Охарактеризуйте биологическое значение процесса деления клетки: Охарактеризуйте биологическое значение процесса деления клетки

Содержание

Регуляция клеточной гибели. Биология 10 класс Захаров



ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ

Вопрос 1. Что такое жизненный цикл клетки?

Жизненным циклом клетки называется совокупность событий от момента ее возникновении до гибели или последующего деления.

Вопрос 2. Дайте определение митотического цикла клетки.

Митотический цикл — совокупность процессов, протекающих в клетке во время подготовки ее к делению и на протяжении митоза. Он включает в себя интерфазу и митоз.

Интерфаза – период подготовки клетки к делению, включает три этапа.

1. Пресинтетический, или постмитотический (G1). Продолжительность 6-8 часов, формула клетки 2п2с. Идет активный синтез РНК, белков, необходимых для процесса редупликации ДНК. Клетка увеличивается в размерах, возрастает количество органоидов.

2. Синтетический — 8-период. Продолжительность — 8-12 часов.

Идет редупликация ДНК; этот процесс начинается сразу во многих точках, в каждой из хромосом. К концу периода количество ДНК в каждой из хромосом удваивается. Формула клетки 2п4с.

З. Постсинтетический, или премитотический (G2) период. Продолжительность 4-6 часов. Идет интенсивный синтез РНК и белков, необходимых для обеспечения процессов митоза. Завершается рост клетки, удваивается клеточный центр.

Митоз — непрямое деление клетки, состоит из четырех фаз — профазы, анафазы, метафазы и телофазы.

Вопрос 3. Расскажите, как осуществляется синтез ДНК.

Молекула ДНК полностью раскручивается — деспирализуется, водородные связи, соединяющие комплементарно связанные полинуклеотидные цепи, разрываются и каждая из них становится матрицей для синтеза новых цепей.

В процессе синтеза ДНК принимает участие целая группа ферментов. Одним из важнейших является ДНК-полимераза. Удвоение ДНК происходит по принципу комплементарности и осуществляется с очень высокой точностью — новые молекулы абсолютно идентичны старой, и каждая из них состоит из одной старой и второй вновь синтезированной полинуклеотидных цепей.

Без этого были бы невозможны сохранение и передача генетической информации по наследству, которая обеспечивает развитие присущих организму признаков. Возникшие под воздействием внешних факторов изменения структуры молекулы ДНК устраняются при помощи специальных ферментов. Таким образом, постоянство наследственной информации обеспечивается матричным синтезом ДНК и восстановлением поврежденных участков молекулы посредством ферментов. В результате удвоения ДНК в ходе процессов митотического цикла в каждой хромосоме оказывается вдвое больше молекул ДНК, чем было, а число хромосом не меняется. Формула клетки становится 2п4с.

Вопрос 4. Опишите процесс митоза.

Митоз — непрямое деление клетки, в результате которого образуются две дочерние клетки с таким же набором хромосом, как в материнской. Митоз состоит из четырех фаз – профазы, метафазы, анафазы и телофазы.

1. Профаза. Формула клетки 2n4с. Идет спирализация ДНК, хромосомы становятся видны как длинные тонкие нити. Клеточный центр заканчивает деление, и группы по две центриоли начиняют движение к полюсам клетки, между ними формируется веретено деления. Спирализация хромосом усиливается, они укорачиваются и утолщаются. Ядерная оболочка распадается на фрагменты. Хромосомы свободно лежат в цитоплазме.

2. Метафаза. Формула клетки 2n4c.

Спирализация хромосом достигает максимума они укорочены и утолщены. В микроскоп становится видно, что каждая хромосома состоит из двух хроматид, соединенных в области центромеры. Хромосомы выстраиваются по экватору клетки. В плоскости экватора лежат центромеры хромосом, к ним прикрепляются нити веретена деления, которые, будучи связанными с хромосомами, называются хромосомными, а не связанные С хромосомами — непрерывными.

3. Анафаза. Центромерные участки целятся, и сестринские хроматиды становятся самостоятельными дочерними хромосомами. Они начинают движение к различным полюсам клетки. Формула клетки: 2n2c + 2n2c = 4n4c. Движение хромосом к полюсам обеспечивается: а) за счет скольжения хромосомной нити по непрерывной нити как по направляющей; 6) подтягиванием хромосомной нити ферментами клеточного центра с одновременным отщеплением от нее фрагментов.

4. Телофаза. Группы дочерних хромосом достигают полюсов клетки и деспирализуются. Они становятся видны как длинные тонкие нити. Вокруг каждой из групп хромосом, из мембран ЭПС, образуется ядерная оболочка. Формула каждого ядра 2n2с. На фоне завершения деления ядра происходит разделение цитоплазмы, в результате чего органоиды примерно поровну распределяются между дочерними клетками.

Вопрос 5. Дайте определение митоза и сформулируйте его биологическое значение.

Митоз — форма клеточного деления, которая заключается в точном и равномерном распределении хромосомного материала между дочерними клетками, в результате чего каждая из них получает наследственную информацию, идентичную материнской.

Биологическое значение митоза.

1. Лежит в основе всех форм бесполого размножения.

2. Обеспечивает рост многоклеточного организма.

3. Обеспечивает физиологическую регенерацию, т. е. восполнение клеточных потерь, возникших естественным путем, замена старых клеток новыми.

4. Осуществляет процессы репаративной регенерации — восполнение клеточных потерь, возникших в результате травмы.

Вопрос 6. В чём заключается биологический смысл митоза?

Биологический смысл митоза заключается в точном и равномерном распределении хромосомного материала между двумя дочерними клетками, при котором каждая из них получает наследственную информацию, идентичную материнской.

Вопрос 7. Охарактеризуйте биологический смысл запрограммированной клеточной гибели — апоптоза.

Апоптоз — естественный и необходимый процесс для поддержания гомеостаза в тканях и нормального развития многоклеточного организма. Апоптоз, чаще называемый программированной смертью клетки, является энергетически активным, генетически контролируемым процессом, который избавляет организм от ненужных или поврежденных клеток.

Апоптоз как генетически запрограммированное самоубийство клетки играет ключевую роль в ряде процессов развития организма, его нормальной жизнедеятельности и регенерации тканей.

Данное явление повсеместно используется живыми организмами в целях контролируемой ликвидации клеток на разных стадиях развития особи. Апоптоз играет жизненно важную роль в развитии нервной системы. Он же, в частности, делает возможным формирование частей тела в результате отмирания ненужных участков тканей; так, наши ладони формируются именно путём разрушения клеток в межпальцевых промежутках. Как показывают исследования, апоптоз приобретает ключевое значение по завершении процессов развития организма, обеспечивая планомерную замену старых клеток новыми и регулируя их численность в соответствии с потребностями зрелого организма.

ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ

Вопрос 1 Как осуществляется движение хромосом в анафазе и что общего во всех двигательных реакциях живого организма?

Движение хромосом в анафазе происходит следующим образом. Центромерные участки целятся, и сестринские хроматиды становятся самостоятельными дочерними хромосомами. Они начинают движение к различным полюсам клетки. Формула клетки: 2n2c + 2n2c = 4n4c. Движение хромосом к полюсам обеспечивается: а) за счет скольжения хромосомной нити по непрерывной нити как по направляющей; 6) подтягиванием хромосомной нити ферментами клеточного центра с одновременным отщеплением от нее фрагментов.

Вопрос 2. В чём заключается биологический смысл различий в течении митотического цикла клеток разных тканей многоклеточного организма?

Биологическое значение митоза в том, что митоз обеспечивает строго одинаковое распределении хромосом между дочерними ядрами, что обеспечивает образование генетически идентичных дочерних клеток и сохраняет преемственность в ряду клеточных поколений наследственную передачу признаков и свойств в ряду поколений клеток при развитии многоклеточного организма. Благодаря точному и равномерному распределению хромосом при митозе все клетки единого организма генетически одинаковы.

Митотическое деление клеток лежит в основе всех форм бесполого размножения у многоклеточных организмов.

Вопрос 3. Раскройте сущность и биологическое значение размножения клеток путём митоза.

Митоз — непрямое деление клетки, в результате которого образуются две дочерние клетки с таким же набором хромосом, как в материнской. Митоз состоит из четырех фаз – профазы, метафазы, анафазы и телофазы.

Процесс митоза обеспечивает строго равномерное распределение хромосом между двумя дочерними ядрами, так что в многоклеточном организме все клетки имеют совершенно одинаковые (по числу и по характеру) наборы хромосом. Хромосомы содержат генетическую информацию, закодированную в ДНК, и поэтому регулярный, упорядоченный митотический процесс обеспечивает также полную передачу всей информации каждому из дочерних ядер; в результате каждая клетка обладает всей генетической информацией, необходимой для развития всех признаков организма. В связи с этим становится понятно, почему одна клетка, взятая из полностью дифференцированного взрослого растения, может при подходящих условиях развиться в целое растение.

Мы описали митоз в диплоидной клетке, но этот процесс протекает сходным образом и в гаплоидных клетках, например в клетках гаметофитного поколения растений.

Т.е. биологическое значение митоза состоит в том, что митоз обеспечивает наследственную передачу признаков и свойств в ряду поколений клеток при развитии многоклеточного организма. Благодаря точному и равномерному распределению хромосом при митозе все клетки единого организма генетически одинаковы.

§22. Простое бинарное деление. Митоз. Амитоз

 

1. Какие способы деления характерны для клеток эукариот? Для прокариотических клеток?

Митоз, амитоз, простое бинарное деление, мейоз.

Для клеток эукариот характерны следующие способы деления: митоз, амитоз, мейоз.

Для прокариотических клеток характерно простое бинарное деление.

 

2. Что представляет собой простое бинарное деление?

Простое бинарное деление характерно только для клеток прокариот. Бактериальные клетки содержат одну хромосому – кольцевую молекулу ДНК. Перед делением клетки происходит репликация и образуются две одинаковые молекулы ДНК, каждая из них прикреплена к цитоплазматической мембране. Во время деления плазмалемма врастает между двумя молекулами ДНК таким образом, что в итоге разделяет клетку надвое. В каждой образовавшейся клетке оказывается по одной идентичной молекуле ДНК.

 

3. Что такое митоз? Охарактеризуйте фазы митоза.

Митоз – основной способ деления эукариотических клеток, в результате которого из одной материнской клетки образуются две дочерние с таким же набором хромосом. Для удобства митоз подразделяют на четыре фазы:

● Профаза. В клетке увеличивается объём ядра, начинает спирализоваться хроматин, в результате чего формируются хромосомы. Каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид, соединённых в области центромеры (в диплоидной клетке – набор 2n4c). Растворяются ядрышки, распадается ядерная оболочка. Хромосомы оказываются в гиалоплазме и располагаются в ней беспорядочно (хаотически). Центриоли попарно расходятся к полюсам клетки, где инициируют образование микротрубочек веретена деления. Часть нитей веретена деления идёт от полюса к полюсу, другие нити прикрепляются к центромерам хромосом и способствуют их перемещению в экваториальную плоскость клетки. В клетках большинства растений центриоли отсутствуют. В этом случае центрами образования микротрубочек веретена деления являются особые структуры, состоящие из мелких вакуолей.

● Метафаза. Завершается формирование веретена деления. Хромосомы достигают максимальной спирализации и располагаются упорядоченно в экваториальной плоскости клетки. Образуется так называемая метафазная пластинка, состоящая из двухроматидных хромосом.

● Анафаза. Нити веретена деления укорачиваются, в результате чего сестринские хроматиды каждой хромосомы отделяются друг от друга и растягиваются к противоположным полюсам клетки. С этого момента разошедшиеся хроматиды называются дочерними хромосомами. У полюсов клетки оказывается одинаковый генетический материал (у каждого полюса – 2n2c).

● Телофаза. Дочерние хромосомы деспирализуются (раскручиваются) у полюсов клетки с образованием хроматина. Вокруг ядерного материала каждого полюса формируются ядерные оболочки. В двух образовавшихся ядрах возникают ядрышки. Нити веретена деления разрушаются. На этом деление ядра заканчивается, и начинается разделение клетки надвое. У клеток животных в экваториальной плоскости возникает кольцевая перетяжка, которая углубляется до тех пор, пока не произойдёт разделение двух дочерних клеток. Клетки растений не могут делиться перетяжкой, т.к. имеют жёсткую клеточную стенку. В экваториальной плоскости растительной клетки из содержимого пузырьков комплекса Гольджи образуется так называемая срединная пластинка, которая и разделяет две дочерние клетки.

 

4. Благодаря чему дочерние клетки в результате митоза получают идентичную наследственную информацию? В чём заключается биологическое значение митоза?

В метафазе в экваториальной плоскости клетки находятся двухроматидные хромосомы. Молекулы ДНК в составе сестринских хроматид идентичны друг другу, т.к. образовались в результате репликации исходной материнской молекулы ДНК (это произошло в S-периоде интерфазы, предшествующей митозу).

В анафазе с помощью нитей веретена деления сестринские хроматиды каждой хромосомы отделяются друг от друга и растягиваются к противоположным полюсам клетки. Таким образом, у двух полюсов клетки оказывается одинаковый генетический материал (2n2c у каждого полюса), который по завершении митоза становится генетическим материалом двух дочерних клеток.

Биологическое значение митоза заключается в том, что он обеспечивает передачу наследственных признаков и свойств в ряду поколений клеток. Это необходимо для нормального развития многоклеточного организма. Благодаря точному и равномерному распределению хромосом при митозе все клетки организма генетически идентичны. Митоз обусловливает рост и развитие организмов, восстановление повреждённых тканей и органов (регенерацию). Митотическое деление клеток лежит в основе бесполого размножения многих организмов.

 

5. Количество хромосом — n, хроматид — с. Каким будет соотношение n и с для соматических клеток человека в следующих периодах интерфазы и митоза. Установите соответствие:

1) G1-период

2) G2-период

3) Профаза

4) Метафаза

5) У каждого полюса клетки в конце анафазы

6) В каждой дочерней клетке в конце телофазы

А) n = 23, c = 23

Б) n = 23, c = 46

В) n = 46, c = 46

Г) n = 46, c = 92

1) В G1-периоде каждая хромосома состоит из одной хроматиды, т.е. соматические клетки содержат набор 2n2с, что для человека составляет 46 хромосом, 46 хроматид.

2) В G2-периоде каждая хромосома состоит из двух хроматид, т.е. соматические клетки содержат набор 2n4с (46 хромосом, 92 хроматиды).

3) В профазе митоза набор хромосом и хроматид – 2n4c, (46 хромосом, 92 хроматиды).

4) В метафазе митоза набор хромосом и хроматид – 2n4c (46 хромосом, 92 хроматиды).

5) В конце анафазы митоза вследствие отделения сестринских хроматид друг от друга и их расхождения к противоположным полюсам клетки, у каждого полюса оказывается набор 2n2с (46 хромосом, 46 хроматид).

6) В конце телофазы митоза формируются две дочерние клетки, каждая содержит набор 2n2c (46 хромосом, 46 хроматид).

Ответ: 1 – В, 2 – Г, 3 – Г, 4 – Г, 5 – В, 6 – В.

 

6. Чем амитоз отличается от митоза? Как вы думаете, почему амитоз называют прямым делением клетки, а митоз — непрямым?

В отличие от митоза при амитозе:

● Происходит деление ядра перетяжкой без спирализации хроматина и образования веретена деления, отсутствуют все четыре фазы, характерные для митоза.

● Наследственный материал распределяется между дочерними ядрами неравномерно, случайным образом.

● Часто наблюдается только деление ядра без дальнейшего разделения клетки на две дочерние. В этом случае возникают двуядерные и даже многоядерные клетки.

● Дочерние клетки оказываются неспособными пройти нормальный клеточный цикл и в итоге поделиться путём митоза.

● Затрачивается меньше энергии.

Митоз называют непрямым делением, т.к. по сравнению с амитозом он представляет собой достаточно сложный и точный процесс, состоящий из четырёх фаз и требующий предварительной подготовки (репликации, удвоения центриолей, запасания энергии, синтеза специальных белков и т.д.). При прямом (т.е. простом, примитивном) делении – амитозе ядро клетки без какой-либо специальной подготовки быстро делится перетяжкой, и наследственный материал случайным образом распределяется между дочерними ядрами.

 

7. В ядре неделящейся клетки наследственный материал (ДНК) находится в виде аморфного рассредоточенного вещества — хроматина. Перед делением хроматин спирализуется и образует компактные структуры — хромосомы, а после деления возвращается в исходное состояние. Для чего клетки совершают такие сложные видоизменения своего наследственного материала?

ДНК в составе аморфного и рассредоточенного хроматина при делении было бы невозможно точно и равномерно распределить между дочерними клетками (именно такая картина и наблюдается при амитозе – наследственный материал распределяется неравномерно, случайным образом).

С другой стороны, если бы клеточная ДНК всегда находилась в компактизированном состоянии (т.е. в составе спирализованных хромосом), с неё было бы невозможно считывать всю необходимую информацию.

Поэтому клетка в начале деления переводит ДНК в максимально компактное состояние, а после завершения деления возвращает в исходное, удобное для считывания.

 

8*. Установлено, что у дневных животных максимальная митотическая активность клеток наблюдается вечером, а минимальная — днём. У животных, ведущих ночной образ жизни, клетки наиболее интенсивно делятся утром, ночью же митотическая активность ослаблена. Как вы думаете, с чем это связано?

Дневные животные активны в светлое время суток. Днём они затрачивают много энергии на передвижение и поиск пищи, при этом их клетки быстрее «изнашиваются» и чаще погибают. Вечером, когда организм переварил пищу, усвоил питательные вещества и накопил достаточное количество энергии, активизируются процессы регенерации и, прежде всего, митоз. Соответственно, у ночных животных максимальная митотическая активность клеток наблюдается утром, когда их организм отдыхает после активного ночного периода.

* Задания, отмеченные звёздочкой, предполагают выдвижение учащимися различных гипотез. Поэтому при выставлении отметки учителю следует ориентироваться не только на ответ, приведённый здесь, а принимать во внимание каждую гипотезу, оценивая биологическое мышление учащихся, логику их рассуждений, оригинальность идей и т. д. После этого целесообразно ознакомить учащихся с приведённым ответом.

Дашков М.Л.

Сайт: dashkov.by

Вернуться к оглавлению

 

< Предыдущая   Следующая >

«Деление клетки. Митоз». 10-й класс

Категория: Биология.

“Всякая клетка из клетки”.
Р.Вирхов

Цель урока: изучить митотический цикл и митоз, как один из видов деления клетки, показать биологическое значение митоза.

Задачи:

  • сформировать знания о значении деления клетки для роста, развития, размножения клетки и организма в целом; рассмотреть механизм митоза;
  • охарактеризовать основные этапы клеточного и митотического цикла;
  • совершенствовать умения работать с микроскопом;
  • выявить биологическое значение митоза.

Оборудование: компьютер, микроскопы, микропрепараты “Митоз в клетках корешка лука”, интерактивная доска, мультимедийная презентация “Деление клетки. Митоз”, диск — “лабораторный практикум Биология 6-11 класс”, видеоролик “Стадии митоза”, видеофрагмент “Деление клетки “митоз”, магниты, динамическая схема “митоз”.

ХОД УРОКА

1.Организационный момент.

Постановка цели урока, определение проблемы и темы урока.

В момент рождения ребенок весит в среднем 3 – 3,5 кг и имеет рост около50 см, детеныш бурого медведя, чьи родители достигают веса 200 кг и более, весит не более 500 г, а крошечный кенгуренок – менее 1 грамма.Из серого невзрачного птенца вырастает прекрасный лебедь, юркий головастик превращается в степенную жабу, а из посаженного возле дома желудя вырастает громадный дуб, который спустя сотню лет радует своей красотой новые поколения людей.

Проблемный вопрос. Благодаря каким процессам возможны все эти изменения?

Все эти изменения возможны благодаря способности организмов к росту и развитию. Дерево не превратиться в семя, рыба не вернется в икринку – процессы роста и развития необратимы. Эти два свойства живой материи неразрывно связаны друг с другом, и в их основе лежит способность клетки к делению и специализации.

Тема  урока “Деление клетки. Митоз”.

В ходе нашего урока мы с вами составим небольшой справочник по теме нашего урока, который вам поможет в дальнейшей учебе и подготовке к ЕГЭ.

Для того, чтобы приступить к изучению новой темы нам изучить митоз необходимо вспомнить изученный ранее материал (строение ядра, строение хромосомы, ДНК, клеточный центр) Слайд 2

2. Изучение нового материала. (Составлением и заполнение справочника по теме урока)

ТИПЫ ДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК (слайд 3)

Одно из положений клеточной теории основано на выводе немецкого ученого Рудольфа Вирхова “Всякая клетка из клетки”. Так было положено начало изучения процессов клеточного деления, основные закономерности которого были выявлены в конце XIX века.

АМИТОЗ (прямое деление) деление интерфазного ядра путем перетяжки без образования веретена деления (хромосомы в световом микроскопе вообще неразличимы). Такое деление встречается у одноклеточных организмов (например, амитозом делятся полиплоидные большие ядра инфузорий), а также в некоторых высокоспециализированных клетках растений и животных с ослабленной физиологической активностью, дегенерирующих, обреченных на гибель, либо при различных патологических процессах, таких как злокачественный рост, воспаление и т. п. После амитоза клетка не способна вступать в митотическое деление

МИТОЗ (от греч. Mitos- нить) непрямое деление, — основной способ деления эукариотических клеток. Митоз — это процесс деления клетки, в результате которого дочерние клетки получают генетический материал, иднтичный тому, который содержался в материнской клетке.

МЕЙОЗ (непрямое деление) это особый способ деления клеток, в результате которого происходит редукция (уменьшение) числа хромосом вдвое. В ходе мейоза происходит два клеточных деления и из одной диплоидной клетки (2n2c) образуются четыре гаплоидные (nc) половые клетки. В ходе дальнейшего процесса оплодотворения (слияния гамет) организм нового поколения получит опять диплоидный набор хромосом, т. е. кариотип организмов данного вида в ряду поколений остается постоянным.

Вывод: существует три вида деления клеток, благодаря которым организмы растут, развиваются, размножаются (амитоз, митоз, мейоз).

КЛЕТОЧНЫЙ (ЖИЗНЕННЫЙ) ЦИКЛ КЛЕТКИ (слайд 4, слайд 5)

Деление клеток осуществляется поэтапно. На каждом этапе деления происходят определенные процессы.

Период жизни клетки от момента ее возникновения в процессе деления до гибели или конца последующего деления называется клеточнм (жизненным) циклом клетки.

В жизненном цикле выделяют два этапа: первый этап – подготовка клетки к делению – интерфаза, второй этап – разделение клетки на две – митоз. (слайд 4)

Какой этап клеточного цикла занимает большую часть жизни клетки?

Интерфазой называют промежуток между двумя клеточными делениями.

Какой этап в клеточном цикле занимает большую часть времени (ИНТЕРФАЗА)

Название этой стадии возникло еще в XIXвеке, когда о деятельности клеток могли судить только по изменениям их морфологии, так как единственным инструментом исследования был световой микроскоп. Поскольку морфологические изменения в клетке происходят во время деления, то к ним и было приковано внимание биологов. На самом деле в интерфазу происходят важнейшие события в клеточной жизни. Длительность интерфазы и всего клеточного цикла может варьировать от 1-3 часа до 18-20 часов. В интерфазу происходит транскрипция, трансляция, репликация.В конце интерфазы хромосомы удвоенные.

Вопросы для закрепления.

1. Какие основные процессы происходят в интерфазе? (рост клетки, синтез молекул РНК, АТФ, белков, редупликация ДНК, увеличение числа органоидов цитоплазмы)

2. В каком периоде интерфазы происходит удвоение ДНК? (синтетическом).

ФАЗЫ МИТОЗА (Слайд 4,5,6)

Ребята! Сейчас вашему вниманию будет представлен ролик “МИТОЗ”. Вам необходимо внимательно его просмотреть, а затем выполнить задание.

ЗАДАНИЕ. Определите и запишите названия фазы соответствующей ее описанию.

Состояние ядра в клетке Название фазы митоза
Хромосомы, собравшись у полюсов, раскручиваются; происходит образование ядерной оболочки; заканчивается делением цитоплазмы  
Хромосомы располагаются в экваториальной плоскости клетки; прикрепление центромер к нитям веретена деления.  
Расхождение сестринских хроматид к полюсам клетки  
Расхождение центриолей и начало образования веретена деления; растворение ядерной оболочки; исчезновение ядрышка.  

Ребята! Предлагаю вашему вниманию стихотворение, которое помогает запомнить последовательность фаз митоза.

Цикл жизни клетки – интерфаза и митоз,
А как он протекает? – это главный вопрос.
Об этом не скажешь ведь в двух словах,
Процесс жизни клетки рассмотрим в стихах.

Интерфаза длится дольше, чем само деление,
Очень быстро происходит ДНК удвоение.
Идет биосинтез, активны ферменты.
Клетка растет, образует органоиды и элементы

Затем следует митотическое деление,
Фазы его легко запомнить — и в этом нет сомнения.
Внимательно на них ты посмотри.
Каждая фаза как член большой и дружной семьи.

Глава семьи – папа (всем ясно сразу),
И первая фаза митоза — профаза.
Исчезло ядрышко и ядерная оболочка,
Но на этом рано еще ставить точку.
Хромосомы укорачиваются, утолщаются,
В компактные формы превращаются.
И затем без промедления —
Появляются нити веретена деления.

Мама — солнышко наше, тепло, доброта.
Метафаза – вторая фаза митоза всегда.
Дети для мамы равны без дозатора,
Хромосомы лежат в области экватора

Дочка — Аня в семье — просто принцесса.
Анафаза – третья фаза процесса.
Убедиться в этом ты можешь сам —
Нити веретена деления оттягивают
хроматиды к различным полюсам.

Сынок в семье Толя – ну, как по заказу
Четвертая фаза митоза – телофаза.
Хромосомы раскручиваются, у них выход один —
Снова превратиться в хроматин.
После деления цитоплазмы и органоидов клетки,
Появляются две прелестные, чудные детки.
Имеют диплоидный набор дочерние клетки
и в точности похожи на материнскую клетку.

3. Закрепление изученного материала.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Тема: “Митоз в клетках корешка лука”.

Цель: изучить процесс митоза в клетках корешка лука.

Оборудование: световые микроскопы, микропрепараты “Митоз в клетках корешка лука”.

Ход работы

1. Рассмотрите готовый микропрепарат, по возможности найдите клетки на всех стадиях митоза.
2. Сравните изображение под микроскопом с микрофотографией в презентации к уроку (слайд).
3. Определите набор хромосом в каждой фазе митоза.
4. Охарактеризуйте особенности каждой наблюдаемой стадии митоза.
5. Сделайте вывод о роли митоза.
Вопросы для закрепления.

1. Общая масса всех молекул ДНК в 46 хромосомах одной соматической клетки человека составляет 6-10″9 мг. Чему будет равна масса молекул ДНК в: а) метафазе митоза; б) телофазе митоза?

2. Подумайте, могут ли условия окружающей среды повлиять на процесс митоза. К каким последствиям для организма это может привести?

3. Почему в ходе митоза образуются дочерние клетки с набором хромосом, равным набору хромосом в материнской клетке? Какое это имеет значение в жизни организмов?

4. Подумайте, могут ли условия окружающей среды повлиять на процесс митоза. К каким последствиям для организма это может привести?

5. Почему в ходе митоза образуются дочерние клетки с набором хромосом, равным набору хромосом в материнской клетке? Какое это имеет значение в жизни организмов?

В конце урока подводятся итоги, учащиеся составляют схему митоза на доске

Домашнее задание.

1. Изучить п. 21

2. Заполнить таблицу “Митотический цикл клетки”

Объяснить от чего зависит количество хромосом в ДНК на разных этапах митоза.

Митотический цикл клетки

Фазы Процесс, происходящий в клетке Количество хромосом (n)и содержание ДНК (c)
Интерфаза (фазы между делениями) Пресинтетический период    
Синтетический период    
Постсинтетический период   ?
Профаза (первая фаза митоза)    
Метафаза (фаза скопления хромосом)    
Анафаза (фаза расхождения хромосом)    
Телофаза (фаза окончания деления)    

Список литературы.

1. Общая биология 10-11 классы. Профильный уровень. В.К.Шумный, Г.М.Дымшиц.

2. Общая биология. Тесты. Вопросы, задания. В.Б.Захарова, А.Г.Мустафина.

3. Биология 10-11.Практикум. Г.М.Дымшиц, О.В.Саблина и др.

4.Учебное электронное издание “Лабораторный практикум.Биология 6-11 класс”

6.03.2013

Охарактеризуйте фазы и значение митоза

Процесс митоза принято подразделять на четыре основные фазы: профазу, метафазу, анафазу и телофазу . Так как он непрерывен, смена фаз осуществляется плавно — одна незаметно переходит в другую.

В профазе увеличивается объем ядра, и вследствие спирализации хроматина формируются хромосомы. К концу профазы видно, что каждая хромосома состоит из двух хроматид. Постепенно растворяются ядрышки и ядерная оболочка, и хромосомы оказываются беспорядочно расположенными в цитоплазме клетки. Центриоли расходятся к полюсам клетки. Формируется ахроматиновое веретено деления, часть нитей которого идет от полюса к полюсу, а часть — прикрепляется к центромерам хромосом. Содержание генетического материала в клетке остается неизменным (2n4c).

В метафазе хромосомы достигают максимальной спирализации и располагаются упорядоченно на экваторе клетки, поэтому их подсчет и изучение проводят в этот период. Содержание генетического материала не изменяется (2n4c).

В анафазе каждая хромосома «расщепляется» на две хроматиды, которые с этого момента называются дочерними хромосомами. Нити веретена, прикрепленные к центромерам, сокращаются и тянут хроматиды (дочерние хромосомы) к противоположным полюсам клетки. Содержание генетического материала в клетке у каждого полюса представлено диплоидным набором хромосом, но каждая хромосома содержит одну хроматиду (4n4c).

В телофазе расположившиеся у полюсов хромосомы деспирализуются и становятся плохо видимыми. Вокруг хромосом у каждого полюса из мембранных структур цитоплазмы формируется ядерная оболочка, в ядрах образуются ядрышки. Разрушается веретено деления. Одновременно идет деление цитоплазмы. Дочерние клетки имеют диплоидный набор хромосом, каждая из которых состоит из одной хроматиды (2n2c).

Биологическое значение митоза состоит в том, что он обеспечивает наследственную передачу признаков и свойств в ряду поколений клеток при развитии многоклеточного организма. Благодаря точному и равномерному распределению хромосом при митозе все клетки единого организма генетически одинаковы.

Митотическое деление клеток лежит в основе всех форм бесполого размножения как у одноклеточных, так и у многоклеточных организмов. Митоз обусловливает важнейшие явления жизнедеятельности: рост, развитие и восстановление тканей и органов и бесполое размножение организмов.

Разработка урока по теме «Деление клетки. Митоз» 9 кл

Урок биологии в 9-м классе.

Тема: «Деление клетки. Митоз»

Образовательные: сформировать знания о значении деления клетки для размножения, роста и развития организмов, о процессах, протекающих в клетке в интерфазу и в период митоза, о механизме, обеспечивающем постоянство числа и формы хромосом в клетках, равномерное распределение генетической информации между дочерними клетками;

Воспитательные задачи: подвести обучающихся к выводу о материальном единстве органического мира, о необходимости охраны природной среды от загрязнения мутагенами;

Развивающие задачи: развивать логическое мышление, умение устанавливать связь между понятиями, развивать речь, познавательную способность, продолжить формирование навыков самостоятельной работы с текстом и рисунками учебника, с дополнительной литературой.

Элементы содержания: митоз, жизненный цикл клетки, интерфаза, профаза, метафаза, анафаза, телофаза, редупликация, хроматиды, центромера, веретено деления.

Тип урока: комбинированный.

I. Организационный момент.

II. Проверка знаний учащихся.

Биологический диктант по теме «Обмен веществ». (СЛАЙД 1)

Выберите правильные суждения.

III. Изучение нового материала.

III. Актуализация знаний учащихся. Определение темы урока.

Прочитайте высказывания.  Выполните задания. (СЛАЙД 3)

1.  Известно, что каждый организм в природе рано или поздно погибает  — от других организмов, от болезней или просто от старости. Но тем не менее численность организмов многих видов не уменьшается, а виды существуют на Земле сотни тысяч и миллионы лет. 
2.  Большинство многоклеточных животных и растений начинают свой жизненный цикл с одной клетки – зиготы.

Проанализируйте эти факты и ответьте на вопросы:
1. Какое свойство, присущее всему живому, обеспечивает сохранение видов в ряду поколений? (размножение)

2. Какой процесс лежит в основе этого свойства живых организмов. (деление клетки)

 —  Ребята, кто сможет определить тему сегодняшнего урока? (Деление клетки. Митоз) 

(СЛАЙД 4. 5 Задачи урока)

Повторение. (СЛАЙД 2)

1.               Что же такое размножение? Прочитайте материал учебника стр.77 §2.14 1-2 абзац и сформулируйте ответ на наш вопрос. ЗАДАНИЕ 94

Размножение – важнейшая функция живых организмов, которая обеспечивает сохранение видов в ряду поколений. К размножению способны все без исключения живые организмы – от бактерий до млекопитающих. Молекулярная сущность этого процесса выражается в уникальной способности ДНК к самоудвоению молекул.

СЛАЙД 6, 7 Основным способом деления клетки является митоз. СЛАЙД 8

Митоз включает в себя ряд последовательных фаз, в результате которых сначала разделяется ядро, а затем происходит деление цитоплазмы. В результате получаются две абсолютно одинаковые клетки с наборами хромосом, идентичными набору родительской клетки.

Последовательность всех процессов, происходящих в клетке с момента ее возникновения до следующего деления или гибели называется Жизненный цикл клетки.

Часть жизненного цикла клетки от ее возникновения и до начала следующего деления называется интерфазой. В период интерфазы в клетке осуществляются процессы биосинтеза, происходит рост клетки, образование веществ, подавляющих или стимулирующих метаболические процессы и циклы деления.

СЛАЙД 12 Митоз искусственно разделяют на четыре стадии: профазу, метафазу, анафазу и телофазу. ВИДЕО

 Ребята, сейчас мы выполним задание № 95 в рабочей тетради, работая по презентации,  мы  заполним эту таблицу.  

Весь процесс митоза занимает в большинстве случаев от 1 до 2 часов. Каждая фаза длится 15-20 минут. Однако частота митоза в разных тканях и у разных видов различна. Например, в красном костном мозге человека, где каждую секунду образуется 10 млн эритроцитов, в каждую секунду должно происходить 10 млн митозов. А есть клетки, например нейроны, которые вообще не способны к делению и выполняют свои функции от рождения до смерти.

СЛАЙД 18 Значение митоза:

  • митотическое деление клеток приводит к увеличению их числа, обеспечивая процессы роста функционирующего живого организма;

  • обеспечивает замещение клеток истощенных или поврежденных тканей. У человека постоянно заменяются клетки кожи, эпителия кишечника и легких, клетки крови;

  • при этом процессе сохраняется набор хромосом. Дочерние клетки имеют идентичные наборы хромосом и функционируют как гармоничная часть ткани, органа, организма;

  • у низших организмов служит механизмом бесполого размножения, при котором появляется потомство, идентичное родителям.

IV. Закрепление изученного материала.

Беседа по вопросам:

  1. В чем заключается биологическое значение митоза?

  2. Какие фазы включает в себя митоз?

  3. Что происходит в интерфазе:
    А) в покое;
    Б) при подготовке клетки к делению?

Домашнее задание: § 2.14 (повторить раздел III «Клеточный уровень»).

Тест по теме «Фотосинтез»

  1. Фотосинтетическим органоидом клетки растения являются :

а) митохондрии б) хромопласты в) хлоропласты г) комплекс Гольджы

2. Хлорофилл содержится:

а) в строме хлоропластов б) на тилакоидах

в) в межклеточном пространстве листа г) в кристах

3. Процесс распада воды до катионов водорода и гидроксид-ионов под действием энергии света называется:

а) фосфолированием б) метаболизмом в) фотолизом г) окислением

4. В реакциях световой фазы энергия:

а) расходуется в процессе распада глюкозы

б) накапливается в процессе синтеза АТФ

в) накапливается в процессе окисления органических веществ под действием кислорода

г) расходуется в процессе образования АТФ

5. Кислород образуется в результате:

а) фотолиза воды б) реакции темновой фазы

в) разложения воды под действием электротока г) реакций фосфолирования

6. Углекислый газ растение получает через:

а) корни б) устьица в) стебель г) склеренхиму

Биологический диктант по теме «Обмен веществ».

Выберите правильные суждения.

  1. Все живые организмы используют две формы энергии: световую и химическую.

  2. Синтез каких-либо веществ происходит без затрат энергии.

  3. К фототрофным организмам относят только зеленые растения.

  4. Источником кислорода при фотосинтезе является вода.

  5. Реакции темновой фазы обеспечиваются энергией, запасенной во время световой фазы.

  6. К сапрофитам относятся растения, животные, грибы.

  7. К хемоавтотрофным организмам относят нитрифицирующие и серные бактерии.

  8. Паразиты существуют только на живых организмах, нанося им вред.

  9. В генетическом коде каждому виду аминокислоты соответствует только один триплет (кодон).

  10. Существует всего 20 видов тРНК (по количеству аминокислот).

Тест с ответами

  1. Фотосинтетическим органоидом клетки растения являются :

а) митохондрии

б) хромопласты

в) хлоропласты +

г) комплекс Гольджы

  1. Х лорофилл содержится:

а) в строме хлоропластов

б) на тилакоидах +

в) в межклеточном пространстве листа

г) в кристах

3. Процесс распада воды до катионов водорода и гидроксид-ионов под действием энергии света называется:

а) фосфолированием

б) метаболизмом

в) фотолизом +

г) окислением

4.В реакциях световой фазы энергия:

а) расходуется в процессе распада глюкозы

б) накапливается в процессе синтеза АТФ +

в) накапливается в процессе окисления органических веществ под действием кислорода

г) расходуется в процессе образования АТФ

5. Кислород образуется в результате:

а) фотолиза воды +

б) реакции темновой фазы

в) разложения воды под действием электротока

г) реакций фосфолирования

6. Углекислый газ растение получает через:

а) корни

б) устьица +

в) стебель

г) склеренхиму

  1. Мотивация

Подводящий к теме диалог.

Давайте вспомним, что изучает биология? (жизнь)

— мы изучаем жизнь и знаем, что она развивается, но при этом должен возникать еще один вопрос о жизни.

— Что обеспечивает существование и продолжение жизни на Земле?

( способность организмов к размножению и самовоспроизведению в основе которого лежит деление клеток)

Давайте, подумаем, как можно сформировать тему урока?

Тема урока: Способы деления клетки. Митоз

(Записывается на доске и в тетради.)

Наиболее общим способом деления клеток растений и животных является митоз. При этом наследственный материал (ДНК), заключенный в удвоенном наборе хромосом, распределяется равномерно между двумя новыми клетками.

Стадия осмысления

Нужную информацию вы найдете в материале учебника стр. 77 – 81

Работать с текстом мы будем, используя прием «чтение с пометками»

Напоминаю, что во время чтения текста вам необходимо на полях ставить пометки:

! – это интересно

Данный прием требует от вас активного и внимательного чтения.

На выполнение данной работы выделим 10 минут.

Обсуждение результатов работы по вопросам:

  • Что знакомого вы нашли в тексте?

  • Что нового вы узнали из текста?

  • Что в тексте вам показалось интересным?

  • Какие вопросы у вас возникли при чтении, что вам было непонятно?

Объяснение непонятных моментов. (АНИМАЦИЯ «МИТОЗ»)

Стадия рефлексии

1.Закрепим полученную информацию заполнением таблицы «Фазы митоза»

1.укорочение и утолщение удвоенных хромосом.

2. разрушение ядерной оболочки.

3. расхождение центриолей к полюсам клетки, образование веретена деления

Метафаза

1.удвоенные хромосомы выстраиваются на экваторе клетки.

2. нити веретена деления прикрепляются к центромерам хромосом.

Анафаза

  1. образование дочерних хромосом.

  2. расхождение их к разным полюсам клетки.

Телофаза

1.достижение дочерними хромосомами полюсов клетки.

2. формирование ядерной оболочки.

3. исчезновение веретена деления.

Цитокинез

  1. деление цитоплазмы и образование новых клеточных мембран.

  2. образование двух дочерних клеток с диплоидным набором хромосом.

  1. Обобщение

«Способы деления клетки»

1. озвучивание таблицы «Митоз»

ДЕЛЕНИЕ КЛЕТКИ = ДЕЛЕНИЕ ЯДРА + ДЕЛЕНИЕ ЦИТОПЛАЗМЫ

Ход урока

I. Организационный момент.

II. Проверка изученного материала (презентация 2-3 слайд).

(Учащиеся открывают тетради, записывают число, классная работа).

Тестовый контроль «Обмен веществ и энергии”

1. Универсальным источником энергии является:

а) глюкоза б) жир в) АТФ

2. В процессе фотосинтеза кислород образуется при расщеплении:

а) СО2б) Н2О в) АТФ

3. Процесс расщепления высокомолекулярных органических веществ до низкомолекулярных называется:

а) диссоциацией б) ассимиляцией в) диссимиляцией

4. Наибольшее количество АТФ образуется в результате:

А) спиртового брожения б) дыхания в) молочнокислого брожения

5. Процессы анаэробного окисления протекают:

а) в митохондриях б) в пластидах в) в цитоплазме

6. Что происходит в темновую фазу фотосинтеза?

а) образование АТФ б) образование НАДФ·Н2 в) образование углеводов

7. Образуют органические вещества из неорганических, используя неорганический источник углерода и энергию света:

а) гетеротрофы б) фотоавтотрофы в) хемоавтотрофы

8. Как называется 1-ый этап биосинтеза белка?

а) транскрипция, б)трансляция, в) элонгация.

9. Где происходит непосредственное образование полимерной цепи белка?

а) в ядре, б) в клеточном центре, в) в рибосоме.

10. Где происходит копирование генетической информации ДНК?

А) в цитоплазме, б) вне клетки, в) в ядре.

 

После выполнения теста проходит взаимопроверка (учащиеся обмениваются тетрадями с соседом по парте) с помощью презентации (слайд 3)

 

III. Актуализация знаний учащихся. Определение темы урока.

Прочитайте высказывания.  Выполните задания (4 слайд)

1.  Известно, что каждый организм в природе рано или поздно погибает  — от других организмов, от болезней или просто от старости. Но тем не менее численность организмов многих видов не уменьшается, а виды существуют на Земле сотни тысяч и миллионы лет. 
2.  Большинство многоклеточных животных и растений начинают свой жизненный цикл с одной клетки – зиготы.

Проанализируйте эти факты и ответьте на вопросы:
1. Какое свойство, присущее всему живому, обеспечивает сохранение видов в ряду поколений?
2. Какой процесс лежит в основе этого свойства живых организмов.

 —  Ребята, кто сможет определить тему сегодняшнего урока? (Деление клетки. Митоз) (5 слайд)

— Теперь запишите тему урока.

 

IV. Изучение нового материала (беседа с использованием мультимедийной презентации)

1.               Что же такое размножение? Прочитайте материал учебника стр.77 §2.14 1-2 абзац и сформулируйте ответ на наш вопрос.

(Подводя итоги ответов детей, далее работают по 6 слайду)

2.              Жизнь клетки, как и жизнь любого организма, можно разделить на периоды: (7 слайд)

Жизненный цикл клетки и митотический цикл.

— Запишите эти определения в тетрадь. Вам нужно их выучить.

3.     Деление  соматических, т.е. неполовых,  клеток называется митозом. Этот процесс проходит в несколько этапов. (8 слайд) сегодня на уроке мы познакомимся с особенностями каждого этапа митоза.

 Ребята, сейчас начертите в тетради таблицу из 3 колонок, как показано на 9 слайде.

Дальше, работая по презентации,  мы  заполним эту таблицу. (10-14 слайды)

 

Релаксационная физминутка.

 

V.          Закрепление изученного материала (самостоятельная работа учащихся).

1.      Теперь, ребята, проверим, как вы усвоили тему урока. Выполните задание по рисунку. (16-17 слайд).

 

2.      Рассмотрите таблицу «Деление клетки». Охарактеризуйте каждый этап деления клетки.   (Ответы учащихся).

 

VI.       Вывод.  Итог урока. (19 слайд)

— Что такое митоз?

— Какое значение имеет митоз?

Роль воды в жизни человека

Общеизвестно, что вода — источник жизни.

Для жизни человека, вода, наряду с воздухом, занимает одно из важнейших мест в поддержании жизни и здоровья. Человек (как и любой живой организм) состоящий из воды более, чем на 70%,  прожить без неё может очень короткое время. Вода нужна всему живому- животным, птицам, растениям и даже микроорганизмам. Не будет воды- не будет жизни на Земле; в том числе и по причине отсутствия продуктов питания, т.к. растения без воды не вырастут и не выживут, сельскохозяйственным животным, птице вода также жизненно необходима, не говоря уже о том, что рыба живет только в воде. Таким образом,  человеку вода нужна не только сама по себе, но ещё и как средства для производства продуктов питания.

На поверхности нашей Земли, как и в атмосфере, содержится огромное количество воды; и  большую часть занимает не суша, а вода. Но, к сожалению, пригодной для питьевых целей воды не так уж и много (вода в океанах и морях содержит большое количество соли и без опреснения её пить практически невозможно, а опреснение  очень затратно),  да и распределена она на земном шаре неравномерно. К счастью, территория Российской Федерации имеет достаточные запасы пресной  воды (пригодной для питья) воды.

Вода необходима для нормального функционирования организма, так как доставляет к клеткам  кислород и питательные вещества; позволяет перерабатывать пищу в энергию, выводит шлаки и отходы из нашего организма;  участвует в регулировании температуры тела.

Вода способствует тому, чтобы пища, которую мы едим, быстро переваривалась и усваивалась организмом. Вода служит в качестве смазки для наших суставов, а также регулирует и поддерживает температуру нашего тела.

Несмотря на то, что вода не имеет энергетической ценности (в ней отсутствуют белки, жиры и углеводы), она необходима для растворения витаминов, необходимых для нормальной жизнедеятельности человека, в том числе:

C-  участвует в окислительно-восстановительных реакциях, функционировании иммунной системы, способствует усвоению железа. Дефицит приводит к рыхлости и кровоточивости десен, носовым кровотечениям вследствие повышенной проницаемости и ломкости кровеносных капилляров.

B1 (тиамин)- в форме образующегося из него тиаминдифосфата входит в состав важнейших ферментов углеводного и энергетического обмена, обеспечивающих организм энергией и пластическими веществами, а также метаболизма разветвленных аминокислот. Недостаток этого витамина ведет к серьезным нарушениям со стороны нервной, пищеварительной и сердечно-сосудистой систем.

Витамин B2 (рибофлавин)- в форме коферментов участвует в окислительно-восстановительных реакциях, способствует повышению восприимчивости цвета зрительным анализатором и темновой адаптации. Недостаточное потребление витамина B2 сопровождается нарушением состояния кожных покровов, слизистых оболочек, нарушением светового и сумеречного зрения.

Витамин B6 (пиридоксин)- в форме своих коферментов участвует в превращениях аминокислот, метаболизме триптофана, липидов и нуклеиновых кислот, участвует в поддержании иммунного ответа, участвует в процессах торможения и возбуждения в центральной нервной системе, способствует нормальному формированию эритроцитов, поддержанию нормального уровня гомоцистеина в крови. Недостаточное потребление витамина B6 сопровождается снижением аппетита, нарушением состояния кожных покровов, развитием гомоцистеинемии, анемии.

Ниацин в качестве кофермента участвует в окислительно-восстановительных реакциях энергетического метаболизма. Недостаточное потребление витамина сопровождается нарушением нормального состояния кожных покровов, желудочно-кишечного тракта и нервной системы.

B12 играет важную роль в метаболизме и превращениях аминокислот. Фолат и витамин B12 являются взаимосвязанными витаминами, участвуют в кроветворении. Недостаток витамина B12 приводит к развитию частичной или вторичной недостаточности фолатов, а также анемии, лейкопении, тромбоцитопении.

Фолаты- в качестве кофермента участвуют в метаболизме нуклеиновых и аминокислот. Дефицит фолатов ведет к нарушению синтеза нуклеиновых кислот и белка, следствием чего является торможение роста и деления клеток, особенно в быстро пролифелирующих тканях: костный мозг, эпителий кишечника и др. Недостаточное потребление фолата во время беременности является одной из причин недоношенности, гипотрофии, врожденных уродств и нарушений развития ребенка. Показана выраженная связь между уровнем фолата, гомоцистеина и риском возникновения сердечно-сосудистых заболеваний.

Пантотеновая кислота- участвует в белковом, жировом, углеводном обмене, обмене холестерина, синтезе ряда гормонов, гемоглобина, способствует всасыванию аминокислот и сахаров в кишечнике, поддерживает функцию коры надпочечников. Недостаток пантотеновой кислоты может вести к поражению кожи и слизистых.

Биотин- участвует в синтезе жиров, гликогена, метаболизме аминокислот. Недостаточное потребление этого витамина может вести к нарушению нормального состояния кожных покровов.

Ежедневно из нашего организма выводится около 2 литров жидкости. Влага выделяется через кожу, мочевыделительную систему,  кишечник и лёгкие; поэтому запасы воды необходимо своевременно пополнять, в том числе и чтобы не наступило обезвоживание (проявляется усталостью, мышечными и головными болями, жаждой, в тяжелых случаях потерей сознания).

Воду необходимо пить  равномерно в течение дня. Не стоит компенсировать потерю воды чаем или кофе, т.к. они обладают мочегонными свойствами. Пить необходимо не дожидаясь сухости во рту, жажды (в это время уже произошло обезвоживание), не стоит пить «залпом» сразу стакан или кружку воды- лучше через равные промежутки времени(в т.ч.во время перерывов в работе) выпивать по нескольку глотков. Во время тяжелой физической нагрузки, в жарком климате и др. условиях может появиться необходимость в повышенном употреблении питьевой воды, поэтому если нет свободного доступа к питьевой воде,  то во время занятий спортом, в условиях походов, при пребывании в условиях повышенной температуры воздуха и др. необходимо иметь с собой достаточное количество питьевой воды (не использовать в этих целях сладкие газированные напитки, снабжающие организм ненужным дополнительным количеством  сахара и способствующие обезвоживанию организма).

В природе вода играет важнейшую роль. Вода океанов, морей, озёр, рек и других (в том числе искусственно созданных водоемов) играет  очень важную роль в создании мирового климата, а также климата той или иной местности.  Вода играет одну из ключевых ролей в процессе фотосинтеза. Не будь воды, растения не могли бы перерабатывать углекислый газ в кислород, а значит — воздух был бы непригоден для дыхания.

Необходима вода  для обеспечения человека продуктами питания (выращивания сельскохозяйственных культур и животных, птиц), для бытовых нужд, для соблюдения личной гигиены, для производства электрической энергии, для теплоснабжения (центрального отопления) жилых, общественных зданий и промышленных предприятий, для борьбы с вредителями с/х культур, возбудителями инфекционных заболеваний (для дезинфекции), вредными насекомыми (дезинсекции), для повышения плодородия почвы при внесения минеральных удобрений и др.

Доступ к водным ресурсам  является важным фактором жизнеобеспечения любого государства, и иногда приводит к  конфликтам (племенным, межгосударственным — особенно в условиях  пустынь).

Человечеству важно не только иметь доступ к питьевой воде, водам мирового океана, но и сохранять это бесценное богатство!

ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области». 2019г.

По материалам сайта: korotoyak.ru

Митоз — обзор | ScienceDirect Topics

Митотическая пролиферация нейробластов (нейроногенез)

После образования нервной трубки пролиферация нейроэпителиальных клеток в зоне желудочка, связанная с митозами на поверхности желудочка, приводит к образованию нейронов и глиальных клеток. Скорость деления максимальна в начале первого триместра в спинном мозге и стволе головного мозга, а в конце первого и начале второго триместра — в переднем мозге. В желудочковой зоне конечного мозга плода человека только 33 митотических цикла обеспечивают общее количество нейронов, необходимое для зрелой коры головного мозга человека (10 циклов у грызунов), из-за экспоненциального увеличения (Caviness et al. , 1981). Большая часть митотической активности в нейроэпителии происходит на поверхности желудочка, а ориентация митотического веретена определяет последующую непосредственную судьбу дочерних клеток. Если плоскость дробления перпендикулярна поверхности желудочка, две дочерние клетки становятся равноценными нейроэпителиальными клетками, готовящимися к дальнейшему митозу. Если, однако, дробление параллельно поверхности желудочка, две дочерние клетки неравны (асимметричное дробление). В этом случае клетка на поверхности желудочка становится другой нейроэпителиальной клеткой, тогда как клетка, удаленная от поверхности желудочка, отделяется от своего прикрепления к желудочку и становится постмитотическим нейробластом, готовым мигрировать в кортикальную пластинку.Более того, продукты двух генов, определяющих клеточную судьбу, названных numb и notch , находятся на разных сторонах нейроэпителиальной клетки. Поэтому при симметричных дроблениях обе дочерние клетки получают одинаковое количество каждой, но. При асимметричном дроблении клетки получают неравные соотношения каждого из них, что также влияет на их последующее развитие (Mione et al., 1997). Ориентация митотического веретена требует центрактина . Митотическое веретено, нити которого представляют собой микротрубочки, связано с плазматической мембраной во время расщепления цитоплазмы (цитокинеза) белковым комплексом, называемым центральным шпинделем (Лекомцев и соавт., 2012).

Активные митозы прекращаются задолго до рождения в большинстве частей нервной системы человека, но в некоторых участках сохраняется потенциал для постнатальных митозов нейробластов. Одним из известных мест является перивентрикулярная область больших полушарий головного мозга (Kendler and Golden, 1996). Другой — внешний зернистый слой коры мозжечка, где случайные митозы сохраняются до 1-летнего возраста. Постнатальная регенерация этих нейронов после разрушения большей части облучением или цитотоксическими препаратами происходит у животных и может встречаться и у человека. Нейроны первичных обонятельных рецепторов также сохраняют способность к регенерации. В самом деле, если бы постоянный оборот этих нейронов в обонятельном эпителии не происходил на протяжении всей жизни, человек стал бы аносмиком после нескольких инфекций верхних дыхательных путей, которые временно оголяют интраназальный эпителий.

Нейроногенез также включает биосинтез клеточно-специфических белков. Многие из них обнаруживаются в зародышевой матрице как свидетельство ранней приверженности клеток не только нейрональному клону, но также и судьбе специфического типа нейронов.Ранее существовавшая концепция о том, что клетки зародышевого матрикса представляют собой однородно недифференцированные постмитотические нейроэпителиальные клетки, была неверной. Но популяция «стволовых клеток» с митотическим потенциалом также присутствует в субвентрикулярной зоне и непосредственно под зубчатой ​​извилиной гиппокампа (Johansson et al., 1999). Они вызвали значительный интерес из-за возможности регенерации поврежденного мозга взрослого человека и из-за того, что их можно заставить созревать в виде нейронов (Schuldiner et al. , 2001). Однако трансплантированные стволовые клетки имеют повышенный риск неопластической трансформации (Dlouhy et al., 2014). Культуры стволовых клеток могут не только генерировать нейроны, но и даже плохо сформированную миниатюрную кору или целый мозг (Lancaster et al., 2013; van den Ameele et al., 2014).

Цели обучения для курсов бакалавриата по биологии – Программа биологии

BIOL 100 – ИССЛЕДОВАНИЕ ЖИВОГО МИРА:

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Описывать уровни организации и связанные с ними функции у растений и животных.
  • Определение характеристик и основных потребностей живых организмов и экосистем.
  • Объяснять процессы роста и развития особей и популяций.
  • Планировать и критически оценивать научные исследования, которые они проводят.
  • Демонстрация навыков критического мышления.

БИОЛОГИЯ 110 — ЖИЗНЬ ВО ВСЕЛЕННОЙ:

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать основные этапы эволюции звезд главной последовательности различной массы, а также планет и других тел, окружающих эти звезды. .
  • Четко определите, что подразумевается под «жизнью» и «живыми организмами».
  • Понять взаимосвязь между звездной массой, шириной околозвездной обитаемой зоны (CHZ), звездным временем жизни и пригодностью планет для поддержания органической эволюции.
  • Опишите этапы геологической и биологической эволюции на Земле и сравните эти этапы с этапами на других планетах земной группы и спутниках нашей Солнечной системы.
  • Объясните, почему биология на Земле основана на химии углерода, и проанализируйте потенциал биологии, основанной на других элементах.
  • Оцените прогресс, достигнутый на сегодняшний день в идентификации экзосолнечных планет, особенно тех, которые потенциально могут иметь земные условия поверхности.
  • Оцените прогресс, достигнутый на сегодняшний день в исследовательских программах по поиску внеземного разума (SETI).
  • Проанализируйте проблемы, связанные с межзвездными путешествиями, и оцените вероятность посещения Земли инопланетными цивилизациями.

БИОЛОГИЯ 170 — ОСНОВЫ НАУКИ О ЖИЗНИ:

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Описывать уровни организации и связанные с ними функции у растений и животных.
  • Определение характеристик и основных потребностей живых организмов и экосистем.
  • Объяснять процессы роста и развития особей и популяций.
  • Планировать и критически оценивать научные исследования, которые они проводят.
  • Определите решающую роль наук о жизни в планировании учебных программ K-6.
  • Оценивайте успеваемость учащихся с помощью управляемых запросов.
  • Демонстрация навыков критического мышления.

БИОЛОГИЯ 200 — ПРИНЦИПЫ БИОЛОГИИ ОРГАНИЗМОВ И ПОПУЛЯЦИЙ:

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Давать определение основным биологическим понятиям и процессам.
  • Описать уровни организации и связанные с ними функции у растений и животных.
  • Определение характеристик и основных потребностей живых организмов.
  • Объяснять процессы роста и развития особей и популяций.
  • Описывать отношения между организмами и окружающей их средой.
  • Определение воздействия на экосистемы.

БИОЛОГИЯ 201 — ПРИНЦИПЫ КЛЕТОЧНОЙ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать структуру биомолекул, обнаруженных во всех живых организмах.
  • Описать функции и структуру клеток, включая метаболические реакции, происходящие в клетках.
  • Объясните процесс наследования.
  • Опишите, как синтезируются РНК, ДНК и белки.
  • Объясните процесс клеточного деления соматических и зародышевых клеток.
  • Объясните процессы, посредством которых животные получают питательные вещества, воду и кислород, выделяют отходы, защищаются от посторонних веществ, получают информацию об окружающей среде и размножаются.
  • Создайте гипотезу на основе набора наблюдений, а затем спланируйте эксперименты для проверки гипотезы.

БИОЛОГИЯ 203 — КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ В БИОЛОГИИ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Выбрать подходящую схему отбора проб и/или план эксперимента для данного биологического вопроса.
  • Выберите и примените соответствующие аналитические методы к биологическим данным.
  • Продемонстрировать необходимые навыки работы с компьютером для управления биологическими данными, их анализа и графического представления.
  • Критически оценивать первичную литературу по наблюдению и экспериментальной биологии.

БИОЛОГИЯ 210 — АНАТОМИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА I

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать функции и строение клеток.
  • Определение и различие между тканями в организме человека.
  • Объяснять строение и функции систем органов в организме человека.

БИОЛОГИЯ 211 — АНАТОМИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА II

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать функции и строение клеток.
  • Определение и различие между тканями в организме человека.
  • Объяснять строение и функции систем органов в организме человека.

БИОЛОГИЯ 212 — НЕЙРОБИОЛОГИЯ И ПОЗНАВАНИЕ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать структуру и функции клеток, из которых состоит нервная система.
  • Объясните химические и электрические сигналы в нервной системе.
  • Опишите сенсорную и двигательную системы.
  • Объясните развитие мозга и сложные функции мозга.
  • Создайте гипотезу на основе набора наблюдений, а затем предложите эксперименты для проверки гипотезы.

БИОЛОГИЯ 213 — ПОЛ, МИКРОЗЫ И БОЛЕЗНИ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать репродуктивную систему человека.
  • Определить факторы распространения инфекционных болезней.
  • Объяснять биологию и патогенез инфекционных агентов, вызывающих заболевания, передающиеся половым путем.
  • Опишите современные биотехнологии в связи с разработкой вакцин, лечением и улучшенной диагностикой этих заболеваний.
  • Определить проблемы, связанные с эпидемиями заболеваний, передающихся половым путем, для экономики, системы общественного здравоохранения, отдельных лиц и общества в целом.

БИОЛОГИЯ 217 — МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать болезнетворные микроорганизмы и микробные агенты на организменном, клеточном и/или молекулярном уровнях.
  • Соотнесите нормальные клеточные и молекулярные структуры с их функциями.
  • Объясните клеточные процессы и механизмы, которые приводят к физиологическим функциям и патологическим состояниям.
  • Продемонстрировать способность справляться с ситуациями и инцидентами в медицинских учреждениях, связанными с потенциальными патогенами.
  • Применение современных биологических методов для выявления потенциальных патогенов и решения различных научных проблем.

БИОЛ 220 — ТЕХНОЛОГИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ПРИМЕНЕНИЕ И СОЦИАЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ

Учащиеся, успешно закончившие этот курс, смогут:

  • Понимать основные концепции клетки и ее роль в развитии и формировании эмбриона.
  • Объясните, что такое стволовые клетки и их потенциальное применение.
  • Описать методы создания, поддержания и изучения стволовых клеток.
  • Обсудите социальные и этические вопросы и влияние технологии стволовых клеток.
  • Опишите законы и правила технологии стволовых клеток.
  • Описать значение технологии стволовых клеток и их применение в медицине и общественном здравоохранении.

БИОЛОГИЯ 300 — КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

Студенты, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Описывать цитологические, биохимические, физиологические и генетические аспекты клетки, включая клеточные процессы, общие для всех клеток, для всех эукариотических клеток как а также процессы в некоторых специализированных клетках.
  • Соотнесите нормальные клеточные структуры с их функциями.
  • Объясните клеточные процессы и механизмы, которые приводят к физиологическим функциям, а также примеры патологических состояний.
  • Применение современных клеточных технологий для решения различных научных задач.
  • Опишите сложные отношения между различными клеточными структурами и их соответствующими функциями.

БИОЛОГИЯ 301 — МИКРОБИОЛОГИЯ

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать клеточные, биохимические и физиологические аспекты микроорганизмов и определять сходство и различие между микробными группами (бактерии, археи, грибы, простейшие). вирусы, вироиды и прионы).
  • Объяснять клеточные и биохимические процессы, участвующие в патогенезе (взаимодействия человека и патогена).
  • Определение микроорганизмов и их роли в различных средах.
  • Описать культурное использование микроорганизмов в производстве продуктов питания, медицины, производства топлива и обработки отходов.
  • Применение методов микробиологии (культуры клеток, химические и молекулярные методы) для решения научных задач.

БИОЛОГИЯ 302 — ГЕНЕТИКА

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Применять количественные навыки решения задач в области генетики.
  • Продемонстрировать свою способность рассуждать как индуктивно, так и дедуктивно, используя экспериментальную информацию и данные.
  • Описать хромосомную теорию, молекулярную генетику, количественную и эволюционную генетику.
  • Выберите и примените экспериментальные процедуры для решения генетических проблем.

БИОЛОГИЯ 303 — ЭВОЛЮЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать теорию естественного отбора.
  • Объясните, как возникают новые виды.
  • Построить филогенетическое дерево.
  • Объясните механизмы, лежащие в основе эволюции на молекулярном уровне.

БИОЛОГИЯ 304 — СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать метаболические реакции, происходящие в клетках.
  • Сравните структуру и функции систем органов у различных типов животных.
  • Объясните, как животные приспосабливаются к изменчивым условиям окружающей среды.
  • Опишите этапы передачи нервных импульсов.

БИОЛОГИЯ 305 — БИОЛОГИЯ СТАРЕНИЯ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Продемонстрировать понимание теорий старения.
  • Применять различные измерения возрастных изменений населения и отдельных лиц.
  • Интерпретация эволюционных и сравнительных аспектов долголетия и старения.
  • Опишите различные исследовательские модели, используемые для изучения старения.
  • Отчет и анализ научных открытий в области старения.
  • Объясните механизмы, лежащие в основе процессов старения.

БИОЛОГИЯ 310 — БИОЛОГИЯ ПОЗВОНОЧНЫХ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Объяснять эволюцию позвоночных от первичных позвоночных до высших млекопитающих.
  • Описать классификацию позвоночных.
  • Применить биологию позвоночных к основным физиологическим, эволюционным и экологическим концепциям.
  • Определите основные группы позвоночных и опишите их отличительные черты.
  • Объясните влияние деятельности человека на позвоночных животных в естественных сообществах.

БИОЛОГИЯ 311 — БИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Выявлять и описывать особенности строения растений.
  • Обсудите основные процессы обмена веществ, транспорта, питания, роста и размножения растений.
  • Описать основные эволюционные линии растений и их определяющие характеристики.
  • Определение видов растений, важных для местных экосистем.
  • Опишите культурное использование растений для производства продуктов питания, волокна, медицины, биотехнологии и т. д.
  • Обсудите растения в контексте более широких экологических проблем, таких как изменение климата, разрушение среды обитания, загрязнение, инвазивные виды и сельское хозяйство.

БИОЛОГИЯ 312 — МОРСКАЯ БИОЛОГИЯ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Идентифицировать организмы, обитающие в приливной зоне Южной Калифорнии.
  • Объяснять структуру и функции морских экосистем.
  • Описать химические и физические свойства морской воды и Мирового океана.
  • Описать организмы, обитающие в морской среде.
  • Создайте гипотезу на основе набора наблюдений, а затем спланируйте эксперименты для проверки гипотезы.

БИОЛОГИЯ 313 — БИОЛОГИЯ ЗАЩИТЫ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Описывать методы оценки ресурсов.
  • Критический анализ факторов, вовлеченных в историческую эволюцию консервации.
  • Анализ общенаучных основ консервации.
  • Анализ управления сохранением как стратегии землепользования.
  • Критически оценить взаимосвязь между человеческими и научными взглядами на сохранение.
  • Критически оценить применение ключевых теорий популяционной и эволюционной экологии для научной охраны природы.
  • Оценка методов измерения биоразнообразия.
  • Анализ концепции заповедника с точки зрения целей сохранения.

БИОЛОГИЯ 315 — ВВЕДЕНИЕ В БИОФИЗИКУ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Объяснять основные концепции и принципы физики и их приложения к биологическим системам.
  • Применение навыков решения практических задач в области наук о жизни.
  • Выберите подходящие биофизические методы для характеристики биологических систем и оценки их ограничений.
  • Анализ сложных вопросов биофизики с помощью моделирования.
  • Используйте различные программы моделирования с анализом и отображением данных, чтобы делать выводы об экспериментальных ситуациях.
  • Критически оценивать научную и медицинскую литературу.
  • Организовывать и ясно и убедительно выражать мысли в устной и письменной форме.

БИОЛОГИЯ 316 — ЗООЛОГИЯ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Объяснять эволюцию строения тела животных от простого к сложному.
  • Описать систему классификации беспозвоночных животных.
  • Применение основных физиологических и экологических концепций к беспозвоночным животным.
  • Определите основные группы беспозвоночных и опишите их основные характеристики.
  • Определение воздействия человека на популяции беспозвоночных и экосистемы, в которых они обитают.

БИОЛОГИЯ 317 — ПАРАЗИТОЛОГИЯ

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Объяснять основы паразитарного образа жизни в контексте экологических и эволюционных сил.
  • Применение основных физиологических, эволюционных и экологических концепций к паразитическим отношениям.
  • Определите основные группы паразитов и опишите их основные характеристики.
  • Опишите влияние паразитарных инфекций на здоровье и историю человека.
  • Объяснить медицинские и медицинские аспекты паразитарных инфекций человека.

БИОЛОГИЯ 318 — МЕДИЦИНСКАЯ МИКОЛОГИЯ

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать, как и почему грибки влияют на нашу жизнь.
  • Определите, чем плесень отличается от других микробов/бактерий.
  • Классификация пресс-форм.
  • Определите характеристики основных групп грибов.
  • Определение основных типов патогенных видов.
  • Идентифицируйте вызываемые болезни.
  • Назовите основные признаки грибковой патологии

БИОЛ 319 — СИСТЕМАТИКА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ РАСТЕНИЙ

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описать биологические основы классификации растений.
  • Распознавать основные семейства растений Северной Америки наизусть.
  • Распознавание экологически и экономически важных видов растений Калифорнии по внешнему виду.
  • Определение неизвестных видов растений с помощью дихотомических ключей.
  • Используйте разнообразные таксономические ресурсы для идентификации растений, включая электронные и печатные СМИ, справочные материалы и гербарные коллекции.
  • Обсуждение текущих вопросов эволюции и классификации растений.

БИОЛОГИЯ 320 — ГЛУБОКОВОДНАЯ БИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Идентифицировать организмы в глубоководных районах.
  • Различать глубоководные экосистемы и описывать их основные характеристики (абиотические и биотические условия).
  • Анализ специализированных биологических приспособлений к экстремальному давлению, температуре, свету и другим условиям.
  • Примените эти общие биологические приспособления для создания теоретического организма, эволюционировавшего в глубоководных водах.
  • Объясните текущее и прогнозируемое антропогенное воздействие на глубоководные экосистемы.
  • Опишите историю, технологии и основные экспедиции по исследованию морских глубин.

БИОЛОГИЯ 326 — НАУЧНАЯ И ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ ЭТИКА

Студенты, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Описывать основные элементы этической теории.
  • Анализ и представление результатов сложных этических дел.
  • Подготовка и проведение эффективных устных презентаций по этическим вопросам.
  • Провести исследование и написать статью объемом 1000 слов по одному из аспектов этики.

БИОЛОГИЯ 332 — РАК И ОБЩЕСТВО

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Применять индуктивные и дедуктивные рассуждения для оценки биологических механизмов, ведущих к индукции рака.
  • Оценка вклада экологических и генетических факторов в возникновение рака.
  • Описать новейшие методы диагностики и лечения рака.
  • Определение проблем и проблем общественного здравоохранения, связанных с раком.
  • Реально оценивать информацию, полученную из современной литературы, новостей и интернет-источников о причинах, профилактике и лечении рака.

BIOL 333 — ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРОБЛЕМЫ ОБЩЕСТВЕННОГО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Выявлять проблемы и проблемы общественного здравоохранения.
  • Оценка способствующих факторов окружающей среды и поведения, а также инфекционных агентов, которые приводят к новым инфекционным заболеваниям и проблемам со здоровьем.
  • Опишите причины вышеуказанных факторов, которые приводят к проблемам и проблемам общественного здравоохранения.
  • Объясните механизмы, используемые микробными агентами для возникновения новых инфекционных заболеваний.
  • Критически оценить психологическое, социальное и экономическое воздействие кризисов в области общественного здравоохранения на человеческое население в их сообществах, странах и, т.е. во всем мире.

БИОЛОГИЯ 335 — БИОСФЕРА

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Объяснить, как развивалась жизнь на планете.
  • Объясните, как эндосимбиоз может объяснить происхождение эукариотических клеток.
  • Описать структуру и состав атмосферы.
  • Проведите различие между краткосрочным и долгосрочным изменением климата и объясните, как возникают эти изменения.
  • Опишите, как ресурсы Земли используются людьми и как это влияет на окружающую среду.

БИОЛ 342 — ЗООПАРК: СОХРАНЕНИЕ, ОБРАЗОВАНИЕ И ОТДЫХ

Учащиеся, успешно закончившие этот курс, смогут:

  • Описать роли биологии, бизнеса, экономики и образования в зоопарке.
  • Анализ взаимодействия биологии, бизнеса, экономики и образования в зоопарке. Этот анализ будет включать способы, которыми эти дисциплины дополняют друг друга и противоречат друг другу.
  • Письменно и устно отразить зоопарк как социальный институт и роль зоопарка в современном обществе.
  • Описать процессы сбора и демонстрации флоры и фауны в зоопарках.
  • Анализ развития коллекции зоопарка.
  • Опишите влияние макроэкономики на зоопарк.

БИОЛОГИЯ 345 — НАУКА И ГОСУДАРСТВЕННАЯ ПОЛИТИКА

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Обсуждать освещение в СМИ вопросов научной политики.
  • Обсудите научные данные, лежащие в основе основных вопросов государственной политики, рассматриваемых в классе.
  • Отличать высококачественные научные исследования от текстов, основанных на мнениях или идеологии.
  • Оценка заявлений политиков относительно научной ценности государственной политики.
  • Опишите процесс разработки научной политики США и оцените роль заинтересованных групп в принятии решений.
  • Обсудите преимущества и недостатки основных решений государственной политики.
  • Представлять научную информацию в формате, понятном политикам.
  • Поиск серьезных научных исследований по вопросам общественной важности

БИОЛОГИЯ 389 — НАУКА ИСКУССТВА И ИСКУССТВО НАУКИ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Распознавать, переводить и разбирать ключевые научные концепции и перерабатывает в эстетическое и информационное искусство с использованием художественных медиа и мультимедийных приложений.
  • Исследуйте отношения между искусством и наукой в ​​художественной и биологической рамках.
  • Наблюдайте и идентифицируйте таксономически важные физические признаки у растений, животных и микробов, а затем создавайте точные репрезентативные иллюстрации и анимацию предмета.
  • Развивайте художественные навыки, которые эффективно иллюстрируют как разнообразных биологических существ, так и научные концепции.
  • Объедините биологические и художественные материалы, разработанные для обучения других науке.

БИОЛОГИЯ 400 — МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Учащиеся, успешно закончившие этот курс, смогут:

  • Применять навыки решения задач для решения биологических задач.
  • Запишите результаты экспериментального исследования в лабораторный отчет.
  • Продемонстрировать свою способность рассуждать как индуктивно, так и дедуктивно, используя экспериментальную информацию и данные.
  • Объясните функцию, репликацию и эволюцию геномов.
  • Выбор и применение экспериментальных процедур для решения биологических задач.

БИОЛ 401 — БИОТЕХНОЛОГИЯ И МЕТОДЫ РЕКОМБИНАТНОЙ ДНК

Учащиеся, успешно закончившие этот курс, смогут:

  • Описывать биокатализ, инженерию путей, контроль биопроцессов и последующую обработку.
  • Продемонстрировать свою способность рассуждать как индуктивно, так и дедуктивно, используя экспериментальную информацию и данные.
  • Объяснить теорию и практику технологии рекомбинантной ДНК.
  • Выберите и примените экспериментальные процедуры к спектру областей с использованием биотехнологии.

БИОЛ 404 — КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ И ЖИВОТНЫХ ТКАНЕЙ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Выращивать, поддерживать и размножать определенные типы клеток растений и животных в стерильной среде.
  • Обработка, хранение и идентификация клеток в культуре.
  • Подсчет, идентификация и оценка жизнеспособности клеток с помощью микроскопического исследования.
  • Определение проблем, связанных с выращиванием, хранением и идентификацией широкого спектра различных типов клеток.
  • Опишите, как можно использовать клеточную культуру для исследований in vitro и коммерческого применения.
  • Анализ данных с использованием соответствующих методов.
  • Составьте точный отчет о своей лабораторной работе в виде лабораторной тетради, включая временные планы и отчеты о своей деятельности.
  • Подготовить отчет о своей работе, который использует ряд навыков письменного выражения и использует соответствующую лексику, состоящую из практического отчета.

БИОЛ 405 — БИОХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Моделировать и анализировать простые биореакторные системы, включая хемостаты и ферментные реакторы периодического действия, используя модели первых принципов.
  • Анализ моделей метаболических путей для применения в реакционных системах хемостата.
  • Процедуры конструирования на основе экспрессии чужеродных генов в E. coli с использованием принципов клеточной химии.
  • Разработка исторической экспозиции биотехнологии.
  • Анализ данных периодического биореактора.
  • Оценка разделительных систем для разделения клеток и очистки внутриклеточных и секретируемых соединений из бактериальных и животных клеточных культур.

БИОЛОГИЯ 406 — ЭВОЛЮЦИОННАЯ БИОГЕОГРАФИЯ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Связать закономерности в распространении современных видов с прошлыми геологическими и климатическими событиями.
  • Опишите основные биогеографические регионы Земли.
  • Сравните биотические и абиотические процессы, управляющие ареалами видов.
  • Различие между моделями расселения и викариации для дизъюнктивных распределений видов.
  • Интерпретация кладограммы площади.
  • Обсудите сильные и слабые стороны теории островной биогеографии.

БИОЛОГИЯ 407 — ЭКОЛОГИЯ ПОВЕДЕНИЯ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Объяснять влияние естественного отбора на поведение.
  • Опишите и приведите примеры репродуктивного поведения и стратегий спаривания, используемых животными.
  • Объяснять корпоративные и конкурентные поведенческие взаимодействия.
  • Дайте определение эусоциальности и объясните затраты и преимущества этой стратегии.

БИОЛОГИЯ 416 — РАДИОБИОЛОГИЯ И РАДИОНУКЛИДЫ

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Объяснять основные понятия и принципы радиационной физики
  • Объяснять генетические эффекты ионизирующего излучения.
  • Рассчитайте дозы облучения и оцените риск.
  • Используйте различные программы моделирования, включающие анализ и отображение данных, чтобы делать выводы о радиационном воздействии и дозе.
  • Объяснить принципы радиационной защиты.
  • Объяснить принципы работы различных детекторов радиации.
  • Критически оценивать научную и медицинскую литературу.
  • Организовывать и ясно и убедительно выражать мысли в устной и письменной форме.

БИОЛОГИЯ 420 — КЛЕТОЧНАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Определять основные компоненты иммунной системы на органном, клеточном и молекулярном уровнях.
  • Обсудите нормальные функции этих компонентов во время иммунных реакций.
  • Выяснить взаимосвязь между основными клеточными и молекулярными компонентами иммунной системы.
  • Объясните неблагоприятные функции этих клеточных и молекулярных компонентов при ненормальных обстоятельствах.
  • Описать механизмы заболеваний, связанных с неблагоприятными функциями иммунной системы.
  • Применение иммунологических методов для решения определенных клинических и исследовательских задач.

БИОЛОГИЯ 421 — ВИРОЛОГИЯ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать общие свойства вирусов.
  • Отличие вирусов от других типов микробных агентов.
  • Выяснить механизмы, которые вирусы используют для репликации в своих хозяевах.
  • Объясните патогенетические механизмы вирусных заболеваний.
  • Опишите механизмы иммунной защиты, используемые хозяином для борьбы с вирусными агентами.
  • Опишите концепцию, практику и значение иммунизации.
  • Определить основные диагностические методы, используемые для оценки вирусов в различных образцах.
  • Назовите основные патогенные вирусы и вызываемые ими заболевания.
  • Примените знания, полученные в ходе этого курса, для предотвращения вирусных инфекций.

БИОЛОГИЯ 422 — ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Продемонстрировать понимание того, как вода движется в растениях на молекулярном и организменном уровнях.
  • Продемонстрировать понимание биохимических процессов фотосинтеза, гликолиза, цикла лимонной кислоты и транспорта электронов.
  • Используйте простые лабораторные навыки в научных измерениях.
  • Написать научно-исследовательскую работу.

БИОЛОГИЯ 423 — КЛЕТОЧНАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ НЕЙРОБИОЛОГИЯ

Студенты, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Описывать функции и структуру клеток, составляющих нервную систему.
  • Объясните на молекулярном уровне химические и электрические сигналы в нервной системе.
  • Объясните, как гены регулируются в нервной системе.
  • Создайте гипотезу на основе набора наблюдений, а затем спланируйте эксперименты для проверки гипотезы.

БИОЛОГИЯ 424 — ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА

Студенты, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать функции и структуру клеток, включая метаболические реакции, происходящие в клетках.
  • Опишите на молекулярном уровне передачу сигналов в возбудимых клетках.
  • Объяснять строение и функции систем органов в организме человека.

БИОЛОГИЯ 425 — ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Применять количественные навыки решения задач в области генетики человека.
  • Оценка биологических факторов, влияющих на наследственность человека.
  • Продемонстрировать свою способность рассуждать как индуктивно, так и дедуктивно, используя экспериментальную информацию и данные.
  • Объяснять молекулярные и биохимические основы диагностики и лечения генетических заболеваний.
  • Выберите и примените экспериментальные процедуры для генетического скрининга.

БИОЛОГИЯ 426 — ГЕМАТОЛОГИЯ

Студенты, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Определять морфологию и функции нормальных клеток крови.
  • Описать дифференцировку и метаболизм клеток крови.
  • Объяснить патогенез гематологических заболеваний.
  • Применение технологии клинической диагностики для выявления нормальных и больных клеток крови.
  • Определите психологические и социальные последствия эпидемических заболеваний крови.
  • Объясните влияние пандемических заболеваний крови человека на мировую цивилизацию и экономику.

БИОЛОГИЯ 427 — БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать и сравнивать стадии развития, которые происходят у различных типов животных.
  • Объясните механизмы, которые приводят к определению клеток.
  • Описать эволюционную консервацию механизмов развития.
  • Создайте гипотезу на основе набора наблюдений, а затем спланируйте эксперименты для проверки гипотезы.

БИОЛОГИЯ 428 — БИОЛОГИЯ РАКА

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Оценивать биологические факторы, влияющие на рак человека.
  • Продемонстрировать свою способность рассуждать как индуктивно, так и дедуктивно, используя экспериментальную информацию и данные.
  • Объяснять молекулярные и биохимические основы диагностики и лечения рака.
  • Выбор и применение экспериментальных процедур для скрининга и лечения рака.

БИОЛОГИЯ 431 — БИОИНФОРМАТИКА

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать поток и регулирование биологической информации.
  • Описать методы, используемые для сбора данных о последовательности и экспрессии.
  • Определить соответствующие базы биологических данных для конкретных анализов.
  • Надлежащим образом управлять сетевыми ресурсами.
  • Анализ экспрессии генов и интерпретация ее значения.
  • Управление инструментами биоинформатики.
  • Применять соответствующие статистические методы для определения сходства последовательностей.

БИОЛОГИЯ 432 — ПРИНЦИПЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Определять обстоятельства, при которых возникает болезнь или сохраняется здоровье среди людей.
  • Выявление проблем гигиены окружающей среды в местных сообществах, обществе в целом и во всем мире.
  • Выбор и применение экспериментальных процедур для решения эпидемиологических проблем.
  • Применять количественные навыки решения задач для решения проблем общественного здравоохранения и гигиены окружающей среды.
  • Рассуждать как индуктивно, так и дедуктивно, используя экспериментальную, демографическую информацию и данные.
  • Применять знания и навыки, полученные в ходе этого курса, в управлении и планировании систем охраны здоровья и окружающей среды.

БИОЛОГИЯ 433 — ЭКОЛОГИЯ И ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Описывать закономерности распространения растений и животных в зависимости от абиотических и биотических факторов.
  • Определить основные характеристики, лежащие в основе природных экосистем.
  • Объясните модельную популяцию и динамику на уровне сообщества.
  • Интерпретация и представление экологических результатов.
  • Определение глобальных экологических проблем.

BIOL 434 — ВВЕДЕНИЕ В БИОМЕДИЦИНСКУЮ ИЗОБРАЖЕНИЕ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Объяснять принципы и основные концепции пяти методов клинической визуализации.
  • Проанализируйте изображения с точки зрения структуры и функции изображенных органов.
  • Сравните диагностическую полезность изображений из разных модальностей.
  • Используйте программное обеспечение для обработки изображений для улучшения клинических изображений.
  • Оцените междисциплинарный характер медицинской визуализации.
  • Критически оценивать научную и медицинскую литературу.
  • Анализ сложных проблем в диагностической визуализации.
  • Организовывать и ясно и убедительно выражать мысли в устной и письменной форме.

БИОЛОГИЯ 435 — ЭТНОБОТАНИКА

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Размышлять (используя обширные письменные задания) о культурных представлениях о восприятии растений.
  • Применить полученные знания для изучения традиционного использования растений племенными народами.
  • Анализ воздействия современных человеческих обществ на традиционные культуры и естественную среду обитания, а также глобальное перемещение растений и человеческих культур.
  • Сравните мудрость традиционной и западной медицины.
  • Подумайте о роли растений в символике, ритуалах и религии.
  • Оценить роль растений в современной технике.
  • Результат 4. 2 Эффективно писать в различных формах.
  • Интеграция контента, идей и подходов с точки зрения интеграции различных дисциплин.

БИОЛОГИЯ 450 — ИХТИОЛОГИЯ: БИОЛОГИЯ РЫБ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Объяснять развитие и основные этапы эволюции рыб.
  • Описывать и применять систему классификации рыб.
  • Применение основных физиологических и экологических концепций к рыбам.
  • Определите основные группы рыб и местные аборигенные виды и опишите их основные характеристики.
  • Определение воздействия человека на популяции рыб и экосистемы, в которых они обитают.

БИОЛОГИЯ 451 — ОРНИТОЛОГИЯ

Студенты, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Описывать современные теории эволюции и разнообразия птиц.
  • Укажите основные физиологические и поведенческие приспособления птиц.
  • Объясните основную экологическую динамику птиц.
  • Определить текущие проблемы охраны птиц и пути решения этих проблем.
  • Дифференциация калифорнийских видов птиц.

БИОЛОГИЯ 452 — ЭНТОМОЛОГИЯ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать значение полезных насекомых и насекомых-вредителей для человека.
  • Сопоставьте морфологию вставок с их экологической функцией.
  • Опишите классификацию и основные направления эволюции отрядов насекомых.
  • Надлежащее размещение и сохранение образцов насекомых.
  • Определите отряды насекомых и важные семейства.

БИОЛОГИЯ 453 — МЕТОДЫ В ЭКОЛОГИИ ПОПУЛЯЦИЙ И СООБЩЕСТВ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Описывать механизмы регулирования популяций и сообществ.
  • Описать динамику населения и сообщества с помощью математических моделей.
  • Знать, как анализировать наборы экологических данных, используя соответствующие методы и программное обеспечение.
  • Обобщить и интерпретировать основную литературу по экологии.

BIOL 464 — МЕДИЦИНСКОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Объяснять принципы и основные концепции современного оборудования для клинической визуализации.
  • Определите аспекты качества изображения и определите составляющие, влияющие на них.
  • Расчет времени передачи изображения по сети.
  • Объясните факторы, определяющие качество изображения при цифровой рентгеноскопии.
  • Опишите характеристики источников рентгеновского излучения, детекторов, коллиматоров и систем отображения, используемых в рентгеновской КТ.
  • Описать различные подходы к реконструкции КТ-изображений по проекционным измерениям.
  • Охарактеризовать свойства ультразвукового датчика и его применение в системе ультразвуковой визуализации.
  • Опишите три режима ультразвуковой визуализации.
  • Объясните явление ядерного магнитного резонанса.
  • Объясните схему формирования импульсов и сбора сигналов, используемую в трех распространенных последовательностях импульсов.

БИОЛОГИЯ 470 — ПАТОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Продемонстрировать знания о живых и неживых возбудителях болезней растений.
  • Объясните взаимодействие между патогенами и условиями окружающей среды, которые вызывают заболевания растений.
  • Описать методы предотвращения, контроля или уменьшения ущерба от болезней растений.
  • Демонстрация знаний о деятельности человека, которая приводит к эпидемиям болезней сельскохозяйственных культур.

БИОЛОГИЯ 471 — ПОЧВОВЕДЕНИЕ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Понимать концепции и методологии качества и здоровья почвы, необходимые для применения их в сельском хозяйстве, пастбищах и других экосистемах.
  • Понимать взаимосвязь между свойствами почвы, функцией почвы и выбором управления для продуктивности, устойчивости и качества окружающей среды.
  • Опишите функцию почв (емкость почвы, использование или управление) в отношении (1) продуктивности растений и животных, (2) качества воды и воздуха и (3) здоровья человека и жилья.
  • Понять роль и судьбу органических химических веществ в почве.
  • Знать роль микроорганизмов в почвенных системах и в трансформации почвенных циклов углерода, азота, серы и фосфора.

БИОЛ 472 — КОМПЛЕКСНАЯ БОРЬБА С ВРЕДИТЕЛЯМИ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Объяснять, как развивается устойчивость к пестицидам.
  • Опишите экологические принципы, на которых основана комплексная борьба с вредителями.
  • Понять, как биология вредителей и их поведение влияют на результаты методов управления.
  • Сравните комплексные методы борьбы с вредителями с обычными методами борьбы с вредителями.
  • Применение текущих принципов комплексной борьбы с вредителями к местным сельскохозяйственным системам.

БИОЛОГИЯ 473 — УСТОЙЧИВОЕ СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Описывать принципы устойчивого развития в отношении методов ведения сельского хозяйства.
  • Определение засухоустойчивых культур и методов управления.
  • Сравните местные и глобальные сельскохозяйственные системы.
  • Анализ потенциального воздействия изменения климата на сельское хозяйство и продовольственную безопасность.
  • Дизайн и уход за экологически сбалансированным садом.

БИОЛОГИЯ 474 — ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТЕМЫ В СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СИСТЕМАХ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Определять новые разработки в сельскохозяйственных производственных системах.
  • Подумайте о научных, социальных и экономических последствиях новых технологий и практик.
  • Идентифицируйте исследовательские материалы, соответствующие теме.
  • Синтезировать информацию из различных источников.
  • Доклад на выбранную тему в письменной и устной форме.

БИОЛОГИЯ 490 — СПЕЦИАЛЬНЫЕ ТЕМЫ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Определять материалы исследования, соответствующие теме.
  • Синтезировать информацию из различных источников.
  • Доклад на выбранную тему в письменной и устной форме.

БИОЛОГИЯ 491 — СПЕЦИАЛЬНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕМЫ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Определять материалы, соответствующие теме исследования.
  • Синтезировать информацию из различных источников.
  • Доклад на выбранную тему в письменной и устной форме.

BIOL 492 — СТАЖИРОВКА

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Объяснять процессы и методы, используемые в промышленных и/или исследовательских целях.
  • Применение концепций и принципов, изученных на курсах биологии, в промышленной и/или исследовательской сфере.
  • Дизайн экспериментов для проверки научных гипотез.
  • Анализ данных и применение соответствующих статистических тестов.
  • Оценка результатов исследований.

БИОЛОГИЯ 494 — НЕЗАВИСИМЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Планировать и проводить эксперименты.
  • Определить материалы, соответствующие теме исследования.
  • Синтезировать информацию из различных источников.
  • Доклад на выбранную тему в письменной и устной форме.

BIOL 497 — НАПРАВЛЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Учащиеся, успешно завершившие этот курс, смогут:

  • Определять материалы, соответствующие теме исследования.
  • Синтезировать информацию из различных источников.
  • Доклад на выбранную тему в письменной и устной форме.

BIOL 499 — SENIOR CAPSTONE

Учащиеся, успешно окончившие этот курс, смогут:

  • Обсуждать и критиковать статьи из научных журналов.
  • Применять знания и навыки из предыдущих курсовых работ для интерпретации научной литературы.
  • Определить материалы, соответствующие теме исследования.
  • Напишите статью, обобщающую информацию из нескольких источников.
  • Доклад на тему в устной форме.
  • Обсудите социальные вопросы, связанные с биологическими науками.

Влияние митотических ошибок на пролиферацию клеток и онкогенез

  1. Эндрю Дж. Холланд
  1. Кафедра молекулярной биологии и генетики, Медицинский факультет Университета Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд 21205, США
  1. Автор, ответственный за переписку: aholland{at}jhmi.edu

Аннотация

Митоз — это деликатное событие, которое должно быть выполнено с высокой точностью для обеспечения стабильности генома.Недавняя работа предоставила понимание того, как митотические ошибки формируют геномы рака, вызывая числовые и структурные изменения в хромосомах, которые способствуют возникновению и прогрессированию опухоли. Здесь мы рассмотрим источники митотических ошибок в опухолях человека и их влияние. о приспособленности и трансформации клеток. Мы обсуждаем новые данные, свидетельствующие о том, что неправильное расхождение хромосом может вызывать провоспалительные процессы. среды и влияет на чувствительность опухоли к иммунотерапии.Наконец, мы рассматриваем уязвимости, проявляющиеся при делении клеток. ошибки и как их можно использовать в терапевтических целях.

Человеку свойственно ошибаться

Каждый день миллионы клеток в нашем организме делятся, чтобы поддержать рост и заменить потерянные или поврежденные клетки в наших тканях. Были разработаны многочисленные меры безопасности, гарантирующие, что эти деления происходят только в идеальных условиях роста и с высокой точностью.Ошибки во время митоза приводят к образованию дочерних клеток со слишком большим или слишком малым количеством хромосом. анеуплоидия. Почти все анеуплоидии, возникающие из-за ошибок в мейозе или на ранних стадиях эмбрионального развития, летальны. за исключением трисомии 21 у человека. Однако митотические ошибки, приводящие к анеуплоидии в более позднем возрасте, были связаны со старением и онкогенезом (Naylor and van Deursen 2016).

Анеуплоидия является очень распространенным признаком рака, возникающим почти в 70% солидных опухолей человека (Duijf et al. 2013). В дополнение к изменениям числа хромосом опухолевые клетки демонстрируют частые структурные изменения в хромосомах, которые включают: делеции, амплификации и транслокации. Ошибки в митозе являются основным источником численных изменений в числе хромосом. наблюдается при раке, а также недавно было признано, что он способствует возникновению хромосомных перестроек. (Бахум и др.2014; Лейбовиц и др. 2015). В этом обзоре мы обсуждаем возможные источники митотических ошибок и влияние этих ошибок на физиологию клеток и онкогенез. Затем мы описываем недавние открытия, предполагающие, что ошибки в клеточном делении распознаются иммунной системой и что опухоль клетки со сложными кариотипами могут выработать механизмы противодействия этому распознаванию. В заключение мы обсудим, как ошибки в делении клеток или связанных с ними последствиях могут быть направлены терапевтически, чтобы принести пользу пациентам с раком.

Источники митотических ошибок

Раковые геномы представляют собой текучие, меняющие форму объекты из-за множества фенотипов генетической нестабильности, каждый из которых проявляет свою уникальную мутационную сигнатуру. Хромосомная нестабильность (CIN) относится к продолжающемуся приобретению геномных изменений. которые связаны с высокой скоростью набора и потери хромосом (Lengauer et al.1997). CIN признан общим свойством большинства анеуплоидных раковых клеточных линий и определяет внутриопухолевую гетерогенность, которая позволяет адаптироваться к меняющимся условиям окружающей среды (van Jaarsveld and Kops 2016). Важно понимать, что CIN и анеуплоидия — это разные признаки, которые могут по-разному влиять на опухоль. эволюции и клинического поведения. В то время как анеуплоидия является генетическим состоянием, CIN относится к скорости расхождения кариотипов.Следовательно, в то время как CIN неизменно приводит к анеуплоидии, клетки могут быть стабильно анеуплоидными без проявления CIN. Ниже мы обсудим причины CIN и то, как ошибки клеточного деления способствуют развитию злокачественных кариотипов при раке человека.

Дефекты контрольной точки узла шпинделя (SAC)

Целью митоза является точное разделение реплицированных хромосом на две новые дочерние клетки. Это достигается прикреплением хромосом к микротрубочкам (МТ) аппарата митотического веретена. Хромосомы прикрепляются к концам МТ на специализированных белковых структурах, известных как кинетохоры, которые собираются на центромерном хроматине. Реплицированные хромосомы имеют две кинетохоры, и биориентация достигается, когда каждая сестринская кинетохора связывает МТ, ориентированные к противоположному веретену столбы. Механизм наблюдения, известный как SAC, задерживает разделение сестринских хроматид в анафазе до тех пор, пока все кинетохоры правильно прикрепились к МТ веретена (рис.1А). Компоненты SAC локализуются на неприкрепленных кинетохорах и функционируют в биохимическом сигнальном каскаде, ингибируя активацию. из CDC20-связанного комплекса, стимулирующего анафазу/циклосома (APC/C Cdc20 ), убиквитинлигазы E3, которая нацелена на Cyclin B и Securin для деградации протеасомой (Fig. 1A). Разрушение секурина высвобождает сепаразу, которая затем расщепляет и инактивирует когезиновый комплекс, содержащий сестринские хроматиды. вместе, тем самым обеспечивая разделение сестринских хроматид и начало анафазы (рис.1Б). Деградация циклина B инактивирует циклинзависимую киназу 1 (Cdk1), обеспечивая выход из митоза и завершение клеточного разделение.

Фигура 1.

Хромосомная сегрегация и источники митотических ошибок. ( A ) Неприкрепленные кинетохоры активируют ингибирующий сигнал SAC, который, в свою очередь, блокирует переход к анафазе.Цель SAC представляет собой APC/C, убиквитинлигазу E3, которая нацелена на деградацию нескольких белков, включая циклин B1 и секурин. Когда все кинетохоры правильно прикреплены к МТ, выходящим из противоположных полюсов клетки (биориентация), SAC замолкает, и APC/C CDC20 убиквитинирует и является мишенью для деградации циклина B (для инактивации CDK1 и обеспечения выхода из митоза) и секурина (для высвобождения протеаза разделяет и инициирует начало анафазы). ( B ) Реплицированные сестринские хроматиды удерживаются вместе когезиновым комплексом белков. После того, как ВАС замолчал, Секурин расщепляется и активируется протеаза сепараза. Сепараза расщепляет когезиновый комплекс, обеспечивая разделение сестринских хроматид. и наступление анафазы. ( C ) Дополнительные центросомы могут генерировать временное мультиполярное веретено, которое после кластеризации центросом приводит к усилению скорость меротелиальных прикреплений, когда одна сестринская кинетохора прикрепляется к МТ, выходящим из противоположных полюсов.меротелиально прикрепленные хромосомы могут отставать от середины веретена во время анафазы и впоследствии могут быть неправильно сегрегированы или инкорпорированы. в микроядра. ( D ) После удвоения центросомы две центросомы соединяются белковым линкером. Этот линкер дизассемблируется перед митотический вход, позволяющий центросомам мигрировать друг от друга и образовывать противоположные полюса веретена. Задержки в разделении центросом может привести к неправильному прикреплению хромосом и/или аномальной геометрии веретена, что приводит к увеличению частоты неправильной сегрегации хромосом.( E ) Регресс борозды дробления приводит к нарушению цитокинеза и образованию двухъядерной тетраплоидной клетки с вдвое большей нормальное содержание центросом.

У млекопитающих инактивация SAC приводит к серьезным ошибкам сегрегации хромосом; таким образом, SAC необходим для организма развитие и жизнеспособность большинства клеток млекопитающих.Однако, в то время как большинству клеток требуется SAC для продолжения роста, примеры появились случаи, когда требование SAC можно обойти. Например, увеличение времени выравнивания хромосом за счет снижение активности APC/C может сделать SAC несущественным в клетках колоректального рака человека (Wild et al. 2016; Sansregret et al. 2017), а некоторые клетки, лишенные компонента SAC MAD2, могут пролиферировать in vitro и in vivo, если p53 инактивирован, чтобы позволить толерантность к высоким уровням нестабильности генома (Burds et al.2005 г.; Фойер и др. 2017).

SAC не является ответом «все или ничего», а сила сигнала зависит от количества неприкрепленных кинетохор. (Коллин и др., 2013). Таким образом, мутации, ослабляющие SAC, могут привести к преждевременному наступлению анафазы до полного прикрепления кинетохор, что резко увеличивает вероятность неправильной сегрегации хромосом. Модели на мышах показали, что ослабление SAC способствует анеуплоидия и нестабильность генома in vivo (Simon et al. 2015). Более того, мутации в белках SAC TRIP13 и BUBR1 вызывают мозаичную пеструю анеуплоидию (MVA), редкое заболевание, характеризующееся высоким уровнем анеуплоидии и повышенной частотой онкогенеза (Hanks et al., 2004; Suijkerbuijk et al., 2010; Yost et al., 2017). Тем не менее, мутации в генах SAC редки в опухолях человека, и клетки с CIN обычно не вступают в анафазу преждевременно. что указывает на то, что дисфункция SAC не является основным фактором митотических ошибок и кариотипической гетерогенности, наблюдаемых у раковые клетки человека (Holland and Cleveland 2012b).

Дефекты сцепления

Разделение хромосом в анафазе зависит от своевременной потери слипчивости сестер (Fig. 1B). В принципе, дефекты когезинового комплекса могут приводить к преждевременному расхождению сестринских хроматид и сегрегации хромосом. ошибки. Недавние исследования неизменно предполагают, что ухудшение сплоченности с преклонным возрастом матери является ведущим фактором. причиной мейотических дефектов и возрастной анеуплоидии в женских ооцитах (El Yakoubi and Wassmann 2017).Было также обнаружено, что гены, участвующие в слипании сестринских хроматид, мутируют при колоректальном раке (Barber et al. 2008) и широком спектре миелоидных новообразований (The Cancer Genome Atlas Research Network 2013; Kon et al. 2013). Однако влияние этих мутаций на точность сегрегации хромосом не проверялось. Так как cohesin играет важную роль в организации хроматина более высокого порядка во время интерфазы, дефекты когезина могут привести к нарушению регуляции экспрессии генов что способствует развитию опухоли.Действительно, в то время как повторяющиеся мутации когезинового компонента STAG2 наблюдались в различных типы опухолей, многие из этих мутаций, связанных с опухолью, не оказывают неблагоприятного воздействия на сегрегацию хромосом (Solomon et al. , 2011; Balbas-Martinez et al., 2013; Kim et al., 2016). Это предполагает, что мутации STAG2 и, возможно, другие связанные с опухолью мутации в когезиновом комплексе проявляют туморогенное действие. эффекты вне митоза.

Насадки меротелы

В то время как клетки с CIN редко обнаруживают признаки SAC или дефекты когезии, они демонстрируют увеличение количества отстающих анафазных хромосом как следствие усиленного прикрепления меротетических кинетохор-MT (K-MT) (Gascoigne and Taylor 2008; Thompson and Compton 2008).Начальный захват МТ веретена кинетохорами является асинхронным и стохастическим. Следовательно, ошибочные привязки K–MT должны быть преобразованы в биориентированные прикрепления, чтобы обеспечить верную сегрегацию хромосом. Меротелические привязанности возникают, когда одиночная кинетохора становится связанной с MTs, закрепленными на обоих полюсах веретена (Fig. 1C). Эти типы прикрепления не вызывают SAC-зависимую митотическую задержку, часто приводя к наступлению анафазы без разрешения. дефект.

Большинство меротелиально прикрепленных хромосом правильно сегрегируют во время анафазы (Cimini et al. 2004). Однако часть хромосом с такими прикреплениями задерживается в расхождении и в конечном итоге отстает в середина шпинделя (рис. 1С). Отстающие анафазные хромосомы часто наблюдаются в хромосомно нестабильных раковых клетках. Эти поздние хромосомы могут подвергаться неправильной сегрегации с образованием анеуплоидных дочерних клеток (Cimini et al.2001 г.; 2003). Однако чаще отстающие хромосомы сегрегируются в правильную дочернюю клетку, но не достигают основной хромосомы. массы до повторной сборки ядерной оболочки и разделяются на микроядра (Thompson and Compton 2011). Как описано ниже, ДНК, попавшая в микроядра, подвергается обширным повреждениям ДНК, что может привести к хромосомным перестройкам. (Чжан и др., 2015). Таким образом, меротелиальные прикрепления, вероятно, являются основным источником генетической нестабильности в опухолях человека; три основных источника эти ошибки прикрепления — гиперстабилизированные взаимодействия K-MT, амплификация центросом и измененное время разделения центросом — являются обсуждаются ниже.

К–МТ стабильность

Эффективная коррекция ошибочных прикреплений K-MT требует отделения MT от неправильно прикрепленных кинетохор. Следовательно, уменьшение оборота K-MT-взаимодействий способствует сохранению ошибочных привязанностей и увеличивает частота ошибок расхождения хромосом. Хромосомно нестабильные опухоли демонстрируют гиперстабильные взаимодействия К-МТ относительно к эуплоидным клеткам (Bakhoum et al.2009а). Более того, снижение стабильности прикрепления K-MT восстанавливает верную сегрегацию хромосом в клетках с CIN (Bakhoum et al. 2009b). Это говорит о том, что повышенная стабильность прикрепления K-MT является основным фактором ошибок сегрегации хромосом. гиперэкспрессия Было показано, что MAD2 или потеря STAG2 приводят к гиперстабилизированным прикреплениям K-MT, которые могут предрасполагать клетки к CIN, но молекулярные дефекты, которые вызывают повышение стабильности прикрепления K-MT в большинстве клеток с CIN, остаются неясными (Kabeche and Compton 2012; Kleyman et al.2014).

Амплификация центросом

Еще одним источником меротелиальных прикреплений является приобретение дополнительных копий центросомы, известной как центросома. усиление (рис. 1C). Нештатные центросомы являются общим признаком рака человека и могут возникать несколькими различными путями, включая нарушение клеточного деления, слияние клеток и избыточное дублирование центросом (Chan 2011; Nigg and Holland 2018). Наличие экстрацентросом приводит к формированию мультиполярного митотического веретена, которое, если предварительно не скорректировать в анафазу приводит к расхождению хромосом более чем на две дочерние клетки. Визуализация живых клеток показала, что потомство мультиполярных делений часто нежизнеспособно, так как дочерние клетки вряд ли наследуют полный комплемент хромосом (Ганем и др., 2009). Наиболее хорошо охарактеризованным механизмом для борьбы с этим бременем является кластеризация дополнительных центросом с образованием псевдобиполярной шпиндель (фиг.1С; Квинтин и др. 2005 г.; Басто и др. 2008 г.; Квон и др. 2008 г.; Лебер и др. 2010). Эффективная кластеризация центросом необходима для выживания раковых клеток с дополнительными центросомами и требует множественных факторы, в том числе моторный белок HSET/KIFC1 с отрицательным концом (Kwon et al. 2008). Недавнее исследование показало, что кластеризация центросом в эпителиальных клетках ингибируется E-кадгерином, который увеличивает корковую активность. сократимость и подавляет движение центросомы (Rhys et al.2018). Потеря Е-кадгерина часто наблюдается в клетках рака молочной железы с высоким уровнем амплификации центросом, что предполагает что раковые клетки могут выбирать генетические изменения, которые обеспечивают эффективную кластеризацию центросом. При слиянии центросом в мультиполярном веретене обеспечивает путь, позволяющий избежать летальных делений, а также способствует образованию меротелических прикреплений K – MT. которые приводят к отставанию хромосом в анафазе (Ganem et al.2009 г.; Силкворт и др. 2009). Это объясняет связь амплификации центросом с CIN и анеуплоидией.

Помимо дополнительных центросом, дополнительные механизмы могут способствовать мультиполярности и/или аберрантной геометрии веретена в раковых клетках. Например, мультиполярные веретена могут образовываться независимо от амплификации центросом после потери веретена. целостность полюса (Maiato and Logarinho 2014).Кроме того, избыточная экспрессия киназы Aurora A или потеря ее негативного регулятора, киназы CHK2, увеличивает скорость сборки МТ. Это приводит к временным изменениям геометрии шпинделя, что способствует возникновению ошибочных приставок К-МТ и отставанию. анафазные хромосомы (Ертыч и др., 2014). Поскольку гиперэкспрессия Aurora A и потеря CHK2 часто происходят при раке человека, это может представлять собой важный путь. влияние на CIN в опухолях.

Время разделения центросом

Неправильное время разделения центросом перед клеточным делением становится дополнительным источником генетической нестабильности. (Нам и др., 2015). После удвоения центросомы две центросомы соединяются белковым линкером, который растворяется перед проникновением в митоз (рис. 1D). Как задержка, так и ускорение разделения центросом повышают частоту неправильного прикрепления хромосом к митотической веретена, что приводит к ошибкам сегрегации хромосом (Silkworth et al.2012 г.; Чжан и др. 2012 г.; Нам и ван Дерсен, 2014 г.; Канаккантара и др. 2016; ван Ри и др. 2016). Деубиквитиназа USP44 локализуется в центросоме, и потеря этого белка приводит к неполному отделению центросомы. и повышенные частоты отстающих хромосом. Важно отметить, что нокаутные по USP44 мыши склонны к анеуплоидизации и спонтанному образование опухоли (Zhang et al. 2012). Дефектное разделение центросом также может происходить в результате неправильной регуляции моторного белка EG5/KIF11, который управляет разделение центросом.Сверхэкспрессия EG5 ведет к неправильной сегрегации хромосом и увеличению числа опухолей (Castillo et al. 2007). Более того, в дополнение к негативной регуляции передачи сигналов PI(3)K посредством его фосфатазной активности, супрессор опухоли белок PTEN также функционирует, чтобы способствовать рекрутированию EG5 в центросомы и контролировать своевременное разделение центросом (van Ree et al. 2016). Мыши, несущие мутант PTEN, дефектный в обеспечении загрузки EG5 на центросомы, но активный в антагонизме Передача сигналов PI (3) K демонстрирует повышенную анеуплоидию и восприимчивость к опухолям, что позволяет предположить, что центросомная роль PTEN способствует его противоопухолевая функция (van Ree et al.2016). Таким образом, дефекты в динамике центросом могут представлять собой источник ошибочных прикреплений кинетохор, которые, в свою очередь, CIN в опухолях человека.

Тетраплоидия

Последний источник митотических ошибок возникает из-за пролиферации тетраплоидных клеток, которые имеют в два раза больше нормальных хромосом. содержание. Тетраплоидия обычно происходит с помощью одного из трех основных механизмов.Первый – недостаточность цитокинеза, когда дочь клетки не могут отделиться после клеточного деления (Fig. 1E). Во-вторых, тетраплоидизация может происходить в результате слияния клеток, которое может происходить спонтанно или в результате вирусного заражения. инфекции (Duelli et al. 2005, 2007). Наконец, тетраплоидные клетки могут возникать в результате эндоредупликации, при которой происходят два цикла репликации ДНК без промежуточного звена. деление клеток. Из этих трех основных путей недостаточность цитокинеза или митотическая недостаточность, вероятно, является основным механизмом, способствующим к продукции тетраплоидных клеток в предраковых поражениях.Один из механизмов, с помощью которого это может происходить, заключается в сохранении хроматина. в середине веретена, что может вызвать регресс борозды (Steigemann et al. 2009). Сообщалось также о нарушении цитокинеза после энтоза, когда жизнеспособные клетки интернализуются соседними клетками. клетки блокируют проникновение в борозды (Krajcovic et al. 2011).

Пролиферирующие тетраплоидные клетки геномно нестабильны и способны способствовать онкогенезу у мышей (Fujiwara et al.2005 г.; Даволи и де Ланге, 2012). Нестабильность тетраплоидных клеток возникает из-за того, что в этих клетках вдвое больше нормального числа центросом, что придает клетки с CIN (рис. 1E; Ганем и др., 2009; Силкворт и др., 2009). Кроме того, дополнительные хромосомы в тетраплоидных клетках защищают от вредных мутаций в эссенциальных и гаплонедостаточных клетках. гены, позволяющие продолжить рост перед лицом фатальных геномных изменений. Вычислительный анализ около 5000 случаев рака последовательности генома показали, что около 37% раковых заболеваний человека подвергаются удвоению генома в какой-то момент своей эволюции. (Зак и др.2013). Соответственно, тетраплоидия может представлять собой раннюю стадию онкогенеза и наблюдается при предраковых поражениях. в пищеводе и шейке матки, а также при немелкоклеточном раке легкого (Galipeau et al., 1996; Olaharski et al., 2006; Jamal-Hanjani et al., 2017). Таким образом, удвоение генома, вероятно, представляет собой важное промежуточное звено в развитии многих геномно нестабильных человеческих организмов. опухоли.

Последствия митотических ошибок

Митотические ошибки приводят к повреждению ДНК

Митотические ошибки давно признаны основным источником полнохромосомной анеуплоидии, но недавние данные также связывают ошибки сегрегации хромосом с повреждением ДНК, которое способствует структурным изменениям в хромосомах.Структурные перестройки изменяют линейную организацию хромосом и являются признанным фактором онкогенеза. развивающийся данные свидетельствуют о том, что отставание хромосом в анафазе, помимо высокого риска неправильной сегрегации, уникально склонны к приобретению повреждений ДНК.

Хромосомы, которые отстают в середине веретена, могут быть повреждены, если им не удается очистить среднюю зону веретена до завершения цитокинеза (рис.2А). Эти хромосомы застревают в борозде деления, образуя двухцепочечные разрывы ДНК, которые ошибочно восстанавливаются. производить несбалансированные транслокации (Janssen et al. 2011). В дополнение к прямому повреждению ДНК во время цитокинеза отстающие хромосомы часто разделяются на микроядра. где они приобретают повреждение ДНК в следующем клеточном цикле. Это происходит отчасти из-за того, что ядерная оболочка микроядер необычно хрупок и склонен к самопроизвольному разрыву, подвергая микроядерную ДНК воздействию потенциально повреждающих цитоплазматических компонентов. (Хэтч и др.2013). Коллапс микроядерной оболочки во время S фазы приводит к остановке репликации и связанному с ней повреждению ДНК (Crasta et al. 2012; Zhang et al. 2015). Кроме того, микроядра демонстрируют замедленную кинетику репликации ДНК, в результате чего клетки вступают в митоз во время репликации. микроядерной ДНК продолжается (Crasta et al. 2012). Это приводит к преждевременной конденсации и фрагментации микроядерной хромосомы (Crasta et al. 2012; Ly et al. 2017).

Фигура 2.

Митотические ошибки могут привести к повреждению ДНК. ( A ) Отстающие хромосомы в анафазе могут получить повреждение ДНК напрямую, будучи захваченными в средней зоне веретена во время цитокинеза. Кроме того, отстающие хромосомы, разделенные на микроядра, могут приобретать повреждения ДНК в интерфазе последующего клеточный цикл. Обширное повреждение приводит к разрушению хромосом, явлению, известному как хромотрипсис, что приводит к образованию высоко локализованных хромосомных перестроек и/или образования двухминутных хромосом. ( B ) Обширное укорочение теломер (теломерный кризис) может привести к слиянию двух теломер конец к концу и образованию дицентрической хромосомы. Дицентрические хромосомы могут прикрепляться к противоположным сторонам клетки и расходиться во время митоза. в результате образуется хроматиновый мостик, соединяющий два дочерних ядра. Ядерная мембрана, окружающая мостики ДНК, разрывается. в интерфазе, и экспонированная ДНК может быть подвергнута расщеплению цитоплазматической нуклеазой для расщепления мостика.Выставленная ДНК в цитоплазму могут подвергаться хромотриптоподобным хромосомным перестройкам и/или гипермутациям, генерируемым цитидином APOBEC дезаминазы. ( C ) Запутывания ДНК между сестринскими хроматидами могут образовываться в недореплицированных областях или в результате стойкой цепной связи ДНК. Если эти связи не разрешаются топоизомеразами и геликазами, они могут образовывать сверхтонкие ДНК-мостики, соединяющие расщепляющиеся сестринские хроматиды в анафазе. Сверхтонкие мостики могут привести к нарушению цитокинеза, что приведет к образованию двухъядерных клеток или их разрыву. во время анафазы, создавая повреждения ДНК и микроядра.

Массивное повреждение ДНК, происходящее на хромосомах, изолированных внутри микроядер, может привести к возникновению сложных паттернов локализованных хромосом. перестройки, очень напоминающие те, которые наблюдаются после явления, известного как «хромотрипсис» (рис.2А; Чжан и др. 2015). Хромотрипсис характеризуется наличием обширных хромосомных перестроек, ограниченных одной или несколькими хромосомами. (Стивенс и др., 2011; Холланд и Кливленд, 2012а). Эти изменения наблюдались в широком спектре типов опухолей и чаще встречаются в определенных типах. раковых заболеваний, в том числе возникающих из крови и головного мозга (Rode et al. 2016). Следовательно, разделение хромосом на микроядра предлагает привлекательное механистическое объяснение того, как митотические ошибки способствуют приобретению высоко локализованных повреждений ДНК.

Разрушение и последующая повторная сборка фрагментов хромосом во время хромотрипсиса также может привести к образованию кольцевые ацентрические хромосомы, известные как двойные минуты (рис. 2А; Stephens et al. 2011; Zhang et al. 2015). Эти кольцевые хромосомы могут присутствовать в очень большом количестве и часто содержат онкогены, которые стимулируют развитие опухоли. Двойные минуты наблюдаются почти в половине опухолей, а их случайное расхождение во время клеточного деления приводит к гетерогенности. в количестве копий онкогена, что делает опухоли более адаптируемыми к изменяющимся условиям окружающей среды (Turner et al.2017).

Еще один источник повреждения ДНК возникает после теломерного кризиса, когда обширное укорочение теломер приводит к сквозному разрыву. слияние двух теломер и образование дицентрической хромосомы с двумя независимыми сайтами прикрепления МТ (рис. 2Б). Дицентрические хромосомы образуют хроматиновые мостики, которые соединяют два дочерних ядра в ранней стадии G1. Во время анафазы происходит дицентрическая хромосома может подвергаться разрыву, который после восстановления может привести к невзаимным транслокациям (Artandi et al.2000). В некоторых случаях захваченная ДНК из дицентрических хромосом может способствовать нарушению цитокинеза и образованию тетраплоидных хромосом. клетки (Даволи и де Ланге, 2012). Однако чаще дочерние клетки мигрируют отдельно друг от друга, и ядерная мембрана, окружающая мостиковые ДНК разрывается, что позволяет атаковать открытый хроматин цитоплазматической нуклеазой, что приводит к разрешению мост (Maciejowski et al.2015). Секвенирование выявило кластерные хромотриптические перестройки, возникающие из хроматина, который предположительно был захвачен. внутри моста. Удивительно, но эти же области были также связаны с гипермутацией или «катаэгией», которая может возникать в результате редактирования экспонированной одноцепочечной ДНК на хроматиновых мостиках с помощью цитидиндеаминаз APOBEC (рис. 2В). Такой путь может объяснить, как в результате приобретаются фокальные перестройки и области кластерной гипермутации. митотических ошибок.

Наконец, повреждение ДНК также может быть вызвано неправильным разрешением сверхтонких мостиков ДНК (UFB). UFB — это тонкие сегменты обнаженной ДНК, соединяющей расходящиеся сестринские хроматиды в анафазе. Они образуются в результате топологических связей между сестринскими хроматидами, которые возникают в результате стойкой катенации ДНК или стресса репликации (Bizard and Hickson 2018). Было высказано предположение, что стресс репликации способствует геномным изменениям и CIN в результате попыток сегрегации. недореплицированные участки генома (Burrell et al.2013). Эти запутывания ДНК часто возникают в определенных хромосомных локусах, таких как общие хрупкие сайты или центромерные области, и обычно разрешаются до митоза. Если оставить их неразрешенными, UFB могут разорваться во время анафазы и сформировать микроядра или привести к отказ или опадение, приводящее к образованию двуядерных тетраплоидных клеток (рис. 2С). Эти события часто происходят в некоторых раковых клетках, что указывает на то, что аберрантное разрешение UFB может привести к митотической ДНК. повреждение, которое способствует числовым и структурным изменениям кариотипа опухоли (Chan et al.2009 г.; Наим и Росселли, 2009 г.; Тивари и др. 2018).

Митотические ошибки могут вызвать активацию p53

При изучении непосредственного влияния ошибок клеточного деления на клеточную пролиферацию возникла общая тема: ошибки в делении клеток часто приводят к активации белка-супрессора опухолей р53, который, в свою очередь, вызывает остановку клеточного цикла, старение, или апоптоз. Триггеры для активации p53 после митотических ошибок сложны и многофакторны. Активация р53 возникает вследствие неправильной сегрегации хромосом, и, соответственно, потеря р53 часто связана с анеуплоидией. при раке человека (Burds et al. 2005; Li et al. 2010; Thompson and Compton 2010). Однако остается неясным, вызывает ли сама анеуплоидия непосредственно активацию p53. Недавно два исследования пролили некоторые пролить свет на этот затянувшийся вопрос, показав, что активация p53 является потенциальным, но не обязательным результатом неправильной сегрегации хромосом. (Сантагида и др.2017; Сото и др. 2017). Сложные анеуплоидии, включающие структурные изменения, вызывают активацию p53, вероятно, в результате повреждения ДНК, которое приобретается во время или после некоторых митотических ошибок. С другой стороны, простые анеуплоидии, затрагивающие лишь небольшую часть генома может размножаться в среде, компетентной в отношении p53 (Santaguida et al. 2017; Soto et al. 2017). Эти данные свидетельствуют о том, что дисбаланса целых хромосом как такового недостаточно для активации р53, но события, связанные с это может быть связано с неправильной сегрегацией хромосом или анеуплоидией.

Дополнительные признаки ошибочного митоза также могут способствовать активации p53 после деления. Например, анеуплоидия было предложено повысить уровень активных форм кислорода, что приводит к активации атаксии телеангиэктазии с мутацией (ATM) сигнальная киназа повреждения ДНК и p53 (рис. 3A; Li et al. 2010). Более того, стабилизация р53 после неправильной сегрегации хромосом была связана с захватом хроматина в цитокинетическая борозда или повреждение, которое накапливается в недореплицированной ДНК, содержащейся в микроядрах (рис.3А; Янссен и др. 2011 г.; Краста и др. 2012). Длительный митоз даже при отсутствии явных ошибок клеточного деления также может вызвать остановку клеточного цикла, зависимую от р53. в нетрансформированных клетках (Uetake and Sluder 2010). Устранение клеток, задерживающих митоз, может служить контролем качества для предотвращения пролиферации клеток, которые испытывали стрессы во время митоза (Lambrus, Holland, 2017). Наконец, в недавней работе было высказано предположение, что требуется дифференциальное фосфорилирование гистонов на отстающих в анафазе хромосомах. для инициации стабилизации p53 в последующем G1 (Hinchcliffe et al.2016). Однако, как специфические неправильно сегрегированные хромосомы могут быть отмечены фосфорилированием гистонов и как это влияет на р53? активации остаются неясными.

Рисунок 3.

Митотические ошибки могут вызвать активацию p53. ( A ) Отстающие хромосомы, которые повреждаются в борозде дробления или в микроядрах, могут вызывать каноническую репарацию повреждений ДНК. путь, активирующий p53.Кроме того, анеуплоидия также может вызывать увеличение количества реактивных окислителей, что приводит к активации сигнализации повреждения ДНК. ( B ) Предполагается, что сбой цитокинеза активирует p53 двумя различными путями. (1) Активация пути Бегемота. Киназа пути Hippo LATS2 активируется в тетраплоидной клетке, что приводит к фосфорилированию и цитоплазматической секвестрации. фактора транскрипции YAP.Кроме того, LATS2 связывает и инактивирует MDM2, негативный регулятор стабильности p53. Ингибирование MDM2 обеспечивает повышенное накопление p53, который активирует p21, вызывая остановку роста. (2) Активация PIDDosome сигнализация. Тетраплоидные клетки активируют PIDDosome, мультипротеиновый комплекс, состоящий из PIDD и RAIDD, который, в свою очередь, активирует Каспаза-2 (CASP2). Каспаза 2 расщепляет и инактивирует MDM2, обеспечивая стабилизацию p53.

Учитывая потенциальный вред, который может возникнуть в результате неконтролируемой пролиферации тетраплоидных клеток, это, пожалуй, неудивительно. что клетки млекопитающих также развили системы, ограничивающие деление клеток с повышенной плоидностью. Хотя некоторые клетки могут пролиферируют после нарушения цитокинеза (Uetake and Sluder 2004; Wong and Stearns 2005), во многих случаях тетраплоидные клетки останавливаются в G1 из-за стабилизации p53 и повышения активности ингибитора CDK р21 (Андреассен и др.2001 г.; Куффер и др. 2013). Два различных пути вовлечены в активацию p53 для подавления пролиферации тетраплоидных клеток (Fig. 3B). В одном пути нарушение цитокинеза активирует киназу пути Hippo LATS2, которая стабилизирует p53 и инактивирует регулятор транскрипции пророста YAP (Ganem et al. 2014). В альтернативном пути нарушение цитокинеза способствует активации PIDDosome, мультипротеинового комплекса, который активирует Каспаза-2, приводящая к последующей стабилизации p53 (Fava et al.2017). Было высказано предположение, что наличие дополнительных центросом в тетраплоидных клетках является ключевым триггером для активации обоих LATS2 и PIDDosome, но степень, в которой эти пути действуют независимо или взаимодействуют, чтобы сдерживать рост тетраплоидные клетки еще предстоит определить.

Поскольку митотические ошибки часто вызывают остановку клеточного цикла в нетрансформированных клетках, опухолевые клетки с CIN, вероятно, приобретут изменения, которые позволяют им обойти антипролиферативные эффекты активации p53.Действительно, нарушение p53 является одним из из наиболее частых событий онкогенеза и позволяет клеткам переносить широкий спектр повреждений, включая CIN. Каспаза 2 было предложено активировать p53 после неправильной сегрегации хромосом путем расщепления MDM2, убиквитинлигазы E3, которая действует нацелить p53 на деградацию протеасомой. Соответственно, потеря каспазы 2 связана с повышенной толерантностью. при дисбалансе кариотипа (Dorstyn et al.2012 г.; Пуччини и др. 2013; Давар и др. 2017). В колоректальных опухолях мутации в BCL9L придают толерантность к CIN за счет снижения уровня каспазы 2 и предотвращения стабилизации p53 (Lopez-Garcia et al. 2017). Наконец, сверхэкспрессия циклина D1 позволяет клеткам обходить остановку G1 после удвоения генома путем секвестрации. p21 (Крокфорд и др., 2017). Таким образом, митотические ошибки могут прямо или косвенно запускать активацию p53; таким образом, механизмы, которые подавляют или обходят Активация p53, вероятно, вносит ключевой вклад в размножение хромосомно нестабильных опухолевых клеток.

Влияние митотических ошибок на приспособленность клеток

Учитывая пагубное влияние митотических ошибок на стабильность генома, естественно возникает вопрос, как часто эти события происходят in vivo. Хотя митотические ошибки трудно наблюдать непосредственно в тканях, в нескольких исследованиях степень анеуплоидии в нормальных клетках с использованием флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), хромосомных спредов или спектрального анализа. кариотипирование.Удивительно, но первоначальные оценки, проведенные с помощью FISH в здоровых тканях, показали, что 30-50% клеток в мозга млекопитающих (Rehen et al. 2001; Pack et al. 2005; Yurov et al. 2007; Faggioli et al. 2012) и до 50% клеток печени являются анеуплоидными (Duncan et al. 2010, 2012). Однако совсем недавно исследования секвенирования одиночных клеток в тех же тканях показали гораздо более низкие уровни анеуплоидии (<5% клеток), и аналогичные низкие показатели наблюдались в коже (McConnell et al. 2013; Кай и др. 2014; Ноус и др. 2014; ван ден Бос и др. 2016). Поскольку секвенирование отдельных клеток предлагает более надежную технологию исследования кариотипов с высоким разрешением в беспристрастной Таким образом, эти данные указывают на то, что клетки с аномальными кариотипами, вероятно, редко встречаются в здоровых тканях (Bakker et al. 2015).

Низкий уровень анеуплоидии в соматических тканях предполагает, что скорость митотических ошибок in vivo соответственно низка или что анеуплоидные клетки отбираются/элиминируются.Хотя оба утверждения, вероятно, верны, недавняя работа предоставила поддержка идеи о том, что анеуплоидные клетки отбираются против in vivo. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) с определенной хромосомой trisomies демонстрируют пониженную приспособленность по сравнению с контрольными эуплоидными клетками при трансплантации облученным мышам (Pfau et al. 2016). Аналогичные эксперименты, проведенные с хромосомно нестабильными ГСК BubR1 H/H , показали, что анеуплоидные клетки со временем истощаются из периферической крови.Важно, что непролиферирующие ткани из BubR1 H/H мышей показали высокие уровни анеуплоидии, в то время как другие регенеративные ткани были в основном эуплоидными (Pfau et al. 2016). Это говорит о том, что в самообновляющихся тканях взрослых анеуплоидные клетки подвергаются очищающему отбору и уступают им в конкурентной борьбе. относительно более приспособленные эуплоидные клетки. В соответствии с этими данными, пациенты с MVA, которые несут мутации в BUBR1 , демонстрируют задержку роста и уменьшенный размер мозга (Garcia-Castillo et al.2008).

Подобно наблюдениям, сделанным in vivo, анеуплоидия обычно вредна для клеточной пролиферации in vitro (Gordon et al. 2012; Santaguida and Amon 2015). Этот дефект приспособленности возникает в результате изменения числа копий генов, расположенных на анеуплоидных хромосомах (Torres et al., 2007, 2010; Pavelka et al., 2010; Stingele et al., 2012; Dephoure et al., 2014). Потеря или приобретение целой хромосомы изменяет производство сотен, если не тысяч белков.При изменении количество копий определенных генов может привести к сильным фенотипическим изменениям, возникает большинство фенотипов, связанных с анеуплоидией. из-за одновременного изменения многих генных продуктов, которые малоэффективны при индивидуальной модификации (Torres et al. 2007; Pavelka et al. 2010; Oromendia et al. 2012; Bonney et al. 2015). Анализ клеток дрожжей или человека с дополнительными копиями отдельной хромосомы показал, что, хотя обилие большинства белков, коррелирующих с повышенной дозировкой генов, было экспрессировано ∼20–25% белков, кодируемых на дополнительных хромосомах. на уровне, близком к диплоидному (Stingele et al.2012 г.; Дефор и соавт. 2014). Важно отметить, что большинство этих белков является компонентами макромолекулярных комплексов. Эти данные свидетельствуют о том, что анеуплоидный клетки противодействуют образованию частично собранных мультисубъединичных комплексов путем деградации нескомплексованных субъединиц.

Деградация белковых субъединиц увеличивает нагрузку на фолдинг белков и пути деградации анеуплоидных клеток, объясняя, почему эти клетки проявляют признаки, указывающие на протетоксический стресс (Torres et al.2007 г.; Оромендиа и др. 2012 г.; Шелцер и др. 2012 г.; Стингеле и др. 2012). Анеуплоидные клетки также склонны к агрегации белков и активируют опосредованную аутофагией деградацию белков (Santaguida et al. 2015). Стресс, вызванный дисбалансом белков, вызванным анеуплоидией, приводит к повышенной чувствительности к соединениям, которые ингибируют аутофагии или препятствуют сворачиванию или деградации белка (Tang et al. 2011). Кроме того, мутации, нарушающие убиквитин-протеасомный путь, вызывают дефекты синтетической приспособленности у анеуплоидных клеток. клетки (Доджсон и др.2016а,б). Эти данные свидетельствуют о том, что наряду со специфическими для хромосом эффектами, вызываемыми дозировкой определенных генов, анеуплоидные клетки также имеют общий набор ассоциированных стрессовых фенотипов, который в значительной степени не зависит от специфического кариотипического изменения.

Связь анеуплоидии со сниженной клеточной приспособленностью, по-видимому, противоречит наблюдению, что анеуплоидия является почти универсальной особенностью опухолей человека.Этот «парадокс анеуплоидии» еще предстоит полностью разрешить, но несколько возможных появились пояснения. Во-первых, последствия ошибок сегрегации хромосом могут быть выявлены только при соответствующем эволюционные ограничения. В условиях жесткого селективного давления в микроокружении опухоли большинство кариотипических изменений ожидается, что они снизят приспособленность клеток и будут выбраны против. Однако в редких случаях могут появиться кариотипы, обеспечивающие избирательное преимущество в определенных условиях окружающей среды.Действительно, было показано, что анеуплоидия дает избирательное преимущество. к клеткам дрожжей и человека в условиях экологического стресса (Pavelka et al. 2010; Chen et al. 2012; Rutledge et al. 2016). Более того, некоторые неопухолевые клеточные линии приобретают в культуре специфические анеуплоидии, которые усиливают клеточную пролиферацию, что свидетельствует о что некоторые анеуплоидные кариотипы могут быть полезными даже в отсутствие клеточной трансформации (Ben-David et al. 2014). Альтернативная гипотеза распространенности анеуплоидии в опухолях человека состоит в том, что раковые клетки приобретают изменения, которые позволяют им переносить неблагоприятные стрессы, связанные с дисбалансом кариотипа. Например, потеря деубиквитинирующего фермент UBP6 улучшает скорость пролиферации нескольких анеуплоидных штаммов дрожжей (Torres et al. 2010). Вместе эти исследования показывают, что анеуплоидия не обязательно подавляет клеточную пролиферацию, но фактически может быть выбрана. для конкретных условий окружающей среды.

Анеуплоидия может способствовать дальнейшей нестабильности генома

Митоз — это динамичное и точно настроенное событие, которое особенно чувствительно к возмущениям в экспрессии генов, возникающим из-за изменения кариотипа.Соответственно, анализ дрожжей показал, что анеуплоидные клетки менее геномно стабильны и проявляют повышенная скорость неправильной сегрегации хромосом, митотической рекомбинации и восстановления дефектных повреждений ДНК (Sheltzer et al. 2011; Zhu et al. 2012). В клетках человека также было показано, что специфические анеуплоидии увеличивают частоту митотических ошибок (Nicholson et al. 2015; Passerini et al. 2016). Кроме того, в то время как линии клеток человека с определенными трисомиями демонстрируют сниженный рост клеток in vitro и в анализах ксенотрансплантата опухоли, спонтанная эволюция кариотипа происходит во время длительного роста и улучшает клеточную приспособленность (Sheltzer et al.2017). Эти данные свидетельствуют о том, что анеуплоидия может способствовать дальнейшей нестабильности кариотипа и способствовать приобретению стимулирующих рост клеток. изменения.

Недавняя работа начала выяснять, как изменения кариотипа нарушают точность митозов. Даже наличие одного доп. Хромосома может вызвать геномную нестабильность, уменьшая количество ключевых белков репликации и нарушая репликацию ДНК. (Пассерини и др.2016). Эти дефекты репликации приводят к повреждению ДНК, что способствует хромосомным перестройкам и увеличению частота митотических ошибок (Santaguida et al. 2017). Кроме того, анеуплоидия также может генерировать фенотипические изменения, специфичные для кариотипа, которые приводят к дефектам митоза. Например, трисомия хромосомы 13 приводит к дефекту цитокинеза из-за повышенной экспрессии гена, кодируемого на анеуплоидном хромосома (Николсон и др.2015). Тем не менее CIN явно не является необходимым следствием анеуплоидии, так как клетки индивидуумов со специфическими трисомиями проявляют скорость неправильной сегрегации хромосом аналогична таковой для эуплоидных клеток in vitro, а также одноклеточное секвенирование нейронов из у человека с синдромом Дауна не удалось выявить дополнительные анеуплоидии (Valind et al., 2013; van den Bos et al., 2016).

Митотические ошибки и онкогенез

Представление о том, что митотические ошибки могут способствовать онкогенезу, было впервые постулировано более 100 лет назад Boveri (1914). Однако вопрос о том, способствуют ли ошибки клеточного деления онкогенезу или возникают как побочный продукт трансформации, остается предметом изучения. активной дискуссии. Тот факт, что гены, контролирующие сегрегацию хромосом, редко мутируют при раке человека, повышает вероятность что индуцирование CIN является попутным событием в развитии опухоли. Действительно, инактивация нескольких генов-супрессоров опухолей была показано, что он способствует CIN и анеуплоидии (Manning et al.2010 г.; ван Ри и др. 2016). Тем не менее, масса доказательств свидетельствует о том, что, по крайней мере при некоторых обстоятельствах, митотические ошибки действительно способствуют туморогенез. Во-первых, у пациентов с МВА отмечаются высокие уровни анеуплоидии и повышенная предрасположенность к определенным видам рака (Garcia-Castillo et al. 2008). Во-вторых, митотические ошибки и анеуплоидизация могут быть обнаружены на ранних стадиях эволюции опухоли, а степень хромосомных аберраций коррелирует со степенью опухоли и плохим прогнозом (Mugneret et al. 2003 г.; ван де Ветеринг и др. 2007 г.; Вальтер и др. 2008 г.; М’Качер и др. 2010 г.; Бакум и др. 2011). Наконец, возможно, наиболее убедительные доказательства в поддержку причинно-следственной связи между CIN и развитием опухоли получены из исследование моделей мышей с повышенной частотой митотических ошибок, вызванных сниженным или повышенным уровнем компонентов SAC. Много этих моделей с CIN демонстрируют повышенную частоту спонтанных опухолей и/или повышение уровня химических или генетических индуцированное образование опухоли (Dobles et al.2000 г.; Мишель и др. 2001 г.; Бабу и др. 2003 г.; Дай и др. 2004 г.; Джеганатан и др. 2006, 2007; Иванага и др. 2007 г.; Сотилло и др. 2007 г.; Уивер и др. 2007 г.; Бейкер и др. 2009 г.; Ли и др. 2009 г.; ван Ри и др. 2010 г.; Фойер и др. 2014). Подробное обсуждение спектра опухолей, образующихся у этих животных, см. в следующих обзорах: Holland and Cleveland (2009), Simon et al. (2015) и Нейлор и ван Дерсен (2016).

То, как митотические дефекты могут способствовать развитию опухоли, остается областью интенсивных исследований.В качестве первого пути для облегчения онкогенеза, CIN управляет постоянно развивающимся кариотипом, который обеспечивает генетическое разнообразие в популяции опухолевых клеток. Помимо популяционного уровня генетическая изменчивость, дисбаланс дозировки, вызванный анеуплоидией, снижает надежность биологических сетей. и повысить клеточную изменчивость (Beach et al. 2017). Вместе эта генетическая и негенетическая гетерогенность создает фенотипическое разнообразие.Хотя подавляющее большинство изменений кариотипа, как ожидается, будет вредным, небольшая часть этих изменений может быть полезной и выбрана для во время эволюция опухоли. Предложена хромосомная локализация и относительная плотность генов-супрессоров опухолей и онкогенов. играть важную роль в формировании тканеспецифических паттернов анеуплоидии, наблюдаемых при различных типах рака (Davoli et al. 2013; Sack et al.2018). Это может объяснить, почему в некоторых типах опухолей периодически наблюдаются определенные хромосомные изменения, такие как увеличение числа хромосом. 8, который наблюдается в 25% случаев хронического миелоидного лейкоза и в 10–15% случаев острого миелоидного лейкоза (Paulsson and Johansson, 2007).

Широко предложенный механизм, с помощью которого митотические ошибки способствуют развитию опухоли, заключается в потере хромосомы, которая содержит оставшуюся копию гена-супрессора опухоли дикого типа.Действительно, было показано, что это происходит у хромосомно нестабильных мыши, гетерозиготные по p53 или несущие мутированный аллель APC (Baker et al. 2009). В дополнение к стимулированию роста первичной опухоли недавняя работа функционально связала CIN с метастазированием, показав, что хромосомно нестабильные линии опухолевых клеток более склонны к распространению и образованию новых опухолей по сравнению с теми же клетками, в которых была CIN. подавляется (Bakhoum et al.2018). Наконец, генетическая нестабильность, вызванная CIN, может способствовать развитию резистентности в ответ на целевое воздействие. противораковые терапии. У мышей CIN, обусловленный сверхэкспрессией белка SAC MAD2, обеспечивает эволюционное топливо для облегчения рецидив опухоли после отмены онкогена KRAS (Sotillo et al. 2010). Генетически модифицированные мыши, которые воспроизводят текущие изменения кариотипа, наблюдаемые в большинстве опухолей человека, таким образом, вероятно, они представляют собой мощные модели для тестирования эффективности новых клинических кандидатов в лекарства.

Наиболее обширная характеристика роли митотических ошибок в онкогенезе была получена при развитии мышиных модели с повышенным или пониженным уровнем белков SAC. Эти животные демонстрируют продолжающуюся CIN и повышенную анеуплоидию. в клетках и тканях. Хотя многие из этих моделей предрасположены к опухолям, некоторые демонстрируют высокие уровни анеуплоидии без увеличения при предрасположенности к опухоли, демонстрируя, что степень анеуплоидии не является точным предиктором предрасположенности к опухоли (Бейкер и др.2006). Одно из возможных объяснений этого наблюдения заключается в том, что некоторые из белков, на которые воздействуют, имеют функции вне митоза, которые мешают интерпретации фенотипов опухолей (Funk et al. 2016). Например, предполагается, что белки SAC играют роль в передаче сигналов инсулина (Choi et al. 2016), репрессии транскрипции (Yoon et al. 2004), репликации и репарации ДНК (Sugimoto et al. 2004; Dotiwala et al. 2010), и перенос мембран (Wan et al. 2014). Альтернативная возможность состоит в том, что гены, манипулированные для индукции неправильной сегрегации хромосом, приводят к различным типам митотические ошибки, изменяющие кариотип по-разному. Например, снижение уровня/активности мотора МТ. белок CENP-E приводит к инициации анафазы с полярными хромосомами, что приводит к событиям увеличения и потери всей хромосомы (Уивер и др., 2003). С другой стороны, сверхэкспрессия MAD2 приводит к отставанию анафазных хромосом, которые могут подвергаться двухцепочечной ДНК. разрывы и служат источником хромосомных перестроек (Sotillo et al. 2007). Будет интересно определить, в какой степени частота разрывов ДНК, возникающих в результате митотических ошибок, коррелирует с со склонностью к опухолевому развитию.

Хотя значительные усилия были направлены на моделирование митотических ошибок с использованием мышей с измененными уровнями компонентов SAC, Дисфункция SAC, по-видимому, не является основной причиной CIN в опухолях человека. Учитывая установленную роль центросомной амплификации в продвижении CIN и его широкого присутствия в анеуплоидных опухолях человека в последнее время внимание было обращено на создание мышей в какие дополнительные центросомы могут образовываться за счет сверхэкспрессии PLK4, главного регулятора биогенеза центросом (Marthiens et al. 2013; Коэльо и др. 2015 г.; Кулукян и др. 2015 г.; Витре и др. 2015 г.; Серчин и др. 2016; Левин и др. 2017). Умеренная сверхэкспрессия Plk4 приводила к хронической амплификации центросом и анеуплоидии во многих тканях и была достаточной. стимулировать образование лимфом и плоскоклеточного рака (Levine et al. 2017). Поразительно, что эти опухоли демонстрировали высокий уровень анеуплоидии, продолжающиеся ошибки сегрегации хромосом и дефектный p53. сигнализация. Кроме того, опухоли, образовавшиеся в результате амплификации центросом, имели сложные кариотипы, имитирующие те, которые часто встречаются в опухолях человека.Теперь будет полезно разработать дополнительные модели животных, которые имитируют другие митотические аберрации, часто наблюдаемые в опухолевых клетках человека, такие как гиперстабилизированные взаимодействия K-MT.

Хотя митотические ошибки уже давно вызывают рак, становится ясно, что в некоторых случаях ошибки сегрегации хромосом могут подавлять онкогенез. В нескольких примерах, когда опухоли развиваются с низкой скоростью CIN, дальнейшее увеличение CIN подавляло заболеваемость опухолью (Weaver et al.2007 г.; Бейкер и др. 2009 г.; Силк и др. 2013). Действительно, сочетание низких показателей неправильной сегрегации хромосом из-за экспрессии мутантного аллеля APC с дополнительным CIN из снижение уровня CENP-E приводило к повышенной гибели клеток, что подавляло прогрессирование опухоли, но не инициацию (Zasadil et al. 2016). Это говорит о том, что низкий уровень неправильной сегрегации хромосом может способствовать развитию опухоли, в то время как высокий уровень CIN ведет к развитию опухоли. к потере основных хромосом и подавлению опухоли (Funk et al.2016). Это объясняет, казалось бы, парадоксальное наблюдение, что низкие уровни CIN связаны с неблагоприятным исходом эстрогена. рецептор-негативный рак молочной железы, в то время как высокие уровни CIN коррелируют с улучшением долгосрочной выживаемости (Birkbak et al. , 2011; Roylance et al., 2011; Jamal-Hanjani et al., 2015). Поскольку чрезмерные ошибки сегрегации хромосом смертельны, опухоли могут выбирать изменения, которые противодействуют эффектам. чрезмерного CIN. Слегка увеличивая продолжительность митоза за счет снижения активности APC/C, уменьшаются ошибки сегрегации хромосом. в клетках с CIN (Sansregret et al.2017). Следовательно, увеличение продолжительности митоза может быть стратегией, используемой раковыми клетками для настройки уровня CIN и противодействия долгосрочные дефекты приспособленности, вызванные чрезмерными ошибками сегрегации хромосом. Последовательно, секвенирование генома одной клетки опухолей молочной железы человека показало, что анеуплоидия возникает на ранней стадии эволюции опухоли, но остается относительно стабильной во время опухолевого процесса. нарост (Wang et al. 2014). Это говорит о том, что как только будет достигнута критическая точка, можно выбрать повышенную стабильность генома, чтобы помочь опухолям. рост.

В совокупности имеющиеся данные свидетельствуют о том, что митотические ошибки могут оказывать различное влияние на разные стадии опухолевого процесса. разработка. Низкая частота митотических ошибок может способствовать развитию опухоли, особенно в контексте инактивации путей, которые подавляют рост анеуплоидных или полиплоидных клеток. Тем не менее более высокая частота ошибок сегрегации хромосом приводит к потере эссенциальных хромосом и подавление опухоли.Выявление генетических изменений, которые взаимодействуют, чтобы облегчить трансформацию хромосомно нестабильных клеток является важным направлением будущей работы.

Митотические ошибки вызывают активацию врожденного иммунного ответа

С 1960-х годов было признано, что иммунная система может распознавать опухолевые антигены и уничтожать зарождающиеся опухолевые клетки. (Бозе, 2017).Эти открытия стимулировали разработку иммунотерапии, которая стимулирует способность иммунной системы атаковать раковые клетки, которые эволюционируют, чтобы уклониться от распознавания иммунной системой. Убедительный массив новых экспериментальных данных поддерживает идею о том, что иммунная система может распознавать и уничтожать клетки со сложными кариотипами, что ставит вопрос о том, как эти изменения обнаруживаются и как они способствуют формированию эволюции опухоли и терапевтическим ответам.

Раковые клетки с аномальным кариотипом могут излучать сигналы, повышающие их иммуногенность. Подается один основной сигнал конститутивным стрессом эндоплазматического ретикулума в анеуплоидных клетках, что приводит к повышенному воздействию иммуногенных клеток поверхностных молекул и последующего клиренса врожденными и адаптивными иммунными клетками (рис. 4А; Senovilla et al. 2012; Acebes-Huerta et al. 2016). Более поздняя работа показала, что рецептор врожденного иммунитета cGAS (циклическая GMP-AMP [cGAMP]-синтаза) является ключевым медиатором иммунная сигнализация в клетках, которые претерпевают митотические ошибки (Harding et al.2017; Маккензи и др. 2017). cGAS представляет собой сенсор цитозольной ДНК, который активируется при связывании с двухцепочечной ДНК и катализирует выработку сигнальной молекулы. cGAMP (Сан и др., 2013; Ву и др., 2013). Второй мессенджер cGAMP связывает и активирует STING (стимулятор генов интерферона), что приводит к образованию типа I интерферон и другие провоспалительные цитокины, запускающие иммунный ответ (рис. 4В). Внутриклеточный cGAMP может распространяться на соседние клетки через щелевые контакты, быстро вызывая паракринный провоспалительный процесс. сигнальная программа (Ablasser et al.2013).

Рисунок 4.

Митотические ошибки активируют иммунную систему. ( A ) Анеуплоидные клетки проявляют конститутивный стресс эндоплазматического ретикулума (ЭР), который приводит к повышенному воздействию на поверхность иммуногенные молекулы клеточной поверхности, такие как кальретикулин. Они распознаются иммунными клетками, такими как естественные киллеры (NK). клетки, дендритные клетки, макрофаги и Т-клетки, которые поглощают или убивают анеуплоидные клетки.( B ) Микроядерная оболочка склонна к разрыву, что приводит к обнажению захваченного хроматина для зондирования цитоплазматической ДНК молекулы, такие как cGAS. cGAS активируется открытой микроядерной ДНК, что позволяет превращать АТФ и ГТФ в второй мессенджер cGAMP. cGAMP активирует STING, который вызывает IRF3- и NFκB-опосредованную экспрессию интерферонов 1-го типа и провоспалительные процессы. цитокинов соответственно.( C ) Анеуплоидные клетки демонстрируют повышенную экспрессию лигандов, активирующих NK-клетки, что позволяет распознавать и уничтожать анеуплоидные клетки. клеток NK-клетками через их рецепторы NKG2D и DNAM1.

Во время интерфазы ДНК компартментализована в ядре и недоступна для цитозольной cGAS. Митотические ошибки могут вызвать целые хромосомы или части хромосом, подлежащие разделению на микроядра.Как обсуждалось ранее, хромосомы, содержащиеся в микроядра подвергаются массивной фрагментации хромосом после спонтанного разрыва микроядерной мембраны (Краста и др., 2012; Хэтч и др., 2013; Чжан и др., 2015). Это позволяет cGAS получить доступ к поврежденной микроядерной ДНК, запуская продукцию провоспалительных цитокинов (Fig. 4B). Микроядерный разрыв также может высвобождать фрагменты ДНК в цитозоль, что объясняет, почему хромосомно нестабильные клетки высокий уровень цитозольной ДНК (Bakhum and Landau 2017).Соответственно, воспалительные сигналы усиливаются в клетках с микроядрами, генерируемыми ионизирующим излучением (Mackenzie et al., 2017). Таким образом, поврежденная ДНК внутри микроядер, вероятно, действует как важный источник иммуностимулирующей ДНК.

Образование микроядер также было идентифицировано как критический медиатор активации cGAS-STING после повреждения ДНК. (Хардинг и др., 2017). Разрывы ДНК, которые сохраняются в митозе, приводят к образованию фрагментов хромосом, в которых отсутствуют центромеры и которые не могут быть разделены.Эти фрагменты хроматина выходят из ядра и приводят к образованию микроядер в следующем клеточном цикле. Недавний работа показала, что прохождение через митоз и образование микроядер необходимы для активации cGAS-STING в реакция на повреждение ДНК (Harding et al. 2017). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что путь cGAS-STING может действовать как путь внутриклеточного надзора для обнаружения наличие цитозольной ДНК в результате повреждения ДНК и дефектов сегрегации хромосом.

Конечным путем активации cGAS-STING после ошибок в митозе является индукция клеточного старения (Dou et al. 2017; Gluck et al. 2017; Yang et al. 2017). Старение – это необратимая остановка роста, вызванная такими стрессами, как ионизирующее излучение, активация онкогенов, или стойкое повреждение ДНК (Tchkonia et al. 2013). Было показано, что cGAS распознает фрагменты цитозольного хроматина, высвобождаемые из ядра стареющих клеток, и, в свою очередь, запускает выработку различных медиаторов воспаления, которые активируют иммунную систему, известных под общим названием секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP) (Dou et al.2017; Глюк и др. 2017; Ян и др. 2017). Было показано, что арестованные анеуплоидные клетки проявляют характеристики старения и производят сигнатуру экспрессии генов, подобную SASP. in vitro (Сантагида и др., 2017). Эти анеуплоидные клетки также демонстрируют повышенную экспрессию лигандов, активирующих клетки естественных киллеров (NK), и эффективно устраняется при совместном культивировании с NK-клетками in vitro (рис. 4C; Santaguida et al., 2017). Будущая работа будет сосредоточена на определении важности цитозольного хроматина, индуцированного микроядрами или старением, для запуска активация cGAS-STING в анеуплоидных клетках.Более того, еще предстоит установить, насколько эффективно эти пути действуют на способствуют иммунному клиренсу анеуплоидных клеток in vivo. Наконец, следует отметить, что активация пути cGAS-STING при анеуплоидных опухолях может действовать как «палка о двух концах», что способствует как клиренсу клеток с аномальными кариотипами, так и к воспалению, которое стимулирует онкогенез (Bose 2017).

В совокупности данные свидетельствуют о том, что распознавание раковых клеток иммунной системой может быть опосредовано анеуплоидным состояния или связанных с ним изменений.Таким образом, опухолевые клетки со сложными кариотипами должны вырабатывать механизмы для подавления узнавания. иммунной системой. Соответственно, хромосомно нестабильные опухолевые клеточные линии избегают индукции провоспалительной сигнализации, несмотря на высокий уровень цитозольной ДНК (Bakhum and Landau 2017). Более того, анализ опухолей из наборов данных «Атлас генома рака» показал, что рак с высоким анеуплоидным кариотипом продемонстрировал сниженную экспрессию генов, связанных с цитотоксическими иммунными функциями и продукцией провоспалительных цитокинов. (Буччителли и др.2017; Даволи и др. 2017; Тейлор и др. 2018). Ретроспективное исследование пациентов с меланомой, получавших терапию блокирующими контрольными точками иммунного ответа анти-CTLA4, показало, что эти с низким уровнем анеуплоидии реагировали лучше. Эти данные подтверждают идею о том, что микроокружение кариотипически опухоли является иммуносупрессивным и предполагает, что оценка уровней анеуплоидии опухоли может быть использована для прогнозирования реактивности. к иммунотерапии.

Генетические изменения, повышающие устойчивость к иммунной системе хозяина, были выявлены при раке (Khong and Restifo 2002). Например, потеря гетерозиготности человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) происходит в 40% случаев немелкоклеточного рака легкого и действует для подавления иммунного распознавания за счет уменьшения презентации неоантигена (McGranahan et al. 2017). Таким образом, выяснение того, ответственны ли этот или другие механизмы за снижение иммуногенности сильно анеуплоидных опухоли является важной областью будущей работы, которая может дать представление о том, как улучшить реакцию пациентов на иммунотерапию.

Использование митотических ошибок для лечения рака

Учитывая широкое распространение митотических ошибок при раке человека, было исследовано несколько подходов к нацеливанию на митотические аппарата или использовать слабости, связанные с анеуплоидным состоянием. Имея долгую историю клинической эффективности, нацеливание на МТ агенты являются наиболее широко используемыми противораковыми препаратами, нацеленными на деление клеток.Один из самых успешных препаратов в этом классе паклитаксел, который десятилетиями использовался для лечения рака молочной железы, яичников и легких. Паклитаксел связывает и стабилизирует решетку МТ и при высоких концентрациях останавливает делящиеся клетки в митозе, предотвращая замалчивание SAC, что приводит либо к гибели клеток, либо к старению. Однако клинически значимые дозы паклитаксела не вызывают остановку митоза, а скорее приводят к образованию мультиполярных веретен, вызывающих массовую неправильную сегрегацию хромосом и гибель клеток (Symmans et al.2000 г.; Орт и др. 2011 г.; Засадил и др. 2014). Хотя уничтожение делящихся клеток является привлекательной моделью противоопухолевого действия паклитаксела, этот механизм сложен. чтобы примириться с медленной скоростью пролиферации многих солидных опухолей, которая предсказывает, что слишком мало клеток проходят через митоз в присутствии препарата для уничтожения обширных опухолей (Mitchison 2012). Недавно была предложена альтернативная модель «воспалительной микронуклеации», основанная на необычной способности паклитаксел, чтобы вызвать образование множества микроядер в клетках после выхода из митоза (Mitchison et al.2017). В этой модели микронуклеация в подгруппе клеток, которая проходит через митоз в присутствии паклитаксела, производит провоспалительный сигнал, который приводит к массовому уничтожению опухолевых клеток. Хотя это предложение еще предстоит проверить, оно имеет привлекательная черта, объясняющая, почему паклитаксел более эффективен при уничтожении солидных опухолей, чем другие препараты, воздействующие на митотического аппарата, но не индуцируют микронуклеации.

Клинический успех паклитаксела стимулировал разработку множества митотически специфичных препаратов, нацеленных на необходимые ферменты. для клеточного деления (Dominguez-Brauer et al.2015). Например, несколько групп разработали ингибиторы киназы SAC MPS1 (Colombo et al., 2010; Jemaa et al., 2013; Tannous et al., 2013; Maachani et al., 2015; Wengner et al., 2016). Эти препараты блокируют контрольную точку митоза и увеличивают частоту ошибок сегрегации хромосом, что приводит к образование нежизнеспособных кариотипов. Интересно, что ингибиторы MPS1 сенсибилизируют ксенотрансплантатные опухоли к действию паклитаксела. уничтожение за счет повышения ошибок сегрегации хромосом выше порога, необходимого для жизнеспособности (Jemaa et al.2013; Таннус и др. 2013; Майя и др. 2015). Однако, несмотря на многообещающие доклинические результаты, специфические для митоза препараты показали ограниченную эффективность в клинических испытаниях. в большинстве случаев уступают классическим средствам для нацеливания на МТ, таким как паклитаксел (Komlodi-Pasztor et al. 2012). Одной из причин такого несоответствия, вероятно, является низкая скорость пролиферации опухолей in vivo по сравнению с раковыми клетками. линий и ксенотрансплантатов опухолей, на которых тестировались препараты (Komlodi-Pasztor et al.2011). Дополнительным барьером, ограничивающим успех митотически специфичных препаратов, является их неспособность различать деления. нормальных клеток и опухолевых клеток, что приводит к токсичности костного мозга, что ограничивает дозу и продолжительность лечения.

Лекарства следующего поколения, специфичные для митоза, вероятно, будут более успешными, если они будут использовать уязвимости, специфичные для опухоли. Один Примером такого подхода является нацеливание на деления раковых клеток с дополнительными центросомами. Поскольку раковые клетки эффективно кластеризовать дополнительные центросомы, чтобы избежать летальных мультиполярных делений, подавляя пути, необходимые для кластеризации центросом будет избирательно разрушать клетки с дополнительными центросомами, не влияя на рост нормальных клеток. Минус-конец направлен моторный белок HSET/KIFC1 идентифицирован как основной компонент, необходимый для кластеризации центросом (Kwon et al. 2008). HSET не требуется для роста клеток с нормальным числом центросом, но необходим для жизнеспособности опухолевые клетки с дополнительными центросомами.Это знание послужило толчком к разработке набора новых лекарств, направленных на уничтожение опухолевые клетки с дополнительными центросомами путем подавления кластеризации центросом (Rebacz et al. 2007; Castiel et al. 2011; Raab et al. 2012; Shiheido et al. 2012; Kawamura et al. 2013; Pannu et al. 2014; Bhakta-Guha et al. и др., 2015; Йоханнес и др., 2015; Ли и др., 2015; Тан и др., 2015; Чжан и др., 2016). Было показано, что эти соединения разрушают центросомы и индуцируют летальные мультиполярные деления в клеточной культуре. еще предстоит определить, достигают ли эти опухолеспецифические препараты улучшенного терапевтического индекса и улучшенной клинической эффективности.

В дополнение к нацеливанию на механизм клеточного деления также может быть возможно выявить последствия ошибок клеточного деления. путем использования уязвимостей, связанных с самим анеуплоидным состоянием. Анеуплоидные клетки более чувствительны, чем эуплоидные. клеток к соединениям, которые усугубляют протеотоксический стресс и метаболический стресс (Tang et al. 2011). Более того, фармакологическая активация обоих этих стрессовых путей действует синергетически, подавляя рост хромосомных клеток. нестабильные ксенотрансплантатные опухоли. Анеуплоидные клетки также демонстрируют нарушение регуляции метаболизма сфинголипидов, что приводит к повышению их уровня. проапоптотического липидного церамида (Hwang et al. 2017; Tang et al. 2017). Соответственно, фармакологические средства, повышающие уровень церамидов, более токсичны для анеуплоидных клеток, чем для диплоидных. (Танг и др., 2017). В совокупности эти исследования предлагают принципиальное доказательство того, что анеуплоидное состояние можно использовать в терапевтических целях и открывать дверь к возможности создания противораковых препаратов широкого спектра действия, направленных на усиление стрессов, присущих анеуплоидным клетки.

Перспектива

Исследование основных механизмов, лежащих в основе верной сегрегации хромосом, позволило понять, как митотические ошибки способствуют внутриопухолевой гетерогенности, опухолевой прогрессии, метастазированию и адаптивной эволюции в ответ на терапию. Однако, нам все еще не хватает глубокого понимания долгосрочного воздействия ошибок клеточного деления in vivo.В будущем модели животных которые повторяют молекулярные дефекты, ответственные за развитие митотических ошибок при раке человека, будут играть важную роль в выяснение физиологических последствий ошибок клеточного деления и их влияния на онкогенез. Такие модели животных будут также помогают понять возникающую связь между ошибками клеточного деления и активацией иммунной системы. Особенно, остается неясным, насколько эффективно анеуплоидные клетки распознаются и уничтожаются иммунной системой in vivo.Более того, будь то провоспалительные последствия ошибок клеточного деления приводят к развитию иммуносупрессивного микроокружения опухоли осталось протестировать.

Разработка методологий для оценки частоты ошибок клеточного деления in vivo будет иметь решающее значение, если они использоваться для терапевтического вмешательства. Поэтому будет важно отказаться от использования FISH и метафазных спредов. для измерения анеуплоидии и вместо этого перейти к более надежному секвенированию отдельных клеток с более высоким разрешением для оценки кариотипа изменения.Мы также выиграем от дальнейшего понимания того, как p53 активируется после ошибок клеточного деления и как опухоль клетки развивают мутации, чтобы настроить скорость CIN. Понимание влияния ошибок клеточного деления на клеточную физиологию большие перспективы для нашего понимания и лечения рака. В связи с этим, используя молекулярные различия в способах что нормальные и опухолевые клетки делятся, чтобы избирательно воздействовать на деление раковых клеток, является особенно многообещающим терапевтическим проспект.

Благодарности

Благодарим сотрудников лаборатории за полезные обсуждения и приносим свои извинения коллегам, чью работу нельзя было процитировать из-за нехватки места. ограничения. Работа в голландской лаборатории была поддержана исследовательским грантом R01 от Национального института здоровья (NIH; GM 114119), грант Американского онкологического общества (129742-RSG-16-156-01-CCG) и грант March of Dimes Research (1-FY17-698). к А.JH и грант F31 Национальной исследовательской службы от NIH (GM122288) для MSL.

Характеристика высвобождения и биологическое значение внеклеточной ДНК из клеточных линий рака молочной железы

ВВЕДЕНИЕ

Фрагменты ДНК в кровотоке, высвобождаемые клетками, называются внеклеточной ДНК (вкДНК), а вкДНК, несущая опухолеспецифические изменения последовательности, называется известная как циркулирующая опухолевая ДНК (цДНК) [1].CfDNA, особенно ctDNA, была признана потенциальным диагностическим и прогностическим биомаркером для нескольких типов рака [2-4]. Хотя вкДНК распространена повсеместно, ее генеративный механизм остается не до конца установленным [5, 6].

Несколько исследований предполагают апоптотическое происхождение вкДНК из раковых клеток у пациентов с паттерном электрофоретической лестницы и размерами фрагментов от 150 до 1000 п.н. [7, 8]. Интересно, что другие исследователи наблюдали более длинные фрагменты ДНК (> 1000 п.н.) в крови больных колоректальным раком по сравнению со здоровыми [6].Они предположили, что вкДНК происходит из некротических клеток, поскольку некротические клетки могут высвобождать в кровоток более длинные фрагменты ДНК [9]. Однако другое исследование показало, что у пациентов, получавших лучевую терапию, которая вызывает в основном некроз клеток, было снижение уровня вкДНК на 90%, что свидетельствует против некроза как основного пути высвобождения вкДНК [10]. Кроме того, несколько исследований показали, что вкДНК происходит из активных клеточных выделений, таких как экзосомы, апоптотические пузырьки, выделяющиеся везикулы и микрочастицы [11, 12].Кроме того, на высвобождение вкДНК могут влиять многие смешанные факторы in vivo , которые частично обходят модели in vitro [13]. Следовательно, апоптоз, некроз и активная клеточная секреция, по-видимому, частично объясняют появление вкДНК; однако точный механизм высвобождения вкДНК остается неясным, особенно при раке молочной железы.

Важно отметить, что в некоторых исследованиях были выявлены биологические эффекты циркулирующих внеклеточных нуклеиновых кислот. Например, микроРНК в крови выполняют важные функции в онкогенезе, метастазировании и резистентности [14].Однако сообщений о влиянии вкДНК на раковые клетки очень мало. Гарсия-Олмо и др. сообщили, что вкДНК из клеток аденокарциномы толстой кишки может способствовать метастазированию опухоли, и предложили гипотезу «генометастаза» [15]. В последующих исследованиях исследователи обнаружили, что вкДНК пациентов с колоректальной опухолью может индуцировать онкогенную трансформацию клеток NIH-3T3 и стволовых клеток, полученных из жировой ткани [16]. При раке молочной железы в нескольких исследованиях изучалось биологическое значение вкДНК. Туомела и др.показали, что ДНК из мертвых раковых клеток может вызывать инвазию и воспаление клеток рака молочной железы [17].

В настоящем исследовании, чтобы избежать смешанных факторов in vivo , мы оценили характер высвобождения вкДНК из культивируемых клеток рака молочной железы человека в различных условиях культивирования и определили критические факторы, влияющие на высвобождение вкДНК in vitro . Кроме того, мы наблюдали, что вкДНК может способствовать пролиферации клеток рака молочной железы, положительных по гормональному рецептору (HR +), путем активации толл-подобного рецептора 9 (TLR9) — ядерного фактора каппа B (NF-κB) — циклина D1.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Кинетика высвобождения вкДНК в нормальных условиях культивирования

Мы обнаружили, что концентрация вкДНК из клеточных линий рака молочной железы (T47-D и MDA-MB-231) была выше, чем из нормальной клеточной линии молочной железы (MCF- 10А) в обычных условиях культивирования во все моменты времени. Кроме того, количество внДНК, высвобождаемой клетками T47-D, было выше, чем количество, высвобождаемое клетками MDA-MB-231, и эта тенденция не менялась при нормализации концентрации ДНК по количеству жизнеспособных клеток. После обновления питательной среды общее количество или нормированная концентрация вкДНК, высвобождаемой клетками T47-D и MDA-MB-231, постепенно увеличивалась через 6 часов, постепенно снижалась с течением времени, а затем стабилизировалась через 24 часа (рис. 1).

Рисунок 1: Концентрация CfDNA в супернатанте клеточных линий MCF-10A, T47-D и MDA-MB-231 в нормальных условиях культивирования. Число в верхней части каждого столбца представляет относительную концентрацию в каждый момент времени. Общая концентрация: концентрация вкДНК в супернатанте клеток рака молочной железы.Нормализованная концентрация: концентрацию вкДНК нормализовали по количеству жизнеспособных клеток.

Концентрация вкДНК не коррелировала с клеточным апоптозом и некрозом

Для исследования взаимосвязи между концентрацией вкДНК и клеточным апоптозом или некрозом клетки T47-D, MDA-MB-231 и MCF-10A обрабатывали 0, 50 , 80 мкМ цисплатина, соответственно, для индукции различных уровней апоптоза и некроза. Проточная цитометрия показала, что соответствующая средняя скорость апоптоза клеток MCF-10A при трех концентрациях цисплатина была равна 1.80, 11,17 и 28,65%; для клеток Т47-Д — 3,00, 22,92 и 41,26%; а для клеток МДА-МВ-231 — 2,22, 38,79 и 48,19%. Средняя скорость некроза клеток MCF-10A при трех концентрациях цисплатина составила 1,95, 2,36 и 0,37%; для клеток Т47-Д — 0,85, 4,25 и 5,57%; а для клеток МДА-МВ-231 – 1,04, 0,17 и 0,33%. Анализ концентрации показал, что соответствующие концентрации вкДНК, высвобождаемой клетками MCF-10A, составляли 11,36, 22,38 и 17,55 нг/мл; для клеток T47-D они были 42,91, 127.07 и 92,18 нг/мл; а для клеток MD-MB-231 — 20,42, 41,16 и 15,39 нг/мл (рис. 2). Корреляционный анализ показал, что концентрация вкДНК не имеет определенной корреляции со степенью клеточного апоптоза (коэффициенты корреляции: MCF-10A: 0,409, p = 0,731; T47D: 0,602, p = 0,589; MDA-MB-231: 0,143, p = 0,909). или некроз (коэффициенты корреляции: MCF-10A: 0,125, p = 0,920; T47D: 0,765, p = 0,445; MDA-MB-231: 0,491, p = 0,674).

Рисунок 2: Концентрация вкДНК из клеток рака молочной железы с разным уровнем апоптоза и некроза. (A) Диаграмма рассеяния проточной цитометрии клеток, обработанных различными дозами индуктора апоптоза; (B–D) гистограмм соотношения апоптоза и некроза клеток MCF-10A, T47-D и MDA-MB-231; (E) Концентрация CfDNA в клеточных линиях, обработанных различными дозами индуктора апоптоза.

Клетки в фазе G1 имели положительную корреляцию с концентрацией вкДНК

Чтобы выяснить, влияет ли клеточный цикл на происхождение вкДНК, клетки MCF-10A, T47-D и MDA-MB-231 обрабатывали и 50 мкМ росковитина.Анализ клеточного цикла показал, что при этих трех концентрациях росковитина 31,35, 38,2 и 45,05% клеток MCF-10A; 40,5, 48,05 и 74,45% клеток T47-D; и 24,1, 31,95 и 44,25% клеток MDA-MB-231 остались в фазе G1 соответственно. Анализ концентрации показал, что соответствующие концентрации вкДНК в клетках MCF-10A составляли 29,52, 31,38 и 36,24 нг/мл, в клетках T47-D — 28,58, 36,79 и 67,63 нг/мл; а из клеток MDA-MB-231 — 32,96, 54,43 и 97,46 нг/мл (рис. 3). Корреляционный анализ показал, что процент клеток в фазе G1 положительно коррелирует с концентрацией вкДНК (коэффициенты корреляции: MCF-10A: 0.968, р = 0,161; T47D: 1,00, р = 0,008; МДА-МБ-231: 0,998, р = 0,041). Чтобы подтвердить взаимосвязь между долей клеток в фазе G1 и концентрацией вкДНК, мы также культивировали клетки в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с 10, 2,5 и 0% фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы вызвать изменения клеточного цикла. . Результаты подтвердили, что процент клеток в фазе G1 положительно коррелирует с концентрацией вкДНК (дополнительная фигура 2).

Рисунок 3: Взаимосвязь концентрации вкДНК и клеточного цикла. (A–D) Анализ клеточного цикла трех клеточных линий, обработанных различными дозами ингибитора клеточного цикла; (E) Концентрация вкДНК в клеточных линиях, обработанных различными дозами ингибитора клеточного цикла.

Клетки в фазе G1 высвобождали вкДНК в основном, но не исключительно, через экзосомы

Концентрация вкДНК не зависела от количества апоптотических или некротических клеток, но была связана с количеством жизнеспособных клеток. Поэтому затем мы оценили взаимосвязь между концентрацией вкДНК и экзосомами, активной секрецией из жизнеспособных клеток, чтобы выяснить, высвобождают ли клетки вкДНК в основном через экзосомы.При культивировании без FBS в фазе G1 оставалось больше клеток. Кроме того, уровень белка CD9 (маркер экзосом) в культуральном супернатанте без FBS был выше, чем в супернатанте с FBS (рис. 4А, 4Б). Концентрационный анализ показал, что общая концентрация вкДНК в супернатанте без FBS (39,37 нг/мл) была значительно выше, чем в супернатанте с FBS (18,94 нг/мл) (p < 0,01). Концентрация вкДНК, связанная с экзосомами, в супернатанте без FBS была значительно выше, чем в супернатанте с FBS (18.39 нг/мл по сравнению с 8,94 нг/мл, p < 0,01). Точно так же в оставшемся супернатанте после удаления экзосом концентрация вкДНК в FBS-отрицательной группе оставалась значительно выше, чем в FBS-положительной группе (16,61 нг/мл против 7,27 нг/мл, p <0,01). Однако разница в концентрации вкДНК между экзосомами и соответствующим супернатантом без экзосом не была статистически значимой (p > 0,05) как в группе с отрицательным результатом FBS (18,39 нг/мл , так и в 16,61 нг/мл, p = 0,19) и FBS-положительная группа (8,94 нг/мл против 7,27 нг/мл, p = 0,11) (рис. 4C). Таким образом, результаты предполагают, что клетки в фазе G1 могут высвобождать cfDNA через экзосомы, но не исключительно.

Рисунок 4: Концентрация CfDNA экзосом и соответствующий культуральный супернатант. (A) Анализ клеточного цикла клеток, культивируемых с или без FBS; (B) Экспрессия CD9 экзосом, выделенных из супернатанта с FBS или без него; (C) Концентрация CfDNA в общем супернатанте (все), экзосомах (экзосомах (+)) и супернатантах без экзосом (экзосомах (-)).+: культура с ФБС; —: культура без FBS.

ВкДНК способствует пролиферации HR+ клеток рака молочной железы

Для изучения биологического значения вкДНК в клетках рака молочной железы T47-D и MDA-MB-231 обрабатывали вкДНК, экстрагированной из супернатанта MD-MB-231 рака молочной железы клетки. Анализы образования клонов и анализы пролиферации CCK-8 показали, что вкДНК не может способствовать пролиферации клеток MDA-MB-231 (дополнительная фигура 3). Напротив, анализ образования клона показал, что количество очагов, образованных клетками T47-D, значительно увеличилось после добавления в среду вкДНК по сравнению с контрольной группой (среднее число очагов: 46 против 24, р < 0,01). Когда клетки T47-D обрабатывали 4-гидрокси-тамоксифеном (4OH-TAM), количество очагов значительно уменьшалось; однако в группе cfDNA плюс 4OH-TAM было больше очагов, чем в группе 4OH-TAM (18 против 5, p <0,05) (рис. 5A). Результаты анализа пролиферации CCK-8 соответствовали результатам анализа образования клонов. Кроме того, также оценивали пролиферативную способность клеток T47-D в условиях культивирования, не зависящих от привязки, и результаты были аналогичны результатам в условиях, зависящих от привязки (фиг. 5B).Анализ клеточного цикла показал, что количество клеток T47-D в фазе G1 значительно уменьшилось, когда их инкубировали с вкДНК (p <0,01) (рис. 5C). Точно так же мы обнаружили, что вкДНК может способствовать пролиферации клеток MCF-7 (p <0,05) (рис. 5).

Рисунок 5: Стимулирование пролиферации клеток T47-D и MCF-7 с помощью вкДНК. (A) Анализ образования клонов клеток, обработанных вкДНК; (B) Анализ CCK-8 клеток, обработанных вкДНК; (C) Анализ клеточного цикла клеток, обработанных вкДНК.

ВкДНК способствует пролиферации HR+ клеток рака молочной железы за счет активации пути TLR9-NF-κB

Затем мы исследовали лежащий в основе молекулярный механизм, с помощью которого вкДНК способствует пролиферации HR+ клеток рака молочной железы. Эндогенная ДНК распознается TLR9 [18], а путь TLR9-NF-κB играет важную роль в пролиферации раковых клеток. Поэтому мы оценили путь TLR9-NF-κB и обнаружили, что вкДНК может активировать путь TLR9-P65, что в конечном итоге увеличивает экспрессию белка циклина D1.Чтобы доказать, что вкДНК окончательно распознается TLR9, для блокирования связывания двух молекул использовали хлорохин, ингибитор TLR9. Результаты показали, что уровни фосфорилированного P65 (p-P65) и циклина D1 снижались после ингибирования TLR9 по сравнению с контролем, и вкДНК не могла увеличивать экспрессию белка нижестоящих молекул. Кроме того, мы обнаружили, что ДНКаза I, которая может в достаточной степени переваривать ДНК (дополнительная фигура 4), может ингибировать зависимое от вкДНК увеличение экспрессии белка (рисунок 6А). В совокупности мы показали, что вкДНК может способствовать пролиферации HR+ клеток рака молочной железы через путь TLR9-NF-κB-циклин D1.

Рисунок 6: Уровни экспрессии белков членов пути TLR9-NF-κB после обработки клеток вкДНК. (A) Уровни экспрессии белков TLR9, p-P65 и циклина D1 в клетках T47-D и MCF-7 после обработки вкДНК, CQ, вкДНК+CQ, ДНКазы I, ДНКазы I+вкДНК; (B) Уровни экспрессии белков IKK α + β, IKK α, ERα и p-ERα в клетках T47-D и MCF-7 после обработки вкДНК, CQ, вкДНК+CQ, ДНКазой I, ДНКазой I+вкДНК .CQ: хлорохин; p-P65: фосфорилированный P65; р-ERα; фосфорилированный Erα.

Кроме того, мы обнаружили, что уровни белка рецептора эстрогена альфа (ERα), еще одной предшествующей молекулы циклина D1, были повышены в клетках T47-D и MCF-7, обработанных вкДНК. Хотя в нескольких исследованиях сообщалось, что TLR9 отрицательно коррелирует с ERα [19], в других сообщалось об обратном [20]. Парк и др. сообщили, что IκB kinase α (IKKα)-зависимый транскрипционный комплекс необходим для ERα-опосредованной активации генов [21]. Поэтому мы оценили уровни экспрессии белка IKKα + β, IKKα, ERα и фосфорилированного ERα (p-ERα) и обнаружили, что они увеличились после обработки вкДНК (рис. 6B). Таким образом, мы показали, что вкДНК может способствовать пролиферации HR+ клеток рака молочной железы, прямо или косвенно активируя путь TLR9-NF-κB. Кроме того, воспалительная реакция в группе cfDNA не была заметной по сравнению с контрольной группой в этом исследовании (дополнительная фигура 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Было показано, что при раке молочной железы вкДНК или цДНК является многообещающим диагностическим и прогностическим биомаркером [3, 22, 23].Однако большинство исследований касалось его диагностических возможностей в отношении рака и уделяло мало внимания характеру его высвобождения [4, 24, 25]. Хотя в предыдущих исследованиях сообщалось, что появление вкДНК связано с апоптозом или некрозом in vivo , на них может влиять сложная внутренняя среда [13].

В настоящем исследовании мы сначала оценили характер высвобождения внДНК из клеток рака молочной железы человека, используя модель in vitro , чтобы исключить смешанные факторы. Кроме того, мы также исследовали, оказывает ли вкДНК прямое биологическое влияние на раковые клетки. Мы обнаружили, что концентрация внДНК увеличивалась через короткое время после пассирования, постепенно снижалась и затем поддерживалась на относительно стабильном уровне в нормальных условиях культивирования. Кроме того, клетки T47-D, считающиеся менее злокачественными клетками рака молочной железы [26, 27], выделяют больше вкДНК, чем клетки MDA-MB-231. При обработке клеток различными дозами индуктора апоптоза концентрация вкДНК не коррелировала с количеством апоптотических и некротических клеток.Напротив, корреляционный анализ показал, что процент клеток в фазе G1 положительно коррелирует с концентрацией вкДНК. Мы также обнаружили, что клетки в фазе G1 могут высвобождать вкДНК через экзосомы. Однако это составляло лишь часть всего выпущенного вкДНК. Кроме того, мы показали, что вкДНК может способствовать пролиферации клеток рака молочной железы HR +, активируя путь TLR9-NF-κB-циклин D1.

До сих пор механизм высвобождения вкДНК оставался неясным [28]. Несколько исследований показали, что вкДНК высвобождается в основном некротическими раковыми клетками и состоит из более длинных фрагментов ДНК по сравнению с нормальными клетками.Некроз является обычным явлением в опухолевой среде, и некротические клетки могут высвобождать в кровоток больше непереваренных, более длинных фрагментов ДНК. Тем не менее, другие сообщения подтверждают точку зрения, что вкДНК высвобождается в основном из апоптотических опухолевых клеток, потому что они обнаружили в крови более короткие молекулы ДНК, которые преимущественно несут ассоциированные с опухолью аберрации числа копий [6, 8]. Хотя кажется, что существует больше доказательств в поддержку теории апоптоза, точный механизм остается неубедительным. В физиологических условиях большая часть вкДНК расщепляется ДНКазой I в крови.Только при изменении баланса генерации и деградации будет обнаружено больше вкДНК [29]. Это объясняет, почему концентрация вкДНК постепенно снижалась и затем поддерживалась на относительно низком уровне при обычных условиях культивирования, тогда как в этом исследовании она увеличивалась, когда клетки обрабатывали низкой дозой индуктора апоптоза. Однако мы показали, что по мере появления большего количества апоптотических и некротических клеток концентрация вкДНК снижалась. Это, казалось, противоречило тому, что мы ожидали. Мы предположили, что когда происходит большой лизис клеток, ДНКаза (ДНКаза II, ДНКаза III) внутри клеток также будет высвобождаться в кровь, где она сможет переваривать увеличенную вкДНК [30].Для непереваренной вкДНК клетки могут иметь какой-то защитный механизм. Некоторые исследования показали, что раковые клетки активно секретируют вкДНК в кровоток в различных формах, например, в экзосомах, и вкДНК внутри этих носителей может быть защищена от деградации [12, 14]. Наши результаты также показали, что клетки рака молочной железы в фазе G1 выделяют больше экзосом. Однако вкДНК внутри экзосом составляет только часть общей вкДНК, что указывает на наличие других защитных механизмов.Наши наблюдения частично доказали, что увеличение вкДНК не было связано с процессом репликации ДНК, а было следствием активного высвобождения из дифференцированных клеток, поскольку дифференцированные клетки имеют тенденцию удерживаться в фазе G1 [31].

Несколько исследований подтвердили, что вкДНК высвобождается из клеток и действует как межклеточный мессенджер. Когда вкДНК попадает в клетки-мишени, она либо интегрируется в геном хозяина, либо связывается с рецепторами, вызывая биологический эффект, такой как индукция толерантности к вредным веществам, иммуномодуляция, развитие метастазов и генетическая нестабильность [32, 33].При раке молочной железы Tuomela et al. обнаружили, что ДНК из мертвых раковых клеток может вызывать TLR9-опосредованную инвазию и воспаление в живых клетках MDA-MB-231 [17]. Однако в этом исследовании сообщалось только о наблюдаемом явлении в клеточной линии тройного негативного рака молочной железы, и не изучался основной механизм. TLR9 является эффектором врожденной иммунной системы и клеточным ДНК-рецептором, который может распознавать не только микробную или вирусную ДНК, но и эндогенную ДНК. Стимуляция TLR9 может индуцировать опосредованный NF-κB воспалительный ответ, который играет критическую роль в аутоиммунных заболеваниях и раке [34]. В этом исследовании мы обнаружили, что вкДНК из клеток рака молочной железы не только может активировать путь TLR9-NF-κB, но также увеличивает количество p-ERα в HR+ клетках рака молочной железы, в конечном итоге увеличивая содержание циклина D1. Однако мы не наблюдали значительного увеличения уровней воспалительных цитокинов после обработки клеток вкДНК. Это может отражать тот факт, что воспалительная реакция не является обычным явлением при HR + раке молочной железы [35].

Циклин D1 представляет собой молекулярный эффект NF-κB или ERα.Он может быть активирован NF-κB и ERα соответственно; однако взаимодействие между NF-κB и ERα остается спорным. Хотя в большинстве исследований предполагалось реципрокное ингибирование между ERα и NF-kB [36], некоторые исследования продемонстрировали положительное взаимодействие между этими транскрипционными факторами [37]. Несоответствие еще предстоит устранить. Фрасор и др. предположил, что синергетическое взаимодействие и транс-репрессивное взаимодействие могут происходить вместе; однако положительные перекрестные помехи были более обширными в клетках рака молочной железы [20]. Белки NF-κB часто располагаются в цитоплазме, где они связаны с ингибирующим белком IκB. Когда клетки подвергаются воздействию различных внеклеточных стимулов, таких как эндогенная ДНК, комплекс киназ IκB (IKK) (включая KKα и IKKβ) может активироваться, что приводит к деградации белков IκB. Этот процесс приводит к транслокации белков NF-kB из цитоплазмы в ядро, где эти белки могут активировать экспрессию генов, регулируемых NF-kB [38]. Парк и др. показали, что активированный IKKα также может приводить к усиленному фосфорилированию ERα.IKKα и ERα рекрутировались в промоторную область ERE-регулируемых генов, что приводило к активации эстроген-опосредованной транскрипции [21].

Настоящее исследование также имело некоторые ограничения. Во-первых, модель in vitro не могла полностью отражать фактическое состояние пациентов; поэтому наши результаты предоставили лишь ограниченную информацию о биогенезе вкДНК, и необходимы дальнейшие углубленные исследования. Во-вторых, влияние вкДНК на клеточную пролиферацию исследовали только на HR+ клеточных линиях рака молочной железы. Мы предположили, что могут быть другие влияющие факторы, и необходимо провести дополнительные исследования влияния вкДНК на другие молекулярные подтипы рака молочной железы.

В заключение мы обнаружили, что вкДНК высвобождается клетками рака молочной железы в основном посредством активной клеточной секреции. Кроме того, вкДНК может стимулировать пролиферацию HR+ клеток рака молочной железы, активируя путь TLR9-NF-κB-циклин D1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии и клеточные культуры

Клетки человека T47-D, MDA-MB-231 и MCF-10A были приобретены в Американской коллекции типовых культур (ATCC, США).MCF-10A представляет собой нормальную клеточную линию эпителия молочной железы. T47-D является положительной по рецептору эстрогена (ER), положительной или отрицательной по рецептору прогестерона (PR), отрицательной по рецептору эпидермального фактора роста 2 (HER2) линии клеток рака молочной железы, а MDA-MB-231 является отрицательной по ER, отрицательной по PR, HER2 отрицательная клеточная линия рака молочной железы [26]. Клетки культивировали в среде DMEM (Life Technologies, Великобритания) с добавлением 10% термоинактивированной FBS (Gibco, США) и 1% пенициллина/стрептомицина (GE Healthcare Life Sciences, США). Все клетки культивировали во влажной атмосфере, содержащей 5% CO 2 , при 37 °C.Через 1–2 поколения клетки отделяли от чашек и использовали для последующих экспериментов.

Культура клеток в нормальных условиях

Клетки (10 5 клеток на лунку) помещали в 12-луночные планшеты и культивировали в течение 24 часов. После этого среду для выращивания удаляли. Клетки дважды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубировали в 2 мл свежей среды в течение 6, 12, 24, 36 и 48 ч соответственно.

Индукция апоптоза, некроза и изменения клеточного цикла

Клетки высевали в 6-луночные планшеты и культивировали до 80% слияния.Затем клетки дважды промывали PBS и инкубировали в течение 24 ч в 2 мл свежей среды с различными дозами индуктора апоптоза (цисплатин, 0, 50 и 80 мкМ) или ингибитора клеточного цикла (росковитин, 0, 30 и 50 мкМ). ) (Beyotime Biotechnology, Китай).

По окончании инкубации ростовую среду собирали в 2 мл пробирки без нуклеаз (Eppendorf, Германия), центрифугировали при 2000×g в течение 20 мин и 1 мл супернатанта переносили в свежую 1,5 мл пробирку. Затем образцы хранили при температуре -80 °C до использования.Клетки отделяли от планшетов и затем использовали для последующих анализов.

Проточная цитометрия

Измерение апоптоза и некроза

Клетки дважды промывали PBS и повторно суспендировали в 1 × буфере для связывания в концентрации 1 × 10 6 клеток/мл. Затем 200 мкл этого раствора переносили в круглодонные пробирки и смешивали с 3 мкл флуоресцеинизотиоцианата (FITC) аннексина V и 3 мкл йодида пропидия (PI) (BD Biosciences, США). Образцы встряхивали и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.После инкубации клетки анализировали с помощью проточного цитометра (BD Biosciences, США).

Измерение клеточного цикла

Анализ клеточного цикла проводили по протоколу коммерческого набора (MultiSciences, Китай). Клетки (10 6 ) дважды промывали PBS и ресуспендировали в 1 мл PBS комнатной температуры. Затем 100% этанол (3 мл) при -20°С смешивали с клеточной суспензией, которую хранили при -20°С до использования. Перед анализом клеточного цикла клетки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 мин и удаляли супернатант.Осажденные клетки гидратировали в 2 мл PBS комнатной температуры в течение 15 мин. В пробирку для сбора добавляли раствор для окрашивания ДНК (1 мл) и перемешивали встряхиванием в течение 10 с. Затем образец инкубировали в темноте в течение 30 минут перед анализом с использованием проточного цитометра.

Экстракция экзосом из культивируемой среды

Клетки MDA-MB-231 культивировали до 80% слияния, затем дважды промывали PBS и инкубировали в течение 48 ч в свежей среде с FBS или без нее. Затем проводили анализ клеточного цикла и супернатант использовали для выделения экзосом согласно протоколу (GENESEED, Китай): а.Супернатант центрифугировали при 2000 × g при 4 °C в течение 20 мин для удаления дебриса. б. Супернатант переносили в новую пробирку для сбора и добавляли к образцу реагент для выделения экзосом GSTM. в. Образец перемешивали и хранили при 4°С в течение ночи. д. Затем супернатант центрифугировали при 5000 × g при 4 °C в течение 30 мин. е. Супернатант (1 мл) переносили в новую пробирку для сбора на 1,5 мл. ф. Образец центрифугировали при 5000×g при 4 °C в течение 5 минут, осадок, содержащий экзосомы, сохраняли.грамм. Экзосомы ресуспендировали в 200 мкл PBS. Все образцы хранились при температуре -80 °С.

Экстракция ДНК

ДНК в супернатанте экстрагировали из 200 мкл среды с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Во фракции экзосом вкДНК выделяли из экзосом, растворенных в PBS, а также из супернатанта без экзосом и необработанного супернатанта. Конечный элюат собирали и хранили при температуре –20 °C

Абсолютный количественный анализ

Концентрацию вкДНК определяли путем анализа повторяющихся элементов ALU. Для этого элемента с использованием абсолютного количественного анализа был измерен фрагмент длиной 111 п.н. в трех повторностях. Праймеры были разработаны в соответствии с предыдущим отчетом [39]. ПЦР проводили с использованием набора FastStart Universal SYBR Green Master mix (Rox, Германия) согласно инструкции производителя. Реакция имела конечный объем 20 мкл и содержала 10 мкл 2 × SYBR Green, 0,2 мкл 10 мкМ прямого праймера для ПЦР, 0,2 мкл 10 мкМ обратного праймера для ПЦР, 1 мкл матрицы ДНК и 8,6 мкл dH 2. O. Условия термоциклирования включали 10 минут при 95 °C, затем 40 циклов денатурации по 15 секунд при 95 °C, отжиг 60 секунд при 60 °C и удлинение 15 секунд при 72 °C.Стандартная кривая значений концентрации ALU-Ct была построена с использованием стандарта с известной концентрацией (дополнительная фигура 1). Общая концентрация вкДНК в образце была выведена из концентрации фрагмента ALU, которая была нормализована в соответствии с фактическим объемом.

Анализы клеточной функции

Анализ образования клонов

Клетки (10 3 клеток на лунку) помещали в 6-луночные планшеты и культивировали в свежей среде с вкДНК (10 нг/мл) или PBS в качестве контроля. HR+ клетки рака молочной железы также обрабатывали 4OH-TAM (10 -5 M) или вкДНК плюс 4OH-TAM. ВкДНК выделяли из супернатанта клеток рака молочной железы MDA-MB-231, обработанных росковитином в течение 24 часов. Концентрацию вкДНК измеряли с помощью прибора nanodrop 2000 (Quawell, США), используемая в данном исследовании концентрация составляла 10 нг/мл. Через три недели выжившие колонии фиксировали, окрашивали кристаллическим фиолетовым и подсчитывали.

Анализ клеточной пролиферации

Клетки (5 × 10 3 клеток на лунку) помещали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 часов.Через 24 ч клетки промывали стерильным PBS и инкубировали в 100 мкл свежей среды с вкДНК (10 нг/мл) или стерильным PBS в качестве контроля. HR+ клетки рака молочной железы также обрабатывали 4OH-TAM (10 -5 M) или вкДНК плюс 4OH-TAM. Пролиферацию клеток оценивали через 0, 24, 48 и 72 ч с использованием набора для подсчета клеток-8 (CCK-8 (Dojindo, Япония)) в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, клетки T47-D культивировали в суспензионных условиях, как в предыдущих сообщениях [40], и также оценивали пролиферативную способность клеток (5 × 10 3 клеток на лунку) в условиях культивирования, не зависящих от привязки.

Анализ клеточного цикла

Клетки помещали в 6-луночные планшеты и культивировали до слияния 60–80%. Затем клетки промывали стерильным PBS и культивировали еще 24 ч в свежей культуральной среде с 10 нг/мл вкДНК или тем же объемом PBS, что и контроль. Затем проводили анализ клеточного цикла, как описано выше.

Вестерн-блоттинг и обработка ДНКазой I

Клетки обрабатывали 10 нг/мл вкДНК, 50 нмоль/мл хлорохина, вкДНК плюс хлорохин и ДМСО в качестве контроля в течение 24 часов.Затем клетки быстро собирали в буфере для лизиса и очищали центрифугированием. Для измерения концентрации белка использовали набор реагентов для анализа белка BCA (Thermo Scientific, США). Затем был проведен вестерн-блоттинг. Мы также использовали ДНКазу I для расщепления ДНК, чтобы дополнительно проверить эффект вкДНК. Сначала проводили электрофорез в агарозном геле (AGE), чтобы доказать, что ДНК была расщеплена ДНКазой I. ДНКазу I добавляли в супернатант клеток T47-D и MDA-MB-231, а затем экстрагировали вкДНК.Ген ALU и гены β-актина амплифицировали с помощью ПЦР в качестве контроля. AGE использовали для определения количества ДНК. После этого клетки обрабатывали 10 нг/мл вкДНК, 30 ед/мл ДНКазы I, вкДНК плюс ДНКаза I и ДМСО в качестве контроля в течение 24 часов.

Выявление воспалительных цитокинов

Выявление воспалительных цитокинов в культуральном супернатанте проводили с помощью набора для иммуноферментного анализа (MULTISCIENCES, Китай) согласно протоколу производителя.

Статистический анализ

Статистические расчеты проводились с использованием пакета статистических программ SPSS (Версия 20.0, SPSS, Inc.). Все эксперименты в этом исследовании были повторены трижды, и данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Сравнения между двумя группами были сделаны с использованием t-критерия Стьюдента. Коэффициенты корреляции рассчитывали с использованием анализа Пирсона для непрерывных переменных. На всех рисунках звездочками обозначены следующие уровни значимости: *р < 0,05, **р < 0,01.

Сокращения

вкДНК: бесклеточная ДНК; ctDNA: циркулирующая опухолевая ДНК; HR+: положительный гормональный рецептор; TLR9: толл-подобный рецептор 9; NF-κB: ядерный фактор каппа B; p-ERα: фосфорилированный рецептор эстрогена альфа.

Авторские вклады

S.W., W.W. и WBZ задумали эксперименты. W.W., W.B.Z., L.L., G.M., P.K., J.Z., T.S.X. и Х.Х. проводил опыты. В.В. и В.Б.З. проанализировал данные. В написании статьи участвовали все авторы.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят Ji Fu Wei (Научно-исследовательский отдел клинической фармакологии, Первая больница-филиал Нанкинского медицинского университета) за помощь.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа была частично поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81572607, 81572595, 81572602, 81502299 и 81502286), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK2011853, BK2011854 и BK2030 Развитие инновационной исследовательской группы в Первой дочерней больнице NJMU (IRT-008) и проект, финансируемый Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений Цзянсу (PAPD).

ССЫЛКИ

1.Хейдари М., Ауэр М., Ульц П., Хейтцер Э., Петру Э., Гаш С., Ритдорф С., Мауэрманн О., Лафер И., Пристауз Г., Лакс С., Пантель К., Гейгл Дж. Б., Шпайхер М. Р. Динамический диапазон циркулирующей опухолевой ДНК при метастатическом раке молочной железы. Рак молочной железы Res. 2014; 16:421.

2. Спеллман П.Т., Грей Дж.В. Обнаружение рака путем мониторинга циркулирующей опухолевой ДНК. Природа Мед. 2014; 20:474-475.

3. Доусон С.Дж., Цуй Д.В., Муртаза М., Биггс Х., Руэда О.М., Чин С.Ф., Даннинг М.Дж., Гейл Д., Форшью Т., Малер-Араужо Б., Раджан С., Хамфри С., Бек Дж. и др.Анализ циркулирующей опухолевой ДНК для мониторинга метастатического рака молочной железы. N Engl J Med. 2013; 368:1199-1209.

4. Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, Kinde I, Wang Y, Agrawal N, Bartlett BR, Wang H, Luber B, Alani RM, Antonarakis ES, Azad NS, Bardelli A, et al. Обнаружение циркулирующей опухолевой ДНК на ранних и поздних стадиях злокачественных новообразований человека. Sci Transl Med. 2014; 6:224ra224.

5. Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K. Внеклеточные нуклеиновые кислоты как биомаркеры у больных раком. Нат Рев Рак.2011 г.; 11:426-437.

6. Мульер Ф., Тьерри А.Р. Важность изучения доли циркулирующей ДНК, происходящей из опухоли, микроокружения и нормальных клеток, у больных колоректальным раком. Мнение Эксперта Биол Тер. 2012 г.; 12:S209-215.

7. Рыкова Е.Ю., Морозкин Е.С., Пономарёва А.А., Лосева Е.М., Запорожченко И.А., Чердынцева Н.В., Власов В.В., Лактионов П.П. Внеклеточные и связанные с клетками циркулирующие комплексы нуклеиновых кислот: механизмы образования, концентрация и содержание. Мнение Эксперта Биол Тер.2012 г.; 12:S141-153.

8. Цзян П., Чан К.В., Чан К.С., Ченг С.Х., Вонг Дж., Вонг В.В., Вонг Г.Л., Чан С.Л., Мок Т.С., Чан Х.Л., Лай П.Б., Чиу Р.В., Ло Ю.М. Удлинение и укорочение ДНК плазмы у больных гепатоцеллюлярной карциномой. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015; 112:Е1317-1325.

9. Schwarzenbach H. Циркулирующие нуклеиновые кислоты как биомаркеры рака молочной железы. Рак молочной железы Res. 2013; 15:211.

10. Леон С.А., Шапиро Б., Склярофф Д.М., Ярос М.Ю. Свободная ДНК в сыворотке крови онкологических больных и эффект терапии.Рак рез. 1977 год; 37:646-650.

11. Thakur BK, Zhang H, Becker A, Matei I, Huang Y, Costa-Silva B, Zheng Y, Hoshino A, Brazier H, Xiang J, Williams C, Rodriguez-Barrueco R, Silva JM, et al. Двухцепочечная ДНК в экзосомах: новый биомаркер в обнаружении рака. Сотовый рез. 2014; 24:766-769.

12. Власов А.В., Магдалено С., Сеттерквист Р., Конрад Р. Экзосомы: современные знания об их составе, биологических функциях, диагностических и терапевтических возможностях. Биохим Биофиз Акта.2012 г.; 1820:940-948.

13. Бронкхорст А.Дж., Вентцель Дж.Ф., Аукамп Дж., Ван Дайк Э., Дю Плесси Л., Преториус П.Дж. Характеристика бесклеточной ДНК, высвобождаемой культивируемыми раковыми клетками. Биохим Биофиз Акта. 2016; 1863: 157-165.

14. Лоури М.С., Галлахер В.М., О’Дрисколл Л. Роль экзосом при раке молочной железы. Клин Хим. 2015 г.; 61:1457-1465.

15. Garcia-Olmo D, Garcia-Olmo DC, Ontanon J, Martinez E, Vallejo M. Опухолевая ДНК, циркулирующая в плазме, может играть роль в метастазировании.Гипотеза генометастаза. Гистол Гистопатол. 1999 г.; 14:1159-1164.

16. Garcia-Olmo DC, Dominguez C, Garcia-Arranz M, Anker P, Stroun M, Garcia-Verdugo JM, Garcia-Olmo D. Бесклеточные нуклеиновые кислоты, циркулирующие в плазме больных колоректальным раком, вызывают онкогенную трансформацию восприимчивых культивируемых клеток. Рак рез. 2010 г.; 70:560-567.

17. Туомела Дж., Сандхольм Дж., Каакинен М., Патель А., Кауппила Дж.Х., Ильвесаро Дж., Чен Д., Харрис К.В., Грейвс Д., Селандер К.С.ДНК из мертвых раковых клеток индуцирует опосредованную TLR9 инвазию и воспаление в живых раковых клетках. Лечение рака молочной железы. 2013; 142:477-487.

18. Lamphier MS, Sirois CM, Verma A, Golenbock DT, Latz E. TLR9 и распознавание собственных и чужих нуклеиновых кислот. Энн Н.Ю. Академия наук. 2006 г.; 1082:31-43.

19. Сандхольм Дж., Кауппила Дж.Х., Пресси С., Туомела Дж., Юккола-Вуоринен А., Ваарала М., Джонсон М.Р., Харрис К.В., Селандер К.С. Эстрогеновый рецептор-альфа и половые стероидные гормоны регулируют экспрессию Toll-подобного рецептора-9 и инвазивную функцию в клетках рака молочной железы человека.Лечение рака молочной железы. 2012 г.; 132:411-419.

20. Frasor J, Weaver A, Pradhan M, Dai Y, Miller LD, Lin CY, Stanculescu A. Положительная перекрестная связь между рецептором эстрогена и NF-kappaB при раке молочной железы. Рак рез. 2009 г.; 69:8918-8925.

21. Пак К.Дж., Кришнан В., О’Мэлли Б.В., Ямамото Ю., Гейнор Р.Б. Формирование IKKalpha-зависимого транскрипционного комплекса необходимо для активации генов, опосредованной рецептором эстрогена. Мол Ячейка. 2005 г.; 18:71-82.

22. Гарсия-Мурильяс И., Шиавон Г., Вайгельт Б., Нг С., Хребьен С., Каттс Р.Дж., Чеанг М., Осин П., Неруркар А., Козарева И., Гарридо Дж.А., Доусетт М., Рейс-Фильо Дж.С. и другие.Отслеживание мутаций в циркулирующей опухолевой ДНК предсказывает рецидив раннего рака молочной железы. Sci Transl Med. 2015 г.; 7:302ra133.

23. Schiavon G, Hrebien S, Garcia-Murillas I, Cutts RJ, Pearson A, Tarazona N, Fenwick K, Kozarewa I, Lopez-Knowles E, Ribas R, Nerurkar A, Osin P, Chandarlapaty S, et al. Анализ мутации ESR1 в циркулирующей опухолевой ДНК демонстрирует эволюцию во время терапии метастатического рака молочной железы. Sci Transl Med. 2015 г.; 7:313ra182.

24. Гарсия-Олмо, округ Колумбия, Гарсия-Олмо, Д.Биологическая роль внеклеточных нуклеиновых кислот при раке: теория генометастаза. Критический преподобный Онког. 2013; 18:153-161.

25. Hutchinson L. Биомаркеры: CtDNA-идентифицирующий рак до его клинического обнаружения. Nat Rev Clin Oncol. 2015 г.; 12:372.

26. Холлидей Д.Л., Спейрс В. Выбор правильной клеточной линии для исследования рака молочной железы. Рак молочной железы Res. 2011 г.; 13:215.

27. Лакруа М., Леклерк Г. Актуальность клеточных линий рака молочной железы в качестве моделей опухолей молочной железы: обновление.Лечение рака молочной железы. 2004 г.; 83:249-289.

28. Петерс Д.Л., Преториус П.Дж. Происхождение, транслокация и назначение внеклеточной ДНК — новая парадигма генетического поведения. Клин Чим Акта. 2011 г.; 412:806-811.

29. Черепанова А.В., Тамкович С.Н., Брызгунова О.Е., Власов В.В., Лактионов П.П. Дезоксирибонуклеазная активность и концентрация циркулирующей ДНК в плазме крови больных опухолями предстательной железы. Энн Н.Ю. Академия наук. 2008 г.; 1137:218-221.

30. Атиананд М.К., Фицджеральд К.А.Молекулярные основы распознавания ДНК в иммунной системе. Дж Иммунол. 2013; 190:1911-1918.

31. Gahan PB, Stroun M. Виртосома — новая цитозольная информативная сущность и межклеточный мессенджер. Клеточная биохимия Функц. 2010 г.; 28:529-538.

32. Gravina S, Sedivy JM, Vijg J. Темная сторона циркулирующих нуклеиновых кислот. Стареющая клетка. 2016; 15:398-399.

33. Volik S, Alcaide M, Morin RD, Collins C. Бесклеточная ДНК (cfDNA): клиническое значение и полезность при раке, формируемом новыми технологиями.Мол Рак Рез. 2016; 14:898-908.

34. Коской Л., Раулет Д.Х. Неправильное управление ДНК приводит к надзору иммунной системы. Клетка. 2007 г.; 131:836-838.

35. Сандхольм Дж., Селандер К.С. Толл-подобный рецептор 9 при раке молочной железы. Фронт Иммунол. 2014; 5:330.

36. Oida K, Matsuda A, Jung K, Xia Y, Jang H, Amagai Y, Ahn G, Nishikawa S, Ishizaka S, Jensen-Jarolim E, Matsuda H, Tanaka A. Ядерный фактор-kB играет решающую роль как врожденной, так и приобретенной резистентности к эндокринной терапии в клетках рака молочной железы человека.Научный представитель 2014; 4:4057.

37. Baumgarten SC, Frasor J. Minireview: Воспаление: причина более агрессивного рецептора эстрогена (ER) положительного рака молочной железы. Мол Эндокринол. 2012 г.; 26:360-371.

38. Бреннер Д., Блазер Х., Мак Т.В. Регуляция передачи сигналов фактора некроза опухоли: живи или дай умереть. Нат Рев Иммунол. 2015 г.; 15:362-374.

39. Мадхаван Д., Валвинер М., Бентс К., Цукник М., Нис Дж., Шотт С., Кук К., Ритдорф С., Трампп А., Пантел К., Сон С., Шнеевейс А., Сурови Х., Бурвинкель Б.Целостность ДНК плазмы как биомаркер первичного и метастатического рака молочной железы и потенциальный маркер для ранней диагностики. Лечение рака молочной железы. 2014; 146:163-174.

40. Hindupur SK, Balaji SA, Saxena M, Pandey S, Sravan GS, Heda N, Kumar MV, Mukherjee G, Dey D, Rangarajan A. Идентификация новой оси AMPK-PEA15 в аноикис-устойчивом росте молочной железы клетки. Рак молочной железы Res. 2014; 16:420.

Понимание клеточного цикла эукариот — мини-обзор

Биологический и экспериментальный обзор

Эукариотический клеточный цикл представляет собой эволюционно законсервированный процесс, который приводит к репликации клеток.Он строго регламентирован и включает в себя три основных контрольных пункта: G1, G2/M и шпиндель (M). Эти контрольные точки контролируют порядок, точность и целостность каждой фазы клеточного цикла. Например, контрольная точка G2/M выявляет потенциальное повреждение ДНК, что позволяет восстановить ее до деления клеток. Дефекты в развитии клеточного цикла часто приводят к таким заболеваниям, как рак. Соответственно, этот важный жизненный цикл обычно используется для оценки здоровья клеток, а также для прогнозирования и диагностики рака. В этом мини-обзоре представлен обзор эукариотического клеточного цикла, включая общие молекулярные методы оценки пролиферирующих клеток.

Понимание клеточного цикла эукариот — биологический и экспериментальный мини-обзор

Скачать PDF

Содержание

1. Обзор клеточного цикла у эукариот
1.1. Введение в эукариотический клеточный цикл
1.2. Контроль клеточного цикла
1.3. Репликация ДНК у эукариот
1.4. Ключевые биомаркеры клеточной пролиферации

2. Молекулярные методы оценки репликации ДНК и кинетики клеточного цикла
2.1. Оценка репликации ДНК
2.2. Количественное определение содержания ДНК
2.3. Измерение экспрессии циклинов и Cdks
2.4. Выявление маркеров пролиферации клеток
2.5. Резюме и перспективы на будущее


1. Обзор клеточного цикла у эукариот

Еще в 19 веке ученые интенсивно исследовали клеточный цикл. В этот период они обнаружили, что новые клетки происходят из ранее существовавших клеток (Nurse et al., 1998). Однако точные процессы, участвующие в клеточном делении, были в значительной степени неизвестны.Особый научный интерес представляло определение того, как этот процесс различался у разных видов.

За последние 60 лет были сделаны важные открытия и понимание молекулярных механизмов, участвующих в делении клеток у прокариот и эукариот. Эти исследования показали, что клеточный цикл у эукариот гораздо сложнее, чем у прокариотических организмов. Хотя репликация ДНК и деление клеток происходят в обоих случаях, процессы существенно различаются. Основное различие заключается в том, как эти организмы реплицируют свою ДНК.Поскольку средняя эукариотическая клетка имеет в 25 раз больше ДНК, чем прокариотическая клетка, деление прокариотической клетки не включает конденсацию ДНК в хромосомы, как это наблюдается в эукариотическом клеточном цикле. Еще одно важное различие заключается в стадиях, на которых происходит репликация ДНК. Прокариоты непрерывно реплицируют свою ДНК на протяжении своего относительно короткого клеточного цикла, тогда как эукариотические клетки реплицируют ДНК только в S-фазе клеточного цикла (подробно обсуждаемой в разделе 1.2).

В этом мини-обзоре будут конкретно обсуждаться тонкости эукариотического клеточного цикла с особым акцентом на репликацию ДНК, контроль клеточного цикла и ключевые биомаркеры клеточного деления.

Back to top

1.1. Введение в эукариотический клеточный цикл

Высоко регулируемый клеточный цикл делится на фазы, называемые интерфазой (G1, S и G2) и митотической (М) фазой (рис. 1). В фазе промежутка 1 (G1) клетка растет и приобретает энергию, необходимую для деления. Клеточные компоненты, за исключением хромосом, на этом этапе удваиваются. В фазе синтеза (S) происходит репликация ДНК для дублирования генетического материала, при этом каждая хромосома теперь состоит из двух сестринских хроматид.В фазе промежутка 2 (G2) клетка готовится к делению, индуцируя метаболические изменения, которые собирают цитоплазматические компоненты, необходимые для митоза. Во время М-фазы происходит деление ядра, и клетка, наконец, делится с образованием двух идентичных дочерних клеток. Физический процесс создания двух дочерних клеток путем деления ядра, цитоплазмы и плазматической мембраны называется цитокинезом (происходит от греческого kyto или kytos , означающего контейнер, тело или вместилище, и kīnēsis , означающего движение). .В конце цитокинеза каждая новая клетка состоит из полного набора ДНК родительской клетки (Kapinas et al. 2013).

Другой специализированный процесс клеточного деления, известный как мейоз, необходим для производства яйцеклеток и сперматозоидов для размножения. Этот процесс делится на мейоз I и мейоз II, при этом мейоз I уникален для зародышевых клеток, а мейоз II подобен митозу. Однако, в отличие от митоза, молекулярные и регуляторные механизмы, участвующие в мейозе, менее изучены (Ohkura 2015).

При определенных условиях клетка может выйти из клеточного цикла и войти в состояние покоя, называемое фазой промежутка 0 (G0). Однако эта фаза обратима, и клетки G0 могут вернуться в фазу G1 и возобновить рост и деление при соответствующей стимуляции.

Рис. 1. Обзор клеточного цикла эукариот.  Во время клеточного деления клетки проходят ряд стадий, которые в совокупности называются клеточным циклом. Чтобы гарантировать производство здоровых клеток после каждого раунда клеточного деления, клеточный цикл состоит из трех основных контрольных точек с различными функциями: контрольных точек G1, G2 и веретена (M).

1.2. Контроль клеточного цикла

Каждая фаза клеточного цикла строго регулируется, с контрольными точками в конце G1, при переходе G2/M и ближе к концу метафазной стадии митоза (контрольная точка веретена (M)). Эти контрольные точки представляют собой механизмы наблюдения, функция которых состоит в том, чтобы гарантировать, что сгенерированные дочерние клетки являются дубликатами родительской клетки с точным числом хромосом и не содержат мутаций (рис. 1). Во время контрольной точки G1 оцениваются клеточные условия, необходимые для прохождения клеточного цикла.Клетка обычно проходит контрольную точку G1, если она имеет соответствующий размер, обладает достаточной энергией и не имеет поврежденной ДНК. Основная функция контрольной точки G2 заключается в обеспечении того, чтобы репликация всех хромосом была полной и без внесения мутаций или нерепарированных повреждений ДНК. Кроме того, во время этой контрольной точки также оцениваются соответствующий размер клеток и запасы белка. Контрольная точка веретена/М гарантирует, что все сестринские хроматиды правильно прикреплены к микротрубочкам веретена и что каждая клетка имеет правильное количество хромосом.

Эти контрольные точки останавливают развитие клеточного цикла, если ячейка не соответствует каждому из оцениваемых требований. Это необходимо для устранения выявленных неблагоприятных условий. Например, обнаруженное повреждение ДНК приводит к активации фактора транскрипции р53, который называют «хранителем генома» из-за его основной роли в поддержании стабильности генома (Lane 1992). Основная функция p53 заключается в том, чтобы индуцировать остановку клеточного цикла в фазах G1 или G2/M и инициировать репарацию ДНК.Он активирует экспрессию генов репарации ДНК, таких как P53R2 (Tanaka et al. 2000). p53 также может индуцировать апоптоз в крайнем случае, если поврежденная ДНК не может быть восстановлена, путем индукции экспрессии апоптотических генов, таких как BAX (Zilfou and Lowe 2009). Поскольку он играет такую ​​важную роль в предотвращении продолжения клеточного цикла клеток с мутировавшей ДНК, p53 считается супрессором опухоли (Zilfou and Lowe 2009). Следовательно, сообщалось, что он часто мутирует или отсутствует при некоторых типах рака (Hussain and Harris, 1998).

Однако главными регуляторами клеточного цикла у эукариот являются гетеродимерные ферментные комплексы, состоящие из циклинов и циклин-зависимых киназ (Cdks) (Murray 2004). Экспрессия циклинов увеличивается или уменьшается на разных фазах клеточного цикла, и они делятся на группы в зависимости от фазы клеточного цикла, которую они регулируют (рис. 2) (Murray 2004). Однако в большинстве случаев концентрация Cdks остается относительно постоянной. Каждая субъединица Cdk может связываться с разными циклинами, и ассоциированный циклин определяет, какие белковые субстраты фосфорилируются комплексом Cdk-циклин (Lodish et al.2000). Более того, Cdks не обладают киназной активностью, если только они не связаны с циклином. Помимо связывания циклинов, для активации комплекса также необходимо фосфорилирование ключевых остатков в петле активации субъединицы Cdk (Harper and Elledge 1998, Hochegger et al. 2008).

Было идентифицировано несколько механизмов ингибирования активированных комплексов циклин-Cdk. К ним относятся ингибирующее фосфорилирование важных остатков, таких как тирозин 15 и треонин 14 в Cdk1, деградация субъединиц циклина путем специфического убиквитин-опосредованного протеолиза или ассоциация комплекса с высокоспецифическим белком-ингибитором, таким как p16, в случае циклина D. Комплекс -Cdk4 (Hochegger et al.2008 г., Kellogg 2003 г., Peters 2006 г., Serrano et al. 1993).

Рис. 2. Экспрессия циклинов на протяжении фаз клеточного цикла (Lodish et al. 2000). Циклины по-разному экспрессируются на разных фазах клеточного цикла и играют разные роли в контроле клеточного цикла. На рисунке показаны стадии клеточного цикла, на которых экспрессируется каждый циклин. Области, заштрихованные серым цветом, представляют собой пиковую экспрессию соответствующего циклина.

Классическая модель контроля клеточного цикла указывает на то, что циклины D-типа и Cdk4 или Cdk6 регулируют события в ранней фазе G1 (Nurse 2000).Затем комплекс циклин E-Cdk2 инициирует S-фазу, а комплексы циклин A-Cdk2 или циклин A-Cdk1 регулируют завершение S-фазы. Комплекс циклин B-Cdk1 впоследствии отвечает за митоз (таблица 1). Переход между каждой фазой клеточного цикла опосредуется фосфорилированием белка, которое катализируется Cdks. В ответ удаление остатков фосфатов фосфатазами также имеет решающее значение для прогрессирования клеточного цикла. Например, несколько фосфатаз участвуют в контроле митоза (Chen et al.2007). Протеиновая фосфатаза-2А1 (РР2А1) опосредует основную фосфатазную активность в отношении митотических субстратов (Sola et al., 1991). PP2A деактивируется, когда клетки вступают в митоз, но реактивируется после протеолиза митотических циклинов (Sola et al. 1991).

Десять лет назад была предложена пересмотренная модель регуляции эукариотического клеточного цикла, названная моделью минимального порога (Hochegger et al. 2008). Эта модель предполагает, что либо Cdk1, либо Cdk2, связанные с циклином А, достаточны для контроля всех стадий интерфазы, тогда как комплекс циклин B-Cdk-1 необходим для перехода к митозу (Hochegger et al.2008). Это также постулирует, что различия между интерфазными и митотическими Cdks не обязательно связаны со специфическими циклинами, с которыми они взаимодействуют. Однако это связано с локализацией и более высоким порогом активности для митоза, чем для интерфазы (Hochegger et al. 2008).

Мыши с нокаутом предоставляют данные в поддержку этой модели, демонстрирующие, что делеция определенных Cdks и циклинов не приводит к нарушению клеточного цикла в соматических клетках (Berthet and Kaldis 2007, Hochegger et al.2008, Малумбрес и Барбацид, 2005). Напр., эмбрионы мышей, лишенных Cdk2, Cdk4 и Cdk6, все еще осуществляют функциональный клеточный цикл (Santamaria et al. 2007). Однако, согласно классической точке зрения, клетки этих мышей не должны быть способны развиваться дальше фазы G1 (Hochegger et al. 2008). Это говорит о том, что только несколько комплексов, таких как Cdk1-циклин А, необходимы для развития клеточного цикла. Минимальная пороговая модель также подтверждается другими исследованиями дрожжей и экспериментами по математическому моделированию (Coudreuse and Nurse 2010, Gérard et al.2015). Однако необходимы дальнейшие исследования для подтверждения этой предложенной модели, такие как те, которые обеспечивают объяснение дифференциальных эффектов делеций Cdk. Согласно Hochegger et al. (2008), это может быть связано с еще неизвестными независимыми от киназ функциями комплексов Cdk-циклин.

Таблица 1. Циклины – ключевые регуляторы клеточного цикла.

Партнер(ы) связывания Cdk Cyclins

Пик экспрессии в клеточном цикле

Роль в клеточном цикле

Циклин Д

Предпочтительно связывает Cdk4 и Cdk6, также может связывать Cdk1 и Cdk2.

G1

Циклин D1 необходим для перехода от G0 к G1.Образует комплекс с Cdk4 для активации белка ретинобластомы, который впоследствии усиливает экспрессию циклина Е.

Циклин Е

Предпочтительно связывает Cdk2, также может связывать Cdk1

Г1/С

Комплекс циклин E-Cdk2 необходим для инициации S-фазы.

Циклин А

Предпочтительно связывает Cdk2, также может связывать Cdk1

С/Г2

Циклин А вместе с Cdk1 или Cdk2 регулирует завершение S-фазы и вступление в митоз.

Циклин Б

Предпочтительно связывает Cdk1, также может связывать Cdk2

М

Циклины B1 и B2 взаимодействуют с Cdk1 в M-фазе с образованием M-фазы/фактора, способствующего созреванию (MPF), который регулирует процессы, способствующие сборке митотического веретена и, наконец, клеточному делению.

Хочеггер и др.(2008). Cdk, циклинзависимая киназа.

Back to top

1.3. Репликация ДНК у эукариот

Репликация ДНК — неотъемлемая часть клеточного цикла, которая явно происходит в S-фазе. Этот процесс должен происходить с исключительной точностью до клеточного деления (Alberts et al. 2002).

Репликация ДНК начинается с раскручивания двойной спирали ДНК членом семейства ферментов геликаз (рис. 3, шаг 1). Геликазы раскручивают ДНК, разрывая водородные связи между парами нуклеотидов.Белки, связывающие одноцепочечную ДНК, стабилизируют размотанную ДНК и препятствуют воссоединению цепей, создавая Y-образную репликативную вилку, в которой происходит синтез новых цепей ДНК (рис. 3, шаг 2).

В репликационной вилке разделенные нити ДНК служат матрицей, которая направляет вставку комплементарных нуклеотидов для образования новой ДНК. Например, цитозиновый нуклеотид на матричной цепи направляет вставку гуанина в новую цепь. Точно так же адениновый нуклеотид направляет вставку тимина.

Перед добавлением комплементарных нуклеотидов праймаза добавляет РНК-праймеры к матричным цепям, оставляя свободную 3′-группу ОН для инициации синтеза новой цепи. Затем ДНК-полимераза ε связывает цепь матрицы и удлиняет РНК-праймер, добавляя нуклеотиды к свободному 3′-концу (рис. 3, шаг 3).

Рис. 3. Обзор репликации ДНК (Alberts et al. 2002). Прежде чем клетки делятся, они должны реплицировать свою ДНК. На этом рисунке показана вилка репликации ДНК у эукариот и этапы создания новой комплементарной цепи ДНК.

ДНК-полимераза работает только в направлении от 5′ к 3′ (см. Рисунок 3 для ориентации ДНК). Следовательно, непрерывно может синтезироваться только одна новая цепь ДНК (называемая ведущей цепью). Синтез другой нити (называемой отстающей нитью) требует более сложного процесса (рис. 3, этапы 5 и 6).

Чтобы создать отстающую цепь от 3′ к 5′, несколько РНК-праймеров прерывисто удлиняются с помощью ДНК-полимеразы в направлении от 5′ к 3′ в сегментах, называемых фрагментами Окадзаки (рис. 3, шаг 5).Подобно синтезу ведущей цепи, праймаза вводит РНК-праймеры для инициации дальнейшего удлинения. РНКаза удаляет РНК-праймеры, а другая ДНК-полимераза (ДНК-полимераза δ) заполняет промежутки между фрагментами Окадзаки. Затем ДНК-лигаза I заполняет разрывы как в ведущей, так и в отстающей цепях, чтобы завершить вновь синтезированную молекулу ДНК (рис. 3, шаг 6).

По завершении процесса репликации ДНК каждая дочерняя клетка активно делящейся родительской клетки наследует новую двойную спираль ДНК, содержащую одну старую и одну новую цепь.

Back to top

1.4. Ключевые биомаркеры клеточной пролиферации

Помимо циклинов и Cdks (описанных в Разделе 1.2), Ki-67, ядерный антиген клеток пролиферации (PCNA) и поддерживающий мини-хромосомный белок 2 (MCM2) также являются ключевыми белками для регуляции клеточного роста и пролиферации.

Ki-67 представляет собой ядерный белок, который присутствует во всех фазах клеточного цикла (поздняя G1, S, G2, M), но отсутствует в покоящихся клетках (фаза G0) (Gerdes et al.1984). Экспрессия его белка низкая во время G1 и ранней S фазы и постепенно увеличивается, достигая максимума во время митоза (Li et al. 2014). Во время митоза Ki-67 специфически экспрессируется на поверхности хромосом и в первую очередь участвует в конденсации хроматина (Cuylen et al. 2016, van Dierendonck et al. 1989). Сообщалось о сверхэкспрессии Ki-67 при многих типах рака, включая рак молочной железы и легких, и это связано со снижением выживаемости пациентов (Pollack et al. 2004, Shiba et al.2000, Стюарт-Харрис и др. 2008). В результате Ki-67 использовался в клинике в качестве прогностического и прогностического маркера для определенных типов рака, таких как рак молочной железы (Li et al. 2014). Однако в качестве клинического биомаркера рака его полезность и клиническое значение оспариваются противоречивыми исследованиями, демонстрирующими межлабораторную изменчивость и изменчивость между наблюдателями (Albarracin and Dhamne 2014).

PCNA является важным эволюционно консервативным белком; подчеркивается тем фактом, что нокаут PCNA у мышей приводит к гибели эмбрионов (Hu and Xiong 2006, Roa et al.2008, Стржалка и Земенович, 2011). Первой ролью этого белка была идентификация участия PCNA в синтезе ДНК в качестве вспомогательного белка для ДНК-полимеразы δ (Bravo et al., 1987). С тех пор наше понимание функции PCNA расширилось, и сообщалось, что этот белок играет роль в различных важных клеточных процессах, таких как репарация ДНК, ремоделирование хроматина, сегрегация хромосом и развитие клеточного цикла (Strzalka and Ziemienowicz 2011). PCNA был описан как «контролер генома» из-за этих разнообразных ролей (Paunesku et al.2001). PCNA также влияет на судьбу клеток посредством взаимодействия с p53. Ген PCNA индуцируется p53, что приводит к репарации ДНК при высокой экспрессии PCNA. В отсутствие супрессора опухоли PCNA может индуцировать репликацию ДНК. Низкая или отсутствующая экспрессия PCNA ведет к апоптозу (Paunesku et al. 2001). Следовательно, PCNA является критическим белком, экспрессия которого диктует клеточную судьбу (Paunesku et al. 2001). PCNA в основном экспрессируется в поздних фазах G1 и S, его экспрессия снижается в фазах G2 и M, а в фазах G0 и ранних G1 она низкая или отсутствует (Kurki et al.1986). Из-за своей роли в репликации и репарации ДНК PCNA считается маркером клеточной пролиферации при многих видах рака, включая рак шейки матки и глиомы (Lv et al. 2016).

MCM2 является одним из шести членов семейства белков MCM, которое состоит из MCM2-MCM7. Эти белки играют ключевую роль в инициации репликации ДНК, формируя пререпликативный комплекс (pre-RC) в фазе G1 (Maiorano et al. 2006). Этот комплекс имеет решающее значение для репликации ДНК в последующей S-фазе, поскольку он также стимулирует раскручивание нитей родительской ДНК (Maiorano et al.2006, Лабиб и др. 2000). По сравнению с другими членами семейства MCM, MCM 2 отчетливо экспрессируется на протяжении всего клеточного цикла. Белки MCM3-MCM7 не экспрессируются в стехиометрических количествах и регулируются по-разному (Todorov et al. 1998). Напр., MCM7 более распространен в покоящихся клетках, чем в пролиферирующих клетках по сравнению с MCM2 (Tsuruga et al. 1997). MCM2 высоко экспрессируется в начале G1, умеренно экспрессируется в фазах S, G2 и M и отсутствует во время G0 (Maiorano et al. 2006). Кроме того, MCM2 демонстрирует различные паттерны клеточной локализации, которые можно измерить в циклических клетках.Он экспрессируется в ядре на протяжении всего клеточного цикла, но прочно связан с хроматином во время G1 (Todorov et al. 1995). Затем он перемещается в фазе S и остается несвязанным в фазах G2 и М (Тодоров и др., 1995). Таким образом, локализация и характер экспрессии MCM2 делают его идеальным маркером пролиферации. Он также используется в качестве диагностического и прогностического маркера при таких типах рака, как рак почки и глиомы (Giaginis et al. 2010, Todorov et al. 1998).

В таблице 2 обобщены экспрессия, функция и диагностическое использование этих ключевых биомаркеров пролиферации при раке в клеточном цикле.

Таблица 2. Сводка ключевых биомаркеров клеточной пролиферации.

Биомаркер пролиферации

Экспрессия во время клеточного цикла

Функция

Применение в диагностике рака

Ки-67

G0: не выражено

G1: низкая экспрессия

S: низкое выражение

G2: повышенная экспрессия

М: максимальное выражение

В первую очередь участвует в конденсации хроматина во время митоза

Используется в качестве прогностического и предиктивного маркера при таких типах рака, как рак груди и легких.

Межлабораторные и межнаблюдательные вариации ограничивают его клиническую полезность.

МСМ2

G0: не выражено

G1: высокая экспрессия в начале G1

S: умеренное выражение

G2: умеренное выражение

М: умеренное выражение

Является частью пререпликативного комплекса для инициации репликации ДНК.

Участвует в раскручивании родительской ДНК

Используется в качестве диагностического и прогностического биомаркера при нескольких типах рака, таких как рак почки и глиомы.

PCNA

G0: низкая экспрессия или не экспрессия

G1: высокая экспрессия в конце G1

S: высокое выражение

G2: уменьшенное выражение

М: уменьшенное выражение

Участвует в репликации и репарации ДНК, ремоделировании хроматина, сегрегации хромосом и развитии клеточного цикла.

Маркер клеточной пролиферации при нескольких типах рака, включая рак шейки матки и глиомы.

MCM2, поддерживающий белок мини-хромосомы 2; PCNA, ядерный антиген клеток пролиферации.

Back to top


2. Молекулярные методы оценки репликации ДНК и кинетики клеточного цикла

Наше нынешнее понимание клеточного цикла и ключевых участвующих белков привело к разработке ряда методов количественной оценки и оценки процессов клеточного цикла и роста клеток. Эти методы обычно применяются в исследованиях рака и клеточной биологии. Наиболее часто используемые методы для оценки делящихся клеток выделены ниже.

2.1. Оценка репликации ДНК

Измерение вновь синтезированной ДНК является наиболее распространенным методом обнаружения пролиферирующих клеток, а также оценки отдельных фаз клеточного цикла. Традиционные методы используют химические соединения, которые встраиваются в ДНК вместо определенных нуклеотидов. Особенно популярны аналоги тимидина, которые включаются во вновь синтезированную ДНК во время репликации ДНК. Традиционно для измерения синтеза ДНК использовали 5′-бром-2′-дезоксиуридин (BrdU).Включенный BrdU обнаруживается с помощью специфических антител с минимальной перекрестной реактивностью к тимидину (Magaud et al., 1989). Хотя включение BrdU позволяет точно обнаруживать вновь синтезированную ДНК, сообщалось, что оно оказывает негативное генетическое и молекулярное воздействие на биологический образец (Anda et al. 2014, Lehner et al. 2011). Следовательно, эксперименты с использованием BrdU должны включать соответствующие элементы управления. Другие аналоги тимидина, обычно используемые для измерения репликации ДНК, включают 5′-хлор-2′-дезоксиуридин (CldU), 5′-йод-2′-дезоксиуридин (IdU) и 5′-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU) ( Салик и Митчисон, 2008 г., Таттл и др.2010).

2.2. Количественная оценка содержания ДНК

Количество ДНК в клетке можно количественно определить с помощью флуоресцентных красителей, которые стехиометрически связывают ДНК. Соответственно, количество обнаруживаемого красителя прямо пропорционально количеству ДНК, присутствующей в клетке. Таким образом, эти красители подходят для различения различных фаз клеточного цикла на основе происходящих изменений в ДНК. Например, клетки в фазе S клеточного цикла будут иметь больше ДНК, чем клетки в фазе G1.Точно так же клетки в фазе G2 будут иметь в два раза больше ДНК и, следовательно, более высокие показания флуоресценции, чем клетки G1. Общие красители, связывающие общую ДНК, включают йодид пропидия (PI), 4′,6′-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и 7-аминоактиномицин-D (7-AAD). Интенсивность этих красителей обычно измеряют с помощью проточной цитометрии. Для эффективного связывания ДНК образцы клеток должны быть пермеабилизированы, так как эти красители не могут проникать в живые клетки с интактными мембранами. Кроме того, эти красители также связывают РНК; поэтому перед добавлением красителя требуется обработка РНКазой, чтобы гарантировать, что измеряется только содержание ДНК.

2.3. Измерение экспрессии циклинов и Cdks

Отчетливая пиковая экспрессия циклинов и Cdks на различных фазах клеточного цикла может быть использована для анализа клеточного цикла (рис. 2). Общие уровни отдельных циклинов, а также их фосфорилированных форм можно определить с помощью методов иммунодетекции, таких как вестерн-блоттинг или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Сочетание этих методов с оценкой синтеза ДНК обеспечивает тщательный анализ клеточного цикла.

2.4. Обнаружение маркеров пролиферации клеток

Анализ маркеров клеточной пролиферации (Ki-67, PCNA и MCM2) можно использовать для идентификации пролиферирующих клеток из-за их различной экспрессии на протяжении клеточного цикла (таблица 2). Антитела, специфичные к этим белкам, позволяют различать активно делящиеся клетки (положительная экспрессия) и покоящиеся (G0) клетки (низкая или отрицательная экспрессия). Этот метод выявления пролиферирующих клеток наиболее распространен при патологических анализах опухолевой ткани с помощью иммуногистохимии.Однако важно подчеркнуть, что результаты, полученные с помощью этого метода, указывают только на количество пролиферирующих клеток, а не на прямое измерение скорости пролиферации.

2.5. Резюме и перспективы на будущее

Клеточный цикл представляет собой упорядоченный процесс, результатом которого является репликация клеток. Этот процесс эволюционно законсервирован, и дефекты в контроле клеточного цикла часто приводят к таким заболеваниям, как рак (Harashima et al. 2013). В отличие от 1800-х годов, когда впервые наблюдалось деление клеток, мы значительно продвинулись в понимании того, как делятся клетки, благодаря разработке новых методов экспериментального измерения этого процесса.Идентификация молекулярных маркеров, участвующих в росте клеток и раке (таблица 2), также привела к их исследованию в качестве многообещающих мишеней для терапии рака. Например, поскольку Ki-67 связан с агрессивным ростом опухоли и плохим прогнозом, в настоящее время его оценивают как терапевтическую мишень для лечения рака (Rahmanzadeh et al. 2010, Ricciardi et al. 2015a, Ricciardi et al. 2015b). Исследования показали, что ингибирование Ki-67 с помощью ингибиторов антител или антисмысловых олигонуклеотидов приводит к уменьшению клеточного деления, что дополнительно подтверждает его полезность в качестве мишени для эффективного лечения рака (Kausch et al.2003, Старборг и др. 1996, Чжан и др. 2007).


Back to top

использованная литература

  • Альбаррасин С. и Дхамне С. (2014). Ki67 как биомаркер прогноза и предсказания: готов ли он к использованию в рутинной практике патологии. Curr Рак молочной железы Rep 6, 260-266.
  • Альбертс Б. и соавт. (2002). Механизмы репликации ДНК. В «Молекулярной биологии клетки», 4-е издание (Нью-Йорк: Garland Science), ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26850/, по состоянию на 25 апреля 2017 г.
  • Анда С. и др. (2014). Анализ клеточного цикла с использованием аналогов тимидина у делящихся дрожжей. PloS One 9, e88629.
  • Бертет С. и Калдис П. (2007). Клеточные специфические ответы на потерю циклинзависимых киназ. Онкоген 26, 4469-4477.
  • Браво Р и др. (1987). Циклин/PCNA является вспомогательным белком ДНК-полимеразы-дельта. Природа 326, 515-517.
  • Чен Ф и др. (2007). Множественные протеинфосфатазы необходимы для митоза у Drosophila . Curr Biol 17, 293-303.
  • Кудрез Д. и медсестра П. (2010). Управление клеточным циклом с минимальной сетью управления CDK. Природа 468, 1074-1079.
  • Кайлен С. и соавт. (2016). Ki-67 действует как биологический сурфактант для рассеивания митотических хромосом. Природа 535, 308-312.
  • Гердес Дж. и соавт. (1984). Анализ клеточного цикла ядерного антигена, связанного с пролиферацией клеток, определяется моноклональным антителом Ki-67. Дж Иммунол 133, 1710-1715.
  • Жерар С и др. (2015). Контроль клеточного цикла с помощью минимальной сети Cdk.PLoS Comput Biol 11, e1004056.
  • Гиагинис С и соавт. (2010). Белки MCM как диагностические и прогностические онкомаркеры в клинических условиях. Histol Histopathol 25, 351-370.
  • Харашима Х. и др. (2013). Контроль клеточного цикла в эукариотическом царстве. Тенденции Cell Biol 23, 345-356.
  • Харпер Дж. В. и Элледж С. Дж. (1998). Роль Cdk7 в функции CAK, ретроспектива. Гены Дев 12, 285-289.
  • Хохеггер Х. и соавт. (2008). Циклинзависимые киназы и переходы клеточного цикла: подходят ли они всем? Nat Rev Mol Cell Biol 9, 910-916.
  • Ху Дж. и Сюн И (2006). Эволюционно законсервированная функция ядерного антигена пролиферирующих клеток для деградации Cdt1 убиквитинлигазой Cul4-Ddb1 в ответ на повреждение ДНК. J Biol Chem 281, 3753-3756.
  • Хуссейн С.П. и Харрис С.С. (1998). Молекулярная эпидемиология рака человека: Вклад исследований спектров мутаций генов-супрессоров опухолей. Рак Рез 58, 4023-4037.
  • Капинас К. и соавт. (2013). Сокращенный плюрипотентный клеточный цикл. J Cell Physiol 228, 9-20.
  • Кауш I и др. (2003). Антисмысловая обработка против мРНК Ki-67 ингибирует пролиферацию и рост опухоли in vitro и in vivo. Int J Рак 105, 710-716.
  • Келлог Д.Р. (2003). Wee1-зависимые механизмы, необходимые для координации клеточного роста и клеточного деления. J Cell Sci 116, 4883-4890.
  • Курки П. и др. (1986). Экспрессия ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA)/циклина во время клеточного цикла. Разрешение ячейки опыта 166, 209-219.
  • Лабиб К. и соавт. (2000).Непрерывная функция MCM2-7 необходима для развития вилки репликации ДНК. Наука 288, 1643-1647.
  • Лейн ДП (1992). Рак. p53, хранитель генома. Природа 358, 15-16.
  • Ленер Б. и соавт. (2011). Темная сторона BrdU в биологии нервных стволовых клеток: вредное воздействие на клеточный цикл, дифференцировку и выживание. Резистентность клеточной ткани 345, 313-328.
  • Ли Т.Л. и соавт. (2014). Ki-67 является перспективной молекулярной мишенью для диагностики рака (обзор). Мол Мед Реп 11, 1566-1572.
  • Лодиш Х и соавт. (2000). Обзор клеточного цикла и его контроля. В Molecular Cell Biology, 4 th edition (Нью-Йорк: WH Freeman & Co.), ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21466/, по состоянию на 2 мая 2017 г.
  • Lv Q и др. (2016). Ядерный антиген пролиферирующих клеток связан с прогнозом и факторами риска у онкологических больных: систематический обзор. Мол Нейробиол 53, 6209-6217.
  • Magaud JP et al. (1989). Двойное иммуноцитохимическое мечение образцов клеток и тканей моноклональным анти-бромдезоксиуридином.J Histochem Cytochem 37, 1517-1527.
  • Майорано Д. и соавт. (2006). Белки MCM и репликация ДНК. Curr Opin Cell Biol 18, 130-136.
  • Малумбрес М. и Барбацид М. (2005). Циклинзависимые киназы млекопитающих. Trends Biochem Sci 30, 630-641.
  • Мюррей А.В. (2004). Переработка клеточного цикла: новый взгляд на циклины. Ячейка 116, 221-234.
  • Медсестра П. и др. (1998). Понимание клеточного цикла. Nat Med 4, 1103-1106.
  • Медсестра П. (2000). Долгий двадцатый век клеточного цикла и далее.Ячейка 100, 71-78.
  • Окура Х (2015). Мейоз: обзор ключевых отличий от митоза. Cold Spring Harb Perspect Biol 7, pii: a015859.
  • Паунеску Т. и соавт. (2001). Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): главный геном. Int J Radiat Biol 77, 1007-1021.
  • Питерс Дж. М. (2006). Анафазный комплекс/циклосома: машина, предназначенная для уничтожения. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 644-656.
  • Поллак А и др. (2004). Окрашивание Ki-67 является сильным предиктором отдаленных метастазов и смертности у мужчин с раком предстательной железы, получавших лучевую терапию плюс андрогенную депривацию: групповое исследование онкологической лучевой терапии 92-02.Дж. Клин Онкол 22, 2133-2140.
  • Рахманзаде Р. и соавт. (2010). Ki-67 как молекулярная мишень для терапии в трехмерной модели рака яичников in vitro. Рак Рез 70, 9234-9242.
  • Рикарди Г.Р. и соавт. (2015а). Рецептор андрогена (AR), E-кадгерин и Ki-67 в качестве новых мишеней и новых прогностических маркеров у пациентов с тройным негативным раком молочной железы (TNBC). PLoS One 10, e0132647.
  • Рикарди Г.Р. и соавт. (2015б). Поправка: рецептор андрогена (AR), E-кадгерин и Ki-67 в качестве новых мишеней и новых прогностических маркеров у пациентов с тройным негативным раком молочной железы (TNBC).PLoS One 10, e0132647.
  • Роа С. и др. (2008). Убиквитилированный PCNA играет роль в соматической гипермутации и рекомбинации переключения классов и необходим для мейотической прогрессии. Proc Natl Acad Sci USA 105, 16248-16253.
  • Салик А. и Митчисон Т.Дж. (2008). Химический метод быстрого и чувствительного обнаружения синтеза ДНК in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 105, 2415-2420.
  • Сантамария Д. и соавт. (2007). Cdk1 достаточно для управления клеточным циклом млекопитающих. Природа 448, 811-815.
  • Серрано М. и соавт. (1993). Новый регуляторный мотив в контроле клеточного цикла, вызывающий специфическое ингибирование циклина D/CDK4. Природа 366, 704-707.
  • Шиба М. и соавт. (2000). Иммуноокрашивание Ki-67 и другие прогностические факторы, включая курение табака, у пациентов с резецированной немелкоклеточной карциномой легкого. Рак 89, 1457-1465.
  • Сола М.М. и соавт. (1991). Сайты фосфорилирования p34cdc2 в гистоне h2 дефосфорилируются протеинфосфатазой 2A1. Биохим Биофиз Акта 1094, 211-216.
  • Старборг М. и др. (1996). Мышиный антиген пролиферации клеток Ki-67 накапливается в ядрышковых и гетерохроматиновых областях интерфазных клеток и на периферии митотических хромосом в процессе, необходимом для развития клеточного цикла. J Cell Sci 109, 143-153.
  • Стржалка В. и Земенович А. (2011). Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): ключевой фактор репликации ДНК и регуляции клеточного цикла. Энн Бот 107, 11:27-11:40.
  • Стюарт-Харрис Р. и соавт.(2008). Маркеры пролиферации и выживаемость при раннем раке молочной железы: систематический обзор и метаанализ 85 исследований с участием 32 825 пациентов. Грудь 17, 323-334.
  • Танака Х и др. (2000). Ген рибонуклеотидредуктазы, участвующий в p53-зависимой контрольной точке клеточного цикла для повреждения ДНК. Природа 404, 42-49.
  • Тодоров И.Т. и соавт. (1995). Ядерный белок человека с последовательностью, гомологичной семейству белков ранней S-фазы, необходим для вступления в S-фазу и для клеточного деления.J Cell Sci 107, 253-265.
  • Тодоров И.Т. и соавт. (1998). HsMCM2/BM28: новый маркер пролиферации опухолей и нормальных тканей человека. Лаб Инвест 78, 73-78.
  • Цуруга Х. и др. (1997). Экспрессия, ядерная локализация и взаимодействия белков MCM/P1 человека. Biochem Biophys Res Commun 236, 118-125.
  • Таттл А.Х. и соавт. (2010). Иммунофлуоресцентное обнаружение двух аналогов тимидина (CIdU и IdU) в первичной ткани. J Vis Exp 46, 2166.
  • Ван Дирендонк Дж. Х. и соавт.(1989). Ядерное распределение антигена Ki-67 во время клеточного цикла: сравнение с фракцией роста в клетках рака молочной железы человека. Рак Рез 49, 2999-3006.
  • Чжан П. и др. (2007). Универсальные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии при инфракрасном возбуждении. J Am Chem Soc 129, 4526-4527.
  • Зилфу Дж. Т. и Лоу С. В. (2009). Опухолесупрессорные функции р53. Cold Spring Harb Perspect Biol 1, a001883.

Back to top

Как работает проточная цитометрия?

Давайте сначала отточим основы проточной цитометрии

Что такое проточная цитометрия?

Проточная цитометрия — это метод, используемый для обнаружения и измерения физических и химических характеристик популяции клеток или частиц.В этом процессе образец, содержащий клетки или частицы, суспендируют в жидкости и вводят в прибор проточного цитометра  .

Для чего предназначена проточная цитометрия?

Проточная цитометрия — это хорошо зарекомендовавший себя метод идентификации клеток в растворе, который чаще всего используется для оценки периферической крови, костного мозга и других жидкостей организма. Проточная цитометрия используется для выявления и количественного определения иммунных клеток и характеристики гематологических злокачественных новообразований. 1 Они могут измерять: 

  • размер ячейки
  • гранулярность ячеек
  • общая ДНК
  • новый синтезированный
  • Экспрессия гена ДНК
  • поверхностные рецепторы
  • внутриклеточные белки
  • переходный сигнал

Возможность выполнения этих измерений в очень короткие сроки является одним из ключевых преимуществ процесса проточной цитометрии. Они могут количественно определять от трех до шести свойств или компонентов в одном образце, клетка за клеткой, примерно для 10 000 клеток менее чем за одну минуту.

Приборы и методология проточной цитометрии

Проточные цитометры берут суспензию монодисперсных одиночных неслипшихся клеток и пропускают их по одному (одним рядом) через лазерный луч, где каждая клетка проходит через лазерный луч, рассеянный и флуоресцентный свет, а затем подсчитывается и сортируется или дополнительно охарактеризуется .

Тремя основными компонентами проточного цитометра являются гидросистема, оптика и электроника.

  • Жидкостная система проточного цитометра отвечает за транспортировку образцов из пробирки для образцов в проточную кювету, мимо лазера, сортировку и/или выбрасывание.
  • Компоненты оптической системы включают в себя источники возбуждающего света, линзы и оптические фильтры, используемые для сбора и перемещения световых длин волн вокруг прибора, а также систему обнаружения, генерирующую фототок. Разница в отклике на длину волны в данных помогает анализировать тип клеток.
  • Приборная часть электроники или проточного цитометра.

Одним из основных принципов использования проточной цитометрии является возможность анализа полного клеточного цикла и анализа содержания ДНК в различных фазах.Мониторинг естественных событий клеточного цикла может предоставить информацию для диагностики заболеваний и прогноза терапии. Различные фазы клеточного цикла могут выявить измененное содержание ДНК и другие аномалии, указывающие на наличие опухоли или признаки прогрессирующей гибели клеток. Выражения данных сохраняются в компьютере с помощью специализированного программного обеспечения для проточной цитометрии, связанного с использованием выбранного инструмента во время анализа. Данные проточной цитометрии обычно представляются двумя разными способами: в виде гистограммы и/или точечной диаграммы 2 .

 

Клетки
Фаза G1: РНК, рибосомы и белки синтезированы
S-фаза: ДНК реплицируется
Фаза G2: Представляет фазу между синтезом ДНК и митозом
М фаза: делятся на две дочерние клетки

ФАКС

Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS) — это специализированный тип проточной цитометрии.Он обеспечивает метод сортировки гетерогенной смеси биологических клеток в два или более контейнера, по одной ячейке за раз, на основе специфических светорассеяния и флуоресцентных характеристик каждой клетки. Он отличается от проточной цитометрии тем, что обеспечивает уникальную характеристику, а не просто подсчет и сортировку клеток. Обычно два принципа работают в процессе совместной характеристики, чтобы предложить полный качественный и количественный подход к анализу проточной цитометрии.

Процесс проточной цитометрии:  

Суспензия клеток попадает в центр узкого, быстро текущего потока жидкости. Поток устроен так, что имеется большое расстояние между ячейками относительно их диаметра. Вибрационный механизм заставляет поток клеток разбиваться на отдельные капли. Система настроена таким образом, чтобы вероятность наличия более одной клетки на каплю была низкой. Непосредственно перед тем, как поток разбивается на капли, поток проходит через станцию ​​измерения флуоресценции, где измеряется интересующий флуоресцентный характер каждой клетки.

Электрическое зарядное кольцо находится как раз в том месте, где струя разбивается на капли. Заряд помещается на кольцо на основе непосредственно предшествующего измерения интенсивности флуоресценции, а противоположный заряд захватывается каплей, когда она отрывается от потока. Затем заряженные капли падают через электростатическую систему отклонения, которая направляет капли в контейнеры в зависимости от их заряда. В некоторых системах заряд подается непосредственно на поток, и оторвавшаяся капля сохраняет заряд того же знака, что и поток.Затем поток возвращается в нейтральное состояние после отрыва капли.

Антитело, специфичное к определенному белку клеточной поверхности, связывают с флуоресцентной молекулой, а затем добавляют к смеси клеток. Следующим шагом является процесс флуоресценции, когда определенные клетки проходят через лазерный луч, за ними наблюдают. Каплям, содержащим одну клетку, присваивается положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, содержит ли клетка антитело с флуоресцентной меткой. Капли, содержащие одну клетку, затем обнаруживаются с помощью электрического поля и направляются в отдельные пробирки для сбора в соответствии с их зарядом, что позволяет легко отделить клетки, помеченные флуоресцентным антителом.

Многоцветная проточная цитометрия

Многоцветная проточная цитометрия является полезным методом исследования смешанных популяций клеток, таких как клетки крови и тканей в образцах человека и животных. Как правило, определенный тип клеток маркируется флуоресцентным красителем (маркерами), например флуорофором или йодидом пропидия. Возможность одновременного использования нескольких флуоресцентных маркеров позволяет идентифицировать несколько типов клеток, а также функциональные маркеры, которые дополнительно характеризуют каждый образец.Существуют специальные приборы, способные измерять более 12 цветов 3,4 . Эти флуоресцентные красители и маркеры измеряются по разным длинам волн света, излучаемого лазером, для сортировки по отдельным типам клеток. Каждый маркер возбуждается определенной длиной волны света, чтобы различать их при использовании нескольких маркеров.

Адаптация типичной панели для окрашивания от 4 до 6 цветов к более чем 12 цветам — это не просто вопрос «подключи и работай», к этому нужно подходить систематически, чтобы добиться успешных параметров панели для окрашивания.Основные принципы проектирования панелей лучше всего работают на основе предварительных исследований. Другими словами, подготовка является ключевой с самого начала процесса обращения к индексу окраски в отношении эффективного сопоставления флуорохромов по яркости 5 .

Наконечник для проточной цитометрии:

Потратьте некоторое время на то, чтобы понять тонкие нюансы вашего проточного цитометра, прежде чем разрабатывать свою основную панель антител . Сосредоточьтесь на том, где в системе могут быть выполнены наиболее чувствительные измерения.В этой истории есть нечто большее, чем просто интенсивность флуоресценции.

Рассмотрите возможность замены менее яркого флуорохрома, чтобы избежать ошибок канала.

Общие применения методологии проточной цитометрии

Проточная цитометрия является неотъемлемым компонентом в нескольких клинических областях, включая диагностику, планы лечения и системные заболевания, статические или прогрессирующие. По мере того, как мы узнаем больше о практических применениях проточной цитометрии, база знаний расширяется.Сейчас, как никогда раньше, исследователи очень рады возможности узнать больше о сложностях определенных заболеваний и состояний. Это привело к быстрому изменению паттернов диагностики и радикальному изменению медицинских подходов к лечению таких заболеваний, как рак 6 .

Методология проточной цитометрии часто сочетается с другими схемами комплексного тестирования, такими как морфологическое исследование. Во многих случаях гематологические новообразования демонстрируют специфические морфологические изменения, а проточная цитометрия обеспечивает большую специфичность и помогает патологоанатомам выявить аномалии тканей или другие запущенные заболевания.Проточная цитометрия в некоторых случаях может предопределить рецидив рака до выявления морфологических изменений 7 .

Некоторые из основных приложений, используемых в современных клинических условиях, как терапевтических, так и ориентированных на исследования, включают: 

  • Экспрессия белка — во всей клетке, даже в ядре
  • Посттрансляционные модификации белков — включает расщепленные и фосфорилированные белки
  • РНК, включая транскрипты микроРНК и мРНК
  • Состояние здоровья клеток — обнаружение апоптотических клеток или гибели клеток
  • Состояние клеточного цикла — мощный инструмент для оценки клеток в фазе G0/G1 по сравнению с фазой S, G2 или полиплоидией, включая анализ пролиферации и активации клеток
  • Идентификация и характеристика отдельных подмножеств клеток в гетерогенном образце, включая различение центральных эффекторных клеток памяти от истощенных Т-клеток или регуляторных Т-клеток

Завершение

Основные принципы проточной цитометрии мало изменились за последнее десятилетие, но применение этой технологии значительно расширилось.Основы проточной цитометрии согласуются с ее основной функцией, которая заключается в опросе отдельных клеток или частиц в потоке с помощью лазера, когда клетки проходят мимо набора стационарных детекторов. Цитометры все чаще обнаруживают больше цветов флуоресценции, наряду с высокоскоростной сортировкой и аналитическими функциями 8 .

Проточная цитометрия играет неотъемлемую роль в исследованиях в области молекулярной науки и продолжает быстро развиваться. На рынке имеется несколько коммерческих проточных цитометров.Они, как правило, работают по одному и тому же основному принципу, но есть важные различия в их конструкции и концепциях согласования и интеграции других компонентов.

Вскоре на горизонте появится 3D-инструментарий, который будет включен в гибридный запатентованный инструмент производства NanoCellect Biomedical, сортировщик клеток WOLF. Мы также можем рассчитывать на разработку флуоресцентных зондов с узким спектром, интеграцию молекулярно-биологических методов с проточной цитометрией и оценку бесклеточных маркеров, таких как цитокины, которые станут ключевыми компонентами в продолжающейся эволюции анализа проточной цитометрии и анализа клеток. технология.

Источники:

1  http://clinchem.aaccjnls.org/content/46/8/1221

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18615596-flow-cytometry-histograms-transformations-resolution-and-display/

3 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.20959

https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/cpim.26

5 https://www.nature.com/articles/nprot.2006.250

6  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19967915-immunophenotypic-analysis-of-bone-marrow-b-lymphocyte-precursors-hematogones-by-flow-cytometry/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4803461/

8  https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-150-0:543

 

Верхушки корня лука онлайн

Биология Проект > Ячейка Биология > Введение to Onion Root Tips Активность > Активность

Онлайн-подсказки корня лука

Определение времени, проведенного в разных фазы клеточного цикла

Рост в организме тщательно контролируется путем регулирования клеточный цикл.У растений корни продолжают расти, пока они ищут для воды и питательных веществ. Эти области роста хороши для изучения клеточный цикл, потому что в любой момент времени вы можете найти клетки, которые подвергаются митозу.

 

Для исследования клеток кончика корня лука использовали тонкий срез корня помещают на предметное стекло и окрашивают так что хромосомы будут видны.Клетки, которые вы будете искать во время этой деятельности были сфотографированы световым микроскопом и затем оцифрованы, чтобы вы могли видеть их на компьютере.

Хотя нарезка корня лука захватывает множество клеток в разных фазы клеточного цикла, имейте в виду, что клеточный цикл является непрерывный процесс. Ученые разделили процесс на 5 фаз, каждый характеризуется важными событиями, но эти подразделения еще произвольно.

Author: alexxlab

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.