Атф значение атф в жизнедеятельности клетки: Большая энциклопедия школьника

Содержание

Большая энциклопедия школьника

Большая энциклопедия школьникауникальное издание, содержащее весь свод знаний, необходимый ученикам младших классов. Для детей, собирающихся в 1-й класс, она послужит незаменимым помощником для подготовки к школе. В этой энциклопедии ребенок сможет найти любую интересующую его информацию, в понятном и простом для него изложении. Вы подбираете слова и определения для простых вещей, которые надо объяснить ребенку? Сомневаетесь в формулировках? Просто возьмите «Большую энциклопедию школьника» и найдите нужный ответ вместе с малышом!

Математика в стихах
Развитие речи
Азбука в картинках
Игры на развитие внимания
Как правильно выбрать школу
Ваш ребенок левша
Как готовить домашнее задание
Контрольные и экзамены

Большая энциклопедия школьника — это твой надёжный путеводитель в мире знаний. Она проведёт сквозь извилистые лабиринты наук и раскроет завесу великих тайн Вселенной. С ней ты поднимешься высоко к звёздам и опустишься на дно самых глубоких морей, ты научишься видеть мельчайшие организмы и осязать огромные пространства Земли. Отправившись в это увлекательное путешествие, ты значительно расширишь свой кругозор и поднимешься на новую ступень развития. Отныне никакие вопросы учителей не смогут поставить тебя в тупик, ты сможешь найти выход из любой ситуации. Мир знаний зовёт тебя. В добрый путь!

Ребенок не хочет учить буквы

Ребенок не хочет учить буквы — Понимаете, ведь надо что-то делать! — с тревогой говорила мне полная, хорошо одетая дама, едва умещающаяся на стуле. Ее ноги в аккуратных лодочках были плотно сжаты (юбка до середины колена казалась слегка коротковатой для такой монументальной фигуры), руки сложены на коленях. — Ей же на тот год в школу, все ее сверстники уже читают, а она даже буквы …

Past continuous passive

Страдательный залог образуется с помощью вспомогательного глагола ‘to be’. Страдательный залог глагола ‘to repair’ в группе ‘continuous’ : To be repaired = Быть исправленным. The road is being repaired = Дорогу чинят. The road is not being repaired = Дорогу не чинят. Is the road being repaired? = Чинят ли дорогу? The road was being repaired = Дорогу чинили. The road was not being repaired = Дорогу не чинили. Was the road being repaired? = Чинили ли дорогу? Страдательный …

Определение формулы органического вещества по его молярной массе

Задание: Определить формулу углеводорода, если его молярная масса равна 78 г. № п/п Последовательность действий Выполнение действий 1. Записать общую формулу углеводорода. Общая формула углеводорода СхНу 2. Найти молярную массу углеводорода в общем виде. М(СхНу)=12х +у 3. Приравнять найденное в общем виде значение молярной массы к данному в …

У

У ЗВУК (У). 1) Удобная буква! Удобно в ней то, Что можно на букву Повесить пальто. У – сучок, В любом лесу Ты увидишь букву У. 2) ФОНЕТИЧЕСКАЯ ЗАРЯДКА. — Как воет волк! ( у – у – у ) 3) ЗАДАНИЯ. а) Подними руку, если услышишь звук (у): паук, цветок, лужа, диван, стол, стул, голуби, курица. б) Где стоит (у)? Зубы, утка, наука, кенгуру …

АТФ и ее роль в клетке

В цитоплазме каждой клетки, а также в митохондриях, хлоропластах и ядрах содержится аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). Она поставляет энергию для большинства реакций, происходящих в клетке. С помощью АТФ клетка синтезирует новые молекулы белков, углеводов, жиров, избавляется от отходов, осуществляет активный транспорт веществ, биение жгутиков и ресничек и т. д.

Молекула АТФ представляет собой нуклеотид, образованный азотистым основанием аденином, пятиуглеродным сахаром рибозой и тремя остатками фосфорной кислоты. Фосфатные группы в молекуле АТФ соединены между собой высокоэнергетическими (макроэргическими) связями :

Связи между фосфатными группами не очень прочные, и при их разрыве выделяется большое количество энергии. В результате гидролитического отщепления от АТФ фосфатной группы образуется аденозиндифосфорная кислота (АДФ) н высвобождается порция энергии:

АДФ также может подвергаться дальнейшему гидролизу с отщеплением еще одной фосфатной группы и выделением второй порции энергии; при этом АДФ преобразуется в аденозин-монофосфат (АМФ), который далее не гидролизуется:

АТФ образуется из АДФ и неорганического фосфата за счет энергии, освобождающейся при окислении органических веществ и в процессе фотосинтеза. Этот процесс называется фосфорилированием. При этом должно быть затрачено не менее 40 кДж/моль энергии, которая аккумулируется в макроэргических связях:

Следовательно, основное значение процессов дыхания и фотосинтеза определяется тем, что они поставляют энергию для синтеза АТФ, с участием которой в клетке выполняется большая часть работы.

Таким образом, АТФ — это главный универсальный поставщик энергии в клетках всех живых организмов.

АТФ чрезвычайно быстро обновляется. У человека, например, каждая молекула АТФ расщепляется и вновь восстанавливается 2 400 раз в сутки, так что ее средняя продолжительность жизни менее 1 мин. Синтез АТФ осуществляется главным образом в митохондриях и хлоропластах (частично в цитоплазме). Образовавшаяся здесь АТФ направляется в те участки клетки, где возникает потребность в энергии.

Источник : Н.А. Лемеза Л.В.Камлюк Н.Д. Лисов «Пособие по биологии для поступающих в ВУЗы»

Каково значение атф. Структура АТФ

В теле человека около 70 триллионов клеток. Для здорового роста каждой из них необходимы помощники — витамины. Молекулы витаминов малы, но их недостаток всегда заметен. Если тяжело адаптироваться к темноте, вам нужны витамины А и В2, появилась перхоть — не хватает B12, B6, P, долго не заживают синяки — дефицит витамина С. На этом уроке вы узнаете о том, как и где в клетке хранится и обрабатывается стратегический запас витаминов, как витамины активизируют работу организма, а также узнаете об АТФ — главном источнике энергии в клетке.

Тема: Основы цитологии

Урок: Строение и функции АТФ

Как вы помните, нуклеиновые кислоты состоят из нуклеотидов . Оказалось, что в клетке нуклеотиды могут находиться в связанном состоянии или в свободном состоянии. В свободном состоянии они выполняют ряд важных для жизнедеятельности организма функций.

К таким свободным нуклеотидам относится молекула АТФ или аденозинтрифосфорная кислота (аденозинтрифосфат). Как и все нуклеотиды, АТФ состоит из пятиуглеродного сахара — рибозы , азотистого основания — аденина , и, в отличие от нуклеотидов ДНК и РНК, трех остатков фосфорной кислоты (рис. 1).

Рис. 1. Три схематических изображения АТФ

Важнейшая функция АТФ состоит в том, что она является универсальным хранителем и переносчиком

энергии в клетке.

Все биохимические реакции в клетке, которые требуют затрат энергии, в качестве ее источника используют АТФ.

При отделении одного остатка фосфорной кислоты, АТФ переходит в АДФ (аденозиндифосфат ). Если отделяется ещё один остаток фосфорной кислоты (что случается в особых случаях), АДФ переходит в АМФ (аденозинмонофосфат) (рис. 2).

Рис. 2. Гидролиза АТФ и превращение её в АДФ

При отделении второго и третьего остатков фосфорной кислоты освобождается большое количество энергии, до 40 кДж. Именно поэтому связь между этими остатками фосфорной кислоты называют макроэргической и обозначают соответственным символом.

При гидролизе обычной связи выделяется (или поглощается) небольшое количество энергии, а при гидролизе макроэргической связи выделяется намного больше энергии (40 кДж). Связь между рибозой и первым остатком фосфорной кислоты не является макроэргической, при её гидролизе выделяется всего 14 кДж энергии.

Макроэргические соединения могут образовываться и на основе других нуклеотидов, например ГТФ (гуанозинтрифосфат) используется как источник энергии в биосинтезе белка, принимает участие в реакциях передачи сигнала, является субстратом для синтеза РНК в процессе транскрипции, но именно АТФ является наиболее распространенным и универсальным источником энергии в клетке.

АТФ содержится как в цитоплазме , так и в ядре, митохондриях и хлоропластах .

Таким образом, мы вспомнили, что такое АТФ, каковы её функции, и что такое макроэргическая связь.

Витамины — биологически активные органические соединения, которые в малых количествах необходимы для подержания процессов жизнедеятельности в клетке.

Они не являются структурными компонентами живой материи, и не используются в качестве источника энергии.

Большинство витаминов не синтезируются в организме человека и животных, а поступают в него с пищей, некоторые синтезируются в небольших количествах микрофлорой кишечника и тканями (витамин D синтезируется кожей).

Потребность человека и животных в витаминах не одинакова и зависит от таких факторов как пол, возраст, физиологическое состояние и условия среды обитания. Некоторые витамины нужны не всем животным.

Например, аскорбиновая кислота, или витамин С, необходим человеку и другим приматам. Вместе с тем, он синтезируется в организме рептилий (моряки брали в плавания черепах, для борьбы с цингой — авитаминозом витамина С).

Витамины были открыты в конце XIX века благодаря работам русских ученых Н. И. Лунина и В. Пашутина, которые показали, что для полноценного питания необходимо не только наличие белков, жиров и углеводов, но и ещё каких-то других, на тот момент неизвестных, веществ.

В 1912 году польский ученый К. Функ (Рис. 3), изучая компоненты шелухи риса, предохраняющей от болезни Бери-Бери (авитаминоз витамина В), предположил, что в состав этих веществ обязательно должны входить аминные группировки. Именно он предложили назвать эти вещества витаминами, то есть аминами жизни.

В дальнейшем было установлено, что многие из этих веществ аминогрупп не содержат, но термин витамины хорошо прижился в языке науки и практики.

По мере открытия отдельных витаминов, их обозначали латинскими буквами и называли в зависимости от выполняемых функций. Например, витамин Е назвали токоферол (от др.-греч. τόκος — «деторождение», и φέρειν — «приносить»).

Сегодня витамины делят по их способности растворяться в воде или в жирах.

К водорастворимым витаминам относят витамины H , C , P , В .

К жирорастворимым витаминам относят A , D , E , K (можно запомнить, как слово: кеда ) .

Как уже было отмечено, потребность в витаминах зависит от возраста, пола, физиологического состояния организма и среды обитания. В молодом возрасте отмечена явная нужда в витаминах. Ослабленный организм тоже требует больших доз этих веществ. С возрастом способность усваивать витамины падает.

Потребность в витаминах также определяется способностью организма их утилизировать.

В 1912 году польский ученый Казимир Функ получил из шелухи риса частично очищенный витамин B1 — тиамин. Ещё 15 лет понадобилось для получения этого вещества в кристаллическом состоянии.

Кристаллический витамин B1 бесцветен, обладает горьковатым вкусом и хорошо растворим в воде. Тиамин найден как в растительных, так и микробных клетках. Особенно много его в зерновых культурах и дрожжах (рис. 4).

Рис. 4. Тиамин в виде таблеток и в продуктах питания

Термическая обработка пищевых продуктов и различные добавки разрушают тиамин. При авитаминозе наблюдаются патологии нервной, сердечно-сосудистой и пищеварительной систем. Авитаминоз приводит к нарушению водного обмена и функции кроветворения. Один из ярких примеров авитаминоза тиамина — это развитие болезни Бери-Бери (рис. 5).

Рис. 5. Человек, страдающий от авитаминоза тиамина — болезни бери-бери

Витамин В1 широко применяется в медицинской практике для лечения различных нервных заболеваний, сердечно-сосудистых расстройств.

В хлебопечении тиамин вместе с другим витаминами — рибофлавином и никотиновой кислотой используется для витаминизации хлебобулочных изделий.

В 1922 году Г. Эванс и А. Бишо открыли жирорастворимый витамин, названный ими токоферолом или витамином Е (дословно: «способствующий родам»).

Витамин Е в чистом виде — маслянистая жидкость. Он широко распространен в злаковых культурах, например в пшенице. Его много в растительных, животных жирах (рис. 6).

Рис. 6. Токоферол и продукты, которые его содержат

Много витамина E в моркови, в яйцах и молоке. Витамин E является антиоксидантом , то есть защищает клетки от патологического окисления, которое приводит их к старению и гибели. Он является «витамином молодости». Огромно значение витамина для половой системы, поэтому его часто называют витамином размножения.

Вследствие этого, дефицит витамина Е, в первую очередь, приводит к нарушению эмбриогенеза и работы репродуктивных органов.

Производство витамина Е основано на выделении его из зародышей пшеницы — методом спиртовой экстракции и отгонки растворителей при низких температурах.

В медицинской практике используют как природные, так и синтетические препараты — токоферолаацетат в растительном масле, заключенный в капсулу (знаменитый «рыбий жир»).

Препараты витамина Е используются как антиоксиданты при облучениях и других патологических состояниях, связанных с повышенным содержанием в организме ионизированных частиц и активных форм кислорода.

Кроме того, витамин Е назначают беременным женщинам, а также используют в комплексной терапии лечения бесплодия, при мышечной дистрофии и некоторых заболеваниях печени.

Витамин А (рис. 7) был открыт Н. Друммондом в 1916 году.

Этому открытию предшествовали наблюдения за наличием жирорастворимого фактора в пище, необходимого для полноценного развития сельскохозяйственных животных.

Витамин А недаром занимает первое место в витамином алфавите. Он участвует практически во всех процессах жизнедеятельности. Этот витамин необходим для восстановления и сохранения хорошего зрения.

Он также помогает вырабатывать иммунитет ко многим заболеваниям, в том числе и простудным.

Без витамина А невозможно здоровое состояние эпителия кожи. Если у вас «гусиная кожа», которая чаще всего появляется на локтях, бедрах, коленях, голенях, если появилась сухость кожи на руках или возникают другие подобные явления, это означает, что вам недостает витамина А.

Витамин А, как и витамин Е, необходим для нормального функционирования половых желез (гонад). При гиповитаминозе витамина А отмечено повреждение репродуктивной системы и органов дыхания.

Одним из специфических последствий недостатка витамина А является нарушение процесса зрения, в частности снижение способности глаз к темновой адаптации — куриная слепота . Авитаминоз приводит к возникновению ксерофтальмии и разрушению роговицы. Последний процесс необратим, и характеризуется полной потерей зрения. Гипервитаминоз приводит к воспалению глаз и нарушению волосяного покрова, потери аппетита и полному истощению организма.

Рис. 7. Витамин А и продукты, которые его содержат

Витамины группы А, в первую очередь, содержатся в продуктах животного происхождения: в печени, в рыбьем жире, в масле, в яйцах (рис. 8).

Рис. 8. Содержание витамина А в продуктах растительного и животного происхождения

В продуктах растительного происхождения содержатся каротиноиды, которые в организме человека под действием фермента каротиназы переходят в витамин А.

Таким образом, Вы познакомились сегодня со структурой и функциями АТФ, а также вспомнили о значении витаминов и выяснили, как некоторые из них участвуют в процессах жизнедеятельности.

При недостаточном поступлении витаминов в организм развивается первичный авитаминоз. Разные продукты содержат разное количество витаминов.

Например, морковь содержит много провитамина А (каротина), капуста содержит витамин С и т. д. Отсюда проистекает необходимость сбалансированной диеты, включающей в себя разнообразные продукты растительного и животного происхождения.

Авитаминоз при нормальных условиях питания встречается очень редко, гораздо чаще встречаются гиповитаминозы , которые связаны с недостаточным поступлением с пищей витаминов.

Гиповитаминоз может возникать не только в результате несбалансированного питания, но и как следствие различных патологий со стороны желудочно-кишечного тракта или печени, или в результате различных эндокринных или инфекционных заболеваний, которые приводят к нарушению всасывания витаминов в организме.

Некоторые витамины вырабатываются кишечной микрофлорой (микробиотой кишечника). Подавление биосинтетических процессов в результате действия антибиотиков может также привести к развитию гиповитаминоза , как следствия дисбактериоза .

Чрезмерное употребление пищевых витаминных добавок, а также лекарственных средств, содержащих витамины, приводит к возникновению патологического состояния — гипервитаминоза . Особенно это характерно для жирорастворимых витаминов, таких как A , D , E , K .

Домашнее задание

1. Какие вещества называют биологически активными?

2. Что такое АТФ? В чем особенность строения молекулы АТФ? Какие типы химической связи существуют в этой комплексной молекуле?

3. Каковы функции АТФ в клетках живых организмов?

4. Где происходит синтез АТФ? Где осуществляется гидролиз АТФ?

5. Что такое витамины? Каковы их функции в организме?

6. Чем витамины отличаются от гормонов?

7. Какие классификации витаминов вам известны?

8. Что такое авитаминоз, гиповитаминоз и гипервитаминоз? Приведите примеры этих явлений.

9. Какие заболевания могут быть следствием недостаточного или избыточного поступления витаминов в организм?

10. Обсудите с друзьями и родственниками свое меню, подсчитайте, пользуясь дополнительной информацией о содержании витаминов в разных продуктах питания, достаточно ли витаминов вы получаете.

1. Единая коллекция Цифровых Образовательных Ресурсов ().

2. Единая коллекция Цифровых Образовательных Ресурсов ().

3. Единая коллекция Цифровых Образовательных Ресурсов ().

Список литературы

1. Каменский А. А., Криксунов Е. А., Пасечник В. В. Общая биология 10-11 класс Дрофа, 2005.

2. Беляев Д. К. Биология 10-11 класс. Общая биология. Базовый уровень. — 11-е изд., стереотип. — М.: Просвещение, 2012. — 304 с.

3. Агафонова И. Б., Захарова Е. Т., Сивоглазов В. И. Биология 10-11 класс. Общая биология. Базовый уровень. — 6-е изд., доп. — Дрофа, 2010. — 384 с.

В биологии АТФ — это источник энергии и основа жизни. АТФ — аденозинтрифосфат — участвует в процессах метаболизма и регулирует биохимические реакции в организме.

Что это?

Понять, что такое АТФ, поможет химия. Химическая формула молекулы АТФ — C10h26N5O13P3. Запомнить полное название несложно, если разбить его на составные части. Аденозинтрифосфат или аденозинтрифосфорная кислота — нуклеотид, состоящий из трёх частей:

  • аденина — пуринового азотистого основания;
  • рибозы — моносахарида, относящегося к пентозам;
  • трёх остатков фосфорной кислоты.

Рис. 1. Строение молекулы АТФ.

Более подробная расшифровка АТФ представлена в таблице.

АТФ впервые обнаружили гарвардские биохимики Суббарао, Ломан, Фиске в 1929 году. В 1941 году немецкий биохимик Фриц Липман установил, что АТФ является источником энергии живого организма.

Образование энергии

Фосфатные группы соединены между собой высокоэнергетическими связями, которые легко разрушаются. При гидролизе (взаимодействии с водой) связи фосфатной группы распадаются, высвобождая большое количество энергии, а АТФ превращается в АДФ (аденозиндифосфорную кислоту).

Условно химическая реакция выглядит следующим образом:

ТОП-4 статьи которые читают вместе с этой

АТФ + Н2О → АДФ + Н3РО4 + энергия

Рис. 2. Гидролиз АТФ.

Часть высвободившейся энергии (около 40 кДж/моль) участвует в анаболизме (ассимиляции, пластическом обмене), часть — рассеивается в виде тепла для поддержания температуры тела. При дальнейшем гидролизе АДФ отщепляется ещё одна фосфатная группа с высвобождением энергии и образованием АМФ (аденозин-монофосфата). АМФ гидролизу не подвергается.

Синтез АТФ

АТФ располагается в цитоплазме, ядре, хлоропластах, в митохондриях. Синтез АТФ в животной клетке происходит в митохондриях, а в растительной — в митохондриях и хлоропластах.

АТФ образуется из АДФ и фосфата с затратой энергии. Такой процесс называется фосфорилированием:

АДФ + Н3РО4 + энергия → АТФ + Н2О

Рис. 3. Образование АТФ из АДФ.

В растительных клетках фосфорилирование происходит при фотосинтезе и называется фотофосфорилированием. У животных процесс протекает при дыхании и называется окислительным фосфорилированием.

В животных клетках синтез АТФ происходит в процессе катаболизма (диссимиляции, энергетического обмена) при расщеплении белков, жиров, углеводов.

Функции

Из определения АТФ понятно, что эта молекула способна давать энергию. Помимо энергетической аденозинтрифосфорная кислота выполняет другие функции:

  • является материалом для синтеза нуклеиновых кислот;
  • является частью ферментов и регулирует химические процессы, ускоряя или замедляя их протекание;
  • является медиатором — передаёт сигнал синапсам (местам контакта двух клеточных мембран).

Что мы узнали?

Из урока биологии 10 класса узнали о строении и функциях АТФ — аденозинтрифосфорной кислоты. АТФ состоит из аденина, рибозы и трёх остатков фосфорной кислоты. При гидролизе фосфатные связи разрушаются, что высвобождает энергию, необходимую для жизнедеятельности организмов.

Тест по теме

Оценка доклада

Средняя оценка: 4.6 . Всего получено оценок: 621.

Продолжение. См. № 11, 12, 13, 14, 15, 16/2005

Расширенное планирование, 10 класс

Урок 19. Химическое строение и биологическая роль АТФ

Оборудование: таблицы по общей биологии, схема строения молекулы АТФ, схема взаимосвязи пластического и энергетического обменов.

I. Проверка знаний

Проведение биологического диктанта «Органические соединения живой материи»

Учитель читает тезисы под номерами, учащиеся записывают в тетрадь номера тех тезисов, которые подходят по содержанию их варианту.

Вариант 1 – белки.
Вариант 2 – углеводы.
Вариант 3 – липиды.
Вариант 4 – нуклеиновые кислоты.

1. В чистом виде состоят только из атомов С, Н, О.

2. Кроме атомов С, Н, О содержат атомы N и обычно S.

3. Кроме атомов С, Н, О содержат атомы N и Р.

4. Обладают относительно небольшой молекулярной массой.

5. Молекулярная масса может быть от тысяч до нескольких десятков и сотен тысяч дальтон.

6. Наиболее крупные органические соединения с молекулярной массой до нескольких десятков и сотен миллионов дальтон.

7. Обладают различными молекулярными массами – от очень небольшой до весьма высокой, в зависимости от того, является ли вещество мономером или полимером.

8. Состоят из моносахаридов.

9. Состоят из аминокислот.

10. Состоят из нуклеотидов.

11. Являются сложными эфирами высших жирных кислот.

12. Основная структурная единица: «азотистое основание–пентоза–остаток фосфорной кислоты».

13. Основная структурная единица: «аминокислот».

14. Основная структурная единица: «моносахарид».

15. Основная структурная единица: «глицерин–жирная кислота».

16. Молекулы полимеров построены из одинаковых мономеров.

17. Молекулы полимеров построены из сходных, но не вполне одинаковых мономеров.

18. Не являются полимерами.

19. Выполняют почти исключительно энергетическую, строительную и запасающую функции, в некоторых случаях – защитную.

20. Помимо энергетической и строительной выполняют каталитическую, сигнальную, транспортную, двигательную и защитную функции;

21. Осуществляют хранение и передачу наследственных свойств клетки и организма.

Вариант 1 – 2; 5; 9; 13; 17; 20.
Вариант 2 – 1; 7; 8; 14; 16; 19.
Вариант 3 – 1; 4; 11; 15; 18; 19.
Вариант 4 – 3; 6; 10; 12; 17; 21.

II. Изучение нового материала

1. Строение аденозинтрифосфорной кислоты

Кроме белков, нуклеиновых кислот, жиров и углеводов в живом веществе синтезируется большое количество других органических соединений. Среди них важнуую роль в биоэнергетике клетки играет аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). АТФ содержится во всех клетках растений и животных. В клетках чаще всего аденозинтрифосфорная кислота присутствует в виде солей, называемых аденозинтрифосфатами . Количество АТФ колеблется и в среднем составляет 0,04% (в клетке в среднем находится около 1 млрд молекул АТФ). Наибольшее количество АТФ содержится в скелетных мышцах (0,2–0,5%).

Молекула АТФ состоит из азотистого основания – аденина, пентозы – рибозы и трех остатков фосфорной кислоты, т.е. АТФ – особый адениловый нуклеотид. В отличие от других нуклеотидов АТФ содержит не один, а три остатка фосфорной кислоты. АТФ относится к макроэргическим веществам – веществам, содержащим в своих связях большое количество энергии.

Пространственная модель (А) и структурная формула (Б) молекулы АТФ

Из состава АТФ под действием ферментов АТФаз отщепляется остаток фосфорной кислоты. АТФ имеет устойчивую тенденцию к отделению своей концевой фосфатной группы:

АТФ 4– + Н 2 О ––> АДФ 3– + 30,5 кДж + Фн,

т.к. это приводит к исчезновению энергетически невыгодного электростатического отталкивания между соседними отрицательными зарядами. Образовавшийся фосфат стабилизируется за счет образования энергетически выгодных водородных связей с водой. Распределение заряда в системе АДФ + Фн становится более устойчивым, чем в АТФ. В результате этой реакции высвобождается 30,5 кДж (при разрыве обычной ковалентной связи высвобождается 12 кДж).

Для того, чтобы подчеркнуть высокую энергетическую «стоимость» фосфорно-кислородной связи в АТФ, ее принято обозначать знаком ~ и называть макроэнергетической связью. При отщеплении одной молекулы фосфорной кислоты АТФ переходит в АДФ (аденозиндифосфорная кислота), а если отщепляются две молекулы фосфорной кислоты, то АТФ переходит в АМФ (аденозинмонофосфорная кислота). Отщепление третьего фосфата сопровождается выделением всего 13,8 кДж, так что собственно макроэргических связей в молекуле АТФ только две.

2. Образование АТФ в клетке

Запас АТФ в клетке невелик. Например, в мышце запасов АТФ хватает на 20–30 сокращений. Но ведь мышца способна работать часами и производить тысячи сокращений. Поэтому наряду с распадом АТФ до АДФ в клетке должен непрерывно идти обратный синтез. Существует несколько путей синтеза АТФ в клетках. Познакомимся с ними.

1. Анаэробное фосфорилирование. Фосфорилированием называют процесс синтеза АТФ из АДФ и низкомолекулярного фосфата (Фн). В данном случае речь идет о бескислородных процессах окисления органических веществ (например, гликолиз – процесс бескислородного окисления глюкозы до пировиноградной кислоты). Примерно 40% выделяемой в ходе этих процессов энергии (около 200 кДж/моль глюкозы), расходуется на синтез АТФ, а остальная часть рассеивается в виде тепла:

С 6 Н 12 О 6 + 2АДФ + 2Фн ––> 2С 3 Н 4 O 3 + 2АТФ + 4Н.

2. Окислительное фосфорилирование – это процесс синтеза АТФ за счет энергии окисления органических веществ кислородом. Этот процесс был открыт в начале 1930-х гг. XX в. В.А. Энгельгардтом. Кислородные процессы окисления органических веществ протекают в митохондриях. Примерно 55% выделяющейся при этом энергии (около 2600 кДж/моль глюкозы) превращается в энергию химических связей АТФ, а 45% рассеивается в виде тепла.

Окислительное фосфорилирование значительно эффективнее анаэробных синтезов: если в процессе гликолиза при распаде молекулы глюкозы синтезируется всего 2 молекулы АТФ, то в ходе окислительного фосфорилирования образуется 36 молекул АТФ.

3. Фотофосфорилирование – процесс синтеза АТФ за счет энергии солнечного света. Этот путь синтеза АТФ характерен только для клеток, способных к фотосинтезу (зеленые растения, цианобактерии). Энергия квантов солнечного света используется фотосинтетиками в световую фазу фотосинтеза для синтеза АТФ.

3. Биологическое значение АТФ

АТФ находится в центре обменных процессов в клетке, являясь связующим звеном между реакциями биологического синтеза и распада. Роль АТФ в клетке можно сравнить с ролью аккумулятора, так как в ходе гидролиза АТФ выделяется энергия, необходимая для различных процессов жизнедеятельности («разрядка»), а в процессе фосфорилирования («зарядка») АТФ вновь аккумулирует в себе энергию.

За счет выделяющейся при гидролизе АТФ энергии происходят почти все процессы жизнедеятельности в клетке и организме: передача нервных импульсов, биосинтез веществ, мышечные сокращения, транспорт веществ и др.

III. Закрепление знаний

Решение биологических задач

Задача 1. При быстром беге мы часто дышим, происходит усиленное потоотделение. Объясните эти явления.

Задача 2. Почему на морозе замерзающие люди начинают притопывать и подпрыгивать?

Задача 3. В известном произведении И.Ильфа и Е.Петрова «Двенадцать стульев» среди многих полезных советов можно найти и такой: «Дышите глубже, вы взволнованы». Попробуйте обосновать этот совет с точки зрения происходящих в организме энергетических процессов.

IV. Домашнее задание

Начать подготовку к зачету и контрольной работе (продиктовать вопросы зачета – см. урок 21).

Урок 20. Обобщение знаний по разделу «Химическая организация жизни»

Оборудование: таблицы по общей биологии.

I. Обобщение знаний раздела

Работа учащихся с вопросами (индивидуально) с последующими проверкой и обсуждением

1. Приведите примеры органических соединений, в состав которых входят углерод, сера, фосфор, азот, железо, марганец.

2. Как по ионному составу можно отличить живую клетку от мертвой?

3. Какие вещества находятся в клетке в нерастворенном виде? В какие органы и ткани они входят?

4. Приведите примеры макроэлементов, входящих в активные центры ферментов.

5. Какие гормоны содержат микроэлементы?

6. Какова роль галогенов в организме человека?

7. Чем белки отличаются от искусственных полимеров?

8. Чем отличаются пептиды от белков?

9. Как называется белок, входящий в состав гемоглобина? Из скольких субъединиц он состоит?

10. Что такое рибонуклеаза? Сколько аминокислот входит в ее состав? Когда она была синтезирована искусственно?

11. Почему скорость химических реакций без ферментов мала?

12. Какие вещества транспортируются белками через клеточную мембрану?

13. Чем отличаются антитела от антигенов? Содержат ли вакцины антитела?

14. На какие вещества распадаются белки в организме? Сколько энергии выделяется при этом? Где и как обезвреживается аммиак?

15. Приведите пример пептидных гормонов: как они участвуют в регуляции клеточного метаболизма?

16. Какова структура сахара, с которым мы пьем чай? Какие еще три синонима этого вещества вы знаете?

17. Почему жир в молоке не собирается на поверхности, а находится в виде суспензии?

18. Какова масса ДНК в ядре соматической и половой клеток?

19. Какое количество АТФ используется человеком в сутки?

20. Из каких белков люди изготавливают одежду?

Первичная структура панкреатической рибонуклеазы (124 аминокислоты)

II. Домашнее задание.

Продолжить подготовку к зачету и контрольной работе по разделу «Химическая организация жизни».

Урок 21. Зачетный урок по разделу «Химическая организация жизни»

I. Проведение устного зачета по вопросам

1. Элементарный состав клетки.

2. Характеристика органогенных элементов.

3. Структура молекулы воды. Водородная связь и ее значение в «химии» жизни.

4. Свойства и биологические функции воды.

5. Гидрофильные и гидрофобные вещества.

6. Катионы и их биологическое значение.

7. Анионы и их биологическое значение.

8. Полимеры. Биологические полимеры. Отличия периодических и непериодических полимеров.

9. Свойства липидов, их биологические функции.

10. Группы углеводов, выделяемые по особенностям строения.

11. Биологические функции углеводов.

12. Элементарный состав белков. Аминокислоты. Образование пептидов.

13. Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры белков.

14. Биологические функция белков.

15. Отличия ферментов от небиологических катализаторов.

16. Строение ферментов. Коферменты.

17. Механизм действия ферментов.

18. Нуклеиновые кислоты. Нуклеотиды и их строение. Образование полинуклеотидов.

19. Правила Э.Чаргаффа. Принцип комплементарности.

20. Образование двухцепочечной молекулы ДНК и ее спирализация.

21. Классы клеточной РНК и их функции.

22. Отличия ДНК и РНК.

23. Репликация ДНК. Транскрипция.

24. Строение и биологическая роль АТФ.

25. Образование АТФ в клетке.

II. Домашнее задание

Продолжить подготовку к контрольной работе по разделу «Химическая организация жизни».

Урок 22. Контрольный урок по разделу «Химическая организация жизни»

I. Проведение письменной контрольной работы

Вариант 1

1. Имеются три вида аминокислот – А, В, С. Сколько вариантов полипептидных цепей, состоящих из пяти аминокислот, можно построить. Укажите эти варианты. Будут ли эти полипептиды обладать одинаковыми свойствами? Почему?

2. Все живое в основном состоит из соединений углерода, а аналог углерода – кремний, содержание которого в земной коре в 300 раз больше, чем углерода, встречается лишь в очень немногих организмах. Объясните этот факт с точки зрения строения и свойств атомов этих элементов.

3. В одну клетку ввели молекулы АТФ, меченные радиоактивным 32Р по последнему, третьему остатку фосфорной кислоты, а в другую – молекулы АТФ, меченные 32Р по первому, ближайшему к рибозе остатку. Через 5 минут в обеих клетках померили содержание неорганического фосфат-иона, меченного 32Р. Где оно окажется значительно выше?

4. Исследования показали, что 34% общего числа нуклеотидов данной иРНК приходится на гуанин, 18% – на урацил, 28% – на цитозин и 20% – на аденин. Определите процентный состав азотистых оснований двухцепочечной ДНК, слепком с которой является указанная иРНК.

Вариант 2

1. Жиры составляют «первый резерв» в энергетическом обмене и используются, когда исчерпан резерв углеводов. Однако в скелетных мышцах при наличии глюкозы и жирных кислот в большей степени используются последние. Белки же в качестве источника энергии всегда используются лишь в крайнем случае, при голодании организма. Объясните эти факты.

2. Ионы тяжелых металлов (ртути, свинца и др.) и мышьяка легко связываются сульфидными группировками белков. Зная свойства сульфидов этих металлов, объясните, что произойдет с белком при соединении с этими металлами. Почему тяжелые металлы являются ядами для организма?

3. В реакции окисления вещества А в вещество В освобождается 60 кДж энергии. Сколько молекул АТФ может быть максимально синтезировано в этой реакции? Как будет израсходована остальная энергия?

4. Исследования показали, что 27% общего числа нуклеотидов данной иРНК приходится на гуанин, 15% – на урацил, 18% – на цитозин и 40% – на аденин. Определите процентный состав азотистых оснований двухцепочечной ДНК, слепком с которой является указанная иРНК.

Продолжение следует

АТФ и другие соединения клетки (витамины)

Особо важную роль в биоэнергетике клетки играет адениловый нуклеотид, к которому присоединены два остатка фосфорной кислоты. Такое вещество называют аденозинтрифосфорной кислотой (АТФ).

В химических связях между остатками фосфорной кислоты молекулы АТФ запасена энергия, которая освобождается при отщеплении органического фосфата: АТФ = АДФ + Ф + Е, где Ф — фермент, Е — освобождающаяся энергия. В этой реакции образуется аденозиндифосфорная кислота (АДФ) — остаток молекулы АТФ и органический фосфат.

Энергию АТФ все клетки используют для процессов биосинтеза, движения, производства тепла, нервных импульсов, свечений (например, у люминесцентных бактерий), т.е. для всех процессов жизнедеятельности.

АТФ — универсальный биологический аккумулятор энергии, который синтезируется в митохондриях (внутриклеточных органоидах).

Митохондрия, таким образом, исполняет в клетке роль «энергетической станции». Принцип образования АТФ в хлоропластах клеток растений в общем тот же — использование протонного градиента и преобразование энергии электрохимического градиента в энергию химических связей.

Световая энергия Солнца и энергия, заключенная в потребляемой пище, запасается в молекулах АТФ. Запас АТФ в клетке невелик. Так, в мышце запаса АТФ хватает на 20-30 сокращений. При усиленной, но кратковременной работе мышцы работают исключительно за счет расщепления содержащейся в них АТФ. После окончания работы человек усиленно дышит — в этот период происходит расщепление углеводов и других веществ (происходит накопление энергии) и запас АТФ в клетках восстанавливается протонов. Протоны проходят через этот канал под действием движущей силы электрохимического градиента. Энергия этого процесса используется ферментом, содержащимся в тех же самых белковых комплексах и способным присоединить фосфатную группу к аденозиндифосфату (АДФ), что и приводит к синтезу АТФ.

Витамины: Vita — жизнь.

Витамины — биологически активные вещества, синтезирующиеся в организме или поступающие с пищей, которые в малых количествах необходимы для нормального обмена веществ и жизнедеятельности организма.

В 1911г. Польский химик К. Функ выделил из рисовых отрубей вещество, излечивающее параличи голубей, питавшихся только полированным рисом. Химический анализ этого вещества показал, что в его состав входит азот.

Открытое им вещество Функ назвал витамином (от слов «вита»- жизнь и «амин»- содержащий азот.

Биологическая роль витаминов заключается в их регулярном действии на обмен веществ. Витамины обладают каталитическими свойствами, то есть способностью стимулировать химические реакции, протекающие в организме, а также активно участвуют в образовании и функции ферментов. Витамины влияют на усвоение организмом питательных веществ, способствуют нормальному росту клеток и развитию всего организма. Являясь составной частью ферментов, витамины определяют их нормальную функцию и активность. Таким образом, недостаток в организме какого-либо витамина ведет к нарушению процессов обмена веществ.

Группы витаминов:

СУТОЧНАЯ ПОТРЕБНОСТЬ В ВИТАМИНАХ

С — аскорбиновая кислота: 70 — 100 мг.

В — тиамин: 1,5 — 2,6 мг.

В — рибофлавин: 1,8 — 3 мг.

А — ретинол: 1,5 мг.

D — кальциферол: для детей и взрослых 100 МЕ,

до 3 лет 400 МЕ.

Е — токоферол: 15 — 20 мг.

В любой клетке нашего организма протекают миллионы биохимических реакций. Они катализируются множеством ферментов, которые зачастую требуют затрат энергии. Где же клетка ее берет? На этот вопрос можно ответить, если рассмотреть строение молекулы АТФ — одного из основных источников энергии.

АТФ — универсальный источник энергии

АТФ расшифровывается как аденозинтрифосфат, или аденозинтрифосфорная кислота. Вещество является одним из двух наиболее важных источников энергии в любой клетке. Строение АТФ и биологическая роль тесно связаны. Большинство биохимических реакций может протекать только при участии молекул вещества, особенно это касается Однако АТФ редко непосредственно участвует в реакции: для протекания любого процесса нужна энергия, заключенная именно в аденозинтрифосфата.

Строение молекул вещества таково, что образующиеся связи между фосфатными группами несут огромное количество энергии. Поэтому такие связи также называются макроэргическими, или макроэнергетическими (макро=много, большое количество). Термин впервые ввел ученый Ф. Липман, и он же предложил использовать значок ̴ для их обозначения.

Очень важно для клетки поддерживать постоянный уровень содержания аденозинтрифосфата. Особенно это характерно для клеток мышечной ткани и нервных волокон, потому что они наиболее энергозависимы и для выполнения своих функций нуждаются в высоком содержании аденозинтрифосфата.

Строение молекулы АТФ

Аденозинтрифосфат состоит из трех элементов: рибозы, аденина и остатков

Рибоза — углевод, который относится к группе пентоз. Это значит, что в составе рибозы 5 атомов углерода, которые заключены в цикл. Рибоза соединяется с аденином β-N-гликозидной связь на 1-ом атоме углерода. Также к пентозе присоединяются остатки фосфорной кислоты на 5-ом атоме углерода.

Аденин — азотистое основание. В зависимости от того, какое азотистое основание присоединяется к рибозе, выделяют также ГТФ (гуанозинтрифосфат), ТТФ (тимидинтрифосфат), ЦТФ (цитидинтрифосфат) и УТФ (уридинтрифосфат). Все эти вещества схожи по строению с аденозинтрифосфатом и выполняют примерно такие же функции, однако они встречаются в клетке намного реже.

Остатки фосфорной кислоты . К рибозе может присоединиться максимально три остатка фосфорной кислоты. Если их два или только один, то соответственно вещество называется АДФ (дифосфат) или АМФ (монофосфат). Именно между фосфорными остатками заключены макроэнергетические связи, после разрыва которых высвобождается от 40 до 60 кДж энергии. Если разрываются две связи, выделяется 80, реже — 120 кДж энергии. При разрыве связи между рибозой и фосфорным остатком выделяется всего лишь 13,8 кДж, поэтому в молекуле трифосфата только две макроэргические связи (Р ̴ Р ̴ Р), а в молекуле АДФ — одна (Р ̴ Р).

Вот каковы особенности строения АТФ. По причине того, что между остатками фосфорной кислоты образуется макроэнергетическая связь, строение и функции АТФ связаны между собой.

Строение АТФ и биологическая роль молекулы. Дополнительные функции аденозинтрифосфата

Кроме энергетической, АТФ может выполнять множество других функций в клетке. Наряду с другими нуклеотидтрифосфатами трифосфат участвует в построении нуклеиновый кислот. В этом случае АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и УТФ являются поставщиками азотистых оснований. Это свойство используется в процессах и транскрипции.

Также АТФ необходим для работы ионных каналов. Например, Na-K канал выкачивает 3 молекулы натрия из клетки и вкачивает 2 молекулы калия в клетку. Такой ток ионов нужен для поддержания положительного заряда на наружной поверхности мембраны, и только с помощью аденозинтрифосфата канал может функционировать. То же касается протонных и кальциевых каналов.

АТФ является предшественником вторичного мессенжера цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) — цАМФ не только передает сигнал, полученный рецепторами мембраны клетки, но и является аллостерическим эффектором. Аллостерические эффекторы — это вещества, которые ускоряют или замедляют ферментативные реакции. Так, циклический аденозинтрифосфат ингибирует синтез фермента, который катализирует расщепление лактозы в клетках бактерии.

Сама молекула аденозинтрифосфата также может быть аллостерическим эффектором. Причем в подобных процессах антагонистом АТФ выступает АДФ: если трифосфат ускоряет реакцию, то дифосфат затормаживает, и наоборот. Таковы функции и строение АТФ.

Как образуется АТФ в клетке

Функции и строение АТФ таковы, что молекулы вещества быстро используются и разрушаются. Поэтому синтез трифосфата — это важный процесс образования энергии в клетке.

Выделяют три наиболее важных способа синтеза аденозинтрифосфата:

1. Субстратное фосфорилирование.

2. Окислительное фосфорилирование.

3. Фотофосфорилирование.

Субстратное фосфорилирование основано на множественных реакциях, протекающих в цитоплазме клетки. Эти реакции получили название гликолиза — анаэробный этап В результате 1 цикла гликолиза из 1 молекулы глюкозы синтезируется две молекулы которые дальше используются для получения энергии, и также синтезируются два АТФ.

  • С 6 Н 12 О 6 + 2АДФ + 2Фн —> 2С 3 Н 4 O 3 + 2АТФ + 4Н.

Дыхание клетки

Окислительное фосфорилирование — это образование аденозинтрифосфата путем передачи электронов по электронно-транспортной цепи мембраны. В результате такой передачи формируется градиент протонов на одной из сторон мембраны и с помощью белкового интегрального комплекта АТФ-синтазы идет построение молекул. Процесс протекает на мембране митохондрий.

Последовательность стадий гликолиза и окислительного фосфорилирования в митохондриях составляет общий процесс под названием дыхание. После полного цикла из 1 молекулы глюкозы в клетке образуется 36 молекул АТФ.

Фотофосфорилирование

Процесс фотофосфорилирования — это то же окислительное фосфорилирование лишь с одним отличием: реакции фотофосфорилирования протекают в хлоропластах клетки под действием света. АТФ образуется во время световой стадии фотосинтеза — основного процесса получения энергии у зеленых растений, водорослей и некоторых бактерий.

В процессе фотосинтеза все по той же электронно-транспортной цепи проходят электроны, в результате чего формируется протонный градиент. Концентрация протонов на одной из сторон мембраны является источником синтеза АТФ. Сборка молекул осуществляется посредством фермента АТФ-синтазы.

В среднестатистической клетке содержится 0,04% аденозинтрифосфата от всей массы. Однако самое большое значение наблюдается в мышечных клетках: 0,2-0,5%.

В клетке около 1 млрд молекул АТФ.

Каждая молекула живет не больше 1 минуты.

Одна молекула аденозинтрифосфата обновляется в день 2000-3000 раз.

В сумме за сутки организм человека синтезирует 40 кг аденозинтрифосфата, и в каждый момент времени запас АТФ составляет 250 г.

Заключение

Строение АТФ и биологическая роль его молекул тесно связаны. Вещество играет ключевую роль в процессах жизнедеятельности, ведь в макроэргических связях между фосфатными остатками содержится огромное количество энергии. Аденозинтрифосфат выполняет множество функций в клетке, и поэтому важно поддерживать постоянную концентрацию вещества. Распад и синтез идут с большой скоростью, т. к. энергия связей постоянно используется в биохимических реакциях. Это незаменимое вещество любой клетки организма. Вот, пожалуй, и все, что можно сказать о том, какое строение имеет АТФ.

главный энергетический спонсор клетки. Или где взять энергию? Митохондриальные дисфункции.

Мурзаева Ирина Юрьевна

Эндокринолог, Врач превентивной медицины

Сегодня внедряемся в научные изыскания. Статья будет сложной для прочтения. Я максимально упрощала материал, но проще — некуда. На написание меня как всегда «вдохновила» всеобщая бесконечная жалоба — «слабость, ничего не помогает, ваших капельниц, таблеток хватило на 2 недели….». Сегодня рассмотрим самый сложный случай дефицита Энергии — дисфункция Митохондрий. Это еще малоизученная и сложная часть медицинской науки. Дисфункция митохондрий может быть врожденная и в нашем (рассматриваемом случае) — приобретенная.

Энергия в нашем организме представлена в следующем виде — молекула АТФ.

АТФ-аденозинтрифосфат, является основным источником энергии для клеток в частности и организма в целом. Представляет собой — эфир аденозина (пурин). Кроме того, является источником синтеза нуклеиновых кислот, для образования структуры ДНК!(наш генетический код)и посредником передачи в клетку гормонально сигнала! Вывод: нехватка АТФ — чревата извращение/недостатком гормонального ответа и не только. АТФ образуется в митохондриях (это маленькие структурные компоненты любой клетки, митохондрия имеет собственную ДНК!, как и ядро клетки!!,это высокоорганизованная структура ). Вот почему заболевания с нарушением синтеза АТФ — называются митохондриальные дисфункции.

В сутки в организме образуется 40 кг АТФ. Органы с максимальной выработкой АТФ: мозг 22%, печень 22%, мышцы 22 %, сердце 9%, жировая ткань всего — 4%, заметьте — ЩЖ с в этот перечень даже не вошла… Мозг и печень лидеры !

Теперь о самом процессе образования энергии. Смотрим на картинку.

Процесс образования энергии можно разделить на 3 этапа.

1 этап — это получение более простых молекул( в цикл образования энергии) из углеводов(У), жиров(Ж) и белков пищи(Б). Углеводы расщепляются до моносахаров(глюкоза,фруктоза), жиры до жирных кислот, белки до аминокислот. «Расщепление» Б,Ж,У происходит как к кислородной среде(аэробной), так и в бескислородной(анаэробной) среде. Это крайне важно! Так как из анаэробного гликолиза 1 молекулы глюкозы образуется — 2 молекулы АТФ, из аэробного (кислородного) гликолиза 1 молекулы глюкозы — образуются 36 молекул АТФ, из аэробного окисления 1 молекулы жирной кислоты — 146 молекул АТФ, ( жиры и белки в бескислородной среде вообще не расщепляются!, вывод — например, при нелеченной анемии(дефицитО2) снижение веса почти невозможно). Так, и усвоение 1 молекулы глюкозы требует 6 молекул О2, а 1 молекулы жирных кислот -23 молекулы О2. Вывод — жиры основной источник энергии, и всем нужен О2!!! 

2 этапом — образуется из всех молекул У, Ж, Б — АцетилКоА — промежуточный метаболит. Суть этого этапа, что кол-во выработанного АцетилКоА зависит от уровня многих витаминов и микроэлементов (витамина С, группы В, цинка, меди, железа и др). Почему так важно для образования энергии — восполнение дефицита этих элементов!

3 этап — этот самый АцетилКоА поступает в 2 основных биохимических пути выработки АТФ — это цикл Кребса( лимонной кислоты) и цикл окислительного фосфорилирования ( передачи электронов, «дыхательная цепь»;), происходит образование НАД- и НАДН+. Связь между этими двумя б/х циклами — и «есть узкое горлышко», «слабое место» в образовании АТФ. И зависит от рН среды клетки — при развитии в/клеточной гипоксии = в/клеточного ацидоза и ухудшается процесс образования АТФ — организм захлебывается в избытке НАДН, а НАДН сопряжен с «утечкой кислорода из клетки»( механизм не буду расшифровывать) и образованием активных(агрессивных) форм кислорода ( свободных радикалов) — а это повреждающие агенты для клетки при образовании в избыточном количестве.

Метаболический ацидоз — это следствие первичного дефицита О2 в организме (сам ацидоз становится причиной вторичного дефицита О2-утечки кислорода). Ацидоз выражается накоплением промежуточного продукта обмена — лактата, избытком Н+(иона водорода), митохондрии «начинают задыхаться и стареть и гибнуть»! А в месте со старением митохондрий — стареет организм, вот почему так молодеют некоторые заболевания — раньше развиваются атеросклероз, б-нь Альцгеймера, сахарный диабет (да-да , это митохондриальное заболевание), рак, артериальная гипертензия, АИТ, синдром хр усталости, даже НЯК и болезнь Крона (как одна из теорий) и др.

Как цикл лимонной кислоты (цикл Кребса) , например, связан с ожирением? — активное поступления с пищей жирных кислот- приводят к истощению транспортных карнитиновых (всем известен для сравнения Карнитин для спорт -питания) систем( переносчиков жирных кислот, их и так немного) и снижения активности работы «дыхательной цепи» , снижается чувствительность тканей к инсулину- развивается многим известная инсулинорезистентость! Исход — метаболическая печалька — метаболический синдром.

Соответственно: причинами снижения синтеза АТФ прежде всего являются дефицит О2!(как бывает в больших городах, где мало зелени!!, загазованность — продукт сгорания бензина это не О2-а СО2 !!!!, люди не выходят из помещений, мало двигаются — «мелкие сосуды закрыты для доступа О2», причинами могут быть болезни органов дыхания и сердечно-сосудистые патологии), ацидоз = «закисление организма» (накопление лактата, избыток Н+), полидефицит витаминов и микроэлементов для улучшения усвоения Ж, Б, У. Для лечение дефицита О2 даже был придуман аппарат — в основе которого интервальная гипоксическая тренировка. Это новая эра в лечении многих патологий.

Как же заподозрить митохондриальные проблемы? Они сложны как для понятия, так и для диагностики.

Из «простых анализов», которые можно набрать любой лаборатории — снижение рН крови, О2, повышение: лактата, СРБ, фибриногена, холестерина, ЛПНП, триглицеридов, гомоцистеина, мочевой кислоты, (клинически — повышение Ад, учащение ЧСС в покое, одышка в покое), снижение ферритина, из редких — снижение глутатиона, витаминов крови, снижение Q10, нарушение в системе антиоксидантов (по крови).

Из более редких , но все же доступных анализов (более специфических) — органические кислоты мочи ( благодаря этому анализу можно определить примерно на каком уровне идет нарушение и чем его скорректировать).
Если патология так сложно выявляемая — «как это лечить?»,- спросите вы

Лечить можно.

Прежде всего меняем образ жизни — улучшаем доставку О2!, бросаем курить! чаще дышим в парке и не только.. Лечим и приводим в ремиссию хронические дыхательные заболевания , восполняем дефицит витаминов и минералов!, добавляем антиоксиданты, сосудистые препараты(!) очень важно улучшить коровок(слабость всегда сопровождается рассеянностью, снижением памяти и внимания, — правильно, максимальная сосудистая сеть в головном мозге!!), реже добавляем «энергетики» — янтарная кислота, Q10, карнитин, НАДН и др. Я не говорю здесь про врожденные митохондриальные дисфункции — это следствие генетической поломки,а мы говорим сейчас больше о приобретенных причинах. Будем ждать новых научных материалов по этой теме…

состав, функции и роль в организме. Структура АТФ. Значение АТФ Функции адф и амф

В любой клетке нашего организма протекают миллионы биохимических реакций. Они катализируются множеством ферментов, которые зачастую требуют затрат энергии. Где же клетка ее берет? На этот вопрос можно ответить, если рассмотреть строение молекулы АТФ — одного из основных источников энергии.

АТФ — универсальный источник энергии

АТФ расшифровывается как аденозинтрифосфат, или аденозинтрифосфорная кислота. Вещество является одним из двух наиболее важных источников энергии в любой клетке. Строение АТФ и биологическая роль тесно связаны. Большинство биохимических реакций может протекать только при участии молекул вещества, особенно это касается Однако АТФ редко непосредственно участвует в реакции: для протекания любого процесса нужна энергия, заключенная именно в аденозинтрифосфата.

Строение молекул вещества таково, что образующиеся связи между фосфатными группами несут огромное количество энергии. Поэтому такие связи также называются макроэргическими, или макроэнергетическими (макро=много, большое количество). Термин впервые ввел ученый Ф. Липман, и он же предложил использовать значок ̴ для их обозначения.

Очень важно для клетки поддерживать постоянный уровень содержания аденозинтрифосфата. Особенно это характерно для клеток мышечной ткани и нервных волокон, потому что они наиболее энергозависимы и для выполнения своих функций нуждаются в высоком содержании аденозинтрифосфата.

Строение молекулы АТФ

Аденозинтрифосфат состоит из трех элементов: рибозы, аденина и остатков

Рибоза — углевод, который относится к группе пентоз. Это значит, что в составе рибозы 5 атомов углерода, которые заключены в цикл. Рибоза соединяется с аденином β-N-гликозидной связь на 1-ом атоме углерода. Также к пентозе присоединяются остатки фосфорной кислоты на 5-ом атоме углерода.

Аденин — азотистое основание. В зависимости от того, какое азотистое основание присоединяется к рибозе, выделяют также ГТФ (гуанозинтрифосфат), ТТФ (тимидинтрифосфат), ЦТФ (цитидинтрифосфат) и УТФ (уридинтрифосфат). Все эти вещества схожи по строению с аденозинтрифосфатом и выполняют примерно такие же функции, однако они встречаются в клетке намного реже.

Остатки фосфорной кислоты . К рибозе может присоединиться максимально три остатка фосфорной кислоты. Если их два или только один, то соответственно вещество называется АДФ (дифосфат) или АМФ (монофосфат). Именно между фосфорными остатками заключены макроэнергетические связи, после разрыва которых высвобождается от 40 до 60 кДж энергии. Если разрываются две связи, выделяется 80, реже — 120 кДж энергии. При разрыве связи между рибозой и фосфорным остатком выделяется всего лишь 13,8 кДж, поэтому в молекуле трифосфата только две макроэргические связи (Р ̴ Р ̴ Р), а в молекуле АДФ — одна (Р ̴ Р).

Вот каковы особенности строения АТФ. По причине того, что между остатками фосфорной кислоты образуется макроэнергетическая связь, строение и функции АТФ связаны между собой.

Строение АТФ и биологическая роль молекулы. Дополнительные функции аденозинтрифосфата

Кроме энергетической, АТФ может выполнять множество других функций в клетке. Наряду с другими нуклеотидтрифосфатами трифосфат участвует в построении нуклеиновый кислот. В этом случае АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ и УТФ являются поставщиками азотистых оснований. Это свойство используется в процессах и транскрипции.

Также АТФ необходим для работы ионных каналов. Например, Na-K канал выкачивает 3 молекулы натрия из клетки и вкачивает 2 молекулы калия в клетку. Такой ток ионов нужен для поддержания положительного заряда на наружной поверхности мембраны, и только с помощью аденозинтрифосфата канал может функционировать. То же касается протонных и кальциевых каналов.

АТФ является предшественником вторичного мессенжера цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) — цАМФ не только передает сигнал, полученный рецепторами мембраны клетки, но и является аллостерическим эффектором. Аллостерические эффекторы — это вещества, которые ускоряют или замедляют ферментативные реакции. Так, циклический аденозинтрифосфат ингибирует синтез фермента, который катализирует расщепление лактозы в клетках бактерии.

Сама молекула аденозинтрифосфата также может быть аллостерическим эффектором. Причем в подобных процессах антагонистом АТФ выступает АДФ: если трифосфат ускоряет реакцию, то дифосфат затормаживает, и наоборот. Таковы функции и строение АТФ.

Как образуется АТФ в клетке

Функции и строение АТФ таковы, что молекулы вещества быстро используются и разрушаются. Поэтому синтез трифосфата — это важный процесс образования энергии в клетке.

Выделяют три наиболее важных способа синтеза аденозинтрифосфата:

1. Субстратное фосфорилирование.

2. Окислительное фосфорилирование.

3. Фотофосфорилирование.

Субстратное фосфорилирование основано на множественных реакциях, протекающих в цитоплазме клетки. Эти реакции получили название гликолиза — анаэробный этап В результате 1 цикла гликолиза из 1 молекулы глюкозы синтезируется две молекулы которые дальше используются для получения энергии, и также синтезируются два АТФ.

  • С 6 Н 12 О 6 + 2АДФ + 2Фн —> 2С 3 Н 4 O 3 + 2АТФ + 4Н.

Дыхание клетки

Окислительное фосфорилирование — это образование аденозинтрифосфата путем передачи электронов по электронно-транспортной цепи мембраны. В результате такой передачи формируется градиент протонов на одной из сторон мембраны и с помощью белкового интегрального комплекта АТФ-синтазы идет построение молекул. Процесс протекает на мембране митохондрий.

Последовательность стадий гликолиза и окислительного фосфорилирования в митохондриях составляет общий процесс под названием дыхание. После полного цикла из 1 молекулы глюкозы в клетке образуется 36 молекул АТФ.

Фотофосфорилирование

Процесс фотофосфорилирования — это то же окислительное фосфорилирование лишь с одним отличием: реакции фотофосфорилирования протекают в хлоропластах клетки под действием света. АТФ образуется во время световой стадии фотосинтеза — основного процесса получения энергии у зеленых растений, водорослей и некоторых бактерий.

В процессе фотосинтеза все по той же электронно-транспортной цепи проходят электроны, в результате чего формируется протонный градиент. Концентрация протонов на одной из сторон мембраны является источником синтеза АТФ. Сборка молекул осуществляется посредством фермента АТФ-синтазы.

В среднестатистической клетке содержится 0,04% аденозинтрифосфата от всей массы. Однако самое большое значение наблюдается в мышечных клетках: 0,2-0,5%.

В клетке около 1 млрд молекул АТФ.

Каждая молекула живет не больше 1 минуты.

Одна молекула аденозинтрифосфата обновляется в день 2000-3000 раз.

В сумме за сутки организм человека синтезирует 40 кг аденозинтрифосфата, и в каждый момент времени запас АТФ составляет 250 г.

Заключение

Строение АТФ и биологическая роль его молекул тесно связаны. Вещество играет ключевую роль в процессах жизнедеятельности, ведь в макроэргических связях между фосфатными остатками содержится огромное количество энергии. Аденозинтрифосфат выполняет множество функций в клетке, и поэтому важно поддерживать постоянную концентрацию вещества. Распад и синтез идут с большой скоростью, т. к. энергия связей постоянно используется в биохимических реакциях. Это незаменимое вещество любой клетки организма. Вот, пожалуй, и все, что можно сказать о том, какое строение имеет АТФ.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

  • Введение
  • 1.1 Химические свойства АТФ
  • 1.2 Физические свойства АТФ
  • 2.1
  • 3.1 Роль в клетке
  • 3.2 Роль в работе ферментов
  • 3.4 Другие функции АТФ
  • Заключение
  • Библиографический список

Основным источником энергии для всех живых существ, населяющих нашу планету, служит энергия солнечного света, которую используют непосредственно только клетки зеленых растений, водорослей, зеленых и пурпурных бактерий. В этих клетках из углекислого газа и воды в процессе фотосинтеза образуются органические вещества (углеводы, жиры, белки, нуклеиновые кислоты и др.). Поедая растения, животные получают органические вещества в готовом виде. Энергия, запасенная в этих веществах, переходит вместе с ними в клетки гетеротрофных организмов.

В клетках животных организмов энергия органических соединений при их окислении превращается в энергию АТФ. (Углекислый газ и вода, выделяющиеся при этом, вновь используются автотрофными организмами для процессов фотосинтеза.) За счет энергии АТФ осуществляются все процессы жизнедеятельности: биосинтез органических соединений, движение, рост, деление клеток и др.

Аденозинтрифосфат — нуклеотид, играет исключительно важную роль в обмене энергии и веществ в организмах; в первую очередь соединение известно как универсальный источник энергии для всех биохимических процессов, протекающих в живых системах. АТФ был открыт в 1929 году Карлом Ломанном, а в1941 году Фриц Липман показал, что АТФ является основным переносчиком энергии в клетке .

По строению АТФ сходна с адениновым нуклеотидом, входящим в состав РНК, только вместо одной фосфорной кислоты в состав АТФ входят три остатка фосфорной кислоты. Клетки не в состоянии содержать кислоты в заметных количествах, а только их соли. Поэтому фосфорная кислота входит в АТФ в виде остатка (вместо ОН-группы кислоты имеется отрицательно заряженный атом кислорода).

Эти реакции обратимы, то есть АМФ может переходить в АДФ и далее в АТФ, аккумулируя энергию. Разрушение обычной пептидной связи высвобождает лишь 12 кДж/моль энергии. А связи, которыми присоединены остатки фосфорной кислоты, высокоэнергетичны (их еще называют макроэргическими): при разрушении каждой из них выделяется 40 кДж/моль энергии. Поэтому АТФ играет в клетках центральную роль универсального биологического аккумулятора энергии. Молекулы АТФ синтезируются в митохондриях и хлоропластах (лишь незначительное их количество синтезируется в цитоплазме), а затем поступают к различным органоидам клетки, обеспечивая энергией все процессы жизнедеятельности.

При усиленной нагрузке (например, в беге на короткие дистанции) мышцы работают исключительно за счет запаса АТФ. В клетках мышц этого запаса хватает на несколько десятков сокращений, а дальше количество АТФ должно восполняться. Синтез АТФ из АДФ и АМФ происходит за счет энергии, выделяющейся при расщеплении углеводов, липидов и других веществ. На выполнение умственной работы также затрачивается большое количество АТФ. По этой причине людям умственного труда требуется повышенное количество глюкозы, расщепление которой обеспечивает синтез АТФ .

АТФ является неустойчивой молекулой. В небуферизованной воде, он гидролизуется до АДФ и фосфата. Это потому, что прочность связей между фосфатными группами в АТФ меньше, чем прочность водородных связей (гидратации облигации), между своей продукции (АДФ + фосфат), и воду. Таким образом, если АТФ и АДФ находятся в химическом равновесии в воде, почти все АТФ будет в конечном счете превращается в AДФ. Система, которая далека от равновесия содержит свободную энергию Гиббса, и способен делать работу. Живые клетки поддерживают соотношение АТФ в АДФ в точке десять порядков от равновесия, при концентрации АТФ в тысячу раз выше, чем концентрация AДФ. Это смещение от положения равновесия означает, что гидролиз АТФ в клетке выпускает большое количество свободной энергии .

Две высокоэнергетические фосфатные связи (те, которые соединяют соседние фосфаты) в молекулы АТФ несут ответственность за высокое содержание энергии этой молекулы. Энергия, запасенная в АТФ может быть освобождена от гидролиза. Расположенный дальний от сахара рибозы, г-фосфатная группа имеет более высокую энергию гидролиза, чем любой б — или в-фосфат. Связи, образованные после гидролиза или фосфорилирования остатка АТФ — ниже по энергии, чем других связей АТФ. Во время фермент-катализируемого гидролиза АТФ или АТФ фосфорилирования, имеющиеся свободная энергия может быть использована на живые системы, чтобы сделать работу .

Любая нестабильная система потенциально реактивных молекул потенциально может служить способом хранения свободной энергии, если клетки сохранили свою концентрацию далеко от точки равновесия реакции. Однако, как и в случае с большинством полимерных биомолекул, разбивка РНК, ДНК и АТФ в простые мономеры обусловлена как выделение энергии и энтропии, увеличение соображения, как в стандартной концентрации, а также тех концентрациях, в которых встречается в клетке .

Стандартное количество энергии, выделяющейся в результате гидролиза АТФ может быть рассчитана по изменениям в энергии, не связанных с природными (стандартные) условия, то исправление биологической концентрации. Чистое изменение в тепловой энергии (энтальпии) при стандартной температуре и давлении разложения АТФ в АДФ и неорганических фосфатов — 20,5 кДж / моль, с изменением свободной энергии на 3,4 кДж / моль. Энергия выпускается путем расщепления фосфата или пирофосфата от АТФ на государственный стандарт 1 М являются:

Эти значения могут быть использованы для расчета изменения энергии в физиологических условиях и клеточных АТФ / АДФ. Тем не менее, более представительная значимость, называемая энергетическим зарядом, чаще работает. Значения приведены для свободной энергии Гиббса. Эти реакции зависят от ряда факторов, включая общую ионную силу и присутствие щелочно-земельных металлов, такие как ионы Mg 2 + и Ca 2 + . В обычных условиях, ДG составляет около — 57 кДж / моль (-14 ккал / моль) .

белок биологический аккумулятор энергия

Фосфорилирование АДФ возможно двумя способами: субстратное фосфорилирование и окислительное фосфорилирование (используя энергию окисляющихся веществ). Основная масса АТФ образуется на мембранах митохондрий в ходе окислительного фосфорилирования H-зависимой АТФ-синтазой. Субстратное фосфорилирование АТФ не требует участия мембранных ферментов, оно происходит в процессе гликолиза или путём переноса фосфатной группы с других макроэргических соединений.

В организме АТФ является одним из самых часто обновляемых веществ. Так у человека продолжительность жизни одной молекулы АТФ менее 1 мин. В течение суток одна молекула АТФ проходит в среднем 2000-3000 циклов ресинтеза (человеческий организм синтезирует около 40 кг АТФ в день), то есть запаса АТФ в организме практически не создаётся, и для нормальной жизнедеятельности необходимо постоянно синтезировать новые молекулы АТФ .

2 .1.1 Гл ико лиз — ферментативный процесс последовательного расщепления глюкозы в клетках, сопровождающийся синтезом АТФ. Гликолиз при аэробных условиях ведёт к образованию пировиноградной кислоты (пирувата), гликолиз в анаэробных условиях ведёт к образованию молочной кислоты (лактата). Гликолиз является основным путём катаболизма глюкозы в организме животных .

Процесс гликолиза условно можно разделить на два этапа. Первый этап, протекающий с расходом энергии 2-х молекул АТФ, заключается в расщеплении молекулы глюкозы на 2 молекулы глицеральдегид-3-фосфата. На втором этапе происходит НАД-зависимое окисление глицеральдегид-3-фосфата, сопровождающееся синтезом АТФ. Сам по себе гликолиз является полностью анаэробным процессом, то есть не требует для протекания реакций присутствия кислорода.

У аэробных организмов конечные продукты гликолиза подвергаются дальнейшим превращениям в биохимических циклах, относящихся к клеточному дыханию. В итоге после полного окисления всех метаболитов одной молекулы глюкозы на последнем этапе клеточного дыхания — окислительном фосфорилировании, происходящем на митохондриальной дыхательной цепи в присутствии кислорода, — дополнительно синтезируются ещё 34 или 36 молекулы АТФ на каждую молекулу глюкозы.

Фосфорилирование глюкозы преследует две цели: во-первых, из-за того что плазматическая мембрана, проницаемая для нейтральной молекулы глюкозы, не пропускает отрицательно заряженные молекулы Г-6-Ф, фосфорилированная глюкоза оказывается запертой внутри клетки. Во-вторых, при фосфорилировании глюкоза переводится в активную форму, способную участвовать в биохимических реакциях и включаться в метаболические циклы.

Это первая реакция субстратного фосфорилирования. С этого момента процесс расщепления глюкозы перестаёт быть убыточным в энергетическом плане, так как энергетические затраты первого этапа оказываются компенсированными: синтезируются 2 молекулы АТФ (по одной на каждый 1,3-дифосфоглицерат) вместо двух потраченных в реакциях 1 и 3 . Для протекания данной реакции требуется присутствие в цитозоле АДФ, то есть при избытке в клетке АТФ (и недостатке АДФ) её скорость снижается. Поскольку АТФ, не подвергающийся метаболизму, в клетке не депонируется а просто разрушается, то эта реакция является важным регулятором гликолиза.

Гликолиз — катаболический путь исключительной важности. Он обеспечивает энергией клеточные реакции, в том числе и синтез белка. Промежуточные продукты гликолиза используются при синтезе жиров. Пируват также может быть использован для синтезааланина, аспартата и других соединений. Благодаря гликолизу производительность митохондрий и доступность кислорода не ограничивают мощность мышц при кратковременных предельных нагрузках .

На I стадии этого процесса пируват теряет свою карбоксильную группу в результате взаимодействия с тиаминпирофосфатом (ТПФ) в составе активного центра фермента пируватдегидрогеназы (E 1). На II стадии оксиэтильная группа комплекса E 1 -ТПФ-СНОН-СН 3 окисляется с образованием ацетильнойгруппы, которая одновременно переносится на амид липоевой кислоты (кофермент), связанной с ферментомдигидроли-поилацетилтрансферазой (Е 2). Этот фермент катализирует III стадию — перенос ацетильнойгруппы на коэнзим КоА (HS-KoA) с образованием конечного продукта ацетил-КоА, который является высокоэнергетическим (макроэргическим) соединением.

На IV стадии регенерируется окисленная форма липоамида из восстановленного комплекса дигидролипоамид-Е 2 . При участии фермента дигидролипоилдегидрогеназы (Е 3) осуществляется переносатомов водорода от восстановленных сульфгидрильных групп дигидролипоамида на ФАД, который выполняет роль простетической группы данного фермента и прочно с ним связан. На V стадии восстановленный ФАДН 2 дигидро-липоилдегидрогеназы передает водород на кофермент НАД с образованием НАДН + Н + .

Процесс окислительного декарбоксилирования пирувата происходит в матриксе митохондрий. В нем принимают участие (в составе сложного мультиферментного комплекса) 3 фермента (пируватдегидрогеназа, ди-гидролипоилацетилтрансфераза, дигидролипоилдегидрогеназа) и 5 кофер-ментов (ТПФ, амид липоевой кислоты, коэнзим А, ФАД и НАД), из которых три относительно прочно связаны с ферментами (ТПФ-E 1 , ли-поамид-Е 2 и ФАД-Е 3), а два — легко диссоциируют (HS-KoA и НАД).

Все эти ферменты, имеющие субъединичное строение, и коферменты организованы в единый комплекс. Поэтому промежуточные продукты способны быстро взаимодействовать друг с другом. Показано, что составляющие комплекс полипептидные цепи субъединиц дигидролипоил-ацетилтрансферазы составляют как бы ядро комплекса, вокруг которого расположены пируватдегидрогеназа и дигидролипоилдегидрогеназа. Принято считать, что нативный ферментный комплекс образуется путем самосборки.

2 .1.3 Цикл трикарбоновых кисло т (цикл Кре бса , цитра тный цикл ) — центральная часть общего пути катаболизма, циклический биохимический аэробный процесс, в ходе которого происходит превращение двух — и трёхуглеродных соединений, образующихся как промежуточные продукты в живых организмах при распаде углеводов, жиров и белков, до CO 2 . При этом освобождённый водород направляется в цепь тканевого дыхания, где в дальнейшем окисляется до воды, принимая непосредственное участие в синтезе универсального источника энергии — АТФ.

Цикл Кребса — это ключевой этап дыхания всех клеток, использующих кислород, центр пересечения множества метаболических путей в организме. Кроме значительной энергетической роли циклу отводится также и существенная пластическая функция, то есть это важный источник молекул-предшественников, из которых в ходе других биохимических превращений синтезируются такие важные для жизнедеятельности клетки соединения как аминокислоты, углеводы, жирные кислоты и др.

У эукариот все реакции цикла Кребса протекают внутри митохондрий, причём катализирующие их ферменты, кроме одного, находятся в свободном состоянии в митохондриальном матриксе, исключение составляет сукцинатдегидрогеназа, которая локализуется на внутренней митохондриальной мембране, встраиваясь в липидный бислой. У прокариот реакции цикла протекают в цитоплазме .

Цикл Кребса регулируется «по механизму отрицательной обратной связи», при наличии большого количества субстратов (ацетил-КоА, оксалоацетат), цикл активно работает, а при избытке продуктов реакции (НАД, ATФ) тормозится. Регуляция осуществляется и при помощи гормонов, основным источником ацетил-КоА является глюкоза, поэтому гормоны, способствующие аэробному распаду глюкозы, способствуют работе цикла Кребса. Такими гормонами являются:

· б-субъединица транспортирует АТФ к мембранному переносчику, который «выбрасывает» АТФ в цитоплазму. Взамен из цитоплазмы этот же переносчик транспортирует АДФ. На внутренней мембране митохондрий также находится переносчик Фосфата из цитоплазмы в митохондрию, но для его работы необходим протон водорода. Такие переносчики называются транслоказами .

Субстр атное фосфорил ирование (биохимическое), синтез богатых энергией фосфорных соединений за счёт энергии окислительно-восстановительных реакций гликолиза (катализируемых фосфоглице-ральдегиддегидрогеназой и енолазой) и при окислении a-кетоглутаровой кислоты в цикле трикарбоновых кислот (под действием a-кетоглутаратдегидрогеназы и сукцинаттиокиназы). Для бактерий описаны случаи С. ф. при окислении пировиноградной кислоты.С. ф., в отличие от фосфорилирования в цепи переноса электронов, не ингибируется «разобщающими» ядами (например, динитрофенолом) и не связано с фиксацией ферментов в мембранах митохондрий. Вклад С. ф. в клеточный фонд АТФ в аэробных условиях значительно меньше, чем вклад фосфорилирования в цепи переноса электронов .

Главная роль АТФ в организме связана с обеспечением энергией многочисленных биохимических реакций. Являясь носителем двух высокоэнергетических связей, АТФ служит непосредственным источником энергии для множества энергозатратных биохимических и физиологических процессов. Всё это реакции синтеза сложных веществ в организме: осуществление активного переноса молекул через биологические мембраны, в том числе и для создания трансмембранного электрического потенциала; осуществления мышечного сокращения .

АТФ представляет собой термодинамически нестойкое соединение. Нестабильность АТФ определяется, во — первых, электростатическим отталкиванием в области кластера одноимённых отрицательных зарядов, что приводит к напряжению всей молекулы, однако сильнее всего связи — Р — О — Р, и во — вторых, конкретным резонансом. В соответствии с последним фактором существует конкуренция между атомами фосфора за неподелённые подвижные электроны атома кислорода, расположенного между ними, поскольку на каждом атоме фосфора имеется частичный положительный заряд в следствии значительного электронаицепторного влияния групп Р=О и Р — О-. Таким образом, возможность существования АТФ определяется наличием достаточного количества химической энергии в молекуле, позволяющей компенсировать эти физико — химические напряжения. В молекуле АТФ имеется две фосфоангидридных (пирофосфатных) связи, гидролиз которых сопровождается значительным уменьшением свободной энергии (при рН 7,0 и 37 о С).

Фосфорилирование АДФ является эндергоническим процессом и требует источника энергии. Как отмечалось ранее, в природе преобладает два таких источника энергии — это солнечная энергия и химическая энергия восстановленных органических соединений. Зелёные растения и некоторые микроорганизмы способны трансформировать энергию, поглощённых квантов света в химическую энергию, которая расходуется на фосфорилирование АДФ в световой стадии фотосинтеза. Этот процесс регенерации АТФ получил название фотосинтетического фосфорилирования. Трансформация энергии окисления органических соединений в макроэнергетические связи АТФ в аэробных условиях происходит преимущественно путём окислительного фосфорилирования. Свободная энергия, необходимая для образования АТФ, генерируется в дыхательной окислительной цепи митаходрий.

Известен ещё один тип синтеза АТФ, получивший название субстратного фосфорилирования. В отличии от окислительного фосфорилирования, сопряжённого с переносом электронов, донором активированной фосфорильной группой (- РО3 Н2), необходимой для регенерации АТФ, являются интермедианты процессов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот. Во всех этих случаях окислительные процессы приводят к образованию высокоэнергетических соединений: 1,3 — дифосфоглицерата (гликолиз), сукцинил — КоА (цикл трикарбоновых кислот), которые при участии соответствующих ферментов способны фолирировать АДФ и образовывать АТФ. Трансформация энергии на уровне субстрата является единственным путём синтеза АТФ в анаэробных организмах. Этот процесс синтеза АТФ позволяет поддерживать интенсивную работу скелетных мышц в периоды кислородного голодания. Следует помнить, что он является единственным путём синтеза АТФ в зрелых эритроцитах не имеющих митохондрий.

где Ф — фермент, Е — освобождающая энергия. В этой реакции образуется аденозинфосфорная кислота (АДФ) — остаток молекулы АТФ и органический фосфат. Энергию АТФ все клетки используют для процессов биосинтеза, движения, производство тепла, нервных импульсов, свечений (например, улюминисцентных бактерий), то есть для всех процессов жизнедеятельности .

Запас АТФ в клетке невелик. Так, в мышце запаса АТФ хватает на 20 — 30 сокращений. При усиленной, но кратковременной работе мышцы работают исключительно за счёт расщепления содержащейся в них АТФ. После окончания работы человек усиленно дышит — в этот период происходит расщепление углеводов и других веществ (происходит накопление энергии) и запас АТФ в клетках восстанавливается.

Живая клетка является далека от равновесия химическая система: ведь приближение живой системы к равновесию означает ее распад и смерть. Продукт каждого фермента обычно быстро расходуется, поскольку используется в качестве субстрата другим ферментом данного метаболического пути. Еще более важно, что большое количество ферментативных реакций связана с расщеплением АТФ на АДФ и неорганический фосфат. Чтобы это было возможным, пул АТФ в свою очередь должен поддерживаться на уровне, далеком от равновесия, так чтобы отношение концентрации АТФ в концентрации продуктов его гидролиза было высоким. Таким образом, пул АТФ играет роль «аккумулятора», поддерживающий постоянный перенес в клетке энергии и атомов по метаболическим путям, определяются присутствовать ферментами.

На пути от А — Н и Б — ОН-А — Б, связанном с гидролизом АТФ, энергия гидролиза сначала переводит Б — ОН в высокоэнергетическую промежуточную соединение, которое затем непосредственно реагирует с А — Н, образуя А — Б. простой механизм данного процесса включает в себя перенес фосфата от АТФ к Б — ОН с образованием Б — ОРО 3 , или Б — О — Р, причем в этом случае суммарная реакция происходит лишь в две стадии:

Величина G гидролиза АТФ до АДФ и неорганического фосфата зависит от концентрации всех реагирующих веществ и обычно для клетки условиях лежит в пределах от — 11 до — 13 ккал / моль. Реакция гидролиза АТФ, наконец, может быть использована для осуществления термодинамически невыгодной реакции со значением G, равным примерно +10 ккал / моль, конечно, в присутствии соответствующей последовательности реакций. Однако для многих реакций биосинтеза оказывается недостаточным даже? G = — 13 ккал / моль. В этих и других случаях путь гидролиза АТФ изменяется таким образом, что сначала образуются АМФ и РР (пирофосфат). На следующей стадии пирофосфат также подвергается гидролизу; общее изменение свободной энергии всего процесса составляет примерно — 26 ккал / моль.

Каким образом энергия гидролиза пирофосфата используется в биосинтетических реакциях? Один из путей можно продемонстрировать на примере приведенного выше синтеза соединения А — Б с А — Н и Б — ОН. При помощи соответствующего фермента Б — ОН может вступить в реакцию с АТФ и превратиться в высокоэнергетическую соединение Б — О — Р — Р. Теперь реакция состоит из трех стадий:

Поскольку фермент всегда ускоряет катализовану ним реакцию как в прямом, так и в обратном направлении, соединение А — Б может распадаться, реагируя с пирофосфатом (реакция, обратная стадии 2). Однако энергетически выгодная реакция гидролиза пирофосфата (стадия 3) способствует поддержанию стабильности соединения А-Б за счет того, что концентрация пирофосфата остается очень низкой (это предотвращает протекание реакции, обратной к стадии 2). Таким образом, энергия гидролиза пирофосфата обеспечивает протекание реакции в прямом направлении. Примером важной биосинтетических реакции такого типа является синтез полинуклеотидов .

Во всех известных организмах, дезоксирибонуклеотиды, которые составляют ДНК синтезируется под действием ферментов рибонуклеотид-редуктазы (РНР) на соответствующих рибонуклеотидах. Эти ферменты снижают остатка сахара отрибозы, чтобы дезоксирибоза путем удаления кислорода из 2″ гидроксильные группы, субстраты рибонуклеозид дифосфаты и продукты дезоксирибонуклеозид дифосфаты. Все ферменты редуктазы использоют общие сульфгидрильные радикального механизма зависит от реактивного цистеина остатков, которые окисляются с образованием дисульфидных связей в ход реакции. РНР фермент перерабатывается в результате реакции с тиоредоксином или глутаредоксином.

При синтезе нуклеиновых кислот РНК, аденозина, полученных от АТФ является одним из четырех нуклеотидов включены непосредственно в молекулах РНК, РНК-полимеразы. Энергия, это полимеризация происходит с отщеплением пирофосфата (две фосфатные группы). Этот процесс аналогичен в биосинтезе ДНК, за исключением того, что АТФ сводится к дезоксирибонуклеотиду дАТФ, перед включением в ДНК .

АТФ используется для многих клеточных функций, включая транспортную работу перемещения веществ через клеточные мембраны. Он также используется для механической работы, поставка энергии, необходимой для мышечного сокращения. Она поставляет энергию не только в сердечной мышце (для циркуляции крови) и скелетных мышц (например, за грубое движение тела), но также и к хромосомам и жгутиков, чтобы они могли выполнять свои многочисленные функции. Большую роль АТФ в химической работе, предоставлению необходимой энергии для синтеза нескольких тысяч типов макромолекул, что клетка должна существовать.

АТФ также используется в качестве включения-выключения как для контроля химических реакций и для отправки информации. Форма белковых цепей, которые производят строительные блоки и другие структуры, используемые в жизни определяется в основном слабые химические связи, которые легко исчезают и переструктурируются. Эти цепи могут сократить, удлинить, а также изменить форму в ответ на ввод или вывод энергии. Изменения в цепях изменить форму белка, а также может изменять свои функции или вызвать его, чтобы стать активным или неактивным.

Роль в метаболизме, синтезе и активном транспорте

Таким образом, АТФ передает энергию между пространственно разделенных метаболических реакций. АТФ является основным источником энергии для большинства клеточных функций. Это включает в себя синтез макромолекул, включая ДНК и РНК, и белки. АТФ также играет важную роль в транспорте макромолекул через клеточные мембраны, например, экзоцитоза и эндоцитоза.

Роль в структуре клеток и передвижения

ATФ участвует в поддержании клеточной структуры путем облегчения монтажа и демонтажа элементов цитоскелета. В связи с этим процессом, АТФ, необходимых для сокращения нитей актина и миозина необходимых для мышечного сокращения. Этот последний процесс является одним из основных требований энергию животных и имеет важное значение для движения и дыхания.

Роль в сигнальных системах
Во внеклеточных сигнальных системах
АТФ также является сигнальной молекулой. АТФ, АДФ, или аденозин признаны пуринергическими рецепторов. Пуринорецепторы могут быть наиболее распространенных рецепторов в тканях млекопитающих.
У людей этой сигнализации роль важна как в центральной и периферической нервной системы. Активность зависит от выпуска АТФ из синапсов, аксонов и глии пуринергическими активирует рецепторы мембраны
Во внутриклеточных сигнальных системах

АТФ имеет решающее значение в передаче сигнала процессов. Он используется киназ в качестве источника фосфатных групп в их реакции фосфата передачи. Киназы на подложках, таких как белки или липиды мембраны являются распространенной формой сигнала. Фосфорилирование белка по киназе могут активировать этот каскад, такие как митогенактивированной протеинкиназыкаскада.

АТФ используется также аденилатциклазу и превращается в вторичный мессенджер молекулы АМФ, который участвует в запуске кальция сигналы высвобождение кальция из внутриклеточных депо. [ 38 ] Эта форма сигнала имеет особенно важное значение в функции мозга, хотя он участвует в регуляции множества других клеточных процессов .

1. Аденозинтрифосфат — нуклеотид, играет исключительно важную роль в обмене энергии и веществ в организмах; в первую очередь соединение известно как универсальный источник энергии для всех биохимических процессов, протекающих в живых системах. Химически АТФ представляет собой трифосфорный эфир аденозина, который является производным аденина и рибозы. По строению АТФ сходна с адениновым нуклеотидом, входящим в состав РНК, только вместо одной фосфорной кислоты в состав АТФ входят три остатка фосфорной кислоты. Клетки не в состоянии содержать кислоты в заметных количествах, а только их соли. Поэтому фосфорная кислота входит в АТФ в виде остатка (вместо ОН-группы кислоты имеется отрицательно заряженный атом кислорода).

3. Главная роль АТФ в организме связана с обеспечением энергией многочисленных биохимических реакций. Являясь носителем двух высокоэнергетических связей, АТФ служит непосредственным источником энергии для множества энергозатратных биохимических и физиологических процессов. В биоэнергетике живых организмов имеют значение: химическая энергия запасается путём образования АТФ, сопряжённого с экзергоническими катаболическими реакциями окисления органических субстратов; химическая энергия утилизируется путём расщепления АТФ, сопряжённого с эндергоническими реакциями анаболизма и другими процессами, требующими затраты энергии.

4. При усиленной нагрузке (например, в беге на короткие дистанции) мышцы работают исключительно за счет запаса АТФ. В клетках мышц этого запаса хватает на несколько десятков сокращений, а дальше количество АТФ должно восполняться. Синтез АТФ из АДФ и АМФ происходит за счет энергии, выделяющейся при расщеплении углеводов, липидов и других веществ. На выполнение умственной работы также затрачивается большое количество АТФ. По этой причине людям умственного труда требуется повышенное количество глюкозы, расщепление которой обеспечивает синтез АТФ.

1. Лемеза, Н.А. Пособие по биологии для поступающих в ВУЗы / Л.В. Камлюк Н.Д. Лисов. — Мн.: Юнипресс, 2011 г. — 624 с.

2. Lodish, H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL, Darnell J. Molecular Cell Biology, 5th ed. — New York: WH Freeman, 2004.

3. Романовский, Ю.М. Молекулярные преобразователи энергии живой клетки. Протонная АТФ-синтаза — вращающийся молекулярный мотор / Ю.М. Романовский А.Н. Тихонов // УФН. — 2010. — Т.180. — С.931 — 956.

4. Voet D, Voet JG. Biochemistry Vol 1 3rd ed. — Wiley: Hoboken, NJ. — N-Y: W. H. Freeman and Company, 2002. — 487 р.

5. Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов. М.: Высшая школа, 1993 г

6. Вершубский, А.В. Биофизика. / А.В. Вершубский, В.И. Прик-лонский, А.Н. Тихонов. — М: 471-481.

7. Альбертс Б. Молекулярная биология клетки в 3-х томах. / Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. М.: Мир, 1994.1558 с.

8. Николаев А.Я. Биологическая химия — М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 1998.

9. Berg, J. M. Biochemistry, international edition. / Berg, J. M, Tymoczko, J. L, Stryer, L. — New York: WH Freeman, 2011; p 287.

10. Кнорре Д.Г. Биологическая химия: Учеб. для хим., биол. И мед. спец. вузов. — 3-е изд., испр. / Кнорре Д.Г., Мысина С.Д. — М.: Высш. шк., 2000. — 479 с.: ил.

11. Элиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Элиот, Д. Элиот. — М.: Изд-во НИИ Биомедицинской химии РАМН, ООО «Материк-альфа», 1999, — 372 с.

12. Shina CL, K., 7 Areieh, W. On the Energetics of ATP Hydrolysis in Solution. Journal Of Physical Chemistry B,113 (47), (2009).

13. Berg, J. M. Biochemistry / J. M. Berg: J. L. Tymoczko, L. Stryer. — N-Y: W. H. Freeman and Company, 2002. — 1514 p.

Подобные документы

    Органические соединения в организме человека. Строение, функции и классификация белков. Нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды), особенности строений и свойства РНК н ДНК. Углеводы в природе и организме человека. Липиды — жиры и жироподобные вещества.

    реферат , добавлен 06.09.2009

    Процесс синтеза белков и их роль в жизнедеятельности живых организмов. Функции и химические свойства аминокислот. Причины их нехватки в организме человека. Виды продуктов, в которых содержатся незаменимые кислоты. Аминокислоты, синтезируемые в печени.

    презентация , добавлен 23.10.2014

    Энергетическая, запасающая и опорно-строительная функции углеводов. Свойства моносахаридов как основного источника энергии в организме человека; глюкоза. Основные представители дисахаридов; сахароза. Полисахариды, образование крахмала, углеводный обмен.

    доклад , добавлен 30.04.2010

    Функции обмена веществ в организме: обеспечение органов и систем энергией, вырабатываемой при расщеплении пищевых веществ; превращение молекул пищевых продуктов в строительные блоки; образование нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и других компонентов.

    реферат , добавлен 20.01.2009

    Роль и значение белков, жиров и углеводов для нормального протекания всех жизненно важных процессов. Состав, структура и ключевые свойства белков, жиров и углеводов, их важнейшие задачи и функции в организме. Основные источники данных пищевых веществ.

    презентация , добавлен 11.04.2013

    Характеристика структуры холестериновых молекул как важного компонента клеточной мембраны. Исследование механизмов регуляции обмена холестерина в организме человека. Анализ особенностей возникновения избытка липопротеидов низкой плотности в кровотоке.

    реферат , добавлен 17.06.2012

    Обмен белков, липидов и углеводов. Типы питания человека: всеядность, раздельное и низкоуглеводное питание, вегетарианство, сыроедение. Роль белков в обмене веществ. Недостаток жиров в организме. Изменения в организме в результате изменения типа питания.

    курсовая работа , добавлен 02.02.2014

    Рассмотрение участия железа в окислительных процессах и в синтезе коллагена. Ознакомление со значением гемоглобина в процессах кровообразования. Головокружения, одышка и нарушение обмена веществ как результат дефицита железа в человеческом организме.

    презентация , добавлен 08.02.2012

    Свойства фтора и железа. Суточная потребность организма. Функции фтора в организме, влияние, смертельная доза, взаимодействие с другими веществами. Железо в организме человека, его источники. Последствия дефицита железа для организма и его переизбытка.

    презентация , добавлен 14.02.2017

    Белки как источники питания, их основные функции. Аминокислоты, участвующие в создании белков. Строение полипептидной цепи. Превращения белков в организме. Полноценные и неполноценные белки. Структура белка, химические свойства, качественные реакции.

Важнейшим веществом в клетках живых организмов является аденозинтрифосфорная кислота или аденозинтрифосфат. Если ввести аббревиатуру этого названия, то получим АТФ (англ. ATP). Это вещество относится к группе нуклеозидтрифосфатов и играет ведущую роль в процессах метаболизма в живых клетках, являясь для них незаменимым источником энергии.

Вконтакте

Одноклассники

Первооткрывателями АТФ стали учёные-биохимики гарвардской школы тропической медицины — Йеллапрагада Суббарао, Карл Ломан и Сайрус Фиске. Открытие произошло в 1929 году и стало главной вехой в биологии живых систем. Позднее, в 1941 году, немецким биохимиком Фрицем Липманом было установлено, что АТФ в клетках является основным переносчиком энергии.

Строение АТФ

Эта молекула имеет систематическое наименование, которое записывается так: 9-β-D-рибофуранозиладенин-5′-трифосфат, или 9-β-D-рибофуранозил-6-амино-пурин-5′-трифосфат. Какие соединения входят в состав АТФ? Химически она представляет собой трифосфорный эфир аденозина — производного аденина и рибозы . Это вещество образуется путём соединения аденина, являющегося пуриновым азотистым основанием, с 1′-углеродом рибозы при помощи β-N-гликозидной связи. К 5′-углероду рибозы затем последовательно присоединяются α-, β- и γ-молекулы фосфорной кислоты.

Таким образом, молекула АТФ содержит такие соединения, как аденин, рибозу и три остатка фосфорной кислоты. АТФ — это особое соединение, содержащее связи, при которых высвобождается большое количество энергии. Такие связи и вещества называются макроэргическими. Во время гидролиза этих связей молекулы АТФ происходит выделение количества энергии от 40 до 60 кДж/моль, при этом данный процесс сопровождается отщеплением одного или двух остатков фосфорной кислоты.

Вот как записываются эти химические реакции :

  • 1). АТФ + вода→АДФ + фосфорная кислота + энергия;
  • 2). АДФ + вода→АМФ + фосфорная кислота + энергия.

Энергия, высвобожденная в ходе указанных реакций, используется в дальнейших биохимических процессах, требующих определённых энергозатрат.

Роль АТФ в живом организме. Её функции

Какую функцию выполняет АТФ? Прежде всего, энергетическую. Как уже было выше сказано, основной ролью аденозинтрифосфата является энергообеспечение биохимических процессов в живом организме. Такая роль обусловлена тем, что благодаря наличию двух высокоэнергетических связей, АТФ выступает источником энергии для многих физиологических и биохимических процессов, требующих больших энергозатрат. Такими процессами являются все реакции синтеза сложных веществ в организме. Это, прежде всего, активный перенос молекул через клеточные мембраны, включая участие в создании межмембранного электрического потенциала, и осуществление сокращения мышц.

Кроме указанной, перечислим ещё несколько, не менее важных, функций АТФ , таких, как:

Как образуется АТФ в организме?

Синтез аденозинтрифосфорной кислоты идёт постоянно , т. к. энергия организму для нормальной жизнедеятельности нужна всегда. В каждый конкретный момент содержится совсем немного этого вещества — примерно 250 граммов, которые являются «неприкосновенным запасом» на «чёрный день». Во время болезни идёт интенсивный синтез этой кислоты, потому что требуется много энергии для работы иммунной и выделительной систем, а также системы терморегуляции организма, что необходимо для эффективной борьбы с начавшимся недугом.

В каких клетках АТФ больше всего? Это клетки мышечной и нервной тканей, поскольку в них наиболее интенсивно идут процессы энергообмена. И это очевидно, ведь мышцы участвуют в движении, требующем сокращения мышечных волокон, а нейроны передают электрические импульсы, без которых невозможна работа всех систем организма. Поэтому так важно для клетки поддерживать неизменный и высокий уровень аденозинтрифосфата.

Каким же образом в организме могут образовываться молекулы аденозинтрифосфата? Они образуются путём так называемого фосфорилирования АДФ (аденозиндифосфата) . Эта химическая реакция выглядит следующим образом:

АДФ + фосфорная кислота + энергия→АТФ + вода.

Фосфорилирование же АДФ происходит при участии таких катализаторов, как ферменты и свет, и осуществляется одним из трёх способов:

Как окислительное, так и субстратное фосфорилирование использует энергию веществ, окисляющихся в процессе такого синтеза.

Вывод

Аденозинтрифосфорная кислота — это наиболее часто обновляемое вещество в организме. Сколько в среднем живёт молекула аденозинтрифосфата? В теле человека, например, продолжительность её жизни составляет менее одной минуты, поэтому одна молекула такого вещества рождается и распадается до 3000 раз за сутки. Поразительно, но в течение дня человеческий организм синтезирует около 40 кг этого вещества! Настолько велики потребности в этом «внутреннем энергетике» для нас!

Весь цикл синтеза и дальнейшего использования АТФ в качестве энергетического топлива для процессов обмена веществ в организме живого существа представляет собой саму суть энергетического обмена в этом организме. Таким образом, аденозинтрифосфат является своего рода «батарейкой», обеспечивающей нормальную жизнедеятельность всех клеток живого организма.

Моносахариды (простые сахара) состоят из одной молекулы, содержащей от 3 до 6 атомов углерода. Дисахариды — соединения, образованные из двух моносахаридов. Полисахариды являются высокомолекулярными веществами, состоящими из большого числа (от нескольких десятков до нескольких десятков тысяч) моносахаридов.

Разнообразные углеводы в больших количествах содержатся в организмах. Их основные функции:

  1. Энергетическая: именно углеводы служат основным источником энергии для организма. Среди моносахаридов это фруктоза, широко встречающаяся в растениях (прежде всего в плодах), и особенно глюкоза (при расщеплении одного ее грамма выделяется 17,6 кДж энергии). Глюкоза содержится в плодах и других частях растений, в крови, лимфе, тканях животных. Из дисахаридов необходимо выделить сахарозу (тростниковый или свекловичный сахар), состоящую из глюкозы и фруктозы, и лактозу (молочный сахар), образованную соединением глюкозы и галактозы. Сахароза содержится в растениях (в основном в плодах), а лактоза — в молоке. Они играют важнейшую роль в питании животных и человека. Большое значение в энергетических процессах имеют такие полисахариды, как крахмал и гликоген, мономером которых выступает глюкоза. Они представляют собой резервные вещества растений и животных соответственно. При наличии в организме большого количества глюкозы она используется для синтеза этих веществ, которые накапливаются в клетках тканей и органов. Так, крахмал в больших количествах содержится в плодах, семенах, клубнях картофеля; гликоген — в печени, мышцах. По мере необходимости данные вещества расщепляются, поставляя глюкозу в различные органы и ткани организма.
  2. Структурная: например, такие моносахариды, как дезоксирибоза и рибоза, участвуют в формировании нуклеотидов. Различные углеводы входят в состав клеточных стенок (целлюлоза у растений, хитин у грибов).

Липиды (жиры) — органические вещества, нерастворимые в воде (гидрофобные), но хорошо растворяющиеся в органических растворителях (хлороформе, бензине и др.). Их молекула состоит из глицерина и жирных кислот. Разнообразие последних и обусловливает многообразие липидов. В мембранах клеток широко встречаются фосфолипиды (содержащие, кроме жирных, остаток фосфорной кислоты) и гликолипиды (соединения липидов и сахаридов).

Функции липидов — структурная, энергетическая и защитная.

Структурной основой клеточной мембраны выступает бимолекулярный (образованный из двух слоев молекул) слой липидов, в который встроены молекулы разнообразных белков.

При расщеплении 1 г жиров выделяется 38,9 кДж энергии, что примерно вдвое больше, чем при расщеплении 1 г углеводов или белков. Жиры могут накапливаться в клетках разных тканей и органов (печени, подкожной клетчатке у животных, семенах у растений), в больших количествах образуя значительный запас «топлива» в организме.

Обладая плохой теплопроводностью, жиры играют важную роль в защите от переохлаждения (например, слои подкожного жира у китов и ластоногих).

АТФ (аденозинтрифосфат). Он служит в клетках универсальным энергоносителем. Энергия, выделяющаяся при расщеплении органических веществ (жиры, углеводы, белки и т. д.), не может использоваться непосредственно для выполнения какой-либо работы, а запасается первоначально в форме АТФ.

Аденозинтрифосфат состоит из азотистого основания аденина, рибозы и трех молекул (а точнее, остатков) фосфорной кислоты (рис. 1).

Рис. 1. Состав молекулы АТФ

При отщеплении одного остатка фосфорной кислоты образуется АДФ (аденозиндифосфат) и высвобождается около 30 кДж энергии, которая расходуется на выполнение какой-либо работы в клетке (например, сокращение мышечной клетки, процессы синтеза органических веществ и т. д.):

Так как запас АТФ в клетке ограничен, он постоянно восстанавливается за счет энергии, выделяющейся при расщеплении других органических веществ; восстановление АТФ происходит путем присоединения молекулы фосфорной кислоты к АДФ:

Таким образом, в биологическом преобразовании энергии можно выделить два основных этапа:

1) синтез АТФ — запасание энергии в клетке;

2)высвобождение запасенной энергии (в процессе расщепления АТФ) для совершения работы в клетке.

На рисунке представлены два способа изображения структуры АТФ . Аденозинмонофосфат (АМФ), аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинтрифосфат (АТФ) относятся к классу соединений, называемых нуклеогидами. Молекула нук-леотида состоит из пятиуглеродного сахара, азотистого основания и фосфорной кислоты. В молекуле АМФ сахар представлен рибо-зой, а основание — аденином. В молекуле АДФ две фосфатные группы, а в молекуле АТФ — три.

Значение АТФ

При расщеплении АТФ на АДФ и неорганический фосфат (Фн) высвобождается энергия:

Реакция идет с поглощением воды , т. е. представляет собой гидролиз (в нашей статье мы много раз встречались с этим весьма распространенным типом биохимических реакций). Отщепившаяся от АТФ третья фосфатная группа остается в клетке в виде неорганического фосфата (Фн). Выход свободной энергии при этой реакции составляет 30,6 кДж на 1 моль АТФ.

Из АДФ и фосфата может быть вновь синтезирован АТФ, но для этого требуется затратить 30,6 кДж энергии на 1 моль вновь образованного АТФ.

В этой реакции , называемой реакцией конденсации, вода выделяется. Присоединение фосфата к АДФ называется реакцией фосфорилирования. Оба приведенных выше уравнения можно объединить:


Катализирует данную обратимую реакцию фермент, называемый АТФазой .

Всем клеткам, как уже было сказано, для выполнения их работы необходима энергия и для всех клеток любого организма источником этой энергии служит АТФ . Поэтому АТФ называют «универсальным носителем энергии» или «энергетической валютой» клеток. Подходящей аналогией служат электрические батарейки. Вспомните, для чего только мы их не используем. Мы можем получать с их помощью в одном случае свет, в другом звук, иногда механическое движение, а иногда нам нужна от них собственно электрическая энергия. Удобство батареек в том, что один и тот же источник энергии — батарейку — мы можем использовать для самых разных целей в зависимости от того, куда мы ее поместим. Эту же роль играет в клетках АТФ. Он поставляет энергию для таких различных процессов, как мышечное сокращение, передача нервных импульсов, активный транспорт веществ или синтез белков, и для всех прочих видов клеточной активности. Для этого он должен быть просто «подключен» к соответствующей части аппарата клетки.

Аналогию можно продолжить. Батарейки требуется сначала изготовить, а некоторые из них (аккумуляторные) так же, как и , можно перезарядить. При изготовлении батареек на фабрике в них должно быть заложено (и тем самым израсходовано фабрикой) определенное количество энергии. Для синтеза АТФ тоже требуется энергия; источником ее служит окисление органических веществ в процессе дыхания. Поскольку для фосфорилирования АДФ энергия высвобождается в процессе окисления, такое фосфорилирование называют окислительным. При фотосинтезе АТФ образуется за счет световой энергии. Этот процесс называют фотофос-форилированием (см. разд. 7.6.2). Есть в клетке и «фабрики», производящие большую часть АТФ. Это митохондрии; в них размешаются химические «сборочные линии», на которых образуется АТФ в процессе аэробного дыхания. Наконец, в клетке происходит и перезарядка разрядившихся «аккумуляторов»: после того как АТФ, высвободив заключенную в нем энергию, превратится в АДФ и Фн, он может быть вновь быстро синтезирован из АДФ и Фн за счет энергии, полученной в процессе дыхания от окисления новой порции органических веществ.

Количество АТФ в клетке в любой данный момент очень невелико. Поэтому в АТФ следует видеть только носителя энергии, а не ее депо. Для длительного хранения энергии служат такие вещества, как жиры или гликоген. Клетки весьма чувствительны к уровню АТФ. Как только скорость его использования возрастает, одновременно возрастает и скорость процесса дыхания, поддерживающего этот уровень.

Роль АТФ в качестве связующего звена между клеточным дыханием и процессами, идущими с потреблением энергии, видна из рисунка Схема эта выглядит простой, но она иллюстрирует очень важную закономерность.

Можно, таким образом, сказать, что в целом функция дыхания заключается в том, чтобы вырабатывать АТФ .


Суммируем вкратце сказанное выше.
1. Для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата требуется 30,6 кДж энергии на 1 моль АТФ.
2. АТФ присутствует во всех живых клетках и является, следовательно, универсальным носителем энергии. Другие носители энергии не используются. Это упрощает дело — необходимый клеточный аппарат может быть более простым и работать более эффективно и экономно.
3. АТФ легко доставляет энергию в любую часть клетки к любому нуждающемуся в энергии процессу.
4. АТФ быстро высвобождает энергию. Для этого требуется всего лишь одна реакция — гидролиз.
5. Скорость воспроизводства АТФ из АДФ и неорганического фосфата (скорость процесса дыхания) легко регулируется в соответствии с потребностями.
6. АТФ синтезируется во время дыхания за счет химической энергии, высвобождаемой при окислении таких органических веществ, как глюкоза, и во время фотосинтеза — за счет солнечной энергии. Образование АТФ из АДФ и неорганического фосфата называют реакцией фос-форилирования. Если энергию для фос-форилирования поставляет окисление, то говорят об окислительном фосфорилиро-вании (этот процесс протекает при дыхании), если же для фосфорилирования используется световая энергия, то процесс называют фотофосфорилированием (это имеет место при фотосинтезе).

8. АТФ и другие органические соединения клетки

Аденозинтрифосфорная кислота — АТФ

АТФ аденозинтрифосфорная кислота, или аденозинтрифосфат. Это вещество — своеобразный аккумулятор, без которого невозможно существование клетки.

  

АТФ находится в цитоплазме, в ядре, в двухмембранных органоидах (пластидах и митохондриях). Это универсальный источник энергии для всех процессов, происходящих в клетке. Благодаря использованию АТФ клетки могут осуществлять активный транспорт, синтезировать необходимые вещества, делиться и т. д. 

  

Количество АТФ определяется выполняемыми функциями — обычно в клетке содержится приблизительно \(0,05\) % АТФ от её массы. Но в активно функционирующих клетках (например, в мышцах) может быть и до \(0,5\) %.

Строение АТФ

АТФ — это нуклеотид, состоящий из аденина, рибозы и трёх остатков фосфорной кислоты. Остатки фосфорной кислоты в молекуле АТФ соединены друг с другом высокоэнергетическими (макроэргическими) связями. При разрыве такой связи выделяется почти в \(4\) раза больше энергии, чем при разрыве других связей. Обычно макроэргические связи обозначают символом ∼.


При гидролизе молекулы АТФ происходит отделение одного остатка фосфорной кислоты и образуется аденозиндифосфат (АДФ). При этом высвобождается \(40\) кДж/моль энергии.

 


Рис. \(1\). Превращение АТФ в АДФ

Другие производные нуклеотидов

Важную роль в процессах обмена веществ играют производные нуклеотидов, которые являются переносчиками водорода в разных биохимических процессах (например, в фотосинтезе и клеточном дыхании). Одним из таких веществ служит никотинамиддинуклеотидфосфат (НАДФ).

 

Рис. \(2\). Модель молекулы НАДФ 

 

В световую фазу фотосинтеза молекула НАДФ присоединяет водород и переходит в восстановленную форму НАДФ·h3служащую источником атомов водорода в реакциях темновой фазы.

Витамины

Витамины — сложные органические соединения, которые в незначительных количествах требуются живым организмам для нормального протекания биохимических процессов. В отличии от других органических соединений витамины не являются источником энергии.

 

Большинство витаминов поступает с пищей, но некоторые могут синтезироваться и в самом организме. 

Витамины обычно называют буквами латинского алфавита. Их делят на две группы: водорастворимые (B1, B2, B5, B6, B12, PP, C) и жирорастворимые (A, D, E, K).


Витамины принимают участие в обмене веществ преимущественно как составная часть сложных ферментов. Их отсутствие или недостаток приводит к тяжёлым нарушениям жизнедеятельности организма.

Источники:

Рис. 1. Превращение АТФ в АДФ https://image.shutterstock.com/image-illustration/atp-energy-currency-cell-600w-1509423494.jpg

Рис. 2. Модель молекулы НАДФ Автор: Benjah-bmm27 — собственная работа, Общественное достояние, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=1884538. 11.09.2021. 

NAD+

Никотинамид-Аденин-Динуклеотид или сокращенно NAD+ — кофермент витамина B3, жизненно важный для каждой клетки человеческого организма.

Эта чудодейственная молекула необходима для синтеза энергии, клеточной регенерации, предотвращения старения, восстановления повреждений ДНК.

NAD+ считается ключевым фактором здорового старения и долголетия.

Области применения NAD+



  • болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера
  • повышение артериального давления
  • сахарный диабет
  • сердечно-сосудистые заболевания
  • заболевания печени
  • иммунные заболевания
  • алкогольная и наркотические зависимости
  • депрессия и беспокойство
  • хронический стресс
  • хроническая усталость
  • антивозрастные программы
  • лишний вес и ожирение
  • нарушения сна
  • нарушения концентрации, памяти
  • снижение энергии и общего тонуса

Как это работает

NAD+ имеет решающее значение для жизни, поскольку непосредственно участвует в функционировании митохондрий и продукции энергии АТФ (митохондрии – мини электростанции нашей клетки, образующей энергию, благодаря которой организм живет).

В клетках NAD существует в двух состояниях NAD+ и NADH — окисленная и восстановленная формы. Оба эти соединения являются звеньями одного процесса выработки энергии, посредством различных реакций переходя из одного в другое. Для жизни важен баланс NAD+ и NADH.

К сожалению, уровень NAD+ снижаются с возрастом и ученые считают, что это снижение может быть напрямую связано со старением.

Уровень NAD+ снижается у всех с возрастом, независимо от вашего личного здоровья, диеты или физической подготовки. NAD+ снижается на 50% в возрасте 40 лет, а к 60 годам до 80%.

NAD+ антивозрастная молекула


Последние научные исследования говорят о том, что NAD+ участвует не только в выработке необходимой для жизни человека энергии, но играет важную роль практически во всех известных на данное время механизмах старения человека.

Так, к примеру, NAD+ является важным прямым кофактором ключевых ферментов, ответственных за долголетие, называемых сиртуинами. Сиртуины, SIRT17, тесно связаны с долголетием благодаря контролю за экспрессией генов и требуют NAD+ для своей активности. Активируя сиртуины, мы можем получить контроль над «старением».

SIRT «выключают» гены, способствующие старению, например, участвующие в процессах воспаления, синтезе и хранении жира, а также в регулировании уровня сахара в крови. SIRT восстанавливают и удлиняют теломеры (защитные колпачки на концах ДНК), принимаю участие в регуляции окислительного стресса и т.д.

Простыми словами сиртуины – продлевают жизнь за счет снижения частоты возрастзависимых заболеваний (сахарного диабета, общего воспаления, накоплении жира, регуляции иммунитета), а NAD+ активирует сиртуины.

Есть исследования, которые подтверждают, что NAD+ играет роль и в других механизмах старения: участвует в восстановлении повреждений ДНК, эпигенетической передаче сигналов, синтезе митохондрий, поддержании целостности хромосом и многое другое.

Роль NAD+ в предотвращении хронических нейродегенеративных заболеваний

Существует прямая связь между производством энергии и хроническими заболеваниями. Низкий NAD+ приводит к низким уровням АТФ. Низкий уровень АТФ быстро истощает запасы энергии вашей клетки, что ускоряет гибель клеток.

Как это проявляется в вашем организме, зависит от того, в каких клетках это происходит:

  • если затронуты нервные клетки, недостаток энергии может проявляться в виде депрессии, беспокойства, усталости и недостатка концентрации
  • длительное воздействие на нервные клетки может приводить к появлению таких симптомов, как тремор, судороги, покалывание, онемение и помутнение зрения. Существует предположение, что тяжелые энергетические нарушения в клетке могут быть причиной нейродегенеративных заболеваний — болезни Паркинсона и рассеянного склероза
  • если поражены клетки сердца, это может привести к сердечно-сосудистым заболеваниям. 
  • если затронуты легочные клетки, могут проявиться легочные расстройства. 

В целом известно, когда клеткам в ваших органах и тканях не хватает энергии, возникает болезнь.

Роль NAD+ в физических нагрузках, спорте и выносливости

Уровень АТФ истощаются в мышцах во время тренировок это понятный процесс. Однако до недавнего времени мы не знали, как NAD+ вовлечен в этот процесс.

Интенсивные физические упражнения уменьшают NAD+, а добавление веществ стимулирующих образование NAD+ усиливает выносливость, укорачивает восстановительный период, повышает работоспособность.

Роль NAD+ в зависимости

НАД+ c 1967 года используется в лечении наркотической и алкогольной зависимости. Несмотря на до конца не полное понимание механизмов терапии, результаты являются впечатляющими: пациенты сообщают о снижении симптомов отмены, общем избавлении от зависимости в течение 7-14 дней терапии.

Возможно один из механизмов формирования зависимости заключается в роли NAD+ в метаболизме алкоголя.

В США, Великобритании и других странах лечением зависимости с помощью NAD+ занимается ряд успешных клиник, среди них Springfield Wellness Clinic в США, NAD+ Clinic в ЮАР, Великобритании и США, Koniver Wellness США и многие другие.

МНЕНИЕ СПЕЦИАЛИСТОВ

Чистюхин Игорь

Семейный врач «TCA-clinic»

Можно сказать, что чем меньше NAD+ в нашем организме, тем больше мы поддаемся болезням, усталости, старению, расстройствам головного мозга, недостатку энергии, потере жизненных сил. Реальность такова, что энергия=производительность, поэтому NAD+ необходим, если Вы хотите преуспеть в работе, жизни, спорте.

Для кого

Положительные действия NAD+

  • повышает способность организма восстанавливаться после стресса и напряжения
  • повышает работоспособность во время физических упражнений, усиливает выносливость
  • помогает противостоять последствиям неправильного питания и малоподвижного образа жизни
  • замедляет повреждение ДНК, защищает теломеры
  • повышает энергию
  • улучшает когнитивные функции (память, мышление, понимание, обучение)
  • поддерживает здоровье сердечно-сосудистой системы, печени и других внутренних органов
  • убирает эпизоды депрессии
  • улучшает состояние кожи

СТОИМОСТЬ NAD+

Зависит от выбранной программы NAD+ терапии: IV или внутривенные капельницы c NAD, NAD-бустеры или биологически активная добавка NAD+

Узнать о том, какая программа NAD+ терапии подходит именно вам, ее особенности и стоимость, можно на консультации врача «TCA-clinic».

Запишитесь на консультацию, получите ответы, как оставаться здоровыми, привлекательными и полными сил независимо от возраста.

Сайт ATF / CREB является ключевым элементом для транскрипции гена РНК-метилтрансферазы, подобного 1 (RNMTL1) человека, недавно открытого гена 17p13.3

Профиль экспрессии

Область, демонстрирующая высокую частую потерю гетерозиготности в опухолях, идентифицированных путем сравнения образцов опухолей с подобранными доброкачественными тканями на наличие молекулярно-генетических маркеров (VNTR, STR и SNP и т. Д.), Может иметь гены, обладающие функция подавления опухоли заключалась в.Поэтому в качестве первого шага исследования, как только этот недавно открытый ген был идентифицирован и клонирован, мы экспериментально установили профиль экспрессии RNMTL1 в контексте как тканей пациентов с гепатокарциномой, так и установленных клеточных линий, которые будут использоваться в качестве реципиентов. ячеек в дальнейшем изучении. С β — актином в качестве контроля загрузки кДНК и реакциями ПЦР для ограниченного числа циклов мы проанализировали девять установленных клеточных линий и четыре пары тканей пациентов вместе с двумя нормальными тканями печени.Как показано на рис. 1, между разными образцами не наблюдалось значительной разницы в плотности полосы ПЦР. Это указывает на то, что ген RNMTL1 не имеет специфического для гепатоцеллюлярной карциномы паттерна экспрессии, по крайней мере, на уровне транскрипции. Если он играет какую-либо роль в гепатоцеллюлярном канцерогенезе, могут быть задействованы другие уровни контроля, например уровни трансляции или посттрансляции.

Рисунок 1

Профиль экспрессии RNMTL1 Общая РНК из культивируемых клеток и тканей была выделена, и была проведена ОТ-ПЦР с использованием β -актина в качестве внутреннего контроля. A , Lane 1-9, LO2, SMMC7721, BEL7402, U2OS, C33A, Hela, HEK293, PM-HO8910, ячейки SKOV3. B , дорожка 1-2, нормальная человеческая печень, дорожка 3-4, D15N и D15C, дорожка 5-6, D24N и D24C, дорожка 7-8, G62N и G62C, дорожка 9-10, Q80N и Q80C. «C’ указывает на образцы ГЦК, а «N» указывает на соседние доброкачественные ткани печени.

Картирование сайтов начала транскрипции гена RNMTL1 человека с помощью анализа удлинения праймера

Первая важная информация для нижней границы промотора любого данного гена касается того, где начинается транскрипция.Предыдущие попытки клонирования полноразмерной кДНК RNMTL1 привели к получению ряда клонов с различными 5′-концами (неопубликованные наблюдения). Хотя сайты инициации можно предсказать на основе статистического обзора увеличивающегося числа генов, экспериментально изученных 10 , окончательный вывод о любом вновь открытом гене должен быть сделан на основе экспериментальной характеристики. С этой целью удлинение праймера выделяется как простотой, так и эффективностью среди всех подходов, в которых в качестве праймеров для обратной транскрипции матрицы РНК используются ген-специфические антисмысловые олигонуклеотиды, меченные Р-концом 32 .Полученные кДНК с 5′-концом разделяли в денатурированном полиакриламидном секвенирующем геле, и длина меченых фрагментов кДНК в принципе должна отражать 5′-конец первичных транскриптов изучаемого гена. Мы выполнили анализ удлинения праймера с двумя комплементарными олигонуклеотидными зондами PE2 (от +16 до -24, нумерация от инициирующего ATG) и PE3 (от -53 до -84) (рис. 2B). Как показано на фиг. 2, панели A и C, в экспериментах, где использовался праймер PE2, мы обнаружили четыре отдельных удлиненных продукта из общей РНК нормальных тканей печени, клеток LO2, SMMC7721 и BEL7402.Для точного картирования сайта инициации лестницы секвенирования, полученные с использованием одних и тех же меченых праймеров, и плазмидная ДНК, содержащая соответствующую вставку в качестве матрицы, запускали параллельно. Таким образом, мы можем с уверенностью заключить, что во всех клетках, протестированных на транскрипты гена RNMTL1, было четыре старта. Два нижних по потоку находятся в CA, где A пронумеровано как +1, а два других находятся в C и A, расположенных в -19 и -20 от A (+1), соответственно. Как показано ниже (фиг. 3), в этом промоторе отсутствуют боксы как TATA, так и CCAAT.Гены этой категории характеризуются коротким фрагментом согласованной последовательности (инициатор: Py Py A N T / A Py Py, где A — +1), охватывающей начало транскрипции 10 . После того, как начало транскрипции было картировано (фиг. 2A-C), внедренные в начало последовательности были выровнены с консенсусом инициатора (фиг. 2D). За исключением того, что роль нуклеотида +3, где он должен быть либо T, либо A в консенсусе, нарушается в обоих начальных встраиваемых сегментах, принципы для остальных шести нуклеотидов в этом консенсусе хорошо соблюдаются 10 .Однако, поскольку A или T в положении + 3 были заявлены как решающие, еще предстоит исследовать, попадают ли начало транскрипции гена RNMTL1 в категорию генов, содержащих ортодоксальный инициатор. Поскольку в экспериментах с зондом PE3 в качестве праймера не было обнаружено удлиненного продукта (данные не показаны), мы пришли к выводу, что ген RNMTL1 не использует никаких дальнейших восходящих запусков, кроме четырех, идентифицированных для транскрипции (фиг. 2).

Фигура 2

Картирование стартовых сайтов с помощью удлинения праймера A , Картирование удлинения праймера сайта инициации RNMTL1 с использованием 32 P-меченного олигонуклеотида PE2.Дорожка 1-4, нуклеотид реакции секвенирования с использованием праймера PE2 и геномного фрагмента; полоса 5, реакция удлинения праймера с 10 мкг г тотальной РНК из образца ткани нормальной печени человека; полоса 6-8, реакция удлинения праймера с 10 мкг г тотальной РНК из клеточных линий LO2, SMMC7721 и BEL7402. Продукты с удлиненным праймером обозначены черной стрелкой (основное начало) и светлыми стрелками (второстепенное начало). B , Схематическое изображение соответствующих положений праймеров по отношению к шаблонам. C . Местоположение основного сайта инициации отмечено как положение +1, а олигонуклеотиды, используемые для анализа удлинения праймера, подчеркнуты. D , Выравнивание как нисходящих запусков, так и восходящих начинается с согласованной последовательности инициатора (центральная линия). Начало запуска указано вместе с соответствующими местоположениями.

Рисунок 3

Первичная структура человека RNMTL1 ген romoter A , Частичная рестрикционная карта 2.Геномный фрагмент размером 1 т.п.н., содержащий 5′-фланкирующую область RNMTL1. B , нуклеотидная последовательность (от -620 до +69) геномной области, окружающей начало транскрипции (основное начало +1 указано изогнутой стрелкой), в то время как другие три стартовых сайта с -1, -19 и -20 являются отмечены звездочкой). Потенциальные цис-действующие элементы обозначены рамкой и обсуждаются в разделе «Результат». Нуклеотиды, выделенные жирным шрифтом, представляют собой кодирующие последовательности гена RNMTL1.

Биоинфоматический анализ 5′-фланкирующей области гена RNMTL1 человека

После определения сайтов инициации транскрипции мы проанализировали вышележащую область, 5′-конец которой простирается до 1.5 Кб с помощью TRANSFAC 4.0 14 , программного обеспечения для прогнозирования мотивов ДНК, распознаваемых известными факторами транскрипции. Как показано на рис. 3, имеется богатая GC область, попадающая в категорию CpG-островка 15 . Рядом с сайтом начала транскрипции гена RNMTL1 нет классических боксов TATA и CCAAT, что является твердым признаком гена без TATA 10 . Присутствует ряд консенсусных последовательностей, распознаваемых известными факторами транскрипции, такими как три сайта консенсуса E2F-DP, один консенсусный сайт ATF / CREB, три сайта AP-2 и несколько сайтов SP1 в этом промоторе (рис. 3, A и B).Однако компьютерный прогноз в значительной степени основан на экспериментальных данных, полученных из анализа связывания in vitro, и часто переоценивает значимость сходства последовательностей. Имеют ли эти сайты функциональное значение, еще предстоит определить экспериментально.

Минимальная промоторная область гена RNMTL1 человека представляет собой фрагмент длиной 72 п.н., простирающийся от -71 до +1

Для оценки активности промотора в клетках распространенным и эффективным подходом является трансфекция в клетки конструкций, в которых репортерный ген, такой как ген люциферазы светлячка, находится ниже по ходу от тестируемого фрагмента ДНК, и оценка активности репортерного белка. в клеточном экстракте через пару дней культивирования.Чтобы начать наш функциональный анализ, фрагмент 573 п.н., охватывающий от -567 до +6 области гена RNMTL1 , был клонирован с помощью ПЦР на 5′-конец гена люциферазы светлячка в векторе pGL3-Basic и обозначен как pF. Убедившись, что его промоторная активность столь же сильна, как ранний промотор SV40 плюс энхансер в pGL3-Control в трансфицированных клетках, мы создали и протестировали серию делеционных мутантов с 5′- или 3′-концов этого фрагмента в pF. Делеция от 5′-конца до -71 в конструкции pD8 (-71 / + 6) не оказывала значительного влияния на эффективность промоторной активности в трансфицированных клетках SMMC 7721 (фиг. 4).Поскольку 3′-граница промотора была довольно точно предсказана, взяв за основу начало транскрипции (рис. 3), мы начали с нуклеотида на +6 в качестве его 3′-конца. Как показано на фиг.4, в то время как сегмент в pD9 (-201 / + 1) сохраняет полную силу промоторной активности, удаление еще 3 пар оснований с 3′-конца сегмента промотора, представленного pD10 (-201 / -3) привело к снижению активности промотора примерно на 40%. При дальнейшем удалении 15 п.н., представленных в pD11 (-201 / -18), промоторная активность полностью исчезла (фиг.4).Несмотря на то, что два вышестоящих начала (-19 и -20) остаются в pD11, его потеря промоторной активности не может означать, что эти два вышестоящих сайта не имеют существенной функциональной роли in vivo. Исходя из данных на фиг. 4, минимальный промотор гена RNMTL1, таким образом, простирается от -71 до +1 и 72 п.н. в длину.

Рисунок 4

Картирование делеции минимального промотора RNMTL1 A , Частичная рестрикционная карта промотора RNMTL1 (от -567 до +6).Изогнутая стрелка указывает главное стартовое место. B , схематическая иллюстрация репортерных конструкций RNMTL1, используемых в анализе временной трансфекции промоторной активности в клеточной линии SMMC7721. Тонкими линиями обозначены векторные последовательности; черные полосы указывают на репортерный ген люциферазы, а толстые линии указывают на фрагменты промотора RNMTL1. Указаны положения относительно сайта инициации транскрипции. Конструкции промотор-репортер котрансфицировали контрольной плазмидой (pRL-TK) и анализировали через 24 часа.Результаты представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. дубликатов из одного из трех отдельных экспериментов и показаны как процент активности pGL3-Control (см. соответствующий раздел в материалах и методах).

Идентификация критических цис-элементов путем анализа промоторной активности набора мутантов, каждый из которых имеет 12 нуклеотидных последовательностей, измененных методом двухцикловой ПЦР на основе мостиков.

Биоинформатический анализ выявил довольно много мотивов последовательностей, соответственно распознаваемых известными регуляторами транскрипции, а именно, один сайт AP-2 (от -49 до -41), один сайт ATF / CREB (от -38 до -31) и один E2F. -DP / SP1 сайт (от -18 до -12) в минимальном промоторе (фиг. 5A).Среди них сайт ATF / CREB на 100% гомологичен консенсусу (ожидаемое значение: 10-3) 16 , в то время как два других значительно отклоняются от консенсуса (ожидаемое значение 10 -1 ) базы данных 14 . Вопросы относительно того, какие из этих сайтов имеют какое-либо функциональное значение и существуют ли какие-либо новые сайты, взаимодействие которых с родственными им факторами транскрипции может способствовать промоторной активности минимального промотора гена RNMTL1, могут быть решены только экспериментально.С этой целью можно сосредоточить внимание на тех последовательностях, которые потенциально связаны известными факторами транскрипции. Вместо этого мы приняли альтернативный подход, то есть систематический подход путем тестирования набора мутантов. В каждом из 9 мутантов в контексте короткого промотора (от -137 до +1) каждые 12 нуклеотидов вставки были последовательно заменены следующей последовательностью: сайты рестрикционных ферментов EcoRI (GAATTC) и BamHI (GGATCC), в которых отсутствуют какие-либо известные цис-элементы (рис. 5Б). Хотя все мутанты обладают пониженной промоторной активностью в различной степени (фиг. 5C), изменение последовательности, представленной мутантами, pM6, pM7 или pM8, является наиболее пагубным.Осталось только 23%, 7% и 17% активности дикого типа соответственно. По совпадению, изменения в мутантах pM6, pM7 и pM8 нарушили следующие три цис-действующих элемента: сайт AP-2 (от -49 до -41), сайт ATF / CREB (от -38 до -31) и сайт E2F-DP / SP1. (От -18 до -12) вместе с двумя вышестоящими сайтами начала транскрипции соответственно.

Рисунок 5

Активность промотора мутантов с заменой последовательностей минимального промотора RNMTL1 A , Частичная карта цис-элементов, распознаваемых программным обеспечением для прогнозирования.Фрагмент CE обозначает нуклеотид, используемый в EMSA. B , Выравнивание мутированной последовательности в каждых 12 мутантах с заменой нуклеотидов по сравнению с pD6 дикого типа (-123 / + 6) на фиг.4. C , Люциферазная активность каждого мутанта в клетках SMMC7721 представлена ​​как среднее ± стандартное отклонение дубликатов образцов из одного из трех отдельных экспериментов, взяв промоторную активность pD6 (-123 / + 6) в качестве эталона.

Для дальнейшего картирования ключевой последовательности в этом фрагменте из 36 пар оснований, который был частично затронут в конструкциях pM6, pM7 и pM8, были получены дополнительные шесть мутантов и протестированы в анализе временной трансфекции / репортера, в каждом из которых только последовательность 6 п.н. был заменен сайтом рестрикции BamHI (фиг. 6).Самая низкая промоторная активность (17% от активности дикого типа) наблюдалась у мутанта pM7a, где последовательность TGACGTCA (консенсус ATF / CREB) была изменена на TGAgGatc, т.е. было изменено 4/8 п.н. В мутанте pM7b, где последовательность TAGCCG, находящаяся вне сайта ATF / CREB, была изменена на GGATCC, он проявлял гораздо более высокую промоторную активность (40% от дикого типа), чем у pM7a. Оба доказательства указывают на жизненно важное значение сайта ATF / CREB для функции промотора. Активность промотора также была значительно снижена у мутантов pM8a и pM8b (23% и 24% от дикого типа, соответственно), но только pM8b был заменен сайтом E2F-DP.Ввиду меньшего сходства этой последовательности с консенсусом аутентичного сайта E2F-DP функциональное значение этой последовательности, представленной исходной последовательностью, которая была заменена мутантами pM8a и pM8b, соответственно, может быть опосредовано неизвестным белком. другие факторы, кроме E2F-DP. Это мнение было подтверждено наблюдениями, что котрансфекция с экспрессирующими конструкциями E2F1 или DP1 млекопитающих не влияла на промоторную активность pF (см. Фиг. 10A). Поскольку мутантный pM6a с замененным сайтом AP-2 все еще обладал, по крайней мере, половиной активности промотора дикого типа, этот сайт может быть не так важен, как вышеупомянутые сайты.В заключение, сегмент от -40 до -12, обозначенный как фрагмент CE, где находится сайт ATF / CREB, играет важную роль в активности промотора RNMTL1 (рис. 5, 6).

Фигура 6

Промоторная активность мутантов с заменой последовательностей (по 6 п.н. каждый в фрагменте CE) минимального промотора RNMTL1 Подчеркнуты нуклеотидные последовательности трех функционально важных цис-действующих элементов. Перечислены нуклеотидные последовательности линкеров длиной 6 п.н., а исходные последовательности показаны дефисами.Люциферазная активность каждого мутанта в клетках SMMC7721 представлена ​​как среднее значение ± стандартное отклонение. дубликатов образцов из одного из трех отдельных экспериментов, взяв промоторную активность pD6 (-123 / + 6) в качестве эталона.

Фигура 10

YY1 репрессирует промоторную активность гена RNMTL1 A , котрансфекция экспрессионных конструкций SP1, SP3, YY1, E2F1 и DP1 (1 мг) соответственно, с pF (-567 / + 6) в клетках SMMC7721. B , Влияние котрансфекции вектора экспрессии YY1 pCB-YY1 на активность промотора RNMTL1 в клеточных линиях SMMC7721 и BEL7402. 1 мкг г конструкции промотор-репортер pF (-567 / + 6) плюс до 1 мкг г pCB-YY1 котрансфицировали контрольной плазмидой (pRL-TK) и проанализировали через 24 часа после трансфекции. . C , YY1-опосредованная репрессия транскрипции промотора RNMTL1 требует интактного сайта ATF / CREB. Набор мутантных конструкций промотор-репортер с заменой последовательности (от pM6a до pM8b, последовательности см. На фиг. 6) плюс контроль дикого типа (pD6) трансфицировали в клетки SMMC7721 с вектором экспрессии YY1 pCB-YY1 или без него, соответственно.

ATF / CREB-подобные белковые факторы могут специфически связываться с фрагментом CE, что может иметь функциональное значение для активности промотора RNMTL1 в клетках

Чтобы охарактеризовать белковые факторы, способные связывать фрагмент CE, мы провели анализ сдвига подвижности при электрофорезе для поиска последовательностей связывающих белков в ядерных экстрактах из клеток SMMC7721, взаимодействующих с каждым из трех 32 P-меченых двойных -цепочечные олигонуклеотидные зонды, соответственно, i.е., CE (от -40 до -12, включает сайт ATF / CREB и сайт E2F-DP / SP1), CE1 (от -40 до -26, включает сайт ATF / CREB) и CE2 (от -25 до -12, включает E2F -DP / SP1 сайт). Было четыре отдельных смещенных полосы, представляющих комплексы ДНК / белок, относящиеся к фрагменту CE и ядерному экстракту из клеток SMMC7721 (пронумерованные a → d; фиг. 7A, дорожка 2). Комплексы (a, b и c) полностью уничтожались 20-100-кратным молярным избытком немеченого CE-олигонуклеотида (фиг. 7A, дорожки 3-5). В случае CE1 можно было обнаружить только три отдельных комплекса (пронумерованные a, b и d; рис. 7A, дорожка 7).Возможно, что комплексы a и b представляют собой комплексы, содержащие ядерные факторы, связанные с сайтом ATF / CREB, тогда как комплекс c представляет собой комплексы, содержащие сайт E2F-DP / SP1. Поскольку при использовании CE2 в качестве зонда можно было обнаружить только комплекс d (фиг. 7A, дорожки 12-15), образование комплексов a, b и c может зависеть от целостности сайта ATF / CREB. Комплекс d появлялся во всех случаях и не мог быть полностью устранен даже 100-кратным молярным избытком холодного зонда. Таким образом, они могут быть неспецифическими комплексами в природе.

Рисунок 7

Взаимодействия ДНК-белок, выявленные с помощью анализа сдвига подвижности при электрофорезе A , 5 мкм г ядерных экстрактов SMMC7721 инкубировали с 32 P-меченными двухцепочечными олигонуклеотидами CE (положение от -40 до −12, дорожка 1–5), CE1 (положение от −40 до −26, дорожка 6–10) и CE2 (положение от −25 до −12, дорожка 11–15) с 20–100-кратным молярным избытком конкретного конкурента или без него. . B , Влияние мутации на взаимодействия ДНК-белок, специфичные для фрагмента CE.Образование комплексов ДНК-белок конкурировало с 50-кратным молярным избытком CE, а также с различными мутантами CE в форме двухцепочечных олигонуклеотидов (перечисленные выше дорожки 3–14, последовательности см. В Таблице 2) и анализировались с помощью EMSA в 4% полиакриламидных гелях. Черные стрелки (a, b) указывают на сайт-специфические комплексы ATF / CREB. Светлая стрелка (c) указывает на сайт-специфические комплексы E2F-DP / SP1, а черный ромб (d) указывает на неспецифические комплексы.

Для дальнейшего определения нуклеотидных последовательностей, необходимых для специфических взаимодействий ДНК-белок фрагмента CE, был изготовлен набор мутантов CE, в которых были мутированы от 6 до 12 нуклеотидов и проанализирована их конкурентная сила в отношении взаимодействий ДНК-белок относительно CE. фрагмент (последовательности различных мутировавших олигонуклеотидов перечислены в Таблице 2).Используя 50-кратный молярный избыток мутантов CE, можно оценить относительную важность отдельных нуклеотидов для связывания, специфичного для последовательности, с помощью EMSA. Как показано на фиг. 7B, сайт-специфические комплексы a и b ATF / CREB могут быть эффективно элиминированы 50-кратным содержанием олигонуклеотида CE или CE1 дикого типа и 50-кратным молярным избытком мутантов, в которых мутации произошли за пределами ATF. / Сайт CREB (полосы 3, 4, 7,11-13). Напротив, комплексы a и b не могли быть полностью уничтожены, когда мутации произошли в пределах сайта ATF / CREB (дорожки 5, 6, 8-10,14).Профиль сайт-специфического комплекса c E2F-DP / SP1 казался сложным. Мутанты с интактным сайтом E2F-DP / SP1 сохраняли полную способность разрушать связывание сайта E2F-DP / SP1 ядерными белками в клетках SMMC7721 (дорожки 5, 9-11). Однако олигонуклеотиды с мутированным или удаленным сайтом E2F-DP / SP1, но неповрежденным сайтом ATF / CREB, все еще сохраняли эту конкурентную эффективность (дорожки 7, 12). Только олигонуклеотиды с мутировавшими обоими сайтами не смогли устранить это связывание (дорожки 6, 8, 14). Эти результаты показали, что для образования сайт-специфических комплексов ATF / CREB требуется интактный сайт ATF / CREB, в то время как для образования сайт-специфического комплекса E2F-DP / SP1 требуется как сайт E2F-DP / SP1, так и соседний с ним сайт ATF / CREB. .

Таблица 2 Олигонуклеотиды, используемые в EMSA

Подтверждение прямого взаимодействия между белками ATF / CREB и их родственной последовательностью внутри фрагмента CE со специфическими антителами

Чтобы определить, какие члены семейства ATF / CREB ответственны за активацию промотора RNMTL1, мы провели эксперименты с суперсдвигом, в которых 32P-меченный зонд CE или CE1 инкубировали с ядерным экстрактом в присутствии специфических антител к белкам ATF2, CREB1 и YY1, соответственно.Как показано на фиг. 8, дорожки 4 и 10, добавление антитела против ДНК-связывающего домена bZIP CREB1 в реакции связывания устраняет комплексы a и b, что свидетельствует о присутствии белка CREB1 в этих двух комплексах. В то время как добавление антитела ATF2, антиген которого находится вне домена связывания ДНК, приводило к сверхсмещенной полосе (фиг. 8, дорожки 5 и 11). В качестве отрицательного контроля добавление антитела YY1 не влияло ни на образование, ни на подвижность любого из этих СЕ-специфических комплексов.Эти наблюдения укрепили вывод о том, что сайт ATF / CREB внутри фрагмента CE действительно взаимодействует с множеством белков семейства ATF / CREB, включая ATF2 и CREB1, в клетках и отвечает за промоторную активность гена RNMTL1 .

Рисунок 8

Идентификация белков семейства ATF / CREB, связанных с сайтом ATF / CREB внутри фрагмента CE. 5 мкМ мкг ядерных экстрактов SMMC7721 инкубировали с 32 P-меченными двухцепочечными олигонуклеотидами CE или CE1 в присутствии специфических антител.Дорожки 2 и 8, без контроля антител; дорожки 3 и 9, без контроля ядерного экстракта; дорожки 4 и 10, кроличьи поликлональные антитела распознают домен bZIP CREB1 / ATF1 / CREM1; дорожки 5 и 11, антитело, специфичное к ATF2; дорожки 6 и 12, YY1-специфическое антитело. Положения суперсдвига ATF2, комплексов ATF / CREB отмечены стрелками (a, b), E2F-DP / SP1-подобные комплексы отмечены светлой стрелкой (c), а неспецифические комплексы — черным ромбом (d).

Белки ATF / CREB могут специфично связываться с одноцепочечным олигонуклеотидом ATF / CREB .

Согласно консенсусу ATF / CREB: «TGACGTCA» представляет собой идеальный перевернутый повтор, он имеет тенденцию образовывать крестообразную вторичную структуру в растворе 16 .Вероятно, что специфичное для последовательности связывание белка ATF / CREB в основном опосредуется связыванием с крестообразной структурой, а не с первичной последовательностью. Таким образом, этот белок должен иметь совместимую связывающую способность с одноцепочечными олигонуклеотидами, которые также могут образовывать петлевую структуру и эквивалентны одной из двух петель в крестообразной структуре своими двухцепочечными аналогами. Чтобы проверить эту рабочую гипотезу, мы выполнили EMSA с использованием 32 Р-меченых одноцепочечных олигонуклеотидных CE с ядерным экстрактом, полученным из клеток SMMC7721.Четыре различных CE-специфических комплекса также могут быть обнаружены и устранены 50-кратным молярным избытком конкурента CE s , CE как , CE и CE1 (фиг. 9A, дорожки 12-15). Более того, одноцепочечный олигонуклеотид CE s , CE как , CE1 s и CE1 как могут конкурировать так же эффективно, как двухцепочечный олигонуклеотид CE (фиг. 9A, дорожки 3-7). При мутации сайта ATF / CREB одноцепочечный олигонуклеотид m7aL не мог конкурировать (дорожка 8).Напротив, когда мутация происходит вне сайта ATF / CREB, одноцепочечный конкурент m7bL сохраняет конкурентную способность (дорожка 9). Пока что наша рабочая гипотеза подтвердилась.

Фигура 9

Связывание ATF / CREB однонитевых или метилированных олигонуклеотидов посредством EMSA A , идентификация активности однонитевого связывания сайта ATF / CREB. 5 мкМ г ядерных экстрактов SMMC7721 инкубировали с 32 P-меченными двухцепочечными олигонуклеотидами CE (дорожки 1-9) или одноцепочечными олигонуклеотидами CE (дорожки 10-15).За образование комплексов ДНК-белок конкурировал 50-кратный молярный избыток различных холодных двухцепочечных (дорожки 3, 14 и 15) или одноцепочечных (дорожки 4-9, 12 и 13) олигонуклеотидов (последовательности см. В Табл. 2). B , CpG-сайт-специфическое метилирование внутри ATF / CREB-сайта привело к снижению связывающей активности. Образование комплексов ДНК-белок конкурировало с 50-кратным молярным избытком CpG-сайт-специфически метилированных олигонуклеотидов CE m (дорожка 4), CE1 m (дорожка 6) и неметилированного контрольного CE (дорожка 3), CE1 (дорожка 5).Мы также сравнили связывающую способность двухцепочечных олигонуклеотидов CE1 с метилированным CpG CE1 m (дорожки 7-10) без или с 50-кратным молярным избытком конкурента CE1 (дорожка 11) и CE1 m (переулок 12).

Сайт ATF / CREB: «TGACGTCA» содержит центральный динуклеотид CpG, и метилирование этого сайта может привести к потере связывания специфического фактора, а также потере транскрипционной активности как in vitro, так и in vivo 17 .Мы сравнили CE с олигонуклеотидами CE1, CEm и CE1 m на предмет их способности конкурировать за связывание ядерных факторов с олигонуклеотидами CE посредством EMSA, в котором как CE m , так и CE1 m олигонуклеотидов были предварительно метилированы метилазой SssI. Как показано на фиг. 9B, CE-специфические белковые комплексы были более заметными в присутствии CE m и CE1 m , чем соответствующие неметилированные олигонуклеотиды соответственно.

YY1 репрессия промоторной активности гена RNMTL1 опосредуется через сайт ATF / CREB

Альтернативный подход к подтверждению участия фактора транскрипции в транскрипции данного промотора заключается в оценке эффекта экзогенно введенного фактора транскрипции с помощью анализа временной трансфекции / репортера, родственный сайт (сайты) которого (есть) ) внутри тестируемого промотора, чтобы управлять репортерным геном люциферазы.Как показано на рис. 3, внутри промотора (от -567 до +6) гена RNMTL1 имеется множество цис-элементов, в частности, три сайта SP1 (от -467 до -458, от -222 до -214 и — От 100 до -94) и три сайта E2F-DP / SP1 (от -425 до -420, от -244 до -238 и от -18 до -12). Чтобы оценить, являются ли эти сайты функционально важными для клеток, мы трансфицировали клетки SMMC7721 и BEL7402, соответственно, экспрессирующими конструкциями млекопитающих человеческих SP1, SP3, E2F1, DP1 и YY1 вместе с pF (от -567 до +6).YY1 был выбран в качестве неродственного контроля, поскольку его родственный сайт отсутствует в этой области. Как показано на фиг. 10A, в экспериментах с использованием 1 мг каждой из экспрессионных конструкций млекопитающих, кодирующих SP1, SP3, E2F1, DP1 и YY1, соответственно с 1 мг pF, только YY1 снижает экспрессию репортера до 20% от уровня фиктивного контроля. в трансфицированных клетках, в то время как все остальные не имеют заметных эффектов. Инертность факторов транскрипции, SP1, SP3, DP1 и E2F1 в этом тесте имеет следующие правдоподобные объяснения: 1, консенсус этих сайтов был менее значимым, т.е.е., ожидаемое значение ниже 10-1; 2, эти сайты недоступны из-за особой структуры хроматина, аналогичная структура может быть довольно точно перенесена на введенную репортерную конструкцию pF; 3, эндогенный уровень экспрессии факторов уже был на функционально насыщенном уровне, дополнительные количества экзогенно поставляемых факторов не привели бы к какому-либо значительному эффекту.

Повышенная экспрессия YY1 в трансфицированных клетках большим количеством конструкций приводит к дозозависимой репрессии, как показано на фиг. 10B.Поскольку не было мотива, распознаваемого YY1 в минимальном промоторе, YY1-опосредованная репрессия транскрипции гена RNMTL1 должна действовать через взаимодействие ДНК-белок, специфичное для другой последовательности, взаимодействие белок-белок, в котором председательствует YY1. Чтобы проверить эту гипотезу, мы проверили репрессирующий эффект YY1 на множестве мутантов с замененной последовательностью. Как показано на фиг. 10C, только pM6b и pM7a, в которых сайты ATF / CREB были мутированы, сопротивлялись этой репрессии. Следовательно, полученным концом минимального промотора для репрессии транскрипции YY1 является цис-элемент, связанный с белками ATF / CREB.

В этой связи мы использовали полуколичественную ПЦР для оценки соответствующего уровня экспрессии YY1 и CREB1 соответственно. Как показано на фиг. 11, уровень экспрессии CREB1 был относительно ниже как в линиях клеток, так и в нормальной печени (дорожки 1-4), чем в образцах пациентов (дорожки 5-8). Однако уровень экспрессии YY1 либо выше в клеточных линиях (дорожки 1-3), либо ниже в нормальной печени и незлокачественных тканях (дорожки 4, 5 и 7), чем в тканях ГЦК тех же пациентов (дорожки 6 и 8).Значимость этого паттерна экспрессии еще предстоит оценить.

Рисунок 11

Профиль экспрессии генов CREB1 и YY1 в клеточных линиях и образцах тканей ОТ-ПЦР выполняли с использованием общей РНК из LO2, SMMC7721, BEL7402 (дорожка 1-3), образцов ткани из нормальной печени человека ( дорожка 4), ткани HCC D15C (дорожка 6), G62C (дорожка 8) и соседние доброкачественные ткани печени D15N (дорожка 5), G62N (дорожка 7).

(PDF) Регулирование трансформирующего фактора роста-β1 ATF-3 и идентификация генов-мишеней ATF-3 в клетках рака молочной железы

[Kang et al., 2003]. Следовательно, наиболее вероятно, что ATF-3 может образовывать

различных белковых комплексов в проксимальном сайте AP-1 и дистальном сайте

RD / Runx для стимуляции TGF-b1 промотора MMP-13

активации в MDA- Клетки MB231.

В целом, наши исследования показывают, что TGF-b1 стимулирует экспрессию ATF-3

устойчивым и продолжительным образом в клетках рака молочной железы

, и это может потребоваться для активации циклина A1 и MMP-

13 генов, приводящих к молочной железе. прогрессирование рака.Понимание функции

ATF-3 в росте и метастазировании клеток рака молочной железы in vivo

, несомненно, будет использоваться для будущих терапевтических целей и для

ранней диагностики агрессивных первичных опухолей молочной железы.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим доктора T. Hai за предоставление вектора ATF-3 и доктора Joseph

Fondell за критическое прочтение рукописи.

ССЫЛКИ

Allan AL, Albanese C, Pestell RG, LaMarre J. 2001. Активация транскрипции

Фактор 3

индуцирует синтез ДНК и экспрессию циклина D1 в гепатоцитах.

J Biol Chem 276: 27272–27280.

Anbazhagan R, Bornman DM, Johnston JC, Westra WH, Gabrielson E. 1999.

Мутация S387Y гена трансформирующего фактора роста-брецептора типа I

не характерна для метастазов рака груди и других распространенных типов

аденокарцинома. Cancer Res 59: 3363–3364.

Barnes GL, Hebert KE, Kamal M, Javed A, Einhorn TA, Lian JB, Stein GS,

Gerstenfeld LC. 2004. Верность активности Runx2 в клетках рака молочной железы составляет

, необходимых для генерации остеолитического заболевания, связанного с метастазами.

Cancer Res 64: 4506–4513.

Чен И, Риттлинг С.Р. 2003. Новые линии эпителиальных клеток молочной железы мышей, которые

образуют остеолитические метастазы в кости: влияние фоновой деформации на опухоль

. Clin Exp Metas 20: 111–120.

Chen BP, Liang G, Whelan J, Hai T. 1994. ATF3 и ATF3 delta Zip.

Репрессия транскрипции в сравнении с активацией альтернативно сплайсированными формами iso-

. J Biol Chem 269: 15812–15819.

Chen CR, Kang Y, Massague J.2001. Дефектная репрессия c-myc в раковых клетках груди

: потеря в основе трансформирующего фактора роста бета-программы роста

. Proc Natl Acad Sci USA 98: 992–999.

Эферл Р., Вагнер Э. Ф. 2003. AP-1: палка о двух концах в канцерогенезе. Nat

Rev Cancer 3: 859–868.

Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999.

Трансформирующий фактор роста бета1 подавляет неметастатический рак толстой кишки на

ранней стадии онкогенеза.Cancer Res 59: 3379–3386.

Fawcett TW, Martindale JL, Guyton KZ, Hai T, Holbrook NJ. 1999. Комплексы

, содержащие активирующий фактор транскрипции (ATF) / cAMP-чувствительный-элемент-

-связывающий белок (CREB), взаимодействуют с CCAAT / связывающим энхансером белком

(C / EBP) -ATF для регулирования экспрессии Gadd153. во время стресса

реакция. Biochem J 339: 135–141.

Хай Т., Вольфганг С.Д., Марси Д.К., Аллен А.Е., Сивапрасад У. 1999. ATF3 и

стрессовые реакции.Gene Expr 7: 321–335.

Hsu JC, Bravo R, Taub R. 1992. Взаимодействия между LRF-1, JunB, c-Jun и

c-Fos определяют регуляторную программу в фазе G1 регенерации печени. Mol

Cell Biol 12: 4654–4665.

Hsu JC, Cressman DE, Taub R. 1993. Специфическая для промотора трансактивация и ингибирование

, опосредованное JunB. Cancer Res 53: 3789–3794.

Джавед А., Барнс Г.Л., Пратап Дж., Антковяк Т., Герстенфельд Л.С., ван Вийнен А.Дж.,

Штайн Дж. Л., Лиан Дж. Б., Стейн Г.С.2005. Нарушение внутриядерного транспорта факторов транскрипции Runx2

(AML3 / CBFA1) в клетках рака груди ингибирует остеолиз

in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 102: 1454–1459.

Канг И., Чен С.Р., Массагу Дж. 2003. Самовоспроизводящийся bresponse TGF, связанный

с передачей сигналов стресса: Smad задействует фактор стрессового ответа ATF3 для репрессии Id1

в эпителиальных клетках. Mol Cell 11: 915–926.

Linardopoulos S, Gonos ES, Spandidos DA. 1993. Аномалии структуры гена ретино-

бластомы в опухолях легких человека.Cancer Lett 71: 67–74.

Massague J. 2000. Как клетки читают сигналы TGF-b. Nat Rev Mol Cell Biol

1: 169–178.

Massague J, Wotton D. 2000. Контроль транскрипции с помощью сигнальной системы TGF- / Smad

. EMBO J 19: 1745–1754.

Oft M, Peli J, Rudaz C, Schwarz H, Beug H, Reichmann E. 1996. TGF-beta1

и Ha-Ras сотрудничают в модулировании фенотипической пластичности и инвазивности эпителиальных опухолевых клеток. Гены Дев 10: 2462–2477.

Пик Э., Робертс AB. 2001. Супрессор и онкогенные роли трансформации фактора роста

-бета и его сигнальные пути в онкогенезе. Adv Cancer

Res 83: 1–54.

Piek E, Heldin CH, Ten Dijke P. 1999. Специфичность, разнообразие и регуляция передачи сигналов суперсемейства

TGF-b. FASEB J 13: 2105–2124.

Пратап Дж., Джавед А., Лангино Л. Р., ван Вийнен А. Дж., Стейн Дж. Л., Стейн Г. С., Лиан Дж. Б..

2005. Остеогенный транскрипционный фактор Runx2 регулирует матриксную металло-

протеиназу 9 в костных метастатических раковых клетках и контролирует клеточную инвазию.Mol

Cell Biol 25: 8581–8591.

Пратап Дж., Лиан Дж. Б., Джавед А., Барнс Г. Л., ван Вейнен А. Дж., Стейн Дж. Л., Стейн Г. С..

2006. Регуляторные роли Runx2 в метастатической опухоли и раковых клетках

взаимодействий с костью. Раковые метастазы Rev 25: 589–600.

Sakai T, Ohtani N, McGee TL, Robbins PD, Dryja TP. 1991. Онкогенные зародыши —

мутации линии

в сайтах Sp1 и ATF в гене ретинобластомы человека.

Природа 353: 83–86.

Selvamurugan N, Chou WY, Pearman AT, Pulumati MR, Партридж, Северная Каролина.1998.

Паратироидный гормон регулирует промотор коллагеназы-3 крысы в ​​тиковых клетках osteoblas-

посредством кооперативного взаимодействия сайта

белка-активатора и последовательности связывания домена runt. J Biol Chem 273: 10647-10657.

Selvamurugan N, Fung Z, Partridge NC. 2002. Активация транскрипции

коллагеназы-3 путем трансформации фактора роста-бета1 осуществляется путями MAPK и Smad

в клетках рака груди человека. FEBS Lett 532: 31–35.

Selvamurugan N, Kwok S, Партридж, Северная Каролина. 2004. Smad3 взаимодействует с JunB

и Cbfa1 / Runx2 для трансформации экспрессии стимулированной фактором роста-1 коллагеназы-

3 в клетках рака груди человека. J Biol Chem 279: 27764–27773.

Tomita S, Deguchi S, Miyaguni T, Muto Y, Tamamoto T., Toda T. 1999.

Анализ микросателлитной нестабильности и трансформирующего фактора роста b

Мутация гена рецептора типа II при спорадическом раке груди и их корреляция

с клинико-патологическими особенностями.Br Cancer Res Treat 53: 33–39.

Turner BC, Zhang J, Gumbs AA, Maher MG, Kaplan L, Carter D, Glazer PM,

Hurst HC, Haffty BG, Williams T. 1998. Экспрессия транскрипции AP-2

факторов коррелирует с раком груди человека с регуляцией множественных сигнальных путей фактора роста

. Cancer Res 58: 5466–5472.

Welch DR, Fabra A, Nakajima M. 1990. Трансформирующий фактор роста бета

стимулирует инвазию клеток аденокарциномы молочной железы и метастатический потенциал.

Proc Natl Acad Sci USA 87: 7678–7682.

Wolfgang CD, Chen BP, Martindale JL, Holbrook NJ, Hai T. 1997. gadd153 /

Chop10, потенциальный ген-мишень репрессора транскрипции ATF3. Mol

Cell Biol 17: 6700–6707.

Вольфганг С.Д., Лян Г., Окамото Ю., Аллен А.Е., Хай Т. 2000. Транскрипционная

авторепрессия индуцируемого стрессом гена ATF3. J Biol Chem 275: 16865–

16870.

Yin JJ, Selander K, Chirgwin JM, Dallas M, Grubbs BG, Wieser R, Massague J,

Mundy GR, Guise TA.1999. Блокада TGF-bsignaling ингибирует секрецию PTHrP

клетками рака груди и развитие метастазов в кости. Дж. Клин

Инвест 103: 197–206.

Yoshizumi M, Hsieh CM, Zhou F, Tsai JC, Patterson C, Perrella MA, Lee ME.

1995. Сайт ATF опосредует подавление гена циклина А в течение

контактного ингибирования в эндотелиальных клетках сосудов. Mol Cell Biol 15: 3266–3272.

414 ATF-3 ЦЕЛЕВЫЕ ГЕНЫ: ЦИКЛИН A1 И MMP-13 ЖУРНАЛ КЛЕТОЧНОЙ БИОХИМИИ

Важность правильного уровня трансмиссионной жидкости

Независимо от того, управляете ли вы традиционной автоматической или механической коробкой передач, трансмиссионная жидкость вашего автомобиля является жизненно важным компонентом.Если вы не поддерживаете надлежащий уровень жидкости, дни вашей передачи могут быть сочтены. Вы можете подумать, что вам не нужно часто проверять трансмиссионную жидкость, потому что у вас никогда не было проблем, но утечки трансмиссии могут произойти без предупреждения.

Здесь вы найдете дополнительную информацию о том, почему вам следует регулярно проверять трансмиссионную жидкость, о признаках ее низкого уровня и о наиболее распространенных местах утечек.

Почему следует проверять трансмиссионную жидкость?

Основная причина, по которой вы должны проверять трансмиссионную жидкость, — это убедиться, что уровни правильные.Ваша трансмиссия представляет собой закрытую систему, и если все работает правильно, вам никогда не придется добавлять жидкость. Если вы обнаружите, что у вас низкий уровень, то, вероятно, у вас есть утечка.

Чрезмерное количество жидкости почти так же плохо, как и недостаток жидкости, поэтому убедитесь, что вы правильно проверяете свои уровни, чтобы избежать переполнения. Проконсультируйтесь с руководством по эксплуатации, чтобы узнать, как проверить трансмиссионную жидкость.

Еще одна причина регулярно проверять трансмиссионную жидкость — это оценивать ее состояние.Вам следует обращать внимание на странные цвета и запахи, а также на количество мусора в жидкости. Точный цвет зависит от модели вашего автомобиля и типа жидкости, но большинство жидкостей имеют полупрозрачный красный или темно-розовый цвет.

Темно-красная и коричневая жидкость, особенно с запахом гари, является признаком того, что вам требуется обслуживание и, возможно, даже ремонт. Небольшое количество крошечных частиц пыли в жидкости — это нормально, но большие куски мусора — нет.

Каковы признаки низкого уровня трансмиссионной жидкости?

Низкий уровень трансмиссионной жидкости означает, что у вас также низкое давление жидкости, и это влияет на то, как ваша трансмиссия переключается.Это особенно актуально для автоматических трансмиссий, где давление жидкости напрямую влияет на диапазоны и интервалы переключения передач. Вот некоторые из общих признаков низкой трансмиссионной жидкости.

Сдвиг с задержкой

Сдвиг с задержкой — это еще один термин, обозначающий пробуксовку трансмиссии. Это когда вы трогаетесь с места или переключаете передачи, а трансмиссия колеблется, прежде чем перейти на эту передачу.

Нет переключения передач

Ваш автомобиль может не переключаться и вести себя так, как будто коробка передач находится на нейтрали.Двигатель набирает обороты, но колеса практически не двигаются.

Звук при переключении передач

Автомобиль быстро переключает передачу, но при включении издает громкий лязг и вздрагивает.

Проблемы с удержанием передачи

Автомобиль может переключаться между передачами в автоматической коробке передач, или рычаг переключения передач выскакивает после переключения передач вручную.

Неисправности контрольной лампы двигателя

В более новых автомобилях контрольная лампа двигателя будет гореть или мигать с кодом, если автомобиль обнаруживает проблему с трансмиссией.Часто свет является единственным индикатором проблемы, связанной с жидкостью.

Где образуются утечки?

Утечки чаще всего образуются при выходе из строя уплотнений. Утечки через уплотнение поддона — одно из наиболее распространенных мест утечки. Иногда металлические линии электропередачи и их соединения ломаются, трескаются или перекручиваются и вызывают утечку. В автоматических трансмиссиях основное уплотнение гидротрансформатора или даже сам гидротрансформатор могут треснуть и протечь.

Не все утечки проявляются в виде пятен на земле.Внутри трансмиссии накапливаются внутренние утечки, которые вызывают вспенивание жидкости и становятся неэффективными при охлаждении агрегата. В этом случае у вас могут возникнуть проблемы с переключением передач и перегревом, но вы можете не заметить никакой или очень небольшой потери жидкости.

Трансмиссионная жидкость — важный компонент, который нельзя игнорировать. Если вы продолжите движение с низким уровнем жидкости, вы можете выйти из строя трансмиссия. Если ваша трансмиссия протекает или показывает признаки низкого давления или жидкости, позвоните в Huntington Beach Transmission & Auto Repair. за советом или записаться на прием.Вы также можете пообщаться с нами в чате.

Форма ATF F 2300.10 ATF F 2300.10 Медицинская подготовка специального агента

Загрузить: pdf | pdf
 OMB № 1140-0056 (31.07.2007)

Министерство юстиции США
Бюро алкоголя, табака, огнестрельного оружия и взрывчатых веществ

1.

Специальный медицинский агент (предварительный / действующий)

Часть I - Демографические данные (заполняется специальным агентом / заявителем)
2. Дата рождения
3. Дата тестирования
4. Номер социального страхования

Имя (пожалуйста, напечатайте или напечатайте)

5.

Секс
Мужчина

6.

Домашний адрес

9.Периферийное отделение

7.

12. Текущий работодатель

Номер домашнего телефона

8.

женский

Номер рабочего телефона

10. Почтовый адрес полевого офиса

11. Личный номер телефона.

13. Текущая профессия

14. Как долго в текущей позиции?
(Годы / мес.)

Часть II - История болезни (Заполняется специальным агентом / заявителем. Отметьте каждый пункт, да или нет. Если да, пожалуйста, объясните)
15. Было ли вам отказано в приеме на работу, не могли ли вы работать или учиться в школе из-за какого-либо состояния здоровья?

16. Лечились ли вы когда-нибудь от какого-либо психического заболевания?

да

да

Нет

Нет

17.Вам когда-нибудь отказывали в страховании жизни или здоровья? (Если да, укажите причину и опишите подробности.)

18. Делали ли вы или вам посоветовали сделать какую-либо операцию?

да

да

Нет

Нет

19. Были ли вы когда-нибудь пациентом в какой-либо больнице? (Если да, укажите, когда, где, и укажите подробности.)

да

Нет

20. Были ли у вас какие-либо болезни или травмы, кроме уже упомянутых? (включая нарушения обучаемости и синдром дефицита внимания (СДВ) и т. д.).
да, укажите когда, где и опишите подробности.)
да
Нет
21. Консультировались ли вы или лечились у клиник, врачей, целителей или других практикующих врачей в течение последних 5 лет по поводу других заболеваний, кроме легких? (Если да,
укажите полный адрес врача, больницы, поликлиники и укажите подробности.)
да
Нет
22. Только для женщин: беременны ли вы в настоящее время? (Если да, укажите триместр. Этот вопрос относится только к вопросу безопасного участия в тренировках.)
да
Нет
23. Отказывались ли вы когда-либо от военной службы или увольняли вас с нее из-за физического, психического состояния или по другим причинам? (Если да, укажите дату, причину
и вид увольнения: почетное, кроме почетного, за непригодность или непригодность.)
да
Нет
24. Получали ли вы когда-нибудь, ожидают ли рассмотрения или подавали ли вы заявление на получение пенсии или компенсации в связи с существующей инвалидностью? (Если да, укажите, какие, предоставленные
кем, в каком количестве, когда и почему.)
да
Нет
25. Испытывали ли вы или в настоящее время испытываете что-либо из следующего? (Если да, объясните, пожалуйста)
Затуманенное зрение?
да
Нет
Дальтоник?

да

Нет

Глаукома?

да

Нет

26. А ты? (Если да, объясните, пожалуйста)
Носите очки или контактные линзы? да
Катаракта?

да

Нет

Нет

У вас когда-нибудь диагностировалось какое-либо заболевание глаз? (Если да, объясните, пожалуйста)

да

Нет
Форма ATF 2300.10
Пересмотрен в июле 2004 г.

Были ли у вас какие-либо операции на глазах (например, РК, ФРК, катаракта и т. Д.)? (Если да, пожалуйста, объясните, какая именно операция была выполнена, и дату
операция.)
да
Нет

27. Испытывали ли вы что-нибудь из следующего? (Если да, пожалуйста
Нарушение слуха
да
Головокружение
да
Громкий ударный шум за последние 14 часов
да
Вы участвуете в программе сохранения слуха?
да
Боли в груди
да
Боли в ногах
да
Шумы в сердце
да
Коронарное шунтирование / другие операции на сердце
да
Аномальная ЭКГ (в покое)
да
Сердечные заболевания, инсульт или инфаркт у родителей
или братья и сестры до 55 лет
да
Онемение стоп / рук
да
Флебит или тромбы
да
Бронхит, туберкулез
да
Астма
да
Тепло / солнечный удар
да
Заболевание щитовидной железы
да
Заболевание крови
да
Боль в спине
да
Боль в суставах или опухоль
да
Отсутствие координации
да
Тремор / дрожь
да
Постоянные боли в животе / животе
да
Рвота кровью
да
Проблемы с ходьбой
да
Потеря силы / мышечная слабость
да
Артрит
да
Проблемы с кожей, крапивница
да
Болезнь почек
да
Вы левша?
да
Постоянный понос / запор
да
Болезнь печени
да
Проблемы с желчным пузырем
да
Психиатрическая / психологическая консультация
да
Периоды нервозности
да
Звон или жужжание в ушах
да

объяснять
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет

ниже)
Громкий, постоянный шум или музыка в течение последних 14 часов
Вы носите слуховой аппарат?
Вы пользуетесь средствами защиты слуха?
Отек лодыжек или ступней
Учащенное сердцебиение (учащенное или прерывистое сердцебиение)
Прошлый анамнез или диагноз сердечных заболеваний
Сердечный приступ или инсульт
Ненормальная беговая дорожка
Холодные руки или ноги, когда другим комфортно в том же
комната
Высокое кровяное давление
Проблемы с дыханием, хрипы, непрекращающийся кашель,
/сбивчивое дыхание
Прошлый анамнез или диагноз заболевания легких или хирургического вмешательства
Диабет
Проблема гипофиза
Анемия
Хирургия спины
Покалывание в голове / руках / ногах
Эпилепсия (припадок)
Потеря чувствительности
Язва желудка
Проблемы с использованием бедра / колена / плеча
Потеря подвижности суставов / конечностей
Любая ампутация конечности или пальца
Подагра
Боль при мочеиспускании / инфекция / кровотечение
Локальная слабость / онемение
Ты правша?
Кровь в стуле
Гепатит
Грыжа
Чувство депрессии
Обморок
Обморок

да
да
да
да
да
да
да
да
да

Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет

да
да

Нет
Нет

да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да
да

Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет

Объяснение:

28.Ваша текущая физическая активность или упражнения
Интенсивность программы
Низкий
Умеренный
Высокий

29. Частота

30. Продолжительность

Дней в неделю

31. Мероприятия

Минут за сеанс

32. Лекарства (перечислите все лекарства (рецептурные и безрецептурные), которые вы в настоящее время принимаете, с указанием дозировки, частоты и причины).

33. Аллергия (проверьте, если применимо)
Никто

Пыль или плесень (указать)

Наркотики (указать)

Животные (указать)

Пыльца (указать)

Еда (указать)

Другое (указать)
34. Вы когда-нибудь курили?
да

Нет

Часть III - Социальная история (заполняется специальным агентом / заявителем)
35.Если да, то когда?
36. Тип
В данный момент

37. Сколько вы курили или курили в день?

Прошлое (количество лет с тех пор, как вы бросили курить)

Сигарета

Трубка

Сигары

38. На сколько лет?

Форма ATF 2300.10
Пересмотрено: июль 2004 г.

39. Каково ваше среднее потребление алкоголя в неделю? (1 напиток = 12 унций пива, 1 стакан вина, 1,5 унции ликера)
Напитки
40. Как часто вы употребляете алкоголь?
Будни
Выходные
Оба
41. Отец
В живых

Покойный

42. Мать
В живых

Часть IV - Семейный медицинский анамнез (заполняется специальным агентом / заявителем)
Текущий возраст
Текущее общее состояние здоровья
Возраст и причина смерти или причина бедности
Превосходно
Справедливый
Неизвестное здоровье
Хороший
Бедных
Текущий возраст

Текущее общее состояние здоровья
Превосходно
Справедливый
Хороший
Бедных

Покойный

Неизвестный

Возраст и причина смерти или причина бедности
Здоровье

43.Количество братьев

Возрастной диапазон

Проблемы со здоровьем, если таковые имеются

Возраст и причина смерти или причина бедности
Здоровье

44. Число сестер.

Возрастной диапазон

Проблемы со здоровьем, если таковые имеются

Возраст и причина смерти или причина бедности
Здоровье

45. Семейные заболевания (есть у кого-либо из ваших кровных родственников, т. Е. Бабушек и дедушек, родителей, братьев и сестер) имели одно из следующего:
Инсульт
Сердечные приступы или инсульты
Мигрени
Зоб
Рак
Операции на сердце
Назад Проблема
Гепатит
Эмфизема
Повышенный холестерин
Герпес
Болезнь желчного пузыря
Склонность к кровотечению
Астма
Анемия
Грыжа
Диабет
Сенная лихорадка
Глаукома
Ожирение
Эпилепсия
Нервный срыв
Артрит
Обморок / внезапная смерть
Заболевание щитовидной железы
Подагра
Колит
Другое (указать)
Обморочные заклинания
Лейкемия
Туберкулез
Высокое кровяное давление
Болезнь почек
Злоупотребление алкоголем / наркотиками
Сердечное заболевание
Психическое расстройство
Язва желудка
Я подтверждаю, что ознакомился с предоставленной мной вышеизложенной информацией, и что она является достоверной и полной, насколько мне известно.Я разрешаю
любой из врачей, больниц или клиник, упомянутых в этих формах, предоставить правительству полную стенограмму моей медицинской карты для
целей обработки моего заявления на эту работу или услугу. Я разрешаю предоставить всю медицинскую информацию Федеральной медицинской программе по гигиене труда / правоохранительным органам и контактному лицу Бюро по алкоголю, табаку, огнестрельному оружию и взрывчатым веществам.
Подпись клиента

Дата

Подпись свидетеля

Дата

Название клиники

Часть V - Заполняется клиникой (распечатайте)
Адрес / Расположение клиники

RN

Номер телефона (включая область
код)

MD / DO

Часть VI - Заполняется поставщиком медицинских услуг
Отказ от ответственности: это обследование не заменяет периодического медицинского осмотра, проводимого вашим частным поставщиком медицинских услуг.Он проводится в профессиональных целях.
1.

Предварительная служба:
Требуемые услуги
(Проверьте, когда тест будет завершен)
Лаборатории (кровь и моча)
Свинец крови и ЗПП
Рост, вес, жизненно важные органы
ЭКГ (12 отведений с расшифровкой)
ППД Манту (кожная проба на туберкулез)
Аудиометрия (500 Гц - 8000 Гц)
Проверка зрения (ближнее и дальнее; скорректированное и нескорректированное)
Цветовое зрение (14 тарелок Исихара)
Периферическое зрение (носовое и височное)
Тонометрия
Восприятие глубины (угловые секунды)
Общий физический осмотр
Общий медицинский анамнез
Прикрепите копии всех результатов тестов

Лабораторные компоненты Кровь натощак

Всесторонний
Метаболическая панель

CBC
(включая Diff / Plat)

Общий холестерин
Триглицериды
ЛПВП - холестерин
ЛПНП - холестерин
Хол / ЛПВП
Билирубин
Трансфераза
GGT
ЛДГ, Всего
Аланин трансминаза

Глюкоза
Азот мочевины (АМК)
Креатинин
АМК / креатинин
Натрий
Калий
Хлористый
Белок, Всего
Глобулин
Соотношение альбумин / глобулин
Щелочная фосфатаза
АСТ (SGOT)

Количество лейкоцитов
Количество красных кровяных телец
Гемаглобин
Гематокрит
MCV
MCH
RDW
Количество тромбоцитов
Нейтрофилов
Лимфоциты
Абсолютные моноциты
Моноциты
Абсолютные эозинофилы
Эозинофилы
Абсолютные базофилы
Базофилы

Общий анализ мочи
Цвет
Появление
Удельный вес
Глюкоза
Кетоны
Оккультная кровь
Протеин
Нитриты
Лейкоцитарная эстераза
Под микроскопом, если показано

Форма ATF 2300.10
Пересмотрено: июль 2004 г.

Часть VII - Диагностика и физические данные (заполняется поставщиком медицинских услуг)
2.

Голова и шея
Обычный

3.

Аномальный

Color Vision (Требуется документация :)
# Верный

Голова, лицо, шея (щитовидная железа), скальп
Нос / пазухи
Рот / Горло
Ученики Равные / Реактивные
Окулярная подвижность

Внутриглазное давление
Верно

Титм
Тарелка Исихара
Другое (указать)
5.

мм / рт.

Тип теста:

Левый
Слойка

Периферийное зрение (требуются числовые значения)

мм / рт.

Шиоц

Правый височный глаз

Левый височный глаз

Носовой

Носовой

Общий

Общий

Восприятие глубины (требуется документация :)
# Верный

из

Всего протестированных дуги

Тип тестера
6.Секунды дуги
Шепард - Фрай%

Некорректное зрение (единицы Снеллена)
Около:

Всего протестировано

Тип теста

Офтальмоскопические результаты
4.

из

Оба 20 /

7.

Исправленное зрение (юниты Снеллена)

Правый 20 /

Осталось 20 /

Около:

Оба 20 /

Правый 20 /

Осталось 20 /

Осталось 20 /

Далеко:

Оба 20 /

Правый 20 /

Осталось 20 /

8.

Далеко:
Оба 20 /
Правый 20 /
Комментарий к отклонениям в состоянии здоровья:

9.

Частота

500 Гц

Часть VIII - Аудиология (заполняется поставщиком медицинских услуг)
1000 Гц
2000 Гц
3000 Гц
4000 Гц

Исходный уровень

Ежегодный

6000 Гц

8000 Гц

Правое ухо
Левое ухо
10.Аудиограмма:
Метод калибровки:

Оскар

Обзор / сравнение с исходным уровнем:

Прекращение (прикрепить текущую и базовую аудиограмму)
Биологические

Изменять

Дата
Без изменений

Правое ухо

Обычный

Аномальный

Левое ухо

Канал / внешнее ухо:

Обычный

Аномальный

Канал / внешнее ухо:

Обычный

Аномальный

Барабанная перепонка:

Обычный

Аномальный

Барабанная перепонка:

Обычный

Аномальный

Комментарии:

11. Показатели жизнедеятельности:
Рост

Масса

Кровяное давление

Пульс

мм / рт. ст. (сидя)

Температура (если указано)
(сидя)

Комментарии:

12. Туберкулез.
Дата регистрации

Дата прочтения

Степени индукции

Дата последнего рентгена грудной клетки

Комментарии (рентген грудной клетки, лечение туберкулеза / свидания):

Форма ATF 2300.10
Пересмотрен в июле 2004 г.

13. Кардио / легочные:
ЭКГ (приложить с интерпретацией):
Обычный
Аномальный

Легкие / грудь (включая грудь):
Обычный
Аномальный

Сердце (шум, сердцебиение, эктопические сокращения): Сосудистые (варикозное расширение вен):
Обычный
Аномальный
Обычный
Аномальный

Комментарии:

14. Тестирование функции легких (прикрепите копию):
% Прогнозируемой FVC
% Прогнозируемого ОФВ1

% Прогнозируемого ОФВ1 / ФЖЕЛ

% Прогнозируемого FEF 25 - 75

Комментарии:

Часть IX - Диагностика и физические данные (заполняется поставщиком медицинских услуг)
15. Опорно-двигательный аппарат.
Верхние конечности (сила):
Обычный
Аномальный

Верхние конечности (диапазон движений):
Обычный
Аномальный

Нижние конечности (сила):
Обычный
Аномальный

Нижние конечности (диапазон движений):
Обычный
Аномальный
Гибкость
Обычный
Аномальный

Ноги

Позвоночник

Обычный
Аномальный
Глубокие сухожильные рефлексы
Обычный
Аномальный

Обычный
Другое неврологическое
Обычный

Аномальный
Аномальный

16.Может ли кандидат участвовать в следующих мероприятиях:
да

Программа интенсивных аэробных упражнений 3 часа в неделю (минимум)
Подтягивания

да

Нет

Приседания

да

Нет

Нет

Отжимания

да

Полтора мили (1,5), бег на время

Нет
да

Нет

Комментарии:

17. Способен ли заявитель:
да
да
да
да

Нет
Нет
Нет
Нет

Приседайте и поднимайтесь, не держась за какой-либо предмет. Постоянно приседайте и вставайте на колени до 45 секунд.
Встаньте на одно колено, вытяните руки перед телом на уровне глаз в течение семи (7) секунд.
Примите позу на одно или два колена в течение двух (2) секунд и сможете подняться без посторонней помощи.Уметь повторить дважды.
Удерживайте положение колена в течение 2–3 минут несколько раз.

Прокомментируйте ответы «Не могу участвовать»:

Обычный

Аномальный

Психическое / эмоциональное воздействие (опишите, если оно ненормальное)

Обычный

Аномальный

Система G -U

Обычный

Аномальный

Живот, Внутренние органы

Обычный

Аномальный

Ректальный / простата

Обычный

Аномальный

Кожа (шрам / уникальные отметины)

Обычный

Аномальный

Лимфатический

Обычный

Аномальный

Другой

Комментарии:

Форма ATF 2300.10
Пересмотрено: июль 2004 г.

Часть X - Образование и направление (заполняется поставщиком медицинских услуг)
18.Проверьте темы, обсуждаемые во время диагностического обследования или физического осмотра:
Липиды

Гипотония

Упражнение

Ожирение

Отказ от курения

Употребление алкоголя

Средства защиты органов слуха

Направление Vision

Другое индивидуальное защитное снаряжение

Стрессоры на работе

Реферал (ы)

Иммунизация

Часть XI - Изучение основных выводов врача с рекомендациями
Примечание: пожалуйста, не предоставляйте никаких официальных заявлений (устных или письменных) относительно пригодности или способности заявителя выполнять обязанности по какой-либо профессии.Это заявление предоставит специалист Агентства по медицинской экспертизе.

Проверка имени врача (напечатайте или напечатайте)

Проверка подписи врача

Дата

После завершения экзамена FedEx в течение двух дней:
Служба общественного здравоохранения
Федеральное управление гигиены труда
Медицинские программы правоохранительных органов
Attn: П. Свон
Федеральный центр Атланты, офис 3R10
100 Алабама-стрит
Атланта, Джорджия 30303
Только использование ATF
Действие предпринято:
Наемный или оставленный
Не выбран для назначения или право на участие отклонено
Действия, предпринятые для разделения
Имя сотрудника по персоналу агентства (шрифт или шрифт) Подпись сотрудника по персоналу агентства

Дата

Информация о Законе о конфиденциальности
Исполнительный приказ, 9830 и 5 CFR 339.301 разрешает сбор этой информации. Основное использование этой информации - определение медицинской пригодности.
претендовать на должность, которая имеет определенные медицинские стандарты, физические требования или покрывается программой медицинской оценки, установленной в соответствии с
эти правила. Предоставление этой информации является обязательным, поскольку такая информация является частью базовой квалификации для должности. Если эта информация
не были предоставлены, кандидат не будет соответствовать требованиям, предъявляемым к должности.Эта информация может быть раскрыта дополнительно: Министерству труда при обработке иска о компенсации за связанную работу.
травма или болезнь; федеральным перевозчикам страхования жизни или медицинского страхования в связи с претензией; в другое федеральное агентство; в суд или к стороне в судебном процессе
в суде или в административном разбирательстве, когда правительство является стороной или когда агентство считает это актуальным и необходимым для
судебный процесс; федеральному, государственному или местному правоохранительному органу, когда такому агентству становится известно о нарушении или возможном нарушении гражданских или уголовных
закон; в федеральный орган при проведении расследования по соображениям занятости или безопасности; Администрации общих служб в связи с
ответственность за управление записями.Уведомление о Законе о сокращении бумажного документооборота
Этот запрос на сбор информации соответствует Закону о сокращении бумажного документооборота 1995 года. Цель этой информации - определить, есть ли
или кандидат не соответствует требованиям на эту должность. Информация будет первоначально использована, чтобы дать рекомендацию о найме или отказе от найма.
заявитель или сохранение физического лица в должности специального агента.
Расчетная средняя нагрузка, связанная со сбором информации, составляет 45 минут на респондента или регистратора, в зависимости от конкретного человека.
обстоятельства.Комментарии относительно точности этой оценки нагрузки и предложения по снижению этой нагрузки следует направлять в отчеты.
Сотрудник по управлению, Отдел документации, Бюро по алкоголю, табаку, огнестрельному оружию и взрывчатым веществам, Вашингтон, округ Колумбия, 20226.
Агентство не может проводить или спонсировать сбор информации, а от человека не требуется отвечать, если только он не отображает действующий в настоящее время OMB.
Контрольный номер.
Форма ATF 2300.10
Пересмотрен в июле 2004 г.

 
906-13 906
Тип файла application / pdf
Название файла F230010
Тема F230010
Автор
Файл создан 13 июля 2004 г.

Разработка новых программируемых индуцируемых промоторов | Исследование нуклеиновых кислот

Абстрактные

Лиганд-чувствительные факторы аллостерической транскрипции (aTF) играют жизненно важную роль в генетических цепях и высокопроизводительном скрининге, поскольку они преобразуют биохимические сигналы в изменения экспрессии генов.Программируемый контроль экспрессии генов от промотора, регулируемого aTF, важен, потому что разные нижестоящие гены-эффекторы функционируют оптимально на разных уровнях экспрессии. Однако настройка экспрессии генов нативных промоторов затруднена из-за сложных уровней гомеостатической регуляции, кодируемых в них. Мы сконструировали синтетические промоторы de novo путем встраивания операторских сайтов с различным сродством и радикально измененными предпочтениями связывания в минимальный конститутивный промотор Escherichia coli .Мультиплексный клеточный скрининг промоторов на три TetR-подобных aTF, полученных с помощью этого подхода, дал богатое разнообразие уровней экспрессии генов, динамических диапазонов и чувствительности к лигандам и был в 50–100 раз более активен по сравнению с соответствующими нативными промоторами. Машинное обучение на нашем наборе данных показало, что относительное положение основного мотива и оснований, фланкирующих основной мотив, играет важную роль в модуляции индукционной реакции. Наш обобщенный подход дает настраиваемые и программируемые промоторы, регулируемые aTF, для разработки клеточных путей и позволяет открывать новые низкомолекулярные биосенсоры.

ВВЕДЕНИЕ

Способность программировать экспрессию генов — фундаментальное требование для создания новых клеточных функций. Разработка стандартизованных частей позволила разработать сложные генетические схемы на основе моделей с минимальным вмешательством человека (1). Это знаменует собой новую эру синтетической биологии, в которой живые клетки могут быть запрограммированы для выполнения определенных пользователем функций с высокой точностью и представляют собой нечто большее, чем просто «мешок с ферментами». Лиганд-зависимые аллостерические факторы транскрипции (aTF) являются жизненно важным компонентом генетических цепей, поскольку они контролируют поток информации, преобразуя биохимические сигналы в экспрессию генов (2).aTF преобразуют внутренние или внешние сигналы (вход) в индуцируемую лигандом экспрессию (выход) промотора нижестоящих эффекторных генов, обеспечивая универсальный контроль практически над любым клеточным процессом. Много усилий было направлено на расширение набора вводимых лигандов для создания новых биосенсоров aTF (3,4). Однако наша способность программировать выход экспрессии генов с промотора, регулируемого aTF (нативный промотор), развита слабо, и ей уделялось гораздо меньше внимания. Программируемый контроль экспрессии генов от регулируемого aTF нативного промотора важен, потому что разные нижестоящие эффекторные гены функционируют оптимально на разных уровнях экспрессии (5).Например, высокая экспрессия флуоресцентного репортера облегчает визуализацию и разрешение клеток для визуализации (микроскоп или проточный цитометр). Точно так же, возможно, придется сверхэкспрессировать слабый метаболический фермент, чтобы улучшить метаболизм. Напротив, экспрессию переносчика или рекомбиназы необходимо тщательно контролировать в рамках жесткого окна, поскольку сверхэкспрессия может быть очень вредной. В сложных схемах, таких как таймеры, счетчики и устройства памяти с несколькими логическими вентилями на основе aTF, выход экспрессии генов каждого вентиля должен быть правильно ‘согласован’, чтобы активировать следующий вентиль, чтобы эффективно ретранслировать сигнал (1,6,7 ).Биосенсоры aTF, используемые для оптимизации метаболических путей, часто могут быть неэффективными, если их динамический диапазон низок или несовместим с внутриклеточными концентрациями метаболитов. Эти примеры иллюстрируют потребность в программируемых промоторах, регулируемых aTF, которые могут быть адаптированы для различных нижестоящих эффекторных генов и приложений.

В настоящее время мы ограничены в основном одним или несколькими хорошо охарактеризованными нативными промоторами в зависимости от aTF. Поскольку нативные промоторы эволюционно оптимизированы для эндогенной роли aTF, они наделены сайтами для контроля обратной связи, ко-регуляторами и могут также содержать элементы, которые усиливают зависимость от контекста, включая сайты для альтернативной сигмы и факторов стресс-ответа.Поскольку эти особенности не могут быть легко разделены, изменение свойств экспрессии генов, таких как базовая экспрессия, динамический диапазон и доза-реакция, является общеизвестно трудным для нативных промоторов. Массивно-параллельные репортерные анализы были разработаны для количественной характеристики взаимодействий промотор-фактор транскрипции (8) и для создания новых промоторов (9). Эти подходы мутагенизируют нативный промотор и измеряют результирующие изменения в экспрессии репортера, чтобы сделать вывод о лежащем в основе ландшафте функции последовательности и энергии связывания (10).Вместо того, чтобы возиться с нативными промоторами, мы решили разработать промоторы, регулируемые aTF, de novo на основе минимального конститутивного промотора, полностью не связанного с нативным промотором и лишенного регуляции. Наша цель состояла в том, чтобы разработать набор индуцибельных промоторов для aTF, отображающих полный диапазон уровней экспрессии генов и характеристик ответа лиганда. Мы решили сконструировать промоторы для TetR-подобного семейства aTF, потому что они обычно используются в генетических цепях (11) и представляют собой большой пул потенциальных новых биосенсоров для первичных и вторичных метаболитов (12).TetR-подобные aTF имеют простой механизм транскрипции: будучи связанными со своим оператором (сайтом связывания на ДНК), они подавляют экспрессию генов, стерически блокируя РНК-полимеразу. После связывания с лигандом аллостерическое конформационное изменение вытесняет aTF из оператора, позволяя РНК-полимеразе транскрибировать нижележащий ген. Это привело нас к гипотезе о том, что экспрессия гена может быть модулирована путем изменения аффинности aTF к его операторной последовательности, поскольку это изменит занятость промотора РНК-полимеразой.Другими словами, поскольку равновесные распределения ДНК-связанных (несвязанных) и ДНК-несвязанных (лигандированных) aTF будут различаться для операторов с разным сродством к aTF, это может привести к разным лиганд-индуцированным транскрипционным ответам. Мы реализовали эту концепцию следующим образом (рисунок 1). Мы сгенерировали библиотеку из ∼10 5 сайтов операторов aTF различной аффинности путем отбора in vitro , начиная с рандомизированных N-меров. У отобранных in vitro операторов была радикально изменена архитектура связывания, но с аналогичными ключевыми мотивами, обнаруженными у их соответствующих нативных аналогов.Библиотека оператора была размещена как спейсер между -35 и -10 сайтами минимального конститутивного промотора Escherichia coli для создания библиотеки регулируемых aTF промоторов. Затем мы обогатили функциональные варианты промоторов с различными уровнями экспрессии генов путем сортировки клеток, несущих библиотеку промоторов, управляющих GFP (без и с индуктором), с последующим клональным скринингом (рис. 1). Для каждого aTF это давало более 30-50 индуцибельных промоторов с низкой базовой экспрессией, демонстрирующих полный спектр индуцированной лигандом экспрессии гена, охватывающий 5-90% экспрессии конститутивного промотора.Сконструированные промоторы также имели широкое распределение динамических диапазонов, чувствительности к лигандам и кооперативности ответа. Мы демонстрируем возможность обобщения этого подхода путем создания индуцируемых промоторов для трех aTF семейства TetR — TtgR, PmeR и NalC. Статистическое машинное обучение на нашем наборе данных показало, что, хотя для связывания aTF требовался мотив ядерной последовательности, относительное положение основного мотива и оснований, фланкирующих основной мотив, играли важную роль в модуляции индукционного ответа.Наши результаты показывают, что простая модель конкурентного доступа к промотору между aTF и РНК-полимеразой может быть использована для создания богатого разнообразия уровней экспрессии генов, индуцированных лигандом, и функций реакции на дозу. Этот подход может быть полезен для быстрой конструирования промоторов для новых метагеномных aTF, воспринимающих полезные молекулы, путем обхода необходимости идентифицировать и оптимизировать их нативные промоторы.

Рисунок 1. Инженерная схема промотора

De novo .Рабочий процесс проектирования включает три этапа: создание библиотеки промоторов с рандомизированными основаниями между -35 и -10 сайтами конститутивного промотора E. coli , обогащение промоторов, которые могут связываться с aTF, путем отбора in vitro и мультиплексный скрининг на индуцируемые промоторов путем высокопроизводительной сортировки клеток с последующим клональным тестированием.

Рисунок 1. Инженерная схема промотора

De novo . Рабочий процесс проектирования включает в себя три этапа: создание библиотеки промоторов со рандомизированными основаниями между -35 и -10 сайтами конститутивного E.coli , обогащение промоторов, которые могут связываться с aTF, путем отбора in vitro и мультиплексный скрининг индуцибельных промоторов путем высокопроизводительной сортировки клеток с последующим клональным тестированием.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обогащение сайтов операторов in vitro

Мы синтезировали гены с оптимизированными кодонами для всех трех aTF (Genscript, Inc) и клонировали их с помощью сборки Гибсона в вектор сверхэкспрессии pET-31b с меткой His на С-конце (15).Мы трансформировали плазмиды с подтвержденной последовательностью в BL21 (DE3) E. coli и высевали их на планшеты Лурия-Бертани (LB), содержащие 100 мкг / мл карбенициллина. После роста в течение ночи при 37 ° C, мы инокулировали колонии в 3 мл среды LB (100 мкг / мл карбенициллина) и выращивали клетки до оптической плотности 0,6 при 600 нм (OD 600 ) при 37 ° C. Затем мы индуцировали культуры 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) в течение 3 часов и подтвердили экспрессию белка на 4–12% глициновом геле бис-трис.Затем клетки лизировали ультразвуком в буфере для лизиса (50 мМ HEPES pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ BME, 10% глицерин).

Мы объединили эквимолярные количества гибридизированных библиотек промоторов из 16, 17, 18 и 19 пар оснований (bp) в одну смешанную библиотеку. Смешанную библиотеку (100 нМ) инкубировали с 2 мкл белкового лизата в 1 × буфере для обогащения (15 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ BME, 0,02 ед. Поли-dI-dC, 0,03% БСА, 0,05%. NP40) в 20 мкл реакционной смеси при комнатной температуре в течение 1 ч. Мы смешали 2,5 мкл магнитных гранул с His-tag (предварительно трижды промытых 500 мкл буфера с 15 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ NaCl, 0,03% BSA) с белком и ДНК путем вращения на низкой скорости в течение 30 мин при 4 ° C. Мы удалили комплекс белок-ДНК, прикрепленный к шарикам, удалили несвязанную ДНК и трижды промыли комплекс буфером для предварительной промывки (15 мМ Tris – HCl pH 7,5, 100 мМ NaCl, 0,03% BSA). После удаления последнего промывочного буфера мы смешали комплекс с мастер-миксом Kapa HF PCR и праймерами для амплификации обогащенной ДНК (протокол ПЦР: 95 ° C в течение 3 минут, 98 ° C в течение 20 секунд, 60 ° C в течение 20 секунд, 72 ° C. в течение 10 с. Повторите шаги 2–4 20 раз, 72 ° C в течение 20 с) и подтвердили размер ампликона на 2% агарозном геле.

Чтобы подготовить ДНК, обогащенную in vitro, для глубокого секвенирования, мы добавили стандартный адаптер Illumina P5 и пользовательский штрих-код 8 п.н. на 5′-конец с помощью ПЦР (протокол ПЦР: 95 ° C в течение 3 минут, 98 ° C в течение 20 с, 60 ° C в течение 20 с, 72 ° C в течение 10 с. Повторите шаги 2–4 15 раз, 72 ° C в течение 20 с). Размер ампликона ДНК со штрих-кодом проверяли с помощью 2100 Bioanalyzer (Agilent) и секвенировали с помощью системы секвенирования Illumina HiSeq 2500 (Университет Висконсин-Мэдисон, центр секвенирования ДНК Биотехнологического центра) после добавления 40% контроля секвенирования PhiX (Illumina).Цикл секвенирования дал около 289 миллионов необработанных чтений.

Анализ мотивов операторов с помощью марковской модели

Первые считывания после секвенирования были демультиплексированы с использованием штрих-кода 8 bp и усечены, чтобы включить только N-мерную случайную часть библиотеки. Для анализа мы используем ‘gapped k -mers’ — это k -mers с пробелами в середине формы ‘ l -mer m -space n -mer’ (таким образом, l + m + n = k ), где l и n могут принимать значения 4 или 5, а распорка m может принимать значения от 0 до N l n , где N — длина случайной части библиотеки.Например, ACTACxxxACGC является «12-мерным с разрывом» типа «5-мерный 3-спейсерный 4-мерный», где спейсеры x могут быть любым нуклеотидом A, C, G или T. Первое появление таких к-меров с разрывом является подсчитанные в случайной части секвенированного образца, а те, у которых обнаружено <50 отсчетов, исключаются из дальнейшего анализа. Затем рассчитывается обогащение для каждого гэп-мера k путем деления этих количеств в секвенированном образце на ожидаемое количество появлений того же гэп-мера k из начальной случайной библиотеки (Bhimsaria et al. в разработке). Для начальной библиотеки глубины секвенирования достаточно, чтобы иметь счетчики для всех 8-мер (без пробелов и пробелов в середине), но глубины (общего числа счетчиков считываний) недостаточно для захвата всех пробелов k -меров или даже без зазора k -меров с k ≥10. Таким образом, чтобы нормализовать количество пробелованных k -меров в образце по отношению к библиотеке, была создана марковская модель пятого порядка, чтобы получить ожидаемое количество вхождений каждой последовательности и зафиксировать смещение в библиотеке (13).Марковская модель пятого порядка выводит вероятность шестого нуклеотида с учетом предыдущих пяти нуклеотидов. Например, вероятность последовательности ACTACxxxACGC может быть вычислена как: вероятность ACTAC * вероятность x при данном ACTAC * вероятность x при данном CTACx * вероятность x при данном TACxx * вероятность A при данном ACxxx * вероятность C при CxxxA * вероятность G при xxxAC * вероятность C при xxACG. Обратите внимание, что вероятность x для любой последовательности равна 1. Умножение этой вероятности на общее количество отсчетов или считываний выборки (для которых должна быть сделана нормализация) дает ожидаемое количество появлений (отсчетов) пробелов k — последовательность мер.

Затем наиболее обогащенная последовательность k -мера с пробелами была использована в качестве начального числа для создания матрицы весовых коэффициентов положения (PWM) путем первого вычисления обогащения для всех последовательностей k -мера с пробелами, имеющих 1-несовпадение с начальной последовательностью в таким же образом, а затем взвешивание каждой позиции ШИМ на основе вычисленных значений обогащения (14).

Подготовка и клонирование библиотеки

Промоторные библиотеки были основаны на сильных конститутивных E.coli , промотор apFab71. Библиотеки промоторов были фланкированы сайтами 3 ‘и 5’ расщепления BsaI и сайтом связывания рибосом (Bujard RBS) и были заказаны как олигонуклеотиды одноцепочечной ДНК у Integrated DNA Technologies, Inc. праймер, комплементарный 3 ‘одноцепочечных библиотек для гибридизации ДНК и полимеризации ДНК (реакция: библиотека 10 мкМ, праймер 10 мкМ, ДНК-полимераза 1U Kapa, ​​1X буфер Kapa HF, 200 мкМ dNTP; протокол: 95 ° C в течение 3 мин. , 60 ° C в течение 1 мин, 72 ° C в течение 3 минут).Продукты гибридизации очищали (Omega Bio-tek, Inc.), и размеры ампликонов проверяли на 2% агарозном геле. Мы использовали сборку Golden Gate Assembly для клонирования промоторов в сконструированный вектор pXL-3 (модифицированный из pJ251-Gerc, плазмида Addgene.org № 47441, дополнительная таблица S3) для управления экспрессией суперпапки GFP. Мы объединили каркас pXL-3 с индивидуальной библиотекой промоторов (молярное соотношение основной цепи и каждой библиотеки промоторов составляло 1: 9) и инкубировали 300 нг ДНК в 20 мкл реакционной смеси Gibson Assembly (15) при 37 ° C в течение 1 ч и 60 ° C в течение 5 мин.Мы диализовали продукт Gibson Assembly на мембране (поры 0,02 мкм) в dH 2 O в течение 1 ч для удаления соли. Мы трансформировали 30 нг ДНК из каждой диализованной реакции в Dh20B-электрокомпетентную E.coli E.coli (New England Biolabs, Inc.) и восстанавливали при 37 ° C в течение 1 часа. После восстановления серийные разведения трансформантов на чашках LB (50 мкг / мл канамицина) дали ~ 500 000 КОЕ на трансформацию.

Обогащение функциональных промоторов с помощью сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS)

Мы клонировали aTF в остов pSC101 (несущий ген устойчивости к спектиномицину, дополнительная таблица S3) под контролем конститутивного промотора и сильного RBS с помощью сборки Гибсона (15).Реакцией сборки трансформировали электрокомпетентные клетки Dh20B и позволяли расти в течение ночи при 37 ° C. После проверки последовательности мы сделали клетки, несущие aTF, электрокомпетентными с помощью стандартных процедур и трансформировали клетки с помощью , обогащенной in vitro библиотекой промоторов . Мы высевали серийные разведения каждой трансформации и оценили примерно 500 000 КОЕ на трансформацию. Мы сделали две реплики клеток, несущих библиотеки с aTF, и индуцировали одну из них подходящим низкомолекулярным индуктором.Мы индуцировали библиотеку PmeR с помощью 250 мкМ флоретина, библиотеку TtgR с помощью 500 мкМ нарингенина и библиотеку NalC с помощью 20 мкМ PCP. После выращивания при встряхивании при 37 ° C в течение 5 ч клетки готовили в PBS для проточной цитометрии (Sony SH800S, Sony Biotechnology, Inc.).

Мы установили равномерно разнесенные границы бункера флуоресценции при 50% PMT и 60% PMT для GFP и mCherry соответственно в сортировщике клеток (SH800S, Sony Biotechnology Inc.). Мы удалили дублеты и клеточный мусор, установив порог прямого рассеяния на 2500 условных единиц.Мы исключили дублеты, построив график зависимости площади прямого рассеяния от высоты прямого рассеяния и удалив события примерно с удвоенным временем (время является функцией площади и высоты при измерении прямого рассеяния). Мы отсортировали 500 000 событий на ячейку и восстановили отсортированную популяцию в 4 мл LB, встряхивая при 37 ° C в течение 1 часа. Затем мы добавили антибиотики (50 мкг / мл канамицина и 50 мкг / мл спектиномицина) и позволили клеткам вырасти до OD 600 0,6. Мы повторно инокулировали клетки из каждого бункера при разведении 1:15 в двух повторностях и индуцировали один из повторений с помощью подходящего низкомолекулярного индуктора.Все культуры росли в течение 5 часов, прежде чем распределение флуоресценции популяции GFP регистрировали с помощью сортировщика клеток.

Измерение кривых ответа aTF от индивидуальных клонов

Мы случайным образом отобрали около 100 колоний из бункеров с максимальной кратностью индукции (бункеры 2 и 3 для PmeR; интервал 6 для TtgR; интервал 6 для NalC). Мы инокулировали колонии в LB (50 мкг / мл канамицина и 50 мкг / мл спектиномицина) в 96-луночные планшеты и позволяли клеткам расти до OD 600 0.6. Затем мы повторно инокулировали клетки в свежем LB в разведении 1:15 с соответствующими индукторами или без них. Мы позволяли клеткам расти в течение 5 часов перед измерением их OD 600 , GFP и флуоресценции mCherry на многопланшетном ридере (Biotek HTX). Мы рассчитали кратную индукцию путем деления индуцированной нормализованной флуоресценции на неиндуцированную нормализованную флуоресценцию. Мы ранжировали колонии по их нормализованной индуцированной флуоресценции и отобрали 96 колоний из каждого исходного пула колоний aTF с высокой кратностью индукции по шкале нормализованной индуцированной флуоресценции.Мы секвенировали 96 колоний из каждого пула aTF, чтобы удалить любые дупликации и последовательности с несовершенными константными областями на промоторе, RBS и репортерном гене gfp . В итоге у нас было 30-60 уникальных последовательностей для каждого aTF (рисунок 4 и дополнительная таблица S1). Мы измерили индукционный ответ для всех синтетических и нативных промоторов в трех биологических повторностях с подходящим низкомолекулярным индуктором или без него. Мы выбрали 20 репрезентативных последовательностей из каждого пула aTF для измерения реакции на дозу индуктора (рисунок 4C и дополнительная таблица S1).Мы рассчитали параметры передаточной функции с использованием пакета minpack.lm в R (рисунок 4D, дополнительный рисунок S5). Подгонянные кривые были проверены вручную (дополнительные рисунки S6 – S8).

Построение моделей с машинным обучением

Для каждой из функциональных операторных последовательностей, соответствующих трем прокариотическим факторам транскрипции — PmeR, TtgR и NalC, рассчитывали коэффициенты кратности индукции на основании экспериментально измеренных реакций индуцированного и подавленного уровней.Поскольку последовательности операторов имели разную длину, множественное выравнивание последовательностей было выполнено с использованием T-coffee, поскольку это дало наиболее компактное представление последовательности с заполненными пробелами (16) (дополнительная таблица S4). Эти последовательности с заполненными пробелами позже были преобразованы в числовые векторы признаков с использованием однократного кодирования (17). Опорная векторная регрессия с радиальной базисной функцией использовалась для построения количественных моделей для точного прогнозирования коэффициентов кратности индукции для данной последовательности операторов при 5-кратной перекрестной проверке.Кроме того, 10% исходного набора данных использовалось для оценки возможности обобщения. Пакет на основе Python — scikit-learn v.0.17.1 (17) использовался для реализации поддерживающей векторной регрессии. Сценарии были оптимизированы и выполнялись параллельно на 23 процессорах (процессоры Intel Xeon 2,4 ГГц) с размером кэша, ограниченным 20 ГБ ОЗУ, для достижения времени выполнения вычислений ~ O (1 час).

Анализ важности характеристик

Чтобы оценить, какие нуклеотиды в данной позиции важны, оценки важности характеристик были рассчитаны на основе того, сколько раз конкретная функция была выбрана среди лучшего набора функций, полученного в конце моделируемого отжига по 100 образцам начальной загрузки из набора обучающих данных. , а также наблюдаемое распределение значений признаков среди индуцируемых и неиндуцируемых множеств.Эти оценки важности функций были внутренне нормализованы, и пользовательские матрицы весовых коэффициентов были рассчитаны для индуцируемых и неиндуцируемых наборов для трех различных aTF. Математически

$$ \ begin {eqnarray *} {\ rm {feature}} \ _ {\ rm {important}} \ _ {\ rm {scor}} {{\ rm {e}} _ {{\ rm { i, j, k}}}} & = & {\ rm {bagged}} \ _ {\ rm {frec}} {{\ rm {y}} _ {{\ rm {i, j}}}} \ нечисловое \\ && \ раз {\ rm {наблюдаемое}} \ _ {\ rm {частота}} {{\ rm {y}} _ {{\ rm {i, j, k}}}} \ end {eqnarray * } $$

, где ‘i’ обозначает номер позиции, который варьируется от 1 до длины последовательности с заполненными пробелами, ‘j’ обозначает символ последовательности в наборе {‘A’, ‘T’, ‘G’, ‘C’ , ‘-‘} и ‘k’ обозначают индуцируемый или не индуцируемый набор, ‘bagged_frequency’ обозначает нормализованную частоту, агрегированную по 100 выборочным наборам данных начальной загрузки.Позднее с помощью инструмента web3logo (18) были сгенерированы последовательные логотипы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Пополнение сайтов новых операторов

in vitro отбор

Мы выбрали сильный конститутивный минимальный промотор E. coli (apFab71) с каноническими сайтами –35 (TTGACA) и –10 (TATAAT) в качестве стартового промотора для дизайна. Мы называем это «шаблонным» промотором, потому что все сконструированные варианты промотора являются производными apFab71. Мы создали библиотеку операторов с теоретическим разнообразием примерно 10 12 последовательностей путем рандомизации спейсерных оснований между –35 и –10 сайтами.Хотя спейсеры в природных промоторах обычно имеют длину 17 п.н., мы создали библиотеки спейсеров длиной 16, 17, 18 и 19 п.н., чтобы обеспечить большую адаптивность для связывания с aTF. Перед отбором in vitro мы подтвердили, что все три aTF действительно связываются и высвобождают свой нативный сайт связывания лиганд-зависимым образом с помощью измерений сдвига геля (дополнительный рисунок S2 и дополнительная таблица S2). Затем мы оценили влияние рандомизации спейсера на конститутивную активность промотора (aTF не экспрессируется совместно), сравнивая экспрессию GFP в невыбранной библиотеке промоторов с немодифицированным apFab71.Библиотеки промоторов из спейсеров из 16, 17 и 18 п.н. были высокоактивными (aTF не экспрессировался совместно) со средним распределением флуоресценции в популяции, сравнимым с немодифицированным промотором apFab71 (дополнительные рисунки S1A и B). Однако библиотека промоторов из 19 п.н. была менее активной, что, вероятно, было вызвано несовпадением сайтов -35 и -10, ослабляющих связывание РНК-полимеразы (дополнительный рисунок S1B). Тем не менее, мы включили библиотеку промоторов размером 19 п.о., потому что более длинная последовательность оператора может быть более подходящей для aTF с большим следом связывания.Мы выбрали три aTF из семейства TetR-подобных: PmeR и TtgR связываются с различными молекулами флавоноидов, которые являются натуральными продуктами, используемыми в медицине, нутрицевтике и косметике, а NalC связывается с пентахлорфенолом, который является токсином окружающей среды, используемым в качестве гербицидов и консервантов древесины против грибковых заболеваний. инфекционное заболевание. Мы провели отбор in vitro путем сверхэкспрессии His-tagged aTF в качестве приманки в лизате клеток E. coli . Эквимолярные количества всех четырех библиотек промоторов смешивали и инкубировали с клеточным лизатом с последующим извлечением белка и амплификацией связанных последовательностей с помощью ПЦР.Глубокое секвенирование после пяти раундов отбора дало приблизительно 10 5 уникальных операторов для каждого aTF (дополнительная таблица S4).

Для оценки результатов отбора in vitro мы удалили последовательности с менее чем 10-кратным охватом, сгруппировали оставшиеся последовательности с порогом идентичности последовательностей 90% (с использованием CD-HIT (19)) и отсортировали кластеры в порядке убывания на основе от их размера (т.е. количества последовательностей в каждом кластере) для каждой из библиотек промоторов индивидуально.Упорядоченный список кластеров для всех трех aTF дал характерную экспоненциальную аппроксимацию, указывающую на успешное обогащение, как это видно в других основанных на SELEX методах (20,21) (рис. 2A). Поскольку обогащение последовательностей было широко распространено, мы пришли к выводу, что выбранная библиотека содержит операторы с разным сродством к aTF, что является важным требованием для нашей стратегии разработки для генерации различных транскрипционных выходов. Отрицательный контроль без aTF не показал экспоненциального ранжирования размеров кластеров, как ожидалось.Для каждого aTF подобные связывающие мотивы возникли в соответствующих библиотеках N-мер, что указывает на конвергенцию in vitro отбора (фиг. 2B). Контроль без aTF давал случайные мотивы с низким содержанием информации, согласующиеся с плохим обогащением (дополнительный рисунок S3). Сильная палиндромная подпись была очевидна среди основных мотивов, что подтвердило, что PmeR, TtgR и NalC функционируют как димеры, как и ожидалось, с каждым половинным сайтом длиной 4-6 п.н. и разделенными на 2-6 п.н. (Figure 2B).

Рисунок 2.

In vitro выбор операторов. ( A ) Очень похожие операторы группируются вместе с порогом идентичности последовательности 90%. Кластеры ранжированы в порядке убывания (слева направо) по количеству последовательностей в кластере или размеру кластера (ось Y). Размер кластера показывает характерное экспоненциальное соответствие. Минимальное количество последовательностей в кластере — пять. Красный, оранжевый, зеленый и синий представляют библиотеки операторов длиной 16, 17, 18 и 19 бит соответственно. ( B ) Мотивы высокообогащенных последовательностей всех четырех операторных библиотек и нативных операторских сайтов PmeR, TtgR и NalC.Палиндромные последовательности, представляющие предполагаемые полусайты, подчеркнуты на сайтах нативных операторов.

Рисунок 2.

In vitro выбор операторов. ( A ) Очень похожие операторы группируются вместе с порогом идентичности последовательности 90%. Кластеры ранжированы в порядке убывания (слева направо) по количеству последовательностей в кластере или размеру кластера (ось Y). Размер кластера показывает характерное экспоненциальное соответствие. Минимальное количество последовательностей в кластере — пять. Красный, оранжевый, зеленый и синий представляют библиотеки операторов длиной 16, 17, 18 и 19 бит соответственно.( B ) Мотивы высокообогащенных последовательностей всех четырех операторных библиотек и нативных операторских сайтов PmeR, TtgR и NalC. Палиндромные последовательности, представляющие предполагаемые полусайты, подчеркнуты на сайтах нативных операторов.

Поразительным наблюдением является то, что отбор in vitro радикально изменил конфигурацию операторского сайта по сравнению с нативным оператором, сохранив при этом основные связывающие мотивы последнего. Нативная связывающая последовательность для PmeR (22) и TtgR (23) имеет длину почти 30 п.н. с сайтом связывания для каждого мономера (половинный сайт) димера, разделенным 12-13 п.н. (Рисунок 2B).Тем не менее, мы обнаружили, что основной связывающий мотив PmeR и TtgR может быть размещен в наших гораздо более коротких библиотеках операторов из 16-19 п.н., при этом только 6-8 п.н. разделяют половинки сайтов (Рис. 2B). Есть две вероятные структурные интерпретации: (i) любая локальная структура между полусайтами, такая как изгиб ДНК, которая может присутствовать в нативном промоторе, больше не существует в in vitro операторах (ii) угол пересечения между ДНК-связывающими доменами отдельные мономеры могут быть больше с нативным сайтом связывания, но уже с операторами in vitro .Интересно, что мы наблюдаем эффект в NalC, где разделение между половинными сайтами больше в библиотеке операторов in vitro (6 п.н.) по сравнению с нативным сайтом связывания (24) (3 п.н.) (рис. 2В). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что взаимодействия aTF-промотор обладают высокой степенью структурной пластичности при сохранении функции. Таким образом, in vitro отбор — это простой, но мощный подход для создания операторов с широким диапазоном аффинностей связывания aTF, позволяющий aTF получать доступ к новым конфигурациям операторов, отличным от их собственных сайтов связывания.

Идентификация функциональных промоторов путем сортировки клеток

Мы использовали сортировку клеток, активируемую флуоресценцией, для быстрого обогащения функциональных или индуцибельных промоторов. Библиотеки промоторов, залитые in vitro, выбранных операторов для PmeR, TtgR и NalC были клонированы перед GFP и трансформированы в E. coli . Трансформированные клетки, лишенные aTF (aTF–), давали высокую флуоресценцию, подтверждающую, что промоторы все еще конститутивно активны (рис. 3A, вверху).Клетки, несущие библиотеку промоторов и коэкспрессирующие aTF без индуктора (aTF + / индуктор-), давали заметно сниженную флуоресценцию с кратным изменением (соотношение медианы флуоресценции aTF- и aTF + / индуктор-клетки) в 10,4-, 12,4- и 2,5 раза. -кратно для TtgR, PmeR и NalC, соответственно (рис. 3А, посередине). Это подтвердило нашу гипотезу о том, что отобранных in vitro операторов, встроенных между -35 и -10 сайтами, должны быть способны репрессировать транскрипцию. Распределение флуоресценции репрессированной популяции (aTF + / индуктор-) составляло 50–100 раз, что указывает на то, что сродство оператора к aTF широко варьирует в библиотеке промоторов.Распределение флуоресценции репрессированной библиотеки промоторов TtgR (aTF + / индуктор-) явно бимодально с небольшой долей клеток с высоким GFP, которые, вероятно, содержат операторов с низким сродством или без сродства к TtgR (рис. 3A, в середине).

Рисунок 3.

Обогащение in vivo индуцибельных промоторов путем сортировки клеток, активируемой флуоресценцией. ( A ) Клетки, экспрессирующие GFP, постоянно регулируемые сконструированными вариантами промотора (вверху, aTF- / индуктор-), коэкспрессирующие aTF без индуктора (средний, aTF + / индуктор-) и коэкспрессирующие aTF с индуктором (внизу , aTF + / индуктор +).Репрессия складок (FR) — это отношение медианы флуоресценции клеток aTF- / индуктор и aTF + / индуктор. FR показан на средней панели. Складчатая индукция (FI) — это отношение медианы флуоресценции aTF + / индуктор + и aTF + / индуктор- клеток. FI показан на нижней панели ( B ). Клетки, репрессированные с помощью aTF (aTF + / индуктор-), сортируются в ячейки в соответствии с их флуоресценцией, и каждая ячейка индуцируется независимо. Верхняя панель — общее распределение репрессированных клеток. Цвета представляют клетки, отсортированные по разным ячейкам флуоресценции.На нижних панелях показан лиганд-индуцированный ответ клеток из каждого бункера. Коэффициент индукции сгиба (FI) каждого бункера указан на панели.

Рисунок 3.

Обогащение in vivo индуцибельных промоторов путем сортировки клеток, активируемой флуоресценцией. ( A ) Клетки, экспрессирующие GFP, постоянно регулируемые сконструированными вариантами промотора (вверху, aTF- / индуктор-), коэкспрессирующие aTF без индуктора (средний, aTF + / индуктор-) и коэкспрессирующие aTF с индуктором (внизу , aTF + / индуктор +).Репрессия складок (FR) — это отношение медианы флуоресценции клеток aTF- / индуктор и aTF + / индуктор. FR показан на средней панели. Складчатая индукция (FI) — это отношение медианы флуоресценции aTF + / индуктор + и aTF + / индуктор- клеток. FI показан на нижней панели ( B ). Клетки, репрессированные с помощью aTF (aTF + / индуктор-), сортируются в ячейки в соответствии с их флуоресценцией, и каждая ячейка индуцируется независимо. Верхняя панель — общее распределение репрессированных клеток. Цвета представляют клетки, отсортированные по разным ячейкам флуоресценции.На нижних панелях показан лиганд-индуцированный ответ клеток из каждого бункера. Коэффициент индукции сгиба (FI) каждого бункера указан на панели.

Затем мы оценили индуцируемость промоторных библиотек путем определения кратности индукции при добавлении лиганда (aTF + / индуктор +) ниже порога токсичности для репрессированных клеток (дополнительный рисунок S4). Индукция складки — это соотношение медианы флуоресценции индуцированных (aTF + / индуктор +) и репрессированных (aTF + / индуктор-) клеток. Действительно, все три библиотеки промоторов были лиганд-индуцируемыми, причем 17.6-, 7,7- и 2,5-кратная индукция для PmeR, TtgR и NalC, соответственно (рис. 3A, внизу). Затем мы отсортировали репрессированные клетки из бункеров с низкой к высокой флуоресценции и впоследствии индуцировали клетки из каждого бункера независимо (рис. 3B, дополнительная таблица S5). Эта стратегия разделения всей популяции на бункеры способствует быстрой идентификации субпопуляций клеток, содержащих индуцибельные промоторы, по сравнению с теми, которые являются конститутивно активными. Лучше всего это проиллюстрировано на NalC, где кратность индукции для общей популяции была скромной 2.В 5 раз, но после сортировки клеток пурпурные и синие ячейки дали кратность индукции 24,2 и 6,5, предполагая, что эти ячейки теперь существенно обогащены индуцибельными промоторами (рис. 3B). Большая часть промоторов в оставшихся четырех ячейках (голубой, розовый, коричневый и зеленый) являются конститутивно активными (кратность индукции ~ 1,0), вероятно, из-за низкого сродства к aTF-оператору. Клетки из трех бинов TtgR с низкой флуоресценцией (пурпурный, синий и голубой) и всех четырех бинов PmeR были обогащены индуцибельными промоторами со кратной индукцией> 5.0 для каждого бункера (рисунок 3B). Примечательно, что небольшая, но значительная часть клеток из бункеров с низкой флуоресценцией остается не индуцируемой, и они, вероятно, представляют собой операторов с очень высоким сродством к aTF.

Характеристика активности промотора и функции ответа

Для каждого aTF мы клонально оценивали промоторы, тестируя ~ 100 случайно выбранных колоний из каждой отсортированной субпопуляции с высокой кратностью индукции, чтобы найти 30-50 индуцибельных промоторов. Выбранные промоторы для всех трех aTF давали широкий спектр свойств экспрессии генов с точки зрения максимальной репортерной экспрессии и динамического диапазона репортерного сигнала (соотношение индуцированной и неиндуцированной репортерной экспрессии) (рис. 4A и B, дополнительная таблица S1).Все промоторы имели низкую индуцированную базовую экспрессию или плотное состояние, но разные уровни индуцированной лигандом экспрессии (фиг. 4A). Максимальная индуцированная лигандом экспрессия между промоторами варьируется в виде постепенного увеличения от 3–80% (PmeR), 20–90% (TtgR) и 10–50% (NalC) конститутивного apFab71 (исходный матричный промотор), что является верхним пределом гена. выражение (рис. 4А). Самый сильный индуцированный промотор PmeR, TtgR и NalC в 77, 16 и 66 раз более активен по сравнению с их соответствующими нативными промоторами, перенесенными в E.coli (синие точки, рис. 4A). Более того, самый сильный индуцированный промотор PmeR и TtgR был более чем в два раза активнее, а NalC на 40% активнее, чем широко используемый промотор pLTetO (25) (рис. 4A, зеленые точки). Кратная индукция отдельных промоторов (соотношение флуоресценции индуцированного и неиндуцированного состояний), которое обозначает динамический диапазон репортерного сигнала, всех двадцати промоторов PmeR и NalC и шестнадцати из двадцати промоторов TtgR была больше, чем у их соответствующих нативных аналогов (рис. 4B).Хотя динамический диапазон нативных промоторов TtgR и PmeR был высоким (55- и 20-кратное соответственно, синие квадраты) из-за низкой неиндуцированной базовой экспрессии, их общая активность была низкой. Но сконструированные варианты промотора со сравнимой неиндуцированной базовой экспрессией дали гораздо более высокие динамические диапазоны из-за большей транскрипционной активности (рис. 4B). Это различие лучше всего иллюстрируется сравнением нативных промоторов PmeR, TtgR и NalC с соответствующими сконструированными вариантами сопоставимого динамического диапазона (вариант 20 PmeR, вариант 20 TtgR и вариант 19 NalC) (фиг. 4B).Хотя динамический диапазон каждой пары сопоставим (рис. 4B), сконструированные варианты промоторов в 50–100 раз более активны (рис. 4A). Низкая активность нативных промоторов в E. coli указывает на плохую совместимость между хозяевами и подчеркивает серьезную проблему в области биосенсоров — ограниченную переносимость регуляторных частей между хозяевами. Используя промотор-шаблон от самого целевого хоста (в данном случае E. coli ), мы упрощаем переносимость aTF и добиваемся высокой активности.

Рисунок 4.

Характеристика транскрипционной активности отдельных промоторов. ( A ) Нормализованная флуоресценция неиндуцированного и индуцированного состояний (темно-бордовые круги), представленная как процентная активность конститутивного промотора apFab71. Активность нативного промотора, перенесенного в E. coli (синие квадраты), и обычно используемый промотор pLTetO (зеленые треугольники) показаны для сравнения. ( B ) Коэффициент кратности индукции между индуцированной и неиндуцированной флуоресценцией сконструированных, нативных промоторов и промоторов pLTetO.( C ) Данные реакции на дозу лиганда подогнаны к стандартному уравнению Хилла. Цветовой градиент представляет индукцию сворачивания, а нативный промотор показан пунктирной линией. ( D ) График максимальной индуцированной репортерной экспрессии ( V max ) в зависимости от концентрации лиганда, необходимой для достижения половины V max ( K m ). Оба параметра оцениваются по подобранному уравнению Хилла. Синяя точка обозначает нативный промоутер.

Рисунок 4.

Характеристика транскрипционной активности отдельных промоторов.( A ) Нормализованная флуоресценция неиндуцированного и индуцированного состояний (темно-бордовые круги), представленная как процентная активность конститутивного промотора apFab71. Активность нативного промотора, перенесенного в E. coli (синие квадраты), и обычно используемый промотор pLTetO (зеленые треугольники) показаны для сравнения. ( B ) Коэффициент кратности индукции между индуцированной и неиндуцированной флуоресценцией сконструированных, нативных промоторов и промоторов pLTetO. ( C ) Данные реакции на дозу лиганда подогнаны к стандартному уравнению Хилла.Цветовой градиент представляет индукцию сворачивания, а нативный промотор показан пунктирной линией. ( D ) График максимальной индуцированной репортерной экспрессии ( V max ) в зависимости от концентрации лиганда, необходимой для достижения половины V max ( K m ). Оба параметра оцениваются по подобранному уравнению Хилла. Синяя точка обозначает нативный промоутер.

Затем мы измерили зависимую от концентрации лиганда экспрессию гена (доза-ответ) всех промоторов и подогнали данные к стандартному уравнению Хилла.Кривые зависимости реакции от дозы показали богатое функциональное разнообразие вариантов промотора с различной чувствительностью к лигандам и транскрипционной активностью по сравнению с нативным промотором, перенесенным в E. coli (фиг. 4C, сплошные линии против пунктирной линии). Чтобы количественно оценить характеристики отклика, мы вычислили следующие параметры уравнения Хилла V max , K m и n с помощью нелинейной регрессии (дополнительная таблица S1, дополнительный рисунок S6 – S8). V max — максимальная активность промотора при полной индукции; K m — концентрация лиганда для половины экспрессии V max и представляет чувствительность к лиганду; и n — коэффициент Хилла, описывающий кооперативность ответа. Некоторые интересные свойства промоторов становятся очевидными при изучении параметров уравнения Хилла (рис. 4D). Во-первых, точки, параллельные оси X (рис. 4D), представляют собой промоторы с различной чувствительностью к лигандам ( K m ), но схожими уровнями экспрессии генов ( V max ).Самый большой разрыв в K м. Значения для аналогичных V max представляют следующие пары промоторов: промоторы PmeR 20 против 17 (77 мкМ против 149 мкМ), промоторы TtgR 5 против 3 (122 мкМ против 339 мкМ) , и промоторов NalC 8 против 11 (2,8 мкМ против 12,2 мкМ). Этот результат не является интуитивно понятным, поскольку он показывает, что чувствительность лиганда может быть изменена путем изменения операторов без изменения самого белка. Можно ожидать, что чувствительность к лиганду будет связана с аффинностью лиганда или аллостерической активностью, которые являются свойствами aTF, а не оператора.Во-вторых, изменение операторов может изменить кооперативность отклика сигнала (дополнительный рисунок S5). Большая кооперативность (более высокий коэффициент Хилла) подразумевает, что оба мономера димерного aTF действуют согласованно, вызывая более крутой ответ, а более низкая кооперативность генерирует постепенный линейный ответ (дополнительный рисунок S5 – S8). Поскольку клетки используют оба типа сигнальных ответов, наши результаты показывают, что естественные промоторы могут адаптировать сигнальный ответ к различным контекстам, возможно, изменяя операторов. Эти результаты открывают возможность совершенно нового уровня регуляции генома, где транскрипционный ответ кодируется оператором, и напоминают исследования, демонстрирующие альтернативные лигандные специфичности глюкокортикоидного рецептора в разных операторских участках (26,27).В-третьих, промоторы с одинаковыми K m имеют разные V max (линии, параллельные оси Y, рисунок 4D). Поскольку in vitro селекция генерирует операторов с разной аффинностью, оператор с большей аффинностью aTF будет иметь более низкое значение V max из-за более высокого остаточного связывания даже при индукции по сравнению с оператором с более низким сродством. Таким образом, характеристика отдельных промоторов показывает, что множество индукционных ответов может быть вызвано простым изменением последовательностей операторов.

Детерминанты последовательности функции промотора с помощью машинного обучения

Поскольку только подмножество промоторов, репрессирующих репортер, было индуцируемым лигандом, а остальные были конститутивно отключены, мы хотели понять детерминанты последовательности функции промотора. Мы предположили, что как индуцибельные, так и не индуцибельные промоторы, вероятно, имеют один и тот же основной мотив, необходимый для связывания, но положение основного мотива и / или идентичность фланкирующих оснований может играть важную роль в индуцибельности лиганда.Чтобы проверить эту гипотезу, мы разработали модели машинного обучения для каждого aTF независимо с использованием индуцибельных и не индуцибельных последовательностей, соответствующих верхнему одному проценту наиболее распространенных последовательностей из in vitro анализа связывания , чтобы оценить вклад различных нуклеотидов в заданном положении. Хорошо известно, что пространство последовательностей выборки единообразно помогает улучшить предсказательную силу эмпирических моделей для прогнозирования неисследованных регионов. Чтобы ретроспективно оценить последовательность и функциональное разнообразие в нашем наборе данных, мы построили график редактирования (или расстояния Левенштейна) между интересующей последовательностью и эталонной последовательностью (по радиальной оси) vs.кратность индукции (по угловой оси) (рис. 5А). В то время как варианты последовательностей PmeR и TtgR были широко распространены, разнообразие последовательностей NalC было относительно низким. Поскольку последовательности операторов имели разную длину (16-19 п.н.), мы выполнили множественное выравнивание последовательностей с использованием T-coffee, чтобы получить наиболее компактное представление последовательности с заполнением пробелов (16) (дополнительная таблица S6). На основе однократного кодирования каждая последовательность была преобразована в вектор числовых признаков, соответствующих идентичности оснований в данной позиции (дополнительный рисунок S9).Мы использовали опорную векторную регрессию (28) с радиальной базисной функцией, чтобы построить количественные модели для точного прогнозирования коэффициентов кратности индукции для данной последовательности операторов. Коэффициент корреляции между прогнозируемыми и фактическими коэффициентами кратности индукции составлял 0,84, 0,88 и 0,83 для TtgR, PmeR и NalC, соответственно (рис. 5B, дополнительная таблица S7). Чтобы оценить, какие нуклеотиды в данной позиции важны, мы вычислили баллы важности характеристик на основе количества раз, когда конкретная функция была выбрана в конце моделируемого отжига по 100 образцам начальной загрузки из набора обучающих данных.Затем мы определили мотивы консенсусной последовательности (18) для операторов в индуцибельных и не индуцибельных промоторах на основе оценок важности признаков, вычисленных с помощью машинного обучения. Как индуцибельные, так и не индуцибельные промоторы имеют сходные основные мотивы, напоминающие мотивы, полученные после отбора in vitro (фиг. 2), что позволяет предположить, что эти мотивы минимально необходимы для связывания с aTF (фиг. 5C). Различия между индуцибельными и не индуцибельными промоторами возникают из-за расположения основного мотива внутри операторной области, а также от идентичности оснований, фланкирующих основной мотив.Для PmeR коровой мотив «TACA» левой половины сайта расположен между нуклеотидами 1–4 среди индуцибельных промоторов и 3–6 среди не индуцибельных промоторов. Правдоподобное объяснение состоит в том, что более широкий угол связывания, вызываемый TACA в положениях 1–4, может увеличивать изгиб ДНК или деформировать интерфейс димера, и результирующая энергия напряжения может позволить PmeR легко диссоциировать при индукции. Основания, фланкирующие основной мотив, также помогают управлять различиями между обоими наборами промоторов (рис. 5C). Они могут быть совершенно разными, как видно на позициях 7 и 13 PmeR.Но чаще они демонстрируют более сильное предпочтение последовательности для определенного основания (оснований), как видно в положениях 12 и 14 PmeR, 7 и 9 TtgR и 3, 5, 6, 17, 18 и 20 NalC. Парные синергетические взаимодействия и взаимодействия более высокого порядка между основаниями также могут способствовать индуцибельности промотора, поскольку простые линейные модели не могут объяснить вариабельность данных. Эти результаты показывают, что кажущиеся незначительными различия в последовательностях промотора могут иметь большое влияние на индуцибельность промотора. Когда лиганд связывается с ДНК-связанным aTF, энергия штамма распространяется от лиганда к ДНК-связывающему домену.Незначительные различия в последовательностях могут контролировать баланс между плотно связанным состоянием, которое не может быть высвобождено, и слабосвязанным состоянием, которое может быть легко удалено при связывании лиганда. Поскольку многие опероны с разными требованиями к транскрипции часто контролируются одним и тем же aTF, наши результаты дают представление о том, как природа может адаптировать сайт оператора для повторного использования aTF для удовлетворения различных нормативных требований.

Рисунок 5.

Детерминанты последовательности активности промотора с помощью машинного обучения.( A ) Разнообразие последовательностей действий оператора и соответствующая им индукция складывания показаны в виде графика спидометра. Центральная точка соответствует эталонной последовательности, в данном случае оператору, встроенному с наибольшей кратной индукцией. Радиальная ось — это расстояние Левенштейна между опорным оператором (центральной точкой) и остальными индуцируемыми последовательностями. Угловая ось — индукция складки. ( B ) Графики разброса предсказанной кратной индукции по сравнению с экспериментальной и коэффициента корреляции Спирмена. ( C ) Мотивы последовательностей индуцибельных (вверху) и несводимых (внизу) операторов.Ось Y представляет биты. Серые прямоугольники указывают на различия в характеристиках ключевых последовательностей индуцибельных и не индуцибельных промоторов. Логотипы были созданы с помощью инструмента web3logo.

Рисунок 5.

Детерминанты последовательности активности промотора с помощью машинного обучения. ( A ) Разнообразие последовательностей действий оператора и соответствующая им индукция складывания показаны в виде графика спидометра. Центральная точка соответствует эталонной последовательности, в данном случае оператору, встроенному с наибольшей кратной индукцией. Радиальная ось — это расстояние Левенштейна между опорным оператором (центральной точкой) и остальными индуцируемыми последовательностями.Угловая ось — индукция складки. ( B ) Графики разброса предсказанной кратной индукции по сравнению с экспериментальной и коэффициента корреляции Спирмена. ( C ) Мотивы последовательностей индуцибельных (вверху) и несводимых (внизу) операторов. Ось Y представляет биты. Серые прямоугольники указывают на различия в характеристиках ключевых последовательностей индуцибельных и не индуцибельных промоторов. Логотипы были созданы с помощью инструмента web3logo

ОБСУЖДЕНИЕ

Программируемые индуцируемые лигандами промоторы — бесценный инструмент для разработки синтетических схем и высокопроизводительного скрининга с использованием биосенсоров.Мы разработали индуцибельные промоторы путем модульной сборки на простейших из бактериальных промоторов, лишенных сложной регуляции, присущей нативным промоторам. Просто изменив сродство aTF к его операторам, мы создали варианты промоторов с разными уровнями экспрессии генов, динамическими диапазонами и чувствительностью к лигандам. Этот обобщаемый метод должен быть применим к другим белкам семейства TetR и потенциально тысячам других бактериальных репрессоров, расширяя набор aTF для приложений синтетической биологии.Мы вставили оператор между сайтами -35 и -10 промотора E. coli , потому что он имитировал расположение естественных сайтов-операторов для многих aTF и, следовательно, мог бы быть наиболее эффективным участком для блокирования РНК-полимеразы. Эта архитектура накладывает ограничение на длину оператора, потому что сила транскрипции очень чувствительна к расстоянию между -35 и -10 сайтами (оптимальное разделение ~ 17 п.н.). Нашу методологию можно легко изменить, чтобы исследовать другие архитектуры промоутеров, чтобы приспособить их к файлам с более длинной привязкой.Длина больше не является ограничением, если оператор размещен перед площадкой -35, по бокам -35 с обеих сторон, по бокам -10 с обеих сторон или ниже по течению от площадки -10. Чтобы повысить эффективность отбора in vitro , мы можем облегчить связывание с помощью a priori, фиксируя основной мотив от естественных операторов и рандомизируя оставшиеся позиции. Наша стратегия инженерии промотора должна быть применима и к активаторам транскрипции, потому что, хотя они механически отличаются от репрессоров, основные принципы, управляющие взаимодействиями aTF-оператора, остаются теми же.Например, активаторы транскрипции AraC-, LysR- и XylR-подобных семейств перемещаются через дистальные и проксимальные операторские сайты с дифференциальной аффинностью лиганд-зависимым образом, маскируя или демаскируя сайты связывания РНК-полимеразы внутри промотора (29). Операторы с разной аффинностью в дистальных и проксимальных сайтах будут модулировать транскрипцию, изменяя занятость промотора РНК-полимеразой. Систематическое изучение различных архитектур и механизмов aTF могло бы привести к всеобъемлющим принципам проектирования лиганд-индуцибельной инженерии промоторов.

Открытие новых метагеномных биосенсоров aTF для высокопроизводительного скрининга будет поддержано нашим методом (30,31). Метагеном — это сокровищница новых биосенсоров aTF, но часто нативные промоторы либо неизвестны, либо не могут быть активированы. Это больше не будет препятствием, потому что мы сможем de novo создать индуцибельные промоторы для метагеномных aTF с помощью нашего метода. Немодельные организмы вновь привлекли к себе внимание благодаря редактированию генома CRISPR-Cas9, поскольку их новые метаболические возможности могут быть использованы для биосинтетической инженерии (32).Хотя биосенсоры на основе aTF широко используются в E. coli , их использование практически не применяется в немодельных организмах из-за плохой совместимости промоторов между хозяевами. Наш метод должен упростить переносимость aTF в промышленно важные немодельные микробы, включая Corynebacterium, Pseudomonas и Zymomonas , за счет использования конститутивного промотора нативного хозяина и корректировки взаимодействий с оператором aTF в соответствии с силой нативного промотора.

Наш результат также ставит под сомнение пассивную роль, отводимую оператору просто как стыковочный узел или узел привязки aTF.Эта точка зрения возникает из восприятия лиганда как аллостерического эффектора и интерфейса связывания ДНК как дистального сайта. Мы показываем, что изменение оператора может существенно повлиять на транскрипционный ответ, такой как чувствительность лиганда и кооперативность, которые обычно рассматриваются как свойства белка, а не ДНК. Аллостерия белка может быть потенциально двунаправленной, когда как аллостерические, так и дистальные участки «разговаривают» друг с другом, а не традиционная однонаправленная парадигма. Более того, это открыло бы совершенно новый уровень сайт-специфической регуляции транскрипции, управляемой взаимодействиями с aTF-оператором.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Вклад авторов : X.L., A.Z.A. и С. задумал исследование. X.L. и С. разработанные эксперименты. J.A.R.-M. и А.З.А. помогли с анализами связывания белка с ДНК in vitro . Д. и А.З.А. проанализировали данные глубокого секвенирования для создания профилей последовательностей. S.T.P.G. и J.L.R. построили модели машинного обучения.Все авторы проанализировали данные и просмотрели рукопись. X.L., S.T.P.G. и С. написал рукопись.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Центр исследований биоэнергетики Великих озер, Министерство энергетики США, Управление науки, Управление биологических и экологических исследований [DE-SC0018409 и DE-FC02-07ER64494 частично]; NIH [GM120625 к A.Z.A.]. Финансирование платы за открытый доступ: Министерство энергетики.

Заявление о конфликте интересов . X.L., J.A.R.-M., A.Z.A.и С. подали предварительную заявку на патент на эту технологию.

ССЫЛКИ

1.

Nielsen

A.A.K.

,

Der

B.S.

,

Shin

J.

,

Vaidyanathan

P.

,

Paralanov

V.

,

Strychalski

E.A.

,

Росс

D.

,

Densmore

D.

,

Voigt

C.A.

Автоматизация проектирования генетических схем

.

Наука

.

2016

;

352

:

aac7341

.2.

Mahr

R.

,

Frunzke

J.

Биосенсоры на основе факторов транскрипции в биотехнологии: текущее состояние и перспективы на будущее

.

заявл. Microbiol. Biotechnol.

2016

;

100

:

79

90

.3.

Garmendia

J.

,

Devos

D.

,

Valencia

A.

,

de Lorenzo

V.

A la carte регуляторы транскрипции: разблокирование ответов прокариотического энхансер-связывающего белка XylR на неприродные эффекторы

.

Мол. Microbiol

.

2001

;

42

:

47

59

.4.

Taylor

N.D.

,

Garruss

A.S.

,

Моретти

р.

,

Chan

S.

,

Arbing

MA

,

Cascio

D.

,

Rogers

J.K.

,

Isaacs

F.J.

,

Kosuri

S.

,

Baker

D.

et al. .

Разработка фактора аллостерической транскрипции для ответа на новые лиганды

.

Нат. Методы

.

2016

;

13

:

177

183

. 5.

Чен

Ю.

,

Ho

J.M.L.

,

Шис

D.L.

,

Gupta

C.

,

Long

J.

,

Wagner

DS

,

Ott

W.

,

Josić

K.

,

Tuning

MR. динамический диапазон бактериальных промоторов регулируется лиганд-индуцибельными факторами транскрипции

.

Nat.Commun.

2018

;

9

:

64

.6.

Yaman

F.

,

Bhatia

S.

,

Adler

A.

,

Densmore

D.

,

Beal

J.

Автоматический выбор синтетических частей для генетических регуляторных сетей

.

ACS Synth. Биол.

2012

;

1

:

332

344

.7.

Луна

Т.С.

,

Лу

К.

,

Тамсир

А.

,

Стэнтон

до н. Э.

,

Voigt

C.A.

Генетические программы, построенные из многоуровневых логических элементов в отдельных ячейках

.

Природа.

2012

;

491

:

249

253

.8.

Kinney

J.B.

,

Murugan

A.

,

Callan

C.G.

,

Cox

E.C.

Использование глубокого секвенирования для характеристики биофизического механизма регуляторной последовательности транскрипции

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2010

;

107

:

9158

9163

,9.

Rohlhill

J.

,

Sandoval

N.R.

,

Papoutsakis

E.T.

Подход Sort-Seq к разработке индуцируемого формальдегидом промотора для динамически регулируемого роста Escherichia coli на метаноле

.

ACS Synth. Биол.

2017

;

6

:

1584

1595

.10.

Barne

S.L.

,

Belliveau

N.M.

,

Ireland

W.T.

,

Kinney

J.B.

,

Phillips

R.

Сопоставление последовательности ДНК с энергией связывания транскрипционного фактора 9 in vivo.

PLoS Comput. Биол.

2019

;

15

:

1

29

.11.

Стэнтон

до н. Э.

,

Nielsen

A.A.

,

Tamsir

A.

,

Clancy

K.

,

Peterson

T.

,

Voigt

C.A.

Геномный майнинг прокариотических репрессоров для ортогональных логических вентилей

.

Нат. Chem. Биол.

2014

;

10

:

99

105

.12.

Cuthbertson

L.

,

Nodwell

J.R.

Семейство регуляторов TetR

.

Microbiol Mol. Биол. Ред.

2013

;

77

:

440

475

. 13.

Родригес-Мартинес

J.A.

,

Reinke

A.W.

,

Bhimsaria

D.

,

Keating

A.E.

,

Ansari

A.Z.

Комбинаторные димеры bZIP демонстрируют сложные ландшафты специфичности связывания ДНК

.

Элиф

.

2017

;

6

:

e19272

.14.

Stormo

G.D.

,

Zhao

Y.

Определение специфичности белок-ДНК-взаимодействий

.

Нат. Преподобный Жене.

2010

;

11

:

751

760

. 15.

Гибсон

D.G.

,

Young

L.

,

Chuang

R.Y.

,

Venter

J.C.

,

Hutchison

C.A.

3-й,

Смит

Х.O.

Ферментативная сборка молекул ДНК размером до нескольких сотен килобаз

.

Нат. Методы

.

2009

;

6

:

343

345

. 16.

Notredame

C.

,

Higgins

D.G.

,

Heringa

J.

T-coffee: новый метод быстрого и точного множественного выравнивания последовательностей

.

J. Mol. Биол.

2000

;

302

:

205

217

.17.

Pedregosa

F.

,

Varoquaux

G.

,

Gramfort

A.

,

Michel

V.

,

Thirion

B. ,

Blondel

M.

,

Prettenhofer

P.

,

Weiss

R.

,

Dubourg

V.

et al. .

Scikit-learn: машинное обучение на python

.

JMLR

.

2011

;

12

:

2825

2830

. 18.

Crooks

G.E.

,

Hon

G.

,

Chandonia

J.-M.

,

Бреннер

S.E.

WebLogo: генератор последовательного логотипа

.

Genome Res.

2004

;

14

:

1188

1190

. 19.

Fu

L.

,

Niu

B.

,

Zhu

Z.

,

Wu

S.

,

Li

W.

CD-HIT: ускорено для кластеризации данных секвенирования следующего поколения

.

Биоинформатика.

2012

;

28

:

3150

3152

.20.

Jolma

A.

,

Kivioja

T.

,

Toivonen

J.

,

Cheng

L.

,

Wei

G.

,

Enge

,

Taipale

M.

,

Vaquerizas

J.M.

,

Yan

J.

,

Sillanpää

M.J.

et al. .

Мультиплексированный массивно-параллельный SELEX для характеристики специфичности связывания человеческого фактора транскрипции

.

Genome Res.

2010

;

20

:

861

873

. 21.

Bhimsaria

D.

,

Rodríguez-Martínez

J.A.

,

Pan

J.

,

Roston

D.

,

Korkmaz

E.N.

,

Cui

Q.

,

Ramanathan

P.

,

Ansari

A.Z.

Специфические ландшафты демаскируют субмаксимальные предпочтения сайтов связывания факторов транскрипции

.

Proc Natl Acad Sci. США

2018

;

115

:

E10586

E10595

.22.

Варгас

П.

,

Фелипе

A.

,

Michán

C.

,

Gallegos

M.-T.

Индукция Pseudomonas syringae pv. Томат DC3000 MexAB-OprM отток нескольких лекарственных препаратов с помощью флавоноидов опосредуется репрессором PmeR

.

Мол. Взаимодействие растений и микробов.

2011

;

24

:

1207

1219

. 23.

Krell

T.

,

Terán

W.

,

Mayorga

O.L.

,

Rivas

G.

,

Jiménez

M.

,

Daniels

C.

,

Molina-Henares

A.J.

,

Мартинес-Буэно

M.

,

Gallegos

M.T.

,

Ramos

J.L.

Оптимизация палиндромного порядка оператора ttgr увеличивает кооперативность связывания

.

J. Mol. Биол.

2007

;

369

:

1188

1199

.24.

Starr

LM

,

Fruci

M.

,

Poole

K.

Индукция пентахлорфенолом pseudomonas aeruginosa mexAB-oprM отток репрессора репрессора 9000 и репрессора репрессора Armor 9000: инвазия репрессора репрессора 9000 и антибиотика. .

PLoS One

.

2012

;

7

:

e32684

.25.

Gossen

M.

,

Bujard

H.

Жесткий контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих с помощью тетрациклин-чувствительных промоторов

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

1992

;

89

:

5547

5551

. 26.

Meijsing

S.H.

,

Pufall

M.A.

,

So

A.Y.

,

Бейтс

D.L.

,

Chen

L.

,

Yamamoto

K.R.

Последовательность сайта связывания ДНК определяет структуру и активность рецептора глюкокортикоидов

.

Наука

.

2009

;

324

:

407

410

. 27.

Gronemeyer

H.

,

Bourguet

W.

Аллостерические эффекты управляют действием ядерных рецепторов: ДНК появляется как игрок

.

Sci. Сигнал.

2009

;

2

:

pe34

. 28.

Pedregosa

F.

,

Varoquaux

G.

,

Gramfort

A.

,

Michel

V.

,

Thirion

B.

,

Grisel

O.

,

Blondel

M.

,

Prettenhofer

P.

,

Weiss

R.

, 9000 9000 et al. al. .

Scikitlearn: машинное обучение на Python Гаэль Варокво

.

J. Mach. Учиться. Res.

2011

;

12

:

2825

2830

. 29.

Фернандес-Лопес

Р.

,

Ruiz

R.

,

de la Cruz

F.

,

Moncalián

G.

Биосенсоры на основе факторов транскрипции, освещенные аналитом

.

Фронт. Microbiol.

2015

;

6

:

648

.30.

Uchiyama

T.

,

Abe

T.

,

Ikemura

T.

,

Watanabe

K.

Субстрат-индуцированный скрининг экспрессии генов метагеномных библиотек окружающей среды для выделения

.

Нат. Biotechnol.

2005

;

23

:

88

93

. 31.

Uchiyama

T.

,

Miyazaki

K.

Экспрессия гена, индуцированная продуктом (PIGEX): репортерный анализ на продукт для ферментного скрининга метагеномных библиотек

.

заявл. Environ. Microbiol.

2010

;

76

:

7029

7035

. 32.

Tian

P.

,

Wang

J.

,

Shen

X.

,

Rey

J.F.

,

Yuan

Q.

,

Yand

Y.

Основные инструменты CRISPR-Cas9 и текущие приложения в микробных системах

.

Synth. Syst. Biotechnol.

2017

;

2

:

219

225

.

© Автор (ы) 2019. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.

Значение АТФ в жизнедеятельности клетки. Способы использования atf

Основным источником энергии для клетки являются питательные вещества: углеводы, жиры и белки, которые окисляются кислородом.Практически все углеводы, прежде чем попасть в клетки организма, превращаются в глюкозу за счет работы желудочно-кишечного тракта и печени. Наряду с углеводами белки также расщепляются на аминокислоты, а липиды — на жирные кислоты. В клетке питательные вещества окисляются под действием кислорода и с участием ферментов, контролирующих реакции выделения энергии и ее использования.

Почти все окислительные реакции происходят в митохондриях, а выделяемая энергия сохраняется в виде высокоэнергетического соединения — АТФ.В будущем именно АТФ будет использоваться для обеспечения энергией внутриклеточных метаболических процессов, а не питательными веществами.

Молекула АТФ содержит: (1) азотистое основание аденина; (2) пентозоуглеводород рибоза, (3) три остатка фосфорной кислоты. Последние два фосфата связаны друг с другом и с остальной частью молекулы высокоэнергетическими фосфатными связями, обозначенными символом ~ в формуле АТФ. В зависимости от физических и химических условий, характерных для организма, энергия каждой такой связи составляет 12 000 калорий на 1 моль АТФ, что во много раз превышает энергию обычной химической связи; поэтому фосфатные связи называют макроэргическими.Более того, эти связи легко разрушаются, обеспечивая энергией внутриклеточные процессы, как только в этом возникает необходимость.

При высвобождении энергии АТФ выделяет фосфатную группу и превращается в аденозиндифосфат. Высвободившаяся энергия используется практически для всех клеточных процессов, например, в реакциях биосинтеза и во время сокращения мышц.

Диаграмма образования аденозинтрифосфата в клетке, показывающая ключевую роль митохондрий в этом процессе.
GI — глюкоза; FA — жирные кислоты; AA — это аминокислота.

Восполнение запасов АТФ происходит за счет воссоединения АДФ с остатком фосфорной кислоты за счет энергии питательных веществ. Этот процесс повторяется снова и снова. АТФ постоянно потребляется и накапливается, поэтому его называют энергетической валютой клетки. Время оборота АТФ составляет всего несколько минут.

Роль митохондрий в химических реакциях образования АТФ … Когда глюкоза попадает в клетку, под действием цитоплазматических ферментов она превращается в пировиноградную кислоту (этот процесс называется гликолизом). Энергия, выделяемая в этом процессе, расходуется на преобразование небольшого количества АДФ в АТФ, что составляет менее 5% от общих запасов энергии.

95% осуществляется в митохондриях. Пировиноградная кислота, жирные кислоты и аминокислоты, образованные соответственно из углеводов, жиров и белков, в конечном итоге превращаются в митохондриальном матриксе в соединение, называемое ацетил-КоА.Это соединение, в свою очередь, вступает в серию ферментативных реакций, которые вместе называются «циклом трикарбоновых кислот» или «циклом Кребса», чтобы высвободить свою энергию.

В петле трикарбоновых кислот ацетил-КоА расщепляется на атомы водорода и молекулы диоксида углерода. Углекислый газ удаляется из митохондрий, затем из клетки путем диффузии и выводится из организма через легкие.

Атомы водорода химически очень активны и поэтому немедленно вступают в реакцию с кислородом, диффундирующим в митохондрии.Большое количество энергии, выделяемой в этой реакции, используется для преобразования многих молекул АДФ в АТФ. Эти реакции довольно сложны и требуют участия огромного количества ферментов, составляющих кристы митохондрий. На начальном этапе от атома водорода отщепляется электрон, и атом превращается в ион водорода. Процесс заканчивается добавлением к кислороду ионов водорода. В результате этой реакции образуется вода и большое количество энергии, которая необходима для работы АТФ-синтетазы, большого глобулярного белка, который проявляется в виде бугорков на поверхности крист митохондрий.Под действием этого фермента, использующего энергию ионов водорода, АДФ превращается в АТФ. Новые молекулы АТФ отправляются из митохондрий во все части клетки, включая ядро, где энергия этого соединения используется для множества функций.
Этот процесс Синтез АТФ обычно называют хемиосмотическим механизмом образования АТФ.



Использование митохондриального аденозинтрифосфата для реализации трех важных функций клетки:
мембранный транспорт, синтез белка и сокращение мышц.

На рисунке показаны два способа. Изображения структуры АТФ. … Аденозинмонофосфат (АМФ), аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинтрифосфат (АТФ) относятся к классу соединений, называемых нуклеогидами. Молекула нуклеотида состоит из пятиуглеродного сахара, азотистого основания и фосфорной кислоты. В молекуле AMP сахар представлен рибозой, а основание — аденином. Молекула АДФ имеет две фосфатные группы, а молекула АТФ — три.

Значение ATP

Когда АТФ расщепляется на АДФ и высвобождается неорганический фосфат (Fn), энергия:

Реакция протекает с абсорбцией воды , то есть это гидролиз (в нашей статье мы неоднократно сталкивались с этим очень распространенным типом биохимических реакций).Третья фосфатная группа, отщепленная от АТФ, остается в клетке в виде неорганического фосфата (Fn). Выход свободной энергии в этой реакции составляет 30,6 кДж на 1 моль АТФ.

Из АДФ можно повторно синтезировать и фосфат с помощью АТФ, но это требует затрат 30,6 кДж энергии на 1 моль вновь образованного АТФ.

В этой реакции , называемой реакцией конденсации, выделяется вода. Добавление фосфата к АДФ называется реакцией фосфорилирования.Оба приведенных выше уравнения можно объединить:


Эта обратимая реакция катализируется ферментом под названием АТФаза .

Все клетки, как уже было сказано, нуждаются в энергии для выполнения своей работы, и для всех клеток любого организма источником этой энергии служит АТФ … Поэтому АТФ называют «универсальным носителем энергии» или «энергоносителем». валюта »ячеек. Электрические батареи — подходящая аналогия. Помните, почему мы их не используем. Мы можем получать с их помощью, в одном случае, свет, в другом, звук, иногда механическое движение, а иногда нам нужна от них соответствующая электрическая энергия.Удобство батарей заключается в том, что мы можем использовать один и тот же источник энергии — батарею — для различных целей, в зависимости от того, куда мы ее поместили. АТФ играет такую ​​же роль в клетках. Он поставляет энергию для различных процессов, таких как сокращение мышц, передача нервных импульсов, активный транспорт веществ или синтез белка, а также для всех других типов клеточной активности. Для этого его нужно просто «подключить» к соответствующей части клеточного аппарата.

Аналогию можно продолжить.Сначала необходимо изготовить батареи, и некоторые из них (перезаряжаемые) можно заряжать таким же образом. Когда батареи производятся на заводе, определенное количество энергии должно храниться в них (и, таким образом, потребляться заводом). Энергия также требуется для синтеза АТФ; его источник — окисление органических веществ при дыхании. Поскольку при окислении выделяется энергия для фосфорилирования АДФ, это фосфорилирование называется окислительным фосфорилированием. При фотосинтезе АТФ производится световой энергией.Этот процесс называется фотофосфорилированием (см. Раздел 7.6.2). В клетке также есть «фабрики», которые производят большую часть АТФ. Это митохондрии; в них находятся химические «конвейеры», на которых образуется АТФ во время аэробного дыхания. Наконец, клетка также перезаряжает разряженные «аккумуляторы»: после того, как АТФ, высвободив содержащуюся в нем энергию, превращается в АДФ и Fn, он может быть снова быстро синтезирован из АДФ и Fn за счет энергии, получаемой при дыхании от окисления новые порции органического вещества.

Количество АТФ в клетке в любой момент очень мало. Следовательно, в ATP следует видеть только носитель энергии, а не ее депо. Для длительного хранения энергии служат такие вещества, как жиры или гликоген. Клетки очень чувствительны к уровню АТФ. Как только скорость его использования увеличивается, увеличивается и скорость процесса дыхания, поддерживающего этот уровень.

Роль ATP как связующего звена между клеточным дыханием и процессами, связанными с потреблением энергии, можно увидеть из рисунка.Эта диаграмма выглядит простой, но она иллюстрирует очень важную закономерность.

Таким образом, можно сказать, что в целом функция дыхания заключается в том, чтобы производить АТФ .


Резюмируем вкратце сказанное.
1. Для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата требуется 30,6 кДж энергии на 1 моль АТФ.
2. АТФ присутствует во всех живых клетках и, следовательно, является универсальным переносчиком энергии. Другие энергоносители не используются.Это упрощает дело — требуемый сотовый аппарат может быть проще и работать эффективнее и экономичнее.
3. АТФ легко доставляет энергию в любую часть клетки для любого процесса, который требует энергии.
4. АТФ быстро высвобождает энергию. Для этого нужна всего одна реакция — гидролиз.
5. Скорость воспроизведения АТФ из АДФ и неорганического фосфата (скорость процесса дыхания) можно легко регулировать в соответствии с потребностями.
6. АТФ синтезируется во время дыхания за счет химической энергии, выделяющейся при окислении органических веществ, таких как глюкоза, и во время фотосинтеза за счет солнечной энергии.Образование АТФ из АДФ и неорганического фосфата называется реакцией фосфорилирования. Если окисление поставляет энергию для фосфорилирования, то мы говорим об окислительном фосфорилировании (этот процесс происходит при дыхании), если световая энергия используется для фосфорилирования, то этот процесс называется фотофосфорилированием (это происходит во время фотосинтеза).

Миллионы биохимических реакций происходят в любой клетке нашего тела. Они катализируются различными ферментами, которые часто требуют энергии.Где клетка? На этот вопрос можно ответить, если рассмотреть структуру молекулы АТФ — одного из основных источников энергии.

АТФ — универсальный источник энергии

АТФ означает аденозинтрифосфат или аденозинтрифосфат. Вещество — один из двух важнейших источников энергии в любой клетке. Структура АТФ и биологическая роль тесно связаны. Большинство биохимических реакций могут происходить только с участием молекул вещества, это особенно актуально.Однако АТФ редко принимает непосредственное участие в реакции: для протекания любого процесса необходима энергия, содержащаяся в аденозинтрифосфате.

Структура молекул вещества такова, что связи, образованные между фосфатными группами, несут огромное количество энергии. Поэтому такие связи еще называют макроэргическими, или макроэнергетическими (макро = много, большое количество). Термин был впервые введен ученым Ф. Липманом, и он также предложил использовать для их обозначения символ.

Для клетки очень важно поддерживать постоянный уровень аденозинтрифосфата. Это особенно верно для клеток мышечной ткани и нервных волокон, потому что они наиболее энергозависимы и нуждаются в высоком содержании аденозинтрифосфата для выполнения своих функций.

Структура молекулы АТФ

Аденозинтрифосфат состоит из трех элементов: рибозы, аденина и остатков

Рибоза — углевод, который относится к группе пентоз.Это означает, что рибоза содержит 5 атомов углерода, которые заключены в цикл. Рибоза соединяется с β-N-гликозидной связью аденина на 1-м атоме углерода. Также к пентозе присоединяются остатки фосфорной кислоты на 5-м атоме углерода.

Аденин — азотистое основание. В зависимости от того, какое азотистое основание присоединено к рибозе, также секретируются GTP (гуанозинтрифосфат), TTP (тимидинтрифосфат), CTP (цитидинтрифосфат) и UTP (уридинтрифосфат). Все эти вещества похожи по структуре на аденозинтрифосфат и выполняют примерно одинаковые функции, но в клетке встречаются гораздо реже.

Остатки фосфорной кислоты … К рибозе можно присоединить не более трех остатков фосфорной кислоты. Если их два или только один, то вещество соответственно называется АДФ (дифосфат) или АМФ (монофосфат). Именно между остатками фосфора заключаются макроэнергетические связи, после разрыва которых выделяется от 40 до 60 кДж энергии. При разрыве двух связей выделяется 80, реже — 120 кДж энергии. Когда связь между рибозой и остатком фосфора разрывается, только 13.Выделяется 8 кДж, следовательно, в молекуле трифосфата всего две высокоэнергетические связи (P ̴ P ̴ P), а в молекуле ADP — одна (P ̴ P).

Это структурные особенности ATP. Благодаря тому, что между остатками фосфорной кислоты образуется макроэнергетическая связь, структура и функции АТФ взаимосвязаны.

Структура АТФ и биологическая роль молекулы. Дополнительные функции аденозинтрифосфата

Помимо энергии, АТФ может выполнять множество других функций в клетке.Наряду с другими нуклеотидтрифосфатами, трифосфат участвует в построении нуклеиновых кислот. В этом случае поставщиками азотистых оснований являются ATP, GTP, TTF, CTP и UTP. Это свойство используется в процессах и транскрипции.

Кроме того, АТФ необходим для функционирования ионных каналов. Например, канал Na-K выкачивает 3 молекулы натрия из клетки и закачивает 2 молекулы калия в клетку. Этот ионный ток необходим для поддержания положительного заряда на внешней поверхности мембраны, и только с помощью аденозинтрифосфата канал может функционировать.То же самое и с протонными и кальциевыми каналами.

АТФ является предшественником вторичного мессенджера цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) — цАМФ не только передает сигнал, полученный рецепторами клеточной мембраны, но также является аллостерическим эффектором. Аллостерические эффекторы — это вещества, которые ускоряют или замедляют ферментативные реакции. Таким образом, циклический аденозинтрифосфат подавляет синтез фермента, который катализирует распад лактозы в бактериальных клетках.

Сама молекула аденозинтрифосфата также может быть аллостерическим эффектором.Более того, в таких процессах АДФ действует как антагонист АТФ: если трифосфат ускоряет реакцию, то дифосфат тормозит, и наоборот. Таковы функции и структура АТФ.

Как АТФ образуется в клетке

Функции и структура АТФ таковы, что молекулы вещества быстро используются и разрушаются. Следовательно, синтез трифосфата является важным процессом для выработки энергии в клетке.

Существует три наиболее важных метода синтеза аденозинтрифосфата:

1.Фосфорилирование субстрата.

2. Окислительное фосфорилирование.

3. Фотофосфорилирование.

Фосфорилирование субстрата основано на множественных реакциях в цитоплазме клетки. Эти реакции называются гликолизом — анаэробной стадией. В результате 1 цикла гликолиза из 1 молекулы глюкозы синтезируются две молекулы, которые в дальнейшем используются для получения энергии, а также синтезируются две АТФ.

  • C 6 H 12 O 6 + 2ADP + 2Fn -> 2C 3 H 4 O 3 + 2ATP + 4H.

Дыхательные клетки

Окислительное фосфорилирование — это образование аденозинтрифосфата путем переноса электронов по цепи переноса электронов мембраны. В результате такого переноса на одной из сторон мембраны образуется протонный градиент, и с помощью белкового интегрального набора АТФ-синтазы строятся молекулы. Процесс происходит на митохондриальной мембране.

Последовательность стадий гликолиза и окислительного фосфорилирования в митохондриях составляет общий процесс, называемый дыханием.После полного цикла из 1 молекулы глюкозы в клетке образуется 36 молекул АТФ.

Фотофосфорилирование

Процесс фотофосфорилирования — это то же окислительное фосфорилирование, только с одним отличием: реакции фотофосфорилирования происходят в хлоропластах клетки под действием света. АТФ образуется на световой стадии фотосинтеза, основного процесса производства энергии зелеными растениями, водорослями и некоторыми бактериями.

В процессе фотосинтеза электроны проходят через одну и ту же цепочку переноса электронов, в результате чего образуется протонный градиент.Концентрация протонов на одной стороне мембраны является источником синтеза АТФ. Сборка молекул осуществляется ферментом АТФ-синтазой.

Средняя клетка содержит 0,04% аденозинтрифосфата от общей массы. Однако наибольшее значение наблюдается в мышечных клетках: 0,2-0,5%.

В клетке около 1 миллиарда молекул АТФ.

Каждая молекула живет не более 1 минуты.

Одна молекула аденозинтрифосфата обновляется 2000-3000 раз в день.

Всего человеческий организм синтезирует 40 кг аденозинтрифосфата в сутки, и в каждый момент времени запас АТФ составляет 250 г.

Заключение

Структура АТФ и биологическая роль его молекул тесно связаны. Вещество играет ключевую роль в жизненно важных процессах, потому что огромное количество энергии содержится в высокоэнергетических связях между фосфатными остатками. Аденозинтрифосфат выполняет в клетке множество функций, поэтому важно поддерживать постоянную концентрацию этого вещества.Распад и синтез протекают с большой скоростью, поскольку энергия связей постоянно используется в биохимических реакциях. Это незаменимое вещество для любой клетки организма. Это, пожалуй, все, что можно сказать о структуре АТФ.

Эта молекула играет чрезвычайно важную роль в обмене веществ, соединение известно как универсальный источник энергии во всех процессах, происходящих в живом организме.

Ответить

Ответить


Другие вопросы категории

1.Главная заслуга Р. Гука в области биологии состоит в том, что он:

а) сконструировал первый микроскоп; б) обнаруженные микроорганизмы; в) открыл клетку; г) сформулировал положения клеточной теории.

2. Клеточная стенка грибов содержит:

а) хитин; б) муреин; в) целлюлоза; г) гликоген.

3. На мембранах гранулированного ЭПС расположены:

а) митохондрии; б) хлоропласты; в) рибосомы; г) лизосомы.

4. Аминокислоты в молекуле белка связаны между собой:

а) ионной связью; б) пептидная связь; в) водородная связь.

5. Какие пластиды содержат пигмент хлорофилла:

а) хлоропласты; б) лейкопласты; в) хромопласты.

6. Как называются внутренние структуры митохондрий?

а) зерна; б) матрица; в) кристы; г) строма.

7. Синтез белка происходит в:

А) аппарате Гольджи; б) рибосомы; в) гладкий пенополистирол; г) лизосомы.

8. Растения, грибы, животные являются эукариотами, так как их клетки:

а) не имеют формализованного ядра; б) митозом не делятся; в) иметь формованный стержень;

г) иметь ядерную ДНК, замкнутую в кольцо.

9. Какие клеточные органеллы образуются из терминальных пузырьков комплекса Гольджи?

а) лизосомы; б) пластиды; в) митохондрии; г) рибосомы.

10. Гранулы хлоропласта состоят из: а) стромы; б) крист; в) тилакоиды; г) матрица.

11. Белки, составляющие плазматическую мембрану, выполняют следующие функции:

а) структурные; б) рецептор; в) ферментативная; г) все указано.

12. Основным местом хранения наследственной информации у бактерий является:

а) нуклеоид; б) сердечник; в) мезосома; г) центриоль.

Часть Б. Задание 2. Выберите три правильных ответа.

1. Аппарат Гольджи находится в клетках:

А) животные; б) бактерии; в) грибы; г) растения; д) вирусы; е) сине-зеленые водоросли.

2. У живых организмов цитоплазматическая мембрана может быть покрыта:

а) гликокаликсом; б) матрица; в) клеточная стенка; г) слизистая капсула; д) клеточная пленка; е) клеточная стенка.

3. Органеллы мембран эукариотических клеток не включают:

а) лизосомы; б) вакуоли; в) клеточный центр; г) рибосомы; д) жгутики; е) включения.

4. В клетке ДНК содержится:

А) ядро; б) митохондрии; в) хлоропласты; г) EPS; д) лизосомы; е) аппарат Гольджи.

Часть B. Задача 3. Обеспечение соответствия.

1. Между органоидом клетки и ее структурой.

Органеллы клетки Структура органоида

1) вакуоли A) состоят из одной мембраны

2) митохондрии B) состоят из двух мембран

3) клеточный центр B) не имеют мембранной структуры

4) рибосомы

5) лизосомы

2.Между структурой и жизнедеятельностью митохондрий и хлоропластов.

Особенности органелл Органоиды

1) внутренняя мембрана образует кристы A) митохондрии

2) имеют гранулы тилакоидов B) хлоропласты

3) внутреннее пространство заполнено стромой

4) внутреннее пространство заполнено матрица

5) окисляет органическое вещество с образованием АТФ

6) фотосинтез

Часть C. Дайте полный, подробный ответ.

С 1.Как устроены нуклеотиды ДНК и РНК? Как нуклеотиды связаны в одну полинуклеотидную цепь?

С 2. На какие группы делятся все элементы ячейки? По какому принципу?

C 3. Сколько нуклеотидов Т, А, С содержится отдельно во фрагменте молекулы ДНК, если в нем найдено 660 G, что составляет 22% от их общего количества. Какова длина и масса этого фрагмента ДНК?
помогите пожалуйста

Читайте также

Помогите пожалуйста вырезать 2 работы, это срочно нужно.Надеюсь на вашу помощь, так как я не очень силен в биологии. А1. Ячейки схожи по структуре и выполняются

функций, образуют 1) Ткани; 2) органы; 3) системы органов; 4) единый организм. A2. В процессе фотосинтеза растения 1) обеспечивают себя органическими веществами 2) окисляют сложные органические вещества до простых 3) поглощают кислород и выделяют углекислый газ 4) потребляют энергию органических веществ. A3. В клетке происходит синтез и расщепление органических веществ, поэтому ее называют единицей 1) Строение 2) жизнедеятельность 3) рост 4) размножение.A4. Какие клеточные структуры во время митоза распределяются между дочерними клетками строго равномерно? 1) рибосомы; 2) митохондрии; 3) хлоропласты; 4) хромосомы. А5. Дезоксирибоза является неотъемлемой частью 1) аминокислот 2) белков 3) и РНК 4) ДНК. А6. Вирусы, проникая в хозяйскую клетку, 1) питаются рибосомами; 2) поселяются в митохондриях; 3) воспроизводить свой генетический материал; 4) Отравить вредными веществами, образующимися при их метаболизме. A7. В чем значение вегетативного размножения? 1) способствует быстрому увеличению численности особей вида; 2) приводит к возникновению вегетативной изменчивости; 3) увеличивает количество особей с мутациями; 4) приводит к разнообразию особей в популяции.А8. Какие клеточные структуры, хранящие питательные вещества, не классифицируются как органеллы? 1) вакуоли; 2) лейкопласты; 3) хромопласты; 4) включения. А9. Белок состоит из 300 аминокислот. Сколько нуклеотидов содержится в гене, который служит матрицей для синтеза белка? 1) 300 2) 600 3) 900 4) 1500 A10. В состав вирусов, как и бактерий, входят 1) нуклеиновые кислоты и белки 2) глюкоза и жиры 3) крахмал и АТФ 4) вода и минеральные соли A11. В молекуле ДНК нуклеотиды с тимином составляют 10% от общего числа нуклеотидов.Сколько нуклеотидов с цитозином в этой молекуле? 1) 10% 2) 40% 3) 80% 4) 90% A12. Наибольшее количество энергии высвобождается при разрыве одной связи в молекуле 1) Полисахарид 2) белок 3) глюкоза 4) АТФ 2 Вариант A1. Благодаря свойству молекул ДНК самовоспроизводиться 1) происходят мутации 2) происходят модификации у людей 3) появляются новые комбинации генов 4) наследственная информация передается дочерним клеткам. A2. Какое значение имеют митохондрии в клетке 1) транспортируют и удаляют конечные продукты биосинтеза 2) преобразуют энергию органических веществ в АТФ 3) осуществляют процесс фотосинтеза 4) синтезируют углеводы A3.Митоз в многоклеточном организме лежит в основе 1) гаметогенеза 2) роста и развития 3) метаболизма 4) процессов саморегуляции A4. Каковы цитологические основы полового размножения организма 1) способность ДНК к репликации 2) процесс образования спор 3) накопление энергии молекулой АТФ 4) матричный синтез мРНК А5. При обратимой денатурации белка, 1) нарушение его первичной структуры 2) образование водородных связей 3) нарушение его третичной структуры 4) образование пептидных связей A6.В процессе биосинтеза белка молекулы мРНК передают наследственную информацию 1) от цитоплазмы к ядру 2) от одной клетки к другой 3) ядра к митохондриям 4) ядра к рибосомам. A7. У животных в процессе митоза, в отличие от мейоза, образуются клетки 1) соматические 2) с половинным набором хромосом 3) половые 4) споровые клетки. А8. В клетках растений, в отличие от клеток человека, животных, грибов: А) выделение 2) питание 3) дыхание 4) фотосинтез А9. Фаза деления, в которой хроматиды расходятся к разным полюсам клетки 1) анафаза 2) метафаза 3) профаза 4) телофаза A10.Прикрепление нитей веретена деления к хромосомам происходит 1) интерфазно; 2) профаза; 3) метафаза; 4) анафаза. A11. Окисление органических веществ с выделением энергии в клетке происходит в процессе 1) биосинтеза 2) дыхания 3) высвобождения 4) фотосинтеза. A12. Дочерние хроматиды в процессе мейоза расходятся к полюсам клетки в 1) Метафазе первого деления 2) Профазе второго деления 3) Анафазе второго деления 4) Телофазе первого деления

Выберите правильные из числа предоставленные заявления.АТФ в клетке: 1) передает генетическую информацию из ядра в цитоплазму; 2) осуществляет распознавание клетками

гормонов; 3) является универсальной энергетической «валютой» »клетки; 4) осуществляет расщепление питательных веществ.

1. Углеводы при фотосинтезе синтезируются из:

1) 02ih3O 3) C02ih30

2) CO2 и h3 4) CO2 и h3CO3

2. Потребителями углекислого газа в биосфере являются:

1) дуб 3) дождевой червь

2) орел 4) почвенные бактерии

3.В этом случае формула глюкозы написана правильно:

1) СН10 О5 3) СН12 Около

2) C5h320 4) C3H603

4. Источником энергии для синтеза АТФ в хлоропластах является:

1) углерод диоксид и вода 3) НАДФН h3

2) аминокислоты 4) глюкоза

5. В процессе фотосинтеза у растений углекислый газ восстанавливается до:

1) гликогена 3) лактозы

2) целлюлозы 4) глюкозы

6. Органические вещества из неорганических могут образовывать:

1) E.coli 3) поганка бледная

2) курица 4) василек

7. На световой стадии фотосинтеза световые кванты возбуждают молекулы:

1) хлорофилл 3) АТФ

2) глюкоза 4) вода

8. Автотрофы не входят:

1) хлорелла и спирогира

2) береза ​​и сосна

3) шампиньоны и бледные поганки 4) сине-зеленые водоросли

9. Основными поставщиками кислорода в атмосферу Земли являются:

1) растения 2) бактерии

3) животные 4) люди

10.Способностью к фотосинтезу обладают:

1) простейшие 2) вирусы

3) растения 4) грибы

11. К хемосинтетикам относятся:

1) железобактерии 2) вирусы гриппа и кори

3) холерные вибрионы 4) бурые водоросли

12. Растение при дыхании поглощает:

1) углекислый газ и выделяет кислород

2) кислород и выделяет углекислый газ

3) световую энергию и выделяет углекислый газ

4 ) световой энергии и выделяет кислород

13.Фотолиз воды происходит во время фотосинтеза:

1) в течение всего процесса фотосинтеза

2) в темной фазе

3) в светлой фазе

4) нет синтеза углеводов

14. Светлая фаза фотосинтеза происходит:

1) на внутренней мембране хлоропластов

2) на внешней мембране хлоропластов

3) в строме хлоропластов

4) в матриксе митохондрий

15.В темной фазе фотосинтеза происходит:

1) выделение кислорода

2) синтез АТФ

3) синтез углеводов из углекислого газа и воды

4) возбуждение хлорофилла фотоном света

16. По По типу питания большинство растений относятся к:

17. В клетках растений, в отличие от клеток человека, животных, грибов, происходит

1) метаболизм 2) аэробное дыхание

3) синтез глюкозы 4) синтез белка

18.Источником водорода для восстановления углекислого газа в процессе фотосинтеза является

1) вода 2) глюкоза

3) крахмал 4) минеральные соли

19. Хлоропласты:

1) транскрипция мРНК 2) образование рибосом

3) образование лизосом 4) фотосинтез

20. Синтез АТФ в клетке происходит в процессе:

1) гликолиз; 2) фотосинтез;

3) клеточное дыхание; 4) всего перечислено

Основным источником энергии для клетки являются питательные вещества: углеводы, жиры и белки, которые окисляются кислородом.Практически все углеводы, прежде чем попасть в клетки организма, превращаются в глюкозу за счет работы желудочно-кишечного тракта и печени. Наряду с углеводами белки также расщепляются на аминокислоты, а липиды — на жирные кислоты. В клетке питательные вещества окисляются кислородом и при участии ферментов, контролирующих реакции выделения энергии и ее использования. Практически все окислительные реакции происходят в митохондриях, а выделяемая энергия сохраняется в виде высокоэнергетического соединения — АТФ.В будущем именно АТФ будет использоваться для обеспечения энергией внутриклеточных метаболических процессов, а не питательными веществами.

Молекула АТФ содержит: (1) азотистое основание аденин; (2) пентозоуглеводород рибоза, (3) три остатка фосфорной кислоты. Последние два фосфата связаны друг с другом и с остальной частью молекулы высокоэнергетическими фосфатными связями, обозначенными символом ~ в формуле АТФ. В зависимости от физических и химических условий, характерных для организма, энергия каждой такой связи составляет 12 000 калорий на моль АТФ, что во много раз превышает энергию обычной химической связи, поэтому фосфатные связи называются макроэргическими.Более того, эти связи легко разрушаются, обеспечивая энергией внутриклеточные процессы, как только в этом возникает необходимость.

При высвобождении энергии АТФ отдает фосфатную группу и превращается в аденозиндифосфат. Высвободившаяся энергия используется практически для всех клеточных процессов, например, в реакциях биосинтеза и во время сокращения мышц.

Восполнение запасов АТФ происходит за счет воссоединения АДФ с остатком фосфорной кислоты за счет энергии питательных веществ.Этот процесс повторяется снова и снова. АТФ постоянно потребляется и накапливается, поэтому его называют энергетической валютой клетки. Время оборота АТФ составляет всего несколько минут.

Роль митохондрий в химических реакциях образования АТФ. Когда глюкоза попадает в клетку, под действием цитоплазматических ферментов она превращается в пировиноградную кислоту (этот процесс называется гликолизом). Энергия, выделяемая в этом процессе, расходуется на преобразование небольшого количества АДФ в АТФ, что составляет менее 5% от общих запасов энергии.

Синтез АТФ на 95% осуществляется в митохондриях. Пировиноградная кислота, жирные кислоты и аминокислоты, образованные соответственно из углеводов, жиров и белков, в конечном итоге превращаются в митохондриальном матриксе в соединение, называемое ацетил-КоА. Это соединение, в свою очередь, вступает в серию ферментативных реакций, которые вместе называются «циклом трикарбоновых кислот» или «циклом Кребса», чтобы высвободить свою энергию. В цикле трикарбоновых кислот ацетил-КоА расщепляется на атомы водорода и молекулы диоксида углерода.Углекислый газ удаляется из митохондрий, затем из клетки путем диффузии и выводится из организма через легкие.

Атомы водорода химически очень активны и поэтому немедленно вступают в реакцию с кислородом, диффундирующим в митохондрии. Большое количество энергии, выделяемой в этой реакции, используется для преобразования многих молекул АДФ в АТФ. Эти реакции довольно сложны и требуют участия огромного количества ферментов, составляющих кристы митохондрий. На начальном этапе от атома водорода отщепляется электрон, и атом превращается в ион водорода.Процесс заканчивается добавлением к кислороду ионов водорода. В результате этой реакции образуется вода и большое количество энергии, которая необходима для работы АТФ-синтетазы, большого глобулярного белка, который проявляется в виде бугорков на поверхности крист митохондрий. Под действием этого фермента, использующего энергию ионов водорода, АДФ превращается в АТФ. Новые молекулы АТФ отправляются из митохондрий во все части клетки, включая ядро, где энергия этого соединения используется для множества функций.Этот процесс синтеза АТФ обычно называют хемиосмотическим механизмом образования АТФ.

Вам действительно нужно заменить трансмиссионную жидкость? | News

В вашем автомобиле есть много жидкостей, но одна из самых важных, за которыми нужно следить, — это трансмиссионная жидкость. Стоит ли вам меняться или нет, это не предмет споров: да, вы должны. Но то, как часто следует выполнять эту услугу, зависит от производителя и транспортного средства, и это открыто для обсуждения.

График технического обслуживания многих автоматических трансмиссий не требует свежей жидкости до 100 000 миль или, для некоторых трансмиссий Ford, даже до 150 000 миль. Многие механики говорят, что это слишком долго и что это нужно делать не реже, чем каждые 50 000 миль. Для механических трансмиссий требуется больше обычного трансмиссионного масла, чем для жидкости для автоматических трансмиссий, и, как правило, они требуют другого графика технического обслуживания, поэтому лучше всего сверяться с интервалами обслуживания в руководстве пользователя.

Связано: Больше новостей службы

Как и другие жизненно важные автомобильные жидкости, трансмиссионная жидкость со временем ухудшается. Жесткое использование — например, частые остановки в движении по городу, перевозка тяжелых грузов и буксировка прицепа — ускорит износ. Такой способ вождения повышает рабочую температуру трансмиссии, а нагрев увеличивает нагрузку на трансмиссию и жидкость. В отличие от моторного масла, которое в первую очередь является смазкой, трансмиссионная жидкость служит одновременно маслом и гидравлической жидкостью, которая помогает переключать передачи, охлаждает трансмиссию и смазывает движущиеся части.

Если вы много водите в условиях высоких нагрузок, вам следует чаще проверять уровень трансмиссионной жидкости и обращаться в ремонтную мастерскую для проверки состояния жидкости. Трансмиссионная жидкость часто бывает красной, но может быть и других цветов, и по мере ее ухудшения она имеет тенденцию становиться темнее. Также может появиться запах гари, который может указывать на необходимость замены или на то, что в трансмиссии возникают механические проблемы.

Как проверить трансмиссионную жидкость

Многие современные автомобили не имеют щупа для измерения уровня трансмиссионной жидкости, и вместо этого автопроизводители рекомендуют сервисный центр проверять уровень жидкости, потому что это часто делается из-под автомобиля.Воспользуйтесь руководством по эксплуатации вашего автомобиля, чтобы определить, есть ли в трансмиссии легкодоступный масляный щуп; если это так, вот несколько советов при проверке жидкости:

1. Используйте руководство пользователя, чтобы найти рекомендованную процедуру проверки трансмиссионной жидкости.

2. Припаркуйте автомобиль на ровной поверхности для наиболее точных показаний.

3. Будьте осторожны с вентиляторами охлаждения двигателя, которые могут продолжать работать после выключения двигателя, а также с горячими деталями двигателя; многие автомобили рекомендуют при проверке трансмиссионной жидкости прогреть двигатель и трансмиссию до рабочей температуры.

4. Определите, проверяется ли жидкость при работающем двигателе или при выключенном. Это может варьироваться от машины к машине и повлияет на точность.

5. Некоторые автомобили рекомендуют переключать селектор передач на каждую передачу на несколько секунд перед проверкой жидкости; всегда возвращайтесь в положение «Парковка» или «Нейтраль» и включайте стояночный тормоз, прежде чем выходить из автомобиля.

6. Найдите ручку масляного щупа коробки передач, которая обычно ярко окрашена; опять же, руководство пользователя поможет вам найти его.

7. Выньте масляный щуп, соблюдая осторожность, чтобы не пролить жидкость на горячий двигатель или детали выхлопной системы, и протрите щуп чистой тряпкой.

8. Снова вставьте щуп, затем извлеките щуп, чтобы проверить уровень жидкости, который должен находиться между отметками «Низкий» и «Полный».

9. Если у вас есть утечка и вам необходимо долить, убедитесь, что вы используете рекомендованную трансмиссионную жидкость, залейте ее до подходящего уровня и устраните утечку как можно скорее.

10.Когда закончите, установите щуп на место.

Еще одним признаком того, что трансмиссионная жидкость нуждается в замене, является наличие в ней частиц или другого мусора. Когда вы отправляете свой автомобиль на замену масла или другое плановое обслуживание, ремонтный центр может потребовать от вас заплатить за замену или промывку трансмиссионной жидкости. Даже если они покажут вам, что жидкость темнее оригинальной, это не значит, что вам нужна свежая жидкость прямо сейчас. Вернитесь назад, проверьте график технического обслуживания в руководстве по эксплуатации и посмотрите, что рекомендует производитель транспортного средства, прежде чем принимать решение.Это также даст вам время сделать покупки по лучшей цене.

Многие ремонтные мастерские используют системы промывки, которые вытесняют старую жидкость и закачивают новую, вместо того, чтобы просто слить старую жидкость. Хотя это звучит неплохо, некоторые производители говорят, что вам не следует этого делать (Honda — одна из них; есть и другие), поэтому вам нужно знать это, прежде чем соглашаться на промывку. Загляните в руководство по эксплуатации. Некоторые производители, такие как Honda, также призывают использовать свой собственный тип жидкости для автоматических трансмиссий и предупреждают, что использование других типов может привести к повреждению.Более того, в некоторых автоматических трансмиссиях есть фильтры, которые следует чистить или заменять при замене жидкости. Убедитесь, что в ремонтной мастерской используется подходящая жидкость и процедуры для вашего автомобиля.

Если вы никогда не меняли трансмиссионную жидкость в своем автомобиле и на одометре более 100 000 миль, следует ли вам заменить ее сейчас ? Мы видели смешанные мнения по этому поводу, при этом некоторые механики предлагали вам просто оставить достаточно хорошо, если у вас нет проблем с переключением передач.Масла в эту теорию добавляют истории о старых трансмиссиях, выходящих из строя вскоре после того, как они наконец получили свежую жидкость.

Нам трудно признать, что свежая жидкость вызывает отказ трансмиссии, поэтому мы склонны к этому, если вы планируете оставить автомобиль на несколько лет или дольше. Однако свежая жидкость не является лекарством от пробуксовки передач, грубого переключения или других механических проблем, поэтому не ожидайте, что смена жидкости станет волшебным эликсиром.

Примечание редактора: Пока мы надеемся помочь вам, Cars.com не несет ответственности за любые травмы или повреждения, которые могут возникнуть у вас или вашего автомобиля в результате выполнения описанных выше действий.

Редакционный отдел Cars.com — ваш источник автомобильных новостей и обзоров. В соответствии с давней политикой этики Cars.com редакторы и рецензенты не принимают подарки или бесплатные поездки от автопроизводителей. Редакционный отдел не зависит от отделов рекламы, продаж и спонсируемого контента Cars.com.

Редакционный отдел Cars.com — ваш источник автомобильных новостей и обзоров.В соответствии с давней политикой этики Cars.com редакторы и рецензенты не принимают подарки или бесплатные поездки от автопроизводителей. Редакционный отдел не зависит от отделов рекламы, продаж и спонсируемого контента Cars.

Author: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.