Как ты будешь действовать в экстремальной ситуации укажи последовательность: Как ты будешь действовать в экстремальной ситуации? Укажи последовательность действий и поясни. — Окажу первую помощь

Отмены

Информируем Вас об изменениях в репертуаре, информация будет дополняться:

19.04.2020 Шедевры великих хореографов Театральный зал перенос на 03 ноября 2020

19.05.2020 19:00 «Даниил Крамер и его трио» Театральный зал перенос на 26 октября 2020

21.05.2020 19:00 «Воспоминания ветра v2.0» Театральный зал перенос на 12 декабря 2020

26.05.2020 19:00 «ТенорА XXI века». «Лучшие песни
советских ВИА» Камерный  зал перенос на 04 октября 2020

27.05.2020 19:00 «Гайдн. «Лондонские симфонии» и концерты. Оркестр Musica viva» , ранее перенесенный на 12 февраля 2021 г в Камерный зал переносится на 09 октября 2021
27.05.2020 19:00 «Всюду жизнь!» Спектакль Егора Дружинина Театральный зал перенос на 23 октября 2020

28.05.2020 19:00 «Фестиваль Олега Митяева «Крепитесь, люди, скоро лето!» Светлановский зал  перенос на 28 апреля 2021

28.05.2020 19:00 «Хор Саввино-Сторожевского монастыря » Камерный зал  перенос на 12 ноября 2020

01.06.2020 19:00 «Хор Московского Сретенского Монастыря» Камерный зал  перенос на 10 сентября 2020

02.06.2020 19:00 «Алексей Айги и ансамбль «4’33»» Театральный зал  перенос на 09 ноября 2020

04.06.2020 19:00 ««Моцарт-Драйв». Классика с шоу песка и света» Камерный  зал перенос на 29 ноября 2020

04.06.2020 19:00 ««Рахманинов. Величайшие шедевры» Светлановский  зал перенос на 19 октября 2020

08.06.2020 19:00 Антон Батагов. «Человек, который стал радугой» Светлановский зал перенос на 19 сентября 2020

09.06.2020 19:00 «Ах, Арбат, мой Арбат…Посвящение Булату Окуджаве» Театральный зал перенос на 22 февраля 2021

09.06.2020 19:00 «Русский Паганини» Камерный зал перенос на 17 октября 2020

16.06.2020 19:00 «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ХОРЕОГРАФИЧЕСКИЙ АНСАМБЛЬ «БЕРЕЗКА» им. Н.С. НАДЕЖДИНОЙ» Светлановский зал перенос на 19 сентября 2020

17.06.2020 19:00 «Орган и дудук. Дыхание вечности» Светлановский  зал перенос на 06 октября 2020

17.06.2020 19:00 «Терем-квартет и Квартет Танеева» Театральный зал перенос на 14 марта 2021

25.06.2020 19:00 «Леван Ломидзе, Константин Никольский» Театральный зал перенос на 19 ноября 2020

01.07.2020 19:00 «День Святого Патрика в Доме Музыки» Театральный зал перенос на 14 октября 2020

01.07.2020 19:00 «Бах. Органные шедевры. О. Кравченко, орган» Светлановский  зал перенос на 13 февраля 2021

07.07.2020 19:00 «Юнона и Авось. Театр Алексея Рыбникова» Театральный зал перенос на 18 октября 2020

13.07.2020 19:00 «Хор Московского Сретенского монастыря «Любимые песни» Камерный зал

перенос на 21 декабря 2020

19.05.2020 и 16.09.2020 19:00 Кубанский казачий хор Светлановский зал, перенесенный ранее на 25.10.2020 ПЕРЕНЕСЕН на 31.01.2021

03.10.2020 19:00 Марк Гросс и его джаз-квартет (США) Театральный зал ПЕРЕНОС на 21.11.2020 

03.10.2020 20:00 Хор Валаамского монастыря Светлановский зал ПЕРЕНОС на 10.10.2021

16.10.2020 19:00 Шедевры Эннио Морриконе Светлановский зал ПЕРЕНОС на 17 октября 2020

18.10.2020 19:00 А. Городницкий «Остается только любовь» Театральный зал ПЕРЕНОС на 18 апреля 2021

17.10.2020 13:00, 12.10.2021 13:00 Холодное сердце Театральный зал ПЕРЕНОС на 13 марта 2022

02.10.2020 19:00 Хор Сретенского монастыря Камерный зал ПЕРЕНОС на 21 января 2021 (Примечание: в этот день уже запланирован другой концерт Хора Сретенского Монастыря. Билеты, купленные на концерт 03.10.2020 действительны для посещения 21.01.2021, для их владельцев специально забронированы места)

18.10.2020 13:00 «Буратино». Театр Алексея Рыбникова Театральный зал ПЕРЕНОС на 30 января 2021

15.10.2020 Оркестр им. Лундстрема. Мастера джаза Театральный зал ПЕРЕНОС на 01 июля 2021

16.10.2020 19ч Полина Шамаева, меццо-сопрано  Театральный зал, ранее перенесенный на 05 февраля 2021 в 19ч  Новый зал ПЕРЕНОСИТСЯ на 05 ноября 2021 19ч

18.10.2020 Органная музыка Баха. «Двенадцать хоралов» Светлановский зал ПЕРЕНОС на 19 декабря 2020 

18.10.2020 Юнона и Авось. Театр Алексея Рыбникова Театральный зал ПЕРЕНОС на 04 декабря 2020

30.10.2020 в 19:00 Большой джазовый оркестр Петра Востокова Светлановский зал ПЕРЕНОС на 17.04.2021 (В этот день уже запланирован аналогичный концерт. Билеты, купленные на концерт 30.10.2020, действительны для посещения концерта 17.04.2021 в 19:00, для их владельцев специально забронированы места)

31.10.2020 в 12:00 Пеппи Длинныйчулок Театрльный зал ПЕРЕНОС на 28.02.2021 (В этот день уже запланирован аналогичный концерт в 12:00. Билеты, купленные на концерт 31.10.2020, действительны для посещения концерта 28.02.2021 в 12:00, для их владельцев специально забронированы места)

31.10.2020 в 17:00 Пеппи Длинныйчулок Театральный зал ПЕРЕНОС на 28.02.2021 (В этот день уже запланирован аналогичный концерт в 17:00. Билеты, купленные на концерт 31.10.2020, действительны для посещения концерта 28.02.2021 в 12:00, для их владельцев специально забронированы места)

18.10.2020 Виртуозы Москвы. Как шутит оркестр Светлановский зал ПЕРЕНОС в КАМЕРНЫЙ зал

19.10.2020 Александр Доронин и Роман Борисов (фортепиано) Камерный зал ПЕРЕНОС в Новый зал

22.10.2020 Моцарт. Виртуозы Москвы Светлановский зал

ПЕРЕНОС в Театральный зал

29.10.2020 Tango evolucion. Solo tango orquesta  Театральный зал ПЕРЕНОС на 28 октября 2021

31.10.2020 Виртуозы Москвы. Как шутит оркестр Камерный зал ПЕРЕНОС на 27 февраля 2021

01.11.2020 13:00 Мифы и легенды Древней Греции  Камерный зал ПЕРЕНОС на 28 февраля 2021

01.11.2020 19:00 Путешествие в блюз с Игорем Брилем Театральный зал ПЕРЕНОС на 16 декабря 2020

* в этот день уже запланирован концерт “М. Мерабова и Bril Family”. Билеты,
купленные на концерт 01.11.2020, действительны для посещения концерта 16.12.2020, для их
владельцев специально забронированы места

04.11.2020 19:00 Джаз-мануш фестиваль Gypsysphera Камерный зал ПЕРЕНОС на 14 апреля 2021

06.11.2020 Моцарт. Реквием; «Ave Maria». Камерный зал ПЕРЕНОС в Камерный зал 

07.11.2020 12:00 «В мире балетных чудес». Президентский оркестр России Светлановский зал

ПЕРЕНОС на 20 ноября 2021

08.11.2020 19:00 Алла Демидова. Мои любимые стихи Театральный зал ПЕРЕНОС на 03 апреля 2021

11.11.2020 Орган и дудук. Дыхание вечности  Светлановский зал, ранее перенесенное на 18.11.2020 в Камерный зал ПЕРЕНОСИТСЯ на 07 апреля 2021 (Камерный зал)

12.11.2020 19:00 Восточная феерия Театральный зал ПЕРЕНОС на 11 ноября 2021

14.11.2020 Вождь краснокожих Театральный зал ПЕРЕНОС на 17.04.2021 (В этот день уже запланирован аналогичный концерт. Билеты, купленные на концерт 14.11.2020, действительны для посещения концерта 17.04.2021, для их владельцев специально забронированы места)

14.11.2020 19:00 Валерия Ланская. Леонид Серебренников Камерный зал ПЕРЕНОС на 13 ноября 2021

14.11.2020 19:00 Денис Мажуков. Осенний рок-н-ролл Театральный зал ПЕРЕНОС на 03 ноября 2021

14.11.2020 19:00  Владимир Спиваков и НФОР. Моцарт. Малер  Светлановский зал ПЕРЕНОС на 08 декабря 2020
13.11.2020 19:00  Иван Ожогин. «Саундтрек» Светлановский зал ПЕРЕНОС на 13 мая 2021

15.11.2020 Дюймовочка. Театр «Корона русского балета» Театральный зал ПЕРЕНОС на 20.02.2021 (В этот день уже запланирован аналогичный концерт. Билеты, купленные на концерт 15.11.2020, действительны для посещения концерта 20.02.2021, для их владельцев специально забронированы места)

18.11.2020 Rastrelli Cello Quartet. От Чайковского до Битлз Камерный зал ПЕРЕНОС на 25 мая 2021
19.11.2020 19:00  Леван Ломидзе и Константин Никольский Театральный зал ПЕРЕНОСна 07 апреля 2021

20.11.2020 Оркестр «Русская филармония». Viva Tango!  Светлановский зал ПЕРЕНОС 20 ноября 2021

21.11.2020 19:00 Марк Гросс и его джаз-квартет (США) Театральный зал ПЕРЕНОС на 25 ноября 2021

21.11.2020 19:00 «Квартет Мелодион. «Времена года» с песочной анимацией » Камерный зал ПЕРЕНОС на 13 марта 2021

23.11.2020 Фестиваль фортепианного искусства «Навстречу конкурсу Крайнева» Театральный зал ПЕРЕНОС в НОВЫЙ зал

26.11.2020 Оскар Строк. Ах, эти черные глаза… Камерный зал ПЕРЕНОС на 26 ноября 2021
27.11.2020  Владимир Спиваков и «Виртуозы Москвы» Светлановский зал ПЕРЕНОС на 24 декабря 2020

28.11.2020  Клоун-дирижер и духовой оркестр Камерный зал ПЕРЕНОС 23 февраля 2021

29.11.2020  Ансамбль песни и пляски имени Локтева Светлановский зал ПЕРЕНОС 28 ноября 2021

29.11.2020 Бенгальские огни Театральный зал ПЕРЕНОС на 13.12.2020 (В этот день уже запланирован аналогичный концерт. Билеты, купленные на концерт 29.11.2020, действительны для посещения концерта 13.12.2020, для их владельцев специально забронированы места)

13.12.2020 19:00  Д. Крамер – Д. Мажуков «Джаз-энд-ролл»  Светлановский зал  ПЕРЕНОС на 15 сентября 2021
29.11.2020 19:00  «Кино и джаз» Театральный зал ПЕРЕНОС на 14 октября 2021
05.12.2020 19:00  Владислав Косарев. «День рождения вместе с вами!»  Театральный зал ПЕРЕНОС на 19 марта 2021
09.12.2020 19:00 Гайдн. «Лондонские симфонии», ранее перенесенный на 12 февраля 2021 г в  Камерный зал ПЕРЕНОС на 9 октября 2021 с заменой названия: Гайдн. «Лондонские симфонии» и концерты. Оркестр Musica viva (Примечание: этот концерт был объединен с ранее перенесенным концертом с 09.12.2020 Гайдн. «Лондонские симфонии», соответственно он тоже переносится)

11.12.2020 19:00 Казаки России Светлановский зал ПЕРЕНОС в Театральный зал
12.12.2020 13:00 Великие люди. Князь Александр Невский Камерный зал ПЕРЕНОСна 27 ноября 2021

12.12.2020 Братья Компанейцы. Воспоминание ветра v2.0 Театральный зал перенесенный ранее на 29.04.2021 ПЕРЕНЕСЕН на 20 мая 2021
15.12.2020 19:00  Арт-проект «ТенорА XXI века». Новогодний концерт  Камерный зал ПЕРЕНОС на 17 декабря 2021 из Камерного зала в Театральный зал
19.12.2020 12:00 Органная музыка Баха. «Двенадцать хоралов»  Светлановский зал ПЕРЕНОС на 11 апреля 2021
19.12.2020 19:00 Оркестр волынщиков Москвы Светлановский зал  ПЕРЕНОС на 02 декабря 2021

24.12.2020 19:00 Андрей Гугнин, фортепиано  Новый зал ПЕРЕНОС на 16 декабря 2021
30.12.2020 19:00  Оркестр им. Лундстрема. Evergreen* Театральный зал ПЕРЕНОС на 30 декабря 2021

28.01.2021 19:00 Ансамбль Александрова. Страны и континенты Светлановский зал ПЕРЕНОС на 02 февраля 2021

28.01.2021 19:00  Павел Майков. Сергей Довлатов «Зона» Камерный зал ПЕРЕНОС на 27 января 2022

30.01.2021 19:00 Александр Вертинский. Пьеро без грима Камерный зал ПЕРЕНОС на 28 января 2022
31.01.2021 12:00   «Времена года»  Светлановский зал  ПЕРЕНОС на 30 января 2022
01.02.2021 19:00  Тимофей Владимиров и Александра Стычкина ПЕРЕНОС мероприятия из
Камерного зала в Новый зал
05.02.21 19:00  Эдуард Артемьев. Киномузыка и «Реквием» Светлановский зал  ПЕРЕНОС  на 10 ноября 2021
05.02.21 19:00  Методие Бужор. «Отражение»  Театральный зал  ПЕРЕНОС на 17 октября 2021
07.02.21 19:00  Г. Остер «Вредные советы»  Театральный зал ПЕРЕНОС на 04 ноября 2021
12.02.2021  Хор «Оптина Пустынь»  Светлановский зал ПЕРЕНОС на 03 марта 2022
07.03.2021 19:00  Леонид Серебренников и его леди  Камерный зал ПЕРЕНОС на 05 марта 2022 и замена названия на Лучшие романсы о любви
08.03.2021 Аарон Майерс и джаз-трио Сергея Васильева  Театральный зал ПЕРЕНОС на 13 марта 2022

13.03.2021 19:00 Александр Вертинский. Возвращение Камерный зал ПЕРЕНОС на 12 марта 2022
14.03.2021 19:00  Михаил Казиник. «Тайны гениев»  Светлановский залПЕРЕНОС на 05 ноября 2021
15.03.2021 19:00  Конкурс Крайнева. Александра Довгань и Валентин Малинин ПЕРЕНОС из Камерного зала в Новый зал
17.03.2021  Кэмерон Карпентер, орган (США)  Светлановский зал ПЕРЕНОС на 19 мая 2022
19.03.2021 19:00  Гайдн. «Лондонские симфонии»  Камерный залПЕРЕНОС на 04 марта 2022 и замена названия Гайдн. «Лондонские симфонии» и концерты. Оркестр Musica viva
03.04.2021 19:00  Ансамбль Александрова. Лучшее и новое  Светлановский залПЕРЕНОС на 29 января 2022 и ЗАМЕНА названия на Ансамбль Александрова
10.04.2021 13:00  Балет «Золушка» Театральный зал  ПЕРЕНОС на 22 мая 2021
10.04.2021 19:00  Леонид Серебренников представлят… Камерный зал  ПЕРЕНОС на 16 апреля 2022
18.04.2021 19:00  Александр Городницкий «Остается только любовь»  Театральный зал  ПЕРЕНОС на 17 апреля 2021
22.05.2021 13:00  Балет «Золушка»  Театральный зал ПЕРЕНОС на 26 сентября 2021

 30.09.2020 19:00 «Алексей Семенов, орган» Светлановский зал ЗАМЕНА исполнителя и названия концерта на Aлексей Семенов, орган.

04.11.2020 19:00 «Кай Йоханнсен (Германия)» Театральный зал ЗАМЕНА исполнителя и названия концерта на Органные шедевры Баха. Олеся Кравченко. 

01.11.2020 19:00 Путешествие в блюз с Игорем Брилем Театральный зал ЗАМЕНА исполнителя и названия на «Путешествие в блюз с Игорем Брилем»

14.11.2020 19:00 «Владимир Спиваков и НФОР. Солист Тони Юн, ф-но» Светлановский зал ЗАМЕНА программы, исполнителя и названия на Владимир Спиваков и НФОР. Моцарт. Малер

20.05.2020 19:00 Бетховен. В.Спиваков и НФОР. Солист — Даниэль Лозакович (скрипка) Светлановский зал ОТМЕНА! 

27.05.2020 19:00 Академический Ансамбль песни и пляски Российской Армии им. А.В.Александрова Светлановский зал ОТМЕНА!

26.05.2020 19:00 «Людмила Голуб, орган» Светлановский зал ОТМЕНА! 

28.05.2020 19:00 «Про Федота-стрельца, удалого молодца» Театральный зал ОТМЕНА! 

31.05.2020 13:00 «В кругу друзей МБФ Владимира Спивакова» Камерный зал ОТМЕНА! 

03.06.2020 19:00 «Денис Мажуков (фортепиано) и его бэнд» Театральный зал ОТМЕНА! 

12.06.2020 19:00 «Ансамбль танца Адыгеи «Нальмэс» и Хор имени М.Е.Пятницкого» Светлановский зал ОТМЕНА! 

16.06.2020 19:00 «Золотой век тенор-саксофона». Валерий Киселев и Ансамбль классического джаза» Театральный зал ОТМЕНА! 

17.06.2020 19:00 «Виртуозы Москвы. Камерные вечера, Мендельсон, Гайдн, Вивальди, Дворжак» Камерный зал ОТМЕНА! 

18.06.2020 19:00 «Хор Московского Данилова монастыря. «Вальса звук прелестный» Камерный зал ОТМЕНА! 

18.06.2020 19:00 «Даниил Крамер, фортепиано» Театральный зал ОТМЕНА! 

19.09.2020 19:00 «Антон Батагов. «Человек, который стал радугой»» Светлановский  зал ОТМЕНА! 

07.11.2020 19:00 АClayton-Hamilton Jazz Orchestra и Рене Мари Светлановский зал  ОТМЕНА!

08.12.2020 19:00 «Хор Московского Сретенского монастыря «Жизнь верой и честью»» Камерный  зал ОТМЕНА! (для зрителей, купивших билеты, специально забронированы места на концерте 21 декабря 2020)

04.10.2020 13:00 «Сказки Пушкина» Камерный зал ОТМЕНА! 

16.10.2020 19:00 «Ревизор. Е. Вуличенко, Е. Воскресенский» Театральный зал ОТМЕНА! 

18.10.2020 19:00 «Ансамбль российского казачества» Светлановский зал ОТМЕНА! 

24.10.2020 19:00 «Дмитрий Назаров «L’amour — Мур» Новый зал ОТМЕНА! 

24.10.2020 19:00 «Марко Муссо и Давиде Томази» Камерный зал ОТМЕНА! 

30.10.2020 19:00 «Джек Гиббонс играет Джорджа Гершвина» Камерный зал ОТМЕНА! 

30.10.2020 19:00 Балет «Паганини». Корона русского балета Театральный зал  ОТМЕНА!

01.11.2020 13:00 «Волк и семеро козлят» Театральный зал ОТМЕНА! 

04.11.2020 19:00 Олеся Кравченко. Бах. Органные шедевры Светлановский зал ОТМЕНА! 

08.11.2020 13:00 «Золушка» Театральный зал ОТМЕНА! 

06.11.2020 19:00 «Red Priest. Вивальди «Времена года»»  Светлановский зал ОТМЕНА! 

07.11.2020 19:00 Трио Сергея Жилина. Чайковский in jazz Светлановский зал ОТМЕНА! 

11.11.2020 19:00 Рок-опера «КарамазоВЫ» Театральный зал ОТМЕНА! 

12.11.2020 19:00 Хор Саввино-Сторожевского монастыря Камерный зал ОТМЕНА! 

15.11.2020 13:00 МБФ Владимира Спивакова. Звезды на утреннем небе  Камерный зал ОТМЕНА! 

21.11.2020 13:00 Айболит и Бармалей Театральный зал ОТМЕНА! 

21.11.2020 19:00 «Грегори Бойд и его джаз-квартет» Камерный зал ОТМЕНА! 

21.11.2020 19:00 «Пьер Меа органист Реймсского собора» Светлановский зал ОТМЕНА! 

22.11.2020 13:00 Приключение Тома Сойера Театральный зал ОТМЕНА! 

24.11.2020 19:00 Большой Детский хор ВГТРК. 50 лет  Театральный зал ОТМЕНА! 
30.11.2020 19:30  В. Спиваков и НФОР. К. Дженкинс «Реквием» Светлановский зал  ОТМЕНА

05.12.2020 19:00 «Ирина Куликова» Камерный зал ОТМЕНА! 

06.12.2020 13:00 «Сказка о мертвой царевне и о семи богатырях» Камерный зал ОТМЕНА! 
08.12.2020 19:00 Дудук и джаз: Аргишти и трио Pal Mundo*  Камерный зал  ОТМЕНА! 
12.12.2020 13:00  «Ночь перед Рождеством» Театральный зал   ОТМЕНА! 
13.12.2020 13:00 Композиторы – детям: Бах и Гайдн Камерный зал   ОТМЕНА! 
13.12.2020 13:00 «Бенгальские огни» Театральный зал ОТМЕНА!
17.12.2020 19:00  Квартеты Бетховена. Rusquartet* Камерный зал  ОТМЕНА! 
19.12.2020 13:00 «Ночь перед Рождеством»  Театральный зал  ОТМЕНА! 
19.12.2020 Органное шоу фантазия «Сон в зимнюю ночь» Светлановский зал  ОТМЕНА! 
20.12.2020 13:00 и 17:00 «Щелкунчик»  Театральный зал  ОТМЕНА! 
20.12.2020 13:00  «Торжество гармонии», ранее была замена названия мероприятия на  «Звезды на утреннем небе»  Камерный зал  ОТМЕНА!
21.12.2020 19:00 Мира Кольцова. Творческий вечер Новый зал ОТМЕНА! 
26.12.2020 13:00 и 17:00  «Щелкунчик» Театральный зал  ОТМЕНА! 
26.12.2020 19:00  Перселл «Дидона и Эней». Questa musica Светлановский зал ОТМЕНА! 
27.12.2020 13:00  «Щелкунчик» Театральный зал ОТМЕНА! 
27.12.2020 13:00  «Сказки под Рождество» Камерный зал ОТМЕНА! 
27.12.2020 19:00 «Татьяна и Сергей Никитины. Диалог у новогодней елки » Камерный зал ОТМЕНА! 
28.12.2020 19:00  Три баса-профундо. «Песни советского кино» Камерный зал ОТМЕНА!
16.01.2021 17:00  Хор мальчиков училища им. М.И. Глинки  Светлановский зал ОТМЕНА!

31.01.2021 19:00 Звезда Русского Севера Светлановский зал ОТМЕНА!
31.01.2021 13:00  Маленький принц  Театральный зал  ОТМЕНА!
04.02.2021 19:00 Мартин Бейкер, орган (Великобритания)  Светлановский зал  ОТМЕНА!
07.02.21 13:00  Сказки Пушкина  Камерный зал  ОТМЕНА!
19.02.2021  Иисус Христос Суперзвезда  Театральный зал  ОТМЕНА!
19.02.2021  Алиса Гицба, сопрано   Камерный зал ОТМЕНА!
06.03.2021 19:00 «Гонсало Рубалькаба» Светлановский зал ОТМЕНА! 
12.03.2021  «Клавдия Шульженко – народная, любимая!»  Камерный зал  ОТМЕНА!
19.03.2021 19:00  Балет Кубанских казаков и ансамбль «Вайнах» Светлановский зал ОТМЕНА
28.03.2021 13:00 и 17:00  «Бременские музыканты»  Театральный зал ОТМЕНА!
04.04.2021 13:00 «Сказка о царе Салтане»  Театральный зал  ОТМЕНА!
11.04.2021 13:00 Органное шоу «Катя в Волшебной стране» Светлановский зал ОТМЕНА!
18.04.2021 13:00   «Приключения Оливера Твиста»   Театральный зал  ОТМЕНА

Билеты на перенесенные мероприятия действительны.
Возврат денежных средств зрителям за билеты по причине переноса возможен не позднее 10 календарных дней с первоначальной даты мероприятия, далее возможен возврат по желанию зрителя (но не позднее 3-х дней до дня проведения мероприятия).

Возврат денежных средств зрителям за билеты по причине отмены возможен не позднее 6 месяцев с даты снятия режима повышенной готовности.

Порядок возврата в разделе Возврат билетов https://msk.kassir.ru/pages/vozvrat  

 

Действия населения при сигнале «ВНИМАНИЕ ВСЕМ» – Новости Владивостока на VL.ru

Каждый гражданин Российской Федерации обязан знать порядок действий при получении сигнала «ВНИМАНИЕ ВСЕМ», поэтому Главное управление МЧС России по Приморскому краю напоминает:

При угрозе возникновения или в случае возникновения экстремальной ситуации, а именно: аварии, катастрофы, стихийного бедствия, воздушной опасности, угрозы химического, радиоактивного заражения и других опасных явлений во всех подверженных ЧС городах, населенных пунктах, объектах народного хозяйства включаются сирены, гудки, другие звуковые сигнальные средства, сирены специальных автомобилей. Это единый сигнал, означающий «ВНИМАНИЕ ВСЕМ», призывающий, в первую очередь внимание населения к тому, что сейчас прозвучит важная информация.

Что необходимо делать по этому сигналу?

Если Вы находитесь дома, на работе, в общественном месте и услышали звук сирены или звуковой сигнал «ВНИМАНИЕ ВСЕМ», то немедленно включите полную громкость приемника радиовещания на любой программе или включите телевизионный приемник на любой местный новостной канал.

По окончании звукового сигнала «ВНИМАНИЕ ВСЕМ» каналам телевидения и по радио будет передаваться речевая информация о сложившейся обстановке и порядке действия населения.

Всем взрослым необходимо усвоить самим и разъяснить детям, что звук сирен — это сигнал «ВНИМАНИЕ ВСЕМ». Услышав его, не надо пугаться. Дождитесь разъяснения его причины.

Полностью прослушав и поняв речевую информацию, необходимо выполнить все рекомендации. Если Вы не полностью прослушали речевую информацию, то не спешите выключить радио или телевизор, информация будет повторена еще раз. Помните, что в первую очередь необходимо взять документы, деньги и по возможности запас еды и питьевой воды на сутки запакованный в водонепроницаемую упаковку или пакет.

Если Вы находитесь на работе, на территории предприятия или в цеху и услышите сигнал «ВНИМАНИЕ ВСЕМ», прервите рабочий процесс, завершите телефонный разговор или совещание, находясь же в шумном цеху, остановите станок, заглушите машину, а если невозможно это сделать, то подойдите к ближайшему громкоговорителю на предприятии.

Если Вы находитесь на улице города или населенного пункта и услышали сигнал «ВНИМАНИЕ ВСЕМ», то подойдите к ближайшему уличному громкоговорителю и по окончании звукового сигнала сирен прослушайте информацию, выполните все рекомендации.

В местах, где из-за удаленности не слышно звука сирен и нет громкоговорителей центрального радиовещания, сигнал «ВНИМАНИЕ ВСЕМ» и речевую информацию будут передавать специальные автомобили оснащенные системой громкоговорящей связи. Речевая информация в каждом случае будет соответствовать угрозе или сложившейся экстремальной ситуации в крае, городе, районе, населенном пункте.

Не забирайте детей из школы и детского сада. Это может задержать их отправку в безопасные места. О Ваших детях есть кому позаботиться. Их защита предусмотрена в первую очередь.

Проинформируйте соседей по подъезду и месту жительства — возможно, они не слышали передаваемой информации. Пресекайте немедленно любые проявления паники и слухи.

404 — Псилогия

Трамвайный проезд, 5а

1 этаж

№ кабинета	Температура
1	19°С
2	18°С
3	18°С
4	18°С
5	19°С
6	18°С
7	18°С
8	19°С
9	18°С
10	19°С
11	19°С
12	20°С
13	19°С
14	18°С
15	18°С
16	18°С
Холл	17°С

Трамвайный проезд, 5а

2 этаж

№ кабинета	Температура
17	19°С
18	19°С
19	20°С
20	18°С
21	18°С
22	19°С
23	20°С
24	19°С
25	18°С
26	19°С
27	19°С
Холл	18°С

Переулок Фабричный, 23а

№ кабинета	Температура
1	18°С
2	18°С
3	18°С
4	18°С
5	18°С
6	19°С
7	18°С
8	19°С
9	18°С

Чрезвычайное расхождение последовательностей, но сохраненная специфичность связывания лиганда в белке Streptococcus pyogenes M

Abstract

Многие патогенные микроорганизмы уклоняются от иммунитета хозяина за счет обширной вариабельности последовательности в белковой области, на которую нацелены защитные антитела. Несмотря на вариабельность последовательности, вариабельная область обычно сохраняет важную функцию связывания лиганда, что отражается в присутствии высококонсервативного мотива последовательности. Здесь мы анализируем пределы дивергенции последовательностей в области связывания лиганда, характеризуя гипервариабельную область (HVR) белка Streptococcus pyogenes M.Наши исследования были сосредоточены на HVR, которые связывают человеческий регулятор комплемента C4b-связывающий белок (C4BP), лиганд, который придает устойчивость к фагоцитозу. Предыдущее сравнение C4BP-связывающих HVR идентифицировало идентичности остатков, которые могли быть частью связывающего мотива, но представленный здесь расширенный анализ показывает, что никакие идентичности остатков не остаются, когда включены дополнительные C4BP-связывающие HVR. Характеристика HVR в белке M22 показала, что два относительно консервативных остатка Leu важны для связывания C4BP, но эти остатки, вероятно, являются остатками ядра в спиральной спирали, подразумевая, что они не вносят прямого вклада в связывание.Напротив, замена любого из двух относительно консервативных остатков Glu, которые, по прогнозам, могут подвергаться воздействию растворителя, не влияла на связывание C4BP, хотя каждое из этих изменений оказывало основное влияние на антигенные свойства HVR. Вместе эти находки показывают, что HVR белков М обладают исключительной способностью к дивергенции последовательностей и антигенной вариабельности, сохраняя при этом специфическую функцию связывания лиганда.

Сводка

Многие патогены развили механизмы, позволяющие уклоняться от иммунитета хозяина.В одном из таких механизмов последовательность поверхностного белка варьируется среди разных штаммов патогена. Эта вариабельность последовательности представляет собой очевидный парадокс, потому что вариабельный белок должен сохранять важную функцию. Авторы изучили эту проблему на Streptococcus pyogenes, — главном патогене человека. Локализованный на поверхности М-белок этой бактерии сильно различается по последовательности между бактериальными штаммами, что позволяет избежать иммунитета. Тем не менее наиболее вариабельная часть белка М обычно связывает белок плазмы человека.Захватывая этот человеческий белок, бактерии уклоняются от атак, дополняя важную часть врожденной иммунной системы. Сравнение лиганд-связывающей области в различных М-белках показало, что в этих областях отсутствует общий мотив аминокислотной последовательности. Таким образом, вариабельный белок может сохранять лиганд-связывающую функцию в отсутствие консервативного связывающего мотива. Также представлены доказательства того, что изменение одной аминокислоты в вариабельной области может вызвать серьезное антигенное изменение, обеспечивая селективное преимущество для бактерий.Вместе эти данные свидетельствуют о необычайной способности патогенов избегать иммунитета хозяина, не теряя при этом способности вызывать болезни.

Образец цитирования: Persson J, Beall B, Linse S, Lindahl G (2006) Крайнее расхождение последовательностей, но сохраненная специфичность связывания лиганда в M-белке Streptococcus pyogenes. PLoS Pathog 2 (5): e47. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0020047

Редактор: Парто Гош, Калифорнийский университет в Сан-Диего, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 27 января 2006 г .; Принята к печати: 10 апреля 2006 г .; Опубликовано: 26 мая 2006 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с положениями декларации Creative Commons Public Domain, которая предусматривает, что после размещения в общественном достоянии эта работа может свободно воспроизводиться, распространяться, передаваться, модифицированы, созданы на основе или иным образом использованы кем-либо в любых законных целях.

Финансирование: Эта работа была поддержана Шведским исследовательским советом, университетской больницей Лунда, Королевским физиографическим обществом в Лунде и фондами Голье, Кока, Лундстрема и Эстерлунда.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения: C4BP, C4b-связывающий белок; КПК, белок контроля комплемента; Fg, фибриноген; HVR, гипервариабельная область; ИЗ, коэффициент непрозрачности

Введение

Вариабельность последовательностей — обычная черта поверхностных белков патогенных микроорганизмов.Такая изменчивость может повысить приспособленность, поскольку она позволяет патогену использовать альтернативные рецепторы или позволяет инфицировать разные ткани или даже разные виды [1–5]. Однако в большинстве случаев изменчивость, вероятно, отражает антигенную изменчивость, которая позволяет патогену уклоняться от защитного иммунитета у инфицированного хозяина [6].

Вариабельность последовательности, которая приводит к антигенной вариабельности, может быть очень обширной и представляет собой очевидный парадокс, потому что вариабельный белок должен сохранять важную функцию, несмотря на вариабельность.Чтобы объяснить это очевидное противоречие, обычно предполагается, что сохранение ограниченного числа остатков является достаточным, чтобы способствовать правильной укладке белка и / или придавать специфическую функцию [7], в то время как другие остатки могут варьироваться и вызывать изменения антигенных свойств белка. белок. Например, очень вариабельный гемагглютинин вируса гриппа имеет несколько высококонсервативных остатков, которые расположены в рецептор-связывающем кармане [8-10]. Точно так же CD36-связывающая область белка PfEMP1 Plasmodium falciparum широко варьирует по последовательности, но предполагается, что несколько консервативных остатков важны для связывания [11].Напротив, мы показываем здесь, что гипервариабельная область (HVR) в стрептококковом М-белке, основном факторе бактериальной вирулентности, сохраняет способность специфически связывать белковый лиганд человека, хотя разные HVR полностью лишены идентичности остатков.

Грамположительная бактерия Streptococcus pyogenes (стрептококк группы А) является основным патогеном человека, вызывающим множество заболеваний, включая острый фарингит и синдром токсического шока, вызываемого стрептококками [12]. Локализованный на поверхности белок М, который является наиболее изученным фактором вирулентности S.pyogenes, представляет собой димерную спиральную спираль, которая ингибирует фагоцитоз и проявляет антигенную изменчивость из-за N-концевой HVR с ~ 50 остатками [13,14]. HVR стабилен в пределах штамма S. pyogenes, что позволяет идентифицировать ~ 120 различных M-типов [15], хотя иногда наблюдается ограниченная вариабельность последовательностей между клиническими изолятами одного и того же M-типа. Таким образом, количество известных M-типов невелико по сравнению с большим количеством возможных вариантов последовательностей, что позволяет предположить, что эти M-типы были выбраны из-за их превосходной пригодности.

Во многих белках М HVR специфически связывает ингибитор комплемента человека, белок плазмы C4b-связывающий белок (C4BP), который предотвращает отложение комплемента на бактериальной поверхности и позволяет бактериям избегать фагоцитоза [16–21] (рис. 1A) . Поскольку антитела, которые предотвращают связывание C4BP, способствуют фагоцитозу [20,21], расхождение последовательностей среди C4BP-связывающих HVR, вероятно, отражает отбор во время эволюции антигенных вариантов, которые сохраняют способность связывать C4BP. Этот аргумент подразумевает, что существуют серьезные ограничения на возможные последовательности в HVR, вывод, подтвержденный обширным анализом последовательностей [22,23].

Рисунок 1. Сайт связывания C4BP человека в гипервариабельной области (HVR) белка M

(A) Схематическое изображение C4BP, связанного с HVR белка M, димерной спиральной спирали. Наиболее распространенная форма C4BP имеет семь идентичных α-цепей и одну короткую β-цепь. Обе цепи состоят из модулей CCP, как указано. Сайт связывания белка M в C4BP расположен в области CCP1–2 α-цепи [17,24,47].

(B) Множественное выравнивание последовательностей HVR, которые связывают C4BP.Пять верхних последовательностей взяты из [25]. Три остатка, которые идентичны в этих пяти последовательностях, заключены в рамку. PrtH — второй белок M, экспрессируемый некоторыми штаммами M1 [35]. В нижней части совмещения показаны HVR M4.1 и M114, охарактеризованные в этой статье. Вертикальные заштрихованные линии, соответствующие остаткам 1–39 в M22, указывают область, используемую для создания логотипа на фиг. 5A.

(C) Конструирование гибридных белков, полученных из белков M22 и M5. N-концевой участок, полученный из M22, был слит с C-концевой частью M5 (остатки 104–450 M5).Слитые белки содержат Fg-связывающую область B-повтора M5.

(D) Схематическое изображение N-концевой области различных слитых белков. Последовательность N-концевой области M22 приведена вверху. Звездочки указывают положение остатков L28, E31 и D40 в M22 (соответствующих трем остаткам в рамке в [B]). Способность слитых белков связывать C4BP, указанная справа, основана на результатах, показанных в (E).

(E) Способность гибридных белков связывать C4BP.Слитые белки (D) обозначаются как M22 ⁵⁷ -M5 и т. Д. Лизаты целых клеток штаммов E. coli, экспрессирующие указанные белки из генов, несущихся в pBR322, анализировали вестерн-блоттингом с использованием Fg или C4BP в качестве зонд. Штамм, экспрессирующий M5, использовали в качестве отрицательного контроля. Контрольный блот с Fg показал, что белки экспрессируются в E. coli. Присутствие двойных полос, вероятно, отражает неполный процессинг сигнальных пептидов в E. coli и / или внутриклеточную деградацию белка М в этом гетерологичном хозяине.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0020047.g001

C4BP-связывающие HVR представляют собой отдельные лиганд-связывающие домены, которые связываются с одним и тем же участком в C4BP и, вероятно, имеют схожие структуры [18,24–26] . Тем не менее, сравнение различных C4BP-связывающих HVRs позволило идентифицировать только три идентичности аминокислотных остатков [18,25]. Казалось возможным, что эти три идентичности были частью связывающего мотива, но мы предположили, что даже эти остатки не потребуются для связывания C4BP.Для анализа этой гипотезы мы использовали большую коллекцию клинических изолятов S. pyogenes и обнаружили, что у C4BP-связывающих HVR действительно отсутствует общий мотив последовательности. Таким образом, М-белки обладают исключительной способностью к дивергенции последовательностей, сохраняя при этом способность специфически связывать лиганд. Мы также представляем доказательства того, что даже одно изменение аминокислоты, которое не влияет на связывание C4BP, может вызвать серьезные антигенные изменения в HVR, обеспечивая молекулярную основу для появления новых типов M за счет постепенного накопления мутаций.

Результаты

C4BP-связывающая область в белке M22

Пять C4BP-связывающих HVR, которые были охарактеризованы ранее [18,25], выровнены в верхней части рисунка 1B, а три идентичности аминокислот в этих последовательностях из ~ 50 остатков заключены в рамку. Несмотря на расхождение последовательностей, выравнивание этих последовательностей было четким, как показали попарные сравнения. Эти три идентичности соответствуют L28, E31 и D40 в M22, широко изученном C4BP-связывающем M-белке, который мы использовали в качестве модельного белка [18,20,21,24].Следует отметить, что M22 является одним из наиболее распространенных серотипов среди штаммов S. pyogenes, выделенных в различных частях мира [27–29], что делает белок M22 привлекательным модельным белком.

Участка, содержащего 52 N-концевых остатка в M22, достаточно для связывания C4BP [25]. Чтобы проанализировать, требуется ли C-концевая часть этой области, и в частности остаток D40, для связывания, мы сконструировали серию гибридных белков, в которых N-концевые области разной длины, происходящие от M22, были слиты с C -концевая часть белка M, которая не связывает C4BP, белок M5 (рис. 1C и 1D).Область, полученная из M5, содержащая остатки 104–450, имела одинаковую длину в каждой конструкции и включала область связывания фибриногена (Fg), которую использовали для обнаружения слитых белков. После экспрессии в Escherichia coli, слитые белки анализировали с помощью вестерн-блоттинга на способность связывать Fg и C4BP (рис. 1E). Конструкции, которые включали 57, 40 или 39 остатков из M22, показали одинаково хорошее связывание C4BP, в то время как конструкция, которая включала только 31 остаток из M22, не связывалась.Следует отметить, что способность белка M22 ³⁹ -M5 связывать C4BP не была связана с вкладом остатка Asp, соответствующего D40 в M22, партнером по слиянию M5, поскольку первый остаток в части, полученной из M5, был лей. Эти данные показывают, что области, содержащей 39 N-концевых аминокислот в M22, достаточно для связывания C4BP. Эта область включает только две идентичности, L28 и E31, с другими ранее изученными областями связывания C4BP (Рисунок 1B).

Характеристика дополнительных М-белков демонстрирует, что участки связывания C4BP полностью лишены идентичности остатков

Мы предположили, что даже два остатка, соответствующие L28 и E31 в M22, не консервативны во всех C4BP-связывающих M-белках.Чтобы проанализировать эту гипотезу, мы проверили большое количество эталонных штаммов S. pyogenes на способность связывать C4BP и проанализировали последовательность белка M в штаммах, которые были способны связывать C4BP. Использованные штаммы были либо положительными по фактору непрозрачности (OF ⁺ ), либо OF ^—, две основные подгруппы штаммов S. pyogenes, и они представляли наиболее известные типы M и некоторые подтипы (рис. 2). Последовательность HVR была проанализирована с использованием информации, полученной в эпидемиологических исследованиях (http: // www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/doc.htm).

Фигура 2. Связывание человеческого C4BP со штаммами S. pyogenes различных типов M

Штаммы указанных типов M были проанализированы на способность связывать меченный радиоактивным изотопом C4BP. Верхняя панель: OF ⁺ деформаций. Нижняя панель: ОФ ^— деформаций. Для анализа использовали только штаммы, которые связывали Fg, как было определено в параллельных тестах, поскольку связывание Fg является характерным свойством изолятов S. pyogenes, экспрессирующих членов семейства белков М.Связывание выражается в процентах от добавленной радиоактивности. Порог связывания C4BP был установлен на уровне ≥10% связывания (пунктирная линия). Фоновое связывание с M-отрицательным штаммом (~ 3%) было вычтено. Все штаммы были протестированы как минимум дважды с дублированными образцами, и результаты были хорошо воспроизводимыми. Для каждого штамма показаны данные одного эксперимента. Данные включают данные связывания для одного аллельного варианта на тип M, за исключением того, что включены данные как для M4, так и для M4.1. Для штаммов некоторых типов M было протестировано несколько аллельных вариантов, и в большинстве случаев эти штаммы не различались по способности связывать C4BP (неопубликованные данные).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0020047.g002

Чтобы гарантировать, что штаммы, проанализированные на связывание C4BP, экспрессируемый M-белок, они сначала были протестированы на способность связывать Fg, характерное свойство клинических изолятов, экспрессирующих членов семейства белков М [13,14,30]; только Fg-связывающие штаммы были проанализированы на способность связывать C4BP. Этот этап был включен, потому что штамм S. pyogenes, размножаемый в лаборатории, может иногда терять способность экспрессировать М-белок [13].Фоновое связывание с M-отрицательным штаммом вычитали, и порог связывания C4BP был установлен на уровне ≥10% связывания. В этом анализе связывание C4BP наблюдали для всех 47 изученных штаммов OF ⁺ и для 80% из 54 штаммов OF ^— (рис. 2). Эти результаты расширяют результаты предыдущих исследований [16,31] и указывают на то, что связывание C4BP является очень распространенным свойством среди штаммов S. pyogenes. Интересно, что связывание C4BP наблюдалось для всех протестированных штаммов недавно признанных M типов M94 – M124, которые включают как штаммы OF ⁺ , так и OF ^— [15,32].Основываясь на предварительном анализе последовательности HVR в C4BP-связывающих штаммах, наша работа была сосредоточена на двух штаммах OF ⁺ , экспрессирующих белки M114 и M4.1 соответственно. Последовательности соответствующих двух HVR выровнены с пятью ранее изученными HVR в нижней части рисунка 1B.

Белок M114 был выбран для дальнейшего изучения, потому что остаток в M114, соответствующий E31 в M22, является Gly, разрушающим спираль, и потому что M114 является распространенным типом среди штаммов, вызывающих инвазивное заболевание (см. [27], где M114 упоминается как ст2967).Белок M4.1, который является подтипом M4, был выбран для дальнейшего изучения, поскольку он имеет Phe в положении, соответствующем L28 в M22. Следует отметить, что даже консервативный переход с Leu на Phe может иметь важные эффекты на структуру и функцию белка, как это наблюдается для позитивного генного регулятора PrfA Listeria monocytogenes [33] и эукариотического белка кальмодулина [34].

Хотя казалось вероятным, что HVR в белках M4.1 и M114 ответственны за способность соответствующих штаммов связывать C4BP, это не было очевидно, потому что некоторые S.pyogenes экспрессируют второй М или М-подобный белок, который связывает C4BP. Например, некоторые штаммы серотипов M1 и M18 экспрессируют белок M, который не связывает C4BP, а также экспрессируют M-подобный C4BP-связывающий белок [18,35,36]. Более того, нельзя исключать, что способность штаммов M4.1 и M114 связывать C4BP была обусловлена ​​структурой поверхности, не связанной с M-белками. Таким образом, было важно продемонстрировать, что HVR белков M4.1 и M114 способствуют связыванию C4BP.

Были сконструированы

гибридных белков, в которых HVR M4.1 или M114 был объединен с C-концевой частью M5, образуя белки M4.1-M5 и M114-M5. Предварительный анализ показал, что эти два слитых белка были способны связывать C4BP после экспрессии в E. coli, , демонстрируя, что HVR M4.1 и M114 действительно связывают C4BP (неопубликованные данные). Для анализа связывания C4BP в физиологических условиях и для проведения количественного анализа два слитых белка были охарактеризованы после экспрессии в S. pyogenes с использованием генов, экспрессируемых из челночного вектора в M-отрицательном S.pyogenes (рисунок 3). Экспрессию слитых белков на бактериальной поверхности подтверждали анализом с использованием антисыворотки к консервативной области C-повтора M5 (анти-M5-C). Штаммы, экспрессирующие C4BP-связывающий слитый белок M22 ⁵⁷ –M5 [18] или несвязывающий белок M5, служили положительными контролями на реактивность с антителами, тогда как M-отрицательный штамм ΔM5 служил отрицательным контролем. Результаты (рис. 3A) показывают, что слитые белки M4.1 – M5 и M114 – M5 экспрессировались на поверхности стрептококков на том же уровне, что и белок M22 ⁵⁷ –M5.Несколько более низкая поверхностная экспрессия, наблюдаемая для M5, может быть связана с более слабым промотором в соответствующем гене. При анализе способности связывать C4BP штаммы стрептококков, экспрессирующие M4.1 – M5 и M114 – M5, не только показали связывание, но и связали C4BP даже лучше, чем контрольный штамм, экспрессирующий белок M22 ⁵⁷ –M5 (рис. 3B). Эти данные показывают, что HVR белков M4.1 и M114 представляют собой C4BP-связывающие области, подобные ранее описанным [18].

Рисунок 3.HVR M4.1 и M114 связывают C4BP

Гибридные белки, происходящие из HVR M4.1 или M114 и C-концевой части M5, были экспрессированы в M-отрицательном штамме S. pyogenes ΔM5 с использованием генов, переносимых на плазмида pLZ12Spec. Контроли включали штамм, экспрессирующий C4BP-связывающий слитый белок M22 ⁵⁷ –M5, штамм, экспрессирующий не-C4BP-связывающий белок M5, и M-отрицательный штамм ΔM5.

(A) Поверхностная экспрессия проанализирована с кроличьими антителами, направленными против области C-повтора M5.Связанные антитела выявляли с помощью радиоактивно меченного белка A. Связывание белка A со штаммом M22 ⁵⁷ –M5, инкубированным с антисывороткой, разведенной × 10 ² , было определено как 100%. M5-отрицательный штамм ΔM5 служил отрицательным контролем.

(B) Связывание меченного радиоактивным изотопом C4BP. Связывание при наивысшей концентрации бактерий с контролем, экспрессирующим M22 ⁵⁷ –M5, было определено как 100%. Штамм M5, не связывающийся с C4BP, служил отрицательным контролем. Все данные в (A) и (B) основаны на трех отдельных экспериментах с повторяющимися образцами и представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0020047.g003

Из анализа M4.1 и M114 следует, что C4BP-связывающие HVR в M-белках полностью лишены идентичности остатков (рис. 1B). Таким образом, HVR белка М обладает исключительной способностью выдерживать расхождение последовательностей, сохраняя при этом способность связывать C4BP.

HVR белка M114 представляет собой отдельный C4BP-связывающий домен

Предыдущие исследования синтетических пептидов, полученных из HVR белков M2, M4 и M22, показали, что эти HVR представляют собой отдельные домены, которые с высокой специфичностью связываются с одной и той же областью в C4BP [25].Важно отметить, что связывание C4BP с таким пептидом сильно усиливается димеризацией пептида через C-концевой остаток цистеина [25,37]. Это открытие может быть объяснено демонстрацией того, что C4BP-связывающие HVRs, вероятно, имеют димерную структуру coiled-coil [26] и предполагают, что coiled-coil д. Быть стабилизированным дисульфидной связью в пептидах, но не в интактных M белках. Поскольку HVR M114 содержит разрушающий спираль остаток Gly, предполагая, что он может иметь свойства, отличные от других HVR, димеризованный синтетический пептид, полученный из этого HVR, был проанализирован в отношении специфичности связывания, сайта связывания в C4BP и вторичной структуры и стабильность.Связывающие свойства HVR M4.1 в дальнейшем не изучались, поскольку было невозможно синтезировать пептид, соответствующий этому HVR.

Было обнаружено, что синтетический пептид, полученный из M114, содержащий 52 N-концевых остатка в зрелой форме M114 и обозначенный как M114-N, связывает C4BP (неопубликованные данные). Специфичность связывания анализировали с помощью аффинной хроматографии. Для этой цели всю человеческую сыворотку наносили на колонку, содержащую иммобилизованный M114-N, и связанный белок элюировали и анализировали с помощью SDS-PAGE [25,37] (рис. 4A).Колонки, содержащие пептиды, полученные из C4BP-связывающей HVR M22 или несвязывающей HVR M5 (пептиды M22-N и M5-N), использовали в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно. Элюаты из колонок M114-N и M22-N содержали один главный полипептид, который был идентифицирован как α-цепь C4BP, в то время как на колонке M5-N белок не удерживался. Поскольку концентрация C4BP в сыворотке составляет ~ 200 мг / л и, следовательно, составляет <0,5% всего белка в сыворотке [38], этот результат демонстрирует, что пептид M114-N связывает C4BP с высокой специфичностью.

Рисунок 4. Характеристика HVR, связывающего C4BP, в M114

(A) HVR M114 представляет собой отдельный белковый домен, который связывает C4BP с высокой специфичностью. Димеризованный синтетический пептид, полученный из 52 N-концевых остатков в M114 и обозначенный M114-N, иммобилизовали в колонке. Через колонку пропускали всю человеческую сыворотку, которую промывали и элюировали. Контрольные колонки содержали C4BP-связывающий пептид M22-N или несвязывающий пептид M5-N. Элюаты и человеческую сыворотку анализировали с помощью SDS-PAGE, как указано.Полипептид ~ 70 кДа, присутствующий в элюатах из колонок M22-N и M114-N, был идентифицирован как α-цепь C4BP посредством вестерн-блоттинга со специфической антисывороткой (не показано).

(B) Белки M114 и M22 связываются с одной и той же областью в C4BP. Указанные пептиды использовали для ингибирования связывания меченного радиоактивным изотопом белка M22 с C4BP, иммобилизованным в лунках для микротитрования. Данные трех отдельных экспериментов с повторяющимися образцами, представленные как средние значения ± стандартное отклонение.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.ppat.0020047.g004

Рисунок 5. Анализ последовательности HVR, связывающихся с C4BP, и сайт-специфический мутагенез в M22

(A) Логотип последовательности C4BP-связывающих HVR. Логотип был создан из семи C4BP-связывающих HVR, выровненных на рисунке 1B, с использованием WebLogo (http://weblogo.berkeley.edu). Для создания логотипа использовались только области в HVR, соответствующие самой короткой из известных C4BP-связывающих областей в M22 (остатки 1–39). Эти области обозначены вертикальными штриховыми линиями на рисунке 1B.В логотипе каждый столбец в выравнивании представлен стопкой букв, причем высота каждой буквы пропорциональна наблюдаемой частоте соответствующего остатка в этой позиции, в то время как общая высота каждой стопки пропорциональна сохранению последовательности в эта позиция [63]. Последовательность HVR M4.1 была включена в создание логотипа, хотя она практически идентична M4, поскольку разница в одном остатке между этими двумя HVR была важна для вывода о том, что разные HVR полностью лишены идентичности остатков (см. Текст ).Нумерация под логотипом относится к номерам остатков в белке M22 и указаны предполагаемые спиральные гептады (a – g) в M22. Звездочки показывают положение четырех остатков M22 (L21, E24, L28 и E31), проанализированных с помощью сайт-специфического мутагенеза.

(B) Изображение спирального колеса димерной спиральной катушки [42]. Последовательность области L21-E31 M22 включена со звездочками над остатками L21, E24, L28 и E31, которые были проанализированы с помощью сайт-специфического мутагенеза и расположены в пределах предсказанной области спиральной спирали.Указаны положения остатков в предполагаемых гептадах спиральной спирали (a – g).

(C – E) Четыре указанных мутантных белка M22, сконструированные с помощью сайт-специфического мутагенеза, и белок M22 дикого типа (wt), были экспрессированы в S. pyogenes, , и штаммы были проанализированы на предмет поверхностной экспрессии белки и способность связывать C4BP. Гены, кодирующие белки, присутствовали в плазмиде pLZ12Spec, несущей М-отрицательный штамм. Этот M-отрицательный штамм также служил отрицательным контролем.(C) и (D) показывают, что различные белки нормально экспрессировались на бактериальной поверхности (см. Текст). (E) показывает, что мутанты L21A и L28A полностью утратили C4BP-связывающую способность, в то время как мутанты E24A и E31A не пострадали. Результаты, показанные в (C – E), основаны на трех отдельных экспериментах с повторяющимися образцами и представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0020047.g005

Чтобы проанализировать, связывается ли M114 с той же областью в C4BP, что и другие C4BP-связывающие M-белки, пептид M114-N был протестирован на способность ингибировать взаимодействие между C4BP-связывающим белком M22 и иммобилизованным C4BP (рис. 4B).C4BP-связывающий пептид M22-N и несвязывающий пептид M5-N использовали в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно. Пептид M114-N ингибировал взаимодействие, но был менее эффективным ингибитором, чем пептид M22-N, возможно, потому, что M114-N связывается с более низким сродством. Это ингибирование не было неспецифическим, поскольку связывание IgA с M22 [39] не ингибировалось M114-N (неопубликованные данные). Эти результаты показывают, что M114 связывается с сайтом в C4BP, который перекрывается, если не идентичен, с сайтом, используемым M22.

Анализ M114-N с помощью спектроскопии кругового дихроизма показал, что вторичная структура этого пептида аналогична M4-N и M22-N (неопубликованные данные). Более того, температура плавления M114-N была ниже, чем для M4-N и M22-N, что, возможно, отражает более низкую стабильность этого пептида из-за присутствия остатка Gly, разрушающего спираль (неопубликованные данные).

Предыдущий иммунологический анализ C4BP-связывающих синтетических пептидов, полученных из HVR в M2, M4 и M22, показал, что у них отсутствует перекрестная реактивность, хотя они обладают сходными связывающими свойствами [25].В соответствии с этими выводами, M114-N не распознавался антителами к HVR белков M4 и M22, но демонстрировал ограниченную перекрестную реактивность с HVR белка M2, с которым M114-N наиболее тесно связан (неопубликованные данные ). Эти результаты подтверждают, что C4BP-связывающие HVR демонстрируют большую антигенную изменчивость.

В совокупности анализ M114-N показывает, что этот пептид имеет свойства, аналогичные свойствам других пептидов, полученных из C4BP-связывающих HVR, несмотря на присутствие остатка Gly в M114-N.

Анализ последовательностей и сайт-специфический мутагенез

Хотя семь C4BP-связывающих HVR, описанных выше, демонстрируют крайнее расхождение последовательностей (рис. 1B), логотип последовательности этих HVR показывает, что область, содержащая остатки 21–31 (нумерация основана на M22), менее вариабельна, чем другие части HVR. (Рисунок 5A). Это неудивительно, поскольку можно ожидать, что некоторые остатки будут более важными, чем другие для связывания структуры и / или лиганда, хотя для способности связывать C4BP абсолютно не требуется один остаток.

Консервативные части M белков известны как димерные coiled-coils [40,41], но остается неясным, образуют ли HVRs также coiled-coils. В самом деле, предыдущий вычислительный анализ показал, что HVRs могут принимать конформацию спираль-поворот-спираль [25]. Однако недавнее исследование ядерного магнитного резонанса André et al. [26] указывает на то, что HVR действительно имеют конформацию coiled-coil. Эта ситуация сделала интересным проанализировать, совместимо ли распределение остатков в области выравнивания, представленной в логотипе, со структурой coiled-coil в HVR.Coiled-coil характеризуется периодичностью из семи остатков, в которой остатки обозначены a – g. Остатки в положениях a и d чаще всего являются гидрофобными и составляют ядро ​​спиральной спирали, в то время как другие остатки подвергаются воздействию растворителя [42] (Рисунок 5B). Однако в M или M-подобных белках структура гептад часто показывает неоптимальное распределение остатков [41,43], а в некоторых M белках положение a обычно занято остатком Asn [40]. Распределение аминокислотных остатков по выровненной области хорошо согласуется с гипотезой о том, что менее вариабельная область, соответствующая остаткам 21-31 в M22, является частью coiled-coil.

Мы использовали сайт-специфический мутагенез M22 для анализа роли различных остатков в связывании C4BP. Эти исследования были сосредоточены на четырех относительно консервативных остатках L21, E24, L28 и E31, которые расположены в пределах предсказанной области спиральной спирали (рис. 5A и 5B). Предполагается, что остатки L21 и L28 являются остатками ядра, которые занимают положение d в спиральной спирали, в то время как остатки E24 и E31, как предполагается, представляют собой остатки, подверженные воздействию растворителя, занимающие положение g. Каждый из этих остатков был заменен на Ala, и четыре мутантных белка M22 были экспрессированы в S.pyogenes. Чтобы проанализировать, нормально ли экспрессируются мутантные белки на бактериальной поверхности, штаммы анализировали на реактивность с антителами против консервативной области С-повторов в M22 и на способность связывать человеческий IgA, который специфически связывается с M22 [39]. Анализ сыворотки анти-C проводили с антителами крысы, поскольку кроличьи антитела проявляют Fc-реактивность с M22 [39]. Анализ с этой крысиной сывороткой показал, что мутантные белки присутствовали на поверхности стрептококков в тех же количествах, что и белок дикого типа, экспрессируемый положительным контролем (фиг. 5C), и аналогичные результаты были получены при анализе связывания с IgA (фиг. 5D). .Таким образом, мутантные белки M22 нормально экспрессировались на поверхности стрептококков, что делает их пригодными для анализа роли мутантных остатков в связывании C4BP (рис. 5E).

Мутанты L21A и L28A полностью утратили способность связывать C4BP, открытие, которое можно объяснить ключевой ролью, которую остатки в положении d гептада играют как остатки ядра в спиральной спирали. Напротив, мутанты E24A и E31A не были затронуты в способности связывать C4BP, что указывает на то, что соответствующие остатки не являются существенными для связывания C4BP, хотя они, вероятно, находятся на поверхности и являются относительно консервативными среди последовательностей, изученных здесь.

Логотип последовательности на рисунке 5A был получен из семи HVR, которые, как известно, связывают C4BP (рисунок 1B). Этот анализ был подтвержден логотипом, полученным из большего числа HVR, о которых точно не известно, что они связывают C4BP, но, вероятно, это делают (Рисунок S1A). Этот логотип был похож на логотип, полученный из известных C4BP-связывающих HVR (рис. 5A), что указывает на то, что наблюдаемый образец может отражать неотъемлемое свойство C4BP-связывающих HVR. Напротив, логотип, полученный из 11 не-C4BP-связывающих HVR, имел другой вид (Рисунок S1B), предполагая, что распределение остатков отличается для тех HVR, которые не связывают C4BP.

Изменения одной аминокислоты в M22, которые не влияют на связывание C4BP, вызывают серьезные иммунологические изменения

Вариабельность последовательности HVR M-белков вызывает антигенную изменчивость, позволяя штамму, экспрессирующему один M-белок, ускользать от распознавания антителами, направленными против других M-белков [13]. Самое простое объяснение этой изменчивости последовательности состоит в том, что она возникла в результате постепенного накопления мутаций, каждая из которых вызывает изменение антигенности и, по крайней мере, частичное ускользание от иммунитета хозяина (антигенный дрейф).Может показаться интуитивно очевидным, что антигенные варианты должны выбираться с помощью этого механизма, но неясно, как изменение одного аминокислотного остатка может изменить антигенные свойства белка до такой степени, что оно может избежать ответа поликлональных антител ( т.е. антитела, которые, вероятно, распознают несколько эпитопов). В самом деле, в литературе имеется мало доказательств этой гипотезы [44,45]. Мы использовали систему M22 для анализа этой проблемы.

Как показано на фиг. 5E, два изменения E24A и E31A не повлияли на способность экспрессируемого на поверхности белка M22 связывать C4BP.Это открытие сделало интересным анализ антигенных свойств мутантов. Для этого мы использовали тест на ингибирование (рис. 6А). Очищенный белок M22 иммобилизовали в лунках для микротитрования и детектировали с помощью поликлональной мышиной сыворотки, индуцированной против пептида M22-N (т.е. HVR M22). Мышиную сыворотку использовали, потому что белок M22 связывается с Fc-частью кроличьего IgG, но не связывает мышиные антитела таким неиммунным образом [39]. Чтобы проанализировать влияние мутаций E24A и E31A на антигенность HVR в M22, мы использовали целые стрептококки, экспрессирующие мутантные белки, для ингибирования связывания антител мыши с иммобилизованным M22.Эта экспериментальная процедура позволила сравнить антигенные свойства различных белков M22, экспрессируемых на поверхности стрептококков (т.е. в физиологических условиях). Контрольные бактерии экспрессировали белок М22 дикого типа или не экспрессировали белок М. Интересно, что для снижения связывания на 50% требуется примерно в 30 раз больше бактерий, экспрессирующих любой из мутантных белков, по сравнению с бактериями, экспрессирующими белок М22 дикого типа (рис. 6В). Этот результат не был связан с уменьшением воздействия на поверхность мутантных белков (рис. 5C и 5D).Таким образом, изменения одной аминокислоты E24A и E31A, которые не влияют на способность M22 связывать C4BP, вызывают серьезные изменения иммунологических свойств белка.

Рисунок 6. Изменения одной аминокислоты, не влияющие на связывание C4BP, вызывают основные антигенные изменения в HVR M22

(A) Схематическое изображение теста ингибирования, используемого для анализа антигенных свойств мутантных белков M22, экспрессируемых на поверхности S. pyogenes. Тест основан на связывании мышиного анти-M22-N с чистым белком M22, иммобилизованным в лунках для микротитрования.Это связывание ингибировалось целыми бактериями S. pyogenes, экспрессирующими мутантные белки M22.

(B) Способность штаммов S. pyogenes, экспрессирующих мутанты M22 E24A и E31A, вызывать ингибирование. Положительный контроль экспрессировал белок М22 дикого типа, а отрицательный контроль не содержал белка М. По сравнению с положительным контролем для 50% ингибирования (пунктирная линия) требовалось примерно в 30 раз больше бактерий, экспрессирующих любой из мутантных белков. Результаты, основанные на трех отдельных экспериментах с повторяющимися образцами, представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0020047.g006

Обсуждение

Во многих штаммах S. pyogenes, связывание человеческого C4BP с М-белком играет важную роль для способности бактерий избегать фагоцитоза [20,21]. Это связывание является высокоспецифичным, несмотря на вариабельность последовательности среди C4BP-связывающих HVR. Действительно, HVR связываются только с C4BP среди всех белков плазмы человека [25,37], а C4BP связывается только с M или M-подобными белками среди всех белков S.pyogenes поверхностные белки [18,21,36,46]. Более того, единственный человеческий белок, который связывается с той же областью в C4BP, что и М-белок, — это природный лиганд C4b [17,24]. Здесь мы показали, что C4BP-связывающие HVR полностью лишены идентичности остатков (т.е. они не имеют общих консервативных мотивов последовательности). Однако выравнивание последовательностей показало, что C-концевая половина HVR более консервативна, чем N-концевая половина, предполагая, что эта часть имеет особое значение для связывания, поскольку взаимодействие с лигандом может ограничивать вариабельность.Гипотеза о том, что относительно консервативная область, соответствующая L21-E31 в M22, является частью области связывания, подтверждается экспериментами по ингибированию с использованием коротких синтетических пептидов в системе M4 [18]. Однако трудно предсказать роль различных остатков в этой области для связывания C4BP, потому что ни один остаток не является полностью консервативным.

Недавнее исследование ядерного магнитного резонанса показывает, что большая часть C4BP-связывающего HVR имеет структуру coiled-coil и сайт связывания C4BP локализован в области, соответствующей остаткам 13–39 в M22 [26].Однако окончательно определить структуру HVR пока не удалось, поэтому имеющиеся данные следует интерпретировать с осторожностью. Наши данные анализа последовательности и мутагенеза подтверждают модель спиральной спирали для HVR, поскольку замена относительно консервативных остатков L21 или L28 в M22 на Ala полностью устраняет связывание C4BP. Хотя нельзя исключить непосредственное участие этих остатков Leu в связывании, этот результат проще всего объяснить искажением структуры coiled-coil.Напротив, замена относительно консервативных остатков E24 и E31 (которые, как предполагается, экспонируются на поверхности в спиральной спирали) на Ala не оказала какого-либо видимого эффекта на связывание C4BP. Более того, позиция, занятая E31 в M22, занята разрушающим спираль остатком Gly в M114. Таким образом, неясно, почему E24 и E31 относительно консервативны среди C4BP-связывающих белков M. Дальнейший анализ роли различных остатков в HVR потребует определения структуры одного или нескольких HVR в комплексе с C4BP.

В то время как предсказанная структура coiled-coil HVR все еще представляет собой модель, недавно была определена структура области связывания M белка в C4BP [47]. Более того, были идентифицированы остатки в C4BP, участвующие в связывании белка M4 [47]. Область связывания в C4BP расположена в α-цепи, в которой первые два модуля белка контроля комплемента (CCP) необходимы и достаточны для связывания [17,24,47]. Сайт связывания с М-белком, скорее всего, расположен на межмодульном интерфейсе или рядом с ним и на участке на CCP2 [47].Электростатические взаимодействия играют роль в связывании, но, вероятно, также вносят вклад другие силы, о чем свидетельствует отсутствие зависимости от соли и pH [24,47]. Таким образом, имеется много информации о взаимодействии между C4BP и M-белком, но эти данные не дают объяснения способности C4BP специфически связывать HVR с очень разными последовательностями.

Чрезвычайная дивергенция последовательностей C4BP-связывающего HVR белка М контрастирует с некоторыми хорошо известными системами, такими как гемагглютинин вируса гриппа, который демонстрирует широкую вариабельность последовательностей, но, тем не менее, сохраняет некоторые полностью консервативные остатки, необходимые для связывания лиганда [ 8–10].Даже очень вариабельный белок gp120 ВИЧ-1 содержит некоторые высококонсервативные остатки, которые участвуют в связывании с клеточным рецептором CD4 [48–50]. Эти сравнения поднимают вопрос, почему C4BP-связывающие HVR обнаруживают такую ​​обширную дивергенцию последовательностей.

Одно из возможных объяснений значительного расхождения последовательностей в C4BP-связывающих HVR заключается в том, что М-белки подвергались более сильному селективному давлению для изменения, чем большинство других поверхностных белков в патогенах, включая два вирусных белка, упомянутых выше.Однако трудно представить, как избирательное давление со стороны иммунной системы могло вызвать большую вариабельность S. pyogenes, чем быстро мутирующих РНК-вирусов, таких как вирус гриппа или ВИЧ-1. Альтернативное объяснение состоит в том, что HVR, связывающие C4BP, используют механизм связывания, который легко допускает вариабельность последовательности. Согласно одной интересной гипотезе, атомы основной цепи в HVR вносят важный вклад в поверхность связывания, ситуация, при которой взаимодействие, по крайней мере, частично не зависит от аминокислотной последовательности.Связывание C4BP через атомы основной цепи также может объяснить, почему HVR имеют очень разные антигенные свойства, хотя они, вероятно, имеют сходную структуру, поскольку антитела преимущественно контактируют с боковыми цепями [51]. Таким образом, C4BP и антитела могут связываться с HVR по разным механизмам. Преимущество связывания через атомы главной цепи в вариабельной области получено из исследований gp120 в ВИЧ-1, в которых половина остатков, которые связываются с CD4 человека, делают это только через атомы основной цепи [49]. Более того, исследования пилина Pseudomonas aeruginosa предполагают, что на поверхности связывания рецептора могут доминировать атомы основной цепи, которые взаимодействуют с дисахаридом на клетках-мишенях [52].

Другой механизм, который может способствовать способности HVR с очень разными последовательностями связывать C4BP, может включать множество заряженных остатков в HVR. Хотя комбинированный эффект этих заряженных остатков может быть важным для связывания, вполне возможно, что HVR ведут себя так, как если бы они были насыщены зарядом, что делает их нечувствительными к однозарядной замене, как описано для пептидов, связывающих эукариотический белок кальмодулин [53 ].

Появление антигенной вариации за счет антигенного дрейфа означает, что изменение одной аминокислоты может изменить антигенные свойства белка до такой степени, что оно может, по крайней мере, частично избежать ответа поликлональных антител.Существует мало доказательств этой важной гипотезы, но наш анализ вариантов M22, созданных с помощью сайт-специфического мутагенеза, продемонстрировал, что изменения отдельных аминокислот, которые не влияли на связывание C4BP, действительно вызывали серьезные изменения антигенных свойств белок. Хотя анализируемые здесь мутации не были идентифицированы среди клинических изолятов S. pyogenes, эти результаты подтверждают мнение о том, что новые антигенные типы могут появиться в результате постепенного накопления изменений отдельных аминокислот.Однако механизм, с помощью которого изменение одной аминокислоты может вызвать серьезное изменение антигенных свойств, не влияя на свойства связывания лиганда, остается неясным. Одним из объяснений этой замечательной ситуации может быть то, что изменение одного остатка косвенно влияет на структуру всех поверхностных эпитопов, не затрагивая сайт связывания лиганда [44]. Альтернативно, ответ поликлональных антител может состоять из ограниченного репертуара антител, что позволяет избежать иммунной атаки также за счет ограниченного структурного изменения [54].

Таким образом, сравнение семи M белков показывает, что их C4BP-связывающие HVR полностью лишены идентичности остатков, хотя они специфически связываются с той же областью в C4BP. Это расхождение последовательностей представляет собой поразительный пример дарвиновской эволюции микробного поверхностного белка, который изменяется, чтобы избежать иммунной атаки у инфицированных хозяев, но одновременно должен сохранять важную функцию [55]. Такое крайнее расхождение последовательностей может иметь место также в других факторах вирулентности, связывающих лиганд, которые являются основными мишенями для иммунитета хозяина, и это подчеркивает сложность идентификации консервативных мотивов последовательностей, подходящих для разработки вакцины.Наконец, описанная здесь работа представляет интерес для структурной биологии, поскольку подразумевает, что участки микробного белка, лишенные идентичности остатков, могут принимать одну и ту же структуру, что позволяет им специфически связываться с одним и тем же лигандом.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования.

Описаны штаммы S. pyogenes, экспрессирующие белки M5, M12, M22 и M60 [16,18]. Все другие штаммы S. pyogenes дикого типа были эталонными штаммами из Центра по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Джорджия.На основе белка М, экспрессируемого этими штаммами, они обозначаются здесь как M2, M4 и т. Д., За исключением того, что некоторые изоляты представляют собой аллельные варианты и обозначаются M3.1, M14.5 и т. Д. были описаны отрицательные мутанты S. pyogenes ΔM5, полученные из штамма M5 Manfredo, и AL168 mrp ^— emm ^— , , полученные из эталонного штамма M22 AL168 [46,56]. Для субклонирования использовали штаммы E. coli LE392, KJ622 [57] или TG1.

Плазмида pBR322 несет ген устойчивости к ампициллину.Плазмида pKEJ1 представляет собой производное pBR322, несущее ген emm 5 с сайтом рестрикции для BglII на нуклеотиде 474 [18]. Плазмида pLZ12Spec представляет собой E. coli-S . pyogenes , несущий ген устойчивости к спектиномицину [58]. Описано производное pLZ12Spec, несущее ген emm 22 [56].

штамма E. coli культивировали в бульоне Лурия-Бертани. Штаммы S. pyogenes выращивали в бульоне Тодда-Хьюитта с добавлением 0,2% дрожжевого экстракта и инкубировали без встряхивания в 5% CO ₂ при 37 ° C.Штаммы E. coli, несущие производные pBR322, выращивали в присутствии ампициллина (100 мкг / мл). Штаммы, несущие pLZ12Spec, выращивали в присутствии спектиномицина (20 мкг / мл для E. coli и 70 мкг / мл для S. pyogenes).

Слитые белки.

В слитых белках M4.1-M5 и M114-M5 область, содержащая первые 45 аминокислотных остатков M4.1 или первые 53 остатка M114, слита с остатками 104-450 M5. Для конструирования генов, кодирующих эти белки, используют промоторную область и область, кодирующую указанную N-концевую область M4.1 или M114 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием хромосомной стрептококковой ДНК в качестве матрицы. Фрагменты ДНК лигировали в плазмиду pKEJ1, расщепленную SalI и BglII. Похожая процедура была использована для получения конструкций, кодирующих слитые белки M22 ³¹ –M5 и M22 ⁴⁰ –M5. Конструкция, кодирующая M22 ³⁹ -M5, была получена из конструкции, кодирующей M22 ⁴⁰ -M5, с использованием набора для мутагенеза QuickChange (Stratagene, La Jolla, California, United States). Описана конструкция, кодирующая M22 ⁵⁷ –M5 [18].Последовательность всех клонов подтверждали секвенированием ДНК. Для экспрессии гибридных генов в S. pyogenes, их переносили в pLZ12Spec с последующей трансформацией в М-отрицательный штамм S. pyogenes ΔM5. Поскольку все слитые белки, изученные здесь, включали Fg-связывающую область B-повтора и область C-повтора M5, эти белки можно было идентифицировать по способности связывать Fg или антисыворотку с C-повторами.

Сайт-специфический мутагенез.

Сайт-специфический мутагенез проводили согласно Berggård et al.(2001). В этой процедуре использовались сайт XhoI и сайт Mph2031 в гене emm 22, расположенные в положениях, соответствующих аминокислотам S8 – N10 и Y36 – L38, соответственно. Сайт Mph2031 присутствовал в гене emm 22 дикого типа, в то время как сайт XhoI был введен сайт-специфическим мутагенезом и вызвал аминокислотную замену. Однако этот сайт XhoI был удален в окончательной конструкции (см. Ниже). Для введения мутации в область между двумя сайтами рестрикции плазмиду, несущую ген emm 22 (с сайтами XhoI и Mph2031), расщепляли XhoI и Mph2031 с последующей заменой удаленного фрагмента синтетическим линкером, содержащим желаемое изменение последовательности.Линкер был сконструирован для разрушения сайта XhoI, тем самым восстанавливая последовательность дикого типа на этом сайте. Из-за трудностей в процессе клонирования, описанного здесь, ген emm 22, подвергнутый мутагенезу, не был перенесен в плазмиду pLZ12Spec, как описано ранее [20], а был перенесен в pBR322. После лигирования линкеров в расщепленную плазмиду конструкцию трансформировали в E. coli LE392, и клоны проверяли на наличие замены путем расщепления продуктов ПЦР XhoI.Клоны, которые оказались отрицательными при этом скрининге, анализировали на экспрессию белка в E. coli и подтверждали секвенированием ДНК. Мутировавшие гены emm 22, лишенные сайта XhoI, были перенесены обратно в pLZ12Spec, чтобы обеспечить трансформацию в стрептококки. Эта процедура была использована для конструирования мутировавших генов, кодирующих белки E24A, L28A и E31A. Ген, кодирующий белок L21A, был получен с помощью ПЦР на плазмиде pLZ12Spec, несущей ген emm 22, с использованием набора для сайт-специфического мутагенеза QuickChange.Это изменение ввело сайт ограничения для AlwNI, свойства, используемого для скрининга продуктов ПЦР. Положительные клоны были подтверждены секвенированием ДНК. Производные pLZ12Spec, кодирующие мутантные белки M22, были перенесены в M-отрицательный штамм S. pyogenes AL168 mrp ^— emm ^— .

Белки очищенные и синтетические пептиды.

Белок M22 (Sir22) очищали, как описано [39]. C4BP человека очищали, как описано [37]. Человеческий Fg был от American Diagnostica (Стэмфорд, Коннектикут, США), а человеческий сывороточный IgA был от Cappel Organon-Teknika (Турнхаут, Бельгия).Стафилококковый белок А и стрептококковый белок G были получены от Amersham Biosciences (Упсала, Швеция). Синтетические пептиды M5 – N и M22 – N произошли от N-концевых 50 или 52 аминокислотных остатков зрелых форм M5 и M22 соответственно [25]. Пептид M114-N был получен из 52 N-концевых остатков предсказанной зрелой формы белка M114. Эти пептиды были приобретены в отделении клинической химии больницы общего профиля Мальмё, Лундский университет (Мальмё, Швеция). Каждый из пептидов M5-N, M22-N и M114-N включал C-концевой остаток цистеина, не присутствующий в интактном белке M, чтобы обеспечить димеризацию через дисульфидный мостик [25].Димеризацию проводили, как описано [25].

Антисыворотка.

Кроличья антисыворотка против пептида, полученного из области C-повтора в M5 (анти-M5-C), была приготовлена, как описано [25]. Крысиную антисыворотку против синтетического пептида, полученного из области C-повтора M4 / M22 и обозначенного как анти-M22-C, получали, как описано [59]. У мышей повышали уровень антисыворотки против пептида M22-N [21]. Кроличьи антимышиные иммуноглобулины были от DakoCytomation (Glostrup, Дания).

Тесты на связывание и тесты на ингибирование.

Связывание меченных радиоактивными изотопами человеческого Fg, IgA или C4BP с целыми стрептококками анализировали, как описано [46]. Вкратце, стрептококки из ночных культур промывали PBS с добавлением 0,02% NaN ₃ и 0,05% Tween 20 (PBSAT) и ресуспендировали до концентрации 10 ⁹ бактерий / мл. Стрептококки разбавляли, как указано, в суспензии E. coli (для получения осадка на последующих этапах центрифугирования) и инкубировали с радиоактивно меченным лигандом (~ 14000 имп / мин) при комнатной температуре в течение 1 часа.После промывок радиоактивность, связанную с каждым осадком, измеряли с помощью гамма-счетчика. Для скрининга многих штаммов S. pyogenes на способность связывать C4BP (рис. 2) меченный C4BP инкубировали с дублированными образцами (200 мкл) бактериальных суспензий, содержащих 10 ⁹ бактерий / мл. Каждый штамм был проанализирован не менее двух раз с аналогичными результатами . Фоновое связывание с M-отрицательным штаммом (~ 3%) было вычтено.

Связывание антител крысы или кролика с целыми стрептококками анализировали в основном, как описано [60].Вкратце, промытые в течение ночи культуры стрептококков в PBSAT разбавляли до 10 ⁹ бактерий / мл и образцы (200 мкл) инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с антисывороткой крысы или кролика, разведенной в PBSAT. Для обнаружения связанных антител промытые бактерии инкубировали с радиоактивно меченным белком А или белком G (~ 14000 имп / мин в 200 мкл). После промывки радиоактивность, связанную с каждым осадком, измеряли гамма-счетчиком.

Тесты ингибирования

с пептидами M22-N и M114-N (рис. 4B) были выполнены в основном, как описано [25].Вкратце, человеческий C4BP был иммобилизован в лунках для микротитрования, которые были заблокированы PBSAT, и радиоактивно меченый белок M22 (~ 14000 имп / мин / лунка) был добавлен вместе с раствором немеченого пептида для достижения конечной концентрации 0-500 мкг / мл. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре лунки промывали и определяли радиоактивность, связанную с каждой лункой.

Способность целых стрептококков ингибировать связывание между чистым M22 и мышиным анти-M22-N (рис. 6) оценивали в основном, как описано [21].Вкратце, суспензии целых промытых бактерий, разведенных, как указано, были приготовлены в мышиных анти-M22-N (разбавленных в 200 раз) и добавлены в лунки для микротитрования, покрытые белком M22 (50 мкл, 1 мкг / мл). После промывок (для удаления бактерий и мышиных антител, не связанных с иммобилизованным M22), мышиные антитела, связанные с иммобилизованным белком M22, были обнаружены с помощью кроличьего антимышиного Ig и радиоактивно меченного белка G. M22, показывая, что связывание сыворотки против M22-N было специфическим.Следует отметить, что мышиный C4BP не связывается с M22 и не должен влиять на анализ [17,37].

Аффинная хроматография.

Хроматографию сыворотки крови человека с использованием иммобилизованных пептидов проводили, как описано [25,37]. Вкратце, 5 мг димеризованного пептида (M5-N, M22-N или M114-N) иммобилизовали в колонке HiTrap объемом 1 мл, содержащей гранул агарозы, активированных -гидроксисукцинимидом (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, United Kingdom) . Сыворотка человека (5 мл), 5-кратно разведенная в TBS (20 мМ Tris, 0.15 M NaCl [pH 7,4]) наносили на колонку, и после десяти промывок TBS (1 мл) связанные белки элюировали , диализовали против TBS и анализировали с помощью SDS-PAGE.

Анализ последовательности.

Множественное выравнивание последовательностей C4BP-связывающих HVR (рис. 1B, верхняя часть) было построено с помощью алгоритма CLUSTALW [61] с матрицами оценки замен остатков BLOSUM62 [62]. Самый короткий из известных C4BP-связывающих участков каждого белка, как определено с помощью гибридных белков или синтетических пептидов [18,25], был включен в выравнивание.Обратите внимание, что последовательность HVR M4, показанная здесь, является последовательностью дикого типа и отличается от последовательности в ранее охарактеризованном пептиде M4-N в одном положении, поскольку остаток R32 был заменен на Lys в пептиде по техническим причинам [25] . C4BP-связывающие HVR белков M4.1 и M114 (рис. 1B, нижняя часть) были вручную сопоставлены с другими последовательностями. Логотипы последовательностей на рисунке 5A и рисунке S1 были созданы с использованием WebLogo (http://weblogo.berkeley.edu) [63]. Прогноз спиральной катушки (рис. 5A) был произведен с использованием алгоритма COILS [64].

Другие методы.

Мечение белков без носителя ¹²⁵ I (Amersham Pharmacia Biotech) проводили с использованием метода хлорамина-Т [65] или модифицированного метода лактопероксидазы [66].

Дополнительная информация

Рисунок S1. Логотипы последовательностей, полученные из HVR в M-белках

Логотип последовательности на фиг. 5A был получен из семи HVR, которые, как известно, связывают C4BP (фиг. 1B). Чтобы проанализировать дополнительные C4BP-связывающие HVR, мы сравнили HVR в M-белках всех штаммов OF ⁺ , изученных здесь.Хотя молекулярный анализ не показал окончательно, что эти HVR связывают C4BP, вполне вероятно, что они связывают C4BP, потому что все штаммы OF ⁺ связывают C4BP (рис. 2, верхняя панель), а способность связывать C4BP приписывается белку M HVR у всех проанализированных штаммов OF ⁺ [18,25] (эта статья). Для анализа не связывающихся с C4BP HVR мы использовали данные для 11 несвязывающих штаммов, представленных на рисунке 2, нижняя панель.

(A) Логотип, полученный из HVR в 47 M белков, экспрессируемых OF ⁺ C4BP-связывающими штаммами различного серотипа (i.е., все деформации на верхней панели рисунка 2). Этот логотип похож на логотип, полученный из известных C4BP-связывающих HVR (рис. 5A). В частности, C-концевая половина менее вариабельна, чем N-концевая половина, и включает два доминирующих остатка Leu и преобладание отрицательно заряженных остатков.

(B) Логотип, полученный из 11 не-C4BP-связывающих HVR. Внешний вид этого логотипа отличается от логотипов на рисунках 5A и (A). Хотя доминирующие остатки Leu также видны в этом логотипе (скорее всего, отражая структуру спиральной спирали), вариабельность аналогична в обеих половинах логотипа, и неясно, что C-концевая половина содержит преобладание отрицательно заряженных остатков. .Логотипы следует сравнивать с осторожностью, но этот анализ показывает, что распределение остатков различно для тех HVR, которые связывают C4BP, и тех, которые не связываются.

Для создания этих логотипов остатки 1–50 указанных HVR были выровнены с помощью ClustalW. Два наиболее консервативных остатка Leu использовали для ручного выравнивания этих HVR с теми, которые проанализированы на рисунке 5A. Обратите внимание, что логотипы, показанные здесь, включают только 39 остатков, которые, как предполагается, соответствуют области связывания C4BP, проанализированной на Фигуре 5A.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0020047.sg001

(303 КБ PDF)

Регистрационный номер

Номера доступа GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) для генов и генных продуктов, обсуждаемых в этой статье: α-цепь C4BP (M31452), M2 (EmmL2.1) (X61276) , M4 (Arp4) (X15198), M22 (Sir22) (X75750), M60 (Arp60) (Z22751) и PrtH (M29398). Последовательности HVR белков M4.1 и M114 и последовательности HVR белков M штаммов, проанализированных на рисунке 2, доступны в базе данных последовательностей Центров по контролю за заболеваниями Streptococcus pyogenes emm (http: // www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/doc.htm).

Благодарности

Мы благодарим Ингемара Андре и Эрика Линдала за ценную помощь и Уллу Регнер за техническую помощь.

Вклад авторов

JP и GL разработали и разработали эксперименты. JP проводил эксперименты с помощью SL. BB предоставил необходимый материал. JP, SL и GL проанализировали данные. JP и GL написали статью.

Ссылки

1. 1. Стрёмберг Н., Марклунд Б.И., Лунд Б., Ильвер Д., Хамерс А. и др.(1990) Хоз-специфичность уропатогенной Escherichia coli зависит от различий в специфичности связывания с изорецепторами, содержащими Galα1–4Gal. EMBO J 9: 2001–2010.
2. 2. Барановский Э., Руис-Джарабо CM, Доминго Э. (2001) Эволюция распознавания клеток вирусами. Наука 292: 1102–1105.
3. 3. Mayer DCG, Mu J-B, Feng X, Su X-Z, Miller LH (2002). Полиморфизм в лиганде, связывающем эритроциты Plasmodium falciparum, изменяет его рецепторную специфичность. J Exp Med 196: 1523–1528.
4. 4. Weissman SJ, Moseley SL, Dykhuizen DE, Sokurenko EV (2003) Энтеробактериальные адгезины и случай для изучения SNP у бактерий. Trends Microbiol 11: 115–117.
5. 5. van Luenen HGAM, Kieft R, Mussmann R, Engstler M, ter Riet B, et al. (2005) Трипаносомы изменяют экспрессию рецепторов трансферрина, чтобы обеспечить эффективное поглощение трансферрина хозяина. Mol Microbiol 58: 151–165.
6. 6. Deitsch KW, Moxon ER, Wellems TE (1997) Общие темы антигенной изменчивости и вирулентности при бактериальных, протозойных и грибковых инфекциях.Microbiol Mol Biol Rev 61: 281–293.
7. 7. Шахнович Э., Абкевич В., Птицын О. (1996) Консервативные остатки и механизм сворачивания белков. Nature 379: 96–98.
8. 8. Wilson IA, Cox NJ (1990) Структурные основы иммунного распознавания гемагглютинина вируса гриппа. Анну Рев Иммунол 8: 737–771.
9. 9. Skehel JJ, Wiley DC (2000) Связывание рецепторов и слияние мембран при проникновении вируса: гемагглютинин гриппа. Анну Рев Биохим 69: 531–569.
10. 10. Стивенс Дж., Корпер А.Л., Баслер К.Ф., Таубенбергер Дж. К., Палезе П. и др. (2004) Структура нерасщепленного гемагглютинина человека h2 из вымершего вируса гриппа 1918 года. Наука 303: 1866–1870.
11. 11. Барух Д.И., Ма XC, Сингх HB, Би X, Паслоске Б.Л. и др. (1997) Идентификация области PfEMP1, которая опосредует прилипание эритроцитов, инфицированных Plasmodium falciparum, к CD36: консервативная функция с вариантной последовательностью. Кровь 90: 3766–3775.
12. 12.Стивенс Д.Л., Каплан Е.Л. (2000) Стрептококковые инфекции: клинические аспекты, микробиология и молекулярный патогенез. Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета. 449 с.
13. 13. Фишетти В.А. (1989) Стрептококковый белок M: молекулярный дизайн и биологическое поведение. Clin Microbiol Rev 2: 285–314.
14. 14. Kehoe MA (1994) Белки, связанные с клеточной стенкой у грамположительных бактерий. В: Ghuysen JM, Hakenbeck R, редакторы. Стенка бактериальной клетки. Амстердам: Elsevier Science B.V. С.
15. 15. Facklam RF, Martin DR, Lovgren M, Johnson DR, Efstratiou A, et al. (2002) Расширение классификации Lancefield для стрептококков группы A путем добавления 22 новых типов последовательностей генов М белка из клинических изолятов: emm 103 до emm 124. Clin Infect Dis 34: 28–38.
16. 16. Thern A, Stenberg L, Dahlbäck B, Lindahl G (1995) Ig-связывающие поверхностные белки Streptococcus pyogenes также связывают человеческий C4b-связывающий белок (C4BP), регуляторный компонент системы комплемента.J Immunol 154: 375–386.
17. 17. Accardo P, Sánchez-Corral P, Criado O, García E, Rodríguez de Córdoba S (1996) Связывание человеческого компонента комплемента C4b-связывающего белка (C4BP) со Streptococcus pyogenes включает сайт связывания C4b. J Immunol 157: 4935–4939.
18. 18. Johnsson E, Thern A, Dahlbäck B, Hedén LO, Wikström M и др. (1996) Высоко вариабельная область у членов семейства стрептококковых белков М связывает человеческий регулятор комплемента C4BP.J Immunol 157: 3021–3029.
19. 19. Lindahl G, Sjöbring U, Johnsson E (2000) Регуляторы комплемента человека: основная мишень для патогенных микроорганизмов. Curr Opin Immunol 12: 44–51.
20. 20. Berggård K, Johnsson E, Morfeldt E, Persson J, Stålhammar-Carlemalm M и др. (2001) Связывание человеческого C4BP с гипервариабельной областью белка М: молекулярный механизм устойчивости к фагоцитозу Streptococcus pyogenes. Mol Microbiol 42: 539–551.
21. 21.Carlsson F, Berggård K, Stålhammar-Carlemalm M, Lindahl G (2003) Уклонение от фагоцитоза посредством сотрудничества между двумя лиганд-связывающими областями в белке Streptococcus pyogenes M. J Exp Med 198: 1057–1068.
22. 22. Li Z, Sakota V, Jackson D, Franklin AR, Beall B (2003) Массив подтипов генов белка M в 1064 недавно инвазивных изолятах стрептококка группы A, извлеченных в результате активного наблюдения за бактериальным ядром. J Infect Dis 188: 1587–1592.
23. 23. Шульман С.Т., Танц Р.Р., Кабат В., Кабат К., Седерлунд Э. и др.(2004) Эпиднадзор за серотипом стрептококкового фарингита в Северной Америке, 2000–2002 гг. Clin Infect Dis 39: 325–332.
24. 24. Блом А.М., Берггард К., Уэбб Дж. Х., Линдаль Г., Виллоутрейкс Б.О. и др. (2000) C4b-связывающий белок человека имеет перекрывающиеся, но не идентичные сайты связывания для белков C4b и стрептококка М. J Immunol 164: 5328–5336.
25. 25. Морфельдт Э., Берггард К., Перссон Дж., Дракенберг Т., Джонссон Э. и др. (2001) Изолированные гипервариабельные области, полученные из стрептококковых белков M, специфически связывают человеческий C4b-связывающий белок: последствия для антигенной изменчивости.J Immunol 167: 3870–3877.
26. 26. Андре И., Перссон Дж., Блом А.М., Нильссон Х., Дракенберг Т. и др. (2006) Streptococcal M-белок: структурные исследования гипервариабельной области, свободной и связанной с человеческим C4BP. Биохимия 45: 4559–4568.
27. 27. Beall B, Facklam R, Hoenes T, Schwartz B (1997) Обзор последовательностей генов emm и типов Т-антигенов из системных изолятов инфекции Streptococcus pyogenes , собранных в Сан-Франциско, Калифорния; Атланта, Джорджия; и Коннектикут в 1994 и 1995 годах.J Clin Microbiol 35: 1231–1235.
28. 28. МакГрегор К.Ф., Билек Н., Беннетт А., Калиа А., Билл Б. и др. (2004) Стрептококки группы А из удаленного сообщества имеют новые мультилокусные генотипы, но имеют общие emm типов и домашних аллелей с изолятами из мировых источников. J Infect Dis 189: 717–723.
29. 29. Эрдем Дж., Форд Дж. М., Каненака Р. Я., Абэ Л., Ямага К. и др. (2005) Молекулярно-эпидемиологическое сравнение двух необычных кластеров стрептококкового некротического фасциита группы А на Гавайях.Clin Infect Dis 40: 1851–1854.
30. 30. Stenberg L, O’Toole P, Lindahl G (1992) Многие штаммы стрептококков группы A экспрессируют два разных иммуноглобулин-связывающих белка, кодируемых тесно связанными генами: характеристика белков, экспрессируемых четырьмя штаммами разного M-типа. Mol Microbiol 6: 1185–1194.
31. 31. Перес-Кабальеро Д., Альберти С., Виванко Ф., Санчес-Корраль П., Родригес де Кордоба С. (2000) Оценка взаимодействия регуляторных белков комплемента человека со стрептококками группы А.Идентификация высокоаффинного сайта связывания стрептококков группы А в FHL-1. Eur J Immunol 30: 1243–1253.
32. 32. Facklam R, Beall B., Efstratiou A, Kriz P, Tyrrell G, et al. (2000) Номенклатура новых типов стрептококков emm группы А. В: Мартин Д.Р., Тагг-младший, редакторы. Стрептококки и стрептококковые заболевания. Секуракопия. Порируа, Новая Зеландия: стр. 797–803. Proc. XIV Lancefield Intl. Symp. С.
33. 33. Вега Ю., Раух М., Банфилд М.Дж., Ермолаева С., Скортти М. и др.(2004) Новые мутанты Listeria monocytogenes prfA * , транскрипционные свойства белков PrfA * и структура-функция регулятора вирулентности PrfA. Мол микробиол 52: 1553–1565.
34. 34. Linse S, Voorhies M, Norström E, Schultz DA (2000) Исследование спаривания субдоменов кальмодулина с помощью фагового дисплея EF-hand. J Mol Biol 296: 473–486.
35. 35. Åkesson P, Schmidt KH, Cooney J, Björck L (1994) Белок M1 и белок H: IgGFc- и альбумин-связывающие стрептококковые поверхностные белки, кодируемые соседними генами.Biochem J 300: 877–886.
36. 36. Перес-Кабальеро Д., Гарсиа-Лаорден I, Кортес Дж., Весселс М.Р., де Кордова С.Р. и др. (2004) Взаимодействие между регуляторами комплемента и Streptococcus pyogenes: Связывание C4b-связывающего белка и фактора H / фактора H-подобного белка 1 со штаммами M18 происходит с участием двух разных молекул клеточной поверхности. J Immunol 173: 6899–6904.
37. 37. Persson J, Lindahl G (2005) Одностадийная очистка человеческого C4b-связывающего белка (C4BP) с помощью аффинной хроматографии на пептиде, полученном из поверхностного белка стрептококка.J Immunol Methods 297: 83–95.
38. 38. Dahlbäck B (1991) Белок S и C4b-связывающий белок: компоненты, участвующие в регуляции антикоагулянтной системы протеина C. Thromb Haemost 66: 49–61.
39. 39. Stenberg L, O’Toole PW, Mestecky J, Lindahl G (1994) Молекулярная характеристика белка Sir, поверхностного белка стрептококковой клетки, который связывает как иммуноглобулин A, так и иммуноглобулин G. J Biol Chem 269: 13458–13464.
40. 40. Manjula BN, Fischetti VA (1980) Тропомиозиноподобная периодичность из семи остатков в трех иммунологически различных белках стрептококков M и ее значение для антифагоцитарных свойств молекулы.J Exp Med 151: 695–708.
41. 41. Нильсон Б.К., Фрик И.М., Окессон П., Форсен С., Бьорк Л. и др. (1995) Структура и стабильность белка H и белка M1 из Streptococcus pyogenes. Значение для других поверхностных белков грамположительных бактерий. Биохимия 34: 13688–13698.
42. 42. Мейсон Дж. М., Арндт К. М. (2004) Домены спиральной спирали: стабильность, специфичность и биологические последствия. Chembiochem 5: 170–176.
43. 43. Cedervall T, Johansson MU, Åkerström B (1997) Спиральная структура белков стрептококков группы A.Различная температурная стабильность белков классов A и C за счет гидрофобных-негидрофобных аминокислотных замен в гептадных положениях a и d. Биохимия 36: 4987–4994.
44. 44. Уоткинс Б.А., Буге С., Олдрич К., Дэвис А.Е., Робинсон Дж. И др. (1996) Устойчивость вируса иммунодефицита человека типа 1 к нейтрализации природными антисыворотками возникает в результате замены одной аминокислоты, которая вызывает изменения связывания антител во многих сайтах. J Virol 70: 8431–8437.
45. 45.Smith DJ, Lapedes AS, de Jong JC, Bestebroer TM, Rimmelzwaan GF и др. (2004) Картирование антигенной и генетической эволюции вируса гриппа. Наука 305: 371–376.
46. 46. Thern A, Wästfelt M, Lindahl G (1998) Экспрессия двух разных антифагоцитарных белков M с помощью Streptococcus pyogenes линии OF ⁺ . J Immunol 160: 860–869.
47. 47. Дженкинс Х.Т., Марк Л., Болл Дж., Перссон Дж., Линдаль Дж. И др. (2006) C4b-связывающий белок человека, структурная основа взаимодействия со стрептококковым M-белком, основным фактором вирулентности бактерий.J Biol Chem 281: 3690–3697.
48. 48. Ольшевский У., Хелсет Э., Фурман Ч., Ли Дж., Хазелтин В. и др. (1990) Идентификация отдельных аминокислот gp120 вируса иммунодефицита человека типа 1, важных для связывания рецептора CD4. J Virol 64: 5701–5707.
49. 49. Kwong PD, Wyatt R, Robinson J, Sweet RW, Sodroski J, et al. (1998) Структура гликопротеина оболочки gp120 ВИЧ в комплексе с рецептором CD4 и нейтрализующим человеческим антителом. Nature 393: 648–659.
50. 50. Wyatt R, Kwong PD, Desjardins E, Sweet RW, Robinson J, et al. (1998) Антигенная структура гликопротеина оболочки gp120 ВИЧ. Природа 393: 705–711.
51. 51. Дэвис Д. Р., Падлан Е. А., Шериф С. (1990) Комплексы антитело-антиген. Анну Рев Биохим 59: 439–473.
52. 52. Hazes B, Sastry PA, Hayakawa K, Read RJ, Irvin RT (2000) Кристаллическая структура пилина PAK Pseudomonas aeruginosa предполагает доминирующий в основной цепи способ связывания рецептора.J Mol Biol 299: 1005–1017.
53. 53. Андре И., Кесватера Т., Йонссон Б., Окерфельдт К.С., Линсе С. (2004) Роль электростатических взаимодействий в образовании комплекса кальмодулин-пептид. Biophys J 87: 1929–1938.
54. 54. Steinhauer DA, Skehel JJ (2002) Генетика вирусов гриппа. Анну Преподобный Женет 36: 305–332.
55. 55. Филлипс RE (2002) Иммунология, преподаваемая Дарвином. Nat Immunol 3: 987–989.
56. 56. Johnsson E, Berggård K, Kotarsky H, Hellwage J, Zipfel PF и др.(1998) Роль гипервариабельной области в белках M стрептококков: связывание ингибитора комплемента человека. J Immunol 161: 4894–4901.
57. 57. Perez AR, Abanes-De Mello A, Pogliano K (2000) SpoIIB локализуется в активных участках биогенеза перегородки и пространственно регулирует истончение перегородки во время поглощения Bacillus subtilis. J Bacteriol 182: 1096–1108.
58. 58. Husmann LK, Scott JR, Lindahl G, Stenberg L (1995) Экспрессия белка Arp, члена семейства белков M, недостаточна для подавления фагоцитоза Streptococcus pyogenes.Заражение иммунной 63: 345–348.
59. 59. Johnsson E, Andersson G, Lindahl G, Hedén LO (1994) Идентификация области связывания IgA в стрептококковом белке Arp. J Immunol 153: 3557–3564.
60. 60. Stålhammar-Carlemalm M, Stenberg L, Lindahl G (1993) Protein Rib: новый белок поверхности стрептококковых клеток группы B, который обеспечивает защитный иммунитет и экспрессируется большинством штаммов, вызывающих инвазивные инфекции. J Exp Med 177: 1593–1603.
61. 61. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994) CLUSTAL W: Повышение чувствительности прогрессивного множественного выравнивания последовательностей посредством взвешивания последовательностей, штрафов за пропуски для конкретных позиций и выбора матрицы весов.Nucleic Acids Res 22: 4673–4680.
62. 62. Henikoff S, Henikoff JG (1992) Матрицы аминокислотных замен из белковых блоков. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 10915–10919.
63. 63. Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE (2004) WebLogo: генератор последовательного логотипа. Genome Res 14: 1188–1190.
64. 64. Lupas A, Van Dyke M, Stock J (1991) Предсказание спиральных спиралей на основе белковых последовательностей. Science 252: 1162–1164.
65. 65. Greenwood FC, Hunter WM, Glover JS (1963) Приготовление меченного I-131 гормона роста человека с высокой удельной радиоактивностью.Biochem J 89: 114–123.
66. 66. Marchalonis JJ (1969) Ферментативный метод следового йодирования иммуноглобулинов и других белков. Biochem J 113: 299–305.

Идентификация и характеристика критических цис-действующих последовательностей в дрожжевом ретротранспозоне Ty1

Аннотация

Дрожжевой ретротранспозон Ty1 с длинным концевым повтором (LTR), как и ретровирусы, кодирует концевую избыточную РНК, которая является упаковывается в вирусоподобные частицы (VLP) и преобразуется в копию ДНК в процессе обратной транскрипции.Мутации предсказано, что они мешают праймингу во время обратной транскрипции и, следовательно, ингибируют репликацию, как известно, значительно уменьшить транспозицию Ty1. Однако дополнительные цис -действующих последовательностей, ответственные за репликацию Ty1, димеризацию и упаковку РНК, остаются неуловимыми. Здесь мы описываем модульный элемент mini-Ty1, кодирующий минимальную последовательность, которая может быть ретротранспонирована белками Ty1, поставляемыми в trans с помощью вспомогательной конструкции.Используя стратегию мутагенного скрининга, мы извлекли модульные элементы mini-Ty1- HIS3 с дефицитом транспозиции с мутациями в последовательностях, необходимых в цис для репликации и интеграции Ty1. Два отдельных кластера мутаций картированы около 5′-конца Ty1 РНК. Кластеры определяют последовательность GAGGAGA на крайнем 5′-конце транскрипта Ty1 и комплементарную нижестоящую последовательность UCUCCUC, 264 nt в РНК. Нарушение обратной комплементарности этих двух последовательностей уменьшило транспозицию и восстановление комплементарности спасла транспозиция до уровней дикого типа.КДНК Ty1 снижена в клетках, экспрессирующих РНК с мутациями. в любой из этих коротких последовательностей, несмотря на почти нормальные уровни Ty1 РНК и VLP. Наши результаты показывают, что внутримолекулярный взаимодействие между последовательностями 5′-GAGGAGA и UCUCCUC стабилизирует структуру РНК, необходимую для эффективного инициирования обратная транскрипция.

Ty1 является одним из пяти типов ретротранспозонов с длинными концевыми повторами (LTR), населяющих геном дрожжей Saccharomyces cerevisiae .Ретротранспозоны LTR, такие как Ty1, во многих отношениях сходны с ретровирусами (Boeke and Stoye 1997; Voytas and Boeke 2002). Аналогично ретровирусам, элементы Ty1 состоят из центральной кодирующей области, фланкированной непосредственно повторяющимися LTR, которые являются разделены на регионы U3, R и U5. Жизненный цикл Ty1, упрощенная версия жизненного цикла ретровирусов, можно разделить в три фазы: (1) экспрессия и сборка, (2) обратная транскрипция и (3) интеграция.Транскрипция Ty1 производит молекула РНК с конечной избыточностью, которая выполняет двойную функцию. Во-первых, трансляция РНК, кодируемой элементом, генерирует структурный белок Gag и фермент Pol, которые необходимы для транспозиции, особенно для репликации и интеграции из Ty1. Pol образуется как белок считывания Gag-Pol посредством трансляционного сдвига рамки считывания (Belcourt and Farabaugh, 1990). Белки Gag и Gag-Pol объединены с РНК Ty1 и тРНК дрожжевого инициатора _i ^Met внутри цитоплазмы, образуя вирусоподобные частицы (VLP) (Chapman et al.1992; Roth 2000; Войтас и Бёке 2002). VLP являются промежуточными продуктами прямой транспозиции, в которых происходит обратная транскрипция (Garfinkel et al. 1985; Eichinger and Boeke 1988). Во-вторых, во время репликации Ty1, как и в ретровирусах, терминально повторяющаяся РНК, генетический материал для транспозиции (Boeke et al. 1985), превращается в копию двухцепочечной ДНК с помощью обратной транскриптазы Ty1 (Garfinkel et al. 1985).

В ретровирусах идентифицировано и охарактеризовано несколько элементов цис .Эти последовательности РНК опосредуют множество процессов, некоторые из которых включают ретровирусные Димеризация, упаковка и обратная транскрипция РНК (Telesnitsky and Goff 1993; Paillart et al. 1996b, 2004; Rabson and Graves 1997; Swanstrom and Wills 1997). Общей темой среди этих цис -действующих последовательностей является их расположение вблизи концов транскрипта ретровирусной РНК. В соответствии с этим последовательности необходимые в цис для ретротранс-позиции дрожжевого элемента Ty1 были ранее картированы в LTR или рядом с ними (Xu and Boeke 1990).Несколько элементов цис , необходимых для репликации Ty1, были подробно описаны, включая сайт связывания праймера (PBS), блок 0, блок 1, и вставка 2.1, а также полипуриновый тракт 1 (PPT1) (Boeke et al. 1988a; Chapman et al. 1992; Heyman et al. 1995; Friant et al. 1998). Кроме того, геномная РНК в Ty1 VLPs, как сообщается, существует в виде нековалентного димера (Feng et al. 2000). Однако мало что известно о последовательностях, необходимых для димеризации или упаковки РНК, кроме предварительных результатов эксперименты с делециями предполагают критическую последовательность 230-580 нуклеотидов в транскрипте Ty1 внутри фрагмента PvuII-HpaI (Xu and Boeke 1990).

Мы сообщаем об использовании модульной системы mini-Ty1, разработанной для идентификации и изучения цис -действующих последовательностей в элементе Ty1, необходимом для транспозиции. Модульный элемент mini-Ty1 состоит из элемента Ty1, Ty1-h4, в котором C-концевая половина GAG и вся ORF POL были удалены и заменены селективным маркером дрожжей, HIS3 . Белки, кодируемые Ty1, предоставленные в trans вспомогательной плазмидой, влияют на транспозицию мини-Ty1- HIS3 РНК.Хотя вспомогательная конструкция кодирует белки Gag и Pol, она неспособна к ретротранспозиции, поскольку 3′-LTR был удален (Xu and Boeke, 1990). Описанные здесь исследования подробно описывают новую плазмиду-помощник, дополнительно поврежденную мутацией PBS.

Локализованный мутагенез последовательностей Ty1, содержащихся в минимальном элементе mini-Ty1- HIS3 , с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) был проведен и выявил несколько кластеров ранее известных и неизвестных последовательностей. требуется для транспонирования.Интересно, что нарушение возможного взаимодействия пар оснований между двумя последовательностями около 5′-конца РНК Ty1 резко ингибирует транспозицию. Дефект транспозиции у этих мутантов лежит между сборкой VLP и завершение обратной транскрипции. Наши результаты предполагают, что внутримолекулярное взаимодействие между последовательностью GAGGAGA в области повтора (R) на 5′-конце транскрипта Ty1 и нижестоящей последовательности UCUC CUC, 264 нуклеотида в pGTy1-h4 транскрипт может стабилизировать структуру РНК, необходимую для эффективной инициации обратной транскрипции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Модульная мини-система Ty1-

HIS3 для исследования элементов цис

Для идентификации цис -действующих последовательностей внутри РНК Ty1, участвующих в механизме ретротранспозиции, был проведен мутагенный скрининг, основанный на транспозиции элемента mini-Ty1 (Xu и Boeke, 1990). Предыдущая стратегия делеции локализовала последовательности, необходимые в цис для ретротранспозиции Ty1, рядом с LTR (Xu and Boeke 1990), таким образом создавая серию элементов mini-Ty1.Минимальный элемент mini-Ty1, выбранный для этого исследования (рис. 1A), кодирует первые 580 нуклеотидов и последние 357 нуклеотидов РНК pGTy1-h4 (Xu and Boeke, 1990). Поскольку mini-Ty1 не кодируют белки Ty1, вспомогательная плазмида, которая имеет полные ORF GAG и POL , многократно мутированный PBS (Chapman et al. 1992) и не имеет области прайминга 3′-LTR или плюс-цепи. используется для доставки белков Ty1 в trans . Мы показываем, что РНК mini-Ty1- HIS3 , кодируемая модульной донорной плазмидой mini-Ty1- HIS3 (каркас URA3 ), транспонируется, но только в присутствии вспомогательной плазмиды (каркас LEU2 ) ( Инжир.1А, Б). Умеренный уровень фонового роста, присутствующий на селективном планшете для штамма дикого типа ( RAD52 ), содержащего модульную донорную плазмиду mini-Ty1- HIS3 с дефицитом транспозиции, по-видимому, является результатом событий гомологичной рекомбинации между плазмидой и хромосомным Ty1s. потому что такой рост отсутствует у штамма rad52 Δ (рис. 1Б). Однако, поскольку наша стратегия мутагенеза требует наличия аппарата эндогенной гомологичной рекомбинации, который включает продукт гена Rad52 (Muhlrad et al.1992), а поскольку фон рекомбинантов не мешал выделению мутантов, мы использовали штамм RAD52 .

Выделение мутанта mini-Ty1s

Чтобы идентифицировать критические цис элементов, необходимых для транспозиции Ty1, мы проверили фенотип транспозиции тысяч мутантных модульных мини-Ty1- HIS3 элементов. Этот скрининг качественно анализирует частоту транспозиции mini-Ty1- HIS3 в дрожжевых клетках, содержащих мутантные модульные донорные плазмиды mini-Ty1- HIS3 и вспомогательную плазмиду.Модульная донорская плазмида mini-Ty1- HIS3 была мутагенизирована с помощью метода, основанного на ПЦР, в котором мутагенизированные продукты ПЦР были включены в любую 5′-область. (XhoI-HpaI) или 3′-область (NotI-BamHI) элемента mini-Ty1- HIS3 посредством репарации плазмид с разрывом in vivo (Muhlrad et al. 1992; Brachmann et al. 1998). Присутствие продукта ПЦР во время трансформации привело к получению в> 160 раз большего количества трансформантов, чем одна плазмида с пробелом, в то время как трансформация одного продукта ПЦР не дала трансформантов.Этот результат предполагает, что> 99% проверенных колоний были образованы путем рекомбинации между продуктом ПЦР и плазмидой с разрывом. Колонии, содержащие мутагенизированные модульные донорские плазмиды mini-Ty1- HIS3 , подвергали скринингу на дефекты транспозиции. Анализ транспозиции состоит из серии этапов нанесения реплик, в которых экспрессия и транспозиция pGal-Ty1 индуцируются на среде, содержащей галактозу, а затем оцениваются качественным определение фракции колоний, свободных от плазмиды His ⁺ (см. Материалы и методы).Все колонии с дефицитом транспозиции были заделаны и повторно протестированы на транспозицию. и собственно сегрегация донорской плазмиды (т.е. способность клеток терять модульную донорскую плазмиду mini-Ty1- HIS3 ). Модульные донорские плазмиды mini-Ty1- HIS3 были спасены из колоний, которые оставались транспозиционно-дефицитными и были способны терять донорскую плазмиду посредством митотическая сегрегация. Мутации в восстановленных элементах mini-Ty1- HIS3 впоследствии были идентифицированы путем секвенирования.

5′-области мутанты

Приблизительно 20 000 колоний были проанализированы на транспозицию во время скрининга 5′-области. Из 663 первичных экранов мутанты, 98 транспонированных, как дикого типа, при повторном тестировании, и 242 приобрели многократно мутировавший PBS из вспомогательной плазмиды; эти плазмиды, вероятно, возникли в результате события тройной рекомбинации между последовательностью всего 5′-сайта XhoI пропущенной и вспомогательные плазмиды, область всего 3 ‘PBS вспомогательной плазмиды и продукта ПЦР и последовательность всего 3’ Сайт HpaI продукта ПЦР и плазмиды с разрывом.Этот неинтересный класс мутантов был отсеян простым методом ПЦР. тест (см. Материалы и методы). Из оставшихся 289 выделенных мутантных донорных плазмид mini-Ty1- HIS3 271 секвенировали. Из этих 271 плазмид три не имели фрагмента XhoI-HpaI (предположительно, они возникли негомологичным концевое соединение плазмиды с разрывом), 106 не имели мутаций в секвенированной области, а 162 имели мутации внутри мутагенизированной область.Из последних 10 имели делеции одного основания в 5′-области. Из 152 оставшихся мутантных элементов mini-Ty1- HIS3 , 85 имели одноосновное основание, 44 — двухосновное и 17 имели замены на тройное основание в мутагенизированной области. Остальное шесть мутантов имели четыре или более мутантных основания в 5′-области. В целом, ~ 81% замененных мутаций были переходными и 19% были трансверсиями.

Мутации, снижающие частоту транспозиции элемента mini-Ty1- HIS3 , локализованы в отдельных кластерах в 5′-области (рис.2А). Как и ожидалось, многие мутации, отображенные в PBS область, содержащая PBS, блок 0, блок 1 и блок 2.1, необходимый для взаимодействия РНК Ty1 с тРНК дрожжевого инициатора _i ^Met для праймирования синтеза минус-цепи, тем самым инициируя обратную транскрипцию. Два дополнительных кластера мутаций, которые уменьшаются транспозиция мини-Ty1- HIS3 элемента появляются в 5′-области. Один находится ниже по течению от сайта PvuII, а другой — рядом с сайтом XhoI, который соответствует стартовому сайту транскрипта mini-Ty1- HIS3 (рис.2А, обозначено *). Другая горячая точка для мутаций, отменяющих транспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 , соответствует TATA-боксу промотора GAL1 , что дополнительно подтверждает метод мутагенеза. Сайты связывания Gal4, расположенные выше мутагенизированного области, не были секвенированы.

3′-области мутанты

Почти 13000 колоний были проанализированы на транспозицию во время скрининга 3′-области.Из 313 мутантов первичного скрининга 93 транспонировались, как и дикий тип, во время вторичных скрининговых тестов, 13 показали дефекты роста, 11 не смогли сегрегировать донорская плазмида, а пять получили многократно мутировавший PBS из вспомогательной плазмиды (этот класс мутантов мог возникнуть четыре события рекомбинации между двумя плазмидами и продуктом ПЦР). Из оставшихся 191 выделенных мутантных донорных плазмид mini-Ty1- HIS3 172 секвенировали.Из этих 172 плазмид одна не имела фрагмента NotI-BamHI (опять же, предположительно, возникшего в результате негомологичных концевое соединение плазмиды с разрывом), пять не имели мутаций в секвенированной области, а 166 имели мутации внутри мутагенизированной область. Из 166 мутантов 37 имели делеции одного основания в 3′-области. Из оставшихся 129 мутантных элементов mini-Ty1- HIS3 26 имели одноосновные, 30 — двухосновные и 30 — трехосновные мутации в мутагенизированной области.Остальное 43 из 129 мутантов имели четыре или более мутантных основания в 3′-области. В целом 78% замененных мутаций были переходными и 22% были трансверсиями.

Последовательность PPT1

Мутации, которые снижают частоту транспозиции элемента mini-Ty1- HIS3 , также локализуются в отдельные кластеры в 3′-области (Fig. 2B). Мутации в 3′-области, снижающие частота транспозиции элемента mini-Ty1- HIS3 , кластеризованного внутри и вокруг последовательности PPT1, необходимая для праймирования синтеза плюс-цепи ДНК во время обратного транскрипция (рис.2Б). Длина этого 3′-кластера предполагает, что фактическая последовательность, необходимая для праймирования синтеза плюс-цепи простирается дальше 5 ‘от самой последовательности PPT1, как ранее было предложено Wilhelm et al. (1999). Основываясь на результатах скрининга 3’-регионов, мы предполагаем, что до восьми оснований, расположенных непосредственно перед PPT1 необходимы для перестановки элемента mini-Ty1- HIS3 . Эта последовательность из 8 нуклеотидов, скорее всего, необходима для эффективного праймирования во время синтеза ДНК с сильной остановкой на положительной стойке.

Последовательность LTR

Мутация первого и третьего оснований последовательности 3′-U3 также уменьшала транспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 . Первый нуклеотид U3 имеет решающее значение для транспозиции, потому что он определяет последовательность левого конца элемента ДНК, который распознается белком IN во время интеграции (Braiterman and Boeke 1994; Sharon et al. 1994; Moore et al. 1995). Что касается третьего основания 3′-U3, его значение для специфичности субстрата ИН остается неясным, но оно может иметь решающее значение. для правильного связывания IN in vivo.

Меньший кластер мутаций, картированный в последовательности 3′-U3 непосредственно перед сигналом терминации 1 (TS1). Значение этой ранее неизвестной области (Рис. 2B, помеченной?) все еще остается под вопросом. К сожалению, не было выделено ни одного мутантного элемента mini-Ty1- HIS3 с заменой одного основания в этом кластере. Следовательно, значение мутаций в этой части области 3′-U3 остается неизвестным.

Проверка 5′-мутантов

Для проверки того, что мутации в изолированных модульных донорских плазмидах mini-Ty1- HIS3 действительно влияли на транспозицию, и чтобы отсортировать эффекты множественных мутаций, фрагменты, содержащие одноосновное основание мутации субклонировали в «чистую» модульную донорскую плазмиду mini-Ty1- HIS3 . Эти одинарные мутантные донорские плазмиды mini-Ty1- HIS3 затем тестировали на транспозицию.Большинство (49 из 69) одноосновных мутаций вызвали значительное снижение по частоте транспозиции (рис. 3А). Для «горячих точек» по крайней мере с тремя мутациями 88% (семь из восьми сайтов) одноосновного мутанты показали снижение транспозиции, а для тех, у кого две мутации, 86% (12 из 14 сайтов) одноосновных мутантов были транспозиционно-дефицитными, что позволяет предположить, что сайты с двумя мутациями не менее «горячие», чем сайты с как минимум тремя мутациями.Кроме того, три кластера мутаций в 5′-области, соответствующей 5′-концу РНК, области PBS и Предполагаемая область димеризации и упаковки (D / P) была подтверждена как транспозиционно-дефицитная. В большинстве случаев субклонированные одноосновные мутации, которые не уменьшали транспозицию, были первоначально выделены как многократно мутировавшие донорские плазмиды. Многие из них дополнительные мутации в PBS, поле 0, поле 1 и поле 2.1 область, и, следовательно, их дефект транспозиции возник в результате аберрантное праймирование обратной транскрипции (Boeke et al. 1988a; Chapman et al. 1992; Friant et al. 1998).

5′-U5 и мутанты области PBS

Мутация нескольких оснований к концу последовательности 5′-U5 (фиг. 3A, помечена?), Особенно последнего нуклеотида, уменьшено перемещение элемента mini-Ty1- HIS3 .Последнее основание имеет решающее значение для транспозиции, поскольку оно определяет последовательность правого конца ДНК. элемент, который распознается белком IN во время интеграции (Braiterman and Boeke 1994; Sharon et al. 1994; Moore et al. 1995). Другие необходимые основания в области U5 (рис. 3B) вполне могут нести ответственность за поддержание предполагаемой вторичной РНК Ty1. структура (Friant et al. 1996, 1998), так как многие из изолированных мутантов, которые снижают транспозицию, предположительно вмешиваются в эту структуру.Точная роль этой интересной части 5′-U5 еще предстоит определить.

Интересно, что никакие элементы mini-Ty1- HIS3 с дефицитом транспозиции не были восстановлены с мутациями в сайте инициации трансляции (AUG). Это позволило нам предположить, что элемент mini-Ty1- HIS3 не должен продуцировать функциональный белок Gag. Чтобы напрямую обратиться к этой гипотезе, мы проанализировали транспозицию частота мутантного элемента mini-Ty1- HIS3 AUG к AUU, полученного посредством сайт-направленного мутагенеза.Удивительно, но мутантный элемент AUG в AUU плохо переносится, но не так плохо. в качестве отрицательного контроля — miniΔ. Таким образом, мы не уверены в судьбе усеченного белка Gag, кодируемого mini-Ty1; Транслируемость Ty1 РНК может быть требованием для эффективной ретротранспозиции. Тот факт, что элемент mini-Ty1- HIS3 хорошо транспонируется, предполагает, что усеченный белок Gag не функционирует доминантно-отрицательным образом. Для дальнейшего Чтобы оценить наши стратегии скрининга, мы сравнили наши результаты в области PBS с данными, о которых сообщалось ранее (Friant et al.1998). Все одноосновные мутации, которые мы выделили в последовательностях PBS и блока 0, снижали частоту транспозиции. элемента mini-Ty1- HIS3 (рис. 3A, B). В то время как одноосновные мутации в блоке 1 не были субклонированы и повторно протестированы, единичные мутации в трех основания, фланкирующие последовательность бокса 1, уменьшили транспозицию. Изменения единой базы во вставке 2.1 дали парадоксальные результаты; один мутация не повлияла на частоту транспозиции элемента mini-Ty1- HIS3 (мутация U в C в GCUUCCA), в то время как другая мутация повлияла (мутация A на U в GCUUCCA).Предыдущее исследование показало, что изменение четырех последовательных нуклеотидов (мутация UUCC в AAGU в GCUUCCA) серьезно влияет на транспозицию (Friant et al. 1998).

Два интересных кластера мутаций в 5′-области

Все протестированные одноосновные мутации около крайнего 5′-конца РНК mini-Ty1- HIS3 и в кластере ниже сайта PvuII также значительно ингибировали транспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 (рис.4, обозначено *). Учитывая, что мы выделили 85 одноосновных мутантов в секвенированной части длиной ~ 800 п.н. мутагенизированной 5′-области мы ожидали получить 1 мутант на 9 п.н. путем случайного распределения. Проверка этого нисходящего потока последовательность показала, что мутации в любом из четырех последовательных нуклеотидов в последовательности CUCCUC РНК Ty1 значительно снижают транспозицию. Из четырех мутировавших нуклеотидных позиций три были восстановлены. как одноосновные мутанты, значительно превышающие предсказанные случайным распределением.Мы сосредоточили свое внимание на этом CUCCUC последовательность, потому что ее расположение в пределах 5′-конца РНК Ty1 приблизительно соответствует положениям РНК ВИЧ-1 последовательности инициации / связывания и упаковки димеризации (Скрипкин и др., 1994; Клевер и др., 1996; Laughrea, Jette, 1996; Сакураги и др., 2003). Короткая длина последовательности Ty1 CUCCUC аналогична сайту инициации димеризации ВИЧ-1 или «петле поцелуев» (GCGCGC и GAGCUC для штаммов MAL и LAI соответственно) (Скрипкин и др.1994; Clever et al. 1996; Laughrea and Jette 1996). Однако «целующаяся петля» ВИЧ-1 является палиндромной, а последовательность Ty1 CUCCUC — нет. В надежде найти обратное комплемента последовательности Ty1 CUCCUC, мы сканировали остальную часть мини-Ty1- HIS3 РНК. Неожиданно мы идентифицировали два совершенных обратных комплемента (GAGGAGA) расширенной последовательности UCUCCUC в LTR (рис. 4). Эта последовательность GAGGAGA расположена на крайнем 5′-конце повторяющейся (R) последовательности РНК Ty1, одна на 5′-конце. и второй около 3′-конца мини-РНК Ty1- HIS3 .Семь элементов mini-Ty1- HIS3 с одноосновными мутациями в последовательности 5′-GAGGAGA были идентифицированы как транспозиционно-дефицитные в исходной 5′-область экрана, опять же, значительно больше, чем предсказано случайным распределением. Из семи, два были подтверждены субклонированием. и повторное тестирование транспозиции (рис. 4, обозначено оранжевым и серым цветом). Однако один элемент mini-Ty1- HIS3 с одноосновной мутацией в последовательности 3′-GAGGAGA показал сниженную транспозицию в нашем исходном скрининге 3′-область (рис.5, выделено серым цветом). Эти результаты предполагают, что последовательность UCUC CUC может взаимодействовать с любым из Последовательности GAGGAGA в R-областях, и что такое взаимодействие может потребоваться для эффективной транспозиции mini-Ty1- элемент HIS3 .

Взаимодействие 5′-GAGGAGA и UCUCCUC, необходимое для транспозиции

Тот факт, что 5′-ГАГГАГА соответствует крайнему 5′-концу РНК Ty1, усложняет анализ и интерпретацию.Мутация этой последовательности может ингибировать экспрессию РНК или удлинение обратной транскрипции минус-цепи после минус-цепи. перенос ДНК с сильной остановкой (-sssDNA). Поэтому мы разработали новые мутации в последних трех нуклеотидах последовательности GAGGAGA, чтобы минимизировать возможное влияние на экспрессию РНК, удлинение -sssDNA и сохранение кодонов для тестирования мутаций. в полноразмерных элементах Ty1.

Чтобы проверить, требуется ли взаимодействие между последовательностями GAGGAGA и UCUCCUC внутри РНК Ty1 для эффективной транспозиции, мы создали модульные донорские плазмиды mini-Ty1- HIS3 , содержащие комбинации одно- и двухосновных мутаций в последовательностях GAGGAGA и UCUCCUC.Транспонирование этих мутантных элементов mini-Ty1- HIS3 анализировали в присутствии вспомогательной плазмиды в штамме rad52 Δ для минимизации фона от гомологичной рекомбинации. Одноосновные мутации были разработаны на основе одного из мутации, идентифицированные во время первоначального 5′-скрининга, а также сохранение кодонов (фиг. 5A). Мутация U в C в последовательности UCUCCUC уменьшала транспозицию, как и мутация A в G в последовательности 5′-GAGGAGA (рис.5Б). Однако та же самая мутация от A к G в последовательности 3′-GAGGAGA не влияла на транспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 . Более того, объединение мутации U в C в последовательности UCUC CUC с мутацией A в G в последовательности 5′-GAG GAGA, таким образом восстанавливая идеальную комплементарность, спасало транспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 до уровней дикого типа. . Напротив, восстановление комплементарности путем комбинирования мутации U в C в последовательности UCUCCUC с мутацией A в G в последовательности 3′-GAGGAGA не спасало транспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 .

Двухосновные мутации были разработаны на основе мутаций, идентифицированных во время первоначального 5′-скрининга, с сохранением кодонов (позволяющим тестирование в «родном» контексте Gal-Ty1) и поддержание содержания G / C во взаимодействующих последовательностях (фиг. 5A). Мутация UC в AG в последовательности UCUC CUC уменьшала транспозицию, как и мутация GA в CU в последовательности 5′-GAGGAGA (фиг. 5B). Однако та же мутация GA в CU в последовательности 3′-GAG GAGA не влияла на транспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 .Более того, объединение мутации UC в AG в последовательности UCUCCUC с мутацией GA в CU в последовательности 5′-GAGGAGA, таким образом восстанавливая идеальную комплементарность, спасало транспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 до уровней дикого типа. Эксперименты по анализу потенциальных взаимодействий с 3′-R-последовательностью пришли к совершенно разным выводам. (Рис. 5B). Восстановление комплементарности путем комбинирования мутации UC в AG в последовательности UCUCCUC с мутацией GA в CU в последовательности 3′-GAGGAGA не спасало транспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 .

Поскольку двухосновные мутации не являются изменениями по сравнению с аминокислотной последовательностью Gag, комбинации двухосновных мутации могут быть перенесены в полноразмерный элемент Ty1-m his3AI , содержащийся в донорской плазмиде pECB9C. Затем был протестирован фенотип транспозиции этих хелпер-независимых мутантных элементов Ty1-m his3AI . Полученные транспозиционные фенотипы мутантных полноразмерных элементов Ty1-m his3AI отражали фенотипы мутантных элементов mini-Ty1- HIS3 (рис.5, ср. Б и В). Только наличие полной обратной комплементарности между 5′-GAGGAGA и UCUCCUC последовательности привели к эффективной транспозиции. Более того, повышение температуры во время индукции и транспозиции Ty1, возможно дальнейшее снижение стабильности уже напряженных взаимодействий между мутантными последовательностями 5′-GAGGAGA и UCUCCUC, уменьшил частоту транспозиции еще больше (рис. 5C). Эти результаты показывают, что эти две последовательности должны взаимодействовать. во время ретротранспозиции.Является ли взаимодействие между последовательностями 5′-GAGGAGA и UCUCCUC внутримолекулярным или межмолекулярным. не рассматривается в вышеупомянутых экспериментах.

Взаимодействие мутировавшего 5′-GAGGAGA / UCUCCUC снижает продукцию кДНК

Восстановление транспозиции элементов Ty1-m his3AI с комбинированными компенсаторными мутациями в РНК Ty1 предполагает, что РНК Ty1 с мутациями в этих областях экспрессируются и хорошо упакован.Чтобы напрямую ответить на вопрос, экспрессируются ли мутантные РНК Ty1-m his3AI на том же уровне, что и РНК дикого типа, общую РНК выделяли из клеток, экспрессирующих элементы Ty1-m his3AI . РНК-блот-анализ показал, что стационарные уровни транскрипта Ty1-m his3AI относительно актина для мутантов 5′-GAGGAGA и UCUCCUC были несколько ниже, чем для РНК Ty1-m his3AI дикого типа, и компенсаторной двойной -мутантные уровни РНК были аналогичны дикому типу (рис.6А). При повышении температуры во время индукции и транспозиции Ty1, возможно, еще больше снижая стабильность уже напряженных взаимодействий между мутировавшие последовательности 5′-GAG GAGA и UCUCCUC снижали частоту транспозиции (рис. 5C), это не изменяло стационарное состояние уровни транскрипта Ty1-m his3AI относительно актина, которые сохранялись во время высокотемпературной индукции, хотя и на меньших уровнях по сравнению с индукции при более низкой температуре.Эти данные указывают на то, что мутантные транскрипты Ty1-m his3AI экспрессируются на уровнях, аналогичных РНК дикого типа, что позволяет предположить, что мутации влияют на посттранскрипционный шаг в транспозиции.

Чтобы выяснить, является ли дефект транспозиции мутантных элементов Ty1-m his3AI результатом измененной сборки / упаковки VLP, мы выделили VLP из клеток дикого типа, экспрессирующих элементы мутантного Ty1-m his3AI .Во время фракционирования градиентов, содержащих VLP, поглощение при 254 нм каждого градиента и содержание белка Gag. Выходы VLP и белка Gag, присутствующих во фракциях пиков, были почти идентичны для частицы, выделенные из клеток, содержащих элементы дикого типа и все протестированные мутантные Ty1-m his3AI элементы (фиг. 6B). Более того, VLP, выделенные из клеток, экспрессирующих мутантные элементы Ty1-m his3AI , содержали такие же уровни РНК Ty1-m his3AI , что и VLP, выделенные из клеток, экспрессирующих элемент Ty1-m his3AI дикого типа (рис.6С). Очевидно, что элементы Ty1-m his3AI дикого типа и мутантные элементы продуцируют сходные количества VLP. Эти VLP содержат одинаковые уровни РНК, что позволяет предположить, что мутантные РНК упакованы. эффективно.

Чтобы определить, завершилась ли обратная транскрипция мутантных элементов Ty1-m his3AI , мы измерили количество кДНК Ty1- HIS3 , продуцируемой в клетках после индукции экспрессии Ty1 (фиг. 6D).Интересно, что стабильные уровни продуцируемой кДНК относительно донорной плазмиды Ty1-m his3AI были значительно снижены всякий раз, когда нарушалась комплементарность последовательностей 5′-GAGGAGA и UCUC CUC. Восстановление полной комплементарности спасло выход кДНК до уровней дикого типа. Эти результаты явно параллельны транспонированию фенотипы, наблюдаемые для элементов дикого типа и мутанта Ty1-m his3AI . Эти данные вместе с данными о стационарной экспрессии убедительно свидетельствуют о том, что нарушение 5′-GAGGAGA и UCUCCUC взаимодействие влияет на транспозицию, ингибируя шаг (и) между сборкой VLP и завершением обратной транскрипции такие как формирование структуры Ty1 РНК, которая необходима для эффективной обратной транскрипции.

Внутри- или межмолекулярные взаимодействия?

Мы провели серию экспериментов, призванных проверить, наблюдаются ли взаимодействия между 5′-GAGGAGA и внутренним UCUCCUC. последовательности были внутри- или межмолекулярными (фиг. 7A). Для этого мы сначала использовали подход комплементации trans , в котором различные элементы Ty1- neo служат в качестве помощников для транспонирования элементов Ty1-m his3AI , и оценивается частота транспонирования различных элементов Ty1-m his3AI (Рис.7Б, жирная черная волнистая линия). Элемент Ty1-m his3AI , содержащий мутации в последовательностях 5′-GAGGAGA или UCUCCUC, плохо переносится даже в присутствии полноразмерного элемент Ty1- neo дикого типа (рис. 7B, светло-серые волнистые линии). Однако наличие компенсаторных мутаций в соответствующих положениях в полноразмерный элемент Ty1- neo должен спасать транспозицию мутантных элементов Ty1-m his3AI к частотам дикого типа, но только если компенсаторные мутации позволяют двум мутантным РНК взаимодействовать межмолекулярно.В частности, предполагается, что комбинации G и H демонстрируют повышенную транспозицию по сравнению с соответствующим одиночным мутантом. контролирует C и D, если межмолекулярные взаимодействия могут происходить свободно в этих экспериментальных условиях. Этого не наблюдалось (Рис. 7C), подтверждая идею о том, что эти последовательности взаимодействуют внутримолекулярно, что подтверждается эффективной транспозицией комбинации E.

Чтобы подтвердить, что отсутствие комплемента в trans не было связано с неравной экспрессией или смешиванием двух плазмид, мы использовали двойную систему mini-Ty1, в которой один донор плазмиду использовали для одновременной экспрессии пары инвертированных и дифференциально маркированных элементов mini-Ty1 (рис.8А). Транспонирование HIS3 -маркированного элемента mini-Ty1 (фиг. 8B, черные волнистые линии) анализировали при экспрессии в присутствии как дикого типа, так и мутантного элементы mini-Ty1- TRP1 (рис. 8Б, серые волнистые линии). Неспособность комбинированных мутантных последовательностей GAGGAGA и UCUCCUC восстановить транспозицию также было замечено при использовании этого подхода (рис. 8C).

ОБСУЖДЕНИЕ

Здесь мы сообщаем о разработке и использовании стратегии генетического скрининга, включающей мутагенез элементов mini-Ty1- HIS3 и последующего анализа их частоты транспозиции.Согласно этой стратегии, только мутации в цис -действующих последовательностях должны приводить к дефекту транспозиции, потому что все белки Ty1 поставляются в транс из вспомогательной плазмиды. Это разумное предположение подтвердилось на основании большого количества мутаций, которые отображались на известных цис- элементах, таких как GAL1 TATA-бокс, область PBS и PPT1, а также на отсутствии восстановления AUG и бессмысленных мутаций в усеченном GAG. Кодовая последовательность .

Мы генетически продемонстрировали, что взаимодействия внутри РНК Ty1, в частности, между последовательностями 5′-GAGGAGA и UCUCCUC, требуются для транспозиции Ty1.Как для модульного элемента mini-Ty1- HIS3 , так и для полноразмерного элемента Ty1 мы показали, что нуклеотидные изменения нарушают пары оснований Уотсона-Крика между эти две последовательности РНК Ty1 снижают транспозицию Ty1 в 10-20 раз. Компенсаторные мутации, восстанавливающие полную комплементарность между этими двумя последовательностями РНК Ty1 спасает транспозицию Ty1 до частот дикого типа. Более того, мутация 5′-ГАГГАГА и последовательности UCUCCUC незначительно снижали стационарные уровни РНК Ty1-m his3AI и, по-видимому, не ингибировали упаковку этих РНК в VLP, но снижали продукцию кДНК Ty1-m his3AI от трех до пяти раз.

Ретровирусы и предположительно ретротранспозоны упаковывают две копии своего генома РНК в частицы вириона нековалентной, многоступенчатый процесс, включающий димеризацию РНК. В общем, сайты инициации самокомплементарных димеров взаимодействуют межмолекулярно. с образованием комплекса петли поцелуя, который превращается в стабильный протяженный дуплекс за счет распространения межмолекулярного взаимодействия к соседним базам (Paillart et al.2004 г.). Классические сайты инициации димера, продемонстрированные для ретровирусов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и птиц, представляют собой короткие самокомплементарные последовательности. (Bieth et al. 1990; Darlix et al. 1992; Laughrea and Jette 1994; Skripkin et al. 1994; Clever et al. 1996; Fosse et al. 1996; Dirac et al. 2001; Lanchy and Lodmell 2002). Примечательно, что сайты инициации палиндромного димера в ВИЧ-1 обеспечивают точку зарождения для димеризации РНК, но дополнительные Известно, что последовательности РНК играют роль в димеризации РНК вириона (Clever et al.1996; Hill et al. 2003; Russell et al. 2003; Сакураги и др. 2003). Мутанты ВИЧ-1 с измененными сайтами инициации димеров также имеют дефекты переноса цепи во время обратной транскрипции (Paillart et al. 1996a; Shen et al. 2000). Для РНК MoMuLV две шпильки, которые образуют межмолекулярные взаимодействия, и две дополнительные петли-стержни, которые образуют межмолекулярные взаимодействия. Взаимодействия поцелуев и петель инициируют димеризацию, в то время как более длинные самокомплементарные последовательности, как полагают, стабилизируют димер. (Tounekti et al.1992; Оруджев и др. 1999; Ким и Тиноко 2000; Ли и Парслоу 2002). Между тем сайты инициации димера и подробные механизмы димеризации и упаковки РНК остаются малоизвестными. для большинства ретровирусов и ретротранспозонов.

Необходимое взаимодействие между последовательностями 5′-GAGGAGA и UCUCCUC может быть внутримолекулярным или межмолекулярным (рис. 7). Модели межмолекулярного взаимодействия привлекательны по нескольким причинам.(1) Геномная РНК в VLP Ty1, как сообщается, является димерной. (Фен и др., 2000). (2) Отсутствие классического мотива «петля поцелуев» (Clever et al. 1996; Laughrea and Jette 1996; Paillart et al. 1996b, 2004) около 5′-конца РНК Ty1 предполагает, что некоторая другая инициация димеризации сайт нужен. (3) Взаимодействие с парами оснований между этими двумя короткими последовательностями Ty1 РНК может позволить образование нековалентно связанных димеров. Однако наши эксперименты до настоящего времени не поддержали такую ​​межмолекулярную модель.Это могло быть потому, что мы не проводили эксперимент под подходящих экспериментальных условиях или, альтернативно, РНК Ty1 может образовывать блокированный димер посредством внутримолекулярного взаимодействия (рис. 7A). Также возможно, что структура РНК более высокого порядка, которая предпочтительно упакована в VLP, не в достаточной степени искалечен изменениями одного основания или другими, еще не охарактеризованными мутациями, идентифицированными во время нашей 5′-области экран может препятствовать образованию такой структуры.Потребуются дальнейшие исследования, чтобы четко определить «сигнал упаковки». для Ty1. Наши эксперименты предназначены для различения потенциальных внутри- и межмолекулярных взаимодействий GAGGAGA и Последовательности UCUCCUC явно подразумевают внутримолекулярное взаимодействие. Важно отметить, что наши эксперименты не исключить дополнительное межмолекулярное взаимодействие последовательностей GAGGAGA и UCUCCUC; например, может быть несколько конформации РНК, необходимые для осуществления транспозиции, которые включают как внутри-, так и межмолекулярные взаимодействия.

Внутримолекулярное взаимодействие между последовательностями 5′-GAG GAGA и UCUCCUC может функционировать во время обратной транскрипции, возможно для стабилизации предпочтительной структуры РНК. Для Ty1 клеточная тРНК _i ^Met , которая, вероятно, образует неотъемлемую часть этой структуры, удлиняется с помощью обратной транскриптазы (Chapman et al. 1992). Модель вторичной структуры РНК Ty1 1–440 с тРНК 1–75 клеток _i ^Met (рис.9) показывает возможную вторичную структуру, которая поддерживает внутримолекулярное взаимодействие между 5′-GAGGAGA и UCUCCUC. последовательности. Модель, которая представляет термодинамически наиболее стабильную структуру (Δ G = -139,7 ккал / моль), была создана с использованием программного обеспечения mfold 3.1 (Mathews et al. 1999; Zuker 2003). Примечательно, что включение 1–75 клеточной тРНК _i ^Met во время складывания увеличивает общую стабильность складок без изменения структуры наиболее стабильных складок, за исключением в ожидаемой PBS, поле 0, поле 1 и поле 2.1 (нуклеотиды 91–174) Ty1 РНК. Подобные вторичные конструкции, которые благоприятствуют взаимодействию последовательностей GAGGAGA и UCUCCUC, были получены, когда Ty1 РНК длиной 270–580 нуклеотидов были свернуты. Интересно, комплементарность между крайним 5′-концом и последовательностью 360–370 нуклеотидов в транскрипте ретротранспозона Tf1 была вовлечена при праймировании обратной транскрипции Tf1 (Левин, 1995). Он аналогичен по положению по сравнению с парой последовательностей, которые мы наблюдали, хотя последовательности Ty1 имеют длину всего 7 п.н., тогда как последовательности Tf1 имеют длину 11 п.н.И в Tf1 (Lin and Levin 1997), и в Ty1 (Fig. 9) может быть нарисована обширная сеть взаимодействий спаривания оснований, смежных с этими последовательностями. Возможно что эти взаимодействующие последовательности являются зародышами образования большой сложной структуры РНК, которая облегчает упаковку РНК и праймирование обратной транскрипции.

Обнаружение того, что специфические взаимодействия необходимы для эффективной димеризации, упаковки и обратной транскрипции нескольких LTR ретротранспозоны и ретровирусы предполагают общие механизмы множественных стадий репликации ретроэлементов.Дальнейшая структура и функциональные исследования необходимы для определения структурного сходства Ty1 РНК высшего порядка с другими ретроэлементами, особенно ретровирусы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и среды

В данном исследовании использовались штаммы JB740 ( MAT α his3 Δ 200 leu2 Δ 1 ura3-167 ) и yEB102C (JB740 с рад52 Δ :: нат MX4).Среды готовили, как описано (Sherman et al. 1986).

Плазмидные конструкции

Модульная донорная плазмида mini-Ty1- HIS3 , pECB3K, была создана путем замены фрагмента HpaI-NotI (4,8 т.п.н.) pJEF1262 (Monokian et al., 1994) геном HIS3 в транскрипционной ориентации, противоположной ориентации транскрипции. Элемент Ty1. Продукт ПЦР был получен путем амплификации гена HIS3 , содержащегося в pRB328, с использованием праймеров JB2285 (5′-ATAGAAGCGGCCGCGATCCTCTAGTA CACTCTATATTTTT-3 ‘) и JB2286 (5’-ACCTAAGTTAACG GCCGACCTAGGTGCAGCTTTAAATAATCGGTGTCA-3 ‘).Версия pECB3K m his3AI , pECB4B, была сконструирована аналогичным образом, за исключением того, что продукт ПЦР гена m his3AI был амплифицирован из pGTy1-h4-m his3AI (Curcio and Garfinkel 1991). Мутантная плазмида mini-Ty1- HIS3 , pECB5K1 (miniΔ), возникла в результате удаления критического фрагмента PvuII-HpaI (0,3 т.п.н.) (Xu and Boeke, 1987) pECB3K. Вспомогательная плазмида pECB2B2 была сконструирована путем удаления фрагмента BglII-NcoI (0,5 т.п.н.) из 2μ LEU2 основной цепи pGal-Ty1-h4, pX87 (H.Xu and J. Boeke, неопубликовано), чтобы удалить последовательность PPT1 и весь 3′-LTR и заменить фрагмент XhoI-Hind III (4,4 т.п.н.) с фрагментом pKC66 (Chapman et al. 1992), который содержит многократно мутированную последовательность PBS. Эти модификации делают вспомогательный элемент Ty1 неспособным транспонировать, позволяя сверхэкспрессию белка Ty1. Полноразмерная плазмида Ty1-m his3AI , pECB9C, была получена путем вставки фрагмента EagI (1,0 т.п.н.) pECB4B, содержащего ген m his3AI , в сайт NotI pJEF1262.Двойная плазмида mini-Ty1 была сконструирована путем вставки элемента mini-Ty1- TRP1 (2,7 т.п.н.), амплифицированного с помощью ПЦР из pJEF1202 (Xu and Boeke, 1990), в сайт SalI плазмиды pECB3K. Мутантные плазмиды были сконструированы таким же образом.

Мутации с заменой одного и двух оснований были сделаны во фрагменте XhoI-HpaI (0,6 т.п.н.) или фрагменте NotI-BamHI (0,6 т.п.н.) pECB3K посредством сайт-направленного мутагенеза каждого фрагмента в скелете вектора pBluescript II SK (Stratagene).Мутации были проверяется секвенированием всего фрагмента. Затем мутантные фрагменты возвращали в вектор pECB3K. Смена двойной базы мутации были введены в полноразмерный вектор Ty1-m his3AI , pECB9C, путем замены HpaI-NotI (0,9 т.п.н.) фрагмента pECB3K на HpaI-NotI (4,8 т.п.н.) фрагмент pECB9C. В полноразмерные Ty1-m his3AI элементы основной цепи 2μ URA3 pGal-Ty1-h4-m his3AI , pECB9C и производные с заменой двух оснований были преобразованы в основную цепь 2μ LEU2 pGal-Ty1- h4- neo , pECB332A и производные с заменой двух оснований.Сначала фрагмент производных pECB9C KpnI-BamHI (3.6 kb, m his3AI ) был заменен на KpnI-BamHI (3.6 kb, neo ген) фрагментом pJEF1105 (Boeke et al. 1988b), а затем фрагмент AatII-NcoI (6,6 т.п.н., pGal-Ty1) 2μ LEU2 основной цепи pGal-Ty1-h4, pX87 (H. Xu и J. Boeke, неопубликовано) был заменен на AatII-NcoI (7,6 т.п.н. , pGal-Ty1- neo ) полученных конструкций pGal-Ty1-h4- neo основной цепи 2μ URA3 .

Мутагенная полимеразная цепная реакция (ПЦР) и репарация разорванной плазмиды

Мутагенная амплификация областей XhoI-HpaI и NotI-BamHI pECB3K с ~ 200 п.н. фланкирующей последовательности на каждом конце были выполнены с использованием праймеров JB2456 (5′-GCCCCACAAAC CTTCAAATG-3 ‘) с JB2457 (5′-CTAGCAGAATTACCCTC CAC-3′) и JB2460 (5’-GCTCTGTCATCTTTGCCTTC3 ‘) с JB2642 (5’-GCCGCCGCAAGGAATGGTG-3 ‘) соответственно.Всего 96 мутагенных ПЦР-реакций (по 50 мкл каждая) содержали 1,5 мМ MgCl ₂ , 100 мкМ MnCl ₂ , 100 мкМ dNTP, 13 нг pECB3K, 0,2 мМ каждого праймера и 2,5 единицы ДНК-полимеразы AmpliTaq (Roche Молекулярные биохимические вещества). Реакции проводили в приборе для ПЦР Perkin-Elmer 9600 (PerkinElmer), используя следующий метод: 95 ° C в течение 5 минут, 95 ° C. в течение 1 минуты, 53 ° C в течение 1 минуты, 72 ° C в течение 1 минуты (30 циклов) и заключительное 5-минутное удлинение при 72 ° C. Вышеуказанные условия были найдены для создания 1 неправильного включения на каждые 800 п.н. полимеризованного или ~ 1 неправильного включения на продукт ПЦР.Частота мутации была определена. путем секвенирования мутагенизированной 5′-области модульных плазмид-доноров mini-Ty1- HIS3 , выделенных из шести дрожжевых колоний, которые не были транспозиционно-дефицитными. Неожиданно те же условия ПЦР привело к гораздо более высокой частоте мутаций во время мутагенеза 3′-области. Мы твердо уверены, что частота расхождения возникли в результате неправильной калибровки ПЦР-машины во время 3′-мутагенного скрининга.Мы добавили по 10 единиц DpnI в каждую Реакция ПЦР, и реакции инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов, затем при 80 ° C в течение 20 минут для расщепления матрицы pECB3K. К максимальное разнообразие продуктов, группы из восьми реакций ПЦР были объединены в 12 пулов, каждый впоследствии подвергнутый обработке фенолом / хлороформом экстракция и осаждение этанолом. Затем мутагенизированные продукты ПЦР разбавляли ТЕ (10 мМ Трис-HCl при pH 8 и 1 мМ EDTA) до конечной концентрации 60 нг / мкл.

Gapped модульные mini-Ty1- HIS3 Донорные плазмиды были созданы путем расщепления pECB3K либо XhoI и HpaI (мутагенез 5′-конца), либо NotI и BamHI (3′-конец мутагенез). Дайджесты подвергали экстракции фенолом / хлороформом и осаждению этанолом. Осадки нуклеиновых кислот были затем разбавили ТЕ до конечной концентрации 100 нг / мкл.

Анализы трансформации и транспозиции

Мутагенизированные продукты ПЦР (300 нг) и плазмида mini-Ty1- HIS3 (100 нг) с пробелами были котрансформированы при мольном соотношении 33: 1 соответственно в штамм дрожжей JB740, уже содержащий вспомогательная плазмида pECB2B2.Дрожжевые трансформанты, содержащие модульную минидонорную плазмиду Ty1- HIS3 с репарированными пробелами (2μ URA3 каркаса) и вспомогательную плазмиду (2μ LEU2 каркас) выращивали на среде SC без гистидина, лейцина и урацила (SC-His -Leu-Ura) с 2% глюкозы. Через 3 дня при 30 ° C, Колонии дрожжей реплицировали на SC-His-Leu-Ura с 2% глицерином / этанолом и инкубировали при 30 ° C в течение 3 дней для ингибирования рост маленьких колоний. Колонии дрожжей помещали в реплики на SC-His-Leu-Ura с 2% галактозой и инкубировали при 22 ° C в течение 3 дня, чтобы вызвать экспрессию и транспозицию Ty1.Плазмиды Ty1 перетасовывались путем роста на YPD при 30 ° C в течение ночи с последующим перемешиванием. путем роста на SC-His, содержащем 1 г / л 5-фтороротовой кислоты (5-FOA) (Boeke et al. 1984) с 2% глюкозы при 30 ° C в течение 2 дней (селективный рост для клеток, содержащих транспонированную копию модульного мини Ty1- HIS3 ).

Дополнительные анализы транспозиции, выполненные на трансформантах, содержащих модульный донор mini-Ty1- HIS3 или производные и вспомогательные плазмиды, выполняли, как описано ранее, за исключением участков или пятен клеток. После нанесения реплики планшет глицерин / этанол был исключен, а индукция экспрессии и транспозиции Ty1 с 2% галактозой составляло 3 дня (штамм JB740) или 4 дня (штамм yEB102C).Транспозицию Ty1- HIS3 оценивали качественно, и планшеты SC-His + 5-FOA фотографировали.

Дрожжевые трансформанты, содержащие донорскую плазмиду Ty1-m his3AI (2 мкм URA3 основной цепи), pECB9C или производные, наносили на SC-Ura с 2% глюкозы. Через 2 дня при 30 ° C были нанесены копии дрожжевых пятен. в аналогичную среду с 2% галактозы и инкубировали при 22 ° C или 30 ° C в течение 1,5 дней. Донорская плазмида Ty1 была затем перетасована рост на YPD при 30 ° C в течение ночи с последующим ростом на SC-His + 5-FOA с 2% глюкозой при 30 ° C в течение 2 дней (селективный рост клеток содержащий транспонированную копию Ty1-m his3AI ).Транспозицию Ty1-m his3AI первоначально анализировали качественно, и планшеты SC-His + 5-FOA фотографировали. Частоты транспозиции были определено по крайней мере для трех независимых трансформантов путем соскабливания клеток с пятен на чашках YPD в стерильную воду, посев различные разведения на чашках SC + 5-FOA и SC-His + 5-FOA с последующим подсчетом колоний.

Дрожжевые трансформанты, содержащие различные комбинации донорной плазмиды Ty1-m his3I (2μ URA3 каркаса), pECB9C или производных с заменой двух оснований и донорной плазмиды Ty1- neo (2μ LEU2 каркаса), pECB332A, или производные с заменой двух оснований, наносили на SC-Ura с 2% глюкозы.Через 2 дня при 30 ° C дрожжи Пятна реплицировали на аналогичную среду с 2% галактозой и инкубировали при 22 ° C или 30 ° C в течение 2 дней (штамм JB740) или 3 дней. (штамм yEB102C). Затем донорные плазмиды Ty1 перетасовывались, как описано выше. Планшеты SC-His + 5-FOA фотографировали, и частоты транспозиции Ty1-m his3AI определяли, как описано выше.

Дрожжевые трансформанты, содержащие двойную донорскую плазмиду mini-Ty1 (2 мкм URA3 каркаса) и вспомогательную плазмиду (2 мкм LEU2 каркас) наносили на SC-Ura-Leu с 2% глюкозы.Через 3 дня при 30 ° C дрожжевые пятна реплицировали на SC-Ura-Leu. с 2% глюкозы или 2% галактозы и инкубировали при 22 ° C в течение 4–10 дней. Обе плазмиды затем перетасовывались путем нанесения реплик. на среду YPD и рост при 30 ° C в течение 2 дней с последующим отбором на SC-His + 5-FOA при 30 ° C в течение 3 дней. Планшеты SC-His + 5-FOA были сфотографировано и частоты транспозиции Ty1- HIS3 определены, как описано выше.

Дополнительный скрининг первичных мутантов

Во время скрининга 5′-области стало очевидно, что многие из наших первичных изолятов с дефицитом транспозиции были мутантными. по менее интересным причинам.Пластыри повторно тестировали на транспозицию, как описано выше. Для 5′- и 3′-области первичной мутанты, 15% и 30%, соответственно, мутантов транспонировались лучше, чем miniΔ при повторном тестировании; от них отказались. Общий рост мутантных колоний также отслеживался во время повторного тестирования транспозиции, и медленно выращиваемые растения (относительно немного) были исключены из дальнейшего анализа. Сегрегацию или способность клеток терять модульную донорскую плазмиду mini-Ty1- HIS3 тестировали путем роста на YPD в течение ночи с последующим ростом на среде с глюкозой SC + 5-FOA.Примерно 5% 5′-области и 4% первичных мутантов по 3′-области не смогли потерять модульную плазмиду-донор mini-Ty1- HIS3 . Известно, что геномная интеграция модульной донорной плазмиды mini-Ty1- HIS3 предотвращает рост 5-FOA. Следовательно, эти первичные мутанты больше не исследовались.

Было обнаружено, что значительная часть (37%) первичных мутантов 5′-области приобрела многократно мутировавший PBS помощника, Таким образом, мы разработали анализ ПЦР колоний для идентификации и исключения этого класса мутантов.Используя праймеры JB3098 (5′-AATTCT CATGGGTCGGCG-3 ‘) и JB3099 (5′-GCCATAAGAGAAGC CACC-3′), мы проверили наличие продукта ПЦР размером 0,6 т.п.н., который при строгом отжиге температура (54 ° C) может быть получена только в том случае, если 3′-конец JB3098 отожжен с многократно мутированной последовательностью PBS (подчеркнутый основания в JB3098 комплементарны мутировавшему PBS). К счастью, только 2% первичных мутантов 3′-области приобрели помощник PBS. Это резкое различие между 5′- и 3′-областями, вероятно, было связано с обширной гомологией выше по течению. 5’-область, разделяемая модульной плазмидой-донором mini-Ty1- HIS3 и вспомогательной плазмидой, в то время как между двумя плазмидами рядом с 3′-областью такой гомологии не существовало.

Спасение донорской плазмиды и секвенирование

Дрожжевые колонии, содержащие модульные мини-Ty1- HIS3 донорскую и вспомогательную плазмиды, были исправлены и пассированы два-три раза на планшетах SC-His-Ura с 2% глюкозы, чтобы позволить клетки теряют вспомогательную плазмиду. Модульные донорные плазмиды mini-Ty1- HIS3 были выделены в Escherichia coli путем выделения тотальной ДНК из дрожжевых пятен с использованием фенольного метода стеклянных шариков (Kaiser et al.1994) с последующей трансформацией химически компетентных бактерий JBe181 и селекцией на среде M9 без урацила. Мутации в модульных мини-Ty1- донорских плазмидах HIS3 картировали путем секвенирования с использованием тех же праймеров, которые использовались для создания мутагенизированных продуктов ПЦР (JB2456 и JB2457 или JB2460 и JB2642).

Выделение РНК и блот-анализ

Суммарная РНК была выделена из 10 мл культур дрожжей (штамм JB740), содержащих pECB9C или производные, выращенные в YNB с добавлением с 2% казаминокислот и 1% рафинозы при 22 ° C или 30 ° C в течение ~ 6 часов.Глюкоза (подавляет) или галактозу (индуцирует экспрессию pGal-Ty1 и транспозиция) до 2% и культуры выращивали при 22 ° C в течение 24–34 ч. Тотальную РНК экстрагировали горячим кислым фенолом. (Collart and Oliviero 1993) и фракционировали денатурирующим гель-электрофорезом, как описано ниже. Для количественного определения РНК ACT1 и Ty1-m his3AI 20 мкг общей РНК денатурировали нагреванием в буфере для образцов (55% деионизированный формамид, буфер MOPS при pH 7.0,5% формальдегида, 8 мМ ЭДТА и 0,1% бромфенолового синего) перед электрофорезом в 1% агарозных гелях, содержащих буфер MOPS (pH 7,0) (40 мМ MOPS, 10 мМ ацетата натрия и 1 мМ ЭДТА) и 2% формальдегида. РНК переносилась капиллярно и фиксировалась УФ-сшивкой. к фильтрам Gene Screen Plus, как описано производителем (NEN Life Science Products). Связанные с мембраной РНК были гибридизированы. к ACT1 -специфичный (1.BamHI-HindIII фрагмент pΔ10-AHX3 размером 2 т.п.н. (Chapman and Boeke 1991) и HIS3 -специфические (0,5 т.п.н. KpnI-фрагмент pECB4B) ДНК-зонды, которые были внутренне помечены и очищены на спин-колонках G25 Sephadex. Фильтры экспонировались на экране Molecular Dynamics PhosphorImager. Количественная оценка относительных устойчивых транскриптов (соотношение Ty1-m his3AI / ACT1 ) было выполнено с использованием системы визуализации Storm с ImageQuant v1.11 (Molecular Dynamics) и программным обеспечением Microsoft Excel.

Выделение и анализ VLP

Клетки дрожжей (штамм JB740), несущие pECB9C или производные, выращивали в 2% галактозе при 22 ° C в течение ~ 24 часов, как описано ранее. (Эйхингер и Бёке, 1988). Осадки клеток (4 г) из этих 0,5-литровых культур ресуспендировали в 5 мл буфера B / EDTA, и VLP выделяли, как описано (Эйхингер и Бёке, 1988). Во время фракционирования градиентов VLP фракции контролировали по их оптической плотности при 254 нм.РНК была выделена из VLP, как описано (Fu and Rein 1993), и 5% обработанной ДНКазой РНК, выделенной из различных образцов VLP, фракционировали денатурирующим гель-электрофорезом. и проанализировали, как описано выше.

анализ кДНК

дрожжевых газонов (штамм JB740), трансформированных векторами на основе pECB9C, соскребали с планшетов SC-Ura с 2% глюкозы и ресуспендировали. в 10 мл среды YNB, содержащей 2% казаминовых кислот и 1% рафинозы.Клетки выращивали при 30 ° C в течение ~ 6 ч, чтобы исчерпать оставшиеся глюкоза. Затем добавляли 2% галактозы и инкубировали культуры при 22 или 30 ° C в течение 24–34 часов. Клетки собирали как описан (Lawler et al. 2001), и геномная ДНК была выделена (Boeke et al. 1985) из 11 мл культур и затем обработана AflII. Фрагменты ДНК фракционировали электрофорезом в агарозном геле и переносили к фильтрам Gene Screen Plus (NEN Life Science Products).Гибридизацию измеряли с использованием Molecular Dynamics PhosphorImager. Отношение HIS3 -специфической гибридизации для фрагмента кДНК Ty1 (2,2 т.п.н.) к таковому для фрагмента pECB9C (14,3 т.п.н.) обеспечило меру относительного количества кДНК Ty1.

РИСУНОК 1.

Модульная система транспозиции mini-Ty1.( A ) Структуры модульных мини-Ty1- HIS3 донорных и вспомогательных плазмид. Часть U3 5′-LTR (промотора Ty1) была заменена индуцибельным промотором GAL1 (полосатый прямоугольник). Последовательность 2μ содержит ориджин репликации дрожжей. Последовательности pBR322 обозначены линиями, а прямоугольники указывают последовательности дрожжей. Маркерный ген HIS3 имеет транскрипционную ориентацию, противоположную элементу mini-Ty1. Обратите внимание, что вспомогательная плазмида не имеет функциональный PBS, а также PPT и 3′-LTR, поэтому он не может быть подвергнут обратной транскрипции или транспонированию. GAG и POL относятся к двум ORF элемента Ty1. ( B ) Транспозиция различных комбинаций элементов mini-Ty1 (mini) и вспомогательных конструкций (хелперов) в окрашиваниях дикого типа ( RAD52 ) и rad52 Δ. Фрагмент PvuII-HpaI элемента mini-Ty1 удален в конструкции miniΔ, pECB5K1, и конструкции helperΔ, p425 GAL1 (Mumberg et al. 1995) полностью лишен кодирующей последовательности Ty1.

РИСУНОК 2.

Сводка по транспозиционно-дефицитным элементам mini-Ty1- HIS3 с одной или двумя мутациями. ( A ) Мутации, идентифицированные в 5′-области. Последовательности, необходимые для событий прайминга во время обратной транскрипции, которые включают указаны PBS, поле 0, поле 1 и поле 2.1. Вертикальные черные полосы указывают положение однонуклеотидных мутаций. в мутагенизированной области элемента mini-Ty1- HIS3 .Высота вертикальных столбцов указывает, сколько раз мутация в этом нуклеотидном положении происходила независимо друг от друга. изолированные. (*) Два кластера мутаций были в регионах, о которых ранее не было известно, что они необходимы для транспозиции. ( B ) Краткое изложение транспозиционно-дефицитных элементов mini-Ty1- HIS3 с одной-двумя мутациями в 3′-области. Последовательности, необходимые для прайминга во время обратной транскрипции, как PPT1, указаны.Для сравнения показаны выровненные последовательности PPT1, PPT2 и фланкирующие последовательности. Ранее выявленные мутации в PPT1, которые отменяют транспозицию (Wilhelm et al. 1999), обозначены маленьким белым шрифтом на черных прямоугольниках. Последовательность крупным серым шрифтом указывает на одноосновные мутации на транспозиционно-дефицитной Элемент mini-Ty1- HIS3 во время оригинального 3′-зонного экрана. Основания мелким серым шрифтом обозначают мутантные нуклеотиды, идентифицированные в положении мутации.

РИСУНОК 3.

Подтвержденные мутации, снижающие ретротранспозицию элемента mini-Ty1- HIS3 . ( A ) Краткое изложение субклонированных однонуклеотидных изменений в 5′-области элемента mini-Ty1- HIS3 и их влияния на транспозицию. Вертикальные оранжевые полосы обозначают позиции одноосновных мутаций, которые уменьшили транспонирование, а мутации, не повлиявшие на транспозицию, обозначены синими полосами.Последовательности в скобках обозначают 5′-область. представляющие интерес последовательности, такие как область PBS, предполагаемая область димеризации и упаковки (D / P) и области 5′-R и U5, все это необходимо для транспонирования. (*) Два кластера мутаций не требовались для транспозиции. ( B ) Изменения позиций одиночных нуклеотидов в областях 5′-U5 и PBS и их влияние на транспозицию. Изменено из исходная предсказанная вторичная структура РНК Ty1 (черные буквы) с комплексом тРНК дрожжевого инициатора _i ^Met (белые буквы на черном фоне) (Friant et al.1996). Оранжевые кружки указывают на мутировавшие основания, которые уменьшили транспозицию, в то время как мутации, которые не повлияли на транспозицию, обведено синим. Соответствующие мутантные основания обозначены оранжевым или синим шрифтом.

РИСУНОК 4.

Сводка мутаций в областях 5′-GAGGAGA, 5′-UCUC CUC и 3′-GAGGAGA, которые снижали транспозицию mini-Ty1- HIS3 .Последовательность, выделенная крупным серым шрифтом, указывает на одноосновные мутации в элементе mini-Ty1- HIS3 с дефицитом транспозиции, выделенном во время первоначального скрининга 5′- и 3′-областей. Нуклеотиды большого оранжевого цвета обозначают субклонированные одноосновные мутации, которые были повторно протестированы и продемонстрировали снижение транспозиции. Основания мелким серым или оранжевым шрифтом обозначают мутант. нуклеотиды, идентифицированные в позиции мутации. (*) Два кластера мутаций ранее не требовались. для транспозиции.

РИСУНОК 5.

Спаривание оснований между двумя последовательностями Ty1 около 5′-конца РНК требуется для эффективной транспозиции. ( A ) Рисунок, показывающий положения мутантных последовательностей Ty1. Экспрессированные РНК Ty1 (черные волнистые линии), содержащие комбинации одноосновных (черные буквы в рамке на белом фоне) или двухосновных (белые буквы в рамке на черном фоне) мутаций (позиции обозначены черным X).(R) последовательности находятся в повторяющейся области РНК; (*) обозначает расположение последовательности UCUCCUC ниже сайта PvuII в элементе Ty1. Транспозиция ( B ) модульных mini-Ty1- HIS3 и ( C ) полноразмерных Ty1-m his3AI элементов, содержащих комбинации мутаций, которые были встроены в последовательность UCUCCUC, а также обратно комплементарные последовательности (GAGGAGA) в R-областях, расположенных на концах РНК Ty1.Транспозицию оценивали при подавлении (глюкоза среда) и индуцирующие (среда галактозы) условия при указанных температурах. Конструкции miniΔ, pECB5K1 и RT-, pGTy1-h4-m his3AI DD-DE (Uzun and Gabriel 2001) содержат элементы Ty1 с дефицитом транспозиции. Частоты транспозиции из отдельно выполненных количественных Анализы транспозиции указаны как процент дикого типа белыми буквами.

РИСУНОК 6.

Характеристика Ty1 РНК, VLP и кДНК, полученных из мутантных полноразмерных Ty1-m his3AI элементов. ( A ) РНК-блот, сравнивающий уровни стационарной экспрессии дикого типа (Wt) и мутантного Ty1-m his3AI элементов (двухосновные мутанты C – I с фиг. 5). ACT1 гибридизацию использовали в качестве контроля загрузки. Уровни РНК определяли в условиях репрессии (-, глюкозная среда) и индукции (+, галактозная среда) при указанных температурах.( B , верхние панели ) Графическое изображение пиков VLP, выделенных из клеток, экспрессирующих производные дикого типа (Wt) и мутант Ty1-m his3AI (двухосновные мутанты C – E на фиг. 5). Фракционирование градиентов VLP контролировали по оптической плотности при 254 нм. Во многих подобных экспериментах пики VLP отсутствуют для клеток, лишенных элемента pGTy1 или выращенных в условиях репрессии Ty1-m his3AI . ( B , нижняя панель ) Иммуноблоттинг фракций пика VLP-содержащих градиентов с использованием антитела против Gag.Иммуноблоттинг выполнялся как описан (Bolton et al. 2002). Указано количество белка Gag, обнаруженного для мутанта, по сравнению с VLP дикого типа. ( C ) РНК-блот, сравнивающий his3 AI-меченую РНК Ty1, выделенную из VLP, продуцируемых элементами дикого типа (Wt) и мутантным Ty1-m his3AI . Тотальную РНК, выделенную из клеток, экспрессирующих элемент Ty1-m his3AI дикого типа, использовали в качестве контроля для специфической упаковки РНК Ty1-m his3AI . ACT1 и his3AI сигналы гибридизации, обнаруженные в образце тотальной РНК, отсутствуют в образцах РНК, выделенных из различных VLP. ( D ) Производство кДНК Ty1, меченной HIS3 , в клетках, экспрессирующих элементы Ty1-m his3AI . Зонд HIS3 гибридизировался с кДНК Ty1, а также с донорной плазмидой pGTy1-h4, меченной his3 AI (внутренний контроль загрузки). Продукция кДНК Ty1 оценивалась при репрессии (-, глюкоза среда) и индуцирующие (+, среда галактозы) условия при 22 ° C.Аналогичные результаты наблюдались для продукции кДНК Ty1 при 30 ° C.

РИСУНОК 7.

Внутри- или межмолекулярные взаимодействия? ( A ) Предлагаемые модели функционального взаимодействия между 5′-последовательностями РНК Ty1. Черные волнистые линии представляют РНК Ty1 (точка на 3′-конце), а серые пунктирные линии указывают взаимодействия при спаривании оснований между последовательностями 5′-GAGGAGA и UCUCCUC.( B ) Анализ внутри- или межмолекулярных взаимодействий с использованием считывания Ty1 с меткой his3AI в сочетании с различными элементами Ty1- neo , экспрессируемыми из отдельной плазмиды. Подробности см. В тексте. ( C ) Транспозиция полноразмерного мутанта дикого типа (комбинация A) или двухосновного мутанта (комбинации C – I) Ty1-m his3AI элементов (нижние черные волнистые линии) в комбинации с элементами дикого типа (комбинации A –E) или двухосновный мутант (комбинации F – I) Элементы Ty1- neo (верхние серые волнистые линии).Транспозицию оценивали при репрессии (среда с глюкозой) и индукции (среда с галактозой). условия при указанных температурах. Частоты транспозиции элементов Ty1-m his3AI из отдельно выполненных количественных анализов транспозиции указаны как процентные доли элементов дикого типа / дикого типа. (комбинация A) белыми буквами.

РИСУНОК 8.

Внутри- или межмолекулярные взаимодействия с использованием модульной системы транспозиции mini-Ty1? ( A ) Структура модульной двойной донорной плазмиды mini-Ty1- HIS3 TRP1 . Как показано на фиг. 1, указаны индуцибельный промотор GAL1 (полосатая рамка), последовательности pBR322 (черные линии) и дрожжевые последовательности (прямоугольники). Маркерные гены HIS3 и TRP1 имеют противоположную транскрипционную ориентацию, как их мини-Ty1 элемент.Вспомогательная плазмида, показанная на фиг. 1A также присутствовал в клетках, чтобы поставлять белки Ty1 в trans . ( B ) Анализ межмолекулярных взаимодействий с использованием считывания Ty1 с меткой HIS3 (черные волнистые линии) в сочетании с различными элементами Ty1- TRP1 (серые волнистые линии), экспрессируемыми из той же плазмиды. Подробности см. В тексте. ( C ) Транспозиция полноразмерных элементов дикого типа (комбинация A) или двухосновных мутантов (комбинации C и H) mini-Ty1- HIS3 элементов (нижние черные волнистые линии) в комбинации с элементами дикого типа (комбинации A и C) или двухосновный мутант (комбинация H) элементы mini-Ty1- TRP1 (верхние серые волнистые линии).Транспозицию оценивали при репрессии (среда с глюкозой) и индукции (среда с галактозой). условия. Частоты транспозиции элементов mini-Ty1- HIS3 из отдельно выполненных количественных анализов транспозиции указаны как процент дикого типа / дикого типа. (комбинация А).

РИСУНОК 9.

Предложенная модель вторичной структуры РНК Ty1. Модель была построена с использованием программы mfold версии 3.1 (http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna) (Mathews et al. 1999; Zuker 2003) и представляет собой наиболее стабильную вторичную структуру, возвращенную для РНК Ty1 1–440 и тРНК 1–75 клеток _i ^Met (Δ G = −139,7 ккал / моль), что также согласуется с анализом мутагенеза (см. Результаты). Клеточная тРНК _i ^Met (серые линии) была свернута с РНК Ty1 (черные линии) и показана взаимодействующей с PBS (нуклеотиды 95–104), поле 0 (нуклеотиды 110–116), блок 1 (нуклеотиды 144–149) и блок 2.1 (нуклеотиды 162–168). Короткие черные линии обозначают Уотсон-Крика. пары оснований, а закрашенные черные кружки представляют пары оснований G: U. Предлагаемое внутримолекулярное взаимодействие между 5′-ГАГГАГА (нуклеотиды 1–7) и UCUCCUC (нуклеотиды 264–270) и положения однонуклеотидных изменений в 1–440 Показаны Ty1 РНК и их влияние на транспозицию. Заполненные оранжевые кружки обозначают мутировавшие основания, которые уменьшили транспозицию, в то время как мутации, которые не повлияли на транспозицию, отмечены синим цветом.Синие круги с черной заливкой представляют собой мутировавшие основания, в которых пара оснований A: U была заменена парой оснований G: U.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Бёке за полезные обсуждения и реагенты, особенно Энн Норрис. Мы также благодарим Анджели Повешен за техническую поддержку во время мутагенеза и скрининга 3′-области и Донг Шен за помощь в конструировании плазмиды.Эта работа была поддержана грантом NIH RO1 GM36481, предоставленным J.B.

ССЫЛКИ

1. ↵

   Белкорт, М.Ф. и Farabaugh, P.J. 1990. Рибосомный сдвиг рамки в дрожжевом ретротранспозоне Ty: тРНК индуцируют проскальзывание на минимальном сайте из 7 нуклеотидов. Ячейка 62 : 339–352.

2. ↵

   Bieth, E., Gabus, C., and Darlix, J.L. 1990. Исследование образования димера РНК вируса саркомы Рауса и его влияния на синтез вирусного белка in vitro. Nucleic Acids Res. 18 : 119–127.

3. ↵

   Боке, Дж. Д. и Стоу, Дж. П. 1997. Ретротранспозоны, эндогенные ретровирусы и эволюция ретроэлементов. В ретровирусов (ред.Х. Вармус), стр. 343–435. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.

4. ↵

   Boeke, J.D., LaCroute, F., and Fink, G.R. 1984. Положительный отбор мутантов, лишенных активности оротидин-5′-фосфатдекарбоксилазы в дрожжах: устойчивость к 5-фтороротовой кислоте. Mol Gen Genet 197 : 345–346.

5. ↵

   Boeke, J.D., Garfinkel, D.J., Styles, C.A., and Fink, G.R. 1985. Элементы Ty переносятся через промежуточную РНК. Ячейка 40, : , 491–500.

6. ↵

   Boeke, J.D., Eichinger, D., Кастрильон Д., Финк Г. 1988a. Геном Saccharomyces cerevisiae содержит функциональные и нефункциональные копии транспозона Ty1. Мол. Клетка. Биол. 8 : 1432–1442.

7. ↵

   Boeke, J.D., Xu, H., and Fink, G.R. 1988b. Общий метод хромосомной амплификации генов дрожжей. Наука 239 : 280–282.

8. ↵

   Bolton, E.C., Mildvan, A.S. и Boeke, J.D. 2002. Ингибирование обратной транскрипции in vivo за счет повышенной концентрации ионов марганца. Мол. Cell 9 : 879–889.

9. ↵

   Брахманн, Р.K., Yu, K., Eby, Y., Pavletich, N.P., и Boeke, J.D. 1998. Генетический отбор внутригенных супрессорных мутаций, которые обращают действие общих мутаций рака p53. EMBO J. 17 : 1847–1859.

10. ↵

    Брайтерман, Л. и Boeke, J.D. 1994. Интеграция Ty1 in vitro: эффекты мутаций в цис и транс. Мол.Клетка. Биол. 14 : 5731–5740.

11. ↵

    Chapman, K.B. и Boeke, J.D. 1991. Выделение и характеристика гена, кодирующего фермент разветвления дрожжей. Ячейка 65, : 483–492.

12. ↵

    Чепмен, К.B., Byström, A.S. и Boeke, J.D. 1992. Инициатор метиониновая тРНК важна для транспозиции Ty1 в дрожжах. Proc. Natl. Акад. Sci. 89 : 3236–3240.

13. ↵

    Клевер, Дж. Л., Вонг, М. Л., и Парслоу, Т. Г. 1996. Требования к димеризации РНК вируса иммунодефицита человека, опосредованной поцелуем петлей. J. Virol. 70 : 5902–5908.

14. ↵

    Колларт М.А. и Оливьеро С. 1993. Получение дрожжевой РНК. В «Текущие протоколы молекулярной биологии» (ред. Ф. М. Аусубель и др.), Стр. 13.12.11–13.12.15. Джон Вили, Нью-Йорк.

15. ↵

    Курчо, М.Дж. И Гарфинкель Д. 1991. Пошаговый отбор для ретротранспозиции элемента Ty1. Proc. Natl. Акад. Sci. 88 : 936–940.

16. ↵

    Darlix, J.L., Gabus, C., and Allain, B. 1992. Аналитическое исследование димерной РНК вируса ретикулоэндотелиоза птиц, полученной in vivo и in vitro. J. Virol. 66 : 7245–7252.

17. ↵

    Дирак, А.M., Huthoff, H., Kjems, J. и Berkhout, B. 2001. Шпилька сайта инициации димера опосредует димеризацию вируса иммунодефицита человека, генома РНК типа 2. J. Biol. Chem. 276 : 32345–32352.

18. ↵

    Эйхингер, Д.Дж. и Boeke, J.D. 1988. Промежуточное соединение ДНК при транспозиции дрожжевого элемента Ty1 соединяется с вирусоподобными частицами: бесклеточная транспозиция Ty1.Ячейка 54, : 955–966.

19. ↵

    Feng, Y.X., Moore, S.P., Garfinkel, D.J., and Rein, A. 2000. Геномная РНК в вирусоподобных частицах Ty1 является димерной. J. Virol. 74 : 10819–10821.

20. ↵

    Фоссе, П., Motte, N., Roumier, A., Gabus, C., Muriaux, D., Darlix, J.L., and Paoletti, J. 1996. Короткая автокомплементарная последовательность играет важную роль в димеризации РНК вируса саркомалейкоза птиц. Биохимия 35 : 16601–16609.

21. ↵

    Friant, S., Heyman, T., Wilhelm, M.L., and Wilhelm, F.X. 1996. Расширенные взаимодействия между праймерной тРНК _i ^Met и геномной РНК дрожжевого ретротранспозона Ty1.Nucleic Acids Res. 24 : 441–449.

22. ↵

    Friant, S., Heyman, T., Bystrom, A.S., Wilhelm, M., and Wilhelm, F.X. 1998. Взаимодействия между РНК ретротранспозона Ty1 и Т- и D-областями праймера тРНК _i ^Met необходимы для инициации обратной транскрипции in vivo. Мол. Клетка. Биол. 18 : 799–806.

23. ↵

    Fu, W. и Rein, A. 1993. Созревание димерной вирусной РНК вируса мышиного лейкоза Молони. J. Virol. 67 : 5443–5449.

24. ↵

    Гарфинкель Д.Дж., Боке Д.Д. и Финк Г.R. 1985. Транспозиция элемента Ty: обратная транскриптаза и вирусоподобные частицы. Ячейка 42, : 507–517.

25. ↵

    Heyman, T., Agoutin, B., Friant, S., Wilhelm, F.X., and Wilhelm, M.L. 1995. Синтез ДНК с плюсовой цепью дрожжевого ретротранспозона Ty1 инициируется в двух сайтах: PPT1 рядом с 3′-LTR и PPT2 внутри ген pol .J. Mol. Биол. 253 : 291–303.

26. ↵

    Hill, MK, Shehu-Xhilaga, M., Campbell, SM, Poumbourios, P., Crowe, SM, and Mak, J. 2003. Ствол-петля димерной последовательности инициации вируса иммунодефицита человека типа 1 не требуется для вирусных репликация в периферийных мононуклеарные клетки крови. J. Virol.77 : 8329–8335.

27. ↵

    Кайзер, С.С., Михаэлис, С. и Митчелл, А. 1994. Методы в генетике дрожжей, Учебное пособие по лаборатории Колд-Спринг-Харбор. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.

28. ↵

    Ким, К.H. and Tinoco Jr., I. 2000. Целующийся комплекс ретровирусной РНК, содержащий только две пары оснований G • C. Proc. Natl. Акад. Sci. 97 : 9396–9401.

29. ↵

    Ланчи, Дж. М., Лодмелл, Дж. С. 2002. Альтернативное использование двух сайтов инициации димеризации в вирусной РНК ВИЧ-2 in vitro. J. Mol. Биол. 319 : 637–648.

30. ↵

    Лауреа, М.и Jette, L. 1994. 19-нуклеотидная последовательность перед 5′-основным донором сплайсинга является частью домена димеризации иммунодефицита человека. геномная РНК вируса 1. Биохимия 33 : 13464–13474.

31. ↵

    ———. 1996. Модель димеризации генома ВИЧ-1 в виде петли поцелуев: РНК ВИЧ-1 могут принимать альтернативные димерные формы, и все последовательности выше по течению. или ниже шпильки 248–271 незаменимы для образования димера.Биохимия 35 : 1589–1598.

32. ↵

    Лоулер, Дж. Ф., Меркулов, Г. В., и Боке, Дж. Д. 2001. Трансплантация сигнала сдвига рамки и однозначный анализ мутаций в дрожжевом ретротранспозоне Ty1 Gag / Pol перекрываются область. J. Virol. 75 : 6769–6775.

33. ↵

    Левин, Х.L. 1995. Новый механизм самопримирования обратной транскрипции определяет новое семейство ретроэлементов. Мол. Клетка. Биол. 15 : 3310–3317.

34. ↵

    Lin, J.H. и Levin, H.L. 1997. Сложная структура мРНК Tf1 распознается и расщепляется с образованием праймера обратной транскрипции. Genes & Dev. 11 : 270–285.

35. ↵

    Ly, H. и Parslow, T.G. 2002. Двудольный сигнал для димеризации геномной РНК в вирусе лейкемии мышей Молони. J. Virol. 76 : 3135–3144.

36. ↵

    Мэтьюз, Д.Х., Сабина, Дж., Zuker, M., and Turner, D.H. 1999. Расширенная зависимость термодинамических параметров от последовательности улучшает предсказание вторичной структуры РНК. J. Mol. Биол. 288 : 911–940.

37. ↵

    Монокиан, Г.М., Брайтерман, Л.Т., и Боке, Дж. Д. 1994. Мутагенез вставки линкера в рамку считывания дрожжевого транспозона Ty1: мутации, транспозиция и доминирование.Gene 139 : 9–18.

38. ↵

    Мур, С.П., Пауэрс, М., Гарфинкель, Д.Дж. 1995. Субстратная специфичность интегразы Ty1. J. Virol. 69 : 4683–4692.

39. ↵

    Мюльрад, Д., Хантер Р. и Паркер Р. 1992. Быстрый метод локализованного мутагенеза генов дрожжей. Дрожжи 8 : 79–82.

40. ↵

    Mumberg, D., Muller, R., and Funk, M. 1995. Дрожжевые векторы для контролируемой экспрессии гетерологичных белков в различных генетических фонах. Gene 156 : 119–122.

41. ↵

    Орудьев, Э.M., Kang, P.C., and Kohlstaedt, L.A. 1999. Дополнительная димерная структура связи в РНК вируса мышиного лейкоза Молони. J. Mol. Биол. 291 : 603–613.

42. ↵

    Пайярт, Дж. К., Берту Л., Оттманн, М., Дарликс, Дж. Л., Марке, Р., Эресманн, Б., и Эресманн, К., 1996a. Двойная роль предполагаемого сайта инициации димеризации РНК вируса иммунодефицита человека 1 типа в упаковке геномной РНК и синтез провирусной ДНК.J. Virol. 70 : 8348–8354.

43. ↵

    Пайярт, Дж. К., Марке, Р., Скрипкин, Э., Эресманн, К., и Эресманн, Б. 1996b. Димеризация ретровирусных геномных РНК: структурные и функциональные последствия. Biochimie 78 : 639–653.

44. ↵

    Пайярт, Дж.С., Шеху-Ксилага, М., Марке, Р. и Мак, Дж. 2004. Димеризация геномов ретровирусной РНК: неразрывная пара. Nat. Rev. Microbiol. 2 : 461–472.

45. ↵

    Rabson, A.B. и Graves, B.J. 1997. Синтез и обработка вирусной РНК. В Ретровирусы (ред. Х. Вармус и др.), Стр. 205–261. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.

46. ↵

    Рот, Дж. Ф. 2000. Дрожжевые вирусоподобные частицы Ty. Дрожжи 16 : 785–795.

47. ↵

    Рассел, Р.С., Ху, Дж., Берио, В., Муланд, А.Дж., Лохри, М., Клейман, Л., Вайнберг, М.A., и Liang, C. 2003. Последовательности ниже 5′-донорного сайта сплайсинга необходимы как для упаковки, так и для димеризации иммунодефицита человека. РНК вируса 1 типа. J. Virol. 77 : 84–96.

48. ↵

    Сакураги, Дж., Уэда, С., Ивамото, А. и Шиода, Т. 2003. Возможная роль димеризации в упаковке РНК генома вируса иммунодефицита человека типа 1.J. Virol. 77 : 4060–4069.

49. ↵

    Шарон, Г., Беркетт, Т.Дж., и Гарфинкель, Д.Дж. 1994. Эффективная гомологичная рекомбинация кДНК элемента Ty1 при блокировании интеграции. Мол. Клетка. Биол. 14 : 6540–6551.

50. ↵

    Шен Н., Jette, L., Liang, C., Wainberg, M.A., и Laughrea, M. 2000. Влияние димеризации РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 на вирусную инфекционность и стебель-петля B на димеризацию РНК. и обратная транскрипция и диссоциация димеризации от упаковки. J. Virol. 74 : 5729–5735.

51. ↵

    Шерман, Ф., Финк, Г.Р., и Хикс, Дж. Б. 1986. Методы в генетике дрожжей. Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.

52. ↵

    Скрипкин, Э., Пайярт, Дж. К., Марке, Р., Эресманн, Б., и Эресманн, С. 1994. Идентификация первичного сайта димеризации РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 in vitro. Proc. Natl. Акад.Sci. 91 : 4945–4949.

53. ↵

    Swanstrom, R. и Wills, J.R. 1997. Синтез, сборка и обработка вирусных белков. В Ретровирусы (ред. Х. Вармус и др.), Стр. 263–334. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.

54. ↵

    Телесницкий, А.и Гофф, С.П. 1993. Перенос цепи с сильным стопором во время обратной транскрипции. В Обратная транскриптаза (ред. А.М. Скалка и С.П. Гофф), стр. 49–83. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.

55. ↵

    Tounekti, N., Mougel, M., Roy, C., Marquet, R., Darlix, J.L., Paoletti, J., Ehresmann, B., and Ehresmann, C. 1992.Влияние димеризации на конформацию инкапсидации Psi-домена РНК вируса мышиного лейкоза Молони. J. Mol. Биол. 223 : 205–220.

56. ↵

    Узун, О. и Габриэль, А. 2001. Мутация аспартата активного сайта обратной транскриптазы Ty1 блокирует транспозицию, но не полимеризацию. J. Virol. 75 : 6337–6347.

57. ↵

    Войтас, Д.Ф. и Боке, Д. Д. 2002. Ty1 и Ty5 из Saccharomyces cerevisiae . В Mobile DNA II (ред. Н.Л. Крейг и др.), Стр. 631–662. Американское общество микробиологии Press, Вашингтон, округ Колумбия.

58. ↵

    Wilhelm, M., Heyman, T., Boutabout, M., and Wilhelm, F.X. 1999. Последовательность непосредственно перед праймером с положительной цепью важна для синтеза ДНК с положительной цепью ретротранспозона Saccharomyces cerevisiae Ty1.Nucleic Acids Res. 27 : 4547–4552.

59. ↵

    Xu, H. и Boeke, J.D.1987. Высокочастотная делеция между гомологичными последовательностями во время ретротранспозиции Ty-элементов в Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Акад. Sci. 84 : 8553–8557.

60. ↵

    ———.1990. Локализация последовательностей, необходимых в цис для транспозиции дрожжевого элемента Ty1 вблизи длинных концевых повторов: анализ элементов mini-Ty1. Мол. Клетка. Биол. 10 : 2695–2702.

61. ↵

    Цукер, М. 2003. Веб-сервер Mfold для предсказания сворачивания нуклеиновых кислот и гибридизации. Nucleic Acids Res. 31 : 3406–3415

Массивное нарушение последовательности небольшого белка

Кэмпбелл-Валуа и др. .10.1073 / pnas.0500465102.

Вспомогательная информация

Файлы в этом дополнении к данным:

Вспомогательные методы
Вспомогательный рисунок 6
Вспомогательная таблица 2
Вспомогательный рисунок 7
Вспомогательная таблица 3
Вспомогательная таблица 4
Вспомогательная таблица 5
Вспомогательная таблица 6
Вспомогательная таблица 7
Опорный стол 8
Опорный стол 9
Опорный рисунок 8
Вспомогательный стол 10
Опорный стол 11
Вспомогательный рисунок 9
Опорный стол 12
Опорный рисунок 10

Опорный рисунок 6

Рис.6. Схема стратегии ПЦР, используемой для создания экспериментальных библиотек. Широкие линии представляют одну цепь ДНК матричной ДНК, тогда как более тонкие линии представляют праймеры. Кодоны, расположенные в целевой секции (пунктирные линии), удаляются и заменяются последовательностью метки удаления, состоящей из сайта рестрикции, стоп-кодона и дополнительной пары оснований, чтобы ввести сдвиг рамки. Реакция ПЦР справа предназначена для замены метки делеции на количество кодонов NNK, соответствующее количеству кодонов в этом сегменте кДНК дикого типа ( методы ).

Вспомогательный рисунок 7

Рис. 7. Показатели энтропии основных библиотек сравниваются с оценками, полученными для альтернативных библиотек (рис. 1 A и таблицы 2 и 8). ( A ) Показатели энтропии, определенные для библиотеки S2 (остатки от L62 до K65 вырождены) по сравнению с S2b (остатки от L62 до Q66 вырождены). ( B ) Показатели энтропии, определенные для библиотеки S6 (с A85 по V88 вырождены) по сравнению с S6b (остатки с K84 по R89 вырождены). ( C ) Оценки энтропии, определенные для библиотеки S8 (остатки от C96 до L101 вырождены) по сравнению с библиотекой S8b (остатки от C96 до L101, кроме R100, вырождены).

Вспомогательный рисунок 8

Рис. 8. Значения доступности растворителя для каждого остатка были извлечены из файла DSSP 1RFA (данные ЯМР) ( A ) и 1GUA (кристаллографические данные комплекса с Rap1a) ( B ) и нанесен на график. ( C ) Был рассчитан средний фактор B для атомов основной цепи (значения для Ca, C (карбонил) и N (амид) были извлечены из файла PDB 1GUA) и нанесен на график. ( D ) Аналогичным образом рассчитывали средние B-факторы для атомов боковой цепи (кроме Cb).Остатки подразделяются на внутреннее ядро ​​и внешнее ядро, но все остальные остатки также показаны для сравнения. На вставках показано распределение доступности растворителей и значения B-факторов для этих трех групп (Таблица 10).

Поддерживающая фигура 9

Рис. 9. ¹ ЯМР спектры H и NOESY в амидных и сильнопольных алифатических областях для Raf RBD wt и пяти клонов ( вспомогательных методов ). ( A ) Спектры 1D протонного ЯМР в амидной области для RBD wt Raf по сравнению с пятью клонами (S1, A1; S2, h3; S3, A3; S7, C7; S12, h22).Последовательность клонов и соответствующий сегмент wt показаны слева от спектров. Относительные положения Trp-114 NeH (9,8 частей на миллион по массе) показаны пунктирной красной линией. ( B ) Спектры 1D протонного ЯМР в области сильного поля для wt по сравнению с пятью клонами. Два крайних сильнопольных пика соответствуют Cg1H ₃ (0,18 м.д.) и Cg2H ₃ (–0,4 м.д.) метиловым протонам Val-98, которые смещены по кольцевому току за счет взаимодействия с боковой цепью Trp-114. Дополнительная пара пиков в спектре C7 может быть связана с заменой Pro на Leu в положении 93, чья боковая цепь может контактировать с боковой цепью Trp 114.( C ) Перекрестные пики протонов NOESY Trp-114 NeH для wt по сравнению с пятью клонами. Наблюдаются кросс-пики как внутри, так и между остатками. Здесь мы назначаем только кросс-пики внутри остатков, потому что корреляции между остатками могут быть неоднозначными. Перекрестные пики внутри остатков включают CaH, 4,49; CbH, 2,9; Cd1H, 7,08; Cz2H, 7,4. ( D ) Перекрестные пики протонов NOESY для Cg1H ₃ (0,18 частей на миллион) и Cg2H ₃ (–0,4 частей на миллион) метильных протонов Val-98 wt по сравнению с пятью клонами. Общие внутрирезидные кросс-пики корреляции включают NOE как от Cg1H ₃ , так и от Cg2H ₃ и включают NH, 7.99; CaH, 4,9; и CbH 1,03. Эти кросс-пики появляются в спектрах wt и клонов. Дополнительные пики в спектре h3 Cg1h4 соответствуют перекрывающемуся пику ( B ) и, вероятно, обусловлены сдвигом кольцевого тока некоторой алифатической аминокислоты вблизи боковой цепи остатка 62, который представляет собой замену Leu на Phe. Наблюдаемые коррелированные химические сдвиги кросс-пиков не соответствуют назначению каких-либо первоначально описанных алифатических аминокислот.

Поддерживающая фигура 10

Рис.10. Падение GST- ras на Ni-NTA-связанных клонах Raf (выраженных как слияния с 6´His-меткой, но без DHFR F [1,2]) и конкуренция связывания с Raf RBD wt. GST- ras в комплексе с GMP-PNP, предварительно инкубированный либо с немаркированным Raf RBD wt, либо с аналогичным объемом ложной очистки (эквивалентная фракция очистки из клетки, содержащей пустой вектор), позволяли взаимодействовать с Ni-NTA-связанным 6´His -Raf RBD wt или семь клонов, выделенных в результате скрининга библиотеки (рис.5, методы поддержки и таблица 11). Также показан ввод 6´His Raf, загруженного в каждую полосу движения. Обратите внимание на остаточный немаркированный Raf на соответствующих полосах движения. Цифры внизу полос GST- ras представляют собой соотношение интенсивностей полос в конкурентной и контрольной обработке.

Вспомогательный текст

Вспомогательные методы

Базовые конструкции ДНК. Конструирование двух векторов (pQE32 Raf RBD-DHFR F [1,2] и pQE32 h-ras -DHFR [3]), необходимых для скрининга вырожденных библиотек (см. Ниже), описано в ссылке.1. Плазмида pQE32 Raf RBDDHFR F [1,2] была модифицирована следующим образом: сайты рестрикции NcoI и XhoI были добавлены соответственно в 5 ‘и 3’ кДНК Raf RBD. Первый сайт привел к добавлению кодона метионина и глицина между меткой гексагистидина и началом кДНК (таким образом, есть три дополнительных остатка между меткой и кДНК). Второй сайт был введен в 3 ‘кДНК путем изменения кодона остатка 131 и вставки консервативной мутации D132E. Наконец, размер вектора был уменьшен для повышения эффективности трансформации за счет удаления ДНК размером 800 п.н. между совместимым сайтом рестрикции XbaI и NheI, расположенным в 3 ‘между терминатором и точкой начала репликации (2).

Дизайн шаблона для вырожденной ПЦР. Для каждой из 13 библиотек была создана матрица с делеционной меткой, в которой область, нацеленная на вырождение (рис. 1 A и таблица 1), заменена уникальным сайтом узнавания для рестрикционного фермента, позволяющим однозначно идентифицировать шаблоны. Кроме того, также были вставлены стоп-кодон и сдвиг рамки на 1 п.н., чтобы исключить потенциальный источник загрязнения кДНК дикого типа (wt) в процессе скрининга.Протокол ПЦР, используемый для синтеза шаблонов, является вариантом протокола ExSite (Stratagene). Остальная часть описанной ниже процедуры представлена ​​на рис. 6.

Клонирование и восстановление библиотеки. Продукт, полученный после второго раунда ПЦР, клонировали в векторе входа, полученном из pQE32 (Qiagen) (как описано выше), несущем DHFR F [1,2] путем лигирования через сайты рестрикции SphI и XhoI. Продукт лигирования трансформировали электропорацией в штамм SS320 Escherichia coli (3).Количество полученных независимых клонов оценивали путем подсчета количества колоний, образованных после инкубации в течение ночи при 37 ° C на чашках LB (с добавлением 25 мг / мл канамицина / 100 мг / мл ампициллина / 10 мг / мл тетрациклина) при посеве фракции. реакции трансформации (разведение 1 × 10 ^-4 ) (Таблица 1). Оставшуюся часть смеси для трансформации использовали для инокуляции 500 мл LB с добавлением упомянутых выше антибиотиков. Через 8–12 ч инкубации получали плазмидную ДНК.Особое внимание уделялось на всех этапах, чтобы избежать контаминации плазмидой wt, поскольку это могло бы затруднить процедуру скрининга.

Множественные выравнивания последовательностей (MSA) естественных последовательностей. MSA функциональных гомологов был получен в результате интеллектуального анализа данных в базе данных SMART [Таблицы 4 (MSA S1) и 5] (4). Близкие гомологи (идентичность> 85%) последовательности были удалены из выравнивания. Кроме того, мы получили 54 структуры [включая 1RFA, структуру Raf ras-связывающего домена (RBD)], разделяющих убиквитиновую складку, но демонстрирующих <35% идентичности последовательностей при попарном выравнивании.На основе этих последовательностей были построены два выравнивания. Структурная классификация белков (SCOP) MSA включала последовательности, строго классифицированные по пяти суперсемействам, принадлежащим суперсемейству убиквитина в соответствии с базой данных SCOP (5): суперсемейство убиквитин-подобное и четыре суперсемейства, вероятно связанных с ним эволюционно, домены CAD и PB1, MoaD / ThiS, TGS-подобный домен и двойной кортин (DC). SCOP-семейства структурно подобных белков (FSSP) MSA включали все последовательности из SCOP MSA, а также последовательности, полученные с помощью интеллектуального анализа данных в четырех из оставшихся шести суперсемейств, принадлежащих суперсложению убиквитина, и в базе данных FSSP (6).Следовательно, SCOP-FSSP MSA включает структуры, более отличные от Raf RBD, чем SCOP MSA. Эти MSA были построены путем выравнивания остатков в соответствии с вторичной структурой или топологическими элементами. Затем использовали грубую ориентацию боковой цепи (например, обращенную внутрь ядра или растворителя), пространственное положение в контексте третичной структуры или сходство в контактах между боковыми цепями в случае, если первый критерий был недостаточным. Все вставки были удалены, таким образом, остались только элементы, общие с Raf RBD во всех последовательностях [Таблицы 4 (MSA S2-S3) и 6].Наконец, обратите внимание, что для простоты всего текста, рисунков и таблиц остаточная нумерация Raf RBD используется для определения позиции во всех MSA.

Теоретическая частота аминокислот, используемая для нормализации экспериментальной частоты аминокислот для расчета энтропии Шеннона и для естественной последовательности MSA Ft _posX . Теоретическая погрешность в появлении кодона NNK перед выбором выглядит следующим образом: (W) 1: (Y) 1: (F) 1: (V) 2: (I) 1: (L) 3: (M) 1: (C) 1: (A) 2: (G) 2: (P) 2: (T) 2: (S) 3: (N) 1: (Q) 1: (D) 1: (E) 1: (K) 1: (R) 3: (H) 1: (стоп) 1.Эти смещения в появлении были использованы для нормализации экспериментальных данных по встречаемости аминокислот для расчета энтропии Шеннона (уравнение 1 ). Теоретическое количество клонов в каждой библиотеке меняется в зависимости от функции 21 ^l , где l — это количество различных аминокислот плюс стоп-кодон, разрешенный в экспериментах (Таблица 1)

Следующее значение аминокислоты частота согласно swiss-prot (декабрь 2003 г.) использовалась для расчета стандартной ошибки пропорции (ур. 2 ): (W) 2,21: (Y) 2,87: (F) 3,11: (V) 7,07: (I) 8,40: (L) 7,70: (M) 7,87: (C) 1: 5,49 (A) 5,25 : (G) 3,86: (P) 3,41: (T) 6,05: (S) 4,68: (N) 4,86: (Q) 4,93: (D) 4,51: (E) 5,17: (K) 5,23: (R) 3,77 : (H) 3,56.

Энтропийная оценка Выбор аминокислот по остатку Представление с помощью цветовой матрицы. Для каждого остатка было рассчитано z-баллов, чтобы определить разницу в профиле энтропии для экспериментальных данных (Fe _posX ) по сравнению с каждым из трех MSA с естественной последовательностью (Ft _posX ) (рис.2 E и Таблица 7). Для каждого сравнения N фиксировали независимо в соответствии с количеством последовательностей N в выравнивании с наименьшим количеством последовательностей (SMART, SCOP и SCOP-FSSP в зависимости от сравниваемых профилей; см. Таблицу 7). Цветовая шкала, показанная на фиг. 2 E , использовалась для выделения цвета каждой аминокислоте на основе остатка за остатком (см. Ниже описание анализа распределения аминокислот для более подробной информации).

Для расчета распределений аминокислот и определения степени отбора для отдельных аминокислот в отдельных положениях последовательности в наборе экспериментальных данных теоретическая частота ( Ft _posX ) была зафиксирована в соответствии с смещением, введенным с использованием кодон NNK.Кроме того, количество клонов ( N ) и встречаемость каждой аминокислоты в данном остатке были нормализованы к наименьшему набору данных (таблица 1), чтобы избежать локального смещения из-за различий в количестве клонов, выделенных для каждой библиотеки ( Уравнение 2 ). Для MSA с естественной последовательностью частоты аминокислот в swiss-prot, появившиеся в декабре 2003 года, использовали как Ft _posX (для обоих вышеупомянутых наборов Ft _posX , см. Предыдущий раздел выше).

Z-значения представлены в виде цветной матрицы (рис. 3). Аминокислоты в данном остатке с положительной и отрицательной оценкой z отображаются соответственно зеленым и красным цветом после шкалы для значения P , показанной на рис. 3. Три самых ярких оттенка зеленого и красного соответствуют от самого темного к самому яркому, соответственно. , до P значений 0,05, 0,01 и 0,001 (см. шкалу на рис. 3). Показатель z, соответствующий заданному значению P для каждого выравнивания (поскольку N изменяется), был получен из таблицы пределов значений t критических значений t распределения.Серые клетки указывают положения последовательностей, которые не были вырождены в библиотеках. Клетки для остатков 102–108, которые соответствуют специфической петле RBD, также были окрашены в серый цвет в структурном аналоге MSA. Значение z-оценки было рассчитано для всех позиций, включая те, которые отображают пропуски> 25%. Последовательности с пробелами подсчитывали по значению N , но распределения аминокислот с пробелами не показаны.

Построение последовательности подписи (SS). Тридцать восемь позиций имеют хотя бы одну значимую ( P <0.05) выбор аминокислот (таблица 9). В рукописи мы обсуждаем в основном 33 позиции, показывающие еще большую значимость ( P <0,01) в их выборе аминокислот. Как обсуждается в Таблице 9, три положения не учитывались, поскольку значение выбора аминокислоты было неоднозначным. Для этих положений ( P <0,01) отображаются все аминокислоты с выбранным z-показателем с P > 0,05. Эта процедура сокращает представленные в рукописи СС до 30 позиций.Распределения выбора аминокислот в этих положениях в экспериментах сравнивали с теми, которые наблюдались в MSA с природной последовательностью, чтобы предположить эволюционное давление, специфичное для функционального гомолога или структурного аналога (рис. 3 и таблица 9).

Физические характеристики. 96 клонов, отобранных для физических характеристик, очищали на Ni-аффинной колонке (Qiagen). Эксперименты с круговым дихроизмом проводили на спектрополяриметре JASCO-710 при 25 ° C в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 мм.В этих экспериментах образцы белка разбавляли до 15 мМ в 25 мМ натрий-ацетатном буфере (pH 4,9).

Эксперименты по кинетическому и равновесному сворачиванию проводили на аппарате с остановленным потоком модели SX.18 MV в режиме флуоресценции (Applied Photophysics). W114 дикого типа, неизменный в эксперименте, является внутренним флуоресцентным зондом, используемым для мониторинга реакций сворачивания и разворачивания Raf RBD (7). Квантовый выход флуоресценции триптофана уменьшался при денатурации Raf RBD.GuHCl использовали для денатурирования белка в 25 мМ NaoAc-буфере при pH 4,9. Обычно исходные белковые растворы с концентрацией 40 мМ в 3,5 М и 0,3 М GuHCl, соответственно, для экспериментов по сворачиванию и разворачиванию, разбавляли 1:10 в денатурирующем растворе. Концентрации GuHCl во всех исходных растворах и в образцах белка оценивали с помощью рефрактометрии.

Последовательности клонов, представленные на фиг. 5 A и B , следующие: a1 (библиотека 1), «PWVDLDA»; h3 (библиотека 2), «FTDG (Q)»; а3 (библиотека 3), «ГТРВТ»; a6 (библиотека 6), «(K) KLSE (R)»; f8 (библиотека 8), «CKLMRR»; c12 (библиотека 13), «TSCHDL». Остальные клоны очищены и охарактеризованы (фиг.5 и Таблицы 11 и 12) указаны ниже (Таблица 2).

Определение константы диссоциации для Raf RBD. Константы диссоциации ( K _d ) нескольких клонов определяли в соответствии с методом, описанным в ссылке. 8. Флуоресценцию контролировали в 96- или 384-луночных черных планшетах с несвязывающейся поверхностью (NBS) (Corning № 3650 и 3654) с помощью планшет-ридера Gemini Xs (Molecular Devices). Как правило, K _d вариантов Raf RBD для h-ras рассчитывали путем подбора трех измерений для каждой концентрации Raf RBD. K _d , определенные экспериментально, перечислены в таблице 12. Эксперименты с ЯМР

. Очищенные образцы белка переносили в дейтерированный 12 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 5,3 / 0,1 мМ DTT / 1 мМ NaN ₃ на колонке для обессоливания PD10 (Amersham Pharmacia). Затем образцы концентрировали (от 0,5 до 1 мМ) с помощью ультрафильтрации и добавляли ² H ₂ O для достижения 94% H ₂ O / 6% ² H ₂ O. Спектры протонного ЯМР были выполняли на спектрометре DMX-500 Bruker при 25 ° C.Подавление воды осуществлялось с использованием фазочувствительного подхода с импульсным градиентом поля, а спектры NOESY собирались при времени смешивания 125 мс (9, 10).

His-Tag Pull-Down и соревнования. Сто микрограммов 6´His-Raf (вес или клоны) инкубировали при умеренном перемешивании путем переворачивания при 4 ° C с 200 мл смолы Ni-NTA в 10 объемах слоя (BV) буфера C (20 мМ Hepes / 5 мМ MgCl2 / 150 мМ NaCl / 25 мМ имидазол, pH 7,4) в течение 20 мин. Между тем 150 или 225 мг GST- ras (в зависимости от аффинности тестируемого варианта), связанного с GMP-PNP (8), предварительно инкубировали либо с 4-6 раз более концентрированным немеченым Raf wt, либо с равным объемом фракции очистки. из клеток, трансформированных пустым вектором в 1 мл буфера С.Затем связанный со смолой образец Raf разделяли на две части, супернатант удаляли, добавляли предварительно инкубированный GST- ras и инкубировали при 4 ° C в течение 30 минут. Связанную фракцию дважды промывали 10 BV буфером C. Объем смолы оценивали и доводили буфером C до »100 мл, и к смеси непосредственно добавляли загрузочный буфер 3´ SDS / PAGE. Образцы недолго кипятили, и 35 мл образцов загружали на дорожку на 15% SDS / PAGE. Полосы выявлялись окрашиванием кумасси синим.Количественную оценку GST- ras при обработке неконкурентным и немаркированным Raf wt проводили с помощью программного обеспечения первого количества (BioRad) путем вычитания фона и расчета соотношения между этими двумя обработками для вариантов Raf.

Используемое программное обеспечение. Представление вторичной структуры для человеческого Raf RBD (код PDB ID 1RFA), показанное на фиг. 2 E и 3, было получено на сервере PDBsum (www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/pdbsum). Графики и кривые были разработаны с использованием призмы (GraphPad) и калейдаграфа 3.52 (Synergy Software). Фигуры были собраны с помощью corel draw 9.0 (Corel) и Illustrator 9.0 (Adobe Systems). Представления структур выполнялись с помощью ds viewer pro (Accelrys). Рисунок ЯМР был получен с использованием topspin 5.0.

Подтверждающие результаты

Сопоставление последовательностей, полученных путем скрининга 13 дегенерированных библиотек. Каждую библиотеку подвергали скринингу независимо в соответствии с протоколом, описанным выше (фиг.1 A , методы и фиг.6). Статистика, представленная на рис. 2 и 3 были основаны исключительно на клонах, отобранных на одном этапе скрининга. Последовательности этих клонов представлены в таблице 2. Она также указывает на клоны, которые были очищены и дополнительно охарактеризованы (фиг. 5 и таблица 11).

Каждую библиотеку выдерживали под селективным давлением в течение нескольких раундов амплификации в жидкой среде (согласно ссылке 16). Последовательности этих клонов следующие (используемые здесь индексы имеют то же значение, что и в таблице 2): Библиотека S1: «FKLILTY» ^† , «PDHLRFE» ^† ; библиотека S2: «LPDTQ *» ^† , «FTDGQ *» ^{† ‡ §} ; библиотека S4: «PDSSST» ^† , «AVPSLR» ^† , «VSLGHK» ^† ; библиотека S5: «LKKLLL» ^† ; библиотека S6: «K * RMTAR *» ^{† ‡ §} , «RSLHRR» ^† ; библиотека S7: «EINHLQ» ^{† ‡ §} , «EILPGQ» ^{† ‡ §} ; библиотека S8: «CKLMRR» ^† , «MVPMRE» ^† ; библиотека S9: «KTQCNG» ^† , «TSGRVLH» ^† ; библиотека S10: «KRTVSW *» ^{† ‡ §} ; библиотека S11: «TGEAIS» ^† , «SSGAHG» ^† ; библиотека S12: «VAGN» ^† , «LADC» ^{† ‡ §} ; библиотека S13: «QLLLEF» ^{† ‡ §} .Из ограниченного отбора клонов (выше и в таблице 2) не наблюдается очевидной систематической ошибки для связывания с GTP-связанным h-ras , стабильности или кинетики сворачивания / разворачивания для клонов, выделенных при 1 раундах отбора по сравнению с 12.

Альтернативные экспериментальные библиотеки. Мы синтезировали три альтернативные вырожденные библиотеки для Raf RBD. Альтернативные библиотеки S2b, S6b и S8b гомологичны библиотекам S2, S6 и S8 соответственно. Библиотеки S2b и S6b были синтезированы и подвергнуты скринингу, чтобы исследовать влияние вырожденных остатков, ранее не измененных (рис.1 и таблица 1), которые, как известно, участвуют в связывании с h-ras (например, Q66, K84 и R89) в зависимости от количества образованных колоний и исследуемого пространства последовательностей на соседних остатках (фиг.7). Фактически, меньшее количество колоний (порядка 1 × 10 ² ) было сформировано в анализе на выживание с библиотеками S2b и S6b, чем с исходными S2 и S6 (Таблица 1). Мы также создали библиотеку S8b для исследования эффекта сохранения константой остатка 100 для аргинина, который является аминокислотой, встречающейся в RBD Raf дикого типа.Последовательности, выбранные из этих трех альтернативных библиотек с помощью теста на выживание DHFR PCA, перечислены в таблице 3.

Если просто взглянуть на последовательности (таблица 3), можно увидеть интересную корреляцию между природой наблюдаемых аминокислот. по остаткам L62 и Q66. Эти два остатка расположены бок о бок около поворота первой b-шпильки во второй и первой b-нитях соответственно. Небольшие аминокислоты, такие как G и A в положении 66, коррелируют с F в положении 62.Остаток 66 также предпочтительно смещен в отношении Q. Когда эта аминокислота находится в положении 66, лейцин (массовая аминокислота) часто наблюдается в положении 62. Для библиотеки 6b наиболее важным наблюдением является высокая сохранность остатка 89 для аргинин. Как описано в статье, мутации этого остатка в лейцин достаточно, чтобы полностью отменить связывание Raf RBD с h-ras в анализе связывания in vitro (17) и в нашем анализе отбора на выживаемость (рис.1 B ). С другой стороны, K84, который, как было показано, увеличивает константу диссоциации на два порядка ( K _{d »} 14 мМ), показывает очень низкую консервацию. В целом, существует небольшое изменение энтропии для остатков в двух альтернативных библиотеках (наборы 2b и 6b) по сравнению с соответствующими основными библиотеками (фиг. 7 A и B ). Напротив, эффект сохранения R100 неизменным на аминокислотное разнообразие по остаткам V98 и L101 очевиден (фиг. 7 C ).R100 является остатком внешнего ядра, расположенного в b-цепи 3 (рис. 3 и 4 и таблица 9). Это наблюдение может объяснить, почему фиксация идентичности аминокислоты в положении 100 уменьшает пространство последовательностей, исследуемое V98, соседним коровым остатком b-цепи 3. В качестве альтернативы, снижение энтропии для L101 в этом контексте может быть связано с тем фактом, что этот остаток исправлены оба его фланговых соседа. В самом деле, очевидно резкое снижение вырожденности аминокислот, допустимое на L101 при фиксации идентичностей аминокислот на обоих по сравнению с одним из соседних остатков.Это еще более поразительно, учитывая, что L101 показал высокую энтропию в основном эксперименте (рис. 2 B, и 7). Это наблюдение указывает на сильный потенциал полипептидной цепи по адаптации своей конформации к локальным ограничениям последовательности. Альтернативно, этот эффект может быть обусловлен специфическими факторами Raf RBD, поскольку R100 демонстрирует специфическую конвергенцию в выборе аминокислот с выравниванием функциональных гомологов (фиг. 3).

В заключение, к этим результатам следует относиться с осторожностью из-за небольшого количества анализируемых последовательностей.Однако результаты подчеркивают потенциальное использование нашего подхода для изучения ковариации остатков в одном и том же белке или между остатками, расположенными на границах раздела димеризации.

Описание MSA природных последовательностей и набора экспериментальных данных.

Ниже представлены сопоставления естественных последовательностей, полученные путем интеллектуального анализа базы данных. Последовательности редактировали, как описано выше. Обратите внимание, что нумерация остатков Raf RBD используется для всех выравниваний по всей рукописи и в этом разделе.

Свойства различных последовательностей, включенных в выравнивание функциональных гомологов (таблица 4, MSA S1), были получены путем поиска в системе поиска blast и включены в таблицу 5.

Свойства различных структур, используемых в выравнивании структурных аналогов были собраны из базы данных SCOP (таблица 4, MSA S2 и S3). Другие структурные детали, собранные путем ручной оценки структур и выравнивания, также перечислены в Таблице 6.

Вариация положения a-спирали над b-листом и суперсемейства отсутствуют в MSA S2 и S3. Расположение a-спирали над b-листом поперек суперсгиба убиквитина является переменным и может быть аппроксимировано W-углом. В структурах, разделяющих эту топологию, положительный и отрицательный угол W будет указывать, соответственно, на то, что a-спираль упакована по b-цепям 1, 2, 5 и 1, 3 и 5. Структуры, включенные в выравнивание, отображаются как отрицательный угол W, при этом для подавляющего большинства конструкций угол между –45 ° и –75 °. Одним заметным исключением является структура фактора инициации трансляции IF3 (1TIF), классифицированного в суперсемействе 10, который показывает слегка положительный угол (»0–5 °).Поскольку сеть контактов в ядре этого домена, особенно в интерфейсе a-спирали и b-листа, кардинально отличается, она не была включена в согласование SCOP-FSSP. Та же аргументация была применена для отклонения структур (таких как код PDB ID 1LGR), отнесенных к суперсемейству 11.

Вариация длины a-спирали. Основная a-спираль (для Raf RBD она включает остатки L78 – R89) варьирует по длине от 8 до 16 остатков по всем членам суперсложки, включенным в выравнивания.Большинство структур (18 из 27) в выравнивании SCOP имеет a-спираль из 12 остатков в длину, аналогичную Raf RBD. Согласование SCOP-FSSP отличается гораздо большим разнообразием. В основном это связано с большим количеством структур 2Fe-2S ферредоксин-подобного суперсемейства (5), которые в большинстве своем имеют более короткую a-спираль. В большинстве этих случаев у a-спирали отсутствует последний виток на карбоксильном конце (таким образом, их спираль охватывает восемь остатков в длину). Таким образом, эти домены не имеют третьего внутреннего корового остатка в а-спирали (внутренний и внешний коровые остатки определены на рис.4). Эта структурная вариация является наиболее частым случаем, приводящим к несоответствию в консервации внутренних коровых остатков в членах ubiquitin superfold (Figs. 3 and 4 and Table 6).

Влияние вариации регистра а-спирали на показатели энтропии. Дополнительная особенность анализа структурных различий между членами суперсложки выявляет несоответствия загадочных последовательностей в естественных последовательностях. Было обнаружено, что расхождения между экспериментальными позиционными энтропиями в a-спирали (L78 – R89) и структурными аналогами MSA связаны с изменением положения a-спирали на b-листе.Основными остатками ядра а-спирали, обращенными к b-листу в Raf RBD, являются i (L78), i + 4 (L82) и i + 8 (L86), тогда как для убиквитина эти остатки составляют i . (I23), i + 3 (V26) и i + 7 (I30). Структуры, классифицированные в выравниваниях SCOP и SCOP-FSSP, чаще принимают расположение убиквитина (соответственно 21 из 27 и 32 из 54). Поэтому оценка энтропии для второго и третьего остатков ядра а-спирали была пересчитана, чтобы учесть эти наблюдения.Непосредственно это было сделано путем выравнивания положения i + 3 и i + 7 с положением i + 4 и i + 8 структур, отображающих, соответственно, упаковку типа убиквитина и Raf-RBD для расчета энтропии. Таким образом, новые оценки позиционной энтропии, полученные для согласований SCOP-FSSP, составляют 0,51 и 0,61. Эти значения близко соответствуют рассчитанным из экспериментальных данных Raf RBD по остатку L82 и L86, соответственно, 0,49 и 0,59.Эти изменения в упаковке a-спирали создают изменения в расположении гидрофобного ядра, включая остатки b-листа. Это последнее явление иллюстрируется остатком L62, который тесно связан с гидрофобным ядром в Raf RBD, тогда как в убиквитине соответствующий остаток в значительной степени подвержен действию растворителя.

Внутренние объемы боковой цепи сердечника. Объем боковых цепей внутреннего ядра (рис. 5 и таблица 6) довольно постоянен по всей суперсложке убиквитина со средним объемом 556 Å ³ и стандартным отклонением 78 Å ³ .Для доменов, классифицированных в выравнивании SCOP ( методы ), средние объемы боковых цепей были более похожими (594 ± 49 Å ³ ). Вариации кумулятивного объема боковой цепи в зависимости от проанализированных структурных аналоговых выравниваний в основном обусловлены слегка расходящейся структурой а-спирали, описанной в статье и выше (Таблица 6 и Вариация в длине а-спирали выше). Raf RBD близок к этому среднему с объемом 601 Å ³ для боковых цепей остатков внутреннего ядра.Интересно, что сохранение объема коровых остатков было продемонстрировано в свернутых клонах репрессора лямбда, выделенных из библиотеки, в которой 7 коровых остатков одновременно дегенерировали до 20 типов аминокислот (13). Аналогичные выводы можно сделать из исследования барназа (14). Основываясь на выравнивании последовательностей, полученных в базе данных SMART, объем боковой цепи остатков внутреннего ядра (на основе последовательности src-Sh4, положения в выравнивании, которые соответствуют внутреннему ядру, следующие: 12A, 26F, 32L, 34I, 45A, 54G, 56I и 60V) в большом семействе Sh4, по-видимому, также высококонсервативны, отображая в среднем 443 ± 31 Å ³ .Значение и общность сохранения объема внутреннего остатка ядра для структуры или образования структуры неизвестны. Однако недавние теоретические работы показали, что сохранение объема ядра может быть особенно актуальным для домена <200 остатков, потому что они обычно имеют более высокую плотность упаковки, чем более крупный домен (15).

Оценка разнообразия последовательностей в выравниваниях. Общие свойства экспериментального и естественного выравнивания последовательностей можно суммировать с помощью средней позиционной энтропии и средней парной идентичности последовательностей.Эти значения перечислены в таблице 7, чтобы облегчить сравнение разнообразия последовательностей, заложенного в каждое выравнивание (фиг. 2 E ).

Исходное значение z-оценки и выбор аминокислот Остаточный остаток. Для упрощения анализа распределения выбора аминокислот представлены исходные z-значения для каждого остатка, рассчитанные для экспериментальных данных (таблица 8). Расчет был выполнен в соответствии с Методами (уравнение 2 ), и эти значения были использованы для построения Рис.3. В Таблице 9 представлены z-баллы распределения значимого выбора аминокислот, наблюдаемого в наборе экспериментальных данных и в трех сопоставлениях естественных последовательностей.

Как описано в статье, сравнение значимого выбора аминокислот в экспериментальных данных с выравниванием функциональных гомологов или выравниванием структурных аналогов было использовано для установления сигнатурной последовательности для Raf RBD ( методы и рис. 3, см. выше). Остатки со значительным выбором аминокислот перечислены в таблице 9.Эти положения подразделяются на восемь категорий, указанных в нижней части таблицы 9. Внешнее ядро ​​относится к остаткам, которые расположены на внешнем слое вокруг остатков внутреннего ядра (рис. 4). Некоторые из остатков внешнего ядра, в частности R100, L112 и L121, также являются частью относительно независимого мини-ядра, расположенного на карбоксильном конце домена между b-цепью 3 и 5. Это мини-ядро также включает в Raf RBD остатки E104. , T116 и E124. Обратите внимание, что некоторые остатки, упомянутые в таблице 8, были опущены в статье, потому что, например, было трудно сопоставить наблюдаемый выбор аминокислот с каким-либо структурным наблюдением (например,g., остаток M83) или потому, что структурная база данных, вероятно, была артефактом (например, кодон инициации трансляции метионина, выровненный по остатку N56).

Определение K _d Raf RBD для h-ras . Было исследовано связывание in vitro вариантов Raf RBD с h-ras ( методы ). Целью этих экспериментов было показать, что выделенные экспериментально мутанты Raf RBD сохраняют близкие к дикому типу K _d (таблица 11).

K _d , полученный этой процедурой для RBD wt Raf, согласуется с поз. 17. Несколько клонов были протестированы в областях, которые, как известно, участвуют в связывании с h-ras , например, библиотеки 2, 3 и 6. Как и можно было предсказать, клоны из этих областей образовывались среди наиболее дестабилизированных комплексов.

Кинетические и термодинамические параметры, полученные для характеристических вариантов Raf RBD. Кинетические и термодинамические параметры варианта Raf RBD, скорость сворачивания которых в воде отображена на рис.5 B Вставка , подробно перечислены в таблице 12.

Обратите внимание, что все термодинамические параметры были определены из кинетических экспериментов.

Иерархия в ядре не полностью очевидна из факторов B и значений доступности растворителей. Доступность растворителя и B-факторы были нанесены на график для всех остатков Raf RBD на основе одной ЯМР и одной кристаллографической структуры (1RFA и 1GUA, соответственно), с акцентом на внутренние и внешние остатки ядра (рис.8). Среднее значение и стандартное отклонение приведены в таблице 10.

Raf wt и варианты Отображение аналогичных 1D ¹ H и спектры NOESY

Мы провели эксперименты ¹ H и NOESY ЯМР на Raf RBD wt и пяти соответствующих мутантах. к положительным клонам, выбранным из библиотек мутантов по различным регионам структуры. В качестве зондов третичной структуры мы сосредоточили внимание на протоне Trp-114 NeH (9,8 ppm для wt), и два крайних сильнопольных пика соответствуют Cg1H ₃ (0.18 м.д.) и Cg2H ₃ (–0,4 м.д.) метильных протонов Val-98, которые смещены по кольцевому току за счет взаимодействия с боковой цепью Trp-114 (химические сдвиги взяты из ссылки 9). Фиг.9 A показывает спектры в амидной области для RBD Raf дикого типа по сравнению с 5 клонами (S1, A1; S2, h3; S3, A3; S7, C7; S12, h22). Последовательность клонов и соответствующий сегмент wt показаны слева от спектров. Относительные положения Trp-114 NeH (9,8 частей на миллион по массе) показаны пунктирной красной линией.Как можно видеть, существуют лишь умеренные различия в химическом сдвиге этого протона для клонов по сравнению с таковым у wt и согласуются с сохранением целостности структуры RBD raf. Сами амидные оболочки показывают незначительные вариации, и один пик при 6,3 м.д. отсутствует для клона h22. Этот пик мог принадлежать одному из протонов амина Gln-127; этот остаток заменен на Leu в h22. К сожалению, эти пики не назначены. Были некоторые интересные различия в крайних областях (рис.9 B ), включая появление нового пика, перекрывающего метильные протоны Cg1H ₃ (0,18 м.д.) Val-98 в спектре h3 и появление двух новых пиков в спектре C7. Увеличение констант связи трех связей для Val-98 Cg1H ₃ и Cg2H ₃ могло быть связано с переориентацией этих метильных групп из цис (± 60 °) в транс (± 120 °) относительно протона CbH. из которого возникает эта связь. Чтобы подтвердить, что небольшие изменения химических сдвигов, наблюдаемые в одномерных спектрах, не представляют существенных структурных изменений, и чтобы разрешить любые неоднозначности относительно химических сдвигов в области сильного поля, мы провели протонные эксперименты NOESY.Эти результаты подтверждают, что кросс-пики NOESY для Trp-114 NeH идентичны в каждом клоне по сравнению с wt (фиг.9 C ; пунктирные красные линии) и для метильных протонов Cg1H ₃ и Cg2H ₃ Val-98. (Рис.9 D ; пунктирные красные линии). Это наблюдение справедливо также для спектра клона h3, в котором другой пик перекрывается с пиком для Cg1H ₃ Val-98. Подробная информация о назначении кросс-пиков представлена ​​на рис. 9, обозначения C и D .

GST- ras Понижение, связанное с Ni-NTA 6´His-Raf wt или клонами, конкурирует с Untagged Raf wt. Мы стремились продемонстрировать, что связывание клонов, выделенных в нашей стратегии скрининга, сохранило тот же механизм и поверхность связывания с h-ras , чем с RBD Raf дикого типа. Для этого мы проверили способность немаркированного Raf wt конкурировать с GST- ras , связанным с GMP-PNP на Ni-NTA-связанном 6´His-Raf wt или клонах (см. Выше, Таблицу 11 и Рис. 10).Этот эксперимент (фиг. 10) показывает, что комплекс, образованный семью клонами, протестированными с GST- ras , может конкурировать с немаркированным Raf дикого типа, что свидетельствует в пользу сохранения границы связывания. Более того, более низкий уровень GST- ras , полученный в раскрывающемся списке для клонов h3 и A3 по сравнению с Raf wt, согласуется с их более низкими константами диссоциации, определенными с помощью флуоресцентного анализа связывания in vitro , как описано выше (Таблица 11) .

1. Пеллетье, Дж.Н., Кэмпбелл-Валуа, Ф.-Х. И Michnick, S. W. (1998) Proc. Natl. Акад. Sci. США 95, 12141–12146.

2. Кэмпбелл-Валуа, Ф.-Х. & Michnick, S. W. (2005) Методы и протоколы в молекулярной биологии , в печати.

3. Сидху, С. С., Лоуман, Х. Б., Каннингем, Б. С. и Уэллс, Дж. А. (2000) Methods Enzymol. 328, 333–363.

4. Шульц, Дж., Милпец, Ф., Борк, П. и Понтинг, К. П. (1998) Proc.Natl. Акад. Sci. USA 95, 5857–5864.

5. Мурзин А.Г., Бреннер С.Э., Хаббард Т. и Чотиа К. (1995) J. Mol. Биол. 247, 536–540.

6. Holm, L. и Sander, C. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 3600–3609.

7. Валли-Белисл А., Теркотт Дж. Ф. и Мичник С. В. (2004) Биохимия 43, 8447–8458.

8. Manor, D. (2000) Methods Enzymol. 325, 139–149.

9. Эмерсон, С. Д., Во, Д. С., Шеффлер, Дж. Э., Цао, К. Л., Принцо, К. М. и Фрай, Д. К. (1994) Биохимия 33, 7745–7752.

10. Эмерсон, С.Д., Мэдисон, В.С., Палермо, Р.Э., Во, Д.С., Шеффлер, Дж. Э., Цао, К.Л., Кифер, С.Е., Лю, С.П. и Фрай, округ Колумбия (1995) Биохимия 34, 6911 –6918.

11. Janin, J. & Chothia, C. (1980) J. Mol. Биол. 143, 95–128.

12. Richards, F. M. (1974) J. Mol. Биол. 82, 1–14.

13. Лим, В. А. и Зауэр, Р. Т. (1989) Nature 339, 31–36.

14. Акс, Д. Д., Фостер, Н. В. и Фершт, А. Р. (1996) Proc. Natl. Акад. Sci. USA 93, 5590–5594.

15. Лян Дж. И Дилл К. А. (2001) Biophys. J. 81, 751–766.

16. Пеллетье, Дж. Н., Арндт, К. М., Плюктун, А.И Michnick, S. W. (1999) Nat. Biotechnol. 17, 683–690.

17. Блок К., Янкнехт Р., Херманн К., Нассар Н. и Виттинггофер А. (1996) Nat. Struct. Biol. 3, 244–251.

18. Фридман М., Марута Х., Гонез Дж., Уокер Ф., Трейтлейн Х., Зенг Дж. И Берджесс А. (2000) J. Biol. Chem. 275, 30363–30371.

Определение последовательности по Merriam-Webster

последовательность | \ ˈSē-kwən (t) s , -ˌKwen (t) s \

1 : гимн неправильного размера между постепенным и Евангелием в мессе для особых случаев (например, Пасхи).

2 : непрерывная или связная серия: например,

а : расширенный цикл стихотворений, объединенных единой темой. последовательность сонетов

б : три или более игральных карты обычно одной масти в последовательном порядке рангов.

c : последовательность повторений мелодической фразы или гармонического паттерна, каждое в новой позиции.

d : набор элементов, упорядоченных так, чтобы их можно было пометить положительными целыми числами.

е : точный порядок оснований в нуклеиновой кислоте или аминокислот в белке

f (1) : последовательность связанных кадров или сцен, раскрывающих отдельный объект или этап рассказа фильма.

3а : порядок преемственности

б : Упорядочение времен последовательных глаголов в предложении, предназначенное для выражения связных отношений, особенно между главной и подчиненной частями.

б : дальнейшее развитие

5 : непрерывность развития повествовательная последовательность

переходный глагол

1 : расположить по порядку

2 : для определения последовательности химических компонентов (таких как аминокислотные остатки или основания нуклеиновых кислот) в

белков | Безграничная биология

Типы и функции белков

Белки выполняют множество важных физиологических функций, в том числе катализируют биохимические реакции.

Цели обучения

Различать типы и функции белков

Основные выводы

Ключевые моменты

• Белки необходимы для основных физиологических процессов жизни и выполняют функции во всех системах человеческого тела.
• Форма белка определяет его функцию.
• Белки состоят из аминокислотных субъединиц, которые образуют полипептидные цепи.
• Ферменты катализируют биохимические реакции, ускоряя химические реакции, и могут либо разрушать свой субстрат, либо строить более крупные молекулы из субстрата.
• Форма активного центра фермента соответствует форме субстрата.
• Гормоны — это тип белков, используемых для передачи сигналов и коммуникации клеток.

Ключевые термины

• аминокислота : Любая из 20 встречающихся в природе α-аминокислот (имеющих амино- и карбоксильные группы на одном атоме углерода) и различных боковых цепей, которые объединяются через пептидные связи с образованием белков.
• полипептид : любой полимер (одинаковых или разных) аминокислот, соединенных пептидными связями.
• катализатор : для ускорения процесса.

Типы и функции белков

Белки выполняют важные функции во всех системах человеческого тела. Эти длинные цепи аминокислот критически важны для:

• катализирующие химические реакции
• синтез и восстановление ДНК
• транспортировка материалов по камере
• прием и отправка химических сигналов
• отвечает на раздражители
• обеспечивает структурную поддержку

Белки (полимеры) представляют собой макромолекулы, состоящие из аминокислотных субъединиц (мономеров).Эти аминокислоты ковалентно связаны друг с другом с образованием длинных линейных цепей, называемых полипептидами, которые затем складываются в определенную трехмерную форму. Иногда эти свернутые полипептидные цепи функционируют сами по себе. В других случаях они объединяются с дополнительными полипептидными цепями, чтобы сформировать окончательную структуру белка. Иногда в конечном белке также требуются неполипептидные группы. Например, гемогобин, белок крови, состоит из четырех полипептидных цепей, каждая из которых также содержит молекулу гема, имеющую кольцевую структуру с атомом железа в центре.

Белки имеют разную форму и молекулярную массу в зависимости от аминокислотной последовательности. Например, гемоглобин — это глобулярный белок, что означает, что он складывается в компактную глобулярную структуру, но коллаген, обнаруженный в нашей коже, представляет собой волокнистый белок, что означает, что он складывается в длинную вытянутую волоконно-подобную цепь. Вы, вероятно, похожи на членов своей семьи, потому что у вас одинаковые белки, но вы выглядите иначе, чем посторонние, потому что белки в ваших глазах, волосах и остальном теле различны.

Гемоглобин человека : Структура гемоглобина человека. Α- и β-субъединицы белков выделены красным и синим цветом, а железосодержащие гемовые группы — зеленым. Из базы данных по белкам.

Поскольку форма определяет функцию, любое незначительное изменение формы белка может привести к нарушению функции белка. Небольшие изменения в аминокислотной последовательности белка могут вызвать разрушительные генетические заболевания, такие как болезнь Хантингтона или серповидно-клеточная анемия.

Ферменты

Ферменты — это белки, которые катализируют биохимические реакции, которые в противном случае не имели бы места.Эти ферменты необходимы для химических процессов, таких как пищеварение и клеточный метаболизм. Без ферментов большинство физиологических процессов протекало бы так медленно (или не протекало бы совсем), что жизнь не могла бы существовать.

Поскольку форма определяет функцию, каждый фермент специфичен для своих субстратов. Субстраты — это реагенты, которые подвергаются химической реакции, катализируемой ферментом. Место, где субстраты связываются с ферментом или взаимодействуют с ним, известно как активный сайт, потому что это место, где происходит химия.Когда субстрат связывается со своим активным центром на ферменте, фермент может способствовать его распаду, перегруппировке или синтезу. Помещая субстрату определенную форму и микроокружение в активном центре, фермент стимулирует протекание химической реакции. Есть два основных класса ферментов:

Ферментная реакция : Катаболическая ферментативная реакция, показывающая, что субстрат точно соответствует форме активного центра.

• Катаболические ферменты: ферменты, расщепляющие субстрат
• Анаболические ферменты: ферменты, которые создают более сложные молекулы из своих субстратов

Ферменты необходимы для пищеварения: процесс расщепления более крупных молекул пищи на субъединицы, достаточно мелкие, чтобы диффундировать через клеточную мембрану и использоваться клеткой.Эти ферменты включают амилазу, которая катализирует переваривание углеводов во рту и тонком кишечнике; пепсин, катализирующий переваривание белков в желудке; липаза, катализирующая реакции, необходимые для эмульгирования жиров в тонком кишечнике; и трипсин, который катализирует дальнейшее переваривание белков в тонком кишечнике.

Ферменты также необходимы для биосинтеза: процесса создания новых сложных молекул из более мелких субъединиц, которые поставляются или генерируются клеткой.Эти биосинтетические ферменты включают ДНК-полимеразу, которая катализирует синтез новых цепей генетического материала до деления клетки; синтетаза жирных кислот, которая синтезирует новые жирные кислоты для образования жиров или мембранных липидов; и компоненты рибосомы, которая катализирует образование новых полипептидов из мономеров аминокислот.

Гормоны

Некоторые белки действуют как химические сигнальные молекулы, называемые гормонами. Эти белки секретируются эндокринными клетками, которые контролируют или регулируют определенные физиологические процессы, включая рост, развитие, метаболизм и размножение.Например, инсулин — это белковый гормон, который помогает регулировать уровень глюкозы в крови. Другие белки действуют как рецепторы для определения концентрации химических веществ и отправки сигналов для ответа. Некоторые типы гормонов, такие как эстроген и тестостерон, являются липидными стероидами, а не белками.

Другие функции белков

Белки выполняют важные функции во всех системах человеческого тела. В дыхательной системе гемоглобин (состоящий из четырех белковых субъединиц) транспортирует кислород для использования в клеточном метаболизме.Дополнительные белки в плазме крови и лимфе переносят питательные вещества и продукты обмена веществ по всему телу. Белки актин и тубулин образуют клеточные структуры, а кератин формирует структурную опору для мертвых клеток, которые становятся ногтями и волосами. Антитела, также называемые иммуноглобинами, помогают распознавать и уничтожать чужеродные патогены в иммунной системе. Актин и миозин позволяют мышцам сокращаться, а альбумин питает раннее развитие эмбриона или проростка.

Тубулин : структурный белок тубулин, окрашенный в красный цвет в клетках мыши.

Аминокислоты

Аминокислота содержит аминогруппу, карбоксильную группу и группу R и объединяется с другими аминокислотами с образованием полипептидных цепей.

Цели обучения

Опишите структуру аминокислоты и особенности, которые придают ее специфическим свойствам

Основные выводы

Ключевые моменты

• Каждая аминокислота содержит центральный атом C, аминогруппу (Nh3), карбоксильную группу (COOH) и определенную группу R.
• Группа R определяет характеристики (размер, полярность и pH) для каждого типа аминокислоты.
• Пептидные связи образуются между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой путем дегидратационного синтеза.
• Цепь аминокислот представляет собой полипептид.

Ключевые термины

• аминокислота : Любая из 20 встречающихся в природе α-аминокислот (имеющих амино- и карбоксильные группы на одном атоме углерода) и различных боковых цепей, которые объединяются через пептидные связи с образованием белков.
• Группа R : Группа R представляет собой боковую цепь, специфичную для каждой аминокислоты, которая придает определенные химические свойства этой аминокислоте.
• полипептид : любой полимер (одинаковых или разных) аминокислот, соединенных пептидными связями.

Структура аминокислоты

Аминокислоты — это мономеры, из которых состоят белки. Каждая аминокислота имеет одинаковую фундаментальную структуру, которая состоит из центрального атома углерода, также известного как альфа (α) углерод, связанного с аминогруппой (NH ₂ ), карбоксильной группой (COOH) и водородом. атом.В водной среде клетки как аминогруппа, так и карбоксильная группа ионизируются в физиологических условиях, и поэтому имеют структуры -NH ₃ ⁺ и -COO ^— соответственно. Каждая аминокислота также имеет другой атом или группу атомов, связанных с центральным атомом, известную как группа R. Эта группа R или боковая цепь придает каждой аминокислоте специфические характеристики белков, включая размер, полярность и pH.

Аминокислотная структура : Аминокислоты имеют центральный асимметричный углерод, к которому присоединены аминогруппа, карбоксильная группа, атом водорода и боковая цепь (R-группа).Эта аминокислота неионизирована, но если ее поместить в воду с pH 7, ее аминогруппа получит другой водород и положительный заряд, а гидроксил в своей карбоксильной группе потеряет водород и получит отрицательный заряд.

Типы аминокислот

Название «аминокислота» происходит от аминогруппы и карбоксикислотной группы в их основной структуре. В белках присутствует 21 аминокислота, каждая из которых имеет определенную R-группу или боковую цепь. Десять из них считаются незаменимыми аминокислотами для человека, потому что человеческий организм не может их производить, и они должны быть получены с пищей.Все организмы имеют разные незаменимые аминокислоты в зависимости от их физиологии.

Типы аминокислот : В белках обычно встречается 21 обычная аминокислота, каждая из которых имеет свою группу R (группу вариантов), которая определяет ее химическую природу. 21-я аминокислота, не показанная здесь, представляет собой селеноцистеин с группой R -CH ₂ -SeH.

Характеристики аминокислот

Какие категории аминокислот вы ожидаете найти на поверхности растворимого белка, а какие — внутри? Какое распределение аминокислот вы ожидаете найти в белке, встроенном в липидный бислой?

Химический состав боковой цепи определяет характеристики аминокислоты.Аминокислоты, такие как валин, метионин и аланин, неполярны (гидрофобны), тогда как аминокислоты, такие как серин, треонин и цистеин, полярны (гидрофильны). Боковые цепи лизина и аргинина заряжены положительно, поэтому эти аминокислоты также известны как основные (с высоким pH) аминокислоты. Пролин является исключением из стандартной структуры аминокислоты, поскольку его группа R связана с аминогруппой, образуя кольцеобразную структуру.

Аминокислоты обозначаются одной заглавной буквой или трехбуквенным сокращением.Например, валин обозначается буквой V или трехбуквенным символом val.

Пептидные облигации

Последовательность и количество аминокислот в конечном итоге определяют форму, размер и функцию белка. Каждая аминокислота связана с другой аминокислотой ковалентной связью, известной как пептидная связь. Когда две аминокислоты ковалентно связаны пептидной связью, карбоксильная группа одной аминокислоты и аминогруппа входящей аминокислоты объединяются и высвобождают молекулу воды.Любая реакция, которая объединяет два мономера в реакцию, которая генерирует H ₂ O в качестве одного из продуктов, известна как реакция дегидратации, поэтому образование пептидной связи является примером реакции дегидратации.

Образование пептидной связи : Образование пептидной связи представляет собой реакцию синтеза дегидратации. Карбоксильная группа одной аминокислоты связана с аминогруппой входящей аминокислоты. При этом выделяется молекула воды.

Полипептидные цепи

Образовавшаяся цепочка аминокислот называется полипептидной цепью.Каждый полипептид имеет свободную аминогруппу на одном конце. Этот конец называется N-концом или амино-концом, а другой конец имеет свободную карбоксильную группу, также известную как C или карбоксильный конец. При считывании или сообщении аминокислотной последовательности белка или полипептида принято использовать направление от N к C. То есть предполагается, что первая аминокислота в последовательности находится на N-конце, а последняя аминокислота — на C-конце.

Хотя термины полипептид и белок иногда используются как взаимозаменяемые, полипептид технически представляет собой любой полимер аминокислот, тогда как термин белок используется для полипептида или полипептидов, которые свернуты должным образом, в сочетании с любыми дополнительными компонентами, необходимыми для правильного функционирования, и являются теперь работоспособен.

Структура белка

Каждый последующий уровень сворачивания белка в конечном итоге влияет на его форму и, следовательно, на его функцию.

Цели обучения

Обобщите четыре уровня структуры белка

Основные выводы

Ключевые моменты

• Структура белка зависит от его аминокислотной последовательности и локальных низкоэнергетических химических связей между атомами как в основной цепи полипептида, так и в боковых цепях аминокислот.
• Структура белка играет ключевую роль в его функции; если белок теряет форму на каком-либо структурном уровне, он может больше не функционировать.
• Первичная структура представляет собой аминокислотную последовательность.
• Вторичная структура представляет собой локальные взаимодействия между участками полипептидной цепи и включает структуры α-спирали и β-складчатых листов.
• Третичная структура — это общая трехмерная складчатость, в значительной степени обусловленная взаимодействиями между R-группами.
• Четвертичные структуры — это ориентация и расположение субъединиц в мульти-субъединичном белке.

Ключевые термины

• антипараллельно : Природа противоположных ориентаций двух цепей ДНК или двух бета-цепей, составляющих вторичную структуру белка
• дисульфидная связь : связь, состоящая из ковалентной связи между двумя атомами серы, образованная реакцией двух тиоловых групп, особенно между тиоловыми группами двух белков
• β-складчатый лист : вторичная структура белков, где группы N-H в основной цепи одной полностью вытянутой цепи устанавливают водородные связи с группами C = O в основной цепи соседней полностью вытянутой цепи
• α-спираль : вторичная структура белков, где каждый N-H основной цепи создает водородную связь с группой C = O аминокислоты на четыре остатка ранее в той же спирали.

Форма белка имеет решающее значение для его функции, поскольку она определяет, может ли белок взаимодействовать с другими молекулами. Белковые структуры очень сложны, и только совсем недавно исследователи смогли легко и быстро определить структуру полных белков вплоть до атомного уровня. (Используемые методы относятся к 1950-м годам, но до недавнего времени они были очень медленными и трудоемкими в использовании, поэтому полные белковые структуры решались очень медленно.) Ранние структурные биохимики концептуально разделили белковые структуры на четыре «уровня», чтобы упростить задачу. чтобы понять сложность общей структуры.Чтобы определить, как белок приобретает свою окончательную форму или конформацию, нам необходимо понять эти четыре уровня структуры белка: первичный, вторичный, третичный и четвертичный.

Первичная структура

Первичная структура белка — это уникальная последовательность аминокислот в каждой полипептидной цепи, из которой состоит белок. На самом деле, это просто список аминокислот в полипептидной цепи, а не ее структура. Но поскольку окончательная структура белка в конечном итоге зависит от этой последовательности, это было названо первичной структурой полипептидной цепи.Например, гормон поджелудочной железы инсулин имеет две полипептидные цепи, A и B.

Первичная структура : Цепь А инсулина состоит из 21 аминокислоты, а цепь В — из 30 аминокислот, и каждая последовательность уникальна для белка инсулина.

Ген или последовательность ДНК в конечном итоге определяет уникальную последовательность аминокислот в каждой пептидной цепи. Изменение нуклеотидной последовательности кодирующей области гена может привести к добавлению другой аминокислоты к растущей полипептидной цепи, вызывая изменение структуры белка и, следовательно, функции.

Гемоглобин, транспортирующий кислород, состоит из четырех полипептидных цепей, двух идентичных α-цепей и двух идентичных β-цепей. При серповидно-клеточной анемии простая замена аминогруппы в β-цепи гемоглобина вызывает изменение структуры всего белка. Когда аминокислота глутаминовая кислота заменяется валином в β-цепи, полипептид складывается в несколько иную форму, что создает дисфункциональный белок гемоглобина. Итак, всего одна замена аминокислоты может вызвать кардинальные изменения.Эти дисфункциональные белки гемоглобина в условиях низкого содержания кислорода начинают связываться друг с другом, образуя длинные волокна, состоящие из миллионов агрегированных гемоглобинов, которые искажают эритроциты в форме полумесяца или «серпа», которые закупоривают артерии. Люди, страдающие этим заболеванием, часто испытывают одышку, головокружение, головные боли и боли в животе.

Серповидно-клеточная анемия : серповидные клетки имеют форму полумесяца, тогда как нормальные клетки имеют форму диска.

Вторичная структура

Вторичная структура белка — это любые регулярные структуры, возникающие в результате взаимодействий между соседними или соседними аминокислотами, когда полипептид начинает складываться в свою функциональную трехмерную форму.Вторичные структуры возникают, когда образуются Н-связи между локальными группами аминокислот в области полипептидной цепи. Редко одна вторичная структура распространяется по всей полипептидной цепи. Обычно это просто часть цепочки. Наиболее распространенными формами вторичной структуры являются α-спиральные и β-складчатые листовые структуры, и они играют важную структурную роль в большинстве глобулярных и волокнистых белков.

Вторичная структура : α-спираль и β-складчатый лист образуются из-за водородной связи между карбонильной и аминогруппой в основной цепи пептида.Некоторые аминокислоты имеют склонность к образованию α-спирали, а другие — к образованию β-складчатого листа.

В цепи α-спирали водородная связь образуется между атомом кислорода в карбонильной группе основной цепи полипептида в одной аминокислоте и атомом водорода в аминогруппе основной цепи полипептида другой аминокислоты, которая находится на четыре аминокислоты дальше по цепи. Это удерживает отрезок аминокислот в правой спирали. Каждый виток в альфа-спирали имеет 3.6 аминокислотных остатков. Группы R (боковые цепи) полипептида выступают из цепи α-спирали и не участвуют в Н-связях, которые поддерживают структуру α-спирали.

В β-гофрированных листах участки аминокислот сохраняются в почти полностью вытянутой конформации, которая «складывается» или зигзагообразно из-за нелинейной природы одиночных ковалентных связей C-C и C-N. β-гофрированные листы никогда не встречаются в одиночку. Они должны удерживаться на месте другими β-гофрированными листами. Участки аминокислот в β-складчатых листах удерживаются в их складчатой ​​структуре листа, потому что водородные связи образуются между атомом кислорода в карбонильной группе полипептидной основной цепи одного β-складчатого листа и атомом водорода в аминогруппе полипептидного каркаса другого β-складчатого листа. лист гофрированный.Скрепляющие друг друга β-гофрированные листы выровнены параллельно или антипараллельно друг другу. Группы R аминокислот в β-складчатом листе указывают перпендикулярно водородным связям, удерживающим β-складчатые листы вместе, и не участвуют в поддержании структуры β-складчатого листа.

Третичная структура

Третичная структура полипептидной цепи — это ее общая трехмерная форма после того, как все элементы вторичной структуры сложены вместе друг с другом.Взаимодействия между полярной, неполярной, кислотной и основной R-группой в полипептидной цепи создают сложную трехмерную третичную структуру белка. Когда сворачивание белка происходит в водной среде организма, гидрофобные группы R неполярных аминокислот в основном лежат внутри белка, в то время как гидрофильные группы R лежат в основном снаружи. Боковые цепи цистеина образуют дисульфидные связи в присутствии кислорода, единственную ковалентную связь, образующуюся во время сворачивания белка.Все эти взаимодействия, слабые и сильные, определяют окончательную трехмерную форму белка. Когда белок теряет свою трехмерную форму, он больше не функционирует.

Третичная структура : Третичная структура белков определяется гидрофобными взаимодействиями, ионными связями, водородными связями и дисульфидными связями.

Четвертичная структура

Четвертичная структура белка — это то, как его субъединицы ориентированы и расположены относительно друг друга.В результате четвертичная структура применима только к многосубъединичным белкам; то есть белки, состоящие из более чем одной полипептидной цепи. Белки, полученные из одного полипептида, не будут иметь четвертичной структуры.

В белках с более чем одной субъединицей слабые взаимодействия между субъединицами помогают стабилизировать общую структуру. Ферменты часто играют ключевую роль в связывании субъединиц с образованием конечного функционирующего белка.

Например, инсулин представляет собой шарообразный глобулярный белок, который содержит как водородные связи, так и дисульфидные связи, которые удерживают вместе две его полипептидные цепи.Шелк — это волокнистый белок, который образуется в результате водородных связей между различными β-складчатыми цепями.

Четыре уровня структуры белка : На этих иллюстрациях можно увидеть четыре уровня структуры белка.

Денатурация и сворачивание белка

Денатурация — это процесс, при котором белки теряют свою форму и, следовательно, свою функцию из-за изменений pH или температуры.

Цели обучения

Обсудить процесс денатурации белка

Основные выводы

Ключевые моменты

• Белки меняют свою форму при воздействии различных значений pH или температуры.
• Организм строго регулирует pH и температуру, чтобы предотвратить денатурацию белков, таких как ферменты.
• Некоторые белки могут восстанавливаться после денатурации, а другие — нет.
• Белки-шапероны помогают некоторым белкам принимать правильную форму.

Ключевые термины

• шаперонин : белки, которые обеспечивают благоприятные условия для правильного сворачивания других белков, тем самым предотвращая агрегацию
• денатурация : изменение складчатой ​​структуры белка (и, следовательно, физических свойств), вызванное нагреванием, изменением pH или воздействием определенных химических веществ

Каждый белок имеет свою собственную уникальную последовательность аминокислот, и взаимодействия между этими аминокислотами создают определенную форму.Эта форма определяет функцию белка, от переваривания белка в желудке до переноса кислорода в кровь.

Изменение формы белка

Если белок подвержен изменениям температуры, pH или воздействию химикатов, внутренние взаимодействия между аминокислотами белка могут измениться, что, в свою очередь, может изменить форму белка. Хотя аминокислотная последовательность (также известная как первичная структура белка) не изменяется, форма белка может измениться настолько, что станет дисфункциональной, и в этом случае белок считается денатурированным.Пепсин, фермент, расщепляющий белок в желудке, действует только при очень низком pH. При более высоких значениях pH конформация пепсина, способ сворачивания его полипептидной цепи в трех измерениях, начинает меняться. В желудке поддерживается очень низкий уровень pH, чтобы пепсин продолжал переваривать белок и не денатурировал его.

Ферменты

Поскольку почти все биохимические реакции требуют ферментов, и поскольку почти все ферменты оптимально работают только в относительно узких диапазонах температуры и pH, многие гомеостатические механизмы регулируют соответствующие температуры и pH, чтобы ферменты могли поддерживать форму своего активного центра.

Реверс денатурации

Часто можно обратить денатурацию, потому что первичная структура полипептида, ковалентные связи, удерживающие аминокислоты в их правильной последовательности, не повреждены. После удаления денатурирующего агента первоначальные взаимодействия между аминокислотами возвращают белок к его исходной конформации, и он может возобновить свою функцию.

Однако денатурация может быть необратимой в экстремальных ситуациях, например, при жарке яйца. Тепло от сковороды денатурирует белок альбумина в жидком яичном белке, и он становится нерастворимым.Белок в мясе также денатурирует и становится твердым при приготовлении.

Денатурация белка иногда необратима. : (Вверху) Белковый альбумин в сыром и вареном яичном белке. (Внизу) Аналогия со скрепкой визуализирует процесс: когда скрепки сшиваются, скрепки («аминокислоты») больше не перемещаются свободно; их структура перестраивается и «денатурируется».

Белки-шапероны (или шаперонины) являются белками-помощниками, которые обеспечивают благоприятные условия для сворачивания белков.Шаперонины скапливаются вокруг формирующегося белка и предотвращают агрегацию других полипептидных цепей. Как только целевой белок сворачивается, шаперонины диссоциируют.

Расстройство исполнительной функции: симптомы, причины и лечение

Управляющая функция — это широкая группа умственных навыков, которые позволяют людям выполнять задачи и взаимодействовать с другими. Расстройство управляющей функции может нарушить способность человека организовываться и контролировать свое поведение.

Однако расстройство исполнительной функции не является конкретным, автономным диагнозом или состоянием.Напротив, неврологические, психические и поведенческие расстройства, такие как депрессия и синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ), могут влиять на исполнительную функцию человека.

Поделиться на Pinterest Нарушение исполнительной функции может повлиять на способность человека концентрироваться и управлять временем.

Управленческие функциональные навыки помогают людям выполнять задачи и взаимодействовать с другими. Они включают в себя ряд навыков, таких как:

• планирование и организация
• концентрация и управление умственным фокусом
• анализ и обработка информации
• контроль эмоций и поведения
• запоминание деталей
• управление временем
• многозадачность
• проблема- решение

Расстройство управляющей функции нарушает некоторые из этих навыков, что может повлиять на способность человека управлять собой и организовываться для достижения целей.

Тем не менее, Диагностическое и статистическое руководство по психическим расстройствам (DSM-5) не признает расстройство исполнительной функции как конкретное состояние психического здоровья. Напротив, нарушения управляющих функций являются симптомами других неврологических, психических и поведенческих расстройств.

Например, депрессия может влиять на определенные исполнительные функции, такие как память, внимание и контроль запретов. Иногда болезнь Альцгеймера может серьезно нарушить исполнительную функцию, и человек больше не может водить машину, одеваться или вести себя надлежащим образом в социальных ситуациях.

Люди с проблемами исполнительной функции могут иметь следующие симптомы:

• проблемы с контролем эмоций или импульсов
• проблемы с запуском, организацией, планированием или выполнением задач
• проблемы со слушанием или вниманием
• проблемы с краткосрочной памятью
• неспособность выполнять одновременно несколько задач или балансировать задачи
• социально неприемлемое поведение
• неспособность извлекать уроки из прошлых последствий
• трудности с решением проблем
• трудности с обучением или обработкой новой информации

Проблемы с исполнительной функцией могут привести к:

• плохой работе или школа
• проблемы формирования или поддержания отношений
• проблемы с настроением
• низкая самооценка
• избегание трудных задач
• низкая мотивация или потеря интереса к деятельности

Управляющая функция требует времени, чтобы развиться, поэтому многие из этих форм поведения являются совершенно нормально у маленьких детей.Однако, если такое поведение сохраняется, это может указывать на то, что у ребенка проблемы с исполнительными функциями. Диагноз СДВГ чаще ставят в детстве, чем во взрослом возрасте.

СДВГ — нарушение развития исполнительной функции, которое может вызвать гиперактивность, импульсивность и невнимательность.

Симптомы СДВГ могут различаться по типу и степени тяжести, но могут включать:

• ерзание, беспокойство, неспособность сидеть на месте и чрезмерно разговаривать
• действовать, не думая, и вести себя социально неприемлемым образом
• часто прерывая разговоры других людей или деятельность
• склонность к отвлечению или непродолжительное внимание
• небрежные ошибки на работе или в школе
• трудности с организацией, выполнением или сосредоточением внимания на задачах
• общая забывчивость

Люди с проблемами исполнительной функции могут иметь СДВГ .Однако СДВГ — не единственное состояние, которое может повлиять на исполнительную функцию.

Состояния, которые могут вызвать проблемы с исполнительной функцией, включают:

Временные причины проблем с исполнительной функцией могут включать:

• истощение
• сильная боль
• стресс
• отвлекающая среда
• употребление наркотиков
• алкоголь
• сильная скука
6555

Врачи могут использовать различные тесты, чтобы оценить исполнительную функцию человека.

В задаче Stroop, например, человек смотрит на названия цветов, которые отображаются чернилами разного цвета. Таким образом, слово «красный» может появиться зелеными чернилами, а слово «желтый» — синими чернилами. Для каждого слова человек должен указать цвет чернил, а не написанное название цвета. Задача Струпа может помочь оценить умственный контроль и избирательное внимание человека.

Другие тесты, которые врач может использовать для оценки исполнительной функции, включают:

• тесты на построение следов
• тесты на рисование часов
• тесты на беглость речи
• тесты на сортировку карточек

Если врач подозревает определенное расстройство, такое как СДВГ они могут пропустить тесты исполнительного функционирования и вместо этого сравнить симптомы человека со стандартными диагностическими критериями этого расстройства.

Иногда врач может порекомендовать дополнительное обследование, чтобы исключить другие причины. Например, они могут заказать МРТ, чтобы исключить инсульт или опухоль головного мозга у людей с признаками деменции.

Поделиться в PinterestВрач может прописать лекарства для лечения причины нарушения исполнительной функции.

Тип лечения будет зависеть от состояния, вызывающего проблемы с исполнительной функцией.

Некоторые неврологические расстройства, в частности деменция, прогрессируют. Хотя некоторые методы лечения могут помочь замедлить развитие болезни, симптомы могут со временем ухудшаться.Однако многие причины нарушения исполнительной функции хорошо поддаются лечению.

Варианты лечения могут включать:

Управляющая функция — это набор умственных навыков, которые помогают людям планировать, организовывать, управлять своим временем, обращать внимание, обрабатывать информацию и контролировать свое поведение. Проблемы с исполнительной функцией могут влиять на все, от того, как человек взаимодействует с другими людьми, до их способности учиться и работать.

Распространенной причиной проблем управляющих функций является СДВГ, но другие причины могут включать слабоумие, депрессию, шизофрению, аутизм и травмы головного мозга.

Диагностика причины нарушения исполнительной функции может помочь определить варианты лечения, такие как лекарства и терапия. Признаки нарушения управляющей функции включают хроническую дезорганизацию, недостаток внимания, проблемы с памятью и социально неприемлемое поведение.

Приступ астмы — симптомы и причины

Обзор

Во время приступа астмы, также называемого обострением астмы, дыхательные пути опухают и воспаляются. Мышцы вокруг дыхательных путей сокращаются, и из них выделяется лишняя слизь, вызывая сужение дыхательных (бронхиальных) трубок.

Во время приступа вы можете кашлять, хрипеть и испытывать затрудненное дыхание. Симптомы легкого приступа астмы проходят при своевременном лечении в домашних условиях. Тяжелый приступ астмы, который не проходит при лечении в домашних условиях, может стать опасным для жизни.

Ключ к остановке приступа астмы — это своевременное распознавание и лечение приступа астмы. Следуйте плану лечения, который вы разработали вместе с врачом заранее. Ваш план лечения должен включать в себя, что делать, когда ваша астма начинает ухудшаться, и как справиться с приступом астмы.

Продукты и услуги

Показать больше товаров от Mayo Clinic

Симптомы

Признаки и симптомы приступа астмы включают:

• Сильная одышка, стеснение в груди или боль, кашель или хрипы
• Показания низкого пикового потока выдоха (PEF), если вы используете измеритель пикового потока
• Симптомы, которые не исчезают при использовании быстродействующего (аварийного) ингалятора

Признаки и симптомы приступа астмы варьируются от человека к человеку.Поработайте со своим врачом, чтобы определить ваши конкретные признаки и симптомы обострения астмы — и что делать, если они возникают.

Если симптомы астмы не улучшаются или не ухудшаются после приема лекарств, назначенных врачом, вам может потребоваться неотложная помощь. Ваш врач может помочь вам научиться распознавать приступ астмы, чтобы вы знали, когда обратиться за помощью.

Когда обращаться к врачу

Если у вас обостряется астма, немедленно выполните шаги лечения, которые вы и ваш врач разработали в своем письменном плане лечения астмы.Если ваши симптомы и показатели пиковой скорости выдоха улучшатся, может потребоваться домашнее лечение. Если ваши симптомы не улучшатся при лечении в домашних условиях, вам может потребоваться неотложная помощь.

При обострении симптомов астмы следуйте письменным инструкциям в плане лечения астмы по использованию быстродействующего (аварийного) ингалятора. Показания PEF в диапазоне от 51% до 79% от ваших личных результатов являются признаком того, что вам нужно использовать быстродействующие (спасательные) лекарства, прописанные вашим врачом.

Проконсультируйтесь с врачом по поводу мер контроля астмы.

Астма может измениться со временем, поэтому вам необходимо периодически вносить корректировки в свой план лечения, чтобы контролировать ежедневные симптомы. Если ваша астма плохо контролируется, у вас больше шансов получить приступ астмы. Затяжное воспаление легких означает, что астма может вспыхнуть в любой момент.

Сходите на все плановые посещения врача. Если у вас регулярные обострения астмы, или если у вас низкие значения пиковой скорости потока или другие признаки того, что астма плохо контролируется, запишитесь на прием к врачу.

Когда обращаться за неотложной медицинской помощью

Немедленно обратитесь за медицинской помощью, если у вас есть признаки или симптомы серьезного приступа астмы, в том числе:

• Сильная одышка или хрипы, особенно ночью или ранним утром
• Неспособность говорить более коротких фраз из-за одышки
• Напряжение грудных мышц для дыхания
• Показания низкого пикового расхода при использовании пикового расходомера
• Нет улучшений после использования быстродействующего (аварийного) ингалятора

Причины

Чрезмерно чувствительная иммунная система заставляет ваши дыхательные пути (бронхи) воспаляться и опухать при воздействии определенных триггеров.Триггеры астмы варьируются от человека к человеку. Общие триггеры приступа астмы включают:

• Пыльца, домашние животные, плесень и пылевые клещи
• Инфекции верхних дыхательных путей
• Табачный дым
• Вдыхание холодного, сухого воздуха
• Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ)
• Напряжение

У многих людей симптомы астмы ухудшаются из-за респираторных инфекций, например, вызванных простудой. У некоторых людей обострения астмы вызваны чем-то в их рабочей среде.Иногда очевидной причины приступа астмы нет.

Факторы риска

Любой человек, страдающий астмой, подвержен риску приступа астмы. Вы можете подвергаться повышенному риску серьезного приступа астмы, если:

• У вас в прошлом был тяжелый приступ астмы
• Ранее вы поступали в больницу или были в отделении неотложной помощи по поводу астмы
• Вам ранее требовалась интубация при приступе астмы
• Вы ​​используете более двух ингаляторов быстрого действия в месяц
• Приступы астмы, как правило, подкрадываются к вам, прежде чем вы заметите, что симптомы ухудшились.
• У вас есть другие хронические заболевания, такие как синусит или полипы носа, сердечно-сосудистые или хронические заболевания легких

Осложнения

Приступы астмы могут быть серьезными.Они могут:

• Прерывайте повседневную деятельность, такую ​​как сон, учеба, работа и физические упражнения, что существенно влияет на качество вашей жизни и может нарушить жизнь окружающих.
• Отправляют вас в отделение неотложной помощи, что может оказаться стрессовым и дорогостоящим.
• Привести к остановке дыхания и смерти.

Профилактика

Лучший способ избежать приступа астмы — это в первую очередь убедиться, что ваша астма хорошо контролируется. Это означает следование письменному плану лечения астмы для отслеживания симптомов и корректировки приема лекарств.

Хотя вы не сможете исключить риск приступа астмы, вероятность его возникновения у вас снижается, если текущее лечение позволяет держать астму под контролем. Принимайте ингаляционные лекарства в соответствии с вашим письменным планом лечения астмы.

Эти профилактические препараты лечат воспаление дыхательных путей, которое вызывает признаки и симптомы астмы. Принимаемые ежедневно, эти лекарства могут уменьшить или устранить обострения астмы — и вам необходимо использовать ингалятор быстрого действия.

Обратитесь к врачу, если вы следуете своему плану действий при астме, но по-прежнему испытываете частые или беспокоящие симптомы или низкие значения пиковой скорости потока.Это признаки того, что ваша астма плохо контролируется, и вам нужно посоветоваться с врачом, чтобы изменить лечение.

Если симптомы астмы обостряются во время простуды или гриппа, примите меры, чтобы избежать приступа астмы, наблюдая за функцией легких и симптомами и корректируя лечение по мере необходимости. Обязательно уменьшите воздействие факторов, вызывающих аллергию, и носите маску для лица при тренировках в холодную погоду.

Авг.