Впр 5 вариант 5 класс по истории: ВПР 2019. История. 5 класс. Вариант 5 с ответами

Содержание

ВПР по истории, 5 класс, 1-2 варианты

ВАРИАНТ 1. Часть 1.

Прочтите перечень из тем и выполните задания 1 — 6.

Перечень тем:

А. Древний Египет Б. Древнее Двуречье В. Финикия Г. Древняя Ассирия

1. Каждая из иллюстрации, приведенных ниже, относится к одной из указанных в перечне тем. Установите соответствие между темами и иллюстрациями: к каждой теме подберите по одной иллюстрации.

1) 2)

3) 4)

Запишите в таблицу цифры под соответствующими буквами

2. Прочтите отрывок из текста и определите, к какой из тем он относится. В ответе напишите букву, которой обозначено это государство.

«Будь писцом – он освобожден от всяких повинностей, от работы мотыгой. Ты не будешь таскать корзин, не будут тебя сечь прутьями. Будь писцом, чтобы тело твое было гладким и рука твоя мягкой.

И ты будешь выходить в белой одежде, тебя будут все почитать и приветствовать. Писцы – у ног владыки и внимают его словам».


Ответ:

А. Древний Египет Б. Древнее Двуречье В. Финикия Г. Древняя Ассирия

3. Выбранная тема: (укажите букву в перечне)

Прочитайте список слов и напишите слово, относящееся к выбранному Вами государству. Объясните смысл этого слова (словосочетания).

Иероглиф, клинопись, библия, алфавит, логовище львов, «нить Ариадны».

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Выбранная тема: (укажите букву в перечне)

Прочитайте список событий (явлений, процессов) и напишите событие (явление, процесс), которое относится к выбранной Вами теме. Используя знания по истории, расскажите об этом событии (явлении, процессе).

Военные походы фараонов, основание колоний, законы Хаммурапи, установление демократии, существование кастовой системы, освоение железа и производство железного оружия и орудий труда.

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


5. Выбранная тема: (укажите букву в перечне)

Заштрихуйте на контурной карте один четырехугольник, образованный градусной сеткой (параллелями и меридианами), в котором полностью или частично располагалась страна, указанная в выбранной Вами теме.

6. Выбранная тема: (укажите букву в перечне)

Используя знания исторических фактов, объясните, как природно-климатические условия повлияли на занятия жителей этой страны?

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Часть 2.

7. Укажите одного исторического деятеля – Вашего земляка, жизнь которого была связана с Вашим регионом или населенным пунктом.

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8.Чем известен Ваш земляк, каков его вклад в развитие Вашего региона, или населенного пункта, или нашей страны?

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ВАРИАНТ 2.

Часть 1.

Прочтите перечень из тем и выполните задания 1-6.

Перечень тем:

А. Древняя Греция Б. Древнее Двуречье В. Палестина Г. Древняя Индия

1. Каждая из иллюстрации, приведенных ниже, относится к одной из указанных в перечне тем. Установите соответствие между темами и иллюстрациями: к каждой теме подберите по одной иллюстрации.

1) 2)

3) 4)

Запишите в таблицу цифры под соответствующими буквами

2. Прочтите отрывок из текста и определите, к какой из тем он относится. В ответе напишите букву, которой обозначено это государство.

«Если  человек  был  нерадив  в  отношении  укрепления плотины,  что  на  его  земле,  не укрепил свою плотину,  и в его плотине образовалась брешь,  и вода  затопила  поле  соседей,  то человек,  в  чьей  плотине образовалась брешь,  должен возместить зерно, которое он погубил».

Ответ:

А. Древняя Греция Б. Древнее Двуречье В. Палестина Г. Древняя Индия

3. Выбранная тема: (укажите букву в перечне)

Прочитайте список слов и напишите слово, относящееся к выбранному Вами государству. Объясните смысл этого слова.

Жрецы, клинопись, скрижали, агора, «Пиррова победа», брахманы.

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Выбранная тема: (укажите букву в перечне)

Прочитайте список событий (явлений, процессов) и напишите событие

(явление, процесс), которое относится к выбранной Вами теме. Используя знания по истории, расскажите об этом событии (явлении, процессе).

«Троянский конь», завоевания Кира, строительство пирамиды Хеопса, законы Хаммурапи, суд Соломона, появление буддизма.

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


5. Выбранная тема: (укажите букву в перечне)

Заштрихуйте на контурной карте один четырехугольник, образованный градусной сеткой (параллелями и меридианами), в котором полностью или частично располагалась страна, указанная в выбранной Вами теме.

6. Выбранная тема: (укажите букву в перечне)

Используя знания исторических фактов, объясните, как природно-климатические условия повлияли на занятия жителей этой страны?

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Часть 2.

7. Укажите одного исторического деятеля – Вашего земляка, жизнь которого была связана с Вашим регионом или населенным пунктом.

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8.Чем известен Ваш земляк, каков его вклад в развитие Вашего региона, или населенного пункта, или нашей страны?

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Около 7 миллионов школьников напишут всероссийские проверочные работы в 2022 году

1 марта в российских школах начинается проведение всероссийских проверочных работ (ВПР). В 2022 году они пройдут для обучающихся 4-8 классов в штатном режиме, для обучающихся 11 классов – по решению школы. Всего в написании ВПР примут участие около 7 миллионов школьников из 38 тысяч школ.

ВПР для 11 классов пройдут с 1 по 25 марта, для остальных классов – с 15 марта по 20 мая. Конкретные даты проведения ВПР для каждого класса и предмета школы определят самостоятельно в рамках установленного расписанием периода. Варианты проверочных работ формируются для каждой школы индивидуально из банка заданий ВПР.

Первыми ВПР напишут одиннадцатиклассники. Для них проверочные работы пройдут по истории, биологии, географии, физике, химии и иностранным языкам (английскому, немецкому или французскому). Эти проверочные работы проводятся по решению школы и предназначены в первую очередь для выпускников, не выбравших данные предметы для сдачи ЕГЭ. ВПР по географии школы могут провести для обучающихся 11 или 10 классов в зависимости от своего учебного плана.

С 15 марта по 20 мая пройдут ВПР для учащихся 4 классов (по русскому языку, математике и окружающему миру) и 5 классов (русский язык, математика, история, биология).

Эти проверочные работы пройдут для всех классов в параллели.

В этот же период пройдут ВПР для 6-8 классов. Обязательными для них будут ВПР по русскому языку и математике, а в 7 классах также по иностранному языку. Еще по двум предметам в этих классах ВПР пройдут на основе случайного выбора. Информация о распределении предметов по классам в каждой параллели будет направлена школам через их личные кабинеты в Федеральной информационной системе оценки качества образования.

Новшество 2022 года – возможность выполнения ряда ВПР в компьютерной форме. Такая возможность может быть предоставлена при проведении ВПР в 5 классах по истории и биологии, в 6, 7, 8 классах – по истории, биологии, географии и обществознанию. Решение о проведении проверочной работы в компьютерной форме школа принимает самостоятельно.

Также в 2022 году время выполнения проверочных работ по большинству предметов в 4 — 8 классах было сокращено до одного урока (45 минут), кроме проверочных работ по русскому языку и математике в 5-8 классах и по химии в 8 классе. ВПР рекомендуется проводить на 2-4 уроках.

При проведении проверочных работ будут соблюдаться все рекомендации Роспотребнадзора в условиях сохранения рисков распространения коронавирусной инфекции.

В школах начались Всероссийские проверочные работы – их напишут 7 миллионов учеников

1 марта в школах нашей страны стартовал «сезон» Всероссийских проверочных работ (ВПР). По информации Рособрнадзора, в 2022 году проверка знаний коснется 7 миллионов школьников из 38 000 образовательных учебных заведений. Вспомним о нюансах, рекомендованных ведомством.

Фото: Никита Чудин

1 марта в школах страны стартовали Всероссийские проверочные работы (ВПР). По информации Рособрнадзора, в этом году свои знания проверят около 7 миллионов школьников из 38 000 школ страны.

В 2022 году испытания пройдут в штатном режиме для учащихся 4–8 классов. Примут ли участие в ВПР выпускники – решит администрация учебного заведения. Если школа посчитает, что испытания для 11-классников необходимы, они начнутся 1 марта и продлятся до 25 числа. Остальные школьники приступят к ВПР 15 марта. Завершатся проверочные работы 20 мая.

На вопрос о четком расписании Всероссийских проверочных работ ученикам, педагогам, родителям отвечают, что «железного» графика нет. Даты проведения ВПР определяет каждое учебное заведение самостоятельно. Так же самостоятельно формируются и варианты проверочных работ.

Если вспомнить о рекомендациях Рособрнадзора, всплывает важный момент. ВПР ведомство рекомендовало проводить не раньше второго урока и не позже четвертого.

В 2022 году ВПР для выпускников включают шесть предметов: историю, биологию, географию, физику, химию, иностранные языки. Важный нюанс: старшеклассник не должен писать работу по предмету, который ему предстоит сдавать на ЕГЭ.

ВПР для школьников 4–х классов пройдут по русскому языку, математике, окружающему миру. Для учащихся 5 классов – по русскому, математике, истории, биологии. Проверочные работы проведут для классов параллельно.

Ученикам 6–8 классов предстоит писать ВПР в тот же период. В числе обязательных работ – русский язык и математика. Семиклассникам предстоит пройти еще и через проверку знаний иностранного языка.

Запланированы две дополнительные работы, но об этом школьники узнают позже. По словам сотрудников Рособрнадзора, они определятся методом случайного выбора.

Есть новация. Впервые некоторые ВПР можно будет преодолеть с помощью компьютера.

Такую возможность предоставят школьникам 5-х классов – на ВПР по истории и биологии, 6, 7, 8 классов – на испытаниях по истории, биологии, географии и обществознанию. Однако решение, проводить ли проверочные работы на компьютере, школы принимают самостоятельно.

В 2022 году сокращено время, отведенное на выполнение работ для учащихся 4–8 классов. Теперь по большинству предметов работы будут длиться по 45 минут. Есть исключение – ВПР по русскому языку и математике для 5–8 классов и по химии – в 8 классе.

Около 7 миллионов школьников напишут всероссийские проверочные работы

https://sn. ria.ru/20220301/proverka_shkolnikov-1775735740.html

Около 7 миллионов школьников напишут всероссийские проверочные работы

Около 7 миллионов школьников напишут всероссийские проверочные работы — РИА Новости, 01.03.2022

Около 7 миллионов школьников напишут всероссийские проверочные работы

Около 7 миллионов школьников из 38 тысяч школ напишут всероссийские проверочные работы в 2022 году, сообщает пресс-служба Рособрнадзора. РИА Новости, 01.03.2022

2022-03-01T09:35

2022-03-01T09:35

2022-03-01T09:36

социальный навигатор

сн_образование

общество

федеральная служба по надзору в сфере образования и науки (рособрнадзор)

россия

школа

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e4/0b/1a/1586480423_0:43:1000:606_1920x0_80_0_0_24779a40a7d1fc187ed92a3e9e759631.jpg

МОСКВА, 1 мар — РИА Новости. Около 7 миллионов школьников из 38 тысяч школ напишут всероссийские проверочные работы в 2022 году, сообщает пресс-служба Рособрнадзора. В российских школах 1 марта начинается проведение всероссийских проверочных работ (ВПР).ВПР для 11 классов пройдут с 1 по 25 марта, для остальных классов — с 15 марта по 20 мая. Конкретные даты проведения ВПР для каждого класса и предмета школы определят самостоятельно. Варианты проверочных работ формируются для каждой школы индивидуально из банка заданий ВПР, сообщает пресс-служба.Для одиннадцатиклассников проверочные работы пройдут по истории, биологии, географии, физике, химии и иностранным языкам — английскому, немецкому или французскому.»Они проводятся по решению школы и предназначены в первую очередь для выпускников, не выбравших данные предметы для сдачи ЕГЭ. ВПР по географии школы могут провести для обучающихся 11 или 10 классов в зависимости от своего учебного плана», — говорится в сообщении.С 15 марта по 20 мая пройдут ВПР для учащихся 4 классов — по русскому языку, математике и окружающему миру. Пятиклассники будут писать работы по русскому языку, математике, истории и биологии. В этот же период пройдут ВПР для 6-8 классов. Обязательными для них будут проверочные по русскому языку и математике, а в 7 классах также по иностранному языку, еще по двум предметам в этих классах ВПР пройдут на основе случайного выбора, сообщает Рособрнадзор.Новшество 2022 года — возможность выполнения ряда ВПР в компьютерной форме.»Такая возможность может быть предоставлена при проведении ВПР в 5 классах по истории и биологии, в 6, 7, 8 классах — по истории, биологии, географии и обществознанию. Решение о проведении проверочной работы в компьютерной форме школа принимает самостоятельно», — сообщает пресс-служба.Все рекомендации Роспотребнадзора остаются обязательными для соблюдения.

https://ria.ru/20220209/ege-1771788604.html

россия

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2022

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og. xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://sn.ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e4/0b/1a/1586480423_98:0:985:665_1920x0_80_0_0_6d973e9fea8fcc003f3253a20e02c65a.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

социальный навигатор, сн_образование, общество, федеральная служба по надзору в сфере образования и науки (рособрнадзор), россия, школа

МОСКВА, 1 мар — РИА Новости. Около 7 миллионов школьников из 38 тысяч школ напишут всероссийские проверочные работы в 2022 году, сообщает пресс-служба Рособрнадзора.

В российских школах 1 марта начинается проведение всероссийских проверочных работ (ВПР).

«В 2022 году они пройдут для обучающихся 4-8 классов в штатном режиме, для обучающихся 11 классов — по решению школы. Всего в написании ВПР примут участие около 7 миллионов школьников из 38 тысяч школ», — говорится в сообщении Рособрнадзора.

ВПР для 11 классов пройдут с 1 по 25 марта, для остальных классов — с 15 марта по 20 мая. Конкретные даты проведения ВПР для каждого класса и предмета школы определят самостоятельно. Варианты проверочных работ формируются для каждой школы индивидуально из банка заданий ВПР, сообщает пресс-служба.

Для одиннадцатиклассников проверочные работы пройдут по истории, биологии, географии, физике, химии и иностранным языкам — английскому, немецкому или французскому.

«Они проводятся по решению школы и предназначены в первую очередь для выпускников, не выбравших данные предметы для сдачи ЕГЭ. ВПР по географии школы могут провести для обучающихся 11 или 10 классов в зависимости от своего учебного плана», — говорится в сообщении.

9 февраля, 00:43

В Рособрнадзоре рассказали, как будет меняться ЕГЭ

С 15 марта по 20 мая пройдут ВПР для учащихся 4 классов — по русскому языку, математике и окружающему миру. Пятиклассники будут писать работы по русскому языку, математике, истории и биологии. В этот же период пройдут ВПР для 6-8 классов. Обязательными для них будут проверочные по русскому языку и математике, а в 7 классах также по иностранному языку, еще по двум предметам в этих классах ВПР пройдут на основе случайного выбора, сообщает Рособрнадзор.

Новшество 2022 года — возможность выполнения ряда ВПР в компьютерной форме.

«Такая возможность может быть предоставлена при проведении ВПР в 5 классах по истории и биологии, в 6, 7, 8 классах — по истории, биологии, географии и обществознанию. Решение о проведении проверочной работы в компьютерной форме школа принимает самостоятельно», — сообщает пресс-служба.

Все рекомендации Роспотребнадзора остаются обязательными для соблюдения.

История воссоединения Крыма с Россией — Биографии и справки

ТАСС-ДОСЬЕ. 16 марта 2019 года исполняется пять лет со дня проведения в Крыму и Севастополе общенародного референдума, по итогам которого 18 марта в Москве был подписан договор о вхождении в состав РФ двух новых субъектов Федерации — Республики Крым и города федерального значения Севастополя. Редакция ТАСС-ДОСЬЕ подготовила справку об истории воссоединения Крыма с Россией.

Политический кризис на Украине

В ноябре 2013 года на Украине начался политический кризис, вызванный отказом официальных властей от подписания соглашения об ассоциации с Евросоюзом. Сторонники евроинтеграции потребовали отставки президента и правительства страны. Волна беспорядков, начавшаяся в Киеве, перекинулась на другие украинские города и регионы. Однако власти Автономной Республики Крым (АРК) отказались поддерживать оппозицию. 4 февраля 2014 года президиум Верховного совета республики постановил инициировать проведение общекрымского опроса о статусе полуострова «в условиях политического кризиса и рвения к власти групп национал-фашистского толка».

22 февраля в результате госпереворота власть на Украине перешла к оппозиции, президент Виктор Янукович покинул Киев. 23 февраля исполнение обязанностей главы государства было возложено на нового спикера Верховной рады Александра Турчинова. В тот же день депутаты отменили закон, предусматривающий предоставление русскому языку статуса регионального в ряде областей страны. Это решение вызвало массовые протесты среди русскоязычного населения, прежде всего на юго-востоке Украины и в Крыму.

Акции протеста в Крыму

23 февраля 2014 года пророссийски настроенные жители полуострова, не желая признавать новое украинское правительство, начали бессрочную акцию протеста у здания Верховного совета республики. Основным требованием митингующих было отделение Крыма от Украины. В Севастополе также прошел митинг, в ходе которого главой города был избран предприниматель Алексей Чалый. Аналогичные акции прошли в Керчи и других городах Крыма, на полуострове стали формировать отряды самообороны.

26 февраля в Симферополе у стен крымского парламента произошли столкновения между сторонниками новых украинских властей и пророссийски настроенными жителями Крыма, пришедшими на митинг. В результате беспорядков два человека погибли, более 30 получили ранения. Работа Верховного совета была блокирована. На следующий день, после освобождения здания и возобновления работы парламента, депутаты отправили в отставку правительство Анатолия Могилева и назначили новым премьер-министром АРК лидера местного движения «Русское единство» Сергея Аксенова.

Референдум

27 февраля 2014 года Верховный совет республики назначил дату проведения референдума по вопросу статуса Крыма — 25 мая того же года.

1 марта Сергей Аксенов обратился к президенту РФ Владимиру Путину с просьбой об оказании содействия в обеспечении мира и спокойствия на территории полуострова. В связи с обострением ситуации в регионе референдум о статусе Крыма решено было перенести на 30 марта. В тот же день Совет Федерации РФ дал согласие главе государства на использование российских Вооруженных сил на территории Украины до нормализации общественно-политической обстановки в этой стране. Депутаты горсовета Севастополя 1 марта проголосовали за неподчинение киевским властям и за поддержку проведения в Крыму референдума о расширении статуса автономии.

6 марта Верховный совет Крыма обратился к президенту России с просьбой включить республику в состав Российской Федерации в качестве ее субъекта и назначил референдум на 16 марта. В этот же день Севастопольский городской совет принял постановление об участии в общекрымском референдуме. 11 марта была подписана Декларация о независимости Автономной Республики Крым и города Севастополя.

На общекрымский референдум 16 марта были вынесены два вопроса: «1. Вы за воссоединение Крыма с Россией на правах субъекта РФ? 2. Вы за восстановление действия Конституции Республики Крым 1992 года и за статус Крыма как части Украины?».

Вопрос считался одобренным, если его поддержат более 50% проголосовавших граждан. Бюллетени были напечатаны на трех языках — русском, украинском и крымско-татарском. По результатам голосования 96,77% граждан (или 1 млн 233 тыс. 2 человека) в Крыму и 95,6% (262 тыс. 41 человек) в Севастополе высказались за воссоединение с Россией. Явка в Крыму составила 83,1%, в Севастополе — 89,5%. За проведением референдума следили более 50 наблюдателей из 21 страны, в том числе Израиля, Франции, Италии. Большинство государств — членов ООН не признало плебисцит о статусе Крыма.

Провозглашение независимости Крыма

17 марта 2014 года Верховный совет республики принял постановление, в котором Крым был провозглашен независимым суверенным государством. В документе также содержалось обращение к России с предложением о принятии Крыма в состав РФ в качестве нового субъекта со статусом республики. В тот же день крымский парламент был переименован в Государственный совет Республики Крым, Севастопольский городской совет — в Законодательное собрание. Госсовет Крыма признал расположенную на полуострове государственную собственность Украины собственностью республики и постановил, что с 17 марта в Крыму «не применяется законодательство Украины, не исполняются решения Верховной Рады и иных госорганов Украины, принятые после 21 февраля 2014 года». Севастопольский горсовет единогласно принял постановление о вхождении Севастополя в состав России в качестве отдельного субъекта Федерации — города федерального значения.

17 марта президент России подписал указ о признании Республики Крым суверенным и независимым государством.

Воссоединение Крыма с Россией

18 марта 2014 года президент РФ Владимир Путин, председатель Совета министров Крыма Сергей Аксенов, председатель Государственного совета Крыма Владимир Константинов и глава Севастополя Алексей Чалый подписали Договор о принятии в Российскую Федерацию Республики Крым и образовании в составе РФ новых субъектов. Украина, США, Европейский союз не признали независимость Крыма и воссоединение его с Россией.

21 марта того же года Путин подписал закон о ратификации договора, а также конституционный закон о принятии Республики Крым и Севастополя в состав РФ в качестве субъектов Федерации. Президент также подписал указ об образовании Крымского федерального округа, в который вошли Республика Крым и город федерального значения Севастополь (28 июля 2016 года Крымский округ был упразднен, Республика Крым и Севастополь включены в состав Южного федерального округа). Вечером в Москве, Севастополе и Симферополе был дан праздничный салют.

11 апреля 2014 года принята Конституция Республики Крым, согласно которой государственными языками являются русский, украинский и крымско-татарский.

День воссоединения Крыма с Россией

18 марта на полуострове отмечается День воссоединения Крыма с Россией, который установлен законом «О праздниках и памятных датах в Республике Крым» от 29 декабря 2014 года. (с поправками от 3 марта 2015 года).

Когда пройдут Всероссийские проверочные работы для школьников | Москва

Российским школьникам обозначили даты проведения ВПР

МОСКВА, 1 марта, ФедералПресс. С сегодняшнего дня в российских школах начинается сезон проведения ВПР (Всероссийских проверочных работ). В Рособрнадзоре заявили, что в этом году их напишут около семи миллионов школьников из 38 тысяч школ. Информация опубликована на официальном сайте ведомства в соцсетях.

«Четкого расписания нет. Конкретные даты для каждого класса и предмета рамках установленного расписанием периода школы определят самостоятельно. Варианты работ формируются для каждой школы индивидуально», – отмечает ведомство.

Ученики 4–8 классов будут писать ВПР «по умолчанию». Для 11 классов проверочная работа может пройти с 1 по 25 марта. Для остальных – с 15 марта по 20 мая.
Кроме того, Рособрнадзор рекомендует проводить проверочные работы на 2–4 уроках, не раньше и не позже.

ВПР для 11 классов могут пройти по шести предметам: история, биология, география, физика, химия, и иностранные языки. В ведомстве уточнили еще один важный момент: выпускник не может писать работу по предмету, который он будет сдавать на ЕГЭ.

Школы могут провести ВПР по географии для учеников 11 или 10 классов. Это будет зависеть напрямую от учебного плана.

Для учеников 4–8 класса ВПР пройдут по русскому языку, математике и окружающему миру, для 5 классов – по русскому, математике, истории и биологии. Эти работы пройдут для всех классов в параллели. В тот же период будут писать ВПР 6–8 классы. Обязательными предметами для них станут русский язык и математика. 7-е классы будут писать работы еще и по иностранному языку.

Впервые в этом году некоторые ВПР можно будет пройти в компьютерной форме. Решение о проведении проверочной работы на компьютере школа принимает самостоятельно.

Напомним, ежегодно задания ЕГЭ адаптируют к современным реалиям. В 2022 году выпускников ждут очередные изменения, сообщили СМИ.

Фото: ФедералПресс / Полина Зиновьева

В школах Иркутской области стартовали всероссийские проверочные работы

02. 03.2022

Для обучающихся 10 – 11-х классов всероссийские проверочные работы (ВПР) пройдут в режиме апробации с 1 по 25 марта по истории, географии, биологии, химии, физике и иностранным языкам. Об этом сообщили в региональном министерстве образования.

В 11 классах ВПР будут проводиться по решению школы для выпускников, не выбравших перечисленные предметы для сдачи ЕГЭ. Десятиклассники могут выполнять ВПР по географии, если в 10 классе предполагается завершение образовательной программы по этому предмету. Заявки для участия в проверочных работах подали 174 школы региона.

С 15 марта по 20 мая пройдут ВПР для учащихся 4 классов (по русскому языку, математике и окружающему миру) и 5 классов (русский язык, математика, история, биология). Эти проверочные работы будут для всех классов в параллели.

В этот же период пройдут ВПР для 6-8 классов. Обязательные ВПР для них – русский язык и математика, а в 7 классах – иностранный язык. Еще по двум предметам в этих классах ВПР пройдут на основе случайного выбора. Информация о распределении предметов по классам в каждой параллели будет направлена школам через их личные кабинеты в Федеральной информационной системе оценки качества образования.

В региональном минобре отметили нововведения этого года. Так, длительность проведения ВПР по большинству предметов в 2022 году сокращена до одного урока (45 минут), кроме проверочных работ по русскому языку и математике в 5-8 классах и по химии в 8 классе. Кроме того, в 5-8 классах предусмотрена возможность проведения ВПР на компьютерах по истории, биологии, географии и обществознанию.

Школам рекомендуется для проведения ВПР предусмотреть в расписании вторые, третьи или четвертые уроки, а также использовать эти испытания как форму промежуточной аттестации в качестве итоговых контрольных работ.

Всего во всероссийских проверочных работах в Приангарье примут участие более 130 тысяч детей из 832 образовательных организаций. С демоверсиями ВПР 2022 года по всем предметам и классам можно ознакомиться на сайте ФИОКО: https://fioco. ru/obraztsi_i_opisaniya_vpr_2022.

Блог RSVP – Страница 5 из 26 – RSVP

Исследовательское общество периодических изданий штата Виктория (RSVP) приглашает участников на приз Салли Митчелл за диссертацию. Эта премия будет признавать лучший доктор философии. диссертация, защищенная в 2020 году, в которой исследуется британская периодическая печать XIX века (включая журналы, газеты и периодические издания всех видов) как самостоятельный объект исследования, а не только как источник материала для других исторических тем. . Мы приветствуем проекты с различными дисциплинарными перспективами, сосредоточенными на любом аспекте периодической печати в самой Британии или во многих странах, внутри и за пределами Империи, где британские журналы и газеты покупались, продавались и читались в течение «долгого девятнадцатого века». век» (ок.1780-1914).

Победитель получит денежное вознаграждение в размере 1000 долларов.

Как подать заявку

Кандидаты должны представить следующие документы через портал приложений Fluid Review до 1 марта 2021 г. :

.
  • Сопроводительное письмо с полной контактной информацией
  • Титульный лист, реферат и оглавление
  • Образец главы (полную диссертацию с этими материалами не подавать)
  • Имя и адрес электронной почты вашего научного руководителя

Консультантам кандидата по диссертациям будет предложено подтвердить успешную дату защиты.

После рассмотрения этих материалов призовой комитет запросит полные версии диссертаций для дальнейшего рассмотрения. Заявки принимаются с 1 февраля 2021 года. Победитель премии Митчелла будет объявлен в июле или августе 2021 года.

Вопросы об этой премии за диссертацию можно направлять президенту RSVP по адресу [email protected]

О Салли Митчелл

Премия Салли Митчелл за диссертацию была названа в честь Салли Митчелл, давнего и высоко ценимого члена RSVP, которая работала в совете организации и в ее старшем консультативном комитете.Она была автором пяти книг, в том числе биографии Фрэнсис Пауэр Кобб: викторианская феминистка, журналистка, реформатор и Новая девушка: культура девочек в Англии, 1880-1915 . Большая часть ее работ была посвящена женщинам-писательницам, женской истории, социальной истории того периода и роли периодических изданий. Салли Митчелл была преданным и горячим наставником аспирантов и усердно работала над их карьерным ростом.

5 Полезные образовательные ресурсы о Франко-Америке


Франко-американская история восходит к основанию Тринадцати колоний.Самуэлю де Шамплену, основателю Квебека в 1608 году, даже приписывают составление первой точной карты Новой Англии, когда он опубликовал свои первые путешествия 17-го века в 1613 году.

Эти ресурсы должны помочь рассказать историю о том, как французский язык и культура укоренились в Новой Англии. Мы говорим о столетиях ключевых исторических личностей, массовых миграциях и продолжающихся усилиях по сохранению Французской Новой Англии по сей день.

1. План урока: Франко-канадские иммигранты в Новой Англии

Промышленная революция изменила парадигму как для канадцев, так и для американцев, особенно на северо-востоке. С конца 19 века до середины 20 века французские канадцы из Квебека и Приморья устремились в Новую Англию в поисках работы. Это был самый большой приток французов на северо-восток США с тех пор, как гугеноты высадились в Северной Америке около 300 лет назад.


(изображение предоставлено Библиотекой Конгресса США)

Этот план урока из Библиотеки Конгресса — отличный способ познакомить учащихся с рассказами из первых рук о франко-канадских иммигрантах в Новой Англии в 1930-х годах.Урок длится 2 недели и подходит для 6-8 классов. Используя множество увлекательных первоисточников, ваши ученики узнают, как и почему франко-канадские иммигранты поселились в Новой Англии и какое культурное влияние они оказали на регион.

2. Радио: прошлое, настоящее и будущее

Хотите включить в свои планы уроков несколько радиодокументов? Мы нашли две программы. В 2018 году программа VPR «Храброе маленькое государство» выпустила книгу «Что такое история франко-канадской иммиграции в Вермонт?», отличный небольшой документ с рассказами из первых рук о том, как французский язык проник в Вермонт.

(изображение предоставлено VPR)

Говоря о VPR, мы нашли еще один замечательный сюжет о будущем французского языка в программе Общественного радио штата Мэн Все учтено . Это о том, как французский язык возрождается в Льюистоне, штат Мэн, благодаря франкоязычным африканским иммигрантам. Это отличный отрывок, который затрагивает прошлое, настоящее и будущее французского языка в Новой Англии.

Мы также нашли регулярное шоу из Нью-Хэмпшира — «Chez-nous» WFEA с Роджером Ласерте.Это трехчасовое шоу представляет собой портрет того, как французский язык выживает в современной Новой Англии. Lacerte играет французскую музыку, такую ​​как кантри Квебека, акадский фолк и международную поп-музыку. WFEA — настоящая жемчужина, вещающая на французское сообщество Merrimack с 1937 года.

3. Материалы для чтения в средней школе о франко-американском альянсе

Студенческие раздаточные материалы — это надежный источник бесплатных заданий для печати и планов уроков по широкому кругу предметов. Этот конкретный ресурс представляет собой чтение истории франко-американского союза, возникшего после Американской революции.Этот бесплатный ресурс подходит для 9-12 классов и включает материалы для чтения и четыре вопроса для проверки понимания (вместе с ключом для ответов). Наслаждаться!

(изображение предоставлено правительством Канады)

4. Французско-канадская иммиграция в США: план урока по написанию писем и ролевым играм

У Йельского института учителей Нью-Хейвена есть отличный план уроков, призванный помочь учащимся развить ощущение большого мира вокруг них и того, как другие люди формировали его на протяжении истории.

(изображение предоставлено Университетом Южного штата Мэн)

Блок изучает географию франкоязычной Северной Америки и семей иммигрантов, которые принесли французский язык и культуру в Соединенные Штаты, особенно через Новую Францию, а затем и Канаду. Темы варьируются от изгнания акадийцев в 1755 году, на которое приходится большая часть французов в Луизиане, до массовой иммиграции во время промышленной революции в Новую Англию. Учащиеся поставят себя на место первых франко-канадских иммигрантов и будут практиковать свой французский язык посредством написания писем и ролевых игр.Это действительно довольно всеобъемлющий и практический план — идеальный план урока, чтобы ваши ученики применяли свой французский.

5. Выбор избалован: франко-американская коллекция

Ф.Ю.С.Айнюк


Эта программа предлагает тщательно отобранные и проверенные курсы Бангорского университета, которые будут переведены обратно в UNCW и будут учитываться при выполнении требований к выпускным. Студенты будут записываться на полный рабочий день занятий (12-15 кредитных часов).Все студенты будут зачислены на основной обязательный курс, а также на три или четыре дополнительных курса.

Регистрация на курс

Регистрация на занятия в Bangor University немного отличается от UNCW. Не волнуйтесь, персонал UNCW и Бангор будут рядом, чтобы помочь вам.

Сначала вы встретитесь с сотрудниками UNCW, чтобы обсудить наличие курсов и то, что может лучше всего подойти для вашей специальности/дополнительной специальности в UNCW. Поскольку некоторые из курсов, которые вы, возможно, захотите пройти, могут быть недоступны или могут конфликтовать с другим временем занятий, мы будем тесно сотрудничать с вами, чтобы у вас также было несколько резервных вариантов курса.

Онлайн-регистрация для этой программы произойдет незадолго до вашего приезда в Уэльс. По прибытии в Бангор вас попросят посетить мероприятие по проверке документов, на котором будет подтверждена ваша личность. Этот шаг завершает вашу регистрацию в качестве студента.

Обязательный курс

Глобальные кельтские культуры: исследование через призму Уэльса
Этот курс знакомит учащихся с кельтскими языками и их культурами, как историческими, так и современными. Внимание уделяется в первую очередь валлийскому и ирландскому языкам со ссылкой на четыре других живых кельтских языка и оспариваемую кельтскую идентичность Галисии (Испания) и общин США. Курс дает знания и обучает навыкам, которые имеют отношение не только к конкретным случаям кельтских языков Великобритании и Ирландии, но, в более широком смысле, к культурам коренных народов и меньшинств в целом.

Курс сначала рассматривает историческое развитие кельтских языков и их литератур (в частности, кладезь средневековых мифов и легенд, а также замечательную поэзию бардовских традиций).Затем мы проследим эволюцию этих культур через колонизацию и упадок в период кельтского возрождения, политического протеста и языкового возрождения, включая создание сообществ говорящих на кельтских языках в Америке.

Учитывая, что Бангор расположен в районе Уэльса с наибольшим количеством говорящих на валлийском языке сообществ, учащимся рекомендуется развивать свое понимание этого материала за пределами классной комнаты, где они могут обнаружить и рассмотреть из первых рук факторы (и проблемы ), которые способствуют сохранению в двадцать первом веке языка, на котором здесь говорили до прихода римлян.

Часть обучения будет проходить в форме экскурсий, во время которых будут посещены ключевые культурные/исторические места. Этот курс будет засчитываться для получения степени «Жизнь в глобальном обществе» в UNCW.

Другие варианты курса/модуля:

История, философия и социальные науки

HXA — 1105     Археологические принципы и методы

Этот модуль знакомит учащихся с идеями, которые вдохновляют и вдохновляют археологов. Таким образом, студенты должны изучить основные принципы, которым следуют археологи, и методы, которые они используют.Археология — это дисциплина, которая связана с социальными, гуманитарными, естественными науками и науками об окружающей среде. Археологи сотрудничают со специалистами во всех этих областях и, следовательно, используют самые разные материалы. Таким образом, археологи используют целый ряд навыков, от крупномасштабных раскопок до полевых записей на изолированных участках и лабораторной идентификации пыльцевых зерен. Вместе эти многочисленные аспекты дисциплины объединены общей целью: раскрыть несколько миллионов лет человеческого прошлого (и нашей эволюции) посредством изучения материальных останков.Этот курс направлен на то, чтобы предоставить студентам широкие знания по этим темам, а также по тому, как археология изучается на университетском уровне.

HXH — 1104    Введение в современную историю 1815-1914 гг.

Этот модуль рассматривает время между Венским конгрессом и началом Первой мировой войны с широкой точки зрения, от социальной структуры до политической и военной истории и от культурных тенденций до империализма. Он сосредоточен в Европе (включая Британские острова).Ожидается, что студенты будут посещать все лекции, чтобы получить представление об общих темах и их взаимосвязи. В рамках модуля будут представлены учебные навыки и методологические подходы.

HXH -1105     Введение в историю и наследие

Этот курс знакомит с дискуссиями о природе наследия; отношения между наследием и дисциплинами истории и археологии; и важность наследия для народного восприятия прошлого. Мы исследуем наше изменяющееся отношение к прошлому и его материальным остаткам; способ, которым мы строим наши взгляды на прошлое; сферы, на которых выражаются эти взгляды; и способы использования этих взглядов.Этот курс побудит вас критически осмыслить исторические и археологические аргументы и то, как прошлое интерпретируется в различных контекстах, от академических дисциплин истории и археологии до общественной сферы. Таким образом, этот курс предложит критику наследия, но также попытается развить понимание его все более важной роли в современном обществе. Мы рассмотрим историю академических подходов к прошлому; развитие музеев; возрастающая роль государства в индустрии наследия; разнообразие объектов наследия; и, наконец, как прошлое используется для создания чувства идентичности, места и принадлежности.

ВПР — 1330     Введение в философию религии

Философия религии в самом широком смысле занимается вопросами, касающимися Бога, религии и религиозной веры. Существует ли Бог? Какими свойствами или атрибутами обладает Бог? Рационально ли верить в Бога и есть ли веские аргументы за или против теизма или атеизма? Существует ли такая вещь, как душа, загробная жизнь или личное бессмертие? Этот модуль представляет собой общее введение в современную философию религии в аналитической традиции, охватывая некоторые архетипические попытки ответить на эти вопросы. Мы рассмотрим лучшие (и худшие) аргументы за (или против) существования Бога. Мы также обсудим некоторые более широкие вопросы философии религии, например, можно ли считать религиозные положения «истинными», существуют ли жизнеспособные альтернативные представления о Боге, а также природу и цель межрелигиозного диалога. Наконец, мы рассмотрим смысл жизни.

LXZ-1700 — Создание национальных историй

Этот модуль направлен на то, чтобы дать учащимся возможность определить ключевые события в истории Европы и Азии и дать им представление об основополагающих моментах в создании современности.Это разовьет понимание учащимися взаимосвязи национальных историй и их способность контекстуализировать национальные события с точки зрения развития современной / современной культуры, менталитета и систем ценностей. Модуль также предоставит учащимся широкий исторический контекст, в котором они могут начать размещать культурные репрезентации, изучаемые в более продвинутых, специализированных модулях. Что касается навыков, модуль направлен на то, чтобы вооружить учащихся навыками критического чтения и анализа и побудить их читать на целевом языке в соответствии с выбранной программой обучения и языковым уровнем.Основание в исторических знаниях важно для понимания контекстов, в которых появляются тексты, события и идеи. Этот модуль познакомит вас с ключевыми событиями в истории Европы и Азии, дав вам представление о некоторых основополагающих моментах в создании современного мира. Благодаря этому модулю вы разовьете их понимание взаимосвязанного характера национальных историй. Кроме того, этот модуль разовьет вашу способность контекстуализировать национальные события с точки зрения развития современной культуры, менталитета и систем ценностей.Модуль построен вокруг пяти взаимосвязанных блоков, охватывающих языковые направления, представленные на кафедре современных языков и культур.

HXH 1111       Европа в Средневековье

Этот модуль направлен на то, чтобы познакомить учащихся с событиями и тенденциями одиннадцатого и двенадцатого веков, обеспечивая основу для многих модулей, предлагаемых на уровнях 5 и 6. Этот модуль исследует историю Западной Европы примерно с 1000 по 900 год33 c . 1250.Это был период так называемого «конкурса инвестиций», борьбы между империей и папством за господство в Европе; расширение Латинской Европы, когда крестоносцы основывали латинские государства на Святой Земле, христианские короли Испании отбрасывали мавров на Пиренейский полуостров, а крестоносцы и миссионеры завоевывали и заселяли славянские земли к востоку от реки Эльбы. Эти завоевания, в свою очередь, помогли зажечь «возрождение двенадцатого века» с открытием заново римского права, классических текстов и развитием нового архитектурного стиля, известного сегодня как готический стиль.Экономические и политические тенденции также привели к консолидации королевства Франции и фрагментации королевства Германии, и модуль исследует расходящиеся истории этих двух могущественных европейских государств, останавливаясь на пути к изучению правления императора Фридриха II, «чудо света», который, будучи отлученным от церкви, вел переговоры о возвращении Иерусалима христианам, проводил бесчеловечные эксперименты, чтобы утолить свою жажду знаний, и написал книгу об искусстве охоты с ястребами.

VPR-1116       Введение: иудаизм и христианство

Целью модуля является дать учащимся базовое введение в иудаизм и христианство. Модуль начнется с краткого изложения некоторых основных принципов еврейской веры, отраженных в Ветхом Завете. Затем будет рассмотрено влияние раввинов на иудейскую веру в первые века нашей эры. Затем следует обзор некоторых противоречий, с которыми сталкивался иудаизм на протяжении столетий, кульминацией которых стало обсуждение вопросов, касающихся Холокоста.Некоторые из основных течений еврейской мысли станут очевидными при обсуждении некоторых людей, которые на протяжении столетий вносили свой вклад в еврейскую мысль, таких как Маймонид и Мартин Бубер. Затем модули обратятся к христианской вере и рассмотрят некоторые богословские вопросы, вытекающие из Нового Завета, с акцентом на теологию Павла. Затем будет рассмотрен вклад некоторых отцов ранней церкви, таких как Ориген и Евсевий, и продолжится обсуждение репрезентативной выборки основных христианских мыслителей на протяжении веков.

ВПР-1119       Введение в ислам

Этот модуль предоставит широкий обзор исторической и религиозной конфигурации ислама вместе с всесторонним анализом исламских верований и обычаев. Модуль начнется с изучения ранней исламской истории, общества и философии, охватывая жизнь и карьеру Пророка Мухаммеда, а также Коран и Сунну как основные источники исламского богословия, а также отдельные вопросы исламского права и философии. .Модуль также будет стремиться представить более широкое понимание и толкование разнообразной природы исламской веры, а именно развития шиитской секты. В нем будет исследована природа религиозного отношения, сосредоточенного на фигуре Али, и его последствия для религиозных, а также философских взглядов сменявших друг друга шиитских общин. Таким образом, модуль направлен на то, чтобы побудить студентов понять более широкий круг вопросов, связанных с изучением ислама, рассматривая как религию ислама, так и мусульман в конкретном социальном и историческом контексте.

SXU-1103       Понимание общества

Этот модуль знакомит учащихся с социологией и обеспечивает основу для дальнейшего изучения предмета. Он начинается с общего обзора того, как социологи осмысливают мир, в котором мы живем, и как они строят теории для объяснения паттернов и закономерностей социальной жизни. Он исследует природу «общества» и процессы исторических изменений, а также исследует происхождение и развитие социальных институтов, таких как семья, образование, работа и религия.Цели модуля: 1. Познакомить студентов разного происхождения с «социологическим воображением», сосредоточив внимание на ключевых теориях, концепциях и темах социологии. 2. Рассмотреть природу и определение «общества», а также типы социальной классификации и социальных групп, из которых оно состоит, включая социальный класс, пол и расу. 3. Изучить причины и последствия социальных изменений, включая урбанизацию, модернизацию и глобализацию. 4. Исследовать происхождение и развитие социальных институтов, таких как система образования и национальное государство. 5. Обсудить природу и роль культуры в социальной жизни и в связи с социальным поведением и социальной идентичностью. 6. Исследовать процессы социального взаимодействия и коллективного поведения между людьми с точки зрения социализации и коллективных действий, связанных с социальными движениями.

SXY-1107        Введение в уголовное правосудие

Этот модуль предназначен для того, чтобы дать учащимся первого года четкое представление о том, каким образом в Англии и Уэльсе преступность попадает в поле зрения властей, как измеряется преступность, как преступность контролируется, как обвиняемые доставляются к суду. суд, и те, кто признан виновным, приговорены и наказаны.Модуль представляет собой исторический обзор истоков уголовного права, полиции, уголовных судов и тюрем, исследуя значительные социальные, экономические и философские изменения, которые помогли сформировать современное уголовное правосудие и пенитенциарную систему. В нем рассматриваются функции органов уголовного правосудия, исследуются некоторые из преобладающих идей и теорий о том, как работают системы, и поднимаются важные вопросы о том, как осуществляется уголовное правосудие и осуществляется наказание.

Музыка и медиа

WXZ 1300      Музыка с 1850 года

Этот модуль знакомит студентов с музыковедением посредством обзора истории музыки с 1850 года по настоящее время в сочетании с серией семинаров по навыкам обучения. В модуле рассматриваются избранные произведения в различных жанрах художественной музыки и популярных жанров. Изменения и развитие музыкального стиля будут происходить в их историческом, культурном, социальном, географическом и эстетическом контексте. Кроме того, учащиеся проводят более глубокое изучение двух произведений, исследуя их аналитически как музыкальные тексты и исследуя обстоятельства, в которых они были созданы.

WXZ 1108      Гармония и контрапункт

Этот модуль направлен на развитие у учащихся понимания элементов музыкального языка – мелодии, гармонии, контрапункта, ритма – посредством изучения композиционной практики в периоды позднего Возрождения и барокко. Студенты проходят курс обучения, который развивает слуховые навыки, оценивает навыки чтения и анализа, креативность и глубокое понимание параметров построения музыки в рассматриваемые периоды. Развивать понимание учащимися элементов музыкального языка. Например, с помощью четырехчастных хоральных гармонизаций И. С. Баха этот модуль исследует все основные аспекты тональной музыки периода общепринятой практики, включая: мелодию и гармонию; фразы и периоды; каденции; триадная гармония; инверсии; голосовое сопровождение; продление; фигурно-римский анализ; проходящие ноты и интонации; фигурный бас.

UXS-1062: Киноязык

Этот модуль предоставляет учащимся набор инструментов для анализа движущегося изображения и направлен на то, чтобы предоставить учащимся технический словарь, позволяющий им анализировать и обсуждать, как фильмы передают смысл.Подробно анализируются отдельные элементы этого инструментария. Лекции охватывают такие темы, как: мизансцена, монтаж, операторская работа, звук, освещение и стиль. Еженедельные показы иллюстрируют соответствующие аспекты формы фильма.

Фильмы, которые будут показаны: «Сбежавший человек» (Брессон, 1956), «Хизерс» (Леманн, 1988), «Беги, Лола, беги» (Тиквер, 1998), «Ультиматум Борна» (Гринграсс, 2007), «Головокружение» (Хичкок, 1958), «Хижина в Лес (Уидон, 2012) и Мулен Руж! (Лурман, 2001)

UXZ– 1063     История кино

Этот модуль направлен на то, чтобы дать учащимся понимание связи между кинотехнологиями, повествованиями, стилями, жанрами и предметами, а также обществами, в которых циркулируют фильмы. Лекции познакомят студентов с рядом важных изменений, которые повлияли на развитие кино как средства массовой информации. Модуль поможет учащимся расположить выбранные фильмы в их культурном, политическом, историческом и технологическом контексте. Лекции охватывают такие темы, как: вехи раннего кинематографа, советский монтаж, немецкий экспрессионизм, сюрреализм, введение диегетического звука, классическая голливудская студийная система, послевоенное японское кино, итальянский неореализм и французская новая волна.

Языки, литература и лингвистика

LXZ 1700        Создание национальных историй

Основание исторических знаний важно для понимания контекстов, в которых появляются тексты, события и идеи. Этот модуль познакомит вас с ключевыми событиями в истории Европы и Азии, дав вам представление о некоторых основополагающих моментах в создании современного мира. Благодаря этому модулю вы разовьете их понимание взаимосвязанного характера национальных историй.Кроме того, этот модуль разовьет вашу способность контекстуализировать национальные события с точки зрения развития современной культуры, менталитета и систем ценностей.

Психология

PPP-1002       Стресс и бедствие

В этом модуле будут представлены концепции физического и психического здоровья и описаны биопсихосоциальные подходы к здоровому поведению и психическим расстройствам. На лекциях по психологии здоровья будут рассмотрены определения здоровья, модели поведения в отношении здоровья, употребление алкоголя, стресс и болезни.Лекции по клинической психологии будут охватывать классификацию и диагностику психических расстройств, объяснения психопатологии, расстройств настроения и расстройств, связанных с употреблением психоактивных веществ. Этот модуль поможет вам понять научные основы психологии, применять различные точки зрения к психологическим проблемам и эффективно излагать психологические концепции в письменной форме.

PPP1009          Человеческий язык и его нарушения

Язык имеет основополагающее значение для человеческого опыта, предоставляя инструменты для мышления и способ для нас передавать сложные мысли другим. Язык также является отличной системой для понимания того, как работает человеческий разум. Этот модуль представляет собой введение в психологическое изучение языка, включая овладение языком (как младенцы и взрослые изучают языки?), понимание (как мы преобразуем слуховые и/или визуальные сигналы в значение?) и речь (как мы преобразовывать наши мысли в последовательности моторных движений, чтобы осмысленно общаться с другими?). Мы также рассмотрим причины и особенности языковых нарушений, таких как афазия и дислексия.Хотя точный план может варьироваться от года к году, обычно рассматриваются следующие темы: овладение языком и нарушения развития; понимание языка и разговорная речь; чтение и его нарушения; многоязычие; лингвистическая относительность; языковая врожденность.

 

Медицинские науки

MSE-1022      Введение в микробиологию

Этот модуль предназначен для ознакомления с прокариотическими и эукариотическими микроорганизмами. Дифференциальные характеристики и структуры микробных клеток будут изучаться вместе с динамикой микробного роста, внедрением механизмов устойчивости к антибиотикам, патогенезом и участием микробов в заболеваниях человека. В разделе, посвященном микологии, будут рассмотрены жизненные циклы грибов и их положительное и отрицательное влияние на повседневную жизнь. Разнообразие вирусов, включая важные с медицинской точки зрения вирусы, будет затем рассмотрено с точки зрения их морфологии, типа генома и стратегий роста. Также будет включено краткое введение в паразитов.

PPP-1003 — Научное письмо

Этот модуль развивает и отрабатывает основные навыки, необходимые для эффективного общения в науке в целом и в психологии в частности.Целью этого модуля является развитие у студентов навыков научного общения и поощрение их уверенности в своей способности эффективно распространять идеи с использованием различных средств и в психологическом сообществе. В этом модуле учащиеся разовьют ряд переносимых коммуникативных навыков. Модуль будет включать в себя следующие компоненты:

Распространение информации (DOI): Студенты прослушают серию исследовательских лекций и сообщат их содержание в письменной форме

Написание научных работ (WfS): учащиеся примут участие в семинарах, чтобы развить навыки письма в области научных исследований.

Типичная учебная программа будет включать семинары и лекции по: стилю письма APA, письму кратко, письму четко, ссылкам и цитатам APA и навыкам критического мышления.

MSE-0003       История медицины

Этот модуль исследует исторический контекст медицинских наук, включая изучение медицинской и исследовательской этики.

В ходе этого модуля студенты изучат следующие предметы:

Почему история медицины важна?

Медицинская этика: от Гиппократа до Генриетты Лакс.

Эволюция понимания анатомии.

Изменение лица инфекции: сифилис, проказа и туберкулез.

Убей или вылечи: медицина от палеолита до наших дней.

Гендер в медицине.

Испанский грипп и его роль в создании современных систем общественного здравоохранения.

Понимая как исторический, так и научный контекст, стоящий за этими вопросами, учащиеся, успешно завершившие этот модуль, разовьют критическое понимание того, что медицинские науки не являются статичной областью.

MSE 1019        Надлежащая лабораторная практика

Знакомство с важным набором передаваемых навыков, которые позволяют учащимся в полной мере воспользоваться другими модулями уровня 4 (первого года), а также подготовить их к работе на более поздних этапах курса. Особое внимание будет уделено безопасной и эффективной работе в лаборатории. На занятиях будут развиваться навыки использования основного лабораторного оборудования. Будут включены избранные ключевые методы и методологии, используемые в клинических лабораториях.

Обратите внимание: этот модуль является основным компонентом программы получения степени в области биомедицинских наук, аккредитованной Школой медицинских наук.

Лабораторные навыки Занятия по навыкам включают лабораторные работы, наряду с теорией, для поддержки понимания основных методов и принципов работы лабораторного оборудования. Каждое занятие будет состоять из небольшой оценки.

Практические студенты будут применять то, что они узнали во время практических занятий, для создания и интерпретации данных и представления этой информации в виде лабораторного отчета.

Учебные пособия Модуль завершится учебными занятиями, чтобы охватить аспекты лабораторных занятий и подготовиться к экзаменационным вопросам, основанным на теории.

MSE-1024       Основы химии

Этот модуль направлен на то, чтобы учащиеся с небольшим опытом в химии или без него были уверены в основных знаниях и понимании различных областей химии, которые имеют особое значение в медицинских науках. Студенты рассмотрят различные области физической, неорганической и органической химии в биомедицинском контексте.У них разовьется интерес к химии, и они станут увереннее в использовании химической номенклатуры и концепций в будущих модулях.

В ходе этого модуля студенты изучат следующие темы:

Атомные структуры и периодическая таблица.

Склеивание в химии

Количество вещества.

Кислоты и основания

Фундаментальная органическая химия.

Спортивное здоровье и физические упражнения

JXH-1040        Принципы прочности и теплопроводности

Вы когда-нибудь задумывались, как специалисты по силовой и физической подготовке помогают улучшить результаты спортсменов? Этот модуль познакомит с фундаментальными принципами силы и физической подготовки, включая теорию науки о тренировках, анализ потребностей спортсменов и спорта и мониторинг спортсменов во время тренировок и соревнований.

В ходе курса вы познакомитесь с фундаментальными теориями обучения науке. Вы также проведете анализ потребностей спортсменов и узнаете, как такие факторы, как индивидуальные профили спортсменов, физиологические потребности и профиль травм в спорте, могут влиять на процесс силы и физической подготовки. Модуль также поможет вам понять, как разрабатывать тренировочные программы, учитывать различные типы тренировок и как контролировать спортсменов в тренировочном процессе для оптимизации результатов.Предварительно выпущенный контент познакомит студентов с теоретическими концепциями и разовьет их, в то время как «живые» интерактивные дискуссии и тематические исследования «реального мира» помогут перенести эти знания в практическую область.

Модуль преподается учеными, имеющими опыт работы в качестве практиков в области профессионального и спортивного спорта и являющимися активными исследователями в этой области.

Краткое содержание: — Карьера и аккредитация в силовой и физической подготовке — Основные принципы силовой и физической подготовки — Анализ потребностей спортсменов и спорта — Разработка программы — Подготовка к тренировке — Программирование упражнений — Мониторинг спортсменов во время тренировочного процесса.

JXH-1044        Проведение успешных исследований

Для успешной карьеры во всех сферах спорта, здравоохранения, медицины и физических упражнений ключевое значение имеет способность генерировать передовые вопросы, а также навыки разработки методов ответа на эти вопросы. Проще говоря, если вы хотите сделать карьеру, в которой вы продолжаете учиться и развивать знания, крайне важно иметь возможность понимать и проводить исследования. Цель этого курса — дать вам понимание навыков, необходимых для этого (процесса исследования).Курс проводит авторитетный и широко публикуемый исследователь спортивной науки, который помогает ведущим организациям (например, UK Sport) отвечать на вопросы, которые позволяют этим организациям оставаться на вершине своей «игры». Курс предоставит вам основные инструменты для понимания и проведения исследований, связанных со спортом, здоровьем, клиникой и физическими упражнениями. Он познакомит вас с навыками и знаниями, необходимыми, чтобы помочь вам подумать о проведении собственных исследований, а также поможет вам развить навыки аналитического и критического мышления. Именно эти навыки позволят вам читать и оценивать исследования других в отношении понимания «хорошо ли их исследование и какой вывод вы можете сделать из их работы?». Это необходимые навыки для «гарантии будущего» вашего развития на любом выбранном карьерном пути.

JXH-1025        Обучение гимнастике и легкой атлетике

В этом модуле особое внимание уделяется приобретению основных личных практических навыков, связанных с безопасным участием и обучением различным спортивным дисциплинам (бег, броски и прыжки) и образовательной гимнастике.

Модуль направлен на то, чтобы дать учащимся возможность приобретать и развиваться; Легкая атлетика

Индивидуальные достижения в различных видах – беговые упражнения, броски и прыжки 2. Судейство – измерение, хронометраж и т. д. 3. Безопасные прогрессии для развития безопасной и эффективной техники 1. Гимнастика базовые прыжки 2. Безопасность — опасности и риск 3. Безопасные прогрессии для развития безопасной и эффективной техники Общее 4. Предоставление опыта для развития навыков, знаний и понимания требований и приложений легкой атлетики и гимнастики в рамках учебной программы (грамотность, счет и др.)

Практическая деятельность будет поддерживаться дальнейшим чтением, доступным на черной доске и последующими рефлексивными действиями в соответствии с развитием передовой практики. Также большое значение будут иметь такие общие личные качества, как осведомленность, суждение и отношение, которые позволяют людям безопасно действовать в группе в потенциально опасных ситуациях. Каждое направление деятельности будет сосредоточено на соревновательных, творческих и технических вопросах. Студенты должны будут получить квалификацию тренера в одном из двух видов деятельности.

Инженерия и информатика

ICE-1111         Фонд императивного программирования

Введение в фундаментальные концепции и методы программирования, включая: алгоритмы и компьютерные программы, физические и виртуальные машины, языковые процессоры, типы данных; структуры управления; методы; ступенчатая доработка; массивы; систематическая документация; ввод/вывод и обработка файлов.

Ориентировочное содержание включает:

Типы языков программирования и их особенности; интерпретация и компиляция; Приложения; среда программирования и использование библиотек.

Использование переменных; имена переменных; примитивные типы данных; арифметические операторы; реляционные операторы; логические операторы; вычисление арифметических и логических выражений; присвоение значений переменным; струны; массивы; Алгоритмы массива.

Концепция алгоритма; основные управляющие структуры — последовательность, выбор и итерация; кодовые блоки; операторы if и switch; использование циклов for, do и while; условия цикла; вложенные циклы; базовые средства ввода/вывода псевдокода в качестве помощи при проектировании и документации.

Представление программных модулей в виде белого и черного ящиков; заголовок и тело компонентов метода; сигнатуры методов; параметры; решение задач с помощью пошагового уточнения; блочная структура и переменная область видимости; рекурсивные и рекурсивные методы.

Постоянное и энергозависимое хранение; понятие файла; структура текстового файла; методы файлового ввода/вывода; двоичные данные и файлы; вывод форматирования.

Правильное использование отступа кода; использование комментариев; выбор имен переменных, классов и методов; капитализация.

Vpr ВИЧ-1 вызывает дисфункцию жировой ткани in vivo за счет взаимного воздействия на ко-регуляцию PPAR/GR

Жевание жира с белком ВИЧ

ВИЧ-инфекция печально известна своим разрушительным иммунодепрессивным действием; однако иммуносупрессия — это еще не все. Пациенты, у которых вирусная нагрузка хорошо контролируется антиретровирусной терапией (АРТ), по-прежнему подвержены риску различных хронических метаболических осложнений, включая жировую дисфункцию. В некоторых из этих хронических осложнений причастны АРТ-препараты, но другие, такие как уменьшение жировых отложений и изменение распределения жира, возникают даже у нелеченных пациентов. Теперь Агарвал и др. демонстрируют, что, по крайней мере у мышей, вирусный белок ВИЧ R (Vpr) может непосредственно способствовать жировой дисфункции.

Авторы начали с наблюдения, что Vpr циркулирует в крови ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих АРТ, даже у тех, у кого вирусная нагрузка не определяется. В сочетании со знанием того, что Vpr может коактивировать глюкокортикоидный рецептор (GR) и ко-репрессировать рецептор, активируемый пролифератором пероксисом γ (PPARγ), оба из которых участвуют в регуляции метаболизма, они выдвинули гипотезу, что сам Vpr может играть патогенную роль в жировой дисфункции. в этих лицах.Они изучили две мышиные модели экспрессии Vpr, у которых отсутствовала ВИЧ-инфекция: трансгенную и фармакологическую. Только Vpr может нарушать ко-регуляцию PPAR/GR и контроль клеточного цикла в жировых отложениях и печени, вызывая жировую дисфункцию и гепатостеатоз. Если эти механизмы верны для людей, они могут привести к целенаправленному лечению этих метаболических осложнений с помощью ингибиторов Vpr, антагонистов GR или агонистов PPARγ/PPARα.

Abstract

Вирусные инфекции, такие как ВИЧ, связаны с ожирением, но отсутствуют механические доказательства того, что они вызывают жировую дисфункцию in vivo.Мы исследовали патогенную роль вспомогательного белка ВИЧ-1, вирусного белка R (Vpr), который может коактивировать глюкокортикоидный рецептор (GR) и ко-репрессировать рецептор, активируемый пролифератором пероксисом γ (PPARγ) in vitro, при ВИЧ-ассоциированной жировой дисфункции. . Vpr циркулировал в крови большинства протестированных ВИЧ-инфицированных пациентов, в том числе получающих антиретровирусную терапию (АРТ) с неопределяемой вирусной нагрузкой. Механизмы, опосредованные Vpr, исследовали in vivo с использованием мышиных моделей, экспрессирующих трансген Vpr в жировых тканях и печени (Vpr-Tg) или инфузированных синтетическим Vpr.Обе модели продемонстрировали ускоренный липолиз всего тела, гипергликемию и гипертриглицеридемию, а также тканеспецифические изменения. Жировые депо у этих мышей имели уменьшенную массу, инфильтрацию макрофагов и притупленную экспрессию гена-мишени PPARγ, но повышенную экспрессию гена-мишени GR. В печени мы наблюдали притупленную экспрессию гена-мишени PPARα, стеатоз со сниженной активностью протеинкиназы, активируемой аденозинмонофосфатом, и резистентность к инсулину. Как и у ВИЧ-инфицированных людей, Vpr циркулировал в сыворотке мышей Vpr-Tg.Vpr блокировал дифференцировку в преадипоцитах посредством остановки клеточного цикла, тогда как в зрелых адипоцитах он увеличивал липолиз с реципрокным изменением ассоциации PPARγ и GR с их целевыми промоторами. Эти результаты указывают на четкую патогенетическую последовательность: Vpr, высвобождаемый из ВИЧ-1 в тканевых резервуарах после ВРТ, может нарушать ко-регуляцию PPAR/GR и контроль клеточного цикла, вызывая жировую дисфункцию и гепатостеатоз. Подтверждение этих механизмов у пациентов с ВИЧ может привести к целенаправленному лечению метаболических осложнений с помощью ингибиторов Vpr, антагонистов GR или агонистов PPARγ/PPARα.

Архив сообщений о COVID-19 — Медицинские услуги

Уважаемое сообщество МГУ,

 

Во-первых, я хочу поблагодарить всех вас за ваше терпение и сотрудничество, пока мы путешествуем вместе. постоянно меняющаяся ситуация с COVID-19. Ежедневно я слышу истории студентов, преподаватели и сотрудники подходят к решению задач, с которыми мы сталкиваемся, или демонстрируют друг другу выдающиеся доброта в эти непредсказуемые времена.Спасибо! Вы все заставляете меня гордиться тем, что я Бобкэт.

Сегодня днем ​​президент Трамп издал директивы, призывающие американцев работать из дома. по возможности избегать дискреционных поездок, а также собраний 10 человек более. В свете этого и других указаний, предоставленных местными и федеральными органами здравоохранения, Хочу поделиться с вами новостями по следующим темам:

  • Удаленная работа для сотрудников
  • Дополнительный отпуск по болезни для больных работников
  • Международные и внутренние поездки, спонсируемые университетом
  • Отмена мероприятий, спонсируемых университетом
  • Значительные закрытия и отмены
  • Новые правила питания на территории кампуса
  • Обновление Летней школы МГУ
  • Изменение расширения MSU
  • Закрытие больших неиспользуемых классных комнат

УДАЛЕННАЯ РАБОТА ДЛЯ СОТРУДНИКОВ

Сегодня днем ​​президент Трамп издал директивы, призывающие американцев работать из дома. когда возможно.В свете этого события МГУ и Университетская система Монтаны выпускаем следующие рекомендации для обеспечения непрерывности деятельности университета сводя к минимуму распространение COVID-19 и обеспечивая доступность нашего кампуса для наши студенты, преподаватели и сотрудники, которые зависят от основных услуг, которые мы предоставляем.

Я хочу повторить это сообщение для наших сотрудников: если вы больны, риск заболеть или иметь близкого члена семьи в группе повышенного риска, вам следует оставаться домой и использовать больничный.Пожалуйста, следуйте обычным процедурам звонка и общайтесь с вашим руководителем на регулярной основе.

менеджера МГУ будут работать с преподавателями и сотрудниками с повышенными семейными потребностями в домой, чтобы рассмотреть возможность альтернативной или удаленной работы для преподавателей и сотрудников потребности семьи в уходе за детьми, стремясь поддерживать операции на рабочем месте, когда возможно.

Даже несмотря на то, что количество студентов в кампусе значительно сократилось благодаря дистанционному обучению до дальнейшего уведомления, по-прежнему существует насущная потребность в том, чтобы основные основные услуги поддерживается на территории кампуса. Одна из причин рассмотреть возможность удаленной работы для должностей которые могут быть выполнены удаленно, чтобы уменьшить трафик и риск для здоровья для наших основных поставщиков услуг, чьи обязанности не могут выполняться вне кампус.

Для дальнейшего улучшения типа дистанцирования и оптимального пространства, поощряемого здоровьем агентств в настоящее время, мы призываем отделы и подразделения использовать большую гибкость в условиях работы на дому или удаленной работы, где это возможно, до дальнейшего уведомления. Альтернатива варианты размещения в больших помещениях, которые гарантируют социальное дистанцирование менее чем за 10 люди также могут быть изучены как вариант в это время.

Сотрудники должны обсудить возможности удаленной работы со своими руководителями. Телеработа Соглашение, устанавливающее ожидания в отношении контактов и подотчетности между работниками и руководителями во время временной организации работы вне кампуса можно получить в отделе кадров. Для получения этого шаблона соглашения обратитесь к бизнес-партнеру отдела кадров вашего отдела.

Для персонала общежитий, столовых, отделений полиции университетов, заводы, студенческие поликлиники — мы понимаем, что эти обязанности не могут быть за пределами кампуса, и я хочу выразить глубокую благодарность за работу, которую вы делать. Меньшее количество людей в кампусе поможет продвигать ответственное социальное дистанцирование. Мы призываем менеджеров этих вышеупомянутых программ помочь с кадровыми потребностями. в ближайшие дни.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ОТПУСК ДЛЯ БОЛЬНЫХ РАБОТНИКОВ

Политики, которыми руководствуются все сотрудники, установлены Университетской системой Монтаны (MUS) и утвержден Попечительским советом. Сегодня компания MUS объявила, что для сотрудников, которые испытывают проблемы со здоровьем, система предоставит новый оплачиваемый отпуск в связи с COVID-19 на срок до 14 календарных дней при соблюдении определенных квалификационных требований и по согласованию с регулярными установленными законом требованиями к отпуску по болезни для государственных служащих.МГУ Сотрудники отдела кадров работают над планами администрирования этого специального отпуска в соответствии с государственными рекомендациями.

Как правило, Оплачиваемый отпуск в связи с COVID-19 помогает в ситуациях, когда сотрудники органов здравоохранения сообщают людям, или поставщиков медицинских услуг, на карантин из-за потенциального воздействия. В отдельном контекст, сотрудники, чьи должностные обязанности и ответственность не позволяют работать на дому договоренность может иметь право на использование Оплачиваемый отпуск COVID-19 на срок до 14 календарных дней по медицинским показаниям или по причине болезни, что отпуск по болезни обычно покрывает до того, как придется использовать накопленный отпуск по болезни. Следует отметить, сотрудники в этой ситуации также имеют право на удаленную работу, если они соответствуют руководящим принципам. для работы из дома: i.д., им, возможно, не придется использовать больничный или оплачиваемый COVID-19. Покинуть.

Детали еще уточняются, но эта программа отпусков будет осуществляться последовательно с шагами, предпринятыми с другими агентствами, департаментами и ветвями государственной власти.

УНИВЕРСИТЕТ СПОНСИРУЕТ МЕЖДУНАРОДНЫЕ И ВНУТРЕННИЕ ПОЕЗДКИ

Все международные поездки, спонсируемые и связанные с университетом, отменяются до конца семестра, пятницы, 8 мая 2020 г.Все спонсируемые университетом и аффилированные дискреционные (не обязательные) внутренние поездки также отменяются до конца семестра.

ОТМЕНА УНИВЕРСИТЕТСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ ДЛЯ БОЛЕЕ 10 ЧЕЛОВЕК НА СЛЕДУЮЩИЕ 15 ДНЕЙ

Сегодня президент Трамп издал национальное руководство по замедлению распространения COVID-19, в котором призвал американцев избегать собраний 10 и более человек в течение следующих 15 дней. МГУ будет следовать этому указанию и отменит все мероприятия с участием 10 и более человек. до 31 марта 2020 г. Пожалуйста, отправьте уведомление об отмене в University Communications. на [email защищено]. Все отмены будут объединены в основной список на веб-странице MSU COVID-19.

УВЕДОМЛЕНИЕ О ЗНАЧИТЕЛЬНЫХ ЗАКРЫТИЯХ И ОТМЕНАХ
  • Весеннее родео МГУ, запланированное на 2-5 апреля, переносится.Потенциально перенесено даты сейчас обсуждаются. Текущие билеты будут учтены на новые даты. Никаких действий не требуется, чтобы сохранить ваши билеты и текущее расположение мест. Ваш билет будет принят на перенесенные даты. По любым вопросам, связанным с билетами, включая запросы на возмещение, обращайтесь в билетную кассу Bobcat по телефону 406-994-2287.
  • Музей Скалистых гор МГУ будет закрыт для посещения с 17 марта по март 31. Это превентивное действие, направленное на замедление распространения вируса COVID-19 и обеспечение безопасность нашего сообщества, посетителей, сотрудников и волонтеров. Сотрудники музея продолжат работать из музея или из дома, в зависимости от характера их работы.Они будут доступны по электронной почте или телефону.

ОБЕД НА КАМПУСЕ НОВОЕ РУКОВОДСТВО

В соответствии с директивами Департамента здравоохранения округа Галлатин, изданными сегодня днем, рестораны, бары и другие заведения в Бозмане закрываются сегодня в 21:00. и оставайся закрыто — кроме самовывоза или проезда, до 8ч.м. 24 марта. Университетская еда площадки Miller и Rendezvous освобождаются от этого приказа при условии, что они будет открыт только для студентов, преподавателей и сотрудников, которые должны предъявить карту CatCard для пользоваться заведением.

Кроме того, павильон Rendezvous Dining Pavilion будет переведен на Grab ‘N’ Go/Take Out. только для того, чтобы помочь студентам, преподавателям и сотрудникам МГУ получить еду и вернуться в их комнаты общежития или офисные помещения.Как уже отмечалось, павильон Rendezvous Dining Pavilion не имеет права быть открытым для публики. Miller Dining Commons закрыт на весну перерыв.

Преподавателям и сотрудникам МГУ, желающим воспользоваться павильоном Rendezvous Dining Pavilion, потребуется карта CatCard чтобы получить доступ. Карты CatCard можно получить в офисе CatCard в подвале Миллер Обеденный Коммонс.

Розничная торговля продуктами питания в Strand Union, Norm Asbjornson Hall и Renne Библиотека была закрыта в соответствии с требованиями Департамента здравоохранения округа Галлатин. заказ.

ЗАКРЫТИЕ БОЛЬШИХ КЛАССОВ, НЕ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ

Во время чрезвычайной ситуации с COVID-19 МГУ начнет дезинфицировать и запирать большие классы чтобы свести к минимуму риск загрязнения. Это позволит сотрудникам службы охраны МГУ сосредоточиться на занятых местах по всему кампусу.

ЛЕТНЯЯ ШКОЛА

МГУ предлагает курсы Летней школы, начиная с 18 мая. В настоящее время мы планируем проводить большинство курсов с помощью дистанционных и онлайн-методов обучения для первые 12 недель летней сессии.Решения о полевых курсах, летних выездах, полевые лагеря, экспедиции и другое практическое обучение будет зависеть от руководств. от национальных и местных органов здравоохранения. Ситуация слишком динамична, чтобы принятие окончательного решения о индивидуальных или групповых курсах. я благодарен нашим инновационные преподаватели МГУ, которые усердно работают, сейчас готовятся к активному онлайн-лету срок!

ИЗМЕНЕНИЯ РАСШИРЕНИЯ MSU

С сегодняшнего дня, 16 марта, MSU Extension прекращает очные программы. до конца марта, когда он проведет переоценку ситуации с намерены возобновить как можно скорее.

MSU Дополнительные собрания из 10 и более человек следует избегать до конца Март.

Что касается собраний больших групп, MSU Extension будет придерживаться предоставленных указаний. Центрами по контролю и профилактике заболеваний, рекомендуя в течение следующих восьми недели, организаторы (будь то группы или отдельные лица), отменяют или откладывают личные мероприятия в составе 50 человек.Расширение MSU будет следовать этому руководству до 10 мая.

Обслуживание клиентов будет продолжаться посредством телефонных звонков, электронных писем, веб-сайтов, социальных сетей, выпуски новостей, радио и другие соответствующие средства. Специалисты МГУ будут думать творчески о новых способах предоставления возможностей для обучения и вовлечения.

Еще раз хочу поблагодарить все сообщество МГУ за дух сотрудничества. и выносливости за это время.Вместе мы преодолеем это испытание. Мы Бобкэтс. Мы знаем, как добиться цели.

Пожалуйста, продолжайте проверять веб-страницу MSU COVID-19 на наличие обновлений и прошлых сообщений.

Пожалуйста, будьте здоровы и в безопасности,

Структурное понимание ремоделирования убиквитинлигазы Cullin4-RING с помощью Vpr из вирусов иммунодефицита обезьян

Abstract

В ходе эволюции вирусы выработали средства манипулирования убиквитин-протеасомной системой хозяина, чтобы подавлять противовирусные факторы хозяина.Семейство лентивирусных вспомогательных белков Vpx/Vpr узурпирует субстратный рецептор DCAF1 лигаз Cullin4-RING (CRL4) хозяина, семейства модульных убиквитинлигаз, участвующих в репликации ДНК, репарации ДНК и регуляции клеточного цикла. Модуляция специфичности CRL4 DCAF1 с помощью Vpx и Vpr некоторых вирусов иммунодефицита обезьян (SIV) приводит к рекрутированию, полиубиквитилированию и последующей протеасомной деградации фактора рестрикции хозяина SAMHD1, что приводит к усилению репликации вируса в дифференцированных клетках.Чтобы раскрыть механизм убиквитилирования SAMHD1, вызванного Vpr SIV, мы провели интегративный биохимический и структурный анализ белка Vpr из SIV, заражающих Cercopithecus cephus (SIV mus ). Рентгеновская кристаллография выявляет сходство между SIV mus Vpr и другими членами семейства Vpx/Vpr в отношении взаимодействия DCAF1, в то время как криоэлектронная микроскопия и масс-спектрометрия сшивания подчеркивают расходящийся молекулярный механизм рекрутирования SAMHD1.Кроме того, эти исследования демонстрируют, как SIV mus Vpr использует динамическую архитектуру мультисубъединичной сборки CRL4 DCAF1 для оптимизации убиквитилирования SAMHD1. В совокупности настоящая работа обеспечивает детальное молекулярное понимание изменчивости и видовой специфичности эволюционной гонки вооружений между рестрикцией SAMHD1 хозяина и противодействием лентивирусам посредством белков Vpx/Vpr.

Резюме автора

Из-за ограниченного размера вирусных геномов репликация вируса в значительной степени зависит от компонентов клетки-хозяина.В дополнение к энергетическому метаболизму клетки-хозяина и ее аппарату репликации ДНК и синтеза белка механизм деградации белка является привлекательной мишенью для повторного присвоения вирусом. Некоторые вирусные факторы переключают специфичность убиквитинлигазы хозяина на противовирусные факторы хозяина, чтобы пометить их для разрушения протеасомой и снять внутриклеточные барьеры для репликации вируса. Здесь мы представляем молекулярные детали того, как вспомогательный белок вируса иммунодефицита обезьян Vpr взаимодействует с субстратным рецептором убиквитинлигазы хозяина Cullin4-RING и как это взаимодействие перенаправляет специфичность Cullin4-RING на противовирусный фактор хозяина SAMHD1. Исследования раскрывают механизм индуцированного Vpr рекрутирования SAMHD1 и последующего убиквитинирования. Более того, путем сравнения с родственными вспомогательными белками других видов вирусов иммунодефицита мы иллюстрируем удивительную изменчивость молекулярных стратегий противодействия SAMHD1, которые эти вирусы приняли во время эволюционной адаптации к своим хозяевам. Наконец, наша работа также обеспечивает более глубокое понимание внутренней работы механизма убиквитилирования Cullin4-RING хозяина.

Введение

Значительная часть вирусов в процессе эволюции разработала средства для кооптации механизма убиквитинирования своего хозяина с целью улучшения условий репликации либо путем введения вирусных убиквитинлигаз и деубиквитиназ, либо путем модификации белков хозяина, участвующих в убиквитилировании [1– 3].В частности, убиквитинлигазы хозяина являются заметной мишенью для вирусной узурпации, чтобы перенаправить специфичность на противовирусные факторы рестрикции хозяина. Это приводит к рекрутированию факторов рестрикции в виде неэндогенных neo -субстратов, вызывая их полиубиквитилирование и последующую протеасомную деградацию [4-8]. Это противодействие противовирусному репертуару хозяина имеет важное значение для инфекционности и распространения вируса [9–12], и механистическое понимание этих изменений специфичности расширяет наше понимание вирусного патогенеза и может проложить путь к новым методам лечения.

Часто модифицирующие белки, кодируемые вирусом, связываются с убиквитинлигазами Cullin4-RING (CRL4) и адаптируются к ним [5]. CRL4 состоит из каркаса Cullin4 (CUL4), который соединяет каталитическую субъединицу RING-домена ROC1 с адапторным белком DDB1, который, в свою очередь, связывается с рецепторами обменного субстрата (DCAF, DDB1- и CUL4-ассоциированные факторы) [13-17]. В некоторых случаях адаптер DDB1 служит якорем для вирусных белков, которые затем действуют как «вирусные DCAF» для рекрутирования антивирусного субстрата.Примерами являются обезьяний белок 5V вируса и мышиный цитомегаловирус M27, которые связываются с DDB1 и привлекают белки STAT1/2 для убиквитинирования, чтобы вмешиваться в интерфероновый ответ хозяина [18-20]. Точно так же CUL4-зависимое подавление передачи сигналов STAT важно для репликации вируса Западного Нила [21]. Кроме того, белок Х вируса гепатита В захватывает DDB1, вызывая протеасомное разрушение комплекса структурного поддержания хромосомы (SMC), что способствует репликации вируса [22,23].

Вирусные факторы также связываются с рецепторами DCAF и модифицируют их, перенаправляя их на антивирусные субстраты. Яркими примерами являются вспомогательные белки лентивирусов Vpr и Vpx. Все современные вирусы иммунодефицита человека и обезьян (ВИЧ/ВИО) кодируют Vpr, в то время как только две линии, представленные ВИЧ-2 и ВИО-инфицирующими мандрилами, несут Vpx [24]. Белки Vpr и Vpx упаковываются в вирионы потомства и высвобождаются в клетку-хозяина при инфицировании, где они связываются с DCAF1 [25]. В этой работе соответствующие белки вируса иммунодефицита обезьян Vpx/Vpr будут указываться с видом их хозяина в качестве нижнего индекса с использованием следующих сокращений: mus-усатая обезьяна ( Cercopithecus cephus ), mnd-mandrill ( Mandrillus sphinx ), rcm – мангабей красношапочный ( Cercocebus torquatus ), мангабей см-сажистый ( Cercocebus atys ), деб – обезьяна Де Бразза ( Cercopithecus ignorenus ), сык – обезьяна Сайка ( Cercopithecus albogularis), зеленый обезьяна ( Chlorocebus спец. ).

Vpr ВИЧ-1 важен для репликации вируса in vivo и в моделях инфекции макрофагов [26]. Недавний протеомный анализ показал, что модуляция специфичности DCAF1 белками Vpr HIV-1 приводит к подавлению сотен белков-хозяев DCAF1- и протеасом-зависимым образом [27], включая ранее описанную деградацию Vpr HIV-1 . нацелены на UNG2 [28], HLTF [29], MUS81 [30,31], MCM10 [32] и TET2 [33]. Эта удивительная неразборчивость в мишенях деградации также частично сохраняется в более отдаленных кладах, примерами которых являются Vpr agm и Vpr mus [27].Однако плейотропность Vpr и отсутствие легкодоступных экспериментальных моделей не позволили определить, как именно эти события деградации способствуют репликации [26].

В отличие от этого, Vpx имеет гораздо более узкий диапазон субстратов. Недавно сообщалось, что он нацеливает стимулятор генов интерферона (STING) и компоненты комплекса концентратора молчания человека (HUSH) на деградацию, что приводит к ингибированию противовирусной cGAS-STING-опосредованной передачи сигналов и реактивации латентных провирусов соответственно [34–36]. ].Важно отметить, что Vpx также рекрутирует фактор рестрикции SAMHD1 в DCAF1, чтобы пометить его для протеасомной деструкции [37,38]. SAMHD1 представляет собой дезоксинуклеотидтрифосфат (dNTP) трифосфогидролазу, которая ограничивает репликацию ретровирусов в неделящихся клетках путем снижения пула dNTP до уровней, которые не могут поддерживать вирусную обратную транскрипцию [39–46]. Ретровирусы, которые экспрессируют Vpx, способны ослаблять ограничение SAMHD1, обеспечивая репликацию в дифференцированных миелоидных клетках, покоящихся Т-клетках и Т-клетках памяти [38,47,48].В результате постоянной эволюционной гонки вооружений между рестрикцией SAMHD1 хозяина и его вирусным антагонистом Vpx, механизм Vpx-опосредованного рекрутирования SAMHD1 в высокой степени зависит от вида и штамма вируса: клада Vpx, представленная Vpx ВИЧ-2 , распознает С-концевой домен SAMHD1 (CtD), тогда как Vpx mnd2/rcm связывает N-концевой домен SAMHD1 (NtD) принципиально другим способом [24,49–52].

В ходе эволюционной адаптации к своим хозяевам-приматам, из-за селективного давления, чтобы избежать ограничения SAMHD1, две группы SIV, SIV agm и SIV deb/mus/syk , ответвились от общего предка, содержащего Vpr белок, который был неспособен взаимодействовать с SAMHD1, и neo -функционализированный Vpr для связывания SAMHD1 и индукции его деградации.Впоследствии в результате дупликации гена или события рекомбинации клады SIV и HIV, представленные SIV rcm и HIV-2, получили белок Vpx, который взял на себя функцию деградации SAMHD1. Эти вирусы дополнительно кодируют белок Vpr с характеристиками, аналогичными предковому Vpr [24,49,53]. Следовательно, SIV agm и SIV deb/mus/syk развили «гибридные» белки Vpr, которые сохраняют нацеливание на некоторые факторы хозяина, истощенные Vpr типа HIV-1 [27], и дополнительно индуцируют деградацию SAMHD1.

Чтобы раскрыть молекулярные механизмы DCAF1- и SAMHD1-взаимодействия такого «гибридного» Vpr, мы инициировали интегративный биохимический и структурный анализ белка Vpr из SIV, заражающего Cercopithecus cephus , Vpr mus . Эти исследования выявляют сходства и различия с белками Vpx и Vpr из других видов лентивирусов и указывают на расходящийся молекулярный механизм Vpr mus -зависимого рекрутирования SAMHD1 в CUL4/ROC1/DDB1/DCAF1 (CRL4 DCAF1 ).Кроме того, криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) реконструкция белкового комплекса CRL4 DCAF1 , модифицированного Vpr mus , позволяет получить представление о структурной пластичности всей сборки убиквитинлигазы CRL4 с последствиями для механизма переноса убиквитина.

Результаты

SAMHD1-CtD необходим и достаточен для связывания и убиквитилирования Vpr

mus in vitro /DCAF1 С-концевой домен (DCAF1-CtD), белковые комплексы восстанавливали in vitro из очищенных компонентов и анализировали с помощью гель-фильтрационной (GF) хроматографии.Различные использованные белковые конструкции схематически показаны на рис. S1A. В отсутствие дополнительных партнеров по связыванию Vpr mus становится нерастворимым после удаления метки аффинной очистки GST (рис. S1B) и, соответственно, не может быть применен к колонке GF. . Взаимодействие SAMHD1 с DDB1/DCAF1-CtD не было обнаружено в отсутствие Vpr mus (рис. S1C). Анализ комбинаций бинарных белков (Vpr mus и DDB1/DCAF1-CtD; Vpr mus и SAMHD1) показывает, что Vpr mus элюируется вместе с DDB1/DCAF1-CtD (рис. S1D) или с SAMHD1 (рис. S1E).Инкубация Vpr mus с DDB1/DCAF1B и SAMHD1 с последующим GF приводила к совместной элюции всех трех компонентов (1). Вместе эти результаты показывают, что Vpr mus образует стабильные бинарные и тройные белковые комплексы с DDB1/DCAF1-CtD и/или SAMHD1 in vitro . Кроме того, инкубация с любым из этих партнеров по взаимодействию, по-видимому, стабилизирует Vpr mus , уменьшая его склонность к агрегации/нерастворимости.

Биохимический анализ Vpr mus -индуцированного CRL4 DCAF1 перенаправления специфичности.

( AC ) Анализ GF in vitro восстановление белковых комплексов, содержащих DDB1/DCAF1-CtD, Vpr mus и SAMHD1 ( A ), SAMHD1-ΔCtD ( B-SAMHD) или TAMHD 0 CtD ( C ). Объемы элюирования стандартов молекулярной массы белка указаны над хроматограммой в A . Окрашенные кумасси синим анализы SDS-PAGE фракций, собранных во время анализов GF, показаны под хроматограммами с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммами.SAM – стерильный α-мотивный домен, HD – гистидин-аспартатный домен, T4L – T4 лизоцим. Звездочка и двойная звездочка указывают на незначительное загрязнение оставшейся протеазой GST-3C и тегом очистки GST соответственно. ( D-G ) In vitro реакции убиквитилирования с очищенными белковыми компонентами в отсутствие ( D ) или в присутствии ( E-G ) Vpr mus с указанными конструкциями SAMHD1 в качестве субстрата. Реакции останавливали через указанное время, разделяли на SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием кумасси синим.

Предыдущие клеточные анализы показали, что остатки 583–626 SAMHD1 макаки-резус (SAMHD1-CtD) необходимы для протеасомной деградации, индуцированной Vpr mus [49]. Чтобы проверить это открытие в нашей системе in vitro , конструкции, содержащие SAMHD1-CtD, слитые с лизоцимом T4 (T4L-SAMHD1-CtD), или содержащие только N-концевые домены SAMHD1 и не содержащие SAMHD1-CtD (SAMHD1-ΔCtD) , инкубировали с Vpr mus и DDB1/DCAF1-CtD, и комплексообразование оценивали с помощью GF-хроматографии.Анализ полученных хроматограмм с помощью SDS-PAGE показывает, что SAMHD1-ΔCtD не элюировался совместно с DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus (). Напротив, T4L-SAMHD1-CtD накапливается в том же пике элюирования, что и DDB1/DCAF1-CtD и Vpr mus (10). Эти результаты подтверждают, что SAMHD1-CtD необходим для стабильной ассоциации с DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus in vitro , и демонстрируют, что SAMHD1-CtD достаточно для опосредованного Vpr mus рекрутирования T4L-SAMHD1- Слитая конструкция CtD с DDB1/DCAF1-CtD.

Чтобы соотнести эти данные с ферментативной активностью, было проведено анализа убиквитилирования in vitro путем инкубации SAMHD1, SAMHD1-ΔCtD или T4L-SAMHD1-CtD с очищенным CRL4 DCAF1-CtD , E1 (UBA1), E2 (UBCH5C), убиквитин и АТФ. Входные белки показаны на рис. S2A, а контрольные реакции — на рис. S2B и S2C. В отсутствие Vpr mus убиквитилирование SAMHD1 не наблюдалось (рис. и S2D), в то время как добавление Vpr mus приводило к надежному убиквитилированию SAMHD1, как показано сдвигом вверх SAMHD1 в анализе SDS PAGE, вызванным ковалентной модификацией с увеличением количества молекул убиквитина, что приводит к почти полной потере полосы, соответствующей немодифицированному SAMHD1, после 15-минутной инкубации (рис. и S2E).В соответствии с аналитическими данными GF, SAMHD1-ΔCtD не убиквитилировался в присутствии Vpr mus (рис. и S2F). Напротив, T4L-SAMHD1-CtD эффективно убиквитилировался, что приводило к потере> 90% полосы, соответствующей немодифицированному T4L-SAMHD1-CtD, через 15 минут (рис. и S2F). Опять же, эти данные подтверждают функциональную важность SAMHD1-CtD для опосредованного Vpr mus рекрутирования в убиквитинлигазу CRL4 DCAF1 .

Анализ кристаллической структуры апо- и Vpr

mus связанных белковых комплексов DDB1/DCAF1-CtD были определены структуры комплекса DDB1/DCAF1-CtD и тройного комплекса слитого белка DDB1/DCAF1-CtD/T4L-Vpr mus (остатки 1–92). Структуры были решены с использованием молекулярной замены и уточнены до разрешений 3,1 Å и 2,5 Å соответственно (таблица S1). Vpr mus принимает трехспиральный пучок, стабилизированный координацией иона цинка остатками His и Cys на спирали-1 и на С-конце (1). Наложение Vpr mus на ранее определенные структуры Vpx sm [50], Vpx mnd2 [51, 52] и Vpr HIV-1 [54] выявляет консервативную трехспиральную складку пучка и сходное положение спиральных пучков на DCAF1-CtD (рис. S3A).Кроме того, большинство боковых цепей, участвующих в DCAF1-взаимодействии, являются консервативными по типу во всех белках Vpx и Vpr (S3B, S3C, S3D, S3E, S3F, S3G и S6A, рис. 1с), что убедительно свидетельствует об общем молекулярном механизме CRL4-хозяина. Захват DCAF1 семейством вспомогательных белков Vpx/Vpr. Однако существуют также значительные различия в длине и регистре спирали, а также конформационные вариации в области петли на N-конце спирали-1, в начале спирали-1 и в петле между спиралями-2 и -3 (рис. S3A). ).

Кристаллическая структура комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus .

( A ) Общая структура комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus в двух проекциях. DCAF1-CtD показан серым рисунком и полупрозрачной поверхностью. Vpr mus показан темно-зеленым рисунком, а координированный ион цинка показан серой сферой. T4L и DDB1 опущены для ясности. ( B ) Наложение апо-DCAF1-CtD (голубой рисунок) на связанный с Vpr mus DCAF1-CtD (серый/зеленый рисунок).Показаны только области DCAF1-CtD со значительными структурными различиями между формами, связанными с апо и Vpr mus . Неупорядоченные петли обозначены пунктирными линиями. ( C ) Сравнение бинарных комплексов Vpr mus /DCAF1-CtD и тройных комплексов Vpx sm /DCAF1-CtD/SAMHD1-CtD. Для DCAF1-CtD показана только N-концевая область «кислой петли». Vpr mus , DCAF1-CtD и связанный цинк окрашены как в A ; Vpx sm представлен оранжевым рисунком, а SAMHD1-CtD — розовым. Выбранные боковые цепи Vpr/Vpx/DCAF1-CtD показаны в виде палочек, а электростатические взаимодействия между этими боковыми цепями обозначены пунктирными линиями. ( D ) Анализ GF in vitro реконструкции белковых комплексов, содержащих DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus или мутант Vpr mus R15E/R75E и SAMHD1. Анализы SDS-PAGE соответствующих фракций GF показаны под хроматограммой с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммой. ( E-F ) In vitro восстановление белковых комплексов, содержащих SAMHD1 и Vpr mus R15E/R75E ( E ) или DDB1/DCAF1-CtD и Vpr mus R15E/R759 ( 9009E ).Анализы SDS-PAGE соответствующих фракций GF показаны под хроматограммой с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммой. Звездочка и двойная звездочка указывают на незначительное загрязнение оставшейся протеазой GST-3C и тегом очистки GST соответственно.

Vpr mus связывается сбоку и сверху дискообразного 7-лопастного β-пропеллера (BP) домена DCAF1-CtD с общей площадью контактной поверхности ~1600 Å 2 , включающей три основные области взаимодействия . Удлиненный N-конец Vpr mus присоединяется к щели между лопастями DCAF1 BP 1 и 2 за счет нескольких водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий (S3B и S3C и S3D Fig). Вторая, меньшая площадь контакта образуется за счет гидрофобного взаимодействия между остатками Vpr mus L31 и E34 из Helix-1 и DCAF1 W1156, расположенными в петле на вершине лопасти BP 2 (рис. S3E). Третья поверхность взаимодействия включает С-концевую половину Vpr mus Helix-3, которая вставляется в гребень на вершине DCAF1 (рис. S3F и S3G).

Наложение кристаллических структур, связанных с apo-DDB1/DCAF1-CtD и Vpr mus , выявляет конформационные изменения в DCAF1 при ассоциации Vpr mus . Связывание N-концевого плеча Vpr mus вызывает лишь незначительную перестройку петли в лезвии 2 BP (рис. S3C). Напротив, значительные структурные изменения происходят на верхней поверхности домена BP: полярные и гидрофобные взаимодействия остатков DCAF1 P1329, F1330, F1355, N1371, L1378, M1380 и T1382 с боковыми цепями Vpr mus T79, R83, R86 и E87 в Helix-3 приводят к стабилизации участка последовательности, соединяющего лопасти BP 6 и 7 («C-концевая петля», рис. и S3F).Более того, электростатические взаимодействия боковых цепей остатков R15, R75 и R76 Vpr mus с DCAF1 E1088, E1091 и E1093 блокируют конформацию «кислотной петли» перед лезвием 1 BP, которая также неструктурирована и гибка в отсутствие Vpr. mus (Фиг.1 и S3D и S3E и S3F).

Примечательно, что в ранее определенных структурах комплексов Vpx/DCAF1/SAMHD1 «кислотная петля» является центральной точкой тройного контакта, обеспечивая платформу для связывания положительно заряженных боковых цепей аминокислот либо на N-, либо на C-конце SAMHD1 [ 50–52].Например, Vpx sm позиционирует SAMHD1-CtD таким образом, что SAMHD1 K622 вступает в электростатическое взаимодействие с остатком «кислой петли» DCAF1 D1092 (, левая панель). Однако в кристаллической структуре Vpr mus связанный Vpr mus теперь блокирует доступ к соответствующему карману для связывания SAMHD1-CtD, в частности, путем расположения расширенной N-концевой петли, которая предшествует Helix-1. Кроме того, боковые цепи Vpr mus R15, R75 и R76 нейтрализуют «кислотную петлю» DCAF1, предотвращая образование дополнительных солевых мостиков к основным остаткам в SAMHD1-CtD (правая панель).

Чтобы подтвердить важность остатков R15 и R75 Vpr mus для связывания DCAF1-CtD, путем сайт-направленного мутагенеза были созданы мутации с реверсированием заряда глутаматов. Спектр кругового дихроизма (CD) двойного мутантного GST-слитого белка Vpr mus R15E R75E был идентичен таковому дикого типа, что указывает на сходное содержание вторичной структуры и, следовательно, на отсутствие серьезных структурных нарушений, вызванных аминокислотными заменами (S3H Fig). Влияние двойного мутанта Vpr mus R15E R75E на сборку комплекса затем анализировали с помощью GF-хроматографии.Анализ полученного хроматографического профиля в SDS-PAGE показывает почти полную потерю пика комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus /SAMHD1 (фракция 6) по сравнению с диким типом одновременно с обогащением (i) некоторая доля Vpr mus R15E R75E, связанного с DDB1/DCAF1-CtD (фракция 7), (ii) свободного DDB1/DCAF1-CtD (фракция 7–8) и (iii) Vpr mus R15E R75E/ Бинарный комплекс SAMHD1 (, фракция 8–9). Это предполагает, что изменение заряда боковых цепей Vpr mus R15 и R75 ослабляет сильную ассоциацию с DCAF1, наблюдаемую в Vpr mus дикого типа, из-за потери электростатического взаимодействия с «кислотной петлей», в соответствии с кристаллической структурой.Следовательно, некоторая часть SAMHD1, связанного с Vpr, диссоциирует. Это мнение дополнительно подтверждается анализом GF бинарных комбинаций двойного мутанта Vpr mus R15E R75E либо с SAMHD1, либо с DDB1/DCAF1-CtD. Инкубация Vpr mus R15E R75E с SAMHD1 с последующим GF приводит к совместной элюции обоих белков, что сопровождается сдвигом пика элюции в сторону более высокой кажущейся молекулярной массы по сравнению с одним SAMHD1 (фракции 8–9). В противоположность этому, инкубация двойного мутанта Vpr mus с DDB1/DCAF1-CtD не изменяет объем элюции видов DDB/DCAF1-CtD, и при анализе SDS-PAGE не удается обнаружить полосу, соответствующую Vpr. соответствующие дроби (, дроби 7–8). Эти данные ясно демонстрируют потерю взаимодействия с DDB1/DCAF1-CtD при изменении заряда остатков 15 и 75 Vpr mus , в то время как активность связывания SAMHD1 сохраняется.

Крио-ЭМ анализ конформационных состояний и динамики CRL4-NEDD8

DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 механизма рекрутирования SAMHD1, мы инициировали крио-ЭМ анализ сборки CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1.В этих исследованиях небольшой убиквитин-подобный белок NEDD8 был ферментативно присоединен к субъединице CUL4, чтобы получить ее активную форму (S4A Fig) [55]. Комплекс CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 был воссоздан in vitro и очищен с помощью GF-хроматографии (S4B Fig). 2D-классификация полученных изображений частиц выявила значительную композиционную и конформационную неоднородность, особенно в отношении присутствия и положения субкомплекса CUL4-NEDD8/ROC1 (стебель) по отношению к DDB1/DCAF1/Vpr mus (ядро) (рис. S4C). .

Два последовательных раунда 3D-классификации дали три популяции частиц, что привело к 3D-реконструкциям с разрешением 8–10 Å, которые содержали как ядро ​​CRL4, связанное с Vpr mus , так и стебель (конформационные состояния -1, -2 и -3 , рис. и S4D и S4E и S4F). Качество трехмерных объемов было достаточным для соответствия кристаллографическим моделям ядра () и стебля (PDB 2hye) [15] как твердых тел (рис. и S4G). Для субъединицы каталитического RING-домена ROC1 присутствовала только фрагментированная электронная плотность рядом с положением, которое она занимает в кристаллографической модели (рис. S4G).Во всех трех состояниях электронная плотность избирательно отсутствовала для С-концевого домена В (WHB) крылатой спирали CUL4 (остатки 674–759), содержащего сайт модификации NEDD8 (К705), и для предшествующей α-спирали, соединяющей N-концевой домен CUL4 к домену WHB (фиг. S4G). В соответствии с этим наблюдением положения NEDD8, присоединенного к CRL5, и домена CRL4 ROC1 RING стерически несовместимы при наложении их соответствующих кристаллических структур (S4H Fig) [56].

Крио-ЭМ анализ конформационных состояний CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1.

( A ) Два вида наложения CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 крио-ЭМ реконструкции (конформационное состояние-1 – светло-зеленый, состояние-2 – лосось, состояние-3 -пурпурный). Части плотностей, соответствующие DDB1 BPA/BPC, DCAF1-CtD и Vpr mus , были наложены друг на друга. ( B ) Два вида суперпозиции молекулярных моделей DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus и CUL4/ROC1 (PDB 2hye) [15], которые были приспособлены как твердые тела к соответствующим крио-ЭМ плотностям; модели ориентированы как в A .DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus показан как на , CUL4 показан как мультяшный, окрашен как A , а ROC1 показан как голубой мультяшный. ( C ) Сравнение самых внешних ориентаций стебля CUL4, наблюдаемых в представленном здесь крио-ЭМ анализе (состояния-1 и -3, окрашены как B , показывают вращение DDB1 BPB на 119,5 °) с двумя крайними положениями стебля. присутствует в предыдущих кристаллических структурах (PDB 4a0l [13], PDB 6dsz [123], окрашен в серый цвет, показывает вращение DDB1 BPB на 143,4°).

Выравнивание трехмерных объемов из состояний-1, -2 и -3 показывает, что плотности ядра, представляющие DDB1 BPA, BPC, DCAF1-CtD и Vpr mus , хорошо накладываются друг на друга, указывая на то, что эти компоненты не подвергаются значительным конформационным флуктуациям и, таким образом, образуют жесткая платформа для связывания субстрата и прикрепления стебля CRL4 (). Однако вращение DDB1 BPB вокруг шарнира, соединяющего его с BPC, приводит к трем разным ориентациям стебельчатых областей состояния-1, -2 и -3 относительно ядра.Углы поворота BPB были измерены как 69° между состояниями-1 и -2 и 50° между состояниями-2 и -3.

Эти данные согласуются с предыдущим прогнозом, основанным на обширном сравнительном анализе кристаллической структуры, который постулировал прибл. Вращение ножки CRL4 вокруг ядра на 150° [13,15,16,19,57]. Однако крайние левая и правая ориентации CUL4, наблюдаемые здесь, состояния-1 и -3 из нашего крио-ЭМ-анализа, указывают на несколько более узкий диапазон вращения стебля (119 °) по сравнению с конформациями самого дальнего стебля, смоделированными из ранее определенных кристаллических структур. (143°) ().Возможное объяснение этого несоответствия возникает из проверки плотностей крио-ЭМ и подобранных моделей, показывающих, что наряду с основным интерфейсом взаимодействия на DDB1 BPB существуют дополнительные молекулярные контакты между CUL4 и DDB1. В частности, в состоянии-1 имеется контакт между петлей, соединяющей спирали D и E кулинового повтора CUL4 (CR)1 (остатки 161–169), и петлей, выступающей из лопасти 3 BP DDB1 BPC (остатки 795–801, S4I рис.). В состоянии-3 петля между спиралями D и E CUL4 CR2 (остатки 275–282) примыкает к области в С-концевом спиральном домене DDB1 (остатки 1110–1127, S4J Fig).Эти вспомогательные взаимодействия могут потребоваться для блокировки наблюдаемых здесь самых удаленных позиций стебля, чтобы ограничить диапазон вращения CUL4.

Молекулярный механизм нацеливания на SAMHD1

Повторный анализ данных крио-ЭМ, включающий сбор частиц на основе матрицы и расширенную трехмерную классификацию, позволил выделить дополнительную однородную популяцию частиц (рис. S5A и S5B). Это подмножество изображений частиц дало трехмерную реконструкцию с номинальным разрешением 7,3 Å, которая содержала только электронную плотность, соответствующую ядру CRL4 (S5A и S5B и S5C и S5D, рис.).Молекулярные модели доменов DDB1 BP A и C (BPA, BPC), DCAF1-CtD и Vpr mus , полученные из нашей кристаллической структуры (), могут быть помещены в виде твердых тел в этот объем крио-ЭМ (). Для большей части SAMHD1 не было видно явной электронной плотности. Однако при ближайшем рассмотрении был обнаружен дополнительный трубчатый, слегка дугообразный элемент плотности, ок. 35 Å в длину, расположен на верхней поверхности пучка спирали Vpr mus , примерно в 17 Å от и напротив интерфейса связывания Vpr mus /DCAF1-CtD (красные стрелки). Один конец тубулярного объема контактирует с серединой Vpr mus Helix-1, а другой конец образует дополнительные контакты с С-концом Helix-2 и N-концом Helix-3 (). Локальное разрешение 7,5–8 Å (рис. S5C) исключало возможность подбора атомной модели. Принимая во внимание биохимические данные, показывающие, что SAMHD1-CtD достаточно для рекрутирования в DDB1/DCAF1/Vpr mus , мы предполагаем, что эта наблюдаемая особенность электронной плотности соответствует области SAMHD1-CtD, которая физически взаимодействует с Vpr mus .Учитывая его размеры, предполагаемая плотность SAMHD1-CtD может вместить ок. 10 аминокислотных остатков в полностью вытянутой конформации или до 23 остатков в изогнутой спиральной конфигурации. Все предыдущие анализы кристаллической структуры [46], а также предсказания вторичной структуры указывают на то, что остатки SAMHD1 на С-конце каталитического HD-домена и С-концевой доли (аминокислоты 599–626) неупорядочены в отсутствие дополнительных партнеров по связыванию. Соответственно, N-концевые глобулярные домены молекулы SAMHD1 могут быть гибко связаны с C-концевой связью, идентифицированной здесь.В этом случае основная масса SAMHD1 сэмплирует множество позиций относительно ядра DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus и, следовательно, усредняется в процессе крио-ЭМ реконструкции.

Механизм рекрутирования SAMHD1-CtD с помощью Vpr mus .

( A ) Два вида крио-ЭМ реконструкции ядра CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1. Кристаллическая структура комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus была вписана как твердое тело в крио-ЭМ плотность и показана теми же цветами, что и на рис.Модель и плотность DDB1 BPB были удалены для ясности. Красными стрелками отмечена дополнительная плотность на верхней поверхности пучка спирали Vpr mus . ( B ) Подробное изображение электронной плотности SAMHD1-CtD. Модель имеет ту же ориентацию, что и в A , левая панель. Выбранные остатки Vpr mus W29 и A66, которые находятся в тесном контакте с дополнительной плотностью, показаны красным цветом. ( C ) Реконструкция in vitro белковых комплексов, содержащих DDB1/DCAF1-CtD, Vpr mus или мутант Vpr mus W29A/A66W, и SAMHD1, оцененная с помощью аналитического GF.Анализы SDS-PAGE соответствующих фракций GF показаны под хроматограммой с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммой. ( D-E ) In vitro восстановление белковых комплексов, содержащих SAMHD1 и Vpr mus W29A/A66W ( D ) или DDB1/DCAF1-CtD и Vpr mus W29A/A606W ( E 9006W). Анализы SDS-PAGE соответствующих фракций GF показаны под хроматограммой с цветными прямоугольниками в соответствии с хроматограммой.Звездочка и двойная звездочка указывают на незначительное загрязнение оставшейся протеазой GST-3C и тегом очистки GST соответственно.

Для проверки этой гипотезы аминокислотные остатки Vpr mus в непосредственной близости от предполагаемой плотности SAMHD1-CtD были заменены с помощью сайт-направленного мутагенеза. В частности, Vpr mus W29 был заменен на аланин, чтобы заблокировать гидрофобный контакт с SAMHD1-CtD с участием ароматической боковой цепи, а Vpr mus A66 был заменен на объемный триптофан, чтобы вызвать стерическое столкновение с SAMHD1-CtD. ().Структурная целостность двойного мутанта Vpr mus W29A A66W была подтверждена с помощью спектроскопии CD (S3H Fig), а затем было оценено образование комплекса с DDB1/DCAF1-CtD и SAMHD1 с помощью аналитического GF. По сравнению с Vpr mus дикого типа, мутант W29A A66W показал снижение интенсивности пика комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus /SAMHD1 (фракция 6) одновременно с (i) обогащением DDB1/DCAF1-CtD/ Тройной комплекс Vpr mus , субстехиометрически связанный с SAMHD1 (, фракция 7), (ii) избыток комплекса DDB1/DCAF1-CtD (, фракция 8) и (iii) избыток SAMHD1 (, фракции 9–10).Кроме того, с помощью GF также были проанализированы бинарные комбинации двойного мутанта Vpr mus W29A A66W с DDB1/DCAF1-CtD или SAMHD1. Эти данные показывают потерю взаимодействия с SAMHD1 (1), в то время как способность связывать DDB1/DCAF1-CtD сохраняется (3). В совокупности эти биохимические анализы подтверждают расположение сайта связывания SAMHD1-CtD на верхней поверхности пучка спирали Vpr mus , что подтверждается крио-ЭМ реконструкцией среднего разрешения.

Для получения дополнительных экспериментальных данных сборка CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 была дополнительно исследована с помощью масс-спектрометрии сшивки (CLMS) с использованием фотореактивного сшивающего агента сульфо-SDA.Это бифункциональное соединение содержит функциональную группу сложного эфира NHS на одном конце, которая реагирует с первичными аминами и гидроксильными группами, а другой конец ковалентно связан с любой боковой цепью аминокислоты в пределах досягаемости при УФ-активации через промежуточный карбен [58]. Соответственно, инкубация белков или белковых комплексов с сульфо-SDA с последующим УФ-освещением позволяет сшивать с высокой плотностью боковые цепи лизина и, в меньшей степени, серина, треонина и тирозина с аминокислотами в пределах досягаемости SDA. спейсерная группа с более быстрой кинетикой, чем сшивающие агенты на основе чистых эфиров NHS, из-за короткого периода полураспада промежуточного соединения, активируемого УФ-излучением.Сшитые пептиды впоследствии идентифицируются с помощью масс-спектрометрии и дают представление о топологии и расстояниях между остатками белков и комплексов [59]. В случае сборки CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 большинство идентифицированных поперечных связей, которые могут быть отображены на структуру (468/519, 90,2%), находятся в пределах установленного порога нарушения 25 Å. по геометрии проставки SDA. Интересно, что 8 из 11 поперечных связей между DDB1 и CUL4 удовлетворяются моделью состояния 1, но все чаще нарушаются в состояниях 2 и -3 (S5E Fig), поддерживая в решении ротационную гибкость стебля CRL4 по отношению к DDB1/DCAF1-CtD, наблюдаемый в крио-ЭМ ().

Дополнительные 300 поперечных связей включали SAMHD1, простирающиеся до С-концевой половины CUL4, до участка последовательности DDB1, включающего аминокислотные остатки 900–1000, до частей DCAF1-CtD и до Vpr mus (рис. и S5E). ). Остатки CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus , демонстрирующие перекрестные связи с SAMHD1, были картированы на модели состояния 2 и показали наличие большой, но определенной поверхности взаимодействия (1). Важно отметить, что были очевидны перекрестные связи между С-концом SAMHD1-CtD (остатки K622, K626) и областью в Vpr mus Helix-1 (остатки 27–36), которая образует часть предполагаемого SAMHD1-CtD. интерфейс связывания, наблюдаемый в крио-ЭМ, и который содержит Vpr mus W29, один из остатков которого заменен в мутагенезе и биохимическом анализе, представленном выше (, фиолетовые сферы).Кроме того, аминокислотные остатки из N-концевой части SAMHD1-CtD (остатки K595, K596, T602-S606) сшиты вблизи «кислой петли» DCAF1-CtD (остатки 1092–1096), которая иммобилизована Vpr рядом с предполагаемым сайтом связывания SAMHD1-CtD и с самым С-концом CUL4 (остатки Y744, A759), который также примыкает к предсказанному положению связывания SAMHD1-CtD (розовые сферы). Наконец, перекрестные связи в N-концевом домене SAMHD1 и каталитическом домене HD почти исключительно включали участки поверхности CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus , окружающие и обращенные к предполагаемой точке прикрепления SAMHD1-CtD (светло-коричневые сферы). ).Эти наблюдения совместимы с рекрутированием SAMHD-CtD на верхней поверхности пучка спирали Vpr, на что указывает крио-ЭМ. Кроме того, пространственное распределение перекрестных связей, включающих N-концевые домены SAMHD1, предполагает, что они гибко связаны с SAMHD1-CtD, что приводит к сильно изменчивому расположению относительно CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus и, таким образом, предлагает множество возможностей сшивания с соседними компонентами CRL4, опять же в соответствии с результатами крио-ЭМ реконструкции, особенно с учетом позиционной неоднородности стебля CUL4 ().

Масс-спектрометрический анализ сшивки (CLMS) CRL4 DCAF1-CtD / Vpr mus /SAMHD1.

( A ) Схематическое изображение перекрестных связей сульфо-SDA между CRL4 DCAF1 /Vpr mus и SAMHD1, идентифицированных с помощью CLMS. Белки имеют цветовую кодировку, как на рисунках и , а SAMHD1 — черный/белый. SAMHD1-CtD выделен желтым цветом. Сшивки с N-концевыми глобулярными доменами SAM и HD SAMHD1 окрашены в светло-коричневый цвет, в то время как сшивки с N-концевой половиной SAMHD1-CtD выделены розовым цветом, а сшивки с С-концом SAMHD1-CtD отмечены окрашены в фиолетовый цвет.( B ) Поперечные связи сульфо-SDA из A , в той же цветовой гамме, картированные на молекулярной модели CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 (состояние-2), полученные из крио-ЭМ анализа (). Плотность SAMHD1-CtD из крио-ЭМ-анализа CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 (основной) () показана желтой сеткой. ( C ) Доступное пространство взаимодействия SAMHD1-CtD, рассчитанное сервером DisVis [61], согласующееся как минимум с 14 из 26 наблюдаемых перекрестных связей, визуализируется серой сеткой.DCAF1-CtD и Vpr mus ориентированы и окрашены, как на рис.

Для более количественной оценки информации о расстоянии, присущей перекрестным ссылкам SAMHD1-CtD, объем, доступный для SAMHD1-CtD для взаимодействия с CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus , в соответствии с расстоянием CLMS ограничений, моделировали с помощью программного инструмента DisVis [60,61]. Для этого анализа SAMHD1-CtD моделировали как пептид в расширенной конформации. При моделировании молекулярная модель state-2 CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus сохранялась фиксированной, а шестимерный поиск всех возможных степеней свободы вращения и трансляции для модели SAMHD1-CtD в молекулярном контакте с CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus был рассчитан и ранжирован в соответствии с ограничениями расстояния CLMS.Чтобы визуализировать выходные данные, все возможные пространственные положения центра масс SAMHD1-CtD, которые удовлетворяют> 50% ограничений CLMS, были нанесены в виде карты плотности на структуру DCAF1-CtD/Vpr mus (). В соответствии с крио-ЭМ-реконструкцией этот независимый вычислительный анализ также определяет местонахождение SAMHD1-CtD поверх пучка спирали Vpr mus .

Взятые вместе, структурные, биохимические данные и данные CLMS согласуются с моделью, в которой сам С-конец SAMHD1 рекрутируется Vpr mus , чтобы разместить оставшиеся домены SAMHD1 надлежащим образом для доступа к каталитическому механизму на дистальном конце стебля CRL4.

Эти данные позволяют провести структурное сравнение с neo -способами связывания субстрата белков Vpx и Vpr из разных линий ретровирусов (). Vpx HIV-2 и Vpx sm позиционируют SAMHD1-CtD на стороне DCAF1 BP домена посредством взаимодействия с N-концами Vpx Helices-1 и -3 () [50]. Vpx mnd2 и Vpx rcm связывают SAMHD1-NtD, используя двусторонний интерфейс, включающий сторону DCAF1 BP и верхнюю поверхность пучка спирали Vpx () [51,52].Vpr HIV-1 взаимодействует со своим субстратом убиквитилирования UNG2, используя как верхнюю часть, так и верхний край пучка спирали Vpr HIV-1 () [54]. Следует отметить, что эти интерфейсы взаимодействия верхней поверхности лишь частично перекрываются с интерфейсом связывания Vpr mus /SAMHD1-CtD, идентифицированным здесь, и используют принципиально разные наборы взаимодействующих аминокислотных остатков (Figs и S6A). Таким образом, оказывается, что интерфейсы молекулярного взаимодействия, управляющие Vpx/Vpr-опосредованным распознаванием и деградацией субстрата neo , не сохраняются между родственными вспомогательными белками SIV и Vpx/Vpr ВИЧ, даже в тех случаях, когда идентичные области SAMHD1-CtD нацелены на рекрутирование. .

Вариабельность распознавания субстрата neo в белках Vpx/Vpr.

Сравнение Нео -Substrate Режимы распознавания VPR MUS ( A ), VPX SM ( B ), VPX MND2 ( C ) и VPR ВИЧ-1 ( Д ). DCAF1-CtD показан серым мультяшным изображением и полупрозрачной поверхностью, Vpr mus — зеленый, Vpx sm — оранжевый, Vpx mnd2 — синий и Vpr HIV-1 — светло-коричневый показаны мультяшным.Модели привлеченных субстратов убиквитилирования показаны в виде строго отфильтрованных, полупрозрачных рассчитанных карт электронной плотности со следующей схемой окраски: SAMHD1-CtD, связанный с Vpr mus -желтый, SAMHD1-CtD (связанный с Vpx sm , PDB 4cc9 ) [50] – мятно-зеленый, SAMHD1-NtD (Vpx mnd2 , PDB 5aja) [51] – пурпурный, UNG2 (Vpr HIV-1 , PDB 5jk7) [54] – светло-фиолетовый. ( E ) Множественное выравнивание последовательностей белков Vpr и Vpx из A D .Спирали обозначены прямоугольниками над последовательностями аминокислот. Остатки, участвующие в узнавании субстрата neo , обозначены звездочками над последовательностями аминокислот. Остатки, участвующие в связывании DCAF1 во всех белках Vpr и Vpx, обозначены красными звездочками под аминокислотной последовательностью Vpr mnd-2 . Остатки, заштрихованные серым или черным цветом, по меньшей мере на 60% или 90% типоконсервативны во всех белках Vpx и Vpr соответственно.

Обсуждение

Наши рентгеноструктурные исследования сборки DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus обеспечивают первое понимание структуры класса «гибридных» белков Vpr SIV.Они присутствуют в линиях лентивирусов SIV agm и SIV mus/deb/syk и сочетают характеристики родственных вспомогательных белков Vpr HIV-1 и SIV Vpx.

Как и Vpx SIV, «гибридные» белки Vpr подавляют рестрикционный фактор хозяина SAMHD1, привлекая его к CRL4 DCAF1 для убиквитинирования и последующей протеасомной деградации. Однако, используя комбинацию рентгеновского, крио-ЭМ и CLMS анализов, мы показываем, что молекулярная стратегия, которую Vpr mus развила для нацеливания на SAMHD1, разительно отличается от Vpx-содержащих штаммов SIV.В двух кладах белков Vpx дивергентная аминокислотная последовательность простирается непосредственно выше Helix-1 (вариабельная область (VR)1, S6A Fig), вместе с полиморфизмами в SAMHD1-N-конце соответствующего вида-хозяина определяют, является ли ВИЧ -2-тип или SIV mnd -тип Vpx распознают SAMHD1-CtD или SAMHD1-NtD соответственно. Эти механизмы распознавания приводят к позиционированию SAMHD1-CtD или -NtD на стороне домена DCAF1 BP таким образом, что обеспечиваются дополнительные контакты между SAMHD1 и DCAF1, образуя тройные сборки Vpx/SAMHD1/DCAF1 с очень низкой скоростью диссоциации [50]. –52,62].В Vpr mus разные принципы определяют специфичность SAMHD1-CtD. Здесь VR1 вообще не участвует в связывании SAMHD1-CtD, но формирует дополнительные взаимодействия с DCAF1, которые не наблюдаются в белковых комплексах Vpx/DCAF1 (S6A Fig). Молекулярные контакты между Vpr mus и SAMHD1 рассредоточены по спиралям-1 и -3, обращены в сторону от места взаимодействия DCAF1 и иммобилизуют SAMHD1-CtD на верхней стороне пучка спирали Vpr mus (рис. S6A). Помещение SAMHD1-CtD в такое положение препятствует стабилизации тройного взаимодействия с DCAF1-CtD, но все же приводит к надежному убиквитилированию SAMHD1 in vitro и деградации SAMHD1 в клеточных анализах [24].Соответственно, наши анализы восстановления in vitro показывают, что Vpr mus способен образовывать стабильное бинарное взаимодействие либо с SAMHD1, либо с DCAF1-CtD в отсутствие соответствующего третьего партнера по связыванию. Это оставляет вопрос без ответа, если в физиологических условиях, при заражении клетки-хозяина, Vpr mus сначала захватывает SAMHD1, чтобы направить его к комплексу CRL4, или захватывает ли он CRL4, чтобы впоследствии рекрутировать SAMHD1. Однако, поскольку CRL4 локализуется как в цитоплазме, так и в ядре [63], тогда как SAMHD1 обнаруживается исключительно в ядре [64], возникает соблазн предположить, что при попадании в клетку-хозяина Vpr сначала встречает и связывает цитоплазматические CRL4 DCAF1 , для последующего перемещения в ядро ​​для рекрутирования SAMHD1.

Предсказания относительно молекулярного механизма связывания SAMHD1 другими «гибридными» ортологами Vpr затруднены из-за расхождения последовательностей. Даже в Vpr deb , самом близком по отношению к Vpr mus , только примерно 50% боковых цепей аминокислот, выстилающих предполагаемый карман связывания SAMHD1-CtD, сохраняются (S6A Fig). Предыдущие эксперименты по убиквитинированию in vitro и клеточной деградации не показали явного предпочтения Vpr deb для рекрутирования либо SAMHD1-NtD, либо –CtD [24,49].Кроме того, оспаривается, действительно ли Vpr deb связывает DCAF1 [65], что, возможно, может быть объяснено аминокислотными вариациями на самом N-конце и/или в Helix-3 (S6A Fig). Vpr syk специфичен для SAMHD1-CtD [49], но большинство остатков, образующих платформу связывания SAMHD1-CtD, наблюдаемых в настоящем исследовании, не являются консервативными. Линия белков Vpr SIV agm еще более дивергентна, со значительными различиями не только в возможных остатках, контактирующих с SAMHD1, но и в участках последовательности, предшествующих Helix-1 и соединяющих Helices-2 и -3, а также в N-концевая половина Helix-3 (фиг. S6A).Кроме того, есть указания на то, что рекрутирование SAMHD1 подтипом Vpr agm.GRI включает молекулярное распознавание как SAMHD1-NtD, так и –CtD [49,53]. В заключение, повторяющиеся раунды эволюционной адаптации лентивирусов к фактору рестрикции SAMHD1 хозяина с последующей повторной адаптацией хозяина привели к высоковидоспецифическим, разнообразным молекулярным способам взаимодействия Vpr-SAMHD1. Аналогичная гонка молекулярных вооружений между внутренними клеточными противовирусными факторами-хозяевами и вирусными антагонистами сформировала видоспецифический лентивирусный антагонизм e.грамм. факторы рестрикции хозяина семейства APOBEC3 и тетерин путем индукции их деградации соответствующими вирусными антагонистами Vif или Nef/Vpu [66–68]. Кроме того, реадаптация вируса к определенным обезьяньим и человеческим вариантам этих рестрикционных факторов после межвидовой передачи принимала участие в появлении пандемических штаммов ВИЧ, что подчеркивает важность структурного понимания этих процессов [9]. В дополнение к представленному здесь случаю, необходима дальнейшая структурная характеристика комплексов SAMHD1-Vpr, чтобы полностью определить результаты этой конкретной гонки молекулярных вооружений вирус-хозяин.

Предыдущее исследование структуры DDB1/DCAF1/Vpr HIV-1 в комплексе с neo -субстратом UNG2 показало, что Vpr HIV-1 взаимодействует с UNG2, имитируя фосфатный остов ДНК. Точнее, остатки UNG2, выступающие в большую бороздку его эндогенного ДНК-субстрата, встраиваются в гидрофобную щель, образованную спиралями-1, -2 Vpr HIV-1 и N-концевой половиной спирали-3 [54]. . Этот механизм может объяснить необычайную неразборчивость связывания Vpr HIV-1 , поскольку список потенциальных субстратов деградации Vpr HIV-1 значительно обогащен ДНК- и РНК-связывающими белками [27].Кроме того, было высказано предположение, что неразборчивая Vpr , индуцированная ВИЧ-1 , деградация факторов хозяина с ДНК- или РНК-связывающей активностью вызывает остановку клеточного цикла на границе фазы G2/M, что является наиболее подробно описанным фенотипом белков Vpr. далеко [26,27,69]. В Vpr mus N-концевая половина Helix-1, а также объемный аминокислотный остаток W48, который также сохраняется в Vpr agm и Vpx, сужают гидрофобную щель (S6A и S6B Fig). Кроме того, удлиненный N-конец Vpr mus Helix-3 несовместим со связыванием UNG2 из-за стерического исключения (рис. S6C).В соответствии с этими наблюдениями, Vpr mus не подавляет UNG2 в линии Т-клеток человека [27]. Однако Vpr mus , Vpr syk и Vpr agm также вызывают остановку клеточного цикла G2/M в соответствующих клетках-хозяевах [65,70,71]. Это убедительно указывает на существование дополнительных структурных детерминант у Vpr mus , Vpr syk , Vpr agm и потенциально Vpr HIV-1 , которые регулируют рекрутирование и убиквитилирование ДНК/РНК-связывающих факторов хозяина, кроме того к гидрофобной, имитирующей ДНК щели на вершине пучка из трех спиралей.Будущие усилия по структурной характеристике этих детерминант еще больше расширят наше понимание того, как спиральный каркас Vpx/Vpr связывается и, таким образом, адаптируется к множеству neo -субстратных эпитопов.

Наши крио-ЭМ реконструкции CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1, дополненные CLMS, также дают представление о структурной динамике сборок CRL4 до переноса убиквитина. Данные подтверждают ранее описанное вращательное движение ножки CRL4 в отсутствие ограничений, налагаемых кристаллической решеткой, создавая зону убиквитилирования вокруг субстратного рецептора, модифицированного Vpr mus (рис. и 13, 15, 16, 19). 57].Отсутствие плотности для недилированного домена CUL4 WHB и для каталитического домена ROC1 RING указывает на то, что эти дистальные элементы стебля очень подвижны и, вероятно, имеют множество ориентаций относительно каркаса CUL4 (рис. S4G). Эти наблюдения согласуются со структурным анализом CRL1 и CRL5, где недилирование CUL1/5 приводит к переориентации домена WHB кулина и высвобождению домена ROC1 RING из каркаса куллина одновременно со стимуляцией активности убиквитилирования [56]. ].Более того, недавний крио-ЭМ анализ структуры CRL1 β-TRCP /IκBα продемонстрировал значительную подвижность прекаталитических доменов CUL1-NEDD8 WHB и ROC1 RING [72]. Такая гибкость, по-видимому, необходима для структурной организации множественных CRL1-зависимых процессов, в частности нуклеации каталитической сборки, включающей сложные белок-белковые взаимодействия между NEDD8, CUL1, заряженным убиквитином E2 и субстратным рецептором. Эта синергетическая сборка затем направляет С-конец убиквитина к субстрату лизину для праймирования убиквитином [72].Соответственно, наши крио-ЭМ исследования могут указывать на то, что аналогичные принципы применимы к катализируемому CRL4 убиквитилированию. Однако, чтобы разгадать каталитическую архитектуру CRL4, необходимо будет провести сложные процедуры перекрестного связывания, как в ссылке [72].

Схематическое изображение структурной пластичности в Vpr mus -модифицированный CRL4 DCAF1-CtD и влияние на перенос убиквитина.

( A ) Вращение ножки CRL4 увеличивает пространство, доступное для каталитических элементов на дистальном конце ножки, образуя зону убиквитилирования вокруг ядра.( B ) Гибкая привязка SAMHD1 к ядру с помощью Vpr mus помещает большую часть SAMHD1 в зону убиквитинирования и оптимизирует доступность поверхности. В экспериментальных условиях SAMHD1 принимает равновесие мономер-димер, при этом обе формы способны связываться с Vpr. В B C для ясности схематично указан только мономерный SAMHD1. ( C ) Модификация CUL4-WHB с помощью NEDD8, запускаемая связыванием субстрата, приводит к увеличению подвижности этих дистальных элементов стебля (CUL4-WHB, домен ROC1 RING) [56], дополнительно расширяя зону убиквитилирования и активируя образование каталитическая сборка для переноса убиквитина (см. также D ) [72].( D ) Динамические процессы A C вместе создают многочисленные возможности для сборки каталитического механизма (CUL4-NEDD8 WHB, ROC1, убиквитин-(уби-)заряженный E2) на открытых боковых цепях лизина SAMHD1. Здесь три из этих возможностей показаны схематически. Таким образом, покрытие убиквитином на SAMHD1 максимизируется.

Мобильность ножки CRL4 может способствовать размещению субстратов различных размеров и форм в зоне убиквитилирования CRL4 и может рационализировать широкий диапазон субстратов, доступных для убиквитилирования CRL4 через множественные рецепторы DCAF ().Из-за селективного давления, направленного на противодействие ограничению SAMHD1 хозяина, ВИЧ-2 и некоторые SIV воспользовались этой динамической архитектурой CRL4 путем модификации субстратного рецептора DCAF1 вспомогательными белками семейства Vpx/Vpr. Таким образом, либо SAMHD1-CtD, либо -NtD связаны с DCAF1, чтобы гибко рекрутировать большую часть SAMHD1 для дальнейшего улучшения доступности боковых цепей лизина как на проксимальных, так и на глобулярных доменах SAMHD1 для недилированного каталитического CRL4. сборка ().

Каталитическая dNTP-трифосфогидролазная активность SAMHD1 зависит от нуклеотид-зависимой олигомеризации, опосредованной двумя аллостерическими сайтами связывания нуклеотидов. В отсутствие нуклеотидов SAMHD1 принимает равновесие мономер-димер с равновесной константой диссоциации в низком микромолярном диапазоне [73]. В настоящей работе препараты SAMHD1 и последующие биохимические и структурные исследования проводились без экзогенно добавленных нуклеотидов. Следовательно, в экспериментальных условиях ожидается, что мономерное и димерное состояния SAMHD1 будут сосуществовать, способные рекрутироваться на Vpr.Для ясности на схеме схематически показано только связывание мономерных видов SAMHD1. Однако рекрутирование димера SAMHD1 может подвергать каталитическому механизму CRL4 дополнительные остатки лизина, экспонированные на поверхности, и, таким образом, может дополнительно повышать эффективность убиквитилирования SAMHD1.

Вставка нуклеотидов на основе гуанина в первый сайт связывания смещает равновесие мономера-димера SAMHD1 в сторону димерной формы, а связывание dNTP со вторым сайтом приводит к сборке каталитически активного тетрамера [41,73–78].В связи с отсутствием таких нуклеотидов наши аналитические данные гель-фильтрации и крио-ЭМ-реконструкции не подтверждают существование тетрамеров SAMHD1 в условиях эксперимента (рис. и S1, S4 и S5). Однако SAMHD1-CtD необходим для образования тетрамера, обеспечивая критические молекулярные контакты с соседними протомерами [46]. Более того, дестабилизация тетрамера CDK1/2-циклинА-зависимым фосфорилированием T592 в SAMHD1-CtD эндогенно ослабляет активность SAMHD1 в циклирующих клетках [46,77,79,80].Следовательно, в физиологических условиях возможно, что Vpr mus дестабилизирует тетрамеры SAMHD1, изолируя SAMHD1-CtD, чтобы отменить активность SAMHD1, прежде чем вызвать его протеасомную деградацию. Такой механизм согласуется с предыдущим наблюдением опосредованной Vpx HIV-2 разборки тетрамера SAMHD1 и ингибирования активности dNTPase [62].

В целом внутренняя мобильность CRL4 в сочетании с гибким Vpx/Vpr-опосредованным рекрутированием SAMHD1 максимизирует эффективность полиубиквитилирования SAMHD1 и протеасомной деградации для стимуляции репликации вируса ().Однако в инфицированных клетках существует стехиометрическое несоответствие между менее чем 1000 молекулами Vpr, которые внедряются в клетку-хозяина, и SAMHD1, который распространен в широком диапазоне тканей и типов клеток [26,81]. Тесное связывание CRL4 с АТФазой p97 обеспечивает эффективное разворачивание полиубиквитилированных субстратов перед протеасомной деградацией [82]. Таким образом, убиквитилированный SAMHD1 удаляется из связанного с Vpr CRL4 DCAF1 , чтобы инициировать последующие раунды рекрутирования, убиквитилирования и деградации SAMHD1.

Наконец, структурное понимание этого эволюционно оптимизированного, высокоспецифичного механизма деградации белка может дать информацию о позиционировании новых синтетических модальностей на основе CRL4 DCAF1 для целенаправленной деградации белка, т.е. в форме химеры, нацеленной на протеолиз (PROTAC-), или соединений типа молекулярного клея [83,84]. Кроме того, хотя современные схемы высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) способны контролировать репликацию ВИЧ-1 у инфицированных пациентов [85], они не могут уничтожить вирус из-за рецидива вируса после прекращения лечения и приводят к появлению резистентных вариантов вируса. [86].Соответственно, идентификация и ингибирование новых мишеней в дополнение к тем, которые уже охвачены ВААРТ, представляют большой интерес. В этом контексте вспомогательные белки ВИЧ долгое время считались многообещающими мишенями для лекарственных средств [87,88]. Например, доклинические исследования, направленные на ингибирование Vif-опосредованной деградации APOBEC3, завершились выделением нескольких соединений, препятствующих репликации ВИЧ-1 [89–91]. Из-за беспорядочных взаимодействий с хозяином Vpr HIV-1 также считается привлекательной мишенью для антиретровирусных препаратов [92].Представленный здесь сравнительный структурный анализ взаимодействия Vpr/DCAF1-CtD может послужить основой для будущих усилий по разрушению этого интерфейса взаимодействия с малыми молекулами, чтобы сразу отменить все процессы деградации белка-хозяина, индуцированные Vpr, и максимизировать ингибирующий эффект на репликацию вируса.

Методы

Экспрессия и очистка белков

Конструкции амплифицировали с помощью ПЦР из матриц кДНК и встраивали в указанные экспрессионные плазмиды с использованием стандартных методов рестрикционных ферментов (таблица S2).pAcGHLT-B-DDB1 (плазмида № 48638) и pET28-UBA1 (плазмида № 32534) были получены от Addgene. Плазмида коэкспрессии pOPC-UBA3-GST-APPBP1 и плазмида pGex6P2-UBC12 были получены от MRC-PPU Reagents and Services (клоны 32498, 3879). Убиквитин бычьих эритроцитов и рекомбинантный hsNEDD8 были приобретены у Sigma-Aldrich (U6253) и BostonBiochem (UL-812) соответственно. Точечные мутации вводили путем сайт-направленного мутагенеза с использованием KOD-полимеразы (Novagen). Все конструкции и варианты суммированы в таблице S3.

Белки, экспрессированные из векторов pAcGHLT-B, pGex6P1/2, pOPC и pET49b, содержали N-концевую GST-His-метку; pHisSUMO–N-концевой His-SUMO-tag; pET28, pRSF-Duet-1 – N-концевая His-метка; pTri-Ex-6 – С-концевая His-метка. Конструкции в векторах pAcGHLT-B и pTri-Ex-6 экспрессировали в клетках Sf9, а конструкции в векторах pET28, pET49b, pGex6P1/2, pRSF-Duet-1 и pHisSUMO в E . coli Розетта 2(DE3).

Рекомбинантные бакуловирусы ( Autographa californica nucleopolyhedrovirus клон C6) были созданы, как описано ранее [93].Клетки Sf9 культивировали в среде Insect-XPRESS (Lonza) при 28°С в шейкере-инкубаторе Innova 42R (New Brunswick) при скорости встряхивания 180 об/мин. В типичном препарате 1 л клеток Sf9 при 3×10 6 клеток/мл коинфицировали 4 мл вируса DDB1 с высоким титром и 4 мл вируса DCAF1-CtD с высоким титром в течение 72 часов.

Для стандартного E . coli Rosetta 2 (DE3), 2 л среды LB инокулировали 20 мл ночной культуры и выращивали в шейкере-инкубаторе Multitron HT (Infors) при 37°C, 150 об/мин до достижения OD 600 0.7. В этот момент температуру снижали до 18°C, экспрессию белка индуцировали добавлением 0,2 мМ IPTG и культуры выращивали еще 20 часов. Во время совместной экспрессии CUL4 и ROC1 из pRSF-Duet перед индукцией в среду для выращивания добавляли 50 мкМ сульфата цинка. Клетки

Sf9 осаждали центрифугированием при 1000 об/мин, 4°С в течение 30 мин с использованием центрифужного ротора JLA 9.1000 (Beckman). Е . Клетки coli осаждали центрифугированием при 4000 об/мин, 4°С в течение 15 мин с использованием того же ротора.Осадок клеток ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ трис, рН 7,8, 500 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, 0,5 мМ трис-(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP), мини-полные ингибиторы протеазы (1 таблетка на 50 мл) и 20 мМ имидазол (только для His-меченых белков). 100 мл лизирующего буфера использовали для ресуспендирования осадка из 1 л культуры Sf9 и 35 мл лизирующего буфера на осадок из 1 л E . coli культура. Перед ресуспендированием осадков коэкспрессии CUL4/ROC1 рН буфера доводили до 8.5. Добавляли 5 мкл бензоназы (Merck) и клетки лизировали, пропуская суспензию не менее двух раз через Microfluidizer (Microfluidics). Лизаты осветляли центрифугированием при 48000 g в течение 45 мин при 4°С.

Очистку белков проводили при 4°C на Äkta pure FPLC (GE) с использованием хроматографических колонок XK 16/20 (GE), содержащих 10 мл соответствующей аффинной смолы. Белки, меченные GST, захватывают на глутатион-сефарозе (GSH-сефарозе FF, GE), промывают 250 мл промывочного буфера (50 мМ трис-HCl, pH 7.8, 500 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP) и элюировали тем же буфером с добавлением 20 мМ восстановленного глутатиона. Белки, меченные His, иммобилизовали на Ni-Sepharose HP (GE), промывали 250 мл промывочного буфера с добавлением 20 мМ имидазола и элюировали промывочным буфером, содержащим 0,3 М имидазол. Фракции элюента анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и доводили до 5 мл с помощью центрифужных фильтрующих устройств (Vivaspin). Если применимо, добавляли 100 мкг протеазы GST-3C или 50 мкг тромбина на мг общего белка, и образец инкубировали в течение 12 часов на льду для отщепления аффинных меток.В качестве второго этапа очистки проводили гель-фильтрационную хроматографию (ГФ) на Äkta prime plus FPLC (GE) с колонками Superdex 200 16/600 (GE), уравновешенными в 10 мМ трис-HCl, pH 7,8, 150 мМ NaCl, 4 мМ. MgCl 2 , 0,5 мМ буфера TCEP, скорость потока 1 мл/мин. Для очистки комплекса CUL4/ROC1 рН всех буферов для очистки доводили до 8,5. Пиковые фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до прибл. 20 мг/мл, мгновенно замороженные в жидком азоте небольшими аликвотами и хранящиеся при -80°C.Концентрации белков определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop (ND 1000, Peqlab) с использованием теоретических коэффициентов поглощения, рассчитанных на основе аминокислотной последовательности с помощью ProtParam на веб-сервере ExPASy [94].

Аналитический гель-фильтрационный анализ

Перед гель-фильтрационным анализом аффинные метки удаляли путем инкубации 30 мкг протеазы GST-3C с 6 мкМ каждого белкового компонента в объеме 150 мкл промывочного буфера с последующей инкубацией на льду в течение 12 ч. . Для удаления расщепленной GST-метки и протеазы GST-3C добавляли 20 мкл гранул GSH-Sepharose FF (GE) и образец вращали при 4°C в течение одного часа.Гранулы GSH-сефарозы удаляли центрифугированием при 4°C, 3500 об/мин в течение 5 мин и 120 мкл супернатанта наносили на аналитическую колонку GF (Superdex 200 10/300 GL, GE), уравновешенную в 10 мМ Tris-HCl. pH 7,8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP, скорость потока 0,5 мл/мин. Фракции объемом 1 мл собирали и анализировали с помощью SDS-PAGE. Для следующих контрольных образцов 120 мкл очищенного белка наносили непосредственно на колонку с GF, поскольку при расщеплении не нужно было удалять метку очистки: SAMHD1, T4L-SAMHD1-CtD, SAMHD1-ΔCtD.Для этих образцов концентрацию доводили до 18 мкМ, 37 мкМ и 30 мкМ соответственно, чтобы учесть более низкий коэффициент экстинкции этих выделенных белковых компонентов, чтобы обеспечить лучшую визуализацию пика элюирования. Колонку GF калибровали с использованием калибровочного набора для гель-фильтрации (GE) с высоким молекулярным весом (HMW) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализы убиквитилирования in vitro

Готовили 160 мкл реакций, содержащих 0.5 мкМ субстрата (указанные конструкции SAMHD1, рис. S2), 0,125 мкМ DDB1/DCAF1-CtD, 0,125 мкМ CUL4/ROC1, 0,125 мкМ HisSUMO-T4L-Vpr mus (остатки 1–92), 0,25 мкМ UBCH5C, 15 мкМ убиквитина в 20 мМ Tris-HCl pH 7,8, 150 мМ NaCl, 2,5 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ АТФ. В контрольных реакциях некоторые компоненты были исключены, как показано на рис. S2. Был взят образец объемом 30 мкл для анализа SDS-PAGE (t = 0). Реакции инициировали добавлением 0,05 мкМ UBA1, инкубировали при 37°C, 30 мкл образцов SDS-PAGE отбирали через 1 мин, 2 мин, 5 мин и 15 мин, немедленно смешивали с 10 мкл буфера для образцов 4x SDS и кипятили при 95°С в течение 5 мин.Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE.

Неддилирование CUL4/ROC1 in vitro

Для начальных испытаний неддилирования готовили 200 мкл реакционной смеси, содержащей 8 мкМ CUL4/ROC1, 1,8 мкМ UBC12, 30 мкМ NEDD8 в 50 мМ Трис-HCl, pH 0,8, 15 NaCl, 2,5 мМ MgCl 2 , 2,5 мМ АТФ. Для SDS-PAGE отбирали 2 образца по 30 мкл, один сразу смешивали с 10 мкл 4x буфера для образцов SDS, другой инкубировали в течение 60 мин при 25°C. Реакцию инициировали добавлением 0,7 мкМ APPBP1/UBA3, инкубировали при 25°C и через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 30 мин и 60 мин отбирали 30 мкл образцов SDS-PAGE, сразу же смешивали с 10 мкл 4x буфер для образца SDS и кипятят при 95°C в течение 5 мин.Образцы анализировали с помощью SDS-PAGE. На основании этого теста объем реакции увеличили до 1 мл и инкубировали в течение 5 мин при 25°C. Реакцию гасили добавлением 5 мМ TCEP и немедленно загружали в колонку Superdex 200 16/600 GF (GE), уравновешенную 10 мМ Tris-HCl, pH 7,8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP при скорость потока 1 мл/мин. Пиковые фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до ~20 мг/мл, мгновенно замораживали в жидком азоте небольшими аликвотами и хранили при -80°C.

Подготовка образцов для рентгеновской кристаллографии, кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Комплекс DDB1/DCAF1-CtD

Кристаллы DDB1/DCAF1-CtD были выращены методом паровой диффузии висячей капли путем смешивания равных объемов (1 мкл) раствора DDB1/DCAF1-CtD в концентрации 10 мг/мл с резервуарным раствором, содержащим 100 мМ Tri-Na цитрата, pH 5,5, 18% ПЭГ 1000, и суспендированного над резервуаром объемом 500 мкл. Кристаллы росли в течение ночи при 18°С. Кристаллы подвергали криозащите в резервуарном растворе с добавлением 20% глицерина и криоохлаждению в жидком азоте.Набор данных с монокристалла был собран в Diamond Light Source (Didcot, Великобритания) при длине волны 0,92819 Å. Данные обрабатывали с помощью XDS [95] (таблица S1), а структуру расшифровывали методом молекулярной замены с помощью программы MOLREP [96] и доступных структур DDB1 (PDB 3e0c) и DCAF1-CtD (PDB 4cc9) [50] в качестве поиска. модели. Итерационные циклы настройки модели с помощью программы Coot [97] с последующим уточнением с помощью программы PHENIX [98] дали окончательное R/R свободных множителей из 22.0%/27,9% (таблица S1). В модели 94,5% остатков имеют двугранные углы основной цепи в предпочтительной области графика Рамачандрана, остальные попадают в разрешенные области, и ни один из них не является выбросом. Детали сбора данных и уточнения статистики представлены в таблице S1. Координаты и структурные факторы депонированы в PDB под инвентарным номером 6zue.

Комплекс DDB1/DCAF1-CtD/T4L-Vpr
мус (1–92)

Комплекс DDB1/DCAF1-CtD/Vpr мус собирали путем инкубации очищенных DDB1/DCAF1-CtD и HisSUMO-T4L- Vpr mus (остатки 1–92) в молярном соотношении 1:1 в буфере, содержащем 50 мМ бис-трис-пропана, рН 8.5, 0,5 М NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP, содержащий 1 мг протеазы HRV-3C для удаления HisSUMO-tag. После инкубации на льду в течение 12 часов образец загружали в колонку Superdex 200 16/600 GF (GE) с колонкой 1 мл GSH-Sepharose FF (GE), подключенной в линию. Колонку уравновешивали 10 мМ бис-трис-пропана, рН 8,5, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2 и 0,5 мМ TCEP. Скорость потока через колонку составляла 1 мл/мин. Фракции GF анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 4.5 мг/мл.

Кристаллы готовили методом паровой диффузии сидячей капли путем смешивания равных объемов (200 нл) белкового комплекса с концентрацией 4,5 мг/мл и резервуарного раствора, содержащего 8–10% ПЭГ 4000 (масса/объем), 200 мМ MgCl 2 , 100 мМ HEPES-NaOH, pH 7,0–8,2. Объем резервуара составлял 75 мкл. Кристаллы вырастали после по меньшей мере 4 недель инкубации при 4°С. Кристаллы подвергали криозащите в резервуарном растворе с добавлением 20% глицерина и криоохлаждению в жидком азоте. Наборы данных из двух монокристаллов были собраны первоначально в BESSY II (Helmholtz-Zentrum Berlin, HZB) при длине волны 0.

  • Å, а затем в ESRF (Гренобль) на длине волны 1 Å. Наборы данных обрабатывались отдельно с использованием XDS [95] и XDSAPP [99]. Структура расшифрована путем молекулярной замены с использованием исходного набора данных BESSY с помощью программы PHASER [100] и следующих структур в качестве поисковых моделей: DDB1/DCAF1-CtD (настоящая работа) и вариант T4L E11H (PDB 1qt6) [101]. ]. После оптимизации исходной модели и уточнения по сравнению с набором данных ESRF с более высоким разрешением Vpr mus был помещен вручную в плотность, используя ЯМР-модель Vpr HIV-1 (PDB 1m8l) [102] в качестве ориентира.Итерационные циклы настройки модели с помощью программы Coot [97] с последующим уточнением с помощью программы PHENIX [98] дали окончательное R/R свободных факторов 21,61%/26,05%. В модели 95,1% остатков имеют двугранные углы основной цепи в предпочтительной области графика Рамачандрана, остальные попадают в разрешенные области, и ни один из них не является выбросом. Детали сбора данных и уточнения статистики представлены в таблице S1. Координаты и структурные факторы депонированы в PDB под инвентарным номером 6zx9.

    Крио-ЭМ подготовка проб и сбор данных

    Сборка комплекса

    Очищенные CUL4-NEDD8/ROC1, DDB1/DCAF1-CtD, GST-Vpr mus и SAMHD1 макака-резуса, 1 мкМ каждый, инкубировали в конечном объеме 1 мл 10 мМ Tris-HCl pH 7,8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP, дополненный 1 мг протеазы GST-3C. Никаких дополнительных GTP или dNTP не добавляли, чтобы гарантировать сохранение SAMHD1 в форме апомономера-димера. После инкубации на льду в течение 12 часов образец загружали на колонку Superdex 200 16/600 GF (GE), уравновешенную тем же буфером со скоростью 1 мл/мин, с колонкой GSH-Sepharose FF (GE) объемом 1 мл, соединенной в линия.Фракции GF анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 2,8 мг/мл.

    Подготовка сетки

    3,5 мкл белкового раствора, содержащего 0,05 мкМ CUL4-NEDD8/ROC1/DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus Комплекс /SAMHD1 и 0,25 мкМ конъюгата UBCH5C-убиквитин (S4A и S4B, рис. 30), наносили на сетка Перфорированная углеродная сетка Quantifoil R2/4 Cu/Rh (Quantifoil Micro Tools GmbH), покрытая дополнительной тонкой углеродной пленкой в ​​качестве подложки для образца и окрашенная 2% уранилацетатом для начальной характеристики.Для крио-ЭМ свежую углеродную сетку Quantifoil R1.2/1.3 Cu с отверстием 400 меш (Quantifoil Micro Tools GmbH) подвергали тлеющему разряду в течение 30 с с использованием плазменной очистки Harrick с техническим воздухом при 0,3 мбар и 7 Вт. Белок 3,5 мкл. раствор, содержащий 0,4 мкМ комплекса CUL4-NEDD8/ROC1/DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus /SAMHD1 и 2 мкМ конъюгата UBCH5C-убиквитин, наносили на сетку, инкубировали в течение 45 с, блотировали с помощью устройства Vitrobot Mark II (FEI , Thermo Fisher Scientific) в течение 1–2 с при температуре 8°C и влажности 80% и погружали в жидкий этан.Сетки хранились в жидком азоте до визуализации.

    Сбор данных крио-ЭМ

    Исходные отрицательные наборы данных окрашивания и крио-ЭМ были собраны автоматически для контроля качества образцов и реконструкции с низким разрешением на крио-ЭМ Tecnai Spirit 120 кВ (FEI, Thermo Fisher Scientific), оснащенном F416 CMOS камера (TVIPS) с использованием Leginon [103,104]. Затем изображения частиц были проанализированы с помощью 2D-классификации и первоначальной реконструкции модели с использованием SPHIRE [105], cisTEM [106] и Relion 3.07 [107]. Эти данные выявили наличие комплексов, содержащих как DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus (ядро), так и CUL4/ROC1 (стебель). Данные высокого разрешения были собраны на крио-ЭМ Tecnai Polara 300 кВ (FEI, Thermo Fisher Scientific), оснащенном детектором прямых электронов K2summit (Gatan) при номинальном увеличении 31000x с размером пикселя 0,625 Å/пиксель на масштаб объекта. Всего было собрано 3644 стопки фильмов в режиме сверхвысокого разрешения с использованием Leginon [103,104] со следующими параметрами: диапазон расфокусировки 0.5–3,0 мкм, 40 кадров на фильм, время экспозиции 10 с, доза электронов 1,25 е/Å 2 /с и кумулятивная доза 50 е/Å 2 на фильм.

    Крио-ЭМ вычислительный анализ

    Видеоролики были совмещены и взвешены по дозе с использованием MotionCor2 [108], а первоначальная оценка функции передачи контраста (CTF) была выполнена с помощью пакета CTFFind4 [109]. Полученные микрофотографии были проверены вручную, чтобы исключить изображения со значительными загрязнениями (как правило, большими агрегатами белка или загрязнениями льда) или артефактами сетки.Спектры мощности проверялись вручную, чтобы исключить изображения с астигматическими, слабыми или плохо определенными спектрами. После этих этапов контроля качества набор данных включал 2322 микрофотографии (63% от общего числа). На этом этапе набор данных был выбран дважды и обработан отдельно, чтобы получить реконструкции состояний-1, -2 и -3 (анализ 1) и ядра (анализ 2).

    Для анализа 1 положения частиц были определены с использованием программы гауссовского пикинга cisTEMs, в результате чего было получено в общей сложности 959 155 изображений частиц.После двух раундов 2D-классификации для дальнейшей обработки было отобрано 227 529 изображений частиц (рис. S4C и S4D). Используя эти данные, была создана исходная модель с использованием Relion 3.07. Полученная карта дала сильный сигнал для ядра, но только для фрагментированной плотности стебля, что указывает на большую неоднородность области стебля в наборе данных. Эта большая степень композиционной (+/- ножка) и конформационной неоднородности (движение ножки относительно ядра) усложняла классификацию.Соответственно, выравнивание и классификация проводились одновременно. Первая цель состояла в том, чтобы разделить набор данных на три категории: «мусор», «ядро» и «ядро+стебель». Поэтому стебель был удален из исходной модели с помощью инструмента «Ластик» в Chimera [110]. Эта основная карта использовалась в качестве исходной модели для 3D-классификации уровня 1 с Relion 3.07 с уменьшенным размером пикселя 2,5 Å/пиксель. Использовались следующие параметры: количество классов K = 6, T = 10, глобальный шаг поиска = 7.5°, количество итераций = 25. Классификация дала два класса, содержащих стебель (классы 3 и 5, содержащие 23% и 22% изображений частиц соответственно) (рис. S4D). Эти частицы были объединены и направлены на 3D-классификацию уровня 2 с использованием следующих параметров: количество классов K = 6, T = 10, глобальный шаг поиска = 7,5°, количество итераций = 25. Три из этих классов дали карты среднего разрешения. с интерпретируемыми функциями (состояния-1, -2 и -3, S4D рис.). Эти три класса были уточнены по отдельности с помощью 3D-автоматического уточнения в Relion 3.07, в результате чего были получены карты с разрешением от 7,8 Å до 8,9 Å (рис. S4E, S4F и S4G).

    Для анализа 2 положения частиц определяли с помощью сопоставления шаблона с отфильтрованной картой, включающей ядро ​​и основу, с использованием программного обеспечения Gautomatch (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/research/locally-developed- программное обеспечение/чжан-программное обеспечение/). Было найдено 712 485 изображений частиц, извлеченных с помощью Relion 3.07 и впоследствии 2D-классифицированных с помощью cryoSPARC [111], в результате чего после отбора было получено 505 342 изображения частиц (рис. S5A и S5B).Эти изображения частиц были разделены на два подмножества одинакового размера, и для уменьшения вычислительной нагрузки была выполнена трехмерная классификация уровня 1 с использованием Relion 3.07 для обоих из них (рис. S5B). Использовались следующие параметры: начальная модель = «ядро», количество классов K = 4, T = 10, глобальный шаг поиска = 7,5°, количество итераций = 25, размер пикселя 3,75 Å/px. Из них были отобраны те, у которых есть и сердцевина, и стебель. Классы, изображающие одинаковую ориентацию стебля относительно ядра, были объединены и направлены на уровень 2 в виде трех разных субпопуляций, содержащих 143 172, 193 059 и 167 666 изображений частиц соответственно (рис. S5B).

    Для уровня 2 каждая субпопуляция была классифицирована отдельно по 4 классам. Из этих 12 классов все изображения частиц, демонстрирующие четко определенные плотности ядра и стебля, были объединены и помечены как «ядро + стебель», в результате чего в общей сложности было получено 310 801 изображение частиц. 193 096 изображений частиц, представляющих классы, содержащие только ядро, были объединены и помечены как «ядро» (рис. S5B).Подмножество «ядро + стебель» было разделено на 6 классов, 5 классов содержали как стебель, так и сердцевину (рис. S5B), а один класс состоял только из ядра со связанным Vpr mus . 5 классов со стеблем показали ориентацию стебля, аналогичную той, что была получена в результате анализа 1 (см. выше, S4 рис.), но были уточнены по отдельности до более низкого разрешения, как в анализе 1, и были отброшены. Однако индивидуальное уточнение класса уровня 3 только для ядра дало реконструкцию 7,3 Å (рис. S5C и S5D).

    Молекулярная визуализация, подгонка твердого тела, трехмерное структурное выравнивание, анализ вращения и интерфейса

    Карты плотности и атомные модели были визуализированы с помощью Coot [97], PyMOL (Schrödinger) и UCSF Chimera [110].Подгонка жесткого тела и структурное выравнивание выполнялись с использованием программы UCSF Chimera [110]. Углы поворота между крайними положениями доменов DDB1 BPB измеряли с помощью сервера DynDom [112] (http://dyndom.cmp.uea.ac.uk/dyndom/runDyndom.jsp). Молекулярные интерфейсы анализировали с помощью сервера EBI PDBePISA [113] (https://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver).

    Масс-спектрометрия с перекрестными связями (CLMS)

    Сборка комплекса

    Очищенные CUL4/ROC1, DDB1/DCAF1-CtD, GST-Vpr mus и SAMHD1 макака-резуса, по 1 мкМ каждого, инкубировали в объеме 3 мл буфер, содержащий 10 мМ HEPES pH 7.8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP, дополненный 1 мг протеазы GST-3C. После инкубации на льду в течение 12 ч образец загружали на колонку Superdex 200 16/600 GF (GE), уравновешенную тем же буфером, со скоростью потока 1 мл/мин с колонкой 1 мл GSH-Sepharose FF ( GE) подключены в линию. Фракции GF анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и концентрировали до 6 мг/мл.

    Фотосшивание

    Сшивающий агент сульфо-SDA (сульфосукцинимидил 4,4′-азипентаноат) (Thermo Scientific) растворяли в сшивающем буфере (10 мМ HEPES, pH 7.8, 150 мМ NaCl, 4 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ TCEP) до 100  мМ перед использованием. Стадию мечения проводили путем инкубации аликвот по 18 мкг комплекса в концентрации 1 мг/мл с добавлением 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 мМ сульфо-SDA, соответственно, в течение часа. Затем образцы облучали УФ-светом с длиной волны 365 нм для образования поперечных связей в течение 20 минут и гасили 50 мМ NH 4 HCO 3 в течение 20 минут. Все шаги выполнялись на льду. Продукты реакции разделяли на геле Novex Bis-Tris 4–12% SDS-PAGE (Life Technologies).Полосу геля, соответствующую сшитому комплексу, вырезали и расщепляли трипсином (Thermo Scientific Pierce) [116], а полученные триптические пептиды экстрагировали и обессоливали с помощью C18 StageTips [117]. Элюированные пептиды фракционировали на колонке Superdex Peptide 3,2/300 (GE Healthcare) при скорости потока 10 мкл/мин с использованием 30% (об./об.) ацетонитрила и 0,1% (об./об.) трифторуксусной кислоты в качестве подвижной фазы. Фракции по 50 мкл собирали и сушили в вакууме.

    Получение CLMS

    Образцы для анализа ресуспендировали в 0.1% (об./об.) муравьиная кислота, 3,2% (об./об.) ацетонитрил. Анализ ЖХ-МС/МС выполняли на масс-спектрометре Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Fisher), соединенном в режиме реального времени с системой ВЭЖХ Ultimate 3000 RSLCnano (Dionex, Thermo Fisher). Образцы разделяли на колонке EASY-Spray длиной 50 см (Thermo Fisher). Подвижная фаза А состояла из 0,1% (об./об.) муравьиной кислоты, а подвижная фаза В состояла из 80% (об./об.) ацетонитрила с 0,1% (об./об.) муравьиной кислоты. Скорость потока составляла 0,3 мкл/мин с использованием градиентов, оптимизированных для каждой хроматографической фракции автономного фракционирования, в диапазоне от 2 % подвижной фазы B до 55 % подвижной фазы B в течение 90 минут.Данные МС были получены в режиме зависимости от данных с использованием настройки максимальной скорости с временем цикла 3 с. Для каждого цикла с помощью Orbitrap записывали полный сканирующий масс-спектр с разрешением 120 000 в диапазоне от 400 до 1 500 m/z. Ионы с исходным зарядовым состоянием от 3+ до 7+ были выделены и фрагментированы. Фрагментация аналита была достигнута с помощью диссоциации столкновений с более высокими энергиями (HCD) [118], а затем спектры фрагментации были записаны в Orbitrap с разрешением 50 000. Динамическое исключение было включено с подсчетом одиночных повторов и длительностью исключения 60 с.

    Обработка CLMS

    Повторная калибровка предшественника m/z была проведена на основе высокодостоверных (<1% доля ложных открытий (FDR)) линейных идентификаций пептидов. Повторно откалиброванные списки пиков сравнивали с последовательностями и обратными последовательностями (в качестве ловушек) перекрестно-сшитых пептидов с использованием пакета программного обеспечения Xi (v.1.7.5.1) для идентификации [119]. Окончательные списки перекрестных ссылок были составлены с использованием идентифицированных кандидатов, отфильтрованных до <1% FDR на уровне ссылок с помощью xiFDR v.2.0 [120], предусматривающий минимум 20% покрытие последовательностей и 4 наблюдаемых фрагмента на пептид.

    Анализ CLMS

    Для того чтобы выбрать доступный объем взаимодействия SAMHD1-CtD в соответствии с данными CLMS, модель SAMHD1 была создана с использованием I-TASSER [121]. Из модели был извлечен SAMHD1-CtD со случайной конфигурацией катушки. Чтобы отобразить все перекрестные связи, недостающие петли в сложной структуре были сгенерированы с помощью MODELLER [122]. Затем поиск объема взаимодействия был отправлен на веб-сервер DisVis [61] с допустимым расстоянием между 1.5 Å и 22 Å для каждого ограничения с использованием опции «полное сканирование». Интервал выборки вращения был установлен на 9,72 °, а шаг вокселя сетки — на 1 Å. Доступный объем взаимодействия визуализировали с помощью UCSF Chimera [110].

    Спектроскопия кругового дихроизма (CD)

    Для оценки содержания вторичной структуры Vpr mus , меченного GST, и двойных мутантов R15E/R75E и W29A/A66W была проведена спектроскопия CD. Образцы белка подвергали диализу в течение ночи при 4°C против буфера CD (смесь 100 мМ NaF, 10 мМ K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4 , pH 8).5), а затем концентрацию белка доводят до 0,2 мг/мл. Для каждого образца регистрировали три повторных спектра КД с шагом 1,0 нм в диапазоне 190–260 нм. Измерения проводились в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 0,05 см (Hellma, Мюльхайм, Германия) при 20°C на спектрополяриметре Chirascan (Applied Photophysics, Лондон, Великобритания). Эталонный спектр буфера CD вычитали из усредненного спектра образца белка. Измеренная эллиптичность в миллиградусах (m°) была преобразована в молярную эллиптичность [Θ] в соответствии с уравнением Θ = m°*M/(10xLxC), где M — средняя молекулярная масса белка, L — длина пути измерительной ячейки, а C — молярная концентрация белка.Молярную эллиптичность строили в зависимости от длины волны с использованием SigmaPlot версии 14.0 (Systat Software Inc., Сан-Хосе, Калифорния, США).

    Вспомогательная информация

    S1 Fig
    Дополнительный биохимический анализ Vpr mus -индуцированного CRL4 DCAF1-CtD перенаправления специфичности в сторону SAMHD1.

    ( A ) Схематическое изображение белковых конструкций, используемых в биохимических анализах. BP-β-пропеллерный домен, HD-гистидин-аспартатный домен, HTH-спираль-поворот-спираль мотив, SAM-стерильный альфа-мотив.( B ) SDS-PAGE анализ GST-Vpr mus . После обработки 3C-протеазой для удаления GST-метки (+3C) и GSH-Sepharose pull down для удаления протеазы и метки в элюированной фракции (S/N) отсутствует Vpr mus , что указывает на то, что он взаимодействует неспецифически. с гранулами GSH-Sepharose и/или становится нерастворимым после удаления метки. ( CE ) Аналитический анализ GF DDB1/DCAF1-CtD, инкубированного с SAMHD1 ( C ), DDB1/DCAF1-CtD, инкубированного с Vpr mus ( D ), и SAMHD1, инкубированного с Vpr 9090 1 mus ).SDS-PAGE соответствующих фракций GF показан под каждой хроматограммой.

    (TIF)

    S2 Fig
    Компоненты, контроли и необрезанные изображения SDS-PAGE реакций убиквитилирования in vitro.

    ( A ) SDS-PAGE индивидуально очищенных белковых компонентов, используемых в реакциях убиквитилирования in vitro. ( B, C ) Контроль реакций в отсутствие указанных компонентов. ( D-F ) Неразрезанные гели реакций показаны на .Все реакции инкубировали при 37°C в течение указанного времени, останавливали добавлением буфера для образцов SDS и разделяли на SDS-PAGE.

    (TIF)

    S3 Fig
    Подробный анализ кристаллической структуры комплекса DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus .

    ( A ) Наложение комплекса Vpr mus (зеленый рисунок)/DCAF1-CtD на Vpx sm (оранжевый рисунок, PDB: 4cc9) [50], Vpx mnd (синий рисунок, PDB: 5aja) [51] и Vpr HIV-1 (светло-коричневый мультфильм, PDB: 5jk7) [54].Структуры были выровнены относительно их доменов DCAF1 BP, но для ясности показан только DCAF1-CtD из комплекса Vpr mus (серый рисунок и полупрозрачная поверхность). ( B-G ) Подробная информация о взаимодействии DCAF1-CtD/Vpr mus . ( B ) Структура комплекса показана в той же ориентации, что и на левой панели. На вставках ( C G ) более подробно показаны отдельные области взаимодействия: Vpr mus (зеленый), Vpr mus , связанный с DCAF1-CtD (серый) и апо-DCAF1-CtD (голубой).Выбранные аминокислотные остатки, осуществляющие межмолекулярные взаимодействия, показаны палочками, а водородные связи/электростатические взаимодействия – пунктирными красными линиями. Остатки Vpr mus со звездочками являются консервативными по типу во всех белках Vpr/Vpx. ( H ) Спектры кругового дихроизма (CD) GST-Vpr mus и GST-Vpr mus вариантов R15E/R75E и W29A/A66W.

    (TIF)

    S4 Fig
    Крио-ЭМ анализ 1 комплекса CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1.

    ( A ) Недилирование CUL4/ROC1 in vitro . Белок смешивали с очищенными недиламинокислотами-Е1 (гетеродимер APPPBP1/UBA3), Е2 (UBC12) и NEDD8. Реакцию инкубировали при 25°C, образцы отбирали в указанное время, останавливали добавлением буфера для образцов SDS и разделяли на SDS-PAGE. ( B ) Анализ GF комплекса CUL4-NEDD8/ROC1/DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus /SAMHD1 с указанием объединенных фракций. 5-кратный молярный избыток UBCH5C-убиквитина был добавлен перед погружением в заморозку для крио-ЭМ-экспериментов в попытке стабилизировать сборку.Однако плотность ни в одной из реконструкций не может быть отнесена к UBCH5C-убиквитину, что указывает на низкую аффинность связывания и/или гетерогенность способа его связывания. ( C ) Средние значения класса 2D, отображающие классы анализа «ядро» или «ядро + стебель» 2. ( D ) Дерево 3D-сортировки после 2D-классификации. Указаны конформационные состояния-1, -2 и -3. ( E ) Локальное разрешение и распределение Эйлера состояний-1, -2 и -3. ( F ) Кривые FSC для реконструкций состояний-1, -2 и -3.( G ) Параллельное сравнение реконструкций состояний-1, -2 и -3, окрашенных, как на рисунке . Молекулярные модели кристаллической структуры DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus и CUL4/ROC1 (PDB 2hye) [15] вписаны в объемы в виде твердых тел и показаны на рисунках. DDB1/DCAF1-CtD/Vpr mus окрашен как в , CUL4 окрашен в желтый цвет, а ROC1 — в голубой. Все состояния показывают дополнительную плотность, соответствующую SAMHD1-CtD, обозначенную красными стрелками. ( H ) Наложение недилированного C-концевого домена WHB CUL5 (черный рисунок, PDB 3dqv) [56] на CUL4 WHB (PDB 2hye), окрашенный как в A .Указаны соответствующие остатки лизина, ковалентно модифицированные NEDD8. ( I , J ) Подробное изображение плотности крио-ЭМ в состоянии 1 (I) и состоянии 3 (J). Красные стрелки указывают на контакты между CUL4A (оранжевый рисунок) и DDB1 BPA/BPC/CtD (синий рисунок).

    (TIF)

    S5 Fig
    Крио-ЭМ анализ 2 и анализ CLMS комплекса CRL4(-NEDD8) DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1.

    ( A ) Средние значения класса 2D, отображающие классы анализа CRL4-NEDD8 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1 «ядро» или «ядро+стебель» 1.( B ) Дерево сортировки после 2D-классификации. На уровне 3 была идентифицирована реконструкция ядра, содержащая 106 747 изображений частиц (красный прямоугольник). ( C ) Локальное разрешение реконструкции ядра после уточнения, указывающее на диапазон разрешения от 6,5 Å в гидрофобной внутренней части DDB1 до 10,5 Å в домене DDB1 BPB. Ниже показано распределение Эйлера. ( D ) Кривая FSC реконструкции керна после уточнения. ( E ) Верхняя панель: перекрестные связи CRL4 DCAF1-CtD /Vpr mus /SAMHD1, идентифицированные с помощью CLMS, нанесенные на карту на молекулярных моделях, представляющих состояния-1, -2 и -3.Удовлетворительные сшивки (<25 Å) окрашены в желтый цвет, нарушенные сшивки — в красный. Красные стрелки указывают на подмножество перекрестных связей между DDB1 и CUL4, чьи ограничения по расстоянию выполняются в состоянии-1 и все чаще нарушаются в состояниях-2 и -3. Нижняя панель: круговая диаграмма данных CLMS для состояний-1, -2 и -3 с использованием той же цветовой схемы, что и на верхней панели. Серые линии представляют собой поперечные связи между остатками, которых нет в молекулярных моделях. Отображаются только перекрестные связи между субъединицами.

    (TIF)

    S6 Fig
    Множественное выравнивание последовательностей белков Vpr/Vpx, подробное структурное сравнение между Vpr mus и Vpr HIV-1 .

    ( A ) Выравнивание последовательностей указанных белков Vpr и Vpx. Спирали обозначены прямоугольниками над последовательностями аминокислот для Vpr HIV-1 (розовый) и Vpr mus (зеленый). Боковые цепи Vpr HIV-1 , участвующие в связывании UNG2, обозначены розовыми звездочками.Боковые цепи Vpr mus , предположительно участвующие в связывании SAMHD1-CtD, обозначены зелеными звездочками. Боковые цепи Vpx sm , нацеленные на SAMHD1-CtD, обозначены оранжевыми звездочками, а боковые цепи Vpx mnd2 , контактирующие с N-концевыми доменами SAMHD1, выделены синими звездочками. Красными символами отмечены боковые цепи Vpr mus , участвующие в связывании DCAF1-CtD. Неконтурные символы обозначают DCAF1-CtD-контактирующие боковые цепи, уникальные для Vpr mus , а штрихи показывают DCAF1-связывающие боковые цепи, которые контактируют с DCAF1-CtD в других структурах Vpr/Vpx, но не в Vpr mus. .Серыми звездочками отмечены боковые цепи Vpr/Vpx, участвующие в координации цинка. ( B ) Структурное выравнивание Vpr HIV-1 (PDB 5jk7 [54], светло-коричневый) в комплексе с UNG2 и Vpr mus (зеленый). Белковый остов показан на мультяшном изображении. Для ясности показана только интеркалирующая ДНК петля UNG2 (розовая), которая вставляется в гидрофобный карман, образованный пучком спирали Vpr HIV-1 . Обратите внимание на стерическое столкновение между боковой цепью L272 UNG2 и остатком W48 Vpr mus в структурной суперпозиции.( C ) Альтернативный вид структурного выравнивания Vpr HIV-1 (светло-коричневый) в комплексе с UNG2 (розовый) и Vpr mus (зеленый). Обратите внимание на стерическое столкновение между UNG2 и удлиненной спиралью-3 Vpr mus .

    (TIF)

    S1 Таблица
    Статистика сбора и уточнения рентгеновских данных.

    *Числа в скобках относятся к оболочке высокого разрешения, **определенной в [124].

    (PDF)

    S2 Таблица
    Последовательности олигонуклеотидных праймеров.

    (PDF)

    Таблица S3
    Конструкции экспрессии.

    (PDF)

    История LightWave — LightWave 2019

     Нажмите здесь, чтобы развернуть оглавление…


    Страница истории LightWave должна быть перестроена, включая полноразмерные изображения. Это займет немного времени, и если пользователи захотят добавить скриншоты, они будут зачислены. Изображения, помеченные zzz или lores, требуют замены

    Эта страница представляет собой сборник и архивный отчет о том, как NewTek, Inc., программное обеспечение для компьютерной графики LightWave 3D эволюционировало и изменило стили интерфейса, упаковку коробок и дизайн логотипа с течением времени, теперь это 27-й год и 13-я версия.

    1988 — предшественник LightWave 3D

    До LightWave появились Videoscape 3D и Aegis Modeler 3D на Commodore Amiga. Videoscape был написан Алленом Хастингсом, а Modeler 3D — Стюартом Фергюсоном, что дало историческую основу для раздвоения личности LightWave 3D. Взгляните на наклейку на коробке Videoscape 3D, чтобы увидеть, как все изменилось с тех пор, как эта программа стала самой современной…
    Конечно, решение Videoscape было не единственным, доступным для NewTek, когда они хотели добавить приложение 3D-графики к Amiga Video Toaster еще в 1989 году. Sculpt 3D…

    • экраны предоставлены Эрни Райтом (Videoscape #3 и Modeler 3D) и Гектором Моратилла (Videoscape #1 и #2)
    • Коробка Videoscape любезно предоставлена: Franck Lafage Программист) и Gökhan Sönmez от AGF, Турция

    VideoScape Amiga

    VideoSpape Amiga


    Modeler Amiga
    Modeler Boxshot
    VideoSpace Boxshot

    1990 — Lightwave 3D 1.0

    В 1990 году состоялся первый реальный выпуск LightWave для видеотостера на базе Commodore Amiga. К этому моменту NewTek обещала свое появление уже около двух лет, но проблема заключалась в наборе микросхем для самого видеотостера, а не в LightWave. В то время были доступны 3D-программы, но они, как правило, стоили десятки тысяч долларов, в то время как весь тостер продавался менее чем за 5000 долларов. Единственной реальной конкуренцией 3D на Amiga в то время была Imagine.

    • экраны любезно предоставлены: Ernie Wright
       
    Modeler and Layout 1.0 Amiga

    1992 — LightWave 3D 2.0

    Video1Toaster92 получил обновление, поэтому LightWave92 получил обновление. Позже в том же году NewTek выпустила обновление «LightWave 2.5 Pro». Это была первая версия со встроенными бликами и некоторыми другими «особыми» вкусностями для пользователей Lightwaving Toaster.

    1993 — LightWave 3D 3.0/3.1

    LightWave все еще был привязан к видеотостеру с VT4000, который вышел в этом году, однако небольшая компания под названием Industrial Might and Logic обслуживала растущее число людей, которые хотели получить доступ к LightWave, но не использовали или не могли использовать Video Toaster (потому что у них были Amiga 3000 или они жили в странах, где использовалась телевизионная система, отличная от NTSC).IML (natch) создала свой собственный ключ (названный «LightRAVE», часто называемый просто «RAVE»), который имитировал наличие карты Video Toaster, чтобы LightWave можно было запускать на машинах без настольной видеокарты.

    • Экраны любезны: Bernhard Bazant
    • Box Shot Courtestesy: Norm Pickthall
    Modeler Amiga, макет Amiga

    Layout Lightwave 3D 4000 Amiga

    VT4000 Boxshot (LORES!)

    1994 — Lightwave 3D 3.5

    Первая официальная автономная версия для Amiga (без видео Тостер не требуется)

    • Box Coundesy: Gökhan Sönmez
    • Экраны любезностей: Bernhard Bazant

    Packshot с деталями коробки


    макет и Modeler 3.5

    1995 — LightWave 3D 4.0

    Это была первая версия, перенесенная на ПК с Windows Intel и DEC Alphas.

    • Экраны ПК предоставлены Энтони Росботтомом
    • Экраны Amiga предоставлены Бернхардом Базантом

    Разработчик моделей 4.0 Версия Amiga, Layout 4.0 Версия Amiga

    Modeler 4.0 Версия Windows, Layout 4.0 Версия Windows
     
    LightWave 4.0 Boxshot и Logo Windows (знания!)

    1995 — LightWave 3D 5.0 ​​

    вне. LightWave был доступен для Intel, а теперь также для SGI, DEC Alpha, Macintosh, а в последней версии для Amiga

    • .

      Модельер 5.0 Версия для Amiga, Layout 5.0 Версия для Amiga

         

      Modeler, Layout 5.0 Версия для Windows
      Boxshot и логотип (знания!) Тостер для платформы ПК на карте PCI. Очевидно, что он должен был поставляться с LightWave, как и в предыдущих воплощениях Amiga, поэтому вот версия Video Toaster в комплекте.

      • экраны предоставлены: неизвестно

         

      Windows Video Toaster версия Modeler and Layout


      Windows Video Toaster Boxshot (знания!)
      199045
      • Экраны любезностей: Unknown


    Modeler, макет 5.5 Windows версии

    1998 — Lightwave 3D 5.6

    • Экраны любезно предоставлены: Doce Bennett


    Modeler, Макет 5.6 Версия Windows

    1997 — вдохновить 3D 1.0

    Также в 97 году NewTek выпустила урезанную версию LightWave под названием Inspire 3D для ПК. Он предлагал ту же простоту использования, что и LightWave, но был намного проще с точки зрения своих возможностей.Тем не менее, это привлекло многих людей к 3D, которые затем могли перейти на более крупного и мощного брата Inspire, как только они поняли, что нужно.

    • экраны вежливости: Ben Vost
    • Box VOST
    • Box Courtesy: Franck Lafage
    • Logo Lobalesy: Newtek Europe


    Assire 3D Modeler и макет, Windows версия


    1999 — Lightwave 3D 6.0

    Редизайн версии! LightWave претерпел серьезные изменения в дизайне, и был представлен новый элемент — Hub — для автоматической синхронизации файлов между Layout и Modeler.Было множество других изменений, таких как новая, редактируемая пользователем система меню, возможность иметь несколько слоев в одном объекте, а также возможность сохранять их в режиме подпатча, вместо того, чтобы зависать при сохранении из Модельер.
    Первое коммерческое приложение, использующее HDRI, и первое воплощение нового механизма рендеринга в 192-битном режиме. Первая реализация метода Монте-Карло и интерполированного излучения для LightWave3D.
    Modeler представил много новых инструментов, таких как скелеты, и обновил многие модификаторы до интерактивных инструментов.

    • Exonse Condestesy: чешская легкая вата Домашняя страница

  • Modeler, макет 6.0 Windows версия
    Boxshot

    2000 — Lightwave 3D 6.5

    из-за основного редизайна, более нескольких человек жаловалось на стабильность света в своем новом воплощении, но NewTek был в деле. Через год после выхода 6.0 выпустили 6.5. Он устранил большинство основных проблем людей, а также добавил динамику ткани и Motion Designer 2 — в бесплатном обновлении!

    • экраны любезно предоставлены: Дин Скотт

       

    Разработчик моделей, макет 6.5 Версия для Windows
       

    2001 — LightWave 3D 7.0

    В LightWave 7.0 добавлены новые методы излучения и интегрированы новые инструменты анимации персонажей: микшер движения для нелинейной анимации, новая настройка костей для более быстрого предварительного просмотра, новые параметры подразделения для ускорения рабочий процесс анимации. Было добавлено решение SasLite для волос и меха, а также многие другие дополнения.

    • экраны любезно предоставлены: Дин Скотт

       

    Разработчик моделей, макет 7.0 Версия для Windows

       

    Boxshot and Logo (знания!)

    2002 — LightWave 3D 7.5

    Еще одно бесплатное обновление до LightWave, включая такие скрипты прилагаются), Bandglue и действительно хорошо названный Magic Bevel среди прочего. В конце концов за 7.5 последовала версия 7.5b (06 марта 2003 г.), которая была не очень успешной и имела ряд проблем, поэтому почти сразу была заменена на 7.5с (16 мая 2003 г.). Какое-то время это оставалось передовым преимуществом LightWave, но после выпуска LightWave 8 было выпущено последнее обновление до 7.5 (7.5d от 27 августа 2004 г.) для устранения проблем с реализацией Apple OpenGL в OSX 10.3.
    Ревизии 7.5b, c и d были первыми видимыми плодами работы новой команды разработчиков.

    • экраны предоставлены Ben Vost
    • коробка предоставлена ​​Darkside Animation
    • логотип предоставлена ​​NewTek Europe
    • Обновление PDF5 Версия для Windows                                                                                                    через код в попытке понять его. Эта работа окупилась, и 30 июня 2004 года была официально выпущена первая за два года новая версия. Для некоторых людей LightWave 3D 8 был всего лишь коммерческой коллекцией плагинов, но это была настоящая отправная точка LightWave3D Reborn.Новая команда начинает интегрировать многие из своих внешних плагинов и добавлять мощные функции, такие как: Bone Tools (полная система редактирования костей), новый редактор сцен с Dopesheet (для более удобного редактирования ключей на временной шкале) и DopeTrack. (для редактирования ключей на временной шкале), новая жесткая и мягкая динамика, мягкие и жесткие ссылки для анимации новой динамики, новое ускорение и предварительный просмотр OpenGL, а также множество других небольших, но важных улучшений.

      • Экраны предоставлены Ben Vost
      • Коробка и логотип предоставлены NewTek Europe

      Разработчик моделей, макет 8.0 Windows версия

      Modeler, Layout 8.0 OS X версии


      boxshot


      2004 — Lightwave 3D 8.0.1

      Первый патч для Lightwave 3D [8] -04.

      2005 — LightWave 3D 8.2

      Выпущено второе бесплатное обновление 18 января 2005 г.
      Это обновление включало в себя метод создания неискаженных UV-карт для поверхностей подразделений и было первым в мире. Помимо исправления ошибок, он также представил сглаживание PLD, улучшения VIPER и IK Booster.Также была включена версия Screamernet для Linux, поставляемая в виде RPM. С тех пор это не обновлялось.

      2005 — LightWave 3D 8.2.1

      Патч для версии 8.2 выпущен 05 марта 2005 года

      2005 — LightWave 3D 8.3

      Это четвертое бесплатное обновление, доступное для зарегистрированных пользователей LightWave 3D 8 09 мая 2005 года. . Он предлагал улучшения для HyperVoxels, экспорта в Photoshop и многого другого…

      • Скриншоты предоставлены: Ben Vost

      Разработчик моделей, Layout 8.3 Версия Windows

      Modeler, Layout 8.3 Версия OS X

      2005 — LightWave 3D 8.5

      Пятое бесплатное обновление выпущено 10 октября 05
      Это новое обновление добавляет совместимость с GLSL в раздел Layout LightWave и Multishift в его инструменты моделирования вместе с множеством исправлений ошибок и реализацией запросов функций.
      20 октября 2005 года компания NewTek также выпустила 64-разрядную версию для выпуска Windows XP Professional xp64. Это позволяет людям с 64-битными машинами на базе Windows получить доступ к более чем 2 ГБ оперативной памяти.На момент написания этой версии не существовало для Mac, поскольку на момент написания OSX не была полностью 64-битной ОС.

      2006 — LightWave 3D 9.0

      Выпущено 13 июля 2006 г.

      • Коробка и логотип предоставлены NewTek очень интересно!

        2007 — LightWave 3D 9.2

        Выпущено 25 апреля 2007 г.

        • Улучшения в конвейере рендеринга и затенения три режима
        • Фотореалистичное размытие в движении и регулируемая эффективность затвора для устранения стробирования
        • Фотореалистичная глубина резкости
        • Физически корректные материалы
        • Значительно улучшенный Modeler OpenGL
        • Предварительный просмотр размытия в движении/глубины резкости 9.3

          Выпущено 17 августа 2007 г.

          • Рендеринг точек/краев в новых камерах
          • Одностороннее освещение области
          • Загрузчик/сохранитель изображений OpenEXR
          • )
          • Новые узлы подповерхностного рассеяния Fast Skin и Sigma 2
          • Macintosh Универсальная версия для улучшенного рендеринга Mac на базе Intel (в среднем примерно в 3 раза быстрее)
          • Техническое обновление, обеспечивающее повышенную надежность и скорость по сравнению с дополнениями, внесенными в LightWave v9.3.

          (примечание: установщик Windows содержит как 32-разрядную, так и 64-разрядную версии)

          2008 — LightWave 9.5

          Выпущено 12 августа 2008 г.

          • режим кеширования радиосити.
          • Система рендеринга волос и меха FiberFX поддерживает расчесывание, динамику, волокна с трассировкой лучей, волокна с радиационным затенением и создание смоделированных волокон.
          • Значительно улучшенные функции IK/оснастки, тот же контроллер, что и у элемента, улучшенная стабильность IK, вектор полюса, выравнивание по цели IK плоскости XY.
          • Типы суставных костей, которые легче оснастить, позволяют правильно скручивать их по длине и позволяют растягивать конечности.
          • Параметры сглаживания HDR в средстве просмотра изображений.
          • Lights теперь являются API, позволяющим кодировать сторонние источники света с помощью SDK. Включены новые типы освещения: купольные, IES/фотометрические и сферические/шаровые. Улучшено качество зонального освещения.
          • Collada, добавлена ​​поддержка FBX и улучшена поддержка ввода/вывода OBJ.
          • Интерполированные мягкие отражения/преломления для наплавки на основе узлов.
          • Композиция Накладки для компоновки кадров.
          • Поддержка метаданных EXIF ​​для загружаемых и отображаемых изображений.

          Эта версия не была доступна для Macintosh OS X, только для 32- и 64-разрядной версии Windows.

          2009 — LightWave 9.6

          Выпущено 19 января 2009 г.

          Layout 9.6 Версия для Windows
          • Клонирование FiberFX — обеспечивает возможность размещения нескольких экземпляров волос на одном объекте
          • Layout Snapping — позволяет быстро соединить
          • Ray Cutoff — позволяет художникам решить, в какой момент остановить дальнейшие отражения лучей при рендеринге сцены с большим количеством отражений, преломлений и прозрачности, что значительно экономит время проекта
          • Новые и улучшенные буферы для Экспорт — позволяет пользователям многопроходного конвейера выводить больше буферов (слоев) в широком динамическом диапазоне, а не ограничиваться 8 битами на канал (бит на канал), для большей гибкости
          • Многопоточные пиксельные фильтры — обеспечивает более быструю визуализацию для проектов которые интегрируют пиксельные фильтры
          • Нормализация буфера глубины — позволяет элементам 3D-сцены, экспортированным в фильм или видеоматериал, автоматически смешиваться надлежащим образом. y, даже при перемещении относительно друг друга
          • Открыто для других механизмов визуализации — другие механизмы визуализации, соответствующие стандарту LightWave v9.6 SDK можно использовать непосредственно из интерфейса LightWave
          • Три новых узла
            • Автомобильная краска: значительно упрощает создание сложной полированной поверхности
            • Чешуйка: процедурная текстура, основанная на чешуйках, часто встречающихся в автомобильной краске
            • Кривая: Позволяет создавать сложные градиенты
          • Перетаскивание — позволяет перетаскивать значок объекта или сцены непосредственно в окно Modeler или Layout для загрузки

          2011 — LightWave 9.6.1

          Выпущено 8 июня 2011 г.
          Последний выпуск LightWave 9 был фактически обнародован в июне 2011 г. (хотя год назад он был доступен для открытых бета-тестеров), намного позже выпуска LightWave 10. пара исправлений ошибок, но, что более важно, 64-битная версия для владельцев Mac.

          2010 — LightWave CORE

          Анонсировано 04 февраля, отменено 23 июня 11
          Объявлено, что CORE имеет множество инновационных функций:

          • Полностью переписан, не будет иметь всего LW9.6, представит новые функции, заменяющие наборы функций LW9.6
          • Внутренняя структура приложения и SDK открыто раскрывают все функции, что упрощает будущую разработку
          • Поддержка Linux. Равная поддержка кроссплатформенного графического интерфейса Qt для Linux, Mac и Windows
          • . Динамическое изменение скина с помощью CSS и цветовых конфигураций видового экрана
          • Полная потеря LW9 и более ранних подключаемых модулей и обратной совместимости со сценариями
          • С помощью Qt используйте кроссплатформенные подключаемые модули, использующие тот же исходный код.Упрощенная поддержка Windows / Linux / Mac / 64-бит / 32-бит, требующая только перекомпиляции для этой ОС.
          • Полное раскрытие внутренней архитектуры позволяет всем подсистемам взаимодействовать друг с другом, т.е. волосы под влиянием имитации воды
          • Частичная совместимость файлов LWS, особенно если LWS использует плагины из LW9 и более старых
          • SDK теперь является более важным компонентом LightWave, поскольку он используется NewTek для фактического создания LightWave CORE. Предыдущий SDK включал только стороннюю поддержку.
          • Собственные сценарии Python. LScript больше не поддерживается. SWIG — позволяет использовать гораздо больше языков для программирования в CORE SDK (Tcl, Perl, Guile, PHP, Java, Ruby, C#, LISP, OCaml, LUA, Modula-3, Javascript, R, Octave).
          • Новый формат файла на основе Collada, заменяющий LWS и LWO
          • Унифицированный модуль моделирования и компоновки, по желанию пользователя. Закрепляемый пользовательский интерфейс, отрывные меню.
          • Инстансирование
          • Стек истории/модификаторов
          • Поддержка графического процессора для ускорения вычислений подразделения на графическом процессоре, что позволяет значительно увеличить количество полигонов предварительного просмотра OpenGL быстрее эти функции, что было потеряно, так это ощущение LightWave в отношении программы, и со сменой руководства группы разработчиков было решено, что необходимо использовать CORE в качестве испытательного стенда за закрытыми дверями, чтобы внедрить эти новые технологии в LightWave, поскольку это было уже известно.Это привело к выпуску LightWave 10.

            2010 — LightWave 10

            Выпущено 30 декабря 2010 г.


            Layout 10 OS X

            LightWave 10 — это первый новый порядковый выпуск LightWave с 2006 года. функциональные возможности — управление цветовым пространством, VPR и виртуальная студия.

            • Управление цветовым пространством — поскольку LightWave работает линейно в отношении цвета, тогда как обычные повседневные цвета, отображаемые на мониторе, подчиняются цветовому пространству sRGB, что означает, что они имеют гамму 2.2, это всегда означало, что освещение должно было быть принудительно в прошлом, или цвета должны быть настроены так, чтобы соответствовать ожиданиям. Управление цветовым пространством LightWave 10 означало, что было просто заставить LightWave вести себя в соответствии с управлением цветом.
            • VPR или Viewport Preview Renderer . По мнению многих пользователей LightWave, Worley Labs FPrime был их основной причиной использования LightWave, но было все больше и больше вещей, которые FPrime не мог показать, особенно с узлами, требующими предварительной обработки. обработка или новые схемы излучения, представленные в LightWave 9.3. LightWave 10 представил VPR, который преобразует представление OpenGL, обычно присутствующее в окне просмотра, в средство визуализации в реальном времени.
            • Виртуальная студия — Система для анимации в реальном времени во вьюпорте с использованием внешних контроллеров, например. Камеры PlayStation Move или Microsoft Kinect для перемещения персонажей LightWave.

            2011 — Lightwave10.1

            выпущено Jul-29-2011

            Макет 10.1 ОС x

            2012 — Lightwave 11

            Выпущено FEB-20-2012

            Макет 11.0.3 Windows

            LightWave 11 многое добавляет к LightWave, что делает его одной из самых полных новых порядковых версий. Вот некоторые основные моменты:

            • Создание экземпляров . Хотя создание экземпляров уже давно доступно для LightWave через коммерческие и бесплатные плагины, LightWave впервые имеет возможность генерировать миллиарды полигонов во время рендеринга. Экземпляры можно увидеть в OpenGL и VPR.
            • Стая — Используя простые правила, регулирующие стайку в природе, LightWave теперь создает огромные стаи «животных» (в сочетании с созданием экземпляров).
            • Унифицированная выборка — Раньше в LightWave вам приходилось настраивать все, что использует выборку, во всех местах, где это делается. Это также значительно замедлило рендеринг, и теперь все это унифицировано, вы получаете сопутствующее ускорение рендеринга, а также более простое использование.
            • Bullet Dynamics — Динамика твердого тела мирового класса в реальном времени теперь доступна в LightWave и очень проста в использовании — вам нужно только сообщить LightWave, что объект является динамическим, чтобы он был.
            • Fracture — Неотъемлемой частью системы динамики теперь является возможность разбивать объекты на части, и теперь вы можете делать это в Modeler и Layout.
            • Virtual Studio Tools — управление макетом с помощью устройств 3D ​​Connexion или даже контроллеров PlayStation Move.
            • Interchange Tools — Добавьте бесшовный рабочий процесс между LightWave и ZBrush через GoZ или Unity.
            • Узел Shadow Catcher — простой способ добавить объект, чтобы поймать тени и отражения ваших объектов LightWave в композиции с элементами реального мира.
            • Python — вместе с LScript был добавлен мощный язык сценариев, но он может напрямую обращаться к SDK.

            Видео запуска

            2012 — LightWave 11 SP1 (11.0.1)

            Выпущено 16-12 апреля
            Выпуск с исправлением ошибок, в котором исправлено или улучшено более 130 проблем. Рабочий процесс Unity также значительно улучшился благодаря новому пакету Applink.

            2012 — LightWave 11 SP2 (11.0.2)

            Выпущено 9 июля 12
            Второй выпуск исправления ошибок.Он не добавляет новых функций, а просто исправляет проблемы в предыдущих выпусках. Отслежено 78 исправлений.

            2012 — LightWave 11 SP3 (11.0.3)

            Выпущено 12 августа
            Третий выпуск пакета обновления. Единственной особенностью здесь является новая система лицензирования, которая позволяет использовать лицензию на программное обеспечение, а не использовать аппаратный ключ, к которому был привязан LightWave с тех пор, как он был впервые отделен от Video Toaster.


            Modeler 11.0.3 OS X

            2013 — LightWave 11.5

            Выпущено 31 января 2013 г. Привлекайте / избегайте сетки

          • пуля динамика — деформирующие тела и силы
          • Обмен
          • Обмен
          • After Effects Interchange
          • Fiberfx — Новые пользовательские банкины
          • Genoma — Полная система такелжи
          • Modeler — Линейное перо — Термоусадка — Перемещение оси/Поворот/Масштабирование — Преобразование — Фаска — Размещение сетки — Разрез — Утолщение — Выпрямление — Редактирование краев — ABF Unwrap UVs — Выбор по нормали — Выбор поверхности — Новое поведение вставки
          • Усовершенствования рабочего процесса — Node Editor Probe — Изогнутые коннекторы узлов — Dome Light with Image — MDD Multi-Loader — DoF, Motion Blur и Refraction в VPR — Расширенная поддержка камеры в VPR — R olling Shutter — Отображение кадра траектории движения — Nodal Metallink — Подогнать выбранное и подогнать все
          • Python — Новые архитектуры плагинов — Формат Single Shot

          2013 — LightWave 11.6

          Предварительно выпущенный 23 июля 2013 г.
          На выставке SIGGRAPH в Анахайме, Калифорния, в этом году LightWave Group представила предварительный выпуск LightWave 11.6 вместе с подключаемым модулем NevronMotion для перенацеливания файлов захвата движения и ChronoSculpt, отдельной программой для настройки MDD, Geometry Кэш или файлы Alembic. Более подробная информация будет опубликована здесь, как только все три будут полностью выпущены.
          Выпущено 31 октября 2013 г. Выпущены версии LightWave 11.6, ChronoSculpt и NevronMotion.

          Компоновка 11.6, показывающая управление сплайнами, Modeler 11.6 с демонстрацией Mesh Repair

          Новые возможности версии 11.6 включают:

          • 3D-дисплей — Отображение VPR или OpenGL в стереоскопическом 3D-режиме на телевизоре или мониторе с соответствующим оборудованием
          • 3D-печать — Новые инструменты и загрузчики/сохранители с 3D-печатью. LightWave теперь может загружать и сохранять модели в форматах STL, PLY и VRML, а также есть инструмент, который проверяет пригодность сетки для печати (без полигонов с одной или двумя точками и т. д.)
          • Alembic — поддержка открытой сцены формат
          • Назначения — набор скриптов, помогающих выполнять иерархические операции в макете (родительский элемент, таргетинг и т. д.).)
          • Шейдеры CgFX — Шейдеры игрового движка для отображения в OpenGL
          • Палитра цветов — Поскольку Кен Ниг теперь работает в LightWave Group, он привнес в LightWave свой превосходный плагин для выбора цвета Jovian в качестве основного средства выбора
          • Compound Узлы — Контейнер узлов для упрощения сетей
          • DPX (Digital Picture Exchange) Загрузчик/сохранитель изображений — Загрузчик/сохранитель изображений для цифрового промежуточного формата, часто используемого в производстве Функции управления сплайнами для оснастки
          • Узел ввода — новый постоянный узел (например, узел Surface), который содержит множество вещей, которые могут понадобиться.Необходимое дополнение, необходимое для работы составных узлов
          • Фиксация затухания света — теперь можно зафиксировать затухание света, чтобы предотвратить слишком яркие области внутри зоны затухания
          • Расширение LUT — поддержка большего количества таблиц поиска цветов (LUT)
          • Сопоставление перспективы с камерой или освещением — теперь вы можете увеличить точку обзора в точке обзора «Перспектива» и скопировать ее на камеру или добавить новую камеру. То же самое относится к сопоставлению Light View с существующим или новым источником света
          • Модуль сокращенного набора инструкций Python (PRIS) — PRIS предназначен для того, чтобы сделать сценарии кодирования для LightWave более похожими на LScript, а не на C
          • Raycast Node — Узел, позволяющий автоматически сажать что-либо на горизонтальную поверхность, вместо того, чтобы делать это вручную.Особенно полезно, если поверхность неровная и на ней должна выполняться анимация
          • Управление сплайном — новая система, использующая нули, кости или другие элементы для создания сплайна, который может быть анимирован сам по себе, но также может служить путем для анимации Другие вещи вдоль

          2014 — Lightwave 11.6.3

          Выпущены May-01-2014
          Исправление ошибки релиз (лицензирование проблем разрешено)

          2014 — Lightwave 2015

          2015.3 Макет, показывающий динамику и кости

          -24-2014
          LightWave отказался от номера версии в пользу ежегодной нумерации.Особенности этой новой версии:

          • VPR в нескольких окнах просмотра;
          • Background Importance Sampling для более быстрого бесшумного рендеринга излучаемости;
          • Ограничители пули;
          • Улучшенный ввод-вывод с улучшениями файлов FBX, Alembic и кэша точек;
          • Genoma 2 — это усовершенствованный инструмент для оснастки, который значительно мощнее оригинальной Genoma, встроенной в 11.5;
          • Отображение клипа, наконец, является свойством поверхности;
          • Сопоставление перспективы для неподвижных фоновых изображений, чтобы лучше придать им трехмерность;
          • Quicktime поддерживается в 64-разрядных версиях Windows
          • любой шрифт, поддерживаемый вашей ОС, может использоваться в Modeler
          • десятки улучшений рабочего процесса

          https://www.lightwave3d.com/new_features/

          2014 — LightWave 2015.1

          Выпущено 22 декабря 2014 г.
          Обновление 1 обеспечивает стабильность и исправление ошибок а также эти дополнения:

          • Поддержка OSX в полноэкранном режиме для Layout и Modeler
          • Переназначенный инструмент «Ввод лицензии»
          • Небольшое обновление для преобразования цветов ручки поворота Gizmo, чтобы они соответствовали цвету оси, вокруг которой происходит вращение место.
          • Поддержка импорта установок Mixamo (https://www.mixamo.com/)
          • Добавлена ​​опция «Инвертировать цвет» в узел изображения.
          • Добавление пользовательских настроек для отмены выбора двойным щелчком в Modeler
          • НОВАЯ КОМАНДА «Удалить/Восстановить выделение» стала стандартной по умолчанию вместо «Удалить выделение» в меню и конфигурациях клавиш.

          2015 — LightWave 2015.3

          Выпущено 15 августа 2015 г.

          • Несколько объединений функций
          • Улучшения стабильности

          2018 — LightWave 2011 — LightWave 2018.0

          выпущено январь-01-2018

          макет OpenGL и VPR бок о бок

          Modeler, показывающий макет 21709
          • Система рендеринга на основе физической находки
          • рендеринг и легкие буферы
          • новый объемный двигатель
          • OpenVDB поддержка
          • новая архитектура освещения
          • камеры виртуальной реальности
          • Modifier Modifier Stack
          • New Cel Shader
          • Макет параметрические фигуры
          • Shoot Nemessific Фильтр
          • UDIM поддержка
          • предустановленные улучшения полки
          • новая система рендеринга сети
          • Документация на основе вики

          2018 — LightWave 2018.0,1

          выпущено январь-12-2018

          71 Bugfixes и запросы на функции реализованы

          2018 — Lightwave 2018.0.2

          Выпущено March-01-2018

          Более 200 Bugfixes и запросов на функции реализованы

          2018 — Lightwave 2018.0.3

          Выпущено 29 марта 2018 г.

          63 исправления ошибок и реализовано

          2018 — LightWave 2018.0.4

          Выпущено 01 мая 2018 г.0.5

          Выпущено июль-02-2018

          21 Исправлены ошибки и запросы на функции

          21

          2018 — Lightwave 2018.0.6

          Выпущено AUG-03-2018

          Шесть исправлений и запросов на функции реализованы

          2018 — Lightwave 2018.0.7

          выпущено Окт-31-2018

          5 Bugfixes и запросы функций реализованы

          2019 — Lightwave 2019.0

          Группы сглаживания

          выпущены Jan-22-2019

          • Unreal Bridge — динамический обмен между LightWave и Unreal Engine
          • MetaMorphic — подключаемый модуль анимированного скульптинга для Layout
          • OpenVDB Conversion — живое редактирование VDB <> преобразования сетки — значительно сокращает использование памяти для изображений в сцене во время рендеринга
          • Материал Компоненты — разделяйте материалы для создания собственного образа
          • шейдеры Edge и Patina — креативные шейдеры для большего реализма
          • группы сглаживания — в LightWave добавлено стандартное сглаживание
          • инструменты UV — обновленные инструменты UV
          • SunSky — новый фоновый шейдер и тип освещения для имитации реалистичного и фантастического неба
          • Поддержка HiDPI — Адаптивный макет пользовательского интерфейса для новых разрешений монитора
          • Обновлена ​​документация — Адаптивная вики теперь должна корректно отображаться на всех опорах

          2019 — LightWave 2019.0,1

          выпущено январь-31-2019

          20 Исправления ошибок и функций

          20 Исследовано

          2019 — Lightwave 2019.0.2

          выпущено февраль-28-2019

          54 bugfixes и запросы на функции реализованы

          2019 — Lightwave 2019.0.3

          выпущено март 13-2019

          23 Bugfixes и запросы на функции.1.1

          выпущено август-05-2019

          12 Bugfixes и запросы на функции реализованы

          2019 — Lightwave 2019.1.2

          выпущены август-07-2019

          3 Bugfixes и запросы на функции реализованы

          2019 — Lightwave 2019.1.3

          Выпущено 13 сентября 2019 г.

          8 исправлений ошибок и реализовано запросов функций

          2019 — LightWave 2019.1.4

          Выпущено 25 сентября 2019 г.

          Об этой истории FX, все права защищены. Обновленная вики-версия и редактирование Беном Востом, NewTek 2005-2020

          .

    Author: alexxlab

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.