Где происходит синтез атф в клетке: АТФ — все статьи и новости

Содержание

Синтез АТФ в клетке

Аденозинтрифосфорная кислота-АТФ — обязательный энергетический компонент любой живой клетки. АТФ также нуклеотид, состоящий из азотистого основания аденина, сахара рибозы и трех остатков молекулы фосфорной кислоты. Это неустойчивая структура. В обменных процессах от нее последовательно отщепляются остатки фосфорной кислоты путем разрыва богатой энергией, но непрочной связи между вторым и третьим остатками фосфорной кислоты. Отрыв одной молекулы фосфорной кислоты сопровождается выделением около 40 кДж энергии. В этом случае АТФ переходит в аденозиндифосфорную кислоту (АДФ), а при дальнейшем отщеплении остатка фосфорной кислоты от АДФ образуется аденозинмонофосфорная кислота (АМФ).

Схема строения АТФ и превращения ее в АДФ (Т.А. Козлова, В.С. Кучменко. Биология в таблицах. М.,2000)

АДФ


Следовательно, АТФ — своеобразный аккумулятор энергии в клетке, который «разряжается» при ее расщеплении. Распад АТФ происходит в процессе реакций синтеза белков, жиров, углеводов и любых других жизненных функций клеток. Эти реакции идут с поглощением энергии, которая извлекается в ходе расщепления веществ.

АТФ синтезируется в митохондриях в несколько этапов. Первый из них — подготовительный — протекает ступенчато, с вовлечением на каждой ступени специфических ферментов. При этом сложные органические соединения расщепляются до мономеров: белки — до аминокислот, углеводы — до глюкозы, нуклеиновые кислоты — до нуклеотидов и т. д. Разрыв связей в этих веществах сопровождается выделением небольшого количества энергии. Образовавшиеся мономеры под действием других ферментов могут претерпеть дальнейший распад с образованием более простых веществ вплоть до диоксида углерода и воды.

Схема Синтез АТФ в мвтохондрии клетки

ПОЯСНЕНИЯ К СХЕМЕ ПРЕВРАЩЕНИЕ ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ В ПРОЦЕССЕ ДИССИМИЛЯЦИИ

I этап — подготовительный: сложные органические вещества под действием пищеварительных ферментов распадаются на простые, при этом выделяется только тепловая энергия.
Белки ->аминокислоты
Жиры-> глицерин и жирные кислоты
Крахмал ->глюкоза

II этап-гликолиз (бескислородный): осуществляется в гиалоплазме, с мембранами не связан; в нем участвуют ферменты; расщеплению подвергается глюкоза:

У дрожжевых грибов молекула глюкозы без участия кислорода превращается в этиловый спирт и диоксид углерода (спиртовое брожение):

У других микроорганизмов гликолиз может завершаться образованием ацетона, уксусной кислоты и т, д. Во всех случаях распад одной молекулы глюкозы сопровождается образованием двух молекул АТФ. В ходе бескислородного расщепления глюкозы в виде химической связи в молекуле АТФ сохраняется 40% анергии, а остальная рассеивается в виде теплоты.

III этап-гидролиз (кислородный): осуществляется в митохондриях, связан с матриксом митохондрий и внутренней мембраной, в нем участвуют ферменты, расщеплению подвергается молочная кислота: СзН6Оз+ЗН20 —>3СО2+ 12Н. С02 (диоксид углерода) выделяется из митохондрий в окружающую среду. Атом водорода включается в цепь реакций, конечный результат которых — синтез АТФ. Эти реакции идут в такой последовательности:

1. Атом водорода Н с помощью ферментов-переносчиков поступает во внутреннюю мембрану митохондрий, образующую кристы, где он окисляется: Н-е—>H+

 2. Протон водорода H+ (катион) выносится переносчиками на наружную поверхность мембраны крист. Для протонов эта мембрана непроницаема, поэтому они накапливаются в межмембранном пространстве, образуя протонный резервуар.

3. Электроны водорода e переносятся на внутреннюю поверхность мембраны крист и тут же присоединяются к кислороду с помощью фермента оксидазы, образуя отрицательно заряженный активный кислород (анион): O2 + е—>O2-

4. Катионы и анионы по обе стороны мембраны создают разноименно заряженное электрическое поле, и когда разность потенциалов достигнет 200 мВ, начинает действовать протонный канал. Он возникает в молекулах ферментов АТФ-синтетаз, которые встроены во внутреннюю мембрану, образующую кристы.

5. Через протонный канал протоны водородаH+ устремляются внутрь митохондрий, создавая высокий уровень энергии, большая часть которой идет на синтез АТФ из АДФ и Ф (АДФ+Ф—>АТФ), а протоны H+ взаимодействуют с активным кислородом, образуя воду и молекулярный 02:
( 4Н++202- —>2Н20+02)

Таким образом, О2, поступающий в митохондрии в процессе дыхания организма, необходим для присоединения протонов водорода Н. При его отсутствии весь процесс в митохондриях прекращается, так как электронно-транспортная цепь перестает функционировать. Общая реакция III этапа:


(2СзНбОз + 6Oз + 36АДФ + 36Ф —> 6С02 + 36АТФ + +42Н20)

В результате расщепления одной молекулы глюкозы образуются 38 молекул АТФ: на II этапе — 2 АТФ и на III этапе — 36 АТФ. Образовавшиеся молекулы АТФ выходят за пределы митохондрии и участвуют во всех процессах клетки, где необходима энергия. Расщепляясь, АТФ отдает энергию (одна фосфатная связь заключает 40 кДж) и в виде АДФ и Ф (фосфата) возвращается в митохондрии.

Урок 24. энергетика живой клетки — Естествознание — 10 класс

Энергетика живой клетки

Необходимо запомнить

ВАЖНО!

Обязательным условием существования биологических систем являются потоки энергии. В этом заключаются ключевые различия между живой и неживой природой. Ключевую роль в трансформации энергии обеспечивает клетка, как элементарная структура живого.

Из всего многообразия существующих форм энергии живые существа на нашей планете используют только две – световую и энергию химических связей. В зависимости от типа питания организмы разделают на автотрофов (от греч. «авто» — сам, «трофос» — питание) и гетеротрофов

(от греч. «гетерос» — другой, «трофос» — питание) .

Главным переносчиком энергии в клетке являются молекулы АТФ (аденозинтрифосфат) Энергия в АТФ запасается в виде высокоэнергетических химических связях между остатками фосфорной кислоты, которая освобождается при отщеплении фосфата:

АТФ → АДФ + Ф + E

Выделяемая энергия используется клетками для процессов выработки тепла, мышечных сокращений (мышечная клетка), для проведения нервного импульса (нервные клетки) и т.п.

Обратный процесс образования АТФ с затратой энергии, получил название энергетический обмен.

Синтез макромолекул важнейших органических соединений, необходимых для построения структур клетки, обеспечения всех процессов жизнедеятельности клеток – пластический обмен — обеспечивается также энергией АТФ.

Независимо от типа питания, универсальным аккумулятором энергии живых организмов выступают молекулы АТФ. Такая схожесть иллюстрирует единство происхождения всего живого.

Фотосинтез

Процесс образования органических веществ из неорганических (углекислого газа и воды) с использованием солнечной энергии получил название фотосинтез. Различают в фотосинтезе две фазы: световую и темовую.

В так называемой, световой фазе, кванты света выбивают электроны из молекулы хлорофилла ион начинает передаваться по специальным белковым переносчикам, расположенных на мембране хлоропластов. Под действием света одновременно происходит разложение воды (фотолиз). Энергия возбуждённого электрона используется на синтез АТФ и молекулу НАДФ (переносчик водорода) – в этом биологический смысл световой фазы фотосинтеза.

Побочными продуктами фотолиза воды становятся кислород и свободные электроны:

2О→ Н+ + 4е + О2

Сущность реакции темновой фазы можно выразить следующим уравнением:

СО2 + НАДФ∙Н + АТФ = С6Н12О6

+АДФ + НАДФ+

Фотосинтез, таким образом, является процессом превращения одной (световой) формы энергии в другую(химическую). Вся энергия биосферы запускается благодаря этому процессу. Другими словами, фотосинтез является отражением космических потоков энергии. Помимо этого, фотосинтезирующие организмы не только обеспечивают первичный синтез органических соединений, но и создают условия необходимые для существования других живых организмов.

Метаболизм

Поступившие вместе с пищей (или в результате фотосинтеза) органические вещества расщепляются на более простые (катаболизм или диссимиляция), которые служат для построения макромолекул органических соединений (анаболизм или ассимиляция). Эти процессы происходят в организме одновременно. Совокупность этих процессов получила название – метаболизм. В результате его организм осуществляет обмен веществом и энергией с окружающей средой.

Наибольшее значение для энергетического обмена являются многостадийные реакции окисления глюкозы.

На стадии гликолиза (бескислородного расщепления) в цитоплазме клетки происходит ферментативное расщепление молекулы глюкозы с образованием более простой пировиноградной кислоты и молекул АТФ:

С6Н12О6 + 2 АДФ + 2 Ф → С3Н4О3 + 4Н+ + 2АТФ

Молекулы пировиноградной кислоты обладают значительной энергией, высвобождение которой происходит в митохондриях. В ходе так называемого клеточного дыхания, образуется 30 молекул АТФ.

Суммарную реакцию окисления глюкозы можно представить следующим образом:

С6Н12О6+6О2+6Н2О+32АДФ+32Ф→6СО2+12Н2О +32АТФ

Некоторые микроорганизмы при недостатке кислорода расщепляют глюкозу в процессе анаэробного дыхания или брожения. В зависимости от конечных продуктов такого расцепления различают спиртовое брожение (с образование этанола), молочнокислое (молочная кислота). Последнее происходит и в мышцах, при недостатке кислорода, например во время длительной тренировки. Энергетический выход такого типа расщепления менее энергоэффективен.

Основным источником энергии для организмов является окисление глюкозы в митохондриях. При этом также может происходить окисление других органических соединений (белков, жиров), потребляемых, например, вместе с пищей. Расщепление жиров происходит с более значительным выделением энергии (чем углеводов), но этот процесс более длительный. Потреблённые белки в первую очередь идут на построение собственных белков клетки, и вовлекаются в энергетический обмен в крайних случаях. Поэтому питание должно быть сбалансированным.

Взаимосвязь энергетического и пластического обмена

Процессы аккумулирования энергии в молекулах АТФ (энергетический обмен) и использование запасённой энергии для синтеза необходимых веществ (белков, жиров, углеводов, нуклеиновых кислот) неразрывно связаны. Так синтез АТФ не возможен без разложения органических веществ, а синтез веществ клетки не возможен без энергии АТФ.

Оба процесса протекают одновременно и неотделимы друг от друга, обеспечивая жизнедеятельность организма. Таким образом, в клетках происходит трансформация вещества и энергии, которые лежат в основе существования жизни и непрерывного самообновления. Сходство процессов энергетического обмена в клетках всех живых организмов является доказательством единства их происхождения.

Вывод

Добытая энергия извне запасается в универсальных биологических аккумуляторах АТФ в виде химических связей.

В клетках происходят одновременно процессы энергетического и пластического обмена, это лежит в основе сохранения жизни. Взаимообмен энергией и веществом между живой и неживой природой является иллюстрацией принципа единства и взаимосвязи материального мира.

Сравнение энергетического и пластического обменов

Биохимия клетки (энергетика) — Департамент физической культуры и спорта

В. Н. Селуянов, В. А. Рыбаков, М. П. Шестаков

Глава 1. Модели систем организма

1.1.3. Биохимия клетки (энергетика)

Процессы мышечного сокращения, передачи нервного импульса, синтеза белка и др. идут с затратами энергии. В клетках энергия используется только в виде АТФ. Освобождение энергии, заключенной в АТФ, осуществляется благодаря ферменту АТФ азе, который имеется во всех местах клетки, где требуется энергия. По мере освобождения энергии образуются молекулы АДФ, Ф, Н. Ресинтез АТФ осуществляется в основном за счет запаса КрФ. Когда КрФ отдает свою энергию для ресинтеза АТФ, то образуется Кр и Ф. Эти молекулы распространяются по цитоплазме и активизируют ферментативную активность, связанную с синтезом АТФ. Существуют два основных пути образования АТФ: анаэробный и аэробный (Аулик И. В., 1990; Хочачка П., Сомеро Дж., 1988 и др.).

Анаэробный путь или анаэробный гликолиз связан с ферментативными системами, расположенными на мембране сарко-плазматического ретикулума и в саркоплазме. При появлении рядом с этими ферментами Кр и Ф запускается цепь химических реакций, в ходе которых гликоген или глюкоза распадаются до пирувата с образованием молекул АТФ. Молекулы АТФ тут же отдают свою энергию для ресинтеза КрФ, а АДФ и Ф вновь используются в гликолизе для образования новой молекулы АТФ. Пируват имеет две возможности для преобразования:

1) Превратиться в Ацетил коэнзим А, подвергнуться в митохондриях окислительному фосфорилированию до образования углекислого газа, воды и молекул АТФ. Этот метаболический путь — гликоген-пируват-митохондрия-углекислый газ и вода — называют аэробным гликолизом.

2) С помощью фермента ЛДГ М (лактат-дегидрогеназы мышечного типа) пируват превращается в лактат. Этот метаболический путь — гликоген-пируват-лактат — называется анаэробным гликолизом и сопровождается образованием и накоплением ионов водорода.

Аэробный путь, или окислительное фосфорилирование, связан с митохондриальной системой. При появлении рядом с митохондриями Кр и Ф с помощью митохондриальной КФК азы выполняется ресинтез КрФ за счет АТФ, образовавшейся в митохондрии. АДФ и Ф поступают обратно в митохондрию для образования новой молекулы АТФ. Для синтеза АТФ имеется два метаболических пути:

    1) аэробный гликолиз;
    2) окисление липидов (жиров).

Аэробные процессы связаны с поглощением ионов водорода, а в медленных мышечных волокнах (МВ сердца и диафрагмы) преобладает фермент ЛДГ Н (лактат дегидрогеназа сердечного типа), который более интенсивно превращает лактат в пируват. Поэтому при функционировании медленных мышечных волокон (ММВ) идет быстрое устранение лактата и ионов водорода.

Увеличение в МВ лактата и Н приводит к ингибированию окисления жиров, а интенсивное окисление жиров приводит к накоплению в клетке цитрата, а он угнетает ферменты гликолиза.



В клеточном ядре нашли альтернативный источник энергии

Гидролаза NUDIX5

Александр Ершов/PDB:2DSC

Столкнувшись с нехваткой АТФ из митохондрий, клеточное ядро может запускать собственные механизмы синтеза этих молекул. Испанские биологи установили ключевые детали работы этого «альтернативного источника энергии» и определили его важнейшие белки. Об этом рассказывает статья, опубликованная журналом Science.

Общая длина ДНК в каждой клетке человеческого тела составляет примерно 2 м, и поместить ее в ядро без сложной и плотной упаковки невозможно. При этом многие связанные с ДНК процессы, включая репликацию, репарацию и регуляцию активности генов, требуют «распаковки» хроматина и действия белков, потребляющих энергию в форме молекул АТФ. АТФ синтезируются митохондриями (реже и в небольших количествах они образуются в ходе реакций гликолиза в цитоплазме).

Однако при массированной перестройке хроматина возникает проблема доставки нужных количеств АТФ внутрь ядра. Поэтому еще более полувека назад было предположено, что в ядре существуют собственные механизмы синтеза молекул АТФ. Это продемонстрировала и новая работа, проведенная испанскими биологами под руководством Мигеля Беато (Miguel Beato) из Научно-технологического института Барселоны (BIST).

Авторы экспериментировали на культуре опухолевых клеток молочной железы. Они замерили соотношение АТФ к АДФ («использованных» молекул-носителей энергии) в разных отделах клетки: в митохондриях, в цитозоле и в ядре. Заблокировав производство АТФ в митохондриях, ученые показали, что ядро быстро исчерпывает накопленные запасы АТФ. Однако в условиях необходимости серьезной перестройки хроматина (при добавлении прогестина, стимулирующего глубокие изменения клеточного метаболизма) содержание АТФ в ядре продолжало расти, несмотря на то, что митохондрии больше не пополняли их запас.

Источником АТФ в ядре служит поли-(АДФ-рибоза) (poly-(ADP-ribose), PAR), которая используется здесь, в частности, для регулирования активности отдельных ферментов. Гидролиз PAR до отдельных мономеров проводит белок PARG. В присутствии пирофосфатов гидролаза NUDIX5 катализирует их превращение в АТФ. Мигель Беато с коллегами показали, что ингибирование любого из этих белков препятствует накоплению АТФ в ядрах клеток, даже обработанных прогестином, и ведет к резкому замедлению процессов, требующих перестройки хроматина.

Вместе с тем, авторы отметили, что и тот, и другой ферменты проявляют повышенную активность в раковых клетках. Это говорит о том, что перестройки генома, происходящие в опухоли, требуют активного синтеза АТФ внутри клеточных ядер, – и делает NUDIX5 перспективной мишенью для создания новых противоопухолевых препаратов.

Роман Фишман

Синтез АТФ

Синтез АТФ

Нуклеотидный кофермент аденозинтрифосфат [АТФ (АТР)] является наиболее важной формой сохранения химической энергии в клетках. Синтез АТФ осуществляется комплексом АТФ-синтазой, встроенным в фотосинтетическую мембрану. АТФ-синтаза работает как вращающаяся машина, крутящаяся при прохождении через неё электрического тока, создаваемого потоком протонов.

В хлоропластах большая часть энергии электрохимического протонного градиента ΔμH+, возникающего на мембране в результате работы электрон-транспортной цепи, используется для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата Pi. В соответствии с хемоосмотической теорией П. Митчелла, энергия, освобождаемая в результате работы электрон-транспортной цепи, первоначально накапливается в форме трансмембранного градиента ионов водорода. Разрядка образующегося ΔμH+ происходит с участием локализованного в той же мембране протонного АТФ-синтазного комплекса: H+ возвращаются по градиенту ΔμH+ через FoF1–АТФсинтазу, при этом без возникновения каких-либо промежуточных высокоэнергетических соединений из АДФ и неорганического фосфата образуется АТФ. (Сами мембраны в интактном состоянии непроницаемы для ионов, особенно H+ и ОH).

Локализованная в мембране FoF1–АТФсинтаза катализирует реакции синтеза и гидролиза АТФ в соответствии с уравнением
.

Реакция, протекающая слева направо, сопряжена с транспортом H+ по градиенту ΔμH+, при этом выделяется энергия ΔGnH+ = -0.023nΔμH+, что приводит к разрядке градиента и синтезу АТФ. Протекающая в противоположном направлении реакция гидролиза АТФ сопровождается выделением энергии
,
и приводит к переносу Н+ против градиента, что приводит к образованию (или возрастанию) ΔμH+ на мембране. Таким образом, АТФ-синтазный ферментный комплекс (FoF1-АТФсинтаза) служит механизмом, обеспечивающим взаимное превращение двух форм клеточной энергии (ΔμH+ и АТФ), устройством, сопрягающим процессы окислительной природы с фосфорилированием. Направление работы комплекса зависит от соотношения между ΔGnH+ и ΔGATP, т.е. от концентраций молекул АТФ и АДФ, а также величины протонодвижущей силы.




Наверх: Основные процессы в тилакоидной мембране

© 2004-2006 Кафедра биофизики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова
– О системе

— источники энергии — Биохимия

Способы получения энергии в клетке

В клетке существуют четыре основных процесса, обеспечивающих высвобождение энергии из химических связей при окислении веществ и ее запасание:

1. Гликолиз (2 этап биологического окисления) – окисление молекулы глюкозы до двух молекул пировиноградной кислоты, при этом образуется 2 молекулы АТФ и НАДН. Далее пировиноградная кислота в аэробных условиях превращается в ацетил-SКоА, в анаэробных условиях – в молочную кислоту.

2. β-Окисление жирных кислот (2 этап биологического окисления) – окисление жирных кислот до ацетил-SКоА, здесь образуются молекулы НАДН и ФАДН2. Молекулы АТФ «в чистом виде» не появляются.

3. Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК, 3 этап биологического окисления) – окисление ацетильной группы (в составе ацетил-SКоА) или иных кетокислот до углекислого газа. Реакции полного цикла сопровождаются образованием 1 молекулы ГТФ (что эквивалентно одной АТФ), 3 молекул НАДН и 1 молекулы ФАДН2.

4. Окислительное фосфорилирование (3 этап биологического окисления) – окисляются НАДН и ФАДН2, полученные в реакциях катаболизма глюкозы, аминокислот и жирных кислот. При этом ферменты дыхательной цепи на внутренней мембране митохондрий обеспечивают образование большей части клеточного АТФ.

Два способа синтеза АТФ

В клетке постоянно происходит использование всех нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ, ТТФ) как донора энергии. При этом АТФ является универсальным макроэргом, участвующим практически во всех сторонах метаболизма и деятельности клетки. И именно за счет АТФ обеспечивается фосфорилирование нуклеотидов ГМФ и ГДФ, ЦДФ, УМФ и УДФ, ТМФ и ТДФ до нуклеозидтрифосфатов. 

1. Основным способом получения АТФ в клетке является окислительное фосфорилирование, протекающее в структурах внутренней мембраны митохондрий. При этом энергия атомов водорода молекул НАДН и ФАДН2, образованных в гликолизе и ЦТК, при окислении жирных кислот и аминокислот, преобразуется в энергию связей АТФ.

2. Однако также есть другой способ фосфорилирования АДФ до АТФ – субстратное фосфорилирование. Этот способ связан с передачей макроэргического фосфата или энергии макроэргической связи какого-либо вещества (субстрата) на АДФ. К таким веществам относятся метаболиты гликолиза (1,3-дифосфоглицериновая кислота, фосфоенолпируват), цикла трикарбоновых кислот (сукцинил-SКоА) и резервный макроэрг креатинфосфат. Энергия гидролиза их макроэргической связи выше, чем 7,3 ккал/моль в АТФ, и роль указанных веществ сводится к использованию этой энергии для фосфорилирования молекулы АДФ до АТФ.

Классификация макроэргов

Макроэргические соединения классифицируются по типу связи, несущей дополнительную энергию:

1. Фосфоангидридная связь. Такую связь имеют все нуклеотиды: нуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ, ТТФ) и нуклеозиддифосфаты (АДФ, ГДФ, ЦДФ, УДФ, ТДФ).

2. Тиоэфирная связь. Примером являются ацил-производные коэнзима А: ацетил-SКоА, сукцинил-SКоА, и другие соединения любой жирной кислоты c HS-КоА.

3. Гуанидинфосфатная связь – присутствует в креатинфосфате, запасном макроэрге мышечной и нервной ткани.

4. Ацилфосфатная связь. К таким макроэргам относится метаболит гликолиза 1,3-дифосфоглицериновая кислота (1,3-дифосфоглицерат). Она обеспечивает синтез АТФ в реакции субстратного фосфорилирования.

5. Енолфосфатная связь. Представитель – фосфоенолпируват, метаболит гликолиза. Он также обеспечивает синтез АТФ в реакции субстратного фосфорилирования в гликолизе.

 

АТФ- главный энергетический спонсор клетки. Или где взять энергию?Митохондриальные дисфункции.

Сегодня внедряемся в научные изыскания . Статья будет  сложной для прочтения . Я  максимально упрощала материал , но проще — некуда. На написание меня как всегда «вдохновила» всеобщая бесконечная жалоба — «слабость , ничего не помогает, ваших  капельниц, таблеток хватило на 2 недели ….». Сегодня рассмотрим самый сложный случай дефицита Энергии —дисфункция Митохондрий.Это еще малоизученная и сложная часть медицинской науки. Дисфункция митохонодрий может быть врожденная и в нашем ( рассматриваемом случае ) — приобретенная.
Энергия в нашем организме представлена в следующем виде — молекула АТФ.
АТФ- аденозинтрифосфат, является основным источником энергии для клеток в частности  и организма в целом. Представляет собой — эфир аденозина (пурин). Кроме того,  является источником синтеза нуклеиновых кислот , для образования структуры ДНК!(наш генетический код)и посредником передачи в клетку гормонально сигнала ! Вывод : нехватка АТФ- чревата извращение/недостатоком  гормонального ответа и не только . АТФ образуется в митохондриях (это маленькие стуктурные компоненты любой клетки, митохондрия имеет  собственную ДНК!, как и ядро клетки!!,это высокоорганизованная структура ).Вот почему заболевания с нарушением синтеза АТФ  — называются митохондриальные дисфункции.
В сутки  в организме образуется 40кг АТФ. Органы с максимальной выработкой АТФ : мозг 22%,печень 22%,мышцы 22 %, сердце 9%,жировая ткань всего-  4%, заметьте -ЩЖ с в этот перечень   даже не вошла  …Мозг и печень лидеры !
Теперь о самом процессе образования энергии. Смотрим на картинку.

Процесс образования энергии можно разделить на 3 этапа.

1 этап — это получение более простых молекул( в цикл образования энергии) из  углеводов(У), жиров(Ж) и белков пищи(Б). Углеводы расщепляются до моносахаров(глюкоза,фруктоза), жиры до жирных кислот, белки до аминокислот. «Расщепление» Б,Ж,У происходит как к кислородной среде(аэробной), так и в бескислородной(анаэробной) среде. Это крайне важно ! Так как из анаэроного гликолиза 1 молекулы глюкозы  образуется — 2 молекулы АТФ, из аэробного (кислородного) гликолиза  1 молекулы глюкозы  —образуются 36 молекул АТФ, из аэробного окисления  1 молекулы жирной кислоты — 146 молекул АТФ , ( жиры и белки  в бескислородной среде вообще не расщепляются!, вывод- например, при нелеченной анемии(дефицитО2) снижение веса почти невозможно). Так,  и усвоение 1 молекулы глюкозы требует 6 молекул О2, а 1 молекулы жирных кислот -23 молекулы О2. Вывод —жиры основной источник энергии,  и всем нужен О2!!!
2 этапом -образуется из всех молекул У,Ж,Б- АцетилКоА- промежуточный метаболит.Суть этого этапа , что  кол-во выработанного АцетилКоА зависит от уровня многих витаминов и микроэлементов(витамина С , группы В, цинка, меди , железа  и др).Почему так важно для образования энергии -восполнение дефицита этих элементов!
3 этап— этот самый АцетилКоА поступает в 2 основных биохимических пути выработки АТФ— это цикл Кребса( лимонной кислоты) и цикл окислительного фосфорилирования ( передачи электронов,»дыхательная цепь»;), происходит образование НАД- и НАДН+. Связь между этими двумя б/х циклами — и «есть узкое горлышко» , «слабое место» в образовании АТФ. И зависит от рН среды клетки — при развитии в/клеточной гипоксии = в/клеточного ацидоза и ухудшается процесс образования  АТФ — организм захлебывается в избытке НАДН , а НАДН сопряжен с «утечкой кислорода из клетки»( механизм не буду расшифровывать) и образованием активных(агрессивных) форм кислорода ( свободных радикалов)- а это повреждающие агенты для клетки при образовании в  избыточном количестве .
Метаболический ацидоз — это следствие  первичного дефицита О2 в организме (сам ацидоз становится причиной вторичного дефицита О2-утечки кислорода) .Ацидоз выражается накоплением  промежуточного продукта обмена -лактата , избытоком Н+(иона водорода) , митохондрии  «начинают задыхаться и стареть и гибнуть «! А в месте со старением митохондрий — стареет организм, вот почему так молодеют некоторые заболевания — раньше  развиваются  атеросклероз, б-нь Альцгеймера,  сахарный диабет ( да-да , это митохондриальное заболевание), рак , артериальная гипертензия, АИТ, синдром хр усталости, даже НЯК и болезнь Крона( как одна из теорий) и др.
Как цикл лимонной кислоты (цикл Кребса) , например, связан с ожирением ?- активное поступления с пищей жирных кислот-  приводят к истощению транспортных карнитиновых (всем известен для сравнения Карнитин для спорт -питания) систем( переносчиков жирных кислот, их и так немного) и снижения активности работы «дыхательной цепи» , снижается чувствительность тканей к инсулину- развивается многим известная инсулинорезистентость! Исход —метаболическая печалька -метаболический синдром.
Соотвественно : причинами снижения синтеза АТФ прежде всего являются дефицит О2 !(как бывает в больших городах, где мало зелени!!, загазованность — продукт сгорания бензина это не О2-а СО2 !!!!, люди не выходят из помещений, мало двигаются — «мелкие сосуды закрыты для доступа О2», причинами могут быть  болезни органов дыхания и сердечно-сосудистые патологии), ацидоз = «закисление организма» (накопление лактата, изыток Н+), полидефицит витаминов и микроэлементов для улучшения усвоения Ж,Б,У. Для лечение дефицита О2 даже был придуман аппарат- в основе которого интервальная гипоксическая тренировка.Это новая эра в лечении многих патологий.
Как же заподозрить митохондриальные проблемы? Они сложны как для понятия , так и для диагностики.
ИЗ «простых анализов» , которые можно набрать любой лаборатории— снижение рН крови,О2, повышение : лактата, СРБ ,фибриногена, холестерина, ЛПНП, триглицеридов, гомоцистеина, мочевой кислоты, (клинически — повышение Ад, учащение ЧСС в покое, одышка в покое),
снижение ферритина, из редких- снижение глутатиона, витаминов крови, снижение Q10, нарушение в системе антикосидантов( по крови).
Из более редких , но  все же доступных анализов (более специфических)  — органические кислоты мочи ( благодаря этому анализу можно определить примерно на каком уровне идет нарушение и чем его скорректировать).
Если патология так сложно выявляемая —«как это лечить?»,- спросите вы
Лечить можно.
Прежде всего меняем  образ жизни — улучшаем доставку О2!, бросаем курить!чаще дышим в парке  и не только .. Лечим  и приводим в ремиссию хронические дыхательные заболевания , восполняем дефицит витаминов и минералов!,добавляем антиоксиданты, сосудистые препараты(!) очень важно улучшить коровок(слабость всегда сопровождается рассеянностью, снижением памяти и внимания, — правильно, максимальная сосудистая сеть в головном мозге!!) ,реже  добавляем «энергетики»-янтарная  кислота,Q10,карнитин,НАДН и др.Я не говорю здесь про врожденные митохондриальные дисфункции -это  следствие генетической поломки,а мы говорим сейчас больше о приобретенных причинах. Будем ждать новых научных материалов по этой теме …

Синтез аденозинтрифосфата — обзор

Источники метаболического топлива

Топливо для синтеза АТФ в скелетных мышцах либо хранится в мышечных клетках, либо забирается из кровотока. Использование топлива ограничено их доступностью, активностью окислительных ферментов и доступностью кислорода для их полного окисления и / или плотностью митохондрий в мышцах. Основным топливом, хранящимся в мышечных волокнах, является гликоген, триглицериды и фосфокреатин, а топливом, поступающим из кровообращения, являются жирные кислоты и глюкоза.Поскольку содержание воды в мышечных клетках может изменяться во время упражнений, концентрации мышечных субстратов часто выражаются в ммолях (или ммолях) на кг сухой мышцы.

Скелетные мышцы лошади обладают высокой способностью накапливать гликоген; у тренированных лошадей типичные значения составляют около 600–650 ммоль / кг сухой мускулатуры. 66,68,78–80 В мышцах человека подобные высокие значения достигаются только после успешных процедур углеводной загрузки. Содержание гидролизуемых углеводов в типичных кормах для спортивных лошадей уже высокое, а дополнительные углеводные добавки лишь незначительно увеличивают содержание гликогена в мышцах. 81–83 Содержание триглицеридов в скелетных мышцах лошади сильно варьирует. 83,84 Третьей формой хранимого топлива является фосфокреатин (PCr), высокоэнергетический фосфат. Хотя содержания PCr достаточно, чтобы поддерживать производство АТФ только в течение нескольких секунд, это важно как в начале, так и в конце максимальных усилий.

Основными запасами энергии за пределами мышечной ткани являются жировая ткань для липидов и печень для глюкозы, последняя образуется в результате гликогенолиза и глюконеогенеза в печени.Во время упражнений повышение концентрации адреналина (адреналина) способствует мобилизации этих запасов энергии. Глюкоза высвобождается из печени под действием глюкозо-6-фосфатазы, а липиды из жировой ткани поступают в кровоток в виде неэтерифицированных жирных кислот (NEFA). Дополнительная глюкоза может вырабатываться в печени из глицерина, который является побочным продуктом липолиза, а также из лактата и аланина, образующихся в мышцах (рис. 5.1.5).

Высвобождение питательных веществ из желудочно-кишечного тракта зависит от режима кормления перед тренировкой (см. Ниже).В общем, рацион лошадей богат углеводами (например, гемицеллюлозой), которые не разлагаются амилазой слюны и поджелудочной железы, а скорее подвергаются бактериальной ферментации в слепой и толстой кишке. С помощью этого процесса производятся короткоцепочечные (или летучие) жирные кислоты, в основном ацетат, пропионат и бутират. Было показано, что в состоянии покоя ацетат может обеспечивать примерно 30% энергии, используемой задними конечностями, 85 , в то время как пропионат используется в основном для глюконеогенеза. 86,87 Непосредственный вклад этих субстратов в потребление энергии во время упражнений неизвестен.

Синтез АТФ

Синтез АТФ включает перенос электронов из межмембранного пространства через внутреннюю мембрану обратно в матрицу. Перенос электронов из матрицы в межмембранное пространство приводит к значительной разнице pH между двумя сторонами мембраны (около 1,4 единицы pH). Митчелл признал, что это представляет собой большую разницу в энергии, потому что хемиосмотический потенциал фактически состоит из двух компонентов. Одним из компонентов является разница в концентрации ионов водорода (pH из — pH из ), обозначенная термином ΔpH.Другой компонент следует из того факта, что протоны заряжены положительно, поэтому существует разница в электрических потенциалов , обозначенная термином ΔΨ. Протонный градиент приводит к состоянию, в котором межмембранное пространство является положительным и кислым по отношению к матрице. Условное обозначение этой ситуации: положительный выход, отрицательный вход; кислотный выход, основной в . Количественно градиент энергии через мембрану представляет собой сумму энергий этих двух компонентов градиента:

Комбинация двух компонентов обеспечивает достаточную энергию для выработки АТФ мультиферментным комплексом V митохондрии, более известным как АТФ-синтаза .(См. Рисунок 1.)


АТФ-синтаза содержит домен, охватывающий мембрану, иногда известный как субъединица F 0 , и узловатый выступ, который простирается в матрикс, субъединица F 1 . Механизм АТФ-синтазы — это не то, что можно было бы наивно предсказать. Субъединица АТФ-синтазы F 1 может выполнять свою функцию лигазы (производя АТФ из АДФ и фосфата) без протонов в матрицу; однако для высвобождения АТФ требуется поток протонов через мембрану .

Существование АТФ-синтазы подразумевает, что транспорт электронов и синтез АТФ не связаны напрямую. Это подтверждается двумя экспериментальными наблюдениями: искусственный протонный градиент может привести к синтезу АТФ без переноса электронов, а молекулы, называемые разобщителями , могут переносить протоны через мембрану, минуя АТФ-синтазу. В этом случае энергия метаболизма выделяется в виде тепла. Одним из таких разобщителей является динитрофенол, показанный на рисунке. Динитрофенол — это слабая кислота, которая достаточно гидрофобна, чтобы раствориться во внутренней мембране.Он протонируется в межмембранном пространстве и депротонируется на матричной стороне мембраны. Поскольку АТФ не производится, энергия из пищи недоступна для синтеза жира. Действительно, динитрофенол использовался в качестве диетического препарата до тех пор, пока побочные эффекты, в том числе токсичность для печени, не привели к его снятию с рынка.


Жирные кислоты также являются разобщителями — слабыми кислотами, которые могут проникать через внутреннюю мембрану. У младенцев тепло тела может вырабатываться так называемыми коричневыми жировыми тканями у основания шеи.Жир кажется коричневым, потому что он содержит большое количество митохондрий, а цитохромы придают ему коричневато-красный цвет. Эти митохондрии находятся в естественном несвязанном состоянии. Жир окисляется, но вырабатывается очень мало АТФ; вместо этого метаболическая энергия преобразуется в тепло, чтобы мозг оставался в тепле и функционировал. К сожалению, с возрастом коричневая жировая ткань теряется, поэтому взрослые люди не могут сжечь лишние калории так легко и естественно.



Биосинтез АТФ

Аденозинтрифосфат (АТФ) — это высокоэнергетическая молекула, присутствующая в живых клетках.Это нуклеозидтрифосфат, который обеспечивает клетки энергией для метаболизма и используется в нескольких клеточных процессах, включая синтез ключевых биомолекул.

АТФ обычно присутствует в клетках в концентрации 1-10 мМ — он постоянно рециркулируется в организмах, чтобы обеспечить постоянный запас энергии для клеточных процессов.

АТФ можно синтезировать с помощью окислительно-восстановительных реакций, в которых в качестве источника энергии используются простые и сложные липиды или углеводы. Сложные источники энергии необходимо переваривать в более простые молекулы, прежде чем использовать их в синтезе АТФ.Сложные углеводы обычно гидролизуются до глюкозы и фруктозы, а триглицериды метаболизируются с образованием глицерина и жирных кислот.

Биосинтез АТФ путем окислительного фосфорилирования и фотофосфорилирования является основным путем производства энергии животными, растениями и микробами. Производство АТФ эукариотами обычно происходит в митохондриях клетки.

Важными путями, с помощью которых эукариоты генерируют энергию, являются гликолиз, цикл лимонной кислоты (или цикл Креба) и цепь переноса электронов (или путь окислительного фосфорилирования).

Вместе эти 3 стадии называются клеточным дыханием. У людей клеточное дыхание превращает аденозиндифосфат (АДФ) в АТФ и, таким образом, высвобождает энергию из молекул, которые богаты энергией.

Гликолиз

Гликолиз включает метаболизм глюкозы и глицерина с образованием пирувата. Эти реакции происходят в цитоплазме большинства организмов и высвобождают 2 АТФ. Здесь глюкоза превращается в пируват путем фосфорилирования с помощью двух ключевых ферментов — фосфоглицераткиназы и пируваткиназы.

Общую реакцию можно представить следующим образом:

Глюкоза + 2 NAD + + 2 ADP + 2 P i à 2 пируват + 2 NADH + 2 H + + 2 ATP + 2 H 2 O

Таким образом, каждая молекула глюкозы подвергается гликолизу с образованием 2 пирувата. Две восстановленные молекулы никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) и 2 молекулы воды (H 2 O) также образуются в результате гликолиза. Молекулы НАДН окисляются в цепи переноса электронов с образованием АТФ, а полученный пируват используется в качестве субстрата для цикла Креба.

Цикл Креба

Цикл Креба также известен как цикл трикарбоновой кислоты (ТСА) и происходит в митохондриях. Он включает серию реакций, в результате которых пируват разлагается на CO 2 , АТФ, воду и электроны.

Пируват, продуцируемый гликолизом в цитоплазме, превращается в ацетил-кофермент А (ацетил-КоА) в митохондриях. Ацетил-КоА превращается в цитрат, который затем подвергается серии реакций окислительно-восстановительного восстановления, гидратации, дегидратации и декарбоксилирования с образованием изоцитрата, альфа-кетоглютерата, сукцинл-КоА, фумерата и малата.

Эти реакции катализируются несколькими ключевыми ферментами пути, такими как цитратсинтаза, аконитаза, изоцитратдегидрогеназа и малатдегидрогеназа. В целом цикл Креба дает 2 молекулы АТФ, 6 молекул НАДН и 2 молекулы восстановленного флавинадениндинуклеотида (FADH 2 ).

Ацетил-КоА, полученный в результате метаболизма углеводов, жиров и белков в клетках, используется в цикле Креба для выработки энергии. Следовательно, это важный метаболический путь, объединяющий углеводный, жировой и белковый обмен в живых организмах.

НАДН и ФАДН 2 молекул, образующихся как побочные продукты цикла лимонной кислоты, подаются в цепь переноса электронов, где они окисляются с образованием АТФ с помощью фермента АТФ-синтазы. Этот фермент присутствует в митохондриях и катализирует производство АТФ, объединяя АДФ и неорганический фосфат.

АТФ-синтазу часто называют сложной молекулярной машиной, у которой есть центральный ротор, который движется со скоростью 150 оборотов в секунду во время синтеза АТФ.

В общей сложности каждая молекула глюкозы, подвергающаяся клеточному дыханию, производит 38 молекул АТФ — 2 АТФ из гликолиза, 2 АТФ из цикла Креба и 34 АТФ из цепи переноса электронов. {+}} \ newcommand {\ rl} {\ rightleftharpoons} \ newcommand {\ ss} {\ mathrm {SS}}% Обозначение скорости: o = 1; w = два; r = три; f = четыре \ newcommand {\ aow} {\ alpha_ {f}} \ newcommand {\ awo} {\ alpha_ {u}} \ newcommand {\ kow} {\ kf}% {\ kf (12)} \ newcommand { \ kwo} {\ ku}% {\ ku (21)} \ newcommand {\ kor} {\ conc {C} \, \ konu}% \ konu (13)} \ newcommand {\ kwf} {\ conc {C } \, \ konf}% \ konf (24)} \ newcommand {\ kro} {\ koffu}% {\ koffu (31)} \ newcommand {\ kfw} {\ kofff}% {\ kofff (42)} \ newcommand {\ krf} {\ kfc}% {\ kfc (34)} \ newcommand {\ kfr} {\ kuc}% {\ kuc (43)} \ newcommand {\ denom} {\ krf \, \ kfw + \ kro \, \ kfw + \ kro \, \ kfr} $

Создание чудо-молекулы: синтез АТФ с помощью АТФ-синтазы

АТФ — самая важная энергетическая молекула в клетке.АТФ — это активированный носитель, который накапливает свободную энергию, потому что он находится в неравновесном состоянии с продуктами его гидролиза, АДФ и Pi. Существует сильная тенденция к гидролизу (расщеплению) АТФ на АДФ и Pi, и любой процесс, связанный с этой реакцией, может быть «приведен в действие» АТФ — даже если этот процесс сам по себе будет неблагоприятным. Примеры включают транспорт других молекул через мембрану против естественного градиента и действие моторных белков.

АТФ синтезируется машиной, которая может быть еще более замечательной, АТФ-синтазой (также называемой F-АТФазой или FoF1-АТФазой).Как показано на рисунке, АТФ-синтаза представляет собой сложную вращающуюся машину, состоящую из белков $ \ sim20 $. Машина приводится в действие разницей в электрохимическом потенциале протонов на бислое (серый контур), которая состоит как из разницы pH (разницы в концентрациях протонов), так и из электростатического потенциала, то есть разности напряжений $ \ Delta \ psi $. Связанную с протонами разность свободной энергии иногда называют «движущей силой протона» или pmf. PMF управляет переносом протонов (зеленые стрелки) с положительной P-стороны на отрицательную N-сторону мембраны, что, в свою очередь, вызывает вращение c-кольца (коричневого) субъединицы Fo, которая прикреплена к $ \ gamma $ стебель (коричневый).Вращение асимметричного стержня $ \ gamma $ внутри трех каталитических $ \ alpha \ beta $ доменов (светло-голубой) субъединицы F1 обеспечивает энергию, достаточную для синтеза АТФ, точнее, для фосфорилирования АДФ.

В общем, электрохимический градиент для протонов преобразуется в механическое движение (вращение), которое, в свою очередь, создает достаточную конформационную энергию (упругую и, возможно, электростатическую), чтобы позволить крайне неблагоприятной химической реакции, снижающей АТФ.Это просто невероятно.

Термодинамический анализ синтеза АТФ

Мы можем понять движущие силы, посредством которых работает АТФ-синтаза , не имея подробных знаний или предположений относительно структурных деталей машины. Например, хотя механическая / конформационная свободная энергия временно сохраняется во время цикла синтеза, она является частью внутренней работы машины, которая не влияет на общую термодинамику. Это потому, что все молекулярные машины являются «пассивными устройствами», которые возвращаются в одно и то же состояние после цикла — по сути, машины просто являются катализаторами сложных процессов, которые могут включать как химические реакции, так и транспорт.Сами машины не поставляют энергию, а используют свободную энергию, хранящуюся в других источниках, таких как активированные носители, такие как АТФ или градиенты концентрации.

АТФ-синтаза всегда генерирует три молекулы АТФ в полном цикле вращения на 360 градусов из-за трех каталитических доменов $ \ alpha \ beta $, но количество транспортируемых протонов $ n $ (которое зависит от количества c-субъединиц — см. рисунок выше) варьируется от 8 до 15, в зависимости от организма и / или органеллы. Таким образом, общая «реакция», катализируемая АТФ-синтазой (без воды), составляет

(1)

, где «P» обозначает положительную сторону мембраны, где химический потенциал протонов выше, а «N» — «отрицательный «сторона более низкого химического потенциала.

Таким образом, общее изменение свободной энергии на синтезированный АТФ представляет собой сумму изменения химического потенциала $ \ mu $ для $ n / 3 $ протонов и стоимости свободной энергии для фосфорилирования АДФ:

(2)

Мы знаем, что общий $ \ dgtot $ должен быть отрицательным, потому что процесс действительно происходит. Отрицательный член $ \ Delta \ mu $ перевешивает положительный член $ \ Delta G $ для фосфорилирования АДФ.

Хотя отдельные члены не могут быть известны точно, мы можем приблизительно их аппроксимировать, используя нашу обычную схему идеального газа (идеального раствора).Мы будем опираться на подробное обсуждение, приведенное в разделе химического потенциала, где мы исследовали свободную энергию гидролиза ATP , $ \ Delta G (\ mbox {ATP} \ rightarrow \ mbox {ADP}) $, которая является просто отрицательное значение от желаемого значения $ \ Delta G $. Таким образом, мы имеем

(3)

, где $ \ conc {X} $ обозначает клеточную концентрацию молекулы X, а $ \ Conceq {X} $ — равновесную концентрацию. АТФ является «активированным переносчиком» свободной энергии, поскольку его концентрация далеко от равновесия… под действием АТФ-синтазы. Состояние активации для ATP эквивалентно условию, что $ \ Delta G (\ mbox {ADP} \ rightarrow \ mbox {ATP})> 0 $.

Когда равновесные и типичные клеточные значения концентраций подставляются в (3), получается, что $ \ Delta G (\ mbox {ADP} \ rightarrow \ mbox {ATP}) \ simeq 12 $ ккал / моль, что составляет примерно В 20 раз больше тепловой энергии ($ RT $ или $ k_BT $) и довольно значительное количество энергии!

Чтобы синтез АТФ продолжался, мы знаем, что общее значение $ \ dgtot $ в (2) должно быть отрицательным, поэтому изменение химического потенциала протона должно быть большим и отрицательным:

(4)

, где $ n = 8 $ для АТФ-синтазы млекопитающих.Как отмечалось выше, на протоны действуют две движущие силы: (i) разность электростатических потенциалов на мембране $ \ Delta \ psi $, которая просто создает электрическое поле, которое воздействует на протон, как вы узнали в старшей школе. физика, и (ii) разница pH $ \ Delta $ pH через мембрану, которая создает диффузионную силу, которая стремится уравнять концентрации, потому что pH — это просто мера концентрации. Доступно более полное обсуждение электростатики мембран.

Мы можем количественно оценить предыдущее описание движущих сил протонов, pmf, опять же в рамках теории идеальных решений, с помощью

(5)

, где $ F $ — постоянная Фарадея, которая просто преобразует разность потенциалов $ \ Delta \ psi $ в единицы энергии для одиночного заряда протона. Чтобы интерпретировать общий эффект этих терминов, мы должны знать соглашения, принятые для терминов «$ \ Delta $»: для pH это значение pH на стороне P минус значение pH на стороне N, что делает $ \ Delta $ pH отрицательным; для $ \ psi $ это та же направленность, поэтому напряжение на стороне N вычитается из напряжения на стороне P, что делает $ \ Delta \ psi $ положительным.В итоге оба члена $ \ Delta \ mu (\ plus {H}) $ по соглашению отрицательны. Физически абсолютное значение $ \ Delta \ mu (\ plus {H}) $ — это свободная энергия, доступная на один протон, переносимый по электрохимическому градиенту. Обратите внимание, что иногда разности электрохимических потенциалов обозначают символ $ \ Delta \ tilde {\ mu} $, чтобы напомнить нам о наличии электрического поля.

Простая кинетическая модель для синтеза АТФ

Мы можем получить более конкретное представление о том, как будет вести себя синтаза, построив простую модель массового действия, которая включает некоторые ключевые особенности ее поведения.Чтобы позволить нам построить модель, основанную на относительно небольшом количестве уравнений, мы, по сути, смоделируем синтез одного АТФ — фактически, мы будем моделировать 120 из полных 360 градусов цикла вращения. И с учетом этого ограничения мы хотим, чтобы количество протонов $ n $ делилось на 3. Мы выберем $ n = 9 $, что близко к значению $ n = 8 $ для АТФ-синтаз млекопитающих.

Модель попытается имитировать поворотный механизм в следующей последовательности шагов, как показано на рисунке.Начиная с состояния 1, АДФ и Pi будут связывать синтазу, что приведет к состоянию 3. Затем протон свяжется со стороны P мембраны, что приведет к состоянию 4, за которым следует развязывание протона на стороне N и состояние 5. (Вращение неявно включается в переходы 3 $ \ rightarrow $ 4 и 4 $ \ rightarrow $ 5, хотя для конкретности на рисунке показано, что это происходит с переходом 4 $ \ rightarrow $ 5.) Связывание, развязывание и вращение протона повторяются еще два раза, что приводит к состоянию 9. Переход в состояние 10 — это каталитическая стадия, на которой образуется АТФ, после чего происходит расщепление АТФ, оставляя машину обратно в состояние 1.Все шаги будут обратимыми, как и цикл любой молекулярной машины.

Уравнения массового действия, определяющие кинетику модели, легко записать. Используя обозначение, что $ [i] $ — это совокупность машины в состоянии $ i $, первое уравнение будет:

(6)

, где $ k_ {12} $ и $ k_ {1,10} $ — по ставкам, а $ k_ {21} $ и $ k_ {10,1} $ — по скидкам. Остальные уравнения принимают аналогичный вид. Например,

(7)

, где $ \ conc {\ plus {H} (\ mbox {N})} $ — это концентрация протонов на стороне N, $ k_ {98} $ — это действующее значение, $ k_ {89} $ — это дополнительная скорость, а $ k_ {9,10} $ и $ k_ {10,9} $ — каталитические скорости для синтеза и гидролиза, соответственно.

Чтобы полностью указать модель, нам нужны все константы скорости. Некоторые из них доступны в литературе, а другие можно оценить, что является довольно техническим процессом, который здесь обсуждаться не будет. (Параметры, используемые в числовых данных, показанных ниже, приведены в файле модели, также доступном ниже.) Однако стоит отметить, что не все константы скорости могут принимать произвольные параметры из-за обычного ограничения, которое возникает в любом цикле.

На рисунке показано стохастическое моделирование нашей роторной модели для (молекулярного) времени 1 сек.Синтез происходит со скоростью около 10 АТФ / с, но обратите внимание, что есть частые стохастические развороты. Ожидается, что такие инверсии, которые происходят на уровне общего синтеза АТФ за счет «микроскопических» инверсий среди 10 состояний, которые мы установили, будут неотъемлемой частью функционирования многих молекулярных машин. В совокупности, однако, с тысячами синтаз на митохондрию, будет очень стабильный синтез при фиксированных условиях движения. Исходный код модели (файл.bngl файл) можно скачать здесь. Моделирование было выполнено с использованием BioNetGen, платформы для кинетического моделирования, основанной на правилах.

Скорость против эффективности и синтез против накачки

Мы можем получить очень полезное общее представление о взаимосвязи между термодинамикой (движущей силой свободной энергии) и кинетикой синтеза АТФ, внимательно изучив уравнение. (2). Условие равновесия — это когда $ \ dgtot = 0 $, поэтому движущая свободная энергия для протонов точно уравновешивает свободную энергию, необходимую для фосфорилирования («синтеза») АТФ:

(8)

На графике зависимости химического потенциала от .свободная энергия синтеза, это соответствует прямой линии с наклоном $ n / 3 $, как показано на рисунке.

В равновесии чистый синтез равен нулю, что непосредственно следует из определения равновесия, основанного на сбалансированном потоке. То есть, хотя случайный АДФ может фосфорилироваться синтазой, это будет уравновешено равным числом событий гидролиза. Чем дальше система отходит от равновесия, тем сильнее движущая сила. При более сильном движении мы ожидаем более быстрого синтеза (в области выше линии равновесия).Однако будет максимальная скорость, с которой машина может работать, поэтому в конечном итоге скорость синтеза стабилизируется даже при очень интенсивном движении.

Чтобы визуализировать взаимосвязь между термодинамическим возбуждением и скоростью синтеза АТФ более количественно, полезно определить свободную энергию вождения как отрицательное значение общего изменения свободной энергии, $ \ dgdrive = — \ dgtot $. По соглашению, $ \ dgdrive $ положительно в условиях синтеза и отрицательно для обратного действия синтазы.На рисунке ниже точка, отмеченная красным крестиком X, представляет условия, используемые для генерации стохастических траекторий, показанных выше.

Как и в любой молекулярной машине, синтаза может работать в обратном направлении, и в этом случае она будет действовать как протонный насос, приводимый в действие гидролизом АТФ — как это было многократно экспериментально показано. Чем сильнее движение, тем быстрее перекачка до плато производительности из-за ограничивающих скорость химических и конформационных стадий. Такое поведение видно на рисунке для отрицательного управляющего потенциала.

По вопросу эффективности, уравнение. (2) говорит нам, что для любого конечного количества движения должна быть некоторая свободная энергия, «проливаемая» ($ \ dgtot $ рассеивается в виде тепла), когда синтез протекает с конечной скоростью. Следовательно, эффективность, измеряемая как доля свободной энергии протонов, преобразованной в химическую свободную энергию АТФ, всегда меньше 100%. Чем ниже привод, тем выше эффективность — ценой снижения скорости синтеза. Ячейка должна оптимизировать компромисс между скоростью и эффективностью для своих собственных целей… и обратите внимание, что некоторое тепловыделение не является полностью расточительным для многих организмов, которым необходимо поддерживать температуру тела.

Вращающиеся АТФазы развили много различных стехиометрий (значения $ n $), позволяя им функционировать в различных условиях, предположительно оптимизированных для разных организмов или органелл. Данный набор термодинамических условий может использоваться либо для протонной перекачки, управляемой гидролизом АТФ, либо для синтеза АТФ, управляемого PMF, в зависимости от стехиометрии. См. Пунктирную линию в таблице $ \ Delta \ mu $ vs.Рисунок $ \ Delta G $.

Благодарности

Большое спасибо Раму Анандакришнану и Зинин Чжан за полезные обсуждения, поскольку мы все узнали о ротационных АТФазах. Раму Анандакришнан подготовил цифры, основанные на данных.

Синтез АТФ, функция митохондрий и биосинтез стероидов в первичных и опухолевых клетках Лейдига грызунов1 | Биология размножения

Аннотация

Предыдущие исследования опухолевых клеток Лейдига MA-10 продемонстрировали, что нарушение митохондриальной электрон-транспортной цепи (ETC), мембранного потенциала (ΔΨ m ) или синтеза АТФ независимо ингибирует стероидогенез.Напротив, исследования первичных клеток Лейдига показали, что ETC, ΔΨ m и синтез АТФ кооперативно влияют на стероидогенез. Эти результаты предполагают существенные различия между двумя системами и ставят под сомнение степень, в которой результаты опухолевых клеток Лейдига связаны с первичными клетками. Таким образом, чтобы лучше понять сходства и различия между двумя системами, а также влияние разрушения АТФ на стероидогенез, мы провели сравнительные исследования MA-10 и первичных клеток Лейдига в аналогичных условиях разрушения митохондрий.Мы показываем, что митохондриальный синтез АТФ имеет решающее значение для стероидогенеза как в первичных, так и в опухолевых клетках Лейдига. Однако, в отличие от первичных клеток, изменение ΔΨ m в клетках MA-10 не привело к существенному снижению клеточного содержания АТФ, что вызывает недоумение, поскольку ΔΨ m обеспечивает питание митохондриальной АТФ-синтазы. Дальнейшие исследования показали, что значительная часть клеточного АТФ в клетках MA-10 образуется в результате гликолиза. Напротив, первичные клетки, по-видимому, почти полностью зависят от дыхания митохондрий для обеспечения их энергией.Исследования ингибиторов также показали, что MA-10 ETC нарушена. В этой работе подчеркивается важность митохондриального АТФ для гормонально-стимулированного производства стероидов как в MA-10, так и в первичных клетках Лейдига, при этом указывается, что следует проявлять осторожность при экстраполяции данных из опухолевых клеток на первичную ткань.

Введение

Синтез тестостерона у самцов млекопитающих осуществляется почти исключительно тестикулярными клетками Лейдига. Острый синтез тестостерона стимулируется связыванием циркулирующего лютеинизирующего гормона (ЛГ) с высокоаффинными рецепторами на плазматической мембране клеток Лейдига, что приводит к образованию 3 ‘, 5’-цАМФ [1].ЛГ через цАМФ способствует переносу холестерина на внутреннюю митохондриальную мембрану, где он метаболизируется в прегненолон (P5) с помощью фермента расщепления боковой цепи холестерина P450 (CYP11A1). Это основная точка пострецепторного контроля стероидогенеза, потому что холестерин не диффундирует свободно через митохондриальное межмембранное пространство. Некоторые белки, в том числе стероидогенный белок острой регуляции (STAR) [2] и белок-транслокатор (TSPO) [3], имеют решающее значение для этого переноса холестерина в митохондриях, работая как компоненты более крупного комплекса «переноса холестерина», недавно названного трансдуцеосомой [4 , 5].При переносе в митохондриальный матрикс холестерин метаболизируется до P5 с помощью CYP11A1. Впоследствии P5 метаболизируется ферментом 3β-гидроксистероиддегидрогеназа / изомераза (3βHSD) в эндоплазматическом ретикулуме (ER) в прогестерон (P4), который превращается в андростендион 17α-гидроксилазой / 17,20-лиазой ER цитохрома P450 ( CYP17). Андростендион, наконец, метаболизируется в ER 17β-гидроксистероиддегидрогеназой (17βHSD) с образованием андрогенного тестостерона [6].

Помимо своей центральной роли в транспорте холестерина и метаболизме в стероидогенных клетках, митохондрии наиболее известны своей ролью в синтезе АТФ.Во многих клетках митохондриальный синтез АТФ обеспечивает основную часть клеточного АТФ посредством окислительного фосфорилирования, процесса, в котором электроны перетекают от доноров электронов (NADH и FADH 2 ), генерируемых митохондриальными метаболическими процессами, к конечному акцептору электронов, кислороду. Перенос электрона происходит по ряду митохондриальных полипептидных комплексов — комплекс I (НАДН-дегидрогеназа), комплекс III (цитохром c редуктаза) и комплекс IV (цитохром c оксидаза) [7, 8] — и электрохимически связан с перемещение протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, генерирующее протонодвижущую силу, состоящую из электрического градиента (ΔΨ m ) и градиента H + (ΔpH).Потенциал митохондриальной мембраны (ΔΨ m ) используется митохондриями для множества процессов, включая питание митохондриальной АТФ-синтазы [7, 8].

Помимо продукции путем окислительного фосфорилирования, АТФ синтезируется путем цитозольного гликолиза [9]. Хотя гликолиз производит гораздо меньше АТФ за цикл, чем окислительное фосфорилирование [9], тем не менее, он играет важную роль в некоторых клетках млекопитающих. Например, сперматозоиды содержат дышащие митохондрии, но гликолитический АТФ, по-видимому, является основным источником энергии для подвижности сперматозоидов [10, 11].Верно ли это также в отношении соматических клеток в яичке, остается открытым вопросом.

В предыдущих исследованиях с использованием опухолевых клеток Лейдига мышей MA-10 ингибирование митохондриального транспорта электронов с помощью антимицина А и митохондриального синтеза АТФ с помощью олигомицина подавляло цАМФ-стимулированный синтез стероидов (P4) [12]. Эти исследования показали, что энергетическое состояние митохондрий клеток MA-10 критически важно для регуляции стероидогенеза. Основываясь на этих открытиях на опухолевых клетках, мы исследовали эффекты ингибирования митохондриальной электрон-транспортной цепи (ETC) в первичных клетках Лейдига с помощью ингибитора ETC комплекса III миксотиазола [13].Миксотиазол подавлял синтез цАМФ и тестостерона в ответ на ЛГ, а также активность последующих стероидогенных ферментов 3βHSD, CYP17 и 17βHSD [13]. В совокупности эти исследования продемонстрировали, что нарушение митохондрий подавляет биосинтез стероидов на нескольких этапах стероидогенного пути. Эти исследования не рассматривали относительный вклад определенных энергетических функций митохондрий — транспорта электронов, ΔΨ m и синтеза АТФ — в контроль стероидогенеза.Знание этого вклада важно для нашего механистического понимания синтеза и метаболизма стероидов.

Во многих предыдущих исследованиях клеточной энергетики в связи со стероидогенезом клеток Лейдига в качестве модельной системы использовались гормонально-чувствительные клетки Лейдига опухоли мыши МА-10 [12, 14, 15]. Однако степень, в которой результаты, полученные с этими клетками, могут быть экстраполированы на первичные клетки, является неопределенной, поскольку быстрорастущие типы опухолевых клеток, такие как клетки MA-10, обычно демонстрируют заметно измененный энергетический метаболизм по сравнению с клетками, свежевыделенными из их ткани. происхождение [9, 16, 17].Основная цель настоящего исследования состояла в том, чтобы критически сравнить взаимосвязь между митохондриальным метаболизмом и синтезом стероидов в первичных и опухолевых клетках Лейдига. С этой целью были проанализированы взаимосвязи между ΔΨ m , клеточными уровнями АТФ, источниками синтеза АТФ и стероидогенезом в первичных клетках Лейдига, свежевыделенных из семенников крысы, по сравнению с опухолевыми клетками Лейдига МА-10. Мы сообщаем, что первичные уровни АТФ в клетках Лейдига были очень чувствительны к разрушению ΔΨ m , тогда как клетки MA-10 получали значительную часть своего клеточного АТФ в результате гликолиза.Кроме того, между двумя типами клеток наблюдались различия в функции митохондриальной ETC. Однако стероидогенная функция обоих типов клеток сильно зависела от митохондриального АТФ. Настоящие результаты, вместе взятые, расширяют наши знания об энергетической регуляции стероидогенеза и указывают на центральную роль митохондриального АТФ в стероидогенезе. Однако результаты также показывают, что, учитывая важные различия между MA-10 и первичными клетками, следует проявлять осторожность перед экстраполяцией данных, полученных с опухолью, на первичные клетки Лейдига.

Материалы и методы

Материалы

Ротенон, антимицин А, цианид натрия, карбонилцианид m Было получено -хлорфенилгидразон (CCCP), олигомицин, 2-дезоксиглюкоза (2-DG), дибутирил-цАМФ (dbcAMP) и 22 (R) -гидроксихолестерин (HC). от Sigma-Aldrich. P5, P4, андростендион и тестостерон были приобретены у Steraloids. Метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM) и этиловый эфир тетраметилродамина (TMRE) были приобретены у Molecular Probes.Коллагеназа типа IV была получена от Worthington. Антитела к тестостерону и P4 были получены от MP Biomedicals. Bovine LH (USDA-bLH-B-6) был предоставлен Гормональной программой для животных Министерства сельского хозяйства США.

Животные

крысы Brown Norway (возраст, 4 мес.) Были получены от Harlan Sprague Dawley через Национальный институт старения и размещены в помещениях для животных Школы общественного здравоохранения Блумберга Джонса Хопкинса (22 ° C, 14L: 10D) с доступом к корму. и вода без ограничений.Обращение с животными и уход за ними осуществлялись в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Джонса Хопкинса.

Выделение клеток Лейдига и культура опухолевых клеток Лейдига

клеток Лейдига выделяли от 4-месячных крыс Brown Norway, как описано ранее [18]. Вкратце, артерию яичка канюлировали и перфузировали коллагеназой типа IV (1 мг / мл) в буфере для диссоциации (среда M199 с 2,2 г / л Hepes, 0.1% бычий сывороточный альбумин, 25 мг / л ингибитора трипсина и 0,7 г / л бикарбоната натрия [pH 7,4]). Затем семенники декапсулировали и диссоциацию продолжали при 34 ° C при более низкой концентрации (0,25 мг / мл) коллагеназы с медленным встряхиванием (90 циклов / мин). Семенные канальцы удаляли фильтрованием через нейлоновую сетку (размер пор 100 мкм). Оставшуюся фракцию центрифугировали при 250 × g и осадок ресуспендировали в 55% изотоническом перколле. Суспензию Перколла центрифугировали 1 ч при 27000 × g , а клетки Лейдига — с плотностью 1.Для последующих экспериментов собирали 07 г / мл и более. Чистота клеток Лейдига, определенная по их окрашиванию на активность 3βHSD [19], была выше 95% во всех экспериментах. Жизнеспособность клеток, по оценке исключения трипанового синего, составляла более 90%.

Клетки Лейдига опухоли мышей MA-10, полученные из опухолей Лейдига мышей [20], были подарком доктора Марио Асколи (Отдел фармакологии Медицинского колледжа Карвера, Университет Айовы, Айова-Сити, Айова). Клетки культивировали в колбах для культивирования клеток 2 размером 75 см (Dow Corning Corp.) и были выращены на полной среде Waymouth MB 752/1 (Invitrogen), содержащей 15% лошадиной сыворотки (Invitrogen), при 34 ° C в 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе.

Двухфотонная лазерная сканирующая микроскопия

Катионный потенциометрический флуоресцентный краситель TMRM использовали для мониторинга изменений ΔΨ m с помощью двухфотонной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии. Большой градиент потенциала на внутренней митохондриальной мембране приводит к накоплению TMRE в компартменте матрикса в соответствии с его потенциалом Нерста.Клетки нагружали 100 нМ TMRM, добавляя краситель в среду и давая поглощение в течение 5 минут при 34 ° C. Двухфотонную микроскопию проводили, как описано ранее [21]. Вкратце, изображения были записаны с использованием двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа (Bio-Rad MRC-1024MP) с возбуждением на 740 нм (лазер Tsunami Ti: Sa; Spectra Physics). Из-за перекрытия сечений двухфотонного возбуждения двух представляющих интерес флуорофоров (NADH и TMRM) эта длина волны позволяла одновременно регистрировать NAD (P) H: NAD (P) + окислительно-восстановительного потенциала и ΔΨ . м .Красную эмиссию TMRE собирали при 605 ± 25 нм, а эмиссию NADH собирали как общую флуоресценцию при длине менее 490 нм. С 2-минутными интервалами одновременно были собраны и сохранены изображения каналов излучения размером 512 × 512 пикселей, 8 бит, шкала серого. Средняя мощность Ti: Sa-лазера составляла 1000 мВт, а ширина полосы импульса составляла приблизительно 12 нм, что соответствовало длительности импульса менее 60 фс при частоте повторения 80 МГц. Это возбуждение ослаблялось оптической системой и комбинацией фильтров нейтральной плотности, так что средняя интенсивность в фокальной плоскости была менее 10 мВт.Изображения были проанализированы и добавлены цвета в автономном режиме с использованием программного обеспечения ImageJ (Wayne Rasband, National Institutes of Health; http://rsbweb.nih.gov/ij/).

Флуоресцентный микропланшет Измерение ΔΨ

м

Измерения флуоресцентных микропланшетов митохондрий ΔΨ м выполняли, как описано ранее [22], с изменениями. Вкратце, первичные клетки или клетки Лейдига MA-10 помещали в 96-луночные планшеты (50000 клеток / лунку) и оставляли для прилипания в течение 1 часа перед инкубацией клеток в феноловом красном M199, содержащем 100 нМ потенциометрического красителя TMRE, в течение 30 минут при 34 ° С.После загрузки клетки промывали PBS и подвергали воздействию различных концентраций энергетических токсинов, используемых в настоящем исследовании, суспендированных в M199, не содержащем фенолового красного, в течение 15 минут при 34 ° C. После этого периода инкубации среду удаляли, и клетки трижды промывали PBS перед тем, как оставить клетки суспендированными в PBS после последней промывки. Флуоресценцию TMRE считывали немедленно с использованием флюоресцентного микропланшетного ридера (Bio-Rad) с длиной волны возбуждения 530 нм и длиной волны излучения 590 нм.

Анализ АТФ

Уровни АТФ в клетках оценивали с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток Promega (Promega G7570; Fisher Scientific). Очищенные первичные опухолевые клетки или опухолевые клетки МА-10 (3,3 × 10 4 клеток / лунку) помещали в 96-луночные планшеты для люминесцентного анализа (Costar, Fisher Scientific). Среды для обработки готовили в 100 мкл среды M199, не содержащей фенолового красного (Invitrogen). Группы лечения анализировали в трех-четырех повторностях. После инкубации при 34 ° C клетки доводили до комнатной температуры и в лунки добавляли равный объем субстрата Promega Cell Titer-Glo (смесь реагента Cell-Glo и буфера).Клетки инкубировали при комнатной температуре на шейкере в течение 2 минут, после чего следовала 8-минутная инкубация при комнатной температуре для обеспечения лизиса клеток. Образцы анализировали на общую люминесценцию с использованием флюоресцентного ридера для микропланшетов (Bio-Rad). Уровни АТФ в клетках определяли по стандартным кривым для свежеприготовленных растворов АТФ (Sigma-Aldrich).

Радиоиммуноанализ тестостерона и P4

Для оценки времени и дозовых реакций первичных и опухолевых клеток Лейдига на CCCP, олигомицин, 2-DG, ротенон и антимицин A, очищенные первичные опухолевые клетки или опухолевые клетки Лейдига MA-10 (1 × 10 5 клеток / лунку) инкубировали в 96-луночных культуральных планшетах Falcon с LH (100 нг / мл) или dbcAMP (1 мМ) в присутствии возрастающих концентраций CCCP (0-10 мкМ), олигомицина (0-10 мкг / мл), 2- ДГ (0–100 мМ), антимицин А (0–10 мкМ) или ротенон (0–10 мкМ) в течение 0–2 часов.В конце инкубации среду собирали для анализа тестостерона (первичные культуры клеток) или анализа P4 (культуры клеток MA-10) с помощью радиоиммуноанализа (РИА). Вкратце, кроличьи поликлональные антитела к антитестостерону использовали в соответствии с инструкциями производителя (MP Biomedicals). Чувствительность антитела составляла 10 мкг тестостерона на пробирку с коэффициентами вариации между анализами и внутри анализов 14,0% и 13,7% соответственно. Для анализа P4 использовали кроличьи моноклональные антитела против P4 в соответствии с инструкциями производителя (MP Biomedicals).Чувствительность антитела составляла 15 пг P4 / пробирка с коэффициентами вариации между анализами и внутри анализов 8,6% и 7,4% соответственно. Для анализа передачи сигналов ЛГ и стероидогенных ферментов 3βHSD, CYP17 и 17βHSD в первичных клетках клетки инкубировали с LH (100 нг / мл), dbcAMP (1 мМ), HC (20 мкМ), P5 (10 мкМ), P4. (10 мкМ) или андростендион (5 мкМ) в течение 2 ч. В конце инкубации собирали среду для измерения тестостерона с помощью RIA.

Статистический анализ

Эксперименты проводили в трех экземплярах, если не указано иное.Каждый эксперимент состоял минимум из трех повторов. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех (или более) независимых экспериментов. При необходимости, статистический анализ выполняли с помощью теста Стьюдента t (сравнение двух наборов данных) или однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса для нескольких наборов данных, если P <0,05 ANOVA с использованием программного пакета Prism 4.02 от GraphPad, Inc.

Результаты

Ответ клеток Лейдига на деполяризацию митохондрий

Влияние митохондриального протонофора и дыхательного разобщителя CCCP на ΔΨ m исследовали на первичных клетках Лейдига крыс в реальном времени с помощью двухфотонной микроскопии.Клетки были загружены потенциометрическим флуоресцентным красителем TMRM, и относительная интенсивность флуоресценции, полученная из изображений отдельных клеток Лейдига, была количественно определена с течением времени (рис. 1, A, B и соответствующие временные кривые). Дозозависимый эффект воздействия CCCP в этом эксперименте был получен путем сравнения относительной флуоресценции клеток до и после воздействия CCCP в течение 5 минут, времени, при котором флуоресценция стабилизировалась. Как показано на рисунке 1C, митохондрии сохраняли свою ΔΨ m на уровне 0.01 мкМ CCCP, но наблюдалось снижение средней внутриклеточной флуоресценции TMRM при дозах 0,1 мкМ и выше, что указывает на потерю красителя из митохондрий из-за деполяризации. Исследования митохондрий головного мозга показали, что рассеяние ΔΨ m приводит к митохондриальному окислению НАД (Ф) Н и снижению автофлуоресценции [23]. Как показано на фиг. 1, B и D, в связи с потерей ΔΨ m клеточные уровни автофлуоресценции NAD (P) H в клетках Лейдига соответственно снизились.

Рис. 1

Двухфотонная микроскопия (TPM) митохондриальных ΔΨ m и клеточных уровней NAD (P) H в LH-стимулированных и в LH- и CCCP-стимулированных первичных клетках Лейдига. A ) TPM-изображение флуоресценции TMRM от двух клеток Лейдига и соответствующие временные кривые флуоресценции TMRM в тех же клетках, подвергнутых воздействию LH (100 нг / мл) и LH плюс 1 мкМ CCCP (стрелка). B ) TPM изображение автофлуоресценции NAD (P) H из тех же клеток Лейдига, что и в A , и соответствующие временные кривые автофлуоресценции NAD (P) H в тех же клетках, подвергнутых воздействию LH (100 нг / мл) и LH и 1 мкМ CCCP (стрелка). C ) показания TPM (среднее ± SEM) флуоресценции TMRM клеток Лейдига, подвергшихся воздействию возрастающих концентраций CCCP (0–1 мкМ) (сводка двух экспериментов, n = 20 клеток). D ) Показания TPM (среднее ± SEM) автофлуоресценции NAD (P) H клеток Лейдига, подвергшихся воздействию возрастающих концентраций CCCP (0–1 мкМ) (сводка двух экспериментов, n = 20 клеток). * P <0,001 по сравнению с клетками, инкубированными без CCCP.

Рис. 1

Двухфотонная микроскопия (TPM) митохондриальных ΔΨ m и клеточных уровней NAD (P) H в LH-стимулированных и в LH- и CCCP-стимулированных первичных клетках Лейдига. A ) TPM-изображение флуоресценции TMRM от двух клеток Лейдига и соответствующие временные кривые флуоресценции TMRM в тех же клетках, подвергнутых воздействию LH (100 нг / мл) и LH плюс 1 мкМ CCCP (стрелка). B ) TPM изображение автофлуоресценции NAD (P) H из тех же клеток Лейдига, что и в A , и соответствующие временные кривые автофлуоресценции NAD (P) H в тех же клетках, подвергнутых воздействию LH (100 нг / мл) и LH и 1 мкМ CCCP (стрелка). C ) показания TPM (среднее ± SEM) флуоресценции TMRM клеток Лейдига, подвергшихся воздействию возрастающих концентраций CCCP (0–1 мкМ) (сводка двух экспериментов, n = 20 клеток). D ) Показания TPM (среднее ± SEM) автофлуоресценции NAD (P) H клеток Лейдига, подвергшихся воздействию возрастающих концентраций CCCP (0–1 мкМ) (сводка двух экспериментов, n = 20 клеток). * P <0,001 по сравнению с клетками, инкубированными без CCCP.

Анализы на планшетах использовали для оценки ΔΨ m и АТФ в зависимости от стероидогенной способности первичных и опухолевых клеток Лейдига. На рис.2 показан эффект обработки МА-10 и первичных клеток Лейдига возрастающими концентрациями CCCP на ΔΨ m (рис.2, A и B), внутриклеточное содержание АТФ (рис. 2, C и D) и выработка стероидов (рис. 2, E и F). ΔΨ m как в MA-10, так и в первичных клетках Лейдига, измеренная с помощью флуоресцентного красителя TMRE, была высокочувствительной к CCCP, со значительным снижением, наблюдаемым при 0,05–10 мкМ CCCP и средних ингибирующих концентрациях ( IC 50 ) 0,08 ± 0,09 и 0,15 ± 0,16 мкМ CCCP для первичных клеток и клеток MA-10 соответственно (рис. 2, A и B). Деполяризация митохондрий не сопровождалась изменениями исключения красителя трипанового синего ни в одном из типов клеток, что указывает на то, что наблюдаемые эффекты не были следствием общей токсичности.В случае клеток MA-10 обработка увеличивающимися концентрациями CCCP вызвала значительное, но умеренное (~ 30%) снижение уровней АТФ при концентрациях выше 1 мкМ (фиг. 2D). В противоположность этому, в первичных клетках Лейдига, подвергшихся воздействию возрастающих концентраций CCCP, наблюдалось существенное снижение клеточного содержания АТФ, при этом ингибирование составляло приблизительно 90% при более чем 1 мкМ (фиг. 2C). IC 50 значения ингибирования АТФ 1,56 ± 0,14 и 0,97 ± 0,54 мкМ наблюдались для первичных клеток и клеток МА-10 соответственно (рис.2, В и Г). Аналогичное лечение опухоли MA-10 и первичных клеток Лейдига с увеличивающимися концентрациями CCCP привело к значительному снижению стероидогенной способности (продукция P4 в случае клеток MA-10; продукция тестостерона в случае первичных клеток Лейдига) с IC 50 значения 5,20 ± 1,66 и 3,87 ± 1,51 мкМ для первичных клеток и клеток MA-10 соответственно (рис. 2, E и F). Примечательно, что концентрация CCCP, которая вызвала значительные изменения уровней АТФ MA-10 и первичными клетками Лейдига (1 мкМ), была почти на порядок больше, чем концентрация, изменяющая ΔΨ m (0.1 мкМ) (рис.2, А и Б). Даже более высокие концентрации CCCP требовались для значительного подавления продукции стероидов (рис. 2, E и F).

Рис. 2

Влияние CCCP на LH-стимулированные первичные и MA-10 опухолевые митохондрии клеток Лейдига ΔΨ m , внутриклеточное содержание АТФ и продукцию стероидов. A и B ) Анализ флуоресцентного ридера ΔΨ m в первичных ( A ) и MA-10 опухолевых ( B ) культурах Лейдига, инкубированных с возрастающими дозами CCCP (0–10 мкМ) в наличие максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 15 мин. C и D) Уровни АТФ первичной ( C ) и опухолевой MA-10 ( D ) культур Лейдига, инкубированных с возрастающими дозами CCCP (0–10 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 мкМ). нг / мл) в течение 2 ч. E и F ) Продукция стероидов первичной ( E ) и опухолевой MA-10 ( F ) культурами Лейдига инкубировали с возрастающими дозами CCCP (0–10 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего LH ( 100 нг / мл) в течение 2 ч. Показанные точки представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех-четырех экспериментов с тремя повторами на эксперимент.* P <0,01 по сравнению с клетками, инкубированными без CCCP, # P <0,05 по сравнению с соответствующими первичными клетками или клетками MA-10.

Рис. 2

Влияние CCCP на LH-стимулированные первичные и MA-10 опухолевые митохондрии клеток Лейдига ΔΨ m , внутриклеточное содержание АТФ и продукцию стероидов. A и B ) Анализ флуоресцентного ридера ΔΨ m в первичных ( A ) и MA-10 опухолевых ( B ) культурах Лейдига, инкубированных с возрастающими дозами CCCP (0–10 мкМ) в наличие максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 15 мин. C и D) Уровни АТФ первичной ( C ) и опухолевой MA-10 ( D ) культур Лейдига, инкубированных с возрастающими дозами CCCP (0–10 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 мкМ). нг / мл) в течение 2 ч. E и F ) Продукция стероидов первичной ( E ) и опухолевой MA-10 ( F ) культурами Лейдига инкубировали с возрастающими дозами CCCP (0–10 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего LH ( 100 нг / мл) в течение 2 ч. Показанные точки представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех-четырех экспериментов с тремя повторами на эксперимент.* P <0,01 по сравнению с клетками, инкубированными без CCCP, # P <0,05 по сравнению с соответствующими первичными клетками или клетками MA-10.

Синтез АТФ и стероидогенез в опухоли по сравнению с первичными клетками Лейдига

Наблюдения за тем, что деполяризующие концентрации CCCP ΔΨ m вызывают лишь умеренные изменения в уровнях МА-10 АТФ в клетках, но сильно истощают уровни в первичных клетках Лейдига, тогда как стероидогенез снижается в обоих типах клеток, предполагают, что роль ΔΨ m Деполяризация и уровни внутриклеточного АТФ при стероидогенезе могут различаться между двумя типами клеток.Мы предположили, что могут существовать различия в важности гликолиза по сравнению с производством митохондриального АТФ для MA-10 и первичных клеток Лейдига. Чтобы проверить это, оценивали влияние культивирования МА-10 по сравнению с первичными клетками Лейдига с олигомицином, ингибитором АТФ-синтазы, на уровни АТФ и продукцию стероидов. Культивирование клеток с олигомицином не влияло на ΔΨ m ни в одном из типов клеток (фиг. 3A). Как видно на Фигуре 3B, обработка олигомицином значительно снижала уровни АТФ как в MA-10, так и в первичных клетках Лейдига.Однако, в то время как первичные клетки сохраняли только 6,4% ± 4,2% своего клеточного АТФ при воздействии CCCP, клетки MA-10 сохраняли 67,9% ± 11,9% (рис. 3B). Эти результаты предполагают, что в то время как первичные клетки получают почти весь свой клеточный АТФ из митохондриального дыхания, клетки MA-10 получают значительную часть своего клеточного АТФ из нечувствительного к олигомицину немитохондриального пула. Производство стероидов в ответ на ЛГ было одинаковым для двух типов клеток (рис. 3С).

Рис.3

Влияние олигомицина на LH-стимулированные митохондрии ΔΨ m , внутриклеточное содержание АТФ и продукцию стероидов в первичных опухолевых клетках и клетках Лейдига MA-10. Черные полосы соответствуют элементам управления; серые столбцы соответствуют лечению олигомицином. Данные представлены в процентах от контрольных значений. A ) ΔΨ m в культурах Лейдига первичной опухоли и опухоли МА-10, инкубированных с олигомицином (1 мкг / мл) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 15 мин. B ) Уровни АТФ первичных и опухолевых культур Лейдига МА-10, инкубированных с олигомицином (1 мкг / мл) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 часов. C ) Продукция стероидов первичной опухолевой культурой Лейдига и опухолевой МА-10, инкубированной с олигомицином (1 мкг / мл) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 часов. Показанные значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех экспериментов с тремя повторами на эксперимент. * P <0,001 по сравнению с клетками, инкубированными без олигомицина, # P <0,05 по сравнению с соответствующими первичными клетками или клетками MA-10.

Рис. 3

Влияние олигомицина на LH-стимулированные митохондрии ΔΨ m , внутриклеточное содержание АТФ и продукцию стероидов в первичных опухолевых клетках и клетках Лейдига MA-10.Черные полосы соответствуют элементам управления; серые столбцы соответствуют лечению олигомицином. Данные представлены в процентах от контрольных значений. A ) ΔΨ m в культурах Лейдига первичной опухоли и опухоли МА-10, инкубированных с олигомицином (1 мкг / мл) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 15 мин. B ) Уровни АТФ первичных и опухолевых культур Лейдига МА-10, инкубированных с олигомицином (1 мкг / мл) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 часов. C ) Продукция стероидов первичной опухолевой культурой Лейдига и опухолевой МА-10, инкубированной с олигомицином (1 мкг / мл) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 часов.Показанные значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех экспериментов с тремя повторами на эксперимент. * P <0,001 по сравнению с клетками, инкубированными без олигомицина, # P <0,05 по сравнению с соответствующими первичными клетками или клетками MA-10.

Для дальнейшего сравнения продукции АТФ в MA-10 и первичных клетках Лейдига соответствующие способности этих типов клеток реагировать на острое ингибирование гликолиза были протестированы путем культивирования клеток с возрастающими концентрациями 2-DG (0–100 мМ).Таким образом, 2-ДГ может служить конкурентным ингибитором гликолиза [24]. 2-ДГ не влиял на ΔΨ м ни в одном из типов ячеек (рис. 4, А и В). Однако, как видно на фиг.4, C и D, 2-DG ингибировал уровни как MA-10, так и первичных клеток Лейдига АТФ, при этом уровни в клетках MA-10 подавлялись при гораздо более низких концентрациях ( IC 50 : первичные клетки 69,94 ± 2,60 мМ; клетки МА-10 1,27 ± 1,33 мМ). Хотя 2-DG ингибировал управляемый гормонами синтез тестостерона в первичных клетках, он делал это только при очень высокой концентрации, с IC IC 50 из 47.63 ± 7,26 мМ. Напротив, продукция P4 клетками MA-10 была намного более чувствительной к 2-DG, с IC IC 50 2,76 ± 1,50 мМ (рис. 4, E и F).

Рис. 4

Влияние 2-DG на LH-стимулированные первичные и MA-10 опухолевые митохондрии клеток Лейдига ΔΨ m , внутриклеточное содержание АТФ и продукцию стероидов. A и B ) ΔΨ m в первичных ( A ) и MA-10 опухолевых ( B ) культурах Лейдига, инкубированных с возрастающими дозами 2-DG (0–100 мМ) в присутствии максимально стимуляция ЛГ (100 нг / мл) в течение 15 мин. C и D ) Уровни АТФ в первичных ( C ) и МА-10 опухолевых ( D ) культурах Лейдига, инкубированных с возрастающими дозами 2-DG (0–100 мМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 ч. E и F ) Продукция стероидов первичной ( E ) и опухолевой MA-10 ( F ) культурами Лейдига, инкубируемыми с возрастающими дозами 2-DG (0–100 мМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 ч. Показанные точки представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех экспериментов с тремя повторами на эксперимент.* P <0,01 по сравнению с клетками, инкубированными с CCCP, # P <0,05 по сравнению с соответствующими первичными клетками или клетками MA-10.

Рис. 4

Влияние 2-DG на LH-стимулированные первичные и MA-10 опухолевые митохондрии клеток Лейдига ΔΨ m , внутриклеточное содержание АТФ и продукцию стероидов. A и B ) ΔΨ m в первичных ( A ) и MA-10 опухолевых ( B ) культурах Лейдига, инкубированных с возрастающими дозами 2-DG (0–100 мМ) в присутствии максимально стимуляция ЛГ (100 нг / мл) в течение 15 мин. C и D ) Уровни АТФ в первичных ( C ) и МА-10 опухолевых ( D ) культурах Лейдига, инкубированных с возрастающими дозами 2-DG (0–100 мМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 ч. E и F ) Продукция стероидов первичной ( E ) и опухолевой MA-10 ( F ) культурами Лейдига, инкубируемыми с возрастающими дозами 2-DG (0–100 мМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 ч. Показанные точки представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех экспериментов с тремя повторами на эксперимент.* P <0,01 по сравнению с клетками, инкубированными с CCCP, # P <0,05 по сравнению с соответствующими первичными клетками или клетками MA-10.

Измененная динамика ETC и стероидогенез в MA-10 по сравнению с первичными клетками Лейдига

Чтобы сравнить эффект ингибирования транспорта электронов на MA-10 и первичные клетки, клетки культивировали в присутствии ротенона, ингибитора транспорта электронов комплекса I, или антимицина А, ингибитора транспорта электронов комплекса III.Измеряли продукцию стероидов, внутриклеточное содержание АТФ и ΔΨ m . Как видно на фиг. 5, зондирование клеточного ответа с помощью ингибитора комплекса I ротенона значительно снизило ΔΨ m , уровни АТФ и продукцию тестостерона в первичных клетках Лейдига, но не в клетках MA-10. Первичные клетки были чрезвычайно чувствительны к ингибированию комплекса I, при этом максимальное ингибирование митохондриальных параметров и синтеза тестостерона наблюдалось при низких наномолярных концентрациях ротенона (данные не показаны).Обработка ингибитором комплекса III антимицином А приводила к уменьшению ΔΨ m (фиг. 5A) и содержания АТФ (фиг. 5B) как в первичных клетках, так и в клетках MA-10. В соответствии с критической ролью, которую играет митохондриальный транспорт электронов в биосинтезе стероидов [12, 13], антимицин A также значительно ингибирует продукцию стероидов обоими типами клеток (рис. 5C). Клеточный АТФ и гормонально-опосредованный синтез стероидов были более серьезно затронуты в первичных клетках, чем в клетках MA-10 (рис.2, B и C), что согласуется с гипотезой о том, что митохондриальная энергия играет критическую роль в стероидогенезе и что первичные клетки в большей степени зависят от синтеза АТФ в митохондриях для клеточного АТФ по сравнению с клетками МА-10.

Рис. 5

Влияние ингибирования ETC на LH-стимулированные митохондрии ΔΨ m , внутриклеточное содержание АТФ и продукцию стероидов в первичных опухолевых клетках и клетках Лейдига MA-10. Черные полосы соответствуют элементам управления; серые полосы соответствуют лечению ротеноном или антимицином А. Данные представлены в процентах от контрольных значений. A ) ΔΨ m в культурах Лейдига первичной опухоли и опухоли MA-10, инкубированных с ротеноном (0,1 мкМ) или антимицином A (1 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 15 мин. B ) Уровни АТФ в первичных и опухолевых культурах Лейдига MA-10, инкубированных с ротеноном (0,1 мкМ) или антимицином A (1 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 часов. C ) Производство стероидов первичными опухолевыми клетками и клетками Лейдига MA-10, инкубируемыми с ротеноном (0,1 мкМ) или антимицином A (1 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 часов. Показанные точки представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех экспериментов с тремя повторами на эксперимент. * P <0.001 по сравнению с клетками, инкубированными без ингибиторов ETC, # P <0,05 по сравнению с соответствующими первичными клетками или клетками MA-10.

Рис. 5

Влияние ингибирования ETC на LH-стимулированные митохондрии ΔΨ m , внутриклеточное содержание АТФ и продукцию стероидов в первичных опухолевых клетках и клетках Лейдига MA-10. Черные полосы соответствуют элементам управления; серые полосы соответствуют лечению ротеноном или антимицином А. Данные представлены в процентах от контрольных значений. A ) ΔΨ m в культурах Лейдига первичной опухоли и опухоли MA-10, инкубированных с ротеноном (0.1 мкМ) или антимицина А (1 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 15 мин. B ) Уровни АТФ в первичных и опухолевых культурах Лейдига MA-10, инкубированных с ротеноном (0,1 мкМ) или антимицином A (1 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 часов. C ) Производство стероидов первичными опухолевыми клетками и клетками Лейдига MA-10, инкубируемыми с ротеноном (0,1 мкМ) или антимицином A (1 мкМ) в присутствии максимально стимулирующего ЛГ (100 нг / мл) в течение 2 часов. Показанные точки представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех экспериментов с тремя повторами на эксперимент.* P <0,001 по сравнению с клетками, инкубированными без ингибиторов ETC, # P <0,05 по сравнению с соответствующими первичными клетками или клетками MA-10.

Энергетический контроль стероидогенного пути

Хотя MA-10 и первичные клетки являются гормонально-чувствительными стероидогенными клетками Лейдига, оба типа клеток производят разные стероиды в качестве своего конечного продукта. Таким образом, в то время как первичные клетки производят тестостерон, клетки MA-10 синтезируют P4 в качестве своего конечного продукта в результате снижения экспрессии CYP17.Это делает клетки MA-10 неподходящей моделью для изучения более поздних этапов синтеза тестостерона. Поэтому, чтобы проверить гипотезу о том, что клеточный АТФ участвует в постмитохондриальных стадиях производства стероидов, первичные клетки Лейдига культивировали в присутствии максимально ингибирующих концентраций CCCP, митохондриального разобщителя или олигомицина, ингибитора АТФ-синтазы (рис. 6А). или с 2-DG, ингибитором гликолиза, для истощения клеточного АТФ двумя разными способами (рис. 6C).Эти клетки также культивировали со стимуляторами стероидогенеза (LH или dbcAMP) или субстратами стероидогенных ферментов (HC для CYP11A1, P5 для 3βHSD, P4 для CYP17 или андростендион для 17βHSD), и измеряли способность клеток синтезировать тестостерон ( Рис.6, Б и Г). Подавление синтеза митохондриального АТФ снижает активность на всех этапах стероидогенеза, без разницы в исключении красителя трипанового синего. Как видно на рисунке 6B, шаги до митохондриального транспорта холестерина были затронуты больше, чем шаги после транспорта холестерина.Более умеренное снижение АТФ с помощью 2-DG (фиг. 6A) влияет только на транспорт митохондриального холестерина, не затрагивая нисходящую активность (фиг. 6D).

Рис. 6

Влияние разрушения митохондрий и гликолитического ингибирования на метаболический поток через стероидогенный путь в первичных клетках Лейдига. A ) Уровни АТФ в клетках, инкубированных с 1 мкг / мл олигомицина или 5 мкМ CCCP в присутствии ЛГ (100 нг / мл), dbcAMP (1 мМ), HC (20 мкМ), P5 (10 мкМ) , P4 (10 мкМ) или андростендион (5 мкМ) в течение 2 часов. B ) Производство тестостерона в клетках, обработанных как в A . Через 2 часа среду собирали и уровни тестостерона оценивали с помощью RIA. Значения представлены как процент выработки тестостерона без ингибитора. C ) Уровни АТФ в клетках, инкубированных со 100 мМ 2-DG в присутствии ЛГ (100 нг / мл), dbcAMP (1 мМ), HC (20 мкМ), P5 (10 мкМ), P4 (10 мкМ). ) или андростендиона (5 мкМ) в течение 2 ч. D ) Производство тестостерона в клетках, обработанных как в C .Через 2 часа среду собирали и уровни тестостерона оценивали с помощью RIA. Значения представлены как процент выработки тестостерона без ингибитора. Строчные буквы обозначают группы, статистически значимые друг от друга ( P <0,05).

Рис. 6

Влияние разрушения митохондрий и гликолитического ингибирования на метаболический поток через стероидогенный путь в первичных клетках Лейдига. A ) Уровни АТФ в клетках, инкубированных с 1 мкг / мл олигомицина или 5 мкМ CCCP в присутствии ЛГ (100 нг / мл), dbcAMP (1 мМ), HC (20 мкМ), P5 (10 мкМ) , P4 (10 мкМ) или андростендион (5 мкМ) в течение 2 часов. B ) Производство тестостерона в клетках, обработанных как в A . Через 2 часа среду собирали и уровни тестостерона оценивали с помощью RIA. Значения представлены как процент выработки тестостерона без ингибитора. C ) Уровни АТФ в клетках, инкубированных со 100 мМ 2-DG в присутствии ЛГ (100 нг / мл), dbcAMP (1 мМ), HC (20 мкМ), P5 (10 мкМ), P4 (10 мкМ). ) или андростендиона (5 мкМ) в течение 2 ч. D ) Производство тестостерона в клетках, обработанных как в C .Через 2 часа среду собирали и уровни тестостерона оценивали с помощью RIA. Значения представлены как процент выработки тестостерона без ингибитора. Строчные буквы обозначают группы, статистически значимые друг от друга ( P <0,05).

Обсуждение

Митохондрии ΔΨ m — центральный компонент митохондриального метаболизма, обеспечивающий движущую силу для окислительного фосфорилирования и импорта белков и метаболитов [7, 8, 25, 26].Предыдущие исследования регуляции стероидогенеза продемонстрировали агенты, которые разрушают ΔΨ m , такие как протонофор CCCP, ингибируют образование стероидов опухолевыми клетками Лейдига MA-10, митохондриями этих клеток, опухолевыми клетками надпочечников и нестероидогенными клетками COS-1. трансфицированы конструкциями CYP11A1 и STAR [12, 14, 27]. Исследования взаимодействия между ΔΨ m и метаболизмом митохондриальных стероидов показали, что в дополнение к ΔΨ m , поток электронов через митохондриальный ETC [12] и присутствие АТФ [28] также имеют решающее значение для образования стероидов в MA- 10 ячеек.

Аналогичные результаты были получены с использованием первичных клеток Лейдига. Недавно мы показали, что нарушение митохондриальной ETC с помощью миксотиазола приводит к подавлению образования тестостерона, стимулированного хорионическим гонадотропином / ЛГ, и снижению внутриклеточного АТФ [13]. Мы также отметили снижение продукции цАМФ и активности 3βHSD, CYP17 и 17βHSD [13]. Поскольку АТФ необходим для нескольких этапов стероидогенеза, результаты этих исследований и исследований на клетках МА-10 предполагают, что миксотиазол может оказывать свое действие за счет снижения продукции АТФ и, таким образом, указывают на важность как митохондриальной верности ETC, так и АТФ для стероидогенез.Однако не все результаты, полученные о взаимосвязи между синтезом АТФ, ΔΨ m и стероидогенезом, согласовывались. Например, сообщалось, что рассеивание ΔΨ m в клетках MA-10 с CCCP ингибировало образование стероидов, но не оказывало значительного влияния на клеточные уровни АТФ [12]. Такие результаты ставят под сомнение, играет ли ΔΨ m роль в стероидогенезе помимо синтеза АТФ в митохондриях, особенно в свете открытий, что транспорт холестерина в дрожжах не зависит от нарушения ΔΨ m [29].

Исследования митохондриальной энергетики в связи с образованием стероидов были проведены с использованием как первичных, так и опухолевых клеток Лейдига. Однако степень, в которой результаты, полученные на опухолевых клетках, могут быть экстраполированы на первичные клетки, критически не проверялась, поэтому нам казалось возможным, что некоторые явно противоречивые данные в литературе могут быть следствием различий в типах клеток. использовал. Мы обратились к этому здесь, проведя сравнительные исследования митохондриальной энергетики клеток Лейдига и синтеза стероидов с использованием как первичных, так и опухолевых клеток Лейдига.Как было показано другими исследователями на клетках MA-10 [12, 14, 27], мы обнаружили, что CCCP деполяризует митохондрии в первичных клетках Лейдига крысы, а также в опухолевых клетках мышей. Значения ΔΨ m деполяризации IC 50 существенно не различались между типами клеток. Удивительно, но концентрации CCCP, необходимые для деполяризации митохондрий ( IC 50 , ∼0,1 мкМ в обоих типах клеток), были значительно меньше, чем концентрации, необходимые для воздействия на синтез тестостерона, стимулированный ЛГ.Более того, воздействие CCCP на первичные клетки Лейдига и выявление деполяризации ΔΨ m сопровождалось существенным снижением клеточных уровней АТФ, что позволяет предположить, что первичный АТФ клеток Лейдига почти полностью происходит за счет окислительного фосфорилирования митохондрий. Однако при оценке клеточного АТФ-ответа на воздействие CCCP между двумя типами клеток наблюдалась разительная разница. В отличие от результатов с первичными клетками и в соответствии с предыдущими данными [12], обработка CCCP клеток MA-10 привела к деполяризации ΔΨ m , но не к существенному снижению клеточных уровней АТФ в клетках Лейдига MA-10.

Большая разница между типами клеток в отношении клеточных уровней АТФ повышает вероятность того, что опухолевые клетки получают большую часть своего АТФ в результате гликолиза, а не окислительного фосфорилирования. Чтобы исследовать эту возможность, было оценено влияние олигомицина, ингибитора АТФ-синтазы, на параметры клеток Лейдига. Как и ожидалось, олигомицин существенно не влиял на ΔΨ m [30]; скорее, он сильно ингибировал синтез тестостерона и P4 как в первичных, так и в опухолевых клетках Лейдига.Олигомицин значительно подавлял клеточные уровни АТФ в обоих типах клеток, но степень подавления была заметно различающейся. Ингибирование митохондриального синтеза АТФ привело к почти полному истощению клеточных уровней АТФ в первичных, но не в опухолевых клетках Лейдига, как сообщалось другими [12, 15]. Действительно, ингибирование синтеза митохондриального АТФ в клетках МА-10 привело только к 40-50% снижению клеточных уровней АТФ. Существование большого пула, нечувствительного к олигомицину, подтверждает гипотезу о том, что опухолевые клетки Лейдига получают АТФ из источников, отличных от митохондриального дыхания или в дополнение к ним.

Чтобы напрямую оценить глюкозозависимость опухолевых и первичных клеток Лейдига, клетки культивировали с негидролизуемым аналогом глюкозы 2-DG, который служит конкурентным ингибитором гликолитического пути [24]. Мы отметили дозозависимое ингибирование метаболизма глюкозы и образования стероидов как в первичных опухолевых клетках, так и в опухолевых клетках МА-10. Однако производство стероидов было более значительным в опухолевых клетках Лейдига, чем в первичных клетках, с максимальным ингибированием при более низких концентрациях глюкозы.Важно отметить, что уровни АТФ в клетках МА-10 были значительно более чувствительны к гликолитическому ингибированию, чем уровни АТФ в первичных клетках.

Энергетические различия между первичными и опухолевыми клетками Лейдига не ограничивались метаболизмом глюкозы и производством АТФ. Хотя первичные клетки Лейдига были высокочувствительны к ингибитору комплекса I ротенону, опухолевые клетки Лейдига оказались неожиданно невосприимчивыми к ингибированию ETC ротеноном. Поскольку на оба типа клеток сильно влияло ингибирование комплекса III антимицином A и комплекса IV NaCN (данные не показаны), эти результаты позволяют предположить, что опухолевые клетки обладают нарушенной митохондриальной ETC на уровне комплекса I.Мутационные и функциональные изменения в комплексе I наблюдались в др. Трансформированных и опухолевых клетках [31, 32], хотя точные изменения неоднородны. Это может быть важным соображением для исследований репродуктивной токсикологии, поскольку ротенон и другие ингибиторы комплекса I в настоящее время используются в пестицидах [33, 34] и использовались для изучения отказа комплекса I на моделях болезни Паркинсона [35]. Важно отметить, что воздействие моделей на грызунах снижает уровень циркулирующего тестостерона [35].Токсикологические исследования ингибиторов комплекса I дали бы ложноотрицательные результаты, если бы их проводили в анализах с использованием опухолевых клеток Лейдига MA-10.

Данные, представленные здесь, делают очевидным, что кажущиеся противоречивыми выводы в литературе относительно вклада митохондриальной энергетики в стероидогенез, вероятно, являются следствием значительных внутренних различий между первичными и опухолевыми клетками Лейдига, как показано на Рисунке 7. Как первичные, так и Клетки Лейдига MA-10 используют митохондриальный АТФ для митохондриального транспорта холестерина.Однако онкогенный переход в клетках MA-10 привел к большему гликолитическому вкладу в клеточный АТФ. Как следствие, клетки MA-10 используют большую долю гликолитического АТФ для транспорта холестерина, чем первичные клетки, хотя АТФ, полученный из митохондрий, остается абсолютно важным в этих клетках. Первичные клетки также используют полученный из митохондрий АТФ для ферментативных реакций, происходящих в ER, как ранее было продемонстрировано в других исследованиях первичных клеток [36]. Эти реакции отсутствуют в опухолевых клетках Лейдига.Гликолитические изменения и дисфункциональная активность комплекса I в клетках MA-10 создают неопределенность относительно степени, в которой исследования митохондриальной энергетики и регуляции стероидогенеза в этих трансформированных клетках связаны с регуляцией стероидогенеза в первичных клетках Лейдига. Несмотря на это, эти результаты демонстрируют, что стероидогенез, особенно импорт митохондриального холестерина, чрезвычайно чувствителен к спросу и предложению АТФ, а не к ΔΨ m или ETC как таковому. Относительная важность этой потребности в АТФ для фосфорилирования ключевых стероидогенных компонентов, таких как STAR [37–39], митохондриального транспорта жирных кислот [15] или неизвестных функций, связанных со сборкой трансдуцеосомы [4, 5], остается область активного исследования.

Рис. 7

Модель использования АТФ в клетках Лейдига. Гормоночувствительные первичные ( A ) и опухолевые ( B ) клетки Лейдига критически используют митохондриальный АТФ для транспорта митохондриального холестерина (верхняя оранжевая стрелка). Однако канцерогенный переход привел к большему гликолитическому вкладу в клеточный АТФ (градиентная стрелка вверху). Следовательно, опухолевые клетки Лейдига используют большую долю гликолитического АТФ ( B ; синяя стрелка) для транспорта холестерина, чем первичные клетки ( A ; синяя стрелка).Первичные клетки также используют полученный из митохондрий АТФ для ферментативных реакций, происходящих в ER ( A ; нижняя оранжевая стрелка), которые отсутствуют в опухолевых клетках Лейдига ( B ).

Рис. 7

Модель использования АТФ в клетках Лейдига. Гормоночувствительные первичные ( A ) и опухолевые ( B ) клетки Лейдига критически используют митохондриальный АТФ для транспорта митохондриального холестерина (верхняя оранжевая стрелка). Однако канцерогенный переход привел к большему гликолитическому вкладу в клеточный АТФ (градиентная стрелка вверху).Следовательно, опухолевые клетки Лейдига используют большую долю гликолитического АТФ ( B ; синяя стрелка) для транспорта холестерина, чем первичные клетки ( A ; синяя стрелка). Первичные клетки также используют полученный из митохондрий АТФ для ферментативных реакций, происходящих в ER ( A ; нижняя оранжевая стрелка), которые отсутствуют в опухолевых клетках Лейдига ( B ).

Благодарность

Мы благодарим доктора М. Асколи (Университет Айовы, Айова-Сити, Айова) за предоставление клеток Лейдига MA-10.

Список литературы

1.

Puett

D

,

Li

Y

,

DeMars

G

,

Angelova

K

,

Fanelli

F

.

Функциональный трансмембранный комплекс: рецептор лютеинизирующего гормона со связанным лигандом и G-белком

.

Mol Cell Endocrinol

2007

;

260–262

:

126

136

.2.

Миллер

WL

.

Стероидогенный белок острой регуляции (StAR), новый переносчик митохондриального холестерина

.

Biochim Biophys Acta

2007

;

1771

:

663

676

.3.

Пападопулос

V

,

Баральди

M

,

Гиларте

TR

,

Кнудсен

TB

,

Лакапер

JJ

000

000 Линия

0005000500050005

Nutt

D

,

Weizman

A

,

Zhang

MR

,

Gavish

M

.

Транслокаторный белок (18 кДа): новая номенклатура бензодиазепинового рецептора периферического типа, основанная на его структуре и молекулярной функции

.

Trends Pharmacol Sci

2006

;

27

:

402

409

.4.

Rone

MB

,

Вентилятор

J

,

Papadopoulos

V

.

Транспорт холестерина в биосинтезе стероидов: роль белок-белковых взаимодействий и значение в болезненных состояниях

.

Biochim Biophys Acta

2009

;

1791

:

646

658

. 5.

Лю

J

,

Rone

MB

,

Пападопулос

V

.

Белковые взаимодействия опосредуют митохондриальный транспорт холестерина и биосинтез стероидов

.

J Biol Chem

2006

;

281

:

38879

38893

.6.

Payne

AH

,

Hales

DB

.

Обзор стероидогенных ферментов на пути от холестерина к активным стероидным гормонам

.

Endocr Ред.

2004

;

25

:

947

970

.7.

Kadenbach

B

,

Ramzan

R

,

Wen

L

,

Vogt

S

.

Новое расширение теории Митчелла для окислительного фосфорилирования в митохондриях живых организмов

.

Biochim Biophys Acta

2010

;

1800

:

205

212

.8.

Wittig

I

,

Schägger

H

.

Надмолекулярная организация АТФ-синтазы и дыхательной цепи митохондриальных мембран

.

Biochim Biophys Acta

2009

;

1787

:

672

680

.9.

Vander Heiden

MG

,

Cantley

LC

,

Thompson

CB

.

Понимание эффекта Варбурга: метаболические потребности пролиферации клеток

.

Наука

2009

;

324

:

1029

1033

.10.

Nascimento

JM

,

Shi

LZ

,

Tam

J

,

Chandsawangbhuwana

C

,

Durrant

B

000

000 EL

B

000 EL

B

000 EL

B

Сравнение гликолиза и окислительного фосфорилирования как источников энергии для подвижности сперматозоидов млекопитающих с использованием комбинации флуоресцентной визуализации, лазерного пинцета и автоматического отслеживания и захвата в реальном времени

.

J Cell Physiol

2008

;

217

:

745

751

. 11.

Лин

CY

,

Hung

PH

,

VandeVoort

CA

,

Миллер

MG

.

1H ЯМР для исследования метаболизма и энергообеспечения спермы макаки резус

.

Reprod Toxicol

2009

;

28

:

75

80

.12.

Шестигранник

JA

,

Shankara

T

,

Janus

P

,

Buck

S

,

Diemer

T

,

Hales

000

Активированные, поляризованные и активно дышащие митохондрии необходимы для острого стероидогенеза клеток Лейдига

.

Эндокринология

2006

;

147

:

3924

3935

. 13.

Midzak

AS

,

Liu

J

,

Zirkin

BR

,

Chen

H

.

Влияние миксотиазола на стероидогенез клеток Лейдига: ингибирование опосредованного лютеинизирующим гормоном синтеза тестостерона, но стимуляция базального стероидогенеза

.

Эндокринология

2007

;

148

:

2583

2590

. 14.

King

SR

,

Liu

Z

,

Soh

J

,

Eimerl

S

,

Orly

J

,

Stocco

Влияние нарушения митохондриального электрохимического градиента на стероидогенез и стероидогенный острый регуляторный белок (StAR)

.

Дж. Стероид Биохим Мол Биол

1999

;

69

:

143

154

.15.

Дуарте

A

,

Кастильо

AF

,

Кастилия

R

,

Малоберти

P

,

Paz

C

,

0004

Podest4á F

.

Система образования / экспорта арахидоновой кислоты, участвующая в регуляции транспорта холестерина в митохондриях стероидогенных клеток

.

FEBS Lett

2007

;

581

:

4023

4028

.16.

Moreno-Sánchez

R

,

Rodríguez-Enríquez

S

,

Saavedra

E

,

Marín-Hernández

A

C

Gédés 9 -0004

Биоэнергетика рака: является ли гликолиз основным поставщиком АТФ во все опухолевые клетки?

Биофакторы

2009

;

35

:

209

225

. 17.

Варбург

О

.

О происхождении раковых клеток

.

Science

1956

;

123

:

309

314

. 18.

Klinefelter

GR

,

Холл

PF

,

Ewing

LL

.

Влияние лишения лютеинизирующего гормона in situ на стероидогенез клеток Лейдига крыс, очищенных многоступенчатой ​​процедурой

.

Biol Reprod

1987

;

36

:

769

783

.19.

Payne

AH

,

Downing

JR

,

Wong

KL

.

Рецепторы лютеинизирующего гормона и синтез тестостерона в двух различных популяциях клеток Лейдига

.

Эндокринология

1980

;

106

:

1424

1429

.20.

Асколи

M

.

Характеристика нескольких клональных линий культивируемых опухолевых клеток Лейдига: рецепторы гонадотропина и стероидогенные ответы

.

Эндокринология

1981

;

108

:

88

95

.21.

Aon

MA

,

Cortassa

S

,

Marbán

E

,

O’Rourke

B

.

Синхронизированные колебания целых клеток в митохондриальном метаболизме, вызванные локальным высвобождением активных форм кислорода в сердечных миоцитах

.

J Biol Chem

2003

;

278

:

44735

44744

. 22.

Хуанг

SG

.

Разработка высокопроизводительного скринингового анализа потенциала митохондриальной мембраны в живых клетках

.

J Экран Biomol

2002

;

7

:

383

389

. 23.

Старков

AA

,

Fiskum

G

.

Регулирование продукции митохондрий мозга H 2 O 2 мембранным потенциалом и окислительно-восстановительным состоянием NAD (P) H

.

J Neurochem

2003

;

86

:

1101

1107

. 24.

Zhu

Z

,

Jiang

W

,

McGinley

JN

,

Thompson

HJ

.

2-дезоксиглюкоза в качестве миметика ограничения энергии: влияние на канцерогенез молочной железы и рост опухолевых клеток молочной железы in vitro

.

Cancer Res

2005

;

65

:

7023

7030

. 25.

Daum

G

,

Vance

JE

.

Импорт липидов в митохондрии

.

Prog Lipid Res

1997

;

36

:

103

130

. 26.

Mokranjac

D

,

Neupert

W

.

Энергетика транслокации белков в митохондрии

.

Biochim Biophys Acta

2008

;

1777

:

758

762

0,27.

Артеменко

IP

,

Zhao

D

,

Hales

DB

,

Hales

KH

,

Jefcoate

CR

.

Процессинг митохондрий вновь синтезированного стероидогенного острого регуляторного белка (StAR), но не общего StAR, опосредует перенос холестерина на фермент расщепления боковой цепи цитохрома P450 в клетках надпочечников

.

J Biol Chem

2001

;

276

:

46583

46596

. 28.

King

SR

,

Stocco

DM

.

АТФ и митохондриальный электрохимический градиент необходимы для функциональной активности стероидогенного белка острой регуляции (StAR) в изолированных митохондриях

.

Endocr Res

1996

;

22

:

505

514

. 29.

Tuller

G

,

Daum

G

.

Импорт стеринов в митохондрии дрожжей Saccharomyces cerevisiae

.

FEBS Lett

1995

;

372

:

29

32

.30.

Weber

J

,

Senior

AE

.

Синтез АТФ за счет транспорта протонов в F1F0-АТФ-синтазе

.

FEBS Lett

2003

;

545

:

61

70

. 31.

Гаспар

G

,

Porcelli

AM

,

Bonora

E

,

Pennisi

LF

,

Толлер

M

,

M

,

Iommarini

Iommarini

Moretti

M

,

Betts

CM

,

Martinelli

GN

,

Ceroni

AR

,

Curcio

F

et al..

Деструктивные мутации митохондриальной ДНК в субъединицах комплекса I являются маркерами онкоцитарного фенотипа в опухолях щитовидной железы

.

Proc Natl Acad Sci U S A

2007

;

104

:

9001

9006

. 32.

Baracca

A

,

Chiaradonna

F

,

Sgarbi

G

,

Solaini

G

,

Alberghina

L

,

0004 Lenaz

Уменьшение митохондриального комплекса I отвечает за биоэнергетическую дисфункцию в клетках, трансформированных K-ras

.

Biochim Biophys Acta

2010

;

1797

:

314

323

. 33.

Люммен

P

.

Ингибиторы комплекса I в качестве инсектицидов и акарицидов

.

Biochim Biophys Acta

1998

;

1364

:

287

296

. 34.

Cicchetti

F

,

Drouin-Ouellet

J

,

Брутто

RE

.

Экологические токсины и болезнь Паркинсона: что мы узнали на моделях животных, индуцированных пестицидами?

Trends Pharmacol Sci

2009

,

30

:

475

483

. 35.

Алам

M

,

Schmidt

WJ

.

Ингибирование митохондриального комплекса I истощает уровень тестостерона в плазме в модели болезни Паркинсона с ротеноном

.

Physiol Behav

2004

;

83

:

395

400

.36.

Ханум

A

,

Buczko

E

,

Dufau

ML

.

Существенная роль аденозинтрифосфата в активации 17бета-гидроксистероид дегидрогеназы в клетках Лейдига крыс

.

Эндокринология

1997

;

138

:

1612

1620

0,37.

Arakane

F

,

King

SR

,

Du

Y

,

Kallen

CB

,

Walsh

LP

,

Watari

H4

Штраус

JF

III.

Фосфорилирование стероидогенного острого регуляторного белка (StAR) модулирует его стероидогенную активность

.

J Biol Chem

1997

;

272

:

32656

32662

0,38.

Jo

Y

,

King

SR

,

Khan

SA

,

Stocco

DM

.

Участие протеинкиназы C и циклической аденозин-3 ‘, 5’-монофосфат-зависимой киназы в стероидогенной острой регуляторной экспрессии белков и биосинтезе стероидов в клетках Лейдига

.

Биол Репрод

2005

;

73

:

244

255

.39.

Poderoso

C

,

Converso

DP

,

Малоберти

P

,

Duarte

A

,

Neuman

I

,

Galli

Paz

C

,

Carreras

MC

,

Poderoso

JJ

,

Podestá

EJ

.

Комплекс митохондриальной киназы необходим для опосредования ERK1 / 2-зависимого фосфорилирования ключевого регуляторного белка в биосинтезе стероидов

.

PLoS ONE

2008

;

3

:

e1443

.

Заметки автора

© 2011, Общество изучения репродукции, Inc.

Синтез

АТФ — Энциклопедия окружающей среды

АТФ играет центральную роль в клеточном метаболизме.[1] Это самый важный донор свободной энергии в любой биологической системе. У эукариот его синтез происходит в митохондриях — во время дыхания — и в хлоропластах — во время фотосинтеза. Здесь приводится последний пример.

Внутри тилакоидной мембраны (см. «Освещение фотосинтеза») свет индуцирует перенос электронов от воды к НАДФ + через фотосистемы II и I, комплекс цитохрома b 6 f, а также через различные мобильные молекулы: пластохиноны, пластоцианин и ферредоксин. (Рисунок 1) [2].Поток электронов вдоль этой мембранной цепи создает градиент концентрации протонов и, следовательно, электрохимический градиент через тилакоидную мембрану. Этот градиент используется АТФ-синтазой для фосфорилирования АДФ в АТФ. [3]

1. Создание трансмембранного градиента pH

1.1. Протоны и линейный перенос электрона

Рисунок 1. Обзор переноса протонов и электронов через тилакоидную мембрану. Протонный градиент, установленный по обе стороны от мембраны, позволит синтезировать АТФ с помощью АТФ-синтазы.

Окисление воды. Каждый фотон, достигающий P680 (в PSII), вызывает разделение зарядов, которое инициирует перенос электронов в PSI и NADP +. Затем P680 переходит в положительно заряженное окисленное состояние (P680 + ). Для работы системы важно, чтобы P680 + восстанавливал каждый отдельный электрон, который был передан. Это происходит за счет окисления воды в соответствии со следующей реакцией (Рисунок 1):

2H 2 O (вода) → O 2 (кислород) + 4H + (протоны) + 4 e (электроны)

Таким образом, производство кислорода сопровождается высвобождением протонов в просвет: по одному протону на каждый электрон, высвобождаемый при окислении H 2 O.

Из PSII в PSI. PSII передает электроны пластохинону (PQ) на стромальной поверхности тилакоидной мембраны. Получая два электрона, PQ поглощает два протона из стромы, давая, таким образом, PQH 2 . Обе формы PQ / PQH 2 подвижны внутри мембраны и участвуют в Q-цикле.

PQH 2 диффундирует к комплексу цитохрома b 6 f и передает ему два электрона (рисунок 1):

  • Один из них восстанавливает P700 (из PSI) через пластоцианин;
  • Другой электрон используется для регенерации PQH 2 (завершая, таким образом, Q-цикл).

Во время этого процесса комплекс цитохрома b 6 f перекачивает протоны из стромы, которые накапливаются в просвет через тилакоидную мембрану.

Бухгалтерский баланс. Всего на каждый электрон, перенесенный с H 2 O на восстанавливающую сторону ФС I, в просвете накапливается три протона:

  • один протон на каждый электрон, высвобождаемый при окислении воды ФС II (п. 1.1.);
  • два протона на каждый электрон, переданный высокопотенциальной цепью цитохрома b 6 f комплексу ФС I (§ 1.2.).

1.2. Протоны и циклический перенос электрона

В некоторых случаях ферредоксин переносит электроны не к НАДФ + -оксидоредуктазу, а к пластохинону через цитохром; отсюда и название циклический перенос. Затем электроны будут следовать по цепочке переносчиков (PQ / PQH 2 , комплекс цитохрома b 6 f, пластоцианин), которые будут снижать P700 PSI. Так же, как при линейном переносе электрона, комплекс Cytochrome b 6 f действует как протонный насос между стромой и просветом.

Циклический перенос электронов, таким образом, участвует в создании протонного градиента, необходимого для синтеза АТФ без чистого производства НАДФН.

1.3. Протонопотребляющие реакции в строме

На последнем этапе линейного переноса электрона электроны переносятся на НАДФ + ферредоксином: НАДФ + оксидоредуктаза (или FNR), находящимся в строме. Эта реакция потребляет протоны из стромы и, таким образом, помогает установить трансмембранный градиент:

2 восстановленных ферредоксина + НАДФ + (окисленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфата) + H + (протон) → 2 окисленных ферредоксина + НАДФН (восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфата)

2.От протонного градиента к электрохимическому градиенту

В 1961 году Питер Митчелл [4] предложил механизм сочетания переноса электрона с синтезом АТФ. Он предположил, что поток электронов через цепь переноса электронов приводит к созданию градиента протонов через мембрану. Синтез АТФ управляется обратным потоком протонов по градиенту. Предложение Митчелла называлось « хемиосмотическая теория ». Это принесло ему Нобелевскую премию 1978 года.

Этот градиент между стромой и просветом может поддерживаться, поскольку тилакоидная мембрана обычно непроницаема для протонов.Энергия, присущая протонному градиенту, называемая «движущей силой протона » (Δp, выраженная в вольтах), управляет синтезом АТФ с помощью АТФ-синтазы. Состоит из двух компонентов:

  • ΔpH, который представляет собой градиент концентрации протонов;
  • Δψ, которая представляет собой разность зарядов (т. Е. Мембранного потенциала) на тилакоидной мембране.

Δp = ΔΨ + Z x ΔpH

Когда электроны переносятся, pH просвета становится кислым (pH> 4 или 5).Светоиндуцированный трансмембранный протонный градиент (ΔpH) составляет около 3,5 единиц pH (см. Рисунок 1). Градиент pH 3,5 единицы через тилакоидную мембрану соответствует движущей силе протонов 0,20 В.

ΔΨ и ΔpH термодинамически эквивалентны для синтеза АТФ. Но в освещенных хлоропластах мембранный потенциал практически равен нулю [5], поскольку перенос протонов в просвет сопровождается переносом ионов (Cl в том же направлении, что и протоны или Ca 2+ или Mg 2+ в обратном направлении).В результате сохраняется электрическая нейтральность и не создается мембранный потенциал: в хлоропластах, следовательно, почти вся движущая сила протонов исходит от градиента pH. Более того, гипотеза Митчелла была подтверждена открытием Андре Ягендорфа о том, что разница в pH через тилакоидную мембрану хлоропласта приводит к синтезу АТФ. [6]

Рисунок 2. Структура и механизм АТФ-синтазы. В части F1 субъединицы расположены в кольцо, причем субъединица γ расположена в центре этой структуры.Деталь F0 будет функционировать как роторный протонный двигатель, при этом ротор состоит из подузлов c, расположенных в виде кольца. Вращательное движение (стрелки) будет передаваться субъединице γ части F1 [Источники: справа, Структура АТФ-синтазы Дэвида Гудселла, Молекула месяца, doi: 10.2210 / rcsb_pdb / mom_2005_12; Изображение под лицензией [CC-BY-4.0].

3. АТФ-синтаза: наномашина

Определение молекулярной структуры АТФ-синтазы позволило нам понять, как она работает, что несколько лет назад представил Пол Бойер.[7] АТФ-синтаза хлоропластов [8] представляет собой большой белковый комплекс, состоящий из двух частей (рис. 2), каждая из которых является двигателем:

  • Гидрофобный домен «F0», внедренный в тилакоидную мембрану. Это электродвигатель, который участвует в перемещении протонов из просвета в строму. Поток протонов в двигателе вращает круговой ротор *;
  • Шаровидная головка, называемая «F1», растворимая в строме. Это химический двигатель, работающий на АДФ.

Периферийный стержень удерживает F1 прикрепленным к статору и предотвращает вращение F1.Две части F0 и F1 соединены друг с другом осью, которая функционирует как вращающийся вал. Вращение этого вала приводит к последовательным изменениям конформации каталитических сайтов F1, которые способствуют связыванию АДФ и Pi, образованию АТФ и высвобождению АТФ (см. Анимацию в виде гифки ниже) в соответствии со следующей реакцией:

ADP 3- (аденозиндифосфат) + H + (протон) + HPO 4 2- (фосфат) → ATP 4- (аденозинтрифосфат) + H 2 O (вода) ( уравнение 2)

Таким образом,

АТФ-синтаза представляет собой уникальную молекулярную машину, общая архитектура которой напоминает водяную мельницу, управляемую потоком протонов, а не водой, как показано в следующем видео (HarwardX), объясняющем, как АТФ-синтаза работает во внутренней мембране митохондрий [9 ]:

В отличие от АТФ, синтезируемого в митохондрии, который будет подпитывать все клеточные реакции, АТФ, образующийся в строме, будет использоваться исключительно для реакций, которые происходят (например, синтез углеродных молекул) внутри самого хлоропласта.

Примечательно, что это исследование было предметом 3 Нобелевских премий по химии, присужденных Митчеллу в 1978 году, а затем Бойеру и Уокеру в 1997 году.


Примечания и ссылки

Обложка. [Источник: Структура АТФ-синтазы, Дэвид Гудселл (2005) «Молекула месяца», doi: 10.2210 / rcsb_pdb / mom_2005_12; Изображение под лицензией CC-BY-4.0]

[1] https://planet-vie.ens.fr/thematiques/cellules-et-molecules/les-roles-de-l-atp

[2] Авенсон Т.J., Kanazawa A., Cruz J.A., Takizawa K., Ettinger W.E. И Крамер Д. (2005) Интеграция протонного контура в фотосинтез: прогресс и проблемы. Завод, клетки и окружающая среда 28, 97-109

[3] Внутренняя мембрана митохондрий также содержит цепь переноса электронов, которая позволит установить протонный градиент. Смотрите видео «Электронная транспортная цепь» профессора Роба Лю (HarwardX): https://www.youtube.com/watch?v=LQmTKxI4Wn4

[4] Питер Деннис Митчелл (1920–1992) — английский химик.Ему была присуждена Нобелевская премия по химии 1978 года «за вклад в понимание передачи биологической энергии через формулировку хемосмотической теории». Теория Митчелла произвела революцию в нашем понимании клеточной биоэнергетики.

[5] Это не тот случай в митохондриях, где вклад мембранного потенциала более важен

[6] Jagendorf A.T. И Урибе Э. (1966). Образование АТФ, вызванное кислотно-основным переходом хлоропластов шпината. Д.Д.А. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 55 (1): 170-177. Bibcode: 1966PNAS… 55… 170J. DOI: 10.1073 / pnas.55.1.170. PMC 285771. PMID 5220864.

[7] Boyer P.D. (2002) Исследовательское путешествие с АТФ-синтазой J. Biol . Chem. 277: 39045-39061. Пол Делос Бойер (1918-2018), американский биохимик, вместе с сэром Джоном Эрнестом Уокером, британским химиком и молекулярным биологом, стал лауреатом Нобелевской премии по химии 1997 года за «выяснение ферментативного механизма, лежащего в основе синтеза аденозина. трифосфат (АТФ) ».

[8] Этот белок принадлежит к большому семейству, состоящему из (а) комплексов типа F, обнаруженных в митохондриях (участках дыхания), хлоропластах (которые осуществляют фотосинтез) и бактериях; (б) тип V (вакуолярный), обнаруженный во внутриклеточных компартментах эукариот, и (в) тип A (архей), обнаруженный у архей и некоторых бактерий.

[9] АТФ-синтаза в действии, профессор Роб Лю (HarwardX)


Узнать больше

Сборка митохондриальной АТФ-синтазы

Митохондрии известны как электростанции клетки.Синтаза F 1 F o -АТФ внутренней мембраны митохондрий продуцирует основную часть клеточного АТФ. Комплексы дыхательной цепи перекачивают протоны через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство и тем самым генерируют протонодвижущую силу, которая управляет АТФ-синтазой. По удивительному молекулярному механизму АТФ-синтаза соединяет синтез АТФ с транспортом протонов в матрицу (1-3). Формирование АТФ-синтазы зависит от ассоциации 17 различных структурных субъединиц двойного генетического происхождения.В то время как ряд факторов и этапов сборки был идентифицирован в модельном организме пекарских дрожжей, мало что было известно о сборке АТФ-синтазы человека. В PNAS He et al. (4) сообщают об идентификации ключевых промежуточных продуктов сборки в образовании АТФ-синтазы в митохондриях человека. Они стремительно определяют молекулярный состав отдельных рудиментарных комплексов АТФ-синтазы в клеточных линиях, в которых отсутствуют отдельные субъединицы фермента, и разрабатывают модель того, как образуется мембраносвязанный домен АТФ-синтазы (рис.1).

Рис. 1.

Пути сборки митохондриальной АТФ-синтазы. ( Upper ) Сборка АТФ-синтазы человека. Свободный домен F 1 или промежуточное звено F 1 –с-кольцо связывается с периферической ножкой. Дополнительные субъединицы e, g и f связывают и способствуют встраиванию ATP6 и ATP8. Добавление 6.8PL и DAPIT стабилизирует вставленный ATP6 / ATP8, что приводит к образованию протонпроводящего канала между ATP6 и c-кольцом. Высвобождается ингибирующий белок IF 1 , который блокирует гидролиз АТФ несвязанной АТФ-синтазы.( Нижний ) Сборка дрожжевой АТФ-синтазы. Шапероны Atp11 и Atp12 способствуют образованию домена F 1 . INAC связывается с c-кольцом, а также с промежуточным соединением сборки, которое содержит Atp6, Atp8, периферический стержень, домен F 1 и факторы созревания Atp10 и Atp23. Таким образом, INAC поддерживает правильную ассоциацию c-кольца с Atp6, чтобы обеспечить образование протонпроводящего канала. Затем добавляются дополнительные субъединицы, чтобы способствовать димеризации фермента.( Вставка ) Структурные субъединицы АТФ-синтазы человека и дрожжей. Звездочками отмечены субъединицы, кодируемые митохондриями. IM, внутренняя митохондриальная мембрана; ИМС, межмембранное пространство; OSCP, белок, придающий чувствительность к олигомицину.

АТФ-синтаза состоит из внутренней мембраносвязанной области F o и экспонированной матрице области F 1 . Каталитическая головка области F 1 и интегрированный с мембраной модуль ротора области F o связаны двумя ножками: центральным ножом F 1 и периферийным ножом F o (рис.1). АТР6 вместе с с-кольцом образует протонпроводящий канал области F o . Центральное с-кольцо состоит из восьми или 10 идентичных субъединиц в митохондриях человека и дрожжей соответственно. Транспорт протонов через роторный модуль F o приводит к вращению С-образного кольца. Крутящий момент с-образного кольца передается на каталитическую головку области F 1 через γ-субъединицу центрального стержня. Три гетеродимера субъединиц α и β образуют реактивные центры, которые претерпевают конформационные изменения при вращении субъединицы γ, что приводит к синтезу АТФ.Периферийный подрулевой рычаг предотвращает вращение каталитической головки (1⇓ – 3). Пять так называемых дополнительных субъединиц являются частью области F o и вносят вклад в образование димеров и олигомеров АТФ-синтазы (5⇓ – 7). Недавняя криоэлектронно-микроскопическая структура с высоким разрешением димерной области F o дрожжевой АТФ-синтазы показала, что субъединицы Atp6 и i / j образуют сайты контакта между двумя мономерами АТФ-синтазы, поддерживаемые взаимодействием между субъединицами е и k (8). .В митохондриях ряды димеров АТФ-синтазы локализуются на краях мембран крист, которые являются инвагинациями внутренней мембраны. Димеры АТФ-синтазы изгибают внутреннюю мембрану и имеют решающее значение для формирования типичной формы крист (9, 10). Дополнительные субъединицы e и g вместе с N-концевой частью субъединицы b периферической ножки влияют на кривизну внутренней мембраны (8, 9, 11). Таким образом, АТФ-синтаза не только синтезирует АТФ, но также имеет решающее значение для архитектуры внутренней митохондриальной мембраны.

Сборка митохондриальной АТФ-синтазы — сложный процесс, который включает скоординированную ассоциацию митохондриально и ядерно кодируемых субъединиц (12). У человека гены, кодирующие субъединицы F или ATP6 и ATP8, расположены в митохондриальном геноме. Другие субъединицы кодируются в ядерном геноме, синтезируются как белки-предшественники на цитозольных рибосомах и импортируются в митохондрии. Во время сборки АТФ-синтазы домен F 1 , по-видимому, формируется независимо от интегрированного в мембрану домена.У дрожжей Atp11 и Atp12 связываются с недавно импортированными субъединицами β и α, соответственно. Потеря этих факторов сборки приводит к агрегации субъединиц α и β и блокирует образование АТФ-синтазы (13). Согласно современным представлениям, ассоциация центрального стебля приводит к высвобождению Atp11 и Atp12 и образованию домена F 1 (12).

Решающим этапом во время сборки АТФ-синтазы является формирование протон-проводящего канала между АТФ6 и с-кольцом в роторном модуле F o .Канал, проводящий протоны, который неправильно вставлен в АТФ-синтазу, может привести к рассеянию градиента протонов через внутреннюю мембрану. He et al. (4) генерировали линии клеток человека с нарушением отдельных генов дополнительных субъединиц e, f, g, 6,8PL (митохондриальный протеолипид 6,8 кДа) и белка, связанного с диабетом, в чувствительных к инсулину тканях (DAPIT). Они обнаружили, что отсутствие отдельных дополнительных субъединиц приводит к респираторным дефектам и потере димеров или олигомеров АТФ-синтазы.Они также определили молекулярный состав рудиментарных АТФ-синтаз в различных линиях клеток с нокаутом, в которых отсутствовали отдельные дополнительные субъединицы, субъединицы периферической ножки или с-кольцо, а также в клетках ρ 0 , лишенных митохондриальной ДНК (4, 14, 15 ). Основываясь на своих открытиях, они предлагают элегантную модель того, как строится мембранный домен АТФ-синтазы человека (4) (Fig. 1, Upper ). В одной из ветвей промежуточное звено F 1 –c-кольцо ассоциируется с периферической ножкой и дополнительными субъединицами e и g (15, 16).В другой ветви домен F 1 сначала собирается с периферической ножкой и дополнительными субъединицами e, g и f. Оба пути сливаются в ключевой промежуточный узел сборки, который содержит домен F 1 , c-кольцо, периферический стержень и дополнительные субъединицы e, g и f. Во всех этих рудиментарных комплексах АТФ-синтазы ингибиторный белок IF 1 обогащен для предотвращения гидролиза АТФ несвязанной АТФ-синтазой (4). Присутствие дополнительных субъединиц e, g и f имеет решающее значение для последующей интеграции кодируемых митохондриями субъединиц ATP6 и ATP8, которые стабилизируются добавлением 6.8PL. Таким образом, образуется протонпроводящий канал между АТФ6 и с-кольцом. На этой стадии синтез АТФ связан с протон-движущей силой и высвобождается ингибирующий белок IF 1 . Наконец, на конвейер добавляется DAPIT, чтобы способствовать димеризации и олигомеризации АТФ-синтазы.

Кроме того, He et al. (4) назвали 6.8PL и DAPIT вероятными функциональными ортологами дрожжевых субъединиц i / j и k, соответственно. Таким образом, 17 основных структурных субъединиц АТФ-синтазы человека и дрожжей теперь напрямую сопоставимы (рис.1, Врезка ).

Интересно, что несколько стадий созревания АТФ-синтазы дрожжей и человека различаются (рис. 1). Субъединица c дрожжей кодируется митохондриями, тогда как три ядерных гена кодируют идентичные субъединицы c у человека (только предшественники несут разные последовательности, нацеленные на митохондрии). Дрожжевые Atp6 и Atp8 сначала связываются с промежуточным звеном периферического стебля-F 1 , а затем добавляется с-кольцо (17). В митохондриях человека АТФ6 и АТФ8 вставляются в промежуточную форму АТФ-синтазы, которая содержит с-кольцо, домен F 1 , периферическую ножку и дополнительные субъединицы (4).У дрожжей был идентифицирован ряд факторов сборки для образования мембраносвязанной области F o . Двухдоменный белок Atp25 стимулирует синтез и сборку субъединицы c в c-кольцо (18). Протеаза Atp23 обрабатывает встроенный в мембрану дрожжевой Atp6, тогда как человеческий Atp6 протеолитически не расщепляется. Помимо протеолитической активности, Atp23 вместе с шапероном Atp10 стабилизирует и собирает дрожжевой Atp6 (19, 20). Комплекс сборки внутренней мембраны (INAC), состоящий из Ina17 и Ina22 (21), связывается с двумя различными промежуточными соединениями сборки дрожжевой АТФ-синтазы: вновь собранным c-кольцом и промежуточным соединением сборки, состоящим из домена F 1 , периферический стержень, Atp6 / Atp8 и факторы сборки Atp10 и Atp23 (17) (рис.1, Нижний ). INAC предотвращает преждевременное взаимодействие промежуточных продуктов и поддерживает правильную сборку c-кольца с Atp6 с образованием протонпроводящего канала. Таким образом, хотя общий состав АТФ-синтазы человека и дрожжей схож, пути сборки центрального протонпроводящего канала различаются.

В совокупности анализ рудиментарных комплексов АТФ-синтазы He et al. (4, 14, 15) приводит к пошаговой модели сборки мембранного домена АТФ-синтазы человека.В будущих исследованиях будут рассмотрены молекулярные механизмы и регуляция отдельных этапов сборки. Важным вопросом является то, способствуют ли сборочные факторы сборке АТФ-синтазы человека и какие именно. Хотя люди и дрожжи принадлежат к одной супергруппе эукариот, опистоконтам, они используют разные пути сборки для протон-проводящего канала. Исследования, направленные на сборку митохондриальной АТФ-синтазы в различных эукариотических супергруппах, вероятно, откроют новые механизмы построения этого центрального клеточного аппарата.

Author: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *