Почему на этапе а транскрипция не идет синтез белка не осуществляется: Недопустимое название — Викиучебник

Содержание

С чего начинается синтез белка

Исследователи из МГУ уточнили картину молекулярных сигналов на начальных этапах белкового синтеза.

Мы, как известно, примерно на 65% состоим из воды, но следом за водой идут белки, составляющие 20% массы тела. Информация о белках зашифрована в ДНК, в виде последовательности четырёх химических «букв» (азотистых оснований аденина, тимина, гуанина и цитозина), и для того, чтобы информация превратилась в реальную белковую молекулу, должна быть проделана довольно сложная молекулярная работа.

Молекулярная схема рибосомы: рибосомная РНК (синие нити), почти скрыта под молекулами рибосомных белков. (Иллюстрация Evolution Tale / Flickr.com.)

Рибосома движется по матричной РНК в поисках точки, с которой ей предстоит начать синтез белка. (Иллюстрация Сергей Дмитриев / НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, МГУ)

Рибосомы, синтезирующие белковые молекулы на ленте матричной РНК.

(Фото Dr. Donald Fawcett & Kiseleva / Visuals Unlimited / Corbis.)

Схематическое изображение большой и малой рибосомных субчастиц. (Фото Cecilia Stevens / Flickr.com.)

Если клетке нужен какой-то белок, она сначала делает копию с того участка в ДНК, в которой требуемый белок записан – на ДНК синтезируется молекула матричной, или информационной, РНК с необходимым куском генетического «текста». Говоря на языке молекулярной биологии, происходит транскрипция, и суть её, грубо говоря, в том, чтобы с ДНК сделать РНК-ксерокс.

А вот потом наступает черёд собственно синтеза белка, или трансляции: к ленте РНК прикрепляется большой и сложный агрегат под названием рибосома. Так называют надмолекулярный комплекс, образованный несколькими молекулами специальных РНК и целой кучей связанных с этими РНК белков. Работу рибосом можно сравнить с машиной, которая в соответствии с генетической инструкцией собирает из мономеров-аминокислот полимерную белковую молекулу.

Но, как и во всяком деле, тут нужно знать, с чего начать и чем закончить.

Логично было бы предположить, что, раз у ленты информационной РНК есть начало и конец, то прямо с начального её конца и нужно включать белковый синтез. Но в силу разных причин те информационные РНК, которые синтезируются в эукариотических клетках (а люди, животные, растения относятся к эукариотам), имеют в своём начале небольшой запуск, последовательность, в которой никакой белковой информации нет. То есть представьте, например, что вы держите в руках лист бумаги с плотным текстом, набранным без пробелов и знаков препинания, и, чтобы что-то из него понять, его следует читать со слова «старт». Но «старт» стоит не в самом начале, а чуть позже, и его нужно ещё увидеть. Вот именно такую задачу и решает рибосома перед тем, как начать синтез белка.

Как всё происходит? Здесь необходимы новые молекулярные детали: рибосома на самом деле состоит из двух модулей-субчастиц, большой и малой, которые перед тем, как сесть на ленту РНК, разделяются. Первой на РНК приземляется малая субчастица, и она же потом начинает искать точку старта. В этом ей помогает целая компания специальных белков, называемых факторами инициации трансляции, или, иными словами, белковыми молекулами, обслуживающими начало синтеза белка. Их довольно много, и для большей наглядности их можно сравнить с аппаратами-лоцманами, которые в каком-нибудь фантастическом фильме подводят огромный, идущий на посадку космический корабль к правильной посадочной площадке – с той разницей, что теперь этот корабль ещё куда-то поедет по земле, и лоцманам придётся вести его и дальше.

Сев на РНК, малая субчастица рибосомы начинает сканировать её в поисках специальной последовательности генетических букв, обозначающих «старт» (и заодно, кстати, кодирующих первую аминокислоту будущей белковой молекулы). Однако таких «стартов» на пути едущей по РНК малой рибосомной субчастицы может быть не один и не два, а вот правильный среди них – только один. Считается, что правильный «старт» – он более «привлекательный», наткнувшись на него, сканирующая молекулярная машинерия слегка задерживается.

И вот нужное стартовое слово узнано, и что происходит дальше? Один из белков-лоцманов (то бишь факторов инициации) держит при себе молекулу ГТФ (гуанозинтрифосфат), которая очень часто используется в самых разных молекулярных реакциях в качестве сигнала. Когда приходит время, от ГТФ отсоединяется один остаток фосфорной кислоты. Распад ГТФ заставляет блоки белковых молекул сдвигаться друг относительно друга – молекулярная машина перестраивается и становится готовой к выполнению следующих задач. В целом, в известной степени огрубляя, ГТФ можно сравнить с сигнальной ракетой.

Вернёмся к рибосоме (точнее, к её малой субчастице), которая узнала на матричной РНК точку старта. Считается, что последовательность событий тут такая: распознавание стартового «слова» вызывает распад ГТФ (то есть «запуск сигнальной ракеты»), после чего белки-лоцманы, висящие на малой субчастице, разбегаются, чтобы к ней могла пристыковаться большая субчастица. (Стыковка происходит опять же с помощью дополнительных обслуживающих белков и опять же с распадом ещё одной молекулы ГТФ. ) И вот теперь полная рибосома, образованная большим и малым «модулями», начинает читать генетический текст и собирать в соответствии с ним белковую молекулу.

 Однако результаты сотрудников лаборатории Ивана Николаевича Шатского из Института НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, опубликованные в

Nucleic Acids Research, заставляют описанную картину несколько пересмотреть. Не будем углубляться в тонкости методов, которые исследователи использовали в работе. Сразу перейдём к выводам: по новым данным, распад ГТФ, который, как считалось, удостоверяет узнавание места старта, на самом деле происходит до этого. То есть весь молекулярный агрегат, наткнувшись на участок в РНК, который с очень большой вероятностью является настоящим стартом, обращается с ГТФ – а точнее, к тем белкам, которые отвечают за её распад. Если ГТФ гидролизовалась, то начнётся синтез белка, если нет, то пусть тут будет хоть трижды «старт», рибосомный малый модуль проедет дальше.

Но о чём тогда сигнализирует «сигнальная ракета»? Здесь нужно вспомнить ещё раз про факторы инициации белки-лоцманы.

Распад, гидролиз ГТФ зависит от присутствия сразу двух белков, и, если какого-то из них не хватает, не будет никакой «сигнальной ракеты». Иными словами, здесь происходит проверка на присутствие всех факторов инициации, и, если все они есть в достаточном количестве, значит, можно плотно сесть на точку старта, присоединить большую субчастицу и т. д.

Если доискиваться глобального биологического смысла, то тут мы имеем дело с дополнительной проверкой, дополнительным пунктом контроля, дополнительным cheсkpoint’ом в крайне важном и крайне сложном молекулярно-клеточном процессе. (Известно, что чем сложнее процедура, тем лучше лишний раз перестраховатся и лишний раз проверить, всё ли идёт как надо.)

Вообще, инициация – то есть начало – трансляции у эукариот очень зарегулирована, на этих самых белках-лоцманах и на рибосомах сходятся множество сигнальных цепочек: прежде, чем начать синтез белка, клетка должна ясно понять, что за белок и в каком количестве он нужен.

Ну, а важность новых данных, проясняющих картину трансляции, легко себе представить, если вспомнить, что многие онкологические процессы начинаются как раз с неполадок в синтезе белка, когда, к примеру, какой-то молекулы, понуждающей клетку к делению, вдруг становится в клетке слишком много.

По материалам МГУ .

Синтез белков в клетке — урок. Биология, 9 класс.

Каждая клетка содержит тысячи белков. Свойства белков зависят от их первичной структуры, т. е. порядка соединения аминокислотных остатков в молекулах.

 

Информация о первичной структуре всех белков организма закодирована последовательностью нуклеотидов, образующих молекулы ДНК. В молекулах ДНК выделяют гены. Каждый ген соответствует одному белку.

Ген — это единица наследственности, представляющая собой участок ДНК, в котором закодирована первичная структура молекул одного белка.

В одной молекуле ДНК содержится много генов. Все гены данного организма образуют его генотип.

Биосинтез белка

Процесс биосинтеза белка состоит из двух этапов: транскрипции и трансляции.

 

Рис. \(1\). Этапы биосинтеза белка

 

Для каждого этапа биосинтеза требуются особые ферменты и АТФ.


Биосинтез происходит в клетках с огромной скоростью. В организме высших животных в одну минуту образуется до \(60\) тыс. пептидных связей.

Транскрипция

Транскрипция — это процесс переписывания наследственной информации с молекулы ДНК на информационную (матричную) РНК.

В ходе транскрипции участок двуцепочечной ДНК «разматывается». На одной из цепочек синтезируется молекула иРНК.

Рис. \(2\). Транскрипция

 

Информационная (матричная) РНК одноцепочечная, она собирается на одной из нитей ДНК по правилу комплементарности.

 

Рис. \(3\). Комплементарность ДНК и РНК

 

Образуется молекула иРНК, которая является копией второй цепочки ДНК, только в ней тимин заменён на урацил. Закодированная в ДНК информация о первичной структуре белка таким образом переписывается на иРНК.


Как и в любой другой биохимической реакции, в этом процессе участвует фермент — РНК-полимераза.


Молекула ДНК содержит большое количество генов. Каждый ген начинается промотором — особым участком ДНК, состоящим из нескольких расположенных друг за другом нуклеотидов, который определяет РНК-полимераза, и с этого места начинает сборку молекулы иРНК.

 

Синтез иРНК продолжается до терминатора — последовательности, указывающей на завершение сборки иРНК.


В клетках прокариот иРНК образуется в цитоплазме, поэтому образовавшиеся молекулы могут сразу принимать участие в синтезе белков на рибосомах.


В клетках эукариот транскрипция происходит в ядре, поэтому иРНК сначала через поры в ядерной мембране выходит в цитоплазму.

Трансляция 

Трансляция — это перевод информации, закодированной в иРНК, в первичную структуру молекулы белка.

Для сборки белковой молекулы в цитоплазме клетки должны присутствовать все необходимые аминокислоты. Они образуются при расщеплении белков, поступающих с пищей, или синтезируются в самом организме.

 

Аминокислоты доставляются к рибосомам транспортными РНК (тРНК). Аминокислота попадает в рибосому только в комплексе с сответствующей тРНК.

 

На тот конец иРНК, с которого нужно начать синтез белка, нанизывается рибосома. Она движется вдоль иРНК прерывисто, «скачками», задерживаясь на каждом кодоне приблизительно \(0,2\) секунды.

  

К кодону, расположенному в активном центре рибосомы, присоединяется тРНК с комплементарным антикодоном. Соединённая с ней аминокислота образует пептидную связь к растущей полипептидной цепочкой. Затем  рибосома перемещается на следующий кодон иРНК. В рибосоме оказывается тРНК с антикодоном, комплементарным следующему триплету в иРНК, и к образующейся молекуле белка присоединяется следующая аминокислота.


  

Рис. \(4\). Трансляция

 

Рибосома постепенно сдвигается по иРНК, задерживаясь на следующих триплетах. Так поэтапно собирается молекула белка.

 

Синтез полипептидной цепи заканчивается, когда в активном центре рибосомы  оказывается стоп-кодон (УАА, УАГ или УГА). Молекула белка отсоединяется от рибосомы, выходит в ЭПС или цитоплазму и усложняется, образуя характерную вторичную, третичную и четвертичную структуры.

 

На одной иРНК одновременно находятся несколько рибосом и происходит синтез нескольких молекул белка. Рибосомы, которые связаны с одной иРНК и синтезируют один и тот же белок, образуют полисому.

 

Когда синтез данного белка окончен, рибосома может найти другую иРНК и начать синтезировать другой белок.

 

Общая схема синтеза белка представлена на рисунке.


  

Рис. \(5\). Общая схема биосинтеза белка

 

Пример:

последовательность нуклеотидов матричной цепи ДНК: ААГ  ГЦТ  ТАГ.
При транскрипции на этой цепи по принципу комплементарности образуется участок иРНК с нуклеотидами УУЦ  ЦГА  АУЦ, на котором в результате трансляции образуется цепочка из аминокислот: фенилаланин — аргинин — серин.

Если в одном из триплетов произойдёт замена нуклеотидов или они поменяются местами, то может случиться так, что триплет станет кодировать какую-нибудь другую аминокислоту. Значит, произойдут изменения и в строении белка, закодированного данным геном, что может оказать влияние на процессы обмена веществ и изменить признаки организма.

 

Обрати внимание!

Нарушения последовательности нуклеотидов в ДНК или иРНК могут приводить к возникновению мутаций.  

Источники:

Рис. 1. Этапы биосинтеза белка. https://image.shutterstock.com/image-vector/dna-replication-protein-synthesis-transcription-600w-1040732464.jpg

Рис. 2. Транскрипция. https://image.shutterstock.com/image-illustration/double-stranded-dna-copied-into-600w-757534681.jpg

Рис. 3. Комплементарность ДНК и РНК. © ЯКласс

Рис. 4. Трансляция. https://image.shutterstock.com/image-vector/scheme-translation-process-syntesis-mrna-600w-1314724547.jpg

Рис. 5. Общая схема биосинтеза белка. https://image.shutterstock.com/image-vector/protein-synthesis-vector-illustration-labeled-600w-1205986015.jpg

Трансляция генетической информации. Синтез белка

    В. Трансляция генетической информации. Синтез белка [c.227]

    До сих пор не раскрыты в деталях молекулярные механизмы передачи генетической информации, закодированной в нуклеотидной последовательности ДНК. Различают три основных этапа реализации генетической информации. На первом этапе-этапе репликации происходит образование дочерних молекул ДНК, первичная структура которых идентична родительской ДНК (копирование ДНК). Репликация ДНК является ключевой функцией делящейся клетки и частью таких биологических процессов, как рекомбинация, транспозиция и репарация. На втором этапе, названном транскрипцией, генетическая информация, записанная в первичной структуре ДНК, переписывается в нуклеотидную последовательность РНК (синтез молекулы РНК на матрице ДНК). На третьем этапе-этапе трансляции генетическая информация, содержащаяся уже в нуклеотидной последовательности молекулы РНК, переводится в аминокислотную последовательность белка. Далее представлены основные итоги исследований и наши представления о биосинтезе полимерных молекул ДНК, РНК и белка, полученные к середине 1996 г. 

[c.478]


    Центральное положение молекулярной генетики заключается в том, что ДНК хранит генетическую информацию, РНК считывает эту информацию и использует ее в синтезе белков.
При этом реализуются три основных процесса репликация, транскрипция и трансляция. [c.540]

    Репликация, транскрипция и трансляция ядерного генома. У эукариот генетическая информация, содержащаяся в ядре, распределена между хромосомами. Каждая хромосома — это нитевидная структура, содержащая ДНК, основные белки особого типа, называемые гистонами и группу негистоновых белков, которые, вероятно, играют какую-то роль в регулировании функции генов. В неделящемся, или интерфазном, ядре каждая хромосома сильно выгнута и имеет толщину всего 20-30 нм поэтому ее нельзя увидеть с помощью светового микроскопа. Интерфазное ядро содержит ядрышко — органеллу, богатую РНК и связанную со специфическим участком хромосомы — ядрышковым организатором. Ядрышковый организатор содержит множество копий генов, определяющих структуру рибосомальных РНК ядрышко служит местом синтеза высокомолекулярного РНК-предшественника, из которого затем путем расщепления образуются основные типы молекул РНК, входящих в состав цитоплазматических рибосом.

Эти РНК, а также матричные РНК, синтезируемые в других участках хромосом, выходят через ядерные поры в цитоплазму, где происходит сборка рибосом и синтезируется основная масса клеточного белка. [c.48]

    Наследственным или генетическим материалом всех организмов является ДНК, в которой в форме генетического кода зашифрована информация о всех белках организма. Передача и реализация фенотипической информации о синтезе белков осуществляется в результате транскрипции и трансляции. Такой путь передачи информации (ДНК РНК Белок) получил название центральной догмы биологии (см. главу 11). [c.539]

    Воспроизведение и действие генов непосредственно связаны с матричными процессами, синтезом макромолекул — ДНК, РНК, белков. Уже рассматривалась репликация (в гл. 6) как процесс, ответственный за воспроизведение генетической информации. Обращаясь к действию гена, рассмотрим транскрипцию или синтез РНК, и трансляцию, или синтез белка. [c.380]

    Ноток генетической информации в нормальных клетках происходит в направлении ДНК—>РНК—>белок. Синтез РНК по ДНК-матрице называется транскрипцией, а синтез белка по РНК-матрице -трансляцией. Существует три типа моле- [c.63]

    Значительное увеличение фракции прочносвязаиной ДНК при нарастании водиого дефицита свидетельствует о нарушении трансляции генетической информации на этапе синтеза матричных РНК. Следовательно, синтез белков при водном дефиците нарушается не только в связи с повышением активности рибонуклеазы, но и по причине значительных изменений в самом хроматине ядер, вследствие чего уменьшается способность передачи информации из ядра в клетку. [c.189]


    Генетическая информация передается от родительской клетки к дочерней путем репликации (синтеза) ДНК- Генетическая информация сохраняется в ДНК до тех пор, пока не понадобится, а затем превращается в инструкцию по синтезу белка специфической последовательности в процессе транскрипции. Генетическая инструкция переписывается на полимерную молекулу РНК (мРНК). Она в свою очередь взаимодействует с соответствующими специфическими амииоацил-тРНК, в результате чего происходит последовательное присоединение аминокислот. Перевод генетической информации из РНК в специфическую аминокислотную последовательность называется трансляцией. [c.108]

    ТРАНСЛЯЦИЯ (от лат. translatio-передача), программируемый генами процесс синтеза белка. Посредством Т. осуществляется реализация генетич. информации нуклеиновых к-т (см. Генетический код). [c.620]

    В последовательности ДНК—> РНК—> Белок недоставало сведений о том, каким образом происходят расшифровка наследственной информации и синтез специфических белков, определяющих широкое разнообразие признаков живых существ. В настоящее время выяснены основные процессы, посредством которых осуществляется передача наследственной информации репликация, т.е. синтез ДНК на матрице ДНК транскрипция, т.е. синтез РНК на матрице ДНК или перевод языка и типа строения ДНК на молекулу РНК (см. ранее), и трансляция—процесс, в котором генетическая информация, содержащаяся в молекуле мРНК, направляет синтез соответствующей аминокислотной последовательности в белке. Напомним, однако, что многие тонкие механизмы транскрипции и трансляции окончательно еще неясны. [c.511]

    Синтез белка представляет собой циклический энергозависимый многоступенчатый процесс, в котором свободные аминокислоты полимеризуются в генетически детерминированную последовательность с образованием полипептидов. Система белкового синтеза, точнее система трансляции, которая использует генетическую информацию, транскрибированную в мРНК, включает участие множества разнообразных молекул (низкомолекулярные вещества и макромолекулы, а также надмолекулярные структуры). В табл. 14.1 обобщены известные к настоящему времени данные [c.523]

    Вся информация о строении и функционировании любого живого организма содержится в закодированном ввде в его генетическом материале, основу которого составляет дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). ДНК большинства организмов — это длинная двухцепочечная полимерная молекула. Последовательность мономерных единиц (дезоксирибонуклеотидов) в одной ее цепи соответствует (комплементарна) последовательности дезоксирибонуклеотидов в другой. Принцип комплементарности обеспечивает идентичность новосинтезированных молекул ДНК, образующихся при их удвоении (репликации), исходным молекулам. Индивидуальными генетическими элементами со строго специфичной нуклеотидной последовательностью, кодирующими определенные продукты, являются гены. Одни из них кодируют белки, другие -только молекулы РНК. Информация, содержащаяся в генах, которые кодируют белки (структурных генах), расшифровывается в ходе двух последовательных процессов синтеза РНК (транскрипции) и синтеза белка (трансляции). Сначала на определенном участке ДНК как на матрице синтезируется матричная РНК (мРНК). Затем в ходе согласованной работы многокомпонентной системы при участии транспортных РНК (тРНК), мРНК, ферментов и различных белковых факторов осуществляется синтез белковой молекулы. Все эти процессы обеспечивают правильный перевод зашифрованной в ДНК генетической информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот. Аминокислотная последовательность белковой молекулы однозначно задает ее структуру и функции. [c.29]

    Репликация, транскрипция и трансляция геномов органелл. В хлоропластах и митохондриях ДНК представлена небольшими двухцепочечными молекулами, обычно кольцевыми, и не связана с гистонами. Таким образом, генетическая информация органелл содержится в структурах, весьма сходных с хромосомами прокариот, хотя и значительно меньших по размерам. В каждой органелле имеется множество копий ДНК (до 40—50 в некоторых хлоропластах). Кроме того, хлоропласты и митохондрии содержат аппарат транскрипции и трансляции, включая специфические для органелл рибосомы, которые меньше цитоплазматических 808-рибосом и близки по величине к 708-рибосо-мам прокариот. Синтез белка в органеллах ингибируется хлорам нико-лом и некоторыми другими антибиотиками, подавляющими этот процесс и у прокариот, но не влияющими на синтез белка в цитоплазме эукариотической клетки. Таким образом, хлоропласты и митохондрии обнаруживают ряд важных черт фундаментального сходства с прокариотическими клетками. Митохондрии обладают еще одной особенностью, характерной для клеток, но не для других компонентов клетки они образуются путем деления предсуществующих органелл. Это продемонстрировано также в отношении многих типов хлоропластов у водорослей. У высших растений зрелые хлоропласты развиваются из более простых структур — пропластид на стадии пропластид и происходит воспроизводство этих органелл. [c.49]


    Все взаимосвязанные реакции, которые, в сущности говоря, и составляют жизнь живой клетки, зависят от ферментов. Репликация генетической информации, ее преобразование в инструкции для синтеза специфических белков (транскрипция и трансляция), самый синтез этих белков — каждый из этих процессов зависит от специфических ферментов, которые в свою очередь образуются в результате этих процессов. Более того, все реакции промежуточного обмена веществ, поставляющие строительный материал и энергию для образования новых и жизнедеятельности старых клеток, катализируются ферментами, синтезированными под контролем ДНК ядер, хлоропластов и митохондрий. Б задачу этой книги не входит рассмотрение вопроса о том, возможна или не возможна жизнь. Ясно одно жизнь как самопро-являющееся, самовоспроизводящееся, метастабильное состояние невозможна без ферментов. Главное, чему учит нас энзимология, коротко состоит в следующем все явления жизни, начиная от самых простейших реакций до сложных процессов человеческого сознания и мышления, могут быть описаны с помощью понятий, определяющих химические и физические свойства атомов, ионов и молекул. [c.15]

    Принщш комплементарности лежит в основе таких важнейших процессов, как репликация (удвоение молекулы ДНК в процессе клеточного деления), транскрипция (передача генетической информации с молекулы ДНК информационной РНК в процессе синтеза белков) и трансляция (сборка из аминокислот белковой молекулы на рибосомах).[c.16]

    Феномен старения и смерти живого организма предопределен биологически и обеспечивает общее эволюционное развитие живой природы. В соответствии с законом естественного отбора в ходе эволюции не только расширяются метаболические (трофические) связи живых систем с окружающей средой, но и увеличивается информационное содержание этих связей. Информационное обеспечение в свою очередь повышает надежность функционирования каждого живого организма и его соответствие окружающей среде на данном этапе эволюции (Шмальгаузен, 1961). Таким образом, изменчивость, вариабельность, накопление новых биологических свойств позволяют живым системам приспосабливаться к изменениям окружающей среды, однако трансляция этих изменений в последующие поколения строго Офаничена консерватизмом генетического аппарата. Старение организма определяется понижением информационной надежности генетического аппарата живых клеток в результате накопления ошибок при репликации ДНК и транскрипции генетической информации, что в свою очередь приводит к ошибкам при синтезе и процессинге полипептидов и белков (Бриллюэн, 1966 Сьяксте, Будылин, 1992). Стратегия биологической эволюции заключается в том, что организм, в котором накопление молекулярных дефектов генетического аппарата достигло критического уровня, изымается из популяции. Иными словами, наряду с этапами зачатия, роста и развития организма старение является эндогенно обусловленным, т. е. естественным, терминальным этапом. Оно начинается периодом стабилизации жизненных функций, угасанием репродуктивного потенциала, постепенным замедлением метаболизма и завершается периодом снижения активности и отмиранием отдельных клеточных систем и тканей. Отказ одних систем организма, как пра- [c.159]

    Известно, что вся генетическая информация для синтеза белка содержится в хромосоме (молекуле ДНК)и что эта информация реализуется в результате последовательных процессов транскрипции и трансляции. При этом сначала на соответствующем гене (участке молекулы ДНК) синтезируется информационная, или матричная, РНК (мРНК). Она служит матрицей для синтеза белка (полипептида) в процессе трансляции (рис. 1). Таким образом, процесс транскрипции представляет собой непосредственное проявление активности отдельных генов. [c.16]

    Черты сходства между вирусами и хозяевами наблюдаются в реализации генетической информации. Так, у многих РНК-со-держащих вирусов эукариот различные белки образуются в результате протеолитического расщепления единого предшественника — полипротеина — первичного продукта трансляции вирусной РНК. Каждую молекулу вирусной РНК у РНК-содержащих вирусов можно рассматривать как самостоятельный ген-кластер. РНК таких вирусов служит одновременно носителем генетической информации и в качестве иРНК. Расщепление же полипротеина — это своеобразное приспособление вирусов к паразитизму внутри клетки эукариот, в которой невозможна повторная инициация в ходе белкового синтеза, и в то же время для созревания вириона необходимо несколько отдельных белковых молекул. [c.483]

    Единицы транскрипции (транскриптоны). Синтез РНК молекулами РНК-полимераз ш vivo начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами, и завершается на особых регуляторных последовательностях — терминаторах. Последовательности нуклеотидов ДНК, заключенные между промоторами и терминаторами, называют транскрипционными единицами, или транскриптонами. В пределах каждого транскриптона транскрибируется только одна цепь ДНК, которая получила название значащей или матричной. Термины транскрипционная единица или транскриптон по смыслу близки термину ген , но они не всегда совпадают. Так, транскрипционные единицы прокариот, как правило, заключают в себе генетическую информацию нескольких генов и называются оперонами. Продуктами транскрипции оперонов являются полицистронные мРНК, при трансляции которых рибосомами образуется несколько белков. Белки, кодируемые полицистронными мРНК, обычно функционально связаны друг с другом и обеспечивают протекание какого-либо метаболического процесса, например, биосинтеза определенной аминокислоты или утилизацию углеводов в качестве источника углерода. Организация генов в виде оперонов облег- [c.30]

    Синтезом полноценного полипептида в результате трансляции кодирующей его мРНК рибосомами обычно завершается процесс передачи генетической информации от генов к белкам как у бактерий, так и у высших организмов. Однако в большинстве случаев при синтезе конечного белкового продукта эукариотическими клетками производятся различные его модификации, в результате которых полипептид и приобретает требуемые свойства. Особой посттрансляционной модификацией является сплайсинг белков, механизм которого будет рассмотрен во второй части книги (раздел 1.3.2). [c.35]

    Роль генов состоит в хранении и передаче генетической информации. Информация записывается в структуре хромосомной ДНК в виде триплетного нуклеотидного кода. Информация в клетках передается благодаря синтезу РНК на матрице ДНК (транскрипция) и синт специализированных белков на матрице мРНК с участием рРНК и тРНК (трансляция). В ходе и после транскрипции или трансляции происходит модификация биополимеров (процессинг), транспортирующихся в места назначения. Специализированные белковые молекулы в соответствии со своей структурной информацией путем самосборки образуют специфические комплексы, выполняющие различные функции каталитические (ферменты), двигательные (сократительные белки), транспортные (насосы и переносчики), рецепторные (хемо-, фото- и механорецепторы), регуляторные (белковые активаторы, репрессоры, ингибиторы), защитные (лектины) и др.[c.33]

    У прокариот основным способом регуляции экспрессии гена является, по-видимому, включение-выключение транскрипции, хотя в некоторых случаях вступают в действие другие механизмы, например аттенуация, терминация, антитерминация, контроль трансляции и регуляция метаболизма матричных РНК и белков. Подобно этому элементы, осуществляющие включение и выключение транскрипции, играют рещающую роль в регуляции экспрессии генов также у эукариот. От сплайсинга, особенно от его способа, зависит, какие именно образуются матричные РНК и соответственно кодируемые ими белки. Кроме того, имеются данные о регуляции при помощи аттенуации или терминации транскрипции, а также указания на то, что трансляция и метаболизм РНК тоже подвержены регуляции в процессе синтеза белков. Уникальные свойства эукариотических клеток и структура их генов и геномов обеспечивают дополнительные возможности для контроля передачи генетической информации. Например, полный транскрипт гена остается нефункциональным до тех пор, пока не будут правильно вырезаны входящие в него интроны. Далее транскрипты предщественники матричных РНК-должны быть модифицированы на 5 — и З -концах, а сами матричные РНК должны перейти из ядра в цитоплазму, прежде чем они смогут участвовать в трансляции. В принципе регуляция может осуществляться на каждом из этих этапов. [c.10]

    А. Поток генетической информации направлен от нуклеиновых кислот (ДНК/РНК) к белкам и никогда в обратном направлении.Это означает, что последовательности оснований ДНК и РНК могут служить матрицами для синтеза других ДНК- или РНК-последовательностей, а аминокислотные последовательности в белках никогда не служат матрицей для синтеза РНК (или ДНК) последовательности оснований. Основные процессы копирования нуклеиновых кислот — это ДНК- ДНК (репликация ДНК), ДНК- (РНК (транскрипция), РНК->(РНК (репликация РНК) и РНК->(ДНК (обратная транскрипция). Аминокислотные последовательности, составляющие белки, определяются последовательностью оснований в молекуле мРНК. Этот сложный процесс, называемый трансляцией, проходит в рибосомах на цитоплазме (см. приложение). [c.52]

    Реализация генетической информации вируса осуществляется в соответствии с хорошо известными из биологии процессами транскрипции (от лат. 1гап8сг1р1ю — переписывание, т.е. синтез информационных РНК — иРНК, комплементарных матричным ДНК или РНК), трансляции (от лат. 1гап81а11о — передача, т. е. синтез белков на рибосомах клетки с участием иРНК) и репликации (от лат. герИса1ю — повторение, т. е. синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному). Поскольку генетический аппарат вирусов достаточно разнообразен, то передача наследственной информации в отношении синтеза иРНК различна. Основные схемы реализации вирусной генетической информации могут быть представлены следующим образом  [c.53]

    Фенотипические признаки клеток разных типов, а также одной и той же клетки в различных условиях зависят от количества и свойств продуцируемых ими структурных, каталитических и регуляторных белков. Регулироваться может какой-то ОДИН или несколько отдельных этапов считывания генетической информации при синтезе белка. У бактерий, например у Е. соН, образование белков регулируется главным образом содержанием мРНК, доступной для трансляции. Дополнительный способ поддержания нужной концентрации клеточных белков состоит в регуляции различных этапов трансляции, а также скорости деградации белков. Эукариотические клетки обладают более сложными механизмами регуляции белкового состава. Содержание мРНК в цитоплазме регулируется не только на уровне инициации транскрипции в ядре, но и на уровне процессинга первичных транскриптов и транспорта зрелых РНК в цитоплазму. Подобно прокариотам, эукариотические клетки тоже могут регулировать как трансляцию, так и скорость транспорта и деградации белков. [c.172]

    Накопление, передача и экспрессия (выражение в фенотипе) генетической информации составляют основную тему части IV. В начале описьгоаются эксперименты, показывающие, что ДНК является генетическим материалом, а также история открытия двойной спирали ДНК. Затем следует описание ферментативного механизма репликации ДНК. Далее мы перейдем к экспрессии генетической информации, заключенной в ДНК, начав с описания данных о роли информационной РНК как промежуточного переносчика информации. Затем рассматривается процесс транскрипции, т. е. синтез РНК в соответствии с инструкциями, заключенными в матричной ДНК. Из этого логически вытекает описание генетического кода, т.е. взаимосвязи между последовательностью оснований в ДНК (или в транскрибируемой с нее информационной РНК) и последовательностью аминокислот в соответствующем белке. Генетический код, общий для всех живых организмов, прекрасен своей простотой. Три основания составляют кодон-единицу кода, соответствующую одной аминокислоте. Кодоны в информационной РНК последовательно считываются молекулами транспортных РНК, которые выполняют роль адапторов в син-тезе белка. Далее мы переходим к механизму белкового синтеза, а именно к процессу трансляции, в ходе которого четырехбуквенный алфавит нуклеиновых кислот, в котором каждая буква представлена соответствующей парой оснований, переводится в 20-буквенный алфавит белков. Трансляция происходит на рибосомах и обеспечивается координированным взаимодействием более чем сотни различных высокомолекулярных соединений. В следующей главе описывается регуляция экспрессии генов у бактерий, причем основное внимание уделяется оперо-нам лактозы и триптофана у Е. соН, как наиболее изученным в настоящее время. Далее обсуждаются результаты последних исследований экспрессии генов у более высокоорганизованных организмов (т.е. у эукариот), отличающихся от бактерий (прокариот) более высоким содержанием ДНК и наличием оформленного ядра, что обеспечивает диф-ференцировку клеток. Затем рассматри- [c.15]

    Образованная в результате транскрипции информационная РНК участвует в ряде реакций, заканчивающихся синтезом новообразованных нолииептидных ценей. Эту последовательность реакций называют трансляцией, так как именно в ходе этих реакций информация, записанная на языке генетического кода, переводится в структуру молекулы белка или полипептида. Механизмы регуляции белкового синтеза на уровне трансляции еще точно не установлены. Теоретически такая регуляция могла бы осуществляться на любом нз последовательных этапов трансляции, включающих 1) присоединение мРНК к рибосомной 405-субчастнце, 2) образование рибосомного 805-комплекса, [c.16]

    Из этого следует, что механизм использования матрицы при биосинтезе белков должен быть иным, чем в случае синтеза ДНК или РНК. Если репликацию и транскрипцию можно сравнить просто с переписыванием текста, то трансляция — это дешифровка, декодирование информации об аминокислотной последовательности, записанной (закодированной) с помощью ну1Слеотидной последовательности. Способ шифровки в нуклеиновых кислотах информации о первичной структуре белков получил название биологического кода (его называют также генетическим, нуклеотидным, аминокислотным кодом). [c.132]


Транскрипция в биологии где происходит. Общие сведения

После расшифровки генетического кода встал вопрос: каким образом осуществляется перенос информации с ДНК на белок? Биохимическими исследованиями было установлено, что основная масса ДНК в клетке локализована в ядре, тогда как синтез белка идет в цитоплазме. Это территориальное разобщение ДНК и синтеза белка обусловило поиски посредника. Поскольку синтез белка шел с участием рибосом, то на роль посредника была выдвинута РНК. Была создана схема, иллюстрирующая направление потока генетической информации в клетке:

ДНК → РНК → белок

Она получила название центральной догмы молекулярной биологии. Ф. Крик постулировал, что синтез макромолекул по этой схеме осуществляется по матричному принципу. На доказательство правильности этого постулата потребовались многие годы.

Вначале предполагалось, что роль посредника выполняет рибосомальная РНК (“один ген — одна рибосома — один белок”). Однако в скором времени выяснилась несостоятельность такого предположения. Было показано, что в процессе белкового синтеза количество рибосом не изменяется, т.е. новая РНК не синтезируется и, следовательно, новая информация не поступает. Вскоре в составе рибосом была обнаружена фракция нестабильной РНК, молекулы которой непрочно удерживаются на рибосоме с помощью катионов Mg. Методом молекулярной гибридизации было показано, что молекулы этой РНК являются копиями определенных участков ДНК. Она получила название матричной , или информационной РНК . Ее также называли раньше РНК-посредник и мессенджер-РНК. Комплементарность этих молекул определенным участкам ДНК говорила о том, что они синтезируются по матричному типу на ДНК.

Постепенно был выяснен весь путь переноса информации от ДНК к белку. Он состоит из двух этапов: транскрипции и трансляции . На этапе транскрипции происходит считывание и перенос генетической информации с ДНК на иРНК. Процесс транскрипции протекает в три стадии: инициации , элонгации и терминации . Информация считывается только с одной цепи ДНК (+ цепь), так как исходя из свойств генетического кода, комплементарные участки ДНК не могут кодировать структуру одного и того же белка из-за отсутствия комплементарной вырожденности кода. Ведет транскрипцию фермент РНК-полимераза, состоящий из четырех субъединиц (ααββ») и не обладающий специфичностью в отношении источника ДНК. На начальном этапе транскрипции — инициации — к ферменту присоединяется пятая субъединица, так называемый s-фактор, который осуществляет узнавание специфического участка ДНК, промотора. Промоторы не транскрибируются. Узнаются они s-фактором по наличию в них специфической последовательности нуклеотидов. В бактериальных промоторах она называется блоком Прибнова и имеет вид ТАТААТ (с небольшими вариациями). К промотору присоединяется фермент РНК-полимераза. Рост цепи иРНК идет в одном направлении, скорость транскрипции равняется ≈ 45-50 нуклеотидов в 1 секунду. На этапе инициации синтезируется только короткая цепочка из 8 нуклеотидов, после чего s-фактор отделяется от РНК-полимеразы и начинается этап элонгации. Наращивание цепи иРНК ведет уже белок-тетрамер. Участок, с которого считывается информация, называется транскриптоном. Он заканчивается терминатором — специфической нуклеотидной последовательностью, играющей роль stop-сигнала. Дойдя до терминатора, фермент РНК-полимераза прекращает работу и с помощью белковых факторов терминации отделяется от матрицы.

В бактериальных клетках образующиеся молекулы иРНК могут сразу выполнять роль матриц для синтеза белка, т.е. транслироваться. Они соединяются с рибосомами, к которым одновременно молекулы транспортных РНК (тРНК) доставляют аминокислоты. Цепочки транспортных РНК состоят примерно из 70 нуклеотидов. Однонитиевая молекула тРНК имеет участки комплементарного спаривания, в составе которых находятся активные центры: участок узнавания тРНК ферментом тРНК-синтетазой, присоединяющим к тРНК соответствующую активированную аминокислоту; акцептор — участок, к которому присоединяется аминокислота, и антикодоновая петля.

Антикодон — это триплет, комплементарный соответствующему кодону в молекуле иРНК. Взаимодействие кодон-антикодон идет по типу комплементарного спаривания, во время которого происходит присоединение аминокислоты к растущей белковой цепи. Инициирующим кодоном в составе разных иРНК является кодон AUG, соответствующий аминокислоте метионину. Поэтому первой к матрице подходит тРНК с антикодоном UAC, соединенная с активированной аминокислотой метионином. Ферменты, активирующие аминокислоты и соединяющие их с тРНК, называются аминоацил-тРНК-синтетазы. Все этапы биосинтеза белка (инициация, элонгация, терминация) обслуживаются белковыми факторами трансляции. У прокариот их по три на каждый этап. В конце матрицы иРНК находятся нонсенс-кодоны, которые не считываются и знаменуют собой конец трансляции.

В геноме многих организмов, от бактерий до человека, обнаружены гены и соответствующие им тРНК, осуществляющие нестандартное считывание кодонов. Это явление получило название неоднозначности трансляции .

Оно позволяет избежать негативных последствий ошибок, возникающих в структуре молекул иРНК при транскрипции. Так, при появлении внутри молекулы иРНК нонсенс-кодонов, способных преждевременно прекратить процесс транскрипции, включается механизм супрессии. Он состоит в том, что в клетке появляется необычная форма тРНК с антикодоном, комплементарным нонсенс-кодону, чего в норме быть не должно. Ее появление является результатом действия гена, осуществляющего замену основания в антикодоне тРНК, близким по составу к нонсенс-кодону. В результате такой замены нонсенс-кодон считывается как обычный значащий кодон. Подобные мутации получили название супрессорных, т.к. они подавляют изначальную мутацию, которая привела к появлению нонсенс-кодона.

ДНК — носитель всей генетической информации в клетке — непосредственного участия в синтезе белков не принимает. В клетках животных и растений молекулы ДНК содержатся в хромосомах ядра и отделены ядерной мембраной от цитоплазмы, где происходит синтез белков. К рибосомам — местам сборки белков — высылается из ядра несущий информацию посредник, способный пройтичерез поры ядерной мембраны. Таким посредником является информационная РНК ( и-РНК). По принципу комплементарности она считывается с ДНК при участии фермента, называемого РНК-полимеразой . Процесс считывания (вернее, списывания), или синтеза РНК, осуществляемый РНК-полимеразой, называется транскрипцией (лат. transcriptio — переписывание). Информационная РНК — это однонитевая молекула, й транскрипция идет с одной нити двунитевой молекулы ДНК. Если в транскрибируемой нити ДНК стоит нуклеотид Г, то РНК-полимераза включает в РНК Ц, если стоит Т, включает А, если стоит А, включает у (в состав РНК не входит Т) ( рис. 46). По длине каждая из молекул и-РНК в сотни раз короче ДНК. Информационная РНК является копией не всей молекулы ДНК, а только части ее — одного гена или группы рядом лежащих генов, несущих информацию о структуре белков, необходимых для выполнения одной функции. У прокариот такая, группа генов называется опероном . О том, как гены объединены в оперон и как организовано управление транскрипцией, вы прочтете в в разделе о биосинтезе белков . В начале каждого оперона находится своего рода посадочная площадка для РНК-полимеразы, называемая промотором . Это специфическая последовательность нуклеотидов ДНК, которую фермент узнает благодаря химическому сродству. Только присоединившись промотору, РНК-полимераза способна начать синтез и-РНК. Дойдя до конца оперона, фермент встречает сигнал (в виде определенной последовательности нуклеотидов), означающий конец считывания. Готовая и- РНК отходит от ДНК и направляется к месту синтеза белков. В описанном процессе транскрипции можно выделить четыре стадии:

1) Связывание РНК-полимеразы с промотором;

2) Инициация — начало синтеза. Она заключается в образовании первой фосфодиэфирной связи между АТФ или ГТФ и вторым нуклеотидом синтезирующейся молекулы и-РНК;

3) элонгация — рост цепи РНК, т. е. последовательное присоединение нуклеотидов друг к другу в том порядке, в котором стоят комплементарные нуклеотиды в транскрибируемой нити ДНК. Скорость элонгации достигает 50 нуклеотидов в секунду;

4) терминация — завершение синтеза и-РНК.

Биосинтез РНК – транскрипция – процесс считывания генетической информации с ДНК, при котором нуклеотидная последовательность ДНК кодируется в виде нуклеотидной последовательности РНК. Используется в качестве энергии и субстрата – нуклеозид-3-фосфат с рибозой. В основе лежит принцип комплиментарности – консервативный процесс – синтезируется новая одноцепочная РНК во время всей интерфазы, начинается в определенных участках – промоторах, заканчивается в терминаторах, а участок между ними – оперон (транскриптон) – содержит один или несколько функционально связанных генов, иногда содержит гены которые не кодируют белки. Отличия транскрипции : 1) транскрибируются отдельные гены. 2) не требуется праймера. 3) в РНК включается рибоза, а не дезоксирибоза.

Этапы транскрипции: 1) связывание РНК-полимеразы с ДНК. 2) инициация – образование цепи РНК. 3) элонгация или рост цепи РНК. 4) терминация.

1 этап – участок с которым связывается РНК-полимераза называется промотор (40 нуклеотидных пар) – имеет сайт узнавания, прикрепления, инициации. РНК-полимераза узнав промотора садится на него и образуется закрытый промоторный комплекс, в котором ДНК спирализовано и комплекс может легко диссоциировать и переходить в открытый промоторный комплекс – связи прочные, азотистое основание выворачивается наружу.

2 этап – инициация синтеза РНК заключается в образовании нескольких звеньев в цепи РНК, синтез начинается на одной цепи ДНК 3’-5’ и идет в направлении 5’-3’. Стадия заканчивается отделением б-субъединицы.

3 этап – элонгация – удлинение цепочки РНК – происходит за счет Core-рРНК-полимеразы. Нить ДНК деспирализована на 18ти парах, а на 12 – гибрид – общий гибрид ДНК и РНК. РНК-полимераза продвигается по цепочке ДНК, а после восстановление цепочки ДНК. У эукариот когда РНК достигает 30 нуклеотидов на 5’-конце образуется защитная структура КЭП.

4 стадия – терминация – происходит на терминаторах. В цепочке находится участок богатый ГЦ, а затем от 4 до 8 расположенных подряд А. После прохождения участка в РНК продукте образуется шпилька и фермент дальше не идет, синтез прекращается. Важную роль играет белковый фактор терминации – ро и тауэр. Пока шел синтез пирофосфат ингибировал ро белок, т.к. фермент остановился (шпилька) прекратился синтез фосфорной кислоты. Ро белок активируется и проявляет нуклеозидфосфатазную активность, что приводит к высвобождению РНК, РНК-полимеразы, которая в дальнейшем объединяется с субчастицей.

Процессинг – созревание РНК. Включает в себя: 1) образование КЭП на 5’-конце, участвует в присоединение к рибосоме. 2) на 3’-конце происходит полиаденилирование и образуется хвост из ста-двухсот адениловых нуклеотидов, он защищает ‘-конец от действия нуклеаз и помогает проходить через ядерные поры и играет роль в присоединение к рибосоме. 3) сплайсинг – вырезается не кодирующие последовательности – интроны. Это происходит двумя путями: а) осуществляется сплайсосомой – это нуклеопротеид, содержащий ряд белков и малую ядерную РНК. В начале происходит выпетливание интронов, при этом остаются только кодирующие последовательности – экзоны. Ферменты эндонуклеазы разрезают, а лигазы сшивают оставшиеся экзоны. Т.О. интроны уходят. Альтернативный сплайсинг – на одной последовательности нуклеиновой кислоты РНК образуют несколько белков. Самосплайсинг – самостоятельное удаление интронов. Нарушение сплайсинга: 1) системная красная волчанка. 2) фенилкетонурия. 3) гемоглобинопатия. Матричная РНК прокариот не подвергается процессингу, т.к. у них не интронов. Процессинг тРНК . Предшественник тРНК расщепляется и отщепляется нуклеотид 5’-3’ Q P. К 3’-концу присоединяется последовательность ССА с ОН-группой, на 5’ конце фосфорилированое пуриновое основание. Дугидроуридиновая петля – АРСаза. Процессинг рРНК. Предшественник рРНК – прорибосомальная РНК 45S синтезируется в ядрышке и подвергается действию рибонуклеаз и образуется 5,8S 18S 28S. Они на 70% спирализуются. рРНК играет роль в формировании рибосомы и участвует в каталитических процессах. Субъединица формируется из рРНК в ядре. Малая субъединица 30S, большая субъединица 50S и образуется рибосома 70S у прокариот, у эукариот 40S + 60S = 80S. Формирование рибосом происходит в цитоплазме.

Участки рибосом для связывания РНК : 1) в малых субъединицах, у которых есть последовательность Шайна-Далгорна мРНК 5’ГГАГГ3’ 3’ЦЦУЦЦ5’. Матричная РНК крепится к малой субъединице. У эукариот КЭП-связывающий участок для мРНК. Участок для связывания с тРНК : а) Р-участок – пептидильный центр для связывания мРНК с растущей пептидной цепью – пептидил-тРНК-связывающий. б) А-участок – для связи тРНК с аминокислотой – аминоацильный участок 2) В большой субъединице Е-участок с пептидилтрансферазной активность.

Обратная транскрипция характерна для ретровирусов или вирусы содержащие РНК – вирус ВИЧ-инфекции, онковирусы.

На цепочке РНК происходит синтез ДНК под действием фермента обратной транскриптазы или ревертазы, или ДНК РНК -полимераза. Внедряясь в клетку хозяина происходит синтез ДНК, в которая встраивается в ДНК хозяина и начинается транскрипция своих РНК и синтез собственных белков.

Генетический код, его характеристика. Генетический код – это нуклеотидная последовательность молекулы рРНК в которой имеются кодовые слова для каждой аминокислоты. Он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в молекуле ДНК.

Характеристика. 1) генетический код триплетный – т.е. каждая а/к-та зашифрована тремя нуклеотидами. 2) генетический код для а/к является вырожденным или избыточным – подавляющее большинство а/к кодируется несколькими кодонами. Всего 64 триплета образуется, из них 61 триплет кодирует определенную а/к, а три триплета – АУГ, УАА, УГА являются нонсенс-кодонами, т.к. они не кодируют ни одной из 20 а/к, выполняют функцию терминации синтеза. 3) Генетический код является непрерывным, отсутствуют знаки препинания, т.е. сигналы, указывающие на конец одного триплета и начала другого. Код является линейным, однонаправленным, непрерывным. Например — АЦГУЦГАЦЦ. 4) кодоном включения синтеза служит триплет АУГ. 5) Генетический код является универсальным.

22. Трансляция – биосинтез белка. Этапы трансляции: 1) инициация. 2) элонгация. 3) терминация. Инициация – происходит активация а/к.

Инициирующая аатРНК будет взаимодействовать с 1 а/к будущего белка только карбоксильной группой, а 1 а/к может давать на синтез только NH 2 группу, т.о. синтез белка начинается с N-конца.

Сборка инициирующего комплекса на малой субчастице. Факторы: 30S мРНК фомилметионил тРНК IF 123 Mg 2+ ГТФ – источник энергии

Нагруженная факторами инициации малая субъединица находит на мРНК старт кодон АУГ или ГУГ и по нему устанавливается рамка считывания, т.е. старт кодон помещается в Р-участок. К нему подходит формлметионил тРНК, что сопровождается высвобождением фактора IF 3, затем присоединяется большая субъединица и высвобождается IF 1 и IF2, происходит гидролиз 1ГТФ и образуется рибосома. Элонгация – рабочий цикл рибосомы. Включает в себя три шага: 1) связывание аатРНК с А-участком т.к. занят Р-участок– нужны факторы элонгации EF-TU, EF-TS и ГТФ.. 2) транспептидирование Е-участок перебрасывает а/к и образуется пептидная связь. Факторы элонгации у прокариот: EF-TU, EF-TS, EF-G. 3)Транслокация – сначала EF-G деацилированная тРНК Р-участка покидает рибосому, происходит перемещение на 1 триплет в сторону 3’ конца; перемещение пептида из А, в Р-участок – используется ГТФ и фактор элонгации – EF-G-транслоказа, А – участок опять свободен и процесс повторяется. Терминация – узнавание терминирующих кодонов УАА, УГА, УАГ с помощью релизинг-факторов RF 1 2 3. При попадании терминального кодона в А-участок к нему не присоединяется тРНК, а присоединяется один из факторов терминации, который блокирует элонгацию, что сопровождается активацией эстеразной активности пептидилтрансферазы участка Е. Происходит гидролиз сложных эфирных связей между пептидом и тРНК, рибосома покидает пептид, тРНК и диссоциирует на субъединицы, которые потом могут быть использованы.

Формирование структуры происходит одновременно с помощью белков-шаперонов – белки теплового шока. На синтез одной пептидной связи расходуется 1АТФ на аминоацилирование тРНК (присоединение аминокислоты), 1ГТФ на связь аатРНК с А-участком и 1ГТФ на транслокацию. Затрата энергии около 4 макроэргических связей на синтез одной пептидной связи.

23. Лактозный оперон. Регуляция репликации осуществляется с помощью концентрации белка Dna и гуанозинтетрафосфата. Основная регуляция экспрессии генов осуществляется на уровне транскрипции (зависит от стадии развития клетки, всех факторов, действия гормонов и других регуляторных компонентов). В разных клетках тканей только 5% генов экспрессируется, 97% молчат – мусорные ДНК – регуляторы транскрипции это хрономеры и ряд регуляторных последовательностей. Если присоединение белка-регулятора к ДНК вызывает транскрипцию, то это позитивная (+) регуляция, если подавление транскрипции – негативная (-) регуляция. Позитивная регуляция – ген выключен, присоединение белка-регулятора приводит к началу синтеза, в итоге ген включается. Т.О. белок-регулятор может быть индуктором или активатором. Негативная регуляция – ген включен, идет синтез РНК, если присоединяется белковый фактор регуляции (ингибитор или репрессор синтеза белка)Д ген выключается. Многие гормоны и другие факторы влияют на присоединение белка регулятора. Лактозный оперон E. Coli – негативная регуляция. Основные элементы его работы: в молекуле ДНК – участок регулятор, промотор, про-оперон и три структурных гена: лаг 1, лаг 2, лаг 3 и терминатор. Лаг 1 – осуществляет синтез фермента лактазы или бета-галактозидазы. Лаг 2 – фермент пермиаза, участвует в транспорте лактозы через мембрану. Лаг 3 – фермент трансацилаза. Регулятор – синтез мРНК на рибосоме, ведет к образованию белка репрессора, он присоединяется к оператору (т.к. имеет сродство), садится на него, а т.к. участки промотора и оперона перекрываются – РНК-полимераза не может присоединиться к промотору и транскрипция выключается. Глюкоза и галактоза обеспечиваю сходство репрессора и оператора. Если сходства не будет, лактоза взаимодействует с репрессором, меняя его трансформацию, и он не садится на оперон, т.к. теряет сходство к нему. РНК-полимераза садится на промотор и начинается транскрипция матричной РНК. Лактоза – это индуктор, а процесс – индукция – форма негативной регуляции, называемая так потому, что транскрипция прекращается из-за присоединения репрессора и его отщепление приводит к началу синтеза. Позитивная регуляция – ТАТА фактор – имеет сходство к участку ТАТА-бокс. ТАТА фактор садится на ТАТА-бокс – сигнал для РНК-полимеразы для узнавания своего промотора, села на него и начала транскрипцию рядом расположенных генов. У прокариот преоблалает негативная регуляция, для эукариот это не выгодно. Участки-энхансеры (усилители транскрипции) + белок-регулятор приводит к усилению транскрипции. Саинсеры + белок-регулятор à выключает транскрипцию и изменяет структуру хромосом.

Согласно принципу последовательности, информация переносится от ДНК к РНК и белкам: ДНК -> РНК -> белок. В связи с этим обратимся к содержанию транскрипции (от лат. transcriptio — переписывание), наряду с репликацией ДНК являющейся важнейшим генно-молекулярным механизмом. Транскрипция во многом похожа на репликацию, но, разумеется, у нее есть и многочисленные особенности. Одна из них состоит в том, что при выяснении содержания транскрипции непременно необходимо учитывать строение генов. Дело в том, что в репликации воспроизводятся все структурные единицы генов, чего нет при транскрипции.

Традиционно ген определяется как единица наследственной информации, детерминирующая выполнение организмом определенной функции. Ген состоит из регуляторной и кодирующей части. Транскрибируется только кодирующая часть, которая состоит из экзонов и нитронов. Такая транскрипция характерна для незрелой РНК. Она находит свое продолжение в окончательной стадии транскрипции, при которой из незрелой РНК исключаются все интроны, а оставшиеся экзоны объединяются. В месте промотора с регуляторной частью гена связывается РНК-полимераза, которая в результате инициирует начало транскрипции на одной из двух цепей ДНК. На рис. 6.8 представлена схема устройства гена эукариотов, а также зрелой и незрелой РНК.

Некоторые из использованных выше терминов, очевидно, нуждаются в характеристике.

Рис. 6.8.

Промотор (от фраиц. promoteur — основатель, инициатор) — это последовательность нуклеотидов ДНК, которая позволяет регулировать экспрессию генов. Он находится около 5″-гена и, следовательно, непосредственно перед той частью гена, которая кодирует РНК. Существенным признаком промотора является его специфическое взаимодействие с ДНК зависимыми белками, которые посредством РНК-полимеразы определяют начало транскрипции. Такие белки называются факторами транскрипции.

Наряду с промотором к регуляторной части гена относятся последовательности нуклеотидов, которые также оказывают существенное влияние на экспрессию генов. Энхансеры (англ, enhancer — усилитель, увеличитель) ее усиливают, а сайленсеры (от англ, silencer — глушитель) подавляют, но не сами по себе, а лишь в случае воздействия на них факторов транскрипции. Пространственное положение энхансеров и сайленсеров не является четко определенным, они могут находиться на меньшем или большем расстоянии от промотора.

Экзон (англ, expressed region — область выражения) — участок гена, кодирующий зрелую РНК и белки. Экзоны являются первичными генетическими единицами, от которых решающим образом зависит облик всего биологического мира. Именно их перекомбинация приводит к образованию новых генов и белков. Всего лишь 1,5% генного состава ДНК определяет синтез белков. Другая часть этого состава либо вообще не транскрибируется, либо определяет строение таких разновидностей РНК, например транспортных РНК, которые не обладают функцией синтеза белков.

Интрон (от англ, intervening regions — промежуточные области) — участок гена, который не содержит информации о зрелых РНК и белках. Биологические функции интронов изучены значительно хуже, чем функции экзонов. Большие споры вызывает также вопрос об их происхождении: то ли они возникли вместе с прокариотами, то ли вместе с эукариго- тами или же даже позже их. В одном гене человека в среднем содержится 8,8 экзона и 7,8 ингрона, но ингроны в среднем приблизительно в 25 раз длиннее экзонов .

После сказанного нетрудно представить в себе в основных чертах весь процесс транскрипции (рис. 6.9).

Рис. 6.9.

Этап инициации. Под воздействием ферментов, в частности энхансеров, присоединившись к промотору, РНК-полимераза разрывает азотистые основания (указаны на рис. 6.9 вертикальными короткими линиями) и выбирает ту ветвь ДНК, которая становится матрицей транскрипции (на рис. 6.9. это нижняя линия). Она также создает глазок транскрипции (на рис. 6.9. это треугольная крышечка). При этом для этапа элонгации обнажается 10-20 пар неклеотидов. Интересно, что в случае транскрипции нет необходимости в формировании праймера, характерного для процесса репликации ДНК. Транскрипция обходится без праймера.

Этап элонгации. Под действием РНК-полимеразы в области транскрипционного глазка формируется РНК. В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза не способна корректировать правильность синтеза РНК-цепи и исправлять допущенные ошибки. Если в процессе синтеза возникают затруднения, то движение РНК-полимеразы приостанавливается. В результате вероятность ошибочной сборки РНК снижается. Транскрипция не прекращается, глазок удаляется от промотера. В тех областях, которые миновал глазок, восстанавливается дуплексная структура ДНК. Цепь синтезируемой РНК постепенно удлиняется. Она растет в направлении 5″-3″.

Этап терминации. Он наступает в силу воздействия на РНК-полимеразу вспомогательных факторов. Как только область транскрипции достигается экзонуклеазами, транскрипция прекращается, а РНК-полимераза и РНК отделяются друг от друга. ДНК полностью восстанавливает свою дуплексную структуру.

До сих пор мы рассматривали транскрипцию PI IK в самом общем плане, абстрагируясь от нескольких существенных обстоятельств, в частности, не учитывалось наличие различных типов как РНК, так и РНК-полимераз. Различают следующие типы РНК:

Информация обо всех разновидностях РНК содержится в ДНК. Впрочем, не все они транскрибируются непосредственно на матричной ДНК.

Некоторые РНК являются модификациями ранее транскрибированных РНК. Для нас, знакомящихся с основаниями молекулярной генетики, наибольший интерес представляют РНК, участвующих непосредственно в синтезе белков. Их всего 5 типов (табл. 6.4).

Таблица 6.4

РНК, участвующие в синтеза белков

* Информационная РНК — то же самое, что матричная РНК; ** SPR — сокр. англ. signal recognition particle — частицы, распознающие сигналы.

Транскрипция всех РНК происходит иод действием определенных РНК-полимераз или их сочетаний. В табл. 6.5 приведены основные три типа РНК-полимераз.

Таблица 6.5

Типы РНК-полимераз

’ Малые (короткие) РГК отличаются от длинных РНК. Микро РНК являются разновидностью малых РНК, которые составляют 98% всего рибонуклеотидного материала.

В заключение параграфа отметим, что наряду с прямой транскрипцией возможна и обратная. Способностью транскрибировать РНК в ДНК обладают ретровирусы, в частности ВИЧ, ответственный за СПИД. Ретровирус встраивается в клетку. Специальный фермент обратная транскриптаза осуществляет транскрипцию РНК -» ДНК. Затем на полученной цепи ДНК как на матрице достраивается вторая цепь ДНК. После чего реализуется цикл ДНК -> РНК -» белки. Некоторые эукариоты содержат фермент теломеразу, которая также инициирует обратную транскрипцию. Феномен обратной транскрипции должен учитываться при формулировке принципа последовательности. Он не должен интерпретироваться в качестве отрицания обратной транскрипции.

  • Ген состоит из регуляторной и кодирующей части.
  • Кодирующая часть гена включает экзоны и нитроны.
  • Интроны не транскрибируются в зрелую РНК.
  • Транскрипция включает этапы инициации, элонгации и терминации.
  • Существуют различные типы и виды как PIIK, так и РИК-полимераз транскрипции.
  • Синтез любой РНК осуществляет либо одна, либо несколько полимераз, причем нс без участия белковых ферментов.
  • SakharkarM. К., Chow V. Т., Kangueane Р. Distributions of Exons and Introns in the HumanGenome //In Silicio Biology. 2004. Vol. 4. No. 4. P. 387-393.

Транскрипция в биологии — это многоступенчатый процесс считывания информации с ДНК, который является составляющей Нуклеиновая кислота является носителем генетической информации в организме, поэтому важно правильно ее расшифровать и передать другим клеточным структурам для дальнейшей сборки пептидов.

Определение «транскрипция в биологии»

Синтез белка является основным жизненно важным процессом в любой клетке организма. Без создания молекул пептида невозможно поддержание нормальной жизнедеятельности, т. к эти органические соединения участвуют во всех процессах метаболизма, являются структурными компонентами многих тканей и органов, играют сигнальную и регулирующую и защитную роли в организме.

Процесс, с которого начинается биосинтез белка, и есть транскрипция. Биология кратко разделяет его на три этапа:

  1. Инициация.
  2. Элонгация (нарастание цепи РНК).
  3. Терминация.

Транскрипция в биологии — это целый каскад пошаговых реакций, в результате которых на матрице ДНК синтезируются молекулы РНК. Причем таким образом формируются не только информационные рибонуклеиновые кислоты, но также транспортные, рибосомальные, малые ядерные и другие.

Как и любой биохимический процесс, транскрипция зависит от множества факторов. Прежде всего, это ферменты, которые отличаются у прокариот и эукариот. Эти специализированные белки помогают инициировать и проводить реакции транскрипции безошибочно, что важно для качественного получения белка на выходе.

Транскрипция прокариот

Так как транкрипция в биологии — это синтез РНК на матрице ДНК, то в этом процессе главным ферментом является ДНК-зависимая РНК-полимераза. У бактерий существует только один вид таких полимераз для всех молекул

РНК-полимераза по принципу комплиментарности достраивает цепь РНК, используя матричную цепь ДНК. В составе этого фермента есть две β-субъединицы, одна α-субъединица и одна σ-субъединица. Первые две составляющие выполняют функцию образования тела фермента, а остальные две отвечают за удержание фермента на молекуле ДНК и узнавание промотерной части дезоксирибонуклеиновой кислоты соответственно.

Кстати, сигма-фактор служит одним из признаков, по которым распознается тот или иной ген. Например, латинская буква σ с индексом N означает то, что эта РНК-полимераза узнает гены, которые включаются при недостатке азота в окружающей среде.

Траскрипция у эукариот

В отличие от бактерий, у животных и растений транскрипция происходит несколько сложнее. Во-первых, В каждой клетке находятся не один, а целых три вида разных РНК-полимераз. Среди них:

  1. РНК-полимераза I. Она отвечает за транскрипцию генов рибосомальных РНК (исключение составляет 5S РНК субъединицв рибосомы).
  2. РНК-полимераза II. Ее задача состоит в синтезе нормальных информационных (матричных) рибонуклеиновых кислот, которые в дальнейшем участвуют в трансляции.
  3. РНК-полимераза III. Функция этого вида полимераз заключается в том, чтобы синтезировать а также 5S-рибосомальную РНК.

Во-вторых, для узнавания промотора у эукариотических клеток недостачно иметь только полимеразу. В инициации транскрипции также участвуют специальные пептиды, которые называются TF-белками. Только с их помощью РНК-полимераза может сесть на ДНК и начать синтез молекулы рибонуклеиновой кислоты.

Значение транскрипции

Молекула РНК, которая образуется на матрице ДНК, впоследствии присоединяется к рибосомам, где с нее считывается информация и синтезируется белок. Процесс образования пептида очень важен для клетки, т.к. без этих органических соединений невозможна нормальная жизнедеятельность: они в первую очередь являются основой для важнейших ферментов всех биохимических реакций.

Транскрипция в биологии — это еще и источник рРНК, которые а также тРНК, которые участвуют в переносе аминокислот во время трансляции к этим немембранным структурам. Также могут синтезироваться мяРНК (малые ядерные), функция которых заключается в сплайсинге всех молекул РНК.

Заключение

Трансляция и транскрипция в биологии играют исключительно важную роль в синтезе белковых молекул. Эти процессы являются основной составляющей центральной догмы молекулярной биологии, которая гласит о том, что на матрице ДНК синтезируется РНК, а РНК, в свою очередь, является основой для начала формирования молекул белка.

Без транскрипции невозможно было бы считать информацию, которая закодирована в триплетах дезоксирибонуклеиновой кислоты. Это еще раз доказывает важность процесса на биологическом уровне. Любая клетка, будь она прокариотическая или эукариотическая, должна постоянно синтезировать новые и новые молекулы белка, которые нужны в данный момент для поддержания жизнедеятельности. Поэтому транскрипция в биологии — это основной этап в работе каждой отдельной клетки организма.

Реферат Биосинтез белка и строение рибосом


Скачать (4,84 Mb)


Биосинтез белка – чрезвычайно сложный и энергозатратный процесс. Он является основой жизнедеятельности клетки. Синтез белка осуществляется в рибосомах и проходит в несколько этапов. Двухцепочечная молекула ДНК на основе принципа комплементарности транскрибируется в одноцепочечную молекулу РНК. В результате получается матричная РНК, которая содержит информацию об аминокислотной последовательности белка. Далее мРНК поступает в рибосому и по ней, как по матрице, синтезируется белок, путем перевода генетической информации с языка нуклеотидной последовательности на язык аминокислотной последовательности…

Оглавление

1. Введение
2. Информационная РНК
3. Генетический код
4. Транспортные РНК и аминоацил-тРНК-синтетазы
5. Рибосомы
6. Трансляция
7. Сворачивание и транспорт белков
8. Заключение
9. Список литературы

Жизнь есть способ существования белковых тел. Это определение, данное Фридрихом Энгельсом, указывает на исключительную роль белков в функционировании организмов. Биосинтез белка – чрезвычайно сложный и энергозатратный процесс. Он является основой жизнедеятельности клетки.
Синтез белка осуществляется в рибосомах и проходит в несколько этапов по схеме ДНК→РНК→белок. Двухцепочечная молекула ДНК на основе принципа комплементарности транскрибируется в одноцепочечную молекулу РНК. В результате получается матричная РНК, которая содержит информацию об аминокислотной последовательности белка. Далее мРНК поступает в рибосому и по ней, как по матрице, синтезируется белок, путем перевода генетической информации с языка нуклеотидной последовательности на язык аминокислотной последовательности. Шаг за шагом строится полипептидная цепь, которая в процессе синтеза и после него модифицируется в биологически активный протеин. Синтезированный белок транспортируется в разные участки клетки для выполнения своих функций.
Кодирование аминокислотной последовательности белков осуществляется по определенным правилам, называемых генетическим кодом. Расшифровка генетического кода – очень значимое достижение науки. Код объясняет механизм синтеза белка, происхождение мутаций и другие биологические явления.
Рентгеноструктурный анализ и другие современные методы исследования позволили далеко продвинутся в изучении биосинтеза белка и других аспектов молекулярной биологии. Но тем не менее все еще не установлены пространственные структуры некоторых жизненно важных макромолекул. Науке предстоит ответить на многие вопросы, касающиеся белкового синтеза.

Общая схема биосинтеза белка

Общая схема биосинтеза белков в клетке: ДНК→РНК→белок (Рисунок 1).

Рисунок 1. Общая схема биосинтеза белков в клетке

Транскрипция. Отдельные участки двухцепочечной ДНК (гены) служат матрицами для синтеза на них однотяжевых цепей РНК по принципу комплементарности. Транскрипция проходит в три стадии: инициация, элонгация, терминация.

Процессинг и транспорт. В процессе синтеза РНК подвергается изменениям, в результате которых превращается в зрелую молекулу, пригодную для синтеза белка. Получающаяся информационная (матричная) РНК (мРНК) затем поступает к рибосомам в качестве программы, определяющей аминокислотную последовательность в синтезируемом белке.

Активация и акцептирование аминокислот. Белки состоят из аминокислот, но свободные аминокислоты клетки не могут быть непосредственно использованы рибосомой. Каждая аминокислота сначала активируется с помощью АТФ, а затем присоединяется к специальной молекуле РНК – трансферной (транспортной) РНК (тРНК) вне рибосомы. Получающаяся аминоацил-тРНК поступает в рибосому в качестве субстрата для синтеза белка.

Трансляция. Поток информации в виде мРНК и поток материала в виде аминоацил-тРНК поступают в рибосомы, которые осуществляют перевод (трансляцию) генетической информации с языка нуклеотидной последовательности мРНК на язык аминокислотной. Каждая рибосома движется вдоль мРНК от одного конца к другому и соответственно выбирает из среды те аминоацил-тРНК, которые соответствуют (комплементарны) триплетным комбинациям нуклеотидов, находящимся в данный момент в рибосоме. Аминокислотный остаток выбранной аминоацил-тРНК каждый раз ковалентно присоединяется рибосомой к растущей полипептидной цепи, а деацилированная тРНК освобождается из рибосомы в раствор. Так последовательно строится полипептидная цепь.

Формирование функционального белка. По ходу синтеза полипептидная цепь высвобождается из рибосомы и сворачиваться в глобулу. Сворачивание и транспорт белка сопровождаются ферментативными модификациями (процессинг белка).

Несмотря на большую сложность аппарата биосинтеза белков, он протекает с чрезвычайно высокой скоростью. Синтез тысяч различных белков в каждой клетке строго упорядочен – при данных условиях метаболизма синтезируется лишь необходимое число молекул каждого белка.

Информационная (матричная) РНК (мРНК) – РНК, являющаяся комплементарной копией участков значащих цепей генов ДНК, содержащих информацию об аминокислотных последовательностях полипептидных цепей белков.

Структура мРНК

Первичная структура

Рисунок 2. Химическое строение полинуклеотида РНК

Матричная РНК — одноцепочечный полинуклеотид (Рисунок 2). Он состоит из четырех нуклеотидов. Нуклеотид ы состоят из азотистого основания (аденин – А, гуанин – G, цитозин – C и урацил – U), сахара рибозы и фосфатной группы. 5′-гидроксил концевого нуклеозида (молекула, содержащая азотистое основание, связанное с сахаром) не образует связи между нуклеотидами. Он обозначается как 5′-конец РНК, а другой концевой нуклеозид со свободным З’-гидроксилом называют З’-концом РНК. мРНК читается рибосомой в направлении от 5′-конца к З’-концу .
В природных мРНК 5′-концевой гидроксил всегда замещен. мРНК эукариотов в большинстве случаев несут на 5′-конце специальную группу – кэп (Рисунок 3). Кэп представляет собой остаток 7-метилгуанозина (Рисунок 4).

 

Рисунок 3. Строение 5′-конца кэпированной мРНК

Рисунок 4. Модель молекулы 7-метилгуанозина

Функциональные участки мРНК

Чаще всего началом (инициаторным кодоном) кодирующей части мРНК яв¬ляется AUG. Не любой триплет может стать инициаторным. Это определяется собственной структурой кодона и положением в структуре мРНК.
мРНК может содержать нуклеотидные последовательности для кодирования нескольких белков. Это характерно для прокариот. Такие мРНК называются полицистронными. У эукариот мРНК обычно кодируют одну полипептидную цепь (моноцистронные мРНК).

Пространственная структура

Рисунок 5. Вторичная структура РНК

Трехмерная структура мРНК еще не установлена. Измерения физических параметров мРНК свидетельствуют о том, что они являются сильно свернутыми структурами, с внутрицепными взаимодействиями между азотистыми основаниями. Вторичная структура мРНК образована благодаря комплементарному спариванию отдельных участков одной и той же цепи друг с другом, с образованием большого набора относительно коротких двуспиральных участков (Рисунок 5).
Вторичная и третичная структуры мРНК играют определенную роль в трансляции. Однако роль вторичной и третичной структуры мРНК в скорости считывания цепи не установлена.
Некодирующие последовательности мРНК участвуют в определении специальных пространственных структур, ответственных за регулирование инициации трансляции, элонгации и других процессов.

Так как существует только 4 нуклеотида в мРНК и 20 аминокислот в белке, то трансляция не может быть осуществляется на основе прямого соотношения между нуклеотидами РНК и аминокислотами в белке. Нуклеотидная последовательность гена через посредничество мРНК транслируется в аминокислотную последовательность по правилам, известным как генетический код.
Генетический код – способ сохранения наследственной информации в виде последовательности нуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот. Этот код был расшифрован в 1960-ых. Генетический код, основан на использовании алфавита, состоящего из четырех букв: А, Г, Ц и Т. Эти буквы соответствуют нуклеотидам, найденным в ДНК: аденин, гуанин, цитозин, тимин.
Последовательность нуклеотидов в молекуле мРНК читается непрерывными группами из трех нуклеотидов, называемых триплетами или кодонами. РНК представляет собой линейные полимер, состоящий из четырех разных нуклеотидов, поэтому возможны 4•4•4=64 комбинации трех нуклеотидов. Белки состоят из 20 аминокислот. Поэтому либо некоторые триплеты не используются, либо некоторые аминокислоты кодируются более, чем одним триплетом.
Различают два типа кодонов— смысловые, или значащие кодоны, и бессмысленные кодоны, или нонсенс-кодоны. Большинство (61) кодонов — значащие и только 3 (UAA, UAG, UGA) – нонсенс-кодоны. Смысловые кодоны соответствуют аминокислотам, а кодон AUG, помимо кодирования митионина, является инициирующим, или стартовым кодоном. Нонсенс-кодоны являются терминирующими кодонами, или стоп-кодонами.

Свойства генетического кода

Генетический код является неперекрываемым, непрерывным, специфичным, универсальным и вырожденным.

Неперекрываемость кода означает, что каждый нуклеотид входит только в один кодон, и поэтому изменения любого нуклеотида изменяют смысл только одного кодона.

Генетический код непрерывен. Он имеет линейный непрерывающийся порядок считывания. Кодоны транслируются всегда целиком. Расположение остатков аминокислот в синтезируемом полипептиде определяется антикодоном тРНК (триплет нуклеотидов, комплементарный одному из кодонов) .

Специфичность кода означает, что код является однозначным, поскольку каждый кодонный триплет кодирует только одну аминокислоту, и с одной мРНК можно синтезировать только одинаковые пептиды,

Генетический код универсален для всех живых существ – у всех живых организмов, включая вирусы и бактерии, одинаковые кодоны (триплеты нуклеотидов) кодируют одинаковые аминокислоты. Исключение составляют 4 кодона митохондрий грибов и животных, имеющих информационный смысл, отличный от универсального кода.

Вырожденность кода означает его избыточность, синонимичность, то есть одну аминокислоту может кодировать более одного триплета. Однако вырожденность не абсолютна. Например, метионину соответствует только один кодон.

До расшифровки генетического кода было невозможно понять механизм синтеза белка и объяснить происхождение мутаций. Открытие генетического кода позволило ответить на вопрос о том, как связаны между собой дефекты определенных белков человека и наследственные заболевания.

Генетический код

1-ая позиция (5’ конец)

2-ая позиция

3-ая позиция (3’ конец)

U

C

A

G

U

Phe
Phe
Leu
Leu

Ser
Ser
Ser
Ser

Tyr
Tyr
STOP
STOP

Cys
Cys
STOP
Trp

U
C
A
G

C

Leu
Leu
Leu
Leu

Pro
Pro
Pro
Pro

His
His
Gln
Gln

Arg
Arg
Arg
Arg

U
C
A
G

A

lle
lle
lle
Met

Thr
Thr
Thr
Thr

Asn
Asn
Lys
Lys

Ser
Ser
Arg
Arg

U
C
A
G

G

Val
Val
Val
Val

Ala
Ala
Ala
Ala

Asp
Asp
Glu
Glu

Gly
Gly
Gly
Gly

U
C
A
G

 

Аминокислоты и их символы

Кодоны

A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
A
R
S
T
V
W
Y
Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr
Alanine
Cysteine
Aspartic acid
Glutamic acid
Phenylalani
Glycine
Histidine
Isoleucine
Lysine
Leucine
Methionine
Asparagine
Proline
Glutamine
Arginine
Serine
Threonine
Valine
Tryptophan
Tyrosine
Аланин
Цистеин
Аспарагиновая кислота
Глутаминовая кислота
Фенилаланин
Глицин
Гистидин
Изолейцин
Лизин
Лейцин
Метионин
Аспарагин
Пролин
Глутамин
Аргинин
Серин
Треонин
Валин
Триптофан
Тирозин

GCA GCC GCG GCU
UGC UGU
GAC GAU
GAA GAG
UUC UUU
GGA GGC GGG GGU
CAC CAU
AUA AUC AUU
AAA AAG
UUA UUG CUA CUC CUG CUU
AUG
AAC AAU
CCA CCC CCC CCU
CAA CAG
AGA AGG CGA CGC CGG CGU
AGC AGU UCA UCC UCG UCU
ACA ACC ACG ACU
GUA GUC GUG GUU
UGG
UAC UAU

Транспортные РНК (тРНК) небольшие по размеру молекулы (73- 97 нуклеотидных остатков в цепи). Все тРНК имеют одинаковый 3′-конец, построенный из двух остатков цитозина и одного аденозина (CCA-конец). В середине цепи тРНК находится антикодон. В молекулах тРНК присутствет множество разнообразных модифицированных нуклеозидов (минорные нуклеозиды), образующиеся путем ферментативной модификации обычных нуклеозидных остатков.

Вторичная структура

Рисунок 6. Вторичная структура тРНК

Вторичная структура тРНК складывается за счет взаимокомплементарности участков цепи. Они формируют структуру «клеверного листа», состоящую из четырех стеблей и трех петель. Стебель с петлей формируют ветвь. В дополнение к трем петлям клеверного листа в структуре тРНК выделяют также дополнительную, или вариабельную, петлю (V петлю). Двухцепочечные стебли с постоянным числом спаренных нуклеотидов представляют собой двойную спираль.

Пространственная структура

Рисунок 7. Третичная структура тРНК

Третичная структура формируется за счет взаимодействия элементов вторичной структуры. Пространственная структура тРНК называется L-формой (из-за сходства с латинской буквой L).
Третичные взаимодействия (стекинг оснований и другие) скрепляют разные участки L-структуры в непрерывные двойные спирали.
Молекулам тРНК присущи индивидуальные различия, проявляющиеся на уровне вторичной и третичной структур, например, разная величина угла между доменами L-структуры.

Функции тРНК

Две основные функции тРНК:

  1. Акцепторная функция – способность ковалентно связываться с аминоацильным остатком, превращаясь в аминоацил-тРНК;
  2. Адапторная функция – способность узнавать триплет генетического кода, соответствующий транспортируемой аминокислоте, и обеспечивать поступление аминокислоты на «законное» место в растущей цепи белка.

Аминоацилирование тРНК

Аминоацилирование тРНКпроцесс активации аминокислот. Он происходит на первом этапе биосинтеза белка – двад­цать различных аминокислот присоеди­няются эфирной связью к соответствую­щим тРНК под действием двадцати различных активирую­щих ферментов, называемыми аминоацил-тРНК-синтетазами. Каждый фермент специфичен по отношению к определенной аминокислоте и к соответствующей тРНК.

Рисунок 8. Обобщенная структура аминоацил-тРНК

Аминоацилирование состоит из двух стадий, проходящих в каталитическом центре фермента. На первой стадии в результате взаимо­действия АТР и аминокислоты образуется промежуточ­ное соединение – аминоациладенилат. На второй стадии аминоацильный оста­ток переносится с аминоациладенилата, связанного с ферментом, на соответ­ствующую специфическую тРНК (Рисунок 8).

Аминоацилирование может быть выражено схемой:

АТФ – аденозинтрифосфат, АМФ – аденозинмонофосфат, PPi – пирофосфаты.
Исключительно низкая частота ошибок при аминоацилировании тРНК является непременным условием реализации генетического кода – если на предрибосомном этапе произошла ошибка и к тРНК присоединилась аминокислота, не соответствующая специфичности антикодона, то эта ошибка уже не может быть исправлена на последующих этапах белкового синтеза.
В ходе эволюции выработались специфические механизмы отбора «правильных» субстратов для аминоацил-тРНК-синтетаз, обеспечивающие безошибочное аминоацилирование тРНК.

Узнавание тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами

Каждая тРНК, сохраняя универсальную L-образную форму, имеет отличительные признаки, безошибочно распознаваемые «своим» ферментом как «притягательные», а остальными 19 ферментами – как «отталкивающие».
Это следующие участки тРНК (Рисунок 9):

  • Антикодон
  • Нуклеотид, предшествующий CCA-концу.
  • Первые три пары нуклеотидов акцепторного стебля

Рисунок 9. Участки, по которым происходит узнавание тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами

Рисунок 10. Комплекс 80S рибосома-мРНК-тРНК клетки дрожжей

Синтез белка происходит в рибосоме. Рибосома – сложный макромолекулярный аппарат, состоящий из более 50 белков, называемых рибосомными белками, и нескольких молекул РНК, называемых рибосомными РНК. Число рибосом в клетке различно. Оно зависит от интенсивности белкового синтеза в данном типе клеток. Обычная эукариотческая клетка содержит миллионы рибосом. Эукариотические и прокариотические рибосомы схожи в строении и функциях и различаются лишь числом и размером рРНК и рибосомных протеинов.
Строение рибосомы приведено на рисунке 10 на примере рибосомы дрожжей (Рисунок 10).
Рибосомы имеют размер 25-30 нм. Они состоят из двух неравных субъединиц. Субъединицы эукариотических рибосом формируются в ядре из рРНК, ассоциированных с рибосомными белками, которые транспортируются в ядро после синтеза в цитоплазме. Две субъединицы рибосомы затем выходят в цитоплазму, где соединяются воедино для участия в синтезе белка.
Рибосомные рибонуклеиновые кислоты (рРНК) – основные компоненты рибосом, составляют большую часть их массы. Молекулы рРНК определяют структуру, физические и химические свойства, функции рибосом, а также расположение рибосомных белков в субчастицах рибосом.
Малые субчастицы рибосом содержат одну молекулу рРНК, большие – две.
Молекулы рРНК являются совокупностью коротких одноцепочечных и двухспиральных участков, образующихся за счет комплементарного спаривания участков одной и той же полинуклеотидной цепи.
В субъединицах рибосом рРНК компактно упакованы благодаря ионам двухвалентных металлов и рибосомным белкам. Основная часть рРНК располагается внутри рибосомных субчастиц. Отдельные участки рРНК находятся на поверхности субчастиц. Они выполняют важную биололическую роль, формируя функциональные центры рибосом (центры связывания матричных и транспортных РНК и белковых факторов трансляции).
Рибосомная РНК концентрируется в основном ближе к центру частиц, тогда как масса рибосомных белков занимает в среднем более периферическое положение. Можно сделать вывод, что свернутая молекула высокополимерной рибосомной РНК – это структурное ядро рибосомной субчастицы, определяющее и ее компактность, и ее форму, и организацию на ней рибосомных белков. То есть рибосома есть прежде всего ее РНК (Рисунок 11).

Рисунок 11. Рибосомные белки и рибосомная РНК

Многочисленные рибосомные белки могут участвовать в функциях связывания субстратов и каталитических функциях рибосомы, локализуясь в соответствующих функциональных центрах и обеспечивая их своими активными группами; рибосомные белки могут служить стабилизаторами или модификаторами определенных локальных структур рибосомной РНК и таким образом поддерживать их в функционально активном состоянии или способствовать их переключениям из одного состояния в другое.
Когда рибосома не участвует в синтезе белков, две субъединицы разделены. Они соединяются с мРНК (обычно возле 5′-конца) для инициации синтеза белков. Затем мРНК продвигается через рибосому, и по мере вхождения кодонов в ядро рибосомы, нуклеотидная последовательность мРНК транслируется в аминокислотную поледовательность с помощью тРНК в качестве адаптора, чтобы приоединять каждую аминокислоту в правильном порядке к концу растущего белка. Когда считывается терминаторный кодон, из рибосомы выходит синтезированный белок, и две субъединицы снова разделяются. Эти субъединицы могут снова быть использованы для синтеза другого белка по другой молекуле мРНК.
Обычно одна молекула мРНК читается сразу несколькими рибосомами, двигающимися вдоль мРНК друг за другом и, таким образом, независимо синтезирующими идентичные молекулы белка, но с соответствующим отставанием. Такой динамический комплекс одной мРНК с несколькими рибосомами называется полирибосомой.

Рисунок 12. Функциональные участки рибосомы

Рибосомы работают чрезвычайно продуктивно: в секунду одна рибосома эукариотической клетки присоединяет 2 аминокислоты к полипептидной цепи, рибосомы бактериальных клеток функционируют еще быстрее — около 20 аминокислот в секунду. Такая продуктивность объясняется наличием четырех функциональных участков (сайтов) для РНК молекул (Рисунок 12) – один для мРНК и три для тРНК:

  • А-сайт (aminoacyl-tRNA — аминоацил-тРНК)
  • Р-сайт (peptidyl-tRNA — пептидил-тРНК)
  • Е-сайт (exit — выход)
  • мРНК-связывающий участок

Молекула тРНК крепится к А- и Р-сайтам только если её антикодон образует пары оснований с комплементарным кодоном молекулы мРНК. А- и Р-сайты расположены близко друг к другу чтобы две их тРНК молекулы формировали пары нуклеотидов с примыкающим кодоном молекулы мРНК. Эта особенность рибосомы обеспечивает правильное считывание мРНК.
Рибосомы разных клеток различаются по размерам, которые опре­деляются по скорости осаждения при центрифу­гировании. Скорость осаждения измеряется в еди­ницах Сведберга (S). Сведберг – это отношение скорости седиментации к центробежному ускорению, 1S = 10-13 секунд. Коэффициенты седимента­ции разных рибосом варьируют от 5S до 80S. У прокариот рибосомы имеют коэффициент 70S, а рибосомы цитоплазмы эукариот — 80S.
Диссоциация рибосом в случае прокариот и эукариот соответственно:
70S→50S + 30S
80S→60S + 40S

Трансляция – непосредственный процесс синтеза белка рибосомой. Трансляция проходит в три стадии: инициация, элонгация, терминация.

Стадия инициации

Трансляция у бактерий и в эукариотических клетках в общем схожи, но различаются механизмом инициации. Для инициация белкового синтеза в бактериях необходимы 30S и 50S рибосомные единицы, мРНК, молекула тРНК, аминоацилированная N-формилметионином – fMet-tRNAfMet, три белка, называемые факторами инициации, гуанозинтрифосфат (ГТФ), Mg2+. В процессе работы рибосома потребляет энергию гидролиза гуанозинтрифосфата (Рисунок 13).

Рисунок 13. Структура гуанозинтрифосфата

Комплекс 30S субъединицы с факторами инициации распознает участки связывания рибосомы (сайты), которые содержат инициаторный кодон AUG, и специальную последовательность Шайна- Дальгарно, служащую для отличия AUG от внутренних кодонов, кодирующих метионин. В результате инициации образуется 70S рибосома – инициирующий комплекс, содержащий мРНК и fMet-tRNAfMet, связанную с P-участком рибосомы. Комплекс готов к элонгации.
В эукариотических клетках имеется как минимум девять факторов инициации. Инициирующий кодон AUG распознается не последовательностью Шайна-Дальгарно, а сканированием мРНК с 5′-конца до первого AUG и соответствующим расположением рамки считывания.

Стадия элонгации

Стадия элонгации требует комплекс инициации, аминоацил-тРНК, факторы элонгации (растворимые цитозольные белки) и гуанозинтрифосфат (ГТФ).
Синтез происходит на рибосоме путем последовательного добавления одного аминокислотного остатка за другим к строящейся полипептидной цепи; таким путем осуществляется элонгация (удлинение) пептида. Каждый новый аминокислотный остаток добавляется к карбоксильному концу (С-концу) пептида, т. е. С-конец пептида является растущим. Добавление одного аминокислотного остатка соответствует прочтению одного нуклеотидного триплета.
Элонгация проходит в три этапа, которые повторяются пока есть остатки аминокислот для присоединения.
На первом шаге аминоацил-тРНК молекула, нагруженная аминокислотой крепится к А-сайту рибосомы, а «отработавшая» тРНК высвобождается с Е-сайта (от exit — выход).
На втором шаге формируется новая пептидная связь под действием фермента пептидилтрансферазы.
На третьем шаге происходит транслокация: большая субъединица занимает позицию относительно малой субъединицы, оставляя две тРНК в гибридных сайтах: в Р-сайте на большой субъединице и А-сайте на малой для одной тРНК и в E-сайте на большой субъединице и Р-сайте на малой для другой. Затем малая субъединица перемещается вместе с мРНК на три нуклеотида, освобождая А-сайт для следующей тРНК и цикл повторяется снова. Молекула мРНК транслируется с 5′-конца к 3′-третьему, а синтез протеина начинается с N-конца. С началом каждого цикла аминокислота крепится к C-концу полипептидной цепи.

Стадия терминации

Элонгация продолжается до тех пор пока рибосома не присоединит последнюю аминокислоту. Терминация начинается при присутствии одного из трех терминаторных кодонов в мРНК (UAA, UAG, UGA), которые следуют сразу за последней аминокислотой. Когда рибосома достигнет терминирующего кодона мРНК, синтез полипептида прекращается. В бактериях, если терминаторный кодон имеет место быть в А-сайте рибосомы, в дело вступают три фактора терминации, которые участвуют в гидролизе пептидил-тРНК связи; освобождении полипептида и последней, уже ненагруженной тРНК из Р-сайта; диссоциации 70S рибосомы на 30S и 50S субъединицы, готовых начать новый цикл синтеза белка.
Таким образом, каждая рибосома проходит полный цикл трансляции, включающий инициацию, элонгацию и терминацию; в результате такого эпицикла прочитывается вся кодирующая последовательность мРНК и синтези­руется законченная полипептидная цепь белка. После этого рибосома может повторить цикл с другой цепью мРНК или другой кодирующей последовательностью той же цепи.

Процесс экспрессии генов не заканчивается на построении аминокислотной последовательности, составляющей протеин, с помощью генетического кода. Чтобы быть полезным клетке, новый пептид должен подвергнутся процессингу: свернутся в трехмерную нативную конформацию, присоединить какие-либо молекулы, необходимые для его активности, модифицироваться под действием протеинкиназ и других энзимов и правильно соединиться с другими частями белка, с которыми он функционирует.
Информация, нужная для всех этих процессов содержится в последовательности связанных аминокислот, которые производит рибосома, когда транслирует мРНК в полипептидную цепь. Когда протеин сворачивается в компактную структуру, гидрофобные звенья обращаются внутрь глобулы. Формируется большая часть нековалентных взаимодействий между различными участками молекул. Итогом всех этих энергетически выгодных взаимодействий, определяющих свернутую структуру полипептидной цепи является конформация с самой низкой энергией.
За миллионы лет эволюции аминокислотная последовательность каждого протеина была выбрана определенным образом не только для конформации, которую он принимает, но также для быстрого сворачивания. Для некоторых белков сворачивание начинается с N-конца сразу после выхода полипептида из рибосомы. В этом случае, как только протеин покидает рибосому, через несколько секунд он формирует компактное строение, содержащее окончательную вторичную структуру (спирали и β-листы).
Большинство белков не сворачиваются во время синтеза. Вместо этого они «встречаются» у рибосомы с отдельным классом белков, называемых шаперонами. Связывание с шаперонами обеспечивает правильное сворачивание белка в нативную конформацию.
Основные этапы процессинга:

  • Модификация N-конца и С-конца
  • Удаление сигнальных последовательностей
  • Фосфорилирование гидраксиаминокислот
  • Реакции карбоксилирования
  • Метилирование групп
  • Присоединение боковых углеводных цепей
  • Добавление простетических групп
  • Образование дисульфидных мостиков

Внутриклеточная сортировка белков

Эукариотические клетки состоят из множества структур, органелл и отсеков со специфичными функциями, которые требуют определенный набор белков. Эти белки (за исключением тех, которые синтезируются в митохондрих и пластидах) производятся рибосомами в цитозоле.
Белки предназначенные для секреции, интеграции в плазматическую мембрану, включения в лизосомы, обычно проходят первые несколько стадий внутриклеточной сортировки. Белки для митохондрий, пластид и ядра используют при отдельных механизм. Белки, предназначенные для цитозоля, остаются там, где были синтезированы.
Важнейшим элементом в процессе сортировки белков является короткая последовательность аминокислот – сигнальная последовательность белка (лидер). Она направляет белок на предназначенное ему место и удаляется во время транспорта или по прибытию белка в конечный пункт.
В процессе синтеза любого белка, в том числе предназначенного на «экспорт», сигнальные лидеры, будучи расположены на N-конце, образуются первыми. Такие лидеры узнаются особыми рецепторными участками на внешней поверхности эндоплазматического ретикулума, при­чем это происходит даже раньше, чем рибосома полностью завершит синтез бел­ка. Гидрофобная жирорастворимая часть лидирующей последовательности проникает сквозь мембрану внутрь цистерн эндоплазматического ретикулума, прота­скивая за собой растущую полипептидную цепь. Внутри цистерн под действием особой пептидазы сигнальный лидер от­щепляется. После этого зрелый белок на­правляется в аппарат Гольджи, инкапсу­лируется и в виде секреторного пузырька покидает наконец клетку.

Белки являются структурными блоками клетки, а также осуществляют большую часть её функций. Биосинтез белка является одним из основополагающих процессов клетки.
Расшифровка генетического кода, правил, по которым нуклеотидная последовательность РНК переводится в аминокислотную последовательность полипептида, позволила понять принцип биосинтеза белка и связанные с этих явления.
Синтез протеина начинается с построения цепи матричной РНК из ДНК по принципу комплементарности.
После определенных преобразований молекула матричной РНК становится матрицей для построения по ней белка.
Биосинтез белка происходит в рибосомах, которые состоят из белков и рРНК. Рибосомы диссоциируют на две неравные субъединицы.

  • Прокароты: 70S→50S + 30S
  • Эукариоты: 80S→60S + 40S

Транспортная РНК состоит из небольшого числа нуклеотидов (73-97), некоторые из которых могут быть модифицированы. тРНК имеют общее строение:

  • универсальная CCA последовательность
  • акцепторный стебель
  • D шпилька
  • T шпилька
  • Антикодоновая шпилька

Транспортные РНК выполняют акцепторную и адапторную функции.
Рост полипептида в рибосоме начинается с N-конца добавлением новых аминокислотных остатков и завершается на C-конце.
Для синтез белка необходима активация аминокислот. Аминокислоты активируются в цитозоле аминоацил-тРНК синтетазой. Эти ферменты катализируют образование аминоацил-тРНК и расщепление АТФ на АМФ и пирофосфаты (PPi). Точность белкового синтеза зависит от правильного протекания этой реакции.
Непосредственный синтез белка (трансляция) проходит в три стадии.

  • Инициация белкового синтеза включает в себя образование комплекса из малой рибосомной субъединицы, мРНК, ГТФ, fMet-tRNAfMet, факторов инициации и большой рибосомной субъединицы. ГТФ гидролизуется с образованием ГМФ и фосфата.
  • На стадии элонгации ГТФ и факторы элонгации учавствуют в процессе связывания аминоацил-тРНК, нагруженной аминокислотой, с А-участком рибосомы. Под действием фермента пептидилтрансферазы образуется пептидная связь. Движение рибосомы вдоль мРНК транслоцирует тРНК из А-сайта в Р-сайт за счет энергии гидролиза ГТФ. «Отработавшая» тРНК высвобождается из Е-участка.
  • После повторения нескольких циклов элонгации, на стадии терминации, синтез полипептида останавливается факторами терминации.

Полипептид сворачивается в биологически активную конформацию и транспортируется к «рабочему месту».
Несмотря на множество открытий в биохимии и значимую работу, проделанную разными учеными в области этой науки, некоторые аспекты синтеза белков еще не установлены. Например, зачем нужны молекулы рРНК и как случилось, что они приобрели главенствующую роль в структуре и функции рибосом? На этот и другие вопросы науке предстоит ответить.

  1. Дроздов, А.Л. Биология для физиков и химиков / А.Л. Дроздов. — Владивосток: Изд-во Дальневосточного. ун-та, 2005. — 414 с.
  2. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ.-М.: Мир, 1985.-329с.,ил.
  3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 2. Пер. с англ.: —М.: Мир, 1993. — 415 с., ил.
  4. Ратнер В. А.Генетический код как система — Соросовский образовательный журнал, 2000, 6, № 3, с.17-22.
  5. Спирин А. С.Принципы структуры рибосом — Соросовский образовательный журнал, 1998, 4, № 11, с.65-70.
  6. Спирин А.С. Молекулярная биология : рибосомы и биосинтез белка : учебник для студ. высш. проф. образования / А. С. Спирин. — М. : Издательский центр «Академия», 2011. — 496 с., [16] с. цв. ил.
  7. Фаворова О. О. Строение транспортных РНК и их функция на первом (предрибосомном) этапе биосинтеза белков — Соросовский образовательный журнал, 1998, 4, № 11, с.71-77.
  8. Химическая энциклопедия. — М.: Советская энциклопедия. Под ред. И. Л. Кнунянца. 1988.
  9. Alberts, B., Wilson, J. and Hunt, T. (2008). Molecular biology of the cell. New York: Garland Science.
  10. Itoh, Y., Chiba, S., Sekine, S. and Yokoyama, S. (2009). Crystal structure of human selenocysteine tRNA.Nucleic Acids Research, 37(18), pp.6259-6268.
  11. Itoh, Y., Sekine, S., Suetsugu, S. and Yokoyama, S. (2013). Tertiary structure of bacterial selenocysteine tRNA. Nucleic Acids Research, 41(13), pp.6729-6738.
  12. Lehninger, A., Nelson, D. and Cox, M. (2000). Lehninger principles of biochemistry. New York: Worth Publishers.
  13. Marshall W. Nirenberg — Nobel Lecture: The Genetic Code. Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 29 Mar 2015. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1968/nirenberg-lecture.html
  14. Svidritskiy, E., Brilot, A., Koh, C., Grigorieff, N. and Korostelev, A. (2014). Structures of Yeast 80S Ribosome-tRNA Complexes in the Rotated and Nonrotated Conformations. Structure, 22(8), pp.1210-1218.

Структуры молекул взяты из RCSB Protein Data Bank и ChemSpider

Извините, ничего не найдено.

Статья по биологии «Биосинтез белка»

Биосинтез белка и нуклеиновых кислот. Гены, генетический код

В обмене веществ организма ведущая роль принадлежит белкам и нуклеиновым кислотам.

Белковые вещества составляют основу всех жизненно важных структур клетки, обладают необычайно высокой реакционной способностью, наделены каталитическими функциями.

Нуклеиновые кислоты входят в состав важнейшего органа клетки — ядра, а также цитоплазмы, рибосом, митохондрий и т. д. Нуклеиновые кислоты играют важную, первостепенную роль в наследственности, изменчивости организма, в синтезе белка.

План синтеза белка хранится в ядре клетки, а непосредственно синтез происходит вне ядра, поэтому необходима помощь для доставки закодированного плана из ядра к месту синтеза. Такую помощь оказывают молекулы РНК.

Процесс  начинается в ядре клетки: раскручивается и открывается часть «лестницы» ДНК. Благодаря этому буквы РНК образуют связи с открытыми буквами ДНК одной из нитей ДНК. Фермент переносит буквы РНК, чтобы соединить их в нить. Так буквы ДНК «переписываются» в буквы РНК. Новообразованная цепочка РНК отделяется, и «лестница» ДНК снова закручивается.

После дальнейших изменений этот вид закодированной РНК готов.

РНК выходит из ядра и направляется к месту синтеза белка, где буквы РНК расшифровываются. Каждый набор из трех букв РНК образует «слово», обозначающее одну конкретную аминокислоту.

Другой вид РНК отыскивает эту аминокислоту, захватывает ее с помощью фермента и доставляет к месту синтеза белка. По мере прочтения и перевода сообщения РНК цепочка аминокислот растет. Эта цепочка закручивается и укладывается в уникальную форму, создавая один вид белка.
Примечателен даже процесс укладки белка: на то, чтобы с помощью компьютера просчитать все возможности укладки белка среднего размера, состоящего из 100 аминокислот, потребовалось бы 1027 лет. А для образования в организме цепочки из 20 аминокислот требуется не более  одной секунды — и этот процесс происходит непрерывно во всех клетках тела.

Гены, генетический код и его свойства.

На Земле живет около 7 млрд людей. Если не считать 25—30 млн пар однояйцовых близнецов, то генетически все люди разные: каждый уникален, обладает неповторимыми наследственными особенностями, свойствами характера, способностями, темпераментом.

Такие различия объясняются  различиями в  генотипах—наборах генов организма;  у каждого он уникален. Генетические признаки конкретного организма воплощаются в белках  — следовательно, и строение белка одного человека отличается, хотя и совсем немного, от белка другого человека.

Это не означает, что у людей не встречается совершенно одинаковых белков. Белки, выполняющие одни и те же функции, могут быть одинаковыми или совсем незначительно отличаться одной-двумя аминокислотами друг от друга. Но не существует на Земле людей (за исключением однояйцовых близнецов), у которых все белки были бы одинаковы.

Информация о первичной структуре белка закодирована в виде последовательности нуклеотидов в участке молекулы ДНК – гене – единице наследственной информации организма. Каждая молекула ДНК содержит множество генов. Совокупность всех генов организма составляет его генотип.

Кодирование наследственной информации происходит с помощью генетического кода, который универсален для всех организмов и отличается лишь чередованием нуклеотидов, образующих гены, и кодирующих белки конкретных организмов.

Генетический код состоит из троек (триплетов) нуклеотидов ДНК, комбинирующихся в разной последовательности  (ААТ, ГЦА, АЦГ, ТГЦ и т. д.), каждый из которых кодирует определенную аминокислоту (которая будет встроена в полипептидную цепь).

Аминокислот 20, а возможностей для комбинаций четырех нуклеотидов в группы по три – 64                              четырех нуклеотидов вполне достаточно, чтобы кодировать 20 аминокислот                                   

поэтому одна аминокислота может кодироваться несколькими триплетами.

Часть триплетов вовсе не кодирует аминокислоты, а запускает или останавливает биосинтез белка.

Собственно кодом считается последовательность нуклеотидов в молекуле и-РНК, т.к. она снимает информацию с ДНК (процесс транскрипции) и переводит ее в последовательность аминокислот в молекулах синтезируемых белков (процесс трансляции).

В состав и-РНК входят нуклеотиды АЦГУ, триплеты которых называются кодонами:  триплет на ДНК ЦГТ на и-РНК станет триплетом ГЦА, а триплет ДНК ААГ станет триплетом УУЦ.

Именно кодонами и-РНК отражается генетический код в записи.

Таким образом, генетический код — единая система записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот в виде последовательности нуклеотидов. Генетический код основан на использовании алфавита, состоящего всего из четырех букв-нуклеотидов, отличающихся азотистыми основаниями: А, Т, Г, Ц.

Основные свойства генетического кода:

1. Генетический код триплетен. Триплет (кодон) — последовательность трех нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту. Поскольку в состав белков входит 20 аминокислот, то очевидно, что каждая из них не может кодироваться одним нуклеотидом (поскольку в ДНК всего четыре типа нуклеотидов, то в этом случае 16 аминокислот остаются незакодированными). Двух нуклеотидов для кодирования аминокислот также не хватает, поскольку в этом случае могут быть закодированы только 16 аминокислот. Значит, наименьшее число нуклеотидов, кодирующих одну аминокислоту, оказывается равным трем. (В этом случае число возможных триплетов нуклеотидов составляет 43 = 64).

2. Избыточность (вырожденность) кода является следствием его триплетности и означает то, что одна аминокислота может кодироваться несколькими триплетами (поскольку аминокислот 20, а триплетов — 64), за исключением метионина и триптофана, которые кодируются только одним триплетом. Кроме того, некоторые триплеты выполняют специфические функции: в молекуле иРНК триплеты УАА, УАГ, УГА — являются терминирующими кодонами, т. е. стоп-сигналами, прекращающими синтез полипептидной цепи. Триплет, соответствующий метионину (АУГ), стоящий в начале цепи ДНК,   не кодирует аминокислоту, а выполняет функцию инициирования (возбуждения) считывания.

3. Одновременно с избыточностью коду присуще свойство однозначности: каждому кодону соответствует только одна определенная аминокислота.

4. Код коллинеарен, т.е. последовательность нуклеотидов в гене точно соответствует последовательности аминокислот в белке.

5. Генетический код неперекрываем и компактен, т. е. не содержит «знаков препинания». Это значит, что процесс считывания не допускает возможности перекрывания колонов (триплетов), и, начавшись на определенном кодоне, считывание идет непрерывно триплет за триплетом вплоть до стоп-сигналов (терминирующих кодонов).

6. Генетический код универсален, т. е. ядерные гены всех организмов одинаковым образом кодируют информацию о белках вне зависимости от уровня организации и систематического положения этих организмов.

Существуют таблицы генетического кода для расшифровки кодонов и-РНК и построения цепочек белковых молекул.

 

Реакции матричного синтеза.  

В живых системах встречается реакции, неизвестные в неживой природе — реакции матричного синтеза.

Термином «матрица» в технике обозначают форму, употребляемую для отливки монет, медалей, типографского шрифта: затвердевший металл в точности воспроизводит все детали формы, служившей для отливки.  Матричный синтез напоминает отливку на матрице: новые молекулы синтезируются в точном соответствии с планом, заложенным в структуре уже существующих молекул.

Матричный принцип лежит в основе важнейших синтетических реакций клетки, таких, как синтез нуклеиновых кислот и белков. В этих реакциях обеспечивается точная, строго специфичная последовательность мономерных звеньев в синтезируемых полимерах.

Здесь происходит направленное стягивание мономеров в определенное место клетки — на молекулы, служащие матрицей, где реакция протекает. Если бы такие реакции происходили в результате случайного столкновения молекул, они протекали бы бесконечно медленно. Синтез сложных молекул на основе матричного принципа осуществляется быстро и точно.

Роль матрицы в матричных реакциях играют макромолекулы нуклеиновых кислот ДНК или РНК.

Мономерные молекулы, из которых синтезируется полимер, — нуклеотиды или аминокислоты — в соответствии с принципом комплементарности располагаются и фиксируются на матрице в строго определенном, заданном порядке.

Затем происходит «сшивание» мономерных звеньев в полимерную цепь, и готовый полимер сбрасывается с матрицы.

После этого матрица готова к сборке новой полимерной молекулы. Понятно, что как на данной форме может производиться отливка только какой-то одной монеты, одной буквы, так и на данной матричной молекуле может идти «сборка» только какого-то одного полимера.

Матричный тип реакций — специфическая особенность химизма живых систем. Они являются основой фундаментального свойства всего живого — его способности к воспроизведению себе подобного.

 К реакциям матричного синтеза относят:

1. репликацию ДНК— процесс самоудвоения молекулы ДНК, осуществляемый под контролем ферментов. На каждой из цепей ДНК, образовавшихся после разрыва водородных связей, при участии фермента ДНК-полимеразы синтезируется дочерняя цепь ДНК. Материалом для синтеза служат свободные нуклеотиды, имеющиеся в цитоплазме клеток.

Биологический смысл репликации заключается в точной передаче наследственной информации от материнской молекулы к дочерним, что в норме и происходит при делении соматических клеток.

Молекула ДНК состоит из двух комплементарных цепей. Эти цепи удерживаются слабыми водородными связями, способными разрываться под действием ферментов.

Молекула способна к самоудвоению (репликации), причем на каждой старой половине молекулы синтезируется новая ее половина.

Кроме того, на молекуле ДНК может синтезироваться молекула и-РНК, которая затем переносит полученную от ДНК информацию к месту синтеза белка.

Передача информации и синтез белка идут по матричному принципу, сравнимому с работой печатного станка в типографии. Информация от ДНК многократно копируется. Если при копировании произойдут ошибки, то они повторятся во всех последующих копиях.

Правда, некоторые ошибки при копировании информации молекулой ДНК могут исправляться — процесс устранения ошибок называется репарацией. Первой из реакций в процессе передачи информации является репликация молекулы ДНК и синтез новых цепей ДНК.

2. транскрипцию – синтез и-РНК на ДНК, процесс снятия информации с молекулы ДНК, синтезируемой на ней молекулой и-РНК.

И-РНК состоит из одной цепи и синтезируется на ДНК в соответствии с правилом комплементарности при участии фермента, который активирует начало и конец синтеза молекулы и-РНК.

Готовая молекула и-РНК выходит в цитоплазму на рибосомы, где происходит синтез полипептидных цепей.

3. трансляцию— синтез белка на и-РНК; процесс перевода информации, содержащейся в последовательности нуклеотидов и-РНК, в последовательность аминокислот в полипептиде.

4. синтез РНК или ДНК на РНК вирусов

Последовательность матричных реакций при биосинтезе белков можно представить в виде схемы:

нетранскрибируемая цепь ДНК

 

А Т Г

Г Г Ц

Т А Т

транскрибируемая цепь ДНК

 

Т А Ц

Ц Ц Г

А Т А

транскрипция ДНК

 

ß

ß

ß

кодоны мРНК

 

А У Г

Г Г Ц

У А У

трансляция мРНК

 

ß

ß

ß

антикодоны тРНК

 

У А Ц

Ц Ц Г

А У А

аминокислоты белка

 

метионин

глицин

тирозин

Таким образом, биосинтез белка  – это один из видов пластического обмена, в ходе которого наследственная информация, закодированная в генах ДНК, реализуется в определенную последовательность аминокислот в белковых молекулах.

Молекулы белков по существу представляют собой полипептидные цепочки, составленные из отдельных аминокислот. Но аминокислоты недостаточно активны, чтобы соединиться между собой самостоятельно. Поэтому, прежде чем соединиться друг с другом и образовать молекулу белка, аминокислоты должны активироваться. Эта активация происходит под действием особых ферментов.

В результате активирования аминокислота становится более лабильной и под действием того же фермента связывается с т-РНК. Каждой аминокислоте соответствует строго специфическая т-РНК, которая находит «свою» аминокислоту и переносит ее в рибосому.

Следовательно, в рибосому поступают различные активированные аминокислоты, соединенные со своими т-РНК. Рибосома представляет собой как бы конвейер для сборки цепочки белка из поступающих в него различных аминокислот.

Одновременно с т-РНК, на которой «сидит» своя аминокислота, в рибосому поступает «сигнал» от ДНК, которая содержится в ядре. В соответствии с этим сигналом в рибосоме синтезируется тот или иной белок.

Направляющее влияние ДНК на синтез белка осуществляется не непосредственно, а с помощью особого посредника –  матричной или информационной РНК (м-РНК или и-РНК), которая синтезируется в ядре под влиянием ДНК, поэтому ее состав отражает состав ДНК. Молекула РНК представляет собой как бы слепок с формы ДНК. Синтезированная и-РНК поступает в рибосому и как бы передает этой структуре план — в каком порядке должны соединяться друг с другом поступившие в рибосому активированные аминокислоты, чтобы синтезировался определенный белок. Иначе, генетическая информация, закодированная в ДНК, передается на и-РНК и далее на белок.

Молекула и-РНК поступает в рибосому и прошивает ее. Тот ее отрезок, который находится в данный момент в рибосоме, определенный кодоном (триплет), взаимодействует совершенно специфично с подходящим к нему по строению триплетом (антикодоном) в транспортной РНК, которая принесла в рибосому аминокислоту.

Транспортная РНК со своей аминокислотой подходит к определенному кодону и-РНК и соединяется с ним; к следующему, соседнему участку и-РНК присоединяется другая т-РНК с другой аминокислотой и так  до тех пор, пока не будет считана вся цепочка и-РНК, пока не нанижутся все аминокислоты в соответствующем порядке, образуя молекулу белка.

А т-РНК, которая доставила аминокислоту к определенному участку полипептидной цепи, освобождается от своей аминокислоты и выходит из рибосомы.

Затем снова в цитоплазме к ней может присоединиться нужная аминокислота, и она снова перенесет ее в рибосому.

В процессе синтеза белка участвует одновременно не одна, а несколько рибосом — полирибосомы.

Основные этапы передачи генетической информации:

синтез на ДНК как на матрице и-РНК (транскрипция)

синтез в рибосомах полипептидной цепи по программе, содержащейся в и-РНК (трансляция).

Этапы универсальны для всех живых существ, но временные и пространственные взаимоотношения этих процессов различаются у про- и эукариотов.

У эукариот  транскрипция и трансляция строго разделены в пространстве и времени: синтез различных РНК происходит в ядре, после чего молекулы РНК должны покинуть пределы ядра, пройдя через ядерную мембрану. Затем в цитоплазме РНК транспортируются к месту синтеза белка — рибосомам. Лишь после этого наступает следующий этап — трансляция.

У прокариот транскрипция и трансляция идут одновременно.

Таким образом,

местом синтеза белков и всех ферментов в клетке являются рибосомы — это как бы «фабрики» белка, как бы сборочный цех, куда поступают все материалы, необходимые для сборки полипептидной цепочки белка из аминокислот. Природа синтезируемого белка  зависит от строения и-РНК, от порядка расположения в ней нуклеоидов, а строение и-РНК отражает строение ДНК, так что в конечном итоге специфическое строение белка, т. е. порядок расположения в нем различных аминокислот, зависит от порядка расположения нуклеоидов в ДНК, от строения ДНК.

Изложенная теория биосинтеза белка получила название матричной теории. Матричной эта теория называется потому, что нуклеиновые кислоты играют как бы роль матриц, в которых записана вся информация относительно последовательности аминокислотных остатков в молекуле белка.

Создание матричной теории биосинтеза белка и расшифровка аминокислотного кода является крупнейшим научным достижением XX века, важнейшим шагом на пути к выяснению молекулярного механизма наследственности.

 

Тематические задания

 

А1. Какое из утверждений неверно?

1) генетический код универсален     

2) генетический код вырожден

3) генетический код индивидуален  

4) генетический код триплетен

 

А2. Один триплет ДНК кодирует:

1) последовательность аминокислот в белке 

2) один признак организма

3) одну аминокислоту                                     

4) несколько аминокислот

 

А3. «Знаки препинания» генетического кода

1) запускают синтез белка               

2) прекращают синтез белка

3) кодируют определенные белки   

4) кодируют группу аминокислот

 

А4. Если у лягушки аминокислота ВАЛИН кодируется триплетом ГУУ, то у собаки эта аминокислота может кодироваться триплетами:

1) ГУА и ГУГ

2) УУЦ и УЦА

3) ЦУЦ и ЦУА 

4) УАГ и УГА

 

А5. Синтез белка завершается в момент

1) узнавания кодона антикодоном

2) поступления и-РНК на рибосомы

3) появления на рибосоме «знака препинания»

4) присоединения аминокислоты к т-РНК

 

А6. Укажите пару клеток в которой у одного человека содержится разная генетическая информация?

1) клетки печени и желудка           

2) нейрон и лейкоцит

3) мышечная и костная клетки      

4) клетка языка и яйцеклетка

 

А7. Функция и-РНК в процессе биосинтеза

1) хранение наследственной информации

2) транспорт аминокислот на рибосомы

3) передача информации на рибосомы

4) ускорение процесса биосинтеза

 

А8. Антикодон т-РНК состоит из нуклеотидов УЦГ. Какой триплет ДНК ему комплементарен?

1) ТЦГ

2) УУГ

3) ТТЦ

4) ЦЦГ

Эволюционные последствия неправильного синтеза белка

Nat Rev Genet. Авторская рукопись; Доступно в PMC 2010 APR 1.

Опубликовано в окончательной отредактированной форме AS:

PMCID: PMC2764353

NIHMSID: NIHMS146926

D. allan Drummond

1 FAS Центр для системной биологии, Гарвардский университет.

Claus O. Wilke

2 Центр вычислительной биологии и биоинформатики, Институт клеточной и молекулярной биологии и Отделение интегративной биологии Техасского университета в Остине.

1 FAS Центр системной биологии, Гарвардский университет.

2 Центр вычислительной биологии и биоинформатики, Институт клеточной и молекулярной биологии и отделение интегративной биологии Техасского университета в Остине.

Окончательная отредактированная версия этой статьи доступна по адресу Nat Rev Genet См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Ошибки в синтезе белков нарушают клеточную приспособленность, вызывают фенотипы заболеваний и влияют на эволюцию генов и генома.Экспериментальные и теоретические результаты по этой теме быстро накапливались в различных областях, таких как нейробиология, биосинтез и деградация белков и молекулярная эволюция, но с ограниченным взаимодействием между дисциплинами. Здесь мы рассмотрим исследования частоты ошибок, их клеточных и организменных последствий и сопутствующих долгосрочных эволюционных реакций. Измерения частот ошибок, от транскрипции до фолдинга белков, остаются в зачаточном состоянии; мы подчеркиваем основные области, в которых мало что известно, например, частота неудач при сворачивании белков, или где технологические инновации могут обеспечить неизбежные выгоды, такие как частоты ошибок трансляционного миссенс.Эволюционные реакции на ошибки делятся на две широкие категории: адаптации, минимизирующие ошибки и связанные с ними издержки, и адаптации, использующие ошибки на благо организма. Учитывая этот широкий спектр эффектов, может быть полезнее называть результаты синтеза полезными и вредными, а не правильными и ошибочными.

Синтез функционального белка из генетической информации поразительно подвержен ошибкам. Например, неправильное включение аминокислот во время трансляции, по оценкам, происходит один раз на каждые 1000-10000 транслируемых кодонов 1 , 2 .При такой частоте ошибок 15% белковых молекул средней длины будут содержать по крайней мере одну неправильно встроенную аминокислоту. Ошибки в полипептидах могут вызывать неправильное сворачивание белков, агрегацию и гибель клеток (например, ссылка 3). Неправильно свернутые белки лежат в основе широкого спектра нейрогенеративных заболеваний, и неправильное включение аминокислот во время трансляции может быть причинным фактором в патологии рассеянного склероза и ALS 4 , 5 . Наоборот, глобальные дефекты синтеза белка вызывают тканеспецифическую нейродегенерацию, связанную с продукцией белков с неправильной укладкой 3 , 6 .

Мы определяем ошибочный синтез белка как любое нарушение преобразования кодирующей последовательности в функционирующий белок. Помимо неправильного включения аминокислот, источниками ошибок являются ошибки транскрипции, аберрантный сплайсинг, преждевременная терминация, ошибочные посттрансляционные модификации и кинетические ошибки во время фолдинга (4). Это определение явно включает правильно синтезированные полипептиды, которые не могут свернуться в функциональный белок.

Источники ошибок в экспрессии эукариотических генов.

Ранее мы выдвинули гипотезу, что основные паттерны эволюции кодирующих последовательностей, сохранившиеся от бактерий до человека, возникают из-за селективного давления, направленного на минимизацию стоимости ошибочного синтеза белка, включая неспособность должным образом синтезированных полипептидов свернуться 5 . Такой отбор действовал бы наиболее сильно на гены с высокой экспрессией, а у животных — на гены, экспрессируемые в нервных тканях. Математическое моделирование и компьютерное моделирование предсказывают биофизические адаптации, которые уменьшат эту стоимость 5 , 7 9 , и некоторые из этих предсказаний теперь были подтверждены в недавнем экспериментальном исследовании эволюции 10 .

Вместе эти исследования проливают свет на путь, ведущий от верности продукции белка через клеточную дисфункцию и дефекты приспособленности организма, примером которых является нейродегенерация, к адаптации, отпечатки которой видны в эволюции кодирующих последовательностей в разных таксонах.

Здесь мы сначала рассмотрим, что известно о частоте ошибок в производстве функциональных белков, от транскрипции до фолдинга белков. Мы не пытаемся провести всесторонний обзор всех измерений.Вместо этого мы стремимся создать перспективу и мотивировать столь необходимые будущие исследования, выделяя разнообразные подходы. Затем мы рассмотрим множество способов, которыми организмы могли эволюционировать, чтобы справляться с ошибками в синтезе, либо путем выборочного снижения частоты ошибок, либо путем развития устойчивости к ошибкам. Далее мы исследуем, как организмы используют ошибки в синтезе для достижения биологических и эволюционных целей, недоступных при безошибочном синтезе. В заключение мы обсудим последствия для будущих исследований.

Ошибочный синтез белка

Ошибки возникают на всех этапах синтеза белка, от транскрипции до фолдинга белка, и имеют широко распространенные фенотипические последствия. Тем не менее, на удивление мало известно о точных коэффициентах ошибок и спектрах ошибок.

Частота ошибок в синтезе белка

Наука об измерении частоты ошибок, связанных с синтезом белка, остается в зачаточном состоянии, хотя первые попытки были предприняты более 45 лет назад (например, ссылка 11). Например, в литературе содержатся экспериментальные измерения частоты менее 5% из 1216 (64 × 19) возможных ошибок преобразования кодона в аминокислоту при трансляции лишь с небольшим количеством оценок для одного и того же вида.Недавние исследования достигли значительного прогресса в измерении частоты ошибок в конкретных случаях (см., например, ссылку 12), но текущие технологические разработки, вероятно, скоро дадут нам первое всестороннее представление о частотах ошибок трансляции в нормальных клетках (вставка 1).

Измерение частоты ошибок трансляции

Трансляция является наиболее подверженной ошибкам стадией синтеза белка. Таким образом, точные измерения скорости неправильного включения аминокислот имеют решающее значение для полного понимания ошибок синтеза.Мы можем записать все возможные ошибки миссенс в виде матрицы 64×19 с 1216 независимыми элементами. На сегодняшний день измерен лишь небольшой процент этих записей и только у нескольких организмов. Проблема измерения коэффициента ошибочных ошибок заключается в том, что в данном образце количество безошибочных молекул на несколько порядков выше, чем у любого вида молекул, содержащих ошибки, что перегружает самые беспристрастные методы обнаружения и вынуждает исследователей использовать умные, но сильно предвзятые схемы для получения вообще какого-либо результата.

Исторические методы, используемые для измерения частоты переводческих ошибок, делятся на три широкие категории. Во-первых, некоторые группы измерили количество определенной аминокислоты в белке, который не должен содержать эту аминокислоту. Например, Эдельманн и Галлант измерили количество цистеина в обычно не содержащем цистеин белке флагеллине E. coli 91 . Во-вторых, некоторые группы измерили изменение изоэлектрической точки белка из-за неправильного включения аминокислот 92 , 93 .Оба этих подхода имеют тот недостаток, что они усредняют множество различных элементов матрицы рибосомных ошибок. Третий подход основывается на специальных репортерных системах, которые выдают сигнал, когда конкретный кодон неправильно транслируется. Например, Kramer и Farabaugh изучали неправильное включение лизина в различные кодоны с помощью слитых люцифераз, F-luc и R-luc, люминесценцию которых можно определить независимо и с предельной точностью. В F-luc они заменили кодон незаменимого лизина в положении 529 всеми почти родственными и несколькими другими кодонами 12 , 94 .С помощью этих конструкций они измерили частоту неправильной трансляции определенных кодонов в лизин путем анализа активности F-luc относительно активности R-luc.

Можно ли оценить всю матрицу ошибок 64×19 в одном эксперименте? В принципе, да. Огромный прирост чувствительности количественной тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) (например, ссылка 90) предлагает заманчивый потенциал для обнаружения низкочастотных ошибок на фоне молекул дикого типа. Глубокое количественное МС/МС исследование пептидов, полученных из очищенного целевого белка или белков, с использованием базы данных детекции, включающей все возможные одиночные аминокислотные замены, а также кодируемую ДНК последовательность, в принципе может определить как тип, так и положение аминокислоты. кислотные замены, введенные неправильной транскрипцией и неправильным переводом.Путем кодирования целевого белка (белков) с несколькими экземплярами всех 64 кодонов спектр ошибок каждого кодона можно было бы оценить в нескольких контекстах, а секвенирование одной молекулы РНК транскриптов целевого гена можно было бы использовать для оценки частоты и положения ошибок транскрипции. позволяя распутывать ошибки перевода из-за неправильного ацилирования и неправильного прочтения. Хотя такой эксперимент технически сложен, он находится в пределах досягаемости современных методов и одним махом даст первое всестороннее представление о спектре ошибок трансляции в любом организме.

предоставляет оценки частоты ошибок от транскрипции до фолдинга белка, подчеркивая использование разнородных экспериментальных подходов и неоднородность полученных знаний. Основное наблюдение заключается в том, что ошибки синтеза происходят на порядки чаще, чем ошибки репликации ДНК. Геном E. coli имеет длину 4,6 × 10 6 пар оснований, так что при типичной частоте мутаций примерно 10 -9 на пару оснований одна бактерия из 200 будет нести мутацию в своем геноме.Напротив, средняя кодирующая последовательность E. coli имеет длину 335 кодонов, и при канонической частоте ошибочных ошибок на кодон 5×10 -4 15% белковых молекул будут содержать по крайней мере одну ошибку. В бактериальном масштабе идеально реплицированные геномы — обычное дело, но идеально синтезированные протеомы никогда не встречаются. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что эукариоты не более и не менее точны в синтезе белка, чем прокариоты 13 . При прочих равных, более длинные белки обязательно накапливают больше ошибок, что приводит к поразительным предсказаниям: если канонические коэффициенты ошибочных ошибок остаются в силе, каждая молекула гигантского мышечного белка человека тайтина, состоящего из 34 350 аминокислот, будет содержать в среднем 17 миссенс-ошибок, а средний человеческий саркомер вообще не содержал бы безошибочных молекул тайтина.

Таблица 1

Репрезентативные средние частоты ошибок на различных этапах синтеза белка.

in vitro 96 -4 3 24 Кодоны → Лев 3 LEU, VAL, SER CODONS
→ PHE
3 -1 20016 3-1 Frameshift AT
Amber (UAG) STOP
CODON
3 +1 Frameshift AT
Amber (UAG) Стоп
Кодон
3 Предоставленная
Уровень завершения на
Кодон
99 -3 0 преданность
Уровень завершения на
Кодон
Ошибка Тип ошибки Основа оценки Организм Ссылка
2
2 × 10 -6 Ставка UTP
Регистрация на G
Константы скорости для
Полимеризация и
Диссоциация
in vitro 95
Ошибки сращивания
5.7 × 10 -6 -6
2,3 × 10 -2
Пропорция
Сохраненные против Sprised
INTERONS
Количественная ПЦР Количественная ПЦР
против Exon-Exon
границы
H. Sapiens (клетки HELA
)
96 96
≈ 0,95 Доля
Сохраненные интроны
Количественная секвенирование Количественная секвенирование
Границы INTONR-EXON
По сравнению с Exon-Exon
границы
S. Pombe 42
Трансляция MUSIONTORIVER
6 × 10 -5 до 2 × 10 -4 Arg CGU / C Кодоны
→ CYS
Внешний вид CYS в
CYS-Free Flagellin
E.COLI 91 91
3,4 × 10 -4 Восстановление активности
до неактивных K529
Мутантов Firefly Luciferase
E. Coli 12
2 × 10 -4 Ошибки, полученные
Положительный заряд
Изменения в трех
белков
2D-гель Количество E. Coli 93
5 × 10 3 UAC → His Восстановление активности
до неактивного h295Y
мутанта хлорамфеникола
ацетилтрансферазы
S.Cerevisiae 13
1 × 10 -5 до 1 × 10 -3 Кинетическое моделирование от
Экспериментально
Определенные курсы
Константы
in vitro 9013
Framestift
1,5 × 10 -5 Восстановление
Beta -Galactosidase
до
стопорный вариант
E.COLI 98
3 × 10 -5 Restoration
бета -Galactosidase
Activity до
вариант остановки
E. coli
Преждевременное радость
2,7 × 10 -4 0.76 вероятность успеха
для завершения
1,021-аминокислот
полипептид β-галактозидазы
E.coli 99
0 до 2 × 10 -3 Сравнение
Плотность рибосомы на 5 ‘
против 3′ мРНК
S. Cerevisiae 100
Ошибка после трансляционной модификации
Неизвестно (без ошибок государства не четко определено)
отказ белка складной
неизвестен (без надежных оценок)

Ошибки в посттрансляционной модификации, вероятно, важны, но их частота и последствия остаются в значительной степени неизвестными.Одна из наиболее распространенных модификаций, гликозилирование, осуществляется на более чем 50% белков в клетке человека 14 . Гликозилирование не управляется матрицей и демонстрирует замечательную гетерогенность 15 . Олигосахариды, присоединенные к сайтам гликозилирования, имеют тенденцию изменяться от копии к копии одного и того же белка, и степени занятости сайтов гликозилирования также различаются, что делает неясным, в какой степени гетерогенность в гликозилировании следует считать ошибочной. То, что не всякая гетерогенность является функционально нормальной, демонстрируется часто очень вредными эффектами мутаций, изменяющих гликозилирование, которые обычно влияют на эффективность гликозилирования или состав гликанов без полного нарушения гликозилирования 16 .Степень и важность неправильного фосфорилирования также остаются плохо изученными, несмотря на потенциально серьезные последствия. Напр., неправильное фосфорилирование тау-белка, связывающего микротрубочки, является патологическим признаком всех случаев болезни Альцгеймера и, по-видимому, способствует неправильному сворачиванию и агрегации тау -17-.

Удивительно, но мы еще меньше знаем о частоте ошибок при производстве функциональных белков. Раннее исследование показало, что до 30% вновь синтезированных белков быстро деградировали, большинство из которых считались дефектными рибосомными продуктами (DRiPs) 18 .Тем не менее, более позднее исследование с использованием аналогичных методов показало, что большинство недавно синтезированных белков были в значительной степени защищены от деградации, даже если они не могли правильно свернуться из-за ошибок неправильного включения, и «максимум несколько процентов» вновь синтезированных белков были быстро расщеплены 19 . Таким образом, частота сбоев в производстве функционального белка, окончательное выражение сбоев в синтезе белка, остается по существу неизвестной. Соответственно, пропорция этих сбоев из-за ошибок восходящего синтеза по сравнению с ошибками фолдинга правильно синтезированных белков также остается неясной.

Вредные последствия ошибок синтеза

Многочисленные данные свидетельствуют о том, что ошибки в синтезе белка снижают приспособленность организма: нарушение точности трансляции с помощью обычных антибиотиков, таких как стрептомицин и канамицин, убивает бактерии; клетки с нарушенной способностью к корректуре трансляции демонстрируют измененную морфологию 20 и страдают серьезными дефектами приспособленности 21 , как и клетки с повышенным уровнем ошибок транскрипции в основном гене 10 ; дефекты точности трансляции и фолдинга белков вызывают фенотипы заболеваний на моделях мышей 3 , 6 .

Единичная аминокислотная замена в домене редактирования аланил-тРНК-синтетазы — мутация, вызывающая мизацилирование, последующие широко распространенные ошибки трансляции и неправильную укладку белка — вызывает дегенерацию клеток Пуркинье в мозжечке мыши, атаксию и смерть 3 . Этот результат подтверждает возможность того, что болезненные состояния, связанные с тканеспецифической дисфункцией, возникают из-за глобальных ошибок в синтезе белка 20 . Нейроны могут быть необычайно чувствительными к ошибкам синтеза из-за их долгой жизни, большого отношения площади поверхности к объему с соответствующим обилием мест для индуцированной мембраной агрегации 22 , разветвленной морфологии, которая препятствует транспорту и реакциям повреждения 23 , флуктуирующей клетке поляризация и системы контроля качества белков, которые с большей вероятностью будут перегружены неправильно свернутыми белками 17 (см.исх. 24 , 25 ).

Затраты на фитнес могут возникать по разным причинам. Ошибки синтеза белка часто приводят к потере функции белка. Недавнее исследование продемонстрировало, что нарушение фолдинга и функции устойчивого к антибиотикам белка β-lactamase из-за ошибок транскрипции снижает приспособленность клеток, но может быть компенсировано повышенной экспрессией и стабилизирующими мутациями в последовательности белка 10 .

Ошибки синтеза белка могут также производить полипептиды, проявляющие увеличение токсической функции . В редких случаях ошибка может придавать альтернативную или патологическую функцию нормальному в остальном свернутому белку. Чаще ошибки нарушают сворачивание, и неправильно свернутая молекула может быть токсичной. В этом контексте «токсичный» просто означает вредный и не указывает модальность или тяжесть вреда. Неправильно свернутые белки могут дестабилизировать мембраны 26 , украсть пропускную способность контроля качества у основных белков 24 , 25 и вызвать хронический стресс.Токсические эффекты аминогликозидных антибиотиков, которые загрязняют рибосомы и приводят к продукции белков с неправильной укладкой, частично прослеживаются в индуцированной неправильной укладкой белка передаче сигналов через мембранный рецептор cpxA . Конечным последствием является повышенное образование радикалов, деполяризация мембран и гибель клеток 27 . Цитотоксичность неправильно свернутого белка широко изучалась как фактор, способствующий нейродегенеративным заболеваниям. Становится все более очевидным, что на молекулярном уровне фенотипы заболеваний, связанных с неправильной укладкой, часто отражают усиление токсической функции, а не ее потерю. 25 , 26 , 28 .

Синтез и расщепление нефункциональных белков также может быть дорогостоящим, не будучи явно вредным ( затраты на очистку , см., например, ссылку 29). Пропускная способность рибосом, предназначенная для полипептида, который в конечном итоге перестанет функционировать, представляет собой альтернативную стоимость, особенно для быстрорастущих организмов 30 . Экспрессия систем контроля качества, таких как шапероны, для помощи, восстановления или деградации полипептидов представляет собой дополнительную стоимость пригодности, действующую в транс .Токсичность и затраты на очистку могут сосуществовать: даже если системы контроля качества в конечном итоге обнаружат и либо расщепят, либо рефолдируют все неправильно свернутые белки, последние все равно могут причинить значительный токсический ущерб, точно так же, как преступность не перестанет быть проблемой, даже если все преступники в конечном итоге будут уничтожены. пойманный.

Ошибки в белках, ответственных за воспроизведение генетического и негенетического материала, особенно в трансляции и репликации, могут привести к снижению точности и последующей дисфункции в последующих поколениях.Такой эффект, первоначально задуманный Оргелом 31 как катастрофа ошибок , был продемонстрирован у бактерий, где наследуемые мутации могут возникать из-за дефекта редактирования в трансляции 21 , 32 .

Влияние уровня экспрессии гена

В той мере, в какой ошибки синтеза белка производят вредные молекулярные виды или растрачивают ценные клеточные ресурсы, тяжесть результирующих фенотипических эффектов будет зависеть от уровня экспрессии этого гена.Чем выше экспрессия гена, тем больше образуется ошибочно синтезированных белков и тем больше влияние этих белков на фенотип организма. Например, затраты на очистку из-за синтеза нефункционального белка будут пропорциональны количеству произведенного белка. Многие формы токсичности неправильно свернутых белков, такие как агрегация и вмешательство в мембраны, увеличиваются с абсолютной концентрацией белка и, следовательно, с уровнем экспрессии генов. Обратите внимание, что если ошибки синтеза в первую очередь действуют за счет снижения функции белка, влияние уровня экспрессии генов не ожидается; ошибки в белке с низкой экспрессией, но функционально важном белке, таком как ДНК-полимераза или фактор транскрипции, не должны вносить меньшего вклада в приспособленность организма, чем нарушение активности фермента или структурной молекулы с высоким содержанием 5 , 7 .

Адаптация для минимизации затрат

Столкнувшись с дорогостоящими ошибками синтеза белка, организмы могут выработать две высокоуровневые стратегии снижения затрат: снижение частоты ошибок (повышение точности) и снижение стоимости оставшихся ошибок (повышенная толерантность или прочность). Поскольку затраты имеют тенденцию к увеличению с уровнем экспрессии генов, отбор на снижение затрат часто виден в различиях между генами с низким и высоким уровнем экспрессии.

Снижение частоты ошибок

Основным источником миссенс-замен во время синтеза белка является неправильное включение неродственных тРНК во время трансляции.Кодоны, соответствующие малочисленным тРНК, как правило, более подвержены ошибкам, чем другие кодоны 12 . Следовательно, использование кодонов влияет на частоту ошибок трансляции. Давление отбора для использования кодонов с низкой частотой ошибок обычно называют отбором по точности трансляции 33 . Однако точный отбор не должен приводить к единообразному использованию точных кодонов вдоль гена. Наоборот, это должно непропорционально воздействовать на те сайты, в которых ошибки трансляции будут иметь особенно серьезное влияние на фолдинг белка или его функцию -33-.Таким образом, общий тест на точность трансляции оценивает, связаны ли предпочтительные кодоны с эволюционно консервативными сайтами 5 , 33 , 34 или с сайтами, которые, как известно, важны для структуры или функции белка 33 , 35 . В целом, эти анализы показывают умеренную, но весьма значимую тенденцию совпадения предпочтительных кодонов с сайтами, в которых ожидается, что ошибки трансляции будут значительными, что согласуется со слабым отбором для повышения точности трансляции.

Хотя изменения в использовании кодонов для повышения точности не требуют больших затрат, рибосомы также можно сделать более точными. Тем не менее, повышенная точность рибосом часто достигается за счет скорости трансляции и эффективности использования энергии 36 , отчасти из-за внутренней физической реализации повышенной точности за счет усиленного энергозависимого отторжения тРНК. Следовательно, организмы могут эволюционировать, чтобы сбалансировать скорость рибосом, точность рибосом и энергетические затраты.

Второе давление отбора на уровне кодонов наказывает кодоны, которые с высокой вероятностью неправильно транслируются в радикально отличающиеся аминокислоты.Мы называем это давление отбора выбором для уменьшения ошибки . Хотя это не приводит к уменьшению частоты ошибок как таковых , это давление отбора снижает частоту наиболее дорогостоящих ошибок за счет большего числа менее серьезных ошибок. В нескольких биоинформатических исследованиях были обнаружены доказательства выбора для смягчения ошибок 37 39 . Генетический код сам по себе также обладает свойствами смягчения ошибок 40 и, возможно, специально разработан для минимизации последствий ошибок перевода 41 .

Вполне вероятно, что отбор ограничивает частоту ошибок на всех этапах синтеза белка. Некоторые простые прогнозы еще предстоит проверить, например, имеют ли гены с высокой экспрессией более низкую частоту ошибок транскрипции. Но помимо выбора точности и уменьшения ошибок, мало что известно о сигнатурах, которые указывали бы на такое давление отбора. Единственным исключением является эффективность сплайсинга у делящихся дрожжей, оцениваемая по доле интрон-экзонных соединений, сохраняющихся в клеточных мРНК.Он заметно увеличивается с уровнем экспрессии генов 42 , по-видимому, потому, что ошибочный сплайсинг становится более дорогостоящим, когда неправильно сплайсированные мРНК в изобилии.

Повышенная толерантность или устойчивость

Нет необходимости полностью устранять ошибки, если вместо этого организмы могут допускать определенное количество ошибок без существенных затрат на приспособление (). Некоторая толерантность присуща белковой биохимии. In vitro белки могут быть устойчивы ко многим отдельным или множественным мутациям 43 48 , хотя большинство мутаций имеет тенденцию снижать стабильность белка.Надежность сама по себе может модулироваться мутациями в белке 47 , 48 . Эти наблюдения предполагают, что белки могут развивать устойчивость к типичным ошибкам, возникающим при трансляции, называемой устойчивостью к трансляции 7 , 8 . Белки, обладающие устойчивостью к трансляции, могут правильно складываться и функционировать даже в случае неправильной трансляции. Математическое и вычислительное моделирование предсказывает, что это давление отбора сделает белки более термостабильными, а также более устойчивыми к генетическим мутациям 5 , 7 9 .Недавние экспериментальные результаты подтверждают эти предсказания 10 .

Альтернативные стратегии уменьшения неправильной укладки белков. (A) Белки плохо укладываются и легко сворачиваются. Высокоточный трансляционный аппарат производит несколько белков с ошибками трансляции и, таким образом, ограничивает общее количество неправильно свернутого белка. (B) Система трансляции, подверженная ошибкам, производит много белков с ошибками. Но белки — отличные папки, и они, как правило, не складываются неправильно даже при неправильном переводе.

Но даже если ген транслируется без каких-либо ошибок, результирующий белок может неправильно свернуться из-за взаимодействия с другими белками (например,g., другие неправильно уложенные или агрегированные белки) или свойства самого белка. Ключевыми среди белковых свойств являются термодинамическая стабильность, измеряемая свободной энергией разворачивания, и кинетика складывания, измеряемая скоростью складывания или разворачивания. Для большинства белков термодинамика определяет, может ли белок когда-либо достичь стабильного свернутого состояния, тогда как кинетика определяет, насколько вероятно, что термодинамически стабильный белок завершит сворачивание до того, как другие процессы, такие как агрегация и деградация, остановят его.Быстрое складывание и высокая стабильность, как правило, коррелируют. Ранее мы выдвинули гипотезу, что отбор снижает склонность белков к неправильной укладке даже при трансляции без ошибок 5 , 7 , но эта гипотеза еще не была проверена экспериментально. Из-за тесной взаимосвязи между термодинамической стабильностью и толерантностью к мутациям 47 50 более трансляционно стойкие белки могут быть также более кинетически стабильными, и наоборот.Ключевая трудность в настоящее время состоит в том, чтобы отличить стохастическое неправильное свертывание от неправильного свертывания, вызванного неправильным переводом, поскольку ошибки перевода по-прежнему трудно обнаружить. В соответствии либо с отбором на устойчивость к трансляции, либо с отбором против стохастического неправильного сворачивания является наблюдение, что высоко экспрессированные гены менее склонны к агрегации, чем гены с низким уровнем экспрессии 51 53 .

Другие приспособления, помимо надежной укладки белка, могут снизить стоимость ошибок синтеза.Одним из них является эффективное обнаружение и деградация продуктов неправильного сплайсинга. Нонсенс-опосредованный путь распада разрушает мРНК, которые содержат преждевременные стоп-кодоны -54-. Интроны эукариот, как правило, либо содержат стоп-кодоны, либо изменяют трансляционную рамку считывания, обнаруживая нижележащий стоп-кодон, что приводит к деградации мРНК неправильно сплайсированных транскриптов путем нонсенс-опосредованного распада -55-.

Общегеномные признаки снижения затрат

Широкие закономерности эволюции кодирующих последовательностей, такие как тенденция к медленной эволюции белков с высокой экспрессией, могут отражать отбор для снижения затрат на неправильное сворачивание белков 5 .Полногеномный анализ эволюционных скоростей последовательно показал, что уровень экспрессии является основным предиктором как синонимичной, так и несинонимичной дивергенции у бактерий, грибов, растений и животных 5 , 56 . Многомерный анализ обнаружил, что величины, связанные с частотой трансляции, вносят больший вклад в скорость эволюции, чем величины, связанные в первую очередь с функцией генов 57 61 . Мы предположили, что отбор против неправильной укладки белков, включая неправильную укладку безошибочных полипептидов, налагает сильное ограничение на эволюцию кодирующих последовательностей 5 .Многие геномные паттерны — ковариация между скоростью эволюции, уровнем экспрессии, предвзятостью использования кодонов и соотношением переход-трансверсия, а также связь между оптимальными кодонами и эволюционно консервативными сайтами — могут быть воспроизведены в модели, включающей только отбор против вызванных неправильной трансляцией. неправильное складывание 5 . Необходимы новые полногеномные сигналы, чтобы разрешить давление отбора и затраты на безошибочное неправильное сворачивание белка по сравнению с вызванным ошибками.

Во всех существующих моделях мы не ожидаем однозначной связи между уровнем экспрессии генов и эволюционной консервативностью.Отбор действует только на пагубные результаты ошибочного синтеза, которые могут варьироваться от белка к белку. Например, белковые аллели, которые с меньшей вероятностью становятся токсичными или быстрее выявляются и направляются в сторону деградации или рефолдинга, должны испытывать меньше эволюционных ограничений. Это давление и результирующие ограничения на изменение последовательности должны усиливаться с увеличением уровня экспрессии или для генов, экспрессируемых в чувствительных типах тканей. Точно так же, если конкретная белковая укладка очень устойчива к ошибкам синтеза, то гены, кодирующие белки этой укладки, будут испытывать небольшое давление отбора для снижения затрат, даже если они экспрессируются на относительно высоком уровне.Напротив, чувствительные складки будут испытывать гораздо более сильное давление отбора при сопоставимых уровнях экспрессии. В соответствии с этим рассуждением биофизические свойства белковой складки также влияют на скорость расхождения последовательностей 62 65 , а относительный вклад уровня экспрессии и структуры белка в эволюционную консервативность, по-видимому, сопоставим по величине 66 .

Полезные ошибки синтеза

Несмотря на то, что ошибки в синтезе белка в среднем вредны, во многих случаях они могут иметь прямую пользу для приспособленности организма.

Зависимая от ошибок экспрессия белков

Большое количество организмов, от вирусов до млекопитающих, развили определенные гены, которые зависят от ошибок в синтезе белков. Наиболее известным примером является запрограммированный сдвиг рамки считывания, когда удлиняющаяся рибосома сдвигается вперед (+1) или назад (-1) на один нуклеотид, чтобы войти в новую рамку считывания 67 . E. coli Субъединицы τ и γ ДНК-полимеразы III и антизим эукариотической орнитиндекарбоксилазы зависят от смещения рамки считывания для правильной экспрессии белка 68 , 69 .

Запрограммированные сдвиги рамки могут контролировать экспрессию генов () 70 . Антизим орнитиндекарбоксилазы (OAZ) неконкурентно ингибирует орнитиндекарбоксилазу (ODC), фермент, который катализирует первую стадию синтеза полиаминов. Полиамины, такие как спермидин, стимулируют сдвиг рамки +1. У эукариот от делящихся дрожжей до млекопитающих ген OAZ обычно заканчивается на раннем стоп-кодоне, давая только короткий пептид без ингибирующей активности, но сдвиг рамки считывания +1 дает полноразмерный антизим, который ингибирует ODC.При низких уровнях полиаминов сдвиг рамки считывания происходит нечасто, и вырабатывается мало антизимов, активнее больше ODC и накапливается больше полиаминов 70 . Когда уровни полиаминов повышаются, сдвиг рамки считывания стимулируется, давая больше полноразмерных антизимов, которые ингибируют ODC и снижают продукцию полиаминов 70 . Таким образом, контролируемая полиамином частота «ошибки» трансляции развилась, чтобы реализовать обратную регуляцию уровней полиамина.

Эволюционная эксплуатация ошибок синтеза.(A) Сдвиг рамки регулирует экспрессию генов. Орнитиндекарбоксилаза (ODC) катализирует синтез путресцина. ODC ингибируется антизимом орнитиндекарбоксилазы (OAZ), который связывается с ODC и вызывает его деградацию протеасомой. Правильное выражение функционала (OAZ) требует сдвига кадра +1. Сдвиг рамки легко происходит при высоких концентрациях полиаминов, таких как путресцин и его производные спермин и спермидин. (B) Трансляция скрытых генетических вариаций. В отсутствие дрожжевого приона ([ psi -]) белок Sup35p легко доступен для образования комплексов терминации трансляции (TTC).Следовательно, стоп-кодоны распознаются надежно. В присутствии дрожжевого приона ([ PSI +]) большая часть Sup35p секвестрируется, и ТТС слишком мало для надежной терминации трансляции. Как следствие, проявляется скрытая генетическая изменчивость (обозначена красным).

В пекарских дрожжах экспрессия генов частично регулируется эффективностью сплайсинга 71 . При аминокислотном голодании сплайсинг ингибируется для большинства интронсодержащих рибосомных генов 71 .Следствием этой регуляции, вероятно, является уменьшение количества функциональных рибосом и, следовательно, ингибирование трансляции. Некоторые бактериофаги используют спонтанное считывание стоп-кодонов в определенных контекстах для регуляции экспрессии генов фаговых белков 72 .

Некоторые пикорнавирусы несут в длинном полипептиде короткую последовательность (~19 аминокислот), которая побуждает эукариотические рибосомы пропускать пептидную связь 73 . Эта вызывающая пропуск последовательность 2A позволяет этим вирусам кодировать несколько белков с использованием одной компактной последовательности, не платя за кодирование протеазы.Такой пропуск рибосомы, по сути, ошибка в трансляционном аппаратном обеспечении, обнаруженная и используемая вирусами, теперь используется инженерами-биологами человека 74 .

Подавление вредных мутаций

Ошибки синтеза могут подавлять вредные в противном случае мутации, такие как считывание стоп-кодона в важном гене. Такое подавление нонсенса давно изучалось в бактериальных и клеточных системах 75 . В последнее время он приобрел повышенное значение в качестве терапии генетических заболеваний, при которых преждевременная мутация стоп-кодона вызывает фенотип заболевания, например, при кистозном фиброзе и мышечной дистрофии Дюшенна 76 .

Лекарства, нарушающие точность трансляции у бактерий, обычно используются в качестве антибиотиков. Бактериальные мутанты, жизнеспособность которых зависит от стрептомицина, легко выделяются 77 и обычно имеют сверхточные, но медленные рибосомы 36 . Независимость от стрептомицина часто восстанавливается мутациями, снижающими точность рибосом 78 .

Исследование альтернативных или новых фенотипов

Ошибки синтеза могут выявить скрытую генетическую изменчивость или создать новые фенотипы и, таким образом, позволить организму либо эпигенетически переключаться между различными фенотипами, либо предварительно отбирать потенциально полезные мутации 79 , 80 .

Дрожжевой прион [ PSI + ] представляет собой амилоидобразующую конформацию фактора терминации трансляции Sup35p. Он изолирует Sup35p и нарушает терминацию трансляции (2). Состояние [ PSI + ] является самораспространяющимся 81 , возникающим и разрешающимся спонтанно с малой вероятностью 82 . Во многих условиях окружающей среды штаммы [ PSI + ] растут лучше , чем штаммы без приона 83 , благодаря генетической изменчивости , выявленной при считывании стоп — кодонов 84 .Прионный домен Sup35p эволюционно законсервирован и, по-видимому, оказывает благотворное влияние на эволюционные временные шкалы 85 . Он может иметь адаптивное значение, не связанное с [ PSI + ]. Но одного состояния [ PSI + ] достаточно для поддержания прионного домена, если условия окружающей среды, при которых [ PSI + ] выявляют адаптивную генетическую изменчивость, встречаются по крайней мере раз в несколько миллионов поколений 86 , 87 .

В более общем смысле организмы могут воспользоваться преимуществами полезных фенотипов, порожденных ошибками 79 , 80 . Мутация, которая увеличивает производство ошибочного, но полезного продукта, будет увеличиваться в популяции. Как следствие, организмы могут получать прямую выгоду от мутаций, которые увеличивают вероятность дополнительных полезных мутаций в будущем. Этот механизм был назван эффектом упреждения 80 .Вариант механизма look-ahead может быть причиной адаптивной мутабельности , т. е. увеличения полезных мутаций в условиях экологического стресса, наблюдаемого у E. coli 88 . Один из экспериментов, описанных в [11]. 88требовалась реверсия инактивирующего сдвига рамки считывания в опероне lac . Но даже в отсутствие реверсионной мутации редкие случайные сдвиги рамки считывания во время трансляции обеспечивают остаточную функцию инактивированного гена; дублирование инактивированного гена приводит к соразмерному увеличению приспособленности, обусловленной остаточной функцией; в то же время это увеличивает вероятность того, что мутация исправит сдвиг рамки 89 .

Значение для будущих исследований

Наше понимание точности транскрипции, трансляции и фолдинга белков остается отрывочным (Box 2). Для клеток в нормальных физиологических условиях не существует исчерпывающих или даже репрезентативных спектров ошибок. Технологические инновации, такие как секвенирование одиночных молекул нуклеиновых кислот, дали нам удивительную картину безудержных ошибок сплайсинга в эукариотическом геноме 42 , и эта технология в сочетании с количественной масс-спектрометрией с глубоким охватом 90 вскоре может обеспечить аналогичный прорыв в наше понимание спектров транскрипционных и трансляционных ошибок (см. вставку 1).Однако частота и типы ошибок в обычных посттрансляционных модификациях, таких как гликозилирование и фосфорилирование, остаются почти полностью неизвестными, как и последствия этих ошибок для фолдинга и функционирования белков. Более того, относительные затраты на пригодность, связанные с потерей функции белка, контролем качества и усилением токсической функции, остаются неизвестными, и для их определения также потребуются значительные усилия (вставка 2). Тем не менее, какими бы ни были результаты таких исследований, существующие данные показывают, что синтез белка удивительно подвержен ошибкам и что ошибочный синтез белка может по-разному влиять на определенные типы тканей, налагать значительные затраты на клеточную приспособленность и модулировать эволюцию целых геномов.

Открытые вопросы

  • Какова точная частота ошибок при транскрипции, сплайсинге, трансляции и посттрансляционных модификациях? Как эти показатели различаются между генами и коррелируют с ключевыми переменными, такими как уровни экспрессии генов?

  • Какова частота неудач при сворачивании белка? Какая доля неудачных сворачиваний возникает из-за ошибок восходящего синтеза по сравнению со стохастическими и/или -транс--действующими факторами?

  • Каково полногеномное распределение посттрансляционных модификаций (ПТМ), таких как гликозилирование и фосфорилирование? Какая доля событий PTM является вредной при нормальных условиях?

  • Каковы основные механизмы, с помощью которых ошибки синтеза белка приводят к затратам на фитнес?

  • Насколько велики затраты на фитнес, связанные с неправильным синтезом белка, по сравнению с другими, не связанными с этим расходами на фитнес?

  • Почему частота ошибок так высока, хотя связанные с этим затраты на приспособление кажутся значительными?

  • Насколько важны ошибки синтеза для правильного функционирования клеточного механизма?

  • Как еще организмы эволюционировали, чтобы использовать молекулярное разнообразие, присутствующее в их клетках из-за ошибок в синтезе белка?

  • Что признаки естественного отбора против последствий ошибок синтеза белка говорят о спектре нейродегенеративных заболеваний человека, особенно об их распространенности, тяжести и клеточных проявлениях?

В отличие от редкости ошибок репликации ДНК, необычайная частота ошибок синтеза белка в нормальных клетках требует другого, возможно, незнакомого взгляда на клеточные операции.Клетки по своей сути представляют собой шумные статистические ансамбли, и генотип лучше всего понимать как кодирование частоты различных результатов, а не как одно так называемое правильное состояние, которое нарушается ошибками. Понятия правильного и ошибочного могут быть включены в более полезные понятия полезного и вредного, с той важной разницей, что предполагаемые ошибки могут быть полезными и даже существенными. Например, запрограммированные сдвиги кадра +1 и скачки трансляции, по-видимому, развились за счет усиления низкочастотных ошибок трансляции 67 .

Недавние исследования одиночных молекул подчеркивают необходимость охвата необычайного молекулярного разнообразия, возникающего из-за одного генотипа. У делящихся дрожжей частота сохраняющихся интронов, по-видимому, превышает 90% для подавляющего большинства транскриптов 42 . Являются ли все эти сохраненные интроны техническими артефактами, ошибками, пагубные последствия которых слишком малы, чтобы их можно было устранить естественным отбором, ошибками в транскриптах, предназначенными для деградации в результате нонсенс-опосредованного распада 55 , или непростым компромиссом, возникающим в результате энергетических или кинетических затрат, связанных с увеличением сращивание верности? Или некоторые из этих оставшихся интронов приносят организму важные преимущества, которые можно было бы подавить сплайсингом с более высокой точностью? Точно так же для некоторых белков с высокой экспрессией ожидается, что определенные генерированные неправильной трансляцией, биохимически сходные молекулярные виды будут существовать при клеточном содержании 10–100 молекул на клетку, что достаточно для действия в качестве регуляторных белков.Кажется маловероятным, что природа всегда не в состоянии использовать существование этих молекулярных подвидов, но их трудно выследить; возможно, гены с высокой экспрессией, которые заметно изменяют экспрессию в клетках со сверхточными рибосомами, могут указывать на ауторегуляторные системы, поддерживаемые неправильной трансляцией. Мы полагаем, что ошибочный синтез с сопутствующими ему модификаторами и результирующими адаптациями не только не будет незначительной неприятностью, но и будет играть центральную роль в нашем понимании молекулярной эволюции.

Краткий обзор

  • Синтез белка — сложный многоэтапный процесс, в ходе которого многое может пойти не так.

  • В настоящее время наши знания об ошибках синтеза белка ограничены. Но существующие измерения показывают, что синтез белка очень подвержен ошибкам по сравнению с репликацией ДНК.

  • Неправильно синтезированный белок может оказаться нефункциональным или токсичным. Однако у него может быть и новая, полезная функция.

  • Синтез нефункциональных и токсичных белков требует от организма затрат на приспособление. Эти затраты обычно увеличиваются с уровнем экспрессии гена.

  • Многие механизмы, кажется, развились, чтобы минимизировать затраты на ошибочный синтез белка.

  • В некоторых случаях организмы также пользуются ошибками синтеза. Например, запрограммированные сдвиги рамки иногда используются для регуляции экспрессии.

  • Жизнь клеток по своей природе шумный процесс.Каждый отдельный ген производит спектр различных вариантов белка, и организмы оптимизируют и используют свойства всего спектра.

Благодарности

Эта работа частично финансировалась за счет грантов NIH P50 GM068763 и R01 GM088344.

Глоссарий

Затраты на очистку Любые затраты на пригодность, связанные с производством и разложением нефункционального белка.
Приобретение токсической функции Любое событие, вызывающее вредное воздействие белка на экспрессирующую его клетку.Например, мутацию, которая вызывает агрегацию белка и его цитотоксичность, можно назвать мутацией с приобретением токсической функции.
Кинетическая неправильная укладка Неспособность безошибочного белка принять свою правильную конформацию в основном состоянии или спонтанная потеря конформации в основном состоянии.
Эффект предвидения Способность организмов ощущать влияние потенциальных будущих мутаций, если эти мутации возникают как ошибки при синтезе белка.
Запрограммированный сдвиг рамки считывания Сдвиг рамки, необходимый для правильной экспрессии определенного функционального белка. Частота, с которой рибосомы изменяют рамку считывания в местах запрограммированного сдвига рамки, часто жестко регулируется.
Пропуск рибосом Механизм, используемый некоторыми пикорнавирусами для образования нескольких пептидов из одной открытой рамки считывания. Специфическая последовательность (последовательность 2А) заставляет транслирующую рибосому пропускать образование пептидной связи на стыке последовательности 2А и нижестоящей последовательности.
Стохастическая неправильная укладка См. кинетическая неправильная укладка
Отбор для смягчения ошибок кислоты с ограниченным вредным действием.
Отбор по точности трансляции Давление отбора, при котором гены или определенные участки в генах кодируются высокоточными кодонами, т.е.е., кодоны, соответствующие очень распространенным тРНК.
Отбор на устойчивость к трансляции Давление отбора, которое заставляет белки быть устойчивыми к ошибкам миссенс при трансляции. Устойчивые к трансляции белки складываются и функционируют даже при неправильной трансляции.

Биографии

• 

Д. Аллан Драммонд является научным сотрудником Центра системной биологии FAS Гарвардского университета. Он получил докторскую степень. в 2006 году в Калифорнийском технологическом институте, США.Его исследовательские интересы включают контроль качества белков и молекулярную эволюцию.

• 

Клаус О. Уилке — доцент кафедры интегративной биологии Техасского университета в Остине. Он также связан с Центром вычислительной биологии и биоинформатики и Институтом клеточной и молекулярной биологии Техасского университета в Остине. Уилке получил докторскую степень. получил степень доктора теоретической физики в Рурском университете в Бохуме, Германия, в 1999 г., а с 2000 по 2004 г. был докторантом в Калифорнийском технологическом институте.Уилке занимается вычислительной эволюционной биологией, молекулярной эволюцией и укладкой белков.

Ссылки

2. Огле Дж. М., Рамакришнан В. Структурное понимание переводческой точности. Анну. Преподобный Биохим. 2005; 74: 129–177. [PubMed] [Google Scholar]3. Ли Дж. В. и др. Дефектная по редактированию тРНК-синтетаза вызывает неправильную укладку белка и нейродегенерацию. Природа. 2006; 443: 50–55. [PubMed] [Академия Google] Глобальная неправильная трансляция, вызванная неправильным сворачиванием белка, приводит к нейродегенерации, специфичной для клеточного типа, у мышей.Захватывающее исследование, которое связывает точность перевода с фенотипом болезни.
4. Рубинштейн Э. Неправильное включение аналога пролина азетидин-2-карбоновой кислоты в патогенез рассеянного склероза: гипотеза. Дж. Нейропатол. Эксп. Нейрол. 2008;67:1032–1034. [PubMed] [Google Scholar]5. Драммонд Д.А., Уилке К.О. Неправильный фолдинг белка, вызванный неправильным переводом, как доминирующее ограничение эволюции кодирующей последовательности. Клетка. 2008; 134:341–352. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Биоинформатическое и модельное исследование, демонстрирующее, что полногеномные модели молекулярной эволюции являются общими для бактерий и млекопитающих.Исследование также показало, что в простой модели эволюции белка для воспроизведения этих паттернов достаточно отбора против индуцированного неправильной трансляцией неправильного сворачивания белка.
6. Чжао Л., Лонго-Угадай С., Харрис Б.С., Ли Дж.В., Акерман С.Л. Накопление белка и нейродегенерация у мутантных мышей woozy вызваны нарушением SIL1, кошаперона BiP. Природа Жене. 2005; 37: 974–979. [PubMed] [Google Scholar]7. Драммонд Д.А., Блум Д.Д., Адами С., Уилке К.О., Арнольд Ф.Х. Почему высокоэкспрессированные белки эволюционируют медленно.проц. Натл. акад. науч. США. 2005; 102:14338–14343. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Вилленсдорфер М., Бюргер Р., Новак М.А. Скорость фенотипических мутаций и обилие аномальных белков в дрожжах. PLoS-компьютер. биол. 2007;3:e203. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]10. Голдсмит М., Тауфик Д.С. Возможная роль фенотипических мутаций в эволюции экспрессии и стабильности белков. проц. Натл. акад. науч. США. 2009;106:6197–6202. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Одно из первых исследований по изучению влияния ошибок транскрипции на эволюцию белка в экспериментальной системе.Бета-лактамаза TEM-1, экспрессируемая под воздействием склонной к ошибкам РНК-полимеразы, показала повышенный уровень экспрессии, повышенную термостабильность и повышенную устойчивость к мутациям.
12. Крамер Э.Б., Фарабо П.Дж. Частота ошибок неправильного прочтения трансляции у E. coli во многом определяется конкуренцией тРНК. РНК. 2007; 13:87–96. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] Высокоточное измерение частоты неправильного включения определенных аминокислот при трансляции.
13. Стэнсфилд И., Джонс К.М., Герберт П., Шоу ALWV, Туите М.Ф.Ошибки перевода Missense в Saccharomyces cerevisiae . Дж. Мол. биол. 1998; 282:13–24. [PubMed] [Google Scholar] 14. Вонг C-H. Гликозилирование белков: новые вызовы и возможности. Дж. Орг. хим. 2005; 70:4219–4225. [PubMed] [Google Scholar] 15. Махал ЛК. Гликомика: к биоинформационным подходам к пониманию гликозилирования. Противораковые агенты в медицинской химии. 2008; 8: 37–51. [PubMed] [Google Scholar] 16. Заморозить ХГ. Генетические дефекты гликома человека. Природа Обзоры Генетика.2006; 7: 537–551. [PubMed] [Google Scholar] 17. Винклхофер К., Тацельт Дж., Хаасс С. Две стороны неправильной укладки белков: усиление и потеря функции при нейродегенеративных заболеваниях. Журнал EMBO. 2008; 27: 336–349. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]18. Шуберт У и др. Быстрая деградация большой доли вновь синтезированных белков протеасомами. Природа. 2000; 404: 770–774. [PubMed] [Google Scholar] 19. Vabulas R, Hartl F. Синтез белка при остром ограничении питательных веществ зависит от функции протеасом.Наука. 2005; 310:1960–1963. [PubMed] [Google Scholar] 20. Нэнгл Л., Мотта С., Шиммель П. Глобальные последствия неправильного перевода из-за дефекта редактирования в клетках млекопитающих. Химия и биология. 2006; 13:1091–1100. [PubMed] [Google Scholar] 21. Бахер Дж. М., де Креси-Лагар В., Шиммель П. Р. Ингибирует рост клеток и функциональные изменения белка из-за дефектной по редактированию тРНК-синтетазы. проц. Натл. акад. науч. США. 2005; 102:1697–1701. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]22. Стефани М. Общая клеточная дисфункция при нейродегенеративных заболеваниях: роль поверхностей в раннем неправильном сворачивании белков, агрегации и совокупной цитотоксичности.Нейробиолог. 2007; 13: 519–531. [PubMed] [Google Scholar] 23. Мальгароли А., Валлар Л., Зимарино В. Белковый гомеостаз в нейронах и его патологические изменения. Текущее мнение в нейробиологии. 2006; 16: 270–274. [PubMed] [Google Scholar] 24. Гидалевиц Т., Бен-Цви А., Хо К., Бригнулл Х., Моримото Р.И. Прогрессирующее нарушение фолдинга клеточных белков в моделях полиглутаминовых заболеваний. Наука. 2006; 311:1471–1474. [PubMed] [Академия Google] Это исследование дает представление о природе клеточных затрат из-за неправильной укладки белков, демонстрируя, как склонные к агрегации белки могут вызывать цитотоксические эффекты, дестабилизируя минимально стабильные основные белки.
25. Гидалевиц Т., Крупински Т., Гарсия С., Моримото Р.И. Дестабилизирующие белковые полиморфизмы на генетическом фоне направляют фенотипическое проявление токсичности мутантного SOD1. Генетика PLoS. 2009;5:e1000399. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]26. Стефани М., Добсон СМ. Агрегация белков и совокупная токсичность: новый взгляд на укладку белков, болезни неправильной укладки и биологическую эволюцию. Дж. Мол. Мед. 2003; 81: 678–699. [PubMed] [Google Scholar] 27. Кохански М.А., Дуайер Д.Дж., Вежбовски Дж., Коттарел Г., Коллинз Дж.Дж.Неправильная трансляция мембранных белков и активация двухкомпонентной системы вызывают гибель клеток, опосредованную антибиотиками. Клетка. 2008; 135: 679–690. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]28. Буччиантини М. и др. Присущая агрегатам токсичность подразумевает общий механизм болезней неправильной укладки белков. Природа. 2002; 416: 507–511. [PubMed] [Академия Google] Одна из первых демонстраций того, что неправильно свернутые белки могут быть цитотоксическими. Агрегаты N-концевого домена белка HypF E. coli снижают жизнеспособность фибробластов мыши в зависимости от концентрации.
29. Бюргер Р., Вилленсдорфер М., Новак М.А. Почему частота фенотипических мутаций намного выше, чем частота генотипических мутаций? Генетика. 2006; 172:197–206. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]30. Stoebel D, Dean A, Dykhuizen D. Стоимость экспрессии генов белков оперона E. coli lac заключается в процессе, а не в продуктах. Генетика. 2008; 178:1653–1660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]31. Оргель Л. Поддержание точности синтеза белка и его значение для старения.проц. Натл. акад. науч. США. 1963; 49: 517–521. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]32. Бахер Дж. М., Шиммель П. Аминоацил-тРНК-синтетаза с дефектом редактирования оказывает мутагенное действие на стареющие бактерии посредством реакции SOS. проц. Натл. акад. науч. США. 2007; 104: 1907–1912. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]33. Акаши Х. Использование синонимичных кодонов в Drosophila melanogaster : естественный отбор и точность трансляции. Генетика. 1994; 136: 927–935. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]34.Столецки Н., Эйр-Уокер А. Использование синонимичных кодонов в Escherichia coli : Отбор по точности перевода. Мол. биол. Эвол. 2007; 24: 374–381. [PubMed] [Google Scholar] 35. Zhou T, Weems M, Wilke CO. Оптимальные для трансляции кодоны связаны со структурно чувствительными сайтами в белках. Мол. биол. Эвол. 2009; 26: 1571–1580. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]37. Арчетти М. Выбор использования кодонов для минимизации ошибок на уровне белка. Дж. Мол. Эвол. 2004; 59: 400–415. [PubMed] [Google Scholar] 38.Арчетти М. Генетическая надежность и отбор на уровне белка для синонимичных кодонов. Дж. Эвол. биол. 2006; 19: 353–365. [PubMed] [Google Scholar] 39. Хиггс П.Г., Хао В., Голдинг Г.Б. Выявление селективного воздействия на высокоэкспрессированные гены. Эволюционная биоинформатика. 2007; 2:1–13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]40. Фриланд С.Дж., Херст Л.Д. Генетический код один на миллион. Дж. Мол. Эвол. 1998; 47: 238–248. [PubMed] [Google Scholar]42. Вильгельм Б.Т. и др. Динамический репертуар эукариотического транскриптома, рассмотренный с разрешением в один нуклеотид.Природа. 2008; 453:1239–1243. [PubMed] [Академия Google] Подробное исследование транскриптома Schizosaccharomyces pombe в различных условиях с использованием как высокопроизводительного секвенирования, так и мозаичных массивов. Исследование обнаружило широко распространенную транскрипцию некодирующих областей и частое удержание интронов в мРНК.
43. Loeb DD, et al. Полный мутагенез протеазы ВИЧ-1. Природа. 1989; 340: 397–400. [PubMed] [Google Scholar]44. Шафихани С., Сигель Р.А., Феррари Э., Шнелленбергер В.Создание больших библиотек случайных мутантов в Bacillus subtilis с помощью мультимеризации плазмид на основе ПЦР. Биотехнологии. 1997; 23: 304–310. [PubMed] [Google Scholar]45. Догерти П.С., Чен Г., Иверсон Б.Л., Джорджиу Г. Количественный анализ влияния частоты мутаций на созревание аффинности одноцепочечных Fv-антител. проц. Натл. акад. науч. США. 1999;97:2029–2034. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]48. Берштейн С., Сегал М., Бекерман Р., Токурики Н., Тауфик Д.С. Связь между устойчивостью и эпистазом формирует ландшафт пригодности случайно дрейфующего белка.Природа. 2006; 444: 929–932. [PubMed] [Google Scholar]49. Таверна Д.М., Гольдштейн Р.А. Почему белки так устойчивы к мутациям? Дж. Мол. биол. 2002; 315: 479–484. [PubMed] [Google Scholar]50. Wilke CO, Bloom JD, Drummond DA, Raval A. Прогнозирование толерантности белков к случайным заменам аминокислот. Биофиз. Дж. 2005; 89: 3714–3720. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]51. Tartaglia GG, Pechmann S, Dobson CM, Vendruscolo M. Жизнь на грани: связь между уровнями экспрессии генов и скоростью агрегации белков человека.Тенденции биохим. науч. 2007; 32: 204–206. [PubMed] [Google Scholar]52. Вендрусколо М., Тарталья Г.Г. К количественным предсказаниям в клеточной биологии с использованием химических свойств белков. Мол. БиоСист. 2008;4:1170–1175. [PubMed] [Google Scholar]53. Tartaglia GG, Pechmann S, Dobson CM, Vendruscolo M. Взаимосвязь между уровнями экспрессии мРНК и растворимостью белка в E. coli . Дж. Мол. биол. 2009; 388: 381–389. [PubMed] [Google Scholar]54. МакГлинси, Нью-Джерси, Смит CWJ. Альтернативный сплайсинг, приводящий к нонсенс-опосредованному распаду мРНК: в чем смысл нонсенса? Тенденции биохим.науч. 2008; 33: 385–393. [PubMed] [Google Scholar]55. Джейлон О. и др. Трансляционный контроль сплайсинга интронов у эукариот. Природа. 2008; 451:359–362. [PubMed] [Академия Google] Изучение важности пути нонсенс-опосредованного распада (NMD) в ограничении количества неправильно сплайсированных интронов у эукариот. Многие интроны у эукариот содержат стоп-кодоны, которые запускают путь NMD в случае неправильного сплайсинга.
56. Pál C, Papp B, Lercher M. Комплексный взгляд на эволюцию белка. Природа Обзоры Генетика.2006; 7: 337–348. [PubMed] [Google Scholar]57. Rocha EPC, Danchin A. Анализ детерминант скорости замещения аминокислот в бактериальных белках. Мол. биол. Эвол. 2004; 21: 108–116. [PubMed] [Google Scholar]58. Аграфиоти I и др. Сравнительный анализ сетей взаимодействия белков Saccharomyces cerevisiae и Caenorhabditis elegans . БМС Эвол. биол. 2005; 5:23. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]60. Драммонд Д.А., Раваль А., Уилке К.О. Единственная детерминанта доминирует над скоростью эволюции дрожжевого белка.Мол. биол. Эвол. 2006; 23: 327–337. [PubMed] [Google Scholar]61. Ся Ю, Францоса Э.А., Герштейн М.Б. Комплексная оценка геномных коррелятов скорости эволюции белков. Комп. PLoS. биол. 2009;5:e1000413. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]62. Блум Д.Д., Драммонд Д.А., Арнольд Ф.Х., Уилке К.О. Структурные детерминанты скорости эволюции белка у дрожжей. Мол. биол. Эвол. 2006; 23:1751–1761. [PubMed] [Google Scholar]63. Хартлинг Дж., Ким Дж. Устойчивость к мутациям и геометрическая форма в белковых структурах.Дж. Эксп. Зоология Б: мол. Девел. Эвол. 2007; 310Б: 216–226. [PubMed] [Google Scholar]64. Чой С.К., Хоболт А., Робинсон Д.М., Кишино Х., Торн Д.Л. Количественная оценка влияния третичной структуры белка на молекулярную эволюцию. Мол. биол. Эвол. 2007; 24:1769–1782. [PubMed] [Google Scholar]65. Чжоу Т., Драммонд Д.А., Уилке К.О. Контактная плотность влияет на скорость эволюции белка от бактерий к животным. Дж. Мол. Эвол. 2008; 66: 395–404. [PubMed] [Google Scholar]66. Вольф М.Ю., Вольф Ю.И., Кунин Е.В. Сопоставимые вклады структурно-функциональных ограничений и уровня экспрессии в скорость эволюции белковых последовательностей.Биология Директ. 2008; 3:40. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]67. Фарабо П.Дж. Программируемый трансляционный сдвиг рамки. Анна. Преподобный Генетика. 1996; 30: 507–528. [PubMed] [Google Scholar]68. Блинкова А.Л., Уокер Дж.Р. Запрограммированный рибосомный сдвиг рамки генерирует гамма-субъединицу ДНК-полимеразы III Escherichia coli из рамки считывания тау-субъединицы. Нуклеиновые Кислоты Res. 1990; 18: 1725–1729. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]70. Иванов И.П., Мацуфудзи С., Мураками Ю., Гестеланд Р.Ф., Аткин Дж.Ф.Сохранение регуляции полиаминов путем сдвига рамки считывания трансляции от дрожжей к млекопитающим. Журнал ЭМБО. 2000; 19:1907–1917. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]71. Плейс Дж. А., Уитворт Г. Б., Бергкессель М., Гатри С. Быстрые, специфичные для транскрипта изменения в сплайсинге в ответ на стресс окружающей среды. Мол. Клетка. 2007; 27: 928–937. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]72. Энгельберг-Кулка Х., Декель Л., Исраэль-Речес М., Белфорт М. Требование бессмысленного подавления для развития нескольких фагов.Мол. Генерал Жене. 1979; 170: 155–159. [PubMed] [Google Scholar]73. Доннелли МЛЛ и др. Анализ механизма «расщепления» полипротеина афтовируса 2A/2B указывает не на протеолитическую реакцию, а на новый трансляционный эффект: предполагаемый рибосомный «скип» Journal of General Virology. 2001; 82: 1013–1025. [PubMed] [Google Scholar]74. Funston GM, Kallioinen SE, de Felipe P, Ryan MD, Iggo RD. Экспрессия гетерологичных генов в онколитических аденовирусах с использованием последовательностей пикорнавируса 2А, запускающих пропуск рибосом.Журнал общей вирусологии. 2008; 89: 389–396. [PubMed] [Google Scholar]75. Горини Л. Информационное подавление. Анна. Преподобный Генетика. 1970; 4: 107–134. [PubMed] [Google Scholar]76. Уэлч Э.М. и соавт. PTC124 нацелен на генетические нарушения, вызванные бессмысленными мутациями. Природа. 2007; 447:87–91. [PubMed] [Google Scholar]77. Бьяре У., Горини Л. Зависимость от наркотиков обратилась вспять мутацией рибосомной неоднозначности, баранов , в Escherichia coli . Дж. Мол. биол. 1971; 57: 423–435. [PubMed] [Google Scholar]78.Бьоркман Дж., Самуэльссон П., Андерссон Д., Хьюз Д. Новые рибосомные мутации, влияющие на точность трансляции, устойчивость к антибиотикам и вирулентность Salmonella typhimurium . Молекулярная микробиология. 1999; 31: 53–58. [PubMed] [Google Scholar]81. Викнер Р.Б., Мэйсон Д.К., Эдскес Х.К. [ PSI ] и [ URE3 ] в качестве прионов дрожжей. Дрожжи. 1995; 11: 1671–1685. [PubMed] [Google Scholar]82. Чернофф Ю.О., Ньюнам Г.П., Кумар Дж., Аллен К., Цинк А.Д. Доказательства белкового мутатора у дрожжей: роль родственного Hsp70 шаперона Ssb в формировании, стабильности и токсичности приона [ PSI ].Мол. Клетка. биол. 1999;19:8103–8112. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]83. True HL, Линдквист SL. Дрожжевой прион обеспечивает механизм генетической изменчивости и фенотипического разнообразия. Природа. 2000;407:477–483. [PubMed] [Академия Google] Важная статья, демонстрирующая, что дрожжевой прион [ PSI + ] может обнаруживать скрытые генетические вариации и создавать новые наследуемые фенотипы.
84. True HL, Berlin I, Lindquist SL. Эпигенетическая регуляция трансляции выявляет скрытые генетические вариации, производящие сложные признаки.Природа. 2004; 431:184–187. [PubMed] [Google Scholar]85. Дженсен М.А., Тру Х.Л., Чернофф Ю.О., Линдквист С. Молекулярная популяционная генетика и эволюция прионоподобного белка в Saccharomyces cerevisiae . Генетика. 2001; 159: 527–535. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]87. Griswold CK, Masel J. Сложные адаптации могут стимулировать эволюцию конденсатора [ PSI + ] даже при реалистичных показателях пола дрожжей. Генетика PLoS. 2009;5:e1000517. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]88.Кэрнс Дж., Овербо Дж., Миллер С. Происхождение мутантов. Природа. 1988; 335: 142–145. [PubMed] [Google Scholar]89. Андерссон Д.И., Слехта Э.С., Рот Дж.Р. Доказательства того, что амплификация генов лежит в основе адаптивной мутабельности бактериального оперона lac . Наука. 1998; 282:1133–1135. [PubMed] [Google Scholar]90. де Годой ЛМФ и др. Комплексная количественная оценка протеома гаплоидных и диплоидных дрожжей на основе масс-спектрометрии. Природа. 2008; 455:1251–1254. [PubMed] [Google Scholar]91. Эдельманн П., Галлант Дж.Неправильный перевод в E. coli . Клетка. 1977; 10: 131–137. [PubMed] [Google Scholar]92. Паркер Дж., Фризен Дж. Д. Чтение кодона «два из трех», приводящее к неправильной трансляции in vivo. Мол. Генерал Жене. 1980; 177: 439–445. [PubMed] [Google Scholar]93. Эллис Н., Галлант Дж. Оценка глобальной частоты ошибок при переводе. Мол Ген Генетика. 1982; 188: 169–172. [PubMed] [Google Scholar]94. Тот М.Дж., Мургола Э.Дж., Шиммель П. Доказательства уникального несоответствия кодон-антикодон первой позиции in vivo. Дж. Мол.биол. 1988; 201: 451–454. [PubMed] [Google Scholar]95. Киреева М.Л. и соавт. Временная инверсия закрытия активного сайта РНК-полимеразы II контролирует точность элонгации транскрипции. Мол. Клетка. 2008; 30: 557–566. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]96. Фокс-Уолш К.Л., Хертель К.Дж. Спаривание сайтов сплайсинга — это процесс с высокой точностью. проц. Натл. акад. науч. США. 2009; 106: 1766–1771. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]97. Давитер Т., Громадски К., Роднина М. Реакция рибосомы на несоответствие кодон-антикодон.Биохимия. 2006; 88: 1001–1011. [PubMed] [Google Scholar]98. Карран Дж., Ярус М. Замена оснований в плече антикодона тРНК не снижает точности поддержания рамки считывания. проц. Натл. акад. науч. США. 1986; 83: 6538–6542. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]99. Йоргенсен Ф., Курланд К.Г. Ошибки процессивности экспрессии генов в Escherichia coli . Дж. Мол. биол. 1990; 215:511–521. [PubMed] [Google Scholar] 100. Арава Ю., Боас Ф., Браун П., Хершлаг Д. Анализ эукариотической трансляции и ее контроль с помощью картирования плотности рибосом.Исследование нуклеиновых кислот. 2005; 33: 2421–2432. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

5.7 Синтез белка — биология человека

Автор: CK-12/Адаптировано Кристин Миллер

Рисунок 5.7.1. Как производятся белки.

На этом удивительном произведении искусства (рис. 5.7.1) показан процесс, происходящий в клетках всех живых существ: выработка протеинов пост. Этот процесс называется синтезом белка , и он   на самом деле состоит из двух процессов — транскрипции и трансляции.В эукариотических клетках транскрипция происходит в ядре. Во время транскрипции ДНК используется в качестве шаблона для создания молекулы матричной РНК (мРНК). Затем молекула мРНК покидает ядро ​​и направляется к рибосоме в цитоплазме, где происходит трансляция. Во время трансляции генетический код мРНК считывается и используется для создания полипептида. Эти два процесса суммируются центральной догмой молекулярной биологии: ДНК РНК Белок .

Транскрипция  является первой частью центральной догмы молекулярной биологии: ДНК     РНК . Это перенос генетических инструкций в ДНК на мРНК. Во время транскрипции цепочка мРНК дополняет цепочку ДНК. Вы можете увидеть, как это происходит, на рис. 5.7.2.

Рис. 5.7.2 Транскрипция использует последовательность оснований в цепи ДНК для создания комплементарной цепи мРНК. Триплеты представляют собой группы из трех последовательных нуклеотидных оснований в ДНК.Кодоны представляют собой комплементарные группы оснований в мРНК.

Транскрипция начинается, когда фермент РНК-полимераза связывается с областью гена, называемой промоторной последовательностью. Это сигнализирует ДНК раскручиваться, чтобы фермент мог «читать» основания ДНК. Две нити ДНК названы в зависимости от того, будут ли они использоваться в качестве матрицы для РНК или нет. Цепь, которая используется в качестве матрицы, называется нитью матрицы или может также называться антисмысловой цепью. Последовательность оснований на противоположной цепи ДНК называется некодирующей или смысловой цепью.Как только ДНК открылась и РНК-полимераза присоединилась, РНК-полимераза движется вдоль ДНК, добавляя нуклеотиды РНК к растущей цепи мРНК. Матричная цепь ДНК используется для создания мРНК посредством комплементарного спаривания оснований. Когда цепь мРНК завершена, она отделяется от ДНК. В результате получается цепь мРНК, которая почти идентична кодирующей цепи ДНК, с той лишь разницей, что ДНК использует основание тимин, а мРНК использует урацил вместо тимина

.

Процессинг мРНК

У эукариот новая мРНК еще не готова к трансляции.На этом этапе она называется пре-мРНК, и она должна пройти дополнительную обработку, прежде чем покинуть ядро ​​в виде зрелой мРНК. Процессинг может включать сплайсинг, редактирование и полиаденилирование. Эти процессы модифицируют мРНК различными способами. Такие модификации позволяют использовать один ген для создания более чем одного белка.

  • Сплайсинг удаляет интроны из мРНК, как показано на рис. 5.7.3. Интроны  – это области, которые не кодируют белок. Оставшаяся мРНК состоит только из областей, называемых 90 148 экзонами 90 149, которые действительно кодируют белок.Рибонуклеопротеины на схеме – это небольшие белки в ядре, которые содержат РНК и необходимы для процесса сплайсинга.
  • Редактирование изменяет некоторые нуклеотиды в мРНК. Например, человеческий белок под названием APOB, который помогает транспортировать липиды в крови, имеет две разные формы из-за редактирования. Одна форма меньше другой, потому что редактирование добавляет более ранний стоп-сигнал в мРНК.
  • 5′-кэппинг добавляет метилированный кэп к «головке» мРНК.Этот колпачок защищает мРНК от разрушения и помогает рибосомам узнать, где связываться с мРНК
  • .
  • Полиаденилирование добавляет «хвост» к мРНК. Хвост состоит из цепочки As (адениновых оснований). Это сигнализирует об окончании мРНК. Он также участвует в экспорте мРНК из ядра и защищает мРНК от ферментов, которые могут ее разрушить.
Рис. 5.7.3 Препроцессинг мРНК. мРНК требует обработки, прежде чем она покинет ядро.

Перевод  является второй частью центральной догмы молекулярной биологии: РНК Белок .Это процесс, при котором генетический код мРНК считывается для создания белка. Перевод показан на рис. 5.7.4. После того, как иРНК покидает ядро, она перемещается к рибосоме, состоящей из рРНК и белков. Рибосома считывает последовательность кодонов в мРНК, а молекулы тРНК доставляют к рибосоме аминокислоты в правильной последовательности.

Трансляция происходит в три этапа: инициация, удлинение и терминация.

Инициация:

После транскрипции в ядре мРНК выходит через ядерную пору и попадает в цитоплазму.В области мРНК, содержащей метилированный кэп и стартовый кодон, малая и большая субъединицы рибосомы связываются с мРНК. Затем к ним присоединяется тРНК, которая содержит антикодоны, совпадающие со стартовым кодоном мРНК. Эта группа молекул (мРНК, рибосома, тРНК) называется комплексом инициации.

Удлинение:

тРНК продолжают доставлять аминокислоты к растущему полипептиду в соответствии с комплементарным спариванием оснований между кодонами на мРНК и антикодонами на тРНК.Когда тРНК движется в рибосому, ее аминокислота переносится на растущий полипептид. Как только этот перенос завершен, тРНК покидает рибосому, рибосома перемещается на один кодон вниз по мРНК, и входит новая тРНК с соответствующей аминокислотой. Этот процесс повторяется, и полипептид растет.

Завершение :

В конце мРНК кодируется стоп-кодон, который завершает стадию элонгации. Стоп-кодон требует не тРНК, а типа белка, называемого фактором высвобождения, который вызывает расщепление всего комплекса (мРНК, рибосомы, тРНК и полипептида), высвобождая все компоненты.

 

 

Рисунок 5.7.4 Трансляция происходит в три этапа: инициация, удлинение и терминация.

Посмотрите это видео «Синтез белка (обновлено) с сестрами-амебами», чтобы увидеть этот процесс в действии:

Синтез белка (обновлено), Amoeba Sisters, 2018.

После синтеза полипептидной цепи в ней могут происходить дополнительные процессы. Например, он может принимать складчатую форму из-за взаимодействия между его аминокислотами.Он также может связываться с другими полипептидами или с другими типами молекул, такими как липиды или углеводы. Многие белки перемещаются в аппарат Гольджи внутри цитоплазмы, где модифицируются для конкретной работы, которую они будут выполнять.7 Резюме

  • Синтез белка — это процесс, в ходе которого клетки производят белки. Он происходит в два этапа: транскрипция и трансляция.
  • Транскрипция — это перенос генетических инструкций в ДНК на мРНК в ядре. Он включает три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.После процессинга мРНК несет инструкции к рибосоме в цитоплазме.
  • Трансляция происходит на рибосоме, состоящей из рРНК и белков. При трансляции считываются инструкции в мРНК, а тРНК доводит до рибосомы правильную последовательность аминокислот. Затем рРНК помогает образовать связи между аминокислотами, образуя полипептидную цепь.
  • После синтеза полипептидной цепи ее можно подвергнуть дополнительной обработке для формирования готового белка.
  1. Свяжите синтез белка и две его основные фазы с центральной догмой молекулярной биологии.
  2. Объясните, как обрабатывается мРНК до того, как она покинет ядро.
  3. Каким дополнительным процессам может подвергнуться полипептидная цепь после ее синтеза?
  4. Где происходит транскрипция у эукариот?
  5. Где происходит перевод?

Синтез белка, Домашнее животное учителя, 2014.

 

Атрибуция

Рисунок 5.7.1

Николь Рейджер, Национальный научный фонд на Викискладе, как создаются белки, опубликована в открытом доступе (https://en.wikipedia.org/wiki/Public_domain) .

Рисунок 5.7.2

Расшифровка Национального института исследования генома человека (переработанная и векторизованная Сулаем) на Викискладе общедоступна (https://en.wikipedia.org/wiki/Public_domain) .

Рисунок 5.7.3

Обработка мРНК

Кристин Миллер используется в соответствии с лицензией CC BY-NC-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/).

Рисунок 5.7.4

Перевод CNX OpenStax на Викискладе используется по лицензии CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0).

Ссылки

Сестры Амебы. (2018, 18 января) Синтез белка (обновлено).YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=oefAI2x2CQM&feature=youtu.be

Паркер, Н., Шнеегурт, М., Ти Ту, А-Х., Листер, П., Форстер, Б.М. (2016, 1 ноября). Микробиология [онлайн]. Рис. 11.15. Трансляция у бактерий начинается с образования инициирующего комплекса. В Микробиология (Раздел 11-4). ОпенСтакс. https://openstax.org/books/microbiology/pages/11-4-протеин-синтез-перевод

Питомец учителя. (2014, 7 декабря). Синтез белка. YouTube.https://www.youtube.com/watch?v=2zAGAmTkZNY&feature=youtu.be

Белковый синтез

В 1950-х и 1960-х годах стало очевидно, что ДНК необходима для синтеза белков. Белки используются в качестве структурных материалов в клетках и функционируют как ферменты. Кроме того, многие специализированные белки участвуют в клеточной активности. Например, у бактерий жгутики и пили состоят из белка.

Генетический код.  Ключевым элементом белковой молекулы является то, как связаны аминокислоты.Последовательности аминокислот, определяемые генетическими кодами в ДНК, отличают один белок от другого. Генетический код   состоит из последовательности азотистых оснований в ДНК. То, как код азотистых оснований транслируется в последовательность аминокислот в белке, является основой для синтеза белка.

Для синтеза белка должны присутствовать несколько необходимых материалов. Один из них содержит 20 аминокислот, из которых состоит большинство белков. Другим важным элементом является ряд ферментов, которые будут функционировать в процессе.ДНК и другая форма нуклеиновой кислоты, называемая рибонуклеиновой кислотой (РНК) , также необходимы. РНК несет инструкции от ядерной ДНК в цитоплазму, где синтезируется белок. РНК похожа на ДНК, за тремя исключениями. Во-первых, углеводом в РНК является рибоза, а не дезоксирибоза. Во-вторых, нуклеотиды РНК содержат пиримидин урацил , а не тимин. И в-третьих, РНК обычно одноцепочечная.

Типы РНК.  Для синтеза белка необходимы три типа РНК.Первая называется рибосомальная РНК (рРНК) и используется для производства рибосом. Рибосомы  представляют собой ультрамикроскопические частицы рРНК и белка, в которых аминокислоты связаны друг с другом во время синтеза белков. Рибосомы могут располагаться вдоль мембран эндоплазматического ретикулума эукариотических клеток или свободно находиться в цитоплазме прокариотических клеток.

Вторым важным типом РНК является транспортная РНК (тРНК) , которая используется для переноса аминокислот к рибосомам для синтеза белка.Молекулы тРНК существуют в цитоплазме клеток в свободном состоянии. Когда происходит синтез белка, ферменты очень специфично связывают тРНК с аминокислотами.

Третья форма РНК — это информационная РНК (мРНК) , которая получает генетический код от ДНК и переносит его в цитоплазму, где происходит синтез белка. Таким образом, генетический код в ДНК можно использовать для синтеза белка в отдаленном месте на рибосоме. Синтез мРНК, тРНК и рРНК осуществляется ферментом, называемым РНК-полимеразой .

Транскрипция. Транскрипция  является одним из первых процессов в общем процессе синтеза белка. При транскрипции цепь мРНК синтезируется с использованием генетического кода ДНК. РНК-полимераза связывается с участком молекулы ДНК в двойной спирали (другая цепь остается неиспользованной). Фермент перемещается по цепи ДНК и выбирает комплементарные основания из доступных нуклеотидов и позиционирует их в молекуле мРНК в соответствии с принципом комплементарного спаривания оснований (рис. 1 ).Цепочка мРНК удлиняется до тех пор, пока не будет получен стоп-код.

Синтез мРНК с использованием цепочки ДНК в качестве матрицы .

Нуклеотиды нитей ДНК считываются группами по три. Каждый триплет называется кодоном . Таким образом, кодон может быть CGA, или TTA, или GCT, или любой другой комбинацией четырех оснований, в зависимости от их последовательности в цепи ДНК. Молекула мРНК состоит из серии кодонов, полученных из генетического сообщения в ДНК.

После достижения стоп-кодона молекула мРНК покидает молекулу ДНК, а молекула ДНК закручивается, образуя двойную спираль. Тем временем молекула мРНК проходит через клеточную цитоплазму к рибосомам.

Перевод. Трансляция — это процесс, при котором генетический код будет «переведен» в последовательность аминокислот в белке. Процесс начинается с прибытия молекулы мРНК на рибосомы. В процессе синтеза мРНК молекулы тРНК соединялись со своими специфическими аминокислотами в соответствии с активностью специфических ферментов.Затем молекулы тРНК начали транспортировать свои аминокислоты к рибосомам для встречи с молекулой мРНК.

Достигнув рибосомы, молекула мРНК выставляет свои основания в наборах из трех кодонов. У каждого кодона есть комплементарный кодон, называемый антикодоном на молекуле тРНК. Когда кодон молекулы мРНК дополняет антикодон молекулы тРНК, последний помещает конкретную аминокислоту в это положение. Затем обнажается следующий кодон мРНК, и ему сопоставляется комплементарный антикодон молекулы тРНК.Таким образом, аминокислота, переносимая второй молекулой тРНК, располагается рядом с первой аминокислотой, и они соединяются. В этот момент молекулы тРНК высвобождают свои аминокислоты и возвращаются в цитоплазму, чтобы соединиться с новыми молекулами аминокислот.

Затем рибосома перемещается дальше по молекуле мРНК и высвобождает другой кодон, который своим антикодоном притягивает другую молекулу тРНК. Другая аминокислота вводится в положение. Таким образом, аминокислоты продолжают добавляться к растущей цепи до тех пор, пока рибосома не сместится к концу молекулы мРНК.Таким образом, последовательность кодонов в молекуле мРНК определяет последовательность аминокислот в конструируемом белке (рис. 2 ).

Стадии синтеза белка, начиная с генетического кода в ДНК и заканчивая готовой полипептидной цепью .

После того, как белок полностью синтезирован, его удаляют из рибосомы для дальнейшей обработки. Например, белок может храниться в теле Гольджи эукариотической клетки перед высвобождением, или бактерия может высвобождать его в виде токсина.Молекула иРНК распадается, а нуклеотиды возвращаются в ядро. Молекулы тРНК возвращаются в цитоплазму для соединения со свежими молекулами аминокислот, а рибосома ожидает прихода новой молекулы мРНК.

Генный контроль.  Процесс синтеза белка происходит в клетке не постоянно, а с интервалами, за которыми следуют периоды генетического «молчания». Таким образом, процесс экспрессии генов регулируется и контролируется клеткой.

Контроль экспрессии генов может происходить на нескольких уровнях клетки.Например, гены редко работают во время митоза. Другие уровни генного контроля могут иметь место при транскрипции, когда определенные сегменты ДНК увеличиваются и ускоряют активность близлежащих генов. После завершения транскрипции молекула мРНК может быть изменена для регуляции активности гена. Например, было обнаружено, что эукариотическая мРНК содержит много бесполезных фрагментов РНК, которые удаляются при производстве конечной молекулы мРНК. Эти бесполезные фрагменты нуклеиновой кислоты называются интронами .  Оставшиеся фрагменты мРНК, называемые экзонами , затем сплайсируются с образованием конечной молекулы мРНК.Бактериальная мРНК не имеет интронов.

Концепция генного контроля была тщательно исследована на бактериях. У этих микроорганизмов гены были идентифицированы как структурные гены, гены-регуляторы и контрольные области. Эти три единицы образуют функциональную единицу, называемую опероном .

Оперон был детально исследован у некоторых бактерий. Было обнаружено, что некоторые углеводы могут индуцировать присутствие ферментов, необходимых для переваривания этих углеводов.Например, когда присутствует лактоза, бактерии синтезируют ферменты, необходимые для ее расщепления. Лактоза действует как индукторная молекула следующим образом: в отсутствие лактозы ген-регулятор продуцирует белок-репрессор, который связывается с контрольной областью, называемой операторным участком.  Это связывание не позволяет структурным генам кодировать фермент для расщепления лактозы. Однако, когда присутствует лактоза, она связывается с белком-репрессором и тем самым удаляет репрессор в месте действия.Когда операторный сайт свободен, структурные гены высвобождаются для производства своего фермента, расщепляющего лактозу.

Перевод против транскрипции: сходства и различия

Что такое транскрипция?

Транскрипция обычно относится к письменной форме чего-либо. В биологии транскрипция — это процесс, при котором ДНК используется в качестве матрицы для формирования комплементарной цепи РНК — РНК — это «записанная» форма ДНК. Это первая стадия производства белка или потока информации внутри клетки.ДНК хранит генетическую информацию, которая затем переносится в РНК при транскрипции, прежде чем направлять синтез белков при трансляции. Могут образовываться три типа РНК: матричная РНК (мРНК), транспортная РНК (тРНК) и рибосомальная РНК (рРНК).

Транскрипция проходит в четыре стадии: преинициация, инициация, элонгация и терминация. Они отличаются у прокариот и эукариот тем, что у эукариот ДНК хранится в ядре, а у прокариот ДНК хранится в цитоплазме.У эукариот ДНК хранится в плотно упакованном хроматине, который должен быть раскручен, прежде чем может произойти транскрипция. Производство мРНК из РНК у эукариот особенно сложнее, чем у прокариот, и включает несколько дополнительных стадий процессинга.

Преинициация, или матричное связывание, инициируется связыванием σ-субъединицы РНК-полимеразы с промоторной областью , расположенной на 5’-конце цепи ДНК. После этого цепь ДНК денатурируется, разъединяя две комплементарные цепи и позволяя ферменту получить доступ к матричной цепи .Противоположная нить известна как партнерская нить . Промоторные последовательности на цепи ДНК жизненно важны для успешной инициации транскрипции. Промоторные последовательности представляют собой специфические последовательности рибонуклеотидных оснований, составляющих цепь ДНК (аденин, тимин, гуанин и цитозин), и была обнаружена идентичность некоторых из этих мотивов, включая TATAAT и TTGACA у прокариот и TATAAAA и GGCCAATCT у эукариот. Эти последовательности известны как цис- действующих элементов .У эукариот дополнительный фактор транскрипции необходим для облегчения связывания РНК-полимеразы с промоторной областью.

РНК-полимераза

катализирует инициацию, вызывая введение первого комплементарного 5′-рибонуклеозидтрифосфата. Помните, что каждое нуклеотидное основание ДНК имеет комплемент: аденин и тимин, а также гуанин и цитозин. Однако комплементы рибонуклеотидных оснований немного различаются, поскольку РНК не содержит тимин, а содержит урацил, поэтому комплементом аденина является урацил.После введения первого комплементарного 5′-рибонуклеотида последующие комплементарные рибонуклеотиды вставляются в направлении от 5′ к 3′. Эти рибонуклеотиды соединены фосфодиэфирными связями, и на этой стадии молекулы ДНК и РНК все еще связаны (см. рис. 1).

Источник изображения: Википедия

Рисунок 1: Инициация транскрипции. RNAP® относится к РНК-полимеразе.

Удлинение цепи происходит, когда субъединица σ диссоциирует от цепи ДНК, позволяя растущей цепи РНК отделиться от цепи ДНК-матрицы.Этому способствует основной фермент (см. рис. 2).

Источник изображения: Википедия

Рисунок 2: Элонгация при транскрипции

Терминация происходит, когда основной фермент встречает терминационную последовательность , которая представляет собой специфическую последовательность нуклеотидов, которая действует как сигнал для остановки транскрипции. В этот момент транскрипт РНК образует вторичную структуру шпильки , складываясь сам с собой с помощью водородных связей.Терминации у прокариот может способствовать дополнительный фактор терминации, известный как rho(ρ) . Терминация завершается, когда молекула РНК высвобождается из цепи матричной ДНК. У эукариот терминация требует дополнительной стадии, известной как полиаденилирование у эукариот, когда к цепи РНК добавляется хвост из нескольких аденозинмонофосфатов.

Рисунок 3: Основные события на каждой стадии транскрипции

Что такое обратная транскрипция?

Обратная транскрипция — это процесс транскрибирования молекулы ДНК с молекулы РНК.Этот метод репликации используется ретровирусами , такими как ВИЧ, и производит измененную ДНК, которая может быть включена непосредственно в клетку-хозяина, обеспечивая быстрое размножение. Это стало возможным благодаря ферменту обратной транскриптазы . Это видно на рисунке 4.

Источник изображения: Википедия

Рисунок 4: Процесс обратной транскрипции.

Что такое перевод?

Перевод относится к преобразованию чего-либо с одного языка или формы на другой.В биологии трансляция — это процесс, посредством которого матричная рибонуклеиновая кислота или мРНК синтезирует белки — мРНК превращается в белки. Это достигается за счет образования цепочки аминокислот (полипептидной цепи), определяемой химической информацией, хранящейся в конкретной цепи мРНК. Эти полипептиды складываются, образуя белки. Каждая цепь мРНК кодируется другим геном и кодирует другой белок. Это важно для экспрессии генов.

Источник изображения: Wikimedia Commons

Рисунок 5: Триплетный код транслируется в аминокислоты, некоторые аминокислоты кодируют начало и конец трансляции

Трансляция состоит из трех основных стадий: инициации, элонгации и терминации.Они немного различаются у прокариотических и эукариотических организмов: у прокариот трансляция происходит в цитоплазме, а у эукариот трансляция происходит в эндоплазматическом ретикулуме. Существенным для процесса трансляции является рибосома; Структура рибосом также различается у прокариот и эукариот, в основном в отношении скорости миграции их субъединиц при центрифугировании и количества белков, содержащихся в их субъединицах.

Инициация начинается с того, что малая субъединица рибосомы связывается с 5′-концом мРНК, матричной РНК, созданной в результате транскрипции из ДНК.Это происходит в два этапа: малая рибосомная субъединица сначала связывается с несколькими белковыми факторами инициации , прежде чем комбинированная структура связывается с мРНК. Этот сайт связывания находится за несколько рибонуклеотидов до стартового кодона мРНК. После этого заряженная молекула тРНК связывается с малой субъединицей рибосомы. Затем большая субъединица рибосомы связывается с комплексом, образованным малой субъединицей рибосомы, мРНК и тРНК. Этот процесс гидролизует GTP (гуанозин-5′-трифосфат), необходимый для питания связей.После присоединения большой рибосомной субъединицы к комплексу высвобождаются факторы инициации.

Зарядка молекулы тРНК, используемая в процессе трансляции, относится к связыванию молекулы тРНК с аминокислотой. Это происходит в результате действия аминоацил-тРНКсинтетаз , которые реагируют с аминокислотой и АТФ (аденозинтрифосфатом) с образованием реактивной формы аминокислоты, известной как аминоациладениловая кислота . Он связывается с АТФ с образованием комплекса, который может реагировать с молекулой тРНК, образуя ковалентную связь между ними.Теперь тРНК может переносить аминокислоту в молекулу мРНК.

Элонгация начинается, когда и малая, и большая рибосомные субъединицы связываются с мРНК. На молекуле мРНК образуются пептидильный и аминоацильный сайты для дальнейшего связывания с тРНК. Сначала тРНК связывается с Р-сайтом (пептидил-сайт), а удлинение начинается со связыванием второй молекулы тРНК с А-сайтом (аминоацил-сайт). Обе эти молекулы тРНК транспортируют аминокислоты. Фермент, известный как пептидилтрансфераза, высвобождается и образует пептидную связь между аминокислотами, транспортируемыми двумя молекулами тРНК.Ковалентная связь между молекулой тРНК в P-сайте и ее аминокислотой разрывается, и эта тРНК высвобождается в E-сайте (сайте выхода) до того, как она полностью высвобождается из молекулы мРНК. ТРНК, расположенная в сайте А, затем перемещается в сайт Р, используя энергию, вырабатываемую ГТФ. Это оставляет сайт A свободным для дальнейшего связывания, в то время как сайт P содержит молекулу тРНК, присоединенную к аминокислоте, , которая присоединена к другой аминокислоте . Это составляет основу полипептидной цепи.Затем к А-участку присоединяется другая молекула тРНК, и пептидилтрансфераза катализирует образование пептидной связи между этой новой аминокислотой и аминокислотой, присоединенной к тРНК, расположенной в Р-участке. Ковалентная связь между аминокислотой и тРНК в Р-сайте разрывается, и тРНК высвобождается. Этот процесс повторяется снова и снова, добавляя аминокислоты к полипептидной цепи.

Терминация происходит, когда рибосомный комплекс встречает стоп-кодон (см. рис. 5).На этой стадии полипептидная цепь присоединяется к тРНК в P-сайте, а A-сайт не присоединяется. GTP-зависимые факторы высвобождения разрывают связь между конечной тРНК и терминальной аминокислотой. ТРНК высвобождается из рибосомного комплекса, который затем снова расщепляется на малую и большую рибосомные субъединицы, которые высвобождаются из цепи мРНК. Затем эта полипептидная цепь сворачивается сама по себе, образуя белок. Этот процесс показан на рис. 6 и рис. 7.

Источник изображения: Википедия

Рисунок 6: Обзор процесса перевода

Рисунок 7: Основные события на каждом этапе перевода.

Чем перевод отличается от транскрипции?

И транскрипция, и трансляция одинаково важны в процессе потока генетической информации внутри клетки, от генов в ДНК до белков. Ни один процесс не может происходить без другого. Однако в этих процессах есть несколько важных отличий.

Начнем с того, что начальные компоненты транскрипции включают ДНК, основной фермент РНК-полимеразы и σ-субъединицу. Компоненты трансляции включают мРНК, малые и большие субъединицы рибосом, факторы инициации, факторы элонгации и тРНК.При транскрипции двойная спираль ДНК денатурируется, чтобы позволить ферменту получить доступ к цепи матрицы. При трансляции такая денатурация не требуется, поскольку матрица представляет собой одну цепь мРНК. Продуктом транскрипции является РНК, которая может встречаться в форме мРНК, тРНК или рРНК, а продуктом трансляции является полипептидная аминокислотная цепь, образующая белок.

Транскрипция происходит в ядре эукариотических организмов, тогда как трансляция происходит в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме.Оба процесса происходят в цитоплазме прокариот. Фактором, контролирующим эти процессы, является РНК-полимераза при транскрипции и рибосомы при трансляции. При транскрипции эта полимераза перемещается по матричной цепи ДНК, а при трансляции комплекс рибосома-тРНК перемещается по цепи мРНК.

Эти различия приведены в Таблице 1 ниже.

Таблица 1: Различия между транскрипцией и трансляцией

  Транскрипция Перевод
Компоненты ДНК, коровый фермент РНК-полимеразы, σ-субъединица мРНК, малая и большая субъединицы рибосомы, факторы инициации, факторы элонгации, тРНК
Шаблон ДНК мРНК
Конечный продукт РНК Белок
Местоположение (эукариоты/прокариоты) Ядро/цитоплазма Эндоплазматический ретикулум/цитоплазма
Контролирующий фактор РНК-полимераза Рибосомы
Действие РНК-полимераза реагирует с матричной цепью ДНК Рибосомный комплекс взаимодействует с цепью мРНК

Несмотря на свою мощь, ДНК так же хороша, как и ее продукты.Именно по этой причине так важны процессы транскрипции и трансляции. Для бесперебойной работы клеточных процессов как последовательности ДНК, так и их продукты должны работать по плану. Именно здесь транскрипция и трансляция вступают в игру и выполняют жизненно важную функцию ДНК.

Давайте применим все на практике. Попробуйте этот практический вопрос по биологии:

Ищете больше практики биологии?

Ознакомьтесь с другими нашими статьями по биологии.

Вы также можете найти тысячи практических вопросов на Albert.io. Albert.io позволяет вам настроить свой учебный процесс так, чтобы он нацеливался на практику, в которой вам больше всего нужна помощь. Мы дадим вам сложные практические вопросы, которые помогут вам достичь мастерства в биологии.

Начните тренироваться здесь .

Вы учитель или администратор, заинтересованный в повышении успеваемости учащихся по биологии?

Узнайте больше о наших школьных лицензиях здесь .

3.4 Синтез белков — анатомия и физиология

Цели обучения

К концу этого раздела вы сможете:

  • Объяснять, как генетический код, хранящийся в ДНК, определяет белок, который будет формироваться
  • Опишите процесс транскрипции
  • Опишите процесс перевода
  • Обсудите функцию рибосом

Ранее упоминалось, что ДНК обеспечивает «чертеж» клеточной структуры и физиологии.Это относится к тому факту, что ДНК содержит информацию, необходимую клетке для построения одного очень важного типа молекулы: белка. Большинство структурных компонентов клетки состоит, по крайней мере частично, из белков, и практически все функции, которые выполняет клетка, выполняются с помощью белков. Одним из наиболее важных классов белков являются ферменты, которые помогают ускорить необходимые биохимические реакции, протекающие внутри клетки. Некоторые из этих критических биохимических реакций включают построение более крупных молекул из более мелких компонентов (например, при репликации ДНК или синтезе микротрубочек) и расщепление более крупных молекул на более мелкие компоненты (например, при извлечении химической энергии из молекул питательных веществ).Каким бы ни был клеточный процесс, в нем почти наверняка участвуют белки. Точно так же, как геном клетки описывает ее полный набор ДНК, протеом клетки представляет собой полный набор белков. Синтез белка начинается с генов. Ген — это функциональный сегмент ДНК, который обеспечивает генетическую информацию, необходимую для построения белка. Каждый конкретный ген обеспечивает код, необходимый для конструирования определенного белка. Экспрессия генов, которая преобразует информацию, закодированную в гене, в конечный продукт гена, в конечном итоге определяет структуру и функцию клетки, определяя, какие белки производятся.

Интерпретация генов работает следующим образом. Напомним, что белки представляют собой полимеры или цепочки из множества строительных блоков аминокислот. Последовательность оснований в гене (то есть его последовательность нуклеотидов A, T, C, G) транслируется в последовательность аминокислот. Триплет — это участок из трех последовательных оснований ДНК, кодирующий определенную аминокислоту. Подобно тому, как трехбуквенный код d-o-g сигнализирует об изображении собаки, трехбуквенный базовый код ДНК сигнализирует об использовании определенной аминокислоты.Например, триплет ДНК CAC (цитозин, аденин и цитозин) определяет аминокислоту валин. Таким образом, ген, состоящий из нескольких триплетов в уникальной последовательности, обеспечивает код для построения целого белка с несколькими аминокислотами в правильной последовательности ([ссылка]). Механизм, с помощью которого клетки превращают код ДНК в белковый продукт, представляет собой двухстадийный процесс с молекулой РНК в качестве промежуточного звена.

Фигура 3,25 Генетический код ДНК содержит всю генетическую информацию, необходимую для построения клеточных белков.Нуклеотидная последовательность гена в конечном итоге транслируется в аминокислотную последовательность соответствующего белка гена.

От ДНК к РНК: транскрипция

ДНК находится в ядре, а синтез белка происходит в цитоплазме, поэтому должен быть какой-то промежуточный мессенджер, который покидает ядро ​​и управляет синтезом белка. Этот промежуточный мессенджер представляет собой матричную РНК (мРНК), одноцепочечную нуклеиновую кислоту, которая несет копию генетического кода для одного гена из ядра в цитоплазму, где она используется для производства белков.

Существует несколько различных типов РНК, каждый из которых выполняет различные функции в клетке. Структура РНК похожа на ДНК, за некоторыми небольшими исключениями. Во-первых, в отличие от ДНК, большинство типов РНК, включая мРНК, являются одноцепочечными и не содержат комплементарных цепей. Во-вторых, сахар рибозы в РНК содержит дополнительный атом кислорода по сравнению с ДНК. Наконец, вместо основания тимина РНК содержит основание урацил. Это означает, что аденин всегда будет соединяться с урацилом в процессе синтеза белка.

Экспрессия генов начинается с процесса, называемого транскрипцией, который представляет собой синтез цепи мРНК, комплементарной интересующему гену. Этот процесс называется транскрипцией, потому что мРНК подобна расшифровке или копии кода ДНК гена. Транскрипция начинается примерно так же, как репликация ДНК, в том смысле, что участок ДНК раскручивается и две нити разделяются, однако разделяется только небольшая часть ДНК. Триплеты внутри гена на этом участке молекулы ДНК используются в качестве матрицы для транскрипции комплементарной цепи РНК ([ссылка]).Кодон представляет собой последовательность мРНК из трех оснований, названную так потому, что они непосредственно кодируют аминокислоты. Как и в репликации ДНК, в транскрипции есть три стадии: инициация, элонгация и терминация.

Фигура 3,26 Транскрипция: с ДНК на мРНК На первом из двух этапов создания белка из ДНК ген на молекуле ДНК транскрибируется в комплементарную молекулу мРНК.

Этап 1: Инициация. Область в начале гена, называемая промотором, — определенная последовательность нуклеотидов — запускает начало транскрипции.

Стадия 2: Удлинение. Транскрипция начинается, когда РНК-полимераза раскручивает сегмент ДНК. Одна цепь, называемая кодирующей цепью, становится матрицей с кодируемыми генами. Затем полимераза выравнивает правильную нуклеиновую кислоту (A, C, G или U) с ее комплементарным основанием на кодирующей цепи ДНК. РНК-полимераза — это фермент, добавляющий новые нуклеотиды к растущей цепи РНК. Этот процесс строит цепь мРНК.

Этап 3: Прекращение. В конце гена последовательность нуклеотидов, называемая терминаторной последовательностью, заставляет новую РНК сворачиваться сама на себя.Эта складка заставляет РНК отделяться от гена и от РНК-полимеразы, заканчивая транскрипцию.

Прежде чем молекула мРНК покинет ядро ​​и приступит к синтезу белка, она модифицируется несколькими способами. По этой причине на этой стадии ее часто называют пре-мРНК. Например, ваша ДНК и, следовательно, комплементарная мРНК содержат длинные области, называемые некодирующими областями, которые не кодируют аминокислоты. Их функция до сих пор остается загадкой, но процесс, называемый сплайсингом, удаляет эти некодирующие области из транскрипта пре-мРНК ([ссылка]).Сплайсосома — структура, состоящая из различных белков и других молекул — присоединяется к мРНК и «сращивает» или вырезает некодирующие области. Удаленный сегмент транскрипта называется интроном. Остальные экзоны склеены вместе. Экзон — это участок РНК, который остается после сплайсинга. Интересно, что некоторые интроны, удаленные из мРНК, не всегда являются некодирующими. При сплайсинге разных кодирующих областей мРНК в конечном итоге получаются разные вариации белка с различиями в структуре и функциях.Этот процесс приводит к гораздо большему разнообразию возможных белков и белковых функций. Когда транскрипт мРНК готов, он выходит из ядра в цитоплазму.

Фигура 3,27 Сплайсинг ДНК В ядре структура, называемая сплайсосомой, вырезает интроны (некодирующие области) в транскрипте пре-мРНК и повторно соединяет экзоны.

От РНК к белку: перевод

Подобно переводу книги с одного языка на другой, кодоны на цепи мРНК должны быть переведены в аминокислотный алфавит белков.Трансляция — это процесс синтеза цепочки аминокислот, называемой полипептидом. Перевод требует двух основных вспомогательных средств: во-первых, «переводчика», молекулы, которая будет осуществлять перевод, и, во-вторых, субстрата, на котором цепь мРНК транслируется в новый белок, наподобие «стола» переводчика. Оба эти требования выполняются другими типами РНК. Субстратом, на котором происходит трансляция, является рибосома.

Помните, что многие клеточные рибосомы связаны с шероховатым ЭР и осуществляют синтез белков, предназначенных для аппарата Гольджи.Рибосомальная РНК (рРНК) представляет собой тип РНК, который вместе с белками составляет структуру рибосомы. Рибосомы существуют в цитоплазме в виде двух отдельных компонентов: малой и большой субъединиц. Когда молекула мРНК готова к трансляции, две субъединицы собираются вместе и присоединяются к мРНК. Рибосома обеспечивает субстрат для трансляции, объединяя и выравнивая молекулу мРНК с молекулярными «переводчиками», которые должны расшифровать ее код.

Другим важным требованием для синтеза белка являются молекулы-трансляторы, которые физически «считывают» кодоны мРНК.Транспортная РНК (тРНК) — это тип РНК, который переносит соответствующие аминокислоты к рибосоме и присоединяет каждую новую аминокислоту к последней, строя полипептидную цепь одну за другой. Таким образом, тРНК переносит определенные аминокислоты из цитоплазмы на растущий полипептид. Молекулы тРНК должны уметь распознавать кодоны на мРНК и сопоставлять их с правильной аминокислотой. ТРНК модифицирована для этой функции. На одном конце его структуры находится сайт связывания определенной аминокислоты.На другом конце находится последовательность оснований, которая соответствует кодону, определяющему конкретную аминокислоту. Эта последовательность из трех оснований молекулы тРНК называется антикодоном. Например, тРНК, ответственная за перемещение аминокислоты глицина, содержит сайт связывания глицина на одном конце. На другом конце он содержит антикодон, который дополняет кодон глицина (GGA является кодоном для глицина, поэтому антикодон тРНК будет читаться как CCU). Оснащенная особым грузом и соответствующим антикодоном, молекула тРНК может считывать свой распознанный кодон мРНК и доставлять соответствующую аминокислоту в растущую цепь ([ссылка]).

Фигура 3,28 Перевод с РНК на белок Во время трансляции транскрипт мРНК «читается» функциональным комплексом, состоящим из молекул рибосомы и тРНК. тРНК привносят соответствующие аминокислоты в последовательность растущей полипептидной цепи, сопоставляя их антикодоны с кодонами на цепи мРНК.

Подобно процессам репликации и транскрипции ДНК, трансляция состоит из трех основных стадий: инициации, элонгации и терминации.Инициация происходит при связывании рибосомы с транскриптом мРНК. Стадия элонгации включает в себя узнавание антикодона тРНК со следующим кодоном мРНК в последовательности. Как только последовательности антикодона и кодона связаны (помните, что они являются комплементарными парами оснований), тРНК представляет свой аминокислотный груз, и растущая полипептидная цепь присоединяется к этой следующей аминокислоте. Это присоединение происходит с помощью различных ферментов и требует энергии. Затем молекула тРНК высвобождает цепь мРНК, цепь мРНК сдвигает один кодон в рибосоме, и появляется следующая подходящая тРНК с соответствующим антикодоном.Этот процесс продолжается до тех пор, пока не будет достигнут последний кодон на мРНК, который обеспечивает сообщение «стоп», сигнализирующее о прекращении трансляции и запускающем высвобождение полного, вновь синтезированного белка. Таким образом, ген внутри молекулы ДНК транскрибируется в мРНК, которая затем транслируется в белковый продукт ([ссылка]).

Фигура 3,29 От ДНК к белку: транскрипция через трансляцию Транскрипция внутри клеточного ядра производит молекулу мРНК, которая модифицируется и затем отправляется в цитоплазму для трансляции.Транскрипт декодируется в белок с помощью рибосомы и молекул тРНК.

Обычно транскрипция мРНК транслируется одновременно несколькими соседними рибосомами. Это повышает эффективность синтеза белка. Одна рибосома может транслировать молекулу мРНК примерно за одну минуту; таким образом, несколько рибосом на борту одного и того же транскрипта могут производить в несколько раз больше одного и того же белка в одну и ту же минуту. Полирибосома представляет собой цепочку рибосом, транслирующих одну цепь мРНК.

Интерактивная ссылка

Посмотрите это видео, чтобы узнать о рибосомах. Рибосома связывается с молекулой мРНК, чтобы начать трансляцию ее кода в белок. Что происходит с малой и большой субъединицами рибосомы в конце трансляции?

Транскрипция ДНК – Стадии – Обработка

Транскрипция ДНК — это процесс, при котором генетическая информация, содержащаяся в ДНК, перезаписывается в информационную РНК (мРНК) с помощью РНК-полимеразы .Затем эта мРНК выходит из ядра, где она действует как основа для трансляции ДНК. Контролируя выработку мРНК в ядре , клетка регулирует скорость экспрессии генов.

В этой статье мы рассмотрим процесс транскрипции ДНК, включая посттранскрипционную модификацию мРНК и ее значение.

РНК против ДНК

РНК, как и ДНК, представляет собой полимер из трех субъединиц, соединенных фосфодиэфирными связями .Однако, как подробно показано в таблице ниже, существуют ключевые различия в мономерных звеньях для каждого соединения.

ДНК РНК
Сахар Дезоксирибоза Рибоза
Основания Аденин, гуанин, цитозин, тимин Аденин, гуанин, цитозин, урацил
Структура Двойная спираль Одноцепочечная спираль
Рис.1 — Сравнение ДНК и РНК

Стадии транскрипции

Процесс транскрипции ДНК можно разделить на 3 основных этапа: инициация, элонгация и терминация. Эти шаги также участвуют в репликации ДНК.

Посвящение

Транскрипция катализируется ферментом РНК-полимеразой , который прикрепляется к молекуле ДНК и перемещается вдоль нее до тех пор, пока не распознает промоторную последовательность . Эта область ДНК указывает на начальную точку транскрипции, и в молекуле ДНК может быть несколько промоторных последовательностей. Факторы транскрипции представляют собой белки, контролирующие скорость транскрипции; они также связываются с последовательностями промотора с помощью РНК-полимеразы.

После связывания с последовательностью промотора РНК-полимераза раскручивает часть двойной спирали ДНК, обнажая основания на каждой из двух цепей ДНК.

Удлинение

Одна цепь ДНК ( матричная цепь ) считывается в направлении от 3′ к 5′ и, таким образом, обеспечивает матрицу для новой молекулы мРНК.Другая цепь ДНК называется кодирующей цепью . Это связано с тем, что его последовательность оснований идентична синтезированной мРНК, за исключением замены тиаминовых оснований урацилом .

РНК-полимераза

использует входящие рибонуклеотидов для формирования новой цепи мРНК. Он делает это, катализируя образование фосфодиэфирных связей между соседними рибонуклеотидами, используя комплементарное спаривание оснований (от A до U, от T до A, от C до G и от G до C).Основания могут быть добавлены только к 3′-концу (три штриха), поэтому цепь удлиняется в направлении от 5′ к 3′ .

Завершение Элонгация

продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не встретит стоп-последовательность . В этот момент транскрипция останавливается, и РНК-полимераза высвобождает матрицу ДНК.

Рис. 2 — 3 стадии транскрипции

Претрансляционный процессинг мРНК

мРНК, которая была транскрибирована до этого момента, называется пре-мРНК .Обработка должна произойти, чтобы преобразовать это в зрелых мРНК. Сюда входят:

5-футовая крышка Кэппинг

описывает добавление метилированного гуанинового кэпа к 5′-концу мРНК. Его присутствие необходимо для распознавания молекулы рибосомами и для защиты незрелой молекулы от деградации РНКазами.

Полиаденилирование Полиаденилирование

описывает добавление поли(А)-хвоста к 3′-концу мРНК.Поли(А)-хвост состоит из нескольких молекул аденозинмонофосфата. Это стабилизирует РНК, что необходимо, поскольку РНК гораздо более нестабильна, чем ДНК.

Сращивание

Сплайсинг позволяет генетической последовательности одной пре-МРНК кодировать множество различных белков, сохраняя генетический материал. Этот процесс зависит от последовательности и происходит внутри транскрипта. В него входит:

  • Удаление интронов (некодирующих последовательностей) путем вырезания сплайсосом
  • Соединение экзонов (кодирующая последовательность) путем лигирования
Рис.3 — Посттранскрипционная модификация пре-МРНК

К концу транскрипции образовалось зрелых мРНК . Это действует как система обмена сообщениями, позволяющая осуществлять трансляцию и синтез белка.

Внутри зрелой мРНК находится открытая рамка считывания (ORF). Этот регион будет преобразован в белок. Он транслируется блоками из трех нуклеотидов, называемыми кодонами. На 5’- и 3’-концах также находится нетранслируемых областей (UTR). Они не транслируются во время синтеза белка.

[старт-клинический]

Клиническая значимость — Фенилкетонурия (ФКУ)

ФКУ возникает из-за замены одной пары оснований (G на A) в ферменте фенилаланингидроксилазе. Это приводит к пропуску интронов и образованию нестабильной мРНК. ФКУ является одним из нескольких генетических состояний, на наличие которых у младенцев проверяют с помощью теста на каплю крови новорожденного (укол из пятки).

Лица с фенилкетонурией накапливают фенилаланина в тканях, плазме и моче.Фенилкетоны также обнаруживаются в их моче. Это приводит к умственной отсталости, задержке развития, микроцефалии, судорогам и гипопигментации.

Лечение включает в себя соблюдение диеты с низким содержанием фенилаланина и отказ от продуктов с высоким содержанием белка, таких как мясо, молоко и яйца.

Рис. 4. Укол в пятку на фенилкетонурию

[конечный клинический]

Зависимость транскрипции от клеточного цикла преобладает над шумом в экспрессии генов

Abstract

Большая вариабельность уровней мРНК и белка, обнаруженная как при статических, так и при динамических измерениях в отдельных клетках, в значительной степени объясняется случайными периодами транскрипции, часто происходящими вспышками.Клеточный цикл играет ярко выраженную глобальную роль в воздействии на выход транскрипции и трансляции, но как это влияет на статистику транскрипции от шумных промоторов, неизвестно и обычно игнорируется современными стохастическими моделями. Здесь мы показываем, что в вариабельной транскрипции с синтетического промотора tetO в S. cerevisiae преобладает ее зависимость от клеточного цикла. Измерения флуоресцентного белка в режиме реального времени при высоких уровнях экспрессии показывают, что промоторы tetO увеличивают скорость транскрипции примерно в 2 раза в S/G2/M, подобно конститутивным генам.При низких уровнях экспрессии, когда считается, что промоторы tetO генерируют нечастые всплески транскрипции, мы наблюдаем случайные импульсы экспрессии, ограниченные S/G2/M, которые коррелируют между гомологичными промоторами, присутствующими в одной и той же клетке. Анализ статических измерений мРНК одиночных клеток в разные моменты клеточного цикла подтверждает эти данные. Наши результаты показывают, что очень изменчивые распределения мРНК у дрожжей являются не только результатом случайного переключения между периодами активной и неактивной экспрессии генов, но и в значительной степени обусловлены различиями в транскрипционной активности между G1 и S/G2/M.

Резюме автора

Существует поразительное количество вариаций количества мРНК и белковых молекул, генерируемых определенными генами между генетически идентичными одиночными клетками, выращенными в одной и той же среде. В частности, для мРНК большая вариация, наблюдаемая в этих «шумных» генах, согласуется с идеей всплеска транскрипции, когда транскрипция происходит в случайные, прерывистые периоды высокой активности. Существует значительная экспериментальная поддержка всплеска транскрипции, и это основная черта стохастических моделей экспрессии генов, которые объясняют изменчивость.Тем не менее уже давно признано, что вариации, особенно в уровне белка, могут возникать из-за глобальных различий между генетически идентичными клетками. Мы показываем, что у почкующихся дрожжей вариации мРНК в значительной степени обусловлены различиями в транскрипционной активности шумного гена между разными фазами клеточного цикла. Эти различия не связаны со специфической регуляцией клеточного цикла, и в некоторых случаях транскрипция кажется ограниченной определенными фазами, что приводит к импульсам продукции мРНК.Эти результаты поднимают новые вопросы о происхождении всплесков транскрипции и о том, как статистика экспрессии генов глобально регулируется клеточным циклом.

Образец цитирования: Зопф С.Дж., Куинн К., Зейдман Дж., Махешри Н. (2013) Зависимость транскрипции от клеточного цикла преобладает над шумом в экспрессии генов. PLoS Comput Biol 9(7): е1003161. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161

Редактор: Джейн Кондев, Университет Брандейса, США

Получено: 8 января 2013 г.; Принято: 14 июня 2013 г.; Опубликовано: 25 июля 2013 г.

Авторское право: © 2013 Zopf et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Эта работа финансировалась стипендией Monash Graduate Fellowship (для KQ) и GM095733, BBBE 103316 и стартовыми фондами MIT (для NM). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

На уровне отдельных клеток уровни мРНК и белков регулируемых генов часто сильно варьируют [1]–[5]. Полученные распределения мРНК и белков с длинными хвостами хорошо описываются стохастическими моделями [1], [5]–[7] всплесков транскрипции, где промотор подвергается случайным и прерывистым периодам высокоактивной транскрипции.Наблюдения за транскрипцией в реальном времени у многих организмов согласуются с таким поведением [5], [8]–[14]. Т.о., как статические, так и динамические взгляды приписывают большую часть наблюдаемой изменчивости мРНК стохастической природе реакций, присущих транскрипции. Следовательно, стандартная стохастическая модель экспрессии генов широко использовалась для определения стационарной динамики [1], [2], [15]–[17].

Однако более ранние исследования, изучающие происхождение изменчивости экспрессии белков, показали, что такая изменчивость обусловлена ​​не только стохастичностью реакций, присущих экспрессии генов, но и внешними факторами.Это было сделано путем поиска корреляций в экспрессии между идентичными копиями одного промотора [18]–[20] и/или между этим промотором и глобальным или специфичным для пути геном [21], [22]. Мало того, что важность внешних факторов ясна, без измерений временных рядов собственный шум, измеренный этими методами, не может быть полностью приписан стохастическим реакциям в экспрессии генов [23], [24]. Хотя предполагается, что глобальные внешние факторы в значительной степени влияют на трансляцию [1], их влияние на транскрипцию и разрывы транскрипции неясно.

Клеточный цикл оказывает глобальное влияние на синтез общего белка и РНК, что должно играть роль в транскрипции [12], [20], [25]. За немногими исключениями [20], большинство детерминированных и стохастических моделей регуляции генов не учитывают изменчивость клеточного цикла. Используя как динамические измерения белка в режиме реального времени, так и статические измерения мРНК отдельных молекул в отдельных клетках, мы показываем, что большая часть вариабельности синтетического промотора tetO, типичного для шумных генов у дрожжей, обусловлена ​​различиями в скорости транскрипции между G1 и S/G2/M. .

Результаты

Мы изучили эффекты, зависящие от клеточного цикла, путем микроскопического мониторинга экспрессии флуоресцентного белка каждые 5 минут в растущих монослоях дрожжей в микрожидкостной камере. Мы использовали «3-цветный» диплоидный штамм дрожжей с гомологичными промоторами 7xtetO (P 7xtetO ), управляющими либо Cerulean (CFP), либо Venus (YFP), и конститутивным промотором PGK1 (P PGK1 ), управляющим tdTomato ( РФП) (рис. 1А). Корреляции транскрипционной активности между разными промоторами позволили различать разные источники флуктуаций [20], [22].Мы разработали метод определения мгновенной скорости транскрипции и продукции белка в отдельных клетках на основе микроскопических фильмов. Мы сегментируем клетки (рис. 1B), определяем время почкования, отслеживаем клеточные линии и создаем временные ряды для объема и концентрации белка (измеряемые по средней флуоресценции, рис. 1C и D), аналогично [26], [27]. Две новые функции нашего анализа позволили нам идентифицировать переходы в состоянии транскрипции из этих временных рядов: точное определение цитокинеза (рис. S1) и использование сплайнов для стабильной оценки первой и второй производных по времени (текст S1).Произведение объема и временного ряда концентрации белка дает общий белок, P ( t ) (рис. 1E), из которого мы делаем вывод о скорости продукции белка (пропорционально мРНК на клетку, M ( t ) ) (рис. 1F) и скорость транскрипции, A ( t ) (рис. 1G) с использованием системы двух дифференциальных уравнений, описывающих транскрипцию и трансляцию (методы). Расчетная мгновенная скорость транскрипции для одной клетки (рис. 1G) представляет собой скорость, сглаженную в течение 15–20 минут (из-за ошибок измерения и подбора сплайна) и задержанную на 10–15 минут из-за созревания флуорофора (текст S1).

Рис. 1. Мгновенная скорость транскрипции рассчитана по временным рядам флуоресценции одиночных клеток.

(A) В трехцветном диплоидном штамме тет-транс-активатор (tTA), экспрессируемый из P MYO2 , активирует P 7xtetO и подавляется доксициклином. Гомологичные копии P 7xtetO управляют экспрессией либо CFP , либо YFP , тогда как P PGK1 конститутивно управляет экспрессией RFP .(B) Мониторинг роста отдельных клеток в микрожидкостной культуре. Сегментированные материнская клетка, дочерняя клетка и смежные области целой клетки выделены синим, зеленым и красным цветом соответственно. Для матери и ее дочерей (C) необработанный объем и (D) временные ряды концентрации CFP были сглажены, чтобы удалить шум измерения; (E) интегрированная флуоресценция CFP была рассчитана как их произведение (соответствующие области показаны на B). Сумма значений зародыша и материнской клетки до деления составляет полную клеточную трассу, которая при расширении после деления дает текущую общую трассу, которая соответствует дифференцируемому сглаживающему сплайну.(F) Расчетные относительные уровни мРНК и (G) мгновенная скорость транскрипции.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.g001

Чтобы изучить влияние фазы клеточного цикла на экспрессию, мы сопоставили данные о росте и экспрессии с учетом хода клеточного цикла. Мы разделили данные временных рядов отдельных клеток между событиями деления, синхронизировали данные по времени образования почек и изменили масштаб времени таким образом, чтобы фазы до и после появления почек соответствовали среднему времени популяции в этих фазах.Таким образом, деление происходит в 0 и 1, и все следы отпочковываются в одном и том же ходе клеточного цикла (рис. S2). В то время как концентрация репортеров почти не меняется в течение всего цикла (рис. 2А), клетки демонстрируют фазу медленного роста вплоть до образования почек, соответствующих G1 и очень раннему S, за которым следует более быстрый рост в S/G2/M (рис. 2B), что соответствует с [27], [28]. Мгновенная скорость продукции белка также имеет два режима, но отстает от мгновенной скорости роста (рис. 2С). Напротив, мгновенная скорость транскрипции и роста коррелирует, приблизительно удваивая S/G2 по сравнению с G1 (рис.2Д). Это не опровергает наблюдения о том, что общая скорость продукции белка коррелирует со средней скоростью роста [29] (рис. S3). Постепенное повышение скорости транскрипции в течение примерно 30 минут может маскировать более резкое изменение из-за сглаживания и созревания репортеров (рис. S4). Эти результаты устойчивы к изменениям средней скорости роста клеток (рис. 2E и рис. S5) и сохраняются даже без времени масштабирования (рис. S2).

Рис. 2. Мгновенная скорость транскрипции в одиночных дрожжевых клетках коррелирует с ростом в течение клеточного цикла.

Данные по отдельным клеткам группировались по ходу клеточного цикла и усреднялись. (A) Из-за небольшого (<10%) снижения концентрации CFP в течение клеточного цикла (B) общий CFP быстро увеличивается с увеличением объема после образования почек, аналогично [27], но с несколько иной скоростью. (C) Средние мгновенные скорости роста и производства белка ниже в G1 и достигают пика в S/G2/M. Мгновенная скорость транскрипции P 7xtetO и P PGK1 коррелирует с мгновенной скоростью роста в (D) 2% глюкозе (N = 171 клеточный цикл/бин) и (E) 2% раффинозе (N = 246 клеточных циклов/бин).Средние значения транскрипции YFP и RFP были нормализованы к среднему уровню транскрипции CFP в глюкозе (D). Столбики погрешностей представляют собой интервал SEM от начальной загрузки. Пунктирные линии обозначают бин s.d.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.g002

Затем мы добавили 50 нг/мл dox, чтобы снизить экспрессию P 7xtetO в трехцветном диплоиде до уровней, при которых транскрипция, как считается, происходит в редких случаях. , независимые всплески в каждом локусе, которые предположительно можно разрешить с помощью анализа в реальном времени.Следы скорости транскрипции одиночных клеток показывают случайные периоды «включения» (Fig. S6), которые ограничены S/G2, обычно начинаются в течение 20 минут после образования почки и продолжаются до деления (Fig. 3A). Если обе копии P 7xtetO включаются, >70% времени они делают это в пределах 15 минут друг от друга (Fig. 3B). Периоды «включения» не являются независимыми (p<10 -5 , тест χ 2 ; ρ = 0,42) в каждом локусе (рис. 3C). Эти результаты находятся в разительном контрасте с представлением о всплесках транскрипции как об внутренне обусловленном экспоненциальном времени между поступлениями [1], [4], [8], [30].

Рисунок 3. Всплески транскрипции из гомологичных локусов зависят от клеточного цикла и частично коррелируют.

3-цветный диплоидный штамм был выращен в микрофлюидике с 50 нг/мл dox, снижая экспрессию P 7xtetO . (A) Вероятность того, что скорость транскрипции каждого P 7xtetO выше фона (текст S1), рассчитанная путем усреднения бинарных ответов отдельных клеток (ON = 1 или OFF = 0) в каждой ячейке прогрессии клеточного цикла, увеличивается после Г1. (B) 2D-гистограмма времени активации для каждого промотора, когда активируются оба (t = 0 при почковании).Большая часть активации происходит в период почкования и коррелирует. (C) Классификация всех одноклеточных периодов S/G2/M (из (A) плюс периоды, следующие за ненаблюдаемым G1) по тому, активируется ли каждый P 7xtetO , выявляет корреляции в спорадической экспрессии. Столбики погрешностей представляют собой SEM из начальной загрузки.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.g003

Мы искали дополнительную поддержку для этих наблюдений в реальном времени, используя флуоресцентную гибридизацию мРНК одиночной молекулы мРНК на месте (FISH), чтобы выяснить, как количество мРНК в отдельных клетках варьируется в зависимости от фазы клеточного цикла, классифицируется на основе наличия и размера почки (методы).На фиг. 4A и B показано распределение мРНК из клеток с P 1xtetO и P 7xtetO , но без активатора (базовая экспрессия). Распределения G1 имеют нулевой пик с длинным хвостом, который исчезает к началу S, предполагая, что транскрипция не происходит в G1, что согласуется с рис. 3A. Прогрессирование через S/G2/M приводит к унимодальному распределению с ненулевым пиком в G2/M, согласующемся с наблюдениями в реальном времени (рис. 3B), что указывает на то, что время, когда неактивный промотор включается в S/G2, является переменным.При промежуточной экспрессии также наблюдается повышенная активность в S/G2/M, но распределение G1 качественно отличается: ненулевой пик указывает на то, что транскрипция теперь происходит в G1 (рис. 4C&D). Однако низкая транскрипционная активность не означает неактивности G1. Слабый, но конститутивный промотор DOA1 (P DOA1 ) [31] имеет ненулевой пик G1 даже при низких уровнях мРНК (рис. 4Е).

Рисунок 4. Большие различия в транскрипционной активности между S/G2/M и G1 зависят от промотора.

(A) Распределение мРНК YFP у гаплоидных дрожжей с интегрированным P 1xtetO -YFP и без tTA показано в столбце в зависимости от фазы клеточного цикла. Горизонтальные линии над каждым распределением представляют собой экспериментальное (серое) и прогнозируемое среднее/стандартное отклонение для различных моделей с цветами, показанными в легенде внизу, рассчитанные, исходя из предположения, что каждая фаза бутонов представляет 1/3 от S/G2/M. (B) То же, что и в (A), но с P 7xtetO . (C и D) То же, что и в (A и B), но с добавлением tTA и 100 или 500 нг/мл dox для P 1xtetO и P 7xtetO соответственно.(E) Интегрированный P DOA1 -YFP с нативным DOA1 , экспрессированным из плазмиды. Анализировали клетки средней логарифмической фазы. (F) То же, что и в (E), но клетки с поздней логарифмической фазой.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.g004

В то время как общее распределение мРНК прекрасно соответствует отрицательному биномиальному предсказанию стандартной модели [1], [32] (рис. 4), разделение данные по фазам клеточного цикла показывают, что они неверны. Мы стремились понять, в какой степени общая изменчивость может быть объяснена моделью с постоянной скоростью транскрипции, которая увеличилась в f раз между G1 и S/G2/M (текст S1).Когда f = 2 , как и ожидалось, на основе репликации S-фазы, модель качественно описывает развитие наблюдаемых распределений для P DOA1 (рис. 4E и F, таблица S3, рис. S7). Однако f>2 лучше описывает измерения промотора tetO, с f >100 для базовой экспрессии, что согласуется с отсутствием транскрипции G1 (рис. 4A-D, рис. S7). Тем не менее, шумные промоторы tetO имеют более вариабельную транскрипцию, чем может генерировать эта модель. Данные о белке в режиме реального времени (рис.S6) также указывают на вариабельность количества мРНК, продуцируемой в S/G2/M. Включение этой изменчивости путем рандомизации времени перехода скорости транскрипции в модель дает прогнозы, которые хорошо согласуются с P 1/7xtetO , но не с P DOA1 (рис. S8, текст S1). Изображения мРНК FISH для промоторов tetO, как правило, имеют яркие пятна, которые, как считается, представляют зарождающуюся транскрипцию мРНК, которые более вероятны в S / G2 / M (рис. S9) и могут указывать на «взрывную» экспрессию как еще один источник изменчивости.

Наконец, мы спросили, влияет ли фаза клеточного цикла на кинетику активации генов, измерив время активации P 1xtetO и P 7xtetO в ответ на ступенчатое изменение входа фактора транскрипции (TF). Поскольку пути регуляции TF в отдельных клетках могут реагировать на химические индукторы, такие как dox, медленно и в разное время [33], мы разработали «кинетический» штамм, в котором активация TF наблюдалась в его ядерной локализации. ТФ Pho4p локализуется в ядре в ответ на низкий уровень фосфатов [34].Реинжиниринг фосфатного пути (текст S1) позволяет быстро и обратимо контролировать слияние Pho4-tetR-YFP, способное активировать P 1/7xtetO -CFP, путем переключения концентрации фосфата (рис. 5A) с минимальным влиянием на рост клеток (рис. 5A). С10).

Рисунок 5. Активация генов зависит от фазы цикла.

P 1xtetO и P 7xtetO были активированы на фоне кинетической деформации (A) путем ступенчатого изменения концентрации фосфата. (Б) Время до локализации химерного Pho4-tetR-YFP и (В) последующая кинетическая активация транскрипции идентичны для обоих промоторов при выращивании в 2% глюкозе, а следы скорости транскрипции нормированы по средней высоте первого пика.Распределение всех одноклеточных (D) локализации и времени задержки активации транскрипции (E) рассчитывали от времени переключения фосфата до времени пересечения эффективного порога (рис. S11). (F) Задержка ответа каждой клетки рассчитывается как разница между временем транскрипции и локализации клетки. (G) Разделение распределения времени задержки ответа по фазам клеточного цикла во время локализации показывает более быструю активацию после почкования. (H) Длительные задержки ответа возникают только тогда, когда Pho4-tetR-YFP локализуется в G1.Каждая клетка представлена ​​в виде стебля, где расстояние по оси абсцисс соответствует ходу клеточного цикла во время локализации ТФ; высота конца стебля по ординате соответствует ходу клеточного цикла на момент активации транскрипции; а длина стержня от зеленой диагонали до конечной точки представляет собой задержку ответа. Цвета изображают фазы локализации и активации, как на вставке. Представленные данные относятся к P 7xtetO в раффинозе.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.g005

В ответ на ступенчатое изменение концентрации фосфата локализация TF и ​​последующая активация гена P 1xtetO или P 7xtetO , управляющая экспрессией CFP, идентичны (рис. 5B и C). Разница между локализацией и временем активации транскрипции в отдельных клетках (рис. 5D и E, текст S1) дает распределение времени задержки ответа (рис. 5F) со средней задержкой 17 минут, вероятно, в основном за счет созревания флуорофора (задержка ~ 10 минут, рис.С12). Поэтому в среднем оба промотора быстро реагируют на ТФ. Однако, когда мы разделяем клетки по фазе клеточного цикла, когда происходит локализация TF, распределение задержки ответа после почкования значительно отличается от распределения задержки до почкования (рис. 5G, тест KS с двумя образцами: p = 0,05, P 1xtetO ; p<0,001, P 7xtetO ), со средним временем отклика в постпочковых клетках на 7 (P 1xtetO ) или 10 (P 7xtetO ) минут раньше. Мы повторили пошаговый тест P 7xtetO в 2% раффинозе, чтобы увеличить количество клеток G1 и улучшить образцы клеток G1.Как медиана 20-минутной задержки ответа, так и 10-минутный разрыв между задержкой клеток до и после почки (критерий KS: p = 0,005) аналогичны результатам для глюкозы, при этом длительные задержки активации ограничиваются G1 (рис. 5H, Рис. S13).

Обсуждение

Всплеск транскрипции, при котором промотор время от времени переходит из долгоживущего неактивного состояния в короткоживущее активное, вызывая всплеск мРНК, обычно используется для объяснения наблюдаемой изменчивости количества мРНК в отдельных клетках [1] шумные гены.Напротив, мы демонстрируем, что большие различия в транскрипционной активности между G1 и S/G2, которые выходят за рамки эффектов дозы генов, обуславливают большую часть наблюдаемой изменчивости одиночных клеток в количестве мРНК. Полногеномные исследования дрожжей [3], [35] идентифицировали шумные промоторы как те, которые связаны с сильными ТАТА-боксами и сильно регулируются факторами ремоделирования хроматина. Сходными характеристиками обладают промоторы tetO, коровая область которых происходит от нативного промотора CYC1 [36]. Аналогичным образом, конститутивные промоторы, промоторы «домашнего хозяйства» и промоторы tetO с высокой экспрессией, ранее связанные с низкой вариабельностью экспрессии [2], [3], [31], демонстрируют только ~2-кратные изменения транскрипции на протяжении клеточного цикла, что согласуется с эффектами дозы генов.Ни один из этих промоторов не классифицируется как регулируемый клеточным циклом [37]. Хотя считается, что клеточный цикл является важным источником внешнего шума, наши результаты показывают, что может быть определенная роль, помимо дозировки генов, для генов-шумов, которые не были связаны с регуляцией клеточного цикла. Всплеск транскрипции все еще может происходить, но он не нужен для объяснения большей части вариабельности уровней мРНК, учитывая вариабельность во времени перехода G1 в S [38], [39]. До сих пор неизученная связь между экспрессией шумовых генов и большими различиями в транскрипционной активности G1 и S/G2 поднимает фундаментальные вопросы, касающиеся ее происхождения и распространенности среди шумных генов в различных организмах и ее значения в регуляции стабильной генной сети.

Исследования, отслеживающие транскрипты в синхронизированных дрожжевых клетках с мозаичными микрочипами, идентифицировали ∼10% генов, экспрессия которых зависит от клеточного цикла [37]. Механистическая основа их цикла посредством регуляции циклин-зависимыми факторами транскрипции хорошо изучена. Ген CYC1 , коровый промотор которого присутствует в промоторах tetO, не является частью этого класса. Поскольку мы наблюдали зависящую от цикла базальную экспрессию промоторов tetO в отсутствие какого-либо tTA, можно было бы ожидать, что ген CYC1 будет вести себя аналогичным образом.Если мы предположим, что эта циклозависимая экспрессия происходит в большинстве из примерно 20% генов, экспрессия которых была идентифицирована в полногеномных исследованиях как зашумленная [35], то почему предыдущие работы, в которых отслеживалась экспрессия в популяциях синхронизированных клеток, не применялись? Идентифицировали эти гены? Во-первых, нормализованные данные микрочипов представляют моль фракций видов мРНК в популяции. Таким образом, они никогда не идентифицируют, скажем, двукратные изменения количества мРНК из-за репликации при нормализации к одновременному увеличению общего количества мРНК [40].Во-вторых, мы видим большие различия в скорости транскрипции между G1 и S/G2, но из-за конечного времени жизни мРНК различия в количестве мРНК меньше. Расхождения гораздо более выражены при более медленных условиях роста (поскольку мРНК достигает нового стационарного состояния в каждой фазе роста), но исследования микрочипов проводились в условиях быстрого роста. В-третьих, в условиях с наибольшими различиями в транскрипции, зависящими от фазы клеточного цикла, транскрипция S/G2 является вероятностным событием.Эксперименты с микрочипами измеряют среднюю мольную долю мРНК популяции в каждой фазе, и, следовательно, относительная разница между S / G2 и G1 в среднем будет довольно низкой. Следовательно, мониторинг экспрессии в отдельных живых клетках в течение нескольких клеточных циклов имеет решающее значение для наблюдения за транскрипцией, зависящей от клеточного цикла.

Исследования с одиночными клетками не подвержены усреднению результатов анализа с помощью микрочипов. Тем не менее, наши данные меняют интерпретацию статических исследований одиночных клеток, в которых распределения мРНК/белков соответствуют стохастическим моделям экспрессии генов, чтобы сделать вывод об установившейся динамике [1], [2], [15], [17].Эта трудность использования статических данных для точного определения источников изменчивости была ожидаема [5], [23], хотя здесь мы показали, что даже статические данные мРНК FISH могут выявить дополнительную динамическую информацию путем дезагрегации распределения мРНК по фазам клеточного цикла. В соответствии с нашими наблюдениями, контрольные измерения, проведенные в исследовании циклозависимой кинетики деградации мРНК с использованием мРНК FISH, показывают примерно двукратное увеличение уровней мРНК по мере того, как клетки проходят через S/G2/M для промоторов ADh2 и DOA1 . [25].Наши результаты показывают, что размеры всплесков и частоты всплесков, полученные путем подгонки статических распределений мРНК к отрицательному биномиальному распределению, могут иметь ограниченное применение, за исключением того факта, что они описывают первые два момента распределения (и, следовательно, его шум). Если мы титруем уровни tTA и получаем статистику всплесков из совокупного распределения, оказывается, что размер всплесков увеличивается при низких уровнях экспрессии, а частота всплесков увеличивается при высоких уровнях экспрессии. Этот переход примерно соответствует переходу от малой или нулевой транскрипции в G1 (с резкой частотой, соответствующей одному клеточному циклу) к сильной экспрессии G1 (Quinn, Maheshri, неопубликованные результаты).Из-за простоты грубой классификации фазы клеточного цикла у дрожжей интересным и простым упражнением было бы повторно проанализировать существующие наборы данных мРНК FISH, опубликованные в нескольких лабораториях, чтобы определить распространенность экспрессии, зависящей от цикла. Морфологические измерения также могут быть объединены с двухцветными измерениями FISH с использованием второго транскрипта с известной регуляцией клеточного цикла [41]. Такой подход с высоким содержанием транскриптов уже выявил независимые клеточные и метаболические циклы [42].

Недавние измерения транскрипции в одиночных клетках в режиме реального времени, возможно, не выявили циклозависимую транскрипцию, о которой мы сообщаем, по разным причинам. В одном исследовании дрожжей экспрессию мРНК гена домашнего хозяйства измеряли в режиме реального времени без учета фазы клеточного цикла [12]. В клетках млекопитающих [14] всплески транскрипции с рефрактерным периодом были выведены из измерений в реальном времени уровней белка люциферазы, экспрессируемых несколькими промоторами, но снова не учитывалась фаза клеточного цикла.Всплески произошли во временных масштабах, намного более коротких, чем переходы клеточного цикла, но пересмотр данных все же может выявить фазовую зависимость клеточного цикла. Интересно, что измерения в режиме реального времени экспрессии мРНК с двух промоторов «домашнего хозяйства» в недифференцированных одиночных клетках Dictyostelium действительно показывают слабую зависимость от клеточного цикла, при этом частота транскрипционных всплесков или импульсов снижается в 2–3 раза от начала до конца клеточный цикл [43]. Однако у Dictyostelium отсутствует период G1 и имеется удлиненный период G2 [44], [45]; снижение экспрессии позже в клеточном цикле может быть связано с митотической репрессией транскрипции, что является хорошо известным явлением в клетках млекопитающих [46].Остается неясным, насколько широко распространена циклозависимая транскрипция у других организмов, и это требует дальнейшего изучения.

Что может быть механистической основой больших различий в транскрипционной активности G1 и S/G2? При низкой экспрессии промоторы tetO демонстрируют импульсы транскрипции, которые возникают вокруг перехода G1 в S, когда происходит репликация ДНК. Было высказано предположение, что прогрессия S-фазы влияет на транскрипцию [47], и было установлено, что она важна для (де)молчания локусов генов таким образом, который либо требует прогрессии репликативной вилки [48], [49], либо нет [50], [51]. .Репликационно-зависимая активация транскрипции вирусных генов была обнаружена в анализах транзиентной трансфекции и зависит от транс- активаторов, которые связываются либо с проксимальным промотором, либо с энхансерной областью [52], [53]. В этих случаях не наблюдается зависящих от цикла изменений активности активаторов транс . Кроме того, в системе in vitro репликация усиливает активацию транскрипции Gal4-VP16 во время S-фазы [54]. В нашем случае циклозависимую активность tTA можно исключить, поскольку мы наблюдаем это явление даже в отсутствие tTA (рис.4А и Б). В S-фазе активность киназы Cdc28 приводит к активизации базального механизма транскрипции, что, как было показано, приводит к аналогичным по времени импульсам транскрипции примерно в 200 дрожжевых генах, не классифицируемых как зависящие от цикла, но они обогащены генами домашнего хозяйства и генами. CYC1 не проявлял такого поведения [55]. Поэтому мы поддерживаем гипотезу о том, что временное нарушение архитектуры хроматина репрессированного промотора во время репликации ДНК может объяснить синхронизацию импульсов (рис.3B) и повышенная тенденция промоторов tetO не активироваться до перехода G1 в S, даже когда Pho4-tetR входит в ядро ​​в G1 (Fig. 5H). (Мы наблюдаем аналогичную зависимость от цикла для нативного промотора PHO5 , где активация гена имеет тенденцию происходить на ранних стадиях S/G2 – Зопф, Махешри, неопубликованные результаты.) Поскольку нуклеосомы, которые откладываются после прохождения репликационной вилки, состоят из смесь материнских и вновь синтезированных гистонов [56], по мере созревания этого хроматина может существовать период, благоприятный для транскрипции.Даже если этот разрешительный период недолговечен, после активации опосредованное транскрипцией отложение гистоновых меток может поддерживать активное состояние транскрипции [57].

Возврат в неактивное состояние в G1 может происходить во время митоза. Репрессивные модификации в общем аппарате транскрипции, изменения гистоновых меток и конденсация хроматина — все это способствует митотической репрессии транскрипции РНК у высших эукариот [58]. Первоначально предполагалось, что у почкующихся дрожжей транскрипция происходит на протяжении всего митоза, поскольку общий синтез РНК, по-видимому, увеличивается во время и после ядерной миграции [59], но недавняя работа показывает, что Cdc14 ингибирует транскрипцию РНК Pol I во время анафазы [60].Тем не менее, митотическая репрессия транскрипции РНК Pol II остается неясной, и мы наблюдали увеличение количества зарождающихся пятен транскрипции в клетках с большими зачатками, указывающими на позднюю фазу G2 или M (Fig. S9). Изучение генетических и химических нарушений в активности факторов, участвующих в созревании хроматина во время репликации ДНК и митоза, на предмет их влияния на зависимый от цикла паттерн транскрипции должно помочь в выяснении точных механизмов.

Наши результаты должны стимулировать разработку новых моделей, которые включают импульсы транскрипции, связанные с клеточным циклом, и анализируют их влияние на динамику и функцию генетических регуляторных сетей.Глобальные внешние факторы влияют на поведение [22], и в предыдущей работе определены две важные роли клеточного деления: в стохастическом разделении клеточного содержимого [24] и в установлении временной шкалы, в которой внешние колебания затухают [61]. Последнее особенно было включено в модели глобальных внешних флуктуаций [62]. Пересмотренные модели в свете наших результатов могут быть особенно интересны для разработки в сетях, содержащих петли положительной обратной связи, где переключение из состояния «ВЫКЛ» в состояние «ВКЛ» в значительной степени зависит от статистики транскрипции при низкой экспрессии.Поскольку здесь транскрипция оказывается запрещенной в G1, это приводит к значительному рефрактерному периоду к переключению. Наконец, поскольку более бедные питательные условия увеличивают время клеточного деления за счет удлинения G1 у дрожжей, запрещенная транскрипция G1 может неожиданным образом изменить динамику регуляторных сетей в клетках в различных условиях роста.

Методы

Конструирование штамма и плазмиды

Все штаммов S. cerevisiae были сконструированы на фоне W303 [63] с использованием стандартных методов молекулярной биологии дрожжей [64].Подробная информация о конструкции штамма и плазмиды приведена в таблицах S1 и S2. Штамм, называемый «трехцветным» диплоидным штаммом дрожжей, содержит гомологичные промоторы 7xtetO (P 7xtetO ), управляющие Cerulean (CFP) [65] или Venus (YFP) [66], и конститутивный промотор PGK1 (P PGK1 ) за рулем tdTomato (RFP) [67] (рис. 1А). Конструкция «кинетического» штамма (рис. 5А), используемого для измерения скорости активации генов, подробно описана в тексте S1.

Микрожидкостная культура и покадровая микроскопия

Азотистое основание дрожжей без фосфата (MP Biomedicals, Санта-Ана, Калифорния; № 4027-812) смешивали с раствором одноосновного фосфата калия (Sigma-Aldrich P8709) для установления уровня фосфата, а рН снижали до 4. Синтетический завершенный (SC ) среда содержала все аминокислоты, 2% глюкозы в качестве источника углерода и 5000 мкМ фосфата, если не указано иное. Для каждого эксперимента с временными рядами клетки брали из одной колонии, свежевыращенной на минимальной твердой синтетической среде (без аминокислот) с 2% глюкозным агаром, инокулировали в среду SC, выращивали в течение ночи на роликовом барабане при 30°C до OD . 600 нм ∼0.1, разбавляли свежей средой и снова выращивали в течение 6–8 ч до OD 600 нм ∼0,1. Эти клетки загружали в предварительно промытый и микрофлюидный планшет Y04C (CellAsic, Hayward, CA), залитый SC с соответствующим источником углерода и/или уровнем фосфата, в соответствии с инструкциями производителя. В течение всего эксперимента клетки перфузировали SC при давлении 6 фунтов на квадратный дюйм. Поток контролировали с помощью программируемой системы ONIX (CellAsic) для быстрого переключения между различными состояниями среды, обсуждаемыми в тексте. Рост и экспрессию клеток наблюдали с помощью Zeiss Axio Observer.Инвертированный микроскоп Z1 при 63-кратном увеличении (Zeiss Plan-Apochromat 63×/1,40 Oil DIC). Изображения в светлом поле (BF), BF вне фокуса (BFOOF, для сегментации) и флуоресценции получали каждые 5 минут с помощью камеры Cascade II EMCCD (Photometrics, Tuscon, AZ) с использованием программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), Металлогалогенная дуговая лампа со световым потоком 200 люмен (PRIOR Scientific, Rockland, MA) для возбуждения флуоресценции, соответствующие фильтры для CFP, YFP и RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; набор 89006) и настройки сбора данных, оптимизированные для быстрых временных точек .(Подробный протокол доступен в Интернете по адресу http://openwetware.org/wiki/Maheshri:Internal.)

Анализ временных рядов

Мы использовали специально написанное программное обеспечение на основе графического интерфейса пользователя в MATLAB (Mathworks, Natick, MA) для полуавтоматического анализа фильмов флуоресцентной микроскопии для извлечения объемов отдельных клеток и рядов данных флуоресценции [68]. Вкратце, клеточные области были сначала сегментированы с использованием сфокусированного и несфокусированного изображения в светлом поле, отслежены во времени и назначены линии материнского зачатка, все из которых были отобраны вручную.Данные каждой почки были включены во временные ряды ее матери до автоматически назначенного времени цитокинеза. Затем, чтобы получить стабильные производные по времени для каждого ряда данных, мы реализовали алгоритм сглаживания, основанный на аппроксимации сплайнами. Наконец, общий белок (флуоресценция) сплайн P ( t ) для каждой клетки был использован для расчета скорости продукции белка (пропорционально мРНК на клетку, M ( t )), и скорость транскрипции, A ( t ), используя простую модель транскрипции и трансляции с непрерывным временем: (1)(2) где γ M — скорость деградации мРНК, а k t — скорость трансляции. мРНК к белку.Мы утверждаем, что скорость трансляции почти постоянна в течение клеточного цикла (текст S1). Более подробная информация об аналитических методах доступна в тексте S1.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) для подсчета мРНК в одиночных клетках

Одноцепочечные ДНК-зонды к vYFP были связаны с флуорофорами тетраметилродамина (TMR) или индодикарбоцианина (Cy5), а зонды к tdTomato были связаны с флуорофорами TMR, как в [2]. Дрожжи выращивали до средней логарифмической фазы (ОП 600 нм  = 0.5–1), затем фиксировали, сферопластировали, гибридизовали и промывали аналогично [69] с модификациями, как описано в [2]. ДНК-зонды в концентрации ~5 мкМ разводили в 50-кратном растворе для гибридизации, содержащем 10% формамида. Клетки визуализировали на инвертированном микроскопе Zeiss AxioObserver, оснащенном ртутной дуговой лампой PRIOR Lumen200, объективом 100×/1,40 (Zeiss) и набором фильтров, специфичных для родамина и Cy5 (Chroma Technology, кат. № 31000v2 и 41024 соответственно). Для каждого образца было получено восемь изображений Z-стека с интервалом 0,3 мкм, которые были проанализированы с использованием специального программного обеспечения, написанного в MATLAB на основе того, что использовалось в [2].Алгоритм, используемый для идентификации пятен, соответствующих одной мРНК, применяет пороговое значение на основе области и идентифицирует локальные максимумы как пятна. Три параметра, используемые алгоритмом, могут изменяться из-за ежедневных изменений в окрашивании: (1) минимальная интенсивность для пикселя, который следует рассматривать как часть пятна, устанавливается вручную путем изучения нескольких z-стеков, выбирая порог, который идентифицирует пятна, а не фон, и проверяется путем обеспечения уровня ложноположительных результатов <5% в образцах отрицательного контроля; (2) средняя интенсивность одиночного пятна мРНК, выбранная с использованием режима интенсивностей пятен для образцов с меньшей экспрессией (рис.S14A), чтобы обеспечить подсчет множества перекрывающихся мРНК; и (3) пороговая интенсивность, при которой пятно классифицируется как место зарождающейся транскрипции, выбранное как переход между остроконечными и плоскими участками гистограммы интенсивностей пятен (примерно в 5–10 раз выше, чем интенсивность одиночного пятна). – Рис. S14A). Средние уровни белка в разных образцах использовались в качестве внутреннего контроля, и мы всегда проверяли, что отношение среднего уровня белка к среднему количеству мРНК было одинаковым для разных образцов и уровней экспрессии.На рис. S14B и C приведены примеры обработанных изображений, на которых видны пятна мРНК.

Классификация фаз клеточного цикла в фиксированных клетках

Чтобы исследовать зависимость транскрипции от клеточного цикла, мы вручную классифицировали клетки на FISH-изображениях как S/G2/M или G1 в зависимости от наличия почки. Визуализация при низкой плотности клеток помогла отличить почки от соседних клеток. Клетки в S/G2/M были далее подразделены на три ячейки одинакового размера на основе ранжированного размера почки, что приблизительно соответствует прохождению через клеточный цикл (как на рис.4).

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Назначения времени деления коррелируют со временем деления ядра и цитокинеза. Вверху снимки в светлом поле с центром в одной клетке перекрываются флуоресценцией RFP, отмечающей ядро. Рост происходит в микрожидкостной камере, и построенная кривая всего объема клетки соответствует непрерывному объему центральной клетки на первом изображении с течением времени. Весь объем клетки получали, как описано в основном тексте и на рис.1С с автоматически назначенным временем почкования и деления (начало и конец периода, заштрихованного серым цветом, соответственно). Клетка начинается в G1 и медленно растет до образования почек (характерно для ранней S-фазы) при t  = 50 мин. Ядро мигрирует к шейке почки в G2 в t  = 95 мин и делится между матерью и дочерью в анафазе (А) в t  = 110 мин. Автоматически определяемое время деления составляет t  = 135 мин, в этот момент происходит разделение ядер и сужение шейки почки в телофазе (T).Последующая G1-фаза начинается после того, как точка пересечения матери и дочери темнеет (указано стрелкой) в следующий момент времени, и к 150 мин делящаяся клеточная стенка становится отчетливой.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s001

(TIF)

Рисунок S2.

In silico Синхронизация временных рядов отдельных клеток позволяет выявить тенденции, зависящие от клеточного цикла. Временные ряды одиночных клеток показаны для трехцветного диплоида, выращенного в 2% глюкозе (соответствует рис.2Б-Г). Первый столбец содержит временные ряды каждой клетки, растущей в установившемся режиме. Во втором столбце каждый клеточный цикл нанесен между событиями деления и синхронизирован так, что почкование происходит при t  = 0 (вертикальные пунктирные линии). В третьем столбце прогрессия клеточного цикла для каждой клетки была нормализована к среднему циклу, простирающемуся от 0 до 1, при этом почка появляется при средней точке почкования 0,27. Синхронизированные трассировки отдельных клеток демонстрируют средние тенденции клеточного цикла, изображенные на рис.2 основного текста представляют поведение одной клетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Мгновенная скорость роста и скорость производства белка зависят от времени удвоения, тогда как объем и уровень белка зависят от ограничения питательных веществ. (A–C) Данные рис. 2 в основном тексте и рис. S5 были усреднены по клеточному циклу и нанесены на график в зависимости от скорости роста популяции (на основе среднего времени удвоения) в каждом условии роста.Средняя мгновенная скорость роста довольно хорошо коррелирует со скоростью роста, необходимой для сбалансированного роста (A), но средний объем зависит от условий питания (B). Средняя скорость продукции CFP также хорошо коррелирует со скоростью удвоения, но немного выше ожидаемой для раффинозы (C). Это согласуется с наблюдениями за общей скоростью производства белка, коррелирующей со средней скоростью роста [24], поскольку >50% белков разбавляются в процессе роста [25]. Разделив среднюю скорость производства CFP (AU/кл/мин) на рост (т.е., скорость разбавления) дает прогноз для среднего общего белка на клетку в стационарном состоянии (D).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Меньшее сглаживание приводит к более резким переходам средних мгновенных скоростей роста и транскрипции по фазам клеточного цикла, но общие тенденции устойчивы к выбору параметра сглаживания. Те же необработанные данные на рис. 2 основного текста и на рис. S5 обрабатываются с использованием более консервативного параметра сглаживания β = 3 (см. Текст S1: Определение параметра сглаживающего сплайна), который не сглаживает зашумленные особенности.После синхронизации и усреднения одноклеточных следов, как на рис. 2, общие тренды скорости транскрипции и роста одинаковы для роста в (A) 2% глюкозы, (B) 2% галактозы, (C) 2% раффинозы и (D) низкий уровень фосфатов. Примечательно, что меньшее сглаживание приводит к более резким переходам при почковании и делении с примерно постоянной скоростью в каждой фазе цикла. Серые области снова показывают среднюю фазу S/G2/M, а белые области показывают среднюю фазу G1.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s004

(ТИФ)

Рисунок S5.

Мгновенная скорость транскрипции и скорость роста коррелируют на протяжении клеточного цикла в различных условиях роста. Графики были построены аналогично графикам на рис. 2D и E основного текста для трехцветного штамма, выращенного в среде SC с 2% галактозой в качестве источника углерода (A) или SC с 2% глюкозы и 100 мкМ фосфата (B). Столбики погрешностей представляют собой интервал SEM от начальной загрузки. Пунктирные линии обозначают бин s.d.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s005

(TIF)

Рисунок S6.

Спорадическая активация транскрипции в режиме реального времени на двух копиях P 7xtetO . Трехцветный диплоидный штамм выращивали с 50 нг/мл доксициклина. Временные ряды скорости транскрипции (сплошные линии) для четырех репрезентативных клеток, по одной клетке на каждой панели, показывающие скорости транскрипции от P 7xtetO , управляющего либо CFP, либо YFP (синий и зеленый, соответственно, вверху каждой панели). Оба промотора выключены в G1, могут включаться или не включаться в S/G2 (со скоростью транскрипции, превышающей пунктирную черную линию, обозначающую предел обнаружения).Напротив, конститутивно выраженный RFP (красный) от P PGK1 (внизу каждой панели) всегда включен и демонстрирует обычные колебания, зависящие от клеточного цикла. Цветные пунктирные линии показывают соответствующий относительный уровень мРНК в результате транскрипционной активности. Вертикальные пунктирные линии разграничивают клеточные деления.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s006

(TIF)

Рисунок S7.

Сводка соответствия каждой модели распределению мРНК, специфичному для S/G2/M. (A–F) Штаммы, как на рис. 4, но включающие конкретное сравнение совокупного распределения S/G2/M и его среднего значения и стандартного отклонения на основе моделей, представленных на рис. 4 и рис. S8. Серые полосы и горизонтальные линии представляют собой экспериментальное распределение S/G2/M, а также его среднее значение и стандартное отклонение.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s007

(TIF)

Рисунок S8.

Распределения мРНК из P 1/7xetO лучше подходят за счет введения различных моментов времени при переходе от G1 к повышенной скорости транскрипции S/G2/M. (A–F) То же, что и на рис. 4, но с моделью, модифицированной для включения случайного, равномерно распределенного перехода от G1 к S/G2/M скорости перехода, происходящего в течение 40-минутного окна после почкования.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s008

(TIF)

Рисунок S9.

Увеличение частоты ярких зарождающихся пятен мРНК в S/G2/M для промоторов tetO. Доля клеток с зарождающимся пятном в G1 и через S/G2/M показана для экспрессии из P 1xtetO и P 7xtetO при базальном (A&B) и промежуточном (C&D) уровнях экспрессии.Штаммы идентичны тем, что на рис. 4A-D. (E&F) Доля зарождающихся пятен RFP и YFP в двухцветном диплоиде P 1xtetO , где красный, зеленый и желтый цвета соответствуют проценту клеток только с пятнами RFP, только пятнами YFP и обоими пятнами. В то время как доля клеток с зарождающимися пятнами больше в (E), их средняя интенсивность составляет менее половины интенсивности клеток в (F), что согласуется с более низкой экспрессией, наблюдаемой в (E). Корреляция в присутствии зарождающихся пятен от каждого промотора предполагает некоторую степень скоординированной экспрессии.При экспрессии конститутивного P DOA1 зарождающихся пятен не наблюдалось.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s009

(TIF)

Рисунок S10.

Скорость роста постепенно уменьшается после удаления фосфата в кинетических экспериментах. Во время ступенчатых испытаний на кинетическую деформацию средняя мгновенная скорость роста снижается ниже нормы примерно через 100 минут после переключения на низкий уровень внешнего фосфата. Измерения распределения задержки активации ограничены этим периодом.Начальный подъем обусловлен тем, что большинство клеток в наблюдаемой популяции начинают рост почек квазисинхронно.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s010

(TIF)

Рисунок S11.

Определение времени активации транскрипции и эффективной ядерной локализации TF в одиночных клетках во время пошаговых тестов. После переключения на низкий уровень фосфата при t  = 0 (серая заштрихованная область) клетка образца начинает экспрессировать CFP (A, голубой) в ответ на локализацию TF в ядре (C, зеленый).Предполагаемая скорость транскрипции CFP (B, синий) повышается после локализации TF до эффективного уровня. Времена перехода транскрипции и локализации для каждой клетки затем находятся в 5 шагах расчета (соответствующих красным числам на графиках). ( 1 ) Порог транскрипции (горизонтальная черная пунктирная линия, B) установлен на уровне 50% от стационарной скорости транскрипции в популяции, определяемой через некоторое время после этапа, описанного в методах. Эта пороговая точка хорошо соответствует началу роста наблюдаемого белка (А).( 2 ) Из-за 10–15-минутной задержки наблюдения транскрипции ( τ obs ) из-за созревания белка отмечается уровень локализации ТФ за 15 минут до наблюдаемого времени активации транскрипции. ( 3 ) Шаги 1 и 2 были повторены для всех следов клеток, создавая распределение значений локализации (вставка в C). ( 4 ) Эффективный порог локализации TF устанавливается на уровне 5 -го -го процентиля локализации (вертикальная пунктирная линия на вставке).Это соответствует уровню TF, при котором многие клетки действительно активируют транскрипцию, предполагая, что уровни ядерного TF больше не являются ограничивающими. Любые возникающие в результате задержки в активации транскрипции интерпретируются как связанные с процессом транскрипции, а не с недостатком ядерного TF. ( 5 ) Затем определяется время локализации каждой клетки, когда уровни ядерного TF пересекают эффективный порог локализации TF (горизонтальная красная пунктирная линия, C).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s011

(TIF)

Рисунок S12.

Измерение скорости созревания для каждого флуоресцентного белка. Трехцветный штамм выращивали в микрофлюидике на синтетических средах. Через три часа камеру перфузировали той же средой, теперь содержащей 30 мкг/мл циклогексимида для ингибирования трансляции. Средняя интенсивность в каждой клетке продолжала увеличиваться для каждого флуоресцентного репортера, отражая созревание флуорофора из пула незрелых белков. (A) Временные ряды необработанных концентраций с одной ячейкой соответствовали (черная линия) уравнению.(S3) ( γ P зафиксировано на 0 для RFP) и (B) показаны гистограммы измеренных периодов полураспада при созревании ln(2)/ k m . Медианы составляют 10 минут, 32 минуты и 150 минут для CFP (верхняя панель), YFP (в центре) и RFP соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s012

(TIF)

Рисунок S13.

Реакция транскрипции на ступенчатое изменение TF медленнее в G1. Временные ряды локализации одноклеточного TF и ​​скорости транскрипции CFP показаны для кинетических ступенчатых тестов на рис.4 основного текста. Несмотря на почти идентичные профили локализации на уровне отдельных клеток и в среднем, ответ транскрипции медленнее для клеток, в которых локализация произошла в G1, по сравнению с теми, в которых локализация произошла после почкования (количество клеток в G1 (n G1 ) или S /G2/M (n S/G2/M ) для каждого опыта: P 1xtetO , n G1  = 20, n S/G2/M  4 6 Gxtet41,919 = 23, n S/G2/M  = 49, P 7xtetO в рафинозе, n G1  = 53, n S/G2/M  = 17).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s013

(TIF)

Рисунок S14.

Анализ изображений мРНК FISH. (A) Гистограмма средней интенсивности пикселей пятен, обнаруженных как мРНК в популяции клеток, с зелеными, синими и красными линиями, показывающими параметры, выбранные для анализа пятен. Пороговое значение (зеленая линия) представляет собой минимальную интенсивность пикселя для пикселя, который следует рассматривать как пятно, выбранное таким образом, чтобы количество ложных срабатываний не превышало 4% в отрицательном контрольном образце без флуоресцентного репортера и соответствовало ручному визуальному осмотру подмножества изображений. .Множественные мРНК, которые перекрываются в z-проекции, выглядят как более яркие пятна. Режим гистограммы (синяя линия) выбирается как интенсивность одной мРНК, а пятна, которые > = в 2 раза ярче, считаются как несколько пятен путем нормализации с порогом режима. Считается, что очень яркие пятна (более чем в 4 раза ярче, чем одиночное пятно мРНК в плоской области гистограммы — красная линия) образованы участками зарождающейся транскрипции, если они выровнены с ядром и автоматически идентифицируются как участки с интенсивностью в плоская область гистограммы (красная линия).(B) Изображения клеток с количеством мРНК, измеренным с помощью мРНК FISH. (вверху) Светлое поле, наложенное на ядро, окрашенное синим DAPI, и (в центре) — максимальная проекция восьми изображений флуоресцентного окрашивания родамином в Z-стеке. (внизу) мРНК и зарождающиеся сайты транскрипции, идентифицированные с помощью алгоритма подсчета точек, отмечены красной или пурпурной точкой соответственно. Зарождающиеся пятна совпадают с синим ядром, окрашенным DAPI. (C) Микрофотографии клеток из трех образцов в (B) с классификацией (вверху) стадии клеточного цикла как G1 (желтый), ранний-S/G2 (оранжевый) или более поздний S/G2/M (красный). ) и (внизу) максимальная проекция восьми изображений флуоресцентного окрашивания родамином в Z-стеке.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s014

(TIF)

Рисунок S15.

Моделирование реалистичных временных рядов общего белка для определения оптимального параметра сглаживания для подбора сплайнов. С помощью метода, описанного в тексте S1, шумовые характеристики экспериментальных интегрированных данных флуоресценции до сплайсинга (A, репрезентативные трассировки отдельных клеток из ступенчатых тестов P 1xtetO и P 7xtetO ) использовались для моделирования базового временного ряда белка (B). .(C–E) A ( t ) моделировали шаг вверх при t  = 0 от нуля до колебательного стационарного состояния с периодом типичного клеточного цикла ( E, t cyc  = 100 мин, P∶T = 2∶1). Смоделированная мРНК (D, мк  = 10) и след общего белка ( C ) были рассчитаны из A ( t ) с использованием уравнений. (S5–8), с добавлением шума к временному ряду белка ξ ( t ), подобному высокочастотному шуму измерений, наблюдаемому в данных ( σ 2  = 2.4д4). Сглаживающий сплайн был подогнан к временным рядам смоделированного белка, а соответствующие временные ряды мРНК и скорости транскрипции были выведены с использованием уравнений. (1–2) в методах. (F) Моделирование было повторено для всех комбинаций параметров, описанных в тексте, которые охватывают наблюдаемые характеристики временных рядов белка во всех экспериментах. Для каждого набора параметров (панелей) было сгенерировано 100 зашумленных асинхронных трасс, и была обнаружена остаточная ошибка между смоделированной и предполагаемой транскрипцией в диапазоне параметров сглаживания β (цветные линии).Выбранное значение β = 300 (вертикальная пунктирная линия) минимизирует остаточную ошибку по всем наборам параметров и использовалось для всех наборов данных. (G) Пример сравнения смоделированной и предполагаемой скорости транскрипции мкА ( t ) (с использованием β = 300) для каждого набора параметров с t циклов  = 100 мин. Черная пунктирная линия представляет собой половину среднего устойчивого состояния для t > 0 (порог для определения активации в ступенчатом тесте).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s015

(TIF)

Рисунок S16.

Уровни мРНК падают экспоненциально с ожидаемой скоростью деградации после периодов сильной транскрипции. Для одной клетки на нижней панели рисунка S6 скорость транскрипции CFP (синий) и уровень мРНК (фиолетовый) показывают спорадическую транскрипцию при низких уровнях экспрессии. В конце сильного периода «включения» (вертикальная пунктирная линия), когда скорость транскрипции падает ниже порогового значения (горизонтальная пунктирная линия), предполагаемое падение уровня мРНК согласуется с ожидаемым процессом деградации первого порядка (красная линия). , где γ — скорость деградации мРНК, а M 0 — константа.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s016

(TIF)

Рисунок S17.

Способность к трансляции не зависит от клеточного цикла. Среднее соотношение белка и мРНК клеток, сгруппированных по фазам клеточного цикла (в зависимости от размера почек), показано для P 1/7xtetO и P DOA1 . Это соотношение не демонстрирует четкой тенденции, зависящей от клеточного цикла, что указывает на то, что зависящие от клеточного цикла изменения скорости трансляции не являются доминирующим источником изменений уровня белка на протяжении клеточного цикла.Столбики погрешностей s.d. полученный бутстрэппингом.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s017

(TIF)

Рисунок S18.

Моделирование для оценки точности времени назначений времени перехода скорости транскрипции. (A) Временные ряды скорости транскрипции (тонкие цветные линии) выводятся для зашумленных белковых данных, смоделированных с помощью функции генератора скорости транскрипции прямоугольных импульсов (толстая синяя линия), как на рисунке S15 (n = 1000). Здесь этап созревания белка включен в моделирование данных о белке, но не в вывод о скорости транскрипции.(B) Время активации и (D) время деактивации, «наблюдаемое» для каждого предполагаемого следа транскрипции в A , задерживается на 10–15 минут по сравнению с истинным временем (синяя гистограмма по сравнению с вертикальной, красная линия) со средним абсолютным отклонением ∼ 2 мин. (C) Учитывая скорость деградации мРНК γ M в уравнении. (S6), чтобы варьироваться во время моделирования, но вывод скорости транскрипции с использованием одного среднего значения γ M приводит к большей дисперсии следов образцов. «Наблюдаемые» времена активации не сильно различались, но среднее абсолютное отклонение времени дезактивации увеличилось до ∼8.4 мин (черные гистограммы на B и D).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003161.s018

(TIF)

Благодарности

Благодарим Н. Фридмана, Н. Славова, Т.Л. Кому и членам лаборатории Махешри за обсуждение/комментарии.

Авторские взносы

Идея и разработка экспериментов: CJZ KQ NM. Проведены эксперименты: CJZ KQ JZ. Проанализированы данные: CJZ KQ JZ NM. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: CJZ KQ NM. Написал статью: CJZ KQ NM.Разработано программное обеспечение, используемое в анализе: CJZ KQ NM.

Каталожные номера

  1. 1. Радж А., Пескин К.С., Транчина Д., Варгас Д.Ю., Тьяги С. (2006)Стохастический синтез мРНК в клетках млекопитающих. Биология PLoS 4: e309 OP.
  2. 2. To TL, Maheshri N (2010) Шум может вызывать бимодальность в петлях положительной транскрипционной обратной связи без бистабильности. Наука 327: 1142–1145.
  3. 3. Ньюман Дж. Р., Гаеммагами С., Ихмелс Дж., Бреслоу Д. К., Ноубл М. и др.(2006) Протеомный анализ отдельных клеток S. cerevisiae раскрывает архитектуру биологического шума. Природа 441: 840–846.
  4. 4. Радж А., ван Ауденарден А. (2009)Одномолекулярные подходы к стохастической экспрессии генов. Annu Rev Biophys 38: 255–270.
  5. 5. Танигучи Ю., Чой П.Дж., Ли Г.В., Чен Х., Бабу М. и др. (2010)Количественная оценка протеома и транскриптома E. coli с чувствительностью к одной молекуле в отдельных клетках. Наука 329: 533–538.
  6. 6. Peccoud J, Ycart B (1995) Марковское моделирование синтеза генного продукта.Theor Popul Biol 48: 222–234.
  7. 7. Shahrezaei V, Swain PS (2008)Аналитические распределения для стохастической экспрессии генов. Proc Natl Acad Sci USA 105: 17256–17261.
  8. 8. Golding I, Paulsson J, Zawilski SM, Cox EC (2005/12/16) Кинетика активности генов в реальном времени у отдельных бактерий. Ячейка 123: 1025–1036.
  9. 9. Майури П., Кнезевич А., Де Марко А., Мазза Д., Кула А. и др. (2011)Высокая скорость транскрипции РНК-полимеразы II в клетках человека.EMBO Rep 12: 1280–1285.
  10. 10. Чабб Дж. Р., Трчек Т., Шеной С. М., Сингер Р. Х. (2006/5/23) Транскрипционная пульсация гена развития. Текущая биология 16: 1018–1025.
  11. 11. Мурамото Т., Кэннон Д., Герлински М., Корриган А., Бартон Г.Дж. и др. (2012) Живая визуализация зарождающейся динамики РНК выявляет различные типы регуляции транскрипционных импульсов. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 7350–7355.
  12. 12. Ларсон Д.Р., Зенклусен Д., Ву Б., Чао Дж.А., Сингер Р.Х. (2011)Наблюдение в режиме реального времени за инициацией и удлинением транскрипции эндогенного гена дрожжей.Наука 332: 475–478.
  13. 13. Choi PJ, Cai L, Frieda K, Xie XS (2008)Стохастическое событие с одной молекулой вызывает переключение фенотипа бактериальной клетки. Наука 322: 442–446.
  14. 14. Сутер Д.М., Молина Н., Гатфилд Д., Шнайдер К., Шиблер У. и др. (2011) Гены млекопитающих транскрибируются с очень разной кинетикой взрыва. Наука 332: 472–474.
  15. 15. Мао С., Браун С.Р., Фальковская Э., Донг С., Храбета-Робинсон Э. и др. (2010)Количественный анализ механизма контроля транскрипции.Мол Сист Биол 6: 431.
  16. 16. Tan RZ, van Oudenaarden A (2010)Подсчет транскриптов в одиночных клетках показывает динамику транскрипции рДНК. Мол Сист Биол 6: 358.
  17. 17. Мунски Б., Нойерт Г., ван Ауденарден А. (2012) Использование шума экспрессии генов для понимания регуляции генов. Наука 336: 183–187.
  18. 18. Эловиц М.Б., Левин А.Дж., Сиггиа Э.Д., Суэйн П.С. (2002)Стохастическая экспрессия генов в одной клетке. Наука 297: 1183.
  19. 19.Raser JM, O’Shea EK (2004) Контроль стохастичности в экспрессии эукариотических генов. Наука 304: 1811–1814.
  20. 20. Вольфсон Д., Марциняк Дж., Блейк В.Дж., Острофф Н., Цимринг Л.С. и соавт. (2006) Происхождение внешней изменчивости экспрессии эукариотических генов. Природа 439: 861–864.
  21. 21. Pedraza JM, van Oudenaarden A (2005) Распространение шума в генных сетях. Наука 307: 1965–1969.
  22. 22. Колман-Лернер А., Гордон А., Серра Э., Чин Т., Реснеков О. и соавт.(2005) Регулируемые межклеточные вариации в системе принятия решений о судьбе клетки. Природа 437: 699–706.
  23. 23. Хилфингер А., Полссон Дж. (2011)Отделение внутренних и внешних колебаний в динамических биологических системах. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 12167–12172.
  24. 24. Huh D, Paulsson J (2011)Негенетическая гетерогенность из-за стохастического разделения при делении клеток. Нат Жене 43: 95–100.
  25. 25. Trcek T, Larson DR, Moldon A, Query CC, Singer RH (2011) Измерения распада мРНК одиночных молекул показывают регулируемую промотором стабильность мРНК в дрожжах.Ячейка 147: 1484–1497.
  26. 26. Гордон А., Колман-Лернер А., Чин Т.Э., Бенджамин К.Р., Ю Р.С. и соавт. (2007)Количественная оценка молекул и скоростей отдельных клеток с использованием цитометрии на основе микроскопа с открытым исходным кодом. Нат-методы 4: 175–181.
  27. 27. Куксон Н.А., Куксон С.В., Цимринг Л.С., Хасти Дж. (2010)Вариации концентрации белка, зависящие от клеточного цикла. Нуклеиновые кислоты Рез. 38: 2676–2681.
  28. 28. Горанов А.И., Кук М.Ф., Рицикова М.Ф., Бен-Ари Г.Ф., Гонсалес С.Ф. и соавт.(2009) Скорость роста клеток определяется стадией клеточного цикла. Гены Дев 23: 1408–1422.
  29. 29. Boehlke KW, Friesen JD (1975)Клеточное содержание рибонуклеиновой кислоты и белка в saccharomyces cerevisiae как функция экспоненциальной скорости роста: расчет кажущейся скорости удлинения пептидной цепи. J Bacteriol 121: 429–433.
  30. 30. Ларсон Д.Р., Сингер Р.Х., Зенклусен Д. (2009) Взгляд одной молекулы на экспрессию генов. Тенденции Cell Biol 19: 630–637.
  31. 31.Zenklusen D, Larson DR, Singer RH (2008) Подсчет одиночных РНК выявляет альтернативные способы экспрессии генов у дрожжей. Nat Struct Mol Biol 15: 1263–1271.
  32. 32. Полссон Дж., Берг О.Г., Эренберг М. (2000)Стохастическая фокусировка: повышенная флуктуациями чувствительность внутриклеточной регуляции. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 97: 7148–7153.
  33. 33. Charvin G, Cross FR, Siggia ED (2008)Микрожидкостное устройство для контролируемой во времени экспрессии генов и долгосрочной флуоресцентной визуализации в невозмущенных делящихся дрожжевых клетках.PLoS One 3: e1468.
  34. 34. О’Нил Э.М., Каффман А., Джолли Э.Р., О’Ши Э.К. (1996) Регуляция ядерной локализации PHO4 с помощью комплекса PHO80-PHO85 циклин-CDK. Наука 271: 209–212.
  35. 35. Бар-Эвен А., Полссон Дж., Махешри Н., Карми М., О’Ши Э. и др. (2006) Шум в экспрессии белка зависит от естественного содержания белка. Нат Жене 38: 636–643.
  36. 36. Gari E, Piedrafita L, Aldea M, Herrero E (1997)Набор векторов с регулируемой тетрациклином промоторной системой для модулированной экспрессии генов в saccharomyces cerevisiae.Дрожжи 13: 837–848.
  37. 37. Грановская М.В., Дженсен Л.Дж., Ричи М.Е., Тодлинг Дж., Нин Ю. и др. (2010)Атлас транскрипции высокого разрешения митотического клеточного цикла у почкующихся дрожжей. Геном Биол 11: R24-2010-11-3-r24.
  38. 38. Bean JM, Siggia ED, Cross FR (2006) Когерентность и время начала клеточного цикла исследованы при разрешении одной клетки. Мол Ячейка 21: 3–14.
  39. 39. Ди Талия С., Скотхейм Дж. М., Бин Дж. М., Сиггиа Э. Д., Кросс Ф. Р. (2007) Влияние молекулярного шума и контроля размера на изменчивость цикла почкующихся дрожжевых клеток.Природа 448: 947–951.
  40. 40. Журинский Дж., Леонхард К., Ватт С., Маргера С., Бахлер Дж. и др. (2010)Координированный глобальный контроль над клеточной транскрипцией. Курс Биол 20: 2010–2015.
  41. 41. Wyart M, Botstein D, Wingreen NS (2010)Оценка динамики экспрессии генов с использованием парных данных РНК FISH. PLoS Comput Biol 6: e1000979.
  42. 42. Сильверман С.Дж., Петти А.А., Славов Н., Парсонс Л., Брихоф Р. и соавт. (2010) Метаболический цикл в одиночных дрожжевых клетках из несинхронизированных стационарных популяций, ограниченных по глюкозе или фосфату.Proc Natl Acad Sci USA 107: 6946–6951.
  43. 43. Мурамото Т., Мюллер И., Томас Г., Мелвин А., Чабб Дж. Р. (2010) Метилирование h4K4 необходимо для наследования активных состояний транскрипции. Текущая биология 20: 397–406.
  44. 44. Weijer CJ, Duschl G, David CN (1984)Пересмотр клеточного цикла dictyostelium discoideum. J Cell Sci 70: 111–131.
  45. 45. Weeks G, Weijer CJ (1994) Клеточный цикл диктиостелиума и его связь с дифференцировкой.FEMS Microbiol Lett 124: 123–130.
  46. 46. Dynlacht BD (1997) Регуляция транскрипции белками, контролирующими клеточный цикл. Природа 389: 149–152.
  47. 47. Wolffe AP (1991) Значение репликации ДНК для экспрессии эукариотических генов. J Cell Sci 99: 201–206.
  48. 48. Crowe AJ, Piechan JL, Sang L, Barton MC (2000) Прогрессия S-фазы опосредует активацию молчащего гена в синтетических ядрах. Мол Селл Биол 20: 4169–4180.
  49. 49.Fisher D, Mechali M (2003)Экспрессия гена HoxB у позвоночных требует репликации ДНК. EMBO J 22: 3737–3748.
  50. 50. Кирхмайер А.Л., Райн Дж. (2001)Независимое от репликации ДНК молчание у S. cerevisiae. Наука 291: 646–650.
  51. 51. Li YC, Cheng TH, Gartenberg MR (2001) Установление подавления транскрипции в отсутствие репликации ДНК. Наука 291: 650–653.
  52. 52. Wilson AC, Patient RK (1993) Репликация ДНК облегчает действие энхансеров транскрипции в анализах транзиторной экспрессии.Nucleic Acids Res 21: 4296–4304.
  53. 53. Williams RD, Lee BA, Jackson SP, Proudfoot NJ (1996)Домены активации факторов транскрипции опосредуют зависимую от репликации транскрипцию с минимального промотора ВИЧ-1. Нуклеиновые кислоты, рез. 24: 549–557.
  54. 54. Kamakaka RT, Bulger M, Kadonaga JT (1993)Потенцирование транскрипции РНК-полимеразы II с помощью Gal4-VP16 во время, но не после репликации ДНК и сборки хроматина. Гены Дев 7: 1779–1795.
  55. 55.Чимкович П., Элдхольм В., Лоренц С., Циммерманн С., Линдвалл Дж. М. и соавт. (2012) Активность киназы Cdc28 регулирует основной механизм транскрипции в подмножестве генов. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 10450–10455.
  56. 56. Annunziato AT (2012) Сборка хроматина: долгая и извилистая дорога. Биохим Биофиз Акта 1819: 196–210.
  57. 57. Шилатифард А. (2006) Модификации хроматина путем метилирования и убиквитинирования: значение в регуляции экспрессии генов.Annu Rev Biochem 75: 243–269.
  58. 58. Gottesfeld JM, Forbes DJ (1997)Митотическая репрессия транскрипционного механизма. Trends Biochem Sci 22: 197–202.
  59. 59. Elliott SG, McLaughlin CS (1978)Скорость макромолекулярного синтеза в клеточном цикле дрожжей saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A 75: 4384–4388.
  60. 60. Клементе-Бланко А., Майан-Сантос М., Шнайдер Д.А., Мачин Ф., Джармуз А. и др. (2009) Cdc14 ингибирует транскрипцию РНК-полимеразой I во время анафазы.Природа 458: 219–222.
  61. 61. Розенфельд Н., Янг Дж.В., Алон У., Суэйн П.С., Эловиц М.Б. (2005)Генная регуляция на уровне одной клетки. Наука 307: 1962–1965.
  62. 62. Shahrezaei V, Ollivier JF, Swain PS (2008)Окрашенные внешние колебания и стохастическая экспрессия генов. Мол Сист Биол 4: 196.
  63. 63. Томас Б.Дж., Ротштейн Р. (1989) Повышенная скорость рекомбинации в транскрипционно активной ДНК. Ячейка 56: 619–630.
  64. 64. Гатри С., Финк Г.Р.(2004) Руководство по генетике дрожжей и молекулярной и клеточной биологии. часть A. Амстердам: Elsevier Academic Press.
  65. 65. Rizzo MA, Springer GH, Granada B, Piston DW (2004)Улучшенный вариант голубого флуоресцентного белка, полезный для FRET. Nat Biotechnol 22: 445–449.
  66. 66. Нагаи Т., Ибата К., Парк Э.С., Кубота М., Микошиба К. и др. (2002) Вариант желтого флуоресцентного белка с быстрым и эффективным созреванием для клеточно-биологических применений. Нац. биотехнология 20: 87–90.
  67. 67. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, et al. (2004)Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из Discosoma sp. красный флуоресцентный белок. Nat Biotechnol 22: 1567–1572.
  68. 68. Zopf CJ, Maheshri N (2013)Получение покадровых фильмов флуоресценции почкующихся дрожжей и анализ динамики одиночных клеток с использованием GRAFTS. J Vis Exp e50456.
  69. 69. Raj A, van den Bogaard P, Rifkin SA, van Oudenaarden A, Tyagi S (2008)Визуализация отдельных молекул мРНК с использованием нескольких однократно меченых зондов.Нат Методы 5: 877–879.
.

Author: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.