Впр по биологии 6 класс с ответами 2018 год все варианты: Все варианты ВПР 2018 по биологии 6 класс с ответами

Содержание

Ошибка 404 — Страница не найдена

К сожалению мы не можем показать то, что вы искали. Может быть, попробуете поиск по сайту или одну из приведенных ниже ссылок?

Архивы Выберите месяц Март 2022 Февраль 2022 Январь 2022 Декабрь 2021 Ноябрь 2021 Октябрь 2021 Сентябрь 2021 Август 2021 Июль 2021 Июнь 2021 Май 2021 Апрель 2021 Март 2021 Февраль 2021 Январь 2021 Декабрь 2020 Ноябрь 2020 Октябрь 2020 Сентябрь 2020 Август 2020 Июль 2020 Июнь 2020 Май 2020 Апрель 2020 Март 2020 Февраль 2020 Январь 2020 Декабрь 2019 Ноябрь 2019 Октябрь 2019 Сентябрь 2019 Август 2019 Июль 2019 Июнь 2019 Май 2019 Апрель 2019 Март 2019 Февраль 2019 Январь 2019 Декабрь 2018 Ноябрь 2018 Октябрь 2018 Сентябрь 2018 Август 2018 Июль 2018 Июнь 2018 Февраль 2018 Январь 2018 Ноябрь 2017 Сентябрь 2017 Август 2017 Июль 2017 Апрель 2017 Март 2017 Февраль 2017 Январь 2017

РубрикиВыберите рубрикуbritish bulldogАстраБез рубрикиВидеоурокиВОШВПРвысшая пробадвиЕГЭ 2022 математиказолотое руноизложениеитоговое устное собеседованиеКенгуруКИТконкурс Пегасматематический праздникмежрегиональный химический турнирМОШмцкоОВИОолимпиада звездаолимпиада курчатоволимпиада ЛомоносовОПКОтветы на работы СтатГрадРДРРешу ЕГЭРешу ОГЭрусский медвежонокСочинениеСтатьитурнир ЛомоносоваУчебные пособияЧИПЮМШ

  • 04. 10.2020 XLIII Турнир Ломоносова задания и ответы
  • 05.12.17 Ответы и задания по математике 10 класс СтатГрад варианты МА00201-МА00208
  • 05.12.17 Ответы и задания по математике 7 класс «СтатГрад» варианты МА70101-МА70106
  • 06.11.2017 Олимпиада «Звезда» естественные науки задания и ответы 6-11 класс отборочный этап
  • 06.12.17 Официальные темы итогового сочинения 2017 для Камчатского края и Чукотского автономного округа
  • 06.12.17 Официальные темы итогового сочинения 2017 для Республика Алтай, Алтайский край, Республика Тыва, Респ. Хакасия, Красноярский край, Кемеровская, Томская и Новосибирская область
  • 06.12.17 Официальные темы итогового сочинения 2017 зона 8 Республика Саха (Якутия), город Якутск, Амурская область, Забайкальский край
  • 06.12.17 Официальные темы итогового сочинения для Республика Бурятия, Иркутская область зона 7
  • 06.12.2017 5 зона Омск MSK+3 (UTC+6) официальные темы
  • 06.12.2017 Ответы и задания по обществознанию 9 класс «СтатГрад» варианты ОБ90201-ОБ90204
  • 07. 12.17 Ответы и задания по русскому языку 11 класс СтатГрад варианты РЯ10701-РЯ10702
  • 07.12.2017 Ответы и задания по биологии 9 класс пробное ОГЭ 4 варианта
  • 08.12.2017 Ответы и задания по географии 9 класс контрольная работа ОГЭ 56 регион
  • 08.12.2017 Ответы и задания по физике 9 класс работа СтатГрад ОГЭ ФИ90201-ФИ90204
  • 10.04.2020 Решать впр тренировочные варианты по математике 6 класс с ответами
  • 10.10.17 Математика 9 класс контрольная работа 4 варианта ФГОС 56 регион задания и ответы
  • 10.10.17 Русский язык 9 класс задания и ответы «СтатГрад» варианты РЯ90101-РЯ90102
  • 10.11.2017 История 9 класс задания и ответы статград варианты ИС90201-ИС90204
  • 100balnik мы в ВКОНТАКТЕ
  • 100balnik отзывы пользователей
  • 11 апреля 10-11 класс география ответы и задания
  • 11 апреля 6 класс история ответы и задания
  • 11 апреля 7 класс биология ответы и задания
  • 11.04.2020 Решать ВПР тренировочные варианты по математике 5 класс с ответами
  • 11. 10.17 Физика 11 класс СтатГрад задания и ответы варианты ФИ10101-ФИ10104
  • 11.12.2017 — 16.12.2017 Олимпиада по дискретной математике и теоретической информатике
  • 11.12.2017 Зимняя олимпиада по окружающему миру для 4 класса задания и ответы
  • 11.12.2017 Ответы и задания по английскому языку 11 класс СтатГрад вариант АЯ10101
  • 11.12.2017 Соревнование для 5-6 классов интернет-карусель по математике задания и ответы
  • 12.04.2020 Решать тренировочные варианты ВПР по математике 4 класс + ответы
  • 12.10 Русский язык 10 класс диагностическая работа ФГОС для 11 региона задания и ответы
  • 12.10.17 Русский 2 класс ВПР официальные варианты задания и ответы
  • 12.10.17 Химия 9 класс «СтатГрад» задания и ответы варианты ХИ90101-ХИ90104
  • 12.12.2017 Ответы и задания по географии 9 класс работа СтатГрад варианты ГГ90101-ГГ90102
  • 13.09.2017 Биология 11 класс СтатГрад задания и ответы все варианты
  • 13.10.17 Математика 9 класс задания и ответы для 11 региона
  • 13. 10.2017 Обществознание 11 класс работа СтатГрад задания и ответы ОБ10101-ОБ10104
  • 13.12.2017 Ответы по физике 11 класс статград задания варианты ФИ10201-ФИ10204
  • 13.12.2017 Письмо говорение по английскому языку 7-9 класс работа 56 регион
  • 14.09.2017 Информатика 11 класс тренировочная работа статград ответы и задания
  • 14.12 Геометрия 9 класс задания и ответы «СтатГрад»
  • 14.12.2017 КДР ответы по русскому языку 8 класс задания все варианты
  • 14.12.2017 Контрольная работа по математике 8 класс за 1 полугодие 2 варианта заданий с ответами
  • 14.12.2017 Литература 11 класс ответы и задания СтатГрад вариант ЛИ10101
  • 14.12.2017 Ответы КДР по математике 10 класс задания 6 вариантов
  • 14.12.2017 Ответы по геометрии 9 класс СтатГрад задания варианты МА90301-МА90304
  • 14.12.2017 Ответы по математике 11 класс КДР задания 6 вариантов
  • 15.09 Математика 10 класс контрольная работа 3 варианта 56 регион задания и ответы
  • 15.
    09.2017 Биология 9 класс тренировочная работа «СтатГрад» БИ90101-БИ90104 ответы и задания
  • 15.11.2017 Задания и ответы 2-11 класс по Русскому медвежонку 2017 год
  • 15.12.2017 Обществознание 11 класс ответы и задания СтатГрад варианты ОБ10201-ОБ10204
  • 16 апреля 11 класс английский язык ответы и задания
  • 16 апреля 5 класс история ответы и задания
  • 16 апреля 6 класс биология ответы и задания
  • 16 апреля 7 класс география ответы и задания
  • 16.01.2018 Контрольная работа по русскому языку 9 класс в формате ОГЭ с ответами
  • 16.01.2018 Ответы и задания КДР по русскому языку 11 класс 23 регион
  • 16.10.2017 Ответы и задания всероссийской олимпиады школьников по математике 4-11 класс ВОШ
  • 16.11.2017 МЦКО 10 класс русский язык ответы и задания
  • 17.01.2018 Ответы и задания по информатике 11 класс работа статград варианты ИН10301-ИН10304
  • 17.10.17 Физика 9 класс «СтатГрад» задания и ответы варианты ФИ90101-ФИ90104
  • 18 апреля 11 класс химия ответы и задания
  • 18 апреля 5 класс биология ответы и задания
  • 18 апреля 6 класс обществознание ответы и задания
  • 18 апреля 7 класс математика ответы и задания
  • 18. 09. Математика 10 класс задания и ответы
  • 18.10.17 Математика 9 класс РПР 64 регион задания и ответы 1 этап
  • 18.10.2017 Задания и ответы по математике 9 класс 50 регион Московская область
  • 18.12.2017 Биология 11 класс Статград задания и ответы варианты БИ10201-БИ10204
  • 19.09 Диагностическая работа по русскому языку 5 класс задания и ответы за 1 четверть
  • 19.09 Контрольная работа по русскому языку 11 класс для 56 региона задания и ответы 1 четверть
  • 19.09.2017 школьный этап всероссийской олимпиады по ОБЖ 5-11 класс задания и ответы
  • 19.10.17 Русский язык 11 класс (ЕГЭ) задания и ответы статград варианты РЯ10601-РЯ10602
  • 19.12.2017 КДР геометрия 8 класс краевая диагностическая работа задания и ответы
  • 19.12.2017 КДР математика 9 класс краевая диагностическая работа задания и ответы
  • 19.12.2017 Математика 10 класс тригонометрия база и профиль ответы и задания СтатГрад
  • 2 апреля 11 класс история ВПР
  • 2 апреля 7 класс английский язык ВПР
  • 20. 09 Входная контрольная работа русский язык 7 класс для 56 региона задания и ответы
  • 20.09.2017 История 9 класс варианты ИС90101-ИС90102 ОГЭ задания и ответы
  • 20.11.2017 Русский язык 9 класс «СтатГрад» ОГЭ задания и ответы РЯ90701-РЯ90702
  • 20.12.2017 Химия 9 класс ответы и задания работа Статград варианты ХИ90201-ХИ90202
  • 21.09.17 Математика 11 класс варианты МА10101-МА10108 задания и ответы
  • 21.10.17 ОБЖ 7-11 класс муниципальный этап ВОШ для Москвы ответы и задания
  • 21.11.17 Биология 9 класс СтатГрад задания и ответы варианты БИ90201-БИ90204
  • 21.12.2017 Математика 9 класс РПР для 64 региона задания и ответы 2 этап
  • 21.12.2017 Ответы и задания по математике 11 класс «СтатГрад» база и профиль
  • 21.12.2017 Ответы и задания по русскому языку 10-11 класс варианты КДР 23 регион
  • 22.09.17 Обществознание 9 класс работа статград ОГЭ варианты ОБ90101-ОБ90102 задания и ответы
  • 22.09.17 Русский язык 10 класс входная контрольная работа ФГОС задания и ответы
  • 22. 10 Задания и ответы олимпиады по литературе 7-11 класс муниципальный этап 2017
  • 23 апреля математика 5 класс ВПР 2019
  • 23 апреля русский язык 6 класс ВПР 2019
  • 23 апреля ФИЗИКА 7 класс ВПР 2019
  • 23.11.2017 Задания и ответы по информатике 9 класс для вариантов статград ИН90201-ИН90204
  • 24.10.17 Изложение 9 класс русский язык СтатГрад варианты РЯ90601-РЯ90602
  • 24.10.17 КДР 8 класс математика алгебра задания и ответы 23 регион
  • 24.10.17 Контрольная работа английский язык 7-9 класс для 56 региона письмо
  • 25.09.17 Информатика 9 класс задания и ответы СтатГрад варианты ИН90101-ИН90102
  • 25.10.17 Английский язык 7-9 класс контрольная работа для 56 региона чтение варианты
  • 25.10.17 История 11 класс МЦКО варианты задания и ответы
  • 25.10.17 Русский язык 9 класс МЦКО задания и ответы
  • 26.09 Английский язык 7,8,9 класс контрольная работа для 56 региона задания и ответы ФГОС
  • 26.09.17 История 11 класс задания и ответы «СтатГрад» варианты ИС10101-ИС10102
  • 26. 09.17 Математика 11 класс мониторинговая работа ЕГЭ 3 варианта задания и ответы
  • 26.10 ВПР Русский язык 5 класс ответы и задания все реальные варианты
  • 26.10.17 Химия 11 класс «СтатГрад» задания и ответы варианты ХИ10101-ХИ10104
  • 27.09.2017 Математика 9 класс работа статград варианты МА90101-МА90104 задания и ответы
  • 27.10 Задания и ответы для олимпиады по биологии муниципальный этап 2017
  • 28.09.17 Русский язык 11 класс задания и ответы «СтатГрад» варианты РЯ10101-РЯ10102
  • 29.09.17 Математика 10 класс задания и ответы «СтатГрад» варианты МА00101-МА00104
  • 30.11.2017 МЦКО математика 11 класс ответы и задания
  • 4 апреля 11 класс биология ВПР
  • 4 апреля 7 класс обществознание ВПР
  • 4 класс диктант 2019 год
  • 4 класс диктант платно
  • 4 класс математика 22.04.2019-26.04.2019
  • 4 класс математика платно ответы и задания
  • 4 класс окр. мир платно
  • 4 класс окружающий мир 22.04.2019-26. 04.2019
  • 4 класс русский тест 2019 год
  • 4 класса тест платно
  • 5 класс биология платно
  • 5 класс история платно
  • 5 класс русский язык впр 25 апреля
  • 5 класс русский язык платно
  • 6 класс история платно
  • 6 класс математика впр 25 апреля
  • 6 класс математика платно
  • 6 класс общество платно
  • 6 класс платно гео ответы и задания
  • 6 класс платно ответы и задания
  • 7 класс ВПР 2019 по географии ответы и задания 16 апреля 2019
  • 7 класс история впр 25 апреля
  • 7 класс русский язык 56 регион ответы и задания 21.12.2018
  • 7.11.17 Английский язык 9 класс от СтатГрад задания и ответы варианты АЯ90101-АЯ90102
  • 8.11.2017 Русский язык 11 класс СтатГрад задания и ответы варианты РЯ10201-РЯ10202
  • 9 апреля география 6 класс ВПР 2019
  • 9 апреля русский язык 7 класс ВПР 2019
  • 9 апреля физика 11 класс ВПР 2019
  • 9 класс английский язык ОГЭ 24 25 мая
  • 9 класс БИОЛОГИЯ ЭКЗАМЕН огэ 2019 год
  • 9 класс информатика огэ 2019 год
  • 9 класс математика огэ 2019 год
  • 9 класс обществознание ОГЭ 2019
  • 9 класс ОГЭ 2019
  • 9 класс русский язык ОГЭ 2019
  • 9 класс ФИЗИКА огэ 2019 год
  • 9 класс ФИЗИКА ЭКЗАМЕН огэ 2019 год
  • 9 класс экзамен по истории огэ 2019 год
  • 9. 11.17 Математика 9 класс работа «СтатГрад» задания и ответы варианты МА90201-МА90204
  • British Bulldog 2019 ответы и задания 3-4 класс 10-11 декабря 2019
  • British Bulldog 3-4 класс ответы и задания 2018-2019
  • British Bulldog 5-6 класс ответы и задания 2018-2019
  • British Bulldog 9-11 класс ответы и задания 2018-2019
  • FAQ
  • My Calendar
  • Алгебра 7 класс статград 4 декабря 2019 ответы и задания МА1970101-106
  • Алгебра и начала анализа статград 10 класс 4 декабря 2019 ответы и задания
  • Английский 9 класс СтатГрад задания и ответы
  • Английский язык 11 класс АЯ10301 ответы и задания 23 апреля 2019 год
  • Английский язык 11 класс СтатГрад 17.04
  • Английский язык 11 класс статград 5 декабря 2019 ответы и задания АЯ1910101
  • Английский язык 7 класс ВПР 2020 тренировочные варианты задания и ответы
  • Английский язык 7 класс ВПР ответы и задания 2 апреля 2019 год
  • Английский язык 7-9 класс ответы и задания 56 регион
  • Английский язык 7,8,9 класс мониторинговая работа чтение 2019
  • Английский язык 9 класс ответы и задания АЯ1990101 АЯ1990102 статград 6 ноября 2019
  • Английский язык 9 класс платно
  • Английский язык 9 класс статград ответы и задания 2018-2019 06. 11
  • Английский язык аудирование ответы 7 8 9 класс 56 регион 2018-2019
  • Английский язык говорение 56 регион ответы 7 8 9 класс 2018-2019
  • Английский язык задания и ответы школьного этапа олимпиады ВОШ 2019-2020
  • Английский язык ответы 7 8 класс 56 регион чтение 2018-2019
  • Английский язык письмо 7 8 класс ответы и задания 2018-2019
  • Аргументы для тем итогового сочинения 2019-2020 регион МСК+8
  • Архив работ
  • Астра 2019 ответы и задания 3-4 класс 20 ноября 2019
  • Банк заданий ФИПИ по русскому языку ЕГЭ 2019 морфемика и словообразование
  • Биология 10 класс РДР задания и ответы 14 ноября 2019-2020
  • Биология 11 класс 5 ноября 2019 статград ответы и задания БИ1910201-204
  • Биология 11 класс ВПР 2019 ответы и задания 4 апреля 2019 год
  • Биология 11 класс ВПР ответы и задания 11.05
  • Биология 11 класс ответы и задания тренировочная №5 26 апреля 2019
  • Биология 5 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • Биология 5 класс ВПР 2019 ответы и задания 18 апреля 2019 год
  • Биология 5 класс ВПР 2020 вариант демоверсии ответы и задания
  • Биология 6 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • Биология 6 класс ВПР 2019 ответы и задания 16 апреля 2019
  • Биология 6 класс платно
  • Биология 7 класс ВПР 2019 ответы и задания 11 апреля 2019
  • Биология 7 класс впр статград ответы и задания 11 сентября 2019
  • Биология 9 класс 15 ноября ответы и задания статград 2018
  • Биология 9 класс БИ90501 БИ90502 ответы и задания 23 апреля 2019
  • Биология 9 класс ответы БИ90401 и БИ90402 статград 01. 2019
  • Биология 9 класс ответы и задания 25 ноября работа статград БИ1990201-БИ1990204
  • Биология 9-10 класс ответы КДР 24 января 2019
  • Биология ОГЭ 2018 платно
  • Благодарим за ваш заказ!
  • Британский бульдог 7-8 класс ответы и задания 2018-2019
  • Вариант 322 КИМы с реального ЕГЭ 2018 по математике
  • Вариант № 33006761 тренировочный ЕГЭ по математике профильный уровень с ответами
  • Вариант № 33006762 тренировочный ЕГЭ по математике профильный уровень с ответами
  • Вариант №1 морфемика и словообразование банк заданий ФИПИ ЕГЭ 2018-2019
  • Вариант №2 морфемика и словообразование банк заданий ФИПИ ЕГЭ 2018-2019
  • Вариант №3 морфемика и словообразование банк заданий ФИПИ ЕГЭ 2018-2019
  • Вариант №4 морфемика и словообразование банк заданий с ответами ФИПИ ЕГЭ
  • Вариант №5 банк заданий с ответами ФИПИ ЕГЭ 2019 по русскому языку морфемика
  • Вариант №6 банк заданий с ответами ФИПИ ЕГЭ 2019 по русскому языку морфемика
  • Вариант №7 банк заданий с ответами ФИПИ ЕГЭ 2019 по русскому языку морфемика
  • Вариант по биологии с реального ЕГЭ 2020 задания и ответы
  • Варианты БИ1910301-БИ1910304 по биологии 11 класс ответы и задания 14 января 2020
  • Варианты ВПР по физике 11 класс задания и ответы за 2018 год
  • Варианты для проведения ВПР 2020 по математике 6 класс с ответами
  • Ваши отзывы — пожелания
  • Вероятность и статистика 7 класс ответы 16. 05
  • Вероятность и статистика 8 класс ответы 16.05
  • Витрина
  • ВКР английский язык 7,8,9 класс задания и ответы говорение 2019-2020
  • ВКР по геометрии 8 класс ответы и задания
  • Возможные варианты для устного собеседования 9 класс ОГЭ 13 марта 2019
  • Вот что с восторгом воскликнул Иван Васильевич готовые сочинения
  • ВОШ всероссийская олимпиада школьников задания и ответы
  • ВОШ ВСЕРОССИЙСКИЕ школьные олимпиады 2017-2018 задания и ответы
  • ВОШ муниципальный этап по обществознанию ответы и задания 2018-2019
  • ВОШ по ОБЩЕСТВОЗНАНИЮ 2017-2018
  • ВОШ Школьный этап 2017-2018 задания и ответы для Республики Коми
  • ВОШ школьный этап по экономике ответы и задания 2018-2019
  • ВПР 11 класс английский язык ответы и задания 20 марта 2018
  • ВПР 11 класс география
  • ВПР 11 класс история ответы и задания 21 марта 2018
  • ВПР 2019 6 класс обществознание ответы и задания 18 апреля 2019 год
  • ВПР 2019 по математике 7 класс ответы и задания 18 апреля 2019 год
  • ВПР 2019 по химии 11 класс ответы и задания 18 апреля 2019 год
  • ВПР 2019 физика 11 класс ответы и задания 9 апреля 2019 год
  • ВПР 2020 6 класс задание №10 по математике с ответами которые будут
  • ВПР 2020 6 класс задание №11 по математике с ответами которые будут
  • ВПР 2020 6 класс задание №6 по математике с ответами
  • ВПР 2020 6 класс задание №7 по математике с ответами
  • ВПР 2020 6 класс задание №8 по математике с ответами
  • ВПР 2020 6 класс задание №9 по математике с ответами которые будут
  • ВПР 2020 английский язык варианты АЯ1910201-АЯ1910202 задания и ответы
  • ВПР 2020 биология 11 класс варианты БИ1910601-БИ1910602 ответы и задания
  • ВПР 2020 биология 5 класс новые варианты с ответами
  • ВПР 2020 вариант демоверсии по биологии 7 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 география 10-11 класс варианты ГГ1910401-ГГ1910402 ответы и задания
  • ВПР 2020 география 6 класс варианты ГГ1960101, ГГ1960102 задания и ответы
  • ВПР 2020 год 6 класс задание №12 по математике с ответами которые будут
  • ВПР 2020 год 6 класс задание №12 по русскому языку с ответами
  • ВПР 2020 год 6 класс задание №13 по математике с ответами которые будут
  • ВПР 2020 год 6 класс задание №13 по русскому языку с ответами
  • ВПР 2020 год 6 класс задание №14 по русскому языку с реальными ответами
  • ВПР 2020 демоверсия по биологии 8 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по географии 7 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по географии 8 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по иностранным языкам 7 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по истории 7 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по истории 8 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по математике 7 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по математике 8 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по обществознанию 7 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по обществознанию 8 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по русскому языку 7 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 демоверсия по русскому языку 8 класс задания и ответы
  • ВПР 2020 задание 6 по русскому языку 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №1 по математике 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №1 по русскому языку 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №10 по русскому языку 6 класс ответы которые будут
  • ВПР 2020 задание №11 по русскому языку 6 класс ответы которые будут
  • ВПР 2020 задание №2 по математике 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №2 по русскому языку 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №3 по математике 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №3 по русскому языку 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №4 по математике 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №4 по русскому языку 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №5 по математике 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №5 по русскому языку 6 класс с ответами
  • ВПР 2020 задание №7 по русскому языку 6 класс с реальными ответами
  • ВПР 2020 задание №8 по русскому языку 6 класс с реальными ответами
  • ВПР 2020 задание №9 по русскому языку 6 класс ответы которые будут
  • ВПР 2020 математика 5 класс реальные задания с ответами
  • ВПР 2020 новые варианты с ответами по русскому языку 7 класс
  • ВПР 2020 ответы и задания всероссийские проверочные работы
  • ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №1 с ответами
  • ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №10 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №2 с ответами
  • ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №3 с ответами
  • ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №4 с ответами
  • ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №6 с ответами
  • ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №7 с ответами
  • ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №8 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №9 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по биологии 7 класс тренировочные варианты БИ1970201,БИ1970202
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание 1 с ответами
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание №10 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание №2 с ответами
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание №3 с ответами
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание №4 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание №5 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание №6 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание №7 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание №8 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по истории 6 класс задание №9 с реальными ответами
  • ВПР 2020 по математике 7 класс задание 11 реальное с ответами
  • ВПР 2020 по математике 7 класс задание 12 реальное с ответами
  • ВПР 2020 по математике 7 класс задание №1 реальное с ответами
  • ВПР 2020 по математике 7 класс задание №13 реальное с ответами
  • ВПР 2020 по математике 7 класс задание №2 реальное с ответами
  • ВПР 2020 по математике 7 класс задание №8 реальное с ответами
  • ВПР 2020 русский язык 8 класс варианты РУ1980201, РУ1980202 ответы
  • ВПР 2020 тренировочные варианты по географии 8 класс задания с ответами
  • ВПР 2020 тренировочные варианты по русскому языку 5 класс задания с ответами
  • ВПР 2020 физика 11 класс варианты ФИ1910601-ФИ1910602 ответы и задания
  • ВПР 2020 химия 8 класс демоверсия задания и ответы
  • ВПР 2021 ответы и задания всероссийские проверочные работы
  • ВПР 2022 ответы и задания всероссийские проверочные работы
  • ВПР 4 класс математика 2020 год реальные официальные задания и ответы
  • ВПР БИОЛОГИЯ 11 класс 2018 реальные ответы и задания
  • ВПР география 10-11 класс
  • ВПР математика 5 класс ответы и задания
  • ВПР по истории 11 класс ответы и задания 18. 05
  • ВПР ФИЗИКА 11 класс 2018
  • ВПР физика 11 класс резервный день ответы
  • ВПР ХИМИЯ 11 05.04
  • ВСЕРОССИЙСКАЯ олимпиада муниципальный этап 2018-2019 задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКАЯ олимпиада муниципальный этап 2019-2020 задания и ответы
  • Всероссийская олимпиада по праву ответы и задания школьный этап 25-26 октября 2019
  • Всероссийская олимпиада по химии ответы и задания школьный этап 21-22 октября 2019
  • ВСЕРОССИЙСКАЯ олимпиада региональный этап 2018-2019 задания и ответы
  • Всероссийская олимпиада школьников региональный этап 2019-2020 задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКАЯ олимпиада школьный этап 2019-2020 задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2017-2018 муниципальный этап задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2017-2018 муниципальный этап задания и ответы для Краснодарского края
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2017-2018 муниципальный этап задания и ответы для Челябинской области
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2017-2018 региональный этап задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2017-2018 учебный год задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2018-2019 учебный год задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2018-2019 школьный этап задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2019-2020 учебный год задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2020-2021 муниципальный этап задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2020-2021 региональный этап задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2020-2021 школьный этап задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2021 заключительный этап задания и ответы
  • ВСЕРОССИЙСКИЕ олимпиады 2021-2022 задания и ответы
  • Всероссийские проверочные работы 2017 задания и ответы
  • Всероссийские проверочные работы 2017-2018 задания и ответы
  • Всероссийские проверочные работы 2018-2019 задания и ответы
  • Всесибирская олимпиада школьников задания и ответы по математике 2018-2019
  • Входная контрольная работа по математике 11 класс ответы и задания 2019-2020
  • Входная контрольная работа по математике 4 класс ответы и задания 2019-2020
  • Входная контрольная работа по математике 5 класс ответы и задания 2019-2020
  • Входная работа по русскому языку 11 класс ответы и задания ФГОС 2019-2020
  • Гарантия
  • ГГ1910101 ответы и задания география 11 класс статград 4 октября 2019
  • ГДЗ 5 классы решебники
  • ГДЗ по Математике за 5 класс: Виленкин Н. Я
  • ГДЗ решебники
  • Гелиантус АСТРА 1-2 класс ответы и задания 2018-2019
  • Гелиантус АСТРА 3-4 класс ответы и задания 2018-2019
  • География 10-11 класс ВПР 2019 ответы и задания 11 апреля 2019
  • География 11 класс ответы и задания 17 апреля 2019 тренировочная №4
  • География 11 класс ответы и задания вариант ГГ10101 статград 2018-2019
  • География 11 класс платно
  • География 11 класс статград ЕГЭ ответы и задания
  • География 6 класс ВПР 2019 ответы и задания 9 апреля 2019
  • География 6 класс ВПР 2020 год задание 7 и официальные ответы
  • География 6 класс ВПР 2020 год задание №8 и реальные ответы
  • География 6 класс ВПР 2020 задание №2 официальное с ответами
  • География 6 класс ВПР 2020 задание №3 с ответами официальные
  • География 6 класс ВПР 2020 задание №4 с ответами официальные
  • География 6 класс ВПР 2020 задание №5 с ответами официальные
  • География 6 класс ВПР 2020 задание №6 и официальные ответы
  • География 6 класс задание №1 реального ВПР 2020 с ответами
  • География 9 класс ОГЭ 4 июня 2019 год
  • География 9 класс ответы и задания ГГ90401 ГГ90402 22 апреля 2019
  • География 9 класс ответы и задания тренировочная статград 18 марта 2019
  • География 9 класс СтатГрад задания и ответы
  • География 9 класс статград ответы и задания 13 марта 2018
  • География задания и ответы школьный этап 2019-2020 всероссийской олимпиады
  • География муниципальный этап 2019 задания и ответы всероссийской олимпиады
  • Геометрия 9 класс ответы и задания 12 декабря 2019 работа статград
  • Готовое итоговое сочинение 2018-2019 на тему может ли добрый человек проявлять жестокость?
  • Готовые сочинения для варианта №1 из сборника ЕГЭ 2021 Цыбулько И. П
  • Готовые сочинения для варианта №2 из сборника ЕГЭ 2021 Цыбулько И.П
  • Готовые сочинения для варианта №3 из сборника ЕГЭ 2021 Цыбулько И.П
  • Готовые сочинения для варианта №4 из сборника ЕГЭ 2021 Цыбулько И.П
  • Готовые сочинения для варианта №5 из сборника ЕГЭ 2021 Цыбулько И.П
  • Готовые сочинения для варианта №6 из сборника ЕГЭ 2021 Цыбулько И.П
  • Готовые сочинения для варианта №7 из сборника ЕГЭ 2021 Цыбулько И.П
  • Готовые сочинения ЕГЭ в избушке у самого леса живёт старый охотник
  • Готовые сочинения ЕГЭ несомненно Дюма останется ещё на многие
  • Готовые сочинения ЕГЭ ты часто жаловался мне, что тебя «не понимают!»
  • Готовые сочинения как-то Анатолий Бочаров высказал по тексту В. В. Быкову
  • Готовые сочинения на Невском, у Литейного постоянно толпились
  • Готовые сочинения по тексту Ф. М. Достоевскому в эту ночь снились мне
  • Готовые сочинения чего нам так не хватает а не хватает нам любви к детям по тексту А. А. Лиханову
  • Готовые сочинения я очень плохо знаю деревенскую жизнь с проблемами и текстом
  • ДВИ МГУ варианты ответы и программы вступительных испытаний
  • Демоверсия ВПР 2020 география 6 класс задания и ответы фипи
  • Демоверсия ВПР 2020 история 6 класс задания и ответы фипи
  • Демоверсия ВПР 2020 по биологии 6 класс задания и ответы фипи
  • Демоверсия ВПР 2020 по обществознанию 6 класс задания и ответы фипи
  • Демоверсия ОГЭ 2019 по математике решение заданий
  • Диктант по русскому языку 4 класс ВПР 2018 задания
  • ДКР 2019 по географии 10 класс ответы и задания Свердловская область
  • ДКР 2019 по географии 7 класс задания и ответы 11 декабря 2019-2020
  • Добро пожаловать
  • Доступ ко всем работам
  • ЕГЭ 2020 тренировочный вариант 200622 с ответами по истории 11 класс
  • Если хочешь понять душу леса найди лесной 9 готовых сочинений ЕГЭ
  • Естественные науки ответы и задания олимпиада ЗВЕЗДА 25-29 ноября 2019-2020
  • за эти месяцы тяжелой борьбы решающей 9 готовых сочинений ЕГЭ
  • Задание № 15 неравенства ОГЭ по математике 9 класс 2020
  • Задания ВПР 2017 для 11 класса по географии
  • Задания ВПР 2017 для 4 класса по русскому языку
  • Задания ВПР 2017 для 5 класса по математике
  • Задания заключительного этапа ВСЕРОССИЙСКОЙ олимпиады по информатике 2017/2018
  • Задания и ответы 2 варианта пробного экзамена ЕГЭ по математике 11 класс 4 апреля 2018
  • Задания и ответы 56 регион на ФЕВРАЛЬ 2017
  • Задания и ответы 6 класс XXX математический праздник 2019 год
  • Задания и ответы Англ. яз 18.11
  • Задания и ответы Биология 14.11
  • Задания и ответы Биология 9 класс 21.11.
  • Задания и ответы всероссийской олимпиады по русскому языку Московской области 19 ноября 2017
  • Задания и ответы ГЕОГРАФИЯ 21.11.2017
  • Задания и ответы для комплексной работы КДР для 8 класса ФГОС 4 варианта
  • Задания и ответы для Оренбургской области 56 регион декабрь 2017
  • Задания и ответы для Оренбургской области ноябрь 2017
  • Задания и ответы для Оренбургской области октябрь 2017
  • Задания и ответы для Оренбургской области сентябрь 2017
  • Задания и ответы для работ 11 регион Республика Коми 2018-2019
  • Задания и ответы для работ 11 региона Республика Коми Декабрь 2018-2019
  • Задания и ответы для работ 11 региона Республика Коми НОЯБРЬ 2018-2019
  • Задания и ответы для работ 56 региона октябрь 2018
  • Задания и ответы для работ Республики Коми
  • Задания и ответы для регионального этапа по физической культуре 2018
  • Задания и ответы для школьных работ Оренбургской области 56 регион декабрь 2018
  • Задания и ответы для школьных работ Оренбургской области 56 регион февраль 2018
  • Задания и ответы КДР 2019 математика 9 класс 20 февраля
  • Задания и ответы Математика 03. 12
  • Задания и ответы Математика 17.11
  • Задания и ответы муниципального этапа 2019-2020 по немецкому языку 7-11 класс ВСОШ
  • Задания и ответы муниципального этапа по русскому языку 2019-2020 Москва
  • Задания и ответы МХК 15.11
  • Задания и ответы на Апрель 2017 для 56 региона
  • Задания и ответы на Май 2017 для 56 региона
  • Задания и ответы на Март 2017 для 56 региона
  • Задания и ответы олимпиады по литературе региональный этап 2020
  • Задания и ответы по информатике 11 класс 28 ноября 2017 СтатГрад варианты ИН10201-ИН10204
  • Задания и ответы по истории для 11 классов (56 регион)
  • Задания и ответы по математике 11 класс профиль вариант №22397963
  • Задания и ответы по математике 11 класс профиль ЕГЭ вариант №22397967
  • Задания и ответы по математике 6 класс ВПР 2018
  • Задания и ответы по русскому языку 6 класс ВПР 2018
  • Задания и ответы по русскому языку 9 класс СтатГрад 29 ноября 2017 варианты РЯ90201-РЯ90202
  • Задания и ответы по физике муниципального этапа 2019 всероссийская олимпиада
  • Задания и ответы по химии 11 класс СтатГрад 30 ноября 2017 года варианты ХИ10201-ХИ10204
  • Задания и ответы ПРАВО 14. 11
  • Задания и ответы право региональный этап ВОШ 2019
  • Задания и ответы регионального этапа 2019 по английскому языку
  • Задания и ответы регионального этапа 2019 по испанскому языку
  • Задания и ответы регионального этапа 2019 по китайскому языку
  • Задания и ответы регионального этапа 2019 по химии ВОШ
  • Задания и ответы региональный этап ВОШ 2019 по французскому
  • Задания и ответы Русский язык 19.11
  • Задания и ответы Русский язык ОГЭ 9 класс 20.11.
  • Задания и ответы Физика 18.11
  • Задания и ответы Химия 24.11
  • Задания Московской математической олимпиады 8 класс 17 марта 2019 год
  • Задания МОШ 2019 по физике 1 тур 7 8 9 10 класс
  • Задания по истории муниципальный этап 11 ноября всероссийской олимпиады 2018-2019
  • Задания, ответы и результаты олимпиады по биологии региональный этап 2020
  • Задания, ответы и результаты олимпиады по химии региональный этап 2020
  • Заключительный этап 2022 задания и ответы многопрофильной инженерной олимпиады звезда
  • Заключительный этап всероссийской олимпиады школьников 2019-2020 задания и ответы
  • Закрытый раздел
  • Золотое руно 2018 ответы и задания 16 февраля конкурс по истории
  • Изложение русский язык 9 класс статград ответы и задания 4 октября 2019
  • Информатика 11 класс 15 ноября 2019 статград ответы и задания ИН1910201- ИН1910204
  • Информатика 11 класс КДР ответы и задания 18 декабря 2018
  • Информатика 11 класс платно
  • Информатика 11 класс СтатГрад задания и ответы
  • Информатика 11 класс тренировочная №5 ответы и задания 15 апреля 2019 год
  • Информатика 7 класс ответы РДР 21 февраля 2019
  • Информатика 9 класс 06. 03
  • Информатика 9 класс ОГЭ 4 июня 2019 год
  • Информатика 9 класс ответы и задания тренировочная №5 25 апреля 2019
  • Информатика 9 класс ответы статград 13 ноября 2018
  • Информатика 9 класс ответы статград 31 января 2019
  • Информатика ВОШ школьный этап ответы и задания 2018-2019
  • Информатика ОГЭ 2018
  • Информатика ОГЭ 2018 платно
  • Информатика ответы и задания школьный этап 2019 всероссийской олимпиады школьников
  • История 10 класс РДР 2019 официальные задания и ответы все варианты
  • История 11 класс 13 ноября 2019 ответы и задания статград вариант ИС1910201- ИС1910204
  • История 11 класс ВПР 2018 год задания и ответы все варианты
  • История 11 класс ВПР 2019 ответы и задания 2 апреля 2019 год
  • История 11 класс ВПР 2020 тренировочные варианты с ответами
  • История 11 класс задания и ответы СтатГрад
  • История 11 класс ИС10201 и ИС10202 ответы и задания статград 23.11.2018
  • История 11 класс ответы и задания СтатГрад 24. 04
  • История 11 класс ответы ИС10401 и ИС10402 11 марта 2019 год
  • История 11 класс СтатГрад 24 ноября 2017 задания и ответы варианты ИС10201-ИС10204
  • История 5 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • История 5 класс ВПР 2019 ответы и задания 16 апреля 2019
  • История 5 класс ВПР 2020 вариант демоверсии ответы и задания
  • История 5 класс ВПР 25.04
  • История 6 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • История 6 класс ВПР 2019 ответы и задания 11 апреля 2019
  • История 6 класс тренировочные варианты ВПР 2020 задания и ответы
  • История 7 класс ВПР 2019 ответы и задания варианты 25 апреля
  • История 7 класс платно 24 апреля
  • История 9 класс входная контрольная работа ФГОС задания и ответы 2019-2020
  • История 9 класс ответы и задания тренировочная №5 26 апреля 2019 год
  • История 9 класс СтатГрад 27 февраля ответы и задания
  • История 9 класс статград ответы и задания 2018-2019
  • История 9 класс статград ответы и задания 30 марта 2018
  • История всероссийская олимпиада школьный этап 2019-2020 задания и ответы московская область
  • Итоговая контрольная работа по математике 8 класс за 2018-2019 учебный год
  • Итоговая контрольная работа по русскому языку 7 класс за 2018-2019 учебный год
  • Итоговая работа математика 10 класс ответы и задания 24 апреля 2019 год
  • Итоговое собеседование варианты 12 февраля 2020
  • Итоговое сочинение 05. 12.2018
  • Итоговое сочинение 2017
  • Итоговое устное собеседование ОГЭ 2022 по русскому языку 9 класс
  • Как написать эссе по обществознанию ЕГЭ
  • Как получить задания и ответы для ВПР 2019
  • Как получить работу задания и ответы
  • Как получить темы на итоговое сочинение 6 декабря 2017 года
  • Как человеку воспитать в себе доброту? готовое итоговое сочинение 2018-2019
  • КДР (задания+ответы) на Февраль 2017
  • КДР (задания+ответы) на Январь 2017
  • КДР 1 класс задания и ответы комплексная работа варианты 2018 год
  • КДР 2 класс задания и ответы комплексная работа варианты 2018 год
  • КДР 2019 23 регион ответы и задания май 2019 год
  • КДР 2019 задания и ответы по английскому языку 8 класс 21 мая 2019 год
  • КДР 2019 ответы и задания апрель 2019 год
  • КДР 2019 ответы по географии 9 класс 15 февраля
  • КДР 2019 химия 9 и 10 класс ответы 19 марта 2019 год
  • КДР 2019-2020 декабрь 23 регион ответы и задания
  • КДР 2020 23 регион ответы и задания Краснодарский край
  • КДР 9 класс русский язык ответы и задания 14 декабря 2018
  • КДР Английский язык 8 класс ответы и задания 2018-2019
  • КДР апрель 2017 работы задания и ответы
  • КДР апрель 2018 задания и ответы для Краснодарского края 23 регион
  • КДР декабрь 2017 задания и ответы для Краснодарского края 23 регион
  • КДР задания и ответы
  • КДР задания и ответы комплексная работа 3 класс 2018 год
  • КДР задания и ответы комплексная работа 4 класс варианты 2018 год
  • КДР Май 2017 работы задания и ответы
  • КДР Май 2018 задания и ответы для Краснодарского края 23 регион
  • КДР математика 11 класс задания и ответы 28 февраля 2018 год
  • КДР математика 7 класс ответы и задания 12. 04
  • КДР математика 9 класс 19.04
  • КДР ответы и задания 23 регион Январь 2019
  • КДР ответы и задания для Краснодарского края 23 регион ДЕКАБРЬ 2018
  • КДР ответы и задания математика 10-11 класс 23 ноября 2018
  • КДР ответы и задания НОЯБРЬ 2018 для Краснодарского края 23 регион
  • КДР ответы и задания октябрь 2018 для Краснодарского края 23 регион
  • КДР ответы и задания по английскому языку 9 10 11 класс 8 февраля 2018
  • КДР ответы и задания по Биологии 10 класс 23 января 2018
  • КДР ответы и задания по Биологии 11 класс 23 января 2018
  • КДР ответы и задания по Биологии 9 класс 23 января 2018
  • КДР ответы и задания по Географии 10 класс 25 января 2018
  • КДР ответы и задания по Географии 9 класс 25 января 2018
  • КДР ответы и задания по информатике 10 класс 18 января 2018
  • КДР ответы и задания по информатике 9 класс 18 января 2018
  • КДР ответы и задания по истории 9 10 11 класс 13 февраля 2018
  • КДР ответы и задания по обществознанию 9 10 11 класс 1 февраля 2018
  • КДР ответы и задания по русскому языку 9 класс 6 февраля 2018
  • КДР ответы и задания по химии 10 11 класс 6 февраля 2018
  • КДР ответы математика 7 класс 30 января 2019
  • КДР ответы русский язык 9 класс 6 февраля 2019
  • КДР ответы физика 9-10 класс 31 января 2019
  • КДР по алгебре 8 класс ответы и задания 2018-2019
  • КДР ПО ГЕОГРАФИИ 11 КЛАСС 23 регион ответы и задания 22 февраля
  • КДР по литературе 10 11 класс 2018 ответы и задания
  • КДР по литературе 10 класс ответы
  • КДР по Математике 9 класс официальные ответы
  • КДР по русскому языку для 9 классов
  • КДР русский язык 7 8 класс ответы и задания
  • КДР русский язык 7-8 класс ответы 17. 05
  • КДР февраль 2018 задания и ответы для Краснодарского края 23 регион
  • КДР январь 2018 задания и ответы для Краснодарского края 23 регион
  • Кенгуру 2017 9 класс ответы
  • Кенгуру 2017 ответы и задания 2-10 класс
  • Кенгуру 2019 ответы и задания 5-6 класс
  • Кенгуру 2019 ответы и задания для 7-8 класса
  • КИТ 2-3 класс ответы и задания 2018-2019
  • КИТ 8-9 класс ответы и задания 2018-2019
  • КИТ-2019 ответы и задания 10-11 класс 27 ноября 2019-2020
  • Комплексная работа ФГОС 5 6 7 8 9 класс ответы и задания 30 ноября 2018
  • Конкурс АСТРА 2019 ответы и задания 5-6 класс 20 ноября 2019
  • Конкурс КИТ 2018 4-5 класс ответы и задания
  • Конкурс КИТ 2019 ответы и задания 2-3 класс 27 ноября 2019
  • Контакты
  • Контрольная входная работа по русскому языку 10 класс ответы и задания 2019-2020
  • Контрольная работа за 1 полугодие по русскому языку 7 класс ответы и задания
  • Контрольная работа по математике 11 класс 2 четверть в формате ЕГЭ 3 варианта с ответами
  • Контрольная работа по русскому языку 10 класс за 1 полугодие 2 варианта с ответами
  • Контрольная работа по русскому языку 8 класс за 1 полугодие 2 четверть задания и ответы
  • Контрольные работы ОГЭ 2021 задания и ответы для 9 класса
  • Контрольные срезы 56 регион ответы и задания октябрь 2019-2020
  • Корзина
  • Критерии ответы и задания по физике 11 класс статград 23 марта 2018
  • Критерии ответы по информатике 11 класс статград 16 марта 2018
  • Критерии ответы по русскому языку 11 класс статград 2018
  • Кружила январская метелица скрипели мерзлые готовые сочинения ЕГЭ
  • Куда поступить после 11 класса в 2017 году
  • Литература 11 класс ответы и задания ЕГЭ статград 22. 03.2018
  • Литература 11 класс СтатГрад задания и ответы
  • Литература 9 класс ОГЭ 2019 год
  • Литература 9 класс ответы и задания статград 22 ноября 2018 год
  • Литература 9 класс статград ОГЭ сочинение ответы 14 марта 2018
  • Литература ОГЭ 2018 платно
  • Литература олимпиада ВОШ задания муниципальный этап 2018-2019
  • Литература ответы и задания школьный этап 2019 всероссийской олимпиады школьников
  • Литература ответы и задания школьный этап всероссийской олимпиады школьников 2019-2020
  • Литература школьный этап 2019-2020 задания и ответы олимпиады ВОШ
  • Математика 7 классов 56 регион задания и ответы
  • Математика 10 класс (вероятность и статистика)
  • Математика 10 класс 56 регион ответы 16.05
  • Математика 10 класс вероятность и статистика ответы и задания 4 апреля 2019
  • Математика 10 класс задания и ответы мониторинговая работа ФГОС 2019-2020
  • Математика 10 класс ответы и задания 18.05
  • Математика 10 класс ответы и задания статград
  • Математика 10 класс ответы и задания статград 2018-2019
  • Математика 10 класс статград ответы и задания 29. 03.2018
  • Математика 10 класс статград ответы и задания БАЗА и ПРОФИЛЬ
  • Математика 10 класс тригонометрия ответы статград 18.12.2018
  • Математика 10-11 класс ответы и задания варианты статград 17 мая 2019
  • Математика 10-11 класс ответы и задания СтатГрад
  • Математика 11 класс 17 декабря 2019 контрольная работа задания и ответы
  • Математика 11 класс диагностическая работа ЕГЭ профиль задания и ответы для 11 региона
  • Математика 11 класс КДР ответы и задания 28 февраля
  • Математика 11 класс ответы база профиль статград 24 января 2019
  • Математика 11 класс ответы и задания БАЗА ПРОФИЛЬ 20.09
  • Математика 11 класс ответы и задания тренировочная работа №5 19 апреля 2019
  • Математика 11 класс ответы статград БАЗА ПРОФИЛЬ 20.12.2018
  • Математика 11 класс профиль 56 рег
  • Математика 11 класс тренировочная №4 статград ответы и задания 13 марта 2019
  • Математика 3 класс задания ВСОКО МЦКО итоговая работа 2019
  • Математика 4 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • Математика 4 класс ВПР ответы 25. 04
  • Математика 4 класс демоверсия ВПР 2020 задания и ответы ФИПИ
  • Математика 5 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • Математика 5 класс ВПР 2019 ответы и задания 23 апреля
  • Математика 5 класс задания и ответы СтатГрад варианты 12 сентября 2017 год
  • Математика 5 класс контрольная работа за 1 полугодие задания и ответы 2019-2020
  • Математика 5 класс официальная демоверсия ВПР 2020 задания и ответы
  • Математика 5 класс платно
  • Математика 6 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • Математика 6 класс ВПР 2019 ответы и задания варианты 25 апреля
  • Математика 6 класс ВПР 2020 демоверсия фипи задания и ответы
  • Математика 6 класс ответы СтатГрад 15.05
  • Математика 7 класс ответы и задания варианты МА70301 МА70302 14 мая 2019
  • Математика 7 класс РДР ответы 2018-2019
  • Математика 8 класс 56 регион 17.03
  • Математика 8 класс 56 регион ответы и задания 15 марта 2018
  • Математика 8 класс входная контрольная работа ответы и задания 2019-2020
  • Математика 8 класс задания и ответы работа статград 12 сентября 2017
  • Математика 8 класс ответы и задания варианты МА80201 МА80202 14 мая 2019
  • Математика 8 класс ответы и задания по диагностической работе 11 регион 2018-2019
  • Математика 8 класс статград ответы и задания
  • Математика 9 класс — 64 регион ответы
  • Математика 9 класс 12 ноября 2019 ответы и задания работа статград МА1990201-04
  • Математика 9 класс 13. 02
  • Математика 9 класс 56 рег ответы
  • Математика 9 класс контрольная работа в формате ОГЭ 4 варианта ответы и задания
  • Математика 9 класс ОГЭ 2018 ответы и задания
  • Математика 9 класс ответы 11 регион 18.12.2018
  • Математика 9 класс ответы 15.05 СтатГрад
  • Математика 9 класс ответы и задания 11 регион 4 октября 2018
  • Математика 9 класс ответы и задания варианты 56 регион 10 октября 2019
  • Математика 9 класс ответы и задания РПР 64 регион 20.12.2018
  • Математика 9 класс ответы и задания статград 19 марта 2019
  • Математика 9 класс ответы и задания статград варианты 15 мая 2019 год
  • Математика 9 класс ответы РПР 64 регион 2019 3 этап 20 марта
  • Математика 9 класс пробник статград ответы и задания 21 марта 2018
  • Математика 9 класс статград ОГЭ ответы и задания
  • Математика 9 класс статград ответы и задания 13 февраля 2018 года
  • Математика 9 класс статград ответы и задания 27.09.2018
  • Математика База платно
  • Математика геометрия 9 класс КДР ответы и задания 20 февраля 2018
  • Математика задания и ответы муниципальный этап ВОШ 2018-2019 для Москвы
  • Математика олимпиада ВОШ 2018-2019 школьный этап задания и ответы
  • Математика ответы и задания для школьного этапа всероссийской олимпиады 2019-2020
  • Математика профиль 11 класс 56 регион контрольная работа 18. 12.2018
  • Математика тренировочная работа 9 класс ответы статград 8 ноября 2018 года
  • Математическая вертикаль 2021-2022 ответы и задания
  • Математическая вертикаль ответы и задания 2020-2021 учебный год
  • Международный молодёжный предметный чемпионат по правоведению для 10-11 классов.
  • Многопрофильная инженерная олимпиада «Звезда» 2017-2018 задания и ответы
  • Многопрофильная инженерная олимпиада «Звезда» 2018-2019 ответы и задания
  • Многопрофильная инженерная олимпиада Звезда 2021-2022 ответы и задания
  • Многопрофильная олимпиада Звезда 2019-2020 ответы и задания
  • Многопрофильная олимпиада Звезда 2020-2021 ответы и задания
  • Мой аккаунт
  • Мониторинговая работа аудирование по английскому языку 7,8,9 класс задания и ответы 2019-2020
  • Мониторинговая работа по английскому языку 7,8,9 класс задания и ответы 2019
  • Мониторинговая работа по русскому языку 5 класс ответы и задания ФГОС 2019-2020
  • Мониторинговая работа по русскому языку 8 класс ответы и задания ФГОС 2019-2020
  • Мониторинговые работы 56 регион ответы и задания сентябрь 2019
  • Московская олимпиада школьников 2020-2021 ответы и задания
  • Московская олимпиада школьников 2021-2022 ответы и задания
  • Московский турнир юных физиков задания 2019-2020 учебный год
  • МПУ МЦКО 4 класс задания 31 января 2019 год
  • Муниципальный этап 2019 олимпиады по испанскому языку задания и ответы ВОШ
  • Муниципальный этап 2019 олимпиады по истории задания и ответы ВСОШ
  • Муниципальный этап 2019-2020 олимпиада по ОБЖ ответы и задания для Москвы
  • Муниципальный этап 2019-2020 олимпиады по химии задания и ответы Московская область
  • Муниципальный этап 2019-2020 олимпиады по экологии ответы и задания ВсОШ Москва
  • Муниципальный этап 2019-2020 по литературе ответы и задания ВсОШ Москва
  • Муниципальный этап ВОШ 2018 по праву задания и ответы для Москвы
  • Муниципальный этап ВОШ 2018-2019 задания по химии в Московской области
  • Муниципальный этап ВОШ по астрономии ответы и задания 2018-2019 учебный год
  • Муниципальный этап ВОШ по ОБЖ ответы и задания 2018-2019
  • Муниципальный этап олимпиады 2019 по искусству МХК задания и ответы ВСОШ
  • Муниципальный этап олимпиады 2019-2020 по астрономии задания и ответы Московская область
  • Муниципальный этап олимпиады по биологии ответы и задания 19 октября 2019
  • Муниципальный этап по астрономии всероссийской олимпиады задания 2018-2019
  • Муниципальный этап по обществознанию 2019-2020 ответы и задания ВСОШ Москва
  • Муниципальный этап по экономике всероссийская олимпиада 2018-2019
  • МХК искусство задания и ответы муниципального этапа 2019-2020 учебный год
  • МХК искусство школьный этап 2019 ответы и задания всероссийской олимпиады школьников
  • МХК муниципальный этап 8 ноября задания всероссийской олимпиады 2018-2019
  • МЦКО 2019-2020 расписание и демоверсии диагностических работ
  • МЦКО 2020-2021 расписание и демоверсии диагностических работ с ответами
  • МЦКО 2021-2022 расписание и демоверсии диагностических работ с ответами
  • МЦКО 7 класс математика ответы 13 февраля 2018
  • МЦКО 8 класс метопредмет ответы и задания 27 февраля
  • МЦКО 8 класс ответы 15. 03
  • МЦКО история 10 класс ответы 25.10.2018
  • МЦКО математика 3 класс задания
  • Мцко математика 7 класс 02.03.17
  • МЦКО математика 9 класс варианты задания и ответы 2019-2020
  • МЦКО математика 9 класс ответы и задания 3 октября 2018
  • МЦКО ответы и задания по русскому языку 11 класс 18 января 2018
  • МЦКО ответы и задания по русскому языку 7 8 класс 1 февраля 2018
  • МЦКО по физике для 9 классов
  • МЦКО русский язык 9 класс ответы 2018-2019
  • МЦКО физика для 7 классов ответы и задания
  • Направления тем итогового сочинения 2017-2018
  • Наше наследие 1-11 класс муниципальный тур ответы и задания 2019-2020
  • Наше наследие 1-11 класс школьный тур ответы и задания 2019-2020
  • Наше наследие олимпиада задания и ответы 2017-2018
  • Наше наследие ответы и задания 5-6 класс школьный тур 2019-2020
  • Наше наследие ответы и задания 9-11 класс школьный тур 2019-2020
  • Новый тренировочный вариант 200622 по биологии 11 класс ЕГЭ 2020 с ответами
  • Новый тренировочный вариант 200622 по физике 11 класс ЕГЭ 2020 с ответами
  • Новый тренировочный вариант 210201 по английскому языку 11 класс ЕГЭ 2021 с ответами
  • Новый тренировочный вариант 210201 по истории 11 класс ЕГЭ 2021 с ответами
  • Новый тренировочный вариант 210201 по литературе 11 класс ЕГЭ 2021 с ответами
  • Новый тренировочный вариант 210201 по обществознанию 11 класс ЕГЭ 2021 с ответами
  • Новый тренировочный вариант 210208 по химии 11 класс ЕГЭ 2021 с ответами
  • Новый тренировочный вариант 34072997 по математике профиль 11 класс ЕГЭ с ответами
  • Новый тренировочный вариант 34072998 по математике профиль 11 класс ЕГЭ с ответами
  • Новый тренировочный вариант 34072999 по математике профиль 11 класс ЕГЭ 2021 с ответами
  • Новый тренировочный вариант 34073000 по математике профиль 11 класс ЕГЭ 2021 с ответами
  • Новый тренировочный вариант ЕГЭ 34073001 по математике профильный с ответами
  • Новый тренировочный вариант КИМ 210208 по биологии 11 класс ЕГЭ 2021 с ответами
  • Новый тренировочный вариант КИМ 210208 по физике 11 класс ЕГЭ 2021 с ответами
  • О нас
  • ОБ1910201-ОБ1910204 ответы и задания обществознание 11 класс 13 декабря 2019
  • ОБЖ школьный этап задания и ответы олимпиады ВОШ 2019-2020
  • Обществознание 10 класс КДР 2019 задания и ответы 01. 03.2019
  • Обществознание 11 класс 04.05
  • Обществознание 11 класс ответы тренировочная №4 статград 20 марта 2019
  • Обществознание 11 класс статград ЕГЭ ответы и задания 19 марта 2018
  • Обществознание 11 класс СтатГрад задания и ответы
  • Обществознание 11 класс Статград ответы и задания
  • Обществознание 6 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • Обществознание 7 класс ВПР 2019 ответы и задания 4 апреля 2019 год
  • Обществознание 9 11 класс контрольная работа 56 регион 20 февраля 2018
  • Обществознание 9 класс 19 декабря 2019 ответы и задания ОБ1990201-ОБ1990204
  • Обществознание 9 класс КДР 2019 ответы 01.03.2019
  • Обществознание 9 класс ответы и задания 29 апреля 2019 тренировочная №5
  • Обществознание 9 класс СтатГрад задания и ответы
  • Обществознание 9 класс тренировочная №4 статград ответы и задания 14 марта 2019
  • Обществознание 9 класс тренировочная работа №1 ответы и задания 21.09
  • ОБЩЕСТВОЗНАНИЕ для 9 классов Республика Коми, 11 регион
  • Обществознание ОГЭ 2018 платно
  • ОГЭ
  • ОГЭ 2017 закрытый раздел
  • ОГЭ 2018 Математика платно
  • ОГЭ 2019 география 9 класс ответы для 24 региона
  • ОГЭ 2019 география 9 класс ответы для 54 региона
  • ОГЭ 2019 официальное расписание экзаменов 9 класс
  • ОГЭ английский язык 2018 ответы и задания 9 класс
  • Одно желание было у лейтенанта Бориса Костяева готовые сочинения ЕГЭ
  • Окружающий мир 4 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • Окружающий мир 4 класс демоверсия ВПР 2020 задания и ответы ФИПИ
  • Олимпиада Звезда заключительный тур 2017-2018 задания и ответы
  • Олимпиада Ломоносов по математике 11 класс задания и ответы 2018-2019
  • Олимпиада Наше Наследие 2019-2020 учебный год задания и ответы
  • Олимпиада Наше Наследие 2020-2021 учебный год ОВИО задания и ответы
  • Олимпиада Наше Наследие задания и ответы 2018-2019 учебный год
  • Олимпиада основы православной культуры задания и ответы 2019-2020
  • Олимпиада по английскому языку 8-10 класс ответы и задания для пригласительного этапа 17 апреля 2020
  • Олимпиада по английскому языку задания и ответы муниципального этапа 2019
  • Олимпиада по английскому языку школьный этап 2017 задания
  • Олимпиада по астрономии муниципальный этап 2019 задания и ответы
  • Олимпиада по биологии ответы и задания школьный этап 2019 ВОШ
  • Олимпиада по биологии ответы и задания школьный этап ВсОШ 23-24 октября 2019
  • Олимпиада по математике НТИ отборочный этап ответы и задания 2018-2019
  • Олимпиада по МХК школьный этап 2017 задания
  • Олимпиада по обществознанию школьный этап 2017 задания
  • Олимпиада по праву школьный этап 2017 задания
  • Олимпиада по русскому языку задания и ответы школьного этапа 2019
  • Олимпиада по физической культуре муниципальный этапа 2019-2020 задания и ответы
  • Олимпиада по экологии 4-10 класс ответы и задания для пригласительного этапа 15 апреля 2020
  • Олимпиада по экологии ответы и задания школьный этап 2019-2020 Московская область
  • Олимпиада по экологии школьный этап 2017 задания
  • Олимпиада РОСАТОМ 2018-2019 задания и ответы
  • Олимпиада ФИЗТЕХ 11 класс ответы и задания 2018-2019
  • Олимпиада школьников САММАТ 2019-2020 ответы и задания
  • Оплата заказа
  • Оренбургская область 56 регион задания и ответы работы январь 2018
  • Отборочные задания по математике для физико-математической школы 2019 год
  • Отборочные задания по физике для физико-математической школы 2019 год
  • Ответы 56 регион математика 8 класс 19 декабря 2018
  • Ответы 7 8 класс золотое руно 2019 с заданиями
  • Ответы 9-11 класс золотое руно задания 2019
  • Ответы английский язык 7 8 9 класс говорение 56 регион 2018-2019
  • Ответы английский язык для 9 классов 56 регион
  • Ответы ВПР 2020 по биологии 6 класс задание №5
  • Ответы для реального задания №10 ВПР 2020 по географии 6 класс
  • Ответы для реального задания №9 ВПР 2020 по географии 6 класс
  • Ответы задания и сочинения татарский язык ЕРТ
  • Ответы задания изложение по русскому языку 9 класс СтатГрад 8 февраля 2018
  • Ответы и задания 1-2 класс конкурс АСТРА 20 ноября 2019-2020
  • Ответы и задания 10-11 класс КИТ 2018
  • Ответы и задания 11 класс кенгуру выпускника 2019
  • Ответы и задания 12. 04.2018
  • Ответы и задания 2 класс пегас 2019
  • Ответы и задания 2 класс чип 2019-2020 Австралия
  • Ответы и задания 3-4 класс золотое руно 2019
  • Ответы и задания 3-4 класс кенгуру 2019 год
  • Ответы и задания 3-4 класс пегас 2019
  • Ответы и задания 3-4 класс ЧИП 2019 год
  • Ответы и задания 4-5 класс КИТ 2019 конкурс 27 ноября 2019-2020
  • Ответы и задания 4-5 класс русский медвежонок 14 ноября 2019
  • Ответы и задания 5-6 класс Гелиантус (астра) 2018-2019
  • Ответы и задания 5-6 класс золотое руно 2019 год
  • Ответы и задания 6-7 класс КИТ 2019 конкурс 27 ноября 2019-2020
  • Ответы и задания 6-7 класс русский медвежонок 2018-2019
  • Ответы и задания 8-9 класс русский медвежонок 2018-2019
  • Ответы и задания 9 класс кенгуру выпускника 2019
  • Ответы и задания 9-10 класс кенгуру 2019 год
  • Ответы и задания английский язык 9 класс диагностика №2 22 марта 2019
  • Ответы и задания БИ10401 и БИ10402 биология 11 класс 4 марта 2019
  • Ответы и задания биология 11 класс статград
  • Ответы и задания биология 11 класс статград 30 ноября 2018
  • Ответы и задания ВПР по географии 10-11 класс 03. 04.2018
  • Ответы и задания география 11 класс статград 9 декабря 2019 ГГ1910201
  • Ответы и задания для конкурса Кенгуру 2020 11 класс
  • Ответы и задания для конкурса по информатике КИТ 1-11 класс 29 ноября 2017 год
  • Ответы и задания для Оренбургской области 56 регион март 2019
  • Ответы и задания для пробных работ 56 региона 2018
  • Ответы и задания для работ 15.02.2017
  • Ответы и задания для работы статград по истории 9 класс
  • Ответы и задания золотое руно 2019 1-2 класс
  • Ответы и задания информатика 11 класс ИН1910101 ИН1910102 23 сентября 2019
  • Ответы и задания история 9 класс статград 29 ноября 2018 год
  • Ответы и задания КДР 23 регион март 2019 год
  • Ответы и задания КДР геометрия 8 класс 16 ноября 2018 года
  • Ответы и задания кенгуру 2 класс 2019 год
  • Ответы и задания кенгуру выпускника 4 класс 2019
  • Ответы и задания контрольная по математике 7 класс
  • Ответы и задания контрольных работ для 56 региона декабрь 2019
  • Ответы и задания МЦКО английский язык 9 класс 2018
  • Ответы и задания ОГЭ 2018 по математике 9 класс
  • Ответы и задания олимпиада звезда по обществознанию 2019-2020 отборочный этап
  • Ответы и задания олимпиады по физкультуре 8,9,10 класс пригласительный этап 28 апреля 2020
  • Ответы и задания по астрономии школьный этап всероссийской олимпиады 2019-2020
  • Ответы и задания по биологии 11 класс 30 января 2018 СтатГрад
  • Ответы и задания по биологии 11 класс статград 12. 09
  • Ответы и задания по биологии 9 класс 17.09 статград
  • Ответы и задания по Биологии 9 класс 24 января 2018 СтатГрад
  • Ответы и задания по биологии 9 класс БИ1990101-02 статград 14 октября 2019
  • Ответы и задания по биология 9 класс СтатГрад 2018
  • Ответы и задания по информатике 11 класс статград 14.09
  • Ответы и задания по информатике 9 класс статград 19.09
  • Ответы и задания по информатике 9 класс СтатГрад 31 января 2018
  • Ответы и задания по Истории 11 класс 23 января 2018 СтатГрад
  • Ответы и задания по истории 11 класс ИС1910101 ИС1910102 27 сентября 2019
  • Ответы и задания по истории 9 класс 18 января 2018 СтатГрад
  • Ответы и задания по истории школьный этап всероссийской олимпиады школьников 2019-2020
  • Ответы и задания по итальянскому языку школьный этап всероссийской олимпиады 2019-2020
  • Ответы и задания по китайскому языку олимпиада школьный этап 2019-2020
  • Ответы и задания по литературе школьный этап всероссийской олимпиады 2019-2020 московская область
  • Ответы и задания по математике 10 класс контрольная работа
  • Ответы и задания по математике 11 класс 25 января 2018 СтатГрад
  • Ответы и задания по математике 11 класс ЕГЭ база 56 регион 04. 04.18
  • Ответы и задания по математике 11 класс мониторинговая работа 2019-2020
  • Ответы и задания по математике 8 класс статград 11.09
  • Ответы и задания по математике 9 класс 12 декабря 2019 статград все варианты
  • Ответы и задания по математике 9 класс 56 регион 4 декабря 2018
  • Ответы и задания по математике 9 класс МА1990101-МА1990104 3 октября 2019
  • Ответы и задания по математике школьный этап 2019-2020 всероссийская олимпиада
  • Ответы и задания по математике школьный этап 2019-2020 всероссийской олимпиады
  • Ответы и задания по МХК искусство всероссийская олимпиада школьный этап 2019-2020
  • Ответы и задания по ОБЖ всероссийская олимпиада 2018-2019
  • Ответы и задания по ОБЖ школьный этап всероссийской олимпиады школьников 2019-2020
  • Ответы и задания по обществознанию 11 класс ОБ10101 ОБ10102 статград 2018-2019
  • Ответы и задания по обществознанию 9 класс 26 января 2018 СтатГрад
  • Ответы и задания по обществознанию ОГЭ 2018
  • Ответы и задания по праву муниципальный этап 11 ноября всероссийской олимпиады 2018-2019
  • Ответы и задания по русскому языку 11 класс 19 января 2018 СтатГрад
  • Ответы и задания по русскому языку 11 класс 2 октября 2019 РУ1910101 РУ1910102
  • Ответы и задания по Русскому языку 11 класс статград 28 марта 2018
  • Ответы и задания по русскому языку 7 класс входная работа
  • Ответы и задания по русскому языку 8 класс 56 регион
  • Ответы и задания по русскому языку 9 класс МЦКО 1 октября 2019
  • Ответы и задания по русскому языку 9 класс статград РУ1990101-02 16 октября 2019
  • Ответы и задания по Русскому языку КДР 11 класс январь 2019
  • Ответы и задания по русскому языку муниципальный этап 11 ноября всероссийской олимпиады 2018-2019
  • Ответы и задания по русскому языку ОГЭ 2018
  • Ответы и задания по русскому языку олимпиада школьный этап 22 октября 2019
  • Ответы и задания по физике 10 класс КДР 30 января 2018
  • Ответы и задания по физике 11 класс ВОШ 2018-2019
  • Ответы и задания по физике 11 класс ВПР 2018 10. 04.18
  • Ответы и задания по физике 11 класс КДР 30 января 2018
  • Ответы и задания по физике 9 класс 29 января 2018 СтатГрад
  • Ответы и задания по физике 9 класс КДР 30 января 2018
  • Ответы и задания по физике 9 класс статград
  • Ответы и задания по физике школьный этап всероссийской олимпиады 2019-2020
  • Ответы и задания по химии 11 класс 28 ноября 2018
  • Ответы и задания по химии 11 класс ВПР 2018 05.04.18
  • Ответы и задания по химии 11 класс статград ХИ1910101 и ХИ1910102 15 октября 2019
  • Ответы и задания по химии 9 класс статград ХИ1990101-ХИ1990104 21 октября 2019
  • Ответы и задания по химии 9 класс тренировочная работа статград
  • Ответы и задания по экологии школьный этап всероссийской олимпиады школьников 2019-2020
  • Ответы и задания русский язык 11 класс варианты 16 мая 2019 год
  • Ответы и задания русский язык 7 класс ВПР 9 апреля 2019 год
  • Ответы и задания русский язык 9 класс 56 регион 06. 04.18
  • Ответы и задания стартовая работа русский язык 8 класс 23 сентября 2019
  • Ответы и задания статград обществознание 11 класс 14 декабря 2018
  • Ответы и задания статград по физике 9 класс варианты 24 октября 2019
  • Ответы и задания тренировочная №4 история 9 класс 21 марта 2019
  • Ответы и задания ФИ90401 и ФИ90402 физика 9 класс 4 марта 2019
  • Ответы и задания Физика ОГЭ 2018 9 класс
  • Ответы и задания ЧИП 1-2 класс 2019
  • Ответы и задания школьный этап по математике всероссийской олимпиады новосибирская область 2019-2020
  • Ответы и задания школьный этап по физике всероссийской олимпиады в Московской области 2019-2020
  • Ответы КДР 2019 по информатике 10 класс 15 марта 23 регион
  • Ответы КДР 2019 по информатике 9 класс 15 марта 23 регион
  • Ответы КДР 2019 по литературе 10 класс 15 марта 23 регион
  • Ответы КДР 2019 по литературе 9 класс 15 марта 23 регион
  • Ответы КДР 23 регион биология 11 класс 21. 12.2018
  • Ответы КДР 23 регион история 11 класс 21.12.2018
  • Ответы КДР задания 23 регион Февраль 2019 год
  • Ответы КДР литература 11 класс 14 декабря 2018
  • Ответы КДР физика 11 класс 14 декабря 2018
  • Ответы МЦКО математика 10 класс 5 декабря 2018
  • Ответы МЦКО математика 11 класс 28 ноября 2018
  • Ответы МЦКО по истории 9 класс 19.09
  • Ответы на тренировочная работа по химии 9 класс «СтатГрад»
  • Ответы на тренировочную работу по русскому языку 11 класс
  • Ответы обществознание 9 класс статград 5 декабря 2018
  • Ответы обществознание для 10 классов 23 регион
  • Ответы ОГЭ 2018 английский язык
  • Ответы ОГЭ 2018 русский язык
  • Ответы олимпиада по праву 9 класс школьный этап ВОШ 2018-2019
  • Ответы олимпиада по физике 9 класс 2018-2019
  • Ответы по английскому языку 7-9 класс 56 регион 10.12.2018 Аудирование
  • Ответы по английскому языку олимпиада ВОШ школьный этап 2018-2019
  • Ответы по астрономии школьный этап олимпиады ВОШ 2018-2019
  • Ответы по биологии 9 10 11 класс вош 2018-2019 школьный этап
  • Ответы по биологии для 9 классов (Оренбургская область, 56 регион)
  • Ответы по географии ВОШ олимпиада школьный этап 2018-2019
  • Ответы по географии для 9 классов 11 регион
  • Ответы по информатике 11 класс 12. 05
  • Ответы по искусству МХК олимпиада ВОШ школьный этап 2018-2019
  • Ответы по истории 11 класс статград тренировочная работа №1 26.09
  • Ответы по истории 11 класс школьный этап олимпиады ВОШ 2018-2019
  • Ответы по истории 9 класс статград
  • Ответы по истории для 9 классов (Оренбургская область, 56 регион)
  • Ответы по математике 7-8 класс КДР
  • Ответы по математике 8 класс МЦКО 28 марта 2018
  • Ответы по математике 9 класс 64 регион
  • Ответы по математике 9 класс СтатГрад 15.02
  • Ответы по немецкому языку 7-9 класс 56 регион 10.12.2018 Аудирование
  • Ответы по русскому языку 11 класс 11 регион 13.02
  • Ответы по русскому языку для 7 и 8 класс 12.05
  • Ответы по русскому языку школьный этап олимпиады ВОШ 2018-2019
  • Ответы по тренировочная работа по биологии 11 класс
  • Ответы по тренировочная работа по обществознанию 9 класс
  • Ответы по физике 9 класс ФИ90201 и ФИ90202 статград 7 декабря 2018
  • Ответы по физике, биологии для 11 классов 56 регион 16. 02
  • Ответы по химии 11 класс пробное ЕГЭ статград 12 марта 2019
  • Ответы по химии 9 класс статград 19 декабря 2018
  • Ответы по химии, информатике, географии, обществознанию для 9 классов
  • Ответы по экологии школьный этап ВОШ 2018-2019
  • Ответы репетиционный экзамен по математике 9 класс пробное ОГЭ 9 февраля 2018
  • Ответы РПР по математике 9 класс 64 регион 3 этап 2018
  • Ответы русский язык 10 класс 56 регион 12.05
  • Ответы русский язык 5-8 класс контрольная работа за 1 полугодие 56 регион 2018
  • Ответы статград география 11 класс 11.12.2018
  • Ответы СтатГрад по обществознанию 9 класс
  • Ответы статград по обществознанию 9 класс варианты ОБ1990101-02 23 октября 2019
  • Ответы тренировочная работа по истории 9 класс
  • Ответы тренировочная работа по математике 10 класс 08.02.2017
  • Ответы тренировочная работа по русскому языку 9 класс 09.02.2017
  • Ответы тренировочная работа по химии 11 класс 14. 02
  • Ответы физике для 9 классов (Оренбургская область, 56 регион)
  • Отзывы прошлых лет
  • Отзывы с первого экзамена ОГЭ 2018 по английскому языку
  • Отзывы с первых экзаменов ЕГЭ 2017
  • Отзывы с прошедших экзаменов ОГЭ 2019
  • Отзывы с экзамена по русскому языку ОГЭ 2018
  • Открытый банк заданий и ответы ФИПИ ЕГЭ 2019 по русскому языку 11 класс
  • Официальные работы РДР 2019-2020 для 78 региона
  • Официальные работы РДР для 78 региона 2018-2019 учебный год
  • Официальные РДР 2020 для Московской области задания и ответы
  • Официальные РДР 2021 для Московской области задания и ответы
  • Официальные РДР 2022 для Московской области задания и ответы
  • Официальные темы для Республика Саха (Якутия) Сахалинская область итоговое сочинение 2018-2019
  • Официальные темы итогового сочинения 2018-2019 11 класс для часового пояса MSK+1
  • Официальные темы итогового сочинения 2018-2019 11 класс для часового пояса MSK+6
  • Официальные темы итогового сочинения 2018-2019 11 класс для часового пояса МСК
  • Официальные темы итогового сочинения 2018-2019 для часового пояса MSK +9
  • Официальные темы итогового сочинения 2018-2019 для часового пояса MSK+7
  • Оформление заказа
  • Пегас 2018 задания и ответы 7 февраля конкурс по литературе
  • Пегас 2019 5-6 класс ответы и задания
  • Пегас 2019 7-8 класс ответы и задания
  • Пегас 2019 ответы для 9-11 класса
  • Письмо английский язык 7 8 9 класс 56 регион ответы и задания
  • Платно русский язык 9 класс
  • Поддержать проект
  • Полугодовая контрольная работа по русскому языку 11 класс задания и ответы 2019-2020
  • ПОЛЬЗОВАТЕЛЬСКОЕ СОГЛАШЕНИЕ
  • Предэкзаменационная работа задания и ответы по информатике 9 класс ОГЭ 2019
  • Предэкзаменационная работа задания и ответы по математике 11 класс ЕГЭ 2019
  • Пригласительный школьный этап 2021 всероссийская олимпиада школьников задания и ответы
  • Пробная (тренировочная) ВПР 2019 география 10-11 класс ответы и задания
  • Пробное (тренировочное) ВПР 2019 биология 11 класс ответы и задания
  • Пробное (тренировочное) ВПР 2019 география 6 класс ответы и задания
  • Пробное (тренировочное) ВПР 2019 математика 7 класс ответы и задания
  • Пробное (тренировочное) ВПР 2019 русский язык 4 класс ответы и задания
  • Пробное (тренировочное) ВПР 2019 русский язык 5 класс ответы и задания
  • Пробное (тренировочное) ВПР 2019 русский язык 6 класс ответы и задания
  • Пробное ВПР 2019 ответы и задания по английскому языку 11 класс
  • Пробное ВПР 2019 ответы и задания по биологии 5 класс
  • Пробное ВПР 2019 ответы и задания по биологии 7 класс
  • Пробное ВПР 2019 по истории 5 класс ответы и задания
  • Пробное ВПР 2019 по истории 6 класс ответы и задания
  • Пробное ВПР 2019 по химии 11 класс ответы и задания
  • Пробное Итоговое собеседование 9 класс русский язык ОГЭ 2019 задания
  • Пробный экзамен по обществознанию и литературе для 11 классов ответы
  • Проект математическая вертикаль ответы и задания
  • Работа по математике 11 класс статград ответы и задания 25 сентября 2019
  • Работа статград по русскому языку 9 класс 3 декабря 2019 ответы и задания
  • Работы (задания+ответы) для Республики Коми Март 2017
  • Работы (задания+ответы) Март 2017 СтатГрад
  • Работы (задания+ответы) Февраль 2017
  • Работы (задания+ответы) Январь 2017
  • Работы 56 регион ответы и задания май 2019 год
  • Работы для 56 региона Май 2018 ответы и задания
  • Работы для Оренбургской области
  • Работы для Республики Коми Декабрь 2017 задания и ответы
  • Работы для Республики Коми Ноябрь 2017 задания и ответы
  • Работы для Республики Коми Октябрь 2017 задания и ответы
  • Работы задания и ответы по регионам
  • Работы МЦКО демоверсии задания и ответы
  • Работы СтатГрад 2018 февраль задания и ответы
  • Работы СтатГрад апрель 2018 задания и ответы
  • Работы Статград ВПР задания и ответы февраль 2019
  • Работы статград ВПР март 2019 задания и ответы
  • Работы СтатГрад декабрь 2017 задания и ответы
  • Работы статград декабрь 2018-2019 ответы и задания
  • Работы статград декабрь 2019 задания и ответы 2019-2020 учебный год
  • Работы статград задания и ответы ноябрь 2019-2020 учебный год
  • Работы СтатГрад задания и ответы октябрь 2018
  • Работы статград задания и ответы октябрь 2019-2020 учебный год
  • Работы СтатГрад задания и ответы сентябрь 2018
  • Работы СтатГрад март 2018 задания и ответы
  • Работы СтатГрад ноябрь 2017 задания и ответы
  • Работы СтатГрад октябрь 2017 задания и ответы
  • Работы СтатГрад сентябрь 2017 задания и ответы
  • Работы статград сентябрь 2019 год ответы и задания
  • Работы СтатГрад январь 2018 задания и ответы
  • Работы статград январь 2020 задания и ответы 2019-2020 учебный год
  • Работы СтатГрад, КДР за апрель 2017
  • Работы СтатГрад, КДР за май 2017
  • Работы СтатГрад, КДР за март 2017
  • Работы СтатГрад, КДР, тренировочные за февраль 2017
  • Работы СтатГрад, КДР, тренировочные за январь 2017
  • Расписание
  • Расписание ГИА ОГЭ 2017
  • Расписание ЕГЭ 2018 досрочный основной резервный период
  • Расписание итогового сочинения 2017-2018
  • Расписание проведения экзаменов 9 класса ОГЭ 2018
  • Расписание школьных олимпиад 2017-2018 задания и ответы
  • Распределения реальных тем итогового сочинения 2017-2018 по зонам регионам
  • РДР 2019-2020 по физике 10 класс ответы и задания
  • РДР 8 класс ответы и задания по математике 15 ноября 2018
  • РДР математика 10 класс 14 ноября 2019 ответы и задания
  • РДР математика 6 класс ответы и задания 21 ноября 2019 78 регион
  • РДР ответы и задания для Санкт-Петербурга
  • РДР по русскому языку 9 класс ответы и задания вариант 1901 и 1902 17 октября 2019
  • Реальное ВПР 2020 задание 1 по биологии 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание 2 по биологии 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №1 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №10 по биологии 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №10 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №11 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №12 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №2 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №3 по биологии 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №3 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №4 по биологии 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №4 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №5 по биологии 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №5 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №6 по биологии 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №6 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №7 по биологии 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №7 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №8 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальное ВПР 2020 задание №9 по русскому языку 5 класс с ответами
  • Реальные задания по математике ПРОФИЛЬ ЕГЭ 2018
  • Реальные темы и готовые сочинения 4 декабря 2019 ФИПИ для региона МСК+9
  • Реальные темы итогового сочинения 2018-2019 5 декабря
  • Реальный вариант с ЕГЭ 2019 по математике 29 мая 2019 год
  • Региональный экзамен по математике 7 класс
  • Региональный экзамен по математике 7 класс 56 регион ответы и задания
  • Региональный экзамен по русскому языку 8 класс 56 регион
  • Региональный этап 2019 по астрономии задания и ответы всероссийская олимпиада
  • Региональный этап 2019 по географии ответы и задания ВОШ
  • Региональный этап 2019 по искусству МХК ответы и задания ВОШ
  • Региональный этап 2019 по истории задания и ответы всероссийская олимпиада
  • Региональный этап 2019 по немецкому языку задания и ответы
  • Региональный этап по биологии задания всероссийская олимпиада 2018-2019
  • Региональный этап по математике ответы и задания 2019
  • Результаты ЕГЭ 2017 у школьников
  • Решать реальное ВПР 2020 задание №8 по биологии 5 класс с ответами
  • Решать реальное ВПР 2020 задание №9 по биологии 5 класс с ответами
  • Решения и задания муниципального этапа 2019 олимпиады по математике
  • РПР 2017-2021 задания и ответы для Саратовской области 64 регион
  • РПР математика 9 класс 3 этап задания и ответы 2018-2019
  • РПР по математике 9 класс 64 регион задания 2018-2019
  • Русский медвежонок 10-11 класс ответы и задания 2018-2019
  • Русский медвежонок 14 ноября 2019 ответы и задания 6-7 класс
  • Русский медвежонок 2-3 класс ответы и задания 2018-2019
  • Русский медвежонок 2019 ответы и задания для 10-11 класса 14 ноября
  • Русский Медвежонок 2019 ответы и задания для 2-3 класса
  • Русский медвежонок 2019-2020 ответы и задания 8-9 класс 14 ноября
  • Русский медвежонок 4-5 класс ответы и задания 2018-2019
  • Русский медвежонок для учителей 2020 год задания и ответы
  • Русский язык 10 класс КДР ответы и задания
  • Русский язык 10 класс КДР ответы и задания 19 декабря 2018
  • Русский язык 10 класс ответы и задания 56 регион
  • Русский язык 10 класс ответы МЦКО 8 ноября 2018 год
  • Русский язык 10 класс СтатГрад ответы 12. 05
  • Русский язык 10-11 класс ответы и задания 22 апреля 2019 тренировочная №1
  • Русский язык 10-11 класс ответы и задания СтатГрад
  • Русский язык 10-11 класс ответы РЯ10901 и РЯ10902 6 марта 2019
  • Русский язык 11 класс 03.06.2019
  • Русский язык 11 класс 11 ноября 2019 ответы и задания работа статград
  • Русский язык 11 класс 56 регион ответы
  • Русский язык 11 класс диагностическая работа №5 ответы и задания 8 апреля 2019
  • Русский язык 11 класс КДР ответы и задания 19 декабря 2018
  • Русский язык 11 класс контрольная работа в формате ЕГЭ 2 варианта задания и ответы
  • Русский язык 11 класс мониторинговая работа ответы и задания
  • Русский язык 11 класс ответы и задания диагностика 2 статград 18 марта 2019
  • Русский язык 11 класс ответы и задания СтатГрад 17.05
  • Русский язык 11 класс ответы РЯ10601 и РЯ10602 статград 2018-2019
  • Русский язык 11 класс ответы статград 30 января 2019
  • Русский язык 11 класс РЯ1910701-РЯ1910702 статград ответы и задания 11 декабря 2019
  • Русский язык 11 класс статград 24 октября 2019 ответы и задания РЯ1910601-02
  • Русский язык 11 класс статград ЕГЭ ответы и задания
  • Русский язык 11 класс СТАТГРАД ответы и задания 28 февраля
  • Русский язык 11 класс статград ответы и задания вариант РЯ10201 и РЯ10202 07. 11.2018
  • Русский язык 11 класс тренировочная работа №1 ответы статград 2018-2019
  • Русский язык 3 класс МЦКО ВСОКО задания итоговая работа 2019
  • Русский язык 4 класс ВПР 2020 демоверсия задания и ответы ФИПИ
  • Русский язык 4 класс задания и ответы мониторинговая работа 2019-2020
  • Русский язык 5 класс демоверсия ВПР 2020 ФИПИ задания и ответы
  • Русский язык 5 класс ответы и задания 21.09
  • Русский язык 6 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • Русский язык 6 класс ВПР 2019 ответы и задания 23 апреля
  • Русский язык 6 класс ВПР 2020 демоверсия фипи задания и ответы
  • Русский язык 6 класс статград ответы и задания 2018-2019
  • Русский язык 7 класс 56 регион ответы
  • Русский язык 7 класс 56 регион ответы и задания 15 марта 2018
  • Русский язык 7 класс задания и ответы мониторинговая работа 10 сентября 2019
  • Русский язык 7 класс ответы и задания РУ1970101 и РУ1970102 26 сентября 2019
  • Русский язык 7 класс ответы и задания статград 2018-2019
  • Русский язык 7 класс статград ответы и задания
  • Русский язык 7-8 класс ответы КДР 23 января 2019
  • Русский язык 8 класс 56 регион задания и ответы
  • Русский язык 8 класс КДР ответы и задания 19 декабря 2018
  • Русский язык 8 класс ответы и задания 56 регион
  • Русский язык 8 класс ответы и задания 6 мая 2019 итоговая работа
  • Русский язык 8 класс стартовая работа ответы и задания 24. 09
  • Русский язык 8 класс статград ответы и задания
  • Русский язык 9 класс 11.05 ответы
  • Русский язык 9 класс 74 регион ответы
  • Русский язык 9 класс ответы и задания 19 апреля 2019 диагностическая работа №4
  • Русский язык 9 класс ответы и задания варианты 13 мая 2019 год
  • Русский язык 9 класс ответы и задания диагностика статград 15 марта 2019
  • Русский язык 9 класс ответы и задания полугодовая работа 2018-2019
  • Русский язык 9 класс ответы изложение статград 2018-2019
  • Русский язык 9 класс СтатГрад 17.04
  • Русский язык 9 класс СтатГрад задания и ответы
  • Русский язык 9 класс статград ОГЭ ответы и задания 15 марта 2018
  • Русский язык 9 класс СТАТГРАД ответы и задания
  • Русский язык 9 класс статград РЯ90201-РЯ90202 ответы и задания 27.11.
  • Русский язык платно
  • Русский язык школьный этап 2018-2019 ответы и задания Санкт-Петербург
  • Русский язык школьный этап 2019-2020 задания и ответы московская область
  • РЭ по математике 7 класс 24. 05 ответы
  • РЭ по русскому языку 7 класс ответы 19.05
  • РЭ по русскому языку 8 класс ответы 24.05
  • СтатГрад
  • Статград 9 класс русский язык ответы и задания 21.12.2018
  • СтатГрад апрель 2017 работы задания и ответы
  • СтатГрад биология 11 класс 14.04.17
  • Статград ВПР работы апрель 2019 ответы и задания
  • СТАТГРАД ВПР февраль 2020 задания и ответы 2019-2020 учебный год
  • Статград география 11 класс ответы и задания март 2018
  • Статград география 9 класс ответы и задания 20 ноября 2018
  • СтатГрад задания и ответы по обществознанию 11 класс 1 февраля 2018 года
  • Статград задания и ответы январь 2018-2019
  • Статград информатика 9 класс 27 ноября 2019 ответы и задания ИН1990201-ИН1990204
  • СтатГрад информатика 9 класс ответы и задания 5 марта 2018
  • Статград история 11 класс 2 варианта ответы и задания 12 марта 2018
  • СтатГрад май 2017 работы задания и ответы
  • СтатГрад математика 11 класс ответы и задания 6 марта 2018
  • Статград Обществознание 11 класс ответы и задания
  • Статград обществознание 9 класс ответы и задания 13 марта 2018
  • СтатГрад обществознание 9 класс ответы и задания 17. 05
  • СтатГрад ответы и задания для работ ноябрь 2018
  • СтатГрад ответы и задания по математике 10 класс База и Профиль 7 февраля 2018
  • СтатГрад ответы и задания по русскому языку 11 класс 6 февраля 2018
  • Статград ответы русский язык 11 класс 19.12.2018
  • СтатГрад по математике для 11 классов
  • Статград работы май 2018 ответы и задания
  • Статград работы ответы и задания май 2019
  • СтатГрад русский язык диагностические работы 2017 задания и ответы
  • Темы итогового сочинения 2017
  • Темы на пробное итоговое сочинение для 52 региона
  • Темы по направлениям которые будут итоговое сочинение 2018 6 декабря
  • Тест по русскому языку 4 класс ВПР 2018 ответы и задания
  • Тренировочная работа по биологии 11 класс
  • Тренировочная работа по биологии 9 класс ответы и задания 15 января 2019
  • Тренировочная работа по информатике 11 класс
  • Тренировочная работа по информатике 9 класс ответы
  • Тренировочная работа по математике 10 класс ответы 6 февраля 2019
  • Тренировочная работа по математике 11 класс ответы 06. 03
  • Тренировочная работа по химии 11 класс ответы 8 февраля 2019
  • Тренировочная работа статград по географии 11 класс ответы 15.02.2019
  • Тренировочное ВПР 2019 ответы и задания по английскому языку 7 класс
  • Тренировочное ВПР 2019 ответы и задания по биологии 6 класс
  • Тренировочное ВПР 2019 ответы и задания по истории 11 класс
  • Тренировочное ВПР 2019 ответы и задания по математике 6 класс
  • Тренировочное ВПР 2019 ответы и задания по физике 11 класс
  • Тренировочные варианты 200203, 200217, 200302 по химии 11 класс с ответами 2020
  • Тренировочные варианты ВПР 2020 по химии 8 класс ХИ1980101,ХИ1980102
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по английскому языку 11 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по биологии задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по географии 11 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по информатике задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по истории 11 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по литературе 11 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по математике 11 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по обществознанию 11 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по русскому языку задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по физике 11 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ЕГЭ по химии 11 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты КДР 10 класс обществознание 2019
  • Тренировочные варианты ОГЭ по английскому языку 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ОГЭ по биологии 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ОГЭ по географии 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ОГЭ по информатике 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ОГЭ по истории 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ОГЭ по математике 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ОГЭ по обществознанию 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ОГЭ по русскому языку 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ОГЭ по физике 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты ОГЭ по химии 9 класс задания с ответами
  • Тренировочные варианты по биологии 10 класс задания с ответами
  • Тренировочные задания МЦКО ВСОКО математика 3 класс 2019
  • Тренировочные работы для 56 региона задания и ответы сентябрь 2018
  • Тренировочные работы для 56 региона Оренбургской области задания и ответы
  • Тренировочные работы по математике статград 2017 задания и ответы
  • Тренировочный вариант 33006757 ЕГЭ по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант 33006758 ЕГЭ по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант 33006759 ЕГЭ по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073002 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073003 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073004 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073005 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073006 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073007 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073008 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073009 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073010 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант ЕГЭ 34073011 по математике профильный уровень с ответами
  • Тренировочный вариант с ответами 200316 по физике 11 класс ЕГЭ 2020
  • Тренировочный варианты №191223 и №191209 по химии 11 класс ЕГЭ 2020
  • Тренировочный ЕГЭ 2020 математика 11 класс профиль задания и ответы
  • Турнир ЛОМОНОСОВ задания и ответы 2018-2019
  • Турнир Ломоносова задания и ответы 2019-2020 учебный год
  • Условия перепечатки материалов | Правообладателям
  • Устная часть английский язык 2018 платно
  • Устное собеседование 2019 официальные варианты 13 февраля
  • Устное собеседование 9 класс 2019
  • Физика 11 класс 7 ноября 2019 статград ответы и задания варианты ФИ1910201-ФИ1910204
  • Физика 11 класс ВПР ответы 25. 04
  • Физика 11 класс ответы и задания 6 мая 2019 тренировочная работа №5
  • Физика 11 класс ответы и задания пробник статград 14 февраля 2018
  • Физика 11 класс ответы и задания статград 2018
  • Физика 11 класс ответы и задания ФИ1910101 ФИ1910102 19 сентября 2019
  • Физика 11 класс СтатГрад ответы и задания
  • Физика 11 класс тренировочная ЕГЭ №4 статград ответы и задания 14 марта 2019
  • Физика 7 класс ВПР 2019 ответы и задания 23 апреля
  • Физика 9 класс задания и ответы СтатГрад
  • Физика 9 класс ответы и задания ФИ90101 и ФИ90102 статград 2018-2019
  • Физика 9 класс ответы и задания ФИ90401 ФИ90402 статград
  • Физика 9 класс СтатГрад 03.05 ответы
  • Физика 9 класс статград ответы и задания 10 декабря 2019 варианты ФИ1990201-ФИ1990204
  • Физика ОГЭ 2018 ответы и задания 2 июня
  • Физика ОГЭ 2018 платно
  • Физика турнир Ломоносова задания 2018-2019
  • Физическая культура 10 ноября задания муниципальный этап всероссийская олимпиада 2018-2019
  • ФИПИ открытый банк заданий ЕГЭ 2019 по русскому языку Лексика и фразеология
  • Французский язык 7-11 класс муниципальный этап 2019-2020 ответы и задания Москва
  • Химия 11 класс 10. 05 СтатГрад ответы
  • Химия 11 класс ВПР 27.04 задания и ответы
  • Химия 11 класс ЕГЭ статград ответы и задания 14 марта 2018
  • Химия 11 класс ответы для ХИ10101 ХИ10102 статград 19.10
  • Химия 11 класс ответы и задания 28 ноября 2019 статград ХИ1910201-ХИ1910204
  • Химия 11 класс ответы и задания варианты статград 13 мая 2019 год
  • Химия 11 класс ответы и задания СтатГрад 9 февраля 2018 года
  • Химия 11 класс СтатГрад задания и ответы
  • Химия 9 класс задания и ответы СтатГрад
  • Химия 9 класс КДР ответы и задания 15 февраля 2018 года
  • Химия 9 класс ОГЭ 4 июня 2019 год
  • Химия 9 класс ОГЭ статград ответы и задания 15 февраля 2018
  • Химия 9 класс ответы и задания 16.05
  • Химия 9 класс ответы и задания ОГЭ статград 22.03.2018
  • Химия 9 класс ответы тренировочная №4 статград 20 марта 2019
  • Химия 9 класс статград ОГЭ ответы и задания
  • Химия ВОШ школьный этап ответы и задания 2018-2019
  • Химия ответы и задания для школьного этапа всероссийской олимпиады 2019-2020
  • Частная группа
  • ЧИП Австралия 23 октября 2019 ответы и задания 7-8 класс
  • ЧИП Австралия 3-4 класс ответы и задания 23 октября 2019-2020
  • ЧИП Австралия ответы и задания 5-6 класс 23 октября 2019-2020
  • ЧИП мир сказок 2019 ответы и задания для 1 класса 5-7 лет
  • Читательская грамотность 4 класс МЦКО 2019 тестирование
  • Чтение читательская грамотность 3 класс МЦКО ВСОКО задания 2019
  • Школьные конкурсы расписание 2017-2018
  • Школьные олимпиады и конкурсы 2017-2018 задания и ответы
  • Школьный тур наше наследие 7-8 класс ответы и задания 2019-2020
  • Школьный этап 2019-2020 всероссийская олимпиада по астрономии ответы и задания
  • Школьный этап 2019-2020 олимпиады ВОШ по физике ответы и задания
  • Школьный этап 2019-2020 по биологии ответы и задания всероссийской олимпиады школьников
  • Школьный этап 2019-2020 по испанскому языку ответы и задания всероссийской олимпиады
  • Школьный этап 2019-2020 по праву задания и ответы для всероссийской олимпиады школьников
  • Школьный этап 2019-2020 по праву ответы и задания всероссийской олимпиады школьников
  • Школьный этап 2019-2020 по русскому языку ответы и задания всероссийская олимпиада школьников
  • Школьный этап ВОШ 2019-2020 ответы и задания по французскому языку
  • Школьный этап ВОШ по информатике ответы и задания 2018-2019
  • Школьный этап ВОШ по испанскому языку ответы и задания 2018-2019
  • Школьный этап ВОШ по математике задания и ответы 2018-2019
  • Школьный этап ВСЕРОССИЙСКИХ олимпиад 2017-2018 задания
  • Школьный этап всероссийской олимпиады задания и ответы по обществознанию 2019-2020 учебный год
  • Школьный этап всероссийской олимпиады задания и ответы по физической культуре 2019-2020
  • Школьный этап ВсОШ 2019-2020 ответы и задания по обществознанию
  • Школьный этап олимпиады по информатике ответы и задания всероссийской олимпиады 2019
  • Школьный этап олимпиады по математике ответы и задания всероссийской олимпиады 2019
  • Школьный этап олимпиады по экономике ответы и задания всероссийской олимпиады 2019
  • Школьный этап по английскому языку 2019-2020 задания и ответы московская область
  • Школьный этап по ОБЖ задания и ответы всероссийская олимпиада 2019-2020
  • Экзамен по географии ОГЭ 2019
  • Экономика олимпиада муниципальный этап 2019 ВсОШ задания и ответы

Тренировочная работа ВПР по биологии 6 класс

 Задание 4.

В изображенном на рисунке опыте экспериментатор взял три стакана и положили на дно каждого по нескольку зёрен пшеницы. В первый стакан воду не наливали. Во второй налили воды столько, чтобы она только смачивала семена, но не покрывала их полностью. Третий стакан наполнили до половины водой. Все три стакана накрыли стеклом и оставили в теплом помещении.

Через 5 дней посмотрели, какие изменения произошли с семенами.

 

Как называется процесс, происходящий с семенами, который иллюстрирует этот опыт?

Задание 4.2

Какие условия необходимы для прорастания семян?

Задание 4.3 

Назовите ещё одно обязательное условие (не указанное на рисунке), чтобы данный опыт прошел успешно?

Задание 5.1

Как называется период в жизни растения (фенологическая фаза), изображенный на рисунке?

Задание 5.

Какую функцию выполняет околоплодник?

Задание 5.3 

Назовите клетку, из которой образовался зародыш семени.

Задание 6 

Составьте «паспорт» растения, изображенного на рисунке.

Список слов: 

1) Рогоз узколистный

2) Растения

3) Рогоз

4) Покрытосеменные

  

Царство

Отдел

Род

Вид

Задание 7

На рисунке представлен график зависимости температуры тела от температуры среды. При какой температуре среды температура тела равна 10 °С?

Задание 7.2

Какому типу животных (по способности поддерживать постоянство температуры тела) соответствует график?

Задание 8. 1

Если куриное яйцо поместить в уксус, то через некоторое время начнут образовываться пузырьки газа. Так взаимодействуют скорлупа яйца и уксус. Причём чем кислее уксус, тем активнее будут выделяться пузырьки газа.

 

Андрей решил исследовать клюквенный морс. Он взял два стакана, налил в них одинаковое количество морса и уксуса, а затем поместил в каждый стакан по яйцу (рис. 1). Через некоторое время он увидел, что в обоих стаканах на поверхности яиц и у верхней границы жидкости собралось большое количество пузырьков, однако в стакане с уксусом их было значительно больше и они продолжили активно образовываться (рис. 2).

 

Какой вывод должен сделать Андрей по результатам своего опыта?

1) Уксус и морс изменяют форму куриного яйца.

2) Морс кислее, чем уксус.

3) Морс не стоит употреблять в пищу.

4) Морс содержит в своём составе кислоту.

Задание 8.2 

Поясните результаты эксперимента

Задание 9.1 

Растения по-разному относятся к свету, теплу и влаге, и это учитывается цветоводами при разведении различных растений.

Опишите особенности растений алоэ и азалии, которые необходимо учитывать при их разведении в домашних условиях, используя для этого таблицу условных обозначений.

Алоэ Азалия

1. _______________ 1. __________________

2. _______________ 2. __________________

3. _______________ 3. __________________

4. ________________ 4. __________________

Задание 9.2 

Чем отличаются алоэ и азалия по уровню выносливости?

Задание 10. 1

Рассмотрите изображения животных: дельфин, аист, землеройка Подпишите их названия под изображениями.

Под каждым названием подпишите название среды обитания взрослой формы животного: наземно-воздушная, водная, почвенная.

Задание 10.2

Какое из этих животных не относится к млекопитающим?

23. Задание 10.3

Какой тип отношений связывает землеройку и аиста?

ВПР по обществознанию 6 класс с ответами 2018 год все варианты |

Собраны все реальные варианты с ответами  по обществознанию для 6 класса. Работа прошла 11 мая 2018 года. На выполнение работы дают 45 минут. В работе 6 заданий.

Задание 1 нацелено на проверку умения анализировать и оценивать собственную деятельность и ее результаты. Задание предполагает систему вопросов об одном из видов деятельности с опорой на личный социальный опыт обучающегося.

Задание 2 построено на основе графического представления статистической информации. Оно нацелено на проверку умения осуществлять поиск социальной информации, представленной в различных знаковых системах (диаграмма) и состоит из двух частей. В первой части обучающемуся требуется проанализировать предложенную информацию, определить наиболее/наименее популярное мнение по заданной тематике и
высказать предположение о причинах соответствующего выбора опрошенных. Во второй части задания нужно дать собственный ответ на поставленный в ходе социологического исследования вопрос.

Задание 3 направлено на анализ социальной ситуации, описанной в форме цитаты известного писателя, ученого, общественного деятеля и т.п. Задание включает в себя систему вопросов, проверяющих знание/понимание социальных свойств человека, особенностей его взаимодействия с другими людьми, а также умение объяснять элементарные взаимосвязи изученных социальных объектов. Обучающийся должен сначала объяснить значения отдельных слов, словосочетаний, а затем – смысл всего высказывания.

Задания 4 и 6 предполагают анализ визуального изображения социальных объектов, социальных ситуаций. Обучающийся должен осуществить поиск социальной информации, представленной в различных знаковых системах (фотоизображение) и выполнить задания, связанные с соответствующей фотографией.

Задание 5 направлено на проверку умения осознанно и произвольно строить речевое высказывание в письменной форме на заданную тему с использованием шести предложенных понятий.

Подчеркнем, что задание 1 во всех вариантах предполагает систему вопросов о виде деятельности (учеба, игра, труд, общение), а задание 5 – составление краткого сообщения о нашей стране / регионе проживания. Задания 2–4 и 6 в различных вариантах ВПР являются одинаковыми по уровню сложности и позволяют проверить одни и те же умения на различных элементах содержания.

Варианты для скачивания размещены ниже.

Подписываться на обновления вконтакте!

 

Структурное изменение ДНК, индуцированное вирусным белком R ВИЧ-1, запускает реакцию повреждения ДНК | Ретровирусология

Ключевые ресурсы (клеточные линии, химические вещества, реагенты, антитела, рекомбинантная ДНК)

Список ресурсов включен в Дополнительный файл 19: Таблица S2.

Клеточные линии и клеточные культуры

Используемые клеточные линии: MonoMac-6 (MM-6) (DSMZ), HEK293T (RIKEN Cell Bank), HT1080 (Healthy Science Research Resources Bank), Δ Vpr, Mit-23 (получено из HT1080) [38], U2OS/2-6-3 (предоставлено Dr.Дэвид Спектор, Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор) [40], U2OS/2-6-3+pCAL-loxP-CLV (263/loxP-CLV), HT1080vRxt (ретровирусный RetroX-tet-ONE)-Luc или — Впр, Мит-23+х3B-GFP и HT1080vRxt-Впр+х3B-GFP. Мы подтвердили отсутствие заражения микоплазмой, периодически проверяя окрашивание Hoechst-33258 (Sigma-Aldrich). Клетки ММ-6 культивировали в среде RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Gibco) с добавлением 1% NEAA (Gibco) и 1% среды OPI (Sigma). Для дифференцировки в макрофагоподобное состояние клетки ММ-6 обрабатывали в течение 3 дней 50 нМ ФМА.Клетки HEK293T и HT1080 культивировали в DMEM с 10% FBS, а клетки Δ Vpr и Mit-23 культивировали в DMEM с 10% FBS без тетрациклина (Hyclone) с добавлением гигромицина B (12,5 мкг/мл) и G418 (100 мкг /мл). Клетки U2OS/2-6-3 культивировали в среде DMEM с 10% FBS, дополненной гигромицином B (12,5 мкг/мл). Клетки 263/loxP-CLV, полученные из U2OS/2-6-3, вновь созданные клеточные линии, стабильно трансдуцированные pCAL-loxP-CLV, культивировали в среде DMEM с 10% FBS, дополненной гигромицином B (12,5 мкг/мл) и G418 (100 мкг /мл).Клетки HT1080vRxt-Luc или -Vpr, полученные из HT1080 вновь созданные клеточные линии, стабильно трансдуцированные ретровирусом RetroX-tet-ONE-Luc или -Vpr, культивировали в среде DMEM с 10% FBS, не содержащей тетрациклин, с добавлением пуромицина (1 мкг/мл). Все клеточные линии, стабильно трансдуцированные pEF-Bos-h3B-GFP (+h3B-GFP), поддерживали в среде, содержащей BlasticidineS (2 мкг/мл). Все клетки выращивали при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO 2 .

Получение макрофагов, полученных из моноцитов (MDM)

Экспериментальные процедуры были одобрены внутренним наблюдательным советом.Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) здоровых добровольцев, давших информированное согласие, выделяли разделением в градиенте плотности фиколла с использованием Lymphoprep (Axis-Shield). Моноциты выделяли с использованием набора для выделения моноцитов II (Miltenyi) путем удаления немоноцитов. Для приготовления MDM изолированные моноциты культивировали в течение 7 дней в RPMI1640 с добавлением 10% FBS в присутствии 25–50 нг/мл рекомбинантного фактора, стимулирующего колонии макрофагов человека (rhM-CSF) (НИОКР).

Бактериальные штаммы

DH5α химически компетентны E.coli (TOYOBO) использовали для стандартной трансформации. Для трансформации ДНК ретровируса, лентивируса и вектора ВИЧ-1 использовали химически компетентную Stbl3 E. coli (Life Technologies). В случае экспрессии белка для трансформации использовали BL21DE3 (Stratagene).

Очистка rVpr из экстракта зародышей пшеницы

С помощью системы бесклеточной транскрипции/трансляции экстракта зародышей пшеницы (WGE) (CellFree Sciences), FLAG-Strep-tag2 (F/S), слитого с N-концом Vpr (pNL4-3) , GenBank: AF324493.2) экспрессировался pEU-F/S-Vpr в качестве матрицы. После синтеза белка WGE разводили в 3-кратном объеме буфера для связывания StA (50 мМ Трис-Cl [pH 8,0], 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40, 0,5% Brij-35) с добавлением РНКазы A (100 мМ). мкг/мл). После инкубации с шариками агарозы Strep-Tactin в течение ночи при 4 °C на вращающейся платформе шарики промывали буфером для связывания StA и элюировали буфером для элюирования 1×SA (Calbiochem), дополненным 1% NP40. Элюат инкубировали с агарозными шариками FLAG-M2 в течение ночи при 4 °C на вращающейся платформе.Гранулы тщательно промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) (-), элюировали 0,1 М HEPES [pH 2,5] и немедленно нейтрализовали 1 M HEPES [pH 8,0] и доводили до 50 мМ NaCl. Концентрацию Vpr в элюированной фракции определяли с помощью α-Vpr ELISA (MBL) [13] или окрашивания геля кумасси бриллиантовым синим (CBB) по сравнению с известными количествами бычьего сывороточного альбумина (BSA). rVpr, произведенный WGE, использовался в экспериментах, за исключением рис. 1с, 2с. Сопоставимая активность F/S-Vpr с rVpr из E.coli был подтвержден анализом нейтральных комет.

Очистка rVpr из

E. coli

rVpr очищали, как сообщалось ранее [13], с некоторыми изменениями. Вкратце, кодон BL21DE3 плюс трансформировали с помощью pGEX-Vpr, в котором Vpr был слит с С-концом GST с последующим сайтом расщепления протеазой PreScission, и культивировали в 2×YTG с добавлением 100 мкг/мл ампициллина (2×YTG-Amp) в течение ночи при 30°С. На следующий день культуру инокулировали в соотношении 1:50 в свежий 2×YTG-Amp и инкубировали при 37°C до тех пор, пока OD600 не достигала 0.8. Затем к среде для культивирования бактерий добавляли 1 мМ IPTG и дополнительно инкубировали в течение 3 ч при 25 °C. Собранный осадок из 500 мл культуры суспендировали в 20 мл буфера для связывания (20 мМ натрий-фосфатный буфер [pH 7,6], 150 мМ NaCl, 0,5% TritonX-100, 10% глицерин) с добавлением 1 мМ PMSF. После обработки ультразвуком и центрифугирования лизат фильтровали через 5 мкм фильтр и инкубировали с 500 мкл гранул глутатион-сефарозы (GSH) в течение ночи при 4 °C на вращающейся платформе. На следующий день гранулы последовательно промывали буфером для связывания с добавлением 500 мМ NaCl или 1% TritonX-100 и буфером для расщепления (50 мМ Трис-HCl [pH 7. 0], 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 % глицерина) дважды, а затем суспендировали в буфере для расщепления с добавлением 1 мМ дитиотреитола (DTT) и 20 мкл протеазы PreScission. После инкубации в течение ночи на вращающейся платформе при 4°C гранулы GSH собирали (Vpr остается связанным с гранулами GSH) и промывали буфером для связывания. Затем белок Vpr элюировали буфером для связывания с добавлением 0,1% TritonX-100. Элюат инкубировали с новыми гранулами GSH для удаления нерасщепленного GST-Vpr и протеазы PreScission в течение 1 ч, а затем супернатант инкубировали с конъюгированными α-Vpr-антителом (8D1) гранулами CNBr-агарозы в течение ночи при 4 °C при вращении. Платформа.Гранулы тщательно промывали PBS (-), Vpr элюировали 0,1 М HEPES [pH 2,5] и немедленно нейтрализовали 1 M HEPES [pH 8,0]. Концентрацию Vpr в элюированной фракции определяли методом ИФА α-Vpr [13]. rVpr, экспрессированный в бактериях, использовали в экспериментах для рис. 1с и 2с.

Очистка rRPA70

BL21DE3 трансформировали с помощью pET15-6×His-RPA70 (в котором hRPA70 был помечен гексагистидином с последующим сайтом расщепления протеазой PreScission на N-конце) и культивировали в 2×YTG-Amp в течение ночи при 30° С. На следующий день культуру инокулировали в соотношении 1:50 в свежий 2×YTG-Amp и инкубировали при 37 °C до тех пор, пока OD600 не достигала 0,8. Затем в среду для культивирования бактерий добавляли 1 мМ IPTG и дополнительно инкубировали в течение ночи при 16 °C. Собранный осадок из 500 мл культуры суспендировали в 20 мл буфера-А (50 мМ Трис-HCl [pH 7,5], 500 мМ NaCl, 0,5% TritonX-100, 10 мМ меркаптоэтанол, 10% глицерин) с добавлением 1 мМ PMSF. После обработки ультразвуком и центрифугирования лизат фильтровали через фильтр 5 мкм и инкубировали с 10 мл смолы Affi-gel Blue (BioRad) в течение ночи при 4 °C на вращающейся платформе.Гранулы дважды промывали 20 мл буфера-А и элюировали 10 мл лизирующего буфера с добавлением 2,5 М NaCl. Элюат разбавляли 4-кратным объемом буфера-В (50 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 0,5 % TritonX-100, 0,625 % Эмпиген, 10 % глицерин, 10 мМ меркаптоэтанол, 12,5 мМ имидазол) с последующей инкубацией в течение ночи. с шариками Ni–NTA (Invitrogen). Шарики промывали буфером-C (50 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 1 М NaCl, 0,5 % Empigen, 0,5 % TritonX-100, 10 мМ меркаптоэтанол, 10 % глицерин, 10 мМ имидазол) и буфером-D (50 мМ). мМ Трис-HCl [pH 8.0], 150 мМ NaCl, 1% TritonX-100, 0,5% Empigen, 10% глицерин). Затем гранулы дважды промывали буфером-E (50 мМ трис-HCl [pH 7,0], 150 мМ NaCl, 0,1% эмпиген, 10% глицерин) и суспендировали в буфере-E с добавлением 1 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА. и 20 мкл протеазы PreScission. После инкубации в течение ночи на вращающейся платформе при 4 °C к элюату добавляли гранулы GSH для удаления протеазы PreScission и перемешивали в течение 1 часа, а затем супернатант использовали в качестве очищенной фракции rRPA70. Концентрацию RPA70 оценивали по окрашиванию геля CBB по сравнению с известными количествами BSA.

Подготовка образца для АСМ-анализа

Пятьдесят нг pUC18 инкубировали с 5 мМ Chlq или 0,5 мкМ rVpr (1000-кратное превышение количества Vpr по отношению к pUC18; 0,37 молекулы Vpr/п.о.) в 50 мкл реакционного буфера AFM ( 10 мМ трис-HCl [pH 8,0], 50 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 ) в течение 30 мин при 37 °C. Перед связыванием ДНК свежерасщепленную слюду обрабатывали буфером для связывания AFM (реакционный буфер AFM с добавлением 5 мМ NiCl 2 ) в течение не менее 10 минут и быстро продували газом N 2 непосредственно перед загрузкой образца. Затем соответствующие количества образца ДНК (обычно 10 мкл) наносили на поверхность слюды, обработанную Ni 2+ , и помещали на 10 мин. После двух быстрых промывок поверхности слюды буфером для связывания АСМ на слюду наносили 100 мкл буфера для связывания АСМ для наблюдения в жидкой АСМ.

Измерение АСМ в водном растворе

Все измерения проводились с помощью АСМ JPK NanoWizard ULTRA Speed ​​(JPK Instruments) на инвертированном микроскопе (IX71, Olympus), оснащенном акустическим кожухом и активной виброизоляцией (Micro40, Accurion).Ультракороткий кантилевер (USC-F0.3-k0.3, NanoWorld) использовался с частотой возбуждения 110–120 кГц для высокоскоростной визуализации с высоким разрешением в жидкой среде. Изображения сканировали в прерывистом контактном режиме (режим переменного тока) по площади 2,0 мкм × 2,0 мкм (512 × 512 пикселей) при частоте сканирования 2,0 Гц, Z-диапазон 1,3 мкм. Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения JPK SPM Data Processing (JPK Instruments). Для обработки изображений использовались одни и те же параметры для всех образцов, проанализированных в один и тот же день. Для получения среднеквадратичного значения шероховатости (Rq) молекулу ДНК вручную окружали минимальным прямоугольником.Для каждой обработки не менее 30 случайно выбранных молекул ДНК подвергали измерению значения Rq, а независимые эксперименты проводили более трех раз.

Анализ RPA70 Pull down с помощью ДНК-связанных гранул

Сначала 10 пмоль биотинилированной 80-мерной одноцепочечной/дцДНК инкубировали с 10 мкл стрептавидина Dynabeads M280 (SA-шарики) в буфере для связывания SA (10 мМ Трис-HCl [рН 8,0], 1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА) при комнатной температуре на вращающейся платформе. Через 15 минут гранулы трижды промывали буфером для связывания СК и хранили в IP-буфере (50 мМ Трис-HCl [pH 8.0], 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40). Затем к суспензии гранул, связанных с ДНК, добавляли 10 пмоль rRPA70 и rVpr и инкубировали в течение 1 часа при 4 °C на вращающейся платформе. Гранулы трижды промывали IP-буфером, и белки, извлеченные с помощью процедуры pull-down (вытянутые вниз белки), анализировали с помощью WB.

Анализ T4gp32 Pull down с помощью ДНК-связанных гранул

Гранулы, связанные с одноцепочечной/дцДНК, готовили, как описано выше, и гранулы суспендировали в 1× буфере CutSmart (NEB), дополненном 1% NP40.Затем к суспензии гранул, связанных с ДНК, добавляли 50 пмоль T4gp32 (NEB) и 100 пмоль пептида C45 или C45D18 и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре на вращающейся платформе. Гранулы трижды промывали буфером 1×CutSmart с добавлением 1% NP40. Вытянутые вниз белки разделяли на SDS-PAGE с последующим окрашиванием флуоресцентным гелевым красителем Oriole (BioRad) и визуализировали с помощью LAS400 с УФ-трансиллюминатором.

Анализ суперспирализации

Суперскрученная плазмидная ДНК, pBluescriptII (500 нг, рис.2b) или pUC18 (100 нг, рис. 2c), инкубировали в 20 мкл 1×CutSmart буфера с 0,025 ед. , 2, 6,32 пмоль для рис. 2b, c соответственно) в течение 30 мин при 37 °C. После этого образцы инактивировали нагреванием в течение 20 минут при 80 °C и инкубировали в течение 20 минут при 55 °C с 0,5% SDS и протеиназой K (1 мг/мл) для депротеинизации. После фенол-хлороформной экстракции очищенную ДНК разделяли на 0,8% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием или 1×SyBr Gold (технологии Life) (рис.2б, в соответственно). Изображения были получены с помощью GelDoc Ez (BioRad), а интенсивность каждого топоизомера была проанализирована с помощью программного обеспечения Image Lab (BioRad).

Иммуногистохимия (ИГХ)

Иммуногистохимия выполнялась по стандартному протоколу. Вкратце, клетки фиксировали 4% параформальдегидом и пермеабилизировали 0,5% TritonX-100. Для окрашивания Topo1 мы провели предварительную экстракцию следующим буфером (20 мМ HEPES [pH 7,5], 50 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы, 0,1% TritonX-100, 3 мМ MgCl 2 ) перед фиксацией.После блокировки 5% обезжиренным молоком/TBS с 0,1% Tween20 использовали указанные антитела. После этого в качестве вторичного антитела использовали оптимальное антитело α-IgG, конъюгированное с флуоресцентным красителем Alexa. Ядра окрашивали 1 мкМ Hoechst-33258 и наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (BX51, Olympus; BZ-X710, Keyence).

Восстановление ковалентного комплекса ДНК-белок (RADAR)

Ковалентный комплекс ДНК-белок был восстановлен в соответствии с ранее опубликованным протоколом [40]. Вкратце, клетки Mit-23 обрабатывали Dox (3 мкг/мл) в течение 1 дня или СРТ (20 мкМ) в течение 1 часа.В случае обработки MG-132, MG-132 (50 мкМ) добавляли в культуральную среду за 2 часа до восстановления. После обработки клетки непосредственно лизировали в буфере-М (6 М тиоцианат гуанидина, 10 мМ Трис-HCl [pH 6,5], 20 мМ ЭДТА, 4% TritonX-100, 1% N -лауроилсаркозин, 1% ДТТ). осаждение этанолом осуществляли добавлением половины объема 99% этанола и центрифугированием. После двукратной промывки 70% этанолом гранулы растворяли и обрабатывали ультразвуком в 8 мМ растворе NaOH. Количество ДНК определяли количественно с помощью Picogreen (Invitrogen) с помощью считывателя планшетов InfiniteM1000 PRO.Для слот-блоттинга равные количества ДНК абсорбировали нитроцеллюлозной мембраной (BioRad) с помощью аппарата для микрофильтрации BioDot-SF (BioRad) с буфером TBS (10 мМ Трис [pH 7,5], 150 мМ NaCl). Topo1-cc или dsDNA обнаруживали соответствующими антителами.

Иммунопреципитация (IP)

Иммунопреципитация для выявления посттрансляционных модификаций Topo1, клетки Mit-23 трансфицировали 3×FLAG/6×His-меченым убиквитином или вектором экспрессии SUMO-1. На следующий день клетки суспендировали в среде с Доксом или без него (3 мкг/мл) и инкубировали в течение 1 дня.Затем ко всем образцам добавляли MG-132 (50 мкМ) на 2 часа. Для СРТ-обработки клетки обрабатывали в течение 1 ч до восстановления. Для выявления убиквитинирования клетки лизировали в 0,5×буфере RIPA (50 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40, 0,25% дезоксихорат натрия (DOC), 0,05% SDS) с добавлением 1× коктейль ингибиторов протеазы (Roche) и 10 мМ N -этилмалеимида (NEM) и подвергли обработке ультразвуком. После этого образцы инкубировали с 50 ЕД бензоназы и 2,5 мМ MgCl 2 в течение 1 ч при 16 °C.После центрифугирования равные количества супернатанта инкубировали в течение 16 часов с поликлональным антителом α-Topo1 или Rabbit-IgG при 4 °C. Иммунокомплекс выделяли с помощью DynaBeads ProteinA, промывали 0,5×RIPA-буфером и подвергали WB-анализу. Для обнаружения модификации SUMO-1 клетки кипятили в буфере Hot-Lysis (10 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 150 мМ NaCl, 2% SDS) с добавлением 1× коктейля ингибиторов протеазы и 10 мМ NEM в течение 10 мин, и разводят в 2-кратном объеме буфера для разведения Hot-Lysis (10 мМ Трис-HCl [pH 8.0], 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 % TrironX-100) с добавлением 10 мМ NEM. После обработки ультразвуком образцы инкубировали в течение 1 часа с 50 ед. бензоназы и 2,5 мМ MgCl 2 при 16 °C. После центрифугирования образцы дополнительно разводили в 19-кратном объеме буфера Hot-Lysis Dilution (в это время концентрация SDS составляла 0,05%), и равные количества супернатанта инкубировали в течение 16 ч с моноклональным антителом α-Topo1 или Mouse-IgM. при 4 °С. Иммунокомплекс извлекали с помощью магнитных шариков ProteinL (Thermo Scientific) и промывали буфером Hot Lysis Wash (10 мМ Tris-HCl [pH 8.0], 250 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40) и подвергли анализу WB.

Анализ проточной цитометрией (FCM)

За два дня до обработки Dox клетки Mit-23 трансфицировали указанной миРНК (50 нМ) или плазмидной ДНК с помощью реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMax или Lipofectamine 2000, соответственно. После культивирования клеток в присутствии Dox (3 мкг/мл) в течение 1 дня мы собирали клетки и суспендировали в свежеприготовленном 70% этаноле. Восстановленные клетки выдерживали в течение 2 ч при -20°С. После этого клетки суспендировали в буфере FCM [PBS (+) с добавлением 4% FBS и 0.1% TritonX-100] и оставляли при 4°С на 30 мин. Для окрашивания γh3AX клетки инкубировали со 100 мкл буфера FCM, дополненного 0,5 мкг конъюгированного FITC α-γh3AX-антитела (Millipore). После инкубации в течение 2 часов при 4 °C образцы трижды промывали буфером FCM, а затем осуществляли окрашивание ядер йодидом пропидия (1 мкг/мл)/PBS (-) с добавлением РНКазы A (200 мкг/мл). После обработки в течение 1 ч при комнатной температуре в темном месте FCM-анализ проводили с помощью FACSCalibur не менее чем на 10 000 клеток.

Анализ нейтральной кометы

Анализ нейтральной кометы проводили в соответствии с инструкциями производителя (Trevigen) с некоторыми изменениями. Вкратце, клетки Mit-23 собирали с помощью 2 мМ EDTA/PBS (-). Дифференцированные клетки MM-6 отделяли с помощью Accutase (Innovative Cell Technologies) и собирали. После ресуспендирования в PBS (-) клетки заключали в низкоплавкую агарозу (Trevigen), распределяли и затвердевали на предметных стеклах Comet (Trevigen) на льду. Предметные стекла погружали в буфер для лизиса (Trevigen) не менее чем на 1 ч, а затем инкубировали в нейтральном буфере для электрофореза (0,01 M Tris-Ac [pH 9,0], 0,3 M NaOAc·3H 2 O) в течение 30 мин при 4 °C. После электрофореза в течение 1 ч при 0,75 В/см при 4 °C образцы фиксировали в осаждающем буфере (1 М NH 4 Ac, 85% этанол) и 70% этаноле. После окрашивания ядер золотом SyBr изображения были захвачены (BZ-X710, Keyence) с 20-кратными объективами с использованием функции Z-стеков и сшивания изображений для получения изображения большого поля с высоким разрешением. Интегрированные изображения анализировали с помощью программного обеспечения Comet Assay IV (Perceptive Instruments) с использованием «момента оливкового хвоста» в качестве параметра степени DSB.Момент оливкового хвоста обычно указывает на степень повреждения ДНК, которая рассчитывается как произведение длины хвоста и доли общей ДНК в хвосте. В программном обеспечении Comet Assay IV (Perceptive Instruments) «момент оливкового хвоста» определяется как произведение пропорции интенсивности хвоста и смещения центра масс хвоста относительно центра головы. Во всех экспериментах анализу подвергалось не менее 80 ядер.

Pull-down анализ отрицательной суперспиральной ДНК

Клетки U2OS/2-6-3 трансфицировали указанной плазмидной ДНК с помощью реагента для трансфекции Viafect (Promega). Через 2 дня трансфекции 5 × 10 6 клеток суспендировали в 250 мкл RSB (10 мМ Трис [pH 7,5], 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl 2 ) и объединяли с 3,5 мл RSB с 0,1% НП40. После осторожного перемешивания клетки центрифугировали при 500× g в течение 10 минут при 4°C. Ядерный осадок суспендировали в PBS (-) с добавлением 5 мкМ Ez-Link Psoralen-PEG 3 -биотина (bPso) (Thermo Scientific) в течение 30 минут при 4 °C. После центрифугирования при 500× g при 4°C в течение 10 мин осадок суспендировали в 100 мкл PBS (-) и переносили в 96-луночный планшет.Для сшивания bPso с ДНК облучали УФ-излучением с длиной волны 365 нм (УФЛ-21, УФП) в течение 30 минут на льду, а затем собранные ядра лизировали в буфере для обработки ультразвуком (50 мМ Трис [pH 7,5], 140 мМ NaCl , 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1 % TritonX-100, 0,1 % DOC, 0,1 % SDS) с добавлением 1× коктейля ингибиторов протеазы. Для получения фрагмента ДНК со средним размером 250 п.н. обработку ультразвуком проводили в следующих условиях: 20 циклов 30 с-ВКЛ/30 с-ВЫКЛ с использованием Bioruptor UCD-250 (Cosmo Bio). После этого образцы центрифугировали при 16000× g в течение 30 мин при 4°C, а полученные супернатанты осторожно смешивали с SA-шариками, блокированными 0.5% БСА и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося не менее 12 часов. Шарики SA последовательно промывали RIPA-буфером (50 мМ Tris-HCl [pH 8,0], 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% NP40, 0,5% DOC, 0,1% SDS) в течение 10 мин, промывочным буфером с высоким содержанием соли (50 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40, 0,5% DOC, 0,1% SDS) в течение 15 мин, промывочный буфер LiCl (50 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 250 мМ LiCl , 1 мМ ЭДТА, 1% NP40, 0,5% DOC) в течение 15 минут и 1 × буфер TE (10 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 1 мМ ЭДТА) дважды в течение 10 минут. Все процессы проводились при 4 °C на вращающейся платформе.После промывки SA-гранулы обрабатывали РНКазой А (1 мг/мл) в буфере 1×TE в течение 30 минут при 37 °C и протеиназой K (100 мкг/мл) с 0,5% SDS в течение 1 часа при 55 °C. Затем супернатант очищали фенол-хлороформной экстракцией (фракция-1). Кроме того, остаточную ДНК на гранулах SA дополнительно экстрагировали 95% формамидом с 10 мМ ЭДТА в течение 10 минут при 90 °C (фракция-2). Объединенные фракции очищали осаждением этанолом, а очищенную ДНК растворяли в буфере 1×TE и подвергали анализу количественной ПЦР с SyBr Premix ExTaq Tli RNaseH plus (TaKaRa) с помощью системы ПЦР в реальном времени StepOne.Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

Клетки U2OS/2-6-3 трансфицировали указанной плазмидной ДНК с помощью реагента для трансфекции Viafect. Через 2 дня после трансфекции клетки перекрестно сшивали 1% параформальдегидом в течение 10 минут с последующим гашением 0,125 М глицином в течение 5 минут при комнатной температуре. После двукратной промывки PBS (-) клетки суспендировали в буфере-1 (10 мМ HEPES [pH 7,5], 10 мМ ЭДТА, 0.5 мМ EGTA, 0,75% TritonX-100) с добавлением 1×коктейля ингибиторов протеазы и инкубировали в течение 10 минут на льду. После центрифугирования при 1700× g в течение 10 мин при 4°C собранные клетки ресуспендировали в буфере-2 (10 мМ HEPES [pH 7,5], 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ЭГТА) с добавлением 1× смесь ингибиторов протеазы и инкубировали в течение 5 минут на льду. Затем клетки извлекали центрифугированием (1700× g в течение 10 минут при 4°C) и лизировали в буфере для лизиса SDS (50 мМ Трис-HCl [pH 8.0], 10 мМ ЭДТА, 1% SDS) с добавлением 1× коктейля ингибиторов протеазы. После фрагментации до средней длины 250 п.н. образцы центрифугировали при 16000× g в течение 30 мин при 4°C, а полученные супернатанты разводили в 9-кратном объеме буфера для разведения ChIP (50 мМ Трис-HCl [pH 8,0] , 167 мМ NaCl, 1,1% TritonX-100, 0,11% DOC). После предварительной очистки гранулами ProteinG Sepharose и IgG Sepharose к каждой аликвоте лизата хроматина добавляли 2 мкг моноклонального антитела α-RPA70 или мышиного IgG и инкубировали на вращающейся платформе в течение более 12 часов при 4 °C.Иммунокомплекс был восстановлен с помощью Dynabeads ProteinG, заблокированного 0,5% BSA и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. После 1 ч инкубации гранулы тщательно промывали, как описано в разделе «Пулл-даун-анализ отрицательной суперскрученной ДНК», и инкубировали в течение 6 ч при 65 °C в буфере 1×TE, дополненном 250 мМ NaCl и 0,5% SDS, и обрабатывали РНКаза А (1 мг/мл) в течение 30 мин при 37 °С и протеиназа К (100 мкг/мл) в течение 1 ч при 55 °С. В это время входная ДНК обрабатывалась таким же образом. Для элюирования ДНК шарики инкубировали с 0.1 М NaHCO 3 и 1% SDS в течение 30 мин при 65 °C, а извлеченную ДНК очищали экстракцией фенолом-хлороформом и осаждением этанолом. Очищенную ДНК растворяли в буфере 1×TE и подвергали количественному ПЦР-анализу. Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Native-ChIP

Для выявления Topo1-cc (ковалентного комплекса Topo1 и ДНК) был проведен анализ ChIP без перекрестного связывания. Клетки U2OS/2-6-3 трансфицировали указанной плазмидной ДНК с помощью реагента для трансфекции Viafect.Через 2 дня после трансфекции клетки обрабатывали MG-132 (50 мкМ) в течение 2 ч и непосредственно лизировали в буфере-М. Ковалентный комплекс ДНК-белок выделяли осаждением этанолом, как описано. Пеллеты растворяли в буфере для лизиса SDS, дополненном 1× коктейлем ингибиторов протеазы, и обрабатывали ультразвуком. После разбавления проводили иммунопреципитацию поликлональными антителами α-Topo1 или IgG кролика. Иммунокомплекс извлекали с помощью DynaBeads ProteinA, блокированного 0,5% BSA и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, и промывали в соответствии с протоколом ChIP.Собранные шарики инкубировали в 1×ТЕ с РНКазой А (1 мг/мл) в течение 30 мин при 37 °С, протеиназой К (100 мкг/мл) с 0,5% ДСН в течение 1 ч при 55 °С и 0,1 М NaHCO 3 с 1% SDS в течение 30 мин при 65 °C. Элюированную ДНК очищали и анализировали с помощью количественной ПЦР, как в стандартном анализе ChIP. Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Иммунопреципитация гибридов ДНК/РНК (DRIP)

Геномную ДНК очищали с помощью набора DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) или Buffer-M в соответствии с протоколом RADAR [39].После обработки ультразвуком образцы обрабатывали РНКазой H (20 ед., NEB) или без нее в 1 × реакционном буфере RNaseH в течение ночи при 37 °C. После очистки осадки ДНК растворяли в буфере DRIP (50 мМ Трис-HCl [pH 8,0], 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,05% TritonX-100) и инкубировали с антителом S9. 6 (KeraFast) или мышиным IgG для 12 ч при 4 °C на вращающейся платформе. Следующие процессы были выполнены, как с Native-ChIP, и проанализированы с помощью количественной ПЦР, как в стандартном анализе ChIP. Промоторная и терминаторная области гена Actin были проанализированы с помощью анализа qPCR в качестве отрицательного и положительного контроля анализа DRIP соответственно [69].Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Опосредованная лигированием (LM)-ПЦР

Эксперименты LM-PCR проводились в соответствии с ранее опубликованным протоколом [41] с некоторыми изменениями. Вкратце, через 2 дня трансфекции клетки лизировали непосредственно в буфере HMW (10 мМ Трис-HCl [pH 7,5], 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% SDS) с добавлением протеиназы K (200 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 55°C без перемешивания. После фенол-хлороформной экстракции к образцу добавляли такой же объем изопропанола, ДНК осторожно собирали и промывали 70% этанолом. Восстановленную ДНК суспендировали в 1×TE с добавлением РНКазы A (100 мкг/мл). Равные количества ДНК обрабатывали набором Quick-Blunting Kit (NEB) и лигировали линкерами с тупыми концами (JW-Linker: отжиг JW102 с JW103). После очистки равные количества ДНК подвергали количественному ПЦР-анализу с использованием праймеров LacO-Rev и JW102 с использованием SyBr Premix ExTaq Tli RNaseH plus. Для оценки количества соединений LacO/JW-линкер соответствующий фрагмент ДНК клонировали в pMD20 и использовали в качестве стандартного образца. qPCR против β глобин проводили параллельно для нормализации количества вводимой ДНК.Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Восстановление флуоресценции после анализа фотообесцвечивания (FRAP) Wt)-GFP, в котором pEF-Bos-h3B-GFP стабильно трансдуцировался в Mit-23 или HT1080vRxt-Vpr, обрабатывали Dox (3 мкг/мл) в течение 1,5 дней. Изображения получали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5 с Leica HCX APO 100×/1.

40–0,60 масляной иммерсионной линзы, а полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения Leica LAS AF Lite (Leica). Для возбуждения GFP мы использовали линию 488 нм аргонового лазера, а излучение флуоресценции собирали между 500 и 530 нм. Все эксперименты проводились на подогретом столике при 37 °C. В экспериментах изображение до отбеливания было получено тремя последовательными изображениями. Затем один квадрат на ядре обесцвечивался пятью лазерными импульсами по 1,318 с при 100% мощности. Затем изображения собирались с интервалом в 10 секунд в течение 180 секунд.Для расчета скорости FRAP фоновые сигналы (ROI B ) вычитались из области интереса для обесцвеченной области (ROI + ) и неотбеленной области (ROI ). Скорректированный сигнал ROI + был нормализован ROI в каждый момент времени, и относительная интенсивность сигнала по сравнению с предварительным отбеливанием (ROI 0 ) использовалась для оценки изменения интенсивности GFP в соответствии с уравнением;

$${\text{Относительный}}\;{\text{сигнал}}\;{\text{интенсивность}} = \{ ({\text{ROI}}^{ + } — {\text{ROI }} ^ {\ text {B}} ) \ div ({\ text {ROI}} ^ { — } — {\ text {ROI}} ^ {\ text {B}} ) \} \ div ({\ text {ROI}}^{0} — {\text{ROI}}^{\text{B}} )$$

Восстановление интенсивности сигнала GFP выражали вычитанием относительной интенсивности сигнала сразу после обесцвечивания из каждый момент времени. Во всех экспериментах анализу подвергали не менее 10 клеток.

Производство псевдотипированного ВИЧ-1

Для производства гликопротеина вируса везикулярного стоматита (VSV-G), псевдотипированного ВИЧ-1, клетки HEK293T котрансфицировали pNL4-3/E- и pHIT-VSV-G с использованием реагента для трансфекции FuGENE6 (Промега). На следующий день культуральную среду меняли на DMEM с добавлением 0,1% FBS. На 2-й день после трансфекции культуральный супернатант, содержащий вирус, извлекали и фильтровали через 0.45 мкм-фильтр, и вирусный титр определяли с помощью набора ELISA p24 (Zeptometrics). NL4-3-Luc/E- и NL4-3-EGFP/E-, которые содержат Luciferase и EGFP в рамке Nef , получали таким же образом. Вирусные образцы перед заражением обрабатывали ДНКазой I (Takara).

Производство лентивируса

Лентивирус был получен с использованием упаковочной смеси Virapower Lentiviral (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя с некоторыми изменениями. Вкратце, клетки HEK293T котрансфицировали pLenti6, pLP1-D64A, pLP2 и pLP-VSV-G с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine 2000.Культуральную среду заменяли на свежую через 16 ч после трансфекции. На 2-й день после трансфекции культуральный супернатант, содержащий вирус, фильтровали через фильтр 0,45 мкм и ультрацентрифугировали при 40 000 об/мин в течение 1 ч при 4 °C (ультрацентрифуга Optima TLX, Beckman Coulter). После удаления супернатанта осадок вируса растворяли в Opti-MEM (Life Technologies) и определяли титр вируса с помощью набора p24 ELISA. Образцы вируса перед заражением обрабатывали ДНКазой I.

Инфекция ВИЧ-1 в клетки ММ-6

Для псевдотипированной инфекции ВИЧ-1, 2.5 × 10 5 Клетки ММ-6 дифференцировали с помощью 50 нМ ФМА в течение 3 дней в 12-луночном планшете. В экспериментах с РНК-интерференцией клетки трансфицировали 300 нМ указанной миРНК с помощью набора Nucleofector Kit-V и суспендировали в среде, содержащей РМА. Через 3 дня добавляли раствор вируса NL4-3 (p24, 50 нг) и инкубировали в течение 2 часов. После двукратного промывания предварительно подогретой средой клетки культивировали в среде, содержащей РМА, в течение дополнительных 1 или 2 дней для анализа нейтральных комет или Alu gag двухэтапного вложенного анализа кПЦР соответственно.Для анализа люциферазы клеточные культуры (50 000 клеток/лунку, в 96-луночном планшете) через 3 дня после заражения (dpi) непосредственно лизировали в равном объеме раствора системы анализа люциферазы One-Glo (Promega) и относительных световых единицах (RLU). измеряли микропланшетным люминометром (Veritas). Для FCM-анализа EGFP клетки фиксировали 1% параформальдегидом не менее 30 минут при комнатной температуре при 3 dpi и анализировали с помощью FACSCalibur не менее 10 000 клеток.

Инфекция ВИЧ-1 для МДМ

Для псевдотипированной инфекции ВИЧ-1, 2.5 × 10  MDM были дифференцированы с помощью 25–50 нг/мл rhM-CSF в течение 5 дней в 12-луночном планшете. В экспериментах с РНКи клетки трансфицировали 50 нМ указанной миРНК с помощью реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMax в течение 4 ч и заменяли на среду, содержащую rhM-CSF. Через 2 дня после трансфекции добавляли вирусный раствор NL4-3 (p24, 12,5 нг) и инкубировали в течение 2 часов. После двукратной промывки предварительно подогретой средой клетки культивировали в среде, содержащей rhM-CSF. Alu gag Двухэтапный вложенный анализ количественной ПЦР выполняли при 2 dpi.

Заражение ВИЧ-1 клетками U2OS/2-6-3 и анализ LacO-направленной интеграции

Клетки U2OS/2-6-3 из 5 × 10 5 трансфицировали указанной плазмидной ДНК с помощью реагента для трансфекции Viafect. Через 2 дня после трансфекции клетки инкубировали с вирусным раствором NL4-3 (p24, 100 нг) в течение 2 дней и подвергали количественному ПЦР-анализу. Геномную ДНК экстрагировали с использованием системы выделения нуклеиновых кислот Quickgene (KURABO). Количественную ПЦР проводили с LacO-(смысловым или антисмысловым), Lenti-5237F и зондом TaqMan (зонд pLenti6-LTR) с использованием универсального зонда SsoAdvance Supermix от системы StepOne Real-time.Для измерения числа копий интегрированной вирусной ДНК, имеющей соединение LacO/провирусная ДНК, соответствующий фрагмент ДНК клонировали в pMD20 и использовали в качестве стандартных образцов. Параллельно для нормализации введенной ДНК была проведена количественная ПЦР для β глобин . В это время Alu gag проводили двухэтапную вложенную количественную ПЦР и измеряли общую инфекционность. Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Alu gag двухэтапная вложенная количественная ПЦР

Геномную ДНК экстрагировали с использованием системы выделения нуклеиновых кислот Quickgene, и 100 нг ДНК подвергли 12 циклам Alu gag с использованием золота Amplit Taq PCR 360 с Alu-F/R и 1st-gag-R.Затем проводили количественную ПЦР с 2-LTR-S и 2-м tag-R и зондом TaqMan (зонд-2). Для определения частоты интеграции одновременно амплифицировали гДНК, содержащую 0,485 копий интеграции ВИЧ/клетку [8]. qPCR против β глобин проводили параллельно с нормализацией количеств вводимой ДНК. Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Заражение лентивирусом клеток U2OS/2-6-3 и анализ LacO-направленной интеграции

Раствор лентивируса (p24, 100 нг) был инфицирован 2.5 × 10 5 U2OS/2-6-3 ячейки на 2 дня. Для количественной оценки LacO-направленной интеграции гДНК подвергали количественному ПЦР-анализу с LacO-(смысловой или антисмысловой)/Lenti-5237F и зондом TaqMan (зонд pLenti6-LTR). Для измерения общей инфекционности клетки культивировали в присутствии бластицидина S (10 мкг/мл) в течение 2 недель. Для нормализации эффективности посева колонии формировали в нормальной культуральной среде. Колонии фиксировали 70% этанолом, окрашивали красящим раствором Гимза и подсчитывали.Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Cre опосредованная экспрессия Cherry-LacR-Vpr

U2OS/2-6-3+pCAL-loxP-CLV (263/loxP-CLV), в которой экспрессия LacR-слитого Vpr включалась, когда Cre-рекомбиназа выражены, были впервые установлены селекцией G418. Затем клетки инфицировали аденовирусом для экспрессии LacZ (контроль) или Cre (индуцирующий экспрессию CLV) при множественности заражения (MOI) 100 в течение 2 дней и подвергали визуализации живых клеток и анализу ChIP для Vpr (дополнительный файл 8: рисунок S7а, б).Для экспериментов с миРНК 2,5 × 10 5 клеток трансфицировали контрольной или миРНК Topo1 (50 нМ) с помощью реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMax. Через 1,5 дня после трансфекции миРНК аденовирус инфицировали в течение 2 дней, а клетки подвергали последующему анализу; Интеграция, направленная на LacO, анализ нативного чипа для Topo1-cc и LM-PCR (рис. 7g и дополнительный файл 8: рисунок S7c, d соответственно). Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Линейная амплификация-ПЦР

LAM-ПЦР проводили, как описано ранее [8] с некоторыми изменениями. Вкратце, ПЦР 1-го вкладыша выполняли с использованием биотинилированного праймера Lenti-5203F посредством двух циклов амплификации с 50 циклами с использованием полимеразы Taq (Qiagen). После очистки SA-шариками была синтезирована двухцепочечная ДНК с фрагментом Кленова (NEB) со статистическим гексамером. После обширных промывок двухцепочечную ДНК на гранулах SA расщепляли Msp I или Nla III и лигировали с соответствующими линкерными кассетами двухцепочечной ДНК (LC).После этого была проведена 1-я ПЦР с биотинилированным M667/LC1 с последующей очисткой SA-шариков. Затем была проведена вторая экспоненциальная ПЦР с использованием EV984/LC2. Селекцию размера амплифицированной ДНК проводили на агарозном геле и клонировали в вектор pGEM-T Easy. Секвенирование проводили с помощью ABI3130x (Applied Biosystems) и определяли сайты интеграции. Олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре, перечислены в (Дополнительный файл 20: Таблица S3).

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR)

Тотальную РНК очищали с помощью набора RNeasy (Qiagen), а кДНК получали с помощью набора для обратной транскрипции кДНК HighCapacity (Invitrogen).Количественную ПЦР проводили с использованием премикса SyBr ExTaq Tli RNaseH plus. Уровни экспрессии каждого гена нормализовали по относительным количествам β актина . Праймеры, используемые для qRT-PCR, перечислены в (Дополнительный файл 21: Таблица S4).

Vpr ВИЧ-1 опосредует истощение клеточного репрессора CTIP2 для противодействия молчанию вирусных генов

  • Descours, B. et al . SAMHD1 ограничивает обратную транскрипцию ВИЧ-1 в покоящихся CD4(+) Т-клетках. Ретровирусология 9 , 87 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Лагетт, Н. и др. . SAMHD1 представляет собой рестрикционный фактор ВИЧ-1, специфичный для дендритных и миелоидных клеток, которому противодействует Vpx. Природа 474 , 654–7 (2011).

    КАС Статья Google ученый

  • Лахуасса, Х. и др. .SAMHD1 ограничивает репликацию вируса иммунодефицита человека типа 1, истощая внутриклеточный пул дезоксинуклеозидтрифосфатов. Нац. Иммунол. 13 , 223–8 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Ле Дус, В., Шеррье, Т., Рикле, Р., Рор, О. и Шварц, К. Многочисленные жизни CTIP2: от СПИДа до рака и сердечной гипертрофии. Дж. Сотовый. Физиол. 229 , 533–537 (2014).

    Артикул Google ученый

  • Ле Дус, В. и др. . HIC1 контролирует транскрипцию клеточных генов и генов ВИЧ-1 посредством взаимодействия с CTIP2 и HMGA1. науч. Респ. 6 , 34920 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья Google ученый

  • Марбан, К. и др. . Ориентация на резервуары мозга: на пути к излечению от ВИЧ. Фронт.Иммунол. 7 , 397 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Ле Дус, В. и др. . LSD1 взаимодействует с CTIP2, чтобы способствовать подавлению транскрипции ВИЧ-1. Рез. нуклеиновых кислот. 40 , 1904–15 (2012).

    Артикул Google ученый

  • Марбан, К. и др. . Рекрутирование ферментов, модифицирующих хроматин, с помощью CTIP2 способствует подавлению транскрипции ВИЧ-1. Embo J 26 , 412–423 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Чишмасиу, В. Б. и др. .BCL11B функционально связывается с комплексом NuRD в Т-лимфоцитах для репрессии целевого промотора. Онкоген 24 , 6753–6764 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Черриер, Т. и др. . CTIP2 является негативным регулятором P-TEFb. Proc Natl Acad Sci USA 110 , 12655–60 (2013).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Эйлебрехт, С. и др. . HMGA1 рекрутирует CTIP2-репрессированный P-TEFb к промоторам ВИЧ-1 и клеточным мишеням. Рез. нуклеиновых кислот. 42 , 4962–71 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Машиба, М. и Коллинз, К.Л. Молекулярные механизмы уклонения ВИЧ от врожденного иммунного ответа в миелоидных клетках. Вирусы 5 , 1–14 (2013).

    КАС Статья Google ученый

  • Ле Русик, Э. и др. . Vpr ВИЧ1 останавливает клеточный цикл, рекрутируя DCAF1/VprBP, рецептор убиквитинлигазы Cul4-DDB1. Cell Cycle 6 , 182–8 (2007).

    Артикул Google ученый

  • Romani, B. & Cohen, E.A. Дополнительные белки лентивирусов Vpr и Vpx узурпируют убиквитинлигазу E3 cullin4-DDB1 (DCAF1). Курс. мнение Вирол. 2 , 755–63 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Вен Х., Кейси Клокоу, Л., Некорчук, М., Шарифи, Х. Дж. и де Норонья, К. М. С. Белок ВИЧ1 Vpr действует, усиливая конститутивный DCAF1-зависимый оборот UNG2. PLoS One 7 , e30939 (2012 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Кейси Клокоу, Л. и др. . Белок ВИЧ-1 Vpr нацеливается на эндорибонуклеазу Dicer для протеасомной деградации, чтобы усилить инфекцию макрофагов. Вирусология 444 , 191–202 (2013).

    КАС Статья Google ученый

  • Моде, К. и др. . Vpr ВИЧ-1 индуцирует деградацию ZIP и sZIP, адаптеров комплекса ремоделирования хроматина NuRD, путем захвата DCAF1/VprBP. PLoS One 8 , e77320 (2013 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Лахуасса, Х. и др. . Vpr ВИЧ-1 разрушает транслоказу ДНК HLTF в Т-клетках и макрофагах. Проц. Натл. акад. науч. США 113 , 5311–6 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Ян Дж. и др. .Vpr ВИЧ-1 перепрограммирует CLR4 DCAF1 E3 Убиквитинлигаза для противодействия опосредованному экзонуклеазой 1 ограничению инфекции ВИЧ-1. МБио 9 (2018).

  • Лагетт, Н. и др. . Преждевременная активация комплекса SLX4 с помощью Vpr способствует аресту G2/M и ускользанию от врожденного иммунного восприятия. Cell 156 , 134–45 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Чжоу Д. и др. . Дополнительный белок ВИЧ-1 Vpr индуцирует деградацию анти-ВИЧ-1 агента APOBEC3G посредством протеасомного пути, опосредованного VprBP. Virus Res ., https://doi.org/10.1016/j.virusres.2014.08.021 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Машиба, М., Коллинз, Д. Р., Терри, В. Х. и Коллинз, К. Л. Vpr преодолевает специфичное для макрофагов ограничение экспрессии Env ВИЧ-1 и продукции вириона. Микроб-хозяин клетки 16 , 722–35 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Чуги, Г. и др. . Вирусный белок X ВИЧ-2/SIV противодействует репрессорному комплексу HUSH. Нац. микробиол. 3 , 891–897 (2018).

    КАС Статья Google ученый

  • Müller, B., Tessmer, U., Schubert, U. & Kräusslich, H.G. Белок Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 включается в вирион в значительно меньших количествах, чем gag, и фосфорилируется в инфицированных клетках. Дж. Вирол. 74 , 9727–9731 (2000).

    Артикул Google ученый

  • Ли, Г. и др. . Репликация ВИЧ-1 через hHR23A-опосредованное взаимодействие Vpr с протеасомой 26S. PLoS One 5 , e11371 (2010 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья Google ученый

  • Рор, О. и др. . Рекрутирование Tat к белку гетерохроматина HP1 посредством взаимодействия с CTIP2 ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека типа 1 в клетках микроглии. J Virol 77 , 5415–5427 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Романи, Б., Байглу, Н.С., Хамиди-Фард, М., Агасадеги, М.Р. и Аллахбахши, Э. Белок ВИЧ-1 Vpr индуцирует протеасомную деградацию ассоциированных с хроматином HDAC класса I для преодоления латентной инфекции макрофагов. Дж. Биол. хим. 291 , 2696–711 (2016).

    КАС Статья Google ученый

  • Lv, L. и др. . Vpr нацеливается на TET2 для деградации лигазой CRL4 VprBP E3 для поддержания экспрессии IL-6 и усиления репликации ВИЧ-1. Мол. Cell 70 , 961–970.e5 (2018).

    КАС Статья Google ученый

  • Чишмасиу, В.В. и др. . BCL11B является общим репрессором транскрипции длинного концевого повтора ВИЧ-1 в Т-лимфоцитах посредством рекрутирования комплекса NuRD. Вирусология 380 , 173–181 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Митчелл, Р. С. и др. . Vpu противодействует BST-2-опосредованному ограничению высвобождения ВИЧ-1 через бета-TrCP и эндолизосомальный перенос. PLoS Патог. 5 , e1000450 (2009 г.).

    Артикул Google ученый

  • Дуглас, Дж. Л. и др. . Vpu направляет деградацию фактора рестрикции вируса иммунодефицита человека BST-2/тетерина посредством {beta}TrCP-зависимого механизма. Дж. Вирол. 83 , 7931–47 (2009).

    КАС Статья Google ученый

  • Попов С. и др. . Вирусный белок R регулирует ядерный импорт преинтеграционного комплекса ВИЧ-1. EMBO J. 17 , 909–17 (1998).

    КАС Статья Google ученый

  • Кино, Т. и др. . Дополнительный белок Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) индуцирует транскрипцию промоторов, реагирующих на ВИЧ-1 и глюкокортикоиды, путем непосредственного связывания с коактиваторами p300/CBP. Дж. Вирол. 76 , 9724–34 (2002).

    КАС Статья Google ученый

  • Курамицу, М. и др. . Новая роль Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 в качестве регулятора сплайсинга клеточной пре-мРНК. Заражение микробами. 7 , 1150–60 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Nishizawa, M., Kamata, M., Mojin, T., Nakai, Y. & Aida, Y. Индукция апоптоза белком Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 происходит независимо от G(2) ареста клеточный цикл. Вирусология 276 , 16–26 (2000).

    КАС Статья Google ученый

  • Guenzel, C. A., Hérate, C. & Benichou, S. HIV-1 Vpr — все еще «загадочный многозадачный человек». Фронт. микробиол. 5 , 127 (2014).

    Артикул Google ученый

  • Ле Рузик, Э. и др. . Сборка с Cul4A-DDB1 DCAF1 Убиквитинлигаза защищает Vpr ВИЧ-1 от протеасомной деградации. Дж. Биол. хим. 283 , 21686–21692 (2008 г.).

    Артикул Google ученый

  • Чжан Л. и др. . Координированная регуляция активности фактора транскрипции Bcl11b в тимоцитах с помощью путей митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и сумоилирования белка. Дж. Биол. хим. 287 , 26971–26988 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Selman, W. H., Esfandiari, E. & Filtz, TM. Изменение Bcl11b при стимуляции как MAP-киназы, так и Gsk3-зависимых сигнальных путей в дважды отрицательных тимоцитах. Биохим. Клеточная биол. 97 , 201–213 (2019).

    КАС Статья Google ученый

  • Романи, Б. и др. . Vpr ВИЧ-1 реактивирует латентный провирус ВИЧ-1, вызывая истощение HDAC класса I на хроматине. науч. Респ. 6 , 31924 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Роббез-Массон, Л. и др. . Комплекс HUSH взаимодействует с TRIM28 для репрессии молодых ретротранспозонов и новых генов. Рез. генома. 28 , 836–845 (2018).

    КАС Статья Google ученый

  • Часовникарова И. А. и др. . Эпигенетическое молчание с помощью комплекса HUSH опосредует пестроту эффектов положения в клетках человека. Наука (80-.). 348 , 1481–1485 (2015).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Ван Линт, К.Прекратите замалчивать SIV/ВИЧ. Нац. микробиол. 3 , 1336–1338 (2018).

    Артикул Google ученый

  • Brégnard, C., Benkirane, M. & Laguette, N. Механизм восстановления повреждений ДНК и ускользание ВИЧ от врожденного иммунного восприятия. Фронт. микробиол. 5 , 176 (2014).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Дюбюисез, М. и др. . Опосредованное протеинкиназой С фосфорилирование BCL11B по серину 2 отрицательно регулирует его взаимодействие с комплексами NuRD во время активации CD4+ Т-клеток. Мол. Клетка. биол. 36 , 1881–98 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Schwartz, C., Rohr, O. & Wallet, C. Ориентация на комплекс ДНК-PK: его рациональное использование при раке и ВИЧ-1-инфекции. Биохим. Фармакол. https://doi.org/10.1016/J.BCP.2018.12.002 (2018 г.).

    Артикул пабмед Google ученый

  • Джанаби, Н., Педенье, С., Эрон, Б., Нг, К.H. & Tardieu, M. Создание линий клеток микроглии человека после трансфекции первичных культур эмбриональных клеток микроглии большим Т-антигеном SV40. Неврологи. лат. 195 , 105–108 (1995).

    КАС Статья Google ученый

  • Вс, Б. и др. . Нейтрализующие антитела ингибируют перенос ВИЧ-1 от первичных дендритных клеток к аутологичным CD4 Т-лимфоцитам. Кровь 120 , 3708–3717 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Холл, В. и др. . Стимуляция репликации ВИЧ-1 в незрелых дендритных клетках в контакте с первичными CD4 Т- или В-лимфоцитами. Дж. Вирол. 84 , 4172–4182 (2010).

    КАС Статья Google ученый

  • Fritz, J. V. и др. . Прямое взаимодействие Vpr-Vpr в клетках отслеживается с помощью двухфотонной флуоресцентной корреляционной спектроскопии и визуализации времени жизни флуоресценции. Ретровирусология 5 , 87 (2008).

    Артикул Google ученый

  • McDonald, D., Carrero, G., Andrin, C., de Vries, G. & Hendzel, M. J. Нуклеоплазматический бета-актин существует в динамическом равновесии между малоподвижными полимерными видами и быстро диффундирующими популяциями. J. Cell Biol. 172 , 541–52 (2006).

    КАС Статья Google ученый

  • Эпигенетическое вытеснение HP1 из гетерохроматина Vpr ВИЧ-1 вызывает преждевременное разделение сестринских хроматид | Журнал клеточной биологии

    Хроматин был выделен для иммуноблоттинга HP1 с использованием комбинации ранее описанных методов (Remboutsika et al., 1999). Вкратце, клетки дважды промывали ледяным PBS, а затем ресуспендировали в буфере N (15 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 60 мМ KCl, 15 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2 , 1 мМ CaCl 2 , 1 мМ дитиотреитола, 2 мМ ванадата натрия, 250 мМ сахарозы, коктейль ингибиторов протеазы [Sigma-Aldrich] и 1 мМ PMSF). Затем к ресуспендированным клеткам добавляли равный объем буфера N, содержащего 0,6% NP-40, полученную суспензию осторожно перемешивали и инкубировали на льду в течение 5 мин. Ядра осаждали центрифугированием при 2000 g в течение 5 мин при 4°С.После трех промывок в буфере N их лизировали в 10 мМ буфере Pipes, pH 6,5, содержащем 10 мМ EDTA, смесь ингибиторов протеаз и 1 мМ PMSF. Полученные осадки хроматина однократно промывали буфером Пайпса и ресуспендировали в загрузочном буфере SDS-PAGE после центрифугирования при 6000 g в течение 10 мин при 4°C. Эквивалентные образцы (с точки зрения исходной ДНК и конечного белка) из фракций супернатантов подвергали 10-15% SDS-PAGE. Контроль (β-тубулин, PSTAIRE, Hh4 или окрашивание Кумасси бриллиантовым синим) использовали для подтверждения эквивалентных нагрузок на каждой дорожке.Экстракцию клеток для анализа когезии проводили, как описано ранее (Тодоров и др., 1995), с небольшими изменениями. После промывки в буфере PBS и цитоскелета (CSK) (10 мМ Pipes, pH 7,0, 100 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы и 3 мМ MgCl 2 ) клетки инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре в буфере для экстракции CSK (буфер CSK). содержащий 0,5% Triton X-100, 0,5 мМ PMSF и смесь ингибиторов протеаз). Частицы осаждали центрифугированием при 700 g в течение 5 мин при 4°С.Полученные осадки трижды промывали буфером для экстракции CSK и лизировали в буфере для радиоиммунопреципитации (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS и смесь ингибиторов протеаз). ) и затем были обработаны ультразвуком на льду. Эквивалентные количества белка подвергали SDS-PAGE с градиентом 10–15%. При иммуноблоттинге клеточные экстракты переносили на нитроцеллюлозные мембраны после SDS-PAGE. После блокировки в 10% БСА (Sigma-Aldrich) мембраны инкубировали с антителами против SMC1 или SMC3 (предоставлены К.Кимура, Университет Цукуба, Цукуба, Япония), HP1-α (Millipore), HP1-β или HP1-γ (предоставлено Т. Харагути и Т. Хаякавой, Центр передовых информационных и коммуникационных технологий Кобе, Национальный институт информации и коммуникаций Technology, Кобе, Япония), NIPBL/делангин (Toyoda and Yanagida, 2006), p300 (Millipore), hRad21 (Abcam) или β-тубулин (Millipore). Антитело против Vpr 8D1 (IgG2a) получали путем иммунизации полноразмерным пептидом Vpr (Peptide Institute, Inc.; Nakai-Murakami et al., 2007). Иммунные комплексы выявляли с использованием Fab-фрагментов антикроличьего или мышиного IgG (GE Healthcare), конъюгированных с HRP. Связанное антитело визуализировали с использованием системы обнаружения вестерн-блоттинга (ECL Plus; GE Healthcare). Интенсивность отсканированных пятен измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ (National Institutes of Health).

    Наука о ВИЧ и СПИДе — обзор

    Ключевые моменты

    • ВИЧ означает вирус иммунодефицита человека, патоген, который действует, атакуя иммунную систему человека.
    • ВИЧ нацелен на клетки CD4, основных защитников организма от инфекции, используя их для создания собственных копий.
    • Антиретровирусные препараты нацелены на определенные этапы «жизненного цикла ВИЧ», чтобы предотвратить репликацию ВИЧ.

    Изучите эту страницу, чтобы узнать больше о структуре ВИЧ, жизненном цикле ВИЧ, клинических стадиях ВИЧ и резервуарах ВИЧ.

    ВИЧ означает вирус иммунодефицита человека, патоген, который действует, атакуя иммунную систему человека.Он принадлежит к классу вирусов, называемых ретровирусами, а точнее к подгруппе, называемой лентивирусами, или вирусами, которые медленно вызывают заболевание.

    ВИЧ не может размножаться сам по себе, поэтому для создания новых копий он должен заразить клетки иммунной системы человека, называемые клетками CD4. Клетки CD4 представляют собой лейкоциты, которые играют центральную роль в реагировании на инфекции в организме.

    Со временем ВИЧ убивает клетки CD4, и способность организма распознавать некоторые виды инфекций и бороться с ними начинает снижаться.Если ВИЧ не контролируется лечением, потеря клеток CD4 приводит к развитию серьезных заболеваний или «оппортунистических инфекций». У людей с нормальным уровнем клеток CD4 эти инфекции распознаются и устраняются иммунной системой.

    Наличие совокупности этих инфекций является наиболее поздней стадией ВИЧ, когда у человека также говорят о СПИДе (синдроме приобретенного иммунодефицита). Эффективное тестирование и лечение ВИЧ означает, что подавляющее большинство людей, живущих с ВИЧ, не достигают этой стадии.

    ВИЧ называют ретровирусом, потому что он работает в обратном направлении. В отличие от других вирусов, ретровирусы хранят свою генетическую информацию, используя РНК вместо ДНК, а это означает, что им необходимо «создавать» ДНК, когда они попадают в клетку человека, чтобы создавать новые копии самих себя.

    ВИЧ представляет собой сферический вирус. Внешняя оболочка вируса называется оболочкой, и она покрыта шипами «гликопротеинов» gp120 и gp41, которые позволяют ВИЧ связываться с рецептором CD4 на CD4 Т-клетках и проникать в клетку.

    Внутри вирусной оболочки находится слой, называемый матрицей. Ядро вируса, или ядро, содержится в капсиде, конусообразной структуре в центре вириона. Капсид содержит два фермента, необходимых для репликации ВИЧ, молекулы обратной транскриптазы и интегразы. Он также содержит две нити РНК, которые содержат генетический материал ВИЧ.

    РНК ВИЧ состоит из девяти генов, которые содержат все инструкции для создания новых вирусов. Три из этих генов — gag, pol и env — дают инструкции для создания белков, которые будут формировать новые вирусные частицы.Например, env предоставляет код для создания белков, формирующих оболочку или оболочку ВИЧ. gag производит структурные белки, такие как матрикс и капсид, а pol производит ферменты, необходимые для создания новых вирусов.

    Другие шесть генов, известных как tat, rev, nef, vif, vpr и vpu , обеспечивают код для создания белков, которые контролируют способность ВИЧ инфицировать клетку, производить новые копии вируса или высвобождать вирусы из инфицированных клеток. клетки.

    1. Приложение и запись

    Процесс производства новых вирусов начинается, когда ВИЧ проникает в клетку. Этот процесс происходит в два этапа: присоединение и слияние.

    ВИЧ поражает клетки иммунной системы, имеющие на поверхности рецептор CD4. Эти клетки включают Т-лимфоциты (также известные как Т-клетки), моноциты, макрофаги и дендритные клетки. Рецептор CD4 используется клеткой для подачи сигнала другим частям иммунной системы о присутствии антигенов.

    Когда ВИЧ вступает в контакт с клеткой CD4, шипы gp120 на поверхности ВИЧ фиксируются на рецепторе CD4 и другом корецепторе, либо CCR5, либо CXCR4.Белок gp41 используется для слияния оболочки ВИЧ с клеточной стенкой. Этот процесс слияния позволяет капсиду ВИЧ проникнуть в клетку CD4.

    Было разработано несколько типов антиретровирусных препаратов для блокирования различных стадий процессов прикрепления и проникновения:

    • Ингибитор CCR5
    • Ингибитор привязанности
    • Ингибитор синтеза

    Белки gp41 и gp120 на поверхности вируса также являются мишенями для вакцин, предназначенных для выработки антител.

    2. Обратная транскрипция

    Когда РНК ВИЧ попадает в клетку, она должна быть «обратно транскрибирована» в провирусную ДНК, прежде чем ее можно будет интегрировать в ДНК клетки-хозяина. ВИЧ использует свой фермент обратной транскриптазы для преобразования РНК в провирусную ДНК внутри клетки.

    Два типа антиретровирусных препаратов были разработаны для прекращения действия обратной транскриптазы и создания провирусной ДНК:

    • Нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ и НИОТ) блокируют выработку ВИЧ, встраивая нуклеозид или нуклеотид в цепь ДНК ВИЧ по мере ее создания, обрывая цепь.

    Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) блокируют выработку ВИЧ путем непосредственного связывания с ферментом обратной транскриптазы.

    3. Интеграция

    После того, как РНК ВИЧ превращается в ДНК, фермент интеграза ВИЧ присоединяется к концам провирусных цепей ДНК и проходит через стенку клеточного ядра. Как только провирусная ДНК проникает в ядро ​​клетки, она связывается с ДНК хозяина, а затем цепь ДНК ВИЧ вставляется в ДНК клетки-хозяина.

    Ингибиторы интегразы ВИЧ были разработаны для блокирования переноса цепи ДНК ВИЧ в ДНК клетки-хозяина.

    После того, как провирусная ДНК интегрируется в ДНК клетки-хозяина, ВИЧ остается в спящем состоянии в клеточной ДНК. Эта стадия называется латентной, а клетка описывается как «латентно инфицированная». Обнаружить эти латентно инфицированные клетки может быть сложно даже при использовании самых чувствительных тестов.

    4. Транскрипция и перевод

    Клетка будет вырабатывать РНК ВИЧ, если получит сигнал стать активной.Клетки CD4 активируются при встрече с инфекционным агентом.

    Когда клетка становится активной, ВИЧ использует фермент хозяина РНК-полимеразу для создания матричной РНК. Эта матричная РНК предоставляет инструкции для создания новых вирусных белков в длинных цепях.

    Длинные цепи белков ВИЧ разрезаются на более мелкие цепи ферментом протеазой ВИЧ.

    5. Сборка и окулировка

    Эти белковые цепи начинают собираться в новые вирусы на клеточной стенке.

    • Ингибиторы протеазы ВИЧ предназначены для блокирования активности фермента протеазы ВИЧ.

    Когда вирус отпочковывается от клеточной стенки, его геном оказывается заключенным в капсид, образованный из белка ВИЧ gag . После того, как новый вирус собран, он должен покинуть клетку, протолкнувшись через клеточную стенку. Чтобы полностью покинуть клетку и стать заразным, вирус должен взять липиды (жиры) из клеточной стенки, чтобы сделать поверхностные гликопротеины.

    • Ингибиторы созревания разрабатываются для блокирования разрезания белка gag , необходимого для получения зрелого вируса.

    1. Первичная (острая) ВИЧ-инфекция

    ВИЧ попадает в организм путем инфицирования клеток CD4 на слизистых оболочках влагалища или прямой кишки или путем прямого инфицирования Т-клеток CD4 в кровотоке.

    На этой стадии доконтактная профилактика с использованием антиретровирусных препаратов может предотвратить заражение ВИЧ, если она принимается последовательно. Постконтактная профилактика с помощью комбинации трех антиретровирусных препаратов может предотвратить заражение ВИЧ на этой стадии и в течение 72 часов после контакта.

    Дендритные клетки одними из первых сталкиваются с ВИЧ, их работа заключается в транспортировке инфекционных агентов в лимфатические узлы. Когда ВИЧ попадает в лимфатические узлы – примерно через 24–48 часов после воздействия – они активируют другие иммунные клетки, такие как Т-клетки CD4, основную мишень ВИЧ.

    Именно здесь, в лимфатических узлах, начинает размножаться ВИЧ. На этом этапе ВИЧ не определяется в крови с помощью тестирования на вирусную нагрузку (РНК ВИЧ) или тестирования на антитела. Эта стадия может длиться от 7 до 21 дня, и в этот период ВИЧ можно обнаружить только путем взятия образцов непосредственно из ткани лимфатического узла (биопсия). Трехкомпонентная антиретровирусная терапия, начатая на этой стадии ВИЧ-инфекции, может значительно ограничить распространение ВИЧ на долгоживущие клетки иммунной системы, формирующие «резервуар» ВИЧ-инфекции в организме. Через несколько недель после заражения ВИЧ становится обнаруживаемым в крови при тестировании на вирусную нагрузку. В этот момент люди могут начать испытывать симптомы острой ВИЧ-инфекции, поскольку уровень ВИЧ в крови очень высок. Общие симптомы острой ВИЧ-инфекции включают, среди прочего, лихорадку, сыпь на теле, опухшие железы.Хотя лихорадка и сыпь являются наиболее распространенными симптомами острой ВИЧ-инфекции, они проявляются не у всех.

    Симптомы острой инфекции могут сохраняться до 2 недель. Вирусная нагрузка достигает своего пика в это время и может составлять более 1 миллиона копий на мл крови. Уровень клеток CD4 в это время также упадет. Вероятность передачи ВИЧ наиболее высока в течение первых нескольких месяцев после заражения, когда уровни ВИЧ в крови, сперме и вагинальной жидкости очень высоки. Примерно через три-четыре недели после заражения антиген ВИЧ (p24) также станет обнаруживаемым.Тесты «четвертого поколения» на антитела/антигены, которые сочетают в себе обнаружение антител к ВИЧ и антигена p24 ВИЧ, на этом этапе показывают положительный результат. В течение последующих 4–8 дней тесты на антитела к ВИЧ с использованием крови покажут положительный результат. Уровень ВИЧ в крови начинает падать, а уровень CD4 снова начинает расти, хотя и не до уровня, предшествующего заражению. Примерно через 6 месяцев вирусная нагрузка и уровни CD4 стабилизируются на уровне, известном как «заданное значение

    ».

    2. Хроническая инфекция

    ВИЧ-инфекция не вызывает дальнейшего заболевания в течение нескольких лет.Этот период известен как бессимптомная фаза. ВИЧ постепенно снижает количество клеток CD4 в организме до тех пор, пока количество клеток CD4 не упадет ниже 200 клеток/мм3. Когда количество клеток CD4 падает ниже этого уровня, риск развития инфекций, связанных со СПИДом (оппортунистических инфекций), значительно возрастает.

    Бессимптомная фаза длится в среднем около десяти лет. Продолжительность бессимптомной фазы зависит от того, насколько быстро снижается количество клеток CD4. Если у человека очень высокая вирусная нагрузка (выше 100 000 копий/мл), он быстрее теряет клетки CD4.

    Антиретровирусное лечение подавляет ВИЧ до неопределяемого уровня, восстанавливает количество клеток CD4 до нормального уровня и предотвращает заболевание, если его начать в любое время в течение бессимптомной фазы и принимать каждый день. Во всех руководствах по лечению людям рекомендуется начинать лечение, как только они будут к нему готовы после постановки диагноза ВИЧ.

    Во время бессимптомной фазы подсчет клеток CD4 и тесты на вирусную нагрузку могут контролировать прогрессирование ВИЧ-инфекции.

    Хотя ВИЧ можно контролировать с помощью антиретровирусной терапии, его невозможно вывести из организма.Это связано с тем, что ВИЧ ускользает от нормальных механизмов иммунной системы для избавления от клеток, зараженных вирусами.

    ВИЧ интегрируется в ДНК клеток иммунной системы человека и реплицируется только тогда, когда клетка стимулируется к ответу на инфекцию. Эти клетки называются латентно инфицированными клетками. Эти клетки не распознаются иммунной системой как инфицированные и уничтожаются, что позволяет им сохраняться до тех пор, пока живет клетка.

    Некоторые из клеток, инфицированных ВИЧ, являются Т-клетками с очень длительной памятью.Резервуары латентно инфицированных клеток формируются в лимфатических узлах, селезенке и кишечнике. ВИЧ также поражает клетки головного мозга, но неясно, может ли ВИЧ перейти из мозга в другие части тела. ВИЧ может также сохраняться в течение многих лет в макрофагах — иммунных клетках, находящихся в основном в тканях — и в дендритных клетках, которые распознают инфекционные агенты и предупреждают другие иммунные клетки об их удалении.

    Латентно инфицированные клетки могут размножаться без активации, и ВИЧ может также передаваться от клетки к клетке в тканях кишечника и других резервуарах. Это означает, что они ускользают от иммунной системы и не подавляются антиретровирусными препаратами до заражения других клеток.

    Неясно, как быстро в организме образуется резервуар ВИЧ-инфицированных клеток. Наблюдения за небольшим числом людей, которые начали антиретровирусное лечение в течение нескольких дней или недель после заражения, показывают, что у них меньше ВИЧ-инфицированных клеток, и если они прекращают антиретровирусное лечение, некоторые из них могут контролировать ВИЧ в течение длительного времени без возобновления лечения.

    ПОМОГИТЕ НАМ ПОМОГИТЕ ДРУГИМ

    Предотвращ.org помогает предотвратить распространение ВИЧ и улучшить сексуальное здоровье, предоставляя людям достоверную и актуальную информацию.

    Мы предоставляем все это БЕСПЛАТНО, но для поддержания работы Avert.org требуются время и деньги.

    Можете ли вы поддержать нас и защитить наше будущее?

    Каждый вклад помогает, каким бы маленьким он ни был.

    Фото: © iStock. com/muzon

     

    Структурное понимание ремоделирования убиквитинлигазы Cullin4-RING с помощью Vpr из вирусов иммунодефицита обезьян

    Abstract

    В ходе эволюции вирусы выработали средства для манипулирования убиквитин-протеасомной системой хозяина, чтобы подавлять противовирусные факторы хозяина.Семейство лентивирусных вспомогательных белков Vpx/Vpr узурпирует субстратный рецептор DCAF1 лигаз Cullin4-RING (CRL4) хозяина, семейства модульных убиквитинлигаз, участвующих в репликации ДНК, репарации ДНК и регуляции клеточного цикла. Модуляция специфичности CRL4 DCAF1 с помощью Vpx и Vpr некоторых вирусов иммунодефицита обезьян (SIV) приводит к рекрутированию, полиубиквитилированию и последующей протеасомной деградации фактора рестрикции хозяина SAMHD1, что приводит к усилению репликации вируса в дифференцированных клетках.Чтобы раскрыть механизм убиквитилирования SAMHD1, вызванного Vpr SIV, мы провели интегративный биохимический и структурный анализ белка Vpr из SIV, заражающих Cercopithecus cephus (SIV mus ). Рентгеновская кристаллография выявляет сходство между SIV mus Vpr и другими членами семейства Vpx/Vpr в отношении взаимодействия DCAF1, в то время как криоэлектронная микроскопия и масс-спектрометрия сшивания подчеркивают расходящийся молекулярный механизм рекрутирования SAMHD1.Кроме того, эти исследования демонстрируют, как SIV mus Vpr использует динамическую архитектуру мультисубъединичной сборки CRL4 DCAF1 для оптимизации убиквитилирования SAMHD1. В совокупности настоящая работа обеспечивает детальное молекулярное понимание изменчивости и видовой специфичности эволюционной гонки вооружений между рестрикцией SAMHD1 хозяина и противодействием лентивирусам посредством белков Vpx/Vpr.

    Резюме автора Из-за ограниченного размера вирусных геномов репликация вируса в значительной степени зависит от компонентов клетки-хозяина.В дополнение к энергетическому метаболизму клетки-хозяина и ее аппарату репликации ДНК и синтеза белка механизм деградации белка является привлекательной мишенью для повторного присвоения вирусом. Некоторые вирусные факторы переключают специфичность убиквитинлигазы хозяина на противовирусные факторы хозяина, чтобы пометить их для разрушения протеасомой, чтобы снять внутриклеточные барьеры для репликации вируса. Здесь мы представляем молекулярные детали того, как вспомогательный белок вируса иммунодефицита обезьян Vpr взаимодействует с субстратным рецептором убиквитинлигазы хозяина Cullin4-RING и как это взаимодействие перенаправляет специфичность Cullin4-RING на противовирусный фактор хозяина SAMHD1.Исследования раскрывают механизм индуцированного Vpr рекрутирования SAMHD1 и последующего убиквитинирования. Более того, путем сравнения с родственными вспомогательными белками других видов вирусов иммунодефицита мы иллюстрируем удивительную изменчивость молекулярных стратегий противодействия SAMHD1, которые эти вирусы приняли во время эволюционной адаптации к своим хозяевам. Наконец, наша работа также обеспечивает более глубокое понимание внутренней работы механизма убиквитилирования Cullin4-RING хозяина.

    Введение

    Значительная часть вирусов в процессе эволюции разработала средства кооптации механизма убиквитинирования своего хозяина для улучшения условий репликации либо путем введения вирусных убиквитинлигаз и деубиквитиназ, либо путем модификации белков хозяина, участвующих в убиквитилировании [1– 3].В частности, убиквитинлигазы хозяина являются заметной мишенью для вирусной узурпации, чтобы перенаправить специфичность на противовирусные факторы рестрикции хозяина. Это приводит к рекрутированию факторов рестрикции в виде неэндогенных -нео--субстратов, вызывая их поли-убиквитилирование и последующую протеасомную деградацию [4-8]. Это противодействие противовирусному репертуару хозяина имеет важное значение для инфекционности и распространения вируса [9–12], и механистическое понимание этих изменений специфичности расширяет наше понимание вирусного патогенеза и может проложить путь к новым методам лечения.

    Часто модифицирующие белки, кодируемые вирусом, связываются с убиквитинлигазами Cullin4-RING (CRL4) и адаптируются к ним [5]. CRL4 состоит из каркаса Cullin4 (CUL4), который связывает субъединицу каталитического RING-домена ROC1 с адапторным белком DDB1, который, в свою очередь, связывается с рецепторами обменного субстрата (DCAF, DDB1- и CUL4-ассоциированные факторы) [13–17]. В некоторых случаях адаптер DDB1 служит якорем для вирусных белков, которые затем действуют как «вирусные DCAF» для рекрутирования антивирусного субстрата.Примерами являются обезьяний белок 5V вируса и мышиный цитомегаловирус M27, которые связываются с DDB1 и привлекают белки STAT1/2 для убиквитинирования, чтобы вмешиваться в интерфероновый ответ хозяина [18-20]. Точно так же CUL4-зависимое подавление передачи сигналов STAT важно для репликации вируса Западного Нила [21]. Кроме того, белок Х вируса гепатита В захватывает DDB1, вызывая протеасомную деструкцию комплекса структурного поддержания хромосомы (SMC), что способствует репликации вируса [22, 23].

    Вирусные факторы также связываются с рецепторами DCAF и модифицируют их, перенаправляя их на антивирусные субстраты. Яркими примерами являются вспомогательные белки лентивирусов Vpr и Vpx. Все современные вирусы иммунодефицита человека и обезьян (ВИЧ/ВИО) кодируют Vpr, в то время как только две линии, представленные ВИЧ-2 и ВИО-инфицирующими мандрилами, несут Vpx [24]. Белки Vpr и Vpx упаковываются в дочерние вирионы и высвобождаются в клетку-хозяина при инфицировании, где они связываются с DCAF1 в ядре [25].В данной работе соответствующие белки вируса иммунодефицита обезьян Vpx/Vpr будут указываться с видом их хозяина в качестве нижнего индекса с использованием следующих сокращений: mus – усатая обезьяна ( Cercopithecus cephus ), mnd – мандрил ( Mandrillus sphinx ), rcm – мангабей красношапочный ( Cercocebus torquatus ), см – мангабей сажичный ( Cercocebus atys ), деб – обезьяна де Бразза ( Cercopithecus ignoretus ), сык – обезьяна Сика ( Cercopithecus ignores ), african – Cercopithecus albogularis обезьяна ( Chlorocebus спец.).Vpr HIV-1 важен для репликации вируса in vivo и в моделях инфекции макрофагов [26]. Недавний протеомный анализ показал, что модуляция специфичности DCAF1 белками Vpr HIV-1 приводит к подавлению сотен белков-хозяев DCAF1- и протеасом-зависимым образом [27], включая ранее описанную деградацию Vpr HIV-1 . нацелены на UNG2 [28], HLTF [29], MUS81 [30, 31], MCM10 [32] и TET2 [33]. Эта удивительная неразборчивость в мишенях деградации также частично сохраняется в более отдаленных кладах, примерами которых являются Vpr agm и Vpr mus [27].Однако плейотропность Vpr и отсутствие легкодоступных экспериментальных моделей не позволили определить, как именно эти события деградации способствуют репликации [26].

    В отличие от этого, Vpx имеет гораздо более узкий диапазон субстратов. Недавно сообщалось, что он нацеливает стимулятор генов интерферона (STING) и компоненты комплекса концентратора молчания человека (HUSH) на деградацию, что приводит к ингибированию противовирусной cGAS-STING-опосредованной передачи сигналов и реактивации латентных провирусов соответственно [34–36]. ].Важно отметить, что Vpx также рекрутирует фактор рестрикции SAMHD1 в DCAF1, чтобы пометить его для протеасомной деструкции [37, 38]. SAMHD1 представляет собой дезоксинуклеотидтрифосфат (dNTP) трифосфогидролазу, которая ограничивает репликацию ретровирусов в неделящихся клетках путем снижения пула dNTP до уровней, которые не могут поддерживать вирусную обратную транскрипцию [39–46]. Ретровирусы, которые экспрессируют Vpx, способны ослаблять рестрикцию SAMHD1, обеспечивая репликацию в дифференцированных клетках миелоидного происхождения, покоящихся Т-клетках и Т-клетках памяти [38, 47, 48].В результате постоянной эволюционной гонки вооружений между рестрикцией SAMHD1 хозяина и его вирусным антагонистом Vpx механизм рекрутирования SAMHD1, опосредованного Vpx, в высокой степени зависит от вида и штамма вируса: клада Vpx, представленная Vpx HIV-2 , распознает С-концевой домен (CtD) SAMHD1, тогда как Vpx mnd2/rcm связывает N-концевой домен (NtD) SAMHD1 принципиально другим образом [24, 49–52].

    В ходе эволюционной адаптации к своим хозяевам-приматам и из-за селективного давления, направленного на уклонение от ограничения SAMHD1, две группы SIV, не имеющие Vpx, SIV agm и SIV deb/mus/syk , neo -функционализировал свой Vpr для связывания SAMHD1 и индукции его деградации [24, 49, 53].Следовательно, эти виды развили «гибридные» белки Vpr, которые сохраняют нацеливание на некоторые факторы хозяина, истощенные Vpr типа HIV-1 [27], и дополнительно индуцируют деградацию SAMHD1.

    Чтобы раскрыть молекулярные механизмы DCAF1- и SAMHD1-взаимодействия такого «гибридного» Vpr, мы инициировали интегративный биохимический и структурный анализ белка Vpr из ВИО, заражающего Cercopithecus cephus , Vpr mus . Эти исследования выявляют сходство и различия с белками Vpx и Vpr из других видов лентивирусов и указывают на расходящийся молекулярный механизм зависимого от Vpr mus рекрутирования SAMHD1 в CUL4/ROC1/DDB1/DCAF1 (CRL4 DCAF1 ). Кроме того, криоэлектронно-микроскопические (крио-ЭМ) реконструкции белкового комплекса CRL4 DCAF1 , модифицированного Vpr mus , позволяют получить представление о структурной пластичности всей сборки убиквитинлигазы CRL4 с последствиями для механизма переноса убиквитина.

    Результаты

    SAMHD1-CtD необходим и достаточен для связывания Vprmus и убиквитилирования in vitro -концевой домен (DCAF1-CtD), белковые комплексы восстанавливали

    in vitro из очищенных компонентов и анализировали с помощью гель-фильтрационной (GF) хроматографии.Различные использованные белковые конструкции схематически показаны на рис. S1A. В отсутствие дополнительных партнеров по связыванию Vpr mus становится нерастворимым после удаления метки аффинной очистки GST (рис. S1B) и, соответственно, не может быть применен к колонке GF. . Взаимодействие SAMHD1 с DDB1/DCAF1-CtD не было обнаружено в отсутствие Vpr mus (рис. S1C). Анализ комбинаций бинарных белков (Vpr mus и DDB1/DCAF1-CtD; Vpr mus и SAMHD1) показывает, что Vpr mus элюируется вместе с DDB1/DCAF1-CtD (рис. S1D) или с SAMHD1 (рис. S1E).Инкубация Vpr mus с DDB1/DCAF1B и SAMHD1 с последующим GF привела к совместной элюции всех трех компонентов (рис. 1А). Вместе эти результаты показывают, что Vpr mus образует стабильные бинарные и тройные белковые комплексы с DDB1/DCAF1-CtD и/или SAMHD1 in vitro . Кроме того, инкубация с любым из этих партнеров по взаимодействию, по-видимому, стабилизирует Vpr mus , уменьшая его склонность к агрегации/нерастворимости.

    Рис. 1. Биохимический анализ Vpr mus , индуцированного перенаправлением специфичности CRL4 DCAF1 .

    ( AC ) Анализ GF in vitro восстановление белковых комплексов, содержащих DDB1/DCAF1-CtD, Vpr mus и SAMHD1 ( A ), SAMHD1-ΔCtD ( B-D1) или T4L ( С ). Объемы элюирования стандартов молекулярной массы белка указаны над хроматограммой в A . Под хроматограммами показаны окрашенные кумасси синим анализы фракций, собранных во время прогонов GF, с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммами. SAM – стерильный α-мотивный домен, HD – гистидин-аспартатный домен, T4L – Т4 лизоцим. Звездочка и двойная звездочка указывают на незначительное загрязнение оставшейся протеазой GST-3C и тегом очистки GST соответственно. ( D-G ) Реакции убиквитилирования in vitro с очищенными белковыми компонентами в отсутствие ( D ) или в присутствии ( E-G ) Vpr mus с указанными конструкциями SAMHD1 в качестве субстрата. Реакции останавливали через указанное время, разделяли на SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием кумасси синим.

    Предыдущие клеточные анализы показали, что остатки 583-626 SAMHD1 макаки-резус (SAMHD1-CtD) необходимы для протеасомной деградации, индуцированной Vpr mus [49]. Чтобы проверить это открытие в нашей системе in vitro , конструкции, содержащие SAMHD1-CtD, слитые с лизоцимом T4 (T4L-SAMHD1-CtD), или содержащие только N-концевые домены SAMHD1 и не содержащие SAMHD1-CtD (SAMHD1-ΔCtD), , инкубировали с Vpr mus и DDB1/DCAF1-CtD, и комплексообразование оценивали с помощью GF-хроматографии. Анализ полученных хроматограмм с помощью SDS-PAGE показывает, что SAMHD1-ΔCtD не элюировался совместно с DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus (рис. 1B). Напротив, T4L-SAMHD1-CtD накапливался в том же пике элюирования, что и DDB1/DCAF1-CtD и Vpr mus (рис. 1C). Эти результаты подтверждают, что SAMHD1-CtD необходим для стабильной ассоциации с DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus in vitro , и демонстрируют, что SAMHD1-CtD достаточно для опосредованного Vpr mus рекрутирования T4L-SAMHD1- Слитая конструкция CtD с DDB1/DCAF1-CtD.

    Чтобы сопоставить эти данные с ферментативной активностью, было проведено анализов убиквитилирования in vitro путем инкубации SAMHD1, SAMHD1-ΔCtD или T4L-SAMHD1-CtD с очищенным CRL4 DCAF1-CtD , E1 (UBA1), E2 (UBCH5C), убиквитин и АТФ. Входные белки показаны на рис. S2A, а контрольные реакции на рис. S2B, C. В отсутствие Vpr mus убиквитилирование SAMHD1 не наблюдалось (рис. 1D и S2D), в то время как добавление Vpr mus приводило к надежному убиквитилированию SAMHD1. , о чем свидетельствует сдвиг вверх SAMHD1 в анализе SDS PAGE, вызванный ковалентной модификацией с увеличением количества молекул убиквитина, что приводит к почти полной потере полосы, соответствующей немодифицированному SAMHD1, после 15-минутной инкубации (рис. 1E и S2E).В соответствии с аналитическими данными GF, SAMHD1-ΔCtD не убиквитилировался в присутствии Vpr mus (рис. 1F и S2F). Напротив, T4L-SAMHD1-CtD был эффективно убиквитилирован, что привело к потере> 90% полосы, соответствующей немодифицированному T4L-SAMHD1-CtD, через 15 минут (рис. 1G и S2F). Опять же, эти данные подтверждают функциональную важность SAMHD1-CtD для опосредованного Vpr mus рекрутирования в убиквитинлигазу CRL4 DCAF1 .

    Анализ кристаллической структуры белковых комплексов DDB1/DCAF1-CtD, связанных с апо- и Vprmus

    Определяли комплекс DDB1/DCAF1-CtD и тройной комплекс слитого белка DDB1/DCAF1-CtD/T4L-Vpr mus (остатки 1-92).Структуры были решены с использованием молекулярной замены и уточнены до разрешений 3,1 Å и 2,5 Å соответственно (таблица S1). Vpr mus принимает трехспиральный пучок, стабилизированный координацией иона цинка остатками His и Cys на спирали-1 и на С-конце (рис. 2А). Наложение Vpr mus на ранее определенные структуры Vpx sm [50], Vpx mnd2 [51, 52] и Vpr HIV-1 [54] выявляет консервативную трехспиральную складку пучка и сходное положение. спиральных пучков на DCAF1-CtD (рис. S3A).Кроме того, большинство боковых цепей, участвующих во взаимодействии с DCAF1, являются консервативными по типу во всех белках Vpx и Vpr (рис. S3B-G и S6A), что убедительно свидетельствует об общем молекулярном механизме захвата CRL4-DCAF1 хозяина семейством Vpx/Vpr. вспомогательных белков. Однако существуют также значительные различия в длине и регистре спирали, а также конформационные вариации в области петли на N-конце спирали-1, в начале спирали-1 и в петле между спиралями-2 и -3 (рис. S3A). ).

    Рис. 2.Кристаллическая структура комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus .

    ( A ) Общая структура комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus в двух проекциях. DCAF1-CtD показан серым рисунком и полупрозрачной поверхностью. Vpr mus показан в виде темно-зеленого изображения, а координированный ион цинка показан в виде серой сферы. T4L и DDB1 опущены для ясности. ( B ) Наложение апо-DCAF1-CtD (голубой рисунок) на связанный с Vpr mus DCAF1-CtD (серый/зеленый рисунок).Показаны только области DCAF1-CtD со значительными структурными различиями между формами, связанными с апо и Vpr mus . Неупорядоченные петли обозначены пунктирными линиями. ( C ) Сравнение бинарных комплексов Vpr mus /DCAF1-CtD и тройных комплексов Vpx sm /DCAF1-CtD/SAMHD1-CtD. Для DCAF1-CtD показана только N-концевая область «кислой петли». Vpr mus , DCAF1-CtD и связанный цинк окрашены, как в A ; Vpx sm представлен оранжевым рисунком, а SAMHD1-CtD — розовым. Выбранные боковые цепи Vpr/Vpx/DCAF1-CtD показаны в виде палочек, а электростатические взаимодействия между этими боковыми цепями обозначены пунктирными линиями. ( D ) Анализ GF in vitro реконструкции белковых комплексов, содержащих DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus или мутант Vpr mus R15E/R75E и SAMHD1. Анализы SDS-PAGE соответствующих фракций GF показаны под хроматограммой с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммой. ( E-F ) In vitro восстановление белковых комплексов, содержащих SAMHD1 и Vpr mus R15E/R75E ( E ) или DDB1/DCAF1-CtD и Vpr mus R15E/R75E ().Анализы SDS-PAGE соответствующих фракций GF показаны под хроматограммой с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммой. Звездочка и двойная звездочка указывают на незначительное загрязнение оставшейся протеазой GST-3C и тегом очистки GST соответственно.

    Vpr mus связывается сбоку и сверху дискообразного 7-лопастного β-пропеллера (BP) домена DCAF1-CtD с общей площадью контактной поверхности ~1600 Å 2 , включающей три основные области взаимодействия . Удлиненный N-конец Vpr mus присоединяется к щели между лопастями DCAF1 BP 1 и 2 посредством нескольких водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий (рис. S3B-D). Вторая, меньшая площадь контакта образуется за счет гидрофобного взаимодействия между остатками Vpr mus L31 и E34 из Helix-1 и DCAF1 W1156, расположенными в петле на вершине лезвия 2 BP (S3E Fig). Третья поверхность взаимодействия включает С-концевую половину Vpr mus Helix-3, которая вставляется в гребень на вершине DCAF1 (S3F, G Fig).

    Наложение кристаллических структур, связанных с apo-DDB1/DCAF1-CtD и Vpr mus , выявляет конформационные изменения в DCAF1 при ассоциации Vpr mus . Связывание N-концевого плеча Vpr с mus вызывает лишь незначительную перестройку петли в лезвии 2 BP (рис. S3C). Напротив, значительные структурные изменения происходят на верхней поверхности домена BP: полярные и гидрофобные взаимодействия остатков DCAF1 P1329, F1330, F1355, N1371, L1378, M1380 и T1382 с боковыми цепями Vpr mus T79, R83, R86 и E87 в Helix-3 приводит к стабилизации растяжения последовательности, соединяющей лопасти BP 6 и 7 («C-терминальная петля», рис. 2B и S3F).Более того, электростатические взаимодействия боковой цепи остатков Vpr mus R15, R75 и R76 с DCAF1 E1088, E1091 и E1093 блокируют конформацию «кислотной петли» перед лезвием 1 BP, которая также неструктурирована и гибка в отсутствие Vpr. mus (рис. 2B, C и S3D, F).

    Примечательно, что в ранее определенных структурах комплексов Vpx/DCAF1/SAMHD1 «кислотная петля» является центральной точкой тройного контакта, обеспечивая платформу для связывания положительно заряженных боковых цепей аминокислот либо на N-, либо на C-конце SAMHD1 [ 50–52].Например, Vpx sm позиционирует SAMHD1-CtD таким образом, что SAMHD1 K622 вступает в электростатическое взаимодействие с остатком «кислой петли» DCAF1 D1092 (рис. 2C, левая панель). Однако в кристаллической структуре Vpr mus связанный Vpr mus теперь блокирует доступ к соответствующему карману для связывания SAMHD1-CtD, в частности, за счет расположения удлиненной N-концевой петли, которая предшествует Helix-1. Кроме того, боковые цепи Vpr mus R15, R75 и R76 нейтрализуют «кислотную петлю» DCAF1, предотвращая образование дополнительных солевых мостиков к основным остаткам в SAMHD1-CtD (рис. 2C, правая панель).

    Чтобы подтвердить важность остатков R15 и R75 Vpr mus для связывания DCAF1-CtD, путем сайт-направленного мутагенеза были созданы мутации с реверсированием заряда глутаматов. Спектр кругового дихроизма (CD) двойного мутантного GST-слитого белка Vpr mus R15E R75E был идентичен дикому типу, что указывает на сходное содержание вторичной структуры и, следовательно, на отсутствие серьезных структурных нарушений, вызванных аминокислотными заменами (S3H Fig). Влияние двойного мутанта Vpr mus R15E R75E на сборку комплекса затем анализировали с помощью GF-хроматографии.SDS-PAGE анализ полученного хроматографического профиля показывает почти полную потерю пика комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus /SAMHD1 (рис. 2D, фракция 6) по сравнению с диким типом, одновременно с обогащением ( i) некоторая часть Vpr мус R15E R75E, связанная с DDB1/DCAF1-CtD (рис. 2D, фракция 7), (ii) свободный DDB1/DCAF1-CtD (фракция 7-8) и (iii) Vpr мус Бинарный комплекс R15E R75E/SAMHD1 (рис. 2D, фракции 8-9). Это предполагает, что изменение заряда боковых цепей Vpr mus R15 и R75 ослабляет сильную ассоциацию с DCAF1, наблюдаемую в Vpr mus дикого типа, из-за потери электростатического взаимодействия с «кислотной петлей», в соответствии с кристаллической структурой.Следовательно, некоторая часть SAMHD1, связанного с Vpr, диссоциирует. Это мнение дополнительно подтверждается анализом GF бинарных комбинаций двойного мутанта Vpr mus R15E R75E либо с SAMHD1, либо с DDB1/DCAF1-CtD. Инкубация Vpr mus R15E R75E с SAMHD1 с последующим добавлением GF приводит к совместной элюции обоих белков, что сопровождается сдвигом пика элюции в сторону более высокой кажущейся молекулярной массы по сравнению с одним SAMHD1 (рис. 2E, фракции 8–9). . Напротив, инкубация двойного мутанта Vpr mus с DDB1/DCAF1-CtD не изменяет объем элюции видов DDB/DCAF1-CtD, и при анализе SDS-PAGE ДНК невозможно обнаружить полосу, соответствующую Vpr. соответствующие дроби (рис.2F, фракции 7-8). Эти данные ясно демонстрируют потерю взаимодействия с DDB1/DCAF1-CtD при изменении заряда остатков 15 и 75 Vpr mus , в то время как активность связывания SAMHD1 сохраняется.

    Крио-ЭМ анализ CRL4-NEDD8

    DCAF1-CtD /Vprmus/SAMHD1 конформационные состояния и динамика

    Чтобы получить представление о структуре Vpr mus в контексте полной сборки CRL4 и понять механизм рекрутирования SAMHD1 , мы инициировали крио-ЭМ анализ сборки CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1.В этих исследованиях небольшой убиквитин-подобный белок NEDD8 был ферментативно присоединен к субъединице CUL4, чтобы получить ее активную форму (S4A Fig) [55]. Комплекс CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 был воссоздан in vitro и очищен хроматографией GF (S4B Fig). 2D-классификация полученных изображений частиц выявила значительную композиционную и конформационную гетерогенность, особенно в отношении присутствия и положения субкомплекса CUL4-NEDD8/ROC1 (стебель) по отношению к DDB1/DCAF1/Vpr mus (ядро) (рис. S4C). .

    Два последовательных раунда 3D-классификации дали три популяции частиц, что привело к 3D-реконструкциям с разрешением 8-10 Å, которые содержали как ядро ​​CRL4, связанное с Vpr mus , так и стебель (конформационные состояния -1, -2 и -3 , рис. 3A и S4D-F). Качество трехмерных объемов было достаточным для соответствия кристаллографическим моделям ядра (рис. 2) и стебля (PDB 2hye) [15] как твердых тел (рис. 3B и S4G). Для субъединицы каталитического RING-домена ROC1 присутствовала только фрагментированная электронная плотность рядом с положением, которое она занимает в кристаллографической модели (рис. S4G).Во всех трех состояниях электронная плотность избирательно отсутствовала для С-концевого домена В (WHB) крылатой спирали CUL4 (остатки 674–759), содержащего сайт модификации NEDD8 (К705), и для предшествующей α-спирали, соединяющей N-концевой домен CUL4 к домену WHB (фиг. S4G). В соответствии с этим наблюдением положения NEDD8, присоединенного к CRL5, и домена CRL4 ROC1 RING стерически несовместимы при наложении их соответствующих кристаллических структур (S4H Fig) [56].

    Рис. 3.Крио-ЭМ анализ конформационных состояний CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1.

    ( A ) Два вида наложения CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 крио-ЭМ реконструкции (конформационное состояние-1 – светло-зеленый, состояние-2 – лосось, состояние-3 – пурпурный). Части плотностей, соответствующие DDB1 BPA/BPC, DCAF1-CtD и Vpr mus , были наложены друг на друга. ( B ) Два вида суперпозиции молекулярных моделей DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus и CUL4/ROC1 (PDB 2hye) [15], которые были приспособлены как твердые тела к соответствующим крио-ЭМ плотностям; модели ориентированы как в A .DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus показан на рис. 2А, CUL4 показан в виде мультяшного изображения, окрашен как A , а ROC1 показан в виде голубого мультяшного изображения. ( C ) Сравнение самых внешних ориентаций стебля CUL4, наблюдаемых в представленном здесь крио-ЭМ анализе (состояния-1 и -3, окрашены как B , показывают вращение DDB1 BPB на 119,5 °) с двумя крайними положениями стебля. присутствует в предыдущих кристаллических структурах (PDB 4a0l [13], PDB 6dsz [115], окрашен в серый цвет, показывает вращение DDB1 BPB на 143,4°).

    Выравнивание трехмерных объемов из состояний-1, -2 и -3 показывает, что плотности ядра, представляющие DDB1 BPA, BPC, DCAF1-CtD и Vpr mus , хорошо накладываются друг на друга, указывая на то, что эти компоненты не подвергаются значительным конформационным флуктуациям и, таким образом, формируют жесткая платформа для связывания субстрата и прикрепления стебля CRL4 (рис. 3). Однако вращение DDB1 BPB вокруг шарнира, соединяющего его с BPC, приводит к трем разным ориентациям стебельчатых областей состояния-1, -2 и -3 относительно ядра.Углы поворота BPB были измерены как 69° между состояниями-1 и -2 и 50° между состояниями-2 и -3.

    Эти данные согласуются с предыдущим прогнозом, основанным на обширном сравнительном анализе кристаллической структуры, который постулировал прибл. Вращение ножки CRL4 вокруг ядра на 150° [13, 15, 16, 19, 57]. Однако крайние левая и правая ориентации CUL4, наблюдаемые здесь, состояния-1 и -3 из нашего крио-ЭМ-анализа, указывают на несколько более узкий диапазон вращения стебля (119 °) по сравнению с конформациями самого дальнего стебля, смоделированными на основе ранее определенных кристаллических структур. (143°) (рис. 3С).Возможное объяснение этого несоответствия возникает из проверки плотностей крио-ЭМ и подобранных моделей, показывающих, что наряду с основным интерфейсом взаимодействия на DDB1 BPB существуют дополнительные молекулярные контакты между CUL4 и DDB1. В частности, в состоянии-1 имеется контакт между петлей, соединяющей спирали D и E кулинового повтора CUL4 (CR)1 (остатки 161–169), и петлей, выступающей из лопасти 3 BP DDB1 BPC (остатки 795–801, S4I рис.). В состоянии 3 петля между спиралями D и E CUL4 CR2 (остатки 275–282) примыкает к области в С-концевом спиральном домене DDB1 (остатки 1110–1127, S4J Fig).Эти вспомогательные взаимодействия могут потребоваться для блокировки наблюдаемых здесь самых удаленных положений стебля, чтобы ограничить диапазон вращения CUL4.

    Молекулярный механизм нацеливания на SAMHD1

    Повторный анализ данных крио-ЭМ, включающий отбор частиц на основе шаблона и расширенную трехмерную классификацию, позволил выделить дополнительную однородную популяцию частиц (S5A, B Fig). Это подмножество изображений частиц дало трехмерную реконструкцию с номинальным разрешением 7,3 Å, которая содержала только электронную плотность, соответствующую ядру CRL4 (рис. S5A-D).Молекулярные модели доменов DDB1 BP A и C (BPA, BPC), DCAF1-CtD и Vpr mus , полученные из нашей кристаллической структуры (рис. 2), могут быть помещены в виде твердых тел в этот объем крио-ЭМ (рис. 4A). . Для большей части SAMHD1 не было видно явной электронной плотности. Однако при ближайшем рассмотрении был обнаружен дополнительный трубчатый, слегка дугообразный элемент плотности, ок. 35 Å в длину, расположен на верхней поверхности спирального пучка Vpr mus , примерно в 17 Å от и напротив интерфейса связывания Vpr mus / DCAF1-CtD (рис. 4A, красные стрелки).Один конец трубчатого объема контактирует с серединой Vpr mus Helix-1, а другой конец образует дополнительные контакты с С-концом Helix-2 и N-концом Helix-3 (рис. 4B). Локальное разрешение 7,5-8 Å (рис. S5C) исключало подгонку атомной модели. Принимая во внимание биохимические данные, показывающие, что SAMHD1-CtD достаточно для рекрутирования в DDB1/DCAF1/Vpr mus , мы предполагаем, что эта наблюдаемая особенность электронной плотности соответствует области SAMHD1-CtD, которая физически взаимодействует с Vpr mus .Учитывая его размеры, предполагаемая плотность SAMHD1-CtD может вместить ок. 10 аминокислотных остатков в полностью вытянутой конформации или до 23 остатков в изогнутой спиральной конфигурации. Все предыдущие анализы кристаллической структуры [46], а также предсказания вторичной структуры показывают, что остатки SAMHD1 на С-конце каталитического домена HD и С-концевой доли (аминокислоты 599-626) неупорядочены в отсутствие дополнительных партнеров по связыванию. Соответственно, N-концевые глобулярные домены молекулы SAMHD1 могут быть гибко связаны с C-концевой связью, идентифицированной здесь.В этом случае основная масса SAMHD1 выбирает множество позиций относительно ядра DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus и, следовательно, усредняется в процессе крио-ЭМ реконструкции.

    Рис. 4. Механизм рекрутирования SAMHD1-CtD с помощью Vpr mus .

    ( A ) Два вида крио-ЭМ реконструкции ядра CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1. Кристаллическая структура комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus была вписана в крио-ЭМ-плотность как твердое тело и показана теми же цветами, что и на рис. 2А.Модель и плотность DDB1 BPB были удалены для ясности. Красными стрелками отмечена дополнительная плотность на верхней поверхности пучка спирали Vpr mus . ( B ) Подробное изображение электронной плотности SAMHD1-CtD. Модель имеет ту же ориентацию, что и A , левая панель. Выбранные остатки Vpr mus W29 и A66, которые находятся в тесном контакте с дополнительной плотностью, показаны красным цветом. ( C ) Реконструкция in vitro белковых комплексов, содержащих DDB1/DCAF1-CtD, Vpr mus или мутант Vpr mus W29A/A66W, и SAMHD1, оцененная с помощью аналитического GF.Анализы SDS-PAGE соответствующих фракций GF показаны под хроматограммой с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммой. ( D-E ) In vitro восстановление белковых комплексов, содержащих SAMHD1 и Vpr mus W29A/A66W ( D ) или DDB1/DCAF1-CtD и Vpr mus W29A/A66W (9096W). Анализы SDS-PAGE соответствующих фракций GF показаны под хроматограммой с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммой.Звездочка и двойная звездочка указывают на незначительное загрязнение оставшейся протеазой GST-3C и тегом очистки GST соответственно.

    Чтобы проверить эту гипотезу, аминокислотные остатки Vpr mus в непосредственной близости от предполагаемой плотности SAMHD1-CtD были заменены с помощью сайт-направленного мутагенеза. В частности, Vpr mus W29 был заменен на аланин, чтобы заблокировать гидрофобный контакт с SAMHD1-CtD с участием ароматической боковой цепи, а Vpr mus A66 был заменен на объемный триптофан, чтобы вызвать стерическое столкновение с SAMHD1-CtD. (рис. 4В).Структурная целостность двойного мутанта Vpr mus W29A A66W была подтверждена с помощью спектроскопии CD (S3H Fig), а затем было оценено образование комплекса с DDB1/DCAF1-CtD и SAMHD1 с помощью аналитического GF. По сравнению с Vpr mus дикого типа, мутант W29A A66W показал сниженную пиковую интенсивность комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus /SAMHD1 (рис. 4C, фракция 6) одновременно с (i) обогащением DDB1/DCAF1- Тройной комплекс CtD/Vpr mus , субстехиометрически связанный с SAMHD1 (рис. 4C, фракция 7), (ii) избыток комплекса DDB1/DCAF1-CtD (рис. 4C, фракция 8) и (iii) избыток SAMHD1 (рис. 4C) , дроби 9-10).Кроме того, с помощью GF также были проанализированы бинарные комбинации двойного мутанта Vpr mus W29A A66W с DDB1/DCAF1-CtD или SAMHD1. Эти данные показывают потерю взаимодействия SAMHD1 (рис. 4D), в то время как способность связывать DDB1/DCAF1-CtD сохраняется (рис. 4E). Вместе эти биохимические анализы подтверждают расположение сайта связывания SAMHD1-CtD на верхней поверхности пучка спирали Vpr mus , как предполагается крио-ЭМ реконструкцией среднего разрешения.

    Для получения дополнительных экспериментальных данных сборка CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 была дополнительно исследована с помощью масс-спектрометрии сшивки (CLMS) с использованием фотореактивного сшивающего агента сульфо-SDA.Это бифункциональное соединение содержит функциональную группу сложного эфира NHS на одном конце, которая реагирует с первичными аминами и гидроксильными группами, а другой конец ковалентно связан с любой боковой цепью аминокислоты в пределах досягаемости при УФ-активации через промежуточный карбен [58]. Соответственно, инкубация белков или белковых комплексов с сульфо-SDA с последующим УФ-освещением позволяет сшивать с высокой плотностью боковые цепи лизина и, в меньшей степени, серина, треонина и тирозина с аминокислотами в пределах досягаемости SDA. спейсерная группа с более быстрой кинетикой, чем сшивающие агенты на основе чистых эфиров NHS, из-за короткого периода полураспада промежуточного соединения, активируемого УФ-излучением.Сшитые пептиды впоследствии идентифицируются с помощью масс-спектрометрии и дают представление о топологии и расстояниях между остатками белков и комплексов [59]. В случае сборки CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 большинство идентифицированных поперечных связей, которые могут быть отображены на структуру (468/519, 90,2%), находятся в пределах установленного порога нарушения 25 Å. по геометрии проставки SDA. Интересно, что 8 из 11 поперечных связей между DDB1 и CUL4 удовлетворяются моделью состояния 1, но все чаще нарушаются в состояниях 2 и -3 (S5E Fig), поддерживая в решении ротационную гибкость стебля CRL4 по отношению к DDB1/DCAF1-CtD, наблюдаемый в крио-ЭМ (рис. 3).

    Дополнительные 300 поперечных связей включали SAMHD1, простирающиеся до С-концевой половины CUL4, до участка последовательности DDB1, включающего аминокислотные остатки 900–1000, до частей DCAF1-CtD и до Vpr mus (рис. 5A, С5Е). Остатки CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus , демонстрирующие перекрестные связи с SAMHD1, были картированы на модели состояния 2 и показали наличие большой, но определенной поверхности взаимодействия (рис. 5B). Важно отметить, что были очевидны перекрестные связи между С-концом SAMHD1-CtD (остатки K622, K626) и областью в Vpr mus Helix-1 (остатки 27–36), которая образует часть предполагаемого SAMHD1-CtD. интерфейс связывания, наблюдаемый в крио-ЭМ, который содержит Vpr mus W29, один из остатков которого заменен в мутагенезе и биохимическом анализе, представленном выше (фиг. 5B, фиолетовые сферы).Кроме того, аминокислотные остатки из N-концевой части SAMHD1-CtD (остатки K595, K596, T602-S606) сшиты вблизи «кислой петли» DCAF1-CtD (остатки 1092-1096), которая иммобилизована Vpr рядом с предполагаемым сайтом связывания SAMHD1-CtD и с самым С-концом CUL4 (остатки Y744, A759), который также примыкает к предсказанному положению связывания SAMHD1-CtD (рис. 5B, розовые сферы). Наконец, перекрестные связи в N-концевом домене SAMHD1 и каталитическом домене HD почти исключительно включали участки поверхности CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus , окружающие предполагаемую точку прикрепления SAMHD1-CtD и обращенные к ней (рис.5В, светло-коричневые сферы). Эти наблюдения совместимы с рекрутированием SAMHD-CtD на верхней поверхности пучка спирали Vpr, на что указывает крио-ЭМ. Кроме того, пространственное распределение перекрестных связей, включающих N-концевые домены SAMHD1, позволяет предположить, что они гибко связаны с SAMHD1-CtD, что приводит к сильно изменчивому расположению относительно CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus и, таким образом, предлагает множество возможностей сшивки с соседними компонентами CRL4, опять же в соответствии с результатами крио-ЭМ-реконструкции, особенно с учетом позиционной неоднородности ножки CUL4 (рис.3).

    Рис. 5. Масс-спектрометрический анализ сшивания (CLMS) CRL4 DCAF1-CtD / Vpr mus /SAMHD1

    ( A ) mus и SAMHD1, идентифицированные с помощью CLMS. Белки имеют цветовую кодировку, как на рис. 3, 4, и черный/белый SAMHD1. SAMHD1-CtD выделен желтым цветом. Сшивки с N-концевыми глобулярными доменами SAM и HD SAMHD1 окрашены в светло-коричневый цвет, в то время как сшивки с N-концевой половиной SAMHD1-CtD выделены розовым цветом, а сшивки с С-концом SAMHD1-CtD отмечены окрашены в фиолетовый цвет.( B ) Поперечные связи сульфо-SDA из A , в той же цветовой схеме, нанесенные на карту на молекулярной модели CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 (состояние-2), получено из крио-ЭМ анализа (рис. 3). Плотность SAMHD1-CtD из крио-ЭМ анализа CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 (основной) (рис. 4) показана желтой сеткой. ( C ) Доступное пространство взаимодействия SAMHD1-CtD, рассчитанное сервером DisVis [61], согласующееся как минимум с 14 из 26 наблюдаемых перекрестных связей, визуализируется в виде серой сетки.DCAF1-CtD и Vpr mus ориентированы и окрашены, как на рис. 4А.

    Для более количественной оценки информации о расстоянии, присущей перекрестным ссылкам SAMHD1-CtD, объем, доступный для SAMHD1-CtD для взаимодействия с CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus , в соответствии с расстоянием CLMS ограничений моделировали с помощью программного инструмента DisVis [60, 61]. Для этого анализа SAMHD1-CtD моделировали как пептид в расширенной конформации. Во время моделирования модель молекулярного состояния CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus оставалась фиксированной, а шестимерный поиск всех возможных степеней свободы вращения и трансляции для модели SAMHD1-CtD в молекулярном контакте с CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus был рассчитан и ранжирован в соответствии с ограничениями расстояния CLMS.Чтобы визуализировать выходные данные, все возможные пространственные положения центра масс SAMHD1-CtD, которые удовлетворяют> 50% ограничений CLMS, были нанесены в виде карты плотности на структуру DCAF1-CtD/Vpr mus (рис. 5C). . В соответствии с крио-ЭМ-реконструкцией этот независимый вычислительный анализ также определяет местонахождение SAMHD1-CtD поверх пучка спирали Vpr mus .

    Взятые вместе, структурные, биохимические данные и данные CLMS согласуются с моделью, в которой сам С-конец SAMHD1 рекрутируется Vpr mus , чтобы разместить оставшиеся домены SAMHD1 надлежащим образом для доступа к каталитическому механизму на дистальном конце стебля CRL4.

    Эти данные позволяют провести структурное сравнение со способами связывания субстрата neo белков Vpx и Vpr из разных линий ретровирусов (рис. 6A-D). Vpx HIV-2 и Vpx sm позиционируют SAMHD1-CtD сбоку от домена DCAF1 BP посредством взаимодействия с N-концами Vpx Helices-1 и -3 (рис. 6B) [50]. Vpx mnd2 и Vpx rcm связывают SAMHD1-NtD, используя двусторонний интерфейс, включающий сторону DCAF1 BP и верхнюю поверхность пучка спирали Vpx (рис. 6C) [51, 52].Vpr HIV-1 взаимодействует со своим субстратом убиквитилирования UNG2, используя как верхнюю часть, так и верхний край пучка спирали Vpr HIV-1 (Fig. 6D) [54]. Следует отметить, что эти интерфейсы взаимодействия верхней поверхности лишь частично перекрываются с интерфейсом связывания Vpr mus /SAMHD1-CtD, идентифицированным здесь, и используют принципиально разные наборы взаимодействующих аминокислотных остатков. Таким образом, оказывается, что интерфейсы молекулярного взаимодействия, управляющие Vpx/Vpr-опосредованным распознаванием и деградацией субстрата neo , не сохраняются между родственными вспомогательными белками SIV и Vpx/Vpr ВИЧ, даже в тех случаях, когда идентичные области SAMHD1-CtD нацелены на рекрутирование. .

    Рис. 6. Вариабельность распознавания субстрата neo в белках Vpx/Vpr.

    Сравнение Нео Моды распознавания Neo VPR MUS ( A ), VPX SM ( B ), VPX MND2 ( C ) и VPR ВИЧ-1 ( D ). DCAF1-CtD показан серым мультяшным изображением и полупрозрачной поверхностью, Vpr mus – зеленым, Vpx sm – оранжевым, Vpx mnd2 – синим и Vpr HIV-1 – светло-коричневым показаны мультяшными. Модели рекрутированных субстратов убиквитилирования показаны в виде сильно отфильтрованных, полупрозрачных рассчитанных карт электронной плотности со следующей схемой окраски: SAMHD1-CtD, связанный с Vpr mus – желтый, SAMHD1-CtD (связанный с Vpx sm , PDB 4cc9 ) [50] – мятно-зеленый, SAMHD1-NtD (Vpx mnd2 , PDB 5aja) [51] – пурпурный, UNG2 (Vpr HIV-1 , PDB 5jk7) [54] – светло-фиолетовый.

    Обсуждение

    Наши рентгеноструктурные исследования сборки DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus обеспечивают первое понимание структуры класса «гибридных» белков Vpr SIV.Они присутствуют в линиях лентивирусов SIV agm и SIV mus/deb/syk и сочетают характеристики родственных вспомогательных белков Vpr HIV-1 и SIV Vpx.

    Как и Vpx SIV, «гибридные» белки Vpr подавляют рестрикционный фактор хозяина SAMHD1, привлекая его к CRL4 DCAF1 для убиквитинирования и последующей протеасомной деградации. Однако, используя комбинацию рентгеновского, крио-ЭМ и CLMS анализов, мы показываем, что молекулярная стратегия, которую Vpr mus развила для нацеливания на SAMHD1, разительно отличается от Vpx-содержащих штаммов SIV.В двух кладах белков Vpx дивергентная аминокислотная последовательность простирается непосредственно выше Helix-1 (вариабельная область (VR)1, S6A Fig), вместе с полиморфизмами в SAMHD1-N-конце соответствующего вида-хозяина определяют, является ли ВИЧ -2-тип или SIV mnd -тип Vpx распознают SAMHD1-CtD или SAMHD1-NtD соответственно. Эти механизмы распознавания приводят к позиционированию SAMHD1-CtD или -NtD на стороне домена DCAF1 BP таким образом, что обеспечиваются дополнительные контакты между SAMHD1 и DCAF1, образуя тройные сборки Vpx/SAMHD1/DCAF1 с очень низкой скоростью диссоциации [50]. –52, 62].В Vpr mus разные принципы определяют специфичность SAMHD1-CtD. Здесь VR1 вообще не участвует в связывании SAMHD1-CtD, но формирует дополнительные взаимодействия с DCAF1, которые не наблюдаются в белковых комплексах Vpx/DCAF1 (S6A Fig). Молекулярные контакты между Vpr mus и SAMHD1 рассредоточены по спиралям-1 и -3, обращены в сторону от места взаимодействия DCAF1 и иммобилизуют SAMHD1-CtD на верхней стороне пучка спирали Vpr mus (рис. S6A). Помещение SAMHD1-CtD в такое положение препятствует стабилизации тройного взаимодействия с DCAF1-CtD, но все же приводит к надежному убиквитилированию SAMHD1 in vitro и деградации SAMHD1 в клеточных анализах [24].

    Каталитическая дНТФазная активность SAMHD1 зависит от нуклеотид-зависимой олигомеризации, опосредованной двумя аллостерическими сайтами связывания нуклеотидов, где нуклеотиды на основе гуанина в первом сайте индуцируют образование димера, а связывание дНТФ со вторым сайтом приводит к сборке каталитически активный тетрамер. SAMHD1-CtD необходим для образования тетрамера, обеспечивая критические молекулярные контакты с соседними протомерами. Более того, дестабилизация тетрамера посредством CDK1/2-циклинА-зависимого фосфорилирования T592 в SAMHD1-CtD эндогенно ослабляет активность SAMHD1 в циклирующих клетках [46, 63-65]. Соответственно, возможно, что, изолируя SAMHD1-CtD, Vpr mus дестабилизирует тетрамер SAMHD1 и, таким образом, аннулирует активность SAMHD1, прежде чем вызвать его протеасомную деградацию, в соответствии с предыдущим наблюдением Vpx , опосредованного ВИЧ-2 . Разборка тетрамера SAMHD1 и ингибирование активности дНТФазы [62].

    Предсказания относительно молекулярного механизма связывания SAMHD1 другими «гибридными» ортологами Vpr затруднены из-за расхождения последовательностей.Даже в Vpr deb , наиболее близком по отношению к Vpr mus , сохраняется только приблизительно 50% боковых цепей аминокислот, выстилающих предполагаемый карман связывания SAMHD1-CtD (S6A Fig). Предыдущие эксперименты in vitro по убиквитинированию и клеточной деградации не показали явного предпочтения Vpr deb для рекрутирования либо SAMHD1-NtD, либо –CtD [24, 49]. Кроме того, оспаривается, действительно ли Vpr deb связывает DCAF1 [66], что, возможно, может быть объяснено аминокислотными вариациями на самом N-конце и/или в Helix-3 (S6A Fig). Vpr syk специфичен для SAMHD1-CtD [49], но большинство остатков, образующих платформу связывания SAMHD1-CtD, наблюдаемых в настоящем исследовании, не являются консервативными. Линия белков Vpr SIV agm еще более дивергентна, со значительными различиями не только в возможных остатках, контактирующих с SAMHD1, но и в участках последовательности, предшествующих Helix-1 и соединяющих спирали-2 и -3, а также в N-концевая половина Helix-3 (фиг. S6A). Кроме того, есть указания на то, что рекрутирование SAMHD1 с помощью Vpr agm.Подтип GRI включает молекулярное распознавание как SAMHD1-NtD, так и –CtD [49, 53]. В заключение, повторяющиеся раунды эволюционной адаптации лентивирусов к фактору рестрикции SAMHD1 хозяина с последующей повторной адаптацией хозяина привели к высоковидоспецифическим, разнообразным молекулярным способам взаимодействия Vpr-SAMHD1. Аналогичная гонка молекулярных вооружений между внутренними клеточными противовирусными факторами-хозяевами и вирусными антагонистами сформировала видоспецифический лентивирусный антагонизм, например. факторы рестрикции хозяина семейства APOBEC3 и тетерин путем индукции их деградации соответствующими вирусными антагонистами Vif или Nef/Vpu [67–69].Кроме того, реадаптация вируса к определенным обезьяньим и человеческим вариантам этих рестрикционных факторов после межвидовой передачи принимала участие в появлении пандемических штаммов ВИЧ, что подчеркивает важность структурного понимания этих процессов [9]. В дополнение к представленному здесь случаю, необходима дальнейшая структурная характеристика комплексов SAMHD1-Vpr, чтобы полностью определить результаты этой конкретной гонки молекулярных вооружений вирус-хозяин.

    Предыдущее исследование структуры DDB1/DCAF1/Vpr HIV-1 в комплексе с neo -субстратом UNG2 показало, что Vpr HIV-1 взаимодействует с UNG2, имитируя фосфатный остов ДНК.Точнее, остатки UNG2, выступающие в большую бороздку его эндогенного ДНК-субстрата, встраиваются в гидрофобную щель, образованную Vpr HIV-1 Helices-1, -2 и N-концевой половиной Helix-3 [54]. . Этот механизм может объяснить необычайную неразборчивость связывания Vpr HIV-1 , поскольку список потенциальных субстратов деградации Vpr HIV-1 значительно обогащен ДНК- и РНК-связывающими белками [27]. Более того, было высказано предположение, что неразборчивая Vpr , индуцированная ВИЧ-1 , деградация факторов хозяина с ДНК- или РНК-связывающей активностью вызывает остановку клеточного цикла на границе фазы G2/M, что является наиболее подробно описанным фенотипом белков Vpr. далеко [26, 27, 70].В Vpr mus N-концевая половина Helix-1, а также объемный аминокислотный остаток W48, который также сохраняется в Vpr agm и Vpx, сужают гидрофобную щель (S6A, B Fig). Кроме того, удлиненный N-конец Vpr mus Helix-3 несовместим со связыванием UNG2 из-за стерического исключения (рис. S6C). В соответствии с этими наблюдениями, Vpr mus не подавляет UNG2 в линии Т-клеток человека [27]. Однако Vpr mus , Vpr syk и Vpr agm также вызывают остановку клеточного цикла G2/M в соответствующих клетках-хозяевах [66, 71, 72]. Это убедительно указывает на существование дополнительных структурных детерминант у Vpr mus , Vpr syk , Vpr agm и потенциально Vpr HIV-1 , которые регулируют рекрутирование и убиквитилирование ДНК/РНК-связывающих факторов хозяина, кроме того к гидрофобной, имитирующей ДНК щели на вершине пучка из трех спиралей. Будущие усилия по структурной характеристике этих детерминант еще больше расширят наше понимание того, как спиральный каркас Vpx/Vpr связывается и, таким образом, адаптируется к множеству neo -субстратных эпитопов.

    Наши крио-ЭМ реконструкции CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1, дополненные CLMS, также дают представление о структурной динамике сборок CRL4 до переноса убиквитина. Данные подтверждают ранее описанное вращательное движение ножки CRL4 в отсутствие ограничений, налагаемых кристаллической решеткой, создавая зону убиквитилирования вокруг субстратного рецептора, модифицированного Vpr mus (рис. 3 и 7А) [13, 15, 16, 19, 57]. Отсутствие плотности для недилированного домена CUL4 WHB и для каталитического домена ROC1 RING указывает на то, что эти дистальные элементы стебля очень подвижны и, вероятно, имеют множество ориентаций относительно каркаса CUL4 (рис. 7B).Эти наблюдения согласуются со структурным анализом CRL1 и CRL5, где недилирование CUL1/5 приводит к переориентации домена WHB кулина и высвобождению домена ROC1 RING из каркаса куллина одновременно со стимуляцией активности убиквитилирования [56]. ]. Более того, недавний крио-ЭМ анализ структуры CRL1 β-TRCP /IκBα продемонстрировал значительную подвижность прекаталитических доменов CUL1-NEDD8 WHB и ROC1 RING [73]. Такая гибкость, по-видимому, необходима для структурной организации множественных CRL1-зависимых процессов, в частности нуклеации каталитической сборки, включающей сложные белок-белковые взаимодействия между NEDD8, CUL1, заряженным убиквитином E2 и субстратным рецептором.Эта синергетическая сборка затем направляет С-конец убиквитина к субстрату лизина для праймирования убиквитином [73]. Соответственно, наши крио-ЭМ исследования могут указывать на то, что аналогичные принципы применимы к катализируемому CRL4 убиквитилированию. Однако, чтобы разгадать каталитическую архитектуру CRL4, должны быть проведены сложные процедуры перекрестного связывания, как в ссылке (73).

    Рис. 7. Схематическая иллюстрация структурной пластичности Vpr mus , модифицированного CRL4 DCAF1-CtD , и значение переноса убиквитина.

    ( A ) Вращение ножки CRL4 увеличивает пространство, доступное для каталитических элементов на дистальном конце ножки, образуя зону убиквитилирования вокруг ядра. ( B ) Модификация CUL4-WHB с помощью NEDD8 приводит к увеличению подвижности этих дистальных элементов стебля (CUL4-WHB, домен ROC1 RING) [56], дополнительно расширяя зону убиквитилирования и активируя формирование каталитической сборки для переноса убиквитина (см. также D ) [73]. ( C ) Гибкая привязка SAMHD1 к ядру с помощью Vpr mus помещает большую часть SAMHD1 в зону убиквитинирования и оптимизирует доступность поверхности. ( D ) Динамические процессы A C вместе создают многочисленные возможности для сборки каталитического механизма (CUL4-NEDD8 WHB, ROC1, убиквитин-(уби-)заряженный E2) на открытых боковых цепях лизина SAMHD1. Здесь три из этих возможностей показаны схематически. Таким образом, покрытие убиквитином на SAMHD1 максимизируется.

    Внутренняя подвижность элементов стебля CRL4 может способствовать размещению субстратов различных размеров и форм в зоне убиквитилирования CRL4 и может рационализировать широкий диапазон субстратов, доступных для убиквитилирования CRL4 через множественные рецепторы DCAF.Из-за селективного давления, направленного на противодействие ограничению SAMHD1 хозяина, ВИЧ-2 и некоторые SIV, среди других вирусов, воспользовались этой динамической архитектурой CRL4 путем модификации субстратного рецептора DCAF1 вспомогательными белками семейства Vpx/Vpr. Путем связывания либо SAMHD1-CtD, либо -NtD с DCAF1 и, таким образом, гибкого рекрутирования основной массы SAMHD1 доступность боковых цепей лизина как проксимальных, так и на глобулярных доменах SAMHD1 к каталитической сборке CRL4 может быть дополнительно улучшена (рис. 7С, Г).Это обеспечивает эффективное Vpx/Vpr-опосредованное праймирование SAMHD1, полиубиквитилирование и протеасомную деградацию для стимуляции репликации вируса. Кроме того, структурное понимание этого эволюционно оптимизированного, высокоспецифичного механизма деградации белка может дать информацию о позиционировании новых синтетических методов на основе CRL4 DCAF1 для направленной деградации белка, например. в виде химерных (PROTAC-) или соединений типа молекулярного клея, нацеленных на протеолиз [74, 75].

    Наконец, хотя современные схемы высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) способны контролировать репликацию ВИЧ-1 у инфицированных пациентов [76], они не могут уничтожить вирус из-за рецидива вируса после прекращения лечения и приводят к появлению резистентного вируса варианты [77].Соответственно, идентификация и ингибирование новых мишеней в дополнение к тем, которые уже охвачены ВААРТ, представляют большой интерес. В этом контексте вспомогательные белки ВИЧ долгое время рассматривались как перспективные мишени для лекарственных средств [78, 79]. Например, доклинические исследования, направленные на ингибирование Vif-опосредованной деградации APOBEC3, завершились выделением нескольких соединений, препятствующих репликации ВИЧ-1 [80–82]. Из-за беспорядочных взаимодействий с хозяином Vpr HIV-1 также считается привлекательной мишенью для антиретровирусных препаратов [83].Представленный здесь сравнительный структурный анализ взаимодействия Vpr/DCAF1-CtD может послужить основой для будущих усилий по разрушению этого интерфейса взаимодействия с малыми молекулами, чтобы сразу отменить все процессы деградации белка-хозяина, индуцированные Vpr, и максимизировать ингибирующий эффект на репликацию вируса.

    Методы

    Экспрессия и очистка белков

    Конструкции амплифицировали с помощью ПЦР из матриц кДНК и встраивали в указанные экспрессионные плазмиды с использованием стандартных методов рестрикционных ферментов (таблица S2).pAcGHLT-B-DDB1 (плазмида № 48638) и pET28-UBA1 (плазмида № 32534) были получены от Addgene. Плазмида коэкспрессии pOPC-UBA3-GST-APPBP1 и плазмида pGex6P2-UBC12 были получены от MRC-PPU Reagents and Services (клоны 32498, 3879). Убиквитин бычьих эритроцитов и рекомбинантный hsNEDD8 были приобретены у Sigma-Aldrich (U6253) и BostonBiochem (UL-812) соответственно. Точечные мутации вводили путем сайт-направленного мутагенеза с использованием KOD-полимеразы (Novagen). Все конструкции и варианты суммированы в таблице S3.

    Белки, экспрессированные из векторов pAcGHLT-B, pGex6P1/2, pOPC и pET49b, содержали N-концевую GST-His-метку; pHisSUMO – N-концевая His-SUMO-метка; pET28, pRSF-Duet-1 – N-концевая His-метка; pTri-Ex-6 – С-концевая His-метка. Конструкции в векторах pAcGHLT-B и pTri-Ex-6 экспрессировали в клетках Sf9, а конструкции в векторах pET28, pET49b, pGex6P1/2, pRSF-Duet-1 и pHisSUMO — в E. coli Rosetta 2(DE3).

    Рекомбинантные бакуловирусы ( Autographa californica nucleopolyhedrovirus клон C6) были получены, как описано ранее [84].Клетки Sf9 культивировали в среде Insect-XPRESS (Lonza) при 28°С в шейкере-инкубаторе Innova 42R (New Brunswick) при скорости встряхивания 180 об/мин. В типичном препарате 1 л клеток Sf9 при 3×10 6 клеток/мл коинфицировали 4 мл вируса DDB1 с высоким титром и 4 мл вируса DCAF1-CtD с высоким титром в течение 72 часов.

    Для типичной экспрессии E. coli Rosetta 2 (DE3) 2 л среды LB инокулировали 20 мл ночной культуры и выращивали в шейкере-инкубаторе Multitron HT (Infors) при 37°C, 150 об/мин до OD 600 достиг 0.7. В этот момент температуру снижали до 18°C, экспрессию белка индуцировали добавлением 0,2 мМ IPTG и культуры выращивали еще 20 часов. Во время совместной экспрессии CUL4 и ROC1 из pRSF-Duet перед индукцией в среду для выращивания добавляли 50 мкМ сульфата цинка. Клетки

    Sf9 осаждали центрифугированием при 1000 об/мин, 4°С в течение 30 мин с использованием центрифужного ротора JLA 9.1000 (Beckman). Клетки E. coli осаждали центрифугированием при 4000 об/мин, 4°С в течение 15 мин с использованием того же ротора.Осадок клеток ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, 0,5 мМ трис-(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP), мини-полные ингибиторы протеазы (1 таблетка на 50 мл) и 20 мМ имидазол (только для His-меченых белков). 100 мл лизирующего буфера использовали для ресуспендирования осадка из 1 л культуры Sf9 и 35 мл лизирующего буфера на осадок из 1 л культуры E. coli . Перед ресуспендированием осадков коэкспрессии CUL4/ROC1 рН буфера доводили до 8,5. Добавляли 5 мкл бензоназы (Merck) и клетки лизировали, пропуская суспензию не менее двух раз через Microfluidizer (Microfluidics).Лизаты осветляли центрифугированием при 48000 g в течение 45 мин при 4°С. Очистку белков проводили при 4°C на Äkta pure FPLC (GE) с использованием хроматографических колонок XK 16/20 (GE), содержащих 10 мл соответствующей аффинной смолы. GST-меченые белки были захвачены на глутатион-сефарозе (GSH-Sepharose FF, GE), промыты 250 мл промывочного буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 7,8, 500 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP). и элюировали тем же буфером с добавлением 20 мМ восстановленного глутатиона.Белки, меченные His, иммобилизовали на Ni-Sepharose HP (GE), промывали 250 мл промывочного буфера с добавлением 20 мМ имидазола и элюировали промывочным буфером, содержащим 0,3 М имидазол. Фракции элюента анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и доводили до 5 мл с помощью центрифужных фильтрующих устройств (Vivaspin). Если применимо, добавляли 100 мкг протеазы GST-3C или 50 мкг тромбина на мг общего белка, и образец инкубировали в течение 12 часов на льду для отщепления аффинных меток. В качестве второго этапа очистки выполняли гель-фильтрационную хроматографию (ГФ) на Äkta prime plus FPLC (GE) с колонками Superdex 200 16/600 (GE), уравновешенными в 10 мМ Tris-HCl, pH 7.8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ буфер TCEP, скорость потока 1 мл/мин. Для очистки комплекса CUL4/ROC1 рН всех буферов для очистки доводили до 8,5. Пиковые фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до прибл. 20 мг/мл, мгновенно замороженные в жидком азоте небольшими аликвотами и хранящиеся при температуре -80°C. Концентрации белков определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop (ND 1000, Peqlab) с использованием теоретических коэффициентов поглощения, рассчитанных на основе аминокислотной последовательности с помощью ProtParam на веб-сервере ExPASy [85].

    Аналитический гель-фильтрационный анализ

    Перед гель-фильтрационным анализом аффинные метки удаляли путем инкубации 30 мкг протеазы GST-3C с 6 мкМ каждого белкового компонента в объеме 150 мкл промывочного буфера с последующей инкубацией на льду в течение 12 ч. . Чтобы удалить расщепленную GST-метку и протеазу GST-3C, добавляли 20 мкл гранул GSH-Sepharose FF (GE) и образец вращали при 4 °C в течение одного часа. Гранулы GSH-сефарозы удаляли центрифугированием при 4°C, 3500 об/мин в течение 5 мин и 120 мкл супернатанта загружали на аналитическую колонку GF (Superdex 200 10/300 GL, GE), уравновешенную в 10 мМ Tris-HCl. рН 7.8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP, скорость потока 0,5 мл/мин. Фракции объемом 1 мл собирали и анализировали с помощью SDS-PAGE. Для следующих контрольных образцов 120 мкл очищенного белка наносили непосредственно на колонку GF, потому что не нужно было удалять метку очистки путем расщепления: SAMHD1, T4L-SAMHD1-CtD, SAMHD1-ΔCtD. Для этих образцов концентрация была доведена до 18 мкМ, 37 мкМ и 30 мкМ, соответственно, для учета более низкого коэффициента экстинкции этих выделенных белковых компонентов, чтобы обеспечить лучшую визуализацию пика элюирования. Колонку GF калибровали с использованием калибровочного набора для гель-фильтрации (GE) с высоким молекулярным весом (HMW) в соответствии с инструкциями производителя.

    In vitro анализов убиквитилирования

    Были приготовлены 160 мкл реакций, содержащих 0,5 мкМ субстрата (указанные конструкции SAMHD1, рис. S2), 0,125 мкМ DDB1/DCAF1-CtD, 0,125 мкМ prTTL-SUV-SUV-ROC1, 0,12MOC1, 0,12MOC1 мус (остатки 1–92), 0,25 мкМ UBCH5C, 15 мкМ убиквитина в 20 мМ трис-HCl, рН 7,8, 150 мМ NaCl, 2.5 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ АТФ. В контрольных реакциях некоторые компоненты были исключены, как показано на рис. S2. Был взят образец объемом 30 мкл для анализа SDS-PAGE (t=0). Реакции инициировали добавлением 0,05 мкМ UBA1, инкубировали при 37°C и через 1 мин, 2 мин, 5 мин и 15 мин отбирали 30 мкл образцов SDS-PAGE, сразу смешивали с 10 мкл буфера для образцов 4x SDS и кипятили при 95°С в течение 5 мин. Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE.

    Неддилирование CUL4/ROC1 in vitro

    Для начальных тестов неддилирования была подготовлена ​​200 мкл реакционная смесь, содержащая 8 мкМ CUL4/ROC1, 1. 8 мкМ UBC12, 30 мкМ NEDD8 в 50 мМ Tris-HCl pH 7,8, 150 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ АТФ. Для SDS-PAGE отбирали 2 образца по 30 мкл, один немедленно смешивали с 10 мкл 4x буфера для образцов SDS, другой инкубировали в течение 60 мин при 25°C. Реакцию инициировали добавлением 0,7 мкМ APPBP1/UBA3, инкубировали при 25°C, и через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 30 мин и 60 мин отбирали 30 мкл образцов SDS-PAGE, сразу же смешивали с 10 мкл 4x буфер для образца SDS и кипятят при 95°C в течение 5 мин. Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE.На основании этого теста объем реакции увеличили до 1 мл и инкубировали в течение 5 мин при 25°C. Реакцию гасили добавлением 5 мМ TCEP и немедленно загружали в колонку Superdex 200 16/600 GF (GE), уравновешенную 10 мМ Tris-HCl, pH 7,8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP при скорость потока 1 мл/мин. Пиковые фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до ~20 мг/мл, мгновенно замораживали в жидком азоте небольшими аликвотами и хранили при -80°C.

    Подготовка образцов для рентгеновской кристаллографии, кристаллизация, сбор данных и определение структуры

    Комплекс DDB1/DCAF1-CtD

    Кристаллы DDB1/DCAF1-CtD были выращены методом паровой диффузии висячей капли путем смешивания равных объемов (1 мкл) раствора DDB1/DCAF1-CtD в концентрации 10 мг/мл с резервуарным раствором, содержащим 100 мМ цитрата Tri-Na, pH 5.5, 18% ПЭГ 1000 и суспендируют над резервуаром объемом 500 мкл. Кристаллы росли в течение ночи при 18°С. Кристаллы подвергали криозащите в резервуарном растворе с добавлением 20% глицерина и криоохлаждению в жидком азоте. Набор данных с монокристалла был собран в Diamond Light Source (Didcot, Великобритания) при длине волны 0, Å. Данные обрабатывали с помощью XDS [86] (S1 Table), а структуру расшифровывали методом молекулярной замены с помощью программы MOLREP [87] и доступных структур DDB1 (PDB 3e0c) и DCAF1-CtD (PDB 4cc9) [50] в качестве поиска. модели.Итерационные циклы корректировки модели с помощью программы Coot [88] с последующим уточнением с помощью программы PHENIX [89] дали окончательное значение R/R свободных факторов 22,0%/27,9% (таблица S1). В модели 94,5 % остатков имеют двугранные углы остова в предпочтительной области графика Рамачандрана, остальные попадают в разрешенные области, и ни один из них не является выбросом. Детали сбора данных и уточнения статистики представлены в таблице S1. Координаты и структурные факторы депонированы в PDB под инвентарным номером 6zue.

    Комплекс DDB1/DCAF1-CtD/T4L-Vprmus (1-92)

    Комплекс DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus был собран путем инкубации очищенных DDB1/DCAF1-CtD и HisSUMO-T4L-Vpr mus (остатки 1-92), в молярном соотношении 1:1, в буфере, содержащем 50 мМ бис-трис-пропана, рН 8,5, 0,5 М NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP, содержащий 1 мг HRV- Протеаза 3C для удаления HisSUMO-tag. После инкубации на льду в течение 12 часов образец загружали в колонку Superdex 200 16/600 GF (GE) с колонкой 1 мл GSH-Sepharose FF (GE), подключенной в линию.Колонку уравновешивали 10 мМ бис-трис-пропана, рН 8,5, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2 и 0,5 мМ TCEP. Скорость потока через колонку составляла 1 мл/мин. Фракции GF анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 4,5 мг/мл.

    Кристаллы получали методом диффузии паров сидячей капли путем смешивания равных объемов (200 нл) белкового комплекса в концентрации 4,5 мг/мл и резервуарного раствора, содержащего 8-10% ПЭГ 4000 (вес/объем), 200 мМ MgCl 2 , 100 мМ HEPES-NaOH, pH 7.0-8,2. Объем резервуара составлял 75 мкл. Кристаллы вырастали после по меньшей мере 4 недель инкубации при 4°С. Кристаллы подвергали криозащите в резервуарном растворе с добавлением 20% глицерина и криоохлаждению в жидком азоте. Были собраны наборы данных с двух монокристаллов, сначала в BESSY II (Helmholtz-Zentrum Berlin, HZB) при длине волны 0,

    Å, а затем в ESRF (Гренобль) при длине волны 1 Å. Наборы данных обрабатывались отдельно с использованием XDS [86] и XDSAPP [90]. Структура расшифрована путем молекулярной замены с использованием исходного набора данных BESSY с помощью программы PHASER [91] и следующих структур в качестве поисковых моделей: DDB1/DCAF1-CtD (настоящая работа) и вариант T4L E11H (PDB 1qt6) [92]. ].После оптимизации исходной модели и уточнения по сравнению с набором данных ESRF с более высоким разрешением, Vpr mus был помещен вручную в плотность, используя ЯМР-модель Vpr HIV-1 (PDB 1m8l) [93] в качестве ориентира. Итерационные циклы настройки модели с помощью программы Coot [88] с последующим уточнением с помощью программы PHENIX [89] дали окончательное R/R свободных факторов 21,61%/26,05%. В модели 95,1 % остатков имеют двугранные углы остова в предпочтительной области графика Рамачандрана, остальные попадают в разрешенные области, и ни один из них не является выбросом.Детали сбора данных и уточнения статистики представлены в таблице S1. Координаты и структурные факторы депонированы в PDB под инвентарным номером 6zx9.

    Крио-ЭМ подготовка проб и сбор данных

    Сборка комплекса

    Очищенные CUL4-NEDD8/ROC1, DDB1/DCAF1-CtD, GST-Vpr mus и SAMHD1 макака-резуса, 1 мкМ каждого, инкубировали в конечном объеме 1 мл 10 мМ Tris-HCl pH 7,8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP, дополненный 1 мг протеазы GST-3C. После инкубации на льду в течение 12 часов образец загружали на колонку Superdex 200 16/600 GF (GE), уравновешенную тем же буфером со скоростью 1 мл/мин, с колонкой GSH-Sepharose FF (GE) объемом 1 мл, соединенной в линия. Фракции GF анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 2,8 мг/мл.

    Подготовка сетки

    3,5 мкл белкового раствора, содержащего 0,05 мкМ CUL4-NEDD8/ROC1/DDB1/DCAF1-CtD/Vpr мус /SAMHD1 и 0,25 мкМ конъюгата UBCH5C-убиквитин (S4 A, B Рис.), наносили на Перфорированная углеродная сетка Quantifoil R2/4 Cu/Rh 300 меш (Quantifoil Micro Tools GmbH), покрытая дополнительной тонкой углеродной пленкой в ​​качестве подложки для образца и окрашенная 2% уранилацетатом для начальной характеристики.Для крио-ЭМ свежую углеродную сетку Quantifoil R1.2/1.3 Cu с отверстием 400 меш (Quantifoil Micro Tools GmbH) подвергали тлеющему разряду в течение 30 с с использованием плазменной очистки Harrick с техническим воздухом при 0,3 мбар и 7 Вт. Белок 3,5 мкл. раствор, содержащий 0,4 мкМ комплекса CUL4-NEDD8/ROC1/DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus /SAMHD1 и 2 мкМ конъюгата UBCH5C-убиквитин, наносили на сетку, инкубировали в течение 45 с, блотировали с помощью устройства Vitrobot Mark II (FEI , Thermo Fisher Scientific) в течение 1-2 с при температуре 8°C и влажности 80% и погружали в жидкий этан.Сетки хранились в жидком азоте до визуализации.

    Сбор данных крио-ЭМ

    Исходные наборы данных отрицательного окрашивания и крио-ЭМ были собраны автоматически для контроля качества образцов и реконструкции с низким разрешением на крио-ЭМ Tecnai Spirit 120 кВ (FEI, Thermo Fisher Scientific), оснащенном F416 CMOS камеры (TVIPS) с использованием Leginon [94, 95]. Затем изображения частиц были проанализированы с помощью 2D-классификации и первоначальной реконструкции модели с использованием SPHIRE [96], cisTEM [97] и Relion 3.07 [98]. Эти данные выявили наличие комплексов, содержащих как DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus (ядро), так и CUL4/ROC1 (стебель). Данные высокого разрешения были собраны на крио-ЭМ Tecnai Polara 300 кВ (FEI, Thermo Fisher Scientific), оснащенном детектором прямых электронов K2summit (Gatan) при номинальном увеличении 31000x с размером пикселя 0,625 Å/пиксель на масштаб объекта. Всего было собрано 3644 видеостека в режиме суперразрешения с использованием Leginon [94, 95] со следующими параметрами: диапазон расфокусировки 0.5-3,0 мкм, 40 кадров на фильм, время экспозиции 10 с, доза электронов 1,25 е/Å 2 /с и кумулятивная доза 50 е/Å 2 на фильм.

    Вычислительный анализ крио-ЭМ

    Видеоролики были совмещены и взвешены по дозе с использованием MotionCor2 [99], а начальная оценка функции передачи контраста (CTF) была выполнена с помощью пакета CTTFind4 [100]. Полученные микрофотографии были проверены вручную, чтобы исключить изображения со значительными загрязнениями (как правило, большими агрегатами белка или загрязнениями льда) или артефактами сетки.Спектры мощности проверялись вручную, чтобы исключить изображения с астигматическими, слабыми или плохо определенными спектрами. После этих этапов контроля качества набор данных включал 2322 микрофотографии (63% от общего числа). На этом этапе набор данных был выбран дважды и обработан отдельно, чтобы получить реконструкции состояний-1, -2 и -3 (анализ 1) и ядра (анализ 2).

    Для анализа 1 положения частиц были определены с использованием программы гауссовского пикинга cisTEMs, в результате чего было получено в общей сложности 959 155 изображений частиц.После двух раундов 2D-классификации для дальнейшей обработки было отобрано 227 529 изображений частиц (S4C, D Fig). Используя эти данные, была создана исходная модель с использованием Relion 3.07. Полученная карта дала сильный сигнал для ядра, но только для фрагментированной плотности стебля, что указывает на большую неоднородность области стебля в наборе данных. Эта большая степень композиционной (+/- ножка) и конформационной неоднородности (движение ножки относительно ядра) усложняла классификацию.Соответственно, выравнивание и классификация проводились одновременно. Первая цель состояла в том, чтобы разделить набор данных на три категории: «мусор», «ядро» и «ядро+стебель».

    Поэтому ножка была удалена из исходной модели с помощью инструмента «Ластик» в Chimera [101]. Эта основная карта использовалась в качестве исходной модели для 3D-классификации уровня 1 с Relion 3.07 с уменьшенным размером пикселя 2,5 Å/пиксель. Использовались следующие параметры: количество классов K=6, T=10, глобальный шаг поиска=7.5°, количество итераций = 25. Классификация дала два класса, содержащих стебель (классы 3 и 5, содержащие 23% и 22% изображений частиц соответственно) (рис. S4D). Эти частицы были объединены и направлены на 3D-классификацию уровня 2 с использованием следующих параметров: количество классов K=6, T=10, глобальный шаг поиска=7,5°, количество итераций=25. Три из этих классов дали карты среднего разрешения с интерпретируемыми функциями (состояния-1, -2 и -3, рис. S4D). Эти три класса были уточнены по отдельности с помощью 3D-автоматического уточнения в Relion 3. 07, в результате чего были получены карты с разрешением от 7,8 Å до 8,9 Å (рис. S4E-G).

    Для анализа 2 положения частиц определяли с помощью сопоставления шаблона с отфильтрованной картой, включающей ядро ​​и основу, с использованием программного обеспечения Gautomatch (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/research/locally-developed- программное обеспечение/чжан-программное обеспечение/). Было найдено 712 485 изображений частиц, извлеченных с помощью Relion 3.07 и впоследствии 2D-классифицированных с помощью cryoSPARC [102], в результате чего после отбора было получено 505 342 изображения частиц (S5A, B Fig).Эти изображения частиц были разделены на два подмножества одинакового размера, и для уменьшения вычислительной нагрузки была выполнена трехмерная классификация уровня 1 с использованием Relion 3.07 для обоих из них (рис. S5B). Были использованы следующие параметры: начальная модель = «ядро», количество классов K = 4, T = 10, глобальный шаг поиска = 7,5 °, количество итераций = 25, размер пикселя 3,75 Å/px. Из них были отобраны те, у которых есть и сердцевина, и стебель. Классы, изображающие одинаковую ориентацию стебля относительно ядра, были объединены и направлены на уровень 2 в виде трех разных субпопуляций, содержащих 143 172, 193 059 и 167 666 изображений частиц соответственно (рис. S5B).

    Для уровня 2 каждая субпопуляция была классифицирована отдельно по 4 классам. Из этих 12 классов все изображения частиц, демонстрирующие четко определенные плотности ядра и стебля, были объединены и помечены как «ядро + стебель», в результате чего в общей сложности было получено 310 801 изображение частиц. 193 096 изображений частиц, представляющих классы, содержащие только ядро, были объединены и помечены как «ядро» (рис. S5B)

    Для уровня 3 подмножество частиц «ядро» было разделено на 4 класса, что привело к неинтерпретируемым реконструкциям без признаков среднего или высокого разрешения.Подмножество «ядро + стебель» было разделено на 6 классов, 5 классов содержали как стебель, так и сердцевину (рис. S5B), а один класс состоял только из ядра со связанным Vpr mus . 5 классов со стеблем показали ориентацию стебля, аналогичную той, что была получена в результате анализа 1 (см. выше, S4 рис.), но были уточнены по отдельности до более низкого разрешения, как в анализе 1, и были отброшены. Однако индивидуальное уточнение класса уровня 3 только для ядра дало реконструкцию 7,3 Å (S5C, рис. D).

    Молекулярная визуализация, подгонка твердого тела, трехмерное структурное выравнивание, анализ вращения и интерфейса

    Карты плотности и атомные модели были визуализированы с помощью Coot [88], PyMOL (Schrödinger) и UCSF Chimera [101].Подгонка жесткого тела и структурное выравнивание выполнялись с использованием программы UCSF Chimera [101]. Углы поворота между крайними положениями домена DDB1 BPB измеряли с помощью сервера DynDom [103] (http://dyndom.cmp.uea.ac.uk/dyndom/runDyndom.jsp). Молекулярные интерфейсы анализировали с помощью сервера EBI PDBePISA [104] (https://www. ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver).

    Масс-спектрометрия с перекрестными связями (CLMS)

    Сборка комплекса

    Очищенные CUL4/ROC1, DDB1/DCAF1-CtD, GST-Vpr mus и SAMHD1 макака-резуса, по 1 мкМ каждого, инкубировали в объеме 3 мл буфер, содержащий 10 мМ HEPES pH 7.8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP, дополненный 1 мг протеазы GST-3C. После инкубации на льду в течение 12 ч образец наносили на колонку Superdex 200 16/600 GF (GE), уравновешенную тем же буфером, со скоростью потока 1 мл/мин с колонкой 1 мл GSH-Sepharose FF ( GE) подключены в линию. Фракции GF анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 6 мг/мл.

    Photo-Crosslinking

    Сшивающий агент сульфо-SDA (сульфосукцинимидил-4,4′-азипентаноат) (Thermo Scientific) растворяли в сшивающем буфере (10 мМ HEPES, pH 7.8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, 0,5 мМ TCEP) до 100 мМ перед использованием. Стадию мечения проводили путем инкубации аликвот по 18 мкг комплекса в концентрации 1 мг/мл с добавлением 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 мМ сульфо-SDA, соответственно, в течение часа. Затем образцы облучали УФ-светом с длиной волны 365 нм для образования поперечных связей в течение 20 мин и гасили 50 мМ Nh5HCO3 в течение 20 мин. Все шаги выполнялись на льду. Продукты реакции разделяли на геле Novex Bis-Tris 4–12% SDS-PAGE (Life Technologies). Полосу геля, соответствующую сшитому комплексу, вырезали и расщепляли трипсином (Thermo Scientific Pierce) [107], а полученные триптические пептиды экстрагировали и обессоливали с помощью C18 StageTips [108].Элюированные пептиды фракционировали на колонке Superdex Peptide 3,2/300 (GE Healthcare) при скорости потока 10 мкл/мин с использованием 30% (об./об.) ацетонитрила и 0,1% (об./об.) трифторуксусной кислоты в качестве подвижной фазы. Фракции по 50 мкл собирали и сушили в вакууме.

    Получение методом CLMS

    Образцы для анализа ресуспендировали в 0,1% (об./об.) муравьиной кислоте, 3,2% (об./об.) ацетонитриле. Анализ ЖХ-МС/МС выполняли на масс-спектрометре Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Fisher), соединенном в режиме реального времени с системой ВЭЖХ Ultimate 3000 RSLCnano (Dionex, Thermo Fisher). Образцы разделяли на колонке EASY-Spray длиной 50 см (Thermo Fisher). Подвижная фаза А состояла из 0,1% (об./об.) муравьиной кислоты, а подвижная фаза В состояла из 80% (об./об.) ацетонитрила с 0,1% (об./об.) муравьиной кислоты. Скорость потока составляла 0,3 мкл/мин с использованием градиентов, оптимизированных для каждой хроматографической фракции автономного фракционирования, в диапазоне от 2% подвижной фазы B до 55% подвижной фазы B в течение 90 минут. Данные МС были получены в режиме зависимости от данных с использованием настройки максимальной скорости с временем цикла 3 с. Для каждого цикла с помощью Orbitrap записывали полный сканирующий масс-спектр с разрешением 120 000 в диапазоне от 400 до 1 500 м/з.Ионы с исходным зарядовым состоянием от 3+ до 7+ были выделены и фрагментированы. Фрагментация аналита была достигнута с помощью высокоэнергетической столкновительной диссоциации (HCD) [109], после чего спектры фрагментации были записаны в Orbitrap с разрешением 50 000. Динамическое исключение было включено с подсчетом одиночных повторов и длительностью исключения 60 с.

    Обработка CLMS

    Повторная калибровка предшественника m/z была проведена на основе высокодостоверных (<1% доля ложных открытий (FDR)) линейных идентификаций пептидов.Повторно откалиброванные списки пиков сравнивали с последовательностями и обратными последовательностями (в качестве ловушек) перекрестно-сшитых пептидов с использованием пакета программного обеспечения Xi (v.1.7.5.1) для идентификации [110]. Окончательные списки перекрестных связей были составлены с использованием идентифицированных кандидатов, отфильтрованных до <1% FDR на уровне связи с xiFDR v.2.0 [111], обеспечивающим минимальное покрытие последовательностей 20% и 4 наблюдаемых фрагмента на пептид.

    Анализ CLMS

    Для выборки доступного объема взаимодействия SAMHD1-CtD, согласующегося с данными CLMS, модель SAMHD1 была создана с использованием I-TASSER [112].Из модели был извлечен SAMHD1-CtD со случайной конфигурацией катушки. Чтобы отобразить все перекрестные связи, недостающие петли в сложной структуре были сгенерированы с помощью MODELLER [113]. Затем поиск объема взаимодействия был отправлен на веб-сервер DisVis [61] с допустимым расстоянием от 1,5 Å до 22 Å для каждого ограничения с использованием опции «полное сканирование». Интервал выборки вращения был установлен на 9,72 °, а шаг вокселя сетки — на 1 Å. Доступный объем взаимодействия визуализировали с помощью UCSF Chimera [101].

    Спектроскопия кругового дихроизма (CD)

    Для оценки вторичной структуры Vpr mus , меченного GST, и двойных мутантов R15E/R75E и W29A/A66W была проведена спектроскопия CD. Образцы белка подвергали диализу в течение ночи при 4°C против буфера CD (100 мМ NaF, 10 мМ K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 смесь, pH 8,5), а затем концентрацию белка доводили до 0,2 мг. /мл. Для каждого образца регистрировали три повторных спектра КД в 1.Шаг 0 нм в диапазоне 190-260 нм. Измерения проводились в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 0,05 см (Hellma, Мюльхайм, Германия) при 20°C на спектрополяриметре Chirascan (Applied Photophysics, Лондон, Великобритания). Эталонный спектр буфера CD вычитали из усредненного спектра образца белка. Измеренная эллиптичность в миллиградусах (m°) была преобразована в молярную эллиптичность [Θ] в соответствии с уравнением Θ=m°*M/(10xLxC), где M — средняя молекулярная масса белка, L — длина пути измерительной ячейки, а C — молярная концентрация белка.Молярную эллиптичность строили в зависимости от длины волны с использованием SigmaPlot версии 14.0 (Systat Software Inc., Сан-Хосе, Калифорния, США).

    Доступность данных

    Координаты и структурные факторы для кристаллических структур были депонированы в Банке белковых данных (PDB) с кодами доступа 6ZUE (DDB1/DCAF1-CtD) и 6ZX9 (DDB1/DCAF1-CtD/T4L-Vpr мус 1-92). Крио-ЭМ-реконструкции были депонированы в банке данных электронной микроскопии (EMDB) с регистрационными кодами EMD-10611 (основной), EMD-10612 (конформационное состояние-1), EMD-10613 (состояние-2) и EMD-10614 ( состояние-3).Данные CLMS депонированы в базе данных PRIDE [114] под кодом доступа PXD020453, пароль рецензента fCrQG2u8.

    Благодарности

    Мы благодарим MPI-MG за предоставление доступа к инструментам TEM группы обслуживания микроскопии и крио-ЭМ. Мы благодарим доктора Манфреда Вайса и научный персонал BESSY-MX (Макромолекулярная рентгеновская кристаллография)/Helmholtz Zentrum Berlin für Materialien und Energie на каналах BL14.1, BL14.2 и BL14.3, управляемых Joint Berlin MX. — Лаборатория на кольце хранения электронов BESSY II (Берлин-Адлерсхоф, Германия), а также научный персонал ESRF (Гренобль, Франция) на каналах ID30A-3, ID30B, ID23-1, ID23-2 и ID29 для непрерывного служба поддержки.Мы благодарим компанию Diamond Light Source (Didcot, Великобритания) за доступ и поддержку синхротронного луча I04 и крио-ЭМ-оборудования в Национальном центре электронной биовизуализации Великобритании (eBIC). Кроме того, авторы признательны Северогерманскому альянсу суперкомпьютеров (HLRN) и кластеру высокопроизводительных вычислений для исследований Берлинского института здравоохранения за предоставление ресурсов для высокопроизводительных вычислений. Мы благодарны профессору Удо Хайнеманну и Цзяньхуэй Вану (Max-Delbrück-Centrum, Берлин, Германия) за доступ и помощь во время спектроскопии КД.Плазмида pHisSUMO была щедрым подарком доктора Евангелоса Христодулу (Институт Фрэнсиса Крика, Лондон, Великобритания). Матрица кДНК SAMHD1 макаки-резуса была щедрым подарком профессора Майкла Эмермана (Центр исследования рака им. Фреда Хатчинсона, Сиэтл, США). Рекомбинантная бакмида BAC10:1629KO была щедрым подарком профессора Яна Джонса (Университет Рединга, Великобритания). pAcGHLT-B-DDB1 был подарен профессором Нин Чжэн (плазмида Addgene 48638). pET28-mE1 был подарен профессором Хорхе Эдуардо Азеведо (плазмида Addgene 32534).

    Границы | Молекулярные механизмы повреждения при ВИЧ-ассоциированной нефропатии

    Эпидемиология и клиническая картина ВИЧ-ассоциированной нефропатии

    ВИЧ-ассоциированная нефропатия (HIVAN) была впервые описана в начале эпидемии ВИЧ в городских центрах США, обслуживающих большое количество ВИЧ-позитивных лиц африканского происхождения. В начале 1990-х годов ВИЧАН был наиболее быстро растущей причиной терминальной почечной недостаточности в США, однако широкое использование комбинированной антиретровирусной терапии (кАРТ), помимо заметного снижения смертности и прогрессирования заболевания до СПИДа, привело к заметному снижение заболеваемости классической ВИЧАН (1).Хотя заболеваемость терминальной почечной недостаточностью, связанной с ВИЧАН, снизилась с момента введения кАРВТ, она не снизилась так резко, как смертность или прогрессирование до СПИДа (2). Поскольку фенотип ВИЧАН заметно ослабляется под действием кАРВТ (1, 3), что приводит к гораздо более низким уровням протеинурии и более медленному прогрессированию тяжелой ХБП/ХПН (уменьшает вероятность биопсии почки), а Система данных о почках США больше не собирает данные относительно ВИЧ-серопозитивного статуса трудно достоверно оценить текущую заболеваемость/распространенность ВИЧАН.

    Пациенты с классической ВИЧАН имеют быстро прогрессирующую почечную недостаточность в сочетании с тяжелой протеинурией, и у большинства из них имеется поздняя стадия ВИЧ/СПИДа с числом CD4 <200 клеток/мм 3 . У этих пациентов обычно выявляются увеличенные гиперэхогенные почки на УЗИ со слабым осадком мочи (4, 5). Эта классическая картина редко встречается у пациентов, получающих кАРТ. Не существует серологических тестов, которые точно предсказывают наличие ВИЧАН, и поскольку ВИЧ-положительные пациенты подвергаются повышенному риску сопутствующих заболеваний, которые увеличивают риск заболевания почек, включая сахарный диабет и инфекцию гепатита С, ВИЧАН может быть окончательно диагностирован только с помощью биопсии почки.

    Имеются сообщения об отдельных случаях ВИЧАН у ВИЧ-2-положительных пациентов, но частота заболеваний почек на фоне ВИЧ-2-инфекции неизвестна (6). Хотя механизм, с помощью которого ВИЧ-2 вызывает заболевание почек, не изучался, поскольку геном ВИЧ-2 кодирует большинство тех же генов, что и ВИЧ-1, вполне вероятно, что патогенез ВИЧАН, возникающей при ВИЧ-1 и ВИЧ-2 -положительные пациенты аналогичны (7).

    Гистопатология

    ВИЧАН характеризуется наличием ФСГС и чаще всего ассоциируется с коллапсирующим вариантом (8). Часто присутствует пролиферация и гипертрофия вышележащих гломерулярных эпителиальных клеток, что может привести к появлению псевдолулулуний [рис. 1, (9)].

    Рисунок 1 . Периодическая биопсия почки, окрашенная кислотой по Шиффу, у пациента с ВИЧАН, демонстрирующая коллапс клубочка с фокальным глобальным склерозом и покрывающим псевдополумесяцем, состоящим из пролиферирующих гломерулярных эпителиальных клеток. Также имеется выраженная канальцевая атрофия и интерстициальный фиброз.

    Тубулоинтерстициальное заболевание является важным компонентом гистопатологии ВИЧАН и может затмевать тяжесть гломерулярного повреждения.Классические находки включают расширение канальцев в «микрокисты» (как минимум в три раза больше диаметра нормальных соседних канальцев), а также интерстициальный фиброз и воспаление (8).

    Специфических результатов иммунофлуоресценции при ВИЧАН нет, однако, поскольку у этих пациентов часто отмечаются повышенные уровни иммуноглобулинов в плазме и сопутствующие инфекции, могут присутствовать различное количество иммуноглобулинов и/или комплемента, и, если они выражены, это может отражать наличие наложенного иммунного комплекса. болезнь.Электронная микроскопия выявляет сглаживание ножки подоцита, нормальную толщину базальной мембраны, отсутствие иммунных отложений и наличие тубулоретикулярных включений эндотелиальных клеток, что, вероятно, отражает высокий уровень циркулирующего интерферона, присутствующий у пациентов с ВИЧАН (8).

    Инфекция почечных эпителиальных клеток ВИЧ

    ВИЧ может инфицировать эпителиальные клетки почечных канальцев (RTEc), подоциты и париетальные эпителиальные клетки, и эта инфекция не является специфичной для ВИЧАН, но также встречается у пациентов с другими формами заболевания почек, включая ВИЧ-позитивных пациентов с диабетической болезнью почек (10, 11).Поскольку клетки почечного эпителия обычно не экспрессируют CD4, первичный рецептор ВИЧ-1, или корецепторы CCR5 и CXCR4 (12), механизмы возникновения инфекции остаются не до конца изученными. Рэй и др. сообщили, что бесклеточные клинические вирусные изоляты ВИЧ способны инфицировать RTEc человека посредством CD4-независимого механизма и что ВИЧ-инфицированные мононуклеары способны опосредовать прямой межклеточный перенос ВИЧ на RTEc (11).

    Совсем недавно исследователи продемонстрировали, что перенос ВИЧ непосредственно из инфицированных лимфоцитов в RTEc был заметно более эффективным, чем заражение бесклеточным вирусом, и что перенос вируса между клетками не требует экспрессии CD4 на клетках-мишенях или белка оболочки ВИЧ (Env). и частично опосредуется протеогликанами гепарансульфата (13).Важно отметить, что дальнейшие исследования показали, что инфицированный RTEc может также передавать ВИЧ неинфицированным первичным Т-лимфоцитам, предполагая, что инфицированный RTEc может служить вирусным резервуаром, способным инфицировать лимфоциты (14). Эти наблюдения имеют важное значение, выходящее за рамки патогенеза ВИЧАН, поскольку они демонстрируют, что терапия, направленная на полное излечение ВИЧ-инфекции, должна включать стратегии по устранению ВИЧ-инфекции в почках.

    Инфекция клеток почечного эпителия также является важной проблемой в контексте трансплантации почки, поскольку недавнее исследование с участием 19 ВИЧ-позитивных пациентов, которым были пересажены ВИЧ-отрицательные почечные аллотрансплантаты, показало, что 13 аллотрансплантатов имели обнаруживаемую РНК ВИЧ в подоцитах и/или RTEc, несмотря на неопределяемую вирусную РНК в плазме.Более того, у пациентов с инфицированными почками было большее повреждение подоцитов и RTEc, а также более быстрая потеря функции почек (15).

    Недавнее исследование выявило новый механизм, с помощью которого ВИЧ-1 инфицирует подоциты человека (16). Подоциты, выделенные от детей с ВИЧАН, поддерживали низкий уровень продуктивной инфекции при воздействии бесклеточного вируса. Способность бесклеточного ВИЧ-1 инфицировать эти подоциты зависела от присутствия гена оболочки ВИЧ ( env ) и протеогликанов клеточной поверхности.Экспрессия трансмембранного TNFα способствует инфицированию ВИЧ и последующей интеграции в геномную ДНК. Роль переноса ВИЧ-1 из инфицированных мононуклеарных клеток в подоциты в этом исследовании не изучалась.

    В почечном эпителии также могут содержаться вирусные штаммы, отличающиеся от таковых в крови того же пациента. В одном исследовании исследователи использовали микродиссекцию с лазерным захватом для выделения ДНК из RTEc в биоптатах почек пациентов с ВИЧАН. Анализ последовательностей ВИЧ, амплифицированных из этой ДНК, продемонстрировал разнообразие последовательностей вируса env , что свидетельствует о продолжающейся репликации и эволюции вируса.Кроме того, сравнение последовательностей, полученных из почек, с последовательностями, амплифицированными из крови, показало, что вирусные последовательности, полученные из почек и крови, кластеризуются отдельно, что позволяет предположить, что почечный эпителий представляет собой отдельный вирусный компартмент, который может содержать уникальные вирусные квазивиды (17). Недавняя работа Блази и др. продемонстрировала аналогичные результаты с использованием образцов мочи. Они обнаружили, что у 12 из 24 пациентов с РНК ВИЧ, обнаруживаемой в плазме, также был обнаружен вирус в моче. Анализ последовательностей вируса env из крови и мочи показал, что последовательности, полученные из мочи, сгруппированы отдельно от последовательностей, полученных из крови (18).

    Исследования на макаках продемонстрировали, что способность клонов химерного вируса иммунодефицита обезьян и человека (SHIV) вызывать повреждение клубочков и канальцев значительно различается, что убедительно свидетельствует о том, что изменчивость вирусной последовательности является важной детерминантой заболевания почек (19). Неизвестно, содержат ли почки пациентов квазивиды с отчетливыми вариациями в генах ВИЧ, которые опосредуют повреждение почек или изменяют ответ на КАРТ. Могут ли гломерулярные эпителиальные клетки служить резервуаром вируса, также еще предстоит определить.

    Патомеханизмы ВИЧАН

    Роль генов ВИЧ в возникновении ВИЧАН

    Геном ВИЧ-1 кодирует 9 генов (рис. 2). Многочисленные модели in vitro и животных использовались для изучения механизмов, с помощью которых вирусная инфекция клеток почечного эпителия может привести к ВИЧАН. Наиболее часто используемая модель («Tg26») является трансгенной для провируса ВИЧ, в котором отсутствуют гены gag и pol . У этих мышей развивается тяжелая протеинурия, прогрессирующая почечная недостаточность и гистологическое повреждение почек, что близко моделирует ВИЧАН (20).Поскольку gag и pol кодируют основные структурные и ферментативные вирусные белки, эти мыши не продуцируют вирус, тем самым демонстрируя, что репликация вируса не является необходимой для фенотипа HIVAN. Было создано множество моделей трансгенных грызунов, экспрессирующих различные гены ВИЧ с использованием разных промоторов, и эти исследования показывают, что экспрессии nef и/или vpr достаточно для создания полного фенотипа ВИЧАН, а остальные гены не нужны для Фенотип ВИЧАН у грызунов (21).

    Рисунок 2 . Схематическая диаграмма генома ВИЧ-1.

    Nef представляет собой миристоилированный белок массой 27–34 кД, играющий важную роль в жизненном цикле ВИЧ. Nef способствует вирусной транскрипции и активации Т-клеток, помогая инфицированным клеткам избежать иммунного надзора за счет снижения экспрессии на клеточной поверхности нескольких рецепторов, включая CD4, CXCR4, CCR5 и главный комплекс гистосовместимости класса I (MHC-I) (22). Nef также оказывает множество эффектов на передачу клеточных сигналов, включая активацию киназ семейства Src (23).

    Vpr представляет собой белок с молекулярной массой 14 кДа, который важен для переноса в ядро ​​преинтеграционных комплексов ВИЧ. Vpr также оказывает несколько других важных эффектов на инфицированные клетки, включая остановку клеточного цикла в фазе G2/M, и является важным медиатором ВИЧ-индуцированного повреждения и смерти (24).

    Tat имеет решающее значение для трансактивации транскрипции ВИЧ в клетках человека, но менее активен в мышиных клетках из-за отсутствия циклина T1 в мышином геноме (25), что может объяснить, почему Tat не играет важной роли в мышиных моделях HIVAN ( 26).Тем не менее, исследований in vitro с использованием клеток человека позволяют предположить, что Tat может способствовать повреждению клубочков при ВИЧАН, частично благодаря его способности активировать провоспалительные цитокины (27, 28).

    Механизмы повреждения клубочков

    Нарушение регуляции клеточного цикла и дедифференцировка

    В ходе развития клубочков подоциты претерпевают пролиферацию и созревание посредством тщательно контролируемых программ развития, в результате чего образуются зрелые подоциты, которые терминально дифференцированы и неспособны к пролиферации (29).Нарушение регуляции клеточного цикла и аномальный повторный вход в клеточный цикл подоцитов являются отличительной чертой патогенеза ВИЧАН. Давно известно, что при ВИЧАН маркер пролиферации Ki67 экспрессируется в подоцитах, покрывающих гломерулярные капилляры, а также в клетках, содержащих псевдополулуния, окружающие гломерулярные пучки в биоптатах ВИЧАН и у ВИЧ-трансгенных мышей (9, 30). Хотя наиболее ранние работы в этой области идентифицировали эти клетки как подоциты, более поздние исследования предполагают, что некоторые или все клетки, содержащие псевдополумесяцы в ВИЧАН и коллапсирующих ФСГС без ВИЧАН, могут быть париетальными эпителиальными клетками (ПЭК) (31).Эти противоречивые результаты могут быть объяснены последующими исследованиями, демонстрирующими, что париетальные эпителиальные клетки могут экспрессировать гены подоцитов на низких уровнях (32), и исследованиями на мышах, показывающими, что PECs могут рекрутироваться на гломерулярные пучки в условиях гломерулярного повреждения (33, 34).

    Ингибиторы циклинзависимой киназы (CDK) p27 и p57 в высокой степени экспрессируются в подоцитах и ​​помогают поддерживать их в состоянии покоя, ингибируя активацию CDK (35). p27 и p57 подавляются в подоцитах в биоптатах HIVAN, тем самым позволяя CDK активироваться и вступать в клеточный цикл.Кроме того, Nef индуцирует активацию киназ семейства Src в подоцитах, что впоследствии приводит к активации Stat3 и MAPK-индуцированной пролиферации и дедифференцировки (36). Блокирование этих путей предотвращает ВИЧ-индуцированную пролиферацию и/или дедифференцировку подоцитов и восстанавливает экспрессию ключевых белков подоцитов, включая синаптоподин и WT-1 (36–38). Пути передачи сигналов Notch также активируются при HIVAN, и ингибирование передачи сигналов Notch с помощью ингибитора гамма-секретазы предотвращает пролиферацию подоцитов, индуцированную Nef и Tat in vitro (39).Другие сигнальные пути, участвующие в патогенезе пролиферации и/или дедифференцировки подоцитов при ВИЧАН, включают передачу сигналов рецептора ретиноевой кислоты (40), мишень рапамицина у млекопитающих (mTOR) (41) и факторы, подобные Круппелю (42, 43).

    Функция подоцитов сильно зависит от поддержания сложного и динамичного цитоскелета. При ВИЧАН широко распространено сглаживание отростков стопы, что частично связано с нарушением регуляции цитоскелета. Активация киназы Src экспрессией гена ВИЧ приводит к активации Rac1 и ингибированию RhoA, что приводит к потере образования актиновых стрессовых волокон (44).Недавно было показано, что HIV Tat способствует опосредованной фактором роста фибробластов-2 дисрегуляции MAPK и RhoA в подоцитах человека in vitro (28). Более того, экспрессия генов ВИЧ также снижает экспрессию генов подоцитов, таких как синаптоподин, которые являются важными медиаторами целостности цитоскелета (45, 46).

    Клеточная травма и смерть

    Несколько исследований выявили механизмы гибели подоцитов, вызванной ВИЧ. Поскольку подоциты являются терминально дифференцированными клетками, аберрантное повторное вхождение подоцитов в клеточный цикл может привести к митотической катастрофе (47).Экспрессия Nef в ВИЧ-инфицированных гломерулярных эпителиальных клетках может индуцировать гибель подоцитов с помощью этого механизма, одновременно индуцируя пролиферацию париетальных эпителиальных клеток в попытке заменить подоциты. Многие гены подоцитов не регулируются ВИЧ-инфекцией in vitro и в моделях на животных, а гены с вероятной ролью в вызванной ВИЧ гибели подоцитов включают APOL1 (обсуждается ниже) (48–50), Fas (51), KLF6 (52) , p53 (53) и p66ShcA (54), инфламмасома NLRP3 (55).

    В эпоху до введения КАРТ небольшие клинические исследования показали, что лечение ингибиторами АПФ улучшает почечные исходы при ВИЧАН (56, 57).Несколько исследований также продемонстрировали, что ингибиторы АПФ и блокаторы рецепторов ангиотензина (БРА) также предотвращают повреждение почек у трансгенных мышей с ВИЧ (58, 59). Интересно, что защитные эффекты БРА у ВИЧ-трансгенных мышей, по-видимому, не зависят от блокады рецептора ангиотензина II типа 1 на подоцитах (60).

    Нарушение регуляции межклеточной и межклеточной адгезии также способствует повреждению клубочков при ВИЧАН. Sidekick-1 (Sdk-1) представляет собой белок семейства трансмембранных иммуноглобулинов, который опосредует межклеточную адгезию.Экспрессия ВИЧ увеличивает экспрессию Sdk-1, которая в первую очередь обнаруживается у ВИЧ-трансгенных мышей с псевдополулуниями клубочков. Опосредованное Sdk-1 нарушение регуляции межклеточной адгезии может способствовать скоплению гломерулярных эпителиальных клеток, что характерно для коллапсирующей гломерулопатии при ВИЧАН (61, 62). Экспрессия ВИЧ также подавляет активацию малой ГТФазы RAP1 за счет увеличения экспрессии RAP1GAP, который является негативным регулятором RAP1. RAP1 является важным регулятором межклеточной и межклеточной адгезии.Сниженная экспрессия RAP1 уменьшает содержание β1-интегрина, что приводит к отслоению подоцитов и гломерулосклерозу у мышей (63). Основные механизмы вызванного ВИЧ повреждения клубочков представлены на рисунке 3.

    Рисунок 3 . Схематическая диаграмма, демонстрирующая основные механизмы, с помощью которых инфекция ВИЧ-1 способствует повреждению клубочков и канальцев.

    Тубулоинтерстициальная травма в ВИЧАН

    Нарушение регуляции клеточного цикла

    Хотя Ki-67 также активируется в RTEc в биоптатах HIVAN, неясно, является ли это первичным патогенным процессом или адаптивным ответом на замену RTEc, подвергающегося апоптозу.Кроме того, хотя Ki-67 обычно используется в качестве маркера пролиферации, он экспрессируется во время всех фаз клеточного цикла, кроме G 0 (64). Поскольку Vpr вызывает остановку фазы G2/M и нарушение регуляции цитокинеза в RTEc in vitro и у мышей (65, 66), возможно, увеличение Ki-67 в RTEc при ВИЧАН отражает увеличение доли клеток, которые задерживаются в фазах клеточного цикла. кроме G 0 и не продолжающегося распространения per se . Более того, поскольку недавно было показано, что остановка RTEc в фазе G2/M является важным механизмом, способствующим тубулоинтерстициальному повреждению и фиброзу при повреждении почек, не связанном с ВИЧ, у мышей (67), вполне вероятно, что механизмы нарушения регуляции клеточного цикла при ВИЧАН могут иметь значение. прямое отношение к нашему пониманию тубулоинтерстициального повреждения при других протеинурических заболеваниях почек.

    Клеточная травма и смерть

    Апоптоз увеличивается в биоптатах HIVAN, при этом самые высокие уровни апоптоза обнаруживаются в RTEc (68, 69). Экспрессия Vpr индуцирует апоптоз в RTEc in vitro , который опосредован постоянной нерегулируемой активацией ERK, приводящей к активации caspase 8, которая расщепляет BID до tBID, приводя к проницаемости митохондриальной мембраны и апоптозу (65). Повреждение митохондрий и индуцированный Vpr апоптоз зависят от экспрессии убиквитин-подобного белка FAT10 (70).Интересно, что подавление экспрессии FAT10 предотвращает апоптоз прежде всего в клетках с индуцированной Vpr гиперплоидией in vitro .

    Протеинкиназа 2, взаимодействующая с гомео-доменом (HIPK2), также недавно была вовлечена в патогенез ВИЧ-индуцированного апоптоза RTEc и тубулоинтерстициального фиброза. Экспрессия HIPK2 увеличивается, в первую очередь, в тубулярных клетках у ВИЧ-трансгенных мышей и в образцах биопсии HIVAN и способствует апоптозу RTEc посредством активации путей p53, TGF-β-SMAD3 и Wnt/Notch, которые вместе способствуют тубулоинтерстициальному фиброзу (71).

    Воспаление

    Преобладающим транскрипционным ответом RTEc после ВИЧ-инфекции является повышенная экспрессия провоспалительных медиаторов, многие из которых представляют собой NF-κB и гены, индуцируемые интерфероном (72, 73). Первичная роль NF-κB-индуцированного воспаления в патогенезе ВИЧАН подтверждается исследованиями, демонстрирующими, что фармакологическое ингибирование NF-κB предотвращает заболевание почек в двух различных мышиных моделях ВИЧ-индуцированного заболевания почек (74, 75). Кроме того, клинические исследования (прежде всего в эпоху до АРВТ) продемонстрировали, что лечение глюкокортикоидами связано с улучшением почечных исходов при ВИЧАН (76–78) и что первичным гистологическим изменением, наблюдаемым после лечения, является уменьшение тубулоинтерстициального воспаления (79).

    Лечение ВИЧ-трансгенных мышей сиролимусом, ингибитором mTOR, также защищает от фенотипа ВИЧАН у ВИЧ-трансгенных мышей. Было показано, что сиролимус снижает транскрипцию ВИЧ в подоцитах in vitro и у мышей (80) и предотвращает экспрессию медиаторов эпителиально-мезенхимального перехода (81) в этих моделях. Поскольку ингибирование mTOR может иметь множество клеточных эффектов, включая иммуносупрессию и активацию аутофагии (цитозащитный и иммуномодулирующий путь), вполне вероятно, что многие пути вовлечены в индуцированную mTOR защиту в моделях ВИЧАН на мышах.

    Основные механизмы повреждения канальцев, вызванного ВИЧ, представлены на рисунке 3.

    Роль вариантов аполипропротеина L1 в ВИЧАН

    Эпидемиология

    Риск ВИЧАН у лиц африканского происхождения намного выше, чем у лиц других расовых/этнических групп, а у представителей черной расы риск ВИЧАН выше в 12,2 раза (82). Генетическая основа этого несоответствия была выяснена в основополагающем исследовании 2010 года, в котором авторы сообщили, что варианты гена APOL1 , кодирующего белок аполипопротеина L1 (ApoL1), тесно связаны с риском заболевания почек.Два варианта (G1 и G2) связаны с повышенным риском заболевания почек по сравнению с диким типом (G0). Аллель G1 кодирует две миссенс-мутации в белке APOL1, тогда как G2 кодирует делецию двух аминокислот (рис. 4). Почечный риск, связанный с аллелями G1 и G2, обычно происходит по аутосомно-рецессивному типу, и лица, гомозиготные по аллелю или компаунд-гетерозиготы по G1 и G2, имеют примерно одинаково повышенный риск заболевания почек (83).

    Рисунок 4 .Схематическая диаграмма основных доменов белка APOL1 и вариантов последовательностей G1 и G2.

    Лица с генотипами высокого риска APOL1 имеют в 10,5 и 7,3 раза повышенный риск развития не связанного с ВИЧ ФСГС и ХПН, связанной с гипертензией, соответственно (83, 84). Примечательно, что последующие исследования показали, что генотипы высокого риска APOL1 связаны с 29-кратным увеличением риска ВИЧАН у афроамериканцев и 89-кратным увеличением риска у южноафриканцев, а ВИЧ-позитивные пациенты имеют 50% риск развития ВИЧАН в течение жизни без антиретровирусного лечения. (85, 86).Важно отметить, что хотя почти все исследования показали, что гетерозиготность по аллелю риска APOL1 не увеличивает риск заболевания почек, Kasembeli et al. сообщили, что у ВИЧ-положительных южноафриканцев гетерозиготность по аллелю G1, но не по аллелю G2, была связана с повышенным риском ХИВАНА (86). Хотя это наблюдение требует повторения в другой когорте, если оно верно, это может быть связано с различиями в генетической примеси населения Южной Африки или факторами окружающей среды.

    Аллели APOL1 G1 и G2 уникальны для лиц африканского происхождения, что объясняется тем, что эти аллели возникли относительно недавно в Африке.Даже в Африке распространенность этих аллелей сильно различается: распространенность аллеля G1 наиболее высока в странах Западной Африки, включая Гану и Нигерию, где распространенность аллеля составляет >40%, но распространенность аллеля G2 более вариабельна в 6–24% (87). В Соединенных Штатах распространенность аллелей G1 и G2 у афроамериканцев составляет 20–22 и 13–15% соответственно, а 10–15% имеют генотипы высокого риска APOL1. Из-за трансатлантической работорговли, имевшей место в Западной Африке с шестнадцатого по девятнадцатый века, аллели риска APOL1 также обнаруживаются среди людей, живущих в Карибском бассейне и Латинской Америке, с очень различной частотой (88).

    Предполагаемые механизмы APOL1-опосредованного повреждения почек

    Механизмы, с помощью которых варианты APOL1 способствуют уничтожению трипаносом, могут дать важную информацию о том, как они способствуют повреждению почек. APOL1 частично функционирует как белок врожденного иммунного ответа и индуцируется интерферонами и TNF-α (89). APOL1 уникален для нескольких видов приматов и не кодируется в геномах других видов. Trypanosoma brucei rhodesiense вызывает африканскую сонную болезнь у людей, гомозиготных по аллелю APOL1 G0, поскольку она продуцирует белок, ассоциированный с резистентностью к сыворотке (SRA), который связывает APOL1, предотвращая его уничтожение паразита.Изменения в APOL1, кодируемые аллелями G1 и G2, предотвращают связывание/инактивацию APOL1 белком SRA, тем самым защищая лиц, несущих один или оба этих аллеля, от африканской сонной болезни, вызванной Trypanosoma brucei rhodesiense (90).

    APOL1 может экспрессироваться во многих типах клеток и тканей, особенно в присутствии интерферонов и/или TNFα (89). Существует также несколько изоформ APOL1, большинство из которых содержат N-концевой сигнальный пептид, который, вероятно, необходим для внеклеточной секреции.Печень является источником большей части циркулирующего белка APOL1, который образует комплекс с частицами HDL3, которые также синтезируются в печени (91). Существуют также изоформы APOL1, в которых отсутствует последовательность N-концевого сигнального пептида (рис. 4), и они экспрессируются в виде внутриклеточных белков (49). Уровни APOL1 в плазме не коррелируют с риском заболевания почек (92, 93). Более того, в условиях трансплантации почки наличие генотипов APOL1 высокого риска у донора почки, но не у реципиента, тесно связано с неблагоприятными исходами аллотрансплантата (94–96).Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что локальная продукция APOL1 в почечных клетках более важна, чем циркулирующий APOL1, в содействии повреждению почек.

    Почти 15% афроамериканцев имеют генотипы высокого риска, у большинства из которых никогда не развивается заболевание почек. Следовательно, необходимы дополнительные факторы или «вторые удары», чтобы разоблачить пагубные эффекты APOL1 на почки. Было идентифицировано несколько таких вторичных ударов, включая введение экзогенного интерферона (89), волчаночный нефрит (97, 98) и серповидно-клеточную анемию (99), но ВИЧ является наиболее мощным «вторым ударом», способствующим заболеванию почек у людей с генотипы APOL1 высокого риска (85, 86).Таким образом, ВИЧАН является важным модельным заболеванием, изучение которого может дать важные сведения о механизмах, с помощью которых APOL1 способствует заболеванию почек. Предполагаемые механизмы, с помощью которых APOL1 и ВИЧ-1 могут вместе способствовать повреждению почек, показаны на рисунке 5.

    Рисунок 5 . Схематическая диаграмма, демонстрирующая предполагаемые механизмы, с помощью которых инфекция ВИЧ-1 и APOL1 вместе способствуют повреждению почек.

    Хотя сообщалось, что несколько типов клеток почек продуцируют APOL1 in vivo , включая подоциты, тубулярные эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и гладкомышечные клетки сосудов (100, 101), остается неясным, какие клетки являются наиболее важными мишенями APOL1-индуцированное повреждение.Более того, в то время как цитокины сильно индуцируют экспрессию APOL1 in vitro , и многие из этих же цитокинов обычно повышаются в контексте хронического повреждения почек, экспрессия APOL1 в образцах биопсии пациентов с ВИЧАН, как сообщается, ниже, чем в контрольных образцах. Хотя возможно, если маловероятно, что экспрессия APOL1 увеличивается в какой-то момент в ходе болезненного процесса, неясно, является ли повышенная экспрессия APOL1 важным фактором патогенеза заболевания.Этот момент также имеет важное значение в отношении релевантности текущего исследования in vitro и животных моделей опосредованного APOL1 повреждения, большинство из которых основано на сверхэкспрессии APOL1 на нефизиологических уровнях или экспрессии трансгенов APOL1 у животных, у которых обычно отсутствует APOL1 в их геномы.

    Многочисленные публикации объясняют потенциальные механизмы, с помощью которых аллели риска APOL1 могут способствовать повреждению почек, но относительно немногие из них посвящены APOL1-опосредованному повреждению в контексте ВИЧ-инфекции.APOL1 убивает трипаносомы, встраиваясь в подкисленные эндосомы, которые при рециклировании в плазматическую мембрану при нейтральном pH становятся катионными каналами с высокой проводимостью, что приводит к быстрому набуханию и лизису паразита (102). Вынужденная сверхэкспрессия аллелей APOL1 G1 и G2 индуцирует большую цитотоксичность, чем аллель G0 in vitro (49, 50, 89), но остается неясным, способствует ли APOL1 повреждению почек посредством своей функции канала. У трансгенных мышей, экспрессирующих аллели G0 или G2 аллеля APOL1 в подоцитах под контролем промотора нефрина, не развивается заболевание почек (103), но у мышей, экспрессирующих аллель G2, но не аллель G0 в подоцитах под контролем промотора подоцина, развиваются поражения FSGS (48). .Повреждение подоцитов, вызванное аллелем G2, в последнем исследовании было связано с нарушением переноса эндосом и аутофагическим потоком, что приводило к пироптозу (48). Исследования in vitro с подоцитами человека показали, что ВИЧ-инфекция заметно увеличивает токсичность гиперэкспрессии APOL1 (50).

    Результаты недавнего провокационного исследования предполагают, что APOL1-индуцированная цитотоксичность и функция канала могут быть артефактами гиперэкспрессии in vitro и что эти эффекты могут не проявляться, когда APOL1 экспрессируется на физиологических уровнях (104).Поскольку в этом исследовании использовали индуцируемый APOL1 в иммортализованных клеточных линиях, необходимы дополнительные исследования, чтобы определить, относится ли это наблюдение к первичным клеткам почки. Однако ясно, что, поскольку почти во всех предыдущих исследованиях роли APOL1 в индукции клеточного повреждения использовались модели сверхэкспрессии, необходимы дальнейшие исследования, в которых APOL1 экспрессируется на физиологически релевантных уровнях в физиологически релевантных клетках.

    Будущие перспективы

    Несмотря на то, что антиретровирусные препараты стали эффективной стратегией профилактики и лечения заболеваний почек у ВИЧ-позитивных лиц, по-прежнему существует острая необходимость в исследованиях, чтобы ответить на ключевые вопросы, имеющие важные последствия для ухода за всеми людьми, живущими с ВИЧ и/или болезни почек, в том числе: (1) Как антиретровирусные препараты предотвращают/лечат ВИЧАН, не уменьшая ВИЧ-инфекцию клеток почечного эпителия? (2) Содержатся ли в почках вирусные штаммы с уникальными образцами устойчивости к антиретровирусным препаратам? (3) Возможно ли эрадикировать ВИЧ-1 из почек без ухудшения повреждения почек путем уничтожения инфицированных эпителиальных клеток? (4) Как варианты риска APOL1 способствуют повреждению почек и почему ВИЧ-1 является таким мощным «вторым ударом» у людей с генотипами высокого риска APOL1? (5) Поскольку ВИЧАН является единственной «нефропатией APOL1» с доступным эффективным лечением (антиретровирусными препаратами), может ли информация о патогенезе ВИЧАН помочь в лечении APOL1-ассоциированного заболевания почек у ВИЧ-отрицательных пациентов? (6) Как мы можем разработать in vitro и модели животных, которые точно моделируют in vivo функцию (функции) APOL1?

    Выводы

    ВИЧАН вызывается инфекцией клеток почечного эпителия у генетически предрасположенных лиц.Помимо важности в патогенезе ВИЧАН, инфицированный почечный эпителий может служить резервуаром вируса, что необходимо учитывать в будущих попытках вылечить ВИЧ-позитивных пациентов. ВИЧ-инфекция вызывает нарушение регуляции генов-хозяев и нескольких клеточных путей, включая воспаление, клеточный цикл, гомеостаз цитоскелета и гибель клеток. Полиморфизмы в гене APOL1 объясняют большую часть избыточного риска ВИЧАН, связанного с африканским происхождением, и всех нефропатий, связанных с APOL1, ВИЧАН имеет самую сильную связь с генотипами риска APOL1.Хотя антиретровирусная терапия заметно снизила бремя ВИЧАН у ВИЧ-позитивных пациентов, исследования, направленные на выяснение того, как ВИЧ повышает восприимчивость к заболеваниям почек у лиц с генотипами высокого риска APOL1, обещают предоставить ключевую информацию, которая может помочь в разработке новых стратегий профилактики и лечения Нефропатии APOL1 у ВИЧ-отрицательных пациентов.

    Вклад авторов

    SR подготовил первоначальный вариант этой рукописи. MR пересмотрел и расширил объем этой рукописи.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Эта работа была поддержана грантами NIH/NIDDK R01DK108346 и R01DK101338.

    Каталожные номера

    1. Маллипатту С.К., Салем Ф., Вятт К.М. Изменение эпидемиологии хронической болезни почек, связанной с ВИЧ, в эпоху антиретровирусной терапии. Почки Междунар. (2014) 86 : 259–65. doi: 10.1038/ki.2014.44

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    3. ЕГРСР (2012). Система данных о почках США. Годовой отчет USRDS за 2012 г.: Атлас хронической болезни почек и терминальной стадии почечной недостаточности в США. Национальные институты здравоохранения, Национальный институт диабета, болезней органов пищеварения и почек, Бетесда, Мэриленд.

    4. Wyatt CM, Klotman PE, D’Agati VD. ВИЧ-ассоциированная нефропатия: клиника, патология и эпидемиология в эпоху антиретровирусной терапии. Семин Нефрол. (2008) 28 : 513–22. doi: 10.1016/j.semprofl.2008.08.005

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    8. D’Agati V, Suh JI, Carbone L, Cheng JT, Appel G. Патология ВИЧ-ассоциированной нефропатии: подробное морфологическое и сравнительное исследование. Почки Междунар. (1989) 35 : 1358–70.

    Реферат PubMed | Академия Google

    9. Barisoni L, Kriz W, Mundel P, D’Agati V. Дисрегуляция фенотипа подоцитов: новая концепция в патогенезе коллапсирующего идиопатического фокально-сегментарного гломерулосклероза и ВИЧ-ассоциированной нефропатии. J Am Soc Нефрол. (1999) 10 : 51–61.

    Реферат PubMed | Академия Google

    10. Брюггеман Л.А., Росс М.Д., Танджи Н., Кара А., Дикман С., Гордон Р.Э. и соавт. Почечный эпителий является ранее нераспознанным местом инфицирования ВИЧ-1. J Am Soc Нефрол. (2000) 11 :2079–87.

    Реферат PubMed | Академия Google

    11. Ray PE, Liu XH, Henry D, Dye LIIII, Xu L, Orenstein JM, et al. Заражение первичных клеток почечного эпителия человека ВИЧ-1 у детей с ВИЧ-ассоциированной нефропатией. Почки Междунар. (1998) 53 : 1217–29. doi: 10.1046/j.1523-1755.1998.00900.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    12. Eitner F, Cui Y, Hudkins KL, Stokes MB, Segerer S, Mack M, et al. Экспрессия хемокиновых рецепторов CCR5 и CXCR4 при ВИЧ-ассоциированном заболевании почек. J Am Soc Нефрол. (2000) 11 : 856–67.

    Реферат PubMed | Академия Google

    13. Chen P, Chen BK, Mosoian A, Hays T, Ross MJ, Klotman PE, et al.Вирусологические синапсы обеспечивают поглощение ВИЧ-1 и экспрессию генов в эпителиальных клетках почечных канальцев. J Am Soc Нефрол. (2011) 22 : 496–507. doi: 10.1681/ASN.2010040379

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    14. Blasi M, Balakumaran B, Chen P, Negri DR, Cara A, Chen BK, et al. Клетки почечного эпителия продуцируют и распространяют ВИЧ-1 посредством контакта с Т-клетками. СПИД (2014) 28 :2345–53. doi: 10.1097/QAD.0000000000000398

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    15.Canaud G, Dejucq-Rainsford N, Avettan-Fenoel V, Viard JP, Anglicheau D, Bienaime F, et al. Почка как резервуар для ВИЧ-1 после трансплантации почки. J Am Soc Нефрол. (2013) 25 : 407–19. doi: 10.1681/ASN.2013050564

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    16. Li J, Das JR, Tang P, Han Z, Jaiswal JK, Ray PE. Трансмембранный TNF- способствует инфицированию ВИЧ-1 подоцитов, культивируемых у детей с ВИЧ-ассоциированной нефропатией. J Am Soc Нефрол . (2016) 28 : 862–75. doi: 10.1681/ASN.2016050564

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    17. Маррас Д., Брюггеман Л.А., Гао Ф., Танжи Н., Мансухани М.М., Кара А. и соавт. Репликация и компартментализация ВИЧ-1 в почечном эпителии у пациентов с ВИЧ-ассоциированной нефропатией. Нац. мед. (2002) 8 : 522–6. doi: 10.1038/nm0502-522

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    18.Блази М., Карпентер Дж. Х., Балакумаран Б., Кара А., Гао Ф., Клотман М.Э. Идентификация компартментализации мочеполового тракта ВИЧ-1 путем анализа последовательностей генов env в моче. СПИД (2015) 29 :1651–7. doi: 10.1097/QAD.0000000000000757

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    19. Stephens EB, Tian C, Dalton SB, Gattone VH. Нефропатия, ассоциированная с вирусом иммунодефицита человека обезьян у макак. AIDS Res Hum Retroviruses (2000) 16 :1295–306.дои: 10.1089/088

    050117050

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    20. Dickie P, Felser J, Eckhaus M, Bryant J, Silver J, Marinos N, et al. ВИЧ-ассоциированная нефропатия у трансгенных мышей, экспрессирующих гены ВИЧ-1. Вирусология (1991) 185 :109–19. дои: 10.1016/0042-6822(91)-5

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    21. Zuo Y, Matsusaka T, Zhong J, Ma J, Ma LJ, Hanna Z, et al. Гены ВИЧ-1 vpr и nef синергически повреждают подоциты, что приводит к гломерулосклерозу. J Am Soc Нефрол. (2006) 17 : 2832–43. doi: 10.1681/ASN.2005080878

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    23. Saksela K, Cheng G, Baltimore D. Богатые пролином (PxxP) мотивы в ВИЧ-1 Nef связываются с доменами Sh4 подмножества киназ Src и необходимы для усиленного роста вирусов Nef+, но не для подавления CD4. EMBO J. (1995) 14 : 484–91.

    Реферат PubMed | Академия Google

    25.Вэй П., Гарбер М.Е., Фанг С.М., Фишер В.Х., Джонс К.А. Новый циклин C-типа, ассоциированный с CDK9, взаимодействует непосредственно с Tat ВИЧ-1 и опосредует его высокоаффинное петлеспецифическое связывание с РНК TAR. Сотовый (1998) 92 : 451–62. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80939-3

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    27. Conaldi PG, Bottelli A, Baj A, Serra C, Fiore L, Federico G, et al. Вирус иммунодефицита человека-1 tat индуцирует гиперпролиферацию и нарушение регуляции почечных гломерулярных эпителиальных клеток. Ам Дж. Патол. (2002) 161 : 53–61. doi: 10.1016/S0002-9440(10)64156-9

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    28. Xie X, Colberg-Poley AM, Das JR, Li J, Zhang A, Tang P, et al. Основной домен трансактивирующего белка ВИЧ-tat необходим для его нацеливания на липидные рафты и регуляции передачи сигналов фактора роста фибробластов-2 в подоцитах, выделенных у детей с ВИЧ-1-ассоциированной нефропатией. J Am Soc Нефрол. (2014) 25 :18:00–13.doi: 10.1681/ASN.2013070710

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    29. Hagen M, Pfister E, Kosel A, Shankland S, Pippin J, Amann K, et al. Повторный вход в клеточный цикл делает подоциты чувствительными к смерти, вызванной повреждением. Клеточный цикл (2016) 15 : 1929–37. дои: 10.1080/15384101.2016.11

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    30. Barisoni L, Bruggeman LA, Mundel P, D’Agati VD, Klotman PE. ВИЧ-1 индуцирует дедифференцировку почечного эпителия в трансгенной модели ВИЧ-ассоциированной нефропатии. Почки Междунар. (2000) 58 : 173–81. doi: 10.1046/j.1523-1755.2000.00152.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    31. Dijkman HB, Weening JJ, Smeets B, Verrijp KC, van Kuppevelt TH, Assmann KK, et al. Пролиферирующие клетки при ВИЧ и ассоциированном с памидронатом коллапсирующем фокально-сегментарном гломерулосклерозе представляют собой париетальные эпителиальные клетки. Почки Междунар. (2006) 70 : 338–44. doi: 10.1038/sj.ki.5001574

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    32.Гур С.С., Сакс М., Вегнер А., Беккер Ю.Ю., Мейер Т.Н., Китцманн Л. и др. Экспрессия специфических для подоцитов белков в париетальных эпителиальных клетках регулируется деградацией белка. Почки Междунар. (2013) 84 : 532–44. doi: 10.1038/ki.2013.115

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    34. Appel D, Kershaw DB, Smeets B, Yuan G, Fuss A, Frye B, et al. Набор подоцитов из гломерулярных париетальных эпителиальных клеток. J Am Soc Нефрол. (2009) 20 : 333–43. doi: 10.1681/ASN.2008070795

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    35. Шенкленд С.Дж., Эйтнер Ф., Хадкинс К.Л., Гудпастер Т., Д’Агати В., Альперс К.Э. Дифференциальная экспрессия ингибиторов циклинзависимой киназы при гломерулярной болезни человека: роль в пролиферации и созревании подоцитов. Kidney Int (2000) 58 :674–83. doi: 10.1046/j.1523-1755.2000.00213.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    36.He JC, Husain M, Sunamoto M, D’Agati VD, Klotman ME, Iyengar R, et al. Nef стимулирует пролиферацию гломерулярных подоцитов посредством активации Src-зависимых путей Stat3 и MAPK1,2. Дж Клин Инвест. (2004) 114 : 643–51. дои: 10.1172/JCI200421004

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    37. Feng X, Lu TC, Chuang PY, Fang W, Ratnam K, Xiong H, et al. Снижение активности stat3 ослабляет вызванное ВИЧ повреждение почек. J Am Soc Нефрол. (2009) 20 : 2138–46. doi: 10.1681/ASN.2008080879

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    38. Lu TC, Wang Z, Feng X, Chuang P, Fang W, Chen Y, et al. Ретиноевая кислота использует CREB и USF1 в транскрипционной петле прямой связи, чтобы стимулировать экспрессию MKP1 в подоцитах, инфицированных вирусом иммунодефицита человека. Мол клеточный биол. (2008b) 28 : 5785–94. doi: 10.1128/MCB.00245-08

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    39.Шарма М., Магенхаймер Л.К., Хоум Т., Тамано К.Н., Сингхал П.С., Хайнк Д.П. и др. Ингибирование пути Notch ослабляет прогрессирование нефропатии, ассоциированной с вирусом иммунодефицита человека. Am J Physiol Renal Physiol. (2013) 304 : F1127–36. doi: 10.1152/ajprenal.00475.2012

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    40. Ratnam KK, Feng X, Chuang PY, Verma V, Lu TC, Wang J, et al. Роль рецептора ретиноевой кислоты-альфа в ВИЧ-ассоциированной нефропатии. Почки Междунар. (2011) 79 : 624–34. doi: 10.1038/ki.2010.470

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    41. Kumar D, Konkimalla S, Yadav A, Sataranatarajan K, Kasinath BS, Chander PN, et al. ВИЧ-ассоциированная нефропатия: роль мишени рапамицинового пути у млекопитающих. Ам Дж. Патол. (2010) 177 : 813–21. doi: 10.2353/ajpath.2010.100131

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    42.Маллипатту С.К., Лю Р., Чжэн Ф., Нарла Г., Мааян А., Дикман С. и др. Kruppel-подобный фактор 15 (KLF15) является ключевым регулятором дифференцировки подоцитов. J Biol Chem. (2012) 287 : 19122–35. doi: 10.1074/jbc.M112.345983

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    43. Маллипатту С.К., Эстрада К.С., Он Дж.К. Критическая роль факторов, подобных Круппелю, в заболевании почек. Am J Physiol Renal Physiol. (2017) 312 : F259–65. дои: 10.1152/айпренал.00550.2016

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    44. Lu TC, He JC, Wang ZH, Feng X, Fukumi-Tominaga T, Chen N, et al. ВИЧ-1 Nef разрушает актиновый цитоскелет подоцитов, взаимодействуя с прозрачным взаимодействующим белком. J Biol Chem. (2008a) 283 : 8173–82. doi: 10.1074/jbc.M708

    0

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    45. Хусейн М., Д’Агати В.Д., Хе Дж.К., Клотман М.Е., Клотман П.Е.ВИЧ-1 Nef индуцирует дедифференцировку подоцитов in vivo : характерная черта ВИЧАН. СПИД (2005) 19 :1975–80. doi: 10.1097/01.aids.00001

    .42110.27

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    46. Сунамото М., Хусейн М., Хе Дж. К., Шварц Э. Дж., Клотман П. Е. Критическая роль Nef в дедифференцировке подоцитов, индуцированной ВИЧ-1. Почки Междунар. (2003) 64 : 1695–701. doi: 10.1046/j.1523-1755.2003.00283.х

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    48. Beckerman P, Bi-Karchin J, Park AS, Qiu C, Dummer PD, Soomro I, et al. Трансгенная экспрессия вариантов риска APOL1 человека в подоцитах вызывает заболевание почек у мышей. Nat Med . (2017) 23 : 429–38. doi: 10.1038/nm.4287

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    49. Khatua AK, Cheatham AM, Kruzel ED, Singhal PC, Skorecki K, Popik W. Последовательность, кодируемая экзоном 4, является основным фактором, определяющим цитотоксичность аполипопротеина L1. Am J Physiol Cell Physiol. (2015) 309 : C22–37. doi: 10.1152/ajpcell.00384.2014

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    50. Lan X, Jhaveri A, Cheng K, Wen H, Saleem MA, Mathieson PW, et al. Варианты риска APOL1 усиливают некроз podoc y te за счет нарушения проницаемости лизосомальной мембраны. Am J Physiol Renal Physiol. (2014) 307 : F326–36. doi: 10.1152/ajprenal.00647.2013

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    51.Росс М.Дж., Мартинка С., Д’Агати В.Д., Брюггеман Л.А. NF-κB регулирует Fas-опосредованный апоптоз при ВИЧ-ассоциированной нефропатии. J Am Soc Нефрол. (2005) 16 : 2403–11. doi: 10.1681/ASN.2004121101

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    52. Маллипатту С.К., Хорн С.Дж., Д’Агати В., Нарла Г., Лю Р., Фроман М.А. и соавт. Круппелеподобный фактор 6 регулирует функцию митохондрий в почках. Дж Клин Инвест. (2015) 125 : 1347–61.дои: 10.1172/JCI77084

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    53. Rai P, Plagov A, Lan X, Chandel N, Singh T, Lederman R, et al. mTOR играет критическую роль в индуцированном р53 окислительном повреждении клеток почек при ВИЧАН. Am J Physiol Renal Physiol. (2013) 305 : F343–54. doi: 10.1152/ajprenal.00135.2013

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    54. Husain M, Meggs LG, Vashishtha H, Simoes S, Griffiths KO, Kumar D, et al.Ингибирование гена долголетия P66SHCA спасает подоциты от вызванного ВИЧ-1 окислительного стресса и апоптоза. J Biol Chem. (2009) 284 : 16648–58. doi: 10.1074/jbc.M109.008482

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    55. Haque S, Lan X, Wen H, Lederman R, Chawla A, Attia M, et al. ВИЧ способствует активации комплекса воспаления NLRP3 при мышиной ВИЧ-ассоциированной нефропатии. Ам Дж. Патол. (2016) 186 : 347–58. дои: 10.1016/j.ajpath.2015.10.002

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    56. Бернс Г.К., Визинтайнер П., Мохаммед Н.Б. Влияние ингибирования ангиотензинпревращающего фермента на прогрессирование почечной недостаточности и смертность при ВИЧ-ассоциированной нефропатии. J Amer Soc Нефрол. (1999) 10 :155.

    57. Киммель П.Л., Мишкин Г.Я., Умана В.О. Каптоприл и почечная выживаемость у пациентов с нефропатией, вызванной вирусом иммунодефицита человека. Am J Kidney Dis. (1996) 28 : 202–8. doi: 10.1016/S0272-6386(96)-9

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    58. Zhong Y, Chen EY, Liu R, Chuang PY, Mallipattu SK, Tan CM, et al. Ренопротекторный эффект сочетанного ингибирования ангиотензинпревращающего фермента и гистондеацетилазы. J Am Soc Нефрол. (2013) 24 : 801–11. doi: 10.1681/ASN.2012060590

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    59.Хирамацу Н., Хиромура К., Шигехара Т., Куроива Т., Идеура Х., Сакураи Н. и др. Ангиотензин 2. Блокада рецепторов типа (2013) 1 ингибирует развитие и прогрессирование ВИЧ-ассоциированной нефропатии на мышиной модели. J Am Soc Нефрол. (2007) 18 : 515–27. doi: 10.1681/ASN.2006030217

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    60. Shimizu A, Zhong J, Miyazaki Y, Hosoya T, Ichikawa I, Matsusaka T. ARB защищает подоциты от нефропатии ВИЧ-1 независимо от подоцита AT1. Трансплантат нефролового диска. (2012) 27 : 3169–75. doi: 10.1093/ndt/gfs033

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    61. Kaufman L, Yang G, Hayashi K, Ashby JR, Huang L, Ross MJ, et al. Гомофильная молекула адгезии sidekick-1 способствует усиленной агрегации подоцитов при ВИЧ-ассоциированной нефропатии. FASEB J. (2007) 21 :1367–75. doi: 10.1096/fj.06-7191com

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    62.Кауфман Л., Хаяши К., Росс М.Дж., Росс М.Д., Клотман П.Е. Sidekick-1 активируется в клубочках при ВИЧ-ассоциированной нефропатии. J Am Soc Нефрол. (2004) 15 : 1721–30. doi: 10.1097/01.ASN.0000128975.28958.C2

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    63. Potla U, Ni J, Vadaparampil J, Yang G, Leventhal JS, Campbell KN, et al. Экспрессия RAP1GAP, специфичная для подоцитов, способствует фокально-сегментарному гломерулосклерозу, связанному с повреждением клубочков. Дж Клин Инвест. (2014) 124 : 1757–69. дои: 10.1172/JCI67846

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    65. Снайдер А., Алсаускас З.С., Левенталь Дж.С., Розенстиль П.Е., Гонг П., Чан Дж.Дж. и соавт. Вирусный белок r ВИЧ-1 индуцирует ERK и зависимый от каспазы-8 апоптоз в эпителиальных клетках почечных канальцев. СПИД (2010) 24 :1107–19. дои: 10.1097/QAD.0b013e328337b0ab

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    66.Розенстил П.Е., Груоссо Т., Летурно А.М., Чан Дж.Дж., Леблан А., Хусейн М. и др. Vpr ВИЧ-1 ингибирует цитокинез в клетках проксимальных канальцев человека. Почки Междунар. (2008) 74 : 1049–58. doi: 10.1038/ki.2008.303

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    67. Ян Л., Бессчетнова Т.Ю., Брукс Ч.Р., Шах Дж.В., Бонвентре Дж.В. Остановка эпителиального клеточного цикла в G2/M опосредует фиброз почек после повреждения. Нац. мед. (2010) 16 :535–43, 1п после 143.дои: 10.1038/nm.2144

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    68. Yang Y, Gubler MC, Beaufils H. Нарушение регуляции фенотипа подоцитов при идиопатической коллапсирующей гломерулопатии и ВИЧ-ассоциированной нефропатии. Нефрон (2002) 91 : 416–23. дои: 10.1159/000064281

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    70. Снайдер А., Алсаускас З., Гонг П., Розенстил П.Е., Клотман М.Е., Клотман П.Е. и соавт. FAT10: новый медиатор Vpr-индуцированного апоптоза при нефропатии, связанной с вирусом иммунодефицита человека. Дж Вирол. (2009) 83 :11983–8. doi: 10.1128/ОВИ.00034-09

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    71. Jin Y, Ratnam K, Chuang PY, Fan Y, Zhong Y, Dai Y, et al. Системный подход определяет HIPK2 как ключевой регулятор фиброза почек. Нац. мед. (2012) 18 : 580–588. doi: 10.1038/nm.2685

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    72. Чен П., Йи З., Чжан В., Клотман М.Э., Чен Б.К.Индуцированная ВИЧ-инфекцией программа транскрипции в эпителиальных клетках почечных канальцев активирует CXCR2-управляемый хемотаксический ответ CD4+ T-клеток. СПИД (2016) 30 :1877–88. doi: 10.1097/QAD.0000000000001153

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    73. Ross MJ, Fan C, Ross MD, Chu TH, Shi Y, Kaufman L, et al. Инфекция ВИЧ-1 инициирует воспалительный каскад в эпителиальных клетках почечных канальцев человека. J Acquir Immune Defic Syndr. (2006) 42 : 1–11.дои: 10.1097/01.qai.0000218353.60099.4f

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    74. Zhang G, Liu R, Zhong Y, Plotnikov AN, Zhang W, Zeng L, et al. Снижение транскрипционной активности NF-κB при ВИЧ-ассоциированном заболевании почек путем ингибирования BRD4. J Biol Chem. (2012) 287 : 28840–51. doi: 10.1074/jbc.M112.359505

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    75. Хекманн А., Вальцингер С., Жоликер П., Дреано М., Коско-Вильбуа М.Х., Саго Ю.Ингибитор IKK2 облегчает заболевания почек и истощение в мышиной модели человеческого СПИДа. Ам Дж. Патол. (2004) 164 : 1253–62. doi: 10.1016/S0002-9440(10)63213-0

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    76. Appel RG, Neill J. Стероид-чувствительный нефротический синдром у пациента с инфекцией вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Ann Intern Med. (1990) 113 : 892–3. дои: 10.7326/0003-4819-113-11-892

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    77.Ларади А., Маллет А., Бофилс Х., Аллуаш М., Мартинес Ф. ВИЧ-ассоциированная нефропатия: исход и факторы прогноза. Groupe d’Etudes Nephrologiques d’Ile de France. J Am Soc Нефрол. (1998) 9 : 2327–35.

    Реферат PubMed | Академия Google

    78. Smith MC, Austen JL, Carey JT, Emancipator SN, Herbener T, Gripshover B, et al. Преднизолон улучшает функцию почек и протеинурию при нефропатии, ассоциированной с вирусом иммунодефицита человека. Am J Med. (1996) 101 : 41–8.doi: 10.1016/S0002-9343(96)00065-4

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    79. Briggs WA, Tanawattanacharoen S, Choi MJ, Scheel PJJr, Nadasdy T, Racusen L. Клиникопатологические корреляты лечения преднизоном нефропатии, связанной с вирусом иммунодефицита человека. Am J Kidney Dis. (1996) 28 : 618–21. doi: 10.1016/S0272-6386(96)

    -1

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    80. Rai P, Plagov A, Kumar D, Pathak S, Ayasolla KR, Chawla AK, et al.Индуцированная рапамицином модуляция транскрипции гена ВИЧ ослабляет прогрессирование ВИЧАН. Опыт Мол Патол. (2012) 94 : 255–61. doi: 10.1016/j.yexmp.2012.09.009

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    81. Ядав А., Кумар Д., Салхан Д., Раттанавич Р., Махешвари С., Адабала М. и соавт. Сиролимус модулирует фенотип ВИЧАН посредством ингибирования эпителиально-мезенхимального перехода. Опыт Мол Патол. (2012) 93 : 173–81.doi: 10.1016/j.yexmp.2012.04.021

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    82. Abbott KC, Hypolite I, Welch PG, Agodoa LY. Нефропатия, связанная с вирусом иммунодефицита человека/синдромом приобретенного иммунодефицита, на терминальной стадии почечной недостаточности в Соединенных Штатах: характеристики пациентов и выживаемость в эпоху до высокоактивной антиретровирусной терапии. Дж Нефрол. (2001) 14 : 377–83.

    Реферат PubMed | Академия Google

    83.Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI, et al. Ассоциация трипанолитических вариантов ApoL1 с заболеванием почек у афроамериканцев. Наука (2010) 329 : 841–5. doi: 10.1126/science.1193032

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    84. Freedman BI, Kopp JB, Langefeld CD, Genovese G, Friedman DJ, Nelson GW, et al. Ген аполипопротеина L1 (APOL1) и недиабетическая нефропатия у афроамериканцев. J Am Soc Нефрол. (2010) 21 : 1422–6. doi: 10.1681/ASN.2010070730

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    85. Kopp JB, Nelson GW, Sampath K, Johnson RC, Genovese G, An P, et al. Генетические варианты APOL1 при фокально-сегментарном гломерулосклерозе и ВИЧ-ассоциированной нефропатии. J Am Soc Нефрол. (2011) 22 :2129–37. doi: 10.1681/ASN.2011040388

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    86. Kasembeli AN, Duarte R, Ramsay M, Mosiane P, Dickens C, Dix-Peek T, et al.Варианты риска APOL1 тесно связаны с ВИЧ-ассоциированной нефропатией у чернокожих жителей Южной Африки. J Am Soc Нефрол. (2015) 26 : 2882–90. doi: 10.1681/ASN.2014050469

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    87. Limou S, Nelson GW, Kopp JB, Winkler CA. Аллели почечного риска APOL1: популяционная генетика и ассоциации заболеваний. Adv Хроническая почечная недостаточность. (2014) 21 : 426–33. doi: 10.1053/j.ackd.2014.06.005

    Реферат PubMed | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    89.Николс Б., Джог П., Ли Дж. Х., Блэклер Д., Уилмот М., Д’Агати В. и др. Пути врожденного иммунитета регулируют ген нефропатии аполипопротеин L1. Почки Междунар. (2015) 87 : 332–42. doi: 10.1038/ki.2014.270

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    90. Thomson R, Genovese G, Canon C, Kovacsics D, Higgins MK, Carrington M, et al. Эволюция трипанолитического фактора приматов APOL1. Proc Natl Acad Sci USA. (2014) 111 :E2130–9.doi: 10.1073/pnas.1400699111

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    92. Козлитина Дж., Чжоу Х., Браун П.Н., Ром Р.Дж., Пан Ю., Аяноглу Г. и соавт. Уровни в плазме варианта APOL1, связанного с риском, не связаны с заболеванием почек в популяционной когорте. J Am Soc Нефрол . (2016) 27 : 3204–19. doi: 10.1681/ASN.2015101121

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    93. Bruggeman LA, O’Toole JF, Ross MD, Madhavan SM, Smurzynski M, Wu K, et al.Уровень аполипопротеина L1 в плазме не коррелирует с ХБП. J Am Soc Нефрол. (2013) 25 : 634–44. doi: 10.1681/ASN.2013070700

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    94. Doshi MD, Ortigosa-Goggins M, Garg AX, Li L, Poggio ED, Winkler CA, et al. Генотип APOL1 и почечная функция черных живых доноров. J Am Soc Нефрол . (2018) 29 : 1309–16. doi: 10.1681/ASN.2017060658

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    95.Ли Б.Т., Кумар В., Уильямс Т.А., Абди Р., Бернхарди А., Дайер С. и др. Генотип APOL1 у афроамериканцев, перенесших трансплантацию почки, этого не делает. влияет на 5-летнюю выживаемость аллотрансплантата. Am J Трансплантация. (2012) 12 : 1924–8. doi: 10.1111/j.1600-6143.2012.04033.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    96. Ривз-Дэниел А.М., ДеПальма Дж.А., Блейер А.Дж., Рокко М.В., Муреа М., Адамс П.Л. и соавт. Ген APOL1 и выживаемость аллотрансплантата после трансплантации почки. Am J Трансплантация. (2011) 11 :1025–30. doi: 10.1111/j.1600-6143.2011.03513.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    97. Freedman BI, Langefeld CD, Andringa KK, Croker JA, Williams AH, Garner NE, et al. Терминальная стадия почечной недостаточности у афроамериканцев с волчаночным нефритом связана с APOL1. Артрит Ревматолог. (2014) 66 : 390–6. дои: 10.1002/арт.38220

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    98.Ларсен С.П., Беггс М.Л., Саид М., Уокер П.Д. Варианты риска аполипопротеина L1 связаны с коллапсирующей гломерулопатией, связанной с системной красной волчанкой. J Am Soc Нефрол. (2013) 24 :722–5. doi: 10.1681/ASN.2012121180

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    99. Ashley-Koch AE, Okocha EC, Garrett ME, Soldano K, De Castro LM, Jonassaint JC, et al. MYH9 и APOL1 связаны с нефропатией при серповидноклеточной анемии. Бр Ж Гематол. (2011) 155 : 386–94. doi: 10.1111/j.1365-2141.2011.08832.x

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    100. Ma L, Shelness GS, Snipes JA, Murea M, Antinozzi PA, Cheng D, et al. Локализация белка и мРНК APOL1 в почках человека: здоровая ткань, первичные клетки и иммортализованные клеточные линии. J Am Soc Нефрол. (2014) 26 : 339–48. doi: 10.1681/ASN.20130

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    101.Мадхаван С.М., О’Тул Дж.Ф., Конецковски М., Ганесан С., Брюггеман Л.А., Седор Дж.Р. Локализация APOL1 в нормальных почках и при недиабетическом заболевании почек. J Am Soc Нефрол. (2011) 22 :2119–28. doi: 10.1681/ASN.2011010069

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    102. Томсон Р., Финкельштейн А. Трипанолитический фактор человека APOL1 формирует рН-зависимые катион-селективные каналы в плоских липидных бислоях: отношение к лизису трипаносом. Proc Natl Acad Sci USA. (2015) 112 : 2894–9. doi: 10.1073/pnas.1421953112

    Реферат PubMed | Полнотекстовая перекрестная ссылка

    103. Bruggeman LA, Wu Z, Luo L, Madhavan SM, Konieczkowski M, Drawz PE, et al. У трансгенных моделей APOL1-G0 или APOL1-G2 развивается преэклампсия, но не заболевание почек. J Am Soc Нефрол. (2016) 27 :3600–10. doi: 10.1681/ASN.2015111220

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    104. O’Toole JF, Schilling W, Kunze D, Madhavan SM, Konieczkowski M, Gu Y, et al.Сверхэкспрессия ApoL1 вызывает независимую от вариантов цитотоксичность. J Am Soc Нефрол. (2018) 29 : 869–79. doi: 10.1681/ASN.2016121322

    Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    .

    Author: alexxlab

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.