Ким егэ по истории 2018: Досрочный ким ЕГЭ 2018 по истории ФИПИ с ответами от 26 марта

Содержание

ЕГЭ 2018 история видеконсульация от разработчиков КИМ

→ Рабочие тетради, учебники, канцтовары для школы !

Федеральная служба по надзору в сфере образования и науки начинает публикацию на своем YouTube-канале видео консультаций по подготовке к единому государственному экзамену 2018 года. 

В создании 12 видеороликов приняли участие руководители федеральных комиссий по разработке контрольных измерительных материалов КИМ  ЕГЭ-2018, психологи, учителя школ и преподаватели вузов. В видеоматериалах детально разбираются нюансы и особенности каждого предмета, даются советы по подготовке и рекомендации по выполнению отдельных заданий. 

Рекомендации по подготовке к ЕГЭ 2018 по истории от учителей и специалистов ФИПИ.

 

00:16 - Лукутин Андрей Владимирович - заместитель директора Государственного бюджетного образовательного учреждения города Москвы дополнительного профессионального образования (повышения квалификации) специалистов Городского методического центра Департамента образования города Москвы

02:16 - Войцик Юлия Григорьевна - учитель истории ГБОУ "Школа № 1251 имени генерала Шарля де Голля" города Москвы

05:13 - Безбородов Александр Борисович - руководитель Федеральной комиссии по разработке КИМ ЕГЭ по истории, доктор исторических наук

11:30 - Фокина Александра Васильевна - методист отдела обществоведческих дисциплин БУ ОО ДПО «Институт развития образования» Орловской области, заместитель председателя предметной комиссии по проверке ЕГЭ по истории Орловской области

15:51 - Артасов Игорь Анатольевич - заместитель руководителя Федеральной комиссии по разработке КИМ ЕГЭ по истории

24:14 - Амосова Инга Владимировна - учитель истории ГАОУ "Школа № 1518" города Москвы, старший эксперт предметной комиссии по проверке ЕГЭ по истории города Москвы, кандидат исторических наук

27:01 - Орехова Светлана Васильевна - руководитель Центра экспертизы и аналитики ФГБНУ "ФИПИ"

Смотрите также:

 

ЕГЭ-2018. История. 30 вариантов. Типовые экзаменационные варианты ФИПИ. / Под ред. И. А. Артасова, Артасов И.А. (под ред.) | ISBN: 978-5-4454-1012-6

Артасов И.А. (под ред.)

Аннотация

Серия «ЕГЭ. ФИПИ — школе» подготовлена разработчиками контрольных измерительных материалов (КИМ) единого государственного экзамена. В сборнике представлены: • 30 типовых экзаменационных вариантов, составленных в соответствии с проектом демоверсии КИМ ЕГЭ по истории 2018 года; • инструкция по выполнению экзаменационной работы; • ответы ко всем заданиям; • критерии оценивания. Выполнение заданий типовых экзаменационных вариантов предоставляет обучающимся возможность самостоятельно подготовиться к государственной итоговой аттестации в форме ЕГЭ, а также объективно оценить уровень своей подготовки к экзамену. Учителя могут использовать типовые экзаменационные варианты для организации контроля результатов освоения школьниками образовательных программ среднего общего образования и интенсивной подготовки обучающихся к ЕГЭ.

Дополнительная информация
Регион (Город/Страна где издана): Москва
Год публикации: 2018
Тираж: 10000
Страниц: 480
Формат:
60x90/8
Ширина издания: 220
Высота издания: 290
Вес в гр.: 777
Язык публикации: Русский
Тип обложки: Мягкий / Полужесткий переплет
Иллюстрирована: Да
Тип иллюстраций: Чёрно-белые иллюстрации, Таблицы, чёрно-белые
Полный список лиц указанных в издании: Артасов И.А. (под ред.)

ФИПИ опубликовал проекты документов, регламентирующих структуру и содержание КИМ ЕГЭ 2018 года и ОГЭ 2018 года

Федеральный институт педагогических измерений (ФИПИ) опубликовал на своем сайте проекты документов, регламентирующих структуру и содержание контрольных измерительных материалов (КИМ) единого государственного экзамена 2018 года, который сдают выпускники 11 классов, и основного государственного экзамена для выпускников 9 классов.

Данные документы являются основой для составления экзаменационных материалов и ежегодно публикуются для экспертного обсуждения до начала учебного года. Они также дают возможность будущим участникам ЕГЭ–2018 и преподавателям составить представление о том, что их ждет на экзаменах в новом учебном году.

Для понимания того, как нужно выполнять экзаменационную работу, следует в первую очередь ознакомиться с демонстрационными версиями контрольных измерительных материалов по предметам этого года. Они помогут составить представление о структуре будущих КИМ, количестве заданий, их форме и уровне сложности. Кроме того,
в демонстрационном варианте приведены критерии оценки выполнения заданий с развернутым ответом. С ними важно ознакомиться, чтобы понимать требования к полноте и правильности записи ответа. Задания, включаемые

в демоверсии, не используются на экзаменах, но они аналогичны реальным.

Полный перечень вопросов и тем, которые могут встретиться на экзамене, приведен в кодификаторе элементов содержания и требований к уровню подготовки выпускников. Его можно использовать при составлении плана повторения материала перед экзаменом.

Проекты опубликованных документов не предполагают изменения в 2018 году структуры и содержания КИМ ЕГЭ
по биологии, географии, истории, математике и иностранным языкам.

В экзаменационной работе по информатике в задании 25 убрана возможность написания алгоритма на естественном языке в связи с невостребованностью этой возможности участниками экзамена. Примеры текстов программ и их фрагментов в условиях заданий на языке Си заменены на примеры на языке С++, как значительно более актуальном и распространенном.

В экзаменационной работе по литературе уточнены требования к выполнению двух заданий и введена четвертая тема сочинения.

В экзаменационную работу по русскому языку включено задание базового уровня, проверяющее знание лексических норм современного русского литературного языка.

В экзаменационную работу по физике добавлено одно задание базового уровня, проверяющее знание элементов астрофизики. В работу по химии добавлено одно задание высокого уровня сложности с развернутым ответом.

Внесены изменения в систему оценивания экзаменационных работ по литературе, обществознанию, русскому языку, физике и химии.

ФИПИ приглашает экспертное и профессиональное сообщества принять участие в обсуждении проектов экзаменационных материалов 2018 года. Все замечания и предложения принимаются на электронный адрес: [email protected]  до 30 сентября 2017 г.

Опубликованы проекты КИМ ЕГЭ и ОГЭ 2019 года

Федеральный институт педагогических измерений (ФИПИ) опубликовал на своем сайте проекты документов, регламентирующих структуру и содержание контрольных измерительных материалов (КИМ) единого государственного экзамена 2019 года, который сдают выпускники 11 классов, и основного государственного экзамена для выпускников 9 классов, сообщает пресс-служба Рособрнадзора.
 
«Данные документы являются основой для составления экзаменационных материалов и ежегодно публикуются для экспертного обсуждения до начала учебного года. Они также дают возможность будущим участникам ЕГЭ-2019 составить представление о том, что их ждет на экзаменах в новом учебном году», - указано в информационном релизе.

Задания, включаемые в демоверсии, не используются на экзаменах, но они аналогичны реальным и помогают составить представление о структуре будущих КИМ, количестве заданий, их уровне сложности. 

Кроме того, в демонстрационном варианте приведены критерии оценки выполнения заданий с развернутым ответом. С ними важно ознакомиться, чтобы понимать требования к полноте и правильности записи ответа. 

Полный перечень вопросов и тем, которые могут встретиться на экзамене, приведен в кодификаторе элементов содержания и требований к уровню подготовки выпускников. Его можно использовать при составлении плана повторения материала перед экзаменом.
 
Рособрнадзор напоминает: все изменения в КИМ ЕГЭ-2019 не носят принципиального характера.

По большинству предметов были уточнены формулировки заданий, усовершенствована система оценивания заданий для повышения дифференцирующей способности экзаменационной работы. Впервые в этом году опубликована для общественно-профессионального обсуждения экзаменационная модель ЕГЭ по китайскому языку.

Проекты опубликованных документов не предполагают изменения в 2019 году структуры и содержания КИМ ЕГЭ по математике, географии, физике, химии и информатике.

В экзаменационной работе по русскому языку увеличено с 26 до 27 количество заданий за счет введения нового задания (21), проверяющего умение проводить пунктуационный анализ текста. Изменен формат заданий 2, 9–12, расширен диапазон проверяемых орфографических и пунктуационных умений, уточнен уровень сложности отдельных заданий, уточнена формулировка и критерии оценки задания 27 с развернутым ответом.
 
В ЕГЭ по биологии изменена модель задания 2: вместо двухбалльного задания с множественным выбором предложено однобалльное задание на работу с таблицей.
В экзаменационной работе по иностранному языку уточнена формулировка и критерии оценивания задания 40 письменной части, в котором участнику экзамена предлагаются на выбор две темы развернутого письменного высказывания с элементами рассуждения «Мое мнение».

В ЕГЭ по литературе уточнены критерии оценивания выполнения заданий с развернутым ответом.
 
В экзаменационной работе по обществознанию детализированы формулировки заданий 25, 28, 29 и усовершенствованы системы их оценивания.
 
В ЕГЭ по истории в задание 21 добавлено дополнительное условие, определяющее требование к оформлению ответа, и дополнены критерии оценивания этого задания.

Изменений структуры и содержания КИМ ОГЭ в 2019 году по сравнению с 2018 годом не предполагается.
 
ФИПИ приглашает экспертное и профессиональное сообщества принять участие в обсуждении проектов экзаменационных материалов 2019 года. Все замечания и предложения принимаются до 1 октября 2018 года.

Опубликованы проекты контрольных измерительных материалов ЕГЭ и ОГЭ 2022 года - 31 Августа 2021

Федеральный институт педагогических измерений (ФИПИ) опубликовал на своем сайте проекты документов, регламентирующих структуру и содержание контрольных измерительных материалов (КИМ) единого государственного экзамена (ЕГЭ) в 2022 году.

С 2022 года ЕГЭ проводится на основе Федерального государственного образовательного стандарта среднего общего образования. В связи с этим во всех учебных предметах, кроме информатики, которая была переведена в компьютерный формат в 2021 году, произошли изменения структуры КИМ, включены новые модели заданий на применение предметных знаний. Все изменения направлены на усиление деятельностной составляющей КИМ: применение умений и навыков анализа различной информации, решения задач, в том числе практических, развернутого объяснения, аргументации.

Так, например, в ЕГЭ по базовой математике добавлены задания, проверяющие умения выполнять действия с геометрическими фигурами, строить и исследовать простейшие математические модели. В ЕГЭ по биологии включено задание, проверяющие умение прогнозировать результаты эксперимента на основе знаний из области физиологии клеток и организмов разных царств живой природы. Из экзаменационной работы по истории исключено историческое сочинение, но добавлено новое задание на установление причинно-следственных связей, а вместо задания с кратким ответом, посвящённого Великой Отечественной войне, включено задание с развёрнутым ответом, предполагающее работу с историческими источниками о Великой Отечественной войне. Участникам ЕГЭ по географии будут предложены два новых задания, проверяющих умения определять и находить информацию, недостающую для решения задачи и информацию, необходимую для классификации географических объектов по заданным основаниям. В ЕГЭ по литературе обогащен литературный материал: шире представлена поэзия второй половины ХIХ–ХХ веков, отечественная литература ХХI века, включена зарубежная литература. Повышены требования к объему сочинения, теперь оно должно содержать не менее 200 слов. Время, отведенное на выполнение экзаменационных работ по истории и обществознанию, сокращено с 235 до 180 минут. С полным перечнем изменений можно ознакомиться на сайте ФИПИ.

Опубликованные материалы являются основой для составления экзаменационных материалов ЕГЭ в новом учебном году. ФИПИ приглашает к их общественно-профессиональному обсуждению. Вопросы и предложения можно направлять на адрес [email protected] до 30 сентября 2021 года.  

Также с помощью данных материалов будущие участники ЕГЭ и их преподаватели могут составить представление о том, что их ждет на экзаменах в новом учебном году.

Для понимания того, как нужно выполнять экзаменационную работу, следует в первую очередь ознакомиться с демонстрационными версиями контрольных измерительных материалов по предметам этого года. Они помогут составить представление о структуре будущих КИМ, количестве заданий, их форме и уровне сложности. Кроме того, в демонстрационном варианте приведены критерии оценки выполнения заданий с развернутым ответом. С ними важно ознакомиться, чтобы понимать требования к полноте и правильности записи ответа. Задания, включенные в демоверсии, не будут использоваться при проведении экзаменов, но они аналогичны реальным.

Полный перечень вопросов и тем, которые могут встретиться на экзамене, приведен в кодификаторе элементов содержания и требований к уровню подготовки выпускников. Его можно использовать при составлении плана повторения материала перед экзаменом.

Ранее на сайте ФИПИ также были опубликованы проекты документов, регламентирующих структуру и содержание контрольных измерительных материалов (КИМ) основного государственного экзамена (ОГЭ) в 2022 году. Изменения в КИМ ОГЭ 2022 года относительно КИМ ОГЭ 2021 года отсутствуют.

 

Пенкина Капиталина по материалам сайта https://krao.ru/

Главная - Мой веб-сайт


Межмуниципальный отдел МО МВД России "Кунгурский" сообщает, что с 14 по 27 июня 2021 года на территории Кунгурского муниципального округа проводится комплекс мероприятий , приуроченных к Международному дню борьбы с наркоманией  и незаконным оборотом наркотиков, направленных на повышение  доверия к правоохранительным органам, осуществляющим борьбу с незаконным оборотом наркотиков, формирования у подростков и молодежи антинаркотического мировоззрения, привлечения внимания граждан к проблемам наркомании и наркопреступности.

Контактные номера МО МВД России "Кунгурский" 83427162033, 83427162002, по которым можно сообщить информацию по линии НОН, в том числе на условиях анонимности.


Видеоролик победителей Конкурса, где вместе с детьми в записи принимали участие деятели культуры и искусства, спортсмены, представители исполнительных и законодательных органов государственной власти, администрации губернатора, а также силовых ведомств Пермского края, читая стихи, в том числе посвященные Победе в Великой Отечественной войне


План и Положения мероприятий по профилактике детского дорожно-транспортного травматизма на 2020-2021 учебный год» 


Информационные материалы по работе школ в условиях сохранения распространения новой коронавирусной инфекции (COVID-19) (приложение) 


Положительный контент

  1. "Семья - один из шедевров природы." (приложение)
  2.  Проект "Сохраним семью - сбережем Россию" (приложение, приложение)
  3.  Видеоролики социальной рекламы (приложение)
  4.  Памятка РЖД (приложение)

 В соответствии с письмом Межмуниципального отдела МВД России «Кунгурский» от 15.06.2020 года № 3/21792 сообщаем, что в период с 15 по 30 июня 2020 года на территории г. Кунгура и Кунгурского муниципального района проводится комплекс мероприятий, приуроченных к Международному дню борьбы с наркоманией и незаконным оборотом наркотиков, направленных на повышение доверия к правоохранительным органам, осуществляющим борьбу с незаконным оборотом наркотиков, формирования у подростков и молодежи антинаркотического мировоззрения, привлечения внимания граждан к проблемам наркомании и наркопреступности.

Контактные номера МО МВД России «Кунгурский» (тел. 83427162033, 83427162002), по которым можно сообщить информацию по линии НОН, в том числе на условиях анонимности. 


График проведения очных консультаций


СТАРТ МЕСЯЧНИКА АНТИНАРКОТИЧЕСКОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ!

УЧАСТИЕ В МЕРОПРИЯТИИ ИНТЕРНЕТ-АКЦИЯ #ТВОЙВЫБОР59 


Проект «Карьера в кармане» https://careerbox.ru/.( приложение)


Со 2 апреля в Прикамье будет введен режим полной самоизоляции

По оценкам Министерства территориальной безопасности Пермского края, самоизоляция жителей может сократить темпы распространения коронавируса почти в два раза.

Как обозначил глава Пермского края Дмитрий Махонин, на заседании штаба было принято решение о введение в регионе режима полной самоизоляции. 

Выйти из дома будет разрешено только за продуктами, выгулять домашних животных и при острой необходимости в больницы.

 «Ограничение касаются всех граждан, за исключением работников организация жизнеобеспечения. Предусмотрено введение пропусков, улицы будут патрулироваться. Сейчас у жителей Прикамья есть сутки, чтобы решить, где они будут находиться в самоизоляции и обеспечить себя необходимыми продуктами и средствами гигиены», - обозначил Дмитрий Махонин.

Также решением оперштаба по противодействию распространения коронавируса в Пермском крае стала остановка межрегиональных, а также сокращение на 80% межмуниципальных автобусных перевозок.

Помимо этого, запрещается проведение каких-либо общественных мероприятий. 

 На улице жители Прикамья должны находиться исключительно в средствах индивидуальной защиты и на дистанции от 1,5 метров друг от друга. 


 

 


Памятки по профилактике ГРИППА, КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ и других  ОРВИ (приложение) 


О направлении информации о приеме в 1 класс общеобразовательной организации


ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ДОКЛАД

О ПОЛОЖЕНИИ ДЕТЕЙ И СЕМЕЙ, ИМЕЮЩИХ ДЕТЕЙ, В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ  

2018 год (приложение) 


«Всероссийская добровольная просветительская интернет-акция «Безопасность детей в сети Интернет» 

Всероссийская добровольная просветительская интернет-акция «Безопасность детей в сети Интернет» (с 19 ноября 2019г. по 7 апреля 2020г.) - одно из мероприятий, нацеленных на последовательное плановое развитие ключевых компетенций цифровой грамотности учащихся и воспитанников в части безопасного использования сети Интернет, повышение уровня эрудированности школьников в области интернет-безопасности, привлечение внимания родительской и педагогической общественности к данной проблеме.

К участию приглашаются педагогические работники, учащиеся и воспитанники образовательных организаций, родители. Официальный интернет-сайт просветительского мероприятия:

httр://ВсероссийскаяАкция.РФ
Кунгурский муниципальный район принял участие в конкурсном 
отборе на реализацию мероприятий «Мы выбираем спорт!», которые 
включают в себя мероприятия по созданию условий для развития массового 
спорта, пропаганду физкультуры и здорового образа жизни. 
По итогам 1 этапа проект Кунгурского муниципального района 
«ПОДТЯНИСЬ К ДВИЖЕНИЮ!» допущен ко второму этапу конкурса. 
На втором этапе конкурсного отбора право выбора проекта 
предоставляется жителям Пермского края, отдать свой голос можно на сайте 
«Управляем вместе» (http://permkrai.ru/program/votings). 
Голоса будут приниматься с 19 ноября по 02 декабря 2019 года 
включительно. 
Просим Вас поддержать проект Кунгурского муниципального района 
«ПОДТЯНИСЬ К ДВИЖЕНИЮ!» и проголосовать на сайте «Управляем 
вместе» (http://permkrai.ru/program/votings).

 

 

 


 

О закреплении муниципальных образовательных организаций, подведомственных Управлению образования Кунгурского муниципального района, осуществляющих образовательную деятельность по образовательным программам дошкольного образования за территориями Кунгурского муниципального района 


 Комиссия по делам несовершеннолетних и защите их прав

 


Памятка по профилактике гриппа и острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ)

Предписание о дополнительных мерах по предупреждению эпидемического распространения гриппа и ОРВИ среди населения Кунгурского муниципального района

 


Рособрнадзор начинает публикацию видеорекомендаций по подготовке к ЕГЭ-2019

 

Федеральная служба по надзору в сфере образования и науки начинает публикацию ежегодных видеоконсультаций с участием специалистов Федерального института педагогических измерений (ФИПИ) по подготовке к единым государственным экзаменам. В этом году серию видеолекций открывают рекомендации, как подготовиться к ЕГЭ по русскому языку.

 

Русский язык - самый массовый и один из двух обязательных экзаменов, статистика выполнения работ по которому показывает стабильные результаты на протяжении нескольких лет. Однако часто участники ЕГЭ сталкиваются с трудностями при выполнении отдельных заданий. Поэтому основная задача рекомендаций - помочь разобраться выпускникам, дать советы и разъяснения, как следует решать задания различных уровней сложности.

 

В видеоконсультации по подготовке к ЕГЭ по русскому языку эксперты подробно рассказывают про алгоритмы выполнения заданий базового уровня сложности, правописание приставок и суффиксов в различных частях речи, использование средств связи в тексте, а также разбирают критерии оценивания и параметры проверки выполнения заданий повышенного уровня сложности.

 

По словам руководителя Федеральной комиссии по разработке контрольных измерительных материалов по русскому языку Ирины Цыбулько, для успешного выполнения 27 задания - сочинение по прочитанному тексту - участнику экзамена необходимо быть готовым к тому, что надо прочитать материал несколько раз, периодически возвращаясь к отдельным фрагментам текста. «Будьте предельно внимательными, обращайте внимание на сильные позиции текста выделенные курсивом или жирным шрифтом, а при написании сочинения будьте логичны и последовательны. Используйте свой читательский опыт, для того, чтобы понять тот текст, по которому вы пишете сочинение», - советует она.

 

Рособрнадзор рекомендует просмотр видеоконсультаций как для самостоятельного изучения, так и для использования на подготовительных занятиях, поскольку в видеоматериалы включен разбор методических рекомендаций для учителей, подготовленный специалистами ФИПИ по итогам проведенного анализа результатов ЕГЭ прошлого года. Краткие обзоры методических рекомендаций по обществознанию, истории, биологии, русскому языку, математике, иностранным языкам, информатике, литературе, физике и химии размещены на сайте ведомства.

 

До начала досрочного периода ЕГЭ-2019 на официальном Youtube-канале Рособрнадзора будет опубликовано 12 видеоконсультаций по всем предметам, включая отдельный видеоролик по добавленному в этом году в перечень экзаменов китайскому языку.


Образцы и описания проверочных работ дают возможность учащимся и преподавателям составить представление о структуре ВПР, количестве заданий, их форме и уровне сложности, перечне вопросов и тем, которые могут встретиться в ВПР, системе оценивания.

ВПР представляют собой контрольные работы, которые проводятся в общеобразовательных организациях по завершении обучения в каждом классе. Это итоговые контрольные работы, которые проходят по отдельным учебным предметам для оценки уровня подготовки школьников с учетом требований федеральных государственных образовательных стандартов. Их организация предусматривает единое расписание, использование единых типов заданий и единых критериев оценивания.

Также Рособрнадзором был утвержден график проведения ВПР и национальных исследований качества образования (НИКО). В 2019 году ВПР пройдут с 5 марта по 25 апреля. Для учащихся 4-х, 5-х и 6-х классов их написание является обязательным, в 7-х и 11-х классах ВПР проводятся по решению школы. Учащиеся четвертых классов напишут ВПР по русскому языку, математике и окружающему миру, пятиклассники – по русскому языку, математике, биологии и истории, шестиклассники – по русскому языку, математике, биологии, истории, обществознанию и географии, семиклассники – по русскому языку, математике, биологии, истории, обществознания, географии и английскому языку, одиннадцатиклассники – по географии, физике, химии, биологии, истории и иностранному языку.

НИКО в 2019 году будут проведены по двум предметам: физической культуре в 6 и 10 классах (8-12 апреля) и технологии в 5 и 8 классах (октябрь).

 


Центр экологической политики и  культуры приглашает принять участие в мероприятиях проекта "Зеленые символы малой родины" 



Рособрнадзор сообщает о сроках подачи заявлений девятиклассниками на участие в итоговом собеседовании по русскому языку

Федеральная служба по надзору в сфере образования и науки напоминает, что заявления на участие в итоговом собеседовании необходимо подать не позднее, чем за две недели до его проведения, то есть до 30 января включительно. Заявления подаются учащимися по месту их обучения.

Итоговое собеседование с 2018/2019 учебного года введено для выпускников 9 классов как обязательное, его успешная сдача будет являться для них условием допуска к государственной итоговой аттестации. Результатом итогового собеседования может быть «зачет» или «незачет».

Основной срок проведения итогового собеседования по русскому языку в этом году – 13 февраля. Для выпускников, получивших «незачет», либо не явившихся на собеседование по уважительной причине, предусмотрены дополнительные дни - 13 марта и 6 мая.

Участникам итогового собеседования будет предложено выполнить четыре задания: чтение текста вслух, его пересказ с привлечением дополнительной информации, монологическое высказывание по одной из выбранных тем и диалог с экзаменатором-собеседником.

На выполнение работы каждому участнику отводится в среднем 15 минут. Для участников итогового собеседования с ограниченными возможностями здоровья, детей-инвалидов и инвалидов  продолжительность процедуры может быть увеличена на 30 минут.

 

историй в Соединенных Штатах, которые тронули нас

5 самых читаемых историй США СЕГОДНЯ в 2018 году

2018 год был годом американских горок. Это 5 самых читаемых историй USA TODAY, которые остановили вас в этом году.

США СЕГОДНЯ

В 2018 году взоры нации снова были прикованы к президенту Дональду Трампу, второй год правления которого был не менее знаменательным, чем его первый. Это был год, когда президент начал торговые войны, встретился с северокорейским лидером Ким Чен Ыном, спорил с прессой и отстоял тайные денежные выплаты женщинам, с которыми он якобы имел отношения, и все это в то время как новые разоблачения и обвинительные заключения сыпались из специального адвоката. Расследование Роберта Мюллера о вмешательстве России в выборы.

Политика и политика разделили нас. Мы оказались втянутыми в ожесточенные иммиграционные дебаты. Кандидат в Верховный суд Трампа Бретт Кавано дошел до высшего суда, несмотря на обвинения в сексуальном насилии со стороны Кристин Блейси Форд.

Природа нас смирила. Калифорния загорелась, поскольку пожар в лагере стал самым разрушительным в истории штата. Ураганные ветры и наводнения обрушились на Каролину. Но другие истории заставили нас гордиться. Сборная США привезла домой 23 олимпийские медали из южнокорейского Пхенчхана.Учителя боролись за повышение заработной платы.

Мы реализовали свои права, проголосовав в самой сложной среднесрочной перспективе за последние годы. Демократы получили контроль над Палатой представителей, республиканцы расширили свое большинство в Сенате, а избиратели вошли в историю, открыв Конгрессу многие новшества для женщин и меньшинств.

Затем мы закончили год торжественным прощанием. Похороны Джорджа Х.В. Буш стали прощанием не только с бывшим президентом, но и с целым поколением.

После еще одного насыщенного событиями года USA TODAY вновь обращается к одной истории из каждого штата, который нас тронул: важные новости, лучшие расследования и моменты, о которых мы не можем перестать говорить.

Подробнее: Наши самые читаемые истории за 2018 год

Отрывки: Арета Франклин, Стивен Хокинг, Джордж Х.В. Буш и другие знаменитости: взгляд на легенды, которые мы потеряли в 2018 году

Подробнее: Поразительные изображения: фото в день 2018 года

Алабама

Джефф Сешнс, расследование по России и уход из Белого дома громких людей

Осажденный срок пребывания бывшего сенатора от Алабамы на посту генерального прокурора США окончательно закончился в ноябре, через день после промежуточных выборов.Хотя Сешнс был одним из первых сторонников президента Дональда Трампа, главнокомандующий ругал его за то, что он отказался участвовать в расследовании российского вмешательства в президентские выборы 2016 года. Уход Сешнса был лишь одним из многих заметных увольнений и отставок администрации Трампа в 2018 году, в том числе главы администрации Джона Келли и госсекретаря Рекса Тиллерсона. Что касается российского расследования: Трамп отрицал правонарушения и неоднократно называл назревающее расследование спецпрокурора Роберта Мюллера «охотой на ведьм».«Ранее в этом месяце бывший личный поверенный Трампа Майкл Коэн был приговорен к трем годам лишения свободы в федеральной тюрьме - первый приговор для члена ближайшего окружения президента и тот, который может представлять опасность для Трампа.

Аляска

Сильное землетрясение превращает катастрофу в познавательный опыт

Землетрясение магнитудой 7,0, произошедшее недалеко от Анкориджа 30 ноября, разрезало открытые дороги, отключило электричество и повредило здания. В регионе произошло более 3000 подземных толчков, однако о смертельных случаях или серьезных травмах не сообщалось.Между тем, усилия по восстановлению, затрудненные из-за холода, стали предметом зависти нации после того, как рабочие бригады отремонтировали серьезные повреждения дороги в течение четырех дней после землетрясения. По словам официальных лиц, доставка продуктов питания, топлива и других грузов не прерывалась. По их словам, экипажи будут переделывать большую часть своей работы летом, чтобы обеспечить долгосрочную устойчивость.

Последствия землетрясения магнитудой 7,0 на Аляске

Землетрясение силой 7,0 баллов вызвало обширные разрушения на Аляске, вынудив студентов в Анкоридже укрыться.

США СЕГОДНЯ

Аризона

«Вы говорите мне, что мое нападение не имеет значения»: спорные слушания в Кавано

Кристин Блейси Форд с тихими и сдержанными эмоциями засвидетельствовала, что Бретт Кавано заставил ее лечь в кровать и попытался чтобы снять одежду на вечеринке, когда оба были подростками. Кавано кричал, плакал и перебивал, когда подошла его очередь перед Судебным комитетом Сената. Днем позже протестующая, которая сказала, что подверглась сексуальному насилию, подошла к уходящему республиканскому сенатору от Аризоны Джеффу Флейку в лифте.«Вы говорите мне, что мое нападение не имеет значения», - сказала Флаке эмоционально эмоциональная женщина. Момент, казалось, имел значение, поскольку это был Флаке вместе с сенатором Крисом Кунсом (демократ), который призвал ФБР провести недельное расследование. В конечном итоге Кавано был утвержден в Верховном суде США.

«Посмотри на меня:» Женщины противостоят Флэйку перед голосованием

Две женщины загнали в угол сенатора США Джеффа Флэйка в лифте в пятницу, через несколько мгновений после того, как он объявил, что проголосует за утверждение Бретта Кавано в Верховном суде, так как эмоции накалились. U.С. Капитолий. (28 сентября)

AP

Арканзас

Вирусная фотография показывает брата, который слишком рано прощается младшая сестра. 4-летняя Адалинн Сутер проиграла битву с редкой опухолью мозга, но ее братья и сестры получили последний шанс провести время вместе. Шестилетний Джексон потер голову сестры, когда она взяла его за руку. Затем Джексон пожелал спокойной ночи.Эдди была «приятелем Джексона, его лучшим другом, его младшей сестрой», - написал отец Мэтт Сутер в Facebook. «Это не так, как должно быть». Хотя ее состояние ухудшилось, а редкая опухоль забрала ее жизнь спустя несколько часов, семья нашла надежду: «В конце концов, у нее не было никакой боли», - написал ее отец.

Калифорния

Лесные пожары опустошают Голден-Стейт

6228 лесных пожаров. Обуглено более 876 000 акров. По крайней мере, 100 смертей. В этом году Калифорния была опустошена историческими пожарами, которые, вероятно, будут влиять на штат на десятилетия.В Северной Калифорнии пожар в лагере, самый смертоносный и разрушительный в истории штата, унес жизни почти в три раза больше людей, чем пожар в парке Гриффит - рекорд, который держался за 85 лет. И худшее, возможно, еще впереди: согласно новому исследованию, лесные пожары в Калифорнии могут быть более обычным явлением из-за жестокого сочетания жаркой и сухой погоды, связанного с изменением климата. Тем временем домовладельцы, пострадавшие от смертоносных пожаров, сталкиваются с дилеммой относительно необходимости восстановления в районах повышенного риска, которые неоднократно подвергались пожарам.

Колорадо

«Самое бесчеловечное и ужасное преступление»: без права досрочного освобождения отец, убивший беременную жену и 2 детей

Кристофер Уоттс дал эмоциональное телеинтервью на следующий день после того, как в августе были объявлены пропавшими без вести беременная жена и две дочери. умоляя об их безопасном возвращении. Вскоре после этого он был арестован и обвинен в их ужасной смерти. Уоттс отвез тела на нефтяное месторождение и похоронил жену в неглубокой могиле. Он затолкал Беллу и Селесту в два отдельных резервуара с маслом, проталкивая их тела через отверстия диаметром всего 8 дюймов.В ноябре папа из пригорода Денвера был приговорен к трем пожизненным срокам тюремного заключения подряд и 84 годам тюремного заключения без возможности условно-досрочного освобождения.

Коннектикут

Учитель уволен за управление студенческим «бойцовским клубом»

Бывший замещающий учитель в средней школе Коннектикута был уволен и предъявлен обвинение после того, как полиция обнаружила, что он руководил «бойцовским клубом» в своем классе математики. 23-летний Райан Фиш поощрял старшеклассников в Монтвилле к физическому сражению, пока ученики записывали драки и приветствовали их.Полиция вмешалась, когда социальный работник сообщил, что 15-летний студент получил травму после того, как его ограбили и избили его одноклассники. Рыба уволили со своей должности в школе, и ему были предъявлены обвинения в совершении уголовных преступлений и мелких правонарушений, связанных с угрозой для детей. Эти обвинения будут сняты, если Фиш завершит государственную программу ускоренной реабилитации, постановил судья в октябре.

Делавэр

Виртуальная реальность позволяет пациентам с химиотерапией бросать стерильные больницы в тихие леса

Когда яд капал ей в вены, Кэтлин Краковски слышала щебетание птиц и наблюдала, как листья колышутся на ветру.Краковски, пациентка с раком груди, проходила курс химиотерапии в Онкологическом центре и исследовательском институте Хелен Ф. Грэм в Ньюарке, но смотрела в безмятежный лес в гарнитуру виртуальной реальности. «Это совсем не выглядит фальшивкой», - сказала она. По словам медсестер, пациенты также могут сидеть на пляже или любоваться горным склоном, забыв - хотя бы на несколько минут - о стерильной больничной палате и смертельных болезнях. В сентябре VR-компании VRHealth и Oculus объявили, что все больше программ VR, ориентированных на здоровье, облегчат проблемы для рожениц и тех, кто страдает хронической болью.

Виртуальная реальность помогает онкологическим больным

Программа виртуальной реальности в Christiana Care предлагает пациентам, проходящим курс химиотерапии, которые посещают онкологический центр Грэма Infusion Suite, испытать виртуальную реальность с помощью Oculus Rift VR, чтобы помочь пациентам расслабиться, а также уменьшить беспокойство и скуку. и стресс.

Сучат Педерсон, Delaware News Journal

Флорида

Они стали свидетелями массовой стрельбы в школе. Затем они маршировали, спасая свои жизни.

Паркленд стал местом массового стрельбы в школе, когда бывший студент убил 17 человек, включая студентов, футбольного тренера и спортивного директора, в средней школе Марджори Стоунман Дуглас в День святого Валентина.Полиция арестовала Николаса Круза, которому теперь, помимо других обвинений, грозит смертная казнь. Круз был известен полиции, которая в период с 2008 по 2017 год получила 18 звонков с предупреждениями о нем, причем некоторые из них напрямую беспокоились о том, что он открыл огонь в школе. На фоне критики вооруженный школьный ресурсный офицер, который ни разу не заходил в школу во время стрельбы, ушел на пенсию. Но студенты Паркленда вышли из трагедии, подпитывающей движение и марши против насилия с применением огнестрельного оружия по всей стране, которые также были нацелены на кандидатов, поддерживаемых NRA, на промежуточных выборах.Студенты недавно были награждены глобальной премией мира и были отмечены как «настоящие творцы перемен».

Джорджия

Брайан Кемп побеждает, Стейси Абрамс подает в суд

Когда многие американцы спрашивали, за кого голосовать в день выборов, заявления о подавлении избирателей заставили некоторых грузин задаться вопросом, будут ли их голоса подсчитаны справедливо. В тесной гонке демократ Стейси Абрамс соперничала за право стать первой в стране чернокожей женщиной-губернатором, в то время как республиканец Брайан Кемп стремился сохранить контроль над офисом своей партии.Кемп победил, но обе стороны заявили о нечестной игре друг друга. Абрамс обвинил Кемпа в попытке подавить голоса демократов на посту государственного секретаря, исключив избирателей из списков. Офис Кемпа заявил, что расследует демократов на предмет того, что он назвал «неудавшейся попыткой взлома» системы регистрации. И борьба еще не окончена: группа, поддерживаемая Абрамсом, недавно подала федеральный иск с просьбой к судье приказать исправить то, что, по ее словам, является глубоко укоренившимися проблемами в избирательной системе штата.

Гавайи

Ложная тревога: гремит сигнал тревоги о баллистических ракетах Гавайи

Гавайцы были отправлены в карабкание одним январским утром после того, как уведомление о чрезвычайной ситуации предупредило о приближающейся угрозе баллистических ракет.Жители и отдыхающие бежали в поисках укрытия и звонили близким, думая, что смерть неминуема. Единственная проблема? Предупреждение было ошибкой. В течение трех минут официальные лица узнали, что произошла ошибка, но на отправку ложного сообщения о тревоге ушло 38 минут. Это тревожное уведомление пришло после нескольких месяцев агрессивной риторики со стороны северокорейского лидера Ким Чен Ына, который угрожал нанести удар по Соединенным Штатам. Позже президент Дональд Трамп встретился с Кимом, чтобы обсудить денуклеаризацию на широко разрекламированном саммите в Сингапуре.Историческое рукопожатие между ними стало первой встречей действующего президента США с лидером Северной Кореи и крупным прорывом в десятилетия напряженности.

Айдахо

На вдохновляющей фотографии показан простой патриотический жест мальчика из Айдахо

Мальчик из Айдахо, который своим телом защищал американский флаг, в сентябре пробудил патриотизм нации. Пятиклассник Джек ЛеБрек лежал на земле под флагом, а двое других мальчиков изо всех сил пытались его сложить в ветреный день.Момент уважения был запечатлен прохожим, который поделился изображением в Facebook, где оно вскоре попало в заголовки национальных газет. Изображение было настолько знаковым, что некоторые усомнились в его подлинности. "Было ли это постановкой?" - спросили некоторые фотографа и пользователь Facebook Аманду Реаллан. Скорее всего, не было: «Эти мальчики понятия не имели, что я фотографирую», - сказала она. «Они взяли на себя защиту флага».

Вирусная фотография показывает, как мальчики вместе снимают американский флаг.

На фотографии трое пятиклассников работают вместе, чтобы снять свой флаг в школе.Пытаясь удержать флаг от земли, один из мальчиков лег на землю, чтобы защитить его.

США СЕГОДНЯ

Иллинойс

Он останавливал вооруженного преступника в баре. Он все равно был застрелен полицией

Джемел Роберсон выполнял свою работу, когда полицейский из пригорода Чикаго застрелил его. 26-летний вооруженный охранник, который был чернокожим, задержал подозреваемого в боевике в баре, где он работал, и ждал помощи полиции, когда белый офицер открыл по нему огонь.Полиция сообщает, что офицер приказал Роберсону бросить пистолет. Свидетели говорят, что они кричали, что Роберсон был охранником. Смерть Роберсона вызвала крики о справедливости со стороны защитников гражданских прав и федеральный иск, поданный его матерью против все еще неназванного полицейского и Мидлотиана, откуда этот офицер. И его смерть была лишь одной из рук полиции в 2018 году.

Индиана

Афтершоки от Ларри Нассара перевернули гимнастику США

Последствия сексуального насилия, совершенного Ларри Нассаром, еще больше охватили гимнастику в Индианаполисе в 2018 году, угрожая поглотить руководителей высшего звена и сам спортивный руководящий орган.В феврале завершились уголовные дела против Нассара, бывшего врача гимнастики США, признанного виновным в изнасиловании молодых гимнасток. Генеральный директор USA Gymnastics ушел в отставку в сентябре, будучи вынужденным уйти из-под жесткой критики. Организация подала заявление о защите от банкротства в декабре, рассыпаясь под тяжестью судебных исков от переживших насилие Нассара. На следующей неделе глава Олимпийского комитета США был уволен после того, как отчет показал, что и комитет, и гимнастика США не смогли «принять надлежащую политику защиты детей» для предотвращения жестокого обращения.

Айова

Молли Тиббетс пропала без вести. Ее история охватила всю страну.

В последний раз Молли Тиббетс видели бегущей по Бордери и Мидл-Стрит в ее родном городе Бруклин 18 июля, как показывают записи видеонаблюдения. На следующий день было объявлено о пропаже 20-летнего студента Университета Айовы, что вызвало месячные поиски, охватившие американцев от Айовы до Белого дома. «Я просто хочу, чтобы семья Молли знала: ты в сердце каждого американца», - сказал вице-президент Майк Пенс.15. Власти нашли ее тело на кукурузном поле к юго-востоку от Бруклина шесть дней спустя и обвинили Кристиан Риверу, 24-летнюю гражданку Мексики, в убийстве первой степени. Ривера, который привел полицию к телу, сказал, что он «заблокировал» свою память после того, как преследовал Тиббетта во время ее бега. Он не признал себя виновным по предъявленному обвинению.

Канзас

Приемная корейская дочь армейского офицера вынуждена покинуть США

Подросток южнокорейского происхождения, усыновленный тетей и дядей в Канзасе, вскоре будет вынужден покинуть страну.Подполковник в отставке Патрик Шрайбер и его жена Су Джин отложили официальное усыновление дочери Хебин во многом из-за того, что Шрайбер, 27-летний ветеран армии, был направлен в Афганистан, где служил офицером разведки. После плохого юридического совета родители официально усыновили свою дочь на год позже, когда ей было 17 лет - через год после того, как ребенок, родившийся за границей, получил гражданство от американца, согласно иммиграционному законодательству. В сентябре федеральный судья постановил, что девушка должна покинуть страну сразу после окончания Канзасского университета.Семья заявила, что в случае депортации их дочери они переедут в Южную Корею.

Кентукки

«Это такой шок»: двое погибают в результате стрельбы в продуктовом магазине Kroger

Через несколько минут после попытки проникновения в церковь, где преобладает черный цвет, стрелок застрелил двух черных покупателей в продуктовом магазине Kroger в Джефферсонтауне. в октябре. Подозреваемый, Грегори Буш, был обвинен в федеральных преступлениях на почве ненависти и, как сообщается, сказал другому человеку, стрелявшему в него на парковке магазина: «Не стреляйте в меня.Я не буду стрелять в тебя. Белые не стреляют в белых ". Община оплакивала смерть 67-летней Викки Ли Джонс и 69-летнего Мориса Э. Сталларда, которые ходили по магазинам со своим внуком во время стрельбы.

Луизиана

Матери продолжают умирать при родах. Простое решение игнорируется

Ежегодно более 50 000 американских женщин получают тяжелые травмы во время родов. Около 700 умирают. Почему? Медицинские работники пропускают меры безопасности, которые, как известно, предотвращают катастрофу. матери - Луизиана, согласно расследованию USA TODAY "Смертельные роды".«С 2012 по 2016 год в штате Пеликан на каждые 100 000 рождений приходилось 58,1 случая смерти. Половину этих смертей можно было предотвратить, по лучшим оценкам, а половину травм можно было бы уменьшить или предотвратить с помощью более качественных мер. Благодаря нашему расследованию, США СЕГОДНЯ связались с 75 больницами. в 13 штатах, чтобы спросить, соблюдают ли они определенные общепризнанные меры безопасности. Половина не ответила.

Материнская смертность растет из-за того, что больницы и врачи игнорируют меры безопасности.

Высокое кровяное давление унесло жизнь одной матери.Из-за чрезмерного кровотечения другому человеку пришлось провести гистерэктомию. Могли бы давно известные техники безопасности спасти обоих?

Уолберт Кастильо, США СЕГОДНЯ

Мэн

Копченые омары? Ресторан пробует марихуану, чтобы облегчить боль ракообразных.

В ресторане Charlotte's Legendary Lobster Pound ваш лобстер может закоптиться еще до того, как его приготовят на пару. В ресторане в Southwest Harbour экспериментировали с использованием марихуаны, чтобы облегчить боль омаров перед приготовлением на пару. Владелец Шарлотта Гилл сказала, что она попробовала это с омаром по имени Роско, поместив его в закрытый ящик с двумя дюймами воды, так как дым марихуаны закачивался внутрь.Гилл сказал, что Роско стал более спокойным после того, как закурил. Однако в PETA это не убедило. «Однако есть хорошо зарекомендовавший себя надежный способ предотвратить страдания ракообразных - не есть их».

Мэриленд

Это было «похоже на зону боевых действий», но они все равно выпускают «чертову бумагу»

Стрельба была «похожа на зону боевых действий». Пять сотрудников газеты были убиты, когда вооруженный преступник открыл огонь по Capital Gazette в Аннаполисе. Жертвы: помощник редактора и обозреватель Роб Хиасен, редактор специальных публикаций Венди Винтерс, писатель Джон Макнамара, редактор редакционной страницы Джеральд Фишман и продавец Ребекка Смит.Джаррод Рамос, которому теперь предъявлено обвинение в пяти убийствах, подал в суд на газету из-за статьи 2011 года о его признании вины в домогательствах, и в течение многих лет он развязал в социальных сетях яростную критику газеты и ее сотрудников. Но трагедия не помешала журналистам Capital Gazette выполнять свою работу после того, как их коллеги были убиты, и «выпустить чертову газету» на следующий день. В декабре они вместе с убитым саудовским писателем Джамалом Хашогги и другими журналистами были названы человеком года по версии журнала TIME в 2018 году.

Массачусетс

Скрытые опасности скрываются под стареющими газовыми трубами

Газовая промышленность и государственные регулирующие органы знали об опасностях протечки газопроводов на протяжении десятилетий. Ремонт этих труб не только сложно и дорого, но и иногда опасно. В сентябре бригады коммунальных служб, модернизирующие чугунные трубы, непреднамеренно вызвали пожары и взрывы в трех городах на севере Массачусетса, в результате чего один человек погиб, 21 человек получил ранения и сотни остались без крова.Следователи говорят, что Columbia Gas издала ошибочные рабочие задания, которые способствовали взрывам. Согласно анализу USA TODAY, долина Мерримак, район к северу от Бостона, потрясенный взрывами, обслуживается одними из старейших и наиболее подверженных утечкам труб в стране. в этом году уже потратила 80 миллионов долларов на модернизацию стареющей инфраструктуры.

Взрывы природного газа обнаруживают опасность под нашими ногами

Более двух.Под нашими улицами проходят 2 миллиона миль трубопроводов, по которым природный газ подается в наши дома и на предприятия. Большая часть этой инфраструктуры устарела, устарела или повреждена, а утечки или разрывы могут иметь катастрофические последствия.

Скотт Холл, США СЕГОДНЯ

Мичиган

Арета Франклин: Америка прощается с королевой

Арета Франклин, «Королева души», чья музыка более 50 лет составляла американский песенник, умерла от рака поджелудочной железы в США. Август.Франклин был выдающейся культурной фигурой 20 века. Она пела для президентов и членов королевской семьи и подружилась с такими известными лидерами, как Revs. Мартин Лютер Кинг-младший и Джесси Джексон. Несмотря на всемирный блеск и признание, она оставалась верной своему приемному дому, живя в районе Детройта на протяжении десятилетий. В ее марафоне и 8-часовых похоронах участвовали такие спикеры, как бывший президент Билл Клинтон и легендарный продюсер Клайв Дэвис, а также музыкальные трибьюты Стиви Уандера, Арианы Гранде и Дженнифер Хадсон.Преподобный Аль Шарптон назвал карьеру Франклина саундтреком к движению за гражданские права, заявив: «Мы не все согласны во всем, но мы согласны с Аретой».

Миннесота

Вашингтон приветствует более молодой и разнообразный Конгресс

В исторический промежуточный сезон Миннесота избрала Ильхан Омар в Палату представителей в ноябре, где она будет одной из первых мусульманских женщин в Конгрессе. Омар, бывшая беженка из Сомали, была избрана вместе с Рашидой Тлайб в Мичигане, единственной мусульманкой в ​​Конгрессе.И они были не одиноки, поскольку выборы 2018 года ознаменовались революционными новостями по всей стране. Деб Хааланд и Шарис Дэвидс будут первыми женщинами-индейцами в Конгрессе. Нью-Йорк избрал Александрию Окасио-Кортес, которая станет самой молодой женщиной в Конгрессе. В Колорадо Джаред Полис был первым открытым геем, выигравшим губернаторскую гонку в американской истории. Вот все новинки промежуточных результатов 2018 года.

Миссисипи

В поисках ответов: ФБР возобновляет дело Эмметта Тилля после шести десятилетий

Прошло шестьдесят три года с момента ужасного убийства Эмметта Тилля, но в июле ФБР объявило, что возобновляет расследование исторического происшествия темнокожего подростка. смерть »после получения новой информации.«Тилль был в гостях у родственников в Мани в 1955 году, когда белая женщина, Кэролайн Брайант Донхэм, обвинила его в сексуальных домогательствах. Тело Тилля, избитое и застреленное, было найдено три дня спустя, что вызвало общенациональные дебаты о расе и насилии. Сегодня его семья все еще ищет истину. «Мы хотим, чтобы этот процесс работал, и мы хотим, чтобы справедливость восторжествовала для Эммета», - сказала USA Till Дебора Уоттс, двоюродная сестра Тилля СЕГОДНЯ. «Это нельзя просто забыть».

Миссури

Утка трагедия на лодке: погибло 17 человек, в том числе девять из одной семьи

В июле во время сильного шторма на озере Тейбл-Рок в Брэнсоне перевернулась лодка-амфибия, в результате чего погибли 17 человек, в том числе девять членов той же семьи.«Мое сердце очень тяжело», - сказала Тиа Коулман, потерявшая мужа и троих детей и одна из оставшихся в живых членов семьи Коулманов на борту лодки. Утиные лодки имеют долгую историю серьезных аварий, в результате которых с 1999 года погибли более 40 человек. В рамках расследования инцидента капитану утки было предъявлено обвинение в прошлом месяце. В сентябре Тиа Коулман подала иск против операторов и производителя лодок.

Монтана

Агент пограничной службы опрашивает женщин, говорят ли они по-испански

Two U.Ранее в этом году граждане S. на заправочной станции в северной Монтане были допрошены сотрудником таможни и пограничной службы США за то, что они говорили по-испански. Ана Суда сняла видео встречи, ставшей теперь вирусной, где ее и ее подругу попросили подтвердить личность из-за того, на каком языке они говорили на заправочной станции круглосуточного магазина примерно в 35 милях к югу от границы США и Канады. Суда обвинил агента в расовом профилировании. Отвечая на вопросы об инциденте и о том, следует ли говорить по-испански публично, исполняющий обязанности комиссара CBP Рональд Витиелло позже сказал: «Это не то, о чем люди должны беспокоиться, если они находятся здесь на законных основаниях."

Небраска

« Пожалуйста, прости меня »: первая казнь фентанила в Небраске

Первый человек, казненный в США с применением фентанила, сказал своим свидетелям три последних слова:« Я люблю тебя. Кэри Дин Мур умер 14 августа от смертельной смеси, включающей наркотик, первая такая казнь в Соединенных Штатах и ​​первая смертельная инъекция в Небраске. 60-летний Мур столкнулся со смертью после убийства двух таксистов летом 1979 года. .Противники смертной казни опасались, что смесь с фентанилом - опиоидом, более сильным, чем героин, - могла бы причинить сильную боль, если бы вещества не сработали, как планировалось. В последнем заявлении Мур извинился перед своим братом, свидетелем первого убийства: «Пожалуйста, прости меня как-нибудь, Дон».

Невада

Деннис Хоф - мертвый, напыщенный, законный владелец публичного дома - избран в ассамблею штата Невада

Избиратели Невады выбрали законного сутенера, который умер за несколько недель до этого в ходе ноябрьской гонки в ассамблею штата.Деннис Хоф был известен как яркий и печально известный владелец публичного дома, звезда реалити-шоу, а позже и политик-республиканец. Митинг в поддержку кампании Хофа состоялся всего за несколько часов до его смерти 16 октября в возрасте 72 лет. В нем приняли участие известные консервативные ораторы, в том числе бывший шериф округа Марикопа Джо Арпайо и личность Fox News Такер Карлсон. После его смерти Хоф остался в избирательном бюллетене и одержал легкую победу в гонке округа Ассамблеи. Его победа положила начало длительному и конкурентному процессу назначения на место живого республиканца.

Нью-Гэмпшир

Победитель таинственной лотереи может остаться анонимным

Победитель таинственной лотереи Нью-Гэмпшира, выигравший приз Powerball в размере 560 миллионов долларов, может остаться анонимным, как постановил судья в марте. Женщина выиграла розыгрыш Powerball 6 января, и Генеральная прокуратура штата утверждала, что ее личность должна быть раскрыта, поскольку она поставила свое имя на обратной стороне билета. Женщина, которая подала иск под псевдонимом Джейн Доу, сказала, что совершила «огромную ошибку», поставив свое настоящее имя перед тем, как обратиться к адвокату.Женщина могла бы остаться анонимной, если бы она учредила траст, а затем доверенное лицо подписало бы билет, утверждали ее адвокаты. В октябре билет на еще более крупный приз - колоссальный джекпот Mega Millions в размере 1,537 миллиарда долларов - был продан в Южной Каролине, но в ноябре приз так и не был востребован.

Нью-Джерси

Джерси-Шор вернулся в год перезагрузок

Снуки, Ситуация и остальные актеры Джерси-Шор вернулись для двухсезонной перезагрузки, наполненной большим количеством «утиного лица» и ностальгией по реальности шоу, премьера которого состоялась в 2009 году.Актеры тусовались в Майами-Бич, Флориде и Лас-Вегасе, прежде чем отправиться - куда еще - в Атлантик-Сити. На этот раз актеры имели дело не только с такси, поскольку в сериале затрагивались такие вопросы, как трезвость и отцовство. И Джерси-Шор была не единственной перезагрузкой в ​​этом году. Франшиза Ocean, A Star is Born и жуткий новый взгляд на Сабрину, юную ведьму, вернулись на наши экраны в 2018 году.

Нью-Мексико

Поиск пропавшего ребенка приводит к ужасному комплексу в Нью-Мексико

" Мы голодаем и нуждаемся в пище и воде.«Сообщение изнутри комплекса, похожего на« третий мир »в Нью-Мексико, привело власти к ужасному открытию в августе. Одиннадцать детей были спасены во время поисков трехлетнего мальчика из Джорджии Абдул-Гани Ваххаджа, чей отец якобы похитил Полиция обнаружила детей с группой вооруженных до зубов мусульман, живущих на территории, которой они не владели, в комплексе, построенном из деревянных поддонов, прозрачного пластикового брезента и покрытых грязью покрышек. Позже тело малыша было найдено похороненным на этом месте. Одно из них. Спасенных детей сообщили властям, что лидер группы полагал, что мертвый ребенок будет реинкарнирован, чтобы начать атаку на банки, школы и другие «коррумпированные» учреждения.Теперь пятерым взрослым из лагеря предъявлены обвинения, связанные с огнестрельным оружием, и обвинения в том, что один из членов группы обучал детей и других лиц военной тактике.

Вид с дрона на комплекс в Нью-Мексико, где были обнаружены дети

С дрона открывается вид на комплекс в Нью-Мексико, где были обнаружены 11 детей, живущих в грязи и нищете. Пятеро взрослых были арестованы по обвинению в жестоком обращении с детьми. Власти не подтвердили личность ребенка, останки которого были обнаружены там. (10 августа)

AP

Нью-Йорк

Фонд Трампа закрывается под давлением государства

Превратил ли президент Дональд Трамп свой Фонд Трампа в политический инструмент? Утверждения "достаточно подтверждают утверждение о том, что г.Трамп намеренно использовал активы Фонда в своих личных интересах, зная, что это может быть не в интересах Фонда ", - заявил в прошлом месяце судья Верховного суда Нью-Йорка Салианн Скарпулла в своем постановлении, которое открыло путь для гражданского иска против Фонда Трампа. Это привело к тому, что генеральный прокурор Нью-Йорка Барбара Андервуд заявила, что Трамп использовал фонд как «не более чем чековую книжку» для продвижения своего бизнеса и президентской кампании. Судебный процесс стимулировал расследование налоговой практики организации налоговым департаментом штата, и Фонд Трампа согласился с этим. распустить в декабре.Добавьте к этому предполагаемое уклонение от уплаты налогов и «прямое мошенничество» со стороны семьи Трампа, о чем сообщила New York Times в октябре. Расследование Times вызвало отдельное государственное расследование в отношении Трампа.

Северная Каролина

Наводнение из-за урагана Флоренция опустошает Северную Каролину

Ураган Флоренс вызвал катастрофическое наводнение в Северной Каролине и прилегающих штатах в сентябре, в результате чего был нанесен материальный ущерб на миллиарды долларов и побиты рекордные данные о количестве осадков и наводнений за все время существования Каролины .В результате урагана погибло более 50 человек, несмотря на предупреждения местных властей об эвакуации. Один мэр Северной Каролины предупредил жителей, чтобы они уведомили своих ближайших родственников, если они планируют пережить шторм. После шторма наводнение перекрыло доступ как большим, так и малым городам. После того, как дождь прекратился, жители начали бороться с разрушениями, в том числе тяжелыми потерями для сельского хозяйства и животных. Погибло более миллиона цыплят, туши рыбы нужно было смыть с дорог из шланга, а переполнение свиных отходов привело к отвратительному и опасному беспорядку.

Северная Дакота

Конкурс «Мисс Америка» вызвал споры

Мисс Северная Дакота Кара Мунд выиграла титул «Мисс Америка 2018» - первая из своего штата, получившая корону, - но менее чем за три недели до конкурса 2019 года в сентябре Мунд публично обвинил генерального директора «Мисс Америка» Регину Хоппер и председателя Гретхен Карлсон в издевательствах над ней и заставлении ее замолчать. Карлсон, бывшая победительница конкурса «Мисс Америка» и ведущая телеканала Fox News, сказала, что в результате обвинений организация потеряла $ 75 000 потенциальных стипендий.Организация Мисс Америка предпринимала публичные шаги во имя расширения прав и возможностей женщин, но борьба и разногласия вокруг конкурса стали заголовками с тех пор, как Карлсон объявил, что на церемонии больше не будет соревнований по купальникам, впервые за ее 98-летний юбилей. история. После капитального ремонта конкурс потерял один миллион телезрителей, и многие были недовольны изменениями.

Мисс Америка бросает конкурс купальников

Организация «Мисс Америка» заявляет, что конкурсантки больше не будут оцениваться по внешнему виду.

США СЕГОДНЯ

Огайо

«Они сделали это быстро, холодно, спокойно и очень осторожно»: одна семья якобы убила другую в споре об опеке в Огайо

В ноябре власти Огайо предъявили обвинение шести членам семьи в связи с одним из самые ужасные преступления штата: массовое убийство, в результате которого восемь членов другой семьи погибли в четырех разных местах. Власти утверждают, что спор об опеке над детьми побудил членов семьи Вагнер убить членов семьи Родена в апреле 2016 года, в результате чего некоторые эксперты были ошеломлены тем, что спор об опеке может привести к такому преступлению.«Они сделали это быстро, холодно, спокойно и очень осторожно, но недостаточно осторожно», - сказал о предъявленных обвинениях шериф округа Пайк Чарльз С. Ридер. Четверо членов семьи Вагнера не признали себя виновными по обвинению в убийстве, а двум другим членам семьи предъявлены аналогичные обвинения.

Оклахома

Рано QB выигрывает Heisman, затем приносит свои извинения за старые гомофобные твиты

Кайлер Мюррей стал вторым подряд защитником Оклахомы, выигравшим трофей Heisman Trophy. Но затем всплыли гомофобные твиты, сделанные, когда ему было 15 лет.Мюррей, которому сейчас 21 год, извинился и присоединился к нескольким другим известным спортсменам, которых в 2018 году выставили в негативном свете из-за предыдущей активности в социальных сетях. Джош Хадер из Milwaukee Brewers вновь напомнил о расистских, гомофобных и женоненавистнических твитах. Квотербек Баффало Биллз Джош Аллен видел, как всплывали расистские твиты из подростковых лет до драфта НФЛ. Самый выдающийся игрок «Финала четырех» Виллановы Донте Ди Винченцо написал оскорбительный твит сразу после того, как помог Wildcats выиграть национальный титул. В мире развлечений комик Кевин Харт отказался извиняться в декабре за прошлые оскорбительные твиты, и возникший в результате кризис заставил его отказаться от участия в церемонии вручения «Оскара».

Орегон

Протестующие, которые пытались захватить ICE, были арестованы, поскольку иммиграционная реакция продолжалась

За несколько дней до того, как иммиграционная политика администрации Трампа "нулевой терпимости" вызвала в июне общенациональные марши, протестующие в Орегоне были арестованы после создания временного лагеря. основание иммиграционной и таможенной службы в Портленде. Несколько десятков протестующих выступили против полиции с ненормативной лексикой и скандированием типа «Нет справедливости, нет мира, нет полиции расистского толка»."Федеральная полиция арестовала несколько демонстрантов 28 июня, но протесты и аресты на этом месте продолжались до июля. Реакция была связана с призывами некоторых прогрессивных левых отменить ICE - сообщение, которое помогло продвинуть некоторых демократов, таких как Александрия Окасио- Кортес, к победе в промежуточных матчах. Движение также помогло укрепить позиции некоторых республиканцев, которые выступали против слабости правоохранительных органов.

Пенсильвания

«Нацисты снова здесь»: 11 прихожан застрелены в синагоге «Древо жизни»

Барри Вербер спрятался в кладовой.Иуда Самет опоздал на четыре минуты. Оба пережили самую смертоносную атаку в истории США, направленную на американских евреев, когда бандит, бросавший антисемитские эпитеты, смертельно застрелил 11 человек в субботу в синагоге «Древо жизни» в Питтсбурге. Еще до нападения насилие и преследования еврейского народа и учреждений резко возрастали. По данным Антидиффамационной лиги, в 2017 году в США произошло не менее 1986 инцидентов, мотивированных антиеврейской предвзятостью, включая физические нападения, вандализм и нападения на еврейские учреждения, что на 57 процентов больше, чем годом ранее.

Уцелевший в синагоге Питтсбурга: нацисты снова здесь

Барри Вербер рассказывает о событиях, связанных со стрельбой в синагоге.

Фил Дидион, Цинциннати Enquirer

Род-Айленд

Мексиканский ресторан нагревается из-за футболок против Трампа '86 45 '

Мексиканский ресторан в Вестерли получил некоторую негативную реакцию на продажу футболок, которые, как он утверждает, выступали за импичмент президента Дональд Трамп. Футболки с надписью «86 45» носили работники ресторанов в день выборов.Это был всего лишь один из примеров того, как человек, не включенный в избирательный бюллетень (Трамп), на самом деле был важным фактором в промежуточных выборах этого года. Трамп не побоялся сделать выборы 6 ноября референдумом по нему, проведя огромные митинги в череде красных и колеблющихся штатов и заявив толпе, что голосование за кандидата в местный Сенат или Палату представителей было «голосом за меня». Промежуточные сроки часто представляют собой суждение о действующем президенте, но никогда в наше время ни одна кампания не была настолько сложной, чтобы убедиться в этом.

Южная Каролина

Смертельный тюремный бунт служит сплоченным призывом к реформе

Кровавый семичасовой бунт в исправительном учреждении Ли, тюрьме строгого режима на 1785 коек в сельской местности Южной Каролины, восстановил систему уголовного правосудия штата в центре внимания страны.В результате апрельского рукопашного боя семь заключенных погибли и более десятка получили ранения в результате того, что считается самым смертоносным тюремным бунтом в стране за четверть века. В то время как государственные чиновники приписывали смерть бандам, некоторые возлагали ответственность за вспышку насилия на условия жизни. Пакет реформ уголовного правосудия 2010 года позволил штату закрыть три тюрьмы строгого режима и сократить ежегодные расходы на содержание тюрем из своего бюджета на миллионы долларов, что сделало тюремную систему штата одной из самых дешевых для налогоплательщиков, но также и одной из самых смертоносных для заключенных.В августе общенациональная забастовка заключенных, организованная в ответ на жестокую драку, была направлена ​​на повышение осведомленности об отсутствии в штате программ психического здоровья и реабилитации.

Южная Дакота

Как человек из Южной Дакоты был связан с предполагаемым российским шпионом

Уроженец Вермиллиона Пол Эриксон попал в заголовки национальных газет после того, как в июле в Вашингтоне была арестована и обвинена в суде российская шпионка Мария Бутина, его деловой партнер и соседка по комнате. за якобы стремление использовать политические группы для продвижения интересов России.Когда-то бывший политическим провокатором, Эриксон практически исчез с политической сцены Южной Дакоты в последние годы, но в марте 2015 года Бутина обратилась к американцу, соответствующему его описанию, заявили в прокуратуре. 56-летний Эриксон, как сообщается, помогал вести предполагаемого российского оперативника на собрания Национальной стрелковой ассоциации и консервативных политических групп. И цель Бутиной построить линию связи между Россией и Соединенными Штатами, похоже, увенчалась успехом. Эриксон якобы обеспечивал контакты, а ее направлял российский чиновник.В декабре Бутина признала себя виновной в сговоре с целью действовать в качестве агента Кремля без регистрации в США.

Теннесси

50 лет со дня смерти Кинга: ушел, но никогда не забыт

В апреле тысячи поклонников преподобного Мартина Лютера Кинга собрались у его мемориала, чтобы отметить 50-летие убийства гражданских прав лидер, чье послание ненасилия продолжает находить отклик среди расовых и религиозных разногласий в нашей стране.Кинга застрелили 4 апреля 1968 года, когда он стоял на балконе мотеля Lorraine в Мемфисе. В ночь перед его смертью такие свидетели, как Клара Эстер, слышали, как Кинг почти произнес свою панегирик, сказав, что он видел Землю Обетованную, но он «может не попасть туда с тобой». Тем не менее, некоторые лидеры гражданских прав задаются вопросом, отступают ли США в отношении расовых отношений, говоря, что если бы Кинг был жив сегодня, «он был бы сбит с толку тем, насколько мало что изменилось».

Клара Эстер, видевшая падение Мартина Лютера Кинга-младшего, сделала свою жизнь свидетелем его жизни.

Жизнь Мартина Лютера Кинга изменила Америку. Вот как его смерть изменила его, как видно из жизни молодой женщины, которая находилась в мотеле «Лотарингия», когда в него застрелили 50 лет назад.

Майкл Шваб / США СЕГОДНЯ СЕТЬ - Теннесси

Техас

Войска США на границе с Мексикой, караваны мигрантов: год иммиграции

Большой караван из тысяч мигрантов из Центральной Америки принес иммиграцию вперед и в центр. Администрация Трампа активно использовала варианты ограничения или прямого блокирования возможности мигрантов въезжать в страну, включая отказ в убежище.Президент Дональд Трамп также приказал вывести тысячи военнослужащих на границу США и Мексики. За лето Трамп ввел в действие (а затем отступил) злополучную политику «нулевой терпимости», которая привела к разлучению более чем 2500 семей вдоль границы. В то время взоры всего мира были сосредоточены на небольшом городке Макаллен - городе, где находилась самая загруженная станция пограничного патруля для задержания иммигрантов, подозреваемых в незаконном въезде в страну. В 2018 году USA TODAY Network также выиграла Пулитцеровскую премию за свой проект The Wall, знаменательный многоплатформенный проект, в котором анализировалось обещание кампании Трампа построить стену на U.Граница между Южной и Мексикой.

Почему жители Центральной Америки покидают свои страны в караванах мигрантов

Караваны мигрантов, извивающиеся в сторону США, вновь разжигают риторику и споры об иммиграции и безопасности границ. И это не в первый раз.

США СЕГОДНЯ

Юта

Олимпийцы США тренируются в Юте перед медализацией в Пхенчхане

До того, как сборная США привезла домой 23 медали с зимних Олимпийских игр в Пхенчхане, Южная Корея, ее лыжники и сноубордисты упорно тренировались в Юте.Парк-Сити является домом для Центра передового опыта в лыжах и сноуборде США, где такие звездные спортсмены, как Линдси Вонн, готовились к 23-м Играм. Вонн, которую многие считают лучшей горнолыжницей в истории, вернулась только с одной бронзовой медалью, вундеркинды сноуборд-хафпайп Хлоя Ким и Шон Уайт, возможно, лучшие из тех, кто когда-либо катался на доске, оба принесли домой золото - закрепив статус сноуборда от изгоя до любимец зимних Олимпийских игр.

Вермонт

Вермонт легализует марихуану.В настоящее время существует 10 штатов с легальной марихуаной.

В 2018 году Вермонт стал девятым штатом, легализовавшим рекреационную марихуану, и первым, кто сделал это через законодательный орган штата. (Позже в том же году Мичиган стал 10-м.) Марихуана стала крупным бизнесом в других штатах, которые легализовали ее, принося примерно 1,6 миллиарда долларов налоговых поступлений. Но Вермонт придерживается другого подхода. Штат продолжит запрещать продажу марихуаны широкой публике, а закон оставляет открытым неясный вопрос о «дарении марихуаны».«В Массачусетсе, который легализовал марихуану в 2016 году, штат открыл свои первые коммерческие магазины марихуаны в ноябре.

Вирджиния

Amazon выбирает Вирджинию и Нью-Йорк для строительства двух новых штаб-квартир

Алекса, что такое National Landing? Ответом будет место расположения половины штаб-квартиры Amazon 2. Технологический гигант выбрал регион Северная Вирджиния, охватывающий округ Арлингтон и город Александрия, и Лонг-Айленд-Сити, штат Нью-Йорк, в качестве мест расположения двух своих новых штаб-квартир.Ноябрьское объявление было сделано после 14 месяцев напряженной борьбы более чем 230 городов, борющихся за честь принять у себя вторую штаб-квартиру Amazon. Ожидается, что Amazon создаст 25 000 высокооплачиваемых рабочих мест и вложит 2,5 миллиарда долларов в каждое место. Это решение заставило многие города задуматься о том, что могло бы быть, и нынешние жители опасались, что их новые соседи могут принести кошмары общественного транспорта и взлетать цены на жилье. При генеральном директоре Джеффе Безосе, который сейчас является самым богатым человеком в мире с собственным капиталом около 166 миллиардов долларов, Amazon также стала второй публично торгуемой компанией в США.S. с биржевой стоимостью выше 1 триллиона долларов в этом году.

Вашингтон

Год, когда люди решили, что пластиковая соломинка - отстой

Дни пластиковой соломки сочтены. В июле Сиэтл стал одним из крупнейших городов, где запретили использование пластиковых соломинок. Кофейный гигант Starbucks со штаб-квартирой в штате Вашингтон заявил, что к 2020 году также откажется от использования пластиковых соломинок. А некоторые сети, такие как Red Lobster, предпочитают выдавать пластиковые соломинки только по запросу. Эти изменения являются частью растущей национальной тенденции избавляться от того, что некоторые считают экологическим мусором.Некоммерческая группа Sailors for the Sea сообщила, что пластиковые соломинки входят в десятку самых крупных морских отходов, собранных во время International Coastal Cleanup. Но мы, кажется, действительно любим их: согласно данным Eco-Cycle, американцы ежедневно используют около 500 миллионов одноразовых соломинок. К счастью, у нас есть множество экологически чистых альтернатив.

Западная Вирджиния

«Нет стимула оставаться, кроме этого дома»: забастовка учителей Западной Вирджинии

Педагоги в Западной Вирджинии объявили забастовку в течение девяти дней в феврале и марте, привлекая всеобщее внимание и заставляя школу закрытие по всему штату с более чем 30 000 учителей и вспомогательного персонала, требующих повышения заработной платы.Губернатор Джим Джордан подписал контракт о пятипроцентном повышении для учителей штата, но зарплаты учителей в Западной Вирджинии по-прежнему остаются одними из самых низких в стране, по данным Американской федерации учителей. Между тем недовольство учителей по всей стране в этом году резко возросло, поскольку преподаватели изо всех сил старались не отставать от первых дней и оплачивать школьные принадлежности из собственных карманов. От Аризоны до Кентукки вспыхнули аналогичные протесты с требованиями повышения заработной платы и льгот.

Американские учителя сталкиваются с огромным давлением, включая нехватку времени.

Их страсть к обучению и детям, возможно, единственное, что удерживает их в профессии.Провел день с учителями по всей Америке.

Джаррад Хендерсон, USA Today

Висконсин

Висконсин остался в шоке от торговых войн Трампа

Немногие штаты попали под перекрестный огонь торговых войн президента Дональда Трампа больше, чем Висконсин. «Это была катастрофа», - сказал в октябре Роб Парментье, генеральный директор производителя лодок в Висконсине. Ответные пошлины из Китая, Европы, Канады и Мексики стали ответом на тарифы Трампа на иностранную сталь и алюминий.Эти торговые барьеры повлияли на все, от производства до фермерства, в том числе на культовую молочную промышленность штата: летом резко упали оптовые цены на сыр и масло, поскольку фермеры столкнулись с переизбытком молока и трениями в отношениях с двумя основными торговыми партнерами Висконсина, Канадой и Мексикой. Спикер Палаты представителей Пол Райан призвал других жителей штата Висконсин «проявить терпение» с тарифами. Между тем, по всему штату закрылись сотни молочных ферм - около 430 к сентябрю.

Вайоминг

Прах Мэтью Шепарда нашел дом

Через двадцать лет после смерти Мэтью Шепарда его прах нашел дом в Вашингтонском национальном соборе.Шепард стал международным символом насилия, с которым сталкиваются ЛГБТ-люди в Америке после его смерти в 1998 году, когда двое мужчин жестоко избили его, а затем привязали к забору возле Ларами. В своих признаниях нападавшие заявили, что нацелены на Шепарда, потому что он был геем. После смерти Шепарда однополые браки были легализованы, как и возможность американцев-трансгендеров служить в армии. Но защитники ЛГБТК говорят, что нужно сделать больше. «Насилие против нас продолжается и по сей день», - сказал Rt.Преподобный В. Джин Робинсон, бывший епископ, открытый гомосексуалистом, председательствовал на службе в память о Шепарде в октябре.

Округ Колумбия

Кэпс претендует на Кубок округа

Вашингтон Кэпиталз завершил более чем 20-летнюю засуху округа Колумбия без крупного профессионального титула, когда команда выиграла Вегас Голден Найтс в финале Кубка Стэнли в июне. После победы команды со счетом 4: 3 в пятой игре, после которой через несколько дней последовал пьяный парад чемпионата и митинг на Национальной аллее, на улицах столицы страны царила настоящая паника.Победа также ознаменовала собой первый титул Кубка Стэнли в 44-летней истории франшизы, а великий Алекс Овечкин выиграл Conn Smythe Trophy как MVP плей-офф, возглавив свою команду с 15 голами в постсезонке.

Это сборник рассказов из США СЕГОДНЯ и сети США СЕГОДНЯ.

Источники: Алия Дастагир, Джош Хафнер, Эшли Мэй, Райан Миллер, Бретт Молина, Марина Питофски, Кара Ричардсон, Джоэл Шеннон, Чарльз Вентура и Н'деа Янси-Брэгг

Информационное агентство: The Associated Press

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Специфичность передачи сигналов дигуанилатциклазы

Annu Rev Microbiol.Авторская рукопись; доступно в PMC 5 мая 2018 г.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC5936083

NIHMSID: NIHMS962740

Департамент микробиологии и иммунологии, Медицинская школа Гейзеля в Дартмуте, Ганновер, Нью-Хэмпс, 037 другие статьи в PMC, цитирующие опубликованную статью.

Abstract

Циклический дигуанилат (c-di-GMP) представляет собой почти универсальную сигнальную молекулу, продуцируемую дигуанилатциклазами, которая может управлять разнообразным поведением бактерий.Основная область исследований за последние несколько лет была направлена ​​на понимание того, как клетка с десятками дигуанилатциклаз может задействовать заданное их подмножество для получения желаемого фенотипического результата без нежелательных перекрестных помех между c-di-GMP-зависимыми системами. Для решения этого вопроса было предложено несколько моделей, включая специфичность активации циклазы, настроенные константы связывания эффекторных белков и физическое взаимодействие между циклазами и эффекторами. Кроме того, недавние данные позволили предположить, что может существовать связь между каталитическим состоянием циклазы и ее физическим контактом с эффектором.В этом обзоре освещается несколько ключевых исследований, исследуются предлагаемые глобальные и локальные модели специфичности передачи сигналов c-di-GMP у бактерий и делается попытка определить наиболее плодотворные шаги, которые могут быть предприняты для лучшего понимания того, как возникают динамические сети родственных циклаз и эффекторных белков. в разумных выходных данных, которые управляют клеточным поведением.

Ключевые слова: циклический дигуанилат, c-di-GMP, дигуанилатциклаза, сигнальная специфичность, биопленки

ВВЕДЕНИЕ

За последние несколько десятилетий циклический дигуанилат (c-di-GMP) был признан основным вторичным сигналом. молекула в бактериальном домене.Возможно, это один из наиболее хорошо изученных примеров того, как бактерии собирают информацию об окружающей среде и обрабатывают эту информацию для выполнения клеточных операций. История его открытия и участия в огромном количестве клеточных процессов хорошо изучена (28, 52, 57). Вкратце, современная парадигма включает белки, называемые дигуанилатциклазами (DGC), циклизующие две молекулы GTP с образованием c-di-GMP, который затем может найти эффектор. Этот эффектор, в свою очередь, может связывать c-di-GMP и в результате инициировать некоторые последующие клеточные действия.c-ди-GMP может разлагаться белками, называемыми фосфодиэстеразами (PDE). DGC и PDE работают противоположно, обеспечивая уровень c-di-GMP, который может активировать эффекторные белки, которые могут влиять на клеточные процессы, включая образование биопленок, подвижность, активацию вирулентности, транскрипцию, макромолекулярный синтез, стрессовые реакции и многие другие (34, 39, 61).

В центре внимания этого обзора - ключевой шаг c-di-GMP из данной циклазы, обнаруживающий ее эффекторный белок. Поскольку эта парадигма была исследована на все большем количестве бактерий, было обнаружено, что многие микробы содержат удивительное количество DGC и PDE, в некоторых случаях их число превышает 60 (23).Важно отметить, что, несмотря на огромное количество работающих DGC, многие исследования продемонстрировали, что большинство DGC, по-видимому, специфически сигнализируют об одном или двух c-di-GMP-зависимых процессах, указывая на какой-то механизм (ы), который позволяет активировать данный DGC. специфический эффектор (25, 43, 47, 66, 67). Эти наблюдения вызвали противоречие между идеей о том, что эффекторы могут воспринимать сигнал c-di-GMP от определенного DGC, и идеей о том, что любой из DGC образует ту же небольшую, способную к диффузии молекулу, что и его родственные ферменты в открытом пространстве бактериальная цитоплазма.Данные нескольких бактериальных систем дали повод к различным интерпретациям этого феномена, что привело к нескольким возможным моделям придания сигнальной специфичности (). Здесь мы исследуем эти модели с точки зрения того, какие наблюдения каждая из них может описать и как они могут в конечном итоге соответствовать друг другу. Мы также исследуем конкретные случаи специфичности DGC и новые работы, предлагающие будущие пути, которые откроют более полное понимание того, как бактерии используют сети на основе c-di-GMP для модуляции многих аспектов своего поведения.

Режимы специфичности сигнализации c-di-GMP. Было предложено множество моделей для объяснения специфичности передачи сигналов данного DGC для конкретного клеточного процесса. ( a ) В глобальной модели сигнальной специфичности разные DGC продуцируют различные количества c-di-GMP, которые вносят вклад в глобальный пул, а PDE могут уменьшать количество глобального пула. Первыми активируются эффекторы с наименьшей константой диссоциации. По мере увеличения глобального пула c-di-GMP активируются эффекторы с более высокими константами диссоциации.( b ) Локальные модели передачи сигналов c-di-GMP могут работать на нескольких различных принципах. DGC, которые находятся в непосредственной близости от эффекторов, но не обязательно взаимодействуют с ними, могут создавать локальный пул c-di-GMP, который может активировать целевые белки, тогда как PDE могут нести ответственность за удержание локального пула c-di-GMP от воздействия на другие эффекторы. ( осталось ). Альтернативно, прямое взаимодействие между DGC, эффекторами и PDE может приводить к функциональным комплексам. Состояние эффектора зависит от состояния активации ферментов DGC или PDE.Кроме того, на каталитическую скорость DGC может влиять физическое взаимодействие с его партнерами ( справа ).

КОМПОНЕНТЫ СИГНАЛИЗАЦИИ C-DI-GMP

DGC работают как димеры, используя свои домены GGDEF для производства c-di-GMP. Тезка домена представляет собой каталитические остатки, которые они используют для осуществления синтеза c-di-GMP, но в дополнение к GGDEF были обнаружены также активные циклазы, которые используют мотивы GGEEF, AGDEF и GGDEM. DGC, использующие SGDEF, также были обнаружены у эукариот (12).В дополнение к их каталитическим остаткам примерно половина доменов GGDEF также содержит остатки, связанные с аутоингибиторным сайтом (I-сайтом). Эти остатки включают RXXD, называемый первичным I-сайтом, который связывает c-di-GMP и подавляет каталитическую активность фермента при связывании (). Домен GGDEF может существовать независимо или может быть слит с множеством других доменов, включая PAS, CACHE, CHASE, MASE и домены регулятора ответа (1, 18, 23). PDE, разрушающие c-di-GMP, бывают двух видов.Многие PDE используют домены EAL для деградации c-di-GMP, в то время как другие содержат домены HD-GYP (8, 16, 55, 63). Белок, который имеет домены GGDEF и EAL, может действовать как DGC, PDE или оба в зависимости от обстоятельств. Кроме того, не все домены GGDEF и EAL каталитически активны, и мы вернемся к этому вопросу в следующем разделе. Наконец, DGC или PDE могут быть обнаружены в цитоплазме или могут содержать трансмембранные домены, прикрепляющие их к внутренней мембране.

Компоненты домена GGDEF РСК.Кристаллическая структура домена GGDEF GcbC. Аминокислотный каркас показан в виде ленты и наложен на электростатическую поверхность. Так называемые домены GGDEF (которые также могут иметь мотив GGEEF) катализируют циклизацию двух молекул GTP в c-di-GMP с использованием каталитически активного кармана (остатки GGEEF показаны желтым, слева, ). Домен GGDEF контактирует со своим эффекторным LapD с помощью N-концевой части спирали α5 GGDEF , показанной голубым ( слева, ).Первичный I-сайт, показанный справа фиолетовым цветом, используется для подавления каталитической активности, когда c-di-GMP связывается с карманом I-сайта. GcbC имеет мотив RRxxD в качестве своего первичного I-сайта, а остаток R366 составляет вторичный I-сайт ( слева от ), который работает вместе с первичным I-сайтом для связывания c-di-GMP.

Центральными элементами передачи сигналов c-di-GMP являются те эффекторы, как белки, так и РНК, которые могут связывать c-di-GMP и в результате заставлять клетку предпринимать определенные действия. Эти датчики c-di-GMP позволяют преобразовывать сигналы окружающей среды во вторичные мессенджеры и интегрировать их в разумный выходной сигнал.Первым клеточным процессом, который, как было установлено, аллостерически активируется c-di-GMP, был синтез целлюлозы через целлюлозосинтазу из Komagataeibacter xylinus (53, 54), но потребовался крупномасштабный анализ множества бактерий, чтобы признать это Связывание c-ди-GMP комплекса целлюлозосинтазы происходит в домене PilZ (3). С этого периода домены PilZ были обнаружены во всем бактериальном домене, и также известно, что они регулируют подвижность у различных видов бактерий, включая отдельные примеры у нескольких энтеробактерий (56), Caulobacter crescentus (15) и Pseudomonas aeruginosa ( 2, 40), помимо вирулентности у Vibrio cholerae (49).Позднее была выяснена структура домена PilZ, и было обнаружено, что он связывает c-di-GMP с использованием мотивов RxxxR и DxSxxG (26, 51), с дальнейшим пониманием того, что домен PilZ может подвергаться структурным перестройкам для передачи c- событие связывания ди-GMP с нижележащими белками (58).

Важно отметить, что обнаружение широко распространенных циклаз и PDE, кодируемых по всему бактериальному домену, в сочетании с осознанием того, что не все c-di-GMP-зависимые процессы могут быть объяснены белками, содержащими PilZ-домен, привело к поиску эффекторного белки, которые могли связывать c-di-GMP, но не были связаны с доменом PilZ.Вскоре после того, как домен PilZ стал понятен на структурном уровне, было обнаружено, что второй класс белков может связываться с c-di-GMP. Одним из ярких примеров этого класса был белок PelD из P. aeruginosa . PelD, необходимый для образования пленки, содержит вырожденный домен GGDEF, но использует интактный ингибиторный сайт для связывания c-di-GMP и действует как эффектор (37). В настоящее время предполагается, что конформационные сдвиги в PelD при связывании c-di-GMP в значительной степени ответственны за сигнальные способности этого белка (57).

Одновременно с открытием того, что вырожденные ферменты, продуцирующие c-di-GMP, могут действовать как эффекторы, Newell et al. (46) идентифицировали вырожденный белок, содержащий EAL-домен, LapD, как рецептор c-di-GMP в исследовании 2009 года. Учитывая, что первый шаг, который должен предпринять PDE, - это связывание c-di-GMP, возможно, неудивительно, что вырожденный домен EAL может участвовать в связывании c-di-GMP. С тех пор LapD из Pseudomonas fluorescens (обсуждается ниже) стал прототипом вырожденного белка, содержащего двойной домен GGDEF / EAL, который может связывать c-di-GMP через его несуществующий домен EAL (45, 46).

Совсем недавно было обнаружено несколько уникальных видов связывающих c-di-GMP белков, которые не являются ни доменами PilZ, ни вырожденными версиями ферментов c-di-GMP. Фактор транскрипции VpsT из V. cholerae , по-видимому, связывает c-di-GMP через мотив W [F / L / M] [T / S] R, что приводит к изменению олигомеризации, что позволяет этому фактору транскрипции регулировать образование биопленок. и моторика (32). Еще два примера эффекторов связывания c-di-GMP, которые, по-видимому, регулируют образование биопленок посредством транскрипции, - это FleQ из P.aeruginosa и Bcam1349 из Burkholderia cenocepacia (22, 29). Хотя способ связывания FleQ c-di-GMP был недавно описан, мотив, используемый для связывания c-di-GMP в Bcam1349, все еще неизвестен, хотя c-di-GMP, по-видимому, усиливает связывание Bcam1349 с ДНК (22 , 41). Наконец, сама РНК была признана эффектором, который может связывать c-di-GMP, обеспечивая еще одну мишень для изучения на организмах, которые, по-видимому, имеют большое количество DGC и PDE, закодированных в их геномах, но которые ранее имели меньше идентифицированных эффекторов.Сударсан и др. (62) впервые распознали домен РНК, который они назвали GEMM, расположенный выше открытых рамок считывания некоторых DGC, PDE и генов, регулируемых c-di-GMP у различных бактерий. За этим открытием вскоре последовало открытие второго класса рибопереключателей, в которых использовался самоприправляющий рибозим группы I для связывания c-di-GMP в псевдоузле с целью регулирования вирулентности в Clostridium difficile (36, 60). Возникает ли и как специфичность между DGCs и рибопереключателями, остается неизвестным.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ, ВЫВОДНАЯ ОТ АКТИВНОСТИ ЦИКЛАЗ

Возможно, наиболее простой способ достижения специфичности между данной циклазой и клеточным процессом - это активация данной циклазы в желаемое время.Хотя многие DGCs имеют предполагаемые сенсорные домены, прикрепленные к домену GGDEF, было идентифицировано относительно немного субстратов. Двумя яркими примерами DGC, где этот шаг был решен, являются DGC, называемый DosC, и PDE, называемый DosP, в E. coli ; каждый из них воспринимает кислород, первый - через модифицированный глобиновый домен, а второй - через гем-связывающий домен PAS (65). Вместе эти ферменты регулируют уровень c-di-GMP, продуцируемого в ответ на молекулярный кислород. Напротив, цинк связывается с ранее не охарактеризованным регуляторным доменом DgcZ в E.coli , что приводит к нарушению выравнивания доменов GGDEF и ингибированию циклизации GTP (69). Еще один интересный пример такого рода регулирования можно найти в исследовании, проведенном в 2015 г. в исследовании V. cholerae A1552. Этот штамм образует биопленку при 15 ° C и имеет 31 предсказанный белок, содержащий домен GGDEF. Когда были протестированы делеции в рамке считывания всех 31 гена, было обнаружено, что только 6 DGC аддитивно ответственны за температурно-зависимое увеличение c-di-GMP, наблюдаемое при 15 ° C по сравнению с 37 ° C, хотя до сих пор неизвестно, почему эти 6 ферментов, а не другие 25, по-видимому, чувствуют изменение температуры (64).Вместе эти находки помогают объяснить, как данный DGC может быть связан с конкретным фенотипом, но они не полностью отвечают на вопрос, как задействован только данный эффекторный белок.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ, ПРОИЗВОДНАЯ ОТ АФФИНИЧНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ ЭФФЕКТОРА

Многие исследования были сосредоточены на понимании организации и интеграции сигнала c-di-GMP, генерируемого DGC, с намеченными эффекторами в зависимости от каталитической скорости DGC и аффинности связывания эффектора. Такая идея допускает специфичность между данным DGC и эффектором на расстоянии и создает то, что мы называем здесь глобальной сигнальной моделью ().В 2012 году Pultz et al. (50) отметили, что в сероваре Typhimurium Salmonella enterica имеется 3 известных c-di-GMP-зависимых фенотипа, 2 белка, содержащие PilZ-домен, и 20 возможных DGC / PDE. Они обнаружили более чем 40-кратную разницу в аффинности связывания с c-di-GMP между YcgR и BcsA, эффекторами для остановки подвижности и синтеза целлюлозы, соответственно. Кроме того, они смогли продемонстрировать, что различие в связывании c-di-GMP было частично связано с остатками рядом с мотивом связывания RxxxR, и что внесение замен в эти остатки может увеличить или уменьшить их сродство к c-di-GMP с сопутствующим действием. фенотипические последствия.Эти результаты побудили предложить глобальную сигнальную модель, в которой некоторые DGC ответственны за первый, базовый уровень продукции c-di-GMP, что приводит к ингибированию генерации крутящего момента жгутиков через YcgR (и, следовательно, к снижению подвижности), за которым следует более высокий уровень. всплеск продукции c-di-GMP вплоть до активации BcsA и последующего синтеза целлюлозы.

Аналогичным образом, константы связывания доменов PilZ в P. aeruginosa показали широкий диапазон аффинностей связывания для c-di-GMP в пределах этого вида, причем некоторые из них различались более чем в 140 раз, что свидетельствует о том, что глобальные уровни c- di-GMP может частично отвечать за специфичность клеточного выхода в силу способности различных эффекторов иметь различную чувствительность к молекуле (17, 21, 42, 50).В дополнение к этим наблюдениям Pultz et al. (50) выдвинули идеи о том, как клетка может модулировать, какие активированные эффекторы функционируют при высоких глобальных уровнях c-di-GMP. Например, было обнаружено, что некоторые домены PilZ имеют несколько сайтов связывания для c-di-GMP, и была выдвинута гипотеза, что они могут использовать сайт связывания в качестве полосы пропускания, что может позволить эффектору работать в определенном диапазоне c-di-GMP. -di-GMP и не выше или ниже этого диапазона (50). Хотя эта концепция никогда не была экспериментально продемонстрирована, ее стоит изучить.

Другие кандидаты на глобальную передачу сигналов c-di-GMP включают организмы с относительно небольшим количеством DGC, такие как Ehrlichia chaffeensis , у которого есть единственный известный DGC, ответственный за регуляцию инвазии моноцитов (35). Аналогичным образом, недавнее исследование Listeria monocytogenes выявило три DGC, которые, по-видимому, работают синергетически, вызывая вирулентность, и три PDE, каждый из которых имеет разную скорость деградации c-di-GMP (11). Единственный известный DGC Borrelia burgdorferi необходим для выживания через клещевого вектора, хотя и не обязателен для инфицирования людей (27).Было отмечено, что облигатные бактериальные патогены, как правило, имеют меньше DGC, чем свободноживущие организмы (4). Хотя этот паттерн не без исключения, он может помочь объяснить потребность некоторых бактерий в большем или меньшем количестве ферментов в их сигнальном механизме c-di-GMP, с организмами, которые видят более разнообразную среду, требующую большей степени регуляции.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ, ВЫВОДНАЯ ФИЗИЧЕСКИМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕМ

В отличие от модели глобальной передачи сигналов, описанной выше, другие исследования были сосредоточены на возможности того, что данная циклаза и эффектор могут физически взаимодействовать, при этом циклаза по существу доставляет c-di-GMP к желаемый эффекторный белок напрямую ().Мы называем эту возможность локальной сигнальной моделью. В последние годы появилось несколько наблюдений, подтверждающих такую ​​концепцию. Было показано, что P. aeruginosa DGC WspR образует кластерные пятна в цитоплазме при активации фосфорилированием, что является одним из первых наблюдений, свидетельствующих о возможности компартментализации передачи сигналов c-di-GMP (24). Другие сообщения продемонстрировали физическое взаимодействие между компонентами передачи сигналов c-di-GMP. Например, было отмечено, что связанный с c-di-GMP эффектор YcgR в Escherichia coli взаимодействует с FliG и FliM, чтобы контролировать торможение жгутиков (48).Кроме того, было показано, что DGC DosC и PDE DosP, обсужденные выше, образуют комплекс друг с другом, открывая возможность того, что DGC и PDE могут работать вместе как комплекс, чтобы регулировать, сколько c-di-GMP доступно для активации эффектора. (65).

Хотя приведенные выше примеры демонстрируют, что члены сети c-di-GMP у бактерий могут взаимодействовать, они не решают, как такие взаимодействия могут приводить к специфичности передачи сигналов. Одна безупречная попытка ответить на этот вопрос была предпринята в исследовании, проведенном Lindenberg et al.в 2013 г. (38), которые показали, что сигнальные модули c-di-GMP могут работать каскадом (). Эти исследователи продемонстрировали, что одна пара DGC / PDE в E. coli , YegE и YhjH, может регулировать следующую пару DGC / PDE в каскаде, YdaM и YciR (38). Таким образом, PDE YciR действует как так называемый триггерный фермент, репрессируя YdaM DGC до тех пор, пока c-di-GMP из вышележащего YegE DGC не связывается и не деградирует, оставляя YdaM свободным для воздействия на нижестоящие пути, включая активацию MlrA и транскрипция csgD , что приводит к стимулированию образования биопленок.Важно отметить, что вторая половина этого каскада, как было обнаружено, основывается на множественных физических взаимодействиях между DGC, PDE и эффектором фактора транскрипции. Было обнаружено, что PDE YciR осуществляет несколько сильных взаимодействий через свой домен EAL с DGC YdaM и эффекторным MlrA, делая возможным, что само физическое взаимодействие блокирует дальнейшую активацию пути до тех пор, пока YciR не свяжется и не разрушит c-di-GMP из YegE. Кроме того, только в отсутствие YciR наблюдались сильные взаимодействия между доменом YdaM GGDEF и MlrA (38).Это исследование подчеркивает важность физического взаимодействия для специфичности мишени, демонстрируя, что физическое взаимодействие может быть важным как для ингибирования, так и для активации последующих мишеней. YegE продуцирует c-di-GMP, который, по-видимому, вступает в контакт с ингибированным нижестоящим комплексом, но c-di-GMP недостаточно для полной активации MlrA. YdaM, напротив, способен сильно взаимодействовать с MlrA только тогда, когда YciR расположен иначе, и в этот момент передача сигналов опосредуется физическим взаимодействием.

Триггерная ферментная система Escherichia coli . Глобальный пул c-di-GMP частично контролируется DGC YegE и PDE YhjH. Когда пул c-di-GMP низкий, триггерный фермент и PDE YciR связывают DGC YdaM и его мишень, фактор транскрипции MlrA ( жирных стрелок ), предотвращая активацию YdaM MlrA. Когда пул c-di-GMP высок, YciR деградирует c-di-GMP и высвобождает YdaM и MlrA в процессе, что приводит к активации YdaM MlrA и дальнейшему вкладу в глобальный пул c-di-GMP ( синяя стрелка ).По материалам Lindenberg et al. (38).

Хотя это исследование осветило способы, которыми DGCs, PDEs и эффекторы могут использовать физическое взаимодействие для регуляции передачи сигналов c-di-GMP, оно открыло дверь для нескольких более важных вопросов. Во-первых, неясно, как происходят взаимодействия между исследованными белками, и, как обсуждает группа Hengge (38), особенно сбивает с толку то, что несколько изолированных доменов взаимодействуют с множественными изолированными доменами своих партнеров. Можно ли обнаружить более дискретный интерфейс? Во-вторых, было определено, что хотя физическое взаимодействие DGC YdaM было необходимо для активации фактора транскрипции MlrA, каталитическая активность YdaM, по-видимому, вносила лишь незначительный вклад в активацию MlrA.Далее было определено, что MlrA, по-видимому, не связывает c-di-GMP определенным образом (38). В результате все еще оставалось неясным, имеет ли значение физическое взаимодействие с точки зрения доставки c-di-GMP к конкретному эффектору, а не к другим мишеням.

Обсуждение системы YegE / YhjH / YdaM / YciR / MlrA подняло следующий вопрос: может ли специфичность передачи сигналов быть достигнута посредством доставки c-di-GMP в эффектор как прямой результат физического взаимодействия между DGC и указанным эффектором? Система Lap P.fluorescens - хорошо задокументированный случай такой возможной прямой передачи обслуживания. Система Lap является одним из наиболее изученных примеров эффекторной цепи c-di-GMP, которая понимается от уровня продукции c-di-GMP до эффекторной активации нижестоящих белков, оказывающих свое влияние на клеточные процессы (). Гены Lap, составляющие контрольный переключатель для образования биопленок, включают большой адгезин LapA на внешней мембране; периплазматическая протеаза LapG; эффекторный белок LapD; и предполагаемый переносчик ABC, ответственный за секрецию LapA.Транспортер ABC включает LapB, LapC и LapE, которые соответствуют АТФазе цитоплазматической мембраны, переносчику внутренней мембраны и гибридному белку внешней мембраны соответственно (30). Ответственный за контроль образования биопленок у P. fluorescens , LapD представляет собой двухдоменный эффектор внутренней мембраны с несуществующими доменами GGDEF и EAL (46). Когда c-di-GMP связывается с доменом EAL, LapD претерпевает структурные изменения, транслируемые через его цитоплазматический домен HAMP в его периплазматический домен (45).Это структурное изменение контролирует развитие образования биопленок за счет секвестрации периплазматической протеазы LapG. LapG представляет собой цистеиновую протеазу, которая может связывать Ca 2+ через остатки D134 и E136. Связывание Ca 2+ с помощью LapG необходимо как для его активности в качестве протеазы, так и для его связывания с активированным LapD (5). Кристаллическая структура Legionella pneumophila LapG была первой, которая пролила механистическое понимание домена DUF920, консервативного в гомологах LapG.Важно отметить, что консервативная каталитическая триада C-H-D была идентифицирована и обнаружена у многих других видов, содержащих гомологи LapG (9). Расщепление LapA с помощью LapG требует консервативного двойного аланинового мотива в положениях 108-109 на N конце LapA. Связывание LapG с LapD зависит от высококонсервативного остатка триптофана на LapD, который вставляется в гидрофобный карман на LapG, что в первую очередь зависит от комплементарности формы (10).

Система Lap Pseudomonas fluorescens .( a ) Упрощенная модель активированной системы Lap. Большой адгезин LapA перемещается через аппарат секреции типа I, состоящий из LapBCE. Пока LapD остается связанным c-di-GMP, он изолирует периплазматическую протеазу LapG. ( b ) Это связывание LapD-LapG предотвращает расщепление LapG N-конца LapA, и образование биопленки может начаться через прилипание LapA к субстрату. Низкие уровни c-di-GMP приводят к белку LapD, неспособному изолировать LapG, опосредованному LapG расщеплению N-концевых 107 аминокислот LapA, потере LapA с поверхности клетки и снижению образования биопленок.От Boyd & O’Toole (6).

Система Lap образует хорошо изученную схему, впервые выясненную при изучении образования биопленок у P. fluorescens в присутствии высоких и низких уровней неорганического фосфата (44). Когда концентрации фосфата высоки, c-di-GMP способен связывать LapD, заставляя LapD принимать свою активную конформацию и связывать LapG через свой периплазматический домен. При секвестрации LapG неспособен отщепить большой адгезин LapA от внешней мембраны. Затем LapA дают возможность накапливаться на клеточной поверхности; LapA придерживается разнообразных поверхностей, частично за счет использования своей центральной повторяющейся области (7).Пока LapA остается на поверхности бактерии, этот адгезин может участвовать в необратимом прикреплении к субстрату. Напротив, в условиях низкого уровня неорганического фосфата ген rapA , кодирующий PDE, активируется транскрипционно, разрушая c-di-GMP и заставляя LapD принимать его неактивное состояние, высвобождая LapG и обеспечивая протеолиз адгезина LapA. Хотя неясно, встречается ли эта система у других родов бактерий, опероны, содержащие гомологи LapD и LapG, были обнаружены у многих бактерий, и исследования показали, что LapG из L.pneumophila может расщеплять LapA и связываться с LapD P. fluorescens (9, 10).

В то время как нижестоящий механизм воздействия LapD на образование биопленок достаточно хорошо охарактеризован, работа вышестоящего сигнального механизма c-di-GMP оставалась несколько неуловимой до недавнего времени. В дополнение к незнанию каких-либо факторов окружающей среды, запускающих передачу сигналов c-di-GMP, кроме фосфата, было неясно, какие из белков, содержащих домен GGDEF, и белков, содержащих домен EAL, участвовали в передаче сигналов до 2011 года, когда Newell et al. .(47) создали мутации каждого канонического синтезирующего или разлагающего c-di-GMP фермента, предсказанного в геноме P. fluorescens . Это исследование выявило четыре DGC, которые, по-видимому, влияли на формирование биопленок в минимальной среде, содержащей глицерин и триптон, два из которых действовали в зависимости от LapD (47). Было показано, что эти DGC, GcbB и GcbC, передают сигнал через LapD путем мониторинга фракций LapA, удерживаемых или отщепляемых с поверхности клетки в ответ на активность GcbB и GcbC.В том же исследовании был выявлен еще один DGC, который влияет на образование биопленок посредством регуляции подвижности, и пять PDE, нарушение которых вызывает повышенное образование биопленок. Учитывая, что существует примерно 42 предсказанных фермента c-di-GMP в P. fluorescens , эти результаты подняли два важных вопроса: как эти DGC и PDE действуют независимо от своих родственных ферментов для определения цели и какова роль более крупная сеть во время этих сигнальных событий?

В двух недавних исследованиях нашей лаборатории мы попытались ответить на вопрос, каким образом DGC может передавать конкретный сигнал LapD.В первом исследовании мы продемонстрировали, что GcbC физически взаимодействует с LapD и что это физическое взаимодействие напрямую связано с сигнальной способностью (19). Это открытие было значительным, поскольку оно представляет собой пример DGC, который использует физическое взаимодействие для доставки c-di-GMP к желаемой цели (). В процессе определения того, что эти белки взаимодействуют, мы попытались провести анализ на уровне доменов, чтобы выяснить, какие домены GcbC и LapD были ответственны за взаимодействие. Мы обнаружили только полноразмерные белки каждого из них, способные взаимодействовать в наших анализах.Мы рассматривали этот результат как указание на одну из двух возможностей. Во-первых, это может означать, что существует множество поверхностей взаимодействия, распределенных по белкам, гипотеза, подтвержденная доказательствами, обсуждаемыми ниже. Во-вторых, также возможно, что белки должны принимать определенные структурные конформации, чтобы иметь возможность взаимодействовать друг с другом, для чего требуется полноразмерный белок. Эта последняя идея привлекает внимание к домену HAMP, присутствующему в LapD, который, как известно, обеспечивает конформационные сдвиги, когда LapD связывает c-di-GMP.

GcbC физически доставляет c-di-GMP в LapD. Внутренняя мембрана DGC требует физического контакта для полной доставки сигнала c-di-GMP в LapD. Взаимодействие α5 GGDEF спираль GcbC изображено синим цветом. Также было показано, что ингибирующий сайт GcbC является необходимым элементом для взаимодействия и может способствовать контакту между этими двумя белками посредством пока еще не определенного механизма. c-di-GMP изображен в виде фиолетовых пятиугольников, расположенных в ингибирующем сайте GcbC и связанных с активным сайтом LapD.Каждый белок функционирует как димер. GcbC имеет кэш-домен, который предположительно обеспечивает ферментативную активность в ответ на неидентифицированный сигнал. Также показаны HAMP, GGDEF, EAL и периплазматические домены LapD. Когда LapD активируется c-di-GMP, периплазматическая протеаза LapG изолируется, и большой адгезин LapA накапливается на поверхности клетки, что позволяет начать образование биопленки. По материалам Navarro et al. (45).

Мутационный анализ GcbC () и LapD выявил дискретную поверхность взаимодействия, состоящую из N-конца спирали α5 GGDEF на домене GGDEF GcbC, который вступает в контакт с комплементарной спиралью α на домене EAL LapD.Мутация четырех из этих остатков, обнаруженных на спирали GcbC α, привела к частичной потере взаимодействия с LapD и соразмерной потере образования биопленок без потери каталитической способности. Интересно, что мутация пятого остатка на этой спирали, D484, также вносит вклад во взаимодействие с LapD, но демонстрирует частичную потерю катализа. Мы предполагаем, что эта потеря катализа происходит из-за того, что D484 координирует молекулу воды, которая, в свою очередь, стабилизирует связанное с продуктом состояние в активном центре GcbC, как это наблюдается в кристаллической структуре DGC из Xanthomonas campestris (68).В то время как трансплантация остатков из этой α-спирали на другой DGC придавала некоторые функциональные возможности GcbC, оптовые трансплантаты спирали не смогли изменить функцию нескольких других DGC, что указывает на многомерную систему физического и функционального взаимодействия.

Во втором исследовании было обнаружено, что аутоингибиторный сайт GcbC является необходимым элементом для взаимодействия с LapD (20). В самом деле, несколько нарушений I-сайта привели к полной потере взаимодействия с LapD, наблюдение, которое выходит за рамки эффекта, вызванного сложенными мутациями из взаимодействующей α-спирали.Нарушения I-сайта DGC традиционно приводят к увеличению продукции c-di-GMP и соразмерному увеличению зависимого фенотипа (14, 31). В то время как повышенная продукция c-di-GMP была верна для некоторых мутантов I-сайта, наблюдаемых в GcbC, другие мутации продемонстрировали повышенные уровни продукции c-di-GMP, но более низкую продукцию биопленки - следствие, вероятно, связанное с потерей взаимодействия между GcbC и LapD ().

Мы отмечаем, что I-сайт отмечает второй пример из GcbC, где остатки, которые могут контролировать скорость катализа, были связаны как прямое или косвенное требование для взаимодействия с LapD в сочетании с остатком D484, обсуждаемым выше.Эти наблюдения предполагают, что важной темой для физического взаимодействия между DGC и его эффектором может быть эффектор, непосредственно влияющий на каталитическую скорость партнерского DGC, когда он находится в комплексе.

ОБЪЕДИНЕНИЕ МОДЕЛЕЙ

Для выяснения специфики сигнализации в больших сетях c-di-GMP остаются важные вопросы. Как часто физическое взаимодействие используется для локализации передачи сигналов по сравнению с процессом воздействия на глобальные уровни c-di-GMP? Имея перед собой кусочки головоломки, касающейся специфичности сигналов, стоит задуматься о том, какие экспериментальные возможности сейчас доступны в этой области и какие могут быть наиболее плодотворными для создания более полных моделей.

Понимание взаимосвязи между контактом DGC-эффектор и катализом

При изучении единственного взаимодействия DGC-эффектор мы наблюдали два случая, когда остатки DGC, которые могут участвовать в контроле скорости катализа, по-видимому, необходимы для взаимодействия с их эффектором. , LapD (19, 20). Демонстрация или опровержение гипотезы о том, что контакт с эффектором может влиять на катализ DGC, - вероятный следующий шаг в этой работе. Также было бы полезно определить, как часто в комплексах DGC-эффектор необходимы остатки, которые модулируют катализ для взаимодействия.Такая модель предполагает тесное взаимодействие между функцией и / или регуляцией фермента и рецептора, с которыми он специфически взаимодействует.

Точное измерение продукции c-di-GMP

Если данный DGC может участвовать в локальной передаче сигналов через физическое взаимодействие со своим эффектором, он не может вносить вклад в глобальный пул c-di-GMP. Такая ситуация может привести к количественному измерению посредством экстракции целых клеток органических веществ с последующей масс-спектрометрией, вводящей в заблуждение, поскольку глобальный пул c-di-GMP может не отражать локальные сигнальные события.Задача становится еще более сложной, если эффекторный белок может каким-либо образом модулировать скорость катализа для своего партнера DGC, как обсуждалось выше. В этом случае дисфункция из-за потери взаимодействия может фактически привести к увеличению глобального уровня c-di-GMP. Качественные тесты, такие как связывание Конго красного как суррогат для измерения уровней c-di-GMP, когда данный DGC экспрессируется гетерологично в другом организме, также могут оказаться неадекватными в некоторых случаях, особенно если анализируемый c-di-GMP-зависимый фенотип является не результат глобальных уровней c-di-GMP, или если тестируемый DGC физически взаимодействует с эффекторами хозяина (см. врезку под названием «Congo Red»).Новые методы количественного определения c-di-GMP in vitro и in vivo на местном уровне могут потребоваться для анализа данного DGC, как с присутствием родственного эффектора, так и без него.

CONGO RED

Многие DGC тестируются на каталитическую активность посредством гетерологичной экспрессии в P. aeruginosa . Чем больше c-ди-GMP продуцируется клеткой, тем больше вырабатывается полисахарида Pel. Конго красный - это краситель, способный связывать полисахарид Pel (а также другие полисахариды).Можно провести качественную корреляцию между покраснением колонии P. aeruginosa из-за связывания красного красителя Конго и количеством продуцируемого c-ди-GMP.

Отображение поверхностей взаимодействия

Обе работы, которые мы обсуждаем в этом обзоре, которые показали, что несколько доменов партнеров по взаимодействию были компетентны взаимодействовать друг с другом (38), и наша собственная работа, в которой мы обнаружили, что разрушения ни одной стороны взаимодействия было достаточно. для полного отрицания взаимодействия (19, 20) предполагают, что в любом данном сигнальном комплексе могут действовать множественные поверхности взаимодействия.В случае системы Lap мы определили интерфейсы взаимодействия для LapD и GcbC. Нужно ли определить дополнительные такие интерфейсы? И насколько сохранены эти интерфейсы? То есть, может ли LapD взаимодействовать с некоторыми или всеми другими DGC в ячейке аналогично GcbC? В его нынешнем виде также неясно, сможем ли мы в конечном итоге определить интерфейсы взаимодействия до такой степени, чтобы мы могли даже предсказать взаимодействие, аналогично тому, что было сделано для двухкомпонентных систем (13, 59).

Отличие взаимодействия от передачи сигналов

Как описано выше, предполагая, что между DGC и эффектором задействовано несколько поверхностей взаимодействия, также становится необходимым выявить разницу между физической ассоциацией, посредством которой белки колокализуются, и функциональным взаимодействием, при котором они целенаправленно обмениваются сигнальной информацией.Вполне возможно, что эти два явления происходят как дискретные ступени, при которых физическое взаимодействие не сразу подразумевает активную передачу сигналов, поскольку множество дефектных по передаче сигналов мутантов как GcbC, так и LapD, как было обнаружено, по-прежнему компетентны для взаимодействия (19). Кроме того, стоит определить, может ли быть этап между ассоциацией и сигнализацией - какой-то тип модуляции, который может происходить после ассоциации, который может либо разрешить, либо запретить продуктивную передачу сигналов. На каждом из этих шагов могут использоваться разные поверхности взаимодействия.Что представляют собой эти интерактивные сайты и как они используются, будут главными темами для обсуждения в будущем.

Характеристика динамики сигнального комплекса

Если комплексы DGC и эффекторов обычно образуются, следующий вопрос, который следует задать, может заключаться в том, как они выключаются, когда сигнализация нежелательна? Хотя регуляция транскрипции и трансляции может играть роль, маловероятно, что каждый активный сигнальный комплекс должен ждать оборота белка, прежде чем отключиться. Ответ может заключаться в том, как часто пара DGC-эффектор вступает в контакт и насколько устойчиво это взаимодействие - еще одна возможная роль разрозненных поверхностей взаимодействия.Дополнительные возможности включают присоединение PDE к этим комплексам, чтобы помочь регулировать их, другие члены DGC, конкурентно связывающие эффектор, и клетки, предотвращающие продуктивное взаимодействие другими способами. Наконец, учитывая, что у большинства DGC есть связанный регуляторный домен, регулирование может потребовать сочетания взаимодействий и факторов окружающей среды. Действительно, такие входы могут регулировать активность DGC или, возможно, его способность взаимодействовать с его рецептором.

Изучение взаимосвязи между локальной и глобальной сигнализацией

Для организмов, которые полагаются как на локальную, так и на глобальную передачу сигналов c-di-GMP, возможно, обе системы время от времени используются для управления заданным клеточным ответом.Следует отметить P. fluorescens DGC, называемый GcbB. Как и GcbC, было обнаружено, что GcbB сигнализирует LapD-зависимым образом, чтобы контролировать накопление LapA на поверхности клетки. Несмотря на эту роль в передаче сигналов, нам не удалось продемонстрировать физическое взаимодействие между LapD и GcbB с помощью бактериальных двугибридных методов и методов соосаждения (неопубликованные данные). Хотя все еще возможно, что эти белки действительно взаимодействуют, стоит рассмотреть, как глобальный пул c-di-GMP может влиять на LapD или аналогичные эффекторы в тандеме с местными партнерами.Какие стратегии бактерии могут использовать, чтобы изолировать эффектор от глобального пула c-di-GMP, или, альтернативно, какие существуют стратегии для интеграции глобального и локального пула c-di-GMP, остается открытым вопросом.

Вероятно, что PDE также должны будут стать частью этого анализа. Имеются доказательства как идеи, что PDE могут физически взаимодействовать с эффекторами, так и того, что PDE могут действовать глобально, снижая уровни c-di-GMP (33, 38). То, как бактерии управляют отдельными событиями передачи сигналов c-di-GMP, вполне может зависеть от того, сколько PDE действует, чтобы удерживать цитоплазму от c-di-GMP, по сравнению с тем, сколько PDEs образуют комплексы с эффекторами, защищая эти рецепторы от глобального c-di-GMP. бассейн.И, как всегда, ответ может быть где-то посередине.

ВЫВОДЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

Благодаря многочисленным выдающимся усилиям по всему миру, область исследований c-di-GMP недавно вступила в эпоху, когда мы можем спросить, как достигается специфичность передачи сигналов в клетке. Важно отметить, что в природе используются как глобальные, так и локальные модели передачи сигналов c-di-GMP. Эти различные механизмы специфичности предоставляют большие возможности для понимания DGC, PDE и эффекторных операций на уровне детализации, который может облегчить прогнозирование функциональных модулей в сетях c-di-GMP и предоставить способы нацеливания на сигнальные системы c-di-GMP различные бактерии в лечебных целях.Также примечательно, что большая сигнальная система с точками потенциальных перекрестных помех может предоставить биоинженерам мощную модель для изучения и разработки более сложных бактериальных схем, чем это возможно в настоящее время.

Еще предстоит ответить на многие важные вопросы базовой биологии. У многих организмов идентифицируемых циклаз больше, чем эффекторов. Это может быть частично связано с относительной легкостью идентификации предполагаемого домена DGC на основе его последовательности по сравнению с более разнообразным и все еще растущим числом эффекторных архетипов.С другой стороны, возможно, что у некоторых организмов несколько ферментов сигнализируют одному и тому же эффектору. Как сигнал интегрируется от нескольких DGCs в один эффектор, еще предстоит выяснить. Кроме того, остается загадкой, как точные роли и обязанности DGC распределяются в зависимости от времени и обстоятельств. Наконец, возможно, самый сложный вопрос носит скорее тематический, чем научный характер: почему у некоторых организмов так много этих ферментов? То, что так много DGC и эффекторов в литературе, по-видимому, не имеют наблюдаемого фенотипа, предполагает, что многие экологически значимые условия отсутствуют в лабораторных тестах, которые обязательно будут выявлены в будущих исследованиях.Но это также предполагает потребность во многих специализированных ферментах, когда организм должен в короткие сроки определить, будет ли он образовывать биопленку при широком и разнообразном наборе обстоятельств. Следовательно, следующий большой вопрос должен выйти за рамки понимания отдельных DGC и PDE и перейти к пониманию того, как клетка выполняет вычисления для интеграции сигнала (ов) по всей сети DGC для каждого фенотипа, управляемого c-di-GMP.

Исследование специфичности передачи сигналов c-di-GMP находится на критическом этапе.Многие механизмы, используемые отдельными DGC и эффекторами, открываются, и это понимание обязательно должно лечь в основу следующего набора гипотез для проверки. Естественным следствием этого периода продуктивности является то, что многие конкурирующие модели создаются в попытке объяснить все более и более широкие диапазоны наблюдаемых систем. Принятие во внимание разрозненных моделей в литературе и возможность их разработки в соответствующих системах является важным шагом на пути к более полному описанию очень сложного режима передачи сигналов.И когда эти модели созреют, вероятно, как это часто бывает в науке, многие из них окажутся не такими взаимоисключающими, как они изначально представлялись.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NIH R01-AI097307 и грантом T32-GM08704 (поддержка K.M.D.).

Сноски

ЗАЯВЛЕНИЕ О РАСКРЫТИИ ИНФОРМАЦИИ

Авторам не известно о какой-либо аффилированности, членстве, финансировании или финансовом положении, которые могут быть восприняты как влияющие на объективность этого обзора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Агостони М., Кестлер Б.Дж., Уотерс К.М., Уильямс Б.Л., Монтгомери Б.Л. Возникновение циклических ди-GMP-модулирующих выходных доменов у цианобактерий: многообещающая перспектива. mBio. 2013; 4 (4): e00451–13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 2. Альм РА, Бодеро А.Дж., Свободный П.П., Мэттик Дж. С.. Идентификация нового гена, pilZ , необходимого для фимбриального биогенеза 4 типа у Pseudomonas aeruginosa . J Bacteriol. 1996; 178: 46–53. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3.Амикам Д, Гальперин М.Ю. Домен PilZ является частью бактериального белка, связывающего c-di-GMP. Биоинформатика. 2006; 22: 3–6. [PubMed] [Google Scholar] 4. Бобров А.Г., Кириллина О., Рыженков Д.А., Уотерс С.М., Прайс П.А. и др. Систематический анализ сигнальных ферментов циклического ди-GMP и их роли в формировании биопленок и вирулентности у Yersinia pestis . Mol Microbiol. 2011; 79: 533–51. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Бойд С.Д., Чаттерджи Д., Сондерманн Х., О’Тул, Джорджия. LapG, необходимый для модуляции образования биопленок с помощью Pseudomonas fluorescens Pf0–1, представляет собой кальций-зависимую протеазу.J Bacteriol. 2012; 194: 4406–14. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 6. Бойд С.Д., О’Тул, Джорджия. Регуляция вторичного мессенджера образования биопленок: прорывы в понимании эффекторных систем c-di-GMP. Annu Rev Cell Dev Biol. 2012; 28: 439–62. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Бойд С.Д., Смит Т.Дж., Эль-Кират-Шатель С., Ньюэлл П.Д., Дюфрен Ю.Ф., О’Тул, Джорджия. Структурные особенности адгезина LapA из биопленки Pseudomonas fluorescens , необходимые для LapG-зависимого расщепления, образования биопленок и локализации на клеточной поверхности.J Bacteriol. 2014; 196: 2775–88. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8. Чанг А.Л., Такерман Дж. Р., Гонсалес Дж., Майер Р., Вайнхаус Н. и др. Фосфодиэстераза A1, регулятор синтеза целлюлозы в Acetobacter xylinum , представляет собой датчик на основе гема. Биохимия. 2001; 40: 3420–26. [PubMed] [Google Scholar] 9. Chatterjee D, Boyd CD, O’Toole GA, Sondermann H. Структурная характеристика консервативной кальций-зависимой периплазматической протеазы из Legionella pneumophila . J Bacteriol.2012; 194: 4415–25. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10. Chatterjee D, Cooley RB, Boyd CD, Mehl RA, O’Toole GA, Sondermann H. Механистическое понимание консервативной аллостерической регуляции периплазматического протеолиза с помощью сигнальной молекулы cyclic-di-GMP. eLife. 2014; 3: e03650. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Чен Л.Х., Косеоглу В.К., Гувенер З.Т., Майерс-Моралес Т., Рид Дж.М. и др. Циклические ди-GMP-зависимые сигнальные пути в патогенном Firmicute Listeria monocytogenes .PLOS Pathog. 2014; 10: e1004301. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Chen ZH, Schaap P. Прокариотный мессенджер c-di-GMP запускает дифференцировку стеблевых клеток в Dictyostelium . Природа. 2012; 488: 680–83. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 13. Ченг Р.Р., Моркос Ф., Левин Х., Онучич Дж. К рациональному изменению конструкции бактериальных двухкомпонентных сигнальных систем с использованием коэволюционной информации. PNAS. 2014; 111: E563–71. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Кристен Б., Кристен М., Пол Р., Шмид Ф., Фолчер М. и др.Аллостерический контроль циклической передачи сигналов ди-GMP. J Biol Chem. 2006; 281: 32015–24. [PubMed] [Google Scholar] 15. Кристен М., Кристен Б., Аллан М.Г., Фолчер М., Джено П. и др. DgrA является членом нового семейства рецепторов циклического дигуанозинмонофосфата и контролирует моторную функцию жгутиков у Caulobacter crescentus . PNAS. 2007; 104: 4112–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Кристен М., Кристен Б., Фолчер М., Шауэрте А., Дженал У. Идентификация и характеристика циклической ди-GMP-специфической фосфодиэстеразы и ее аллостерический контроль с помощью GTP.J Biol Chem. 2005; 280: 30829–37. [PubMed] [Google Scholar] 17. Кристен М., Куласекара HD, Кристен Б., Куласекара Б.Р., Хоффман Л.Р., Миллер С.И. Асимметричное распределение второго мессенджера c-di-GMP при делении бактериальных клеток. Наука. 2010; 328: 1295–97. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Круз Д.П., Уэртас М.Г., Лозано М., Сарате Л., Самбрано М.М. Сравнительный анализ генов дигуанилатциклазы и фосфодиэстеразы у Klebsiella pneumoniae . BMC Microbiol. 2012; 12: 139. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 19.Дальстром К.М., Джильо К.М., Коллинз А.Дж., Сондерманн Х., О’Тул Г.А. Вклад физических взаимодействий в специфичность передачи сигналов между дигуанилатциклазой и ее эффектором. mBio. 2015; 6 (6): e01978–15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. Дальстром К.М., Джильо К.М., Зондерманн Х., О’Тул Г.А. Ингибирующий сайт дигуанилатциклазы является необходимым элементом для взаимодействия и передачи сигналов с эффекторным белком. J Bacteriol. 2016; 198: 1595–603. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21.Дувель Дж., Бертинетти Д., Моллер С., Шведе Ф., Морр М. и др. Подход химической протеомики для идентификации белков, связывающих c-di-GMP, в Pseudomonas aeruginosa . J Microbiol Methods. 2012; 88: 229–36. [PubMed] [Google Scholar] 22. Фазли М., О’Коннелл А., Нильссон М., Нихаус К., Доу Дж. М. и др. Белок семейства CRP / FNR Bcam1349 представляет собой эффектор c-di-GMP, который регулирует образование биопленок у респираторного патогена Burkholderia cenocepacia . Mol Microbiol. 2011; 82: 327–41. [PubMed] [Google Scholar] 23.Гальперин М.Ю., Никольская А.Н., Кунин Е.В. Новые домены прокариотических систем передачи двухкомпонентного сигнала. FEMS Microbiol Lett. 2001; 203: 11–21. [PubMed] [Google Scholar] 24. Guvener ZT, Harwood CS. Характеристики субклеточного расположения белка Pseudomonas aeruginosa GGDEF, WspR, указывают на то, что он продуцирует циклический ди-GMP в ответ на рост на поверхности. Mol Microbiol. 2007; 66: 1459–73. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 25. Ха Д.Г., Ричман М.Э., О’Тул, Джорджия. Библиотека делеционных мутантов для исследования функциональных выходов метаболизма циклических дигуанилатов у Pseudomonas aeruginosa PA14.Appl Environ Microbiol. 2014; 80: 3384–93. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 26. Habazettl J, Allan MG, Jenal U, Grzesiek S. Структура раствора комплекса белка PA4608 домена PilZ с циклическим ди-GMP идентифицирует кластеризацию заряда как молекулярное считывание. J Biol Chem. 2011; 286: 14304–14. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 27. He M, Ouyang ZM, Troxell B, Xu HJ, Moh A и др. Циклический ди-GMP необходим для выживания спирохет при болезни Лайма у клещей. PLOS Pathog. 2011; 7: e1002133.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 28. Хенгге Р. Принципы передачи сигналов c-di-GMP у бактерий. Nat Rev Microbiol. 2009; 7: 263–73. [PubMed] [Google Scholar] 29. Хикман JW, Харвуд CS. Идентификация FleQ из Pseudomonas aeruginosa как c-di-GMP-чувствительного фактора транскрипции. Mol Microbiol. 2008; 69: 376–89. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30. Hinsa SM, Espinosa-Urgel M, Ramos JL, O’Toole GA. Переход от обратимого к необратимому прикреплению во время образования биопленки с помощью Pseudomonas fluorescens WCS365 требует транспортера ABC и большого секретируемого белка.Mol Microbiol. 2003. 49: 905–18. [PubMed] [Google Scholar] 31. Хантер JL, Северин GB, Koestler BJ, Waters CM. Vibrio cholerae дигуанилатциклаза VCA0965 имеет активный сайт AGDEF и синтезирует циклический ди-GMP. BMC Microbiol. 2014; 14:22. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 32. Крастева П.В., Фонг Дж. К., Шикума Н. Дж., Бейхан С., Наварро М. В. и др. Vibrio cholerae VpsT регулирует выработку и подвижность матрикса путем прямого определения циклического ди-GMP. Наука. 2010. 327: 866–68.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Kuchma SL, Brothers KM, Merritt JH, Liberati NT, Ausubel FM, O’Toole GA. BifA, циклическая ди-GMP фосфодиэстераза, обратно регулирует образование биопленок и подвижность роя с помощью Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 2007; 189: 8165–78. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 34. Куласакара Х., Ли В., Бренчич А., Либерати Н., Урбах Дж. И др. Анализ дигуанилатциклаз и фосфодиэстераз Pseudomonas aeruginosa выявил роль бис- (3′ – 5 ′) - циклического GMP в вирулентности.PNAS. 2006; 103: 2839–44. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 35. Кумагаи Ю., Мацуо Дж., Хаякава Ю., Рикихиса Ю. Циклическая передача сигналов ди-GMP регулирует вторжение Ehrlichia chaffeensis в моноциты человека. J Bacteriol. 2010; 192: 4122–33. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36. Ли Э.Р., Бейкер Дж.Л., Вайнберг З., Сударсан Н., Брейкер Р.Р. Аллостерический самосплайсирующийся рибозим, запускаемый бактериальным вторичным мессенджером. Наука. 2010. 329: 845–48. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37.Ли З, Чен Дж. Х., Хао Й, Наир СК. Структуры эффектора циклического дигуанилата PelD, участвующего в образовании пелликулы в Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Biol Chem. 2012; 287: 30191–204. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Lindenberg S, Klauck G, Pesavento C, Klauck E, Hengge R. Белок домена EAL YciR действует как триггерный фермент в каскаде передачи сигналов c-di-GMP в контроле биопленки E. coli . EMBO J. 2013; 32: 2001–14. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 39. Мартинес-Хиль М., Рамос-Гонсалес М.И., Эспиноза-Ургель М.Роль циклического ди-GMP и системы Gac в транскрипционном контроле генов, кодирующих Pseudomonas putida , адгезины LapA и LapF. J Bacteriol. 2014; 196: 1484–95. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 40. Мартинес-Гранеро Ф., Навазо А., Бараона Э., Редондо-Ньето М., Гонсалес де Эредиа Э. и др. Идентификация flgZ как жгутикового гена, кодирующего белок домена PilZ, который регулирует подвижность и образование биопленок у Pseudomonas . PLOS ONE.2014; 9: e87608. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 41. Мацуяма Б.Ю., Крастева П.В., Баракет С., Харвуд К.С., Сондерманн Х., Наварро М.В. Механистическое понимание c-di-GMP-зависимого контроля регулятора биопленки FleQ из Pseudomonas aeruginosa . PNAS. 2016; 113: E209–18. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 42. Merighi M, Lee VT, Hyodo M, Hayakawa Y, Lory S. Второй мессенджер бис- (3'– 5 ') - cyclic-GMP и его рецептор Alg44, содержащий домен PilZ, необходимы для биосинтеза альгината в Pseudomonas aeruginosa .Mol Microbiol. 2007; 65: 876–95. [PubMed] [Google Scholar] 43. Мерритт Дж. Х., Ха Д. Г., Коулз К. Н., Лу В., Моралес Д. К. и др. Специфический контроль поведения, связанного с поверхностью Pseudomonas aeruginosa , с помощью двух дигуанилатциклаз c-di-GMP. mBio. 2010; 1 (4): e00183–10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 44. Monds RD, Newell PD, Gross RH, O’Toole GA. Фосфат-зависимая модуляция уровней c-di-GMP регулирует образование биопленок Pseudomonas fluorescens Pf0–1, контролируя секрецию адгезина LapA.Mol Microbiol. 2007; 63: 656–79. [PubMed] [Google Scholar] 45. Наварро М.В., Ньюэлл П.Д., Крастева П.В., Чаттерджи Д., Мэдден Д.Р. и др. Структурная основа c-di-GMP-опосредованной передачи сигналов изнутри наружу, контролирующей периплазматический протеолиз. PLOS Biol. 2011; 9: e1000588. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 46. Newell PD, Monds RD, O’Toole GA. LapD представляет собой бис- (3 ', 5') - циклический димерный GMP-связывающий белок, который регулирует поверхностное прикрепление с помощью Pseudomonas fluorescens Pf0–1. PNAS. 2009; 106: 3461–66. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 47.Newell PD, Yoshioka S, Hvorecny KL, Monds RD, O’Toole GA. Систематический анализ дигуанилатциклаз, которые способствуют образованию биопленок с помощью Pseudomonas fluorescens Pf0–1. J Bacteriol. 2011; 193: 4685–98. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 48. Пол К., Ньето В., Карлквист В. К., Блэр Д. Ф., Харши Р. М.. Связывающий c-di-GMP белок YcgR контролирует направление и скорость моторики жгутиков, влияя на хемотаксис с помощью механизма «обратного торможения». Mol Cell. 2010; 38: 128–39. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 49.Pratt JT, Tamayo R, Tischler AD, Camilli A. Белки домена PilZ связывают циклический дигуанилат и регулируют различные процессы в Vibrio cholerae . J Biol Chem. 2007. 282: 12860–70. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 50. Пульц И.С., Кристен М., Куласекара HD, Кеннард А., Куласекара Б., Миллер С.И. Порог ответа белков домена Salmonella PilZ определяется их аффинностью связывания с c-di-GMP. Mol Microbiol. 2012; 86: 1424–40. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 51.Рамелот Т.А., Йи А., Корт-младший, Семеси А., Эроусмит С.Х., Кеннеди Массачусетс. Исследования структуры и связывания ЯМР подтверждают, что PA4608 из Pseudomonas aeruginosa является доменом PilZ и связывающим белком c-di-GMP. Белки. 2007; 66: 266–71. [PubMed] [Google Scholar] 52. Ромлинг У., Гальперин М.Ю., Гомельский М. Циклический ди-ГМП: первые 25 лет универсального бактериального вторичного мессенджера. Microbiol Mol Biol Rev.2013; 77: 1–52. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 53. Росс П., Майер Р., Вайнхаус Х, Амикам Д., Хуггират Ю. и др.Система регуляции синтеза целлюлозы циклической дигуаниловой кислотой в Acetobacter xylinum : химический синтез и биологическая активность димера циклического нуклеотида, тримера и производных фосфотиоата. J Biol Chem. 1990; 265: 18933–43. [PubMed] [Google Scholar] 54. Росс П., Вайнхаус Х., Алони Й., Михаэли Д., Вайнбергер-Охана П. и др. Регуляция синтеза целлюлозы в Acetobacter xylinum с помощью циклической дигуаниловой кислоты. Природа. 1987. 325: 279–81. [PubMed] [Google Scholar] 55.Райан Р.П., Фухи Ю., Люси Дж. Ф., Кроссман Л.С., Спиро С. и др. Передача сигналов между клетками в Xanthomonas campestris включает белок домена HD-GYP, который функционирует в циклическом обмене ди-GMP. PNAS. 2006; 103: 6712–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Отказано56. Рыженков Д.А., Симм Р., Ромлинг У., Гомельский М. Домен PilZ является рецептором для второго мессенджера c-di-GMP: белок домена PilZ YcgR контролирует подвижность энтеробактерий. J Biol Chem. 2006; 281: 30310–14. [PubMed] [Google Scholar] 57.Ширмер Т., Дженал У. Структурные и механистические детерминанты передачи сигналов c-di-GMP. Nat Rev Microbiol. 2009; 7: 724–35. [PubMed] [Google Scholar] 58. Шин Дж.С., Рю К.С., Ко Дж., Ли А., Чой Б.С. Структурная характеристика показывает, что белок с доменом PilZ претерпевает существенные конформационные изменения при связывании с циклическим димерным гуанозинмонофосфатом. Protein Sci. 2011; 20: 270–77. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 59. Скеркер Дж. М., Перчук Б. С., Сирьяпорн А., Любин Е. А., Ашенберг О. и др. Переосмысление специфики двухкомпонентных систем передачи сигналов.Клетка. 2008; 133: 1043–54. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 60. Смит К.Д., Шанахан, Калифорния, Мур Э.Л., Саймон А.С., Штробель С.А. Структурные основы дифференциального распознавания лигандов двумя классами бис- (3′ – 5 ′) - циклических димерных рибопереключателей, связывающих гуанозинмонофосфат. PNAS. 2011; 108: 7757–62. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 61. Шривастава Д., Сие М.Л., Хатаокар А., Нейдич М.Б., Уотерс К.М. Циклический ди-GMP подавляет подвижность Vibrio cholerae , подавляя индукцию транскрипции и индуцируя внеклеточную продукцию полисахаридов.Mol Microbiol. 2013; 90: 1262–76. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 62. Сударсан Н., Ли Э. Р., Вайнберг З., Мой Р. Х., Ким Дж. Н. и др. Рибопереключатели у эубактерий ощущают вторичный мессенджер циклический ди-GMP. Наука. 2008; 321: 411–13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 63. Султан С.З., Питцер Дж. Э., Бокой Т., Хоббс Дж., Миллер М.Р., Моталеб М.А. Анализ циклической димерной GMP фосфодиэстеразы домена HD-GYP показывает роль в подвижности и энзоотическом жизненном цикле Borrelia burgdorferi .Infect Immun. 2011; 79: 3273–83. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 64. Таунсли Л., Йылдыз Ф. Х. Температура влияет на передачу сигналов c-di-GMP и образование биопленок в Vibrio cholerae . Environ Microbiol. 2015; 17: 4290–305. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 65. Tuckerman JR, Gonzalez G, Sousa EHS, Wan XH, Saito JA и др. Чувствительная к кислороду пара дигуанилатциклазы и фосфодиэстеразы для контроля c-di-GMP. Биохимия. 2009; 48: 9764–74. [PubMed] [Google Scholar] 66. Вэй С., Цзян В.Д., Чжао М.Р., Лин Дж.Дж., Цзэн Х и др.Систематический анализ роли белков домена GGDEF-EAL в вирулентности и подвижности у Xanthomonas oryzae pv. oryzicola. Научный доклад 2016; 6: 23769. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 67. Weinhouse H, Sapir S, Amikam D, Shilo Y, Volman G и др. c-ди-GMP-связывающий белок, новый фактор, регулирующий синтез целлюлозы в Acetobacter xylinum . FEBS Lett. 1997; 416: 207–11. [PubMed] [Google Scholar] 68. Ян Ц.Ю., Чин К.Х., Чуа М.Л., Лян Ц.Х., Ван А.Х., Чжоу Ш. Структура и ингибирование дигуанилатциклазы GGDEF, образующей комплекс с (c-di-GMP) 2 в активном центре.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2011; 67: 997–1008. [PubMed] [Google Scholar] 69. Zahringer F, Lacanna E, Jenal U, Schirmer T, Boehm A. Структура и сигнальный механизм цинк-сенсорной дигуанилатциклазы. Состав. 2013; 21: 1149–57. [PubMed] [Google Scholar]

Yege despre istorie. Ege despre istorie și Principalele sale caracteristici

Examenul de istorie este considerat un test destul de dificil pentru studenți. Judecați singuri, pe lângă faptul că este necesar să vă formulați corect gândurile, trebuie să numiți și datele corecte ale evenimentelor istorice cu Precizie matematică.

Pentru a trece mai bine examenul despre istoria anului 2018, vă sugerăm să văngloryizați cu nuanțele și inovațiile din acest subiect.

Ce sarcini vor fi UTILIZAREA KIM в истории в 2018

Se știe deja cu siguranță că examenul va conține 25 de sarcini. Din Care șase vor necesita un răspuns complete, restul poate fi răspuns pe scurt.

6 sarcini vă vor cere să cunoașteți acest tip de cunoștințe:

  • datele exacte ale începutului și sfârșitului anumitor evenimente istorice;
  • vi se va cere cunoașterea termenilor istorici;
  • caracteristicile anumitor eroi istorici;
  • Capacitatea de a utiliza harta;
  • lucrați cu mese și fotografii.

Sarcinile 20-23 vor cere să dați un răspuns Complete la întrebare. I, în special, denumiți cu excitate data evenimentului descris în întrebare. Решение проблемы с историей. I pentru o gustare, un eseu, în mod firesc pe o temă istorică.

De ce istoria este atât de grea

Pentru mulți studenți, examenul de istorie este foarte dificil. Și totul pentru că în această știință mii de fapte istorice și evenimente care trebuie cunoscute cu Precizie matematică.Suntem chinuiți de analiza a ceea ce se întâmpla cu multe secole în urmă. Trebuie să păstrăm tabele de perioade întregi în memorie. Nu este de mirare că este ușor să greșești la examenul de istorie. Prin urmare, este extrem de important să cunoașteți inovațiile, precum și structura examen nou 2018 despre istorie. Prin urmare, vom analiza sarcinile Individual care necesită un răspuns Complete.

Cea mai sofisticată sarcină este compoziția

Pe scrierea istorică vor fi alocate aproape 4 ore de timp.În aceste ore va trebui să faceți eveniment istoric cu astfel de derivate:

  • folosiți cel puțin doi membersanți;
  • este imperativ ca termenii istorici să fie prezenți;
  • abaterea de la faptele cunoscute este inadmisibilă.

Este difficil să se calculeze numărul maxim de puncte pentru un astfel de eseu, deoarece acestea sunt convertite după o formulă specială.

Cele mai dificile întrebări USE din istoria anului 2018

Cu aceste întrebări, elevii se simt cel mai adesea dificili:

  • sarcini privind al doilea război mondial 1941-1945;
  • номеров i porecle ale unor personaje istorice Знаменитость;
  • постоянных данных даже представить себе.

Nu este un secret faptul că complexitatea examenelor de istorie crește în fiecare an. Nici inovațiile nu au cruțat 2018. Sfaturi universalale pentru livrare cu successces Nu există examene, dar chiar și o scurtă cunoaștere репетитор perioadelor de material istoric acoperite vă mărește ansa de a obține un scor mare.

Examen de istorie - популярный printre absolvenții de clasa XI-a. N 2015, 130 de mii de școlari l-au ales.

Specificul examenului de istorie se schimbă constant, iar în 2016 FIPI a pregătit noi inovații pentru viitorii studenți.Acum trebuie să treacă două părți эль testului în loc de trei. Așa-numitele «jocuri de ghicire» au fost исключить из списка sarcinilor: întrebări la care trebuia să se răspundă alegând singura opțiune corectă dintre mai multe dintre cele sugerate.

Examenul in history va dura 235 de minute. În acest timp, elevul trebuie să răspundă pe scurt la 36 de întrebări. Aceasta este prima parte a examenului. În processul de îndeplinire a acestor sarcini, cunoașterea datelor, faptelor, fenomenelor și Capacitatea de a compare diferite evenimente... De asemenea, studentului i se oferă să lucreze cu materiale cartografice și ilustrații.

A doua parte conține Principala inovație - acesta este eseul care l-a înlocuit портрет истори ... Esența sarcinii este de a scrie un text coerent care ar trebui să descrie una dintre cele trei ere din care să aleagă. Eseul va fi оценка соответствует următoarelor критерии:

  • trebuie să descrie cel puțin două figuri istorice;
  • текстов, требующихся, чтобы указать даже на выбранную эпоху;
  • trebuie să urmeze legătură de anchetă între faptele istorice descrise;
  • elevul trebuie să respecte anumite terminologii atunci când descrie personalități și fenomene.

Принципиальная сложная проверка истории

Pentru a trece cu success USE в истории России, este important nu numai să înghesuiți datele și numele, ci i să puteți compare fapte, să construiți lanțuri logice. După cum arată Practica, cel mai adesea este difficil pentru absolvenți să opereze cu termeni: ei folosesc Definiții caracteristice unei epoci, descriind evenimente dintr-o perioadă istorică complete diferită.

Evaluatorii susțin, de asemenea, că elevii fac în mod tradițional greșeli în sarcini care, как указано в современной современной истории... În timpul examenului, nu numai intern procse istorice, dar de asemenea politica externa ,iplomație, figuri străine.

Минимум промовара

Minimum prag USE in history in 2016 este de 32 de puncte. Acesta este un minim aproximativ, dar trebuie avut în vedere faptul că există o concurență ridicată între cei care intră în Universități și 32 de puncte ar putea să nu fie suficiente.

Jurisprudența, limbile orientale ... Toate aceste și alte specialități solicitate solicită solicitanților să aibă cunoștințe excelente de istorie, adică studentul va trebui să promoveze examenul la aceastăduclină acestănă dacă de decă.
Cât de dificil este examenul de istorie - știai? Pregătirea pentru USE в исторической онлайн-истории nu este de trei sau patru zile i nu de 2 săptămâni, acesta este un an de lecții obișnuite cu un преподаватель онлайн-истории, un profesor care cunoaște toate subtilitățile i specificul USE.

Să Evidențiem Principalele caracteristici ale ИСПОЛЬЗОВАНИЕ в соответствии с историей:

1. Date, fapte, nume site-uri geografice, adică elevul trebuie să învețe o cantitate mare mici detalii. Examenul în istorie mare mulțime întrebări care sugerează un singur răspuns corect.De exemplu,

  • - n ce an fost răscoala condusă de Stepan Razin?
  • - Pe ce râu a fost bătălia cu mongolii-tătari la 31 mai 1223?

Chiar și nu fiecare Образование для взрослых va răspunde la toate aceste întrebări. Și aceasta este doar partea A examen examen despre istorie;

2. Există, de asemenea, o astfel de nuanță, в SUA despre istorie există un număr suficient de excactități, Precum și în multe manuale de storie. Prin urmare, într-un fel sau altul, va fi necesar să învățăm totul temeinic.Ajuta la rezolvarea acestui tip de nuanțe nu poate decât să ajute profesor profesionist - наставник по истории в Skype, забота о резольвии toate momentele de neînțeles pentru student;

3. Uneori Întrebări de UTILIZARE istoria nu este pe deplin corectă. De exemplu, studentului i se cere să aleagă data corectă pentru orice luptă sau luptă, deși ar fi putut contina câteva zile sau chiar o săptămână;

4. Partea B a examenului din istorie include, de asemenea, un număr suficient de проблема Dificile, mari затруднительная, определенная acele sarcini care, impun elevului să clasifice evenimente sau numeric, să sistematizeze informaçiile istorice xxAbsolvenții au, de asemenea, dificultăți in îndeplinirea sarcinilor care necesită стабильная unei secvențe temporale de fenomene sau evenimente. Dificultăți apar atunci când se lucrează cu date illustrative i statistice, hărți istorice, diagrame и т. Д.

5. Partea C provoacă, de asemenea, un număr достаточное количество сложных pentru școlari datorită faptului că adesea nu tiu să formuleze corect propriile gânduri și nu aveți un stoc bunț de cunoștin. De exemplu, dacă are sarcini pentru analiza poziției autorului, Definiția problemă istorică elevii se descurcă destul de bine, apoi direct argumentarea celor selectați versiuni istorice provoacă mari dificultăți școlarilor.

Numai sesiuni Individual cu un tutor de storie, vor puncta i-urile pe Skype, studentul va primi răspunsuri la toate ntrebările sale, va afla despre toate subtilitățile i capcanele examenului de stat unificat.

https://www.pilotonline.com/757teamz/photogallery_17937b08-f26d-11e8-98fd-e76cd32d9a8a.html2018-11-28T18:00:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/qvfJNv4FWZS -arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/RMLVRPEOANEHVNWWZT76JOOIQA.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/U_Jm27iOWkHkMNJH0B0NtlVaGwk=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. /9gPKlAOYyzI8mlbCg4s2PSYmB5o=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/GYPGINP67BGUXGJR3Q2NU3UIKE.jpg https://www.pilot6ESPROWGU2U5 -tronc.s3.amazonaws.com/public/KT2OEXPWTNAMVLSEMPJOSDIVZQ.jpg https: //www.pilotonline.com / inside-business / photogallery_aca5704a-f333-11e8-8cc6-0b826844c77d.html2018-11-28T17: 33: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/F29S70DvOQOpMCTR5s6M5EAhc.Zmo=/arc-t2anglerfish .amazonaws.com / public / 3SQERMYYJBFOFLW4J3KZRE2ZMI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/Emd0dy2RNHXUVFSBYPp0bqC0ht4=/ARc-anglerfish-arc2-prod2RNHXUVFSBYPp0bqC0ht4=/AVC-anglerfish-arc2-prod2-tron.pdf //www.pilotonline.com/resizer/wq2h3zxfKz_-aiqvAW7spsIduAg=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/LCYF55NYFVANRNCROGYZFB5NSY.jpg https://www.pilotonline.com/entertainment/photogallery_14ddd7f6-78b8-5bd8-89fe-99eb815b8299.html2018-11-28. com / resizer / yyjzThhFNMG1cXM1J-oZZaxzPxU = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / 26BLO4SYYRBSPFYYSXTE4AKUZA.jpg https://www.pilot-pilot.com/ru/pilot/pilot/pilot/pilot/ anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/T6MDKYCLWBHZRL5EOE6EEXVXHQ.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/lGkhgE2rHEa5vbXb0MdXRA3ZA5E=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/URRHMJRIOVF57FHWXPZUU55R2E.jpg 910mer3a-Galon_support/index.html -90c4-7fee7906daf8.html2018-11-28T17: 09: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/nne8CXNQXIxlMDcsOlL_rHxHiEI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. https://www.pilotonline.com/resizer/ZeXCDiOxu8mqAVQdMfW89rbewp4=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/WD5TBPUTDVGO5GEPHSIRSD7JK4.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/8AR42PS5A0ujmF84Q6v3QN7bPw8=/arc-anglerfish-arc2-prod-trons.com/arc-anglerfish-arc2-prod-tronps.com : //www.pilotonline.com/resizer/iJnx6KmDCpvSAPYZaUGpn0qslqo=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/YKIPR5K7BZB5BOAIQRRNLLFw16wi.js/public/YKIPR5K7BZB5BOAIQRRNLLFw16wi.js/?hl=ru&hl=ru /arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/IMP7RAUCBVEVLDRILFFAK2VUKI.jpg https://www.pilotonline.com/nation-world/photogallery_73b454b0-6948-56d2-81aa-be7f67b9febc.html2018-11-28T17:07:59Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/EteH0EYv-WPdd /arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/QPO66UAOCVAE5FVGR3OANQI6CI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/G8gPabGU6jHCDQYvBFvhz/arc-ix2c8-prod-jyc-xd-rc-dd-dd-rc-dr-db.hd-rc-dd-rc-dd-dd-dd-dd-dd-dddd-db. amazonaws.com/public/DKR62KRECZCZTO2PURXCJGSBWE.jpg https://www.pilotonline.com/life/photogallery_75f87ed8-f31b-11e8-8946-23c63514e81b.html2018-11-28T17: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/1jRvLdG7K6PinRK_6FbGAsPTtCE=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/MUPC26RSKND2PG.X./public/MUPC26RSKND3.X. .pilotonline.com / resizer / agh5Wz6nbpg5wRv7V7x1w5JirX8 = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / C7B7ZHZYCFDYRPYFJ37Yh55ELY.jpg piline.com/photowonline-driver.jpg .pdf ad08-d32d3f1f2752.html2018-11-28T16: 40: 22Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/sT71dD82keJ81ynIFXkDXUPGByI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/AGGO2ENI7VA7PAYKYVUHVRJYCA.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/4ZVIkRHA7rZY1oTWD-Eqx1ELpMI=/arc-anglerfish-arc2-PROD-TONG.COM/FRJ02-M02-PG.UA/RJ02-M03/2-PG-M03/2-PG-G03-C.F. https://www.pilotonline.com/resizer/FrhC7xVavNzz4pTOSDD5KuG8NbI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/W5NMKXCKNJAPHGYG44UPYG107E. q-hX0ELYaWIdolnGaKEgLixACqc = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / XCGLEWGHN5CFHGGPKAUAV6Z7K4.jpg https://www.pilotonline.com/life/photogallery_7250fa05-af2b-5f95-a09c-35fd35c9fade.html2018-11-28T16:22:32Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/YWqJLMWQlICnBLp / YWqJLMWQlICnBLp -arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/Y56DG3M5DVGY5DIVJBBGEXSH7Q.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/jH9jB8lQbSLDiEpZHSUqtQiT-anglerfish. com / public / L6HZIJWIWND27JTCJ2MC6246XY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/y_rKs0XFO5sRReTb24I2Jwaf8K0=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/EZ57D2AJOBCRPJDKNTDTUJ4KNU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/aFD32AL6vkntsqkNo3mw7NlPfXo=/arc-anglerfish-arc4-prod-turx.pdf.jpg : //www.pilotonline.com/entertainment/photogallery_de4fdd9e-63c7-5dae-b2da-13e1126692a6.html2018-11-28T15: 44: 46Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/JmNH8-8Q0fsqBOXXnc-hgLofsqBOXXnc-hgLo arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/LOXUBS5DP5GDLLOVD7QYPAKUNM.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/br5v0CCOcggtdA57zOJBivwvTWk=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/FWWSMGT7XRCB3NQ4RLOAA5VBPA.jpg /photo-www.pilery.com/photo-www.pilotru.com/photo-global-dress-a.com -9588d6e0f27a.html2018-11-28T15: 05: 37Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/gJp0hDJmSsAdMThuLK21mIU0Ef8=/arc-anglerfish-arc2-prod-IGMJTronc.s3.amazonDPQ6/QuickerFX/FXJN03/6/6/5/6/5/5/6/6/5/5 //www.pilotonline.com/resizer/mQhLHeTHhc6QBJWXnyiyjeVrBoM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/BP7K3E7WWBCY7NN2PVZGBJTHGY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/L82Y9iCJNx1S-qowHP65anxM6Gk=/arc-anglerfish-arc2-prod-publications.com/arc-anglerfish-arc2-prod-tv/arc-anglerfish3.jpg https://www.pilotonline.com/news/photogallery_ba97fc58-edad-11e8-ba0e-4f8230ead2db.html2018-11-28T15:00:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/IRPODdafbai-CpXeoBRYL=U anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/5EJIP7UX2ND23CMP3OOXE5F76Q.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / Glflj86VifTqtJbgsSi1sPxbUlE = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / T7GAGR7ST5HSXFPHW64TZSD55I.jpg https://www.pilotczsd55i.jpg https://www.pilotcfc/cjc/c/c/c/c/c/c/c/s/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/m/res/w/ prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/NFJOVPIJERHSNPNA2ZP3YIFYIE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/NMV2CnMMkDDvORTLbokqXIwBtV8=/arc-anglerfish3-arc2-c2/arc-anglerfish3-arc2-c2/arc-anglerfish3-arc2-c2 .jpg https://www.pilotonline.com/resizer/gjlV4YVnVnstnlW_UhNhz5neLWo=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/TT5PIOF3RJACJETITCPZZF6PFE.jpg https://www.pilotonline.com/inside-business/photogallery_a7cf8ab2-ed9b-11e8-95f0-6be98bbf70fe.html2018-11-28Tps://www.pilotonline.com/inside-business/photogallery_a7cf8ab2-ed9b-11e8-95f0-6be98bbf70fe.html2018-11-28Ttml Pilotonline.com/resizer/pvlyi826EXJE6z6YP9JRpKCfHaw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/MZMKJUCNWJG3NPSSETKO2FEVN4.pnghttps://www.xressells.com/pnghttps: // www. prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/BYQ3VYAHYNF4LHJK7OEZWI474M.jpgh https://www.pilotonline.com / resizer / OrQVTNbF86zi4alxO__4WIQiXn4 = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / P7NI2PMXD5F3TKWEPS3DCPD554.jpghttps: //www.pilus3dpilot-global.com/docs/doc-pilot-djs/js/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/m6/m/c/c/c1/c/m/c/c1/m/c/js/c/mg/c/m/c/js/js/ tronc.s3.amazonaws.com/public/4UA42Z7QGND3REX4UYYMKHW6XA.jpgh : //www.pilotonline.com/757teamz/photogallery_68630900-ed26-11e8-8da6-9f986ba06e9c.html2018-11-28T14: 30: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/kXuN4NaJJQCdeK8vfw7q1PiBh6o=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.EVamazonaws.com/public/YG106JPSGOOP.UA .pilotonline.com / resizer / u7nGDNlkF338ThKkI86eVCXfUWo = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / TCLTTNPBXBEN7ERNKX3FILRTh5.jpg /https: //www.mobile-review.com/ru/film/s/files/files/files/files/files/files/files/files/files/files/files/files/files/files/files/files/files/free/ -arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/EN4337XYN5BPPDP5RSDEQIBOO4.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/62KiNWrWL_P39hLbquNrV5Og7aI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/AKDQH7UP4ZEWBFFXFJDBES4FZE.jpg /on2nd0sw.pilot=s04d06ddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd/ arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/5C7PFD4AQFEKHJAIZWHWVBJIPE.jpg https://www.pilotonline.com/inside-business/photogallery_58354a90-e914-11e8-b472-63218.ht1111:00 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/P_v2aKgnCzOoljNrM6oWfffW6YQ=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/E7SN5UW76Zh35J42YPF7XJRTVY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/GBvJzK9qrm24D_rd-wF1BbrY9r8=/arc-anglerfish-arc2-HSBMazpd-tronpg-s.com/ru/ru/ru/ru/ru/TronBa.cz/ https://www.pilotonline.com/resizer/DmqlkOUJtbtoiz1pjgM4rLfRweE=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. YA8TlaVC3pgpne3lH7oCLEFSyPw = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / V7STKABVYJEENKGXTXCMGXGFTI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/-MZ1CCljTDoioOgnX_Nnb-5gJU4=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/IDK6MYKSLNCNPI2ULNIQPVY10AFA.jpg. com / resizer / c-DrucTzXwemKAByHs8qtTPOcxQ = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / VGTAM3RKN5BKBI56UCQVDMH6GA.jpg https://www.filot-7500-world.ru/photo-pilot-world-db/ -b88d-acc12e126d5b.html2018-11-28T02: 38: 05Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/OT-5b2_A8JciOz0gSUPAiPYPzr4=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/7IPZEJIC4JAFLFDKFL4PKN4FBQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/jy6xIIFtnG7ExYBeH9uzAqoYKxs=/arc-anglerfish-arc2-prod.com : //www.pilotonline.com/resizer/6dVTjIfGEpOK-m1G3XE7416XWxU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/WADMHVZBJBFSBGN5BZQ4GQMCV16pilation.com/www.jpg world / photogallery_119288c1-f9b6-5ade-beans1-819c07

9.html2018-11-28T02: 13: 57Zhttps: // www.Pilotonline.com/resizer/nhx66XXDOrODujOBjIGKL70agKE=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/JKGMMWISQJGLBHGAKXXPCWWQVY.jpg https://wwwcAvilot.com/ru/ru/c/c/c/silot/s/vc/vc/c/vc/vc/vc/vc/vc/vc/vc/v6/2/6/6/2 anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/BDX3CUZVCNB2TC5HMU6LCSYO4Y.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/DKCPM6cF0tCXYowFl6DNoURc-tronfish.com/arc-on-sport.ua/ /public/XLSBGF36ZRCY5C7XA6BX62K76A.jpg https://www.pilotonline.com/sports/photogallery_1c7763d0-f27e-11e8-8f6c-0f0701810990.html2018-11-27T21: 17: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/gSc2xtVO2w3KoG_emKMMXlW-Zw8=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/Z4XDR2JGC6Z / Public/Z4XDR2JGC6 /www.pilotonline.com/resizer/UEPL38STNJY8kFrNqQnY2lon5vA=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/UJVC62D3WZBLLHCULCPKRN3FII. 11e8-8d2f-6f35eae08d97.html2018-11-27T21: 17: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/gSc2xtVO2w3KoG_emKMMXlW-Zw8=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/Z4XDRXGC6ZHPJAVZIDZF2XKKDU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/UEPL38STNJY8kFrNqQnY2lon5vA=/arc-anglerfish-arc2-prodII-tron.ua : //www.pilotonline.com/entertainment/photogallery_09bace79-d151-5fd3-9b66-f836d8f49a6e.html2018-11-27T21: 15: 53Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/A-K16k2gfZOlBdangler/Pilotonline.com/resizer/A-K16k2gfZOlBkuwi/ arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/ZNHTXOQQPNGXPJNID7YWEHG2MU.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/7gVMnKCbjdCidY6e-aezka7fNfA=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/UPS63K66SZBTNFINRJXWTBU7UA.jpg /filmwcddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd1 anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/WJUTQCFIBBBSTPYJDBYIULPRYY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/4afxkMK8sQJfAprRnUF-pc6PTron-dawc-doc-docs/arc6PTron-dress-dll/arc6PTron-dress-dll/arc6PT-N0s-d. .com / public / XNRGKCLI6VG43HNBSPJUPWAMLI.jpg https://www.pilotonline.com/government/virginia/photogallery_cb42e56c-f263-11e8-88c9-ef85c37835ab.html2018-11-27T21: 15: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/AbpSUz3zHV279VQMwC8eyHrZ5bk=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/57F16HJPGFMGWW .pilotonline.com / resizer / PRcgiRxlP2PwNfHI_lD1eJC9VKI = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / H623XUYVS5BLVPFBRLSMOABDPA.jpg 6https: //www.smOABDPA.jpg 6pd1/www.html.jpg -anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/LFXZAUUYAJBFNNJFF2L2G4OPZ4.jpg https: // www.pilotonline.com/sports/college/photogallery_df696e16-f269-11e8-b235-a7e1f9faa0b5.html2018-11-27T20:45:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/2sWGaoPx7LGU-hAxcwrang-rc/03 -tronc.s3.amazonaws.com/public/EDBD4KLVJ5HQPN5GU2YW5ELI6A.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/X29luVg0CzVVLT7eBx6EMQBK2pE=/arc-anglerfish-publications.freepik-svp-dz.pdf. jpg https://www.pilotonline.com/resizer/3D3ywFOhsvOW-oh5GFmXgtySWVU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/LHD2P6W2G5EGTAQ7GYKUYE54DI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/RBe1OM9CU_uMBaseF7NAFczlwy4=/arc-anglerfish-arc2-prod-trona.com/arc-anglerfish-arc2-prod-trona.com : //www.pilotonline.com/photogallery_4d3721d0-f284-11e8-9160-031be8bb01c2.html2018-11-27T20: 37: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/Q8hcXkhRUz1OAfE4fWJ5cprod-arc-d-rc-d-rc-d-rc-dd-rc-dd-dd-dd-dd-db tronc.s3.amazonaws.com/public/MZ6DDRSDGBEF5A7TTBBTJJIJXI.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / H8NcGcRKqKRwbPkhouOA9Fur2E4 = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / DXPFLTAXHJD6HEPFFQZAQILE7E.jpghttps: //www.pilot-pilot-pilot-djs-dj-dj-dj-dd-rd-dd-dd-dd-dd-dd-ddd-dddb/ tronc.s3.amazonaws.com/public/VGGAKI3DNFDUDMWIRPNU2OZQYU.jpgh pilotonline.com/resizer/ZUP9pPe0bceR_MrWmM1aACTBRIM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / TJLJ33R5YRFDTKPRSK6SIDBNQQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/ykqMoRiEAGsq3ubEbmlk3d0ISuI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tron16Lps/arc-anglerfish-arc2-prod-tron16Lps/vk2-prod-tron.cz/ru/VZPG/VBQI5/VBQI5/V2/VPGV3/VPGNGV3/VBQI5/VPG/VPGIQ5/VPG.VPG.VPG.VPG.V. .pilotonline.com / 757teamz / photogallery_2faed576-ed26-11e8-be49-3bc7dd4528c5.html2018-11-27T19: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/8AgrcquPwC2hjzi2c2c-dn-dd-db-dd-dd-dd-dd-dd-dd-dd-dd-b1/ s3.amazonaws.com/public/N2KNPG3IIVDCHBZIQ4LHNXJ5FQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/gvX3J8XmLcr6h0XvIb2k-rJ9R-E=/arc-anglerfish-arc2.s3.amazonaws.com/public/PPK7BYBSMFHKFIKEh42KGUEPSQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/DHfvtMvulvNEYKJUx5LUFIHbT0k=/arc-Tanglerfish-arc2-prod-trona.jpg : //www.pilotonline.com/resizer/0WAvZGahHPN5rlC52nqukuJ0mzs=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/JSXEIO6HD5BQRP5H6WRAFTCCHA. photogallery_844041f8-f26a-11e8-b253-131a4e55bdc8.html2018-11-27T19: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com / resizer / qpqNpczGk6QjMEDMvCWULwC6ygM = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / FRQGVT2MXFh4TO7IUJG3PTXZVY.jpg /www.pilcUnews.com/arc-yc-news.com/ru/ru/ru/ru/ru/ru/ru/ru/ru/c/c/s/c/s/c/c/s/s/c/c/c/c/c/c/m/c/c/c/m/c/c/m/c/c/c/c/s/c/m/c/c/c/c/m/c/c/c/m/pubs-c/mg-sqe.html / prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/KEKC2UX52JDCJJPHK4LZLPSh34.jpg https://www.pilotonline.com/nation-world/photogallery_40b61ea5-9293-5da9-95b9-e798fb701b2018e.ht //www.pilotonline.com/resizer/47XvW9Sc2-qG-Viu_lk1h2-b3zQ=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/LRX4TNJIXVAZ7FVUX7KJ4TFKKM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/KslbGZUKx02LuEZgN1ItLtjTKNQ=/arc-anglerfish-arc2.ru : //www.pilotonline.com/resizer/ZIaTGMCsogGHdPSUwAdDhxY1uP8=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/URYAIZNDORCNVM4R6DUEGK7QZM.jpg .com/public/URYAIZNDORCNVM4R6DUEGK7QZM.jpg /arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/P4S3GCX5YJCTHEZRGLTD3D73RA.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/f7NoMurcaXfr92JBurOrI1ubKAQ=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. /photogallery_63064696-f197-11e8-b625-1b7eb1b33547.html2018-11-27T18:00:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/zZrWy32XBVRJOcN4jVPcVECFAWk=/azc-anglerfish-dress.com public / 452TJHPC6FCOZDJFEPTRSPHX2E.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/DHTFDcNTfB_9G9sj8KQKWvErqgY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/BGPKJCXCYREKVDEK6BHKOFRSVQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/jlhZfU8AB-AJiehIB8Cug-1ruqQ=/arc-anglerfish-arc2-prod-trondownloads/arc-anglerfish-arc2-prod-tron-tron.cz/ .jpg https://www.pilotonline.com/life/photogallery_510b92bb-e16d-5754-96ed-3e01d9835afb.html2018-11-27T17:36:14Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/MoZ8c3rOiULPEJz/vd anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/GXDLVYK5IZHIJDOGBE7YMGY5Z4.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / mJ3hezuANtYbgvnyzie9MzMzsmA = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / N6A5KARPIBHKVO3RPESDIIIMXA.jpg https://www.pilotonline-freepik/response-global/response/resource/res/res/res/pilotonline/res/ arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/AK4IMHT5SFBJVCBBBPUL6ECSEU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/o4_viXhv1Yit9tSTBpb9rbXpoqs=/arc-anglerfish-arc2c.ru /ETIKWNACPBBZ5PLA6P3HWOJI6Y.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/D94fYvhPp8WZ7Fa8FMjcPYpuuLw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/3WYKFP47KRGKJK6GG2ONZKJ4JY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/IvQhtutezlIGM0xpzkydwPYauDo=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronpg.com : //www.pilotonline.com/resizer/8LgJgwuoHp3Ya5k-kNxokBQ0DnI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. JrGVjs5VBD-WayXQNYxCZP1DwoM = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / IHKCIPDMQZA6TJ4K5O5VP3NQ74.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/4wr7W28a2bxjMUGt75iA3VMU6Es=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/GD75W5JRBBBSNGUGL16.public/GD75W5JRBBBSNGUGL16.jpg /w7r_oQso0baJuaoOWiagc9XD6Ak=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/4UCPB2VGIBH6XDYNGXBYGNT7HQ.jpg https://www.pilotfegalecabe.com/ru/business5ecfcdb8-8f6-8db-db-db-db-a1-a2-a6-a2-a6-a2-a6-a2-a1-a-a-cn-e.pc/ html2018-11-27T17: 30: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/XabUz07qFZNFYLMci88UYWVlWbo=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/VAFYWUS2LFCUFIYNFY6LJDLM3I.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/SBUpMhdIFU72gD4-w2V21dWigTs=/arc-anglerfish-arc2-prod-tworld.com https://www.pilotonline.com/entertainment/photogallery_59a28f91-7373-540d-9219-2bf2b73dd4a2.html2018-11-27T17:27:44Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/ymYBMvro_wWcbBNx-cwhp-white9 arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/ZNADFLGFIJCTFKPQCBWCHPISNE.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/GTeZgpGcScygTNp1hBA5teSOrEY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/TC7VQQHI3FA3TMJTWUHJCFW2LE.jpg /www.pilot.com/ru-ru/news-db.html arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/27GU6UOICBDYTO7VKCRPU3YOYU.jpg https://www.pilotonline.com/entertainment/photogallery_1174c878-3f4a-52c6-b73a-21711.bea8: 27: 44Z https://www.pilotonline.com/resizer/NdmpxD-yFUhtoBrovM1P2eNdwS0=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/GVKGF5QHWFBBRPYVJF2OSNCSCQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/TNE67qPFi4LpnLLEzB7AM6eW9Oo=/arc-anglerfish-arc2-prod-pd.ua : //www.pilotonline.com/resizer/mChIx2YBW-kkZZPRYaLgbTxKhow=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. photogallery_f9b80f70-f770-5d55-a643-0d3d283fd7e2.html2018-11-27T17: 18: 44Zhttps: //www.pilotonline.com / resizer / YJ5c3ECFjG_V3q7VgTBUS4IaK_I = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / MOSO4XPEI5FBDLZWUF2DMCHNVI.jpg https://Xwww.zwuf2DMCHNVI.jpg https://Xwww.presilot.com/ru/zql-c02-d0c/v0-c/c/c/c/v1/6/6/6/6/6/6/6/6/6/6/6/6/6/6/6/6/2/2/6 anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/FETZA6JAWBD2JI232YCNIL7A3A.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/ccr1aolc8y4hbJsKL7gcBKo31_anglerfish-drcb.azcon-russia.ua /public/2H7AAALEPBGIFE37WRODCUDHJI.jpg https://www.pilotonline.com/757teamz/photogallery_79adb174-f1c7-11e8-887b-a7e3e115c6fc.html2018-11-27T16: 30: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/0dYuhcdmHZlkzlCwvpBBSooO-uw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/QOJTLCVML9/public/QOJTLCVMLJDN7 /www.pilotonline.com/resizer/8LaF7dI_7u_nU9pp4Yqa2cqnMDo=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. 11e8-9c56-277914eda9c5.html2018-11-27T16: 25: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/Av4uQRJSy1zc0zpoR3WFmVk5aLU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/KR7AD3LH5NCRJACPUM4PTL3NIY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/_Jz7t0XWWWmVjfsLlfF83Q9eSJGY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tvpd.jpg : //www.pilotonline.com/life/photogallery_939465e8-ecf8-11e8-b52d-8fda03f213ed.html2018-11-27T16: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/tAJJA89xX43nOyark-Z6d6d6 prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/7SY7PPMYAJBMRDRL4VZEEWPGKY.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / RjS_vQq8TZeexjyqNY9LY1hLjmw = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / UY3IGFXTEBASJFPZZJTV36XCSY.jpg https://www.pilot-global.com/ru/pilotonline.com/ru/pilotonline/ prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/ZJL535TEKVHJPIFA2RPA2AI4CY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/Iq1CQeRjOoc1HAUzvjWUtGXIj4s=/NDc2Dec2-GUZ-DUtGXIj4s=/Ndc2Dec2-GUp-dc/docs/arc2-anglerfish.com .jpg https://www.pilotonline.com/resizer/AWeFOsGc7Y6FPaph3czx_Ah3Lf4=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/K5X3LWPZE5HQBAD4I6HPJ2F7h5.jpg https://www.pilotonline.com/757teamz/photogallery_ecb

-ed25-11e8-b529-733fbc3891c1.html2018-11:00. com / resizer / hNjhEQe2t_S6P3GlQEkwTG9I2_g = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / ZTNSXUVCLJBFRG47EMNLNFFCVU.jpg

/jpg/freecfc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/fc/s/files/files/files/files/files/files/files/files/files/files/f/ prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/P567QEDSR5DHLCUAW2KQ5SRD7M.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / I3Tgx3CKC2UBc0QymeDcNT277Ls = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / GN2CIPTFPZHZZMT4R4DI65UAWI.jpg https://www.pilotzuvs.com/ru/pilotonline.html?hl=ru&hl= ru arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/APQ4ETKHDFD3TLGGBU4M24XOSE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/V184hgYUN2uZ1VFrC_ZvlxyPns0=/arc-anglerfish-arc2c.ru /SYPU4NMANBCVHEYBIV7Z32W7DA.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/OOLio5ATRVoocfpQnNkPlvFqrRg=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/PEMDYURLUZGZ7HWSOMF2TPLPQM.jpg https://www.pilotonline.com/food-drink/photogallery_7c10229c-ed05-11e8-ac91-5383c9357beb.html2018-11-27Tps://www.pilotonline.com/food-drink/photogallery_7c10229c-ed05-11e8-ac91-5383c9357beb.html2018-11-27. Pilotonline.com/resizer/pf9mtswhRLyG8eRxaI0rz6ATo_c=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/NWTHSOK5YFDQ3AH6BJW3EQO7MM.jpg pilot.jpg .jpg arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/5RDTRCM2MZDGZCBIZEBWVSV4VI.jpgh https://www.pilotonline.com / nation-world / photogallery_3f540206-d6d6-565f-a3b4-acd97553e783.html2018-11-27T13: 28: 32Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/81XrjKGceyqCRyUj0agdD0xcron-drfish/ .amazonaws.com / public / ZC74EEKGD5BWJCM7C4LHQOLV3M.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/BGwW4bT9Ft2Y5i-ua02Pnw1hl7E=/arc-anglerfish-arc2-Gu02Pnw1hl7E=/arc-anglerfish-arc2-prod-tvrc-anglerfish-arc2-prod-tvpd.ua https://www.pilotonline.com/entertainment/photogallery_80f41bf8-1fbf-53a7-8a18-1bd7b341610f.html2018-11-27T05:48:41Zhttps://www.Pilotonline.com/resizer/UIS8HkIevxRikWacHQkWdlcZa-g=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/BFWGB6ZOH5FFLB5YTDDPLNCFMY.jpg https://MusicFlash.com/pilot/master/subs/master/pilot/pilot/pilot/pilot/8/8/8/2/8/2/8/2/8/6/2/8 = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / VRBAEU63VVF5LHYZWAMXDN5N7E.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/gAHyjNvvfLtX0yz6c.jv_Nprod-cronfish .amazonaws.com / public / 2NQEIZB6HFCXNOPUQOLECSYHBM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/rTk7-8T_8zk9HMxyI-3I96sOgSY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/2XZWDW743BBF3MHRYQXPQMIDME.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/vP5r3s2cbP0LfGlrDwwzj1fgdmA=/arc-anglerfish-3c4pgdmA=/arc-anglerfish-3c4pdpd2/arc-anglerfish-arc4pdpd2/arc-anglerfish-3c4pdpd2/arc-anglerfish-arc4ps27.pdf : //www.pilotonline.com/resizer/A9VAqWugKZqTYl8Ye0i5M2pl1LU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/J5YW62L4SRA45FPZJ7GEKH5QXU.jpg 910 cwmDwf_0_SbO9k4 = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / 6WLXLCPC7FE7ZIB6ZNI2MORPMA.jpg https://www.pilotonline.com/opinion/columns/photogallery_35199a28-edcb-11e8-bddc-ff7a2db4712f.html2018-11-27T05:00:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/vxPbMUpLegVeg/vxPbGUpc02/vxpcdjpc/ -anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/Z36AGI72TJANJF747F4SZT63PE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/coGkz-E20AJ1kGyvD6-1QXicx6c-prod-arc- s3.amazonaws.com/public/CLHKMQVIARHYZBTIFPRRC7K7NM.jpg https://www.pilotonline.com/nation-world/photogallery_0876a6c6-8f8e-541a-bbad-fc322f99b919.html2018-11-27T03: 48: 53Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/JzC38f9eFABi8VsWHfADNG9weOY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/HIG7ESAB2VUUJ.ps: https://www.pilotonline.com/public/HIG7ESAB2VUJPG./ .pilotonline.com / resizer / AAyq_uryzLWAVVm_GcyAlfj859o = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / ON3SXD6WUJEE5N7KOANOT2Q52Q.jpg https://www.presilotonline.com / -arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/3MKRSQHDR5CGVNMHBEMGC7P7GE.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/NQBuNE2adjdB-B7C4rNNCp69osI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/2KRPMBE2PFB6NHAFS7PIW256LI.jpg https://www.facebook.com/publications/publications/ -5ac4-8bda-a9d2e38ed22e.html2018-11-27T02: 09: 12Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/fSIUcvakmLZb5nGnJi7q3rU4EIU=/arc-anglerfish-arc2-prod6Gaz.com/arc-anglerfish-arc2-prod6Gaz/arc-anglerfish-arc2-prod6-tron.ua jpg https://www.pilotonline.com/resizer/7NqhgKzbPN5wuIco3Eve7EzfhzI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/XKI24VMC4JB6HJ2ENVFIZHINZU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/7bDXcI9s2GVUOzo8BouPOsXHq6U=/MParc-anglerfish-arc2FF2-prod-trc-anglerfish-arc2-prod-tvpd.ua : //www.pilotonline.com/resizer/J2OI7dv4JzSGGts6Ci97XNi-cfw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/F3IMCBPDHJHB7JQZSDPQNJ210ENQ. BdxIV_FfY4SFJsz8tVuyMeKr6qg = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / 34GJORONVJHHDMP6EFM5MBYJOQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/AQCqjcKp6YYOJBepe4kE4W4LG9Q=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/LA2SSLFNIBEH5DY10G16.public/LA2SSLFNIBEH5DY10G2IX.public/LA2SSLFNIBEH5DY10G2IX.jpg -world / photogallery_fa4a7c71-aebe-55a3-b8d5-e664fea9e561.html2018-11-27T02: 09: 12Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/g2fDfEnsO45tyizB91P1RKcztron-drops. amazonaws.com/public/TGUWAWBYYBHF3ASP7MQPNUHSJ4.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/Rz4Wsk9PNDfsOiJuo4gl-FWjpQ0=/arc-anglerfish-arc2-prod-tron.s3.amazonaws.com/public/TKZMAP5DNBDGRF6Z35ICSDDKYA.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/A3yNkih7h3z5edkTjrxCAnntp5Q=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronpg.com/arc-anglerfish-arc2-prod-tronpg.cz/3/4/3/4/5/4/5/4/4 : //www.pilotonline.com/resizer/YtpNUcWAXiajYmtUg3Dgh0-yEgE=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/ES552LLL25HGVDEXULG67TMTSM.jpg . dvMTOjmMipdkrSUI_rczUiXZ-j8 = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / Z3AVNK4QSZHHIGEAKIMTERVGY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/9MTKGhKZLuBdWmIKEkLK_U_gX-M=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/NZGKFWWNVZBQPBOX106NVZ.jpg /nation-world/photogallery_8b6d02dd-01d5-52e9-a686-5ab9beea80c3.html2018-11-27T01:53:54Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/ngyaPWHPunu6BhnOZtLRekmcOCYprod3-drc-rc-rc-rc-dn-rc-dd-rc-dd-rc. amazonaws.com/public/SLULARZBRBEKNE6657QSTRYBYM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/hDI2buo57bWgNwX7Ud-KaU_OBz0=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/IRE5DTXPLBHGRKXP6BJI7XUPW4.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/kmswijHPzS45K1pZVS1w8lNjsIAQc=/GBonlerfishLAN-arc2-prod-public.pdf/arc10-prod-public.club.ua : //www.pilotonline.com/resizer/iD3cCqUmbjvXVQM3KNySbMPVaOE=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. photogallery_20b181c0-8229-55e6-8c6a-0f45a46665e2.html2018-11-26T23: 22: 21Zhttps: // www.Pilotonline.com/resizer/WChUMSD7LSaow7SmUPQeM0kkCHk=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/ZHECIOWWPJFI7PSANO3WSC5VBI.jpg https://wwwLango.com/drespilot/ru/docs/subs/docs/s/docs/s/docs/c/s/c/s/s/c/s/s/s/s/s/s/p/ arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/ZGYZ2YOENBCWTCKUKLGIHHPKUE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/k8JaLHSsmYVV-CZwqdrpO_-KqSU=-arc-ang2. .com / public / 4IJ55F2PDJGXVMWETQJIDXPE4E.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/_--4N9vFWUL2BC5pmqoADEubZ2Q=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/I3ERSZRWDNHNPAXPRCRZCHXN3M.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/U0wsGjM6xyOhWiVgbzIX-5cubsc=/arc-anglerfish-arc2-prodND-tronMc.s/Mpg-anglerfish-arc2-prodND-tronc.s/Mpgz3cpd-troncpd.html https://www.pilotonline.com/sports/college/virginia-tech/photogallery_50b63aa8-f1b2-11e8-8257-678470a3dd17.html2018-11-26T23:00:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/D -7sUkuVGinEq8nMIpo-kl-eyCM = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / Q6NRSNAYDFCMNHPR4C53IRHY5M.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/nXn-_RAP5-5Oz8PhWtXRtHHOY3Y=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/W3O3LVBUO5A45I65GW2DMWW6JQ.jpg 910gepiversity.com/collineEnterfaces / www.colline.com/collections/colline -virginia / photogallery_f87adea8-f1bf-11e8-8bbe-3796b194fc40.html2018-11-26T21: 12: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/XO9bnn7pg0aiX7P82kU_cySpupler-prod-. com / public / 643WH6JTOZG5HLJC6KPGS23LXU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/WcXLqzVVg-Urk1LJ9h3j_IPZbq0=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/BGTXJR7VKZAFNEB4EULNKRYQ4Y.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/er4Z-gFs_8Ab6uqN_nMXu4OIoXs_8Ab6uqN_nMXu4OIoVg=/arc-anglerfish-tronoVg=/arc-anglerfish-arc2-pg=ru.jpg https://www.pilotonline.com/sports/college/old-dominion/photogallery_7c1b0d90-f1bc-11e8-85b6-e7be9172d92a.html2018-11-26T20:47:00Zhttps://www.pilotonline.com/8DrXIQSUV2_Resizer/ov2/8ddddd/ = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / SVH7Y7PONBFCDLJVDC2OBDHASA.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/_YLyrhyMzdBAGpJ88LNynbtGRsI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/HAEH5756KZETRN6XSNY3FJQJOM.jpg https://global.com/blog/photo.html/global-index.html -8bc4-275c858107fe.html2018-11-26T20: 23: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/aBzEnrXV4qw0m_eE6zR_CX0a9PQ=/arc-anglerfish-arc2-prod-tron10c. https://www.pilotonline.com/resizer/84YzHbJzkIXtHxK0c0rjRxlwpAw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/YCK3JADWKVDKFFZFIFIVGD3QPE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/HWyVb3tkxYF5Wr5hMCKoKbWBKCw=OBamc-anglerfish-arc2-prod.ua : //www.pilotonline.com/resizer/D5dfpEB5MIb42QiBclKBOFYv9Dg=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. /arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/YDI3GJGTQFGQXCSXOWTICRPRCI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/wt6U9whfS8XX2MssCtFZz1OdUbA=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/IAJGBLFJRVF4LM4VL16.UZEZE3 /photogallery_fe63e721-2594-5b88-8775-d72b99e75c40.html2018-11-26T19:08:41Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/mKnmEBbWObPYgNk7rqJFUhvolNs3./arc-anglerfish.com public / JS2TYALM5JBMBIQAIOXFR4GQMU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/1lo8h0XpxYSJ9bR8dDqjb7J9kZg=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/6ZHYXQHDPBBCXNXBLXQC6R2BGU.jpg https://www.pilotonline.com/life/photogallery_7466c92f-f483-587a-a939-e456c4a4fe60.html201829-26T18. com / resizer / DadUXOSvObDtFsIM1c9Gux7mDkI = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / MOG7BIV5XBEGPILDV7MIHWCU6U.jpg https://www.pilotonfish-global.com/subscribe.com/html?hl=ru/html?hl=ru / prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/5DPHVGFZ7BFHVOT3D62RERMOTA.jpg https: //www.pilotonline.ru / business / photogallery_eeaaa033-0fe1-503f-a7ab-edb836add731.html2018-11-26T17: 46: 06Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/xZVKj4DevGpO9RmtiDxHRxi7con2prod-arcawsc.ru .com / public / GAXBNBEK3FAQLN3BSHW4EQ345A.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/xh34ZeLycD6vc9HEA6K_NY6LSdE=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronQU10.RuVC5VDJPGV2-prodpublic-tronc.s4/GV2/VPGV2/VPGVZ5/VZ5VPGV2 www.pilotonline.com/entertainment/photogallery_5c2169e0-63d7-5dd5-9fa4-44aafcb0b239.html2018-11-26T17:35:28Zhttps://www.Pilotonline.com/resizer/QhrVF_GfYePh4MHG029Kro2XDEs=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/YJOICA4I3JCCJAQTJWHW4PDSFYae.jpg /ru-ru-ru.jpg arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/FDBT4Sh5SBBRFLSEEZWBSSTTAA.jpg https://www.pilotonline.com/757teamz/basketball/photogallery_eb400dac-ec39-11e8-87dd-b418a-11: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/aFezY5RrkVkTs2mymQ4g9Tzf40Q=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/6OEGJN6M4BDGVJTYIAI2FGF3DE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/ss-2borWcwKvPf3O045ylwOZDRc=/arc-anglerfish-arc2-BZDRc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronpgs.com/ru https://www.pilotonline.com/resizer/jUa3lBkZ5cjzte41EkOfa1hGk6k=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/S6I6ATT3ZRC4DKTJGRC2MUV2UQLine/ h46pwVPbT0Y7-3_WWYkOP9Ufbns = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / X5JRCS3BY5A2XCTKJZLZI2CN2I.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/7eHCcqUoNrWK5WZTUZfg8xM2tOo=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/NJ6NXLW7A5AGNKEADUVh4.com /qDU78Vk2QRq72vaPsnbPt8AoBqU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/MNUZHQ7UQNGMVMFPNAMEXIAHOE.jpg https://www.pilot4free-park-sport.com/subscribe.com/ru/docs/data-data-data-date-data-data-data-data-dex-data-in-dex.html -tronc.s3.amazonaws.com/public/F2JWTXB2QVAUDDV3WFOZHAZG3Y.jpg https: //www.pilotonline.com / news / education / photogallery_4321ed26-ecf1-11e8-b22f-073fa1dd3798.html2018-11-26T16: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/1FPs7Wa8iPlPYtaP4zxWgigBxYanglerfishc. .amazonaws.com / public / 3NLQ2WDMSBA3BCMF3YD4IK73XU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/F1rDNQkXchJpmzpBquvf3VFM7EM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronawc. //www.pilotonline.com/resizer/8gx3w3cLOQvJcU_WlEPgVDGZVbY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/UPF2YJHXWJDAPK6XNSE5J6M3JI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/bti7VPh4MloxLbjx35S1LvyJyUM=/arc-anglerfish-arc2ORWJyUM=/arc-anglerfish-arc4ORBAMPG.COM/Query.js/subscribe.com/ru/wiki/White/?hl=ru/White/?hl=3 : //www.pilotonline.com/resizer/J6PmypIuJhuZSHB5-QUbk9vDAwo=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/TZTQZASGFBCQFP5C235XFR6DCU.jpg / https://www.jpg баскетбол / фотогалерея_0b54da76-f0f6-11e8-9f7e-6712e9ebe8bd.html2018-11-26T16: 00: 00Zhttps: // www.Pilotonline.com/resizer/1Onor5LqcUxTSlgfdqssLcbHlX4=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/G7UYQKXCRRDBLPGUFWYXC53LQU.jpg /wwwqlcdjpcdjpc/BSecdjp.czcdjpcdjpc/bpcdjpcdjpc/b2cdjpc/ru/ru/ru/ru/ru/c/c/cpcdjpc/ru/ru/ru.pdf arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/7MHDCYNMPVh33CYGCTXGJ2LMXI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/QaAFceYOAQ7mNpajGR2hJh5wCjc.4=/arc-anglerfish.com /J2HOSFZNVJB5HJTGKS65V7W3KU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/v10yOswXSG90lD4Z0-nDA0Pf0Qk=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/F2JWTXB2QVAUDDV3WFOZHAZG3Y.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/aFezY5RrkVkTs2mymQ4g9Tzf40Q=/arc-anglerfish-6Tzf40Q=/arc-anglerfish-arc2-prod.com/arc-anglerfish-arc2-prod/arc-anglerfish-arc2-prod/arc-anglerfish-arc2-prod.html : //www.pilotonline.com/resizer/Dn9CJfMPzL4tpl5OsnBHKFpEdb8=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. jzwBxCYpkldni0pSY_osE = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / AIT3NOTMU5HWXGQMZFRFUXWZOY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/9PMge_StTSz6_x58oA6nSJ4I1HM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/O3ZVLO7W4ZANFCGAKBAIDF6US4.jpg /basketball/photogallery_e16701d2-ec34-11e8-8049-af2319d8f6da.html2018-11-26T16:00:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/i3BLCsZcr-d_2ogrNxyyxte2n2k=/arc-tanglerfish. amazonaws.com/public/X3K26HICAVDAHOCKRSOEDVP2Q4.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/EKqhnn6mgJGzKNmyw1wPYcYPMHA=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/52Q245UUBVEYTEWOR46QTAYSYM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/BIJwMDtz9I1gdglvJ9G2_PzxJGg=/arc-anglerfishTublicSarc2-prod10TonGPS.com : //www.pilotonline.com/resizer/uQwnrFMYTcMKt7Wdj5KBEg9KLyA=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. 11e8-9ab2-139764096687.html2018-11-26T14: 58: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/YE99s91ZnfI3l2B7tzr4MuejVnI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/JTB4VLTQIJACZKK7XENKCZ2D5U.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/BKLFNNWArQlTi5aBHybkvNPiEaA=/arc-anglerfish-arc2.com/arc-anglerfish-arc2.ua : //www.pilotonline.com/food-drink/photogallery_3f59ebec-edc5-11e8-afbe-df98172b095e.html2018-11-26T14: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/uoHjXmObTdbuqI3x8 arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/LWBJGGh3VRE6RE4SJWPTLPZ4QE.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / uQNB_3EqGDDWyqtmVrA0ukjgrgo = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / IVR2EU2Y2VAONN2CORH6XVR4OU.jpg https://www.pilot-subscribe.com/arc-pilot-rc/news/docs/pilot/s/c/s/pilot/?hl=ru&hl=ru prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/GEQLFXRAEBGH5MAEIQSNMYVXFQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/t8ODkZfZDh2VbGxDB1leh42FYrY=/arc-anglerfish-arc3-anglerfish-arc/arc3-anglerfish-arc/arc3-anglerfish-arc/arc3-anglerfish-arc2 .jpg https://www.pilotonline.com/inside-business/photogallery_0232a830-e433-11e8-8add-1795e12180e7.html2018-11-26T11: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/7entZNckX1uNgCf96j9_kMTo2rY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/S3XQ16QY5K2JPG3XBYPGJPG5JPG3XBYPJPG5JPG5K2 .pilotonline.com / resizer / An-VEUwBxp_MnjM95ox5nlbvc_g = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / NGLVZBIWONG2BAAOONAG6GNYFM.jpg https: //www.mazon.jpg /arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/OOQVHKBB65EDJPHFVLNZZZTIAY.jpg https: // www.Pilotonline.com/photogallery_5a1a923e-ec2a-11e8-8c4a-d354cf8dcd13.html2018-11-26T04:27:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/srUkFTPRZ3QzI1UV7c. .com / public / YCASFVLFMNES7LJNCIDZSAMRAY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/4BRB9e9r72eoQlqEijyX7bHJKfQ=/arc-anglerfish-arc2-prod-tron10c. www.pilotonline.com/resizer/5G7QXlpf_ggLU_hh31GfHXPDdL8=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/NLFX47JGKRBSBFNPXRDOUBD5SQ.jpg https://www.pilotonline.com/photogallery_818f37b6-dfe1-11e8-81dc-db45539126d6.html2018-11-26T04:27:00 srUkFTPRZ3QzI1UV7_8ji08xo7o = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. s3.amazonaws.com/public/C7GAXBM7TZDANJVG5VEJI3Y524.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/5G7QXlpf_ggLU_hh31GfHXPDdL8=/arc-anglerfish-arc2-prods3.amazonaws.com/public/NLFX47JGKRBSBFNPXRDOUBD5SQ.jpg https://www.pilotonline.com/business/photogallery_6a29ce77-017e-552e-b58a-2164e9a452d0.html2018-11otline. com / resizer / Jqovb0vTnoyhvd1_1GCFGtlwCcQ = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / PKR4KH6MNVHBHEDX6VW4DVUNDA.jpg https://www.pilotonline.com/pilotonline.com prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/HL4DEZVGM5h4XER5HEZOKHCQGA.jpg https: //www.pilotonline.com / business / photogallery_27284c78-0592-50d8-a3e5-a778489004fb.html2018-11-26T03: 05: 39Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/Tv97MZe6QevRvtkH5qK6oxrTW_0=-arc-dress2. .com / public / 75LETKYBRBCTDLVV2MV3AWAEGU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/DqFMFG9W3mzdJ6BNVapT4RNr5Ow=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronawc. www.pilotonline.com/nation-world/photogallery_766ac62b-cc07-5563-b8d2-124c62a80d6e.html2018-11-26T02:52:04Zhttps://www.Pilotonline.com/resizer/JMRxlnV-NLrrridjQbMvB4sDLBI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/FWRU4DIM7FAG7ELBWDZRNAJCLY.jpg //GLINCONGIQI03/ViCh3/ViCh3/ViCh3/ViCh3/ViLiCh3/ViChtx anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/OZR7DOQLI5HWZE4NQAXHVIMYUI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/X9f1ofCMKpgpv9qOZJr3. /public/I7h34S6T7ZHCZGSF6Z5HZNCUNQ.jpg https://www.pilotonline.com/nation-world/photogallery_56b8fb44-efbc-5476-8fda-2238e541d06d.html2018-11-26T02: 37: 01Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/wNnajtdDEoP0PLqx1hlrDZGyhZ0=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/Q46XALB103PLBGNPS.com/public/Q46XALB103PLGNB .pilotonline.com / resizer / gXVBfsXqxplojO0A_zVRKC_RyDU = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / XHTCVJAQ4VDIPHBUHFEQRKNEHY.jpg_with.com df8a21dbb0f9.html2018-11-26T02: 22: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/yjp8Zhgj_4cClKomJEXwQn-n-AM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/RS6BZWI3TBDAVNESGZ2W4L5FDQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/HszcuWlG8d844I6VOXBcPlBp6Xk=/arc-anglerfish3.-arc2-prod.com : //www.pilotonline.com/resizer/s3F6tPHMcXictAu-XaiPTGWdM8k=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/2WPFHFAQHRGBHBDQTHDR5Q4VI16sports/wwline.com College / norfolk-state / photogallery_089b5798-f11d-11e8-a044-b7daa571f8f7.html2018-11-26T01: 45: 00Zhttps: // www.Pilotonline.com/resizer/mcw4-qqM-aRknwRrNFdXL4G9d5g=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/P37UJP4DPJAGJDY3ZE5RU6DALQ.jpg pilotpilot / www. arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/MBBZSWYAH5DWHA7N7RYLIOIGIE.jpg https://www.pilotonline.com/photogallery_a11d3324-e92f-11e8-a72b-a7f18-25ht23cd: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/PrdML8lm6cCYPKhBPDNVgdnCXtk=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/KYNVLLZFZVF7HE2G2FXLG5OZQI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/_HTgpKycUyNPGtybm6AiD7gVzHI=/arc-anglerfish-arc2-prod/arc-anglerfish-arc2-prod/arc-anglerfish-arc2-prod.html /www.pilotonline.com/photogallery_ac97de88-e9bc-11e8-abc7-8734bb5f8330.html2018-11-25T23:19:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/ECkvZb8I6k9_wvZGipaqpGFc-cron-ds/disc-pds/ s3.amazonaws.com/public/K2XAILP7ERBURLUY7L32Hh3SHE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/e8zn6hhHCZHuR84nbg6DCnHei9g=/arc-anglerfish-arc2-prod.s3.amazonaws.com/public/7KSEW6KMKNATPFQYOJUIXB3LAY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/fb6Z1c98v1gpO9EkrWuJti9lmlk=/arc-anglerfish-arc2-prod-trona.jpg : //www.pilotonline.com/photogallery_237426c8-ec2f-11e8-ab01-03c2c6d57e22.html2018-11-25T19: 13: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/srUkFTPRZ3QzI1UV7c2-dzi-dj08-d08-d08-d2-d2-d2-aaaaaaaaaaaaaaaaaa tronc.s3.amazonaws.com/public/YCASFVLFMNES7LJNCIDZSAMRAY.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / 4BRB9e9r72eoQlqEijyX7bHJKfQ = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / C7GAXBM7TZDANJVG5VEJI3Y524.jpg https://Xwww.presilot.com/ru/html?hl=ru/ru/digital/html?hl=ru/html?hl=ru/html?hl=ru/html?hl=ru/html?hl=ru/html> prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/NLFX47JGKRBSBFNPXRDOUBD5SQ.jpg https://www.pilotonline.com/757teamz/basketball/photogallery_5db7d392-ec49-11e8-b7c2-25T458-11e8-b7c6-9358-11e8-b7c6-935a6 //www.pilotonline.com/resizer/0MrCXVh2xfNaM9mCGVjOyMGM2d8=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/AHYJRS3LJFHJZKLK6U3SJIIO6Q.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/MEEfIGr_k8RPeH0xQYuGdL54dsg=/arc-anglerfish3.GUGdL54dsg=/arc-anglerfish3.OGIUGdL54dsg=/arc-anglerfish3.OFFRc2-prodpdz.html/arc-anglerfish3. : //www.pilotonline.com/757teamz/basketball/photogallery_1cccfc54-f103-11e8-844c-ff030578e4a4.html2018-11-25T16: 45: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/0MrCXVh2mCGV2-MaMrCXVh2xfGV3 arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/AHYJRS3LJFHJZKLK6U3SJIIO6Q.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/MEEfIGr_k8RPeH0xQYuGdL54dsg=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/SOYTH7Q7GFDPTFFJ6AHW7OGU5I.jpg /www.pilotlery_info-gmail.com/filot_a_gmail.com/filot-e4-fc/v5-c8-34-a5-a7-p.html -810c-bf28b644e6c9.html2018-11-25T16: 40: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/hRxD7vMYfNGD5RfjIbWFlPgemwY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s.com/NoJPG.UA https://www.pilotonline.com/resizer/pcoHbJ95-66T0CpcxnE_IsJc8Pc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/J75E63T6ABB6REDL4X3WF5INTQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/gG15dP3nlsUff-SbvqBj_i0Mvhc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronpg.com/Quick-anglerfish-arc2-prod-tronpg https://www.pilotonline.com/resizer/BhAfleyP30eOaSD6QznKoBpcakw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/HZQA6DQJ65HNXIFHIJNT2TV10XQ. 9zI6CoxBIoEGJs1IR5-_kZ29_bI = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / CCVFOD76HRA4PHHWKD2KDGAS54.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/LrCd29kuO9jooVUkUky6quLAsOU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. /k3Vw0lYZCQ5cP7JMB8oY6h_R04E=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/YYWPZLSTEFCFBL6Q5TILDFW424.jpg https://www. .s3.amazonaws.com / public / PPYRTCAPY5FVPG4OTQ3UYNK7DQ.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / Ywhc4xEikUWPgJUsQ0phtDCF7JA = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / MG3RN54XLNCAPCOH7J2F6N2AJE.jpg https://www.pilballbollejet-subscribe.com/ru/photo/pilot-e/ -e3a17a74dae5.html2018-11-25T16: 40: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/hRxD7vMYfNGD5RfjIbWFlPgemwY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amaz3jpgG.PDWWNHUJI.C.F.J.F.JPG.JPG.U. //www.pilotonline.com/resizer/pcoHbJ95-66T0CpcxnE_IsJc8Pc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/J75E63T6ABB6REDL4X3WF5INTQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/gG15dP3nlsUff-SbvqBj_i0Mvhc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronpg.com/Quick-anglerfish-arc2-prod-tronpg https://www.pilotonline.com/resizer/BhAfleyP30eOaSD6QznKoBpcakw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/HZQA6DQJ65HNXIFHIJNT2TV10XQ. 9zI6CoxBIoEGJs1IR5-_kZ29_bI = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / CCVFOD76HRA4PHHWKD2KDGAS54.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/LrCd29kuO9jooVUkUky6quLAsOU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. /k3Vw0lYZCQ5cP7JMB8oY6h_R04E=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/YYWPZLSTEFCFBL6Q5TILDFW424.jpg https://www. .s3.amazonaws.com / public / PPYRTCAPY5FVPG4OTQ3UYNK7DQ.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / Ywhc4xEikUWPgJUsQ0phtDCF7JA = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / MG3RN54XLNCAPCOH7J2F6N2AJE.jpg https://www.pilabe.com/business-film-c/ec/docs/docs/docs/docs/business-film-c/s/photo/docs/docs/data/ .html2018-11-25T16: 35: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/JekXRd-uQdEFo2v3yTd8CN_kmh5=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/COCVY105UNFEJPGISSJRDJ08U.jpg //www.pilotonline.com/resizer/yaF1FaMV0qrV8Xl5B_lpQgzy82Q=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / QVABXY2455FYDNWUDRBDZMAEJU.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/Na-IxyMig6UQrNKJpGpygWbJwso=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronjc.s3.amaz10Naws.vp: /www.pilotonline.com/nation-world/photogallery_04abaf4d-7a15-5ca0-9ef9-4d44cfb459b4.html2018-11-25T16:19:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/5r7Q6wxJnZLrw8NuizHUZHUHHHU prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/QX3KHOVVS5CJRAXR5DFD4RGUTI.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / cBG80POUnu6yxnW1EYFjfsac8OE = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / V3FKTFBUJRGNDIC45MF2QZQ32M.jpg https://www.pilot-pilotonline.com / prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/DF4YSRVMVRE65L7R7A55HBRBQE.jpg https://www.pilotonline.com/757teamz/basketball/photogallery_70bd39f0-f068-11e8-97aa-1f543f2ca //www.pilotonline.com/resizer/5FavLLirC-Avrw_ONqnPa_CO7FM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/SSKLCXRAPBDKFMQXSB74AA2VU4.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/iZVI-U-hE2xXyIf5WnLjDsNKfLs=/arc-anglerfish3-arc2-sqwc/arc-anglerfish3-arc2-sql/arc-anglerfish3-arc2-sql/arc-anglerfish3-arc2-sq.html .jpg https://www.pilotonline.com/resizer/uQUREa0HJXtwGqj2-_LwlN5lHpo=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. com / resizer / bZ58POCdHGvFKpmabNzg-VUYk7U = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / VUQ7S4U575BA3L5ZIPTKAYOJP4.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/Slt6rVcfGNRVOYd5iKiMjQoMMqg=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. /photogallery_697277a6-e9f0-11e8-be92-f36dfdc51c43.html2018-11-25T12:00:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/dDZmfit-qGnHx5TSD3slNS0VkqE=/azcron-anglerfish-. com / public / 34CY3VIIHBDDDDNM5333APOPYE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/03_aSTMHRROPVHNKwFWjfp4p1Hw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/P7GTJSPFJBCXNBHKMUZLQK6LEE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/DBvpg2WpMNItrtdgZkWPLgMXZ9U=/arc-anglerfish3.Farc2-prod/arc-anglerfish3.-arc2-prod/arc-anglerfish3.-arc2-prod-publications/arc-anglerfish3. : //www.pilotonline.com/resizer/GIJc0KW-MxUoVVFi_FBcB7QSetQ=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/7U7QNIWDANBRVNG635UOS7PCJU.jpg 910 columns / photogallery_36c6f4d8-e9c5-11e8-94b4-b71fd481b154.html2018-11-25T11: 00: 00Zhttps: // www.Pilotonline.com/resizer/QLNHgW8l3AsgYnXAaAJVB02Nk50=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/SPS2BD4VERHX7HTT2WTC7H73BA.jpg /GRUGT2WTC7H73BA.jpg https://www.jsvg.com/ru/ru/ru/ru/ru/ru/ru/ru/ru/g/ru/ru/g/ru/ru/g/ru/g/ru/g/ru/ru/ru/ru/ru/ru/ru/g/ru/g/ru/g/ru/g/ru/g/ru/g/ru/ru/ru/g/g/g/g/ru/ arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/Z7LHASM3CVDODKLJUXGK6NS7KA.jpg https://www.pilotonline.com/news/photogallery_2f97e57c-deae-11e8-9c0f-cb96c322201885.htps11 //www.pilotonline.com/resizer/_wNDU_GPfHdqjozr1_IC5Tv-jH8=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/ERZ75WGPWJCMDAHHVWWJF7TTQM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/PHMwOP22IWxZQuPcu60suLf5eP0=/arc-anglerfish-arc2-prod-tron.ua/arc-anglerfish-arc2-prod-tron.html : //www.pilotonline.com/resizer/dwXT3cdAYSo24wk3ce6wXpkgJmY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. photogallery_171ce93a-ec27-11e8-9be9-5f05421cbd30.html2018-11-25T11: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com / resizer / QLNHgW8l3AsgYnXAaAJVB02Nk50 = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / SPS2BD4VERHX7HTT2WTC7H73BA.jpg https://www.pilizerBangler-subscribe.com/ru/ru/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/c/s/g/s/ prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/Z7LHASM3CVDODKLJUXGK6NS7KA.jpg https://www.pilotonline.com/news/photogallery_e9a08618-ec50-11e8-94d3-ffa1ce996418fa.ht10:00:00:00 www.pilotonline.com/resizer/At_yQxLkN3MXtVfXU4uYhRX1u5k=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / XRTKSVYICZCLDNILW6WAXPI6OI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/GyjTCVqEeurxzbCQ1m1DUERPILw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc. .pilotonline.com / resizer / duG1RxXcbEUyqr0uG_pH0drMxyQ = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / YUGXRU3h3FBBVOTP2GVYELLUVM.jpg .jpg -arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/EBNJIYR6ERGNNPB2HEKZYG4BDI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/U1fM_RPH-zvKvfqsetbirr8T7O0=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/6YXHLY5S7VAG7MASSXC4PSYL103 /news/photogallery_87e69d80-e9bd-11e8-9043-6363676e5151.html2018-11-25T10:00:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/XsR-AkidU2eW3wI9zH8X_g9q_c.8=/arc-anglerfish. amazonaws.com/public/TO6EO4FB6ZAQRHIT6ITZQ53NQ4.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/Vi6uuETVSm_2HHStg88ppmHeXMc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/KO4YVLI3UZDSHGGQNO5G5CD23Q.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/9M2BHOcuA7n8iHVaRF26OtbUUoc=/arc-anglerfish-arc2-prod-publications.jpg : //www.pilotonline.com/opinion/columns/photogallery_99ab8458-edd3-11e8-ac9b-87da420503df.html2018-11-25T05: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/WhJxvRXX4G_YZrO3 arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/LKBU46R3J5F5DODGWNJUJRGIFQ.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/RwxSwsP_mJxfX-kQLtvB1CwriS8=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/HEW3NXXS5BC7RKLS4PYVYJLLUU.jpg 75filotru/photo.info/photo.html -11e8-9009-6b198e1451dc.html2018-11-25T03: 41: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/zxlGmj-92EMAuOe9UVzvVQJKptc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronAWc.s/amaz XJ6EIOEYINGPPLBLIUYCX4ZDTY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/0uBh2SPSObn8qb9U1eKtLJ3WEcU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/BND7JKJGF5BFDHETTOZB22S7WM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/xif0ChCyfKK0seBs5jodixBKbfE=/arc-anglerfish-arc2-prod-trono.cz/arc2-prod-tron.html : //www.pilotonline.com/757teamz/football/photogallery_58593f80-f040-11e8-9da3-5ff5c1cf784a.html2018-11-24T23: 26: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/IioL5ztamknicizYWp arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/ZF3N6BQ52ZAPJNVE2HN2ZBFFNQ.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/U2dxN2a8sQpX2dnti9pghgL9qnU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/6ECUNB7MSRCCTPATHOHLCU2MHA.jpg https://www.fjcdjdzdzdzdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddb/ arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/TXYHC5LZPNHZPBO6KGXE7GIP3Q.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/wkaMfbTDhj4QqXLDHza-wURKK2c. /public/BAVVBWZPQ5E3BADDCJ7T3VRBNE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/ARhqV2jUqKM3NcOFCFI-JW9d0Ro=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/FBDGZ5FL2ZDGFA6IHGQGNTHJOM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/Fe-ATDvIocYFjqs8s1rBCZC9TOg=/arc-anglerfish-arc2-prod-tg=ru/arc-anglerfish-arc2-prod-tv/arc-anglerfish-arc2-prod-tpublications/arc2-prod-tv/arc-anglerfish-arc2-prod-tv/arc-anglerfish-arc2-prod-tpd-public/ https://www.pilotonline.com/resizer/z3XgbJz-OZhwUMuLoj8LcznHhnw=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/TPJK7IMPWVHINHURLZBTHERN16.jpg изменение размера / igduHclqLoGHg3MvguB9W7w6AKU = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / FQYUSPMS35B4XAR5EMTIPBOZXA.jpg https://www.pilotonline.com/sports/college/old-dominion/photogallery_ba55915e-f039-11e8-b3bb-abf63260983a.html2018-11-24T22:38:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/ uwpZ2r-DSdmRt3Bla1mrLwx3GeU = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. tronc.s3.amazonaws.com/public/HAEH5756KZETRN6XSNY3FJQJOM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/Fct6O4b7CCgJXaagdZDWROAtIqI=/arc-anglerfish-arc2-prod.s3.amazonaws.com/public/3FZY6XNFZNC3TPQ5SPM7R6HKKI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/hOYRw2aUyneatdVLfeQHF-lMpfo=/arc-anglerfish-arc2-prod-tq3/arc-anglerfish-arc2-prod-tq5.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/yIpokUDCVJlEyswpmDoFioOTmgU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/OW4SPYLVI5AMPFERNAEU2MY6AA.jpg / https://spilot.com/ photogallery_f4fb4f71-669e-5b51-91cd-4687b13c4e4d.html2018-11-24T22: 27: 26Zhttps: //www.pilotonline.com / resizer / 5tYtwB8vE1wUmf9InB8hcXTgdIo = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / UCGTB2PZDBALPGDV22ZYSOMPXQ.jpg /www.pilabs.com/ru/zwc/vc/sql/qs/v6/c/v1/qqq/v6/v6/6/qqq/v6/6/6/6/qyqq.jpg anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/6KBKKQHER5FTRMIENKMRIYFEBM.jpg https://www.pilotonline.com/nation-world/photogallery_843ad19f-92d4-59ed-8869-50-24dc21e201883d 54: 37Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/QfyAqWG-z5sGr2s6nJ105QSYCBU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/JVMGT75OPVFCVGQFPVDAFCXMYY.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/dOk0WNjsJxtRtCU0tsBwNS90jAs=/arc-anglerfish-arc2-A.3JAs=/arc-anglerfish-arc2-A.3SSC2C02-A.paz5.js/3/6/2/6/3/6/3/4/4/6/2/4/4/4/4/4 : / / /arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/IEKERTDK4VDLTB4LBGMECBQB5Q.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/vzKE0g1hT4U2dY_R3bOgfrtr1iI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/US47LLNGPVh5HO4NJ3XNSZ7.ru /DEKhoxSz-IsPmQrfAJdidCPbIqU=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/MUCIXDQRXRAJHBD5E3QZ57LEIQ.jpg https://www.pilotonline8cz57LEIQ.jpg https://www.pilotonline8bJr66x06d03d3d-dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd/ -prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/EDXJFTZ23ZDCFBSWTP67V665B4.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / 0n4BVduYybKloV-MCXyS3jOq7GM = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / JTT35CVN3BGCPJVTJVHOR2Uh4Y.jpg https://www.OUXfrescep.com/ru/doc/fres/piloton/ arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/4C6PSQMA2ZB3JAJPDY2VM7GGZA.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/B2Ij19OBZQi8UUlITSkqkW476-KY-KY-KY-RUB-KY-KY-SKQK-W476-KY .com / public / LEBABT7SGVCWBOAM7BNVXEW2JE.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/-wwUVgqiOlTPwJguzxPqDde9fVc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/2DCHVHPPV5GMLHJKCG7M33UBBQ.jpg https://www.pilotonline.com/photogallery_99ef441e-f02f-11e8-a325-57a141e1f727.html2018-11-24T21:26:00 resizer / 42wpF1heLe9ZlrAIEeSoYmFsrKw = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / NCE5CMXDRRA5TOEIAXY7FTZ7JE.jpg https://www.pilot4cz7je.jpg https://www.piloton3-doc-docs/result_pilotonline.com/reso_d_s_d_d_c/res/pilotonline/res/res/res/pilotonline/res/res/res/res/pilotonline/res/res/res/res/pilotonline/res/res/res/ tronc.s3.amazonaws.com/public/5WFFRQV2MZBO5P23L7QEUCGXRA.jpg https: //www.pilotonline.com / business / consumer / photogallery_0d2c9d7a-ed09-11e8-9076-7b5fcf60d854.html2018-11-24T20: 30: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/u2P6-zxT1A8ikXxXcGDczG1-SER8 .s3.amazonaws.com / public / JKWBZ4MPCFBR5MEFOQQQ3NGEVM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/rpQqlUqpZ9S-_ZPnRHU--KRV53A=/arc-anglerfish-arc2-prod- /MVW3FYWNOBGX7DBIOD2RUXPCA4.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/7wYMb8d-CnwCooP_M5OjOBNS1DQ=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/IM2O64E65ZAKVHZG5IFFCJUHJI.jpg https://www.pilotonline.com/government/nation/photogallery_5cc574d4-ed08-11e8-bf8d-f735320d772a.html2018-11:00. Pilotonline.com/resizer/UuxqUnTt2hp8NegaWzJSqyMs9VM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/BF6RUCECTJCALGGT3EHLK2J7Paeot2hp8NegaWzJSqyMs9VM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/7HPNBA2KABFRHAR4TIGYSGGIDA.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/N5MctyDzHFuh7BboD8Im7Jei-YY=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/HAS2UHL2LFFMZODKPITQ7TOSGQ.jpg https://www.pilews.com/gmail.com -bc4a-1b17d4141fdf.html2018-11-24T19: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/mkxzKUa-Rad0CEmT8I1GRS_isS0=/arc-anglerfish-arc2-produblic-tronc.s3. jpg https://www.pilotonline.com/resizer/inQqDQ8fjxpy2Soep0ol2F9_oPM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/XG3NCO2JW5DAHOCYYMDNA3DBQM.jpg https://www.pilotonline.com/photogallery_71e72474-f34e-11e8-9002-779c384a8d4b.html2018-11-24T19:00:00Z.com resizer / mkxzKUa-Rad0CEmT8I1GRS_isS0 = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / DGJZSFKGCVCVZNL4W2NVWZHFPM.jpg https://www.pilot-global.com/pilotonline.com/pilotonline.jpg prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/XG3NCO2JW5DAHOCYYMDNA3DBQM.jpg https: //www.pilotonline.ru / news / photogallery_1b4d7700-ec0d-11e8-87c9-3f749bd6049a.html2018-11-24T19: 00: 00Zhttps: //www.pilotonline.com/resizer/mkxzKUa-Rad0CEmT8I1GRS_isc.S0=/-arc-anglerfish .amazonaws.com / public / DGJZSFKGCVCVZNL4W2NVWZHFPM.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/inQqDQ8fjxpy2Soep0ol2F9_oPM=/arc-anglerfish-arc2-DApd-tpublications.jpg //www.pilotonline.com/business/consumer/photogallery_0

02-edac-11e8-8a64-5bf667a90da0.html2018-11-24T17:45:00Zhttps://www.Pilotonline.com/resizer/XOxBoHeOQ73SjlyJGe9HOdyh2Bg=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/WRLAF2OF2RD6LA5UG3OWZQCMS4.jpg 910FFpilotpilot / www. anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/523N4G54NFD6NOVQ7BLBAU6QFA.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/dN1NzC6GxgHteKjoipeFWT_C2Jw-prod-arc-rc-s.com /public/CDSLDLC4JintageFJ3WOB3DYTUIMI.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/XdK83FSzI0til9WpnVuSw0Nlym0=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/NF27JBO55RFU7CHVS2XMY2NWDQ.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/8Lqdf5xdPBhrmxBTmwmdOxYEf60=/arc-anglerfish-arc2-prod/arc-anglerfish-arc2-prod/arc-anglerfish-arc2-prod/arc-anglerfish-arc2-prod/arc-anglerfish-arc2-prod-dc/arc-anglerfish-arc2-prod-pdc/arc-anglerfish-arc2-prod / : //www.pilotonline.com/resizer/qm3nuUqo_jbp9HBSVg3evcG37dM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/S7C76UJ635APRCK25BNFEB3SQI. /arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/5Y563TNOGJBXJFCI7732WMPKCA.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/Nv4R1ynTTbaZIb0kJFDHXmHKYuM=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3. /_2NK67VQmkz3Z5NVb4VmNBKybNc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/A4ULXA7NOFGN3G2JLO6ASZQRRY.jpg https://www.pilot-pilotonline.com/pilotonline.com .s3.amazonaws.com / public / UB6B6F6X3BGNVHA6JSIQTNh5RA.jpg https: //www.pilotonline.com / resizer / 7x87rYC5yMasZkDSICWbANqwMJM = / arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com / public / TQCQYYWQ75FTRB7DERA77VNXDU.jpg https://www.pilizerHiPilot-Jarc.com/ru/film-subs/docs/d/c/s/c/s/c/s/c/s/html/html/s/c/c/c/c/c/c/c/c/2/2/2/3/3/2 prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/KLX4KNAPZBHFRJS3MMNQ5IWQ5Q.jpg https://www.pilotonline.com/news/health/photogallery_b422b884-ec47-11e8-b089-53c180934b: https://www.pilotonline.com/ //www.pilotonline.com/resizer/I-P_7AIse_D3ZsxkjGCLZSliybg=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/WWPIR6QUQZD2ZMNUPROPVH5h3M.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/SHPGXVw4WUvU6EaSI4gYnQmv3e0=/arXc-anglerfish-arc2-prod-tvU6EaSI4gYnQmv3e0=/arXc-anglerfish-arc2-prod-tpublica.jpg /www.pilotonline.com/resizer/Gku8fTImVx9ejYStNeEqL55cdBI=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/4JZVPW3BFZFCJBH5IWYN6K2C1016M.JBH5IWYN6K2C1016M.jot.jtv.jtv.jtw.html /arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/IZVY2XLPCBGWDh5MKBJC7OYI3A.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/jLi8pnzEuOHY2yP-2T06VwLJ9jc=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/U3RJSY4RERCYPLVYG16.GFOIU9 /news/photogallery_8a037958-e9ae-11e8-8b7a-3f9be87ce080.html2018-11-24T15:00:00Zhttps://www.pilotonline.com/resizer/QuD5_4728OXVxK9NbkSw3CCUXzM=/arc-anglerfish-arc-anglerfish-arc-anglerfish- com / public / 7KNTCRNJ2VGHDNB3F4K3FT3CII.jpg https://www.pilotonline.com/resizer/tGH54BlOKv5Ug_PeohINyDBmH_k=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/FTUIA6LKZRAGNAQOGAEGMMYEXQ.jpg https://www.pilotonline.com/life/home-garden/photogallery_ce24cb4e-e9ab-11e8-a73d-4f4d4ccf5179.html2018-11-24Tps://html2018-11-24Tps://www.pilotonline.com/life/home-garden/photogallery_ce24cb4e-e9ab-11e8-a73d-4f4d4ccf5179.html www.pilotonline.com/resizer/93jeppNqeq11a_Aw4Cg9iUrbFoA=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/RB2OA7FBXNEYPM3DD755RU7ECQ.jpg _ru/www.xsql.jpg .jpg arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/AY3IY5VODRGTPEVYKQ6NOK4IYU.jpg https: // www.Pilotonline.com/resizer/5_BmcWppKT_BcwDCvp0xQgvn0o8=/arc-anglerfish-arc2-prod-tronc.s3.amazonaws.com/public/NQRI6QGKYNDZ5DV7IDF6TBL4OI.jpg

Staging stage

The Picture Cultural Stage Шан в роли Саломеи, держащей голову Иоанна

Крестителя, снова с ее змеиными кудрями. Ее лицо покрыто золотой пудрой , а глаза тщательно обведены темными тенями. Здесь эта вестернизированная роковая женщина сопровождается женственной внешностью Иоанна Крестителя в исполнении Чэнь Нинцю.[18] В очередной раз образ Саломе представляет «мужественность, осажденную» женским грехом, пробуждая мощно соблазнительную голливудскую вампиршу, а также революционный дух советского современного танца, воплощенный Тянь Ханом в Шанхае. [19]

Актерский состав для Саломе был исключительным в художественном отношении, с Ю Шань в роли Саломе; Ван Лайтян с его «львиными волосами и глазами антилопы», как Иродиада; «кореец Валентино» Джин Ян [20] с меланхоличным выражением лица молодого сирийца; и «Поэт Мира Духа» Чен Нинцю в роли Иоанна Крестителя.[21] Сценография и «реалистичные декорации» для спектакля Salomé были первыми в театральных кругах того времени. Но наивысшее очарование спектакля, по словам художника-постановщика и концертмейстера скрипки Ву Цзуорен, исходило от «красивой и выразительной» восходящей звезды Юй Шаня, чья смелая и энергичная игра в роли Саломе была заразительно страстной. [22] В 1929 году, в том же году, когда была поставлена ​​постановка Саломе , Тянь Хан, комментируя «искусство и его связь с временем и политикой», заявил, что «искусство - это прыжок души, оно склоняется к идеализму; в то время как политика направлена ​​на сохранение статус-кво.. . искусство как индикатор более чувствительно, чем политика, это авангард политики »[23].

В своем эссе «Гунъян чжицянь» («Перед публичным выступлением») Тянь Хан описывает Саломе политизированным тоном с возрожденным тяготением к «красной революции». Он поддерживает пьесу Уайльда как призыв к гуманистическому освобождению и национальному спасению - эксцентричную интерпретацию, которой многие другие в то время не разделяли [24]. Политическая риторика Тянь Хана не может скрыть его одержимости смертельной соблазнительностью эротической любви, лежащей в основе пьесы Саломе , уже укоренившейся в его художественной чувствительности в Токио.Можно спросить, как декадентская чувственность пьесы, воспринимаемая многими как контрреволюционная, может быть истолкована как революционная. Ответ заключается в том, что для Тянь Хана и многих его коллег-авангардистов агрессивная женская сексуальность Саломе является воплощением и вытеснением радикальной революционной энергии. Атмосфера социальной и политической революции стала отправной точкой для пьесы Salomé в 1929 году. Что касается Тянь Хана, пьеса уже давно занимала его, казалось, давая ответ на его настойчивые, беспокойные поиски сексуального, духовного и духовного. политическое освобождение.

Этот комплекс Саломе был далее проявлен в статье Тянь Хана 1930 года о современном советском кино, основанной на двух эссе, написанных реальной «Красной Саломе», «мисс Соней», получившей образование в Москве. [25] В своем эссе Тиан позаимствовал предисловие Сони к произведению советского режиссера Якова Протазанова « Сорок первый » ( Сорок первый , 1927). Сюжетная линия дочери рыбака, превратившейся в красноармейца Марютку, и ее отношения любви-ненависти с офицером Белой армии на необитаемом острове явно очаровали Тиана и захватили его воображение.Он не мог не описать момент Саломеи после того, как женщина-солдат застрелила офицера. Держась за окровавленную голову возлюбленного, она плачет: «О, боже. . . моя милая . . . твои прекрасные глаза ». [26] Комментарий Тиана к этой сцене, хотя и был направлен на критику тропа Саломе посредством классового анализа, лишь показал его одержимость соблазнительной силой фигуры Саломе как в рассказе, так и в реальной жизни. Именно через историю фильма о Марютке Тянь Хан представил своим шанхайским читателям загадочную «мисс Соню», получившую образование в советских временах, - псевдоним Ан Е, реальной «Рыжей Саломе», которая вошла в личную жизнь Тиан примерно в это время.[27] В двадцать первом веке и Wilde Salomé , и An E, «Red Salomé» вернутся на китайскую сцену, чтобы рассказать историю Тянь Хана на стыке сексуальности и революции.

То, что сделало взаимодействие Тянь Хана с фигурой Саломе на протяжении 1920-х годов и после него в современном Китае таким увлекательным и важным, во многом связано с его воплощением сложного диапазона меняющихся и конкурирующих культурных и политических позиций из Токио, Шанхая и Пекин.Символика Саломе путешествовала между социал-демократией и коммунизмом, между Голливудом и Москвой, между сексуальностью и революцией и между 1920-ми и 2020-ми годами. Поминовение КНР Тянь Хана как основателя страны и празднование его работ по случаю 80-летия и 100-летия основания КПК не должно приводить к упрощенному толкованию культурной политики постановки Саломе в Китае. как линейная последовательность «превращения Саломе в красную (коммунистическую)».Скорее, он указывает на трудности и трудности, связанные с принятием культурного символа в основополагающий момент формирования собственной идентичности, и на взаимную конституирующую силу создания его заново с использованием ресурсов, как местных, так и международных, как местных, так и глобальных.


Примечания

[1] Перевод Саломе Тиан Ханом, вероятно, основан на первом английском издании пьесы Оскара Уайльда, переведенном с французского, иллюстрированном Одри Бердсли и опубликованном Элкином Мэтьюзом и Джоном Лейном в Лондон в 1894 году.Он, вероятно, также ознакомился с французским оригиналом и доступными японскими вступлениями и переводами пьесы, в том числе с кратким изложением Мори Огая Саломе , опубликованным в августовском выпуске Кабуки за 1907 год, когда пьеса впервые была представлена ​​в Японии. Подробнее о взаимодействии Тянь Хана с тропой Саломе от Токио до Шанхая, от китайских глубин военного времени до Пекина и с 1920-х по 1960-е годы см. Лян Луо, Авангард и популярное в современном Китае: Тянь Хан и Пересечение производительности и политики (Анн-Арбор, Мичиган: University of Michigan Press, 2014).

[2] Перевод Salomé Тянь Хань см. В Tian Han, trans., ‘Shalemei’, Shaonian zhongguo , 2 (9) (март 1921 г.). Впервые он был опубликован в виде книги издательством Zhonghua shuju (China Books) с иллюстрациями Одри Бердсли в 1922 году в Шанхае.

[3] Аяко Кано, Действуя как женщина в современной Японии: театр, гендер и национализм (Нью-Йорк: Palgrave Macmillan, 2001), 219.

[4] Дженнифер Хорн, «Алла Назимова», в Джейн Гейнс, Радха Ватсал и Моника Далл'Аста, ред., Проект женщин-пионеров кино (Нью-Йорк, Нью-Йорк: библиотеки Колумбийского университета, 2013).

[5] Тянь Хан, «Fanpaiya de shiji» («Век вампиров», 1927), in Tian Han sanwenji ( Сборник эссе Тянь Хана, ) (Шанхай: Цзиньдай Шудянь, 1936), 148- 49; Тиан Хан неправильно написал имя Аллы Назимовой как Анна Назимова на стр. 148.

[6] Подробнее о воссоздании Саломе в Пекинской опере «Белая змея» в 1950-е гг. И создании глобального архива «Белая змея», глубоко связанного с тропой Саломе, см. «Белая змея в Пекине. -создание социалистической оперы », в Лян Луо, Авангард и популярное в современном Китае, , глава 5; и Лян Луо, The Global White Snake (Анн-Арбор, Мичиган: University of Michigan Press, 2021).

[7] Тянь Хан, «Эго цзинчи чжи гэмин ю пинфу вэньти» (Русская революция и проблема богатых и бедных). Шэньчжоу xuecong ( Divine Land Review ), no. 1 (сентябрь 1917 г.).

[8] Тянь Хань, «Женщины дэ цзыцзи пипан» («Наша самокритика», 1930), в Тянь Хань цюаньцзи ( Полное собрание сочинений Тянь Хань ) (Шицзячжуан: Хуашань вэньи чубанше, 2000, т. 15), 103.

[9] Немецкое происхождение танцевальной труппы Дункана еще больше усложняет эту советскую связь.Спорно, можно ли назвать танцевальную труппу Ирмы Дункан или движение советской. Это было одновременно европейское и в некотором роде американское, опосредованное через Советский Союз. Безусловно, это встреча с интернациональным модернизмом. Тянь Хань намеренно представил эту встречу как сугубо советскую по духу.

[10] Тянь Хань, «Шуофэн» («Суровый ветер», 1927), в Тянь Хань цюаньцзи, , т. 13, 83-84.

[11] Тянь Хан имел в виду влиятельную работу Куриягавы Хакусона Kumon no shōchō ( символов агонии ) и свой визит в Куриягава в Киото весной 1921 года.

[12] Тянь Хань, «Шуофэн», in Tian Han quanji , vol. 13, 83-85.

[13] Тянь Хань, 'Kafei dian zhi yiye' ('Ночь в кафе'), Chuangzao jikan ( Creation Quarterly ), 1, (1) (1922), in Tian Han quanji , т. 1, 109-10.

[14] Qtd. в Линде Вонг, «Неадекватные» представления Саломе Оскара Уайльда в современном Китае », в Decadence (Fin de Siècle) в китайско-западном литературном противостоянии , изд. Мариан Галик (Братислава: Институт восточных и африканских исследований Словацкой академии наук, 2005), 103.

[15] Оуян Юйцянь, «Пан Цзиньлянь», в Китайская драма двадцатого века: Антология , изд. Эдвард М. Ганн (Блумингтон: издательство Индианского университета, 1983).

[16] Тянь Хань, «Гуанью Ву Сун юй Пань Цзиньлянь», Пинлунь бао (Куньмин), 12 мая 1945 г., в Тянь Хань цюаньцзи , т. 17, 335-37.

[17] Юй Шань происходил из известной семьи Ю из Шаньинь (Шаосин), Чжэцзян. Ю сделала себе имя, сыграв Саломе и Кармен в постановках Тиан в 1929 и 1930 годах соответственно.См. Ван Минцзян, «Юй Шань: Minguo caizi milian de jiaren», Wenshi bolan , 5 (2009).

[18] Чтобы узнать больше о Чэнь Нинцю и его репутации антияпонского поэта, лирика, драматурга и киноработника, см. Han Sanzhou, 'Yan'an «guairen» Sai Ke de «guaishi»', Gejie , 3 (2011), 32.

[19] Для информативного обсуждения мужественности в современной китайской литературе см. Xueping Zhong, Masculinity Besieged? Проблемы современности и мужской субъективности в китайской литературе конца двадцатого века (Дарем, Северная Каролина: издательство Duke University Press, 2000).

[20] Хе Сын Чунг, «Корейское Валентино: Джин Ян (Ким Ём), китайско-корейское единство и шанхайские фильмы 1930-х годов», корееведение 37 (2013), 150–70.

[21] См. Тан Шаохуа, Вентань вангши цзяньчжэн (Тайбэй: Чжуаньцзи вэньсюэ чубаньше, 1996).

[22] См. Чжоу Чжаокуань, изд., Ивэй рэншэн: Ву Цзорен де ишэн (Сиань: Шаньси жэньминь мэйшу чубаншэ, 1998).

[23] Тянь Хань, «Ишу ю шидай цзи чжэнчжи чжи гуаньси», в Тянь Хань няньпу , изд.Чжан Сянхуа (Пекин: Чжунго xiju, 1992), 129.

[24] Тянь Хан, «Gongyan zhiqian: Ti ziji hanjiao, ti minzhong hanjiao», в Tian Han quanji , 15, 174-77.

[25] Тянь Хань, «Сулиан дяньин ишу фачжань дэ цзяосюнь ю воуо дианин юньдун де цяньту», Нангуо юэкань , 2, (4) (20 июля 1930 г.), в Тянь Хань цюаньцзи , т. 18, 74-95.

[26] Там же, 80.

[27] Постановка современного китайского авангардиста Тянь Циньсиня 2001 года о романтических отношениях Тянь Хана с четырьмя современными женщинами, Kuangbiao ( Hurricane ), воссоздает An E , Вечный соратник Тянь Хана в искусстве, революции и любви, как «Красная Саломе».См. Tian Qinxin, Kuangbiao , in Tian Qinxin de xiju ben (Пекин: Beijing daxue chubanshe, 2010).

Белковая деацетилаза CobB взаимодействует с c-di-GMP

Введение

Циклический дигуанозинмонофосфат (c-di-GMP) впервые был идентифицирован в Gluconacetobacter xylinus , где было обнаружено, что он регулирует синтез целлюлозы. Впоследствии было показано, что c-di-GMP участвует в широком спектре бактериальных биологических процессов, таких как подвижность бактерий, образование биопленок, вирулентность и регуляция транскрипции 2-4 .Однако эти процессы, вероятно, представляют только часть полного объема его разнообразных функций в клетке из-за типичных проблем, связанных с однозначным приписыванием функциональности непосредственно активности определенного вторичного мессенджера малых молекул 5 . Первым шагом к этому пониманию часто является идентификация белков, с которыми он сильно взаимодействует, как показано в исследованиях связывания c-di-GMP с YcgR 6 , CckA 7 , BldD 8 и CheY- как (Cle) белки 9 .Таким образом, мы предположили, что лучшее понимание полного репертуара функций c-di-GMP у бактерий может возникнуть на основе всестороннего знания всего диапазона белков, с которыми он связывается.

c-ди-GMP синтезируется дигуанилатциклазами (DGC) 10 и разлагается специфическими фосфодиэстеразами (PDE) 11-13 . В E.coli доминирующими DGC являются YdeH (также известный как DgcZ) 14 и DosC 15 , а основными PDE являются YhjH 16 и DosP 15 .Было показано, что каждый из этих белков модулируется «первыми» посредниками, такими как свет, кислород и температура 2 . Тем не менее, благодаря участию c-ди-GMP в вышеупомянутых фундаментальных биологических процессах, которые все хорошо регулируются многими основными метаболическими механизмами 17, 18 , существует также возможность того, что биосинтез c-ди-GMP также регулируется. через связанные с метаболизмом внутриклеточные сигналы.

Белок семейства Sir2 CobB представляет собой NAD + -зависимую деацетилазу, которая высококонсервативна у прокариот 19, 20 E.coli CobB является единственным гомологом Sir2, хотя существуют две формы CobB, а именно CobB и CobB S , первая из которых имеет дополнительные 37 аминокислотных остатков на N-конце 21 . CobB проявляет активность деацетилирования белков и регулирует множество физиологических функций. Например, CobB деацетилирует лизин-609 синтетазы ацетил-кофермента А (Acs), чтобы активировать его активность 22 , что приводит к увеличению клеточной концентрации ацетил-кофермента А (ацетил-КоА), который является центральным компонентом энергетического метаболизма. .Кроме того, CobB регулирует хемотаксис E.coli путем деацетилирования белка-регулятора реакции хемотаксиса (CheY) 23 , а также активность N-гидроксиариламин-O-ацетилтрансферазы (NhoA) 24 и топоизомеразы I (TopA) . 25 . Тем не менее, несмотря на критическую роль, которую CobB играет во многих биологических процессах, его внутренняя регуляция остается плохо изученной 26-28 .

Для глобальной идентификации эффекторов c-di-GMP и изучения новых функций c-di-GMP мы использовали E.coli протеомный микрочип 29 для общепротеомной идентификации c-di-GMP связывающих белков. Неожиданно мы обнаружили, что c-di-GMP прочно связывается с CobB. Последующий биохимический анализ подтвердил, что c-di-GMP связывается с CobB и ингибирует его деацетилирующую активность как in vitro , так и in vivo . Кроме того, мы обнаружили, что основной DGC в E.coli , YdeH, эндогенно ацетилирован, а CobB способствует стабильности и активности YdeH посредством деацетилирования лизина-4.В целом, мы установили основанную на доказательствах петлю регуляции, лежащую в основе цитоплазматической концентрации c-di-GMP, которая включает его прямое связывание с CobB и, следовательно, его ингибирование.

Результаты

Протеиндеацетилаза CobB представляет собой новый эффектор c-di-GMP

Для идентификации новых эффекторов c-di-GMP протеомный микрочип E.coli был зондирован биотин-c-di-GMP. Таким образом, CobB (в частности, версия CobB с дополнительным N-концевым хвостом) был идентифицирован как сильное связывающее вещество c-di-GMP (рис.1а) . Чтобы подтвердить это взаимодействие, мы разработали простой анализ in vitro , в котором очищенный CobB инкубировали с биотин-c-ди-GMP, подвергали УФ-сшивке, а затем исследовали флуоресцентным стрептавидином. 30, 31 Мы обнаружили, что c-di-GMP действительно демонстрирует сильное связывание с CobB, хотя следовые связывания также наблюдались для cGMP и c-di-AMP (Fig. 1b) . Смешивание c-di-GMP с биотин-c-di-GMP перед добавлением этих двух веществ к CobB привело к значительному снижению связывания биотин-c-di-GMP с CobB (рис.1б) . Чтобы количественно оценить силу связывания этого взаимодействия, мы выполнили изотермическую калориметрию титрования (ITC) и обнаружили, что константа сродства c-di-GMP / CobB, K d , составляет 21,6 мкМ при стехиометрии связывания 0,97. Мы также выполнили анализы ITC с цГМФ и ц-ди-АМФ, и не было обнаружено связывания с этими двумя молекулами (рис. 1c и дополнительный рис. 1a-c) . Чтобы подтвердить эти результаты, мы также определили константу сродства с помощью микромасштабного термофореза (MST), который дал K d 22.7 ± 1,63 мкМ для взаимодействия c-di-GMP и CobB (дополнительный рис. 2) . Однако мы отмечаем, что хотя константы сродства, определенные из ITC и MST, согласуются друг с другом, мы наблюдали некоторую полимеризацию CobB в присутствии c-di-GMP (дополнительный рис. 3) , что может несколько повлиять на измерение сродство к c-ди-GMP. Тем не менее, вместе взятые, эти результаты ясно показывают, что c-di-GMP специфически связывается с CobB.

Рис. 1. Белковая деацетилаза CobB представляет собой новый эффектор c-di-GMP.

(a) Протеомные микроматрицы E.coli зондировали с помощью био-c-ди-GMP с последующей инкубацией с Cy3-конъюгированным стрептавидином. Контрольный эксперимент проводили с биотином. Наблюдали очевидную разницу в связывании CobB на микрочипах, инкубированных с био-c-ди-GMP по сравнению с биотином. На каждый белок приходится два пятна, SNR (+) - это среднее отношение сигнал / шум двух повторяющихся пятен. (b) Тест блоттинга на стрептавидин. Очищенный аффинно очищенный CobB инкубировали с 10 мкМ био-c-ди-GMP.10 мкМ биотина, биотин-цГМФ и биотин-ц-ди-АМФ были включены в качестве отрицательных контролей. В полосе 3 rd CobB инкубировали с 10 мкМ био-c-ди-GMP и 20 мкМ c-ди-GMP. Связывание биотинилированных лигандов визуализировали стрептавидином. Окрашивание серебром показало, что для каждой реакции были включены равные количества CobB. (c) ITC-анализ связывания c-di-GMP и CobB. 1,5 мМ c-di-GMP (фиолетовая линия) титровали в CobB, в параллельных анализах равное количество cGMP (зеленая линия) и c-di-AMP (красная линия) включали в качестве отрицательных контролей.Kd связывания c-di-GMP и CobB была определена как 21,6 мкМ.

c-di-GMP ингибирует деацетилазную активность CobB и подавляет биогенез ацетил-CoA

С демонстрацией связывания между c-di-GMP и CobB мы предположили, что c-di-GMP может влиять на деацетилазная активность CobB. Чтобы проверить это, мы исследовали активность CobB в присутствии c-di-GMP, отслеживая деацетилирование хорошо известных субстратов CobB, Acs 22 , CheY 23 , NhoA 24 .Перед инкубацией с CobB мы обнаружили, что очищенные Acs из CobB-дефицитной E.coli cobB ) сильно ацетилированы ( рис. 2а, ). Инкубация с CobB привела к значительному снижению ацетилирования, что согласуется с предыдущей работой 22 ( рис. 2а, ). Однако в присутствии c-di-GMP деацетилирование Acs значительно ингибировалось дозозависимым образом (фиг. 2a и дополнительная фиг. 4a) . Напротив, ни присутствие цГМФ, ни ц-ди-АМФ не влияло на деактилирование CobB Acs.Аналогичные результаты были получены для CheY (дополнительный рисунок 4b) и NhoA (дополнительный рисунок 4c) .

Рисунок 2. c-di-GMP ингибирует деацетилазную активность CobB и подавляет биогенез ацетил-КоА.

(a) Анализ активности CobB проводили с использованием Acs в качестве субстрата. Потеря ацетилирования Acs указывает на деацетилазную активность CobB, что подтверждается пан-антиацетильным антителом. (три препарата; ** P <0,01, двусторонний t-критерий Стьюдента).Уровни белка Acs и CobB определяли окрашиванием серебром. (б) Кинетика реакций, катализируемых ферментом CobB. Каталитическую кинетику CobB проводили с добавлением 0, 10, 20, 80 мкМ c-di-GMP, и ацетилированный пептид использовали в качестве субстрата. Ацетилированные и деацетилированные пептиды были количественно определены с помощью ВЭЖХ с тремя повторностями, и эти кривые были подогнаны по уравнению Михаэлиса-Ментена с использованием GraphPad Prism 6. (c) Уровни эндогенного c-di-GMP 6 E.coli определяли с помощью UPLC-IM-MS (три препарата; * P <0,05, двусторонний t-критерий Стьюдента). (d) Активность деацетилирования CobB контролировали с использованием эндогенных Acs в качестве субстрата для 6 штаммов. 3xFLAG-меченные Acs обогащали антителом против FLAG, и уровень ацетилирования определяли с помощью пан-антитела против ацетила. Экспрессию DGC и CobB определяли с использованием антитела против His. Гистограмма показывает количественное определение уровня ацетилирования Acs.(три препарата; * P 0,05 и ** P <0,01, двусторонний t-критерий Стьюдента) (e) c-di-GMP модулирует синтез ацетил-CoA посредством ингибирования CobB до деацетилирования Acs. (f) Были определены кривые роста 6 штаммов. Штаммы E.coli культивировали в среде Фогеля-Боннера. Рост измеряли через 8, 12, 16, 20, 24 и 32 часа в трех повторностях.

Чтобы изучить ингибирование c-di-GMP на CobB более подробно, мы измерили кинетику деацетилирования CobB ацетилированного пептида 32 при различных концентрациях c-di-GMP.Мы обнаружили, что c-di-GMP значительно снижает максимальную каталитическую скорость CobB без изменения значений Km, в результате чего K i c-di-GMP для CobB составляет 32,27 мкМ ( рис. 2b, ). Таким образом, c-di-GMP неконкурентно ингибирует активность деацетилирования CobB, что позволяет предположить, что область связывания c-di-GMP на CobB не находится в каталитическом кармане.

Чтобы дополнительно подтвердить ингибирование c-di-GMP на активность CobB, мы попытались изменить эндогенные уровни c-di-GMP и протестировать активность деацетилирования CobB in vivo E.coli , YdeH 14 является основным DGC, который производит c-di-GMP. Таким образом, мы исследовали штамм E.coli со сверхэкспрессией YdeH (y deH + ) и штамм, экспрессирующий дисфункциональный мутант YdeH ( ydeH G206A, G207A ) 14 для получения штаммов с высоким и низкие уровни c-di-GMP, соответственно. Чтобы контролировать активность CobB, мы исследовали уровень ацетилирования эндогенных Ac, к которым был прикреплен хромосомный C-концевой FLAG-тег.Мы также исследовали серию штаммов, обедненных CobB, а именно Δ cobB , Δ cobB :: cobB и Δ cobB :: cobB ydeH + , для дальнейшего изучения этого взаимодействия. Как и ожидалось, высокие уровни c-di-GMP четко наблюдались для штаммов с YdeH + (рис. 2c) . У этих штаммов мы обнаружили значительное снижение деацетилирования Acs (рис. 2d) . Мы обнаружили, что это деацетилирование Acs отменяется делецией CobB (Δ cobB ), и что это можно восстановить, вернув CobB (Δ cobB :: cobB ).Таким образом, эти результаты показывают, что c-di-GMP увеличивает уровни ацетилирования Acs зависимым от CobB образом.

Известно, что CobB активирует Acs посредством деацетилирования K609, а Acs отвечает за синтез ацетил-CoA, который необходим для роста клеток 22 . Также известно, что и ацетат, и пропионат могут служить донором для ацетил-КоА для роста клеток 33, 34 (Рис. 2e) . Чтобы еще раз подтвердить регуляторную роль c-di-GMP в синтезе ацетил-КоА, все вышеупомянутые штаммы (рис.2f) культивировали с использованием ацетата или пропионата в качестве единственного источника углерода. Для клеток с дефицитом CobB (Δ cobB ) мы наблюдали очевидный дефект роста, соответствующий отсутствию активированных Ac. Сходным образом сверхэкспрессия YdeH значительно ингибировала рост клеток у штаммов ydeH + и Δ cobB :: cobB ydeH + . Эти результаты согласуются с ингибированием CobB высокими уровнями c-di-GMP (фиг. 2f, дополнительная таблица 1) .Мы также обнаружили, что штамм ydeH G206A, G207A демонстрировал такой же рост, как и штамм WT. Ингибирование роста в штаммах с ydeH + было аналогичным при концентрациях ацетата или пропионата 10 мМ или 30 мМ (дополнительный рисунок 5, дополнительная таблица 1) . Таким образом, помимо подтверждения ингибирования c-di-GMP CobB in vivo , эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что c-di-GMP является физиологически значимым эффектором регуляции биогенеза ацетил-CoA посредством ингибирования активности деацетилирования. CobB.

c-di-GMP глобально влияет на CobB-зависимое деацетилирование в

vivo

Чтобы определить, может ли c-di-GMP влиять на CobB-зависимое деацетилирование в глобальных условиях, мы применили метку стабильных изотопов с аминокислотами в клеточной культуре ( SILAC) в сочетании с MS для количественного сравнения уровней ацетилирования белка в клетках WT и ydeH + . Ранее Weinert et al . 34 идентифицировали 366 сайтов ацетилирования, регулируемых CobB, когда E.coli культивировали в среде M9 с добавлением 0,2% глюкозы. Кроме того, Cerezo et al. 35 идентифицировал 283 сайта ацетилирования в E.coli в условиях ограничения углерода. Поскольку ацетилом E.coli значительно различается в разных условиях культивирования, для облегчения сравнения с предыдущей работой мы приняли процедуру, разработанную Weinert et al . 34 с небольшими изменениями (см. Методы). Всего было идентифицировано 802 сайта ацетилирования ( набор данных S1 ), из которых 107 ( набор данных S2 ) показали усиленное ацетилирование при сверхэкспрессии YdeH (рис.3а, б, доп.6) . Из сайтов регулируемого CobB ацетилирования, идентифицированных Weinert et al . 34 ( набор данных S3 ), 43 были обнаружены в нашем исследовании, 28 из которых были среди тех, которые показали большее ацетилирование в ydeH + (рис. 3c, набор данных S4) . Следовательно, сайты, регулируемые CobB, обогащены клетками ydeH + . Кроме того, мы картировали 107 сайтов с повышенной регуляцией c-di-GMP на 87 белков и обнаружили, что 42 из этих белков перекрываются с 271 регулируемыми CobB белками, идентифицированными ранее 34 (рис.3d, набор данных S5) . Мы также сравнили функциональные категории белков с повышенной регуляцией c-di-GMP с белками, регулируемыми CobB, и обнаружили, что эти два набора белков очень похожи в нескольких классификациях (дополнительный рис. 7) . Мы отмечаем небольшие отличия нашей процедуры от описанной Weinert et al . (в частности, отсутствие фракционирования перед анализом MS) может объяснить меньшее количество сайтов ацетилирования, идентифицированных здесь по сравнению с более ранней работой (802 vs.3680). Тем не менее, наши данные убедительно показывают, что регулируемое c-di-GMP ацетилирование тесно связано с CobB-зависимым деацетилированием. Таким образом, эти результаты предполагают, что c-di-GMP глобально влияет на CobB-зависимое деацетилирование белка in vivo .

Рис. 3. c-di-GMP глобально влияет на CobB-зависимое деацетилирование.

c-di-GMP влияет на ацетилирование E.coli . Два штамма, , то есть ., WT и ydeH + , были включены для количественного анализа ацетилирования с использованием SILAC-MS. (a) Масс-спектры показывают легкий ( ydeH + ) и тяжелый (WT) сигналы для репрезентативного пептида. (b) Гистограмма показывает распределение соотношения SILAC сайтов ацетилирования в клетках ydeH + по сравнению с таковым для клеток WT. Уровни 107 ацетилированных пептидов были повышены в ydeH + . (c) Круговые диаграммы показывают перекрытие сайтов ацетилирования, регулируемых c-di-GMP, и известных сайтов ацетилирования, регулируемых CobB, о которых сообщают Weinert et al . (d) На графиках показано перекрытие белков ацетилирования, регулируемых c-di-GMP, и известных белков ацетилирования, регулируемых CobB, о которых сообщают Weinert et al .

Мутагенез и исследования связывания CobB и взаимодействия c-di-GMP

Есть дополнительные 37 аминокислотных N-концевых хвостов у CobB по сравнению с CobB S 21 ( Fig. 4a ). Анализы стрептавидин-блоттинга показали, что укорочение N-концевого фрагмента CobB нарушает связывание c-di-GMP, предполагая, что остатки 1-37 CobB важны для взаимодействия c-di-GMP ( рис.4b ). Известно, что c-di-GMP связывается со многими из своих эффекторов с помощью остатков Arg, Leu, Asp и Glu 36 . Чтобы определить точные сайты связывания на CobB, мы мутировали все остатки Arg, Leu, Asp и Glu на Ala в N-концевом домене CobB. Мы обнаружили, что только мутанты CobB с R8A, R17A и E21A проявляют ослабленное взаимодействие с c-di-GMP (Fig. 4c) . Затем мы выполнили титрование ITC с этими мутантами и обнаружили, что значения K d составляют 1,8 мМ, 1.6 мМ и 0,32 мМ для CobB R8A , CobB R17A и CobB E21A , соответственно (рис. 4d) , что в 15-83 раз ниже, чем у CobB дикого типа (рис. 1c и дополнительный рис. 1d-f) . Несмотря на потерю связывания c-di-GMP, CobB R8A , CobB R17A и CobB E21A проявляли активность деацетилазы, аналогичную CobB. Важно отметить, что добавление c-di-GMP не ингибирует активность этих мутантов (фиг. 4e) .В совокупности эти данные предполагают, что R8, R17 и E21 важны для связывания c-di-GMP, но не участвуют напрямую в каталитической активности CobB.

Рисунок 4. Определение сайтов связывания c-di-GMP на CobB.

(a) Архитектура домена CobB показывает N-концевой домен (окрашен в желтый цвет). В то время как для усеченной версии CobB, , то есть , CobB S , N-концевой домен отсутствует. (b) CobB S потеряла связь с c-di-GMP.И CobB, и CobB S инкубировали с био-c-ди-GMP. После УФ-сшивания реакционные смеси подвергали блоттингу стрептавидином. (c) Блоттинг-анализ стрептавидина для мутантов WT и CobB. Известно, что c-di-GMP имеет тенденцию связывать остатки Arg (R) и Glu (E). Мы индивидуально мутировали все остатки R и E, чтобы точно определить сайты связывания. Анализы связывания c-di-GMP проводили со всеми этими мутированными CobB, связывание визуализировали с помощью стрептавидина. Нагрузки контролировали окрашиванием по Ponceau S. (d) ITC-анализ для измерения кинетики связывания c-di-GMP и трех мутантов CobB. (e) Анализ деацетилирования in vitro трех мутантов CobB с использованием Acs в качестве субстрата в трех повторах. (f) Активность деацетилирования мутантов CobB контролировали с использованием эндогенных Acs в качестве субстрата in vivo . (три препарата; двусторонний t-критерий Стьюдента, * P <0,05) (g) Были определены кривые роста мутантных штаммов CobB.Рост измеряли через 8, 12, 16, 20, 24 и 32 часа в трех повторностях.

Для дальнейшей проверки специфического связывания c-di-GMP с CobB мы сконструировали штаммы этих трех мутантов CobB, т.е. , Δ cobB :: cobB R8A ydeH + , Δ cobB :: cobB R17A ydeH + и Δ cobB :: cobB E21A ydeH + на основе штамма E.coli , который включает хромосомные метки.Эти штаммы культивировали с ацетатом или пропионатом и измеряли концентрации c-di-GMP (, дополнительная фиг. 8a), . Чтобы контролировать активность in vivo CobB, мы исследовали ацетилирование эндогенных Ac. Как и ожидалось, уровни ацетилирования Acs были значительно ниже в штаммах с этими мутантами CobB по сравнению с таковым в Δ cobB :: cobB ydeH + штамм (рис. 4f) . Кроме того, эти мутантные штаммы CobB показали те же скорости роста, что и Δ cobB :: cobB , но более высокие скорости роста, чем Δ cobB :: cobB ydeH + (рис.4g, дополнительный рис. 8b-d) . Следовательно, эти результаты предоставляют in vivo доказательств роли этих остатков в CobB в связывании c-di-GMP.

Связывание и ингибирование активности деацетилирования CobB с помощью c-di-GMP является консервативным среди прокариот.

CobB является гомологом Sir2, который является высококонсервативным у прокариот. Таким образом, мы предположили, что связывание и ингибирование c-di-GMP, наблюдаемое с CobB из E.coli , является таким же для гомологов CobB у других прокариот.Чтобы проверить эту гипотезу, последовательности белка CobB из ряда очень разнообразных бактерий были выровнены по (дополнительный рис. 9) . Мы обнаружили, что область связывания c-di-GMP достаточно хорошо консервативна у этих бактерий (Рис. 5a) . Исследуя S. typhimurium CobB в качестве типичного члена этого консервативного набора, мы обнаружили, что CobB S. typhimurium связывается с c-di-GMP, но не с c-di-AMP и cGMP ( рис. 5b. ). Кроме того, мы определили сродство S.typhimurium CobB и c-di-GMP должны составлять 15,5 мкМ (дополнительный рисунок 10) , и что деацетилирование Acs CobB S.typhimurium может явно ингибироваться c-di-GMP, но не cGMP. и c-di-AMP (рис. 5c) .

Рисунок 5. c-di-GMP связывает CobB и ингибирует его активность, консервативно у прокариот.

(a) CLUSTALW выравнивание связывающего мотива c-di-GMP и CobB. Остатки, участвующие в связывании c-di-GMP R8, R17 и E21, были заключены в рамку (серый цвет), а глубина цвета указывала на степень консервативности остатков. (b) Анализ связывания c-di-GMP для E.coli и S. typhimurium CobB. E.coli и S. typhimurium CobB инкубировали с био-c-di-GMP, такое же количество биотина, cGMP и c-di-AMP были включены в качестве контролей. (c) c-di-GMP ингибирует активность деацетилазы S. typhimurium CobB in vitro . Анализ активности CobB S. typhimurium проводили с использованием E.coli Acs в качестве субстрата.Уровень ацетилирования Acs определяли с помощью пан-антиацетильных антител. (три препарата; * P <0,05, двусторонний t-критерий Стьюдента).

CobB деацетилирует YdeH на K4, чтобы активировать его активность DGC

Ацетилирование белка является одной из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций у бактерий (и эукариот), при этом сотни ацетилированных белков уже идентифицированы в E.coli 37, 38 . Мы предположили, что некоторые белки, участвующие в метаболизме c-di-GMP, ацетилированы эндогенно и могут быть деацетилированы CobB.Мы выбрали 4 DGC (YdeH, YaiC, YegE и YeaJ), 2 PED (YahA, DosP) и 3 GTPases (Era, YihK и YihI) из E.coli , чтобы проверить эту возможность. Мы обнаружили, что 2 DGCs (YdeH, YegE) и 2 GTPases (Era, YihK) были ацетилированы (Рис. 6a) . Далее, обрабатывая эти белки CobB, мы обнаружили, что YdeH (DGC) и Era (GTPase) могут эффективно деацетилироваться с помощью CobB (Рис. 6a) . Для определения остатка (ов) YdeH, нацеленного на деацетилирование CobB, как ацетилированный YdeH, так и обработанный CobB деацетилированный YdeH подвергали масс-спектрометрическому анализу.Таким образом, YdeH K4, K170, K277 были определены как сайты, которые могут быть деацетилированы CobB (Рис. 6b, дополнительный Рис. 11) . Чтобы проверить эти сайты, мы по отдельности мутировали все 8 остатков Lys YdeH в Ala и обнаружили, что только мутант YdeH K4 обнаруживает значительно сниженный уровень ацетилирования (Рис. 6c) . Эти результаты показывают, что K4 является доминирующим ацетилированным сайтом на YdeH. Кроме того, два других сайта ацетилирования также были идентифицированы на Era (K171) (дополнительный рис.12a) и YegE (K936) (дополнительный рис. 12b) .

Рисунок 6. CobB повышает уровень c-di-GMP посредством деацетилирования основной дигуанилатциклазы YdeH в E.coli .

(a) Уровни ацетилирования четырех ферментов, связанных с c-di-GMP, из E. coli с обработкой CobB или без нее контролировали с помощью пан-антиацетильных антител. (b) Масс-спектрометрический анализ (МС) для определения сайтов ацетилирования YdeH, которые могут быть деацетилированы CobB.Очищенный аффинно очищенный YdeH с обработкой CobB или без нее подвергали анализу MS. K4 был открыт как сайт деацетилирования. (c) Мутагенез YdeH подтвердил, что K4 является основным сайтом ацетилирования. Все 8 остатков Lys YdeH были по отдельности мутированы на Ala. Ацетилирование визуализировали с помощью антиацетильного антитела. (d) Мутагенез YdeH K4 подтверждает ацетилирование K4. Были сконструированы три одиночных мутанта YdeH, K4R, K4Q и K4A. (e) CobB модулирует синтез c-di-GMP посредством деацетилирования YdeH. (f) Активность DGC трех мутантов вместе с WT YdeH и CobB, обработанными WT YdeH, анализировали с использованием UPLC-IM-MS in vitro с тремя повторностями, площади пиков представляют количества c-di-GMP в эти образцы. (g) Уровни ацетилирования YdeH и концентрации c-di-GMP измеряли с мутантами CobB и мутантами YdeH. Уровень ацетилирования очищенного YdeH определяли с помощью пан-анти-ацетильного антитела, а уровни белка YdeH и CobB определяли с помощью анти-His-антитела.(три препарата; * P <0,05, ** P <0,01, двусторонний t-критерий Стьюдента).

Чтобы проверить функциональную роль ацетилирования YdeH K4, мы мутировали Lys в Arg (YdeH K4R ), Gln (YdeH K4Q ) или Ala (YdeH K4A ). Вестерн-блоттинг показал, что эти мутации значительно снижали уровень ацетилирования YdeH по сравнению с WT YdeH (фиг. 6d) . Поскольку YdeH является основным DGC в E.coli , мы затем решили проверить, может ли деацетилирование CobB влиять на DGC-активность YdeH, используя UPLC-IM MS ( рис.6e ). После обработки CobB, WT YdeH показал 2-кратное увеличение продукции c-di-GMP, в то время как активность YdeH K4R , YdeH K4Q и YdeH K4A составила 69,5%, 29,5% и 27,1% от этого показателя. БТ соответственно (рис. 6е) . Неожиданно мутант YdeH K4R , который структурно напоминает форму деацетилирования YdeH, также показал более низкую активность DGC. Очевидно, мутация «K» в «R» в остатке 4 не может полностью имитировать статус деацетилирования этого сайта.Тем не менее, эти результаты предполагают, что K4 является критическим для активности DGC YdeH.

Чтобы проверить, может ли CobB регулировать уровни c-di-GMP in vivo , мы сконструировали несколько штаммов ydeH + и Δ cobB ydeH + , в том числе с мутантами CobB или мутантами YdeH, а затем определяли уровни ацетилирования YdeH и c-ди-GMP. Мы обнаружили, что уровень ацетилирования YdeH в ydeH + ниже, чем у Δ cobB ydeH + , а уровень c-di-GMP ydeH + значительно выше, чем у Δ cobB ydeH + (рис.6г) . Эти результаты подтверждают, что CobB может регулировать DGC-активность YdeH посредством деацетилирования. Штаммы с мутантами YdeH показали самую низкую активность DGC, подтверждая, что K4 является критическим для активности DGC YdeH (рис. 6g). Интересно, что штаммы с мутантами CobB обнаруживают более низкие уровни ацетилирования, чем WT CobB (Fig. 6g) . Эти результаты показывают, что c-di-GMP не влияет на активность мутантов CobB R8A, R17A и E21A в vivo .Тем не менее, мутанты CobB демонстрируют более высокие уровни c-di-GMP, что дополнительно подтверждает, что CobB способствует DGC-активности YdeH посредством деацетилирования.

CobB увеличивает растворимость / стабильность YdeH посредством деацетилирования

Мы обнаружили, что уровень ацетилирования эндогенного YdeH значительно снижен в клетках WT по сравнению с уровнем CobB-дефицитных клеток (Рис. 7a) . Чтобы лучше охарактеризовать эндогенную стехиометрию ацетилирования YdeH K4, мы использовали метод абсолютного количественного определения (AQUA) 39, 40 для количественного определения уровня ацетилированного пептида K4.Как показано на рис. 7b , стехиометрия ацетилирования YdeH K4 составляла 1,3 ± 0,2% для CobB-дефицитных клеток, в то время как для клеток WT она не определялась.

Рисунок 7. YdeH ацетилирован эндогенно, и это ацетилирование регулируется CobB.

(a) Уровень эндогенного ацетилирования YdeH 3 штаммов E.coli . Тег 3xFLAG был вставлен в хромосому на 3’-конце кодирующей последовательности Acs. YdeH, меченный 3xFLAG, был обогащен антителом против FLAG, и уровни ацетилирования определялись антителом pan-Ack. (b) Масс-спектры показывают количественное определение AQUA эндогенного ацетилирования YdeH K4 с использованием пептидов AQUA. (в) Уровень эндогенного YdeH. Уровни белка определяли с помощью антитела против FLAG, и GroEL применяли в качестве контроля нагрузки. Гистограмма показала количественное определение уровней белка YdeH в трех повторностях. (d) Относительная репрессия мРНК эндогенного YdeH. (e) Стабильность YdeH с обработкой CobB или без нее.Эти образцы разделяли через 0,5 часа, 1,5 часа и 2,5 часа, и уровни белка определяли с помощью антитела против His. Гистограмма показывает количественное определение уровня белка YdeH в трех повторностях. (f) Уровень сверхэкспрессии YdeH в надосадочной жидкости и осадке. Уровни белка определяли с помощью антитела против His, и GroEL применяли в качестве контроля загрузки. Гистограмма показывает количественное определение уровня белка супернатанта YdeH в трех повторностях.

Поскольку известно, что ацетилирование может приводить к деградации белка in vivo 41 , мы предположили, что ацетилирование YdeH может повлиять на его стабильность. Действительно, мы обнаружили, что уровень эндогенного растворимого YdeH снизился на 40% в клетках с дефицитом CobB по сравнению с уровнем клеток WT (а также восстановленных клеток CobB) при экспоненциальном росте (рис. 7c) , и, что более важно, a уменьшение 70% растворимого YdeH наблюдалось для стационарного роста (дополнительный рис.16в) . Более того, для стационарного роста значительное количество осажденного YdeH наблюдалось для CobB-дефицитных клеток, но не для WT и восстановленных CobB клеток (дополнительный рис. 16c) . Затем мы исследовали стабильность белка мутантов YdeH in vitro и обнаружили, что YdeH WT и YdeH K4Q менее стабильны, чем YdeH K4A и YdeH K4R (дополнительный рисунок 13) . Кроме того, мы также заметили, что уровень растворимого YdeH после добавления CobB в 2 раза выше, чем в отсутствие CobB (рис.7д) .

Кроме того, наши данные показывают, что c-di-GMP увеличивается на 36% в клетках WT, чем в клетках с дефицитом CobB in vivo при экспоненциальном росте, когда YdeH сверхэкспрессируется (рис. 6g) . Чтобы понять основной механизм, мы затем определили уровень YdeH, когда он был сверхэкспрессирован в клетках WT и клетках с дефицитом CobB. Результаты показали, что уровень растворимого YdeH снизился на ~ 45% в CobB-дефицитных клетках по сравнению с таковым в клетках WT (рис.7f) , который аналогичен эндогенному YdeH при экспоненциальном росте ( рис. 7c, ). Мы также измерили уровень YdeH в осадке и наблюдали значительное количество осажденного YdeH в клетках с дефицитом CobB по сравнению с таковым для WT и восстановленных CobB клеток (рис. 7f) .

Таким образом, похоже, что ацетилирование YdeH K4 приводит к агрегации / преципитации белка за счет снижения его растворимости / стабильности (Рис. 8a) . В клетках WT ацетилирование YdeH удаляется CobB и остается в растворимом состоянии с небольшим или необнаруживаемым белковым осадком (дополнительный рис.16в) . В клетках с дефицитом CobB большее количество ацетилированного YdeH будет осаждаться как с ацетилированным, так и / или деацетилированным YdeH из-за отсутствия деацетилирования CobB. Кроме того, эта модель также объясняет, почему YdeH K4 может часто ацетилироваться, но не может накапливаться до высокого уровня in vivo . Известно, что ацетилирование на определенных сайтах способствует агрегации белков 42, 43 . Например, ацетилирование K280 вызывает агрегацию тау. И тау способствует выживанию нейронов, поэтому агрегация тау, вызванная ацетилированием, является патологически значимой.Интересно, что тау K280 принадлежит к двойному лизиновому мотиву, , то есть ., 275, , VQIINKK, , 281, и YdeH K4, принадлежит аналогичному двойному лизиновому мотиву, , то есть ., 1 , MIKK 4 . Таким образом, возможно, что основной механизм индуцированной ацетилированием лизина агрегации белка YdeH может быть аналогичен таковому у тау. Однако из-за возможной сложности подробный механизм еще предстоит открыть.

Рисунок 8. Регулирующая модель взаимодействия c-di-GMP и CobB.

(a) Ацетилирование YdeH K4 снижает стабильность YdeH и вызывает осаждение. (b) Обзор взаимодействия c-di-GMP и CobB. c-di-GMP ингибирует активность деацетилирования CobB, а затем регулирует синтез Ac-CoA. В другом направлении, CobB активирует активность DGC YdeH посредством деацетилирования, чтобы предотвратить осаждение YdeH, а также активировать YdeH. Кроме того, Ac-CoA модулирует GTP, предшественник образования c-di-GMP через TCA. Количественно c-di-GMP устраняет 72% активности децетилирования CobB за счет прямого связывания CobB, а CobB повышает уровень c-di-GMP до 36% за счет деацетилирования YdeH.

ОБСУЖДЕНИЕ

c-di-GMP является ключевым вторичным посредником у прокариот. CobB - первая и основная протеин-деацетилаза, идентифицированная у прокариот. Здесь мы обнаружили, что c-di-GMP специфически связывается с CobB и ингибирует его деацетилазную активность, а также подавляет клеточную концентрацию ацетил-CoA посредством модуляции уровней ацетилирования Acs. Интересно, что мы также обнаружили, что основной E.coli DGC, YdeH, эндогенно ацетилирован, а CobB увеличивает растворимость / стабильность YdeH и активирует DGC-активность YdeH посредством деацетилирования.Таким образом, мы установили регуляторную петлю отрицательной обратной связи между биогенезом c-di-GMP и зависимым от CobB деацетилированием белка.

Область связывания и кинетика CobB и c-di-GMP

Наиболее известным мотивом связывания c-di-GMP является мотив EXLXR 44 . Интересно, что сайт связывания c-di-GMP на CobB содержит RXLXE, что в точности является EXLXR в обратном направлении. Как и ожидалось в мотиве EXLXR, как R17, так и E21 являются критическими для связывания c-di-GMP, в то время как остаток L19 не связывается напрямую с c-di-GMP в мотиве RXLXE.Этот мотив расположен в N-конце этого белка, который, как мы обнаружили, отвечает за его димеризацию (дополнительная фигура 3) . Поскольку многие из связывающих c-ди-GMP белков представляют собой димеры или тетрамеры 4, 31, 45 , правдоподобным объяснением этого эффекта c-di-GMP, описанного здесь, является то, что c-di-GMP препятствует димеризации CobB. .

Проблема с нашей моделью заключается в том, что K d и K i c-di-GMP для CobB, измеренные in vitro , больше, чем суб- и микромолярные концентрации c-di-GMP. обычно наблюдается in vivo 46 .Хотя это может быть связано с неидентифицированными в настоящее время молекулярными факторами, которые снижают это сродство in vivo , мы полагаем, что это несоответствие может быть объяснено пространственным и временным неравномерным распределением c-di-GMP в бактериях. Действительно, прямое измерение концентрации c-di-GMP в бактериях с использованием биосенсора FRET выявило широкий диапазон концентраций в отдельных клетках 47 , включая некоторые места с ограниченным разрешением (~ 200 x 200 x 1000 нм 3 ), локальная концентрация которых значительно превышает 1 мкМ.Отметим, что эта концентрация соответствует всего 25 молекулам в этом объеме. Кроме того, хорошо известно, что бактериальная цитоплазма чрезвычайно переполнена 48 , и недавняя работа показала, что, в результате, эффективно возникают эффекты клетки на свободную диффузию частиц 49 . Отдельная молекула c-di-GMP в «клетке» размером всего 20 x 20 x 100 нм 3 находится в концентрации 40 мкМ. Таким образом, мы предполагаем, что действительно физически возможно, что локальная концентрация c-di-GMP может превышать измеренные константы сродства к CobB у бактерий WT.Фактически, благодаря описанному здесь механизму, отрицательная регуляторная петля с участием CobB и YdeH может быть принципиально ответственна за поддержание локальной (и, следовательно, глобальной) цитозольной концентрации на наблюдаемых максимальных уровнях.

c-di-GMP регулирует физиологические функции путем ингибирования деацетилирования CobB

Как наиболее важный субстрат CobB, Acs отвечает за синтез ацетил-CoA, который контролирует энергетический метаболизм клеток и общее ацетилирование белка, а также влияет на рост клеток и распространение 50-52 .Наши результаты показывают, что c-di-GMP может снижать концентрацию ацетил-CoA in vivo за счет ингибирования CobB и повышения уровня ацетилирования Acs. Предыдущие исследования выявили несколько возможных перекрывающихся эффектов c-di-GMP и ацетил-CoA. Например, c-di-GMP влияет на экспрессию ацетаткиназы (AckA) посредством связывания фактора транскрипции, который регулирует транскрипцию AckA в B. burgdorferi 53 . Кроме того, ацил-КоА-дегидрогеназа, ключевой фермент в путях метаболизма ацетил-КоА, является подлинным эффектором c-ди-GMP в B.bacteriovorus 54 . Здесь мы усилили связь между c-di-GMP и ацетил-CoA, впервые показав, что c-di-GMP напрямую модулирует биогенез ацетил-CoA.

c-di-GMP стал ключевым регулятором при выборе между подвижными и сидячими формами бактерий 2 . Повышенные уровни c-di-GMP подавляют подвижность бактерий за счет воздействия на белок, связанный со жгутиками 6 . Совсем недавно Nesper et al . обнаружили, что c-di-GMP напрямую связывается с CheY-подобными регуляторами и настраивает бактериальный жгутиковый мотор 9 .По нашим данным, c-di-GMP может регулировать уровень ацетилирования CheY за счет ингибирования деацетилазной активности CobB. Таким образом, весьма вероятно, что c-di-GMP регулирует подвижность бактерий посредством CobB-опосредованной регуляции активности CheY.

CobB является членом семейства белков сиртуинов, которые высоко консервативны у прокариот и эукариот. Таким образом, возможно, что c-di-GMP может также связывать сиртуины человека и играть критические функциональные роли в различных биологических процессах, таких как взаимодействия хозяин-патоген.

CobB регулирует активность YdeH DGC

in vitro

Сверхэкспрессированный YdeH использовали для анализа активности DGC in vitro . Мы определили стехиометрию ацетилирования K4 сверхэкспрессированного YdeH, следуя той же процедуре AQUA, которую мы использовали для эндогенного YdeH. Результаты показали, что стехиометрия сверхэкспрессированного ацетилирования YdeH K4 составляет 28,7 ± 4,9% (дополнительный рис. 14) . Предполагая, что все ацетилирование K4 могло быть деацетилировано CobB, мы могли ожидать a ~ 1.Повышение активности в 4 раза при деацетилировании CobB. Но это все еще не может полностью объяснить 2-кратное увеличение активности при деацетилировании CobB (рис. 6f) . С этой целью мы попытались определить с помощью простой модели, может ли потеря стабильного YdeH полностью объяснить двукратную разницу в c-di-GMP. В частности, на основании данных о стабильности (, рис. 7e, ) мы рассмотрели случай, когда разница в c-di-GMP полностью связана с уменьшением количества растворимого белка.Если предположить, что субстрат не является ограничивающим на протяжении всего анализа и что устойчивое состояние достигается через очень короткое время, меньшее количество продуцируемого c-di-GMP будет просто результатом меньшего количества растворимого белка в любой момент времени. Мы обнаружили, что уменьшение растворимого белка хорошо описывается одной экспонентой (дополнительный рис. 15) где C - концентрация YdeH, а k - скорость потери белка, определенная как 0,49 часа -1 при подборе.Таким образом, кратное увеличение F , ожидаемое для полностью стабильного (обработанного CobB) YdeH по сравнению с более нестабильной версией, может быть рассчитано (для 2-часового анализа) с помощью с вышеупомянутой стоимостью к . Таким образом, простая потеря активного белка приведет к 1,57-кратной разнице в c-ди-GMP. Поскольку мы наблюдали двукратную разницу, мы пришли к выводу, что потеря растворимого белка может составлять ~ 78% (1,57 / 2) разницы, измеренной с ацетилированным и деацетилированным YdeH.Следовательно, разница в присущей активности между ацетилированным YdeH и деацетилированным YdeH необходима для полного объяснения наблюдаемой разницы в продуцировании c-ди-GMP.

Мы заметили, что стехиометрия ацетилирования K4 сверхэкспрессированного YdeH намного выше, чем у эндогенного YdeH. Стехиометрию эндогенного ацетилирования YdeH K4 измеряли с использованием экспоненциального роста E. coli . В то время как обычная практика, когда сверхэкспрессия белка в E. coli , штамм обычно индуцируется экспоненциальным ростом, а затем культивируется еще ~ 2 часа для быстрого продуцирования белка.На момент очистки белка штамм уже находится в стационарной фазе. Таким образом, возможно, что большая разница в стехиометрии ацетилирования между сверхэкспрессированным YdeH и эндогенным, по крайней мере, частично связана с различием фаз роста.

Чтобы проверить эту возможность, мы измерили стехиометрию ацетилирования YdeH K4 с использованием E. coli стационарного роста. Результаты показали, что стехиометрия ацетилирования YdeH K4 составляет 1,1 ± 0,3% в клетках WT и 4.2 ± 0,5% в клетках с дефицитом CobB (дополнительный рис. 16a-b) . Для CobB-дефицитных клеток стехиометрия ацетилирования YdeH K4 в 3 раза (4,2% / 1,3%) при стационарном росте, чем при экспоненциальном росте. По крайней мере, эти данные могут частично объяснить стехиометрический разрыв между эндогенным и сверхэкспрессированным YdeH.

CobB регулирует активность YdeH DGC

in vivo

Известно, что экспрессия YdeH жестко регулируется РНК-связывающим белком CsrA, а мутант csrA может увеличивать транскрипцию YdeH в 15 раз и еще раз. DGC YcdT в 45 раз 55 .Таким образом, чтобы искусственно создать условие высокой экспрессии YdeH для функционального анализа, часто применяли мутант csrA 56 . Однако мутация csrA может также активировать экспрессию другого DGC, , то есть , YcdT, который может вызывать высокий фон c-di-GMP при изучении YdeH. Итак, мы решили сверхэкспрессировать YdeH в E. coli , чтобы изучить регулирующую роль CobB в YdeH внутри клетки. Наши данные показывают, что c-di-GMP увеличивается на 36% в клетках WT, чем CobB-дефицитные клетки in vivo при экспоненциальном росте, когда YdeH был сверхэкспрессирован (рис.6g) , что согласуется с наблюдаемым снижением уровня растворимого YdeH на 45% в клетках с дефицитом CobB по сравнению с таковым в клетках WT (фиг. 7f) . Следовательно, снижение c-di-GMP на 36% в клетках с дефицитом CobB в основном связано с нестабильностью / преципитацией YdeH.

Хотя теперь ясно, что основным функциональным последствием ацетилирования K4 является снижение стабильности YdeH, прямое изменение активности при ацетилировании и деацетилировании с помощью CobB все еще может играть важную роль. Наши результаты показали, что YdeH K4A , который имеет сопоставимую стабильность с WT YdeH, также продемонстрировал потерю ~ 50% своей активности DGC (рис.6е) . Возможно, что ацетилирование YdeH K4 может существенно повлиять на структуру YdeH. Чтобы понять механизм, мы предложили рабочую модель, которая иллюстрирует, как CobB может регулировать структуру YdeH, на основе анализа атомной структуры YdeH 56 . Сообщалось, что димеризация и правильная конформационная перестройка активного центра необходимы для оптимальной активности YdeH DGC (Supplementary Fig. 17a) . Reside K4 расположен в «шарнирной» области YdeH и потенциально может регулировать конформационную перестройку активного центра при образовании димера (дополнительный рис.17б-г) . В ацетилированной форме K4 два каталитических домена GGDEF YdeH смещены, что может вызвать агрегацию, а затем привести к преципитации. (дополнительный рис. 17b). Кроме того, эта неправильно выровненная область может препятствовать продуктивному лигированию двух молекул GTP, каждая из которых захватывается доменом GGDEF. Согласно нашим ферментативным исследованиям, весьма вероятно, что деацетилирование YdeH K4ac запускает правильную перестройку димера GGDEF, так что активный центр перестраивается, чтобы позволить образование межмолекулярных фосфоэфирных связей между двумя субстратами GTP (дополнительный рис.17в) . Интересно, что предложенная модель близка к Zn-регуляционному механизму в YdeH, то есть ., ингибирует активность YdeH DGC, препятствуя его димеризации 56 . Таким образом, по крайней мере частично, CobB может регулировать переключение активный / неактивный DGC-активности YdeH посредством деацетилирования YdeH на K4 (дополнительный рис. 17d).

Взаимодействие между CobB и c-di-GMP

Наши данные показывают, что c-di-GMP может значительно снизить активность децетилирования CobB посредством прямого связывания, и что деацетилирование сверхэкспрессированного YdeH с помощью CobB приводит к увеличению c-ди-GMP на 36% in vivo .Кроме того, c-di-GMP синтезируется из GTP посредством DGC. CobB регулирует уровни ацетил-КоА посредством деацетилирования Acs, а затем модулирует образование GTP в цикле трикарбоновой кислоты (TCA). Таким образом, в определенной степени биогенез c-di-GMP может быть активирован CobB через его влияние на цикл TCA. Мы также обнаружили, что GTPase Era и DGC YegE также ацетилируются эндогенно. Эти результаты дополнительно демонстрируют, что биогенез c-di-GMP регулируется (де) ацетилированием.

Взаимодействие c-di-GMP и CobB может играть важную роль в бактериях. Известно, что c-di-GMP участвует в подвижности, формировании биопленок и вирулентности, которые регулируются энергетическим метаболизмом 57, 58 . Мы обнаружили, что c-di-GMP модулирует бактериальный энергетический метаболизм путем ингибирования активности деацетилирования CobB, таким образом, может быть установлена ​​связь между важными бактериальными процессами и энергетическим метаболизмом. Кроме того, CobB явно участвует в регуляции метаболизма 59 , а c-di-GMP участвует в метаболизме GTP и пуриновом метаболизме, что указывает на возможную двустороннюю регуляцию между c-di-GMP и CobB на метаболическом уровне.

Вместе взятые, мы установили новую петлю регуляции обратной связи между c-di-GMP и активностью деацетилирования CobB (Fig. 8b) . Результаты обоих направлений (c-di-GMP ингибирует CobB, а CobB способствует биогенезу c-di-GMP) являются новыми. Из этой петли мы можем представить строго регулируемый баланс между уровнями c-di-GMP и активностью протеиндеацетилазы CobB. Мы твердо верим, что наши результаты будут способствовать будущим функциональным исследованиям регуляции ацетилирования белков на основе c-di-GMP и CobB.

Методы

Бактериальные штаммы, плазмиды и конструкция мутанта CobB

В этом исследовании мы использовали E.coli BW25113 в качестве штамма дикого типа и плазмиду pSUMO10 для сверхэкспрессии CobB, pET32a для эксперимента по спасению и pCA24N для сверхэкспрессии YdeH, Acs, CheY, NhoA, Era, YeaJ, YaiC, YahA, DosP, YihI, YegE и YihK. Мы выполнили мутации CobB с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange ® (Agilent Technologies, Санта-Клара, США).

Скрининг протеомных микрочипов E.coli и обработка данных

Протеомные микроматрицы E.coli получали, как описано ранее 29 . Протеомные микрочипы сначала блокировали блокирующим буфером (3% BSA в 0,1% Tween 20; TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем Bio-c-di-GMP разбавляли до 1 мкМ и инкубировали на микрочипе при комнатной температуре в течение 1 ч, и такая же концентрация биотина была включена в качестве отрицательного контроля. Затем микроматрицы промывали TBST три раза по 5 мин каждый, а затем инкубировали с Cy3-стрептавидином в разведении 1: 1000 (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) в течение 1 ч при комнатной температуре с последующими тремя промываниями TBST для По 5 мин.Микроматрицы центрифугировали при 250 × g в течение 3 мин и сканировали с помощью сканера микрочипов GenePix pro 6.1 для визуализации и количественной оценки результатов. Исходные данные были опубликованы в базе данных микрочипов белков (www.proteinarray.cn) с регистрационным номером PMDE271. Инструмент автоанализа в базе данных микрочипов белков (http://www.proteinarray.cn/index.php/analysis-toolkits) использовался для обработки данных микрочипов.

Получение c-di-GMP

Известно, что c-di-GMP (BIOLOG Life Science Institute, Бремен, Германия) может образовывать димер или полимер, влияет на связывание с его эффекторами.Таким образом, мы сначала определили популяцию мономера c-ди-GMP. OD 276 и OD 289 c-di-GMP измеряли с использованием кюветного режима Nanodrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) объемом 100 мкл. Чтобы рассчитать соотношение мономера ц-ди-GMP ( P моно ) при различных концентрациях, мы применили уравнение ( p моно = 1,15 ( A 276 / A 289 ) - 1.64), разработанный Gentner et al. 60 Чтобы исключить возможное влияние полимера c-ди-GMP, мы нагревали раствор c-ди-GMP на водяной бане при 60 ° C в течение 1 часа для деполимеризации ~ 80% c-ди-GMP до мономера. тестирование.

Стрептавидин-блоттинг-анализ

В этом анализе CobB (0,5 мг / мл, 16,13 мкМ) и 10 мкМ био-c-ди-GMP инкубировали в буфере для деацетилирования (50 мМ трис-HCl, 4 мМ MgCl 2 , 50 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 1 мМ NAD + , pH 8,0) при 37 ° C в течение 1 ч и такое же количество биотина, цГМФ, ц-ди-АМФ были включены в качестве отрицательных контролей.Затем образцы подвергали сшиванию УФ-излучением на льду в течение 10 мин при энергии 1,2 мДж / см 2 для дальнейшего связывания c-di-GMP с CobB. Затем эти образцы анализировали вестерн-блоттингом. После инкубации со стрептавидином, конъюгированным с IRDye 800-CW (LI-COR Biosciences, Небраска, США) в течение 2 ч, мембраны трижды промывали TBST и визуализировали с помощью системы инфракрасной визуализации Odyssey (LI-COR Biosciences, Небраска, США). А уровень белка определяли окрашиванием по Понсо (Sangon Biotech, Шанхай, Китай).

Анализ ITC

В анализе ITC c-di-GMP, CobB дикого типа и мутантные белки CobB были приготовлены в буфере для титрования (20 мМ Трис, 250 мМ NaCl, 2 мМ DTT и pH 7,5). Концентрации белка измеряли на основе поглощения УФ 280 нм. ITC-титрование проводили с использованием системы MicroCal iTC200 (GE Healthcare, Питтсбург, США) при 25 ° C. Каждое титрование состояло из 17 последовательных инъекций (первая по 0,4 мкл, а остальные 16 по 2,4 мкл). Базовые c-di-GMP, cGMP и c-di-AMP на уровне 1.5 мМ титровали до CobB дикого типа или мутанта (0,1 мМ) в образцах клеток объемом 200 мкл по отдельности. c-di-GMP, cGMP и c-di-AMP в концентрации 1,5 мМ титровали в 200 мкл буфера для титрования в качестве контролей для обработки данных. Полученные кривые титрования обрабатывали с помощью программы Origin 7.0 (OriginLab) в соответствии с моделью аппроксимации «один набор площадок».

Анализ активности деацетилазы CobB

CobB (50 мкг / мл, 1,6 мкМ) и c-di-GMP (при 0,25 или 0,5 мМ) инкубировали в 20 мкл буфера для деацетилирования (50 мМ Tris-HCl, 4 мМ MgCl 2 , 50 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 1 мМ NAD + , pH 8.0) при 37 ° C в течение 0,5 ч. В качестве отрицательного контроля мы использовали 0,5 мМ цГМФ и ц-ди-АМФ. Затем добавляли субстраты CobB (4,16 мкМ Acs, 1,41 мкМ CheY, 0,62 мкМ NhoA) и инкубировали при 37 ° C в течение 1,5 часов. Эти белки анализировали как окрашиванием серебром, так и вестерн-блоттингом. Мембраны инкубировали с пан-антиацетильным антителом (Cell Signaling Technology, MA, США, с разведением 1: 1000) в течение 12 часов при 4 ° C, а затем инкубировали с вторичным антителом IRDye 800 при комнатной температуре в течение 1 часа. Мембраны визуализировали с помощью инфракрасной системы визуализации Odyssey.

Измерение каталитической кинетики CobB

CobB (9,3 мкг / мл, 0,3 мкМ) инкубировали с 0, 10, 20 и 80 мкМ c-di-GMP при 37 ° C в течение 20 минут в 80 мкл буфера для деацетилирования и затем добавляли ацилированный пептид с градиентной концентрацией 20 мкл (LEQIAELAGVSK ac TNLLYYFPSK) 32 (1, 2, 4, 8, 16, 32, 50, 75, 100, 150 и 200 мкМ) и инкубировали совместно при 37 °. C в течение 30 мин. Добавляли 100 мМ HCl и 160 мМ уксусную кислоту, чтобы остановить реакции, и центрифугировали в течение 10 мин при 18000 x g, чтобы отделить фермент от реакций.Эти образцы были проанализированы с помощью ВЭЖХ. Вкратце, образцы вводили в колонку C-18 (AlltimaTM C18 4,6 x 250 мм) и анализировали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (Shimadzu, Япония). Раствор A (0,065% трифторуксусной кислоты в 100% воде (об. / Об.)) И раствор B (0,05% трифторуксусной кислоты в 100% -ном ацетонитриле (об. / Об.)) Использовали в программе градиента (0,01 мин с 5% раствором B, 25 мин с 65% раствором B, 25,01 мин с 95% раствором B, 31 мин с 95% раствором B, 31,01 мин с 5% раствором B, 40 мин с 5% раствором B и остановка через 40 минут.01 мин) со скоростью потока 1 мл / мин. Пептиды обнаруживали при длине волны 220 нм. Этот анализ был проведен для трех препаратов, и значения V max , K и были рассчитаны путем аппроксимации графика с использованием GraphPad Prism 6.

Конструирование штамма

E.coli (BW25113), несущего хромосомные 3xFLAG-меченные Acs. и 3xFLAG-меченный штамм YdeH

E.coli (BW25113), несущий хромосомные 3xFLAG-меченные Acs и 3xFLAG-меченый YdeH, были сконструированы с использованием системы рекомбинации Red 61 , как описано ранее 32 .

Выделение и количественное определение c-di-GMP в

E.coli

Методы выделения c-di-GMP были описаны ранее 62 . Вкратце, было собрано общее количество клеток E.coli с OD 50 и ресуспендировали в 2 мл ddH 2 О. Для экстракции внутриклеточного c-di-GMP, 8 мл смеси экстрактов 50% метанола и 50 % ацетонитрила. Мы также добавили 1 мкМ цГМФ в качестве стандарта. Смесь инкубировали в кипящей воде в течение 10 мин, а затем центрифугировали при 10 000 об / мин в течение 10 мин.Супернатант переносили в новую пробирку для сублимационной сушки. Осушенный вымораживанием осадок ресуспендировали в 100 мкл воды, содержащей 50% метанола. Образцы анализировали с помощью UPLC-IM-MS (масс-спектрометрия со сверхвысокой жидкостной хроматографией и сопряженной ионной подвижностью). UPLC-IM-MS выполняли с использованием системы Waters UPLC I-класса, оснащенной диспетчером доставки бинарного растворителя и диспетчером образцов, в сочетании с масс-спектрометром Waters VION IMS Q-TOF, оборудованным интерфейсом для электрораспыления (Waters Corporation, Милфорд, США. ) в Центре инструментального анализа Шанхайского университета Цзяо Тонг.UPLC выполняли на колонке ZIC-HILIC (100 мм × 2,1 мм внутренний диаметр, 3,5 мкм; Merck). Колонку элюировали градиентным растворителем от A: B (5: 95) до A: B (40:60) при скорости потока 0,40 мл / мин, где A - 50 мМ формиат аммония, а B - ацетонитрил. Мы использовали следующие экспериментальные параметры МС: отрицательная полярность с капиллярным напряжением 2,0 кВ, конус дискретизации 20 В и энергия столкновения 6 эВ. c-di-GMP был обнаружен в ионе M-1 m / z 689.086 с фрагментным ионом m / z 344.040, и цГМФ в качестве входа в ионе М-1 m / z 344.039.

SILAC MS анализ количественной протеомики ацетилирования.

E.coli BW25113 ( lysA ) и BW25113 со сверхэкспрессией YdeH ( △ lysA ydeH + ). Два штамма активировали в среде LB, а затем культивировали в минимальной среде с 2% глюкозы M9, дополненной тяжелыми изотопами лизина ( 13 C 6 14 N 2 -лизин) или легкими изотопами лизина ( 12 C 6 14 N 2 -lysine) (Силантес, Мюнхен, Германия) для △ lysA и △ lysA ydeH + , соответственно.Штаммы индуцировали 0,1 мМ IPTG во время экспоненциального роста (OD 600 нм = ~ 0,4), и клетки собирали после индукции в течение 4 часов (OD 600 нм = ~ 1,0). К этим клеткам (~ 30 OD) добавляли 1 мл буфера для лизиса (8 M мочевина, 100 мМ NH 4 HCO 3 , 2 мМ бутират натрия, 5 мМ никотинамид, 1x ингибитор протеазы (Roche, Базель, Швейцария), pH 8,0) и лизировали в течение 2 минут при 4 ° C с помощью ультразвукового разрушителя клеток (Cheng-cheng Weiye Science and Technology, Пекин, Китай). Концентрацию белка определяли с помощью набора BCA (Pierce, MA, США).Эффективность мечения E.coli , культивированного в «тяжелой» среде, проверяли перед последовательными протеомными экспериментами.

Лизаты с легкой и тяжелой меткой смешивали в равной степени. Цистеиновые связи восстанавливали 5 мМ дитиотреитолом (DTT) при 56 ° C в течение 30 минут с последующей реакцией алкилирования 15 мМ йодацетамидом при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Реакцию алкилирования гасили 30 мМ цистеином. Белковый раствор разбавляли до менее 2 М мочевины путем добавления 100 мМ NH 4 HCO 3 (pH 8.0), а затем переваривали трипсином для секвенирования при соотношении трипсина к белку 1:50 (мас. / Мас.) При 37 ° C в течение 16 часов. Для полного переваривания добавляли дополнительный трипсин при соотношении трипсин: белок 1: 100 (мас. / Мас.) При 37 ° C в течение еще четырех часов. Триптические пептиды обессоливали через картриджи SepPak C18 (Waters, MA, USA) и сушили в вакууме.

Для обогащения пептидов, ацетилированных лизином, 2 мг обессоленных пептидов растворяли в буфере NETN (600 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 50 мМ Tris-HCl, 0,5% NP-40, pH 8.0) и инкубировали с 10 мкл осушенных предварительно промытых антиацетиловых шариков (Immunechem, Burnaby, Canada) при 4 ° C в течение ночи при осторожном встряхивании. Гранулы осторожно промывали четыре раза буфером NETN и дважды деионизированной водой. Связанные пептиды элюировали 0,1% TFA и сушили в вакууме. Элюированные пептиды обессоливали с помощью C18 ZipTips (Millipore, MA, USA) в соответствии с инструкциями производителя.

Обогащенные ацетилированные пептиды анализировали с помощью нанопоточной ЖХ-МС / МС с использованием системы EASY-nLC 1000, подключенной к масс-спектрометру Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США).Пептиды растворяли в растворителе A (0,1% FA в 2% ACN) и разделяли, используя самодельную аналитическую колонку C18 с обращенной фазой (внутренний диаметр 75 мкм × длина 18 см, размер частиц 3 мкм) с 90-минутным градиентом от 5% до 80% растворителя B (0,1% FA в 90% ACN) при постоянной скорости потока 300 нл / мин. Интактные пептиды с m / z 300-1400 были обнаружены с разрешением 120000 при m / z 200. Ионы с интенсивностью выше 5000 были выделены и последовательно фрагментированы методом высшей диссоциации столкновений (HCD) с нормализованной энергией столкновения 32% в режиме максимальной скорости. .Цели автоматической регулировки усиления (AGC) были установлены на 5.0e5 для полного сканирования и 7.0e3 для MS / MS сканирования, соответственно. Длительность динамического исключения составляла 30 секунд.

файлов данных MS / MS были обработаны с помощью программного обеспечения MaxQuant (версия 1.5.3.8) против базы данных Escherichia coli (штамм K12) от Uniprot (идентификатор протеома: UP000000625, 4309 последовательностей, последнее изменение 13 мая 2017 г.) с обратным база данных-приманка. SILAC был выбран как «дублеты», а панель «Heavy label» была выбрана как тяжелый лизин (Lys6).В качестве фермента переваривания был выбран трипсин / Р, и было допущено два максимально отсутствующих расщепления. Карбамидометил (C) был определен как фиксированная модификация, а переменными модификациями были окисление (M), ацетилирование (N-термин белка) и ацетилирование (K). Уровень ложного обнаружения (FDR) на уровне белка, пептида и модификации был установлен на уровне 1%. Для количественного анализа нормализованное соотношение H / L каждого ацетилированного пептида, экспортированного с помощью программного обеспечения MaxQuant, было скорректировано на уровне белка, чтобы устранить разницу в содержании белка.Исходные данные масс-спектрометрии протеомики SILAC были депонированы в Консорциум ProteomeXchange 63 через репозиторий партнеров PRIDE 64 с идентификатором набора данных PXD007616 (имя пользователя: reviewer16485 {at} ebi.ac.uk, пароль: dD4exhSO).

Идентификация сайтов деацетилирования с помощью Q Exactive plus MS

Пять белков пути DGC, YdeH, Era, YegE, YeaJ и YihK, были сконструированы для Pca24N и очищены из E.coli BL21. После разделения SDS-PAGE и триптического расщепления эти белки смешивали и анализировали масс-спектрометрией.Вкратце, наноЖХ-МС / МС-эксперименты проводили на системе EASY-nLC (Thermo Scientific, Оденсе, Дания), подключенной к Q Exactive Plus (Thermo Scientific, Бремен, Германия) через источник ионов наноэлектроспрея. Образцы (1 мкл) загружали с помощью автосэмплера на 2-сантиметровую насадочную колонку (внутренний диаметр 75 мкм x внешний диаметр 360 мкм) в 0,1% HCOOH / воде (буфер A) при скорости потока 1 мкл / мин в течение 5 минут. . Аналитическое разделение выполняли на 15-см насадочной колонке (внутренний диаметр 75 мкм x внешний диаметр 360 мкм) при 300 нл / мин с 60-минутным градиентом увеличения Ch4CN (буфер B, 0.1% HCOOH / CH 3 CN). Предварительная колонка (диаметр 5 мкм, размер пор 200 Å) и аналитическая колонка (диаметр 3 мкм, размер пор 100 Å) были заполнены диоксидом кремния с обращенной фазой C18 (DIKMA-inspire TM, Калифорния, США) с использованием напорной бомбы. После загрузки образца буфер B быстро увеличивался с 3% до 6% за 5 минут, затем постепенно до 22% за 36 минут, а затем до 35% за 9 минут с последующим быстрым увеличением до 95% в течение 3 минут и выдерживанием 95 % за 7 мин. Общая продолжительность сбора составила 60 мин. Масс-спектрометр Q Exactive Plus работал в режиме зависимости от данных для автоматического переключения между МС полного сканирования и получением МС / МС.Обзорные спектры МС полного сканирования (m / z 350-1800) были получены в Orbitrap с разрешением 70 000 (m / z 200) после накопления ионов до целевого значения 3 × 10 6 на основе прогнозируемой АРУ из предыдущего полного сканирования. Динамическое исключение было установлено на 60 с. 15 наиболее интенсивных многозарядных ионов (z≥2) были последовательно изолированы и фрагментированы в октупольной ячейке столкновений с помощью более высокой энергии столкновительной диссоциации (HCD) с фиксированным временем инжекции 55 мс и разрешением 17500 для метода быстрого сканирования.Типичные условия масс-спектрометрии были следующими: напряжение распыления 1,7 кВ; температура нагретого капилляра 320 ° C; нормализованная энергия столкновения HCD 27%. Порог выбора ионов МС / МС был установлен на 9 × 10 3 отсчетов. Для samp7les была выбрана ширина изоляции 1,6 Да. Необработанные данные масс-спектрометрии были отправлены в PRIDE 63, 64 с номером проекта PXD007651 (пользователь: reviewer60424 {at} ebi.ac.uk, пароль: 6rxEMkjm). И файл необработанных данных был назван «20161202_ZHN_AC.raw» с файлом поиска «20161202_ZHN_AC-01.msf ».

YdeH был выбран для углубленного количественного анализа МС с использованием масс-спектрометра Q Exactive plus. YdeH был сверхэкспрессирован в E. coli и очищен с помощью аффинности. YdeH обрабатывали CobB для деацетилирования и необработанным WT YdeH в качестве контроля. После разделения SDS-PAGE и расщепления трипсином образцы анализировали с помощью масс-спектрометра Q Exactive plus в тех же условиях эксперимента. Необработанные данные MS обрабатывали с использованием программного обеспечения Protein Discovery (ThermoFisher) для идентификации сайтов ацетилирования лизина.Сайты ацетилирования, которые были идентифицированы в необработанном образце WT YdeH, но не в обработанном CobB образце, считались деацетилированными CobB. Необработанные данные масс-спектрометрии были представлены в PRIDE с доступом к проекту PXD008113 (имя пользователя: reviewer00527 {at} ebi.ac.uk, пароль: jKBngFLH).

Определение активности деацетилирования CobB

in vivo

Штаммы, △ cobB , WT, ydeH + , ydeH G206A, G207A cob20, △ cobB :: cobB ydeH + использовали для анализа активности деацетилирования CobB.Эти штаммы выращивали на среде Фогеля-Боннера (0,81 мМ MgSO 4 · 7H 2 O, 43,8 мМ K 2 HPO 4 , 10 мМ C 6 H 8 O 7 · H 2 O, 16,7 мМ NaNH 4 HPO 4 · 4H 2 O) с 10 мМ ацетатом при 25 ° C в течение 12 часов и индуцированным 0,2 мМ IPTG при 25 ° C в течение 12 часов. Собирали 20 клеток OD и повторно трижды замораживали-оттаивать. Затем клетки обрабатывали 4 мл буфера для лизиса (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол (Sigma-Aldrich), 1 мг / мл лизоцима (Sangon Biotech, Шанхай, Китай), 1x CelLytic B (Sigma-Aldrich), 50 единиц / мл бензоназы (Sigma-Aldrich) и 1 мМ PMSF (Sigma-Aldrich), pH 8.0) при 4 ° C в течение 20 мин при энергичном встряхивании. После лизиса и центрифугирования при 10000 об / мин в течение 5 минут добавляли 20 мкл антител против FLAG (Sigma-Aldrich) и 50 мкл бусинок агарозы, конъюгированных с белком G (Roche), при 4 ° C в течение 2 часов при осторожном перемешивании для обогащения 3xFLAG- помечены как Acs. Агарозу, конъюгированную с белком G, собирали и трижды промывали буфером А (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, pH 8,0). Затем 3xFLAG-меченые Acs элюировали нагреванием при 95 ° C в течение 10 мин.Количество белка Acs и уровень деацетилирования этих образцов анализировали вестерн-блоттингом. Мембраны инкубировали с пан-антителом против ацетила (Cell Signaling Technology с разведением 1: 1000) при 4 ° C в течение 16 ч и с антителом против FLAG (Sigma-Aldrich с разведением 1: 2000) при 4 ° C. за 16 ч. Антитело IRDye 800 использовали в качестве вторичного антитела, и мембраны инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны трижды промывали TBST между каждой стадией инкубации антител.Окончательная визуализация была выполнена с использованием системы инфракрасной визуализации Odyssey.

Определение кривой роста штамма в среде Фогеля-Боннера

Вышеописанные штаммы выращивали в среде Фогеля-Боннера с 10 или 30 мМ ацетата или пропионата при 25 ° C в течение 12 ч, а затем индуцировали 0,2 мМ IPTG при 25 ° C. ° C в течение 20 ч. В течение всего 32-часового периода роста концентрации клеток измеряли при OD 600 с использованием Nanodrop 2000 через 8, 12, 16, 24 и 32 часа. Затем были построены кривые роста с помощью GraphPad Prism 6.

Анализ гомологии, построение филогенетического древа и выравнивание последовательностей

Для анализа гомологии мы выбрали 25 бактерий: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, Shigella dysenteriae, Citrobacter amalonaticus, Erwinia tracheiphilaa, Cerebriella tracheiphilaca neteri, Achromobacter sp.ATCC35328, Siccibacter colletis, Lelliottia amnigena, Buttiauxella brennerae, Kluyvera ascorbata, Mangrovibacter sp.MFB070, Cronobacter dublinensis, Hafnia alvei, Ханья multitudinisentens, Serratia SymbioticA, Yokenella regensburgei, Trabulsiella odontotermitis, Leclercia adecarboxylata, Pantoea dispersa, Shimwellia blattae , Kosakonia radicincitans .Последовательности CobB были исследованы на веб-сайте NCBI, а филогенетическое дерево было построено с помощью онлайн-инструмента EMBL-EBI Clustalw2. Выравнивание последовательностей проводили с использованием DNAMAN 2.0.

Определение активности YdeH DGC

Очищенный белок WT YdeH 5 мкМ (0,14 мг / мл) инкубировали с 1,6 мкМ (0,05 мг / мл) CobB для деацетилирования при 37 ° С в течение 30 мин. Для определения активности DGC WT YdeH, деацетилированные мутанты YdeH и YdeH инкубировали с 1 мМ GTP, 5 мМ MgCl 2 в 100 мкл при 30 ° C в течение 2 часов.Реакцию останавливали нагреванием при 95 ° C в течение 10 минут и центрифугировали в течение 10 минут при 18000 g, чтобы отделить фермент от реакции. Перед анализом мы добавляли к этим реакциям 2 мкМ цГМФ в качестве контроля. Концентрации c-ди-GMP определяли с помощью UPLC-IM-MS с теми же параметрами, что упоминались ранее.

Определение стехиометрии ацетилирования YdeH K4 с использованием количественного анализа AQUA

Мы использовали метод абсолютного количественного определения (AQUA) 39, 40 для количественного определения уровней пептидов.Мы синтезировали пептиды AQUA для деацетилированных (KTTEIDAI L ( 13 C 6 , 15 N) LNLNK и TTEIDAI L ( 13 C 6 , 15 N) и L пептиды (K ac TTEIDAI L ( 13 C 6 , 15 N) LNLNK) YdeH K4. Чтобы получить эндогенный белок YdeH, мы вставили хромосомную C-концевую Flag-метку в YdeH и иммуно-преципитировали антителом против FLAG. Штаммы cobB и WT использовали для анализа стехиометрии ацетилирования YdeH K4.Эти штаммы выращивали в среде LB в течение ночи и переносили в 1 л среды VB-E с разведением 1: 500 и выращивали до OD600 = ~ 0,3 при 25 ° C в течение 16 часов в качестве экспоненциальных клеток роста и до OD600 = ~ 0,6 при 25 ° C в течение 42 ч в качестве ячеек с неподвижной фазой. Эти клетки собирали и лизировали при высоком давлении с 50 мл лизирующего буфера (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl и 1 мМ PMSF (Sigma-Aldrich), pH 8,0). После лизиса и центрифугирования при 10000 об / мин в течение 5 минут добавляли 100 мкл антитела против FLAG (Sigma-Aldrich) и инкубировали при 4 ° C в течение 20 часов при осторожном перемешивании для обогащения YdeH, меченного 3xFLAG.Добавляли 300 мкл агарозных шариков, конъюгированных с белком G (Roche), и инкубировали при 4 ° C в течение 4 часов при осторожном перемешивании для обогащения антителом против Flag. Агарозу, конъюгированную с белком G, собирали и трижды промывали буфером А (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, pH 8,0). YdeH, меченный 3xFLAG, элюировали 2 мл 0,2 мг / мл пептида Flag при 4 ° C в течение 4 часов. Свободный пептид Flag отделяли диализом.

Чтобы получить сверхэкспрессированный YdeH, мы сконструировали YdeH для pCA24N в штамме cobB ( cobB ydeH + ).Этот штамм выращивали в среде LB в течение ночи и переносили в 100 мл среды LB с разбавлением 1: 100 и выращивали до OD600 = ~ 0,6 при 37 ° C в течение 2 часов, добавляли 0,1 мМ IPTG для индукции при 37 ° C в течение 2 часов. Клетки собирали и лизировали с использованием 35 мл буфера для лизиса. После лизиса и центрифугирования при 10000 об / мин в течение 5 минут добавляли 1 мл гранул Ni-IDA (Senhuimicrosphere, Сучжоу, Китай) и инкубировали при 4 ° C в течение 1 ч при осторожном перемешивании для обогащения His-меченного YdeH. YdeH, меченный His, элюировали 250 мМ имидазолом при 4 ° C в течение 20 мин.Свободный имидазол отделяли диализом.

Для стехиометрии ацетилирования YdeH очищенные аффинно очищенные белки YdeH расщепляли трипсином в течение ночи после реакции восстановления цистеина и алкилирования. Затем обессоливали триптические пептиды. Синтетические стандартные пептиды AQUA добавляли к расщепленным образцам YdeH с интенсивностью, близкой к интенсивности нативных пептидов. Пептидную смесь, содержащую пептиды AQUA, анализировали с помощью масс-спектрометра Q-Exactive с тремя независимыми измерениями.Был использован режим полного MS-сканирования, и диапазон сканирования был установлен от 700 до 900 m / z, содержащий все три целевых пептида. Для расчета стехиометрии использовали площади пиков экстрактивной ионной хроматографии (XIC) нативного пептида и соответствующего тяжелого меченого пептида. Исходные данные масс-спектрометрической протеомики были депонированы в Консорциум ProteomeXchange 63 через репозиторий партнеров PRIDE 64 с идентификатором набора данных PXD007616 (имя пользователя: reviewer16485 {at} ebi.ac.uk, пароль: dD4exhSO).

Определение стабильности YdeH

in vitro

После сверхэкспрессии в клетках с дефицитом CobB YdeH очищали и разбавляли до 0,14 мг / мл с последующей обработкой CobB или без нее. Эти образцы инкубировали при 37 ° С для деацетилирования в течение 0,5 часа. Затем добавляли 1 мМ GTP, образцы инкубировали при 30 ° C еще 1 час и 2 часа.

Author: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *