тасымалдайтын, құрылысы 4 азотты негіздері: аденин, гуанин, тимин, цитозин өзара сутекті байланыспен (А-Т, Ц-Г) комплементарлы байланысқан антипараллельді қос тізбек.	Desoxyribonucleic acid (DNA) – structure, consisting from two antiparallel, complementary chains, including 4 nitrogenic bases; adenin, guanin, thymin, cytosin connecting with hydrogen bonds (A-T, G-C), carrier of genetic information.
Рибонуклеиновые кислоты (РНК) –структуры, состояшие из одной цепи, включающей 4 азотистых основания: аденин, гуанин, урацил, цитозин; участвуют в процессе реализации наследственной информации.	Рибонуклеин қышқылдары –тұқым қуалау ақпаратының іске асырылуына қатысатын, құрылысы төрт азотты негіздерден: аденин, гуанин, урацил, цитозиннен тұратын бір тізбекті нуклеин қышқылы.	Ribоnucleic acids (RNA) – structures, consisting from four single chains, including 4 nitrogenic bases: adenin, guanin, uracil, cytosin: taking part in process of realization of genetic information.
Нуклеотид – мономеры нуклеиновых кислот, состоящие из азотистого основания, сахара и остатков фосфорной кислоты.	Нуклеотидтер – азотты негіз, қант және фосфор қышқылының қалдығынан тұратын нуклеин қышқылдарының мономерлері.	Nucleotide– monomers of nucleic acids, consisting from four nitrogenic bases, sugar and phosphoric acid.

Функции и расположение рибосом в клетке

Время чтения 2 мин.Просмотры 1.4k.Обновлено 2017-12-02

Рибосомы являются клеточными органеллами, которые состоят из РНК и белков. Они отвечают за биосинтез белков клетки. В зависимости от уровня белка в конкретной клетке, количество рибосом может достигать миллионов.

Отличительные характеристики

Рибосомы обычно состоят из двух субъединиц: большой субъединицы и малой субъединицы. Рибосомные субъединицы синтезируются в ядрышко и пересекают ядерную мембрану в цитоплазме через ядерные поры. Эти две субъединицы объединяются, когда рибосома присоединяется к матричной РНК (мРНК) во время синтеза белка. Рибосомы вместе с другой молекулой РНК, транспортной РНК (тРНК), помогают преобразовать кодирующие белок гены мРНК в белки. Рибосомы связывают аминокислоты вместе для образования полипептидных цепей, которые модифицируются далее, прежде чем станут функциональными белками.

Расположение в клетке

Есть два места, где рибосомы обычно существуют в эукариотической клетке: суспендированы в цитозоле (свободные рибосомы) и связаны с эндоплазматическим ретикулумом (связанные рибосомы). В обоих случаях рибосомы обычно образуют агрегаты, называемые полисомами или полирибосомами во время синтеза белка. Полирибосомы представляют собой кластеры рибосом, которые присоединяются к молекуле мРНК во время биосинтеза белка.

Это позволяет синтезировать сразу несколько копий белка из одной молекулы мРНК. Свободные рибосомы обычно производят белки, функционирующие в цитозоле (жидкий компонент цитоплазмы), тогда как связанные рибосомы обычно синтезируют белки, которые экспортируются из клетки или включаются в мембраны клетки.

Интересно, что свободные рибосомы и связанные рибосомы взаимозаменяемы, и клетка может изменять их число в соответствии с потребностями метаболизма.

Органеллы, такие как митохондрии и хлоропласты в эукариотических организмах, имеют свои собственные рибосомы, которые больше похожи на рибосомы, обнаруженные у бактерий. Субъединицы, содержащие рибосомы в митохондриях и хлоропластах, меньше (30S – 50S), чем субъединицы, обнаруженные во всей остальной части клетки (40S – 60S).

Рибосомы и протеин

Синтез белка протекает под воздействием процессов транскрипции и трансляции. В транскрипции генетический код, содержащийся в ДНК, транскрибируется в версию РНК кода, известного как матричная РНК (мРНК). В трансляции вырабатывается растущая аминокислотная цепь, также называемая полипептидной цепью. Рибосомы помогают трансформировать мРНК и связывать аминокислоты вместе для получения полипептидной цепи, которая в конечном итоге становится полностью функционирующим белком. Белки – очень важные биологические полимеры в наших клетках, поскольку они задействованы практически во всех функциях.

Гугломаг

Спрашивай! Не стесняйся!

Задать вопрос

Мне нравитсяНе нравится

Не все нашли? Используйте поиск по сайту

Что такое РНК?

	Начнем с основ. Дезоксирибонуклеиновая кислота ( ДНК ) — это молекула, с которой вы, возможно, уже знакомы; он содержит наш генетический код, план жизни. Эта важная молекула является основой «центральной догмы биологии» или последовательности событий, необходимых для функционирования жизни. ДНК — это длинная двухцепочечная молекула, состоящая из оснований, расположенных в ядре клетки. Порядок этих основ определяет генетический план, аналогично тому, как порядок букв в алфавите используется для образования слов.«Слова» ДНК состоят из трех букв (или оснований), и эти слова конкретно кодируют гены, что на языке клетки является планом для производства белков. ДНК также чрезвычайно стабильна (удивительно, что неповрежденная ДНК была выделена из замороженных шерстистых мамонтов, умерших более 10 000 лет назад!), Поэтому эти схемы используются для передачи генетической информации из поколения в поколение.
	Чтобы «прочитать» эти схемы, двойная спираль ДНК распаковывается, чтобы обнажить отдельные цепи, и фермент переводит их в мобильное промежуточное сообщение, называемое рибонуклеиновой кислотой ( РНК ).Это промежуточное сообщение называется информационной РНК ( мРНК ), и оно несет инструкции по созданию белков. Когда клетке больше не нужно производить этот белок, инструкции мРНК уничтожаются. Поскольку схемы ДНК остаются нетронутыми, клетка может вернуться к ДНК и сделать больше копий РНК, когда ей потребуется произвести больше белков.
	Затем мРНК транспортируется за пределы ядра на молекулярную фабрику, отвечающую за производство белков, называемую рибосомой.Здесь рибосома переводит мРНК с помощью другого трехбуквенного слова; каждые три пары оснований обозначают определенный строительный блок, называемый аминокислотой (их 20), для создания полипептидной цепи, которая в конечном итоге станет белком. Рибосома собирает белок в три этапа — во время инициации, на первом этапе, передающая РНК ( тРНК ) переносит на рибосому конкретную аминокислоту, обозначенную трехбуквенным кодом. На втором этапе, элонгации, каждая аминокислота последовательно соединяется пептидными связями, образуя полипептидную цепь.
	Порядок каждой аминокислоты имеет решающее значение для функциональности будущего белка; ошибки при добавлении аминокислоты могут привести к заболеванию. Наконец, во время терминации завершенная полипептидная цепь высвобождается из рибосомы и сворачивается в свое конечное белковое состояние. Белки необходимы для структуры, функции и регулирования тканей и органов тела; их функциональность, казалось бы, безгранична. Человеческие клетки производят около 100000 различных типов белков , каждый со своей собственной уникальной последовательностью РНК-мессенджера.

На протяжении второй половины 20 века мы считали, что основная роль РНК заключалась в том, чтобы быть промежуточным звеном между ДНК и белком, как описано выше. За последние три десятилетия эти давние убеждения были разрушены. Мы стали свидетелями удивительных открытий в области биологии РНК, многие из которых были сделаны в наших собственных лабораториях в Институте терапии РНК. В 1998 году Эндрю Файер и специалист Craig Mello из RTI обнаружили РНК-интерференцию (РНКи), при которой двухцепочечная РНК может находить и отключать определенные гены на основе определенных последовательностей (порядок слов).За это они получили Нобелевскую премию 2006 года! Чтобы узнать больше о РНКи и узнать, как мы превращаем этот инструмент в терапевтическую платформу, см .: Что такое РНКи? и Что такое РНК-терапия?

ДНК, РНК и белки

И.А. ДНК, РНК и белки

ДНК или другое название дезоксирибонуклеиновой кислоты является строительным блоком жизни. Он содержит информацию, необходимую клетке для синтеза белка и репликации, короче говоря, это хранилище информации, необходимой для функционирования любой клетки.Уотсон-Крик открыл нынешнюю структуру ДНК в 1953 году. Знаменитая двойная спиральная структура ДНК имеет собственное значение. В основном ДНК состоит из четырех нуклеотидных оснований. Аденин (A), гуанин (G), тимин (T) и цитозин (C). Последовательность ДНК выглядит примерно так: «ATTGCTGAAGGTGCGG». ДНК измеряется по количеству пар оснований, из которых она состоит, обычно в kBp или mBp (килограмм / мегапар оснований). У каждого основания есть комплементарное основание, что означает, что в двойной спиральной структуре ДНК A будет иметь T в качестве комплементарного основания, и аналогично G будет иметь C.nbsp; Молекулы ДНК невероятно длинные. Если бы все основания ДНК человеческого генома были обозначены как A, C, T и G, 3 миллиарда букв заняли бы 4000 книг по 500 страниц в каждой! ДНК разбита на кусочки и плотно скручена в спирали, которые называются хромосомами; у человека 23 пары хромосом. Эти хромосомы далее разбиваются на более мелкие фрагменты кода, называемые генами. 23 пары хромосом состоят из примерно 70 000 генов, и каждый ген выполняет свою функцию. Как я уже упоминал ранее, ДНК состоит из четырех нуклеотидных оснований, выяснение расположения оснований называется секвенированием ДНК, существуют различные методы секвенирования ДНК, обычно это выполняется с помощью машины или путем анализа образца ДНК. над гелем, иначе называемым гель-электрофорезом.Типичная последовательность будет выглядеть так: «ATTTGCTGACCTG».

Рис 1.1.1. Пример генетического кода с дополнительными цепями.
Определение функциональности и положения гена в хромосоме называется картированием генов. Последние разработки показывают, что ученые картируют каждый ген в организме человека. Они назвали свой проект Human Genome Project (HGP), который включает в себя тщательное изучение всех 70 000 генов человеческого тела. Ух! Это что-то невообразимое. Изменение генетического кода называется мутацией.
Значение ДНК очень велико. Последовательность гена подобна языку, который инструктирует клетку производить определенный белок. Промежуточный язык, закодированный в последовательности рибонуклеиновой кислоты (РНК), переводит сообщение гена в аминокислотную последовательность белка. Именно белок определяет признак. Это называется центральной догмой жизни .
Рис 1.a.2 Центральная догма жизни.
Примечания: Гены — это последовательности ДНК, которые заставляют клетки производить определенные белки, которые, в свою очередь, определяют признаки.Хромосомы — это цепочки генов. Мутации — это изменения в последовательности ДНК гена.
РНК чем-то похожа на ДНК; они оба представляют собой нуклеиновые кислоты азотсодержащих оснований, соединенных сахарно-фосфатным остовом. Однако структурные и функциональные различия отличают РНК от ДНК. Структурно РНК является одноцепочечной, а ДНК — двухцепочечной. В ДНК есть тимин, а в РНК — урацил. Нуклеотиды РНК включают сахарную рибозу, а не дезоксирибозу, которая является частью ДНК. Функционально ДНК поддерживает информацию, кодирующую белок, тогда как РНК использует информацию, чтобы позволить клетке синтезировать конкретный белок.

РНК	ДНК
одножильный	двухниточный
В основе лежит урацил	Имеет тимин в качестве основы
Рибоза как сахар	Дезоксирибоза как сахар
Использует информацию о кодировании белков	Поддерживает информацию о кодировании белков

а.1 Различия между ДНК и РНК Примечания: ДНК хранит генетическую информацию, а РНК использует информацию, чтобы помочь клетке производить белок. Следующий

Какая клеточная органелла хранит ДНК и синтезирует РНК?

Информация, которая определяет эти структуры и функции, находится в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК), которая хранится в ядре клетки. Рибонуклеиновая кислота (РНК) — это тип «копии» последовательности ДНК, созданной в ядре для выполнения этих инструкций.

Внутри ядра

Ядро является центром управления клетки и местом расположения хромосом. Хромосомы состоят из белков и спиралей ДНК. Молекулы ДНК организованы на основе генов, которые унаследованы от обоих родителей.

Название коллекции ДНК в ядре эукариотических клеток — , хроматин . Хроматин состоит из ДНК и белка. Внутри хромосомы плотно упакованная цепочка ДНК свернута вокруг белковых молекул, называемых гистонами .Гистоны обеспечивают структуру нити, которая позволяет уплотнять огромное количество ДНК в крошечный пакет хроматина.

Ядрышко расположено внутри ядра: органелла внутри органеллы со специальной функцией. Ядрышко клетки содержит компоненты для создания рибосом, и отвечает за производство этих органелл. Рибосомы — это органеллы, синтезирующие белки.

Структура и функции ДНК

Вся генетическая информация о человеке находится в молекуле ДНК.Код этого огромного количества данных объясняется расположением четырех химических оснований: аденина, гуанина, цитозина и тимина. Пары оснований связаны вместе и обрамлены молекулой сахара и молекулой фосфата с образованием нуклеотида . Последовательные нуклеотиды образуют спиралевидную лестничную молекулу ДНК.

ДНК является главной копией инструкций всей клеточной информации. Для выполнения клеточных функций клетка должна транскрибировать или делать копии инструкций для конкретной функции на основе последовательности нуклеотидных оснований.Эти скопированные наборы представляют собой молекулы РНК.

Синтез РНК: копирование последовательностей ДНК

В ядре синтезируются или транскрибируются компоненты РНК эукариотической клетки. Во время процесса транскрипции фермент под названием РНК-полимераза раскручивает участок ДНК. Нуклеотидная последовательность в одной цепи ДНК копируется с образованием цепи РНК.

Существует три различных типа РНК, которые могут быть синтезированы во время транскрипции: матричная РНК (мРНК) , транспортная РНК (тРНК) и рибосомная РНК (рРНК) .Различные ферменты РНК-полимеразы ответственны за создание различных типов РНК,

Структура рибосом состоит из рибосомальной РНК. Рибосомы — это место, где белки синтезируются с использованием мРНК и тРНК. Конкретные гены содержат последовательности ДНК для кодирования белков. Эти гены производят копии мРНК, которые содержат код для синтеза белков.

Белки — это биологические посредники, которые выполняют важные функции в организме, такие как ферменты и гормоны.Белки образуются из аминокислот. РНК переноса (тРНК) переносит аминокислоты в мРНК, чтобы они могли связываться с нуклеотидами в мРНК.

Рибосомы и синтез белка

Рибосомы являются местом синтеза белка в клетках. Они в основном расположены на эндоплазматическом ретикулуме , который расположен рядом с ядром и на мембране, окружающей ядро, называемой ядерной оболочкой. Состоящие в основном из рРНК и белков, рибосомы используют мРНК и тРНК для создания белков из аминокислот.МРНК предоставляет инструкции, а тРНК выстраивает аминокислоты.

После синтеза белка белки покидают рибосомы для транспортировки в аппарат Гольджи . Сортировка и модификация белков — важная функция аппарата Гольджи в эукариотических клетках.

Основы ДНК и РНК: репликация, транскрипция и трансляция

ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) — одна из самых важных молекул в вашем теле, и хотя около 99,9% вашей ДНК такая же, как и у любого другого человека, 0.1% — это то, что делает вас генетически уникальным! Эта крошечная биологическая структура представляет собой полное руководство по эксплуатации, содержащее «рецепты» белков, необходимых вашему организму для развития и функционирования.

Сегодня мы познакомим вас с основами ДНК. Мы поговорим о его структуре, способах размножения и роли, которую он играет в производстве белков.

Обновление за октябрь 2021 года:
В этом классическом посте в блоге VB теперь есть несколько новых изображений, чтобы вы могли взглянуть на наш новейший проект Visible Biology! Visible Biology — это наглядное руководство по важным биологическим концепциям и процессам, включая ДНК и хромосомы, прокариотические vs.эукариотические клетки, структуры однодольных и двудольных растений, клетки крови, фотосинтез и многое другое. Visible Biology теперь доступна для демонстраций и пробных версий инструкторов.

Структура ДНК: феноменальные биологические силы … Маленькое жизненное пространство

Знаете ли вы, что в средней клетке человека содержится около 2 м (6 футов) ДНК? Это впечатляет, учитывая, что даже самые большие ячейки имеют диаметр чуть более 100 мкм. (Кстати, это действительно крошечный размер — 1 мкм составляет одну миллионную метра.)

Узнайте, как вы можете преподавать и изучать структуру ДНК и хромосом в Visible Biology.

Как весь этот генетический материал упакован в пространство на меньше булавочной головки? Короткий ответ — это много скручиваний и намоток. ДНК обвивает белковые кластеры, называемые гистонами, с образованием единиц, называемых нуклеосомами. Эти нуклеосомы складываются в зигзагообразное волокно, которое затем образует петли.

Структура и хранение ДНК.Изображение из Visible Biology.

В каждой соматической клетке человеческого тела 46 отдельных цепочек ДНК. Каждая из них называется хромосомой. Ученые группируют их в 23 гомологичные пары, что означает, что хромосомы в каждой паре схожи по структуре и функциям. Единственным исключением из этого правила является 23-я пара — половые хромосомы — у биологически мужских особей. Половые хромосомы X и Y имеют только определенные области (аутосомные области), которые являются гомологичными.

На молекулярном уровне ДНК имеет характерную форму двойной спирали, и хотя ученые не наблюдали этого до середины 20 века, она быстро стала одной из самых знаковых форм во всей науке.

Скриншот из анимации в Visible Biology.

Стороны этой витой лестницы состоят из чередующихся молекул сахара (если быть точным, дезоксирибозы) и фосфатной группы. Каждая сторона названа в честь направления, в котором она бежит (5–3 или 3–5). «Ступени» лестницы состоят из двух азотистых оснований, скрепленных водородными связями.

Молекулярная структура ДНК. Изображение из Visible Biology.

Четыре азотистых основания — цитозин, тимин, аденин и гуанин — можно найти на цепях ДНК.По своей химической структуре цитозин и тимин относятся к пиримидинам, а аденин и гуанин — к пуринам. Аденин и тимин (A и T) всегда соединяются вместе, а гуанин и цитозин (G и C) всегда соединяются вместе. Они образуют пары таким образом, потому что A и T образуют две водородные связи друг с другом, а G и C образуют три.

На самом базовом уровне различные участки цепей ДНК (последовательности азотистых оснований) предоставляют инструкции по синтезу белков. Один участок ДНК может даже кодировать несколько белков!

Репликация: удвоение ДНК

Иллюстрация из A&P 6.

Репликация клеточной ДНК происходит до того, как клетка готовится к делению — митозу или мейозу I.

Это происходит в три (иш) этапа.

ДНК раскручивается от гистонов.
Фермент под названием ДНК-геликаза открывает спиральную структуру на участке ДНК, разрывая связи между азотистыми основаниями. Он делает это как застежку-молнию, оставляя за собой вилку репликации.
Вот здесь все становится напугано.

На 5′-3′-цепи ДНК фермент, называемый ДНК-полимеразой, скользит по направлению к репликационной вилке и использует последовательность азотистых оснований на этой цепи, чтобы создать новую цепь ДНК, комплементарную ей (это означает, что ее пары оснований с базами на старой нити).
На 3’ – 5 ’цепи несколько ДНК-полимераз сопоставляют пары оснований в частичных сегментах, удаляясь от репликационной вилки. Позже ДНК-лигаза соединяет эти частичные цепи в новый непрерывный сегмент ДНК.

Хотите узнать что-нибудь интересное? Когда молекула ДНК реплицируется, каждая из образующихся новых молекул ДНК содержит цепь оригинала, поэтому ни одна из них не является полностью «новой». Кроме того, новые гистоны создаются одновременно с репликацией ДНК, так что новые цепи ДНК могут скручиваться. вокруг них.

Интерлюдия: РНК против ДНК

Прежде чем мы обсудим транскрипцию и трансляцию, два ключевых процесса синтеза белка, нам нужно поговорить о другом виде молекулы: РНК.

РНК

очень похожа на ДНК — у нее сахарно-фосфатный остов и последовательности азотистых оснований. Однако между РНК и ДНК есть несколько существенных различий:

РНК имеет только одну нуклеотидную цепь. Похоже, это только одна сторона лестницы ДНК.

РНК содержит рибозу в качестве сахара в своей основе.

РНК содержит урацил (U) вместо тимина.

РНК меньше ДНК. РНК имеет длину около 10 000 оснований, в то время как ДНК в среднем составляет около 100 миллионов.
РНК может покидать ядро. Фактически, он выполняет большую часть своей работы в цитоплазме.

Существует несколько различных типов РНК, каждая из которых выполняет разные функции, но для целей этой статьи мы собираемся сосредоточиться на информационной РНК ( m, РНК) и транспортной РНК ( t RNA).

Создание белка, часть 1: Транскрипция

Транскрипция — это первая фаза процесса производства белка, хотя фактический синтез белка не происходит до второй фазы. По сути, во время транскрипции происходит то, что m РНК «копирует» инструкции по созданию белка из ДНК.

Иллюстрация из A&P 6.

Во-первых, фермент, называемый РНК-полимеразой, открывает участок ДНК и собирает цепь из м РНК, «считывая» последовательность оснований на одной из цепей ДНК.Если на ДНК есть буква C, то на РНК будет буква G (и наоборот). Если на ДНК есть буква Т, на РНК будет буква А, но если на ДНК есть буква А, то на РНК будет буква U (вместо буквы Т). По мере того, как РНК-полимераза движется вниз по цепочке ДНК, она замыкает спиральную структуру за ней.

Прежде чем новая РНК m сможет доставить инструкции по производству белка, она «очищается» ферментами. Они удаляют сегменты, называемые интронами, а затем соединяют вместе оставшиеся сегменты, называемые экзонами.Экзоны — это последовательности, которые на самом деле кодируют белки, поэтому именно они должны удерживаться РНК m . Вы можете думать об интронах как о прокладке между экзонами.

Кроме того, помните, как я упоминал, что одна последовательность ДНК может кодировать несколько белков? Причина этого заключается в альтернативном сплайсинге: прежде, чем m РНК покинет ядро, ее экзоны могут быть сплайсированы вместе различными способами.

Создание белка, часть 2: перевод

После того, как все очищено и готово к работе, m РНК покидает ядро и отправляется выполнять свое предназначение: участвовать в трансляции, второй половине построения белка.

В цитоплазме m РНК должна взаимодействовать с t РНК с помощью рибосомы. t РНК — это тип РНК, у которой есть место для связывания со свободными аминокислотами и особая последовательность из трех азотистых оснований (антикодон), которая связывается с рибосомой.

Рибосомы представляют собой органеллы, которые способствуют встрече t РНК и m РНК. Во время трансляции рибосомы и РНК t следуют инструкциям на РНК m и собирают аминокислоты в белки.

Иллюстрация из A&P 6.

Каждая рибосома состоит из двух субъединиц (большой и малой). Они объединяются в начале перевода. Рибосомные субъединицы обычно можно найти плавающими в цитоплазме, но рибосома будет стыковаться с грубым эндоплазматическим ретикулумом, если вырабатываемый ею белок необходимо поместить в транспортную везикулу. Рибосомы также имеют три сайта связывания, где t РНК может стыковаться: сайт A ( аминоацил, , первое положение), сайт P (пептидил , второе положение ) и сайт E (положение выхода).

В конечном счете, перевод состоит из трех этапов: инициирования, продолжения и завершения.

Во время инициации нить мРНК образует петлю, и небольшая рибосомная субъединица (нижняя часть рибосомы) зацепляется за нее и находит последовательность оснований, которая сигнализирует ей о начале транскрипции. Это называется стартовым кодоном (AUG).

Затем, t РНК с UAC-антикодоном соединяется с этим стартовым кодоном и занимает второе положение (P) сайта рибосомы. Эта РНК t несет аминокислоту метионин (Met).В этот момент большая субъединица рибосомы также занимает свое положение (она выше м РНК, а малая субъединица находится ниже).

В фазе удлинения полностью собранная рибосома начинает скользить по m РНК. Скажем, следующая последовательность оснований, с которой он сталкивается после стартового кодона, — это GCU. Молекула РНК t с антикодоном CGA будет связываться с сайтом первого положения (A) рибосомы. Аминокислота, которую он несет (аланин), образует пептидную связь с Met.После этого РНК CGA t (несущая цепь Met-Ala) перемещается во вторую позицию, и РНК UAC t входит в E-связывающий сайт. Затем сайт первой позиции готов принять новую РНК t . Этот процесс продолжается до тех пор, пока рибосома не дойдет до «стоп-кодона».

Видеозаписи из анимации в Visible Biology.

Termination — это примерно то, на что это похоже. Достигнув «стоп-кодона», РНК t , которая связывается с первым положением, несет белок, называемый фактором высвобождения.Затем аминокислотная цепь отрывается от рибосомы, уходя либо в цитозоль, либо в цистерну грубого ER, и рибосома разбирается. Однако он вполне может снова собраться и снова обойти петлю мРНК. Кроме того, несколько рибосом могут работать с одной и той же мРНК одновременно!

И это основы ДНК!

Вот удобная таблица, на которую вы можете посмотреть, если вам нужно помнить о различиях между транскрипцией, трансляцией и репликацией:

	Расположение	Назначение	Основные участники	Продукты
Репликация	Ядро	Дублировать полную цепь ДНК	ДНК ДНК-геликаза ДНК-полимераза ДНК-лигаза	2 идентичных нити ДНК
Транскрипция	Ядро	Используйте нить ДНК, чтобы построить молекулу размером м РНК	ДНК РНК-полимераза (ДНК-лигаза)	м РНК
Перевод	Цитоплазма	Используйте m РНК для построения аминокислотной цепи	m РНК Рибосома t РНК (и аминокислоты)	Аминокислотная цепь (белок)

Если вы хотите узнать больше о ячейках, ознакомьтесь с соответствующими сообщениями в блоге VB:

Не забудьте подписаться на блог Visible Body , чтобы узнать больше об анатомии!

Вы инструктор? У нас есть отмеченные наградами 3D-продукты и ресурсы для вашего курса анатомии и физиологии! Подробнее здесь.

Дополнительные источники:

Пространственно-временной контроль синтеза ДНК, РНК, белков и липидов

У эукариот синтез ДНК, РНК, белков и липидов осуществляется пространственно-временным способом. Каждая молекула продуцируется в специализированных органеллах или компартментах со строгими регуляторными механизмами, регулирующими время и скорость синтеза. Эти регуляторные механизмы сложны и могут включать петли обратной связи, внешние стимулы и множество сигнальных путей.

ДНК и РНК продуцируются в ядре. ДНК полностью реплицируется во время s-фазы клеточного цикла. Затем по одной копии передается в каждую из дочерних ячеек. Во время других фаз клеточного цикла синтезируется минимальное количество ДНК, в первую очередь для восстановления генетического материала. Хотя базовая скорость синтеза РНК поддерживает синтез мРНК на протяжении всей жизни клетки, мРНК для определенных генов может экспрессироваться только или может быть повышена или понижена после обнаружения определенных механических или химических сигналов.В результате разные клетки имеют разные профили мРНК, и это часто наблюдается при использовании технологий микроматриц, которые скринируют генетические профили клеток.

ДНК и РНК синтезируются в ядре (верхняя панель). Затем РНК переносится в цитозоль или грубую эндоплазматическую сеть (нижняя панель), где происходит синтез белка.

После процессинга и модификации в ядре транскрибированная мРНК доставляется в цитозоль для трансляции или синтеза белка.Подобно синтезу РНК, базовый уровень синтеза белка поддерживается на протяжении всей жизни клетки, однако он также может изменяться, когда определенные стимулы вызывают выработку определенных белков или когда регуляторные механизмы снижают продукцию других. Например, синтез белка активируется во время фазы G1 клеточного цикла, непосредственно перед S-фазой. Это необходимо для того, чтобы в клетке была достаточная концентрация белкового аппарата, необходимого для репликации ДНК и деления клетки.

У прокариот, где нет отдельных компартментов, транскрипция и трансляция происходят одновременно.

Липиды, которые синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме (ER) или Гольджи, транспортируются к другим органеллам в форме везикул, которые сливаются с акцепторной органеллой. Некоторые клетки могут также использовать белки-носители для переноса липидов из одного места в другое. Синтез липидов также динамичен и может повышаться во время пролиферации клеток или во время процессов, связанных с расширением плазматической мембраны, когда требуются новые мембраны.

Практическое руководство по секвенированию одноклеточной РНК для биомедицинских исследований и клинических приложений | Геномная медицина

Newell EW, Sigal N, Bendall SC, Nolan GP, Davis MM. Цитометрия по времени пролета показывает комбинаторную экспрессию цитокинов и вирус-специфические клеточные ниши в пределах континуума фенотипов CD8 + Т-клеток. Иммунитет. 2012; 36: 142–52.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Giesen C, Wang HA, Schapiro D, Zivanovic N, Jacobs A, Hattendorf B и др. Мультиплексная визуализация опухолевых тканей с субклеточным разрешением методом массовой цитометрии. Нат методы. 2014; 11: 417–22.

CAS Статья PubMed Google Scholar

См. P, Dutertre CA, Chen J, Günther P, McGovern N, Irac SE, et al. Картирование происхождения человеческого DC посредством интеграции многомерных методов. Наука. 2017; 356: eaag3009.

Артикул PubMed Google Scholar

Ng SW, Mitchell A, Kennedy JA, Chen WC, McLeod J, Ibrahimova N, et al. Оценка устойчивости к 17 генам для быстрого определения риска острого лейкоза. Природа. 2016; 540: 433–7.

CAS Статья PubMed Google Scholar

Тан Ф., Барбачору С., Ван И, Нордман Э., Ли С., Сюй Н. и др. Полнотранскриптомный анализ mRNA-seq отдельной клетки.Нат методы. 2009; 6: 377–82.

CAS Статья PubMed Google Scholar

Сасагава Ю., Никайдо И., Хаяси Т., Данно Х, Уно К.Д., Имаи Т. и др. Quartz-Seq: высоко воспроизводимый и чувствительный метод секвенирования одноклеточной РНК, выявляющий негенетическую гетерогенность экспрессии генов. Genome Biol. 2013; 14: R31.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

Brennecke P, Anders S, Kim JK, Kołodziejczyk AA, Zhang X, Proserpio V, et al. Учет технического шума в экспериментах с одноклеточной последовательностью РНК. Нат методы. 2013; 10: 1093–5.

CAS Статья PubMed Google Scholar

Махата Б., Чжан X, Колодзейчик А.А., Просерпио В., Хаим-Вильмовский Л., Тейлор А.Е. и др. Секвенирование одноклеточной РНК показывает, что Т-хелперы синтезируют стероиды de novo, чтобы способствовать иммунному гомеостазу.Cell Rep. 2014; 7: 1130–42.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Deng Q, Ramsköld D, Reinius B., Sandberg R. Single-cell RNA-seq выявляет динамическую, случайную моноаллельную экспрессию гена в клетках млекопитающих. Наука. 2014; 343: 193–6.

CAS Статья PubMed Google Scholar

10.

Джайтин Д.А., Кенигсберг Э., Керен-Шауль Х., Элефант Н., Пауль Ф., Зарецкий И. и др.Массивно-параллельная одноклеточная последовательность РНК для безмаркерного разложения тканей на типы клеток. Наука. 2014; 343: 776–9.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

11.

Treutlein B, Brownfield DG, Wu AR, Neff NF, Mantalas GL, Espinoza FH, et al. Реконструкция иерархии клонов дистального эпителия легких с использованием одноклеточной RNA-seq. Природа. 2014; 509: 371–5.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

12.

Shalek AK, Satija R, Adiconis X, Gertner RS, Gaublomme JT, Raychowdhury R, et al. Одноклеточная транскриптомика показывает бимодальность экспрессии и сплайсинга в иммунных клетках. Природа. 2013; 498: 236–40.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

13.

Шалек А.К., Сатия Р., Шуга Дж., Тромбетта Дж. Дж., Геннерт Д., Лу Д. и др. Одноклеточная последовательность РНК обнаруживает динамический паракринный контроль клеточной изменчивости. Природа.2014; 510: 363–9.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

14.

Пател А.П., Тирош И., Тромбетта Дж. Дж., Шалек А. К., Гиллеспи С. М., Вакимото Н. и др. Одноклеточная РНК-seq подчеркивает внутриопухолевую гетерогенность первичной глиобластомы. Наука. 2014; 344: 1396–401.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

15.

Zeisel A, Muñoz-Manchado AB, Codeluppi S, Lönnerberg P, La Manno G, Juréus A, et al.Строение мозга. Типы клеток коры головного мозга и гиппокампа мышей, выявленные с помощью одноклеточной последовательности РНК. Наука. 2015; 347: 1138–42.

CAS Статья PubMed Google Scholar

16.

Колодзейчик А.А., Ким Дж. К., Цанг Дж. К., Иличич Т., Хенрикссон Дж., Натараджан К. Н. и др. Одноклеточное РНК-секвенирование плюрипотентных состояний открывает модульную вариабельность транскрипции. Стволовая клетка. 2015; 17: 471–85.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

17.

Ян Л., Ян М., Го Х, Ян Л., Ву Дж, Ли Р. и др. Одноклеточная РНК-Seq-профили доимплантационных эмбрионов человека и эмбриональных стволовых клеток. Nat Struct Mol Biol. 2013; 20: 1131–9.

CAS Статья PubMed Google Scholar

18.

Miyamoto DT, Zheng Y, Wittner BS, Lee RJ, Zhu H, Broderick KT, et al. RNA-Seq одиночных CTCs простаты участвует в неканонической передаче сигналов Wnt в устойчивость к антиандрогенам. Наука. 2015; 349: 1351–6.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

19.

Tirosh I, Izar B, Prakadan SM, Wadsworth MH, Treacy D, Trombetta JJ, et al. Рассечение многоклеточной экосистемы метастатической меланомы с помощью одноклеточной RNA-seq. Наука. 2016; 352: 189–96.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

20.

Стаббингтон М.Дж., Лённберг Т., Просерпио В., Клэр С., Спик А.О., Дуган Г. и др.Заключение о судьбе и клональности Т-клеток по одноклеточным транскриптомам. Нат методы. 2016; 13: 329–32.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

21.

Blakeley P, Fogarty NM, Del Valle I, Wamaitha SE, Hu TX, Elder K, et al. Определение трех клеточных линий бластоцисты человека с помощью одноклеточной РНК-seq. Разработка. 2015; 142: 3613.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

22.

Trapnell C, Cacchiarelli D, Grimsby J, Pokharel P, Li S, Morse M и др. Динамика и регуляторы решений клеточной судьбы выявляются с помощью псевдотемпорального упорядочения отдельных клеток. Nat Biotechnol. 2014; 32: 381–6.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

23.

Петропулос С., Эдсгард Д., Рейниус Б., Денг К., Панула С.П., Коделуппи С. и др. Последовательность одноклеточной РНК выявляет клонирование и динамику Х-хромосомы в доимплантационных эмбрионах человека.Клетка. 2016; 167: 285.

CAS Статья PubMed Google Scholar

24.

Лоннберг Т., Свенссон В., Джеймс К.Р., Фернандес-Руис Д., Себина И., Монтандон Р. и др. Последовательность одноклеточной РНК и вычислительный анализ с использованием моделирования временной смеси разрешает бифуркацию Th2 / Tfh судеб при малярии. Sci Immunol. 2017; 2: eaal2192.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

25.

Venteicher AS, Tirosh I, Hebert C, Yizhak K, Neftel C, Filbin MG, et al. Разделение генетики, клонов и микроокружения в IDH-мутантных глиомах с помощью одноклеточной последовательности РНК. Наука. 2017; 355: eaai8478.

Артикул PubMed Google Scholar

26.

Тан Ф., Барбачору С., Нордман Э., Бао С., Ли С., Ван Х и др. Детерминированная и стохастическая аллель-специфическая экспрессия генов в отдельных бластомерах мыши. PLoS One. 2011; 6: e21208.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

27.

Reinius B, Mold JE, Ramsköld D, Deng Q, Johnsson P, Michaëlsson J, et al. Анализ паттернов аллельной экспрессии в клональных соматических клетках с помощью одноклеточной RNA-seq. Нат Жене. 2016; 48: 1430–5.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

28.

Ким Дж. К., Колодзейчик А. А., Иличич Т., Илличич Т., Тейхманн С.А., Мариони Дж.Характеристика структуры шума в одноклеточной последовательности РНК отличает истинную стохастическую аллельную экспрессию от технической. Nat Commun. 2015; 6: 8687.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

29.

Кар Г., Ким Дж. К., Колодзейчик А. А., Натараджан К. Н., Торлай Триглиа Е., Мифсуд Б. и др. Переключение между репрессированным Polycomb и активным состояниями транскрипции вносит шум в экспрессию генов. Nat Commun. 2017; 8: 36.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

30.

Лю С., Трапнелл С. Секвенирование одноклеточного транскриптома: последние достижения и нерешенные проблемы. F1000Res. 2016; 5: 182.

31.

Вагнер А., Регев А., Йосеф Н. Выявление векторов клеточной идентичности с одноклеточной геномикой. Nat Biotechnol. 2016; 34: 1145–60.

CAS Статья PubMed Google Scholar

32.

Ziegenhain C, Viet B, Parekh S, Reinius B, Guillaumet-Adkins A, Smets M, et al. Сравнительный анализ методов секвенирования одноклеточной РНК. Mol Cell. 2017; 65: 631–43. e4.

CAS Статья PubMed Google Scholar

33.

Свенссон В., Натараджан К.Н., Ли Л.Х., Мирагая Р.Дж., Лабалетт С., Маколей И.К. и др. Анализ мощности экспериментов по секвенированию одноклеточной РНК. Нат методы. 2017; 14: 381–7.

CAS Статья PubMed Google Scholar

34.

Habib N, Li Y, Heidenreich M, Swiech L, Avraham-Davidi I, Trombetta JJ, et al. Div-Seq: Одноядерная РНК-Seq показывает динамику редких взрослых нейронов новорожденных. Наука. 2016; 353: 925–8.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

35.

Лакар Б., Линкер С.Б., Джегер Б.Н., Кришнасвами С., Бэррон Дж., Келдер М. и др. Последовательность ядерной РНК отдельных нейронов выявляет молекулярные сигнатуры активации. Nat Commun.2016; 7: 11022.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

36.

Цзэн В., Цзян С., Конг Х, Эль-Али Н., Болл А.Р., Ма К.И. и др. Одноядерная последовательность РНК дифференцирующихся миобластов человека показывает степень гетерогенности судеб. Nucleic Acids Res. 2016; 44: e158.

PubMed PubMed Central Google Scholar

37.

Cao J, Packer JS, Ramani V, Cusanovich DA, Huynh C., Daza R, et al.Комплексное профилирование одноклеточной транскрипции многоклеточного организма с помощью комбинаторной индексации. В BioRxiv. 2017. https://doi.org/10.1101/104844.

38.

Розенберг А.Б., Роко С., Маскат Р.А., Кучина А., Мукерджи С., Чен В. и др. Масштабирование транскриптомики отдельных клеток с помощью штрих-кодирования разделенного пула. В BioRxiv. 2017. https://doi.org/10.1101/105163.

39.

Sheng K, Cao W, Niu Y, Deng Q, Zong C. Эффективное обнаружение вариаций в одноклеточных транскриптомах с использованием MATQ-seq.Нат методы. 2017; 14: 267–70.

CAS Статья PubMed Google Scholar

40.

Fan X, Zhang X, Wu X, Guo H, Hu Y, Tang F и др. Одноклеточный анализ транскриптома RNA-seq линейных и кольцевых РНК в мышиных доимплантационных эмбрионах. Genome Biol. 2015; 16: 148.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

41.

Kivioja T, Vähärautio A, Karlsson K, Bonke M, Enge M, Linnarsson S, et al.Подсчет абсолютного количества молекул с использованием уникальных молекулярных идентификаторов. Нат методы. 2011; 9: 72–4.

Артикул PubMed Google Scholar

42.

Донати Г. Ниша в одноклеточных технологиях. Immunol Cell Biol. 2016; 94: 250–5.

CAS Статья PubMed Google Scholar

43.

van Dijk EL, Auger H, Jaszczyszyn Y, Thermes C. Десять лет технологии секвенирования нового поколения.Тенденции Genet. 2014; 30: 418–26.

Артикул PubMed Google Scholar

44.

Wu AR, Neff NF, Kalisky T., Dalerba P, Treutlein B, Rothenberg ME, et al. Количественная оценка методов секвенирования одноклеточной РНК. Нат методы. 2014; 11: 41–6.

CAS Статья PubMed Google Scholar

45.

Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al.Профилирование экспрессии отдельных клеток с высокой степенью параллельности генома с использованием нанолитровых капель. Клетка. 2015; 161: 1202–14.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

46.

Кляйн А.М., Мазутис Л., Акартуна I, Таллапрагада Н., Верес А., Ли В. и др. Штрих-кодирование капель для транскриптомики одиночных клеток, применяемое к эмбриональным стволовым клеткам. Клетка. 2015; 161: 1187–201.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

47.

Zheng GX, Terry JM, Belgrader P, Ryvkin P, Bent ZW, Wilson R, et al. Массивно-параллельное цифровое транскрипционное профилирование отдельных клеток. Nat Commun. 2017; 8: 14049.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

48.

Усоскин Д., Фурлан А., Ислам С., Абдо Х., Лённерберг П., Лу Д. и др. Беспристрастная классификация типов сенсорных нейронов с помощью крупномасштабного секвенирования одноклеточной РНК. Nat Neurosci. 2015; 18: 145–53.

CAS Статья PubMed Google Scholar

49.

Wang C, Yosef N, Gaublomme J, Wu C, Lee Y, Clish CB, et al. CD5L / AIM регулирует биосинтез липидов и ограничивает патогенность клеток Th27. Клетка. 2015; 163: 1413–27.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

50.

Gaublomme JT, Yosef N, Lee Y, Gertner RS, Yang LV, Wu C, et al.Одноклеточная геномика раскрывает важнейшие регуляторы патогенности клеток Th27. Клетка. 2015; 163: 1400–12.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

51.

Регев А., Тейхманн С., Лендер Е.С., Амит И., Бенуа С., Бирни Е. и др. Атлас клеток человека. BioRxiv. 2017. https://doi.org/10.1101/121202.

52.

Канг Х.М., Субраманиам М., Тарг С., Нгуен М., Малискова Л., Ван Е. и др. Мультиплексирование капельного секвенирования одноклеточной РНК с использованием естественных генетических штрих-кодов.BioRxiv. 2017. https://doi.org/10.1101/118778.

53.

Guillaumet-Adkins A, Rodríguez-Esteban G, Mereu E, Mendez-Lago M, Jaitin DA, Villanueva A, et al. Консервация одноклеточного транскриптома в криоконсервированных клетках и тканях. Genome Biol. 2017; 18:45.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

54.

Alles J, Karaiskos N, Praktiknjo SD, Grosswendt S, Wahle P, Ruffault PL, et al. Фиксация и сохранение клеток для транскриптомики отдельных клеток на основе капель.BMC Biol. 2017; 15:44.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

55.

Thomsen ER, Mich JK, Yao Z, Hodge RD, Doyle AM, Jang S, et al. Фиксированная одноклеточная транскриптомная характеристика радиального глиального разнообразия человека. Нат методы. 2016; 13: 87–93.

CAS PubMed Google Scholar

56.

Колодзейчик А.А., Ким Дж. К., Свенссон В., Мариони Дж. К., Тейхманн С.А.Технология и биология секвенирования одноклеточной РНК. Mol Cell. 2015; 58: 610–20.

CAS Статья PubMed Google Scholar

57.

Picelli S, Björklund Å, Faridani OR, Sagasser S, Winberg G, Sandberg R. Smart-seq2 для профилирования чувствительного полноразмерного транскриптома в отдельных клетках. Нат методы. 2013; 10: 1096–8.

CAS Статья PubMed Google Scholar

58.

Консорциум ERC. Предлагаемые методы тестирования и выбора контрольных внешних РНК ERCC. BMC Genomics. 2005; 6: 150.

Артикул Google Scholar

59.

Risso D, Ngai J, Speed TP, Dudoit S. Нормализация данных последовательности РНК с использованием факторного анализа контрольных генов или образцов. Nat Biotechnol. 2014; 32: 896–902.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

60.

Хашимшони Т., Сендерович Н., Авиталь Г., Клохендлер А., де Лиу Й., Анави Л. и др. CEL-Seq2. чувствительная высокомультиплексированная одноклеточная РНК-Seq. Genome Biol. 2016; 17: 77.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

61.

Kakaradov B, Arsenio J, Widjaja CE, He Z, Aigner S, Metz PJ, et al. Ранняя транскрипционная и эпигенетическая регуляция дифференцировки CD8 (+) Т-клеток, выявленная с помощью секвенирования одноклеточной РНК.Nat Immunol. 2017; 18: 422–32.

CAS Статья PubMed Google Scholar

62.

Vieth B., Ziegenhain C, Parekh S, Enard W., Hellmann I. BioRxiv. 2017. https://doi.org/10.1101/117150.

63.

Пыльца А.А., Новаковски Т.Дж., Шуга Дж., Ван X, Лейрат А.А., Луи Дж. Х. и др. Секвенирование одноклеточной мРНК с низким охватом выявляет клеточную гетерогенность и активацию сигнальных путей в развивающейся коре головного мозга.Nat Biotechnol. 2014; 32: 1053–8.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

64.

Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I. CEL-Seq: одноклеточная RNA-Seq посредством мультиплексной линейной амплификации. Cell Rep. 2012; 2: 666–73.

CAS Статья PubMed Google Scholar

65.

Islam S, Kjällquist U, Moliner A, Zajac P, Fan JB, Lönnerberg P, et al.Характеристика одноклеточного транскрипционного ландшафта с помощью высоко мультиплексной последовательности РНК. Genome Res. 2011; 21: 1160–7.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

66.

Wagner GP, Kin K, Lynch VJ. Измерение количества мРНК с использованием данных RNA-seq: измерение RPKM несовместимо между образцами. Теория Биоски. 2012; 131: 281–5.

CAS Статья PubMed Google Scholar

67.

Suter DM, Molina N, Gatfield D, Schneider K, Schibler U, Naef F. Гены млекопитающих транскрибируются с сильно различающейся кинетикой разрыва. Наука. 2011; 332: 472–4.

CAS Статья PubMed Google Scholar

68.

Padovan-Merhar O, Nair GP, Biaesch AG, Mayer A, Scarfone S, Foley SW, et al. Одиночные клетки млекопитающих компенсируют различия в клеточном объеме и количестве копий ДНК с помощью независимых глобальных механизмов транскрипции.Mol Cell. 2015; 58: 339–52.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

69.

Kempe H, Schwabe A, Crémazy F, Verschure PJ, Bruggeman FJ. Объемы и количество транскриптов отдельных клеток показывают гомеостаз концентрации и улавливают биологический шум. Mol Biol Cell. 2015; 26: 797–804.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

70.

Buettner F, Natarajan KN, Casale FP, Proserpio V, Scialdone A, Theis FJ, et al. Компьютерный анализ межклеточной гетерогенности данных секвенирования одноклеточной РНК позволяет выявить скрытые субпопуляции клеток. Nat Biotechnol. 2015; 33: 155–60.

CAS Статья PubMed Google Scholar

71.

Баррон М., Ли Дж. Выявление и удаление эффекта клеточного цикла из данных секвенирования одноклеточной РНК. Научный отчет 2016; 6: 33892.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

72.

Janes KA. Одноклеточные состояния против одноклеточных атласов — два класса неоднородности, которые различаются по значению и методам. Curr Opin Biotechnol. 2016; 39: 120–5.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

73.

Грюн Д., Кестер Л., ван Ауденаарден А. Валидация шумовых моделей для одноклеточной транскриптомики.Нат методы. 2014; 11: 637–40.

Артикул PubMed Google Scholar

74.

Bacher R, Kendziorski C. Дизайн и вычислительный анализ экспериментов по секвенированию одноклеточной РНК. Genome Biol. 2016; 17: 63.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

75.

Zhu X, Wolfgruber T, Tasato A, Garmire L. Granatum: графический конвейер анализа последовательностей РНК одиночных клеток для ученых-геномиков.BioRxiv. 2017. https://doi.org/10.1101/110759.

76.

Lun AT, McCarthy DJ, Marioni JC. Пошаговый рабочий процесс для низкоуровневого анализа данных последовательности РНК одиночных клеток с помощью Bioconductor. F1000Res. 2016; 5: 2122.

PubMed PubMed Central Google Scholar

77.

Stegle O, Teichmann SA, Marioni JC. Вычислительные и аналитические проблемы в одноклеточной транскриптомике. Nat Rev Genet. 2015; 16: 133–45.

CAS Статья PubMed Google Scholar

78.

Jiang P, Thomson JA, Stewart R. Контроль качества одноклеточной РНК-seq с помощью SinQC. Биоинформатика. 2016; 32: 2514–6.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

79.

Ilicic T, Kim JK, Kolodziejczyk AA, Bagger FO, McCarthy DJ, Marioni JC, et al. Классификация клеток низкого качества по данным одноклеточной последовательности РНК. Genome Biol. 2016; 17:29.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

80.

McCarthy DJ, Кэмпбелл KR, Lun AT, Wills QF. Scater: предварительная обработка, контроль качества, нормализация и визуализация данных одноклеточной РНК-seq в R. Bioinformatics. 2017; 33: 1179–86.

PubMed PubMed Central Google Scholar

81.

Диаз А., Лю С.Дж., Сандовал С., Пыльца А., Новаковски Т.Дж., Лим Д.А. и др. SCell: интегрированный анализ данных секвенирования РНК одиночных клеток. Биоинформатика. 2016; 32: 2219–20.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

82.

Poirion OB, Zhu X, Ching T, Garmire L. Биоинформатика одноклеточной транскриптомики и вычислительные задачи. Фронт Жене. 2016; 7: 163.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

83.

Rostom R, Svensson V, Teichmann SA, Kar G. Вычислительные подходы для интерпретации данных scRNA-seq. FEBS Lett. 2017. DOI: 10.1002 / 1873-3468.12684.

84.

Ронан Т., Ци Зи, Нэгле К.М. Избегайте распространенных ошибок при кластеризации биологических данных.Sci Signal. 2016; 9: re6.

Артикул PubMed Google Scholar

85.

Киселев В.Ю., Киршнер К., Шауб М.Т., Эндрюс Т., Ю А., Чандра Т. и др. SC3: консенсусная кластеризация одноклеточных данных последовательности РНК. Нат методы. 2017; 14: 483–6.

CAS Статья PubMed Google Scholar

86.

urauskienė J, Yau C. pcaReduce: иерархическая кластеризация профилей транскрипции отдельных клеток.BMC Bioinf. 2016; 17: 140.

Артикул Google Scholar

87.

Xu C, Su Z. Идентификация типов клеток из одноклеточных транскриптомов с использованием нового метода кластеризации. Биоинформатика. 2015; 31: 1974–80.

CAS Статья PubMed Google Scholar

88.

Guo M, Wang H, Potter SS, Whitsett JA, Xu Y. SINCERA: конвейер для анализа профилей РНК-seq отдельных клеток.PLoS Comput Biol. 2015; 11: e1004575.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

89.

Jaakkola MK, Seyednasrollah F, Mehmood A, Elo LL. Сравнение методов обнаружения дифференциально экспрессируемых генов в одноклеточных популяциях. Краткий биоинформ. 2016. doi: 10.1093 / bib / bbw057.

90.

Марко Э., Карп Р.Л., Гуо Г., Робсон П., Харт А.Х., Триппа Л. и др. Бифуркационный анализ данных экспрессии одноклеточных генов показывает эпигенетический ландшафт.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014; 111: E5643–50.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

91.

Setty M, Tadmor MD, Reich-Zeliger S, Angel O, Salame TM, Kathail P, et al. Wishbone идентифицирует бифуркационные траектории развития на основе данных одной клетки. Nat Biotechnol. 2016; 34: 637–45.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

92.

Chen J, Schlitzer A, Chakarov S, Ginhoux F, Poidinger M. Mpath отображает множественные ветвящиеся траектории отдельных клеток, показывая прогрессию клеток-предшественников во время развития. Nat Commun. 2016; 7: 11988.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

93.

Haghverdi L, Buettner F, Theis FJ. Карты диффузии для многомерного анализа данных дифференциации отдельных клеток. Биоинформатика. 2015; 31: 2989–98.

CAS Статья PubMed Google Scholar

94.

Haghverdi L, Büttner M, Wolf FA, Buettner F, Theis FJ. Псевдовремя диффузии надежно реконструирует ветвление клонов. Нат методы. 2016; 13: 845–8.

CAS Статья PubMed Google Scholar

95.

Welch JD, Hartemink AJ, Prins JF. SLICER: вывод разветвленных, нелинейных клеточных траекторий из данных последовательности РНК одной клетки. Genome Biol. 2016; 17: 106.

Артикул PubMed PubMed Central Google Scholar

96.

Svensson V, Vento-Tormo R, Teichmann SA. Закон Мура в транскриптомике одиночных клеток. Препринт ArXiv arXiv: 1704.01379v2 [q-bio.GN]. 2017.

97.

Ner-Gaon H, Melchior A, Golan N, Ben-Haim Y, Shay T. JingleBells: репозиторий иммуно-связанных наборов данных по секвенированию одноклеточной РНК. J Immunol. 2017; 198: 3375–9.

CAS PubMed Google Scholar

98.

Adamson B, Norman TM, Jost M, Cho MY, Nuñez JK, Chen Y, et al.Платформа мультиплексного одноэлементного скрининга CRISPR позволяет систематически анализировать развернутый белковый ответ. Клетка. 2016; 167: 1867–82. e21.

CAS Статья PubMed Google Scholar

99.

Диксит А., Парнас О., Ли Б., Чен Дж., Фулко С.П., Джерби-Арнон Л. и др. Perturb-Seq. Рассечение молекулярных цепей с помощью масштабируемого профилирования одноклеточной РНК объединенных генетических скринингов. Клетка. 2016; 167: 1853–66. e17.

CAS Статья PubMed Google Scholar

100.

Macaulay IC, Ponting CP, Voet T. Мультиомность одной соты: множественные измерения от одной соты. Тенденции Genet. 2017; 33: 155–68.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

101.

Gierahn TM, Wadsworth MH, Hughes TK, Bryson BD, Butler A, Satija R, et al. Seq-Well: портативное недорогое средство для секвенирования отдельных клеток с высокой производительностью. Нат методы. 2017; 14: 395–8.

CAS Статья PubMed PubMed Central Google Scholar

Параллельный анализ РНК и ДНК после глубокого секвенирования (PRDD-seq) выявляет типовые образцы клеток в человеческом мозге

Значение

Стволовые клетки и предшественники подвергаются серии клеточных делений для образования нейронов мозга, и понимание этой последовательности имеет решающее значение для изучения механизмов, контролирующих деление и миграцию клеток в развивающемся мозге.Мутации, которые происходят при делении клеток, известны как основа рака, но недавно было показано, что они происходят при нормальном делении клеток, создавая постоянную криминалистическую карту клональных паттернов, которые определяют мозг. Здесь мы разрабатываем технологию для анализа как мутаций ДНК, так и паттернов экспрессии генов РНК в отдельных клетках из посмертного мозга человека, что позволяет нам определять клональные паттерны среди различных типов нейронов человеческого мозга, получая непосредственное представление о том, как они формируются.

Abstract

Выяснение родственных связей между различными типами клеток является ключом к пониманию развития человеческого мозга.Здесь мы разработали параллельный анализ РНК и ДНК после глубокого секвенирования (PRDD-seq), который сочетает в себе анализ РНК типов нейрональных клеток с анализом вложенных спонтанных соматических мутаций ДНК в качестве маркеров клеточного происхождения, идентифицированных в результате совместного анализа одноклеточного и объемного секвенирования ДНК. от одноклеточного MosaicHunter (scMH). PRDD-seq позволяет одновременно реконструировать тип нейрональных клеток, клеточную линию и последовательное формирование нейронов («дату рождения») в посмертной коре головного мозга человека. Анализ двух человеческих мозгов показал замечательные количественные детали, которые связывают частоту мозаики мутаций с клональными паттернами, подтверждая раннее расхождение предшественников возбуждающих и тормозных нейронов, а также формирование слоя возбуждающих нейронов «наизнанку», как это наблюдается у других видов.Кроме того, наш анализ позволяет оценить количество предшественников, ограниченных возбуждающими нейронами (около 10), которые генерируют возбуждающие нейроны в кортикальном столбе. Тормозящие нейроны обнаруживают сложные, специфичные для подтипа паттерны нейрогенеза, включая некоторые паттерны развития, консервативные по сравнению с мышами, но также некоторые аспекты развития кортикальных интернейронов приматов, не наблюдаемые у мышей. PRDD-seq может широко применяться для характеристики клеточной идентичности и происхождения из различных архивных образцов с разрешением отдельных клеток и потенциально при любом состоянии развития или болезни.

Хотя мы многое узнали о развитии коры головного мозга на животных моделях, у нас очень мало прямой информации о том, как человеческий мозг, который сильно отличается по форме, размеру и составу от мозга неприматов, формирует нейроны. коры головного мозга (1–4). Недавние исследования, определяющие основные типы клеток взрослой и развивающейся коры головного мозга человека (5-7), формируют основу для понимания того, как развиваются эти типы клеток, как возникают уникальные аспекты коры головного мозга человека и как нарушения развития мозга могут изменять модели клеточного происхождения или клеточного типа в человеческом мозге.Однако вопрос о том, ограничены ли отдельные нейральные клетки-предшественники (NPC) на эмбриональных стадиях для производства определенных подтипов нейронов или мультипотенциальные для создания всех типов нейронов, остается открытым даже для модельных видов животных, поскольку для проведения этого различия требуется одновременная идентификация клеток. клональный и транскрипционный анализ клеточного типа, который остается сложной технической задачей (8–12).

Соматические генетические мутации накапливаются с каждым делением клетки на раннем этапе развития, когда спонтанное повреждение ДНК ускользает от механизма репарации ДНК, причем однонуклеотидные варианты (SNV) являются наиболее распространенным типом мутации (13⇓ – 15).Время соматических мутаций может быть определено либо по фракции клеток, несущей каждую мутацию, либо по статусу совпадения множественных мутаций, при котором ранние мутации должны разделяться большой частью клеток, тогда как более поздние мутации должны присутствовать во вложенных субпопуляциях клеток ( 16). Предыдущее исследование показало возможность использования соматических SNV (sSNV) в качестве обширной карты внутренних клонов для определения сроков развития каждого нейрона, дифференцированного от нейрональных клеток-предшественников (14), но не сочетало это с прямым анализом подтипов нейронов, определенных по морфологии, расположению, физиологии или паттерну транскрипции РНК.

Одноклеточные транскриптомы предоставляют детальную информацию об идентичности клеток (5-7), но они не могут предоставить карты клонов, так как не могут уловить большинство соматических мутаций, поскольку соматические мутации происходят по всему геному, чаще всего в интронных или межгенных областях ( 16, 17). Точно так же секвенирование ДНК само по себе не может предоставить информацию об идентичности клеток, и поэтому картирование клонов с использованием только соматических мутаций из секвенирования ДНК неспособно ответить на вопросы о происхождении конкретных идентичностей клеток в развитии нервной системы.Соматические мутации в митохондриальной ДНК также были недавно предложены как потенциальные метки происхождения, но скромный целевой размер митохондриального генома и множество разнообразных митохондриальных геномов в каждой клетке создают проблемы для использования митохондриальных мутаций в качестве богатого источника стабильных маркеры происхождения (18).

Для решения этой проблемы мы разработали параллельный анализ РНК и ДНК после глубокого секвенирования (PRDD-seq), который идентифицирует sSNV по данным одноклеточного и группового полногеномного секвенирования (WGS), с мультиплексным обнаружением sSNV и транскриптов множественных маркеров РНК. от одиночных ядер.Затем мы сравнили эффективность ДНК- и РНК-анализов PRDD-seq с объемным секвенированием WGS и одноклеточной РНК (scRNAseq), соответственно. Применение PRDD-seq к двум посмертным мозгам людей без неврологических заболеваний позволило провести беспрецедентный количественный анализ клеточного происхождения в человеческом мозге. Выявляя ожидаемые паттерны дивергенции возбуждающих и тормозных клонов и генерацию возбуждающих нейронов «наизнанку», наши данные PRDD-seq также прямо указывают на сложные паттерны образования интернейронов в мозге человека.

Результаты

Одновременный анализ отдельных клеток по типу и происхождению с помощью PRDD-Seq.

Рабочий процесс PRDD-seq проиллюстрирован на рис. 1. Отдельные корковые нейронные ядра NeuN + из префронтальной коры (PFC) посмертной ткани головного мозга человека очищали с помощью флуоресцентно-активируемой ядерной сортировки (FANS) (16) (рис. 1 ). A ) и подвергали одноэтапной кОТ-ПЦР с целевыми праймерами для 1) комплементарной ДНК (кДНК), специфичной для 30 маркерных генов основных типов нейрональных клеток, и 2) локусов специфической геномной ДНК (гДНК), представляющих идентифицировали соматические мутации (см. ниже) как маркеры клеточного происхождения (рис.1 В ). Аликвоты предварительно усиленных библиотек гДНК и кДНК анализировали на наличие специфических соматических мутаций и транскриптов с помощью микрофлюидного генотипирования и профилирования экспрессии генов, соответственно, с использованием системы Fluidigm Biomark (рис. 1 C ). Соматические мутации, используемые в PRDD-seq, были идентифицированы одноклеточным MosaicHunter (scMH), описанным ниже, биоинформатическим инструментом для выявления информативных клонов sSNV, с совместным рассмотрением данных WGS от единичных клеток, амплифицированных многократной амплификацией, и глубокого сопоставления (> 200 ×) WGS из объемных образцов ДНК, собранных из той же области мозга (рис.1 D ).

Рис. 1.

PRDD-seq позволяет одновременно оценивать идентичность клеток и клонирование отдельных клеток. ( A ) Нейрональные ядра из посмертного мозга человека были основаны на иммунореактивности NeuN +. ( B ) Целенаправленная одностадийная qRT-PCR-амплификация интересующих фрагментов кДНК и гДНК. ( C ) Коанализ scMH одноклеточных и массивных данных глубокого секвенирования для идентификации информативных к клону sSNV. ( D ) Мультиплексный анализ амплифицированных фрагментов кДНК и гДНК для генотипа sSNV и профиля 30 маркеров экспрессии гена, специфичных для типа клеток.( E ) 10 × Genomics scRNAseq выполняли на ядрах NeuN +, выделенных из той же области PFC. ( F ) 21 кластер клеток был идентифицирован на основе данных экспрессии генов 10 × Genomics, а затем разделен на верхний, средний и нижний слои возбуждающих нейронов и четыре подтипа тормозных нейронов. ( G ) Второй набор данных scRNAseq (5), выполненный на ядрах, выделенных из области MTG другого посмертного здорового человеческого мозга, также был проанализирован, где информация о слоях была идентифицирована на основе микродиссекции слоев.Типы клеток были идентифицированы на основании данных об экспрессии генов. ( H ) Транскрипционная кластеризация выявила аналогичные профили экспрессии отдельных клеток в наборах данных 10 × Genomics PFC и SMART-seq MTG scRNAseq. Кластеры ячеек были обозначены цветом для обозначения аннотаций различных типов ячеек, а кластеры, полученные из 10 × Genomics PFC (треугольник) и SMART-seq MTG (круг), в общем, сгруппированы по типу ячеек, но не по платформе. ( I ) Каждую клетку PRDD-seq сопоставили с картами t-SNE по косинусному сходству экспрессии гена с клетками scRNAseq, а затем назначили тип клетки и рассеченный слой соответственно большинством голосов 25 ближайших соседей.( J и K ) Комбинация информации о генотипе и экспрессии генов клеток PRDD-seq позволила ( J ) провести анализ линии и даты рождения определенных типов / слоев клеток и ( K ) анализа дифференцировки конкретных типов клеток. родословная реконструирована соматическими мутациями. Цветные треугольники в I указывают на клетки PRDD-seq. Серые полосы в K указывают на наличие соматических мутаций, тогда как все клетки в одном соответствующем субкладе имеют одну и ту же соматическую мутацию.

Сначала мы создали карту типов нейронных клеток, проанализировав> 25000 отдельных нейронных ядер — отсортированных по FANS на основе иммунореактивности NeuN — с помощью scRNAseq из двух разных наборов данных, чтобы создать ландшафт типов клеток, на котором могут быть расположены нейроны, проанализированные PRDD-seq. . Мы выполнили 10 × геномных scRNAseq 10967 ядер NeuN + из той же области PFC одного из головного мозга, в котором были идентифицированы мутации ДНК (рис. 1 E ). Анализ этого набора данных t-распределенным стохастическим встраиванием соседей (t-SNE) определил 21 транскрипционно отличный кластер клеток, в том числе 8 кластеров возбуждающих нейронов, которые затем сгруппированы в верхний, средний и нижний уровни, и 13 кластеров тормозных нейронов, которые могут быть дополнительно классифицированы. на подтипы SST +, PV +, VIP + и LAMP5 + (рис.1 F и SI Приложение , Рис. S1) (5, 7). Недавно опубликованный набор данных Switching Mechanism at 5 ‘End of RNA Template Sequencing (SMART-seq) из 15 928 одиночных нейрональных ядер из средней височной извилины (MTG) человека (5), отсортированных по иммунореактивности NeuN после микродиссекции слоев коры головного мозга, предоставил дополнительные прямые информация о слое расположения типов нейронов (Рис. 1 G и SI Приложение , Рис. S2) и поэтому использовалась для картирования типов клеток параллельно.PFC и MTG имеют относительно общую архитектуру коры головного мозга как «ассоциативную» кору, и кластерный анализ двух наборов данных (рис. 1 H ) показывает, что они идентифицировали схожие основные типы клеток, с кластеризацией клеток по типу клеток, а не по платформам. хотя набор данных SMART-seq от MTG определил более тонкие подразделения типа ячеек, как и ожидалось, из-за большего размера выборки и большей глубины последовательности.

Мы совместно проанализировали отдельные клетки PRDD-seq и клетки scRNAseq и картировали каждую клетку PRDD-seq на карты t-SNE scRNAseq на основе сходства экспрессии генов (рис.1 I ; см. Материалы и методы ). Затем информация о типе клеток и корковом слое каждой клетки PRDD-seq была вычислена на основе назначенного ей кластера в наборах данных scRNAseq. Наконец, комбинация информации о генотипе и экспрессии генов клеток PRDD-seq позволила провести анализ клонов и даты рождения определенных типов клеток (рис. 1 J ), а также анализ дифференцировки по типам клеток конкретных клонов (рис. 1 K). ).

Обнаружение sSNV, информативных о происхождении, на основе данных WGS большого мозга и одиночного нейрона.

Разрешение реконструкции клонов зависит от наличия исчерпывающего списка соматических мутаций, идентифицированных в конкретном анализируемом мозге. В то время как глубокий WGS (например, 200–250-кратное покрытие) «основной» ДНК, выделенной из ткани, эффективно идентифицирует sSNV, присутствующие в 4% или более клеток (19), он нечувствителен к обнаружению более поздних sSNV, которые маркируют поздние клетки. события происхождения. С другой стороны, WGS ДНК, амплифицированная из отдельных нейрональных ядер (16), выявляет более поздние sSNV, но ограничена по стоимости и подвержена артефактам во время одноклеточной амплификации.Поэтому мы разработали scMH, который включает байесовскую графическую модель (20, 21), которая объединяет анализ объемных данных WGS и одноклеточных WGS, чтобы отличить соматические мутации от мутаций зародышевой линии и технических артефактов (рис.2 A ; см. Материалы . и методы ). ScMH сначала вычисляет вероятность и мозаичную фракцию sSNV-кандидатов из совокупного образца ДНК, а затем применяет эти значения в качестве априорных значений для генотипирования каждого SNV-кандидата для каждой отдельной анализируемой клетки.Совместное присутствие данного sSNV в массе ДНК и одной или нескольких отдельных клеток служит подтверждением sSNV. Чтобы расширить возможности scMH, когда согласованная групповая выборка недоступна, мы дополнительно разработали «безнапорный» режим, который может использовать «синтетический» объемный набор данных WGS, сгенерированный in silico слияния множества наборов данных WGS из нескольких полученных отдельных ячеек. от того же донора. Мы тестировали scMH, используя 45 одноклеточных WGS из 24 нейронов, 22 из которых были секвенированы в предыдущих исследованиях (16, 17), а также примерно 200-кратный объемный WGS PFC (оба из мозга одного человека, UMB1465, которые умерли в возрасте 17 лет без неврологического диагноза) против существующих одноклеточных sSNV, включая Monovar (22), SCcaller (23), LiRA (24) и Conbase (25).Чувствительность и частота ложных открытий (FDR) были оценены на основе экспериментально подтвержденных мутаций и аннотаций клады, выявленных ранее (16). Как с основной массой ПФУ, так и с синтетической массой, scMH превзошел другие инструменты и достиг чувствительности ~ 70% для выявления информативных клонов мутаций с <5% FDR; объединение режимов по умолчанию и «без объема» улучшило чувствительность обнаружения до 93% без увеличения FDR, предполагая, что «безнапорный» режим scMH может обнаруживать sSNV, которые присутствуют в нескольких отдельных ячейках, но могут не обнаруживаться в большом количестве. 200 × образцов WGS из-за низкой мозаичности этих поздних мутаций (рис.2 В ).

Рис. 2.

scMH идентифицирует клон-информативные sSNV на основе совместного анализа основной массы мозга и отдельных нейронов. ( A ) Обзор расширенной байесовской модели scMH для использования данных массового секвенирования для облегчения вызова sSNV в отдельных клетках. G обозначает состояние генотипа, π обозначает априорные вероятности генотипа, а d , o и q обозначают глубину, наблюдаемые основания и их основные качества, соответственно, в целом ( Left ) или одноклеточные ( Правый ) данные секвенирования.( B ) Специфичность и точность идентификации sSNV с использованием scMH и других опубликованных вызывающих. ScMH превзошел других абонентов как по точности, так и по чувствительности. ( C — E ) Проверенные sSNV, информативные по происхождению, идентифицированные scMH в ( C ) UMB1465, ( D ) UMB4638 и ( E ) UMB4643. Тепловые карты демонстрируют статус генотипирования sSNV; темно-синие и белые квадраты обозначают присутствие или отсутствие sSNV в данной клетке, тогда как серые квадраты обозначают неизвестный генотип из-за выпадения локуса в одноклеточном WGS.Гистограммы показывают мозаичную фракцию каждого sSNV в WGS основной выборки головного мозга. Клада E в C и клада C в E представляют собой вероятные ветви ветвления, в которых присутствуют ранние общие мутации, тогда как более поздние sSNV маркируют две ветви с различными мутациями. Планки погрешностей отражают 95% доверительных интервалов.

Применение scMH к данным из мозга трех нормальных людей (UMB1465, UMB4638 и UMB4643) (16, 17) идентифицировало и подтвердило 42, 19 и 22 sSNV соответственно (рис.2 C — E и SI Приложение , Таблица S1) с общим показателем валидации 74.8% определяется секвенированием по Сэнгеру независимо отсортированных нейронов из той же области мозга. Число и частота валидации информативных к происхождению sSNV, обнаруженных с помощью scMH, резко увеличились по сравнению с предыдущими исследованиями (16, 17). SSNV, идентифицированные во всех трех головах мозга, показали обогащение мутациями C> T, особенно в сайтах CpG ( SI Приложение , рис. S3), паттерн, наблюдаемый в других исследованиях эмбриональных мутаций и мутаций рака (13, 26), поскольку такие мутации C> T, по-видимому, вызваны дезаминированием цитозина, которое реплицируется в фиксированный SNV, прежде чем он может быть восстановлен (27).Неконтролируемый кластерный анализ сгруппировал 24 секвенированных нейрона из UMB1465 в шесть разных клад; ни в одной клетке не обнаружены мутации множественных клад, что свидетельствует о высокой точности scMH для одноклеточного генотипирования sSNV (рис. 2 C ). В кладах C и E мы наблюдали нейроны, которые имели общие ранние мутации, но несли разные наборы более поздних мутаций, предполагая, что они произошли из разных ветвей одной и той же клады (Fig. 2 C ). Кластеризация 10 и 9 секвенированных нейронов из UMB4638 и UMB4643 — соответственно по их sSNV — продемонстрировала аналогичные паттерны вложенности, формирующие три первичные клады для каждого индивидуума, а также показала доказательства ветвей этих клад (рис.2 D и E ). Мозаичная фракция каждого sSNV в «основной массе» ДНК (рис. 2 C — E ) использовалась в качестве дополнительного индикатора последовательности, в которой возник sSNV, поскольку ранние sSNV, как правило, обнаруживаются во многих отдельных клетках, поскольку также как и при более высокой фракции мозаики в массе ДНК, тогда как более поздние мутации появляются в меньшем количестве клеток и меньшая фракция мозаичности в массе ДНК. Эти два вывода очень сильно коррелировали.

Клонирование и идентичность клеточного типа одиночных нейронов, выявленная с помощью PRDD-Seq.

Чтобы оценить эффективность PRDD-seq при сборе информации о происхождении и типе клеток из отдельных клеток, мы применили PRDD-seq к 1710 кортикальным нейронам из UMB1465 PFC, используя зонды для обнаружения 30 из 42 проверенных sSNV в UMB1465, для которых мы успешно сконструированы высокоспецифичные и чувствительные зонды ( SI Приложение , Таблица S1), а также 30 маркерных генов, уровни экспрессии которых различают основные тормозные и возбуждающие нейрональные подтипы и корковые слои, идентифицированные в наборах данных scRNAseq (5, 7) ( SI Приложение ). , Таблица S2).В целом, PRDD-seq картировал 1112/1710 (65%) кортикальных нейронов из UMB1465 PFC в 20 ветвей клонов и шесть основных клад (рис. 3 A ). Для каждой основной клады ветви клонов, упорядоченные по дате рождения, были выведены из вложенных sSNV, где ранее полученные нейроны содержали меньше клональных мутаций, а нейроны, сгенерированные позже, несли дополнительные мутации от последующих делений клеток (16). Вложенная природа sSNV в кладах позволяет помещать клетки в клады с использованием нескольких sSNV, так что клетки, чьи геномы подвергались аллельному выпадению — что не редкость при амплификации одноклеточных молекул ДНК — все же могут быть помещены в клады на основе другие sSNV из той же клады (рис.3 A и SI Приложение , Таблица S1). С другой стороны, только 71/1710 (4,2%) нейронов содержали sSNV из нескольких клад, что свидетельствует о низком уровне ложноположительной амплификации или сортировки нескольких ядер в отдельные лунки в анализе ДНК с помощью PRDD-seq (рис. 3 B). , Верхний ). А 527/1710 (30,8%) нейронов показали отсутствие каких-либо sSNV из шести клад; эти нейроны могут быть из других клад, в которых мы не обнаружили маркеры sSNV (Fig. 3 B , Upper ).В клетках PRDD-seq мозаичные фракции sSNV линейно коррелировали с фракциями, вычисленными из ∼200 × WGS в объеме, что указывает на в целом несмещенное обнаружение sSNV (рис. последовательность развития sSNV в соответствии с вложенным паттерном.

Рис. 3.

PRDD-seq профилирует одиночные нейроны с различными маркерами клонирования и идентичностью различных типов клеток. ( A ) Результаты генотипирования 30 sSNV (по строкам) из 20 клонов через клетки PRDD-seq (по столбцам) из UMB1465.Синие и белые квадраты представляют присутствие или отсутствие sSNV, соответственно, тогда как голубые квадраты представляют sSNV, которые выпали из анализа PRDD-seq, но были выведены из-за наличия более глубоких мутаций из той же клады. ( B , Lower ) Классификация Clade ячеек PRDD-seq, профилированных в UMB1465. ( Верхний ) Клетки PRDD-seq, которые содержали sSNV из нескольких кладов или без них, помечены как «конфликтные» и «неизвестные» соответственно. ( C ) Корреляция мозаичных фракций из WGS и PRDD-seq (рассчитанная как процент проанализированных клеток, несущих данный sSNV) в UMB1465.Оба метода показали достоверно совпадающие фракции мозаики (коэффициент корреляции Пирсона P <0,001). ( D ) Точность классификации типа клеток ( Левый ) и кортикального слоя ( Правый ) на основе профиля экспрессии 30 маркерных генов, используемых в PRDD-seq. Клетки scRNAseq из каждого типа клеток (10 × Genomics) и кортикального слоя (SMART-seq) отбирались случайным образом, а затем повторно назначались кластерам карты t-SNE с использованием 30 маркерных генов в соответствии со стратегией картирования PRDD-seq.( E , Lower ) Таксономия трех возбуждающих слоев и четырех ингибирующих подтипов основана на средней экспрессии 30 маркерных генов в клетках PRDD-seq. ( Верхний ) Также показана относительная плотность корковых слоев для каждой подгруппы. Здесь pPVALB + обозначает подтип ингибирующих нейронов PVALB + / SST-VIP-LAMP5-. ( F ) Относительное соотношение между возбуждающими и тормозными нейронами ( Верхний, ) и между различными типами клеток возбуждающих нейронов ( Средний, ) или тормозных нейронов ( Нижний ) между PRDD-seq и 10 × Genomics scRNAseq.

Среди 1112 клеток PRDD-seq, которые были успешно заложены, мы провели анализ РНК PRDD-seq для измерения экспрессии 30 маркерных генов для каждой клетки. Наша оценка с использованием данных моделирования, полученных из наших собственных и опубликованных наборов данных scRNAseq (см. Материалы и методы ), показала, что эти 30 маркерных генов были достаточно информативными, чтобы сделать вывод о многих аспектах типа клеток и аннотации рассеченного слоя (рис. 3 D ). со средней точностью 84% для классификации коркового слоя (в пределах ± 1-слойная разница) и 83% для классификации подтипа тормозных нейронов.Затем мы использовали экспрессию этих 30 маркеров, чтобы успешно классифицировать 747/1112 PRDD-seq нейронов (67,2%) из UMB1465 на три возбуждающие подгруппы, соответствующие верхнему, среднему или нижнему кортикальному слою, и четыре ингибирующие подгруппы: соматостатин-положительные (SST +) , вазоактивный кишечный пептид-положительный (VIP +), лизосомно-ассоциированный мембранный белок 5-положительный (LAMP5 +) и предполагаемый парвальбумин-положительный (предполагаемый PVALB + или pPVALB +), поскольку пробы на PVALB не всегда анализировались напрямую (рис.3 E ). Клетки PRDD-seq, назначенные верхнему, среднему и нижнему уровням набором данных 10 × PFC scRNAseq, также были обогащены маркерами L2-L3, L4-L5 и L6, соответственно, в соответствии с набором данных SMART-seq MTG scRNAseq, что указывает на сходство составов типов клеток между PFC и MTG, сходство результатов с двумя методами scRNAseq и надежность алгоритма картирования (рис. 3 E , верхний ). Как наш набор данных 10 × scRNAseq, так и анализ PRDD-seq для UMB1465 и UMB4638 показали более высокую долю ингибирующих нейронов (от 43 до 47%), чем сообщалось с другими методами; однако это соотношение было очень схожим между тремя экспериментами, что позволяет предположить, что это соотношение отражает наш конкретный протокол сортировки NeuN +, а не технические аспекты методов типирования клеток (рис.3 F , Верхний ). Мы наблюдали удивительно сходное распределение слоев и подтипов между клетками PRDD-seq и scRNAseq для возбуждающих нейронов (тест χ ²; фиг. 3 F , средний ). Среди ингибирующих нейронов pPVALB + ингибирующие нейроны показали более высокое пропорциональное представительство в PRDD-seq, чем в scRNAseq, что позволяет предположить, что несколько нейронов в этой категории могут отражать неудачу амплификации других ингибирующих зондов (SST, VIP и LAMP5). Таким образом, наш анализ предполагает, что PRDD-seq захватывает основные аспекты типов клеток без систематической потери любого данного типа клеток.

Раннее расхождение предшественников возбуждающих и тормозных нейронов.

Одновременный анализ клонов и экспрессии генов от одних и тех же нейронов позволил нам изучить изменение вклада клеточного типа во время раннего нейрогенеза. Используя PRDD-seq, мы профилировали> 2700 нейронов из двух мозгов, UMB1465 и UMB4638, и успешно захватили информацию о клонах и типах клеток из 747 и 480 нейронов соответственно. Как в UMB4638, так и в UMB1465, все ветви клонов показали ранние sSNV как в возбуждающих, так и в тормозных нейронах, что отражает мутации, происходящие во время раннего эмбриогенеза до расхождения этих типов клеток, тогда как поздние SNV демонстрируют прогрессирующее ограничение одним или другим типом клеток (рис.4 A и B ). Среди шести основных клад в UMB1465 клада C содержала семь вложенных ветвей с мозаичными фракциями, уменьшающимися с 0,33 до 0,0067 (Рис. C5, и только возбуждающие нейроны, содержащие мутации от C6 до C7 (фиг. 4 A ), в то время как клады F демонстрировали аналогичное прогрессирующее ограничение. Точно так же обе клады A и B в UMB4638 показали вложенные мутации, которые постепенно ограничивались возбуждающими нейронами (рис.4 В ). Интересно, что возбуждающие нейроны появляются исключительно в ветвях с мозаичной фракцией ниже ∼0,04 (рис. 4 A и B и SI, приложение , таблица S1), что соответствует предшественнику, дающему около 4% от общего числа клеток. в этом кортикальном образце. Принимая во внимание, что около 40% кортикальных клеток являются возбуждающими нейронами, а остальные — глиальными клетками или тормозными нейронами (28, 29), это наблюдение предполагает, что 10 или более возбуждающих NPC генерируют возбуждающие нейроны в данной области коры или «столбце»; тот факт, что от шести до семи (включая разветвленную кладу) возбуждающих предшественников явно отмечены неперекрывающимися кладами и составляют от 60 до 70% возбуждающих нейронов в нашей выборке, независимо подтверждает эту оценку.С другой стороны, две клады (A и B) из UMB1465 статистически обогащены ингибирующими нейронами (двусторонний однопроцентный тест Z P <0,05), при этом процент ингибирующих нейронов увеличивается с B1 до B2. (Рис.4 A ). Эти результаты показывают, что по крайней мере некоторые человеческие NPCs демонстрируют ограниченный выход клеточного типа и что возбуждающие и тормозящие нейроны генерируются из разных областей-предшественников, подтверждая модель, впервые установленную на мышах (30–32).Фактически, ганглиозное возвышение между людьми и животными вполне сохраняется (33, 34), что согласуется с нашими выводами.

Рис. 4.

PRDD-seq выявляет четкую последовательность развития возбуждающих нейронов в разных корковых слоях. ( A и B ) Общее количество (столбиковый график) и соотношение (точечный график) возбуждающих и тормозных нейронов в разных клонах, определенных одним или несколькими sSNV в ( A ) UMB1465 и ( B ) UMB4638. Процент возбуждающих нейронов увеличивался в более поздние моменты времени клонирования в кладах C и F в UMB1465 и в кладах A и B в UMB4638.В кладе E UMB1465 E1 разветвляется на два субклада E2A и E2B. Пунктирная линия обозначает средний процент возбуждающих нейронов. Звездочка обозначает значительно отличающееся от среднего соотношение возбуждающее-ингибирующее (двусторонний однопропорциональный тест Z , P <0,05). В кладах C и F из UMB1465 и в кладах A и B из UMB4638 более поздние мутации постепенно ограничиваются возбуждающими нейронами. ( C и D ) Распределение слоев возбуждающих нейронов в репрезентативных возбуждающих клонах в ( C ) UMB1465 и ( D ) UMB4638.Слои определяют путем картирования клеток PRDD-seq на ( верхний ) scRNAseq PFC человека или ( нижний ) человеческий scRNAseq MTG на основании сходства профилей экспрессии маркерных генов. Во всех трех проиллюстрированных кладах процент нейронов верхнего слоя увеличился, в то время как процент нейронов нижнего слоя уменьшился в клетках, содержащих sSNV, присутствующих в нижней мозаичной фракции. Значение P рассчитывали по корреляции Пирсона с порядковыми переменными.

Порядок формирования коркового слоя возбуждающих нейронов «наизнанку».

Дальнейшее определение подтипов возбуждающих нейронов с использованием ламинарных маркеров выявило специфичные для слоев паттерны нейрогенеза возбуждающих нейронов. Например, в UMB1465 процент нейронов нижнего слоя, несущих мутацию, уменьшился от мутации C1 до C4, и не было обнаружено нейронов глубокого слоя, несущих C5 к C7, при этом процент нейронов верхнего слоя увеличивался соответственно с C1 до C7 (Pearson корреляция P = 2,9 × 10 ⁻³; рис.4 C , верхний ).Чтобы получить более точную идентичность слоев клеток PRDD-seq, мы сопоставили их с набором данных SMART-seq MTG scRNAseq, полученным после микродиссекции слоев с использованием тех же методов, что и ранее (5), которые генерировали аналогичные шаблоны «даты рождения» в кладе C, с ранним линейные sSNV присутствуют во всех слоях, а позже sSNV ограничиваются средним и верхним слоями (корреляция Пирсона P = 1,4 × 10 ⁻³; Рис. 4 C , Нижний ). Аналогичная тенденция наблюдалась и в кладах A и B в UMB4638.Сопоставление клеток PRDD-seq UMB4638 с наборами данных 10 × PFC и SMART-seq MTG scRNAseq показало, что клетки с более поздними маркерами клонирования были ограничены средним и верхним слоями (фиг. 4 D ). Эти результаты вместе прямо указывают на то, что возбуждающие нейроны коры головного мозга человека формируются в последовательности «наизнанку-наружу» после рождения преплатных клеток, подобно мышам и нечеловеческим приматам (35–37). Кроме того, это предполагает, что нейроны в нижних слоях коры начинают относительно быстро становиться постмитотическими после того, как предшественники специализируются на продукции возбуждающих нейронов.

Разнообразные пространственно-временные закономерности развития тормозных подтипов нейронов.

Сопоставление клеток PRDD-seq с двумя разными наборами данных scRNAseq также позволило провести анализ кортикальных ингибирующих нейронов, которые происходят из нескольких временных структур вентрального конечного мозга, включая медиальные, латеральные и каудальные ганглиозные возвышения (MGE, LGE и CGE). , и мигрируют в дорсальную кору (30, 38). Однако высокодисперсный характер клонов тормозных нейронов, наблюдаемых на животных моделях (39–41), предполагает, что sSNV в ингибиторной линии, вероятно, будут присутствовать с чрезвычайно низкими частотами аллелей в основной массе ДНК и крошечных фракциях отдельных клеток, так что только До сих пор анализировались sSNV, возникающие на относительно ранней стадии развития.Тормозящие нейроны, полученные из MGE и CGE, можно отличить по экспрессии специфических маркеров (5, 6), а анализ PRDD-seq показал, что интернейроны с разными маркерными генами генерировались в одном и том же окне развития (рис. 5 A, и B). ). Анализируемые sSNV были общими для нескольких ингибирующих подтипов, что указывает на то, что поздние отметки могут быть более ограничены типами клеток, но не имеют различий, которые достигли бы статистической значимости (с поправкой на FDR χ ² теста P > 0.05). Предыдущие исследования, каталогизирующие интернейроны у мышей и людей, предположили, что производные MGE подтипы тормозных нейронов (SST + и PVALB +) обогащены инфрагранулярными кортикальными слоями, в то время как подтипы интернейронов, производные от CGE (LAMP5 / PAX6 +, VIP +), имеют тенденцию занимать преимущественно верхние корковые слои ( 5, 42, 43), и, таким образом, наше картирование клеток PRDD-seq на scRNAseq отражает эти паттерны. Анализы даты рождения у мышей и нечеловеческих приматов пришли к противоречивым выводам о том, следуют ли тормозные нейроны вывернутым паттернам генерации, подобным возбуждающим нейронам (44, 45), хотя недавние исследования на мышах предполагают, что предыдущие противоречия могут отражать свертку множественных паттернов генерации. это может быть специфичным для подтипа (46).Мы обнаружили, что нейроны подтипа pPVALB +, происходящие из MGE, обогащенные слоями с IV по VI, демонстрируют, во всяком случае, тенденцию для последних сгенерированных нейронов, чтобы показывать маркеры более глубоких слоев (рис. 5 C и D ). SST + нейроны, широко распространенные в слоях II-VI, аналогичным образом не демонстрировали вывернутого наизнанку паттерна, обнаруживаемого с помощью проанализированных мутаций и клеток (фиг. 5 C и D ). Мы надежно детектировали SST + нейроны с экспрессией маркеров слоя I в ПФК человека (SST-подобный подкласс) (рис.5 C и D ), что согласуется с наблюдениями на MTG (5, 47) и на мышах, где такие клетки, экспрессирующие SST + слоя I, редки, но присутствуют (43, 47). Эти SST-подобные клетки верхнего слоя, происходящие из CGE, являются подклассом интернейронов LAMP5 +, которые более транскрипционно связаны с VIP-нейронами, чем происходящие из MGE интернейроны SST +, хотя у них отсутствует экспрессия VIP (5, 47). Наши данные дополнительно подтверждают, что интернейроны LAMP5 + экспрессируют маркеры, указывающие на широкую ламинарную локализацию, но также не обнаруживают простой прогрессии образования изнутри наружу (5).Интересно, что мы наблюдали значительную часть нейронов, ингибирующих LAMP5 +, особенно SST-подобного класса, помеченных более поздними мутациями, что указывает на то, что этот подтип может образовываться позже во время развития, чем другие типы ингибирующих клеток (рис. 5 C и D ). ). В целом, наши результаты предлагают мало доказательств вывернутых паттернов нейрогенеза, демонстрируемых возбуждающими нейронами, но также показывают, что подробный анализ интернейронов, вероятно, потребует глубоких наборов данных sSNV, происходящих на поздних стадиях развития интернейронов, и методов анализа с более высокой пропускной способностью. .

Рис. 5.

PRDD-seq выявляет гетерогенный процесс развития тормозных нейронов. ( A и B ) Распределение различных подтипов тормозных нейронов в разных клонах в ( A ) UMB1465 и ( B ) UMB4638. Основные подтипы тормозных нейронов широко распространены в разных клонах. ( C и D ) Распределение уровней ингибирующих подтипов в репрезентативных клонах в ( C ) UMB1465 и ( D ) UMB4638.Гистограммы показывают долю нейронов каждого подтипа в разных слоях. Интернейроны, происходящие из MGE (SST + и pPVALB +) и CGE (VIP +, LAMP5 / PAX6 + и SST-подобные), показали сходные профили мутаций, что позволяет предположить, что группы продуцируются одновременно. Нейроны подтипа pPVALB + были обогащены слоями с IV по VI, в то время как полученные из MGE интернейроны SST + показали такое же ламинарное распределение, что и интернейроны pPVALB +, без четких доказательств паттерна датирования рождения «наизнанку». Интернейроны, производные от CGE, были широко распределены по кортикальным слоям, при этом SST-подобные клетки в значительной степени поддерживали надгранулярные слои; LAMP5 +, включая SST-подобные клетки, были обогащены более поздними метками клонирования, что позволяет предположить, что они могут продуцироваться позже в развитии, чем другие подтипы.

Обсуждение

Мы разработали scMH и PRDD-seq, которые позволили нам одновременный анализ клеточного происхождения и типа транскрипционных клеток в мозге человека — и, потенциально, в мозге любого млекопитающего — за счет улучшенной идентификации sSNV в глубоком объеме и секвенирования одной клетки данные. Наш анализ одной области коры (PFC) в двух отдельных головах мозга выявил некоторые консервативные образцы клеточного происхождения по сравнению с нечеловеческими, в том числе то, что тормозные и возбуждающие нейроны расходятся на ранней стадии у людей, и что возбуждающие нейроны формируются в аналогичном порядке «наизнанку». как видно на моделях животных.Однако PRDD-seq также обеспечивает количественную оценку у любого вида количества клеток-предшественников (~ 10), которые генерируют возбуждающие нейроны в данной области коры. Кроме того, PRDD-seq также предоставил некоторое прямое представление о развитии тормозных нейронов у людей, поддерживая параллельное развитие различных подтипов тормозных нейронов с пространственными и временными ассоциациями, специфичными только для некоторых подтипов. Наши данные показывают, что по мере улучшения методов захвата sSNV, присутствующих в небольшом количестве клеток, естественного появления sSNV с каждым клеточным делением (13, 14, 17), вероятно, достаточно, чтобы обеспечить очень богатую карту структур клеточных клонов в любом заданном посмертный человеческий мозг.

Считается, что кора головного мозга человека содержит ~ 80% возбуждающих глутаматергических нейронов и 20% ГАМКергических интернейронов (48), хотя недавние исследования scRNAseq показали несколько меньшее соотношение — около 70% возбуждающих нейронов ( SI Приложение , Таблица S3. ) (5, 49, 50). Хотя наш анализ PRDD-seq показал в целом 661 возбуждающих против 566 тормозных PRDD-seq клеток для UMB1465 и UMB4638, что составляет 54% возбуждающих нейронов ( SI Приложение , Таблица S3), эта более высокая доля тормозных нейронов, по-видимому, отражает оба аспекта ткани (которая хранилась в замороженном виде в течение длительного времени) или наш метод сортировки NeuN +, поскольку аналогичные соотношения наблюдаются в 10 × scRNAseq из одного проанализированного мозга ( SI Приложение , Таблица S3).С другой стороны, клетки PRDD-seq исследуются как содержащие по крайней мере один sSNV, идентифицированный из scMH с использованием небольшого количества глубоко секвенированных нейронных ядер, выделенных из той же области, и поэтому не представляют собой объективную выборку области человеческого мозга. Тем не менее, тот факт, что мы можем отнести от 60 до 70% всех возбуждающих нейронов к кладам в UMB1465, и что нейроны с идентифицированными SNV представляют собой большинство основных типов нейронов в scRNAseq (рис. 3 E ), предполагает, что наша выборка захватила большая часть линии коркового пятна, хотя редкие линии, вероятно, будут пропущены без более глубокого секвенирования.Более того, наличие от шести до семи явно отмеченных клад и способность соотносить частоту аллелей sSNV с возбуждающим ограничением клеток, несущих этот sSNV, позволяет проводить две независимые количественные оценки того, сколько предшественников (~ 10) вносят вклад в нейроны участка коры, из которого были изолированы нейроны, иллюстрируют замечательный количественный потенциал этого подхода.

Поскольку случайное выпадение ДНК-меток и РНК-маркеров в PRDD-seq неизбежно, что ограничивается качеством изолированных ядер, мы подчеркиваем, что наши результаты наиболее надежны при анализе клеток, положительных для обоих.Качество посмертных тканей головного мозга может влиять на целостность как гДНК, так и информационной РНК (мРНК). Что касается ДНК, поскольку перед целевой преамплификацией не проводится полногеномная амплификация, для генотипирования каждого sSNV доступна только одна молекулярная копия каждого аллеля, поэтому случайное выпадение неизбежно. Однако наша стратегия клонирования основана не только на наличии clade-специфических sSNVs, но также и на отсутствии многих sSNV из др. Клад (Fig. 3 A ), поэтому вероятность неверного назначения клеток должна быть относительно небольшой.Тем не менее, сопоставление наших sSNV с нашим набором данных scRNAseq предполагает, что метки происхождения присутствуют в основных подтипах нейронов, хотя редкие типы нейронов, вероятно, будут пропущены с учетом нашего скромного размера выборки. Что касается РНК, отдельные ядра из посмертного мозга человека содержат лишь небольшое количество мРНК. Анализы Fluidigm Biomark — это методы количественной ПЦР на основе микрофлюидики, чувствительные к незначительным изменениям входных данных или окружающей среды. В результате мы наблюдали процент выпадения ДНК-маркеров 30,4% и аналогичный уровень выпадения маркеров РНК.Однако, поскольку анализ PRDD-seq исключил эти события выпадения и был полностью основан на относительных пропорциях типов клеток на разных стадиях в пределах одной линии, у нас нет оснований полагать, что выпадения являются систематическими по отношению к типу клеток, за одним исключением: относительно большая доля нейронов pPVALB + в PRDD-seq, чем у scRNAseq, что, вероятно, отражает отказ некоторых зондов для SST, VIP и LAMP5. В будущем, вероятно, удастся решить эту проблему с помощью более совершенных и богатых наборов датчиков.

У нашего анализа есть ограничения, так как мы анализируем небольшую выборку огромного размера человеческого мозга, а PRDD-seq является относительно низкой пропускной способностью и дорогостоящим, поэтому только наш первоначальный анализ может сделать выводы об относительно распространенных типах клеток. Настоящий анализ несколько ограничен в анализе поздних мутаций, присутствующих в 1% клеток, особенно в интернейронах, так как сложно обнаружить эти мутации с большой чувствительностью, но в будущем потребуется провести исследования отдельных клеток на подтипах нейронов.С другой стороны, комбинированный анализ sSNV и типов клеток архивный и прогрессивный. Огромный размер человеческого мозга означает, что каждый последующий раунд секвенирования ДНК — будь то объемная ткань или единичные или объединенные клетки — увеличивает общую глубину данных последовательности и предоставляет все более богатую информацию о поздних sSNV. В самом деле, вероятная дисперсная природа ингибирующих клонов предполагает, что анализ одной области коры может предоставить данные о последовательности, полезные при анализе совершенно другой области коры для этих типов клеток.

В целом PRDD-seq имеет много преимуществ даже за пределами количественного анализа родословных и мозаичных фракций, которые мы начинаем иллюстрировать здесь. Поскольку в этом методе sSNV используются в качестве маркеров клонов, он по своей сути является геномным и не только позволяет корреляцию нормальных паттернов развития, но и немедленно фиксирует изменения клонов паттернов, вызванные изменяющими функцию зародышевой линией или соматическими мутациями. Кроме того, поскольку sSNV служат клеточными маркерами in vivo для построения карты линии развития без каких-либо трансгенных манипуляций, как показано в этом исследовании, метод обещает быть применимым, в принципе, к любому виду или заболеванию человека, для которого доступен посмертный мозг. .

Материалы и методы

Методологические детали WGS тканей человека, оценка частоты отказов и ошибок, связанных с конкретными клетками, вызов sSNV и сравнение производительности, проверка sSNV, создание моделируемых данных WGS для отдельных клеток, разработка и выбор генотипирования Taqman и зонды экспрессии генов, подготовка и секвенирование 10x Genomics, анализ scRNAseq, совместный анализ клеток PRDD-seq и scRNAseq, а также количественный и статистический анализ описаны в SI Приложение , Дополнительные материалы и методы .

Структура scMH.

Общая структура scMH проиллюстрирована на рис. 2 A . Кандидаты sSNV сначала вызывались из данных массового секвенирования с использованием байесовской графической модели (20, 21), в которой вероятность соматической мутации и трех генотипов унаследованной мутации вычислялась с учетом вариации биномиальной выборки и ошибок определения оснований ( Рис.2 A , Левый ). Присутствие или отсутствие соматической мутации в каждой отдельной клетке затем предполагалось путем адаптации вероятности и доли аллеля соматической мутации, оцененных из основной выборки как априорная вероятность, после контроля частоты выпадения клеточно-специфичных аллелей ( d ) и частоты ошибок (). e ) (рис.2 A , Правый ). Подробная информация о байесовской модели и фильтрах ошибок scMH представлена в SI Приложение , Дополнительные материалы и методы .

PRDD-Seq.

Отдельные ядра из посмертных образцов головного мозга выделяли с использованием FANS для NeuN, как описано ранее (51). Выделенные одиночные ядра нейронов напрямую сортировали в буферы для предварительной амплификации CellsDirect One-Step qRT-PCR (Thermo Fisher Scientific), содержащие 0 мкг.14 × анализов экспрессии генов Taqman и генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов. Предварительную амплификацию всех ампликонов кДНК и гДНК проводили непосредственно после сортировки FANS. После предварительной амплификации образцы разбавляли в 10 раз и загружали в интегрированные жидкостные схемы для определения генотипа 96,96 или динамического анализа экспрессии гена 192,24 для стандартной амплификации в соответствии с инструкциями производителя (Biomark, Fluidigm). Генотип и экспрессию генов дополнительно определяли с помощью машины Biomark и анализировали с помощью программного обеспечения Biomark / EP1 (Fluidigm).

Благодарности

Мы благодарим Р. Маттье, К. Браунстайна, Дж. Ли, центр проточной цитометрии в Бостонской детской больнице, Бостонскую детскую больницу, Центр исследования молекулярной генетики, Исследовательского центра психических расстройств и нарушений развития, а также группу исследовательских вычислений в Гарвардской медицинской школе. для оказания помощи. Мы благодарим Дж. Фишелла, К. Харвелла и Ф. Ваккарино за комментарии к рукописи. Человеческие ткани были получены из NeuroBioBank при Университете Мэриленда и из BrainNet для аутизма, и мы благодарим доноров и их семьи за их неоценимые пожертвования на развитие науки.П.Л. является научным сотрудником Медицинского института Говарда Хьюза и Фонда Хелен Хей Уитни. R.E.R. поддерживается стипендией Стюарта Х. К. и Виктории Куан в области нейробиологии и программой Гарварда / Массачусетского технологического института (Грант T32GM007753). S.N.K поддерживается стипендией Стюарта Х. К. и Виктории Куан в области нейробиологии. E.A.L поддерживается грантами Национального института старения (грант K01AG051791), Фонда Сух Кёнбае и программы Allen Discovery Center через The Paul G. Allen Frontiers Group.C.A.W. поддерживается Центром исследования орфанных болезней Мантона, программой Центра открытий Аллена через The Paul G. Allen Frontiers Group, грантом R01NS032457 из Национального института неврологических расстройств и инсульта и грантом U01Mh206883 из Национального института психического здоровья. C.A.W. является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза.

Сноски

Этот вклад является частью специальной серии инаугурационных статей членов Национальной академии наук, избранных в 2018 году.
Вклад авторов: A.Y.H., P.L., and C.A.W. спланированное исследование; A.Y.H. и П. проведенное исследование; A.Y.H., P.L., R.E.R., S.N.K., C.J.K., R.D.H., T.E.B., J.A.M. и E.S.L. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; A.Y.H., P.L., S.N.K., Y.D., S.K.A., P.J.P., E.A.L. и C.A.W. проанализированные данные; и A.Y.H., P.L., S.K.A., E.A.L. и C.A.W. написал газету.
Рецензенты: M.E.H., Университет Рокфеллера; и П.Р., Йельский университет.
Заявление о конкурирующих интересах: T.Э. и P.R. являются соавторами статьи 2019 года.
Размещение данных: данные о секвенировании были депонированы в Национальном центре биотехнологии. Архив считывания последовательностей с номерами доступа. SRP041470 и SRP061939.

Нуклеиновые кислоты. ДНК и РНК

Биология — 9

Наука: Наука и техника: Lenta.ru

Укажите различие между РНК и ДНК по составу главных и минорных оснований, характеру углевода, строению, молекулярной массе, локализации в клетке

Сравнительная характеристика ДНК и РНК

Функции и расположение рибосом в клетке

Отличительные характеристики

Расположение в клетке

Рибосомы и протеин

Что такое РНК?

ДНК, РНК и белки

И.А. ДНК, РНК и белки

Какая клеточная органелла хранит ДНК и синтезирует РНК?

Внутри ядра

Структура и функции ДНК

Синтез РНК: копирование последовательностей ДНК

Рибосомы и синтез белка

Основы ДНК и РНК: репликация, транскрипция и трансляция

Структура ДНК: феноменальные биологические силы … Маленькое жизненное пространство

Репликация: удвоение ДНК

Интерлюдия: РНК против ДНК

Создание белка, часть 1: Транскрипция

Создание белка, часть 2: перевод

Пространственно-временной контроль синтеза ДНК, РНК, белков и липидов

Практическое руководство по секвенированию одноклеточной РНК для биомедицинских исследований и клинических приложений | Геномная медицина

Параллельный анализ РНК и ДНК после глубокого секвенирования (PRDD-seq) выявляет типовые образцы клеток в человеческом мозге

Значение

Abstract

Результаты

Одновременный анализ отдельных клеток по типу и происхождению с помощью PRDD-Seq.

Обнаружение sSNV, информативных о происхождении, на основе данных WGS большого мозга и одиночного нейрона.

Клонирование и идентичность клеточного типа одиночных нейронов, выявленная с помощью PRDD-Seq.

Раннее расхождение предшественников возбуждающих и тормозных нейронов.

Порядок формирования коркового слоя возбуждающих нейронов «наизнанку».

Разнообразные пространственно-временные закономерности развития тормозных подтипов нейронов.

Обсуждение

Материалы и методы

Структура scMH.

PRDD-Seq.

Благодарности

Сноски

Author: alexxlab

Добавить комментарий Отменить ответ

Рубрики